CZ280682B6

CZ280682B6 - Peptidy s bradykinin-antagonistickým účinkem, způsob jejich výroby, jejich použití a farmaceu tický prostředek tyto peptidy obsahující

Info

Publication number: CZ280682B6
Application number: CS911165A
Authority: CZ
Inventors: Gerhard Dr. Breipohl; Stephan Dr. Henke; Jochen Dr. Knolle; Bernward Prof. Dr. Schölkens; Franz Dr. Hock
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1990-04-26
Filing date: 1991-04-24
Publication date: 1996-04-17
Also published as: NZ237928A; RU2056432C1; KR910018405A; EP0455133A2; ZA913121B; FI911978A; CS9101165A2; PT97466B; DK0455133T3; HU208028B; CY2113B1; JPH04225997A; CA2041268C; LV10290A; EP0455133A3; IL97944A0; KR100195569B1; ES2099102T3; NO300779B1; GR3023172T3

Abstract

Nové peptidy s bradykinin-antagonistickým účinkem obecného vzorce A-B-C-E-F-K-/D/-tic-G-M-F-I, ve kterém značí B basickou aminokyselinu, E zbytek neutrální, kyselé nebo basické aminokyseliny, F zbytek neutrální, kyselé nebo basické aminokyseliny nebo přímou vazbu, stejně jako M, K zbytek -NH-/CH.sub.2.n./.sub.x.n.-CO- a I hydroxylovou skupinu, aminoskupinu nebo skupinu -NHC.sub.2.n.H.sub.5.n.. Uvedené peptidy se mohou vyrobit reakcí odpovídajících fragmentů s volným N- a C-koncem nebo postupnou konstrukcí.ŕ

Description

Vynález se týká nových peptidů s bradykinin-antagonistickým účinkem, jakož i způsobu jejich výroby, jejich použití a farmaceutických prostředků uvedené peptidy obsahujících.

Dosavadní stav techniky

Ve WO 86/07263 jsou popsány bradykinin-antagonistické peptidy, u nichž je mimo jiného nahrazen L-prolin v poloze 7 peptidového hormonu bradykininu nebo jiného analogu bradykininu D-aminokyselinou, jako je D-phe, D-thia, D-pal, CDF, D-nal, MDY, D-phg, D-his, D-trp, D-tyr, D-val, D-ala, D-his, D-ile, D-leu a DOMT.

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vynálezu tedy je nalezení nových účinných peptidů, které by vykazovaly bradykinin - antagonistický účinek.

Uvedený úkol byl vyřešen syntézou peptidů obecného vzorce I

A-B-C-E-F-K-(D)-Tic-G-M-F'-I /1/, ve kterém značí

A vodíkový atom, (D)-H-arginin, (L)-H-arginin, (D)-H-lysin, (L)-H-lysin, (D)-H-ornithin nebo (L)-H-ornithin,

B arginin, ornithin nebo lysin, přičemž guanidinová skupina, popřípadě aminoskupina postranního řetězce, mohou být substituovány vodíkovým atomem, alkanoylovou skupinou s 1 až 8 uhlíkovými atomy, aroylovou skupinou se 7 až 13 uhlíkovými atomy, heteroaroylovou skupinou se 3 až 9 uhlíkovými atomy, alkylsulfonylovou skupinou s 1 až 8 uhlíkovými atomy nebo arylsulfonylovou skupinou se 6 až 12 uhlíkovými atomy, přičemž arylová, heteroarylová, aroylová, arylsulfonylová a heteroaroylová skupina mohou být popřípadě jednou, dvakrát, třikrát nebo čtyřikrát substituovány stejnými nebo různými zbytky, vybranými ze skupiny, zahrnující methylovou skupinu, methoxyskupinu a atom halogenu,

C Pro-Pro-Gly, Hyp-Pro-Gly nebo Pro-Hyp-Gly,

E Leu, Ile, Tbg nebo Cha,

F Ser, Η-Ser, Lys, Leu, Val, Nle, Ile, nebo Thr

K přímou vazbu, (D)-Tic zbytek vzorce V

-1CZ 280682 B6 (V)

M přímou vazbu,

G zbytek heterocyklického kruhového systému obecného vzorce IV,

(IV) přičemž R⁴ a R⁵ společně s atomy, na které jsou vázány, tvoří heterocyklický mono-, di-, nebo tricyklický kruhový systém se 2 až 15 uhlíkovými atomy, nebo přímou vazbu, přičemž zbytky heterocyklú jsou výhodně kyselina pyrrolidin-2-karboxylová, kyselina piperidin-2-karboxylová, kyselina tetrahydroisochinolin-3-karboxylová, kyselina cis-dekahydroisochinolin-2-karboxylová, kyselina trans-dekahydroisochinolin-3-karboxylová, kyselina cis-endo-oktahydroindol-2-karboxylová, kyselina cis-exo-oktahydroindol-2-karboxylová, kyselina trans-oktahydroindol-2-karboxylová, kyselina cis-endo-oktahydrocyklopenta/b/pyrrol-2-karboxylová, kyselina cis-exo-okrahydrocyklopenta/b/pyrrol-2-karboxylová, kyselina trans-oktahydropenta/b/-pyrrol-2-karboxylová nebo kyselina hydroxyprolin-2-karboxylová,

F' arginin a

I hydroxyskupinu jakož i jejich fyziologicky přijatelných solí.

Pokud není uvedeno jinak, znamená zkratka aminokyselinového zbytku bez stereodeskriptoru zbytek v L-formě (viz Schróder, Lúbke, The Peptides, díl I, New York 1965, str. XXII až XXIII; Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, díl XV/1 a 2, Stuttgart 1974).

Jako zbytky heterocyklických kruhových systémů obecného vzorce IV přicházejí v úvahu obzvláště zbytky heterocyklú, vybrané ze skupiny:

kyselina pyrrolidin-2-karboxylová, kyselina piperidin-2-karboxylová, kyselina 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-karboxylová, kyselina dekahydroisochinolin-3-karboxylová, kyselina oktahydroindol-2-karboxylové, kyselina dekahydrochinolin-2-karboxylová, kyselina oktahydrocyklopenta/b/pyrrol-2-karboxylová, kyselina 2-aza-bicyklo/2.2.2/oktan-3-karboxylové, kyselina 2-azabicyklo/2.2.1/heptan-3-karboxylová, kyselina 2-azabicyklo/3.1.0/hexan-3-karbo

-2CZ 280682 B6 xylová, kyselina 2-azaspiro/4.4/nonan-3-karboxylová, kyselina 2-azaspiro/4.5/dekan-3-karboxylová, kyselina spiro//bicyklo/2.2.1./heptan/-2,3-pyrrolidin-5-karboxylová/, kyselina spiro//bicyklo/2.2.2/oktan/-2,3-pyrrolidin-5-karboxylová/, kyselina 2-azatricyklo/4.3.0.I⁶'⁹/dekan-3-karboxylové, kyselina dekahydrocyklohepta/b/pyrrol-2-karboxylová, kyselina dekahydrocyklookta/b/pyrrol-2-karboxylová, kyselina oktahydrocyklopenta/c/pyrrol-2-karboxylová, kyselina oktahydroisoindol-l-karboxylová, kyselina 2,3,3a,4,6a-hexahydrocyklopenta/b/pyrrol-2-karboxylová, kyselina 2,3,3a,4,5,7a-hexahydroindol-2-karboxylová, kyselina tetrahydrothiazol-4-karboxylová, kyselina isooxazolidin-3-karboxylová, kyselina pyrazolidin-3-karboxylová, kyselina hydroxyprolin-2-karboxylová, které všechny mohou být popřípadě substituované:

N‘

CO-Ν'

CO-CO

CoΝ'

Ν'

CO-CO-Ν'

Ν'

-3CZ 280682 B6

-4CZ 280682 B6

Výše uváděné zbytky heterocyklů jsou například známé z

US-A	4	344 949,	US-A	4	374 847,	US-A 4 350 704,	EP-A	29	488,
EP-A	31	741, EP-A	46	953	t	EP-A 49	605,	EP-A 49	658 ,	EP-A	50	800,
EP-A	51	020, EP-A	52	870	/	EP-A 79	022,	EP-A 84	164 ,	EP-A	89	637,
EP-A	90	341, EP-	•A	90	36	2, EP-A	105	102, EP	-A	109 020,	EP-A
111 ;	873 ,	EP-A 271	865	a	EP	-A 344 682.

Pokud v jednotlivých případech není uvedeno jinak, může být alkylová skupina přímá nebo rozvětvená. Odpovídajícím způsobem to platí i u od alkylové skupiny odvozených skupin, jako je alkoxyskupina, aralkylová skupina nebo alkanoylová skupina.

Arylová skupina se 6 až 12 uhlíkovými atomy značí výhodně fenylovou skupinu, naftylovou skupinu nebo bifenylovou skupinu. Odpovídajícím způsobem jsou formulovány od nich odvozené zbytky, jako je například aryloxyskupina, aralkylová skupina nebo aroylová skupina.

Pod pojmem atom halogenu se rozumí atom fluoru, chloru, bromu nebo jodu, především atom chloru.

Jako soli přicházejí v úvahu obvzláště soli alkalických kovů, nebo kovů alkalických zemin, soli s fyzioloicky přijatelnými aminy a soli s anorganickými nebo organickými kyselinami, jako je například kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina citrónová, kyselina vinná nebo kyselina octová.

Výhodné jsou peptidy obecného vzorce I, ve kterých značí

H-(D)-Arg,

Arg, Pro-Hyp-Gly,

-5CZ 280682 B6

E Leu, Tbg nebo Cha,

F Ser,

K a M přímou vazbu,

G Oic,

F' Arg a I hydroxylovou skupinu, jakož i jejich fyziologicky přijatelné soli.

Příklady zcela obzvláště výhodných peptidů obecného vzorce I jsou následující:

H/D/-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Leu-Ser-/D/-Tic-Oic-Arg-OH, H-/D/-arg-arg-pro-hyp-gly-cha-ser-/D/-tic-oic-arg-OH a H-/D/-arg-arg-pro-hyp-gly-tbg-ser-/D/-tic-oic-arg-OH.

Vynález se dále týká způsobu výroby peptidů obecného vzorce I, jehož podstata spočívá v tom, že se a/ nechá reagovat fragment s C-terminální karboxylovou volnou skupinou, nebo její aktivovaný derivát, s odpovídajícím fragmentem s N-terminální volnou aminoskupinou, nebo se b/ postupně konstruuje peptid, načež se ve sloučenině, získané postupem /a/ nebo /b/ popřípadě odštěpí jedna nebo několik ochranných skupin, zavedených k ochraně jiných funkcí, a takto získaná sloučenina obecného vzorce I se popřípadě převede na fyziologicky přijatelnou sůl.

Peptidy podle předloženého vynálezu byly podle všeobecných metod chemie peptidů /viz například Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Band 15/2/ výhodně pomocí syntézy v pevné fázi /např. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85., 2149 /1963/ nebo R. C. Sheppard, Int. J. Peptide Protein Res. 21 118 /1983// popsány, nebo ekvivalentními známými metodami vyrobeny. Jako ochranné skupiny alfa-aminoskupin se používají urethanové ochranné skupiny, jako je například terc.-butyloxykarbonyl/Boc/-skupina nebo fluorenylmethyloxykarbonyl/Fmoc/-skupina. Pokud je pro potlačení vedlejších reakcí nebo pro syntézu speciálních peptidů zapotřebí, jsou funkční skupiny v postranních řetězcích aminokyselin dodatečně chráněny vhodnými ochrannými skupinami /viz například T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis/, přičemž v první řadě se používá arg/tos/, arg/mts/, arg/mtr/, arg/PMC/, asp/Obzl/, asp/Obut/, cys/4-MeBzl/, cys/acm/, cys/Sbut/, glu/Obzl/, glu/Obut/, his/tos/, his/fmoc/, his/dnp/, his/trt/, lys/Cl-z/, lys/bos/, met/0/, ser/bzl/, ser/but/, thr/bzl/, thr/but/, trp/mts/, trp/CHO/, tyr/Br-z/, tyr/Bzl/ nebo tyr/but/.

Syntéza v pevné fázi počíná na C-terminálním konci peptidů navázáním chráněné aminokyseliny na odpovídající pryskyřici. Takovéto výchozí materiály je možno získat vazbou chráněné aminokyseliny s polystyrénovou nebo polyakrylaminovou pryskyřicí, modifikovanou chlormethylovou skupinou, hydroxymethylovou skupinou, benzhydrylaminovou skupinou /BHA/ nebo methylbenzhydrylaminoskupinou /MBHA/, přes esterovou nebo amidovou vazbu. Pryskyřice, používané jako nosný materiál, jsou komerčně dostupné. BHA-pryskyřice a MBHA-pryskyřice se obvykle používají tehdy, když se má

-6CZ 280682 B6 získat syntetizovaný peptid, obsahující na C-konci volnou karbamoylovou skupinu. Pokud má peptid obsahovat sekundární amidovou skupinu na C-terminálním konci, použije se chlormethylová pryskyřice, popřípadě hydroxymethylová pryskyřice a odštěpování se provádí s odpovídajícími aminy. Když se má například získat ethylamid, může se peptid odštěpit od pryskyřice pomocí ethylaminu, přičemž odštěpení ochranné skupiny postranního řetězce se provede následně pomocí vhodného činidla. Když mají v peptidů zůstat získané terč.-butylové ochranné skupiny aminokyseliny postranního řetězce, provádí se syntéza pomocí fmoc-ochranné skupiny dočasným blokováním alfa-aminoskupiny aminokyseliny za použití metodiky, popsané například v publikaci R.C. Sheppard, J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1982, 587, přičemž guanidinová funkce argininu se ochrání protonizací pomocí pyridinium chloristanu a ochrana ostatních aminokyselin, funkcionalizovaných v postranním řetězci, probíhá katalytickou transhydrogenací /A. Felix a kol. J. Org. Chem. 13, 4194 /1078//, nebo pomocí sodíku v kapalném amoniaku /W. Roberts, J. Am. Chem. Soc. 76, 6203 /1954// odštěpitelných benzylových ochranných skupin.

Po odštěpení aminové ochranné skupiny aminokyseliny, navázané na pryskyřici, pomocí vhodného činidla, jako je například kyselina trifluormethyloctová v methylenchloridu v případě boc-ochranné skupiny, nebo 20% roztok piperidinu v dimethylformamidu v případě fmoc-ochranné skupiny, se navážou následující chráněné aminokyseliny postupně v požadovaném pořadí. Intermediárně vznikající, na N-konci chráněné, peptidové pryskyřice se před vazbou s následujícím derivátem aminokyseliny odblokují pomocí výše uvedených činidel.

Jako vazebná činidla se mohou použít všechna možná aktivační činidla, využívaná v syntéze peptidů /viz například Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Band 15/2/, obzvláště ale karbodiimidy, jako je například Ν,Ν-dicyklohexylkarbodiimid, N,N-diisopropylkarbodiimid nebo N-ethyl-N'-/3-dimethylaminopropyl/karbodiimid. Navázání se přitom může provádět přímo adicí derivátu aminokyseliny za pomoci aktivačního činidla a popřípadě přísady, potlačující racemizaci, jako je například 1-hydroxybenzotriazol /HObt/ /W. Kónig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 708 /1970//, nebo 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydrobenzotriazin /HOobt/ /W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103. 2054 /1970//, na pryskyřici, nebo ale také může předběžná aktivace derivátu aminokyseliny zvlášť probíhat jako asymetrický anhydrid nebo HObt-, .popřípadě HOobt-ester, a roztok aktivované látky ve vhodném rozpouštědle se přidá k peptidové pryskyřici, schopné vazby.

Navázání, popřípadě aktivace derivátů aminokyselin pomocí jednoho z výše uvedených aktivačních činidel se může provádět v dimethylformamidu, N-methylpyrrolidonu nebo methylenchloridu, nebo ve směsi uvedených rozpouštědel. Aktivovaný derivát aminokyseliny se obyčejně používá v 1,5 až čtyřnásobném přebytku. V případech, u kterých dochází k neúplnému navázání, se vazebná reakce opakuje bez toho, že by se předem provedlo odblokování alfa-aminoskupiny peptidové pryskyřice, nutné pro navázání následující aminokyseliny.

Úspěšný průběh vazebné reakce se může přezkoušet pomocí ninhydrinové reakce, která je například popsána v publikaci E. Kai

-7CZ 280682 B6 ser a kol., Anal. Biochem. 34 , 595 /1970/. Syntéza se může provádět také automaticky, například za využití přístroje Peptid-Synthetizer Model 430A firmy Applied Biosystems, přičemž se mohou buď použít syntézní programy, dodané výrobcem přístroje, nebo také programy, dané využivatelem. Posledně jmenované se využijí obzvláště při použití derivátů aminokyselin, chráněných fmoc-skupinou.

Po syntéze peptidu výše popsaným způsobem se může peptid odštěpit od pryskyřice pomocí různých činidel, jako je například kapalný fluorovodík (výhodně u peptidů, vyrobených podle boc-metody) nebo kyselina trifluoroctová (výhodně u peptidů, syntetizovaných podle fmoc-metody). Tato činidla odštěpují nejen peptid od pryskyřice, nýbrž odštěpují také další ochranné skupiny postranních řetězců derivátů aminokyselin. Tímto způsobem se získá, kromě postupu za použití BHA-pryskyřic a MBHA-pryskyřic, peptid ve formě volné kyseliny. Při použití BHA-pryskyřic a MBHA-pryskyřic se získá při štěpení fluorovodíkem nebo kyselinou trifluormethansulfonovou peptid ve formě amidu kyseliny.

Další způsoby výroby peptidamidů jsou popsány v EP-A 287 882 a EP-A 322 348. Zde probíhá odštěpení peptidamidů od pryskyřice zpracováním se středně silnými kyselinami, běžně používanými při syntéze peptidů (jako je například kyseliny trifluoroctová), přičemž jako akceptor elektronů se přidávají látky, jako je například fenol, kresol, thiokresol, anisol, thioanisol, ethandithiol, dimethylsulfid, ethylmethylsulfid nebo podobné akceptory kationtů, běžné při syntéze v pevné fázi, jednotlivě nebo ve směsi dvou nebo několika uvedených pomocných látek. Kyselina trifluoroctová se přitom může používat zředěná vhodným rozpouštědlem, jako je například methylenchlorid.

Pokud mají zůstat v peptidu zachovány ochranné skupiny butylových, popřípadě benzylových postranních řetězců, provádí se odštěpení peptidu, syntetizovaného na obzvláště modifikované nosné pryskyřici, pomocí 1% kyseliny trifluoroctové v methylenchloridu, jak je například popsáno v publikaci R. C. Sheppard, J. Chem. Soc., Chem. Comm., 1982, 587. Když mají být zachovány jednotlivé terč.-butylové, popřípadě benzylové ochranné skupiny postranních řetězců, použije se vhodná kombinace metod syntézy a odštěpování.

Pro syntézu peptidů s karbamoylskupinou nebo omega-aminoalkylskupinou, popřípadě omega-guanidinoalkylskupinou na C-konci se rovněž používá modifikovaná nosná pryskyřice, popsaná Sheppardem. Po syntéze se peptid, v postranním řetězci úplně chráněný, z pryskyřice odštěpí a potom se klasickou syntézou nechá zreagovat s odpovídajícím aminem, popřípadě omega-aminoalkylaminem nebo omega-guanidinoalkylaminem, přičemž se mohou popřípadě přítomné další funkční skupiny známým způsobem dočasně chránit.

Další způsob výroby peptidů s omega-aminoalkylskupinou je popsán v EP-A 264 802.

Peptidy podle předloženého vynálezu se výhodně syntetizují za použití techniky v pevné fázi podle dvou základních taktik ochranných skupin:

-8CZ 280682 B6

Syntéza se provádí pomocí automatického syntetizéru peptidů model 430 A firmy Applied Biosystems za využití boc-ochranných skupin, popřípadě fmoc-ochranných skupin pro dočasné blokování alfa-aminoskupiny.

Při používání boc-ochranné skupiny se pro syntézu využívají syntézní cykly, naprogramované výrobcem přístroje.

Syntéza peptidů s volnými karboxylovými skupinami na C-terminálním konci se provádí na 4-/hydroxymethyl/fenylacetamidomethylpolystyrenové pryskyřici (R. B. Merrifield, J. Org. Chem. 43. 2845 (1978)), funkcionalizované boc-aminokyselinou, firmy

Applied Biosystems. Pro výrobu peptidamidů se používá MBHA-pryskyřice stejné firmy.

Jako aktivační činidla se používal

N,N'-dicyklohexylkarbodi imid nebo

N,N'-diisopropylkarbodiimid.

Aktivace se provádí jako symetrický anhydrid, jako HObt-ester nebo HObt-ester v dichlormethanu, směsi dichlormethanu a dimethylformamidu nebo v NMP. Pro navázání se používají 2 až 4 ekvivalenty aktivovaného derivátu aminokyseliny. V případech, kdy navázání neproběhne úplně, se reakce opakuje.

Při použití fmoc-ochranné skupiny k dočasné ochraně alfa-aminoskupiny se využívají pro syntézu pomocí automatického syntetizéru peptidů model 430 A firmy Applied Biosystems vlastní syntézní programy. Syntéza se provádí na p-benzyloxybenzylalkoholové pryskyřici (S. Wang, J. Am. Chem. Soc. 95 (1973)) firmy

Bachem, která byla pomocí známé metody (F. Atherton a kol. J. C. S. Chem. Comm. 1981, 336) esterifikována odpovídající aminokyselinou. Aktivace derivátu aminokyseliny jako HObt-ester nebo HOobt-ester probíhá přímo v zásobníku aminokyseliny, dodávaném výrobcem přístroje, přídavkem roztoku diisopropylkarbodiimidu v dimethylformamidu do předem navážené směsi z derivátu aminokyseliny a HObt nebo HOobt. Rovněž je možno použít jako substanci vyrobený fmoc-aminokyselina-Oobt-ester, popsaný v EP-A 247 573. Odštěpení fmoc-ochranné skupiny se provádí pomocí 20% roztoku piperidinu v dimethylformamidu v reakčni nádobě. Používaný přebytek reaktivního derivátu aminokyseliny činí 1,5 až 2,5 ekvivalentu. Pokud navázání nebylo úplné, opakuje se jako při provádění boc-metody.

Peptidy podle předloženého vynálezu mají jednotlivé nebo v kombinaci bradykinin-antagonistický účinek, který může být testován na různých modelech (viz například Handbook of Exp. Pharmacol. Vol. 25, Springer Verlag, 1970, str. 53 až 55), například na izolovaných krysích dělohách, na střevech morčat nebo na izolovaných pulmonálních arteriích morčat.

Pro testování peptidů podle předloženého vynálezu na izolovaných arteria pulmonalis se morčata (Dunkin Hartley) o hmotnosti 400 až 450 g usmrtí úderem do týla.

Hrudní koš se otevře a arteria pulmonalis se opatrně vypreparuje. Okolní tkáně se opatrně odstraní a arteria pulmonalis se V úhlu 45° spirálovitě rozřízne.

-9CZ 280682 B6

Pásky cévy o délce 2,5 cm a šířce 3 až 4 mm se fixují v 10 ml nádobce, naplněné Ringerovým roztokem.

Složení tohoto roztoku v mmol/1 je následující:

chlorid sodný154 chlorid draselný5,6 chlorid vápenatý1,9 hydrogenuhličitan sodný2,4 glukóza5,0.

Roztok se probublá směsí 95 % kyslíku a 5 % oxidu uhličitého a zahřeje se na teplotu 37 °C. Hodnota pH činí 7,4, dávka na proužek cévy činí 1,0 g.

Isometrické změny kontrakce se zjišťují pomocí pákové předsádky a HF-Modemu (měřidlo dráhy) podle Hugo Sachse a registrují se na kompenzačním zapisovači (BEC, Goerz Metrwatt SE 460).

Po jedné hodině ekvilibrace se pokus ukončí. Poté, kdy pásky cévy dosáhly své maximální citlivosti vůči 2 x 10 mol/1 bradykininu - bradykinin způsobuje kontrakci pásků cévy - se nechají působit peptidy v dávkách 5 χ 10^-8 až 1 χ 10^-5 mol/1 po dobu vždy 10 minut. Po novém přídavku bradykininu se srovnává úbytek efektu působení bradykininu ve srovnání s kontrolou.

Pro zjišťování parciálního agonistického efektu se peptidy používají v dávkách 1 χ 10^-5 až 1 χ 10^-3 mol/1.

Hodnoty IC₅₀ pro peptidy podle předloženého vynálezu, vypočtené z křivek závislosti účinku na dávce, jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Sloučenina

H-/D/-arg-arg-pro-hyp-gly-leu-ser-/D/-tic-oic-arg-OH

H-/D/-arg-arg-pro-hyp-gly-cha-ser-/D/-tic-oic-arg-OH

H-/D/-arg-arg-pro-hyp-gly-tbg-ser-/D/-tic-oic-arg-OH ic₅₀/m/

5.9.10^- ⁹

3.7.10^- ⁷

6,0.10^-6

Terapeutické využití peptidů podle předloženého vynálezu zahrnuje patologické stavy, které jsou způsobovány, vyvolávány nebo podmiňovány bradykininem a bradykininu příbuznými peptidy. Uvedené látky lze použít například u traumat, jako jsou rány, spálenin, vyrážek, erythemů, edemů, angíny, arthritidy, astmatu, alergií, rhinitidy, šoků, zánětů, nízkého tlaku, bolestí, dráždivého svědění a změněné motility spermatu.

Předložený vynález se tedy týká také použití peptidů obecného vzorce I jako léčiva, a farmaceutických preparátů, které tyto sloučeniny obsahují.

-10CZ 280682 B6

Farmaceutické preparáty obsahují účinné množství účinné látky obecného vzorce I, jednotlivě nebo v kombinaci, společně s anorganickými nebo organickými farmaceuticky přijatelnými nosiči .

Aplikace uvedených preparátů může probíhat enterálně, parenterálně - jako například subkutánně, intramuskulárně nebo intravenózně - sublinguálně, epikutánně, nazálně, rektálně, intravaginálně, intrabukkálně nebo inhalačně. Dávkování účinné látky závisí na druhu teplokrevného živočicha, tělesné hmotnosti, stáří a na druhu aplikace.

Farmaceutické preparáty podle předloženého vynálezu se vyrábějí o sobě známými postupy pro výrobu roztoků, směsí, granulí nebo dražé.

Pro orální formy aplikace a pro aplikaci na sliznatou pokožku se aktivní sloučeniny smísí s k tomu běžnými přísadami, jako jsou například nosné látky, stabilizátory nebo inertní zředovací činidla, a běžnými metodami se převedou na vhodné aplikační formy, jako jsou například tablety, dražé, kapsle, vodné, alkoholické nebo olejové suspenze, nebo vodné, alkoholické nebo olejové roztoky. Jako inertní nosiče je možno použít například arabskou gumu, oxid hořečnatý, uhličitan hořečnatý, fosforečnan draselný, mléčný cukr, glukózu, stearylfumarát hořečnatý nebo škroby, obzvláště kukuřičný škrob. Přitom příprava probíhat jak se suchým, tak s vlhkým granulátem. Jako olejovité nosné látky nebo rozpouštědla přicházejí v úvahu například rostlinné nebo živočišné oleje, jako je například slunečnicový olej nebo rybí tuk.

Preparáty pro topickou aplikaci se mohou vyskytovat ve formě vodných nebo olejových roztoků, suspenzí, emulzí nebo želé, mastí a tukových mastí, nebo, pokud je to možné, ve sprejové formě, přičemž se popřípadě může zlepšit přilnavost přísadou polymeru.

Pro intranazální forma aplikace se sloučeniny podle předloženého vynálezu smísí s běžnými přísadami pro tento účel, jako jsou například stabilizátory nebo inertní zředovací činidla, a pomocí běžných metod se převedou na vhodnou aplikační formu, jako je například vodná, alkoholická nebo olejová suspenze nebo vodný, alkoholický nebo olejový roztok. Do vodných intranazálních přípravků se mohou přidávat chelátotvorná činidla, jako je například kyselina ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',N'-tetraoctová, kyselina citrónová, kyselina vinná nebo jejich soli. Aplikace nazálních roztoků se může provádět pomocí dávkovacího rozprašovače nebo ve formě nosních kapek s přídavkem látky, zvyšující viskozitu, popřípadě ve formě nosního gelu nebo nosního krému.

Pro inhalační aplikaci se mohou využít zmlžovače nebo tlaková balení za použití inertního nosného plynu.

Pro intravenózní, subkutánní, epikutánní nebo intradermální aplikaci se aktivní látky nebo jejich fyziologicky přijatelné soli převedou podle požadavků s farmaceuticky běžnými pomocnými látkami, například pro isotonisaci nebo nastavení hodnoty pH, jakož i pro zprostředkováni rozpouštění, emulgátory nebo jinými pomocnými látkami, na roztoky, suspenze nebo emulze.

-11CZ 280682 B6

Na základě krátkého poločasu některých popsaných léčivých látek v tělních tekutinách je účelný přídavek injikovatelných retardujících přípravků. Jako lékové formy je možno například použít krystalové suspenze, mikrokapsle nebo implantáty, přičemž poslední mohou být vystaveny z polymerů, přijatelných pro tkáně, například na bázi kopolymerů kyseliny polymléčné a kyseliny polyglykolové, nebo lidského albuminu.

Vhodný rozsah dávkování pro topické a inhalační aplikační formy je z roztoků 0,1 až 5 mg/1, u systemických aplikačních forem 0,01 až 10 mg/kg.

Seznam používaných zkratek

Zkratky, používané pro aminokyseliny, odpovídají písmenovým kódům, běžným v chemii peptidů, jak je popsáno v Europ. J. Biochem. 138, 9 (1984). Další používané zkratky jsou uvedeny v následuj ícím:

acm epsilon-ahx aoc boc but bzl CDF cha chg

Cl-Z DMF DOMT dnp fmoc MDY me 4-mebzl mtr mts nal NMP npg oic opr pal pmc tbg TFA thia tes tic trt acetamidomethyl epsilon-aminohexyl cis, endo-2-azabicyklo/3.3.0/oktan-3-S-karbonyl terč.-butyloxykarbonyl terč.-butyl benzyl chlor-/D/-fenylalanyl cyklohexylalanyl cyklohexylglycyl 4-chlor-benzyloxykarbonyl dimethy1formamid 0-methyl-/D/-threonyl

2.4- dinitrofenyl

9-fluorenylmethyloxykarbonyl 0-methyl-/D/-tyrosyl methyl

4-methylbenzyl

4-methoxy-2,3,6-trimethylfenyl-sulfonyl mesitylen-2-sulfonyl

2-naftylalanyl N-methylpyrrolidon neopentylglycyl cis-endo-oktanhydroindol-2-karbonyl isoxazolidin-3-yl-karbonyl pyridylalanyl

2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl terč.-butylglycyl kyselina trifluoroctová

2-thienylalanyl

4-methylfenylsulfonyl

1.2.3.4- tetrahydroisochinolin-3-yl-karbonyl trityl.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady provedení slouží k objasnění výhodných metod syntézy v pevné fázi peptidů podle předloženého vynálezu bez toho, že by předložený vynález nějakým způsobem omezovaly.

-12CZ 280682 B6

Používají se následující deriváty aminokyselin: fmoc-arg/mtr/-OH, boc-/D/-arg-OH, fmoc-arg/pmc/-OH, fmoc-hyp-OH, fmoc-pro-Oobt, fmoc-gly-Oobt, fmoc-phe-Oobt, fmoc-ser/tbu/-Oobt, fmoc-/D/-tic-OH, fmoc-gln-OH, fmoc-aoc-OH, fmoc-thia-OH, fmoc-opr-OH, fmoc-/D/-asn-OH, fmoc-beta-ala-OH a fmoc-oic-OH.

Příklad 1

H-/D/-arg-arg-hyp-pro-gly-leu-ser-/D/-tic-oic-arg-OH

Uvedený peptid se syntetizuje na syntetizéru peptidů model 430 A firmy Applied Biosystems za použití fmoc-metody na p-benzyloxybenzylalkoholové pryskyřici, esterifikované fmoc-arg/mtr/-0H, firmy Novabiochem. Použije se 1 g uvedené pryskyřice a syntéza se provádí za pomoci syntézního programu, modifikovaného pro fmoc-metodu.

Do zásobníku syntetizéru se naváží vždy 1 mmol derivátu aminokyseliny s volnou karboxylovou skupinou společně s 0,95 mmol HOobt. Předaktivace těchto aminokyselin se provádí přímo v zásobníku rozpuštěním ve 4 ml dimethylformamidu a přídavkem 2 ml roztoku diisopropylkarbodiimidu v dimethylformamidu o koncentraci 0,55 mol/1.

HOobt-estery jiných aminokyselin se rozpustí v 6 ml NMP a potom se rovněž jako in sítu předaktivované aminokyseliny naváží na pryskyřici, odblokovanou předtím pomocí 20% pyridinu v dimethylformamidu. Po ukončení syntézy se peptid za současného odstranění ochranných skupin postranních řetězců kyselinou trichloroctovou odštěpí od pryskyřice za použití thioanisolu a ethandithiolu jako akceptorů elektronů. Zbytek, získaný po odtažení kyseliny trifluoroctové, se několikrát digeruje ethylesterem kyseliny octové a odcentrifuguje. Získaný produkt se chromatograf uje na Sephadexu LH 20 za pomoci 10% kyseliny octové. Frakce, obsahující čistý peptid, se spojí a za mrazu se vysuší.

MS/FAB/: 1264 /M+H/.

Látky, uvedené v následujících příkladech, byly připraveny analogickým postupem, jako v příkladě 1.

Příklad 2

H-/D/-arg-arg-hyp-pro-gly-cha-ser-/D/-tic-oic-arg-OH

MS /FAB/: 1304 /M+H/

Příklad 3

H-/D/-arg-arg-hyp-pro-gly-tbg-ser-/D/-tic-oic-arg-OH

MS /FAB/: 1264 /M+H/.

Claims

1· Peptidy s bradykinin-antagonistickým účinkem obecného vzorce I

A-B-C-E-F-K-(D)-Tic-G-M-F'-I ve kterém značí

B arginin, ornithin nebo lysin, přičemž guanidinová skupina, popřípadě aminoskupina postranního řetězce, mohou být substituovány vodíkovým atomem, alkanoylovou skupinou s 1 až 8 uhlíkovými atomy, aroylovou skupinou se 7 až 13 uhlíkovými atomy, heteroaroylovou skupinou se 3 až 9 uhlíkovými atomy, alkylsulfonylovou skupinou s 1 až 8 uhlíkovými atomy nebo arylsulfonylovou skupinou se 6 až 12 uhlíkovými atomy, přičemž arylová, heteroarylová, aroylová, arylsulfonylová a heteroaroylová skupina mohou být popřípadě jednou, dvakrát, třikrát nebo čtyřikrát substituovány stejnými nebo různými zbytky, vybranými ze skupiny, zahrnující methylovou skupinu, methoxyskupinu a atom halogenu

C Pro-Pro-Gly, Hyp-Pro-Gly nebo Pro-Hyp-Gly,

E Leu, Ile, Tbg nebo Cha,

F Ser, Η-Ser, Lys, Leu, Val, Nle, Ile, nebo Thr

K přímou vazbu, (D)-Tic zbytek vzorce V

M přímou vazbu,

G zbytek heterocyklického kruhového systému obecného vzorce IV, (IV)

-14CZ 280682 B6 přičemž R⁴ a R⁵ společně s atomy, na které jsou vázány, tvoří heterocyklický mono-, di-, nebo tricyklický kruhový systém se 2 až 15 uhlíkovými atomy, nebo přímou vazbu, přičemž zbytky heterocyklů jsou výhodné kyselina pyrrolidin-2-karboxylová, kyselina piperidin-2-karboxylová, kyselina tetrahydroisochinolin-3-karboxylová, kyselina cis-dekahydroisochinolin-2-karboxylová, kyselina trans-dekahydroisochinolin-3-karboxylová, kyselina cis-endo-oktahydroindol-2-karboxylové, kyselina cis-exo-oktahydroindol-2-karboxylová, kyselina trans-oktahydroindol-2-karboxylová, kyselina cis-endo-oktahydrocyklopenta/b/pyrrol-2-karboxylová, kyselina cis-exo-oktahydrocyklopenta/b/pyrrol-2-karboxylová, kyselina trans-oktahydropenta/b/-pyrrol-2-karboxylová nebo kyselina hydroxyprolin-2-karboxylová,

F' arginin a

I hydroxyskupinu jakož i jejich fyziologicky přijatelné soli.

2. Peptidy podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém

A značí B značí C značí E značí F značí K a M značí G značí F ' značí I značí

H-(D)-Arg,

Arg,

Pro-Hyp-Gly,

Leu, Tbg nebo Cha,

Ser, přímou vazbu,

Oic,

Arg a hydroxylovou skupinu, jakož i jejich fyziologicky přijatelné soli.

3. Způsob výroby peptidů obecného vzorce I podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že se

a) nechá reagovat fragment s C-terminální volnou karboxylovou skupinou, nebo jeho aktivovaný derivát, s odpovídajícím fragmentem s N-terminální volnou aminoskupinou, nebo se

b) postupné konstruuje peptid, načež se ve sloučenině, získané postupem a) nebo b), popřípadě odštěpí jedna nebo několik dočasně zavedených ochranných skupin k ochraně jiných funkcí, a takto získané sloučeniny obecného vzorce I se popřípadě převedou na svoje fyziologicky neškodné soli.

Peptid obecného vzorce I podle nároku 1 jako léčivo.

nebo 2 pro použití

5. Peptid obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2 pro použití jako léčivo pro aplikaci při patologických stavech, způsobených, vyvolaných nebo podporovaných bradykininem a bradykininu příbuznými peptidy.

-15CZ 280682 B6

6. Farmaceutický prostředek pro aplikaci při patologických stavech, způsobených, vyvolaných nebo podporovaných bradykininem a bradykininu příbuznými peptidy, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje peptid obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2.