CN1056105A

CN1056105A - 有舒缓激肽拮抗作用的肽

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Publication number: CN1056105A
Application number: CN91102638A
Authority: CN
Inventors: 吉哈德·伯里佛尔; 斯狄芬·霍克; 约克·诺尔; 伯尔那德·斯霍克司; 弗兰茨·霍克
Original assignee: Hechester Jsc
Current assignee: Hechester Jsc; Hoechst AG
Priority date: 1990-04-26
Filing date: 1991-04-25
Publication date: 1991-11-13
Anticipated expiration: 2006-04-25
Also published as: PT97466A; EP0455133B1; HU208028B; JP2552402B2; ATE149519T1; GR3023172T3; HK1006843A1; FI911978A; CS9101165A2; IL97944A; NO911649L; AU7530491A; RU2056432C1; EP0455133A3; CA2041268C; LV10290B; NZ237928A; CN1034416C; ZA913121B; DE59108573D1

Abstract

公开了具有舒缓激肽拮抗作用的式I的肽：

A-B-C-E-F-K-(D)-TiC-G-M-F′-I(I)

其中各符号的定义详见说明书。

它们的治疗应用包括所有由舒缓激肽或舒缓激肽相关肽介导、诱导或促成的病理状态。可按已知的肽合成方法制备式I的肽。

Description

本发明涉及有舒缓激肽拮抗作用的肽及其制备方法。

国际专利WO86/07263号中描述了舒缓激肽的拮抗肽，特征是肽激素舒缓激肽或其他舒缓激肽类似物之位置7中的L-Pro被D-氨基酸如D-Phe、D-Thia、D-Pal CDF、N-Nal、MDY、D-Phg、D-His、D-Trp、D-Tyr、D-hPhe、D-Val、D-Ala、D-His、D-Ile、D-Leu和DOMT所取代。

本发明的目的是找到有拮抗舒缓激肽之作用的新的活性肽。

这一目的是借助制得有下列式Ⅰ的肽及其生理上可耐受的盐而实现的：

A-B-C-E-F-K-（D）-Tic-G-M-F′-I （Ⅰ）

其中

A是a1）氢、（C₁-C₈）-烷基、（C₁-C₈）-链烷酰基、（C₁-C₈）-烷氧基碳酰基或（C₁-C₈）-烷基磺酰，其中每个基团中的1、2或3个氢原子可被1、2或3个相同或不同的下列残基所取代;

羧基、氨基、（C₁-C₄）-烷基、（C₁-C₄）-烷基氨基、羟基、（C₁-C₄）-烷氧基、卤素、二-（C₁-C₄）-烷基氨基、氨基甲酰、氨磺酰、（C₁-C₄）-烷氧基碳酰、（C₆-C₁₂）-芳基和（C₆-C₁₂）-芳基-（C₁-C₅）-烷基;

或其中每个基团的1个氢原子可被选自下列的残基所取代：（C₃-C₈）-环烷基、（C₁-C₄）-烷基磺酰、（C₁-C₄）-烷基亚磺酰、（C₆-C₁₂）-芳基-（C₁-C₄）-烷基磺酰、（C₆-C₁₂）-芳基-（C₁-C₄）-烷基亚磺酰、（C₆-C₁₂）-芳氧基、（C₃-C₉）-杂芳基和（C₃-C₉）-杂芳氧基，且

1或2个碳原子被选自下列的1或2个相同或不同的残基所取代：

羧基、氨基、（C₁-C₄）-烷基氨基、羟基、（C₁-C₄）-烷氧基、卤素、二-（C₁-C₄）-烷基氨基、氨基甲酰、氨磺酰、（C₁-C₄）-烷氧基羰基、（C₆-C₁₂）-芳基和（C₆-C₁₂）-芳基-（C₁-C₅）-烷基，

a2）（C₃-C₈）-环烷基、可在氮原子上被（C₁-C₆）-烷基或（C₆-C₁₂）-芳基取代的氨基甲酰、（C₆-C₁₂）-芳基、（C₇-C₁₃）-芳酰基、（C₆-C₁₂）-芳基磺酰、（C₃-C₉）-杂芳基或（C₃-C₉）-杂芳酰基，

其中a1）和a2）下限定的每个残基，芳基、杂芳基、芳酰基、烷基磺酰基和杂芳酰基均可被选自下列的1、2、3或4个相同或不同的残基所取代：

羧基、氨基、硝基、（C₁-C₄）-烷基氨基、羟基、（C₁-C₄）-烷基、（C₁-C₄）-烷氧基、卤素、氰基、二-（C₁-C₄）-烷基氨基、氨基甲酰、氨磺酰和（C₁-C₄）-烷氧基碳酰取代，或

a3）有下列式Ⅱ的残基

其中R′定义同a1）或a2）下限定的A，

R²是氢或甲基，

R³是氢或

可被氨基、被取代的氨基、羟基、羧基、氨基甲酰、胍基、被取代的胍基、脲基、巯基、甲硫基、苯基、4-氯苯基、4-氟苯基、4-硝基苯基、4-甲氧苯基、4-羟苯基、苯二甲酰亚氨基、4-咪唑基、3-吲哚基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基或环己基单取代的（C₁-C₆）-烷基、且最好是（C₁-C₄）-烷基，其中被取代的氨基是-NH-A，且被取代的胍基是-NH-C（NH）-NH-A;

式中A同a）和a）下定义的A，

B是呈L或D构型、且可在侧链中被取代的碱性氨基酸;

C是式Ⅲa或Ⅲb的连接臂

G′-G′-Gly G′-NH-（CH₂）n-CO

（Ⅲa）（Ⅲb）

其中G′分别独自是式Ⅳ的残基

式中R⁴和R⁵与携带它们的原子一起形成有2-5个碳原子的杂环单、双或三环体系，且n是2至8;

E是中性、酸性或碱性脂族或脂环-脂族氨基酸残基;

F各自是可在侧链中被取代的中性、酸性或碱性脂族或芳族氨基酸的残基，或者是直接键;

（D）-Tic是下列式Ⅴ的残基：

G定义同上述G′，或者是一直接键;

F′定义同F，是其中n为2至8的残基-NH-（CH₂）n-

或者当G不是直接键时其可为一直接键，且

I是-OH、-NH₂或-NHC₂H₅，

K是其中X＝1至4的残基-NH-（CH₂）x-CO-，或者是一直接键，且

M定义同F，

除特别指出者外，没有立体描述符号的氨基酸残基之缩写符号均代表L型残基（参见Schrǒder，Lübke，The Peptides，Volume I，New York 1965，pages ⅩⅫ-ⅩⅩⅢ;Houben-Weyl，Methoden der Organischen Chemie（Methods of Organic Chemistry），Volume ⅩⅤ/1 and 2，Stuttgart 1974），

如：

Aad，Abu，γAbu，ABz，2ABz，εAca，Ach，Acp，Adpd，Ahb，

Aib，βAib，Ala，βAla，ΔAla，Alg，All，Ama，Amt，Ape，Apm，

Apr，Arg，Asn，Asp，Asu，Aze，Azi，Bai，Bph，Can，Cit，

Cys，Cyta，Daad，Dab，Dadd，Dap，Dapm，Dasu，Djen，Dpa，

Dtc，Fel，Gln，Glu，Gly，Guv，hAla，hArg，hCys，hGln，

hGlu，His，hIle，hLeu，hLys，hMet，hPhe，hPro，hSer，

hThr，hTrp，hTyr，Hyl，Hyp，3Hyp，Ile，Ise，Iva，Kyn，

Lant，Lcn，Leu，Lsg，Lys，βLys，ΔLys，Met，Mim，Min，

nArg，Nle，Nva，Oly，Orn，Pan，Pec，Pen，Phe，Phg，Pic，

Pro，ΔPro，Pse，Pya，Pyr，Pza，Qin，Ros，Sar，Sec，Sem，

Ser，Thi，βThi，Thr，Thy，Thx，Tia，Tle，Tly，Trp，Trta，

Tyr，Val.

适于作为式Ⅳ之杂环体系的残基，具体的是选自下列化合物的杂环残基：吡咯烷-2-羧酸;哌啶-2-羧酸;1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸;十氢化异喹啉-3-羧酸;八氢化吲哚-2-羧酸;十氢化喹啉-2-羧酸;八氢化环戊〔b〕吡咯-2-羧酸;2-氮杂双环〔2，2，2〕辛烷-3-羧酸;2-氮杂双环〔2，2，1〕庚烷-3-羧酸;2-氮杂双环〔3，1，0〕己烷-3-羧酸;2-氮杂螺〔4，4〕壬烷-3-羧酸;2-氮杂螺〔4，5〕癸烷-3-羧酸;螺〔（双环〔2，2，1〕庚烷）-2，3-吡咯烷-5-羧酸〕;螺〔（双环〔2，2，2〕辛烷）-2，3-吡咯烷-5-羧酸〕;2-氮杂环〔4，3，0，1^6，9〕癸烷-3-羧酸;十氢化芳庚并〔b〕吡咯-2-羧酸;十氢化环芳辛并〔b〕吡咯-2-羧酸;八氢化芳庚并〔c〕吡咯-2-羧酸;八氢化异吲哚-1-羧酸;2，3，3a，4，6a-六氢化芳庚并〔b〕吡咯-2-羧酸;2，3，3a，4，5，7a-六氢化吲哚-2-羧酸;四氢化噻唑-3-羧酸;吡唑烷-3-羧酸;羟基脯氢酸-2-羧酸;它们均可被取代;

文献中已公开了形成上述残基的杂环，如

US-A 4，344，949，US-A 4，374，847，US-A 4，350，704，

EP-A 29 488，EP-A 31 741，EP-A 46 953，EP-A 49 605，

EP-A 49 658，EP-A 50 800，EP-A 51 020，EP-A 52 870，

EP-A 79 022，EP-A 84 164，EP-A 89 637，EP-A 90 341，

EP-A 90 362，EP-A 105 102，EP-A 109 020，EP-A 111 873，

EP-A 271 865 and EP-A 344 682.

除在特定例子中指出者外，烷基均可以是直链或分支的。相当情况也适用于由其衍生的残基，如烷氧基、芳烷基或链烷酰基。

（C₆-C₁₂）-芳基最好是苯基、萘基或联苯基。由之衍生的残基，如芳氧基、芳烷基或芳酰基，均可作相当地限定。

卤素是氟、氯、溴或碘，且最好是氯。

特别适用的盐是碱金属盐或碱土金属盐，与生理上可耐受的胺形成的盐和与无机或有机酸如HCl、BBr、H₂SO₄、H₃PO₄、马来酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸及乙酸形成的盐。

优选的式Ⅰ肽是其中

B是Arq、Lys、Orn、2，4-二氨基丁酰或L-高精氨酸残基，其中每一个残基之侧链的氨基或胍基基团均可被a1）或a2）下限定的A所取代;

E是呈L或D构型并在侧链上含有1到14个碳原子的脂族或脂环-脂族氨基酸残基;如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、O-（C₁-C₆）-烷基-或O-（C₆-C₁₀）-芳基被保护的丝氨酸或苏氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、新戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或（C₃-C₇）-环烷基（C₁-C₃）-烷基甘氨酸;

F′是呈L或D构型的碱性氨基酸残基，如Arq或Lys，其中侧链的胍基或氨基基团可被a1）或a2）下描述的A取代，或者是其中n＝2至8的残基

-NH-（CH₂）n-;

K是具有X＝2至4的残基-NH-（CH₂）x-CO-或为直接键的肽。

更优选的式Ⅰ肽是其中

B是其侧链的胍基或氨基基团可被（C₁-C₈）-链烷酰基，（C₃-C₇）-芳酰基、（C₃-C₉）-杂芳酰基、（C₁-C₈）-烷基磺酰或（C₆-C₁₂）-芳基磺酰未取代或取代的Arq、Orn或Lys，其中这些芳基、杂芳基、芳酰基、芳基磺酰和杂芳酰基残基在适当情况下又可被a2）下所述的1、2、3或4个相同或不同的残基取代;

E是亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、叔丁基甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或环己基丙氨酸;

K是直接键，且

M是直接键的肽。

特别优选的式Ⅰ肽是其中

A是氢、（D）-或（L）-H-Arg、（D）-或（L）-H-Lys或（D）或（L）-Orn，

B是其侧链中的胍基或氨基基团可被（C₁-C₈）-链烷酰基、（C₇-C₁₃）-芳酰基、（C₃-C₉）-杂芳酰基、（C₁-C₈）-烷基磺酰或（C₆-C₁₂）-芳基磺酰取代的Arg、Orn或Lys，其中芳基、杂芳基、芳酰基、芳基磺酰和杂芳酰基残基又可被选自甲基、甲氧基和卤素的1、2、3或4个相同或不同的残基所取代;

C是Pro-Pro-Gly、Hyp-Pro-Gly或Pro-Hpy-Gly，

E是Leu、Ile、Tbg或Cha，

F是Ser、Hser、Lys、Leu、Val、Nle、Ile或Thr，

K是直接键，

M是直接键，

G是式Ⅳ之杂环体系的残基，其中优选的是杂环化合物吡咯烷-2-羧酸;呱啶-2-羧酸;四氢化异喹啉-3-羧酸、顺-和反-十氢化异喹啉-3-羧酸;顺-内-、顺-外-、反-八氢化吲哚-2-羧酸;顺-内-、顺-外-、反-八氢化芳庚并〔b〕吡咯-2-羧酸或羟脯氨酸-2-羧酸的残基，

F′是Arg，且

I是OH的肽。

特别优选的式Ⅰ肽的例子是：

H-（D）-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Leu-Ser-（D）-Tic-Oic-Arg-OH

H-（D）-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Cha-Ser-（D）-Tic-Oic-Arg-OH

H-（D）-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Tbg-Ser-（D）-Tic-Oic-Arg-OH

本发明涉及制备式Ⅰ肽的方法，其包括

a）使具有C末端游离羧基基团的片段或其活化的衍生物与具有N末端游离氨基基团的相应片段反应，或

b）逐步合成该肽，

除去暂时引入按（a）或（b）中所述制得之化合物中的一个或多个保护性基团，以保护其他适当的官能团，并将已按这种方法制得的式Ⅰ的化合物转化成其适当的生理上可耐受的盐。

可按普通熟知的肽化学方法制备本发明的肽，如参见Houben-Weyl，Methoden der Organischen Chemie，Vil.15/2，但最好是使用例如B.Merrifield（J.Am.Chem Soc.85，2149（1963））或R.C.Sheppard（Int.J.Peptide Rrotein Res.21118（1983））所述的固相合成法或已知的等同方法制备之。用作α-氨基保护基团的是氨基甲酸乙酯保护基团，如叔丁氧基碳酰（DOC）或芴基甲氧基碳酰（Fmoc）保护基团。为了防止侧链反应或合成特定的肽，必要时可使用适当的保护基团另外保护氨基酸侧链中的官能团（如参见T.W.Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis”），不同氨基酸所主要使用的保护基团是

Arg（Tos），Arg（Mts），Arg（Mtr），Arg（PMC），Asp（OBzl），

Asp（OBut），Cys（4-MeBzl），Cys（Acm），Cys（SBut），Glu（OBzl），

Glu（OBut），His（Tos），His（Fmoc），His（Dnp），His（Trt），

Lys（Cl-Z），Lys（Boc），Met（O），Ser（Bzl），Ser（But），

Thr（Bzl），Thr（But），Trp（Mts），Trp（CHO），Tyr（Br-Z），

Tyr（Bzl） or Tyr（But）.

固相合成是通过将一被保护的氨基酸偶联到适当树脂上而从肽的C末端开始的。这一合成方式的起始材料可通过酯或酰胺键，将被保护的氨基酸连接到用氯代甲基、羟甲基、二苯甲基氨基（BHA）或甲基二苯甲氨基（MBHA）基团修饰的聚苯乙烯或聚丙烯酰胺树脂上而得到。用作载体材料是树脂可由市场上买到。当被合成的肽须在C末端含有游离氨基甲酰基团时，通常使用BHA-和MBHA-树脂。如果肽在C末端含有第二个氨基甲酰基团，可使用氯代甲基-或羟甲基-树脂并用适当的胺进行裂解。如果希望其含有乙酰胺，可用乙胺从树脂上切掉肽，在这种情况下然后可用适当试剂除去侧链保护基团。如果使氨基酸侧链中的叔丁基保护基团保留在肽上，可用Fmoc保护基团完成合成，以使用已述方法（如参见R.C.Sheppard，J.Chem.Soc.，Chem.Comm.1982，587）临时封闭该氨基酸的α-氨基基团，在这种情况下，可通过与过氯酸吡啶鎓的质子化作用来保护精氨酸的胍基，并用能借助催化转移氢化（A.Felix et al.，J.Org.Chem.13，4194（1978））或在氨水中的钠（W.Roberts，J.Am.Chem.Soc.76，6203（！（%$））除去的苄基保护基团以保护侧链中功能化的其他氨基酸。

可使用适当试剂除去偶联在树脂上的氨基酸的氨基保护基团，如对Boc保护基团可使用溶于二氯甲烷中的三氟乙酸，对Fmoc保护基团则使用溶于二甲基甲酰胺中的哌啶的20%强度溶液，然后根据所需序列依次偶联下面的被保护之氨基酸。用上述试剂使N末端被保护的肽-树脂（作为中间产物）去封闭，以便再连接继后的氨基酸衍生物。

可以将用于肽合成的所有可能的活化剂用作偶联试剂，如参见Houben-Weyl，Methoden derOrganischem Chemie，Vol.15/2，但最好是碳二亚胺类，如N，N′-二环己基碳二亚胺、N，N′-二异丙基碳二亚胺或N-乙基-N′-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺。此外，可借助活化剂直接将氨基酸衍生物加到树脂中，并在适当情况下利用附加有抑制内消旋作用的活化剂，如1-羟基苯并三唑（HOBt）（W.Konig，R.Geiger，Chem.Ber.103，708（1979））或3-羟基-4-氧代-3，4-二氢苯并三唑（HOBt）（W.Konig，R.Geiger，Cehm.Ber.103，2054（1979））进行偶联，或者也可以分别作为对称酐或HOBt或HOObt酯对氨基酸进行预活化，并可将活化之氨基酸衍生物在适当溶剂中的溶液加到准备好进行偶联的肽-树脂中。

可在二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷中，或所说溶剂的混合物中用上述活试剂之一进行氨基酸衍生物的偶联或活化。一般情况下，活化的氨基酸衍生物以1.5至4倍过量使用。在偶联不完全的情况下，可在没有对肽-树脂上的α-氨基基团事先去封闭时重复该偶联反应，这对于偶联序列中的下一个氨基酸是很必要的。

可使用已述的茚三酮反应（如参见E.Kaiser et al.，Anal.Biochem.34，595（1979））检查偶联反应是否成功。自动合成也是可能的，如可使用Applied Biosystems公司生产的430A型肽合成仪，此时可使用由仪器制造商提供的合成程序或使用本人拟定的合成程序。特别当使用由Fmoc基团保护的氨基酸衍生物时，则利用后者。

在按上述方法合成了肽之后，可使用液体氯化氢（特别适用于用Boc方法制备的肽）或三氟乙酸（特别适用于用Fmoc方法合成的肽）等试剂从树脂上裂解之。这些试剂不仅能从树脂上裂解掉肽，而且也能裂解掉氨基酸衍生物的其他侧链保护基团。除使用BHA-和MBHA-树脂者外，以这种方法得到的肽都是以游离酸形式存在的。在使用BHA-和MBHA-树脂的情况下，用氯化氢或三氟甲烷-磺酸裂解则产生酰胺形的肽。EP-A287，882和EP-A322，348中描述了制备肽酰胺的进一步加工方法。在这种情况下，可用常见于肽合成的中等强度酸（如三氟乙酸），加上苯酚、甲氧甲酚、甲氧硫酚、茴香醚、茴香硫醚、乙二硫醇、乙基甲基硫等阳离子俘获物质或常用于固相合成中的相似阳离子俘获物质（这些助剂可单独或两种或多种混合使用）进行处理，以从树脂上裂解肽酰胺。这种情况下，三氟乙酸也可以在用适当溶剂如二氯甲烷稀释后使用。

如果肽上的叔丁基或苄基侧链保护基团被保留，可按已描方法（如参见R.C.Sheppard，J.Chem.Soc.，Chem.Comm.，1982，587），用溶于二氯甲烷中的1%三氟乙酸裂解掉已在特殊修饰的载体树脂上合成的肽。如果个别叔丁基或苄基侧链保护基团被保留，则适当的合用合成和裂解方法。

由Sheppard介绍的修饰的载体树脂也用于合成具有C末端氨基甲酰基团和W-氨基或-胍基烷基基团的肽。合成后，由树脂上裂解掉侧链完全被保护的肽，然后在经典合成溶液中与适当的胺或W-氨烷基胺或W-胍烷基胺，这种情况下有可能根据需要按已知方式暂时保护所存在的其他官能性基团。

EP-A264802中描述了制备带W-氨烷基基团之肽的另一种方法。

最好使用固相技术，用两个通用的保护基团合成本发明的肽：

使用Applied Biosystems公司生产的，430A型自动肽合成仪进行合成，其中以Boc和Fmoc保护基团暂时封闭α-氨基。

当使用Boc保护基团时，可利用由仪器制造商预编程序的合成周期合成。

在Applied Biosystems公司生产的、用适当Boc-氨基酸使之功能化的4-（羟甲基）苯乙酰氨基甲基聚苯乙烯树脂（R.B.Merrifield，J.Org.Chem.，43，2845（1978））上合成C末端有游离羧基的肽。用同一公司生产的MBHA-树脂制备肽酰胺。所使用的活化剂是N，N′-二环己基碳二亚胺或N，N′-二异丙基碳二亚胺。在CH₂Cl、CH₂Cl/DMF混合物或NMP中作对称酐、作为HOBt或HOObt酯活化。利用2-4当量的活化之氨基酸衍生物偶联。在偶联不完全的情况下，须使反应重复进行。

当使用Fmoc保护基团暂时保护α-氨基基团时，引入了我们自己的合成程序借助Applied Biosystems的430A型自动肽合成仪进行合成。在已按已知方法（E.Atherton et al.，J.C.S.Chem.Comm.1981，336）用适当的氨基酸酯化的Bachem之对位苄氧基苄基醇-树脂（S.Wang，J.Am.Chem.Soc.95，1328（19873））上进行合成。在由仪器制造商提供的氨基酸小筒内，经向已称重加入的氨基酸衍生物和HOBt或HOObt的混合物中加入溶于DMF的二异丙基碳二亚胺溶液，以作为HOBt或HOObt酯而直接活化氨基酸衍生物。同样有可能按EP-A247573中所述方法利用Fmoc-氨基酸OObt酯进行批量制备。在反应容器内使用溶于DMF中的20%哌啶强溶液除去Fmoc保护基团。所用的过量反应性氨基酸衍生物为1.5至2.5当量。如果偶联不完全，可按Boc方法重复该偶联反应。

本发明的肽单用或合用均表现有舒缓激肽拮抗作用，这一作用可用多种试验模型检验（参见Handbook of Exp.Pharmacol.，Vol.25，Springer Verlag，1970，pp.53-55），如使用分离的大鼠子宫、豚鼠回肠或分离的豚鼠肺动脉。

为了用分离的肺动脉检验本发明的肽，将体重400-450g的豚鼠（Dunkin Hartley）经颈后部充气处死。打开胸腔并小心剥离肺动脉。除去周围组织并以45℃解成螺旋形切开脉动脉。

在充满林格氏溶液的容量为10ml的器官浴器内固定长2.5cm、宽3-4mm的血管条。

其中溶液的组成（mmol/l）为：

Nacl 154

Kcl 5.6

Cacl₂1.9

NaHCO₃2.4

葡萄糖 5.0

将溶液加热到37℃并通过溶液吹入95%O₂和5%CO₂。PH为7.4，且血管条的负荷为1.0g。

用杠杆附件和HF解调器（行程测量装置）（Hugo Sachs）检测等长收缩的改变，并在电位记录仪（BEC，Goerz Metrawatt SE 460）上记录之。

平衡1小时后开始实验。一旦血管条对2×10^-7mol/1舒缓激肽达到其最大敏感度-舒缓激肽可引起血管条收缩-便使肽以5×10^-8到1×10^-5mol/l的剂量作用10分钟，并在更换舒缓激肽后，将舒缓激肽效应的增加与对照组比较。

为了检测部分拮抗效果，所用肽剂量为1×10^-5-1×10^-3mol/l。

由剂量一效应作图计算中本发明之肽的IC₅₀值并列于表1中。

表1：

化合物 IC₅₀[M]

本发明肽的治疗应用范围包括由舒缓激肽和与舒缓激肽相关的肽介导、诱导或促成的所有病理状态。这些病理状态包括创伤如外伤、烧伤、皮疹、红疹、水肿、扁桃体炎、关节炎、气喘、变态反应、鼻炎、休克、炎症、低血压、疼痛、瘙痒和改变的精子游动性。

因此本发明还涉及Ⅰ肽作为药物的应用，及含有这些化合物的医药产品。

医药产品可以只含有有效量的式Ⅰ之活性化合物，或者还合并有医药上可利用的无机或有机赋形剂。

可经肠内或胃肠道外给药，如皮下、肌肉或静脉注射、或经舌下、表皮、鼻腔、直肠、子宫内、口内给药或吸入给药。活性化合物的剂量依据温血动物种、体重、年龄及给药方式而定。

可经已知的溶解、混合、造粒或包衣等工艺过程制备本发明的医药产品。

就口服给药或经粘膜给药的剂型来说，可将活性化合物与用于此目的常用辅助添加剂，如赋形剂、稳定剂或惰性稀释剂混合，并用常规方法转化成适当的剂型，如片剂、包衣片剂、硬明胶胶囊剂、含水、含醇或油悬浮剂或溶液。可使用的惰性载体包括阿拉伯胶、氧化镁、碳酸镁、磷酸钾、乳糖、葡萄糖、硬脂酰富马酸镁或淀粉，特别是玉米淀粉。该制剂可制成干或湿颗粒形式的。适用的油性赋形剂式溶剂可以是植物油或动物油，如葵花籽油和鱼肝油。

对于局部给药的产品，可以是含水、含油溶液、洗液、乳剂或胶冻，软豪或油膏形式的，必要时可制成喷雾形式的，且有可能经加入一种聚合物来改善药物附着力。

对于鼻内给药的剂型，可将活性化合物与常用添加剂如稳定剂或惰性稀释剂混合，并用常规方法将其转变为适当的剂型，如含水、醇或油的悬浮剂或溶液。有可能向含水的鼻内给药制剂内加入螯合剂，如乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸、柠檬酸、酒石酸或其盐。鼻溶液可用有刻度的喷雾器给药，或作为含粘度增加内容物的滴鼻剂、鼻用凝胶或鼻用乳给药。

可使用喷雾器或利用惰性载体气体的压缩气体包装进行吸入给药。

对于静脉内、皮下、表皮或皮内给药的制剂，可将活性化合物或其医药上可耐受的盐，并根据需要加入保持等渗性或调节PH的常用医药佐剂，制成溶液剂、悬浮剂或乳剂。

某些已述及的医药物质在体液内的半寿期短便意味着有必要使用可注射的储存制剂。为此可使用的药物剂型有油状结晶悬浮剂、微胶囊、棒或植入剂，后者可以包含组织相容性聚合物，特别是生物可降解的聚合物，如基于聚乙酸/聚乙醇酸共聚物或人白蛋白的生物可降解聚合物。

局部给药或吸入给药之剂型的适当剂量范围为含0.01-5mg/ml活性化合物的溶液，而全身给药的适当剂量范围为0.01-10mg/kg。

所用氨基酸缩写符号相当于Europ.J.Biochem.138，9（1984）中所述之肽化学中惯用的三字母代码。其他缩写符号列示如下：

Acm 乙酰氨基甲基

ε-Ahx ε-氨基己酰

Aoc 顺，内-2-氮杂双环〔3，3，0〕辛烷-

3-S-碳酰

Boc 叔丁氧基碳酰

But 叔丁基

Bzl 苄基

CDF 氯代-（D）-苯丙氨酰

Cha 环己基丙氨酰

Chg 环己基甘氨酰

cl-z 4-氯苄氧基碳酰

DMF 二甲基甲酰胺

DOMF O-甲基-（D）-苏氨酰

Dnp 2，4-二硝基苯基

Fmoc 9-芴基甲氧基碳酰

MDY O-甲基-（D）-酷氨酰

Me 甲基

4-Mebzl 4-甲苄基

Mtr 4-甲氧基-2，3，6-三甲苯基磺酰

Mts 1，3，5-三甲基苯-2-磺酰

Nal 1-或2-萘基丙氨酰

NMP N-甲基吡咯烷

Npg 新戊基甘氨酰

Oic 顺-内-八氢化吲哚-2-碳酰

Opr 异噁唑烷-3-基碳酰

Pal 2-或3-吡啶基丙氨酰

Pmc 2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-

6-磺酰

Tbg 叔丁基甘氨酰

TFA 三氟乙酸

Thia 2-噻吩基丙氨酰

Tcs 4-甲苯基磺酰

Tic 1，2，3，4-四氢异喹啉-3-基碳酰

Trt 三苯甲基

下列实施例旨在进一步说明固相合成根据本发明之肽的优选方法，而不构成对本发明的限制。

使用了下列氨基酸衍生物：

Fmoc-Arg（Mtr）-OH，Boc-（D）-Arg-OH，Fmoc-Arg（Pmc）-OH，

Fmoc-Hyp-OH，Fmoc-Pro-OObt，Fmoc-Gly-OObt，Fmoc-Phe-OObt，

Fmoc-Ser（tBu）-OObt，Fmoc-（D）-Tic-OH，Fmoc-Gln-OH，

Fmoc-Aoc-OH，Fmoc-Thia-OH，Fmoc-Opr-OH，Fmoc-（D）-Asn-OH，

Fmoc-β-Ala-OH，Fmoc-Oic-OH.

实施例1

使用Applied Biosystems公司的430A型肽合成仪，并使用Fmoc方法在用Fmoc-Arg（Mtr）-OH（Novabiochem）酯化的对位苄氧基苄基醇-树脂上（每克树脂加样量约0.5mmol）分步合成H-（D）-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Leu-Ser-（D）-Tic-Oic-Arg-OH。

合成中使用了1克树脂，并使用了为Fmoc方法而改动的合成程序。

每种情况下均将1mmol带游离羧基的氨基酸衍生物和0.95mmolHOObt准确加入合成仪药筒内。这些氨基酸在使用前被溶解在4mlDMF中，并加入2ml溶在DMF中的0.55mol/l二异丙基碳二亚胺溶液，以使之直接预活化。将其他氨基酸的HOObt酯溶解在6mlNMP中，然后将预活化的氨基酸在原位偶联到事先已用DMF中的20%哌啶去封闭的树脂上。合成完成后，由树脂上裂解肽，同时以茴香硫醚和乙二硫醇作阳离子俘获物质用三氟乙酸除去侧链保护基团。除去三氟乙酸后，用乙酸乙酯将所得残留物消化几次并离心之。在Sephadex LH20柱上层析分离剩余的残留物并用10%乙酸洗脱。合并含纯肽的部分并冷冻干燥。

MS（FAB）：1264（M+H）

以用实施例1相似的方法制备下列肽。

实施例2

H-（D）-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Cha-Ser-（D）-Tic-Oic-Arg-OH

MS（FAB）：1304（M+H）

实施例3

H-（D）-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Tbg-Ser-（D）-Tic-Oic-Arg-OH

MS（FAB）：1264（M+H）

Claims

1、制备如下式Ⅰ的肽及其医药上可耐受的盐的方法，

A-B-C-E-F-K-(D)-TiC-G-M-F′-Ⅰ (Ⅰ)

其中A是

a1)氢、(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₈)-链烷酰基、(C₁-C₈)-烷氧基碳酰或(C₁-C₈)-烷基磺酰，其中各个基团中的1、2或3个氢原子均可被选自羧基、氨基、(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₄)-烷基氨基、羟基、(C₁-C₄)-烷氧基、卤素、二-(C₁-C₄)-烷基氨基、氨基甲酰、氨磺酰、(C₁-C₄)-烷氧基碳酰、(C₆-C₁₂)-芳基和(C₆-C₁₂)-芳基-(C₁-C₅)-烷基

的1、2或3个相同或不同的残基取代，或其中各基团的1个氢原子可被选自

(C₃-C₈)-环烷基、(C₁-C₄)-烷基磺酰、(C₁-C₄)-烷基亚磺酰、(C₆-C₁₂)-芳基-(C₁-C₄)-烷基磺酰、(C₆-C₁₂)-芳基-(C₁-C₄)-烷基亚磺酰、(C₆-C₁₂)-芳氧基、(C₃-C₉)-杂芳基和(C₃-C₉)-杂芳氧基的残基取代，且1或2个碳原子被选自羧基、氨基、(C₁-C₄)-烷基氨基、羟基、(C₁-C₄)-烷氧基、卤素、二-(C₁-C₄)-烷基氨基、氨基甲酰、氨磺酰、(C₁-C₄)-烷氧基碳酰、(C₆-C₁₂)-芳基和(C₆-C₁₂)-芳基-(C₁-C₅)-烷基的1或2个相同或不同的残基取代，

a2)(C₃-C₈)-环烷基、可在氮原子上被(C₁-C₆)-烷基或(C₆-C₁₂)-芳基取代的氨基甲酰、(C₆-C₁₂)-芳基、(C₇-C₁₃)-芳酰基、(C₆-C₁₂)-芳基磺酰、(C₃-C₉)-杂芳基或(C₃-C₉)-杂芳酰基，

其中a1)和a2)下限定的各残基，芳基、杂芳基、芳酰基、烷基磺酰和杂芳酰基均可被选自

羟基、氨基、硝基、(C₁-C₄)-烷基氨基、羟基、(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₄)-烷氧基、卤素、氰基、二-(C₁-C₄)-烷基氨基、氨基甲酰、氨磺酰和(C₁-C₄)-烷氧基碳酰的1、2、3或4个相同或不同的残基取代，或者

a3)式Ⅱ的残基

其中R¹同al)或a2)下限定的A，

R²是氢或甲基，

R³是氢或可被氨、被取代的氨基、羟基、羧基、氨基甲酰、胍基、被取代的胍基、脲基、巯基、甲硫基、苯基、4-氯代苯基、4-氟代苯基、4-硝基苯基、4-甲氧苯基、4-羟苯基、苯二甲酰亚氨基、4-咪唑基、3-吲哚基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基或环已基单取代的(C₁-C₆)-烷基、更好是(C₁-C₄)-烷基，其中被取代的氨基是-NH-A，且被取代的胍基是其中A有al)或a)下之定义的-NH-C(NH)-NH-A；

B是呈L或D构型并可在侧链上被取代的碱性氨基酸；

C是式Ⅲa或Ⅲb的连接臂

G′-G′-Gly G′-NH-(CH₂)n-CO

(Ⅲa) (Ⅲb)

其中G′各自是式Ⅳ的残基

其中R⁴和R⁵与携带它们的原子一起形成有2至15个碳原子的杂环单、双或三环体系，且n是2至8；

E是中性、酸性或碱性脂族或脂环-脂族氨基酸的残基；

F各自是可在侧链中被取代的中性、酸性或碱性脂族或芳族氨基酸的残基，或者是直接键；

(D)-Tic是式Ⅴ的残基：

G定义同上述G′，或者是直接键；

F′定义同F，是其中n为2至8的残基

-NH-(CH₂)n-，或者当G不是直接键时其可以是直接键，且

I是-OH、-NH₂或-NHC₂H₅，

K是具有X=1至4的残基-NH-(CH₂)x-CO-或直接键，且

M定义同F，

该方法包括：

a)使具有C未端游离羧基基团的片段或其活化的衍生物与具有N未端游离氨基基团的相应片段反应，或

b)逐步合成该肽，

除去暂时引入按(a)或(b)所述制得之化合物中的一个或多个保护基团，以保护其他适当的官能团，并将已按这种方式制得的式Ⅰ的化合物转化成其适当的生理上可耐受的盐。

2、根据权利要求1的方法，其所制得的式Ⅰ的肽中，

B是Arq、Lys、Orn、2，4-二氨基丁酰或L-高精氨酸残基，其中各残基之侧链的氨基或胍基均可被权利要求1中a1）或a2）下限定的A所取代;

E是呈L或D构型并在侧链上含有1到14个碳原子的脂族或脂环-肪族氨基酸残基;

F′是呈L或D构型的碱性氨基酸残基，如Arq或Lys，其侧链的胍基或氨基基团可被权利要求1中a1）或a2）下限定的A所取代，或者是具有n＝2至8的残基

-NH-（CH₂）n-;

K是具有X＝2至4的残基-NH-（CH₂）x-CO-或者是直接键。

3、根据权利要求1和/或2的方法，其所制得的式Ⅰ的肽中B是其侧链的胍基或氨基基团未被取代或可被（C₁-C₈）-链烷酰基，（C₇-C₁₃）-芳酰基、（C₃-C₉）-杂芳酰基、（C₁-C₈）-烷基磺酰或（C₆-C₁₂）-芳基磺酰取代的Arq、Orn或Lys，而这些芳基、杂芳基、芳酰基、芳基磺酰和杂芳酰基残基又可在适当情况下被a2）下所述的1、2、3或4个相同或不同的残基取代;

E是亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、叔丁基甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或环己丙氨酸、

K是直接键，且

M是直接键。

4、根据权利要求1至4中一项或多项的方法，其所制得的式Ⅰ的肽中

A是氢、（D）-或（L）-H-Arg、（D）-或（L）-H-Lys或（D）-或（L）-H-Orn，

B是其侧链中的胍基或氨基基团可被（C₁-C₈）-链烷酰基、（C₇-C₁₃）-芳酰基，（C₃-C₉）-杂芳酰基、（C₁-C₈）-烷基磺酰或（C₆-C₁₂）-芳基磺酰取代的Arg、Orn或Lys，其中芳基、杂芳基、芳酰基、芳基磺酰和杂芳酰基残基又可被选自甲基、甲氧基和卤素的1、2、3和4个相同或不同的残基取代;

C是Pro-Pro-Gly、Hyp-Pro-Gly或Pro-Hpy-Gly，

E是Leu、Ile、Tbg或Cha，

F是Ser、Hser、Lys、Leu、Val、Nle、Ile或Thr，

K是直接键，

M是直接键，

G是式Ⅳ杂环体系的残基，其中优选的是杂环化合物吡咯烷-2-羧酸;呱啶-2-羧酸;1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、顺-和反-十氢异喹啉-3-羧酸;顺-内-、顺-外-、反-八氢吲哚-2-羧酸;顺-内-、顺-外-、反-八氢芳庚并〔b〕吡咯-2-羧酸或羟腈氨酸-2-羧酸的残基，

F′是Arg，且

I是OH。

5、制备含权利要求1至4中一或多项限定之式Ⅰ肽的药剂的方法，其包括将所说和肽的一种载体转化成适当的剂型。