FI94353B

FI94353B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen bradykiniiniantagonistin valmistamiseksi

Info

Publication number: FI94353B
Application number: FI893738A
Authority: FI
Inventors: Bernward Schoelkens; Gerhard Breipohl; Jochen Knolle; Hans-Wolfram Fehlhaber; Hiristo Anagnostopulos; Stephan Henke; Jens Stechl
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-11-24
Filing date: 1989-08-08
Publication date: 1995-05-15
Also published as: SK490689A3; NO2008016I2; FI94353C; ES2057071T3; SK279315B6; DE3938751A1; HU210712A9; CA1340667C; IL91298A; KR900007870A; IL91298A0; FI893738A0; EP0370453A3; HU210566B; NZ230244A; LU91499I2; LV10720A; CY2008022I2; DK384089A; HUT52527A

Description

94355

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen bradykiniini-antagonistin valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää uusien peptidien valmis-5 tamiseksi, joilla on bradykiniinille vastakkainen vaikutus.

Patenttijulkaisussa W0 86/07263 on kuvailtu vaikutukseltaan bradykiniinille vastakkaiset peptidit, joissa peptidihormoni bradykiniinin tai muiden bradykiniinin ana-10 logien muun muassa 7-aseman L-Pro on korvattu D-aminoha-polla, kuten D-Phe, D-Thi, D-Pal, CDF, D-Nal, MDY, D-Phg, D-His, D-Trp, D-Tyr, D-hPhe, D-Val, D-Ala, D-His, D-Ile, D-Leu ja DOMT.

Keksinnön tehtävänä on löytää uusia vaikuttavia 15 peptidejä, joilla on bradykiniinille vastakkainen vaikutus.

Esillä oleva keksintö eroaa tunnetusta tekniikasta siinä, ettei aikaisemmin ole kuvattu peptidejä, jotka 7-asemassa sisältäisivät ei luonnossa esiintyvää aminohappoa 20 D-Tic.

Keksinnön kohteena on näin ollen menetelmä kaavan I mukaisen terapeuttisesti käyttökelpoisen bradykiniinian-tagonistin valmistamiseksi

25 A-B-C-E-F-K-(D)-Tic-G-M-F'-I I

* • jossa A on ax) vety, asetyyli, propionyyli tai metyylioksikar-bonyyli, jossa yksi vetyatomi on mahdollisesti korvattu 20 karboksilla, fenyylillä tai 4-hydroksifenyylillä, a2) karbamoyyli, joka on mahdollisesti substituoitu • typpeen liittyneellä fenyylillä, fenyylisulfonyyli, joka on mahdollisesti substituoitu 1 tai 4 ryhmällä joukosta metyyli ja metoksi tai pyridyylikarbonyyli, tai 35 94353 2 a3) kaavan II mukainen ryhmä

R1 - N - CH - C - II

k2 k3 o 5 jossa R1 on A kohdassa ax) tai a2) määritelty, R2 on vety, R3 on (C^-C*)-alkyyli, joka on mahdollisesti monosubsti-tuoitu aminolla, substituoidulla guanidiinolla tai 4-hyd-10 roksifenyylillä, jolloin substituoitu guanidiino on ryhmä -NH-C(NH)-NH-A, jossa A on kohdassa a:) määritelty; B on Arg, Lys, Orn, 2,4-diaminobutyroyyli tai L-homoarginiiniryhmä, jolloin sivuketjun amino- tai guani-15 diinoryhmä saattaa olla substituoitu A:11a kuten kohdassa ai) tai a2) on kuvattu; C on kaavan lila tai Illb mukainen yhdiste G' -G' -Gly Ula G' -NH-(CH-) -CO Illb « Il 20 jolloin G':t ovat toisistaan riippumatta kaavan IV mukaisia ryhmiä 4 5

R R O IV

I ! "

.25 - N - CH - C

jossa R4 ja R5 muodostavat yhdessä atomien kanssa, joihin ne ovat kiinnittyneet, heterosyklisen mono-, di- tai trisyklisen rengasjärjestelmän, jossa on 2 - 15 C-atomia ja n on 30 2 - 8; . E on fenyylialaniiniryhmä, joka mahdollisesti on substituoitu halogeenilla 2-, 3- tai 4-asemassa, tyrosii-ni, O-metyylityrosiini, 2-tienyylialaniini, 2-pyridyyli-alaniini tai naftyylialaniini; 35 94353 3 F on Ser, Hser, Lys, Leu, Vai, Nle, Ile Thr tai on suora sidos; (D)-Tic on kaavan V mukainen ryhmä;

JOO

O H

G on kuten edellä määritelty G' tai on suora sidos; F' on emäksinen aminohapporyhmä Arg tai Lys L- tai 10 D-muodossa tai suora sidos, jolloin sivuketjun guanidiino-tai aminoryhmä saattaa olla substituoitu A:11a, kuten kohdassa a2) tai a2) on määritelty, tai on ryhmä -NH-(CH2)n-, jolloin n - 2 - 8, I on -OH, -NH2 tai -NHC2H5, 15 K on ryhmä -NH-(CH2)x-C0-, jossa x = 1 - 4, tai suo ra sidos, ja M on kuten F, ja sen fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi .

20 Ellei toisin ole mainittu, tarkoittaa aminohappoes- terin lyhenne ilman stereoselitystä L-muodon ryhmää (vertaa Schröder, Liibke, The Peptides, Osa I, New York 1965, s. XXII-XXIII; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Che-mie, Osa XV/1 ja 2, Stuttgart 1974), kuten esimerkiksi .25 Aad, Abu, rAbu, ABz, 2ABz, 6Aca, Ach, Acp, Adpd, Ahb, Aib, * BAib, Ala, 8Ala, AAla, Alg, All, Ama, Amt, Ape, Apm, Apr,

Arg, Asn, Asp, Asu, Aze, Azi, Bai, Bph, Can, Cit, Cys,

Cyta, Daad, Dab, Dadd, Dap, Dapm, Dasu, Dj en, Dpa, Dtc, Fel, Gin, Glu, Gly, Guv, hAla, hArg, hCys, hGln, hGlu, 30 His, hile, hLeu, hLys, hMet, hPhe, hPro, hSer, hThr, hTrp, . hTyr, Hyi, Hyp, 3Hyp, Ile, Ise, Iva, Kyn, Lant, Len, Leu,

Lsg, Lys, fiLys, ALys, Met, Mim, Min, nArg, Nle, Nva, Oly,

Orn, Pan, Pec, Pen, Phe, Phg, Pic, Pro, ΔΡγο, Pse, Pya,

Pyr, Pza, Qin, Ros, Sar, See, Sem, Ser, Thi, BThi, Thr, 3Γ> Thy, Thx, Tia, Tie, Tly, Trp, Trta, Tyr, Vai.

94353 4

Kaavan IV mukaisen heterosyklisenä rengasjärjestel-märyhmänä tulevat kyseeseen erityisesti seuraavan joukon heterosykliset ryhmät: pyrrolidiini (A); piperidiini (B); tetrahydroisokinoliini 5 (C); dekahydroisokinoliini (D); oktahydroindoli (E); ok- tahydrosyklopenta[b]pyrroli (F); 2-atsabisyklo[2.2.2]oktaani (G); 2-atsabisyklo[2.2.1]heptaani (H); 2-atsaspiro-[4.5]dekaani (I); 2-atsaspiro[4.4]nonaani (J); spiro[(bi-syklo[2.2.l]heptaani)-2,3-pyrrolidiini] (K); spiro[(bisyk-10 lo[2.2.2]oktaani)-2,3-pyrrolidiini] (L); 2-atsatrisyklo- [4.3.0.16·9]dekaani (M); dekahydrosyklohepta[b]pyrroli (N); oktahydroisoindoli (O); Oktahydrosyklopenta[c]pyrroli (P); 2,3,3a,4,5,7a-heksahydroindoli (Q); tetrahydrotiatsoli (R); 2-atsabisyklo[3.1.0]heksaani (S); isoksatsolidiini 15 (T); pyratsolidiini (U); hydroksiproliini (V); jotka saat tavat kaikki mahdollisesti olla substituoituja.

: 94353 5 = Q~ 0-“- OCT·' Cfc-' ·<*-' g>- ‘

10 B » ' P

e X £ .

Ν^°·0·εο" 15 ·η 'i 1 £ ' & „ <2ξ>~ Q>- <o·»- *1 L I M 1 N 1 1 /”) O. r— *: 25 V__/ B-Λ—(“Η Λ )—v S^*\ (~\co- ^ )-co- |_^Veo- 1 o 1 t 8 1 £ . 1 * H0\ 0-c°- O-c0- 0-c° 4 Ä 2 94353 6

Edellä esitetyille ryhmille perustana olevat he-terosyklit tunnetaan esimerkiksi patenttijulkaisuista US-4 344 949, US-4 374 847, US-4 350 704, EP-50 800, EP-31 741, EP-51 020, EP-49 658, EP-49 605, EP-29 488, 5 EP-46 953, EP-52 870, EP-271 865, DE-32 26 768, DE-31 51 690, DE-32 10 496, DE-32 11 397, DE-32 11 676, DE-32 27 055, DE-32 42 151, DE-32 46 503 ja DE-32 46 757.

Edelleen joitain näistä heterosykleistä esitetään patenttijulkaisussa DE-38 18 850.3.

10 Ellei yksittäistapauksissa ole toisin ilmoitettu, voi alkyyli olla suoraketjuinen tai haaroittunut.

Halogeeni on fluori, kloori, bromi tai jodi, edullisesti kloori.

Suoloina tulevat kyseeseen erityisesti alkali- tai 15 maa-alkalisuolat, suolat fysiologisesti hyväksyttävien amiinien kanssa ja suolat epäorgaanisten tai orgaanisten happojen kanssa kuten esimerkiksi HC1, HBr, H2S04, H3P04, maleiinihappo, fumaarihappo, sitruunahappo, viinihappo, etikkahappo.

20 Edullisia ovat kaavan I mukaiset peptidit, joissa K on ryhmä -NH-(CH2)x-C0-, jossa x = 2 - 4, tai suora sidos.

Erityisen edullisia ovat kaavan I mukaiset peptidit, joissa • .25 B on Arg, Orn tai Lys, jolloin sivuketjun guanidii- noryhmä tai aminoryhmä on substituoimaton tai substituoitu 4-hydroksifenyylipropionyylillä, pyridyylikarbonyylillä tai fenyylisulfonyylillä, jolloin fenyylisulfonyyliryhmä saattaa mahdollisesti olla substituoitu kohdassa a2) ku-30 vaillulla tavalla 1 tai 4 samalla tai erilaisella ryhmällä; E on fenyylialaniini, 2-kloorifenyylialaniini, 3-kloorifenyylialaniini, 4-kloorifenyylialaniini, 2-fluo-rifenyylialaniini, 3-fluorifenyylialaniini, 4-fluorifenyy-55 lialaniini, tyrosiini, 0-metyylityrosiini tai B-(2-tienyy-li)alaniini; 94353 7 K on suora sidos; ja M on suora sidos.

Aivan erityisen edullisia ovat kaavan I mukaiset peptidit, joissa 5 A on vety, (D)- tai (L)-H-Arg, (D)- tai (L)-H-Lys tai (D)- tai (L)-H-Orn; B on Arg, Orn tai Lys, jolloin sivuketjun aminoryh-mä saattaa olla substituoitu vedyllä, 4-hydroksifenyyli-propionyylillä, pyridyylikarbonyylillä tai fenyylisulfo-10 nyylillä, jolloin fenyylisulfonyyliryhmä saattaa mahdollisesti olla substituoitu 1 tai 4 samanlaisella tai erilaisella ryhmällä joukosta metyyli ja metoksi; C on Pro-Pro-Gly, Hyp-Pro-Gly tai Pro-Hyp-Gly; E on Phe tai Thia; 15 F on Ser, Hser, Lys, Leu, Vai, Nle, Ile tai Thr; K on suora sidos; M on suora sidos; G on kaavan IV mukainen heterosyklinen rengasjär-jestelmäryhmä, jolloin heterosykliset ryhmät ovat edulli-20 sesti pyrrolidiini (A); piperidiini (B); tetrahydroisoki-noliini (C); cis- tai trans-dekahydroisokinoliini (D); cis-endo-oktahydroindoli (E), cis-el:so-oktahydroindoli (E), trans-oktahydroindoli (E), cis-endo-, cis-ekso-, tai trans-oktahydrosyklopentano[b]pyrroli (F); tai hydroksi-• •25 proliini (V); F' on Arg; ja I on OH.

Esimerkkejä aivan erityisen edullisista kaavan I mukaisista peptideistä ovat: 30 H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, . H-(D)-Arg-Arg-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, H-(D)-Arg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH.

35 Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan I mu kaisten peptidien valmistamiseksi on ominaista, että 94353 8 a) osa, jossa on vapaa C-terminaalinen karboksyyli-ryhmä tai sen aktivoitu johdannainen, saatetaan reagoimaan vastaavan osan kanssa, jossa on vapaa N-terminaalinen ami-noryhmä, tai 5 b) peptidi rakennetaan vaiheittain kiinteäfaasime- netelmän mukaisesti, (a):n tai (b):n mukaan saadusta yhdisteestä lohkaistaan mahdollisesti yksi tai useampia muiden funktionaalisten ryhmien suojaksi väliaikaisesti kiinnitettyjä suojaryhmiä 10 ja näin saadut kaavan I mukaiset yhdisteet mahdollisesti muutetaan fysiologisesti hyväksyttävien suolojen muotoon.

Tämän keksinnön peptidit valmistettiin yleisesti tunnettujen peptidikemian menetelmien mukaisesti, katso esimerkiksi Hoyben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, 15 Osa 15/2, edullisesti kiintofaasisynteesillä kuten esimerkiksi B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963) s. 2149, tai R. C. Sheppard, Int. J. Peptide Protein Res. 21 (1983) s. 118, kuvailevat, tai samanlaisilla tunnetuilla menetelmillä. α-aminosuojaryhminä käytettiin uretaanisuojaryhmiä 20 kuten esimerkiksi tert-butyylioksikarbonyyli (Boc)- tai fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (Fmoc)-suojaryhmiä. Mikäli sivureaktioiden estoon tai erityisten peptidien synteesiin vaadittiin, suojattiin aminohappojen sivuketjujen funktionaaliset ryhmät sopivilla suojaryhmillä (katso esi-•;25 merkiksi T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synt-hesis"), jolloin ensisijassa käytettiin ryhmiä Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Arg(PMC), Asp(OBzl), Asp(OBut), Cys(4-MeBzl), Cys(Acm), Cys(SBut), Glu(OBzl), Glu(OBut), Ηχεί Tos ) , His(Fmoc), His(Dnp), His(Trt), Lys(Cl-Z), Lys(Boc), 30 Met(O), Ser(Bzl), Ser(But), Thr(Bzl), Thr(But), Trp(Mts), Trp(CHO), Tyr(Br-Z), Tyr(Bzl) tai Tyr(But).

Kiintofaasisynteesi aloitetaan peptidin C-terminaa-lisesta päädystä suojatun aminohapon liittämisellä vastaavaan hartsiin. Sellaisia lähtöaineita voidaan saada suoja-35 tun aminohapon yhdistämisellä kloorimetyyli-, hydroksime-tyyli-, bentshydryyliamino(BHA)- tai metyylibentshydryyli- 94353 9 amino(MBHA)-ryhmällä modifioidusta polystyreeni- tai poly-akryyliamidihartsista esteri- tai amidisidoksella. Väliaineina käytetyt hartsit ovat kaupallisesti saatavia. Mikäli peptidin on sisällettävä C-terminaalisessa päädyssä sekun-5 däärisen amidiryhmän, käytetään kloorimetyyli- tai hydrok-simetyylihartsia ja lohkaisu suoritetaan vastaavilla amiineilla. Mikäli halutaan säilyttää etyyliamidi, voidaan peptidi lohkaista hartsista etyyliamiinilla, jolloin sivu-ketjujen suojaryhmien lohkaisu tapahtuu jatkossa muilla 10 soveliailla reagensseilla. Mikäli aminohapon sivuketjun tert-butyyli-suojaryhmien on säilyttävä peptidissä, niin synteesi suoritetaan Fmoc-suojaryhmällä aminohapon a-ami-noryhmän tilapäisesti suojaamiseksi esimerkiksi R.C. Shep-pardin, J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1982, s. 587, kuvaile-15 maila tavalla, jolloin arginiinin guanidiinoryhmä suojataan protonoimalla pyridiniumperkloraatilla ja muiden sivuketjuissa funktionaalisuutta sisältävien aminohappojen suojaus tapahtuu katalyyttisellä poistohydrauksella (A. Felix et ai., J. Org. Chem. 13 (1988), s. 4194) tai nat-20 riumilla nestetypessä (W. Roberts, J. Am. Chem. Soc. 76 (1954), s. 6203) lohkaistavissa olevilla bentsyylisuoja-ryhmillä.

Hartsiin kiinnitettyjen aminohappojen aminosuoja-ryhmien lohkaisun jälkeen sopivalla reagenssilla, kuten •;25 esimerkiksi trifluorietikkahappo metyleenikloridissa Boc- suojaryhmän kohdalla tai 20-% piperidiinin liuoksella di-metyyliformamidissa Fmoc-suojaryhmän kohdalla, liitetään seuraavat suojatut aminohapot peräjälkeen halutussa järjestyksessä. Välituotteina muodostuvat N-terminaalisesti 30 suojatut peptidihartsit suojataan edelläkuvatuilla rea- ·, gensseilla ennen seuraavan aminohappojohdannaisen kanssa liittämistä.

Kytkentäreagensseina tulevat kyseeseen kaikki pep-tidisyntetiikassa käytetyt aktivointireagenssit, katso 35 esimerkiksi Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Osa 15/2, mutta erityisesti karbodi-imidit kuten esimer- 10 94353 kiksi N, N'-disykloheksyylikarbodi-imidi, Ν,Ν'-di-isopro-pyylikarbodi-imidi tai N-etyyli-N’-(3-dimetyyliaminopro-pyyli)karbodi-imidi. Kytkentä hartsiin voidaan tällöin suorittaa suoraan aminohappojohdannaisen additiolla akti-5 vointireagenssin ja mahdollisesti rasemisoitumista ehkäisevän lisäaineen kuten esimerkiksi 1-hydroksibentsotriat-solin (HOBt) (W. König ja R. Geiger, Chem. Ber. 103 (1970), s. 708) tai 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydrobentso-triatsiinin (HOObt) (W. König ja R. Geiger, Chem. Ber. 103 10 (1970), s. 2054) kanssa mutta aminohappojohdannainen voi daan esiaktivoida symmetriseksi anhydridiksi tai HOBt- tai HOObt-esteriksi erikseenkin ja lisätä aktivoidun lajin liuos sopivassa liuottimessa kytkentävalmiiseen peptidi-hartsiin.

15 Aminohappojohdannaisen kytkentä tai aktivointi jol lain edellä mainituista aktivointireagensseista voidaan suorittaa dimetyyliformamidissa, N-metyylipyrrolidonissa tai metyleenikloridissa tai mainittujen liuottimien seoksessa. Aktivoitua aminohappojohdannaista käytetään taval-20 lisesti 1,5- - 4-kertainen ylimäärä. Tapauksissa, joissa tapahtuu epätäydellinen kytkeytyminen, toistetaan kytkentä suorittamatta seuraavan aminohapon kytkentään tarvittavaa peptidihartsin α-aminoryhmän suojauksen poistoa.

Kytkentäreaktion onnistuminen voidaan testata nin-J25 hydriinireaktiolla, kuten esimerkiksi E. Kaiser et ai.. Anal. Biochem. 34 (1970) s. 595, kuvailee. Synteesi voidaan myös automatisoida esimerkiksi peptidisyntetisaatto-rilla malli 430A, Applied Biosystems-yhtiö, jolloin voidaan käyttää joko laitteen valmistajan toimittamia, mutta 30 myös laitteen käyttäjän omia synteesiohjelmia. Viimeksi-·. mainittuja käytetään erityisesti Fmoc-ryhmillä suojattuja aminohappojohdannaisia käytettäessä.

Peptidin synteesin jälkeen edellä kuvaillulla tavalla peptidi voidaan irroittaa hartsista reagensseilla, 35 kuten esimerkiksi nestemäisellä fluorivedyllä (edullisesti Boc-menetelmällä valmistetulla peptidillä) tai trifluori-etikkahapolla (edullisesti Fmoc-menetelmällä valmistetun- 94353 11 la peptideillä). Nämä reagenssit eivät ainoastaan lohkaise peptidiä hartsista vaan myös aminohappojohdannaisten muut sivuketjujen suojaryhmät. Tällä tavoin saadaan paitsi BHA-ja MBHA-hartseja käyttäen peptidi vapaan hapon muodossa.

5 BHA- tai MBHA-hartseilla saadaan fluorivedyllä tai tri-fluorimetaanisulfonihapolla lohkaisemalla peptidi happo-amidina. Muita menetelmiä peptidiamidien valmistamiseksi on kuvailtu patenttihakemuksissa DE-37 11 866.8 ja DE-37 43 620.1. Näissä peptidiamidin lohkaisu hartsista tapahtuu 10 käsittelemällä peptidisyntetiikassa tavanomaisesti käy tetyillä keskivahvoilla hapoilla (esimerkiksi trifluori-etikkahappo) jolloin käytetään kationinsiepparina aineita kuten fenoli, kresoli, tiokresoli, anisoli, tioanisoli, etaaniditioli, dimetyylisulfidi, etyylimetyylisulfidi tai 15 samanlaisia kiintofaasisyntetiikassa tavanomaisia katio- ninsieppareita yksinään tai kahden tai useamman näiden apuaineiden seoksena. Trifluorietikkahappoa voidaan tällöin myös laimentaa sopivilla liuottimilla kuten esimerkiksi metyleenikloridi.

20 Mikäli peptidin sivuketjun tert-butyyli- tai bent- syylisuojaryhmät on säilytettävä, suoritetaan erityisesti muunnellulla väliainehartsilla syntetisoidun peptidin lohkaisu 1—% trifluorietikkahapolla metyleenikloridilla, kuten kuvailee esimerkiksi R.C. Sheppard, J. Chem. Soc., 'j25 Chem. Commun. 1982, s. 587. Mikäli on säilytettävä yksit-täisiä sivuketjujen tert-butyyli- tai bentsyylisuojaryh-miä, niin käytetään sopivaa synteesi- ja lohkaisumenetelmien yhdistelmää.

Peptidien syntetisoimiseksi, joissa on C-terminaa-30 linen amidiryhmä tai fr) -amino- tai tJ-guanidiinoalkyyliryh-mä, käytetään samoin Sheppard'in kuvailemaa muunneltua vä-liainehartsia. Synteesin jälkeen sivuketjujen suhteen täysin suojattu peptidi lohkaistaan hartsista ja saatetaan lopuksi reagoimaan klassisella liuossynteesillä (Lösungs-35 synthese) vastaavan amiinin tai U -aminoalkyyliamiinin tai W-guanidiinoalkyyliamiinin kanssa, jolloin mahdollisesti 94353 12 esiintyvät muut funktionaaliset ryhmät voidaan tilapäisesti suojata tunnetulla tavalla.

Edelleen eräs menetelmä w-aminoalkyyliryhmän sisältävien peptidien valmistamiseksi on kuvailtu patentti-5 hakemuksessa DE-36 35 670.0.

Tässä kuvatut peptidit syntetisoitiin etupäässä kiintofaasitekniikkaa käyttäen kahden yleisen suojaryhmä-taktiikan mukaisesti:

Synteesi tapahtui automaattisella peptidisynteti-10 saattorilla malli 430A, Applied Biosystems-yhtiö, Boc- tai Fmoc-suojaryhmiä a-aminoryhmien tilapäiseen suojaukseen käyttäen.

Boc-suojaryhmiä käytettäessä hyödynnettiin synteesissä laitteen valmistajan esiohjelmoimia synteesisykle-15 jä.

C-terminaalisessa päädyssä vapaita karboksyyliryh-miä sisältävien peptidien synteesi tapahtui vastaavalla Boc-aminohapolla funktionalisoidulla Applied Biosystems-yhtiön 4-(hydroksimetyyli)fenyyliasetamidometyylipolysty-20 reenihartsilla [R.B. Merrifield, J. Org. Chem. 43 (1978), s. 2845]. Peptidiamidien valmistukseen käytettiin saman yhtiön MBHA-hartsia.

Aktivointireagensseina käytettiin N,N'-disyklohek-syylikarbodi-imidiä tai N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidiä. ;25 Aktivointi tapahtui symmetrisenä anhydridinä, HOBt-esteri- nä tai HOObt-esterinä CH2Cl2:ssa, CH2Cl2/DMF-seoksessa tai MNPrssä. Kytkentään käytettiin 2-4 ekvivalenttia aktivoitua aminohappojohdannaista. Mikäli kytkentä tapahtui epätäydellisestä, reaktio toistettiin.

30 Käytettäessä tilapäiseen suojaukseen Fmoc-suojaryh- ·.: miä käytettiin synteesiin automaattisella peptidisynteti- saattorilla malli 430A, Applied Biosystems-yhtiö, omaa synteesiohjelmaa. Synteesi tapahtui Bachem-yhtiön p-bent-syylioksibentsyylialkoholihartsilla (S. Wang, J. Am. Chem. 35 Soc. 95 (1973) s. 1328), joka oli esteröity tunnetulla menetelmällä (E. Atherton et ai., J. C. S. Chem. comm. 1981 li 13 94353 s. 336) vastaalla aminohapolla. Aminohappojohdannaisen aktivointi HOBt- tai HOObt-esterinä tapahtui suoraan laitteen valmistajan toimittamissa aminohappokaseteissa lisäämällä etukäteen punnittujen aminohappojohdannaisen ja 5 HOBt:n tai H00bt:n seokseen di-isopropyylikarbodi-imidin liuosta DMFrssä. Samoin saatettiin käyttää väliaineessa valmistettua Fmoc-aminohappo-OObt-esteriä patenttihakemuksessa EP-87107634.5 kuvaillulla tavalla. Fmoc-suojaryhmän lohkaisu tapahtui 20-% piperidiini/DMF-liuoksella reaktio-10 astiassa. Käytetty reaktiivisen aminohappojohdannaisen ylimäärä oli 1,5 - 2,5 ekvivalenttia. Mikäli kytkentä ei ollut täydellinen, se toistettiin Boc-menetelmällä.

Keksinnön mukaisesti valmistetuilla peptideillä on yksinään tai yhdistelmänä bradykiniinille vastakkainen 15 vaikutus, joka voidaan testata erilaisilla malleilla (katso Handbook of Exp. Pharmacol. Osa 25, Springer Verlag, 1970, s. 53 - 55), esimerkiksi eristetyllä rotan kohdulla, marsun sykkyräsuolella tai eristetyllä marsun keuhkovalti-; molla.

« '20 Keksinnön mukaisesti valmistetuilla peptidien tes taamiseksi eristetyillä keuhkovaltimoilla 400 - 450 g painoiset marsut (Dunkin Hartley) tapettiin niskalyönnillä.

Rintakehä avattiin ja keuhkovaltimo otettiin varovasti esille. Ympäröivä kudos poistettiin huolellisesti ja •25 keuhkovaltimo leikattiin 45° kulmassa spiraalimaiseksi.

2,5 cm pitkä ja 3 - 4 mm leveä suonisuikale kiinnitettiin 10-ml Ringer-liuoksella täytettyyn elinhauteeseen. Liuoksen koostumus, mmol/1 NaCl 154 30 KC1 5,6

CaCl2 1,9

NaHCOj 2,4 glukoosi 5,0

Liuosta ilmastettiin 95 %:lla ja 5 % C02:lla ja läm-35 mitettiin 37 eC:een. pH-arvo oli 7,4, suonisuikaleisiin kohdistettu alkukuorma oli 1,0 g.

94353 14

Isotoniset supistumismuutokset otettiin Hugo Sachs'in vipulaitteella ja HF-modeemilla (etäisyysmittari) ja rekisteröitiin tasauspiirturilla (BEC, Goerz Metrawatt SE 460).

5 Kokeet aloitettiin 1 tunnin tasapainotuksen jäl keen. Kun suonisuikaleet olivat saavuttaneet maksimiherk-kyytensä 2 x 10'7 mol/1 bradykiniiniin nähden - bradykinii-ni johtaa suonisuikaleiden supistumiseen - annettiin peptidien kulloinkin vaikuttaa annoksina 5 x 10*8 - 1 x 10'5 10 mol/1 ja verrattiin uudistetun bradykiniinin annon jälkeen bradykiniinin vaikutusta kontrolliin verrattuna.

Osittaisen vastakkaisen vaikutuksen tunnistamiseksi peptidejä käytettiin annostuksella 1 x 10*5 - 1 x 10"3 mol/1.

15 Annos/vaste-käyristä saadut keksinnön mukaisesti valmitettujen peptidien IC50-arvot on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1 •20 Yhdiste IC50 [M] H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic- 4,6 · 10*6

Phe-Arg-OH

H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic- 2,1 · 10'6

Thia-Arg-OH

•2b H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tie- 1,2 · 10*5

Phe-Arg-OH

H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Glo-(D)-Tie- 2,4 · 10‘5

Phe-Arg-OH

H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic- 2,5 · 10~5

30 Phe-Arg(Mtr)-OH

H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic- 2,5 ♦ 10'7

Pro-Arg-OH

H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic- 1,9 ♦ 10"7

Pro-Arg-OH

35 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic- 5,6 · 10-8

Aoc-^rg-OH

94353 15 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-8-Ala- 1,7 · ΙΟ'6

(D)-Tic-Aoc-Arg-OH

H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-Gly- 3,9 · 10'7

(D)-Tic-Aoc-Arg-OH

5 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Gly-(D)-Tic- 3,2 · 10'7

(D,L)-Oic-Arg-OH

H-(D)-Arg-(D)-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)- 4,8 · 10'7

Tic-Aoc-Arg-OH

H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic- 1,7 · 10'7

10 Tic-Arg-OH

H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic- 1,1 · 10'8

Aoc-Arg-OH

H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic- 4,6 · 10'8

Aoc-Arg-OH

15 H-(D)-Tyr-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic- 6,2 · 10'8

Aoc-Arg-OH

H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic- 2,6 · 10'5

(D)-OiC-Arg-OH

: H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic- 5,4 · 10'9 «

20 Oic-Arg-OH

H-(D)-Arg-Lys-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic- 3,2 · 10'7

Aoc-Arg-OH

H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic- 6,8 · 10'9

Oic-Arg-OH

• 25 H-(D)-Arg-Arg-(N02)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)- 6,4 · 10~8

Tic-Aoc-Arg-OH

H-(D)-Arg-Arg-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic- 4,2 · 10'9

Oic-Arg-OH

H-(D)-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic- 3,4 · 10'7

30 Arg-OH

H-Arg-(Tos)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic- 3,0 · 10'8

Dic-Arg-OH

H-Arg-(Tos)-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic- 1,8 · 10'8

Dic-Arg-OH

35 Keksinnön mukaisesti valmistettujen peptidien tera peuttinen hyödyntäminen käsittää kaikki bradykiniinin tai 94353 16 bradykiniinin sukuisten peptidien välittämät, aiheuttamat ja ylläpitämät tilat. Nämä käsittävät muun muassa vauriot kuten haavat, palovammat, ihottumat, punoittumat, vesipö-hön, kurkkutulehduksen, niveltulehduksen, astman, aller-5 giat, riniitin, shokin, tulehdukset, alhaisen verenpaineen, kivun, syyhykiihotuksen ja heikentyneen sperman 1i ikkuvuuden.

Näitä yhdisteitä sisältävät farmaseuttiset valmisteet sisältävät vaikuttavan määrän kaavan I mukaista lää-10 keainetta - yksinään tai yhdistelmänä - yhdessä epäorgaanisen tai orgaanisen farmaseuttisesti hyväksyttävän väliaineen kanssa.

Käyttö voi tapahtua enteraalisesti, parenteraali-sesti - kuten esimerkiksi ihonalaisesti, lihaksensisäi-15 sesti tai laskimonsisäisesti -, kielen alle, iholle, nenään, peräaukkoon, emättimeen, poskeen tai sisäänhengitet-tynä. Lääkeaineen annostelu riippuu lämminverisen eläimen lajista, kehonpainosta, iästä ja antotavasta.

Sopiva annosalue paikallisesti ja sisäänhengitetty-20 nä annettuna käytettäviin muotoihin ovat liuokset, jotka sisältävät 0,01 - 5 mg/ml, ja systeemiseen verenkiertoon tarkoitetuissa antomuodoissa ovat sopivia annokset 0,01 -10 mg/kg.

Lyhenteiden selitykset 25 Aminohapoille käytetyt lyhenteet vastaavat peptidi- kemiassa tavanomaisia kolmikirjaimisia merkkejä julkaisussa Europ. J. Biochem. 138 (1984) s. 9 kuvaillulla tavalla. Muut käytetyt lyhenteet esitetään seuraavassa luettelossa. Acm asetamidometyyli 30 6-Ahx 6-aminoheksanoyyli . Aoc cis, endo-2-atsabisyklo[3.3.0]oktaani-3-S-kar- bonyyli

Boc tert-butyylioksikarbonyyli

But tert-butyyli 35 Bzl bentsyyli

Cl-Z 4-klooribentsyylioksikarbonyyli 94353 17 DMF dimetyyliformamidi

Dnp 2,4-dinitrofenyyli

Fmoc 9-f luorenyylimetyylioks.ikarbonyyli

Me metyyli 5 4-Mebzl 4-metyylibentsyyli

Mt.r 4-metoksi-2,3,6-trimetyylifenyylisulfonyyli

Mts mesityleeni-2-sulfonyyli NMP N-metyylipyrrolidiini

Oic ci s-endo-oktahydroindoli-2-karbonyyli 10 Opr isoksatsolidin-3-yylikarbonyyli

Pmc 2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6-sulfonyyli TFA trifluorietikkahappo

Tcs 4-metyylifenyylisulfonyyli

Thia 2-tienyyl±alanyyli 15 Tic 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-3-yylikarbonyyli

Trt trityyli

Seuraavissa esimerkeissä esitetään edullisia menetelmiä keksinnön mukaisesti peptidien kiintofaasisyntee-siin.

*20 Käytettiin seuraavia aminohappojohdannaisia:

Fmoc-Arg(Mtr)-0H, Boc-(D)-Arg-0H, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Hyp-OH, Fmoc-Pro-00bt, Fmoc-Gly-OObt, Fmoc-Phe-OObt, Fmoc-Ser(tBu)-00bt, Fmoc-(D)-Tic-0H, Fmoc-Gln-0H, Fmoc-Aoc-OH, Fmoc-Thia-OH, Fmoc-0pr-0H, Fmoc-(D)-Asn-OH, Fmoc-B-Ala-25 OH, Fmoc-0ic-0H.

Esimerkki 1 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Phe-Arg-OH valmistettiin vaiheittain peptidisyntetisaattorilla malli 430 A, Applied Biosystems-yhtiö, Fmoc-menetelmää 30 käyttäen Novabiochem-yhtiön Fmoc-Arg(Mtr)-OH:lla esteröi- dyllä p-bentsyylioksibentsyylialkoholihartsilla (panostus • · noin 0,5 mmol/g hartsia). Hartsia käytettiin 1 g ja synteesi suoritettiin Fmoc-menetelmälle muunnellun synteesi-ohjelman avulla.

35 Syntetisaattorin kasetteihin punnittiin kulloinkin 1 mmol vapaita karboksyyliryhmiä sisältäviä aminohappojoh- 94353 18 dannaisia yhdessä 0,95 mmol H00bt:n kanssa. Näiden aminohappojen esiaktivointi tapahtui suoraan kaseteissa liuottamalla 4 ml:aan DMF:ää ja lisäämällä 2 ml di-isopropyyli-karbodi-imidin 0,55-mol DMF-liuosta. Toisten aminohappojen 5 HOObt-esterit liuotettiin 6 ml:aan NMP:tä ja kytkettiin sitten ennalta 20-% piperidiini/DMF:llä suojaryhmistä vapautettuun hartsiin samoin kuin in situ esiaktivoidut aminohapot. Loppuun saatetun synteesin jälkeen peptidi lohkaistiin hartsista samanaikaisella sivuketjujen suojaryh-10 mien poistolla trifluorietikkahapolla käyttäen tioanisolia tai etaaniditiolia kationinsieppaajana. Trifluorietikkaha-pon poistamisen jälkeen saatu jäännös uutettiin useita kertoja etikkaesterillä ja sentrifugoitiin. Jäljelle jäänyt jäännös kromatografoitiin ®Sephadex LH 20:11a 10-% 15 etikkahapolla. Puhtaan peptidin sisältämät jakeet yhdistettiin ja pakastekuivattiin.

MS(FAB): 1294 (M+H)

Seuraavien esimerkkien 2-24 peptidit valmistettiin ja puhdistettiin samalla tavalla.

* 20 Esimerkki 2 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-(D)-Ser-(D)-Tic-Phe-Arg-0H, MS(FAB): 1294 (M+H)

Esimerkki 3 H- (D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Thia-25 Arg-OH, MS(FAB): 1306 (M+H)

Esimerkki 4 H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Phe-Arg-0H, MS(FAB): 1294 (M+H)

Esimerkki 5 30 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Gln-(D)-Tic-Phe-Arg- OH, MS(FAB): 1335 (M+H) ·

Esimerkki 6 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Pro-Arg-OH, MS(FAB): 1244 (M+H) 35 Esimerkki 7 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Trp-(D)-Tic-Phe-Arg-0H, MS(FAB): 1393 (M+H) 94353 19

Esimerkki 8 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Pro-Arg-OH, MS(FAB): 1250 (M+H)

Esimerkki 9 5 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-(D)-Asn-(D)-Tic-

Thia-Arg-OH, MS(FAB): 1333 (M+H)

Esimerkki 10 H- ( D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Opr-(D)-Tic-Thia-Arg-OH, MS(FAB): 1301 (M+H) 10 Esimerkki 11 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-(D)-Gln-(D)-Tic-Thia-Arg-OH, MS(FAB): 1347 (M+H)

Esimerkki 12 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-Gly- (D) -Tic-Pro-15 Arg-OH, MS(FAB): 1307 (M+H)

Esimerkki 13 H- (D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Pro-Phe-OH, MS(FAB): 1241 (M+H) .· Esimerkki 14 20 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Pro-Phe-

Arg-OH, MS(FAB): 1397 (M+H)

Esimerkki 15 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-S-Ala- (D) -Tic-Pro-Arg-OH, MS(FAB): 1321 (M+H) 25 Esimerkki 16 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Gly- (D) -Tic-Pro-Arg-OH, MS(FAB): 1220 (M+H)

Esimerkki 17 H - (D)-Arg-Arg-Aoc-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Thia-30 Arg-OH, MS(FAB): 1330 (M+H)

Esimerkki 18 t ♦ ' H-(D)-Arg-Arg-Pro-Aoc-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Thia-Arg-OH, MS(FAB): 1330 (M+H)

Esimerkki 19 35 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Aoc-Arg- OH, MS(FAB): 1290 (M+H) 94353 20

Esimerkki 20 H- (D) -Arg-Arg-Opr-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Pro-Arg-OH, MS(FAB): 1236 (M+H)

Esimerkki 21 5 H- (D ) - Arg-Arg-Pro-Opr-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Pro-Arg- OH, MS(FAB): 1236 (M+H)

Esimerkki 22 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Opr-Arg-0H, MS(FAB): 1252 (M+H) 10 Esimerkki 23 H- (D) -Arg- (D) -Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1290 (M+H)

Esimerkki 24 H- (D) -Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Aoc-Arg-15 OH, MS(FAB): 1290 (M+H)

Esimerkit 25 - 27 H- (D) - Arg-Arg (Mtr)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser- (D)-Tic-Phe-

Arg-0H, H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Phe- . . Arg(Mtr)-0H ja H-(D)-Arg-Arg(Mtr)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)- • « 20 Tic-Phe-Arg(Mtr)-OH valmistettiin esimerkin 1 tavalla, jolloin siviketjujen suojaryhmien lohkaisu ja peptidin lohkaisu hartsista trifluorietikkahapolla rajoitettiin 30 minuuttiin huoneenlämpötilassa. Näin valituissa olosuhteissa tapahtuu vain olematonta Arginiinin Mtr-suojaryh-25 mien lohkeamista. Osittain suojaryhmistään vapautetut pep tidit voidaan erottaa ja puhdistaa käänteisfaasimateriaa-lilla kromatografoimalla.

25: H-(D)-Arg-Arg(Mtr)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Phe-

Arg-OH, MS(FAB): 1506 (M+H) 30 26: H-(D)-Arg-Arg(Mtr)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Phe-

Arg(Mtr)-OH, MS(FAB): 1718 (M+H) 27: H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Phe-

Arg(Mtr)-OH, MS(FAB): 1506 (M+H)

Seuraavien esimerkkien 28-31 peptidit valmistet-35 tiin ja puhdistettiin esimerkkien 25 - 27 tavalla.

94353 21

Esimerkki 28 H- (D)-Arg-Arg(Mtr)-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Pro-Arg-OH, MS(FAB): 1462 (M+H)

Esimerkki 29 5 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Pro-

Arg(Mtr)-OH, MS(FAB): 1462 (M+H)

Esimerkki 30 H- ( D)-Arg-Arg(Mtr)-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Pro-Phe-OH, MS(FAB): 1453 (M+H) 10 Esimerkki 31 H - ( D)-Arg-Arg(Mtr)-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1502 (M+H)

Esimerkki 32 H-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D) -Tic-Phe-NH- (CH2 )4-NH2. 15 Peptidisynteesi suoritettiin 1 g: 11a aminor.ietyyli- hartsia, joka oli muunneltu patenttijulkaisun EP-264 802 kuvailemalla kiinnitysryhmällä ^c=c\ 20 Fmoc-NH-(CH2)4-NH-C0-0-CH2-C 'C-0-CH2-C0- ^^c-cr käyttäen Fmoc-aminohappo-OObt-estereitä automaattisella peptidisyntetisaattorilla (malli 430A, Applied Biosystems-25 yhtiö) ja itse muunnellulla synteesiohjelmalla. Tätä varten punnittiin kulloinkin 1 mmol vastaavaa aminohappojohdannaista laitteen valmistajan toimittamiin kasetteihin, Fmoc-Arg(Mtr)-0H, Fmoc-Hyp-OH ja Fmoc-(D)-Tic-OH punnittiin yhdessä 0,95 mmol HOObtrn kanssa kasetteihin. Näiden 30 aminohappojen in situ esiaktivointi tapahtui suoraan kaseteissa liuottamalla 4 ml:aan DMF:ää ja lisäämällä 2 ml di- • · isopropyylikarbodi-imidin 0,55 M liuosta DMFrssä. Toisten aminohappojen HOObt-esterit liuotettiin 6 ml:aan NMP:tä ja ja kytkettiin sitten ennalta 20-% piperidiini/DMF:llä suo-35 jaryhmistä vapautettuun hartsiin samoin kuin in situ esi-aktivoidut aminohapot, jolloin in situ aktivoidut aminoha- 94353 22 pot tulivat kahdesti kytketyiksi. Loppuun saatetun synteesin jälkeen peptidi-4-aminobutyyliamidi lohkaistiin hartsista samanaikaisella sivuketjujen suojaryhmien poistolla trifluorietikkahapolla, joka sisälsi tioanisolia ja 5 m-kresolia kationinsieppaajana. Trifluorietikkahapon pois tamisen jälkeen saatu jäännös uutettiin useita kertoja etikkaesterillä ja sentrifugoitiin. Jäljelle jäänyt raaka-peptidi kromatografoitiin ®Sephadex G25:llä 1 N etikkaha-polla. Puhtaan peptidin sisältämät jakeet yhdistettiin ja 10 pakastekuivattiin.

Esimerkkien 33 - 35 yhdisteet valmistettiin esimerkin 32 tavalla:

Esimerkki 33 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser- (D) -Tic-Phe-NH-15 (CH2)4-NH2.

Esimerkki 34 HOOC-(CH2 )2-CO-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser- (D) -Tic-Phe-NH-(CH2)4-NH2.

Esimerkki 35 ' 20 HOOC- (CH2) 2-C0-(D)-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-

Phe-NH- ( CH2 )4-NH2.

Esimerkkien 36 - 161 peptidit valmistettiin esimerkissä 1 kuvaillulla tavalla.

Esimerkki 36 25 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-Gly- (D) -Tic-Pro-

Arg-OH, MS(FAB): 1307 (M+H)

Esimerkki 37 H- (D) -Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-Gly- (D) -Tic-Pro-Arg-OH, MS(FAB): 1307 (M+H) 30 Esimerkki 38 . H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Pro-Phe-

I I

OH, MS(FAB): 1241 (M+H)

Esimerkki 39 H- ( D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-S-Ala-(D)-Tic-35 Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1361 (M+H) 94353 23

Esimerkki 40 H- (D) -Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-β-Ala- (D )-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1361 (M+H)

Esimerkki 41 5 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Pro-Phe-

Arg-OH, MS(FAB): 1397 (M+H)

Esimerkki 42 H- (D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Pro-Phe-Arg-OH, MS(FAB): 1397 (M+H) 10 Esimerkki 43 H- (D) -Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Gly-(D) -Tic-Aoc-Arg-0H, MS(FAB): 1260 (M+H)

Esimerkki 44 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Gly- (D) -Tic-Aoc-Arg-15 OH, MS(FAB): 1260 (M+H)

Esimerkki 45 H- (D) -Arg- (D) -Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1290 (M+H)

Esimerkki 46 '20 H- (D) -Arg- (D) -Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D)-Tic-Aoc-

Arg-OH, MS(FAB): 1290 (M+H)

Esimerkki 47 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Tic-Arg-OH, MS(FAB): 1312 (M+H) 25 Esimerkki 48 H- (D) -Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Tic-Arg-OH, MS(FAB): 1312 (M+H)

Esimerkki 49 H- (D)-Arg-Arg-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Aoc-Arg-30 OH, MS(FAB): 1274 (M+H)

Esimerkki 50 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-(D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1203 (M+H)

Esimerkki 51 35 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Aoc-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg- OH, MS(FAB): 1274 (M+H) 94353 24

Esimerkki 52 H- (D) -Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-B-Ala- ( D ) -Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1274 (M+H)

Esimerkki 53 5 H- (D) -Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-B-Ala- ( D ) -Tic-Aoc-

Arg-OH, MS(FAB): 1274 (M+H)

Esimerkki 54 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Asp-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1252 (M+H) 10 Esimerkki 55 H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Asp-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-0H, MS(FAB): 1252 (M+H)

Esimerkki 56 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Trp-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-15 OH, MS(FAB): 1323,7 (M+H)

Esimerkki 57 H- (D) -Tyr-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Aoc-Arg-0H, MS(FAB): 1297,7 (M+H) . Esimerkki 58 20 H- (D) -Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic- (D) -Oic-

Arg-OH, MS(FAB): 1304,6 (M+H)

Esimerkki 59 H- (D) - Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1304,6 (M+H) 25 Esimerkki 60 H- (D) - Arg-Arg-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Oio-Arg-OH, MS(FAB): 1289 (M+H)

Esimerkki 61 H- (D) -Arg-Lys-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-( D)-Tic-Aoc-Arg-30 OH, MS(FAB): 1262 (M+H)

Esimerkki 62 H- (D) -Arg- Lys-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1276 (M+H)

Esimerkki 63 35 H- (D) -Arg-Lys-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Oic-Arg- OH, MS(FAB): 1260 (M+H) 94353 25

Esimerkki 64 H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1298 (M+H)

Esimerkki 65 5 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg- OH, MS(FAB): 1298 (M+H)

Esimerkki 66 H-(D)-Arg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1282 (M+H) 10 Esimerkki 67 H- (D) -Arg-Arg(N02) -Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser- (D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1329,7 (M+H)

Esimerkki 68 H- (D) -Arg-Arg( N02) -Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser- (D) -Tic-Oic-15 Arg-OH, MS(FAB): 1343 (M+H)

Esimerkki 69 H- (D)-Arg-Arg( N02) -Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1327 (M+H) .· Esimerkki 70 20 H- (D) -Arg-Arg( N02) -Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Oic-

Arg-OH, MS(FAB): 1333 (M+H)

Esimerkki 71 H- (D) -Arg-Arg( N02) -Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1349 (M+H) 25 Esimerkki 72 H-Arg( Tos)-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1302 (M+H)

Esimerkki 73 H- (D) -Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser- (D) -Tic-Oic-Arg-OH, 30 MS(FAB): 1142 (M+H)

Esimerkki 74 * n ~ Η-Ly s( -CO-NH-C6H5) -Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser- (D) -Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1233 (M+H)

Esimerkki 75 35 H-Arg(Tos)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1296 (M+H) 26 94355

Esimerkki 76 H-Lys(nikotinoyyli ) -Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1219 (M+H)

Esimerkki 77 5 H-Arg(Tos)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(d)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1282 (M+H)

Esimerkki 78

Ac-Arg(Tos)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser- ( D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1324 (M+H) 10 Esimerkki 79 H- (D) -Arg-Arg(Tos ) - Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D) -Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1438 (M+H)

Esimerkki 80 H-Arg(Tos)-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-15 OH, MS(FAB): 1302 (M+H)

Esimerkki 81 H-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1142 (M+H) ’ : Esimerkki 82 t ~ ' — 20 H-Lys(-CO-NH-C6H5) -Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-

Arg-OH, MS(FAB): 1233 (M+H)

Esimerkki 83 H-Arg(Tos)-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1296 (M+H) 25 Esimerkki 84 H-Lys(nikotinoyyli ) -Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1219 (M+H)

Esimerkki 85 H-Arg(Tos)-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-OH, 30 MS(FAB): 1282 (M+H)

Esimerkki 86

Ac-Arg ( Tos)-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1324 (M+H)

Esimerkki 87 35 H- (D) -Arg-Arg( Tos)-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser- (D)-Tic-Aoc-

Arg-OH, MS(FAB): 1438 (M+H) 94353 27

Esimerkki 88 H-Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1286 (M+H)

Esimerkki 89 5 H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1126 (M+H)

Esimerkki 90 H-Lys(-CO-NH-C6H5)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1217 (M+H) 10 Esimerkki 91 H-Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1280 (M+H)

Esimerkki 92 H-Lys(nikotinoyyli)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-15 OiC-Arg-OH, MS(FAB): 1203 (M+H)

Esimerkki 93 H-Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1266 (M+H)

Esimerkki 94 *20 Ac-Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D) -Tic-Aoc-Arg- OH, MS(FAB): 1308 (M+H)

Esimerkki 95 H- (D) - Arg-Arg (Tos) -Pro-Pro-Gly-Phe-Ser- (D) -Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1422 (M+H) 25 Esimerkki 96 H-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- ( D) -Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1148 (M+H)

Esimerkki 97 H-Lys ( -C0-NH-C6Hs) -Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Oic-30 Arg-OH, MS(FAB): 1239 (M+H)

Esimerkki 98 %I ' ' H-Lys (nikotinoyyli)-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-

Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1225 (M+H)

Esimerkki 99 35 H-Arg( Tos)-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg- 0H, MS(FAB): 1288 (M+H) 94353 28

Esimerkki 100

Ac-Arg( Tos ) -Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- ( D) -Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1330 (M+H)

Esimerkki 101 5 H - ( D)-Arg-Arg(Tos)-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-

Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1444 (M+H)

Esimerkki 102 H-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D) - Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1148 (M+H) 10 Esimerkki 103 H-Lys( -CO-NH-C6H5) -Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1239 (M+H)

Esimerkki 104 H-Lys (nikotinoyyli) -Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-15 Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1225 (M+H)

Esimerkki 105 H-Arg( Tos)-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1288 (M+H)

Esimerkki 106 * *20 Ac-Arg (Tos ) -Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser- ( D) -Tie-Aoc-Arg- OH, MS(FAB): 1330 (M+H)

Esimerkki 107 H- (D)-Arg-Arg(Tos)-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1440 (M+H) .25 Esimerkki 108 H-Lys( -CO-NH-C6H5)-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1225 (M+H)

Esimerkki 109 H-Lys( nikotinoyyli) -Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-30 Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1209 (M+H) . Esimerkki 110 H-Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tie-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1272 (M+H)

Esimerkki 111 35 Ac-Arg( Tos ) -Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Aoc-Arg- OH, MS(FAB): 1314 (M+H) 94353 29

Esimerkki 112 H-(D)-Arg-Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1428 (M+H)

Esimerkki 113 5 H- (D) -Arg-Lys (nikotinoyyli)-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1365 (M+H)

Esimerkki 114 H- (D) -Arg-Lys ( -CO-NH-C6H5) -Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1379 (M+H) 10 Esimerkki 115 H- (D)-Arg-Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1442 (M+H)

Esimerkki 116 H-Lys-Lys (nikotinoyyli ) -Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (D ) -15 Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1337 (M+H)

Esimerkki 117 H-Lys-Lys( -CO-NH-C6H5)-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1351 (M+H)

Esimerkki 118 '20 H-Lys-Arg(Tos ) -Pro-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-

Arg-OH, MS(FAB): 1414 (M+H)

Esimerkki 119 H- (D) -Arg-Lys (nikotinoyyli ) -Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1381 (M+H) 25 Esimerkki 120 • — H- (D) -Arg-Lys(C0-NH-C6H5)-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1395 (M+H)

Esimerkki 121 H- (D)-Arg-Arg(Tos)-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-30 0ic-Arg-0H, MS(FAB): 1458 (M+H) .. Esimerkki 122 H-Lys-Lys( -C0-NH-C6H5)-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D^Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1367 (M+H)

Esimerkki 123 35 H-Lys-Lys(nikotinoyyli ) -Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D) -

Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1353 (M+H) 94353 30

Esimerkki 124 H-Lys-Arg(Tos ) -Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1430 (M+H)

Esimerkki 125 5 H-(D)-Arg-Lys(nikotinoyyli)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser- (D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1359 (M+H)

Esimerkki 126 H- (D) -Arg-Lys(-CO-NH-C6H5)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1373 (M+H) 10 Esimerkki 127 H- (D) -Arg-Arg (Tos) -Pro-Pro-Gly-Phe-Ser- (D) -Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1436 (M+H)

Esimerkki 128 H-Lys-Lys(nikotinoyyli)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-15 Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1331 (M+H)

Esimerkki 129 H-Lys-Lys(-CO-NH-C6H5)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1345 (M+H)

Esimerkki 130 '20 H-Lys-Arg (Tos) -Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg- 0H, MS(FAB): 1408 (M+H)

Esimerkki 131 H- (D)-Arg-Lys(nikotinoyyli)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1375 (M+H) 25 Esimerkki 132 H- (D)-Arg-Lys(-C0-NH-C6H5)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1389 (M+H)

Esimerkki 133 H- (D) -Arg-Arg (Tos) -Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser- (D) -Tic-Oic-30 Arg-OH, MS(FAB): 1452 (M+H) .· Esimerkki 134 H-Lys-Lys(nikotinoyyli)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser- (D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1347 (M+H)

Esimerkki 135 35 H-Lys-Lys(-C0-NH-C6H5)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-

Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1361 (M+H) 94353 31

Esimerkki 136 H-Lys-Arg ( Tos ) -Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser- (D) -Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1424 (M+H)

Esimerkki 137 5 H-(D)-Arg-Orn( nikotinoyyli ) -Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1351 (M+H)

Esimerkki 138 H- (D) -Arg-Orn( -CO-NH-C6H5) -Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (Π)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1428 (M+H) 10 Esimerkki 139 H-Lys-0rn( nikotinoyyli ) -Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1323 (M+H)

Esimerkki 140 H-Lys-0rn( -CO-NH-C6H5) -Pro-Pro-Gly-Thia-Ser- (D) -Tic-15 0ic-Arg-0H, MS(FAB): 1337 (M+H)

Esimerkki 141 H- (D ) -Arg-0rn( nikotinoyyli ) -Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1367 (M+H)

Esimerkki 142 *2C H- (D ) -Arg-0rn( -CO-NH-C6H5)-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- (D) -

Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1381 (M+H)

Esimerkki 143 H-Lys-0rn( nikotinoyyli ) -Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser- ( D) -Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1339 (M+H) .25 Esimerkki 144 H-Lys-0rn( -CO-NH-C6H5)-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1353 (M+H)

Esimerkki 145 H- ( D)-Arg-Orn(nikotinoyyli)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-30 (D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1345 (M+H) .. Esimerkki 146 H-(D)-Arg-0rn(-CO-NH-C6H5)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1359 (M+H)

Esimerkki 147 35 H-Lys-0rn( nikotinoyyli ) -Pro-Pro-Gly-Phe-Ser- (D) -

Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1317 (M+H) 94353 32

Esimerkki 148 H-Lys-Orn(-CO-NH-C6H5)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1331 (M+H)

Esimerkki 149 5 H-(D)-Arg-Orn(nikotinoyyli)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser- (D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1361 (M+H)

Esimerkki 150 H- (D) -Arg-0rn( CO-NH-C6H5) -Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser- (D) -Tic-Oic-Arg-OH, M3(FAB): 1375 (M+H) 10 Esimerkki 151 H-Lys-0rn(nikotinoyyli)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1333 (M+H)

Esimerkki 152 H-Lys-Orn(-CO-NH-C6H5)-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-15 Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1347 (M+H)

Esimerkki 153 H-Lys-Lys-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1218 (M+H)

Esimerkki 154 2C H-Lys-Lys-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1234 (M+H)

Esimerkki 155 ; H-Lys-Lys-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1234 (M+H) •25 Esimerkki 156 1 H-Lys-Lys-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser- (D) -Tic-Aoc-Arg-OH, MS(FAB): 1212 (M+H)

Esimerkki 157 H-Lys-Lys-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-( D)-Tic-Aoc-Arg-OH, 30 MS(FAB): 1228 (M+H) . Esimerkki 158 H-Lys-Lys-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1232 (M+H)

Esimerkki 159 35 H-Lys-Lys-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1248 (M+H) 94353 33

Esimerkki 160 H-Lys-Lys-Hyp-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1226 (M+H)

Esimerkki 161 5 H-Lys-Lys-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser- (D) -Tic-Oic-Arg-OH, MS(FAB): 1242 (M+H)

Esimerkkien 162 - 164 peptidit valmistettiin esimerkin 32 tavalla käyttäen patenttijulkaisussa EP-322348 kuvailtua hartsia, jolla on rakenne 10

F mec-NH OCH3 I

15 CH2 C-0

NH

CHp SO (Polystyreeni)

Esimerkki 162 H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg- NH2, MS(FAB): 1283 (M+H) 25 Esimerkki 163 • 1 H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-3er-(D)-Tic-Aoc-Arg-NH2, MS(FAB): 1283 (M+H)

Esimerkki 164 H-(D)-Arg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Aoc-Arg-30 NH2, MS(FAB): 1267 (M+H) • · 4

Claims

94353 34

1. Menetelmä kaavan I mukaisen terapeuttisesti käyttökelpoisen bradykiniiniantagonistin valmistamiseksi 5 A-B-C-E-F-K-(D)-Tic-G-M-F'-I I jossa A on ax) vety, asetyyli, propionyyli tai metyylioksikar-10 bonyyli, jossa yksi vetyatomi on mahdollisesti korvattu karboksilla, fenyylillä tai 4-hydroksifenyylillä, a2) karbamoyyli, joka on mahdollisesti substituoitu typpeen liittyneellä fenyylillä, fenyylisulfonyyli, joka on mahdollisesti substituoitu 1 tai 4 ryhmällä joukosta 15 metyyli ja metoksi tai pyridyylikarbonyyli, tai a3) kaavan II mukainen ryhmä R1 - N - CH - C - II A2 A3 & ‘20 jossa R1 on A kohdassa ax) tai a2) määritelty, R2 on vety, R3 on (C1“C^)—alkyyli, joka on mahdollisesti monosubsti-tuoitu aminolla, substituoidulla guanidiinolla tai 4-hyd-.25 roksifenyylillä, t jolloin substituoitu guanidiino on ryhmä -NH-C(NH)-NH-A, jossa A on kohdassa ax) määritelty; B on Arg, Lys, Orn, 2,4-diaminobutyroyyli tai L-homoarginiiniryhmä, jolloin sivuketjun amino- tai guani-39 diinoryhmä saattaa olla substituoitu A:11a kuten kohdassa . a:) tai a2) on kuvattu; C on kaavan lila tai Illb mukainen yhdiste G'-G'-Gly G'-NH-(CH-) -CO « n

35 Ula Illb, 94353 35 jolloin G' :t ovat toisistaan riippumatta kaavan IV mukaisia ryhmiä

5 R4 R5 O IV I i " - N - CH - C jossa R4 ja R5 muodostavat yhdessä atomien kanssa, joihin ne ovat kiinnittyneet, heterosyklisen mono-, di- tai trisyklisen 10 rengasjärjestelmän, jossa on 2 - 15 C-atomia ja n on 2-8; E on fenyylialaniiniryhmä, joka mahdollisesti on substituoitu halogeenilla 2-, 3- tai 4-asemassa, tyrosii-ni, O-metyylityrosiini, 2-tienyylialaniini, 2-pyridyyli-15 alaniini tai naftyylialaniini; F on Ser, Hser, Lys, Leu, Vai, Nle, Ile Thr tai on suora sidos; (D)-Tic on kaavan V mukainen ryhmä;

20. O CCi^ G on kuten edellä määritelty G' tai on suora sidos; .25 F’ on emäksinen aminohapporyhmä Arg tai Lys L- tai D-muodossa tai suora sidos, jolloin sivuketjun guanidiino-tai aminoryhmä saattaa olla substituoitu Ailia, kuten kohdassa a1) tai a2) on määritelty, tai on ryhmä -NH-(CH2)n-, jolloin n = 2 - 8, 30. on -OH, -NH2 tai -NHC2H5, ... K on ryhmä -NH-(CH2)X-C0-, jossa x = 1 - 4, tai suo ra sidos, ja M on kuten F, ja sen fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistami-35 seksi, 94353 36 tunnettu siitä, että a) osa, jossa on vapaa C-terminaalinen karboksyyli-ryhmä tai sen aktivoitu johdannainen, saatetaan reagoimaan vastaavan osan kanssa, jossa on vapaa N-terminaalinen ami- 5 noryhmä, tai b) peptidi rakennetaan vaiheittain kiinteäfaasime-netelmän mukaisesti, (a): n tai (b):n mukaan saadusta yhdisteestä lohkaistaan mahdollisesti yksi tai useampia muiden funktio-10 naalisten ryhmien suojaksi väliaikaisesti kiinnitettyjä suojaryhmiä ja näin saadut kaavan I mukaiset yhdisteet mahdollisesti muutetaan fysiologisesti hyväksyttävien suolojen muotoon.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa B on Arg, Orn tai Lys, jolloin sivuketjun guanidii-noryhmä tai aminoryhmä on substituoimaton tai substituoitu 4-hydroksifenyylipropionyylillä, pyridyylikarbonyylillä tai fenyylisulfonyylillä, jolloin fenyylisulfonyyliryhmä *20 saattaa mahdollisesti olla substituoitu kohdassa a2) kuvaillulla tavalla 1 tai 4 samalla tai erilaisella ryhmällä; E on fenyylialaniini, 2-kloorifenyylialaniini, 3-kloorifenyylialaniini, 4-kloorifenyylialaniini, 2-fluori-•25 fenyylialaniini, 3-fluorifenyylialaniini, 4-fluorifenyyli- * alaniini, tyrosiini, O-metyylityrosiini tai B-(2-tienyy- li)alaniini; ja K on suora sidos; ja M on suora sidos.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa 1 A on vety, (D)- tai (L)-H-Arg, (D)- tai (L)-H-Lys tai (D)- tai (L)-H-Orn; B on Arg, Orn tai Lys, jolloin sivuketjun guani-35 diinoryhmä tai aminoryhmä saattaa olla substituoitu vedyl- 94353 37 lä, 4-hydroksifenyylipropionyylillä, pyridyylikarbonyylil-lä tai fenyylisulfonyylillä, jolloin fenyylisulfonyyliryh-mä saattaa mahdollisesti olla substituoitu 1 tai 4 samanlaisella tai erilaisella ryhmällä joukosta metyyli ja me-5 toksi; C on Pro-Pro-Gly, Hyp-Pro-Gly tai Pro-Hyp-Gly; E on Phe tai Thia; F on Ser, Hser, Lys, Leu, Vai, Nle, Ile tai Thr; K on suora sidos; 10. on suora sidos; G on kaavan IV mukainen heterosyklinen rengasjär-jestelmäryhmä, jolloin heterosykliset ryhmät ovat pyrroli-diini (A); piperidiini (B); tetrahydroisokinoliini (C); cis- tai trans-dekahydroisokinoliini (D); cis-endo-okta-15 hydroindoli (E), cis-ekso-oktahydroindoli (E), trans-okta- hydroindoli (E), cis-endo-, cis-ekso-, tai trans-oktahyd-rosyklopentano[b]pyrroli (F); tai hydroksiproliini (V); F' on Arg; ja I on OH.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, H-(D)-Arg-Arg-Pro-Pro-Gly-Thia-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH,

2. H-(D)-Arg-Arg-Kyp-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH, tai c H-(D)-Arg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH. t 94353 38