ES3033729T3 - Polypeptide constructs and uses thereof - Google Patents

Polypeptide constructs and uses thereof

Info

Publication number
ES3033729T3
ES3033729T3 ES12843185T ES12843185T ES3033729T3 ES 3033729 T3 ES3033729 T3 ES 3033729T3 ES 12843185 T ES12843185 T ES 12843185T ES 12843185 T ES12843185 T ES 12843185T ES 3033729 T3 ES3033729 T3 ES 3033729T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
cells
antigen
seq
ifn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12843185T
Other languages
English (en)
Inventor
Wilson, Jr
Sarah L Pogue
Glen E Mikesell
Tetsuya Taura
Wouter Korver
Antony G Doyle
Adam Clarke
Matthew Pollard
Stephen Tran
Jack Tzu Chiao Lin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Original Assignee
Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2011904502A external-priority patent/AU2011904502A0/en
Application filed by Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd filed Critical Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES3033729T3 publication Critical patent/ES3033729T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5406—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C07K16/11—
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La presente invención proporciona un constructo polipeptídico que comprende un ligando de señalización peptídica o polipeptídica unido a un anticuerpo o a una porción de unión a antígeno del mismo que se une a un antígeno asociado a la superficie celular, en donde el ligando comprende al menos una sustitución o deleción de aminoácido que reduce su potencia en células que carecen de expresión de dicho antígeno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Construcciones polipeptídicas y usos de las mismas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a construcciones polipeptídicas que comprenden ligandos polipeptídicos mutados y atenuados unidos a anticuerpos, en donde los anticuerpos dirigen los ligandos mutados a células que expresan en su superficie los antígenos a los que se unen dichos anticuerpos, así como a receptores para dichos ligandos. La invención también se refiere a composiciones que comprenden las construcciones polipeptídicas y a dichas construcciones polipeptídicas para su uso en el tratamiento del cáncer.
Antecedentes de la invención
Se ha descrito que numerosos ligandos peptídicos y polipeptídicos funcionan interactuando con un receptor sobre la superficie celular, y estimulando de este modo, inhibiendo o modulando de otro modo una respuesta biológica, normalmente a través de vías de transducción de señales dentro de la célula portadora de dicho receptor. Los ejemplos de estos ligandos incluyen hormonas peptídicas y polipeptídicas, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, factores inductores de apoptosis y similares. Los ligandos naturales pueden ser solubles o estar unidos a la superficie de otra célula.
Debido a la actividad biológica de dichos ligandos, algunos tienen un uso potencial como agentes terapéuticos. Varios ligandos peptídicos o polipeptídicos han sido aprobados por las agencias reguladoras como productos terapéuticos, incluyendo, por ejemplo, hormona de crecimiento humana, insulina, interferón (IFN)-a2b, IFNa2a, IFNp, eritropoyetina, G-CSF y g M-CSF. Muchos de estos y otros ligandos han demostrado potencial en aplicaciones terapéuticas, pero también han mostrado toxicidad al administrarse a pacientes humanos. Una razón de esta toxicidad es que la mayoría de estos ligandos activan receptores en diversas células, incluyendo células distintas a las que median en el efecto terapéutico. Por ejemplo, cuando se usa IFNa2b para tratar el mieloma múltiple, su utilidad reside, al menos en parte, en su unión a los receptores de interferón tipo I en las células del mieloma, lo que a su vez reduce la proliferación y, por lo tanto, limita la progresión de la enfermedad. Desafortunadamente, sin embargo, este IFN también se une a muchas otras células normales del organismo, desencadenando diversas respuestas celulares, algunas de las cuales son perjudiciales (por ejemplo, síntomas pseudogripales, neutropenia, depresión). Una consecuencia de dicha actividad "inespecífica" de los ligandos es que muchos de ellos no son adecuados como candidatos farmacológicos. En este contexto, la "actividad inespecífica" se refiere a la actividad en el receptor natural del ligando, pero en la superficie de células distintas de las que median en los efectos terapéuticos beneficiosos.
Aunque algunos ligandos, tal como IFNa2b, están aprobados para el tratamiento de afecciones médicas, presentan una mala tolerancia debido a su actividad biológica "inespecífica". La actividad inespecífica y la mala tolerabilidad asociada también implican que algunos de estos fármacos a base de ligandos peptídicos no se pueden administrar en dosis suficientemente altas para producir efectos terapéuticos óptimos en las células diana que median en el efecto terapéutico.
De manera similar, desde mediados de la década de 1980 se sabe que los interferones, en particular IFNa, pueden aumentar la apoptosis y disminuir la proliferación de determinadas células cancerosas. Estas actividades biológicas están mediadas por los receptores de interferón tipo I en la superficie de las células cancerosas, que, al estimularse, inician diversas vías de transducción de señales que conducen a una menor proliferación y/o a la inducción de la diferenciación terminal o apoptosis. El IFNa ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento de varios cánceres, incluyendo melanoma, carcinoma de células renales, linfoma de linfocitos B, mieloma múltiple, leucemia mieloide crónica (LMC) y tricoleucemia. Un efecto "directo" del IFNa sobre las células tumorales está mediado por la unión directa de IFNa al receptor de IFN tipo I en estas células, y la estimulación de la apoptosis, la diferenciación terminal o la reducción de la proliferación. Un efecto "indirecto" del IFNa en células no cancerosas es la estimulación del sistema inmunitario, lo que puede producir un efecto antineoplásico adicional al provocar que el sistema inmunitario rechace el tumor.
Desafortunadamente, el receptor de interferón tipo I también está presente en la mayoría de las células no cancerosas. La activación de este receptor en dichas células por el IFNa provoca la expresión de numerosas citocinas y quimiocinas proinflamatorias, lo que provoca toxicidad. Dicha toxicidad impide la dosificación de IFNa a un sujeto a niveles que ejerzan la máxima actividad antiproliferativa y proapoptótica en las células cancerosas.
Ozzelloet al.(Breast Cancer Research and Treatment 25:265-76, 1993) describieron la unión covalente de IFNa humano a un anticuerpo dirigido contra el tumor, localizando así la actividad inhibidora directa del IFNa en el tumor como una forma de reducir las tasas de crecimiento tumoral, y demostraron que dichos conjugados tienen actividad antitumoral en un
modelo de xenoinjerto de cáncer humano. El mecanismo de la actividad antineoplásica observada se atribuyó a un efecto directo del IFNa sobre las células cancerosas, ya que el IFNa humano usado en los experimentos no interactuó de manera apreciable con el receptor murino de IFN tipo I, lo que podría haber provocado un efecto antineoplásico indirecto. Sin embargo, debido a esta falta de unión del IFNa humano a las células murinas, los autores no pudieron evaluar la toxicidad del conjugado anticuerpo-IFNa en relación con el INFa libre. Estos autores usaron un método químico para unir el IFNa al anticuerpo.
Alkanet al.,(Journal of Interferon Research, volumen 4, número 3, pág. 355-63, 1984) demostraron que la unión del IFNa humano a un anticuerpo que se une al antígeno de membrana (MA) del virus de Epstein-Barr (v Eb ) aumentó su actividad antiproliferativa hacia las células que expresan el antígeno VEB-MA. Este aumento de potencia dependía tanto de la expresión del antígeno por las células diana como de la especificidad de unión del anticuerpo. La estirpe celular analizada fue la estirpe celular cancerosa QIMR-WIL, una leucemia mieloblástica. Los autores sugirieron que la unión del IFNa a un anticuerpo podría usarse como tratamiento para el cáncer, ya que reduciría el crecimiento tumoral. Alkanet al.no abordaron la posible toxicidad de estos conjugados anticuerpo-IFNa que surge de sus interacciones con células negativas para antígeno normales.
También se sabe que la unión entre un anticuerpo e IFNa puede lograrse mediante la creación de una construcción de proteína de fusión. Por ejemplo, IDEC (documento WO01/97844) divulgan una fusión directa de IFNa humano con el extremo C de la cadena pesada de una IgG dirigida al antígeno tumoral CD20. Otros grupos han divulgado el uso de diversos enlazadores entre el extremo C de una cadena pesada de IgG y el IFNa. Por ejemplo, el documento US 7.456.257 divulga que el extremo C de la región constante de cadena pesada de anticuerpo puede conectarse al IFNa mediante un enlazador rico en serina-glicina (S/G) intermedio de la secuencia (GGGGS)<n>, donde n puede ser 1,2 o 3, y que no existen diferencias significativas en la actividad de IFNa de la construcción de proteína de fusión, independientemente de la longitud del enlazador.
Morrisonet al.(documento US2011/0104112 A1; y Xuan C, Steward KK, Timmerman JM, Morrison SL. Targeted delivery of interferon-a via fusion to anti-CD20 results in potent antitumor activity against B-cell lymphoma. Blood 2010;115:2864-71) también divulgan la unión de IFNa al extremo C de la cadena pesada de un anticuerpo IgG dirigido contra el cáncer, con un enlazador S/G intermedio, y observaron que la fusión de la IgG y el enlazador con el IFNa redujo la actividad del IFNa en células que no expresaban el antígeno correspondiente en la superficie celular. La disminución de la actividad del IFN en estas construcciones de proteínas de fusión fue modesta en comparación con IFNa no proteína de fusión (IFNa libre) humano que actúa sobre células humanas, pero pareció ser más significativa para el IFNa murino en células murinas. La disminución de la actividad del IFNa humano resultante de su fusión al extremo C de un anticuerpo, como se observó por Morrisonet al,y en el documento US 7.456.257, es modesta y generalmente se considera una desventaja, ya que reduce la potencia del ligando. Esta desventaja fue señalada, por ejemplo, por Rossiet al.(Blood vol. 114, N.° 18, págs. 3864-71), quienes usaron una estrategia alternativa para unir el IFNa a un anticuerpo dirigido contra un tumor, de tal manera que no se observó pérdida de actividad del IFNa.
En general, la técnica anterior enseña a usar un IFN potente y a dirigir este IFN a células cancerosas. Si bien este enfoque produce un aumento de la actividad del IFN contra las células cancerosas, no aborda el problema de la actividad del IFN en células "inespecíficas" normales. En los ejemplos de la técnica anterior mencionados anteriormente, la porción humana de IFNa de la proteína de fusión anticuerpo-IFNa mantuvo una alta proporción de actividad de IFNa natural al exponerse a células humanas que no expresan el antígeno correspondiente en sus superficies celulares. Esta actividad puede provocar toxicidad derivada de la activación de células normales no cancerosas ("inespecíficas") por la porción de IFNa de la proteína de fusión. Por consiguiente, existe la necesidad de disminuir la actividad "inespecífica" de los fármacos a base de ligandos, manteniendo al mismo tiempo el efecto terapéutico "específico" de dichos ligandos. El mantenimiento de la actividad del ligando específica de la diana y, al mismo tiempo, la reducción de la toxicidad no diana de los agentes terapéuticos a base de ligandos crearía una mayor ventana de concentración terapéutica para ligandos terapéuticamente útiles. Por ejemplo, sería deseable usar IFNa humano en una forma que permita que se pueda dirigir su actividad a las células cancerosas, minimizando al mismo tiempo sus efectos sobre las células humanas normales. De manera ideal, el receptor de interferón tipo I en las células cancerosas se estimularía al máximo, mientras que el mismo receptor en las células no cancerosas experimentaría una estimulación mínima. Existe la necesidad de dirigir el IFNa humano a las células cancerosas de tal manera que tenga una actividad considerablemente mayor en las células cancerosas, que presentan el antígeno, que en las células normales, que no presentan el antígeno. La misma lógica se aplica a otros ligandos potencialmente terapéuticos, por ejemplo, otras citocinas, hormonas peptídicas y polipeptídicas, quimiocinas, factores de crecimiento, factores inductores de apoptosis y similares.
Sumario de la invención
La invención se describe en las reivindicaciones adjuntas. Los presentes inventores han encontrado que cuando un ligando de señalización peptídica o polipeptídica, con una o más mutaciones que reducen sustancialmente su afinidad por su receptor, se une a un anticuerpo que dirige el ligando mutado a células diana que presentan el antígeno correspondiente del anticuerpo, la actividad del ligando en las células diana positivas para antígeno se mantiene, mientras que la actividad del ligando en las células no diana negativas para antígeno se reduce sustancialmente. El resultado es una molécula de señalización de ligando que tiene una potencia mucho mayor en la activación de sus receptores en las células diana positivas para antígeno, en comparación con las células no diana negativas para antígeno, lo que proporciona un medio para reducir la toxicidad que surge de la actividad del ligando inespecífica.
Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invención proporciona una construcción polipeptídica que comprende un interferón (IFN) unido a un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une a un antígeno asociado a la superficie celular, en donde el IFN es un interferón a (IFNa) atenuado que comprende, en relación con el tipo natural, una mutación como se representa en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en R144A (SEQ ID NO:30), R144S (SEQ ID NO:40), R144T (SEQ ID NO:41), R144Y (SEQ ID NO:43), R144I (SEQ ID NO:35), R144L (SEQ ID NO:37), A145D (SEQ ID NO:44), A145H (SEQ ID NO:47), A145Y (SEQ ID NO:58), A145K (SEQ ID NO:49), R33A+YNS (SEQ ID NO:65), R33A (SEQ ID NO:16) y R144A+YNS (SEQ ID NO:68).
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende la construcción polipeptídica de la presente invención y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona la construcción polipeptídica de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer.
A diferencia de la unión de un ligando humano "natural" o "de tipo natural" no atenuado a un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que típicamente da como resultado una potencia del ligando de 1 a 15 veces mayor en células positivas para antígeno en comparación con las negativas para antígeno, la presente invención demuestra que la unión de formas mutadas y atenuadas del ligando al mismo anticuerpo puede generar una mayor potencia en células positivas para antígeno en comparación con las células negativas para antígeno.
En una realización, la construcción polipeptídica muestra al menos 10, al menos 100, al menos 1.000, al menos 10.000 o al menos 100.000 veces más selectividad hacia células positivas para antígeno que hacia células negativas para antígeno, en comparación con el ligando libre de tipo natural, usando el ensayo "inespecífico" y los ensayos "específico (ARP)" o "específico (Daudi)" descritos en el presente documento.
La presente invención también proporciona proteínas de fusión anticuerpo-ligando atenuado, en donde la construcción de proteína de fusión, al inyectarse en un ratón con un tumor humano establecido, puede eliminar el tumor.
La presente invención también proporciona proteínas de fusión anticuerpo-ligando atenuado, en donde la construcción de proteína de fusión, al inyectarse en un ratón con un tumor humano establecido con un volumen superior a 500 milímetros cúbicos, puede eliminar el tumor.
La presente invención también proporciona proteínas de fusión anticuerpo-ligando atenuado, en donde la construcción de proteína de fusión, al inyectarse como tratamiento único en un ratón con un tumor humano establecido, puede eliminar el tumor.
La presente invención también proporciona proteínas de fusión anticuerpo-ligando atenuado, en donde la construcción de proteína de fusión puede eliminar tanto tumores de mieloma establecidos como tumores de linfoma establecidos en un ratón
En cada uno de estos casos, se prefiere que el antígeno asociado a la superficie celular sea CD38.
En una realización, la secuencia de aminoácidos del ligando de señalización que comprende al menos una sustitución o deleción de aminoácidos tiene más de un 90 %, o más de un 95 %, o más de un 96 %, o más de un 97 %, o más de un 98 %, o más de un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de ligando de tipo natural.
En una realización, la construcción es una proteína de fusión.
En determinadas realizaciones, el ligando de señalización está unido al extremo C de la cadena pesada del anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo. En determinadas realizaciones, el ligando de señalización está unido al extremo C de la cadena ligera del anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo. En cualquiera de estas realizaciones, el ligando puede estar unido directamente al extremo C de la cadena pesada o ligera del anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, (es decir, sin un enlazador adicional intermedio).
En una realización, el antígeno asociado a la superficie celular se selecciona del MHC de clase I o PD-1.
En determinadas realizaciones, el antígeno asociado a la superficie celular es un antígeno asociado a mieloma que se selecciona del grupo que consiste en CD38, HM1.24, CD56, CS1, CD138, CD74, IL-6R, Blys (BAFF), BCMA,<h>L<a>-SR, quininógeno, beta2 microglobulina, FGFR3, ICAM-1, matriptasa, CD52, EGFR, GM2, integrina alfa 4, IFG-1R y KIR.
En una realización, el ligando de señalización es IFNa2b con las mutaciones reivindicadas. Como se divulga en el presente documento, el ligando de señalización puede seleccionarse de uno cualquiera de IFNp, IL-4 o IL-6.
En la invención, el ligando de señalización es un IFNa y la sustitución se selecciona del grupo que consiste en R144A (SEQ ID NO:30), R144S (SEQ ID NO:40), R144T (SEQ ID NO:41), R144Y (SEQ ID NO:43), R144I (SEQ ID NO:35), R144L (SEQ ID NO:37), A145D (SEQ ID NO:44), A145H (SEQ ID NO:47), A145Y (SEQ ID NO:58), A145K (SEQ ID NO:49), R33A+YNS (SEQ ID NO:65), R33A (SEQ ID NO:16) y R144A+YNS (SEQ ID NO:68).
En determinadas realizaciones en las que el antígeno asociado a la superficie celular es CD38, el anticuerpo se selecciona de uno cualquiera de G003, G005, G024, MOR03077, MORO3079, MORO3080, MORO3100, 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31, 38SB39, OKT10, X355/02, X910/12, X355/07, X913/15, R5D1, R5E8, R10A2, o una porción de unión a antígeno de los mismos, o un anticuerpo con más de un 95 %, más de un 96 %, más de un 97 %, más de un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con uno cualquiera de R5D1, R5E8 o R10A2.
En determinadas realizaciones en las que el antígeno asociado a la superficie celular es CD38, la construcción polipeptídica sirve para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto seleccionado de mieloma múltiple, una leucemia o un linfoma. En realizaciones particulares, el sujeto también recibe tratamiento con un retinoide, tal como ácido retinoico todo-frans. En determinadas realizaciones en las que el antígeno asociado a la superficie celular es CD38, el tumor o cáncer puede seleccionarse de mieloma múltiple, linfoma no hodgkin, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica o leucemia mieloide aguda.
En realizaciones en las que el ligando está unido a un anticuerpo, el anticuerpo puede ser una IgG4. En realizaciones particulares, la IgG4 comprende una sustitución de aminoácidos S228P.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, puede unirse a un antígeno asociado a la superficie celular en células infectadas por virus. En estas realizaciones, el antígeno asociado a la superficie celular puede seleccionarse entre una proteína codificada por virus, la fosfatidilserina o una proteína de unión a fosfatidilserina. En las realizaciones en las que el antígeno asociado a la superficie celular es fosfatidilserina o una proteína de unión a fosfatidilserina, la construcción puede usarse para tratar la hepatitis C.
En determinadas realizaciones, el antígeno asociado a la superficie celular se selecciona de CD20, CD38, CD138 o CS1. En determinadas realizaciones, el tumor o cáncer puede seleccionarse de mieloma múltiple, melanoma, carcinoma de células renales, leucemia mielógena crónica o tricoleucemia.
En una realización particular, la construcción es G005-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4.
Como se divulga en el presente documento, cuando el ligando de señalización de la construcción polipeptídica es un IFNp, el antígeno asociado a la superficie celular puede ser un linfocito T, una célula mieloide o una proteína asociada a la superficie celular de una célula presentadora de antígeno.
Como se divulga en el presente documento, cuando el ligando de señalización de la construcción polipeptídica es un IFNp, el antígeno asociado a la superficie celular puede seleccionarse del grupo que consiste en CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD44, CD69, CD71, CD83, CD86, CD96, HLA-DR, PD-1, ICOS, CD33, CD115, CD11c, CD14, CD52 y PD-1. La construcción puede usarse para tratar una enfermedad caracterizada por un exceso de inflamación, tal como una enfermedad autoinmunitaria.
Como se divulga en el presente documento, cuando el ligando de señalización de la construcción polipeptídica es un IFNp, la al menos una sustitución o deleción de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en R35A, R35T, E42K, M62I, G78S, A141Y, A142T, E149K, R152H. El IFNp también puede presentar una sustitución C17S o C17A.
Como se divulga en el presente documento, el ligando de señalización de la construcción polipeptídica puede ser un IFNy. El antígeno asociado a la superficie celular puede ser un antígeno asociado a tumor. El antígeno asociado a la superficie celular puede seleccionarse del grupo que consiste en CD14, FSP1, FAP, PDGFR alfa y PDGFR beta. La construcción puede usarse para tratar una enfermedad caracterizada por un exceso de fibrosis.
Como se divulga en el presente documento, cuando el ligando de señalización de la construcción polipeptídica es un IFNy, la al menos una sustitución o deleción de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en una deleción de residuos A23 y D24, una sustitución S20I, una sustitución A23V, una sustitución D21K y una sustitución D24A.
Como se divulga en el presente documento, cuando el ligando de señalización de la construcción polipeptídica es una IL-4, el antígeno asociado a la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en CD3, CD4, CD24, CD38, CD44, CD69, CD71, CD96, PD-1, ICOS, CD52 y PD-1.
Como se divulga en el presente documento, cuando el ligando de señalización de la construcción polipeptídica es una IL-6, el antígeno asociado a la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en CD3, CD4, CD24, CD38, CD44, CD69, CD71, CD96, PD-1, ICOS, CD52 y PD-1.
Como se divulga en el presente documento, cuando el ligando de señalización de la construcción polipeptídica es un HGF, el antígeno asociado a la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en ASGR1, ASGR2, FSP1, RTI140/Ti-alfa, HTI56 y un receptor de VEGF.
Como se divulga en el presente documento, cuando el ligando de señalización de la construcción polipeptídica es un TGFp, el antígeno asociado a la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD44, CD69, CD71, CD83, CD86, CD96, HLA-DR, PD-1, ICOS, CD33, CD115, CD11c, CD14, CD52 y PD-1. Como se divulga en el presente documento, cuando el ligando de señalización de la construcción polipeptídica es una eritropoyetina, el antígeno asociado a la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en CD241, el producto del gen RCHE, CD117 (c-kit), CD71 (receptor de transferrina), CD36 (receptor de trombospondina), CD34, CD45RO, CD45RA, CD115, CD168, CD235, CD236, CD237, CD238, CD239 y CD240.
Como se divulga en el presente documento, cuando el ligando de señalización de la construcción polipeptídica es una interleucina-10 y el antígeno asociado a la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en CD11c, CD33 o CD115, CD14, FSP1, FAP o PDGFR (alfa o beta).
En el presente documento se divulgan anticuerpos anti-CD38 con regiones variables denominadas X910/12, X913/15, X355/02, X355/07, R5D1, R5E8 o R10A2, cuyas secuencias se exponen a continuación:
A partir de estas secuencias, el experto en la materia puede identificar fácilmente las secuencias de CDR mediante métodos conocidos. Como se reconocerá por el trabajador experto, estas secuencias de CDR se pueden usar en secuencias marco diferentes a las especificadas en las SEQ ID NO especificadas anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un esquema de determinadas realizaciones de la presente invención que comprenden un anticuerpo que consiste en 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras, en el que uno o dos ligandos de señalización atenuados están unidos a cada cadena pesada, a cada cadena ligera o a ambas.
La figura 2 muestra un esquema que ilustra un posible enfoque sobre cómo las proteínas de fusión anticuerpo-ligando atenuado de la presente invención provocan señalización mediante la activación de receptores en células que muestran el antígeno correspondiente a dicho anticuerpo en sus superficies celulares. La proteína de fusión activa el receptor en la misma célula a la que se une el anticuerpo, a través de su antígeno específico.
La figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos del CD38 humano (SEQ ID NO:131).
La figura 4 muestra las secuencias de aminoácidos de determinados ligandos de señalización de ejemplo de la presente invención y divulgación: (a) IFNa2b, IFNp1, IFNp1b e IFNy humanos; (b) IL-4 e IL-6.
La figura 5 muestra las secuencias de aminoácidos de determinadas proteínas de fusión anticuerpo-ligando atenuado de la presente invención y divulgación: (a) G005-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4; (b) nBT062-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4; (c) G005-HC-L0-IFNP (R35A) IgG4; (d) HB95-HC-L16-IL-6 (R179E) IgG1; y (e) J110-HC-L6-IL-4 (R88Q) IgG1. La nomenclatura de las proteínas de fusión se describe en los ejemplos.
La figura 6 muestra la actividad de interferón no dirigida por anticuerpo-antígeno de IFNa2b, y de las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFN Rituximab-IFNa2b (Rituximab-HC-L6-IFNa IgG1) y Palivizumab-IFNa2b (Isotipo-HC-L6-IFNa IgG1) en el ensayo de actividad de interferón descrito en los ejemplos a continuación como el "ensayo inespecífico". En las figuras, "equivalentes de IFNa" se refiere a la concentración molar de moléculas de interferón, ya sean libres o unidas a un anticuerpo. "IFN" se refiere a interferón de tipo natural libre (no proteína de fusión).
La figura 7 muestra la actividad de interferón dirigida por anticuerpo-antígeno de la construcción de proteína de fusión Rituximab-IFNa2b (Rituximab-HC-L6-IFNa IgG1) en comparación con IFNa2b en el ensayo antiproliferativo descrito en los ejemplos a continuación como el "ensayo específico (Daudi)".
La figura 8 muestra la actividad de interferón dirigida por anticuerpo-antígeno de la construcción de proteína de fusión Rituximab-IFNa (Rituximab-HC-L6-IFNa IgG1) en comparación con la actividad no dirigida de la construcción de proteína de fusión Palivizumab-IFNa (Isotipo-HC-L6-IFNa IgG1) en el "ensayo específico (Daudi)" descrito en los ejemplos a continuación.
La figura 9 muestra la actividad de interferón no dirigida por anticuerpo-antígeno de IFNa2b, de las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFN Rituximab-IFNa2b (Rituximab-HC-L6-IFNa IgG1) y Palivizumab-IFNa2b (Isotipo-HC-L6-IFNa IgG1), y de determinadas variantes de construcciones Rituximab-IFNa2b que se han mutado para reducir su actividad de interferón. El ensayo se describe en los ejemplos como "ensayo inespecífico".
La figura 10 muestra la actividad de interferón no dirigida por anticuerpo-antígeno de las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFN Rituximab-IFNa2b (Rituximab-HC-L6-IFNa IgG1) y de dos variantes de Rituximab-IFNa2b que se mutaron para reducir la actividad de interferón. El ensayo se describe en los ejemplos como "ensayo inespecífico".
La figura 11 muestra la actividad de interferón dirigida por anticuerpo-antígeno de la construcción de proteína de fusión anticuerpo-IFN Rituximab-IFNa2b (Rituximab-HC-L6-IFNa IgG1) y de variantes de construcciones Rituximab-IFNa2b que se han mutado para reducir su actividad de interferón en comparación con la actividad no dirigida de las construcciones de proteína de fusión Palivizumab-IFNa2b (Isotipo-HC-L6-IFNa IgG1) y en comparación con IFNa2b. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (Daudi)".
La figura 12 muestra la actividad de interferón dirigida por anticuerpo-antígeno de las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFN Rituximab-IFNa2b (Rituximab-HC-L6-IFNa IgGl) y de dos variantes que se mutaron para reducir la actividad de interferón. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (Daudi)".
La figura 13 muestra las secuencias de determinados anticuerpos anti-CD38 humanos novedosos divulgados en el presente documento.
La figura 14 muestra los resultados de la detección de la unión de anticuerpos anti-CD38 humanos novedosos a una estirpe celular CD38+ RPMI-8226 mediante citometría de flujo. El eje x representa la concentración de anticuerpos en microgramos/ml y el eje y representa la intensidad media de fluorescencia.
La figura 15 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de IFNa2b en comparación con una construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNa (G005-HC-L0-IFNa IgG4), basándose en el anticuerpo anti-CD38 G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 16 muestra la actividad antiproliferativa de IFNa2b frente a una construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNa (G005-HC-L0-IFNa IgG4) en la estirpe celular de mieloma múltiple ARP-1 (CD38+). El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (ARP)".
La figura 17 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de IFNa2b frente a diversas construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa portadoras de mutaciones puntuales en la porción IFN. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtuvieron del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 18 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de IFNa2b frente a diversas construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa portadoras de mutaciones puntuales en la porción IFN. Las regiones variables de anticuerpo de estas proteínas de fusión se obtuvieron del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 19 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de IFNa2b frente a dos construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa portadoras de mutaciones puntuales en la porción IFN. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 20 muestra la actividad antiproliferativa de IFNa2b frente a construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con mutaciones en la porción IFN en la estirpe celular de linfoma Daudi. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (Daudi)".
La figura 21 muestra la actividad antiproliferativa de IFNa2b y diversas proteínas de fusión anti-CD38-IFNa con la mutación A145G en la porción IFN. Las construcciones de proteínas de fusión tienen el enlazador de 6 aminoácidos L6 o no tienen enlazador (L0) y son del isotipo IgG1 o IgG4. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (Daudi)".
La figura 22 muestra la actividad antiproliferativa de IFNa2b y dos proteínas de fusión anti-CD38-IFNa con la mutación A145G en la porción IFN. Ambas construcciones de proteínas de fusión tenían la porción de IFN unida al extremo C de la cadena ligera, con un enlazador de seis aminoácidos (L6) o sin enlazador (L0). Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (Daudi)".
La figura 23 muestra la actividad antiproliferativa en la estirpe celular de mieloma múltiple ARP-1 de IFNa2b frente a construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con la mutación R144A en la porción IFN. El experimento compara la potencia de las construcciones de proteínas de fusión en función del isotipo (IgG1 frente a IgG4) y la presencia o ausencia del enlazador L6 entre el extremo C de la cadena pesada de anticuerpo y el extremo N del IFN mutado. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (ARP)".
La figura 24 muestra la actividad antiproliferativa en la estirpe celular de mieloma múltiple ARP-1 de IFNa2b frente a construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con la mutación A145G en la porción IFN. El experimento compara la potencia de las construcciones de proteínas de fusión en función del isotipo (IgG1 frente a IgG4) y la presencia o ausencia del enlazador L6 entre el extremo C de la cadena pesada de anticuerpo y el extremo N del IFN mutado. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (ARP)".
La figura 25 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de diversas construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con diferentes mutaciones puntuales en la porción IFN. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 26 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de diversas construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con diferentes mutaciones puntuales en la porción IFN. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 27 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de diversas construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con diferentes mutaciones puntuales en la porción IFN. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 28 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de diversas construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con diferentes mutaciones puntuales en la porción IFN. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 29 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de IFNa2b frente a diversas construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con diferentes mutaciones puntuales en la porción IFN. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 30 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de diversas construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con diferentes mutaciones puntuales en la porción IFN. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 31 muestra la actividad antiproliferativa en la estirpe celular de mieloma múltiple ARP-1 de construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con las diversas mutaciones en la porción IFN. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (ARP)".
La figura 32 muestra la actividad antiproliferativa en la estirpe celular de mieloma múltiple ARP-1 de IFNa2b frente a construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con las diversas mutaciones en la porción IFN. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (ARP)".
La figura 33 muestra la actividad antiproliferativa en la estirpe celular de mieloma múltiple ARP-1 de IFNa2b frente a construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con la mutación R144A en la porción IFN. El experimento compara diferentes regiones variables de anticuerpo en el contexto de la misma proteína de fusión de IFN mutada. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (ARP)".
La figura 34 muestra la actividad antiproliferativa en la estirpe celular de mieloma múltiple ARP-1 de IFNa2b frente a construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con la mutación A145D en la porción IFN. El experimento compara diferentes regiones variables de anticuerpo en el contexto de la misma construcción de proteína de fusión de IFN mutada. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (ARP)".
La figura 35 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de IFNa2b y diversas construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con la mutación R144A en la porción IFN. El experimento compara diferentes regiones variables de anticuerpo en el contexto de la misma construcción de proteína de fusión de IFN mutada. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 36 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de IFNa2b y diversas construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con la mutación A145D en la porción IFN. El experimento compara diferentes regiones variables de anticuerpo en el contexto de la misma construcción de proteína de fusión de IFN mutada. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 37 muestra la actividad antiproliferativa en la estirpe celular de mieloma múltiple ARP-1 de IFNa2b frente a construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con la mutación A145D en la porción IFN. El experimento compara diferentes regiones variables de anticuerpo en el contexto de la misma construcción de proteína de fusión de IFN mutada. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (ARP)".
La figura 38 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de IFNa2b y diversas construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa con la mutación A145D en la porción IFN. El experimento compara diferentes regiones variables de anticuerpo en el contexto de la misma construcción de proteína de fusión de IFN mutada. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 39 muestra la actividad antiproliferativa en la estirpe celular de mieloma múltiple ARP-1 de dos construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa con la mutación A145D en la porción IFN. El anticuerpo nBT062 se une a CD138, mientras que el anticuerpo de "isotipo" no lo hace (procede del anticuerpo 2D12). El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (ARP)".
La figura 40 (a) muestra la actividad antiproliferativa en la estirpe celular de mieloma múltiple ARP-1 de IFNa2b y dos construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa con la mutación A145D en la porción IFN. El anticuerpo HB95 se une al MHC de clase I humano (que se expresa en las células ARP-1), mientras que el anticuerpo de "isotipo" no lo hace (procede del anticuerpo 2Dl2). Palivizumab, al igual que 2D12, no se une a las células ARP-1. (b) muestra el mismo ensayo, comparando construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa atenuado, en las que la porción de anticuerpo es un fragmento Fab en lugar de un anticuerpo completo. Para los paneles (a) y (b), el ensayo se describe en los ejemplos como "ensayo específico (ARP)".
La figura 41 muestra mediciones de la actividad antivírica de IFNa y dos construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa con la mutación A145D en la porción IFN. Este ensayo de inhibición del efecto citopático utilizó la estirpe celular A549 y el virus EMC. El anticuerpo HB95 se une al MHC de clase I humano (que se expresa en las células A549), mientras que el anticuerpo de "isotipo" procedente del anticuerpo 2D12 no lo hace.
La figura 42 muestra la actividad de IFN no dirigida por anticuerpo-antígeno de IFNp, una construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNp y una construcción de proteína de fusión idéntica pero con la mutación R35A atenuante en la porción IFN. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo inespecífico".
La figura 43 muestra la actividad antiproliferativa en la estirpe celular de mieloma múltiple ARP-1 de IFNp, una construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNp y una construcción de proteína de fusión idéntica pero con la mutación R35A atenuante en la porción IFN. Las regiones variables de anticuerpo de estas construcciones de proteína de fusión se obtienen del anticuerpo G005. El ensayo se describe en los ejemplos como el "ensayo específico (ARP)". "Equivalentes de IFN" se refiere a la concentración molar de moléculas de interferón, ya sean libres o unidas a un anticuerpo.
La figura 44 muestra la actividad de IL-4 no dirigida por anticuerpo-antígeno ["ensayo inespecífico (HB-IL4)"] de IL-4 y tres construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IL-4: J110-HC-L6-IL-4 IgG1, un anticuerpo anti-PD1 fusionado a IL-4 de tipo natural; J110-HC-L6-IL-4 (R88Q), que es idéntica a la construcción de proteína de fusión mencionada previamente excepto por la mutación R88Q atenuante en la porción IL-4; e Isotipo-HC-L6-IL-4 (R88Q), basándose en el anticuerpo 2D12, que no se une a ninguna de las células usadas en los ensayos de la presente divulgación y se fusiona a la IL-4 atenuada. "Equivalentes de IL-4" se refiere a la concentración molar de moléculas de IL-4, ya sean libres o unidas a un anticuerpo.
La figura 45 muestra el "ensayo específico (desviación de Th1)" que compara la actividad de IL-4 y tres construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IL-4: J110-HC-L6-IL-4 IgG1, un anticuerpo anti-PD1 fusionado a IL-4 de tipo natural; J110-HC-L6-IL-4 (R88Q), que es idéntica a la construcción de proteína de fusión mencionada previamente excepto por la mutación R88Q atenuante en la porción IL-4; e Isotipo-HC-L6-IL-4 (R88Q), basándose en el anticuerpo 2D12, que no se une a ninguna de las células usadas en los ensayos de la presente divulgación y se fusiona a la IL-4 atenuada. "Equivalentes de IL-4" se refiere a la concentración molar de moléculas de IL-4, ya sean libres o unidas a un anticuerpo.
La figura 46 muestra el "bioensayo de IL-6" que compara IL-6 con diversas construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IL-6 que se unen a las células diana (basándose en el anticuerpo HB95, que se une al MHC de clase I en las células diana) o no se unen a las células diana (basándose en el anticuerpo de control de isotipo 2D12), fusionadas a IL-6 de tipo natural o IL-6 con la mutación R179E atenuante. "Equivalentes de IL-6" se refiere a la concentración molar de moléculas de IL-6, ya sean libres o unidas a un anticuerpo.
La figura 47 muestra los efectos de diversos compuestos sobre el crecimiento de tumores subcutáneos de mieloma H929 en ratones SCID. La barra marcada "tratamiento" muestra la duración del tratamiento con los compuestos. El anticuerpo de "isotipo" se basó en el anticuerpo 2D12. G005 es un anticuerpo anti-CD38.
La figura 48 muestra los efectos de diversos compuestos sobre la supervivencia (gráfico de Kaplan-Meier) de ratones NOD-SCID inoculados sistémicamente con la estirpe celular de mieloma humano MM1S. La barra marcada "tratamiento" muestra la duración del tratamiento con los compuestos. G005 es un anticuerpo anti-CD38.
La figura 49 muestra los efectos de diversos compuestos sobre el crecimiento de tumores subcutáneos de linfoma de Daudi en ratones NOD-SCID. La barra marcada "tratamiento" muestra la duración del tratamiento con los compuestos. El anticuerpo de "isotipo" se basó en el anticuerpo 2D12. G005 es un anticuerpo anti-CD38.
La figura 50 muestra los efectos de una construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNa atenuado (G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1) y una construcción de proteína de fusión control de isotipo-IFNa atenuado (Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1) sobre el crecimiento de tumores subcutáneos de mieloma H929 en ratones SCID, a diversas dosis. La barra marcada "tratamiento" muestra la duración del tratamiento con los compuestos. El anticuerpo de "isotipo" se basó en el anticuerpo 2D12.
La figura 51 muestra los efectos de construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa atenuado frente a construcciones de proteína de fusión anticuerpo de control de isotipo-IFNa atenuado, sobre el crecimiento de tumores subcutáneos de mieloma H929 en ratones SCID. IgG1 se compara con IgG4 en el contexto de estas construcciones de proteínas de fusión. La barra marcada "tratamiento" muestra la duración del tratamiento con los compuestos. El anticuerpo de "isotipo" se basó en el anticuerpo 2D12.
La figura 52 muestra los efectos de una construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNa atenuado (X355/02-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4) frente a construcciones de proteína de fusión anticuerpo de control de isotipo-IFNa atenuado sobre el crecimiento de tumores subcutáneos de mieloma H929 en ratones SCID. La barra marcada "fase de tratamiento" muestra la duración del tratamiento con los compuestos. El anticuerpo de "isotipo" se basó en el anticuerpo 2D12.
La figura 53 muestra los efectos de diversos compuestos sobre el crecimiento de tumores subcutáneos de mieloma H929 en ratones SCID. G005 es un anticuerpo anti-CD38.
La figura 54 muestra los efectos de una construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNa atenuado (G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG4) y una construcción de proteína de fusión control de isotipo-IFNa atenuado (Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgG4) sobre el crecimiento de tumores subcutáneos de mieloma H929 en ratones SCID, con varias rondas de administración, cada una a una dosis de 10 mg/kg. El anticuerpo de "isotipo" se basó en el anticuerpo 2D12.
La figura 55 muestra los efectos de una construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNa atenuado (G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG4) sobre el crecimiento de tumores subcutáneos de mieloma H929 en ratones SCID. La dosificación (indicada por flechas) se inició cuando el volumen tumoral medio alcanzó 730 mm3.
La figura 56 muestra la inhibición de la formación de colonias en células mononucleares de médula ósea humana (BM MNC) normales por IFNa2b, una construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNa atenuado (G005-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4) y una construcción de proteína de fusión anticuerpo de control de isotipo-IFNa atenuado 2D12-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4. Las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa atenuado muestran una potencia aproximadamente 10.000 menor en este ensayo.
La figura 57 muestra los efectos de IFNa2b frente a una construcción de proteína de fusión anticuerpo-IFNa atenuado (Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1; las regiones variables de isotipo se basan en el anticuerpo 2D12) sobre la producción de citocinas por células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas. (a) IP-10 y MCP-1; (b) MCP-3 e IL-1a.
Descripción detallada de la invención
Las construcciones de la presente invención son construcciones anticuerpo-ligando atenuado, que muestran un índice de especificidad antigénica elevado con respecto a la activación de las vías de señalización debido a la acción del ligando atenuado sobre un receptor de la superficie celular. Estas construcciones se basan en el sorprendente descubrimiento de que, en el contexto de una construcción anticuerpo-ligando, la porción de ligando se puede mutar de tal manera que la actividad del ligando en las células negativas para antígeno se atenúe drásticamente, mientras que la actividad del ligando en las células positivas para antígeno sólo se atenúa modestamente, si es que se atenúa. Dichas construcciones presentan uno, dos, tres, cuatro o cinco órdenes de magnitud de mayor potencia en las células positivas para antígeno en comparación con las células negativas para antígeno que el ligando libre. En una realización, la construcción anticuerpo-ligando atenuado conserva al menos el 1 %, al menos el 10%, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 % o al menos el 50 % de la potencia en las células positivas para antígeno que el ligando libre no atenuado (es decir, no unido a un anticuerpo). Además, en una realización, la construcción anticuerpo-ligando atenuado conserva al menos el 30 %, al menos el 50 %, al menos el 75 % o al menos el 90 % de la actividad máxima del ligando libre no atenuado (es decir, no unido a un anticuerpo); en este contexto, "actividad máxima" debe entenderse como la cantidad de actividad de señalización (o el efecto aguas abajo de la misma) en la porción de estancamiento alta de una curva de respuesta a la dosis, donde aumentos adicionales del agente no aumentan adicionalmente la cantidad de respuesta).
Como se usa en el presente documento, "especificidad" no es necesariamente una designación absoluta, sino a menudo un término relativo que significa el grado de selectividad de una construcción de proteína de fusión anticuerpoligando para una célula positiva para antígeno en comparación con una célula negativa para antígeno. Por lo tanto, por ejemplo, se puede decir que una construcción tiene "100 veces más de especificidad para las células positivas para antígeno en comparación con las células negativas para antígeno", y esto indicaría que la construcción tiene 100 veces más potencia en las células que expresan el antígeno en comparación con las células que no lo expresan. En algunos casos, este grado de especificidad de una construcción que compara células positivas para antígeno frente a negativas para antígeno puede no estar basado en la relación absoluta de potencia de la construcción en células positivas para antígeno frente a negativas para antígeno, sino en la potencia de la construcción en cada tipo de célula en relación con la potencia del ligando libre, no atenuado, en el mismo tipo de célula. Este enfoque de "relación de relaciones" para cuantificar el grado de especificidad de una construcción anticuerpo-ligando toma en consideración cualquier diferencia inherente en la potencia de un ligando en diferentes tipos de células y se ilustra mediante los cálculos del índice de especificidad antigénica (ASI) en la Tabla 25. Los ensayos para determinar la potencia de las construcciones de fusión anticuerpo-ligando se ilustran en los ejemplos e incluyen ensayos basados en células para la proliferación, apoptosis, fosforilación de receptores y proteínas intracelulares, migración, diferenciación (por ejemplo, diferenciación de linfocitos T CD4+ sin tratamiento previo en linfocitos Th1, Th17, Th2 frente a linfocitos Treg), aumentos o disminuciones en la expresión genética o secreción de productos génicos en el medio, etc.
En el presente documento se divulga una construcción polipeptídica que comprende un ligando de señalización peptídica o polipeptídica unido a un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une a un antígeno asociado a la superficie celular, en donde el ligando comprende al menos una sustitución o eliminación de aminoácidos que reduce su potencia en las células que carecen de expresión de dicho antígeno.
En el presente documento se divulga una construcción polipeptídica que comprende IFN unido a un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une a un antígeno asociado a tumor, en donde el IFN comprende al menos una sustitución o deleción de aminoácidos que reduce su potencia en las células que carecen de expresión de dicho antígeno. Tal polipéptido, tal como un polipéptido de la invención, podrá ejercer con alta potencia la actividad antiproliferativa de IFN en las células tumorales positivas para antígeno, mientras que ejerce una potencia mucho menor en las células no tumorales negativas para antígeno dentro del organismo.
En el presente documento se divulga un método para tratar un tumor en un sujeto que comprende administrar al sujeto la construcción polipeptídica de la presente invención.
Como se usa en el presente documento, la expresión "construcción anticuerpo-ligando" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, unido covalentemente a un ligando de señalización que se ha atenuado por una o más sustituciones o deleciones que reducen la potencia del ligando en células que no expresan el antígeno correspondiente al anticuerpo.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o cualquier fragmento funcional, mutante, variante o derivación de los mismos, que conserve las características esenciales de unión a epítopos de una molécula de Ig. Dichos formatos de anticuerpos mutantes, variantes o derivados son conocidos en la técnica, cuyas realizaciones no limitantes se analizan a continuación.
En un anticuerpo de longitud completa, cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) o subclase.
La expresión "dominio de unión a antígeno" o "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo o proteína que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, CD38). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Dichas realizaciones de anticuerpos también pueden ser formatos biespecíficos, duales o multiespecíficos, uniéndose específicamente a dos o más antígenos diferentes. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab además de una porción de la región bisagra, unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un anticuerpo de dominio (dAb) (Wardet al.1989 Nature 341 544-6, Winteret al.,Publicación PCT WO 90/05144 A1), que comprende un único dominio variable; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes independientes, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una única cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véanse, por ejemplo, Birdet al.1988 Science 242 423-6; Hustonet al.
1988 Proc Natl Acad Sci U S A 85 5879-83). También se pretende que tales anticuerpos monocatenarios estén abarcados por la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. También se abarcan otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero que usan un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno (véanse, por ejemplo, Holliger, P.,et al.,1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J.,et al.,1994, Structure 2:1121-1123). Dichas porciones de unión de anticuerpos se conocen en la técnica (Kontermann y Dubel eds., Antibody Engineering 2001 Springer-Verlag. Nueva York. págs. 790, ISBN 3-540-41354-5). En una realización, la porción de unión de anticuerpo es un fragmento Fab.
El anticuerpo descrito en el presente documento puede ser un anticuerpo humanizado. La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a una proteína que comprende una región variable de tipo humano, que incluye CDR de un anticuerpo de una especie no humana (por ejemplo, ratón, rata o primate no humano) injertadas o insertadas en FR de un anticuerpo humano (este tipo de anticuerpo también se denomina "anticuerpo injertado con CDR"). Los anticuerpos humanizados también incluyen proteínas en las que uno o más residuos de la proteína humana se modifican mediante una o más sustituciones de aminoácidos, y/o uno o más residuos de FR de la proteína humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo humano ni en el anticuerpo no humano. Cualquier región adicional de la proteína (por ejemplo, la región Fc) es generalmente humana. La humanización se puede realizar usando un método conocido en la técnica, por ejemplo, los documentos US5225539, US6054297, US7566771 o US5585089. La expresión "anticuerpo humanizado" también abarca un anticuerpo superhumanizado, por ejemplo, como se describe en el documento US7.732.578.
El anticuerpo descrito en el presente documento puede ser humano. Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humano" se refiere a proteínas que tienen regiones de anticuerpo variables y, opcionalmente, constantes que se encuentran en seres humanos, por ejemplo, en la estirpe germinal humana o en células somáticas, o en bibliotecas producidas usando dichas regiones. Los anticuerpos "humanos" pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas, por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutaciones aleatorias o dirigidasin vitro(en particular, mutaciones que implican sustituciones conservadoras o mutaciones en un pequeño número de residuos de la proteína, por ejemplo, en 1, 2, 3, 4 o 5 de los residuos de la proteína). Estos "anticuerpos humanos" no necesariamente deben generarse como resultado de una respuesta inmunitaria de un ser humano, en cambio, pueden generarse usando medios recombinantes (por ejemplo, cribado de una biblioteca de presentación en fagos) y/o mediante un animal transgénico (por ejemplo, un ratón) que comprende un ácido nucleico que codifica regiones constantes y/o variables de anticuerpos humanos, y/o usando selección guiada (por ejemplo, como se describe en el documento US5.565.332). Este término también abarca las formas maduradas por afinidad de dichos anticuerpos. Para los fines de la presente divulgación, también se considerará que una proteína humana incluye una proteína que comprende FR de un anticuerpo humano o FR que comprende secuencias de una secuencia consenso de FR humanas, y en la que una o más de las CDR son aleatorias o semi-aleatorias, por ejemplo, como se describe en los documentos US6300064 y/o US6248516.
Las porciones de anticuerpo de los polipéptidos de la presente invención pueden ser anticuerpos de longitud completa de cualquier clase, preferentemente IgG1, IgG2 o IgG4. Los dominios constantes de dichos anticuerpos son preferentemente humanos. Las regiones variables de dichos anticuerpos pueden ser de origen no humano o, preferentemente, de origen humano o humanizadas. También pueden usarse fragmentos de anticuerpos en lugar de los anticuerpos de longitud completa.
El término "anticuerpo" también incluye anticuerpos genomanipulados. Como se apreciará, existen numerosas variantes de anticuerpos genomanipulados (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón, quiméricos, humanizados y anticuerpos monoclonales humanos, fragmentos de anticuerpos variables monocatenarios (scFv), minicuerpos, aptámeros, así como anticuerpos biespecíficos y diacuerpos, como se ha descrito anteriormente).
Los dominios de región variable única (denominados dAb) se divulgan, por ejemplo, en (Wardet al.,Nature 341: 544 546, 1989; Hamers-Castermanet al.,Nature 363: 446-448, 1993; Davies y Riechmann, FEBS Lett. 339: 285-290, 1994).
Los minicuerpos son versiones pequeñas de anticuerpos completos, que codifican en una sola cadena los elementos esenciales de un anticuerpo completo. De manera adecuada, el minicuerpo está compuesto por los dominios VH y VL de un anticuerpo natural fusionado a la región bisagra y al dominio CH3 de la molécula de inmunoglobulina como se divulga, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N.° 5.837.821.
En una realización alternativa, el anticuerpo genomanipulado puede comprender estructuras proteicas no procedentes de inmunoglobulinas. Por ejemplo, puede hacerse referencia a (Ku y Schutz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552 6556, 1995) que divulga un citocromo b562 de proteína haz de cuatro hélices con dos bucles aleatorizados para crear CDR, que se han seleccionado para la unión a antígeno.
Existe una gran variedad de armazones de proteínas o dominios proteicos de reconocimiento no procedentes de anticuerpos que pueden utilizarse como dominios de unión a antígeno en las construcciones de la presente invención. Estos incluyen armazones basados en el antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) (Evibody; documento US 7.166.697); transferrina humana (Trans-body); un haz de tres hélices del dominio Z de la proteína A (Affibody); un dominio de lectina humana de tipo C, monomérico o trimérico (tetranectina); el décimo dominio humano de fibronectina tipo III (AdNectin); el dominio de tipo Kunitz del inhibidor de tripsina humano o bovino; defensina A de insecto (IICA29), APPI (dominios Kuntz); lipocalinas, FABP, proteína de unión a bilina, apolopropteína D (anticalinas); molécula de a cristalina o ubiquitina humana (Affilin); inhibidor de tripsina II (microcuerpo); repetición de a2p8 o anquirina (proteínas con motivo repetido), caribdotoxina (toxinas de escorpión), Min-23, dominio de unión a celulosa (knottinas); neocarzinostatina, CBM4-2 y tendamistat.
Adicionalmente, además de los andamiajes proporcionados por dominios procedentes de anticuerpos o pliegues no procedentes de anticuerpos, como se ha descrito anteriormente, existen proteínas de unión a ligando de origen natural o dominios proteicos que pueden utilizarse como dominios de unión a ligando en la presente invención. Por ejemplo, los dominios proteicos que poseen propiedades de unión a ligando incluyen dominios extracelulares de receptores, módulos PDZ de proteínas de señalización, tales como proteína de unión a Ras AF-6, moléculas de adhesión y enzimas.
La presente invención abarca además análogos químicos de aminoácidos en los anticuerpos en cuestión. El uso de análogos químicos de aminoácidos es útil, entre otras cosas, para estabilizar las moléculas tal como si se requiere su administración a un sujeto. Los análogos de los aminoácidos contemplados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, modificaciones de cadenas laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus derivados durante la síntesis de péptidos, polipéptidos o proteínas, y el uso de reticulantes y otros métodos que imponen restricciones conformacionales a la molécula proteínica o sus análogos.
Los ejemplos de modificaciones de las cadenas laterales contempladas por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino tales como por alquilación reductora mediante reacción con un aldehído seguido de reducción con NaBH4; amidinación con metilacetimidato; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato seguido de reducción con NaBH4.
El grupo de guanidina de residuos de arginina puede modificarse mediante la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.
El grupo carboxilo puede modificarse mediante la activación de carbodiimida a través de la formación de O-acilisourea seguido de derivación posterior, por ejemplo, a una amida correspondiente.
Los grupos sulfhidrilo pueden modificarse mediante métodos tales como carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación de ácido perfórmico en ácido cisteico; formación de disulfuros mixtos con otros compuestos de tiol; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; formación de derivados mercuriales usando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol y otros mercuriales; carbamoilación con cianato a pH alcalino.
Los residuos de triptófano pueden modificarse mediante, por ejemplo, oxidación con N-bromosuccinimida o alquilación del anillo de indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo. Los residuos de tirosina, por otro lado, pueden alterarse mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina.
Se puede realizar la modificación del anillo de imidazol de un residuos de histidina mediante alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carbetoxilación con pirocarbonato de dietilo.
Los ejemplos de la incorporación de aminoácidos no naturales y derivados durante la síntesis de péptidos incluyen, pero sin limitación, el uso de norleucina, ácido 4-aminobutírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, 2 tienil-alanina y/o isómeros D de aminoácidos. La Tabla 1 muestra una lista de aminoácidos no naturales contemplados en el presente documento.
Tabla 1
(continuación)
Los reticulantes se pueden usar, por ejemplo, para estabilizar conformaciones tridimensionales, usando reticulantes homobifuncionales tales como imidoésteres bifuncionales que tienen grupos espaciadores (CH2)n con n = 1 a n = 6, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida y reactivos heterobifuncionales que suelen contener un resto aminorreactivo, tal como N-hidroxisuccinimida, y otro resto reactivo específico de grupo, tal como un resto maleimido o ditio (SH), o carbodiimida (COOH).
Se usan métodos bien conocidos en la técnica para aumentar la unión, mediante, por ejemplo, la maduración de la afinidad, o para disminuir la inmunogenicidad mediante la eliminación de los motivos de unión al MHC de clase II previstos. La utilidad terapéutica de los anticuerpos descritos en el presente documento se puede mejorar aún más modulando sus características funcionales, tal como la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la semivida sérica, la biodistribución y la unión a los receptores Fc, o la combinación de cualquiera de estas. Esta modulación se puede lograr mediante ingeniería de proteínas, glucoingeniería o métodos químicos. Dependiendo de la aplicación terapéutica requerida, podría ser ventajoso aumentar o disminuir cualquiera de estas actividades.
Un ejemplo de glucoingeniería usó el método Potelligent® como se describe en Shinkawa T.et al.,2003 (J Biol Chem 278: 3466-73).
Se conocen en la técnica numerosos métodos para la maduración de la afinidad de los anticuerpos. Muchos de estos se basan en la estrategia general de generar paneles o bibliotecas de proteínas variantes mediante mutagénesis, seguida de selección y/o cribado para mejorar la afinidad. La mutagénesis se realiza a menudo a nivel de ADN, por ejemplo, mediante PCR propensa a errores (Thie, Voedischet al.2009), mediante redistribución genética (Kolkman y Stemmer 2001), mediante el uso de productos químicos mutagénicos o irradiación, mediante el uso de cepas "mutadoras" con maquinaria de replicación propensa a errores (Greener, 1996) o mediante enfoques de hipermutación somática que aprovechan la maquinaria natural de maduración por afinidad (Peled, Kuanget al.,2008). La mutagénesis también se puede realizar a nivel de ARN, por ejemplo, mediante el uso de la replicasa Qp (Kopsidas, Robertset al.,2006). Los métodos basados en bibliotecas que permiten el cribado de proteínas variantes mejoradas se pueden basar en diversas tecnologías de presentación, tal como fago, levadura, ribosoma, células bacterianas o de mamíferos, y se conocen bien en la técnica (Benhar, 2007). La maduración de la afinidad puede lograrse mediante métodos más dirigidos/predictivos, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida o síntesis génica guiada por hallazgos del modelado de proteínas 3D (véanse, por ejemplo, Queen, Schneideret al.1989 o la Patente de EE. UU. 6.180.370 o la Patente de EE. UU. 5.225.539).
Se han descrito métodos para aumentar la ADCC por Ferrara, Brunkeret al.2006; Li, Sethuramanet al.2006; Stavenhagen, Gorlatovet al.2007; Shields, Namenuket al.2001; Shinkawa, Nakamuraet al.2003; y el documento WO 2008/006554.
Se han descrito métodos para aumentar la CDC por Idusogie, Wonget al.2001; Dall'Acqua, Cooket al.2006; Michaelsen, Aaseet al.1990; Brekke, Bremneset al.1993; Tan, Shopeset al.1990; y Norderhaug, Brekkeet al.1991.
Las referencias que describen métodos para aumentar la ADCC y la CDC incluyen Natsume, Inet al.2008. La divulgación de cada una de estas referencias se incluye en el presente documento por referencia cruzada.
Diversos métodos para modular la semivida sérica y la biodistribución de los anticuerpos se basan en la modificación de la interacción entre el anticuerpo y el receptor Fc neonatal (FcRn), un receptor con una función clave en la protección de la IgG del catabolismo y el mantenimiento de alta concentración sérica de anticuerpo. Dall'Acquaet al.describen sustituciones en la región Fc de IgG1 que mejoran la afinidad de unión a FcRn, aumentando así la semivida sérica (Dall'Acqua, Woodset al.2002) y demuestran además una mayor biodisponibilidad y modulación de la actividad de A<d>C<c>con la triple sustitución de M252Y/S254T/T256E (Dall'Acqua, Kieneret al.2006). Véanse también las Pat. de EE. UU. N.° 6.277.375; 6.821.505; y 7.083.784. Hintonet al.han descrito sustituciones de aminoácidos de dominio constante en las posiciones 250 y 428 que confieren una mayor semividain vivo(Hinton, Johlfset al.2004). (Hinton, Xionget al.2006). Véase también la Pat. de EE. UU. N.° 7.217.797. Petkovaet al.han descrito sustituciones de aminoácidos de dominio constante en las posiciones 307, 380 y 434 que confieren una mayor semividain vivo(Petkova, Akileshet al.2006). Véanse también Shieldset al.2001 y el documento WO 2000/42072. Otros ejemplos de sustituciones de aminoácidos de dominio constante que modulan la unión a los receptores Fc y la función posterior mediada por estos receptores, incluyendo la unión a FcRn y la semivida sérica, se describen en las Solicitudes de Pat. de EE. UU. N.° 20090142340; 20090068175 y 20090092599.
Se sabe que los glucanos unidos a moléculas de anticuerpo influyen en las interacciones de los anticuerpos con los receptores Fc y los receptores de glucanos, y por lo tanto, influyen en la actividad de los anticuerpos, incluyendo la semivida sérica (Kaneko, Nimmerjahnet al.2006; Jones, Papacet al.2007; y Kanda, Yamadaet al.2007). Por lo tanto, determinada glucoformas que modulan las actividades deseadas de los anticuerpos pueden conferir una ventaja terapéutica. Los métodos para generar glucoformas modificadas son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, los descritos en las Pat. de EE. UU. N.° 6.602.684; 7.326.681; 7.388.081 y el documento WO 2008/006554.
La prolongación de la semivida mediante la adición de polietilenglicol (PEG) se ha usado ampliamente para prolongar la semivida sérica de las proteínas, como se revisó, por ejemplo, por Fishburn 2008.
Como se reconocerá, es posible realizar sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro de las secuencias de la presente invención. Por "sustitución conservadora" se entiende aminoácidos con propiedades similares. Como se usa en la presente memoria descriptiva, los siguientes grupos de aminoácidos se consideran sustituciones conservadoras: H, R y K; D, E, N y Q; V, I y L; C y M; S, T, P, A y G; y F, Y y W.
La expresión "antígeno asociado a la superficie celular", como se usa en el presente documento, se refiere en sentido amplio a cualquier antígeno expresado en la superficie celular, incluyendo células o virus infecciosos o exógenos.
En determinados aspectos de la presente invención, las construcciones o composiciones polipeptídicas de la presente invención pueden usarse para tratar a pacientes con cáncer. Los cánceres contemplados en el presente documento incluyen: un grupo de enfermedades y trastornos que se caracterizan por un crecimiento celular descontrolado (por ejemplo, formación de tumor) sin diferenciación de dichas células en células especializadas y diferentes. Tales enfermedades y trastornos incluyen el protooncogén ABL1, cánceres relacionados con el SIDA, neuroma acústico, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenoquístico, cáncer adrenocortical, metaplasia mieloide angiogénica, alopecia, sarcoma alveolar de las partes blandas, cáncer de ano, angiosarcoma, anemia aplásica, astrocitoma, ataxia-telangiectasia, carcinoma basocelular (piel), cáncer de vejiga, cánceres óseos, cáncer de intestino, glioma del tronco encefálico, tumores cerebrales y del<s>N<c>, cáncer de mama, tumores del SNC, tumores carcinoides, cáncer de cuello del útero, tumores cerebrales infantiles, cáncer infantil, leucemia infantil, sarcoma de tejidos blandos infantil, condrosarcoma, coriocarcinoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, cánceres colorrectales, linfoma cutáneo de linfocitos T, dermatofibrosarcoma protuberans, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, carcinoma ductal, cánceres endocrinos, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer ocular, melanoma ocular, retinoblastoma, cáncer de las trompas de Falopio, anemia de fanconi, fibrosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cánceres gastrointestinales, tumor carcinoide gastrointestinal, cánceres urogenitales, tumores de células germinales, enfermedad trofoblástica gestacional, glioma, cánceres ginecológicos, neoplasias malignas hemáticas, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, cáncer de mama hereditario, histiocitosis, enfermedad de Hodgkin, virus del papiloma humano, mola hidatiforme, hipercalcemia, cáncer de la hipofaringe, melanoma intraocular, cáncer de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, leiomiosarcoma, leucemia, síndrome de Li-Fraumeni, cáncer de labios, liposarcoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfedema, linfoma, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkin, cáncer de mama masculino, tumor rabdoide maligno de riñón, meduloblastoma, melanoma, cáncer de células de Merkel, mesotelioma, cáncer metastásico, cáncer de boca, neoplasia endocrina múltiple, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos, cáncer nasal, cáncer nasofaríngeo, nefroblastoma, neuroblastoma, neurofibromatosis, síndrome de rotura de Nijmegen, cáncer de piel no melanomatoso, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cánceres oculares, cáncer de esófago, cáncer de la cavidad oral, cáncer de orofaringe, osteosarcoma, ostomía por cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer paranasal, cáncer paratiroideo, cáncer de glándula parótida, cáncer de pene, tumores neuroectodérmicos periféricos, cáncer de hipófisis, policitemia vera, cáncer de próstata, cánceres raros y trastornos asociados, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, síndrome de Rothmund-Thomson, cáncer de las glándulas salivales, sarcoma, schwannoma, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de pulmón microcítico (SCLC), cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, tumor de la médula espinal, carcinoma escamocelular (piel), cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer de testículo, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales (vejiga), cáncer de células transicionales (pelvis renal/uréter), cáncer trofoblástico, cáncer de uretra, cáncer del sistema urinario, uroplaquinas, sarcoma de útero, cáncer de útero, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldestrom y tumor de Wilms. En una realización, el tumor se selecciona de un grupo de mieloma múltiple y linfoma no Hodgkin.
Como se contempla para el tratamiento del cáncer, las porciones de anticuerpo de las construcciones de la presente invención pueden unirse a antígenos asociados a tumor,es decir,antígenos de superficie celular que se expresan selectivamente en las células cancerosas o se sobreexpresan en las células cancerosas en relación con la mayoría de las células normales. Existen numerosos antígenos asociados a tumor (TAA, por sus siglas en inglés) conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de TAA incluyen enzima tirosinasa; antígeno de melanoma GM2; alfafetoproteína (AFP); antígeno carcinoembrionario (CEA); mucina 1 (MUC1); receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (Her2/Neu); oncoproteína de leucemia/linfoma de linfocitos T 1 (TCL1). Los TAA de ejemplo asociados con diversos tipos de cáncer son telomerasa (hTERT); antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA); activador del plasminógeno urocinasa y su receptor (uPA/uPAR); factor de crecimiento vascular endotelial y su receptor (VEGF/<v>E<g>FR); inductor de metaloproteinasas de matriz extracelular (EMMPRIN/CD147); factor de crecimiento epidérmico (EGFR); factor de crecimiento derivado de plaquetas y su receptor (PDGF/PDGFR) y c-kit (CD117).
Se proporciona una lista de otros TAA en el documento US 2010/0297076, cuya divulgación se incluye en el presente documento por referencia. Son de particular interés los antígenos de superficie celular asociados con células de mieloma múltiple, incluyendo, pero sin limitación, CD38, CD138, CS1 y HM1.24. En una realización, un antígeno para las construcciones anticuerpo-ligando atenuado, por ejemplo, una construcción anticuerpo-interferón atenuado, es CD38.
CD38 es una glucoproteína transmembrana tipo II de 46 kDa. Posee una cola citoplasmática en el extremo N corta de 20 aminoácidos, una única hélice transmembrana y un dominio extracelular largo de 256 aminoácidos (Bergsagel, P., Blood; 85:436, 1995 y Liu, Q., Structure, 13:1331,2005). Se expresa en la superficie de muchas células inmunitarias, incluyendo linfocitos T positivos para CD4 y CD8, linfocitos B, células NK, monocitos, células plasmáticas y una proporción significativa de células precursoras de médula ósea normal (Malavasi, F., Hum. Immunol. 9:9, 1984). En los linfocitos, sin embargo, la expresión parece depender del estado de diferenciación y activación de la célula. Los linfocitos T y B en reposo son negativos, mientras que los linfocitos inmaduros y activados son predominantemente positivos para la expresión de CD38 (Funaro, A., J. Immunol. 145:2390, 1990). Estudios adicionales indican la expresión de ARNm en órganos no hematopoyéticos, tales como el páncreas, el cerebro, el bazo y el hígado (Koguma, T., Biochim. Biophys. Acta 1223:160, 1994).
El CD38 es una ectoenzima multifuncional que participa en la señalización transmembrana y la adhesión celular. También se conoce como ADP ribosa hidrolasa cíclica, ya que puede transformar NAD+ y NAD<p>+ en cADPR, ADPR y NAADP, dependiendo del pH extracelular. Estos productos inducen la movilización de Ca2+ dentro de la célula, lo que puede conducir a la fosforilación de tirosina y la activación de la célula. CD38 también es un receptor que puede interactuar con un ligando, CD31. La activación del receptor a través de CD31 provoca eventos intracelulares, incluyendo la movilización de Ca2+, la activación celular, la proliferación, la diferenciación y la migración (revisado en Deaglio, S., Trends in Mol. Med. 14:210, 2008).
CD38 se expresa en niveles elevados en células de mieloma múltiple, en la mayoría de los casos de leucemias linfoblásticas agudas de linaje T y B, algunas leucemias mielocíticas agudas, linfomas de células del centro folicular y linfomas linfoblásticos T. (Malavasi, F., J. Clin Lab Res. 22:73, 1992). Más recientemente, la expresión de CD38 se ha convertido en un marcador pronóstico fiable en la leucemia linfoblástica crónica de linaje B (LLC-B) (Ibrahim, S., Blood.
98:181, 2001 y Durig, J., Leuk. Res. 25:927, 2002). Grupos independientes han demostrado que los pacientes con LLC-B que presentan un clon CD38+ se caracterizan por una evolución clínica desfavorable, con una estadio más avanzado de la enfermedad, una mala respuesta a la quimioterapia y una supervivencia más corta (Morabito, F., Haematologica. 87:217,2002). La expresión constante y mejorada de CD38 en tumores linfoides hace que sea una diana atractiva para las tecnologías de anticuerpos terapéuticos.
Los antígenos preferidos para el desarrollo de construcciones de proteínas de fusión anticuerpo-ligando atenuados que se dirigen al cáncer son antígenos que muestran una expresión selectiva o mayor en las células cancerosas que en la mayoría de las demás células no transformadas dentro del cuerpo. Los ejemplos no proteicos de dichos antígenos incluyen esfingolípidos, gangliósido GD2 (Salehet al.,1993, J. Immunol., 151, 3390-3398), gangliósido GD3 (Shitaraet al.,1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380), gangliósido GM2 (Livingstonet al.,1994, J. Clin. Oncol.
12:1036-1044), gangliósido GM3 (Hoonet al.,1993, Cancer Res. 53:5244-5250) y los antígenos de carbohidratos de Lewisx, lewis y y lewis xy que pueden expresarse en proteínas o glucolípidos. Los ejemplos de antígenos proteicos son HER-2/neu, virus del papiloma humano E6 o E7, MUC-1; antígeno de pan-carcinoma KS 1/4 (Perez y Walker, 1990, J. Immunol. 142:3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415); antígeno de carcinoma de ovario CA125 (Yuet al.,1991, Cancer Res. 51(2):468-475); fosfato de ácido prostático (Tailoret al.,1990, Nucl. Acids Res. 18(16):4928); antígeno específico de próstata (Henttu y Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910; Israeliet al.,1993, Cancer Res. 53:227-230); antígeno p97 asociado a melanoma (Estinet al.,1989, J. Natl. Cancer Instit.
81(6):445-446); antígeno gp75 de melanoma (Vijayasardahlet al.,1990, J. Exp. Med. 171(4):1375-1380); antígeno de membrana específico de próstata; antígeno carcinoembrionario (CEA) (Foonet al.,1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.
13:294), MUC16 (los anticuerpos incluyen MJ-170, MJ-171, MJ-172 y MJ-173 [documento US 7.202.346], 3A5 [documento US 7.723.485]), NMB (documento US 8.039.593), antígeno APO-1 de linfocitos humanos malignos (Bernhardet al.,1989, Science 245:301-304); antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) (Nataliet al.,1987, Cancer 59:55-63; Mittelmanet al.,1990, J. Clin. Invest. 86:2136-2144); antígeno de linfoma de Burkitt-38.13; CD19 (Ghetieet al.,1994, Blood 83:1329-1336); antígeno de linfoma de linfocitos B humanos-CD20 (Reffet al.,1994, Blood 83:435-445); GICA 19-9 (Herlynet al.,1982, J. Clin. Immunol. 2:135), CTA-1 y LEA; CD33 (Sgouroset al.,1993, J. Nucl. Med. 34:422-430); antígenos oncofetales tales como alfa-fetoproteína para el cáncer de hígado o el antígeno oncofetal para tumores de vejiga (Hellstromet al.,1985, Cancer. Res. 45:2210-2188); antígenos de diferenciación tal como antígeno L6 o L20 de carcinoma de pulmón humano (Hellstromet al.,1986, Cancer Res. 46:3917-3923); antígenos de fibrosarcoma; antígeno Gp37 de linfocitos T de leucemia humana (Bhattacharya-Chatterjeeet al.,1988, J. Immunol. 141:1398-1403); antígeno de la superficie celular de tipo trasplante específico de tumor (TSTA) tal como antígenos tumorales inducidos por virus, incluyendo virus de tumores de ADN de antígeno T y antígenos de envoltura de virus de tumores de ARN; neoglucoproteínas, antígenos de cáncer de mama, tal como EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), mucina epitelial polimórfica (PEM) (Hilkenset al.,1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359); antígeno de mucina epitelial polimórfico; antígeno de glóbulos grasos de leche humana; antígenos asociados a tumores colorrectales tales como TAG-72 (Yokataet al.,1992, Cancer Res. 52:3402-3408), CO 17-1A (Ragnhammaret al.,1993, Int. J. Cancer 53:751-758); antígenos de diferenciación (Feizi, 1985, Nature 314:53-57), tales como I(Ma) encontrado en adenocarcinomas gástricos, SSEA-1 encontrado en células mieloides, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, M18 y M39 encontrados en cánceres epiteliales de mama, D156-22 encontrado en cáncer colorrectal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H), C14 encontrado en adenocarcinoma de colon, F3 encontrado en adenocarcinoma de pulmón, AH6 encontrado en cáncer gástrico, hapteno Y encontrado en células de carcinoma embrionario, TL5 (grupo sanguíneo A), antígenos de la serie E1 (grupo sanguíneo B) encontrados en cáncer de páncreas, FC10.2 encontrado en células de carcinoma embrionario, antígeno de adenocarcinoma gástrico, CO-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrado en el adenocarcinoma, NS-10 encontrado en adenocarcinomas, CO-43 (grupo sanguíneo Leb), G49 encontrado en células A431, 19.9 encontrado en cáncer de colon; mucinas de cáncer gástrico; R24 encontrado en melanoma, MH2 (grupo sanguíneo ALeb/Ley) encontrado en adenocarcinoma de colon, 4.2, D1.1, OFA-1, Gm2, OFA-2 y M1:22:25:8 encontrados en células de carcinoma embrionario, y SSEA-3 y SSEA-4. HMW-MAA (SEQ ID NO:433), también conocido como proteoglicano de condroitín sulfato de melanoma, es una proteína unida a la membrana de 2322 residuos que se sobreexpresa en más del 90 % de los nevos benignos y lesiones de melanoma extirpados quirúrgicamente (Camploi,et al.,Crit Rev Immunol.;24:267,2004). Por consiguiente, podría ser un posible antígeno asociado a la superficie de células diana.
Otro ejemplo de antígenos de cáncer para el direccionamiento con construcciones de proteínas de fusión de la presente invención incluyen (los cánceres de ejemplo se muestran entre paréntesis): CD5 (leucemia/linfoma de linfocitos T), CA15-3 (carcinomas), CA19-9 (carcinomas), L6 (carcinomas), CA 242 (colorrectal), fosfatasa alcalina placentaria (carcinomas), fosfatasa ácida prostática (próstata), MAGE-1 (carcinomas), MAGE-2 (carcinomas), MAGE-3 (carcinomas), MAGE-4 (carcinomas), receptor de transferrina (carcinomas), p97 (melanoma), MUC1 (cáncer de mama), MART1 (melanoma), CD20 (linfoma no Hodgkin), CD52 (leucemia), CD33 (leucemia), gonadotropina coriónica humana (carcinoma), CD38 (mieloma múltiple), CD21 (linfoma de linfocitos B), CD22 (linfoma), CD25 (linfoma de linfocitos B), CD37 (linfoma de linfocitos B), CD45 (leucemia mieloblástica aguda), HLA-DR (linfoma de linfocitos B), receptor de IL-2 (leucemia de linfocitos T y linfomas), CD40 (linfoma), diversas mucinas (carcinomas), P21 (carcinomas), MPG (melanoma), Ep-CAM (tumores epiteliales), receptor de folato alfa (ovárico), A33 (colorrectal), G250 (renal), ferritina (linfoma de Hodgkin), de2-7 EGFR (glioblastoma, mama y pulmón), proteína de activación de fibroblastos (epitelial) y metaloproteinasas de tenascina (glioblastoma). Algunos anticuerpos específicos y útiles incluyen, pero sin limitación, b R64 (Trailet al.,1997, Cancer Research 57:100 105), mAb BR96 (Trailet al.,1993, Science 261:212-215), mAb contra el antígeno CD40, tales como mAb S2C6 (Franciscoet al.,2000, Cancer Res.
60:3225-3231) u otros anticuerpos anti-CD40, tales como los divulgados en las Publicaciones de Patente de EE. UU. N.° 2003-0211100 y 2002-0142358; mAb contra el antígeno CD30, tales como AC10 (Bowenet al.,1993, J. Immunol.
151:5896-5906; Wahlet al.,2002 Cancer Res. 62(13):3736-42) o MDX-0060 (Publicación de Patente de EE. UU. N.° 2004-0006215) y mAb contra el antígeno CD70, tales como mAb 1F6 y mAb 2F2 (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de EE. UU. N.° 2006-0083736) o anticuerpos 2H5, 10B4, 8B5, 18<e>7, 69A7 (documento US 8.124.738). Se han revisado otros anticuerpos en otras publicaciones (Frankeet al.,2000, Cancer Biother. Radiopharm. 15:45976; Murray, 2000, Semin. Oncol. 27:6470; Breitling, F. y Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons, Nueva York, 1998).
En determinadas realizaciones, los anticuerpos útiles pueden unirse a un receptor o a un complejo de receptores expresados en una célula diana. El receptor o el complejo receptor puede comprender un miembro de la superfamilia de los genes de inmunoglobulina, una proteína principal de histocompatibilidad, un receptor de citocina, un miembro de la superfamilia de receptores de TNF, un receptor de quimiocinas, una integrina, una lectina, una proteína de control del complemento, un receptor del factor de crecimiento, un receptor hormonal o un receptor de neurotransmisores. Los ejemplos no limitantes de miembros adecuados de la superfamilia de inmunoglobulinas son CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD79, CD90, CD152/CTLA-4, PD-1, B7-H4, B7-H3 e ICOS. Los ejemplos no limitantes de miembros adecuados de la superfamilia de receptores de TNF son TACI, BCMA, CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/0X40, CD137/4-1BB, TNFR1, TNFR2, RANK, osteoprotegerina, APO 3, Apo2/TRAIL R1, TRAIL R2, TRAIL R3 y TRAIL R4. Los ejemplos no limitantes de integrinas adecuadas son CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD41, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD103 y CD104. Los ejemplos no limitantes de lectinas adecuadas son las lectinas del tipo S, de tipo C y de tipo I. En la Tabla 2 se muestran ejemplos de anticuerpos contra CEA.
Tabla 2
Los anticuerpos que se unen al antígeno CD22 expresado en linfocitos B humanos incluyen, por ejemplo, HD6, RFB4, UV22-2, To15, 4KB128 y un anticuerpo anti-CD22 humanizado (hLL2) (véanse, por ejemplo, por ejemplo, Liet al.(1989) Cell. Immunol. 111: 85-99; Masonet al.(1987) Blood 69: 836-40; Behret al.(1999) Clin. Cancer Res. 5: 3304s-3314s; Bonardiet al.(1993) Cancer Res. 53: 3015-3021).
Los anticuerpos contra CD33 incluyen, por ejemplo, HuM195 (véase, por ejemplo, Kossmanet al.(1999) Clin. Cancer Res. 5: 2748-2755; documento US5693761) y C<m>A-676 (véase, por ejemplo, Sieverset al.,(1999) Blood 93: 3678 3684).
Los anticuerpos anti-MUC-1 ilustrativos incluyen, pero sin limitación, Mc5 (véase, por ejemplo, Petersonet al.(1997) Cancer Res. 57: 1103-1108; Ozzelloet al.(1993) Breast Cancer Res. Treat. 25: 265-276) y hCTMO1 (véase, por ejemplo, Van Hofet al.(1996) Cancer Res. 56: 5179-5185).
Los anticuerpos anti-TAG-72 ilustrativos incluyen, pero sin limitación, CC49 (véase, por ejemplo, Pavlinkovaet al.(1999) Clin. Cancer Res. 5: 2613-2619), B72.3 (véase, por ejemplo, Divgiet al.(1994) Nucl. Med. Biol. 21: 9-15), y los divulgados en la Pat. de EE. UU. N.° 5.976.531.
Los anticuerpos anti-HM1.24 ilustrativos incluyen, pero sin limitación, un anticuerpo anti-HM1.24 monoclonal de ratón y un anticuerpo anti-HM1.24 IgGlkappa humanizado (véase, por ejemplo, Onoet al.(1999) Mol. Immuno. 36: 387 395).
En determinadas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo anti-HER2. El gen erBB2, más comúnmente conocido como (Her-2/neu), es un oncogén que codifica un receptor transmembrana. Se han desarrollado varios anticuerpos contra Her-2/neu, incluyendo trastuzumab (por ejemplo, HERCEPTIN™; Fornieret al.(1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-58), TAB-250 (Rosenblumet al.(1999) Clin. Cancer Res. 5: 865-874), BACH-250 (Id.), TA1 (Maieret al.(1991) Cancer Res. 51: 5361-5369), y los mAb descritos en las Pat. de EE. UU. N.° 5.772.997; 5.770.195 (mAb 4D5; ATCC CRL 10463); y la Pat. de EE. UU. N.° 5.677.171.
Se han desarrollado varios anticuerpos que se unen específicamente a HER2 y algunos se encuentran en uso clínico. Estos incluyen, por ejemplo, trastuzumab (por ejemplo, HERCEPTIN™, Fornieret al.(1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-658), TAB-250 (Rosenblumet al.(1999) Clin. Cancer Res. 5: 865-874), BACH-250 (Id.), TA1 (véase, por ejemplo, Maieret al.(1991) Cancer Res. 51: 5361-5369), y los anticuerpos descritos en las Pat. de EE. UU. N.° 5.772.997; 5.770.195 y 5.677.171.
Los expertos en la técnica conocen bien otros anticuerpos anti-HER2/neu totalmente humanos. Dichos anticuerpos incluyen, pero sin limitación, los anticuerpos C6, tales como C6.5, DPL5, G98A, C6MH3-B1, B1D2, C6VLB, C6VLD, C6VLE, C6VLF, C6MH3-D7, C6MH3-D6, C6MH3-D5, C6MH3-D3, C6MH3-D2, C6MH3-D1, C6MH3-C4, C6MH3-C3, C6MH3-B9, C6MH3-B5, C6MH3-B48, C6MH3-B47, C6MH3-B46, C6MH3-B43, C6MH3-B41, C6MH3-B39, C6MH3-B34, C6MH3-B33, C6MH3-B31, C6MH3-B27, C6MH3-B25, C6MH3-B21, C6MH3-B20, C6MH3-B2, C6MH3-B16, C6MH3-B15, C6MH3-B11, C6MH3-B1, C6MH3-A3, C6MH3-A2 y C6ML3-9. Estos y otros anticuerpos anti-HER2/neu se describen en las Pat. de EE. UU. N.° 6.512.097 y 5.977.322, en la Publicación PCT WO 97/00271, en Schieret al.(1996) J Mol Biol 255: 28-43, Schieret al.(1996) J Mol Biol 263: 551-567, y similares.
Más generalmente, los anticuerpos dirigidos a diversos miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico son muy adecuados para su uso como anticuerpos diana, o porciones de unión a antígeno de los mismos, en las construcciones de la presente invención. Dichos anticuerpos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos anti-EGF-R, como se describe en las Pat. de EE. UU. N.° 5.844.093 y 5.558.864, y en la Patente Europea N.° 706.799A. Otros anticuerpos de la familia anti-EGFR ilustrativos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos tales como C6.5, C6ML3-9, C6MH3-B1, C6-B1D2, F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1, HER3.H3, HER3.E12, HER3.B12, EGFR.E12, EGFR.C10, EGFR.B11, EGFR.E8, HER4.B4, HER4.G4, HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4, HER4.D7, HER4.D11, HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7, HER4.F8 y HER4.C7 y similares (véanse, por ejemplo, las Publicaciones de Patente de EE. UU. US 2006/0099205 A1 y el documento US 2004/0071696 A1).
Puede ser ventajoso que el antígeno asociado a la superficie celular se exprese en niveles suficientes en la célula diana para que una cantidad terapéuticamente suficiente de la construcción polipeptídica se presente a los receptores de ligando en la superficie de la célula diana. Por consiguiente, en realizaciones particulares, el antígeno asociado a la superficie celular se expresa a una densidad superior a 12.600 copias por célula o superior a 15.000 copias por célula. Los métodos para determinar el número de copias de un antígeno de superficie celular se conocen bien y están fácilmente disponibles para un experto en la técnica, por ejemplo, el método proporcionado por Jilana (Am J Clin Pathol 118:560-566, 2002)
Puede ser ventajoso que el antígeno asociado a la superficie celular se exprese en una configuración en la superficie celular tal que la construcción polipeptídica pueda entrar en contacto tanto con el antígeno de superficie celular como con el receptor de ligando en la célula diana. Por consiguiente, en realizaciones particulares, el antígeno asociado a la superficie celular tiene un dominio extracelular con un peso molecular inferior a 240 kD.
Puede ser ventajoso que el anticuerpo, o porción de unión a antígeno de mismo, se una al antígeno asociado a la superficie celular con suficiente afinidad para facilitar la unión del ligando al receptor de ligando en la superficie celular. Por consiguiente, en realizaciones particulares de la presente invención, las construcciones polipeptídicas exhiben una afinidad de unión a antígeno, según lo medido por CE50, de 50 nM, de 25 nM, de 10 nM o de 5 nM a 0,1 pM.
Como se describe en las Pat. de EE. UU. N.° 6.512.097 y 5.977.322, otros anticuerpos miembros de la familia anti-EGFR se pueden producir fácilmente mediante la redistribución de cadenas ligeras y/o pesadas, seguida de una o más rondas de selección por afinidad. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, la presente invención contempla el uso de una, dos o tres CDR en la región VL y/o VH que son CDR descritas en los anticuerpos identificados anteriormente y/o las publicaciones identificadas anteriormente.
En diversas realizaciones, el anticuerpo de direccionamiento, o porción de unión a antígeno del mismo, comprende un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específica o preferentemente a CD20. Los anticuerpos anti-CD20 se conocen bien por los expertos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, rituximab, ibritumomab y tositumomab, AME-133v (Applied Molecular Evolution), ocrelizumab (Roche), ofatumumab (Genmab), TRU-015 (Trubion) e IMMU-106 (Immunomedics).
El documento WO 2010/105290 divulga un anticuerpo denominado "SC104" junto con una gama de variantes humanizadas que se unen a un antígeno expresado en diversas células tumorales.
En una realización, la unión del anticuerpo y la mutación atenuante en el ligando aumentan el índice de especificidad antigénica (ASI) en más de 10 veces, preferentemente en más de 50 veces, preferentemente en más de 100 veces, preferentemente en más de 1000 veces o preferentemente en más de 10.000 veces. El índice de especificidad antigénica (ASI) se define en el presente documento como el factor de aumento de la potencia en la actividad de señalización de la construcción polipeptídica de la invención en relación con el ligando polipeptídico libre no mutado en células diana positivas para antígeno, multiplicado por el factor de disminución de la potencia en la actividad de señalización en relación con el ligando polipeptídico libre no mutado en células diana negativas para antígeno. El término "potencia" en este contexto puede representarse cuantitativamente mediante el valor de CE50, que es el punto medio matemático de una curva de respuesta a la dosis, en la que la dosis se refiere a la concentración de ligando o de la construcción anticuerpo-ligando en un ensayo, y respuesta se refiere a la respuesta cuantitativa de las células a la actividad de señalización del ligando a una dosis particular. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se demuestra que un primer compuesto posee una CE50 (expresada, por ejemplo, en unidades molares) 10 veces menor que la CE50 de un segundo compuesto en las mismas células, típicamente cuando se mide mediante el mismo método, se dice que el primer compuesto tiene una potencia 10 veces mayor. Por el contrario, cuando se demuestra que un primer compuesto posee una CE50 10 veces mayor que la CE50 de un segundo compuesto en las mismas células, típicamente cuando se mide mediante el mismo método, se dice que el primer compuesto tiene una potencia 10 veces menor.
Si bien la gran mayoría de los anticuerpos ensayados mostraron un direccionamiento eficaz del IFNa atenuado, los presentes inventores identificaron ejemplos de dos antígenos donde el direccionamiento del IFNa atenuado a una estirpe celular que expresaba la diana no mostró un ASI apreciablemente mayor que la del ligando libre no mutado. El primer ejemplo lo demuestra el antígeno CSPG4 (también conocido como HMW-MAA, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular). Se ensayaron dos construcciones de proteína de fusión anticuerpo anti-HMW-MAA-IFNa diferentes en ensayos de proliferación específicos usando las estirpes celulares A375 o CHL-1. No se observó actividad inhibitoria ni con la estirpe celular ni con el anticuerpo a las dosis ensayadas (CE50 >21 nM). El dominio extracelular de este antígeno es excepcionalmente grande (PM del dominio extracelular aprox. 240 kD-450 kD, dependiendo de la glucosilación). Es posible que determinadas construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFN que se unen a antígenos muy grandes puedan tener restricciones estéricas para interactuar simultáneamente con los receptores de IFN en las mismas células. Sin embargo, es posible que otros anticuerpos que se dirigen a otros epítopos de este antígeno puedan soportar la actividad de IFN dirigido. A pesar de esta posibilidad, se prefiere que el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la construcción polipeptídica de la presente invención se una a un antígeno, en donde el dominio extracelular del mismo tiene un peso molecular inferior a 240 kD.
Un segundo ejemplo de una construcción de proteína de fusión anticuerpo-IFNa atenuado que no mostró actividad potente se basó en un anticuerpo que se une al antígeno mieloide CD33. El CD33 se expresa a un nivel relativamente bajo en las células KG-1, indicado como 12.600 copias por célula (Sutherland, MAbs. 1(5): 481-490, 2009). El tratamiento de células KG-1 con una construcción de proteína de fusión anticuerpo anti-CD33-IFNa atenuado no logró inhibir la proliferación en todas las dosis ensayadas (CI50 > 76 nM). Se cree que el número relativamente bajo de copias de esta diana puede, en algunos casos, dependiendo de otros factores tales como la posición del epítopo, la densidad de receptores de IFN, etc., limitar la potencia de las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFN atenuado. Sin embargo, es posible que otros anticuerpos dirigidos a otros epítopos de este antígeno puedan soportar la actividad del IFN diana, o que otras células con un bajo número de copias de CD33 puedan, no obstante, responder a dichas construcciones de proteína de fusión debido a una mayor sensibilidad intrínseca al IFN, por ejemplo. A pesar de esta posibilidad, se prefiere que el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la construcción polipeptídica de la presente invención se una a un antígeno, en donde el antígeno está presente en la célula a una densidad superior a 12.600 copias por célula, preferentemente superior a 15.000 copias por célula.
Otro ejemplo de una construcción de proteína de fusión atenuada por anticuerpo en la que el anticuerpo no proporcionó suficiente direccionamiento hacia las células cancerosas, era un anticuerpo anti-gangliósido GM2 unido a un IFNa atenuado. En este caso, el anticuerpo se dirigía a un epítopo de carbohidrato y, como es habitual en estos anticuerpos, tenía baja afinidad (la CE50 para la unión a las células diana fue de ~50 nM mediante citometría de flujo). Por lo tanto, las realizaciones preferidas de la presente invención muestran una alta afinidad de unión a sus antígenos, con CE50 preferentemente inferiores a 50 nM, más preferentemente inferiores a 25 nM, aún más preferentemente inferiores a 10 nM e idealmente inferiores a 5 nM. Además, las realizaciones preferidas comprenden anticuerpos que se unen a epítopos de proteínas y péptidos en lugar de epítopos de carbohidratos.
El mieloma múltiple es de particular interés para determinadas realizaciones de la presente invención, concretamente para construcciones de proteínas de fusión que comprenden anticuerpos contra antígenos de mieloma múltiple y péptidos IFNa atenuados. La Tabla 3 enumera ejemplos de antígenos y anticuerpos de mieloma múltiple, con referencia a las secuencias de anticuerpos.
Tabla 3
(continuación
CD38 es de particular interés como diana de anticuerpos para las construcciones de proteínas de fusión de la presente invención. Los anticuerpos contra CD38 incluyen, por ejemplo, AT13/5 (véase, por ejemplo, Elliset al.(1995) J. Immunol. 155: 925-937), HB7 y similares. La Tabla 4 divulga varios anticuerpos c D38 conocidos que pueden usarse en este contexto:
Tabla 4
Como se usa en el presente documento, la expresión "ligando de señalización" incluye ampliamente cualquier ligando implicado en la activación de las vías de señalización celular, incluyendo cualquier molécula capaz de activar o inhibir los receptores de la superficie celular. La expresión también debe entenderse como una referencia a moléculas que pueden atravesar la bicapa lipídica de la membrana celular para activar las vías de señalización celular dentro de la célula. Como se usa en el presente documento, la expresión "ligando de señalización polipeptídica" se refiere a secuencias peptídicas y polipeptídicas de 6 a 1000 aminoácidos de longitud, que se unen a moléculas específicas de la superficie celular ("receptores") en determinadas células y, por lo tanto, transmiten una o varias señales dentro de dichas células. Los ligandos de señalización y ligandos de señalización polipeptídica de ejemplo contemplados en la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas, neurotransmisores y factores inductores de apoptosis.
Los ejemplos no limitantes de citocinas adecuadas incluyen la interleucina IL-1, IL-2 IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL_25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, Il-35 y sus subfamilias; la subfamilia del interferón (IFN), incluyendo interferón tipo I (IFN-a (IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21), IFN-p (IFN-P1 (IFNB1) e IFN-P3 (IFNB3)), IFN-w) ((IFNW1), IFNWP2, IFNWP4, IFNWP5, IFNWP9, IFNWP15, IFNWp18 e IFNWP19 e IFNK), interferón tipo II (IFN-<y>) e interferón tipo III (IFN-épsilon, -kappa, -omega, -delta, -tau y -gamma) y moléculas similares al interferón (limitina, IL-28A, IL-28B e IL-29; la familia IL-1, incluyendo IL-1a, IL-1p, el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1RA) e IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9 e IL1F10, y la familia IL-17, incluyendo IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (IL-25) e IL-17F. Como se divulga en el presente documento, el ligando de sepalizacian peptvdica o polipeptvdica puede seleccionarse del grupo que consiste en un IFN, IL-4 y IL-6. En una realizacian, el ligando de sepalizacian peptvdica o polipeptvdica es IFNa2b, con las mutaciones reivindicadas. Como se divulga en el presente documento, el ligando de señalización peptídica o polipeptídica se selecciona del grupo que consiste en IFNp1, IFNp1b e IFNy. Como se divulga en el presente documento, la secuencia de IFNa puede seleccionarse de las SEQ ID NOs 1 a 3, 80 a 90, 434 y 435.
Las quimiocinas de ejemplo incluyen, por ejemplo, RANTES, MCAF, MIP1-alfa, IP-10, proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1 o c Cl2), interleucina-8 (IL-8), CXCL13, XCL1 (linfotactina-a), XCL2 (linfotactina-p) y fractalquina (CX<3>CL1).
Los ejemplos no limitantes de factores de crecimiento incluyen, por ejemplo, adrenomedulina (AM), angiopoyetina (Ang), factor de motilidad autocrina, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor neurotrófico derivado de la estirpe celular glial (GDNF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de diferenciación del crecimiento-9 (GDF9), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento derivado de hepatocitos (HDGF), factor de crecimiento insulínico (IGF), factor estimulante de la migración, miostatina (GDF-8), factor de crecimiento nervioso (NGF) y otras neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento placentario (P1GF), IL-1-cofactor de iL-3 e IL-6, IL-2-factor de crecimiento de linfocitos T, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 y IL-7.
Los factores inductores de apoptosis de ejemplo incluyen FasL y TRAIL.
Las hormonas de ejemplo incluyen hormonas peptídicas tales como TRH y vasopresina, hormonas proteicas tales como insulina y hormona del crecimiento, hormonas glucoproteicas, tales como hormona luteinizante, hormona folículo estimulante y hormona estimulante de la tiroides, y hormonas procedentes de lípidos y fosfolípidos, tales como hormonas esteroideas, por ejemplo, testosterona y cortisol, hormonas esterol, tales como calcitriol, eicosanoides, tales como prostaglandinas.
Los ejemplos no limitantes de neurotransmisores adecuados incluyen monoaminas y otras aminas biógenas: dopamina (DA), norepinefrina (noradrenalina; NE, NA), epinefrina (adrenalina), histamina, serotonina (SE, 5-HT), somatostatina, sustancia P, péptidos opioides y acetilcolina (ACh).
La unión entre el anticuerpo y el ligando podría realizarse mediante un enlace peptídico simple, creando una proteína de fusión entre el ligando y la cadena pesada o ligera, o ambas, del anticuerpo. El ligando podría estar unido al extremo N o C de la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo, con o sin una secuencia peptídica de enlazador intermedio. En una realización, el ligando se une al anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, a través de un enlace peptídico. En una realización, el ligando se une al extremo C de la cadena pesada de una IgG1, IgG2 o IgG4 humana, humanizada o quimérica, ya sea directamente o con un enlazador intermedio de 1 a 20 aminoácidos de longitud.
Los ligandos polipeptídicos mutados pueden unirse al anticuerpo o fragmento de anticuerpo mediante conjugación química, interacciones proteína-proteína no covalentes o fusión genética. Los métodos para conjugar los ligandos descritos en el presente documento con anticuerpos pueden ser fácilmente implementados por un experto en la técnica. Como se apreciará fácilmente, pueden utilizarse métodos de acoplamiento químico usados comúnmente para unir ligandos a anticuerpos mediante, por ejemplo, grupos amino libres, ácido carboxílico o sulfhidrilo. Los ligandos también pueden unirse a anticuerpos mediante carbonilo (-CHO); estos grupos aldehído se pueden crear mediante la oxidación de grupos carbohidrato en glucoproteínas.
Algunos reactivos de reticulación usados comúnmente incluyen glutaraldehído, que une moléculas proteicas o peptídicas a los grupos amino alifáticos o del extremo N de péptidos o polipéptidos, carbodiimida (EDC), que une proteínas o péptidos al extremo C o los grupos carboxilo de la cadena lateral de proteínas o péptidos, ésteres de succinimida (por ejemplo, MBS, SMCC), que conjugan grupos amino libres y tioles de residuos de Cys, bencidina (BDB), que se une a residuos de Tyr, peryodato, que se une a grupos carbohidrato; e isotiocianato. Se contempla el uso de kits comerciales de conjugación química.
En algunas realizaciones, los marcadores se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. Por ejemplo, puede usarse un enlazador químico entre el ligando y el anticuerpo. Los expertos en la técnica podrán determinar fácilmente secuencias de enlazador de ejemplo, y es probable que incluyan enlazadores tales como modificadores de amino C6, C7 y C12 y enlazadores que comprenden grupos tiol.
Las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-ligando de la presente invención presentan mutaciones o deleciones en el ligando que reducen la actividad de los ligandos en la estimulación de sus receptores en células que carecen de la expresión de superficie celular del antígeno al que se une el anticuerpo.
Como se divulga en el presente documento, el ligando puede ser un interferón, cuyos ejemplos son interferones de tipo I (IFN-a (alfa), IFN-p (beta), IFN-<k>(kappa), IFN-6 (delta), IFN-£ (épsilon), IFN-<t>(tau), IFN-w (omega) e IFN-Z (zeta, también conocido como limitina), interferones de tipo II (IFN-y) o interferones de tipo III (IFN-A1, IFN-A2 e IFN-A3) (Pestka, Immunological Reviews 202(1):8-32, 2004).
Todos los interferones de tipo I emiten señales a través del receptor de interferón de tipo I, que está compuesto por IFNAR1 e IFNAR2. La señalización se produce cuando un IFN de tipo I se une a IFNAR1 e IFNAR2, uniéndolos así para formar un complejo con el IFN. Esto inicia una cascada de eventos intracelulares (la "señalización") que provoca, entre otras cosas, cambios en la expresión de numerosos genes regulados por el interferón. Se describen detalles de los eventos de señalización intracelular desencadenados por la activación del receptor de interferón de tipo I, por ejemplo, por Platanias, (Nature Reviews 5:375-86. 2005). Los interferones de tipo I incluyen diversos interferones alfa. Los interferones alfa humanos conocidos son IFNalb, a2a, a2p, a4b, a5, a6, a7, a8, a10, a1a/13, a14, a16, a17, av5 a21, a2c y a4a. Algunas realizaciones comprenden IFNa2b con las mutaciones reivindicadas, cuya secuencia de tipo natural, SEQ ID NO:3, se muestra en la figura 4. Los IFN han sido aprobados en diversas formas para diversas indicaciones, como se describe en la Tabla 5 (que también muestra listas de IFNp y<y>aprobados):
Tabla 5
(continuación
g
En las Tablas 6 y 7 se describen ejemplos no limitativos de mutaciones en IFNa2b que se pueden usar para reducir su potencia, basándose en la secuencia de IFNa2b humana (SEQ ID NO:3):
Tabla 6. Actividades biológicas relativas de meantes de interferón
(continuación
( ) ,
Tabla 7. Afinidad relativa de los mutantes in rf r n r r r
Estos mutantes presentan reducciones conocidas en la unión al receptor de interferón de tipo 1 IFNAR1 o IFNAR2, y/o reducciones conocidas de la potencia de IFNa basándose en ensayos basados en células.
Los datos de estas tablas se divulgaron en las siguientes referencias:
Piehler, Jacob, Roisman, Laila C., Schreiber, Gideon (2000). New structural and functional aspects of the Type I interferon-receptor interaction revealed by comprehensive mutational analysis of the binding interface. J. Biol. Chem. 275: 40425-40433.
Jaitin, Diego A, Roisman, Laila C, Jaks, Eva, Gavutis, Martynas, Piehler, Jacob, Van der Heyden, Jose, Uze, Gilles, Schreiber, Gideon (2006). Inquiring into the differential action of interferons (IFNs): an IFN-a2 mutant with enhanced affinity to IFNAR1 is functionally similar to IFN-p. Mol. Cell. Biol. 26: 1888-1897.
Slutzki, Michal, Jaitin, Diego A., Yehezkel, Tuval Ben, Schreiber, Gideon (2006). Variations in the unstructured C-terminal tail of interferons contribute to differential receptor binding and biological activity. J. Mol. Biol. 360: 1019 1030.
Kalie, Eyal, Jaitin, Diego A., Abramovich, Renne, Schreiber, Gideon (2007). An interferon a2 mutant optimized by phage display for IFNAR1 binding confers specifically enhanced antitubor activities. J. Biol. Chem. 282: 11602 11611.
Pan, Manjing, Kalie, Eyal, Scaglione, Brian J., Raveche, Elizabeth S., Schreiber, Gideon, Langer, Jerome A. (2008). Mutation of te IFNAR-1 receptor binding site of human IFN-a2 generates Tyep I IFN competitive antagonists. Biochemistry 47: 12018-12027.
Kalie, Eyal, Jaitin, Diego A., Podoplelova, Yulia, Piehler, Jacob, Schreiber, Gideon (2008). The Stability of the ternary interferon-receptor complex rather than the affinity to the individual subunits dictates differential biological activities. J. Biol. Chem. 283: 32925-32936.
La abreviatura "YNS" se usa a veces en el presente documento para representar variantes de IFNa, incluyendo las siguientes mutaciones: H57Y, E58N y Q61S.
La presente invención también contempla combinaciones de las mutaciones o deleciones de IFNa mencionadas anteriormente.
La invención también contempla la combinación de las construcciones de la presente invención con otros fármacos y/o junto con otras pautas o modalidades de tratamiento, tales como radioterapia o cirugía. Cuando las construcciones de la presente invención se usan junto con agentes terapéuticos conocidos, la combinación puede administrarse secuencialmente (de forma continua o interrumpida por períodos sin tratamiento), simultáneamente o como una mezcla. En el caso del cáncer, existen numerosos agentes antineoplásicos conocidos que pueden usarse en este contexto. También se contempla el tratamiento combinado, que abarca el tratamiento con la construcción de la invención seguido de un tratamiento conocido, o el tratamiento con un agente conocido seguido del tratamiento con la construcción de la invención, por ejemplo, como terapia de mantenimiento. Por ejemplo, en el tratamiento del cáncer se contempla que las construcciones de la presente invención pueden administrarse junto con un agente alquilante (tal como mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, ifosfamida, cisplatino o agentes alquilantes similares que contienen platino, tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino), un antimetabolito (tal como un análogo de purina o pirimidina o un agente antifolato, tal como azatioprina y mercaptopurina), una antraciclina (tal como daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, valrrubicina, mitoxantrona o análogo de antraciclina), un alcaloide vegetal (tal como un alcaloide de vinca o un taxano, tal como vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, paclitaxel o dosetaxel), un inhibidor de la topoisomerasa (tal como un inhibidor de la topoisomerasa tipo I o tipo II), una podofilotoxina (tal como etopósido o tenipósido) o un inhibidor de la tirosina cinasa (tal como mesilato de imatinib, nilotinib o dasatinib).
En el caso del tratamiento del mieloma múltiple, se contempla que las construcciones de la presente invención puedan administrarse junto con terapias actuales, tal como esteroides, tales dexametasona, inhibidores del proteasoma (tales como bortezomib o carfilzomib), fármacos inmunomoduladores (tales como talidomida, lenalidomida o pomalidomida), o quimioterapia de inducción seguida de trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas, con o sin otros agentes quimioterápicos, tales como clorhidrato de melfalán o los agentes quimioterápicos mencionados anteriormente.
En el caso del tratamiento del linfoma de Hodgkin, se contempla que las construcciones de la presente invención puedan administrarse junto con estrategias terapéuticas actuales, tales como ABVD (adriamicina [doxorrubicina], bleomicina, vinblastina y dacarbazina), Stanford V (doxorrubicina, bleomicina, vinblastina, vincristina, mecloretamina, etopósido, prednisona), o BEACOPP (doxorrubicina, bleomicina, vincristina, ciclofosfamida, procarbazina, etopósido, prednisona). En el caso del linfoma no Hodgkin u otros linfomas, se contempla que las construcciones de la presente invención puedan administrarse junto con estrategias terapéuticas actuales. Los ejemplos de fármacos aprobados para el linfoma no Hodgkin incluyen abitrexato (metotrexato), adriamicina PFS (clorhidrato de doxorrubicina), adriamicina RDF (clorhidrato de doxorrubicina), amboclorina (clorambucilo), amboclorina (clorambucilo), Arranon (nelarabina), clorhidrato de bendamustina, Bexxar (tositumomab y yodo I 131 tositumomab), Blenoxane (bleomicina), bleomicina, bortezomib, clorambucilo, Clafen (ciclofosfamida), ciclofosfamida, Cytoxan (ciclofosfamida), denileukin diftitox, DepoCyt (citarabina liposómica), clorhidrato de doxorrubicina, DTIC-Dome (dacarbazina), Folex (metotrexato), Folex PFS (metotrexato), Folotyn (pralatrexato), ibritumomab tiuxetano, Istodax (romidepsina), Leukeran (clorambucilo), Linfolizin (clorambucilo), citarabina liposómica, Matulane (clorhidrato de procarbazina), metotrexato, metotrexato LPF (metotrexato), Mexate (metotrexato), Mexate-AQ (metotrexato), Mozobil (plerixafor), nelarabina, Neosar (ciclofosfamida), Ontak (denileucina diftitox), plerixafor, pralatrexato, rituxan (rituximab), rituximab, romidepsina, tositumomab y yodo I 131 tositumomab, Treanda (clorhidrato de bendamustina), Velban (sulfato de vinblastina), Velcade (bortezomib) y Velsar (sulfato de vinblastina), sulfato de vinblastina, Vincasar PFS (sulfato de vincristina), sulfato de vincristina, vorinostat, Zevalin (ibritumomab tiuxetano), Zolinza (vorinostat). Los ejemplos de combinaciones farmacológicas usadas en el tratamiento del linfoma no Hodgkin incluyen CHOP (C = ciclofosfamida, H = Clorhidrato de doxorrubicina (hidroxidaunomicina), O = Sulfato de vincristina (Oncovin), P = Prednisona); COPP (C = Ciclofosfamida, O = Sulfato de vincristina (Oncovin), P = Clorhidrato de procarbazina, P = Prednisona); CVP (C = Ciclofosfamida, V = Sulfato de vincristina, P = Prednisona); EPOCH (E = Etopósido, P = Prednisona, O = Sulfato de vincristina (Oncovin), C = Ciclofosfamida, H = Clorhidrato de doxorrubicina (hidroxidaunomicina)); ICE (I = Ifosfamida, C = Carboplatino, E = Etopósido) y R-CHOP (R = Rituximab, C = Ciclofosfamida, H = Clorhidrato de doxorrubicina (hidroxidaunomicina), O = Sulfato de vincristina (Oncovin), P = Prednisona.
También se contempla la combinación de retinoides con construcciones de proteína de fusión basadas en interferón. Los retinoides son una familia de moléculas que desempeñan un papel fundamental en numerosas funciones biológicas, incluyendo el crecimiento, la visión, la reproducción, la diferenciación de células epiteliales y la función inmunitaria (Meyskens, F.et al.Crit Rev Oncol Hematol 3:75, 1987, Herold, M.et al.Acta Dermatovener 74:29 1975). Estudios preclínicos iniciales con el ácido retinoicotodo-transretinol o ATRA, ya sea solo o junto con otros agentes, demostraron actividad contra la leucemia promielocítica aguda (LPA), síndrome mielodisplásico, leucemia mieloide crónica (LMC), micosis fungoide y mieloma múltiple (revisado en Smith, M. J. Clin. Oncol. 10:839, 1992). Estos estudios condujeron a la aprobación de ATRA para el tratamiento de la LPA. Actualmente, existen más de 100 ensayos clínicos que evalúan la actividad de ATRA junto con otras terapias para el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas, cánceres de riñón, cánceres de pulmón, carcinomas escamocelulares y más. Son particular interés, y están directamente relacionados con la presente invención, los estudios que demuestran una mayor eficacia del tratamiento con interferón-a cuando se combina con ATRA. Esto se describe para el linfoma de células del manto (Col, J.et al.Cancer Res. 72:1825, 2012), carcinoma de células renales (Aass, N.et al.J. Clin. Oncol. 23:4172, 2005; Motzer, R. J. Clin. Oncol. 18:2972, 2000), LMC, melanoma, mieloma y carcinoma de células renales (Kast, R. Cancer Biology and Therapy, 7:1515, 2008) y cáncer de mama (Recchia, F.et al.J. Interferon Cytokine Res. 15:605, 1995). Por lo tanto, se predice una mayor actividad de los IFN atenuados dirigidos cuando se combinan con una dosificación terapéutica de ATRA en la práctica clínica. Además, Mehta (Mol Cancer Ther 3(3):345-52, 2004) demostró que el tratamientoin vitrode células leucémicas con ácido retinoico inducía la expresión del antígeno CD38. Por lo tanto, la mayor eficacia del interferón, sumada a la expresión inducida del CD38 diana, indicaría una terapia combinada de ATRA con este anticuerpo anti-CD38-IFNa atenuado en el tratamiento de cánceres sensibles a IFN que expresan CD38 o que pueden ser inducidos por ATRA para expresar CD38. Los ejemplos de dichos cánceres son mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, LMC y LMA.
Además, si bien las construcciones anteriores se basan en IFNa2b, las mutaciones o deleciones también podrían producirse en el contexto de cualquiera de los otros IFNa o IFNp. Como se divulga en el presente documento, el IFN tipo I puede ser un IFNp. El IFN-p está aprobado para el tratamiento de la esclerosis múltiple (EM). El IFN-p podría atenuarse mediante mutación o deleción y a continuación unirse a un anticuerpo dirigido a las células implicadas en la patogénesis de esta enfermedad. El IFN-p es un fármaco eficaz en la EM, pero su uso se asocia a efectos adversos, incluyendo inflamación en el lugar de la inyección, síntomas pseudogripales, leucocitopenia, disfunción hepática y depresión, lo que lleva a la interrupción del tratamiento en un subgrupo de pacientes. Al dirigir la actividad del IFN-p directamente a las células patógenas, pueden evitarse estos efectos adversos.
Se cree que la patogénesis de la EM se inicia y progresa mediante diversos eventos, incluyendo la activación innata de células dendríticas y microgliales a través de receptores tipo Toll, un desequilibrio entre las citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias/reguladoras, la diferenciación de linfocitos T CD4+ en los fenotipos Th1 y Th17, la activación de linfocitos Th1 por las células presentadoras de antígenos (APC), la reducción del número de linfocitos T reguladores (Treg) y la migración de células inmunitarias activadas a través de la barrera hematoencefálica (BHE). Se cree que los principales desencadenantes de los episodios clínicos de la enfermedad son los linfocitos Th1 autorreactivos y específicos de la mielina (revisado en Gandhi, 2010 J Neuroimmunol 221:7; Boppana, 2011 Mt Sinai J Med 78:207; Loma, 2011 Curr Neuropharmacol 9:409).
Como se divulga en el presente documento, una versión atenuada de IFN-p puede unirse a un anticuerpo dirigido a un marcador de superficie celular específico para linfocitos T, para el tratamiento de la esclerosis múltiple u otras indicaciones autoinmunitarias, donde el IFN-p puede ser eficaz. Los efectos directos del IFN-p en los linfocitos T incluyen la inhibición de la proliferación (Rep, 1996 J Neuroimmunol 67:111),la regulación negativa de la molécula coestimuladora CD40L (Teleshova, 2000 Scand J Immunol. 51:312), la disminución de la actividad de la metaloproteinasa que conduce a una menor migración a través de la BHE (Stuve, 1996 Ann Neurol 40:853; Uhm, 1999 Ann Neurol 46:319), la inducción de la apoptosis mediante la regulación positiva de CTLA-4 intracelular y moléculas Fas de la superficie celular (Hallal-Longo, 2007 J Interferon Cytokine Res 27:865), la regulación negativa de las proteínas antiapoptóticas (Sharief, 2001 J Neuroimmunol. 120:199; Sharief, 2002 J Neuroimmunol. 129:224), y la restauración de la función Treg (De Andres, 2007 J Neuroimmunol 182:204; Korporal, 2008 Arch Neurol 65:1434; Sarasella, 2008 FASEB J 22:3500; Chen, 2012 J Neuroimmunol 242:39).
Por lo tanto, como se divulga en el presente documento, un IFN-p atenuado puede unirse a un anticuerpo anti-CD3 dirigido a todos los linfocitos T, que incluye linfocitos CD4+, CD8+, Treg, Th1, Th2 y Th17. Este enfoque integral garantiza una cobertura total de todos los linfocitos T, ya que todos estos tipos de células tienen funciones indicadas en la patogénesis de la EM y se ven afectados por el tratamiento con IFN-p (Dhib-Jalbut, 2010 Neurology 74:S17; Prinz, 2010 Trends Mol Med 16:379; Graber, 2010 Clin Neurol Neurosurg 112:58 y Loma, 2011 Curr Neuropharmacol 9:409). En la Tabla 8 se enumeran ejemplos de anticuerpos CD3 que pueden incorporarse a las construcciones de proteínas de fusión de la presente invención.
Tabla 8
, , ,
Como alternativa, una construcción de proteína de fusión IFN -p atenuado-anti-CD4 presenta un enfoque mas restrictivo, pero se dirigirá a linfocitos T autorreactivos y reguladores, incluyendo linfocitos Th1 y Th17 y linfocitos Treg CD4+CD25+. Además, subconjuntos de células dendríticas (CD) también expresan CD4 y se han divulgado efectos terapéuticos directos del IFN-p sobre las CD (Shinohara, 2008 Immunity 29:68; Dann, 2012 Nat Neurosci 15:98). En la Tabla 9 se enumeran ejemplos de anticuerpos CD4 que pueden incorporarse a las construcciones de proteínas de fusión de la presente invención.
Tabla 9
Se ha indicado una función de los linfocitos T CD8+ en la EM (Friese, 2005 Brain 128:1747; Friese, 2009 Ann Neurol 66:132), así como un efecto directo del IFN-p sobre los linfocitos T CD8+ en pacientes con EM (Zafranskaya, 2006 Immunol 121:29). Por lo tanto, dirigir un IFN-p atenuado directamente a los linfocitos T CD8+ con un anticuerpo anti-CD8 puede dar como resultado beneficios clínicos para los pacientes con EM. En la Tabla 10 se muestran ejemplos de anticuerpos CD8.
Tabla 10
Los marcadores de linfocitos T activados, incluyendo, pero sin limitación, CD25, CD38, CD44, CD69, CD71, CD83, CD86, CD96, HLA-DR, ICOS y PD-1, también representan dianas atractivas para este enfoque, ya que se cree que los linfocitos T activados son los principales impulsores de la autorreactividad que da como resultado la desmielinización en la EM (Gandhi, 2010 J Neuroimmunol 221:7; Boppana, 2011 Mt Sinai J Med 78:207; Loma, 2011 Curr Neuropharmacol 9:409). Los anticuerpos dirigidos a cualquiera de estos antígenos podrían unirse a un IFNp atenuado. Los ejemplos de anticuerpos que podrían usarse en la presente invención incluyen los siguientes: Los anticuerpos CD71 incluyen BA120g (documento US 7736647) y diversos anticuerpos mencionados en Wanget al(Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao (Academic journal of the first medical college of PLA) 22(5):409-411, 2002). Los ejemplos de anticuerpos contra CD83 incluyen 20B08, 6G05, 20D04, 11G05, 14C12, 96G08 y 95F04 (documento US 7.700.740). Un ejemplo de un anticuerpo contra CD86 incluye 1G10H6D10 (documento US 6.071.519). Los anticuerpos HLA-DR incluyen HD3, HD4, HD6, HD7, HD8 y HD10 (documento US 7.262.278), DN1921 y DN1924 (documento US2005/0208048). Una diana atractiva en este sentido podría ser PD-1, que se expresa en linfocitos T recientemente activados. De forma ideal, se podría usar un anticuerpo no antagonista, tal como el anticuerpo J110 analizado con más detalle más adelante.
Los ejemplos de anticuerpos contra ICOS incluyen JMabs (documento US 6.803.039) y JMab 136 (documento US2011/0243929).
En las Tablas 11 y 12 se muestran ejemplos adicionales de anticuerpos dirigidos a estas dianas.
Tabla 11
, )
Tabla 12
Como se divulga en el presente documento, una versión atenuada de IFN-p se puede fusionar con un anticuerpo dirigido a marcadores de superficie celular de células mieloides, conocidos por contribuir a la patogénesis de la EM al impulsar la activación y diferenciación de los linfocitos T. Por ejemplo, se pueden dirigir los marcadores pan-mieloides CD33, CD115, o el marcador de células dendríticas CD11c. Se puede preferir un enfoque de direccionamiento amplio, por ejemplo, usando anticuerpos contra CD33 o CD115, ya que la contribución exacta de cada uno de los subconjuntos de células mieloides a la patogénesis de la EM y la respuesta al IFN-p ha sido objeto de controversia (Prinz, 2008 Immunity 28:675; Shinohara, 2008 Immunity 29:68; Dann, 2012 Nat Neurosci 15:98). Los anticuerpos contra CD33 que podrían usarse en la presente invención incluyen My9-6 (documento US 7.557.189), cualquiera de los 14 anticuerpos descritos en la Solicitud de Patente de EE. UU. US2012/0082670, o el anticuerpo conocido como huM195 (documento US5693761). Los anticuerpos contra CD115 que podrían usarse incluyen Ab1 y Ab16 (documento US 8.206.715) o CXIIG6 (documento US2011/0178278). Un ejemplo de anticuerpo CD11c que podría usarse de acuerdo con la presente invención es mAb 107 (documento US 7.998.738, número de depósito de la ATCC PTA-11614). Como alternativa, el IFN-p atenuado podría dirigirse al antígeno CD14, presente principalmente en macrófagos. En la Tabla 13 se muestran ejemplos de anticuerpos CD14.
Tabla 13
Como se divulga en el presente documento, el direccionamiento de las células que expresan CD52 suministrará IFN-p a todos los linfocitos y, además, a los monocitos y las células dendríticas periféricas (Buggins, 2002 Blood 100:1715; Ratzinger, 2003 Blood 101:1422), que son las APC clave responsables de la proliferación y diferenciación de los linfocitos T autorreactivos en la EM. Este enfoque dirigirá la actividad de IFN-p a los tipos celulares clave que se sabe que se ven directamente afectados por IFN-p y facilitará su actividad terapéutica en la Em . Los ejemplos de anticuerpos CD52 que podrían usarse de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación, DIVHv5/DIVKv2 (documento US 7.910.104), cualquiera de los anticuerpos CD52 divulgados en el documento (US2012/0100152) o CAMPATH.
Cualquiera de las construcciones de proteína de fusión de IFNp atenuado dirigidas por anticuerpos mencionadas anteriormente podría tener actividad terapéutica en el contexto de otras enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias más allá de la esclerosis múltiple, debido a sus etiologías inmunitarias subyacentes comunes.
Las enfermedades autoinmunitarias contempladas en el presente documento incluyen, entre otras, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison autoinmunitaria, esclerosis múltiple, enfermedad autoinmunitaria de las glándulas suprarrenales, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, ooforitis y orquitis autoinmunitarias, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, esprúe celiaco-dermatitis, síndrome de fatiga crónica (SFC), desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de Crest, enfermedad por crioaglutininas, enfermedad de Crohn, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria intestinal, dermatitis herpetiforme, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia, glomerulonefritis, enfermedad de Grave, enfermedad de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía de IgA, diabetes insulinodependiente (tipo I), liquen plano, lupus, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple, miastenia grave, miocarditis, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, puochitis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis y vitíligo. Es de particular interés la enfermedad de Behget, el edema macular uveítico crónico y otros tipos de uveítis, ya que se ha demostrado que el IFNa ofrece beneficios terapéuticos (Deuter, Dev Ophthalmol. 51:90-7. 2012)
Los ejemplos de enfermedades inflamatorias contempladas en la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, las enfermedades o trastornos que provocan enrojecimiento, hinchazón, dolor y sensación de calor en determinadas zonas, con el fin de
proteger los tejidos afectados por la lesión o la enfermedad. Las enfermedades inflamatorias que se pueden tratar usando los métodos de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, acné, angina de pecho, artritis, neumonía por aspiración, empiema, gastroenteritis, inflamación, gripe intestinal, NEC, enterocolitis necrosante, enfermedad inflamatoria pélvica, faringitis, PID, pleuresía, garganta irritada, enrojecimiento, rubor, dolor de garganta, gripe estomacal e infecciones del tracto urinario, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica.
La secuencia del interferón-p1 humano se muestra a continuación: (SEQ ID NO: 191)
1 MSYNLLGFLQ RSSNFQCQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDI PEEIKQLQQF 50
k k k
51 QKEDAñLTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT 100
-k k k k k
101 VLEEKLEKED FTRGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CñWTIVRVEI 150
151 LRNFYFINRL TGYLRN 166
Usando el esquema de numeración anterior (residuos 1-166), las mutaciones conocidas (en las posiciones indicadas con asteriscos) en el IFNp humano que reducen su actividad incluyen las enumeradas en la Tabla 14.
Tabla 14. Mutaciones atenuantes de la actividad del IFN
Referencias:
(1) Runkel, L., Pfeffer, L., Lewerenz, M., Mogensen, K. (1998). Differences in Activity between a and p Type I Interferons Explored by Mutational Analysis. J. Biol. Chem. 273: 8003-8008
(2) Stewart, A. G., Adair, J. R., Catlin, G., Hynes, C., Hall, J., Davies, J., Dawson, K. y Porter, A. G. (1987). Chemical mutagenesis of human interferon-beta: construction, expression in E. coli, and biological activity of sodium bisulfiteinduced mutations. DNA 6: 119 -128.
(3) Resultados internos
Como se divulga en el presente documento, el IFN puede ser IFN-A (documento WO 2007/029041 A2), que puede usarse para cualquiera de las aplicaciones descritas con más detalle para IFNa o IFNp.
Los IFN de tipo I pueden tener actividad antineoplásica basada en la estimulación directa del receptor de IFN de tipo I en las células cancerosas. Esto se ha demostrado para numerosos tipos de cáncer, incluyendo mieloma múltiple, melanoma, linfoma de linfocitos B, cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma de células renales, tricoleucemia, leucemia mielógena crónica, cáncer de ovario, fibrosarcoma, cáncer de cuello del útero, cáncer de vejiga, astrocitoma, cáncer de páncreas, etc. (Borden, Cancer Research 42:4948-53, 1982; Chawla-Sarkar, Clinical Cancer Research 7: 1821-31,2001; Morgensen, Int J. Cancer 28:575-82, 1981; Otsuka, British Journal of Haematology 103:518-529, 1998; Lindner, J of Interferon and Cytokine Research 17:681-693, 1997; Caraglia, Cell Death and Differentiation 6:773-80, 1999; Ma, World J Gastroenterol 11(10):1521-8, 2005). Un experto en la materia reconocerá que la presente invención y divulgación presenta numerosos aspectos resultantes de la combinación de anticuerpos contra antígenos tumorales con interferones de tipo I mutados, y que las construcciones de proteínas de fusión resultantes pueden usarse para reducir la proliferación de diversos cánceres sensibles al interferón que expresan los antígenos asociados a tumor correspondientes. También se apreciará que los interferones de tipo I se pueden combinar con otros agentes para mejorar aún más su eficacia.
Los interferones de tipo I también pueden presentar propiedades antivíricas. IFNa2b, por ejemplo, ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento de infecciones por hepatitis C crónica y también podría ser útil en el tratamiento de otras infecciones víricas. El IFN-a pegilado forma parte actualmente del tratamiento de referencia para la hepatitis C, de acuerdo con las directrices estadounidenses y europeas, pero produce efectos secundarios en más del 80 % de los pacientes, lo que a menudo lleva a la interrupción del tratamiento (Aman, 2012; Calvaruso, 2011). En un aspecto de la presente invención y divulgación, un IFN tipo I con una mutación atenuante se une a un anticuerpo que se une a las células infectadas por virus. El antígeno que debe reconocer el anticuerpo al que se ha hecho referencia anteriormente podría ser una proteína vírica que se expresa transitoriamente en la superficie celular del hospedador, o podría ser un antígeno endógeno producido por la célula hospedadora que se expone en la superficie celular en mayor medida después de la infección vírica que antes de la infección. Las proteínas víricas de ejemplo que podrían servir como dianas para la porción de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, glucoproteínas de la envoltura vírica de la hepatitis C, E1 y E2; antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg); glucoproteínas de la envoltura vírica del virus del herpes B, C, D, E, G, H, I, J, K, L, M y UL32, y proteína de la envoltura UL49A; proteínas de la envoltura del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), glucoproteína (gp) 120 y gp41; dominio perilla de la proteína de fibra de adenovirus; glucoproteínas de la envoltura del virus de la varicela-zóster (gB, gC, gE, gH, gI, gK, gL); glucoproteína vírica del virus de Epstein-Barr gp350 y proteína vírica BMRF-2; citomegalovirus humano UL16; proteínas de la cápside vírica del parvovirus B19 VP1-3; proteínas estructurales del astrovirus humano, por ejemplo, VP26, VP29 y VP32; proteína estructural VP1 y proteína de la cápside VP2 de norovirus; proteínas de la cápside vírica del poliovirus VP0, VP1, VP2, VP3 y VP4; proteínas de la cápside vírica del rinovirus VP1, VP2, VP3 y VP4; y proteínas de la partícula vírica del virus del dengue: cápside (C), premembrana/membrana (prM/M) y envoltura (E).
En una realización, la actividad del IFN-a puede dirigirse con un anticuerpo que se une, directa o indirectamente a través de una proteína intermediaria, tal como anexina V o beta2-glucoproteína 1, a la fosfatidilserina (PS), un componente fosfolípido de la lámina interna de las membranas celulares. Las células en apoptosis, sin embargo, o las células infectadas con virus, exponen la PS en la membrana externa, donde se vuelve accesible a los anticuerpos. La PS se encuentra expuesta en la superficie de las células cancerosas (Reidl, L.et al.,J Immunol.14:3623, 1991), en el endotelio vascular de los tumores (Ran, S.et al.,Cancer Res. 62:6132. 2002; He, J.et al.,Clin Cancer Res.15:6871, 2009), y en células infectadas por virus (Soares, M.et al.,Nat Med. 14:1357, 2008). Se ha descrito un anticuerpo dirigido indirectamente (a través de la beta2 glucoproteína 1) contra la PS, bavituximab. Este anticuerpo media en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos y es eficaz en diversos modelos de cáncerin vivo,incluyendo xenoinjertos de mama y linfoma humanos y un modelo de glioblastoma en ratas, así como en modelos de enfermedades víricas (Ran, S.et al.,Clin Cancer Res;11:1551, 2005; He, J.et al.,Clin Cancer Res.15:6871, 2009; Soares, M.et al.,Nat Med. 14:1357, 2008). En la actualidad, se está desarrollando como anticuerpo terapéutico para el tratamiento del cáncer de pulmón (DeRose, P.et al.,Immunotherapy. 3:933, 2011; Gerber, D.et al.,Clin Cancer Res.17:6888, 2011). Anticuerpos alternativos pueden basarse en las regiones variables del anticuerpo anti-PS 9D2 (Cancer Res, 1 de noviembre de 200262; 6132). Otra alternativa para dirigirse a la PS sería reemplazar las porciones Fab del anticuerpo por una proteína natural de unión a PS, tal como anexina V o beta2-glucoproteína 1. Un anticuerpo anti-PS (o como alternativa, una proteína de unión directa o indirecta a PS) fusionado con una versión atenuada de IFN-a dirigirá la actividad del IFN-a a las células infectadas por virus que expresan PS sin presentar los problemas de seguridad sistémica relacionados con el IFN-a. Determinadas células tumorales, tales como células de cáncer de pulmón, también expresan PS en su superficie celular, por lo que un anticuerpo (o como alternativa, una proteína de unión directa o indirecta a PS) contra P<s>, unido a un IFN atenuado, también podría ser útil en el tratamiento de determinados cánceres.
Debe entenderse que el IFNA atenuado dirigido por anticuerpos también podría usarse de la misma manera que el IFNa para el direccionamiento a las células infectadas por virus (S. V. Kotenko, G. Gallagher, V. V. Baurinet al.,"IFN-As mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex", Nature Immunology, vol. 4, n.° 1, págs. 69-77, 2003).
Como se divulga en el presente documento, los IFN de tipo II, concretamente INFy, también pueden atenuarse y unirse a anticuerpos que los dirigen a tipos celulares específicos. El IFN<y>posee propiedades antiproliferativas contra las células cancerosas (Kalvakolanu, Histol. Histopathol 15:523-37, 2000; Xu, Cancer Research 58:2832-7, 1998; Chawla-Sarkar, Apoptosis 8:237-49, 2003; Schiller, J Interferon Resarch 6:615-25, 1986). Sharifi ha descrito cómo crear una proteína de fusión en la que se ha fusionado un IFN<y>al extremo C de un anticuerpo dirigido a tumor (Sharifi, Hybridoma and Hybridomics 21(6):421-32, 2002). En esta referencia, Sharifi divulgó cómo producir proteínas de fusión anticuerpo-IFN<y>en células de mamífero y demostró que tanto el anticuerpo como el IFN eran funcionales. Como alternativa, puede usarse una versión dimérica monocatenaria de IFNy, como se describe por Lander (J Mol Biol. 26 de mayo de 2000; 299(1):169-79) en la proteína de fusión. Además del efecto antiproliferativo del IFN<y>en las células tumorales dirigidas, también podría tener otro efecto específico en las células de cáncer de mama: Se ha demostrado que el IFNy restaura la sensibilidad antiestrógena de las células de cáncer de mama (Mol Cancer Ther. mayo de 2010; 9(5): 1274-1285), por lo que un IFNy atenuado unido a un anticuerpo antigénico de cáncer de mama podría ser terapéuticamente útil junto con la terapia antiestrógena. Al atenuar el IFNy mediante mutación, puede producirse una forma de IFNy más selectiva contra el cáncer. Se han descrito dos mutaciones atenuantes en el IFNy por Waschutza (Eur J. Biochem. 256:303-9, 1998), concretamente des-(A23, D24), en la que se eliminan los residuos A23 y D24, y des-(N25, G26), en la que se eliminan los residuos N25 y G26. El mutante des-(A23, D24) tiene una afinidad ~18 veces reducida por el receptor de IFN<y>en comparación con el IFN<y>de tipo natural, y tenía una actividad antivírica ~100 veces reducida en comparación con el IFNy de tipo natural. La variante des-(N25, G26) tenía una afinidad ~140 veces reducida por el receptor de IFNy en comparación con el IFNy de tipo natural, y tenía una actividad antivírica ~10 veces reducida en comparación con el IFN<y>de tipo natural. Los ejemplos de proteínas de fusión que comprenden anticuerpos contra dianas de la superficie de células tumorales y mutantes atenuados de IFN<y>incluyen los siguientes: Rituximab puede usarse como proteína de fusión con uno de estos IFNy atenuados usando un enlazador de 7 aminoácidos descrito por Sharifi para producir la construcción de proteína de fusión "Rituximab-HC-L7-IFNY(A[A23,D24]) IgG1", compuesta por las SEQ ID NOS:378 (cadena pesada) y 276 (cadena ligera)). Se esperaría que una construcción de proteína de fusión de este tipo tuviera una potente actividad antiproliferativa contra las neoplasias malignas CD20, tales como linfomas de linfocitos B. Se describieron otros mutantes atenuados de IFNy que podrían ser apropiados para fusionarse con un anticuerpo dirigido a las células por Lundell (J Biol. Chem. 269(23):16159-62, 1994), concretamente S20I (~50 veces menos de afinidad), D21K (~100 veces menos de afinidad), A23Q (~2.500 veces menos de unión), A23V (~2.000 veces menos de unión) y D24A (~4 veces menos de unión). Estos IFNy atenuados pueden usarse como fusiones junto con anticuerpos anti-CD38, para generar la construcción de proteína de fusión "X355/02-HC-L7-IFNy(S20I) IgG1" (compuesta por las SEQ ID NOS:380 (cadena pesada) y 226 (cadena ligera)) o "R10A2-HC-L7-IFNy(D21K) IgG1" (compuesta por las SEQ ID NOS:382 (cadena pesada) y 270 (cadena ligera)). Se describieron otras mutaciones atenuantes en IFNy que podrían aprovecharse para la presente divulgación por Fish (Drug Des Deliv. febrero de 1988; 2(3):191-206).
El IFN<y>atenuado dirigido también puede usarse para tratar diversas indicaciones caracterizadas por fibrosis patológica, incluyendo fibrosis renal crónica, fibrosis hepática y fibrosis pulmonar idiopática (FPI). LA FPI es una forma crónica y progresiva de enfermedad pulmonar, caracterizada por fibrosis de causa desconocida, que se presenta principalmente en adultos mayores. A pesar de su necesidad médica, se ha avanzado poco en el desarrollo de estrategias terapéuticas eficaces (O'Connell, 2011 Adv Ther 28:986). La fibrosis pulmonar también puede ser inducida por la exposición a fármacos, partículas, microorganismos o irradiación. Lo siguiente se refiere tanto a la FPI como a la fibrosis pulmonar inducida por agentes conocidos y potencialmente al tratamiento de la fibrosis en otros tipos de órganos, incluyendo el hígado y el riñón.
Los fibroblastos desempeñan un papel clave en las enfermedades fibróticas del pulmón y su activación provoca la disposición de colágeno, dando como resultado una cicatrización excesiva y la destrucción de la arquitectura pulmonar. Sin embargo, existe poca información sobre el origen de estos fibroblastos patógenos, aunque se han propuesto varios tipos de células precursoras, incluyendo progenitores de médula ósea, monocitos, fibrocitos circulantes y células endógenas, tales como las células mesenquimales y epiteliales residentes (Stevens, 2008 Proc Am Thorac Soc 5:783; King, 2011 Lancet 378:1949).
Los monocitos CD14+ de sangre periférica pueden diferenciarse en fibrocitos, los precursores de fibroblastos, y este proceso es inhibido por el interferón-Y (IFN-<y>). Se demostró un efecto directo del IFN-<y>sobre los monocitos en estudios de diferenciaciónin vitro,lo que respalda la estrategia de dirigir una forma atenuada de IFN-y a los monocitos CD14+ para el tratamiento de la enfermedad fibrótica (Shao, 2008 J Leukoc Biol 83:1323).
Existe evidencia experimental de que el IFN-y es capaz de inhibir la proliferación y activación de fibroblastos (Rogliani, 2008 Ther Adv Respir Dis 2:75) y este hecho se ha aprovechado con éxito en modelos preclínicos para reducir la cicatrización y la fibrosis. Los ensayos clínicos en pacientes con FPI que estudian el beneficio de la administración subcutánea de IFN-y no alcanzaron los criterios de valoración principales de supervivencia (O'Connell, 2011 Adv Ther 28:986; King, 2011). Los enfoques actuales se centran en el suministro directo de IFN-<y>recombinante mediante la inhalación de un aerosol (Diaz, 2012 J Aerosol Med Pulm Drug Deliv 25:79), de modo que los pulmones puedan alcanzar suficiente actividad de IFN-y para producir un beneficio con una dosis sistémica global segura.
Suministrar la actividad de IFN-<y>directamente a los fibroblastos podría ser un método eficaz para aumentar la respuesta clínica a este agente y, al mismo tiempo, reducir sus efectos secundarios. La fusión de IFN-y atenuado con anticuerpos dirigidos a marcadores específicos de fibroblastos podría facilitar este enfoque. Existen varias moléculas de la superficie celular de los fibroblastos que se encuentran enriquecidas en fibroblastos. Estas incluyen, por ejemplo, la proteína específica de fibroblastos (FSP1; Strutz, 1995 J Cell Biol 130:393), la proteína de activación de fibroblastos (fA p ; Park, 1999 J Biol Chem 274:36505; Acharya, 2006 Hum Pathol 37:352), y los receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR-a y -p; Trojanowska, 2008 Rheumatology (Oxford) 47S5:2). La expresión de estas moléculas es elevada en biopsias pulmonares obtenidas de pacientes con FPI y participan directamente como dianas farmacológicas en la FPI o su patogénesis (Lawson, 2005 Am J Respir Crit Care Med 171:899; Acharya, 2006 Hum Pathol 37:352; Abdollahi, 2005 J Exp Med 201:925). En las Tablas 15 y 16 se muestran ejemplos de anticuerpos contra FAP y los receptores de PDGF.
Tabla 15
g g
Tabla 16
En un modelo preclínico de fibrosis hepática, se suministró IFN-y a las células estrelladas hepáticas, el equivalente a los fibroblastos y responsables de la secreción de colágeno en la fibrosis hepática, a través de liposomas dirigidos a PDGFR-p, potenciando así los efectos antifibróticos del IFN-y (Li, 2012 J Control Release 159:261). Estos datos respaldan el concepto y el posible beneficio terapéutico obtenido al suministrar la actividad de IFN-<y>directamente a los fibroblastos en enfermedades fibróticas, incluyendo la FPI y la fibrosis hepática, y validan el PDGFR-p como diana para este enfoque.
La presente divulgación también contempla la atenuación y el direccionamiento basado en anticuerpos de los IFN de tipo III, incluyendo IFNA1 (IL29), IFNA2 (IL28A) e IFNA3 (IL28B) (S. V. Kotenko, G. Gallagher, V. V. Baurinet al.,"IFN-As mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex", Nature Immunology, vol. 4, n.° 1, págs. 69-77, 2003., P. Sheppard, W. Kindsvogel, W. Xu,et al.,"IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R", Nature Immunology, vol. 4, n.° 1, págs. 63-68, 2003). Estos IFN actúan a través de receptores compuestos por la cadena IFNAR1 (también conocida como IL28Ra) y la cadena IL10R2 (compartida con los complejos receptores IL10, IL22 e IL26 [A. Lasfar, W. Abushahba, M. Balan, y K. A. Cohen-Solal, "Interferon lambda: a new sword in cancer immunotherapy", Clinical and Developmental Immunology, vol. 2011, Artículo ID 349575, 11 páginas, 2011]). Los IFNAR se expresan en la mayoría de los tipos celulares y median en las vías de señalización similares a las de los IFN de tipo I. La actividad antivírica de los IFN A se ha demostrado contra varios virus, incluyendo el VHB y el VHC (E. M. Coccia, M. Severa, E. Giacominiet al.,"Viral infection and toll-like receptor agonists induce a differential expression of type I and A interferons in humans plasmacytoid and monocyte-derived dendritic cells", European Journal of Immunology, vol. 34, n.° 3, págs. 796-805, 2004; M. D. Robek, B. S. Boyd, y F. V. Chisari, "Lambda interferon inhibits hepatitis B and C virus replication", Journal of Virology, vol. 79, n.°6, págs. 3851-3854, 2005; N. Ank, H. West, C. Bartholdy, K. Eriksson, A. R. Thomsen, y S. R. Paludan, "Lambda interferon (IFN-A), a type III IFN, is induced by viruses and IFNs and displays potent antiviral activity against select virus infections in vivo", Journal of Virology, vol. 80, n.° 9, págs. 4501-4509, 2006; S. E. Doyle, H. Schreckhise, K. Khuu-Duonget al.,"Interleukin-29 uses a type 1 interferonlike program to promote antiviral responses in human hepatocytes", Journal of Hepatology, vol. 44, n.° 4, págs. 896 906, 2006; T. Marcello, A. Grakoui, G. Barba-Spaethet al.,"Interferons a and A inhibit hepatitis C virus replication with distinct signal transduction and gene regulation kinetics", Gastroenterology, vol. 131, n.°6, págs. 1887-1898, 2006). Los estudios clínicos con IFNA para el tratamiento de la hepatitis C han mostrado resultados prometedores (E. L. Ramos, "Preclinical and clinical development of pegylated interferon-lambda 1 in chronic hepatitis C", Journal of Interferon and Cytokine Research, vol. 30, n.° 8, págs. 591-595, 2010). Un aspecto de la presente divulgación es dirigir un IFNA mutado y atenuado hacia células infectadas por virus, usando, por ejemplo, los anticuerpos de direccionamiento descritos anteriormente para la direccionamiento de una forma atenuada de IFNa. Las formas mutadas y atenuadas de un IFNA también podrían usarse para dirigirse a células cancerosas, como se describe con más detalle para el IFNa, anteriormente.
Los ligandos no IFN también se contemplan en la presente divulgación y pueden atenuarse mediante mutación y a continuación dirigirse a tipos celulares específicos mediante anticuerpos o fragmentos de los mismos. La citocina antiinflamatoria interleucina-10 (IL-10) desempeña un papel fundamental durante las respuestas inmunitarias innata y adaptativa. La IL-10 forma un homodímero y se une al complejo receptor de IL-10 expresado en las APC, lo que conduce a la reducción de la expresión del MHC de clase II y la producción de citocinas y quimiocinas proinflamatorias, inhibiendo así el desarrollo y la diferenciación de los linfocitos T. Sin embargo, la IL-10 también se ha visto implicada en la inducción de la proliferación de varias células inmunitarias, incluyendo los linfocitos B (Hofmann, 2012 Clin Immunol 143:116).
La expresión reducida de IL-10 se asocia con diversos trastornos autoinmunitarios en seres humanos y roedores, incluyendo psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal y artritis reumatoide. Los ratones con deficiencia de IL-10 desarrollan enterocolitis crónica, que puede prevenirse mediante la administración de IL-10, pero la aplicación clínica de estos hallazgos dio como resultado varios ensayos clínicos fallidos en pacientes. Una explicación de estos fracasos es que las concentraciones locales de IL-10 pueden ser demasiado bajas, incluso a una administración sistémica máxima tolerable (Herfarth, 2002 Gut 50:146). Otra explicación podría ser el efecto inmunoestimulante de la IL-10 sobre los linfocitos B y la consiguiente producción del IFN-<y>proinflamatorio, como se demostró en pacientes con enfermedad de Crohn tratados con IL-10 (Tilg, 2002 Gut 50:191).
La fusión de IL-10 atenuada con un anticuerpo específico para las APC, por ejemplo, dirigido a células dendríticas a través de CD11c, o a marcadores mieloides de expresión más amplia, como CD33 o CD115, disminuirá la actividad biológica sistémicamente activa y, al mismo tiempo, aumentará las concentraciones locales activas dirigidas de IL-10. Además, el efecto proinflamatorio demostrado a través de los linfocitos B se reducirá o se eliminará. La producción de proteínas de fusión anticuerpo-IL10 se ha descrito previamente (Schwager Arthritis Res Ther. 11(5): R142, 2009).
Existe evidencia de la función antifibrótica de la IL-10 en diversos modelos. Una característica distintiva de la fibrosis es la sobreproducción y deposición de colágeno producido por los fibroblastos, lo que da como resultado la formación de tejido cicatricial. La IL-10 inhibe directamente la síntesis de la matriz extracelular por fibroblastos humanos (Reitamo, 1994 J Clin Invest 94:2489) y es antifibrótica en un modelo de fibrosis hepática en ratas mediante la regulación negativa del TGF-p (Shi, 2006 World J Gastroenterol 12:2357; Zhang, 2007 Hepatogastroenterology 54:2092). El uso clínico de la IL-10 se ve obstaculizado por su corta semivida, y una versión PEGilada ha mostrado prometedoras mejoras farmacocinéticas y eficacia en un modelo preclínico de fibrosis (Mattos, 2012 J Control Release 162:84). El direccionamiento de la actividad de la IL-10 mediante la fusión con un anticuerpo que la dirige a los fibroblastos podría dar como resultado beneficios terapéuticos en enfermedades fibróticas, incluyendo la fibrosis pulmonar y hepática. Los anticuerpos contra proteínas específicas de fibroblastos, tales como la proteína de activación de fibroblastos y los receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas, como se ha descrito anteriormente en la descripción del direccionamiento de IFN-<y>, podrían suministrar IL-10 atenuada directamente a los fibroblastos.
La eritropoyetina recombinante (EPO) es una hormona ampliamente usada y eficaz para el tratamiento de la anemia, a menudo en pacientes con cáncer. Actúa mediante la señalización a través del receptor de EPO (EPOR), que no solo se expresa en células del sistema hematopoyético, sino también en células no hematopoyéticas, incluyendo células de diversos tipos tumorales. Numerosos estudios han examinado el papel de la estimulación con EPO y EPO-R en modelos de cáncerin vitroein vivo,y varios estudios han demostrado un efecto estimulante sobre el crecimiento tumoral, ya sea directamente en las células cancerosas o mediante el aumento de la angiogénesis en los tumores (revisado en Jelkmann, 2008 Crit Rev Oncol Hematol 67:39). En varios ensayos clínicos, el tratamiento con EPO se ha asociado con un mayor crecimiento tumoral y una menor supervivencia, lo que ha llevado a la recomendación y a la advertencia de recuadro negro de limitar y monitorizar la exposición a la EPO en pacientes con cáncer tanto como sea clínicamente posible (Farrell, 2004 The Oncologist 9:18; Jelkmann, 2008 Crit Rev Oncol Hematol 67:39; Elliott, 2012).
La eritropoyesis es un proceso multietapa, en el que las células madre pluripotentes experimentan etapas de diferenciación y proliferación estrictamente controladas. Un tipo celular intermedio en este proceso es la célula eritroide de unidades formadoras de colonias (CFU-E), que expresa altos niveles de EPOR, depende de la EPO para su supervivencia y parece ser el principal tipo celular en el proceso de diferenciación con esta dependencia (Elliott, 2008 Exp Hematol 36:1573).
El direccionamiento de la actividad de la EPO a las células CFU-E mediante marcadores específicos reducirá sustancialmente su efecto sobre el cáncer y otras células no hematopoyéticas, a la vez que mantendrá su capacidad para impulsar la formación de eritrocitos y aumentar los niveles de hemoglobina. El análisis genómico completo de las células CFU-E reveló varios marcadores celulares candidatos potenciales, incluyendo glucoproteínas asociadas al Rh, por ejemplo, CD241, y miembros del sistema de grupo sanguíneo Rh, por ejemplo, el producto del gen RCHE (Terszowski, 2005 Blood 105:1937).
Los marcadores de superficie de ejemplo adicionales expresados en UFC-E, y varios otros intermedios de la eritropoyesis, incluyen CD117 (c-kit), CD71 (receptor de transferrina) y CD36 (receptor de trombospondina) (Elliott, 2012 Biologics 6:163), pero estos marcadores también se sobreexpresan en determinadas células cancerosas, ya que todos participan en el crecimiento y la proliferación general y, por lo tanto, representan dianas menos atractivas para el direccionamiento de la actividad de EPO en pacientes con cáncer, pero este enfoque podría beneficiar a pacientes con tumores que no expresan estas dianas. Los anticuerpos CD117 incluyen SR-1 (US 7.915.391) y los anticuerpos DSM ACC 2007, 2008 y 2009 (documento US 5.545.533). Otros antígenos para el direccionamiento de una EPO atenuada incluyen CD34, CD45RO, CD45RA, CD115, CD168, CD235, CD236, CD237, CD238, CD239 y CD240.
La fusión de la actividad de la EPO con un anticuerpo también aumenta considerablemente el alcance de la actividad terapéutica. La semivida de la EPO recombinante es de aproximadamente 5 horas en seres humanos y probablemente se aumentará a semanas al fusionar la EPO atenuada con un anticuerpo. Este enfoque podría beneficiar a los pacientes tratados por anemia, quienes suelen recibir dosis varias veces a la semana, a menudo mediante inyecciones intravenosas. De manera importante, se ha demostrado que la respuesta terapéutica a la EPO está controlada principalmente por el tiempo que se mantienen las concentraciones de EPO, y no por los niveles de concentración (Elliott, 2008 Exp Hematol 36:1573).
Otro ejemplo es el factor de crecimiento transformante p (TGF-p), que es un factor crucial en la regulación de las respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T y la inducción de inmunotolerancia. Ratones genomanipulados por desactivación de TGF-p mueren por inflamación multifocal y trastornos autoinmunitarios, lo que sugiere un efecto inmunosupresor (Shull, 1992 Nature 359:693). Sin embargo, también se ha demostrado que el TGF-p induce enfermedad fibrótica mediante un papel destacado en la regulación de la matriz extracelular y al promover la migración, proliferación y activación de fibroblastos (Rosenbloom, 2010 Ann Intern Med 152:159; Wynn, 2011 J Exp Med 208:1339; King, 2011 Lancet 378:1949).
En presencia de TGF-p, los linfocitos T CD4+CD25' sin tratar se pueden convertir en linfocitos Treg, lo que puede suprimir la expansión de linfocitos T específicos de antígenoin vivoy prevenir la patogénesis alérgica en un modelo murino de asma (Chen, 2003 J Exp Med 198:1875). Las respuestas inflamatorias también contribuyen a la transición de la hepatopatía aguda y su perpetuación hacia la fibrosis crónica y la cirrosis, y el TGF-p puede ayudar a atenuar estas respuestas mediante su efecto sobre la diferenciación de los Treg (Dooley, 2012 Cell Tissue Res 347:245). De manera similar, el TGF-p dirigido a linfocitos T sin tratar en la enfermedad inflamatoria intestinal podría conducir al control y la supresión de la inflamación (Feagins, 2010 Inflamm Bowel Dis 16:1963).
El direccionamiento del TGF-p específicamente a los linfocitos T CD4+ puede aprovechar el potencial antiinflamatorio de TGF-p, minimizando al mismo tiempo sus propiedades profibróticas, y podría proporcionar una estrategia novedosa para combatir los trastornos autoinmunitarios. Como alternativa, el TGF-p podría dirigirse únicamente a los linfocitos T activados mediante un marcador de activación de linfocitos T, como se ha descrito anteriormente para el análisis del IFNp. Una diana atractiva en este sentido podría ser, por ejemplo, PD-1, que se expresa en los linfocitos T CD4 recientemente activados. De forma ideal, se podría usar un anticuerpo no antagonista, tal como el anticuerpo J110 analizado con más detalle más adelante.
Otro ejemplo es la interleucina-4 (IL-4), que es una citocina que induce la diferenciación de linfocitos T CD4+ sin tratar en linfocitos Th2. Tras la activación, los linfocitos Th2 producen más IL-4 y, como resultado, se considera que la IL-4 es un impulsor principal en la respuesta inmunitaria mediada por Th2. El concepto de un desequilibrio Th1/Th2 (que favorece a Th1) que contribuye a las enfermedades autoinmunitarias y otras enfermedades inflamatorias se postuló por primera vez en la década de 1980 (revisado en Kidd, 2003 Altern Med Rev 8:223) y, de hecho, se ha documentado el papel de los linfocitos Th1/Th17 como impulsores de la psoriasis (Ghoreschi, 2007 Clin Dermatol 25:574), determinados tipos de enfermedad inflamatoria intestinal, en particular la enfermedad de Crohn (Sanchez-Munoz, 2008 World J Gastroenterol 14:4280), o formas graves frente a leves de asma (Hansbro, 2011 Br J Pharmacol 163:81).
En modelos preclínicos de enfermedades infecciosas, la desviación de la respuesta inmunitaria de Th1 a Th2 y la activación de los macrófagos por IL-4 protegieron de la inmunopatología (Hunig, 2010 Med Microbiol Immunol 199:239), y la terapia con IL-4 en pacientes con psoriasis dio como resultado una inducción de la diferenciación de Th2 y una mejora en las puntuaciones clínicas (Ghoreschi, 2003 Nat Med 9:40).
La desviación hacia Th2 puede proporcionar un beneficio terapéutico en determinados tipos de enfermedades. El suministro de IL-4 a los linfocitos T CD4+ podría lograr esto, o la actividad de IL-4 podría dirigirse a los macrófagos para protegerlos de la inmunopatología (Ghoreschi, 2007 Clin Dermatol 25:574; Hunig, 2010 Med Microbiol Immunol 199:239).
Las mutaciones atenuantes de IL-4 que pueden aprovecharse en el diseño de construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IL-4 atenuada de la presente invención incluyen las que se enumeran en la Tabla 17.
Tabla 17
g p
Los mutantes de IL-4 de esta tabla, así como sus propiedades de unión y actividad biológica, se describieron por Wang Y, Shen B y Sebald W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4 de marzo de 1997; 94(5): 1657-62.
En otro ejemplo más, la interleucina-6 (IL-6) también puede atenuarse y dirigirse a tipos celulares específicos. Un mecanismo por el cual los tumores pueden evadir la inmunidad antitumoral es el reclutamiento de linfocitos Treg al microambiente tumoral, lo que genera tolerancia en los sitios tumorales. La IL-6 es una citocina que participa en la regulación del equilibrio entre los linfocitos Treg y Th17 e induce el desarrollo de linfocitos Th17, a la vez que inhibe la diferenciación de Treg (Kimura, 2010 Eur J Immunol 40:1830).
IL-6, al sesgar la diferenciación terminal de los linfocitos T CD4+ sin tratar hacia el linaje Th17, o la reprogramación de los linfocitos Th17, tiene el potencial de revertir la supresión inmunitaria asociada a tumores por parte de los linfocitos Treg en el contexto del cáncer, permitiendo así que el sistema inmunitario controle los tumores.
Esta estrategia ha demostrado ser eficaz en un modelo murino de cáncer de páncreas, en el que ratones a los que se les inyectaron células tumorales que expresaban IL-6 mostraron un retraso significativo en el crecimiento tumoral y una mayor supervivencia, acompañado de un aumento de linfocitos Th17 en el microambiente tumoral, en comparación con ratones portadores de tumores que no expresaban IL-6 (Gnerlich, 2010 J Immunol 185:4063).
La transferencia adoptiva de linfocitos T es un tratamiento eficaz para neoplasias malignas sólidas (Rosenberg, 2011 Clin Cancer Res 17:4550) y hematológicas (Kochenderfer, 2012 Blood 119:2709). El análisis de cinco ensayos clínicos diferentes en los que se empleó la transferencia adoptiva de linfocitos T mediante una diversidad de pautas de preacondicionamiento reveló que la profundidad y la duración del agotamiento de Treg se correlacionan con la tasa de respuesta clínica, lo que destaca el importante papel de los Treg residuales en el control de la respuesta antitumoral (Yao, 2012 Blood 119:5688). En ratones, una relación directa entre la supervivencia de los Treg y la eficacia de la terapia de transferencia adoptiva respalda firmemente estas observaciones clínicas a (Baba, 2012 Blood 120:2417).
La importancia de los linfocitos Treg en el control de la actividad antitumoral se ilustra adicionalmente por un aumento significativo en la respuesta humoral a la vacunación con péptidos en pacientes con glioblastoma tras el agotamiento de linfocitos Treg con el anticuerpo anti-receptor de IL-2 daclizumab (Sampson, 2012 PloS ONE 7:e31046).
En conjunto, los datos publicados respaldan firmemente el papel de los linfocitos Treg en la inhibición de la respuesta inmunitaria contra los tumores. Al dirigir la actividad de IL-6 a las células CD4+ para estimular la diferenciación de Th17 y disminuir la formación de Treg, se espera una mayor respuesta antitumoral. Esto puede lograrse con o sin estrategias de vacunación complementarias. La fusión de IL-6 atenuada con un anticuerpo contra un antígeno de linfocitos T (por ejemplo, direccionamiento a CD4) o un antígeno de linfocitos T activado (tal como PD-1) proporcionará un suministro completo directamente a las células diana.
Los mutantes atenuados de IL-6 incluyen los que se enumeran en la Tabla 18.
Tabla 18
Estos mutantes de IL-6 y sus propiedades se describieron por Kalai Met al.Blood. 15 de febrero de 1997;89(4):1319-1333
Otro ejemplo es el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), descubierto como mitógeno para los hepatocitos (revisado en Nakamura, 2010 Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 86:588). El factor de crecimiento de hepatocitos es una citocina pleiotrópica que regula el crecimiento y la motilidad celular, desempeñando un papel central en la angiogénesis y la generación y reparación de tejidos en muchos órganos.
El HGF actúa a través de su receptor, MET, que se expresa en células epiteliales y endoteliales. La unión del HGF a MET produce diversos eventos de fosforilación y señalización intracelular, lo que provoca diversas respuestas biológicas, incluyendo la migración, la proliferación y la morfogénesis. Esencial para la embriogénesis, la función principal del HGF en el adulto es la reparación tisular (Nakamura, 2010 Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 86:588).
Se ha demostrado que el HGF altera el destino de las células epiteliales y reduce la transición epitelial-mesenquimal (EMT) mediante su interferencia con la señalización de TGF-p, antagonizando el proceso de fibroblastogénesis (Shukla, 2009 Am J Respir Cell Mol Biol 40:643). Tras una lesión orgánica, el TGF-p impulsa la conversión de fibroblastos productores de HGF en miofibroblastos productores de colágeno, mientras que el HGF, a su vez, inhibe la producción de TGF-p por parte de los miofibroblastos (Mizuno, 2004 Am J Physiol Renal Physiol 286:F134). El HGF exógeno, o los miméticos que activan el receptor MET, actúan restaurando este desequilibrio impuesto por la lesión tisular y, por lo tanto, se consideran prometedores candidatos farmacológicos para el tratamiento de tejidos dañados y enfermedades fibróticas (Nakamura, 2010 Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 86:588).
Inicialmente estudiado en modelos de daño hepático y hepatitis (Roos, 1992 Endocrinology 131:2540; Ishiki, 1992 Hepatology 16:1227), el HGF demostró posteriormente beneficios terapéuticos en muchos otros órganos dañados, incluyendo modelos pulmonares, gastrointestinales, renales y cardiovasculares de lesión y fibrosis (Nakamura, 2011 J Gastroenterol Hepatol 26:188).
En sistemas modelo de fibrosisin vivo,el HGF previene la progresión de los cambios fibróticos y reduce la acumulación de colágeno cuando se administra de forma profiláctica o terapéutica en pulmones murinos expuestos a bleomicina (Yaekashiwa, 1997 Am J Respir Crit Care Med 156:1937; Mizuno, 2005 FASEB J 19:580), en un modelo de nefropatía obstructiva en ratones (Yang, 2003 Am J Physiol Renal Physiol 284:F349) yen modelos de fibrosis hepática en ratas (Matsuda, 1997 Hepatology 26:81); el HGF también previene la fibrosis en hámsteres cardiomiópatas (Nakamura, 2005 Am J Physiol Heart Circ Physiol 288:H2131).
Las limitaciones del HGF como agente terapéutico incluyen su corta semivida, que requiere concentraciones sistémicas suprafisiológicas para alcanzar niveles localmente eficaces, y el papel de su receptor, MET, en el cáncer. MET puede activar vías oncogénicas en células epiteliales. Ambas limitaciones pueden superarse mediante la generación de una construcción de proteína de fusión anticuerpo-HGF y su direccionamiento hacia tejido en regeneración o fibrótico. Esta estrategia produciría un agente terapéutico con una semivida mucho más larga, dirigido principalmente a los tipos celulares relevantes.
Ensayos clínicos han investigado el potencial terapéutico y la actividad regenerativa del HGF, o de miméticos de HGF, en insuficiencia hepática, úlceras crónicas en las piernas, isquemia de extremidades, arteriopatía periférica, vasculopatía tras un infarto de miocardio y enfermedades neurológicas (de Andrade 2009 Curr Opin Rheumatol 21:649; Nakamura, 2011 J Gastroenterol Hepatol 26:188; Madonna, 2012 Thromb Haemost 107:656).
La fibrosis hepática, típicamente resultado de daño hepático crónico causado por infecciones o abuso de alcohol, se caracteriza, al igual que la fibrosis en otros órganos, por una acumulación excesiva de matriz extracelular, incluyendo el colágeno producido por los (mio)fibroblastos. Los hepatocitos dañados liberan citocinas inflamatorias y el medio inflamatorio resultante estimula la transformación de las células estrelladas hepáticas (HSC) en fibroblastos, que producen colágeno. La acumulación de proteínas de la matriz extracelular produce tejido cicatricial, lo que conduce a la cirrosis hepática (Bataller, 2005 J Clin Invest 115:209). Existe evidencia de un efecto directo del HGF sobre los hepatocitos y Hs Cin vitro(Kwiecinski, 2012 PloS One 6:e24568; Namada, 2012 J Cell Physiol DOI 10.1002/jcp.24143). El direccionamiento del HGF específicamente a los hepatocitos o las HSC puede dar como resultado un beneficio terapéutico en pacientes con fibrosis hepática, a la vez que elimina los efectos sistémicos no deseados del HGF.
Las posibles proteínas de membrana para los hepatocitos incluyen, por ejemplo, ASGR1, una subunidad de la asialoglucoproteína, usada como diana para el suministro farmacológico específico al hígado (Stockert, 1995 Physiol Rev 75:591) o, como alternativa, la otra subunidad de este receptor, ASGR2. La expresión de la proteína específica de fibroblastos (FSP1) aumenta tras una lesión hepática y puede usarse para dirigirse a fibroblastos o macrófagos inflamatorios en el tejido hepático fibrótico (Osterreicher, 2011 Proc Natl Acad Sci USA 108:308).
En pacientes con fibrosis pulmonar, la pérdida de la arquitectura pulmonar se caracteriza por la pérdida de células epiteliales alveolares, la proliferación persistente de fibroblastos activados y la alteración extensa de la matriz extracelular (Panganiban, 2011 Acta Pharmacol Sin 32:12).
Para tratar la fibrosis pulmonar, la actividad del HGF puede suministrarse a las células epiteliales alveolares mediante su atenuación (mediante mutación) y su unión a un anticuerpo contra una proteína de superficie celular específica en estas células, tal como RTI40/Tia o HTI56 (McElroy, 2004 Eur Respir J 24:664).
Los marcadores específicos de células endoteliales, incluidos los receptores de VEGF (Stuttfeld, 2009 IUBMB Life 61:915) pueden usarse para dirigirse a los vasos sanguíneos y potenciar la capa de células endoteliales en varias indicaciones patológicas, incluyendo isquemia de las extremidades posteriores. En la Tabla 19 se muestran ejemplos de anticuerpos contra el receptor de VEGF.
Tabla 19
gy
En la técnica se conocen muchos otros ejemplos de ligandos de señalización que, como se describe en las realizaciones de ejemplo no limitantes anteriores, pueden atenuarse y unirse a un anticuerpo (o fragmento del mismo) que se une a un antígeno en células diana específicas, lo que permite que el ligando genere su señal biológica en dichas células diana en un grado mucho mayor que el que genera su señal en células negativas para antígeno. Los ejemplos de ligandos que tienen un efecto negativo directo sobre la proliferación tumoral incluyen TNFa, TRAIL, ligando Fas, IFNp, IFN<y>o IFNA, que pueden dirigirse a diversos antígenos de la superficie de las células tumorales, como se ha analizado anteriormente para INFa.
En la presente invención, se mencionan explícitamente mutaciones específicas en INFa. Sin embargo, existen métodos bien conocidos en la técnica para identificar otras mutaciones en ligandos de señalización y numerosos métodos para la mutagénesis de proteínas. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, la mutagénesis aleatoria, que expone la proteína a radiación UV o productos químicos mutagénicos y la selección de mutantes con las características deseadas. La mutagénesis aleatoria también puede realizarse mediante el uso de nucleótidos dopados en la síntesis de oligonucleótidos o mediante una reacción de PCR en condiciones que favorecen la incorporación incorrecta de nucleótidos, generando así mutantes. Otra técnica es la mutagénesis dirigida, que introduce cambios específicos en el ADN. Un ejemplo de mutagénesis dirigida es el uso de oligonucleótidos mutagénicos en una reacción de extensión de cebadores con la ADN polimerasa. Este método permite la mutación puntual, o la deleción o inserción de pequeños tramos de ADN, que se introducen en sitios específicos. El enfoque dirigido puede realizarse sistemáticamente mediante técnicas como la mutagénesis por barrido de alanina, mediante la cual los residuos se mutan sistemáticamente a alanina y se determina su efecto sobre la actividad del péptido. Cada uno de los residuos de aminoácido del péptido se analiza de esta manera para determinar las regiones importantes del péptido.
Otro ejemplo es la mutagénesis combinatoria, que permite el cribado de un gran número de mutantes para una característica particular. En esta técnica, pueden modificarse exhaustivamente unas pocas posiciones seleccionadas o un tramo corto de ADN para obtener una biblioteca completa de proteínas mutantes. Un enfoque de esta técnica consiste en escindir una porción de ADN y reemplazarla con una biblioteca de secuencias que contenga todas las combinaciones posibles en los sitios de mutación deseados. El segmento puede estar en un sitio activo de una enzima o en secuencias con importancia estructural o propiedades inmunogénicas. Sin embargo, también se puede insertar un segmento aleatoriamente en el gen para evaluar la importancia estructural o funcional de una parte específica de la proteína.
Los métodos para cribar ligandos mutados para determinar su potencia incluyen el ensayo de la presencia de un complejo entre el ligando y la diana. Un tipo de ensayo consiste en ensayos de unión competitiva. En dichos ensayos de unión competitiva, la diana típicamente está marcada. La diana libre se separa de cualquier complejo potencial y la cantidad de marcador libre (es decir, no sin formar complejo) es una medición de la unión del agente en estudio a la molécula diana. También se puede medir la cantidad de diana unida, en lugar de la libre. También es posible marcar el compuesto en lugar de la diana y medir la cantidad de compuesto que se une a la diana en presencia y en ausencia del fármaco en estudio.
Un ejemplo de un ensayo acelular es un ensayo de unión. Aunque no aborda directamente la función, la capacidad de un modulador para unirse a una molécula diana de una manera específica constituye una prueba contundente de un efecto biológico relacionado. Por ejemplo, la unión de una molécula a una diana puede, en sí misma, ser inhibitoria debido a interacciones estéricas, alostéricas o de carga-carga. La diana puede estar libre en solución, fijada a un soporte, expresada en o sobre la superficie de una célula. Tanto la diana como el compuesto pueden estar marcados, permitiendo de este modo determinar la unión. Por lo general, la diana será la especie marcada, lo que reduce la probabilidad de que el marcaje interfiera o mejore la unión. Se pueden usar formatos de unión competitiva en los que uno de los agentes está marcado, y se puede medir la cantidad de marcador libre frente a la de marcador unido para determinar el efecto sobre la unión.
Dependiendo del ensayo, puede requerirse un cultivo. La célula se examina mediante diferentes ensayos fisiológicos. Como alternativa, pueden realizarse análisis moleculares, por ejemplo, expresión de proteínas, expresión de ARNm (incluida la visualización diferencial de ARN de poliA o una célula completa) y otros. Los ejemplos no limitantes de ensayos biológicosin vitroque se pueden usar para cribar variantes proteicas se muestran en los Ejemplos a continuación y también incluyen ensayos de apoptosis, ensayos de migración, ensayos de invasión, ensayos de activación de caspasas, ensayos de producción de citocinas y similares.
La presente invención también proporciona composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente invención y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden comprender además al menos uno de cualquier auxiliar adecuado, tal como, pero sin limitación, aglutinante, estabilizante, tampones, sales, disolventes lipófilos, conservante, adyuvantes o similares. Se prefieren los auxiliares farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos no limitantes y métodos para preparar dichas soluciones estériles se conocen bien en la técnica, tal como, pero sin limitación, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a edición, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990. Se pueden seleccionar rutinariamente portadores farmacéuticamente aceptables que sean adecuados para el modo de administración, la solubilidad y/o la estabilidad de la composición de anticuerpos, como se conoce en la técnica o como se describe en el presente documento.
Los excipientes y aditivos farmacéuticos útiles en la presente composición incluyen, pero sin limitación, proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos y carbohidratos (por ejemplo, azúcares, incluyendo monosacáridos, di-, tri-, tetra- y oligosacáridos; azúcares derivatizados tales como alditoles, ácidos aldónicos, azúcares esterificados y similares; y polisacáridos o polímeros de azúcar), que pueden estar presentes individualmente o en combinación, comprendiendo, solos o en combinación, el 1-99,99 % en peso o volumen. Los ejemplos de excipientes proteicos de ejemplo incluyen seroalbúmina, tal como seroalbúmina humana (HSA), albúmina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína y similares. Los aminoácidos representativos que también pueden actuar como tampón incluyen alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo, y similares. Un aminoácido preferido es la histidina. Un segundo aminoácido preferido es arginina.
Los excipientes de carbohidratos adecuados para su uso en la invención incluyen, por ejemplo, monosacáridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), mioinositol y similares. Los excipientes de carbohidratos preferidos para su uso en la presente invención son manitol, trehalosa y rafinosa.
Las composiciones de anticuerpos también pueden incluir un tampón o un agente de ajuste del pH; típicamente, el tampón es una sal preparada a partir de un ácido o base orgánicos. Los tampones representativos incluyen sales de ácidos orgánicos, tales como sales de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético o acido Itálico; tampones Tris, clorhidrato de trometamina o fosfato. Los tampones preferidos para su uso en las presentes composiciones son sales de ácidos orgánicos, tales como citrato.
Adicionalmente, las composiciones de la invención pueden incluir excipientes/aditivos poliméricos, tales como polivinilpirrolidonas, ficolls (un azúcar polimérico), dextratos (por ejemplo, ciclodextrinas, tal como 2-hidroxipropil-pciclodextrina), polietilenglicoles, agentes saporíferos, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, tensioactivos (por ejemplo, polisorbatos, tales como "TWEEN® 20" y "TWEEN® 80"), lípidos (por ejemplo, fosfolípidos, ácidos grasos), esteroides (por ejemplo, colesterol) y agentes quelantes (por ejemplo, EDTA).
Estos y otros excipientes y/o aditivos farmacéuticos conocidos, adecuados para su uso en las composiciones de anticuerpos de acuerdo con la invención, se conocen en la técnica, por ejemplo, como se enumera en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19.a ed., Williams & Williams, (1995), y en "Physician's Desk Reference", 52.a ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998). Los materiales portadores o excipientes preferidos son carbohidratos (por ejemplo, sacáridos y alditoles) y tampones (por ejemplo, citrato) o agentes poliméricos.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende", o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento indicado, integrante o etapa, o grupo de elementos, integrantes o etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento, integrante o etapa, o grupo de elementos, integrantes o etapas.
Cualquier análisis de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o similares que se han incluido en la presente memoria descriptiva es únicamente con el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. Esto no debe tomarse como una admisión de que alguno o todos estos elementos formen parte de la base de la técnica anterior ni que fueran de conocimiento general en el campo pertinente a la presente invención, tal como existía en Australia o en otros lugares antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de la presente solicitud.
Cabe señalar que, como se usa en la memoria descriptiva en cuestión, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen aspectos en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "uno" incluye tanto uno como dos o más; la referencia a "uno" incluye tanto uno como dos o más; la referencia a "el/la" incluye tanto uno como dos o más, etc.
Habiendo descrito de manera general la invención, la misma se comprenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no tienen carácter limitante.
Ejemplos de la invención
Producción de construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa
Vectores de expresión:
El ADN que codifica las regiones variables de rituximab (Andersonet al.,Patente de EE. UU. 5.843.439, 1 de diciembre de 1998) y palivizumab (Johnson, Patente de EE. UU. 5.824.307, 20 de octubre de 1998) se generó a partir de 18 oligonudeótidos de ADN (de cadena pesada) y 16 (de cadena ligera), que se diseñaron de acuerdo con las secuencias de aminoácidos publicadas, mediante ensamblaje génico basado en PCR. El ADN que codifica las regiones variables de los anticuerpos monoclonales G005 anti-CD38 y nBT062 anti-CD138 se extrajo de las publicaciones de De Weerset al.(Patente de EE. UU. 7829673) y de Daelkenet al.(documento WO 2009/080832), respectivamente, y se sometió a síntesis por Integrated DNA Technology, Inc. (Coralville, IA) tras la modificación de secuencias para eliminar codones raros y sitios de restricción no preferidos.
Las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de los anticuerpos monoclonales anti-HLA humano (HB95), anti-PD-1 humano (J110) y anti-virus de la fiebre amarilla (2D12) se determinaron tras la clonación a partir del hibridoma W6/32 (ATCC HB-95, Barnstableet al.(1978), Cell 14:9-20), j 110 (Depositario Internacional de Organismos de Patentes FERM-8392, Iwaiet al.(2002), Immunol. Lett, 83:215-220) y 2D12 (ATCC CRL-1689, Schlesingeret al.(1983), Virol. 125:8-17), respectivamente, usando el kit de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech, Mountain View, CA) y conjuntos de cebadores de Ig de ratón (Novagen/EMD Chemicals, San Diego, CA). La determinación de secuencias y la subclonación de los anticuerpos anti-CD38 recién aislados se describen en las siguientes secciones.
El ADN que codifica el interferón-a2b humano (IFNa2b; secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3) se aisló del ADN genómico de una estirpe celular HEK mediante PCR. Las secuencias de interferón-p1 humano (IFNp1, SEQ ID NO:91), interleucina-4 humana (IL-4, SEQ ID NO:119) e interleucina-6 humana (IL-6, SEQ ID NO:123) se diseñaron a partir de las secuencias proteicas, tales como NP_002167, NP_000580 y NP_000591, respectivamente, y se sintetizaron por Integrated DNA Technology, Inc. (Coralville, IA) o GenScript<u>S<a>Inc. (Piscataway, NJ) usando métodos conocidos comúnmente por los expertos en la técnica. Se introdujeron alteraciones de las secuencias de citocinas, por ejemplo, la adición de enlazadores o mutaciones puntuales, en los genes de las citocinas usando técnicas de PCR de extensión por superposición bien conocidas en la técnica.
A continuación, los fragmentos génicos codificantes de citocinas se clonaron en el vector de expresión pTT5 (Durocher, Nucleic Acids Research volumen 30, número 2, páginas E1-9, 2002) que contenía una región constante completa o parcial de cadena pesada de IgG1 humana (tal como número de acceso de Swissprot PO1857), una región constante de cadena pesada de IgG4 humana (tal como número de acceso de Swissprot P01861 que incorpora la sustitución S228P), región constante de Ig kappa humana (número de acceso de Swissprot P01834) o región constante de Ig lambda humana (número de acceso de Swissprot P0CG05) como una Ig desproteinizada o como una forma de fusión génica de citocina usando técnicas de PCR de extensión por superposición y sitios de restricción de acuerdo con métodos de clonación bien conocidos por los expertos en la técnica.
Producción de IgG y construcciones de proteína de fusión IgG-interferón:
Se prepararon plásmidos de ADN que codificaban las IgG y construcciones de proteína de fusión IgG-citocina usando el kit Plasmid Plus Maxi (Qiagen, Valencia, CA) y a continuación se transfectaron en células HEK293-6E (CNRC, Montreal, Canadá) cultivadas en medio sintético F17 complementado con Pluronic F-68 al 0,1 %, L-glutamina 4 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando un reactivo de transfección disponible en el mercado y medio OptiMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tras permitir la expresión durante 6 días en una incubadora suministrada con CO2 al 5 % y agitación suave, el medio de cultivo se aisló y se sometió a purificación por afinidad de IgG usando perlas de proteína G-agarosa (GE Healthcare, Piscataway, NJ). A continuación, las construcciones de proteína de fusión de IgG purificada y citocina-IgG se concentraron y se sometieron a intercambio de tampón con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4 usando dispositivos de filtración centrífuga Amicon Ultra (Millipore, Billerica, MA), seguido de la determinación de la concentración de proteínas usando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA).
Aunque se expresaron diferentes construcciones de proteína de fusión anticuerpo-citocina en el sistema HEK con diferentes rendimientos, varias de ellas, en particular varias de las basadas en IFNa, se produjeron a razón de al menos 100 mg/l de medio, mostraron una alta solubilidad y no se agregaron, como se determinó mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
Las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos y las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-ligando se describen a continuación. Para las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-citocina en las que la citocina se fusionó al extremo C de la cadena pesada o ligera, se usó la siguiente convención de nomenclatura:
[nombre de mab] - [enlace a cadena pesada ("HC") o cadena ligera ("LC")] - [Nombre del enlazador] - [nombre del ligando] [(mutación)] [isotipo].
Por lo tanto, por ejemplo, la construcción "Rituximab-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1" (que no se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones) es el anticuerpo rituximab, con IFNa2b (con la mutación puntual A145G), unido al extremo C de la cadena pesada de IgG1, con el enlazador intermedio L6.
Los enlazadores usados en los experimentos fueron los siguientes:
L0: ningún enlazador (fusión directa del extremo C de una cadena de anticuerpo con el extremo N de la citocina)
L6: SGGGGS (SEQ ID NO:132)
L16: SGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:133)
Método para medir la actividad dirigida a antígeno de construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa
"Ensayo específico (Daudi)": Este ensayo se usó para cuantificar la actividad antiproliferativa de los IFN y construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFN en células que presentan el antígeno correspondiente al anticuerpo al que se fusiona el IFN, y puede usarse como parte del ensayo para calcular el índice de sensibilidad al antígeno (ASI) definido en el presente documento. Las células Daudi expresan tanto CD20 como CD38 como antígenos asociados a la superficie celular. La viabilidad de las células se midió usando el reactivo CellTiter-Glo®, N.° de cat. G7570, de Promega (Madison, Wisconsin). Este es un ensayo basado en luminiscencia que determina la viabilidad de las células en cultivo basándose en la cuantificación de ATP. La intensidad de la señal es proporcional al número de células viables en un pocillo de una placa de microvaloración. Los detalles del ensayo son los siguientes:
Las células Daudi (obtenidas en la ATCC, Manassas, VA) se cultivaron en un matraz T75 (TPP, Trasadingen, Suiza, N.° de cat. 90076) a una densidad preferida de entre 0,5 x 105 y 0,8 x 105 células viables/ml en RPMI 1640 (Mediatech, Inc., Manassas, V<a>, N.° de cat. 10-040-CV) con suero fetal bovino al 10% (FBS; Hyclone, Logan, UT N.° de cat. SH30070.03). Las células se recogieron por centrifugación a 400 g durante cinco minutos, decantando el sobrenadante y suspendiendo de nuevo el sedimento celular en RPMI 1640 FBS al 10 %. A continuación, las células se contaron y la densidad se ajustó a 3,0 x 105 células/ml en RPMI 1640 FBS al 10 %. A continuación, 50 pl de la suspensión celular se dividieron en alícuotas en cada pocillo de una placa de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos (en lo sucesivo, "placa experimental") (TPP, N.° de cat. 92067). En una placa estéril de 96 pocillos separada (en lo sucesivo, "placa de dilución"; Costar, Corning, NY, N.° de cat. 3879), los artículos de prueba se diluyeron en serie por duplicado en RPMI 1640 FBS al 10%. A continuación, se transfirieron 50 pl/pocillo de la placa de dilución a la placa experimental. A continuación, la placa experimental se incubó durante cuatro días a 37 °C con CO2 al 5 %.
Se añadió a la placa experimental a razón de 100 pl/pocillo una mezcla del tampón de ensayo suministrado por el fabricante y el sustrato de ensayo (en lo sucesivo, "reactivo CellTiterGlo", mezclado de acuerdo con las instrucciones del fabricante). La placa se agitó durante dos minutos. A continuación, se transfirieron 100 pl/pocillo de la placa experimental a una placa opaca de color blanco de fondo plano de 96 pocillos (en lo sucesivo, "placa de ensayo"; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, N.° de cat. 35 3296). A continuación, el contenido de la placa de ensayo se dejó estabilizar en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. La placa se leyó en un contador Victor 3V Multilabel (Perkin Elmer, Waltham, MA, modelo n.° 1420-041) en el canal de luminometría y se midió la luminiscencia. Los resultados se presentan como "unidades relativas de luminiscencia (URL)".
Los datos se analizaron usando Prism 5 (Graphpad, San Diego, CA) usando regresión no lineal y ajuste de curva de tres parámetros para determinar el punto medio de la curva (CE50). Para cada artículo de prueba, se calculó la potencia relativa al IFNa2b libre (o alguna otra forma de IFN con una potencia conocida relativa al IFNa2b) como la relación de las CE50.
Un experto en la técnica apreciará que existen muchos otros ensayos usados comúnmente para medir la viabilidad celular que también podrían usarse.
"Ensayo específico (ARP)" (también denominado con frecuencia en el presente documento "ensayo dirigido"): La estirpe celular de mieloma múltiple ARP-1 fue un obsequio del Dr. Bart Barlogie, PhD, director del Myeloma Institute en la University of Arkansas Medical Center (Little Rock, AK). Se describe en Hardin J.et al.,(Interleukin-6 prevents dexamethasone-induced myeloma cell death. Blood; 84:3063, 1994). Se usaron células ARP-1 (CD38+) para ensayar las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa dirigidas a CD38. Las condiciones de cultivo y ensayo fueron las mismas que para el ensayo basado en Daudi descrito anteriormente, con las siguientes excepciones: ARP-1 se cultivó a una densidad de 4,0 x 105 a 6,0 x 105 células/ml. La concentración de ARP-1 se ajustó a 1,0 x 104 células/ml antes del ensayo.
Método para medir la actividad no dirigida a antígeno de construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa
"Ensayo inespecífico" (también denominado con frecuencia en el presente documento ensayo "no dirigido"): El ensayo iLite de PBL Interferon Source (Piscataway, NJ, N.° de cat. 51100), se realizó en gran medida según lo descrito por el fabricante, con la adición de una etapa de bloqueo de IgG humana. El fabricante describe la estirpe celular iLite como "una estirpe celular transfectada estable procedente de una estirpe celular humana promonocítica disponible en el mercado, caracterizada por la expresión de antígenos MHC de clase II, en particular el antígeno linfocitario humano (HLA-DR), en la superficie celular". La estirpe celular contiene un gen de luciferasa transfectado de manera estable, cuya expresión está impulsada por un elemento de respuesta a interferón (IRE), que permite cuantificar la actividad del interferón basándose en el resultado de luminiscencia. La placa iLite suministrada por el fabricante (en lo sucesivo, "placa de ensayo") y el diluyente se retiraron del congelador a -80 °C y se dejaron equilibrar a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 50 pl de diluyente por pocillo a la placa de ensayo. El vial con las células indicadoras suministradas por el fabricante se retiró del congelador a -80 °C y se descongeló en un baño de agua a 37 °C. A continuación, se dispensaron alícuotas de 25 pl de células en cada pocillo de la placa de ensayo. A continuación, se añadieron por pocillo 12,5 pl de IgG humana a razón de 8 mg/ml que se diluyó en RPMI 1640 FBS al 10 % (Sigma Chemicals, St. Louis, MO; N.° de cat. I4506). El contenido se mezcló y se incubó a 37 °C durante 15 minutos. En una "placa de dilución" separada, los artículos de prueba se diluyeron en serie por duplicado en RPMI 1640 FBS al 10 %. A continuación, se transfirieron 12,5 pl de los artículos de prueba de la placa de dilución a la placa de ensayo. A continuación, la placa de ensayo se incubó a 37 °C con CO2 al 5% durante 17 horas. El tampón de ensayo suministrado por el fabricante y el sustrato se retiraron del congelador a -80 °C y se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante dos horas. El tampón de ensayo suministrado por el fabricante se añadió al vial de sustrato suministrado por el fabricante y se mezcló bien de acuerdo con las instrucciones del fabricante para crear la "solución de luminiscencia". A continuación, se añadieron 100 pl de la solución de luminiscencia a cada pocillo de la placa de ensayo. La placa se agitó durante 2 minutos. A continuación, la placa se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad y finalmente se leyó en un contador Victor 3V Multilabel en un canal de luminometría, y la luminiscencia se midió y se presentó como URL. Los datos se analizaron con Graphpad Prism 5 como se describe para el "ensayo específico (Daudi)", anteriormente. Para ensayar las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFN anti-CD38 en el ensayo iLte, el diluyente suministrado por el fabricante se complementó con 2 mg/ml de IgG humana y 0,5 mg/ml de anticuerpo anti-CD38 (ensayándose el mismo clon de anticuerpo como construcción de proteína de fusión anticuerpo-IFN, para bloquear cualquier unión de las construcciones de proteína de fusión anticuerpo anti-CD38-IFN al CD38 expresado en las células iLite).
Resultados: Especificidad antigénica de construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa
La figura 6 muestra la actividad de interferón del IFNa2b libre (SEQ ID NO:3; "IFNa" en la figura), así como del IFNa2b fusionado al extremo C de la cadena pesada de dos anticuerpos diferentes (rituximab y palivizumab, un anticuerpo de control de isotipo), actuando sobre la estirpe celular iLite. Esta estirpe celular no presenta el antígeno para ninguno de estos anticuerpos, por lo que este ensayo revela la potencia de diversas proteínas que contienen IFNa2b en ausencia del direccionamiento basado en anticuerpo-antígeno. Los detalles de este ensayo se han descrito anteriormente en el apartado "Método para medir la actividad no dirigida al antígeno de las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa" y, en lo sucesivo, se abreviará como "ensayo inespecífico". "Rituximab-HC-L6-IFNa IgG1" (que no se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones) se refiere al anticuerpo quimérico dirigido a CD20 Rituximab, cuya cadena ligera (SEQ ID NO:276) permanece inalterada, pero la cadena pesada de la clase IgG1 (SEQ ID NO:277) tiene, unida a su extremo C, una secuencia de enlazador de 6 aminoácidos ("L6"; SGGGGS, SEQ ID NO: 132), seguida de la secuencia de IFNa2b (SEQ ID NO:3); esta secuencia de enlazador de cadena pesada-IFNa se muestra como SEQ ID NO:280. "Isotipo-HC-L6-IFNa IgG1" (que no se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones) se refiere al anticuerpo humanizado dirigido contra el VRS palivizumab, cuya cadena ligera (SEQ ID NO:290) permanece inalterada, pero la cadena pesada de la clase IgG1 (SEQ ID NO:291) tiene, unida a su extremo C, una secuencia de enlazador de 6 aminoácidos ("L6"; SGGGGS, SEQ ID NO: 132), seguida de la secuencia de IFNa2b (SEQ ID NO:3); esta secuencia de enlazador de cadena pesada-IFNa2b se muestra como SEQ ID NO:294. En este ensayo, el IFNa2b libre mostró una CE50 para la activación de la expresión génica a través de un elemento de respuesta al interferón (IRE) de 1,9 pM. Al unir IFNa2b a rituximab, hubo una disminución de 3,1 veces (5,9/1,9 = 3,1) en su potencia. Se observó una disminución modesta similar en la potencia cuando se unió IFNa2b a palivizumab (que no se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones). De nuevo, la estirpe celular usada en este estudio no presentó el antígeno correspondiente a ninguno de estos anticuerpos en su superficie celular, lo que demuestra que la unión de una IgG al extremo N de IFNa2b causó una disminución modesta (3-4 veces) en su actividad de IFN no dirigida al antígeno. Esto concuerda con lo notificado por otros autores (por ejemplo, en el documento US 7.456.257). Ni palivizumab ni rituximab por sí solos (sin la fusión con un interferón) mostraron actividad en este ensayo (datos no mostrados).
Para determinar si las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa2b presentaban una actividad mejorada con respecto al IFNa2b libre en células que presentan el antígeno correspondiente en su superficie celular, se examinó su efecto en las células Daudi, que presentan el antígeno CD20 de rituximab, pero no el antígeno de la proteína F del VRS correspondiente a palivizumab. El ensayo usado en este caso, descrito anteriormente como "Método para medir la actividad dirigida a antígeno de construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa" o simplemente el "ensayo específico (Daudi)", midió el efecto de las sustancias de prueba sobre la viabilidad de las células Daudi. Con estas células, la construcción de proteína de fusión Rituximab-IFNa2b (Rituximab-HC-L6-IFNa IgG1, que no se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones) era 3,25 veces (1,3/0,4 = 3,25) más potente que el IFNa2b libre (figura 7). En otras palabras, la unión de rituximab al IFNa2b dio como resultado una actividad ligeramente reducida (3,1 veces) hacia las células negativas para antígeno (figura 6), pero ligeramente aumentada (3,25 veces) hacia las células positivas para antígeno (figura 7). En general, por lo tanto, la unión del anticuerpo aumentó el índice de especificidad antigénica (IEA), definido como el factor de aumento de la potencia en relación con el IFNa2b libre en células positivas para antígeno multiplicado por el factor de disminución de la potencia en relación con el IFNa2b libre en células negativas para antígeno, en 10 veces (3,1 x 3,25) en este experimento. Una repetición de los experimentos midió un ASI de 14, como se muestra en la Tabla 20, fila 2. La CE50 (punto medio matemático de la curva de respuesta a la dosis) se usó como medida de potencia en los cálculos presentados aquí. En otras palabras, cuando el compuesto A mostró una CE50 10 veces menor que el compuesto B, se consideró que tenía una potencia 10 veces mayor.
Los resultados presentados en la figura 8 concuerdan con el direccionamiento basado en anticuerpos, que depende de la reactividad anticuerpo-antígeno: la construcción de proteína de fusión Rituximab-IFNa (Rituximab-HC-L6-IFNa-IgG1, que no se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones) era 12 veces (2,2/0,18 = 12) más potente en la reducción de la viabilidad de las células Daudi CD20+ que la construcción de proteína de fusión Palivizumab-IFNa (Isotipo-HC-L6-IFNa-IgG1, que no se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones), cuyo antígeno no está presente en las células Daudi.
La modesta reducción en la actividad de IFNa que se produjo como resultado de su unión a un anticuerpo podría no ser suficiente para prevenir la toxicidad del componente IFNa de la construcción en sujetos humanos. Por lo tanto, se introdujeron diversas mutaciones en IFNa2b para reducir su actividad y toxicidad. Por ejemplo, se generaron cinco versiones mutantes diferentes de IFNa2b y, en cada caso, se unieron al extremo C de la cadena pesada de rituximab mediante el enlazador de seis aminoácidos L6, que tiene la secuencia SGGGGS (SEQ ID NO:132). Estas construcciones se compararon con la construcción de proteína de fusión Rituximab-IFN de tipo natural, Rituximab-HC-L6-IFNa IgG1, que no se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones (ya que también se usó en los experimentos que se muestran en las figuras 6-8). Las cinco versiones de mutantes fueron R144A, A145G (que no se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones), R33A+YNS, R33A y R144A+YNS. Las secuencias de estas variantes se describen a continuación. El grado de afinidad reducida esperada por los receptores de interferón tipo I, basado en la caracterización previa por mutantes de IFN, y la magnitud de la atenuación esperada en la actividad del interferón, se muestran en las Tablas 6 y 7, anteriormente.
Las figuras 9, 10 y la Tabla 20 muestran el grado de reducción de la actividad del interferón para cada una de estas construcciones de proteína de fusión Rituximab-IFNa2b atenuado en relación con el IFNa2b libre de tipo natural, en células negativas para antígeno (es decir, CD20 negativas). El mutante R144A de la construcción de proteína de fusión Rituximab-IFNa2b (compuesta por la SEQ ID NOS:282 (cadena pesada) y 276 (cadena ligera)) mostró 386 veces menos actividad del interferón (2200/5,7 = 386). Las versiones A145G (que no se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones) y R33A+YNS (compuestas por las cadenas pesadas de las SEQ ID NOS:284 y 286, respectivamente, cada una de las cuales se combina con la cadena ligera de la SEQ ID NO:276) mostraron 491 veces (2800/5,7 = 491) y 1.071 veces (6100/5,7 = 1.071) menos actividad, respectivamente. La figura 10 muestra que el grado de reducción de la actividad del interferón para la construcción de proteína de fusión R144A+YNS (compuesta por las SEQ ID NOS:288 (cadena pesada) y 276 (cadena ligera)) es de 303 veces (1700/5,6 = 303) en relación con la construcción de proteína de fusión de rituxumab que carece de mutaciones de IFN (Rituximab-HC-L6-IFNa IgG1); ya que Rituximab-HC-L6-IFNa IgG1 es 3,8 veces menos potente en las células negativas para antígeno que el IFNa2b libre de tipo natural (datos de la figura 9; 22/5,7 = 3,8), esto significa que la versión R144A+YNS de la construcción de proteína de fusión era 1.150 veces menos potente que el IFNa libre de tipo natural (303 x 3,8 = 1.150). La versión R33A de la construcción de proteína de fusión (compuesta por las SEQ ID NOS:436 (cadena pesada) y 276 (cadena ligera)) se atenuó a tal grado que no mostró actividad detectable en el ensayo no dirigido.
Tabla 20 - Los ejemplos representados por ♦ se encuenr n f r l l n l r ivin i i n
g ( ,
Curiosamente, cuando la cantidad de actividad de interferón de estas construcciones de proteína de fusión rituxumab-IFNa2b mutante muy atenuadas se midió en células positivas para antígeno (Daudi, CD2o+), generalmente hubo muy poca atenuación en comparación con la versión de IFNa2b de tipo natural de la construcción de proteína de fusión Rituximab-IFNa2b (figuras 11-12) y, por lo tanto, los interferones mutados aún poseían la capacidad de activar el receptor de IFN en las células "específicas", mientras que su capacidad para activarlo en las células "inespecíficas" era considerablemente menor. Por ejemplo, la versión R33A+YNS de la construcción fue solo 2,2 veces (0,74/0,33 = 2,2) menos activa que la construcción de tipo natural Rituximab-IFNa2b en las células positivas para antígeno (Daudi). Esto contrastó con la reducción de 277 veces (6100/22 = 277; figura 9) de la actividad en las células negativas para antígeno. Las mutaciones en el IFNa2b, en el contexto de la construcción de proteína de fusión Rituximab-IFNa2b, provocaron una atenuación sustancialmente mayor de la actividad en células negativas para antígeno que en células positivas para antígeno. Como resultado, la construcción de proteína de fusión Rituximab-HC-L6-IFNa2b (R33A+YNS) IgG1 mostró un índice de especificidad antigénica (ASI, 1.700 veces) sustancialmente mayor en comparación con Rituximab-HC-L6-IFNa2b IgG1 (de 10 a 14 veces) o IFNa2b libre (1 veces, por definición), lo que sugiere que sus efectos inespecíficosin vivose reducirán sustancialmente.
Otras construcciones de Rituximab-IFNa2b con mutaciones en la porción IFNa2b también mostraron una actividad sorprendentemente reducida en células positivas para antígeno (figuras 11 y 12) en relación con su potencia reducida en células negativas para antígeno (figuras 9 y 10). Con la excepción de la versión R33A de la construcción de proteína de fusión, analizada más adelante, las mutaciones atenuantes causaron una disminución de 384-1.160 veces en la actividad del interferón en relación con el IFNa2b libre de tipo natural en células negativas para antígeno, pero mostraron una potencia 0,23-1,2 veces superior a la del IFNa2b de tipo natural en células positivas para antígeno. La construcción de proteína de fusión con mutación R33A, que tenía una actividad de IFN indetectable en ausencia de direccionamiento de anticuerpo-antígeno, aún mostró una actividad significativa en presencia de direccionamiento de anticuerpo; la potencia de la versión R33A de la construcción de proteína de fusión era 1.620 veces menor que la de la misma construcción de proteína de fusión que carecía de esta mutación atenuante en el ensayo específico (340/0,21 = atenuación de 1.620 veces). Esto contrasta marcadamente con la atenuación de al menos 100.000 veces causada por la misma mutación en ausencia de direccionamiento basado en anticuerpos (figura 10). Estos resultados se resumen en la Tabla 20.
Para determinar si esta drástica diferencia en la capacidad de las mutaciones en el componente IFNa de las construcciones de proteína de fusión para reducir sustancialmente su actividad en células negativas para antígeno, en comparación con las células positivas para antígeno, podría extenderse a otras construcciones de proteína de fusión dirigidas a otros antígenos, se fusionaron anticuerpos dirigidos al antígeno del mieloma múltiple CD 38 (SEQ ID NO: 131) tanto con la forma natural como atenuada de IFNa y se caracterizaron. Algunos de estos experimentos se realizaron usando el anticuerpo G005 (De Weerset al.(Patente de EE. UU. 7829673)); las secuencias de las cadenas pesada y ligera de este anticuerpo humano se muestran como SEQ ID NOS: 135 y 134, respectivamente.
Además, se produjeron varios anticuerpos humanos y de rata novedosos contra CD38, como se describe a continuación.
Desarrollo de anticuerpos CD38 novedosos
Formateo de construcciones de CD38 para su expresión
Los dominios extracelulares (ECD) de las proteínas CD38 humanas y de macaco cangrejero se formatearon cada uno para incluir una secuencia líder del extremo N escindible, un Avitag™, un marcador de polihistidina y un sitio de escisión de trombina para producir las proteínas SEQ ID NO: 127 y 128, respectivamente. Estas se retrotradujeron a secuencias de ADN y se sintetizaronde novomediante el ensamblaje de oligonucleótidos sintéticos mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Tras la síntesis génica, los genes se subclonaron en el vector pTT5 (Durocher, Nucleic Acids Research volumen 30, número 2, páginas E1-9, 2002) para producir construcciones que producen formas solubles secretadas de estas proteínas mediante expresión transitoria en células HEK293E (Durocher, anteriormente).
Construcción de vectores para la expresión de anticuerpos
Las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera se subclonaron en variantes del vector pTT5 que contenían una región constante de cadena pesada de IgG1 humana (tal como número de acceso de Swissprot PO1857), una región constante de cadena pesada de IgG4 humana (tal como número de acceso de Swissprot P01861 que incorpora la sustitución S228P), una región constante kappa humana (número de acceso de Swissprot P01834) o una región lambda humana (número de acceso de Swissprot P0CG05) para producir cadenas de anticuerpo de longitud completa.
Expresión transitoria de construcciones en células HEK293-6E
Se cultivaron células HEK293-6E en medio de crecimiento celular completo (1 l de medio F17 (Invitrogen™), 9 ml de Pluronic F68 (Invitrogen™), glutamina 2 mM que contenía triptona NI al 20 % (p/v) (Organotechnie®) con geneticina (50 mg/ml, Invitrogen™) a razón de 50 pl/100 ml de cultivo). El día antes de la transfección, las células se recogieron por centrifugación y se suspendieron de nuevo en medio nuevo (sin geneticina). Al día siguiente, el ADN se mezcló con un reactivo de transfección comercial y la mezcla de transfección de ADN se añadió gota a gota al cultivo. El cultivo se incubó durante una noche a 37 °C con CO2 al 5 % y a 120 rpm sin geneticina. Al día siguiente, se añadieron 12,5 ml de triptona junto con 250 pl de geneticina por 500 ml de cultivo. El cultivo se incubó a 37 °C, con CO2 al 5 % y a 120 rpm. Después de 7 días, el sobrenadante se recogió por centrifugación y estuvo listo para la purificación.
Expresión y purificación de anticuerpos
La coexpresión transitoria de cadenas pesadas y ligeras en células HEK293-6E (como se ha descrito anteriormente) generó anticuerpos que posteriormente se purificaron mediante cromatografía de proteína A. Brevemente, los sobrenadantes procedentes de estas transfecciones se ajustaron a pH 7,4 antes de cargarse en una columna HiTrap de Proteína A (5 ml, GE Healthcare). La columna se lavó con 50 ml de PBS 1x (pH 7,4). La elución se realizó con ácido cítrico 0,1 M a pH 2,5. El anticuerpo eluido se desalinizó usando columnas de desalinización Zeba (Pierce) en PBS 1x (pH 7,4). Los anticuerpos se analizaron mediante SDS-PAGE. La concentración del anticuerpo se determinó usando el kit de ensayo de BCA (Pierce).
Purificación de proteínas marcadas con histidina a partir de sobrenadantes de cultivo tisular
Se usó cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar las proteínas del dominio extracelular (ED, por sus siglas en inglés) de CD38 humana y de macaco cangrejero a partir de sobrenadantes de cultivo tisular. Brevemente, los sobrenadantes de proteínas se diluyeron en tampón de unión (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 30 mM, pH 7,4) antes de cargarlos en una columna HisTrap™ FF (1 ml, GE Healthcare). La columna se lavó con 5 ml de tampón de unión (pH 7,4) y la elución se realizó usando fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 500 mM, pH 7,4. Las proteínas eluidas se desalinizaron y el tampón se intercambió con una unidad de filtración centrífuga Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-10 (Millipore) en PBS 1x (pH 7,4). La absorbancia a 280 nm (A280) de la proteína se evaluó con un espectrofotómetro Nanodrop y las lecturas se corrigieron usando los coeficientes de extinción previstos para determinar las concentraciones de proteína.
Biotinilación de antígenos para la presentación en fagos
Los motivos Avitag™ de los CD38 ED humanos y de macaco cangrejero se biotinilaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Avidity LLC, Aurora, CO). El exceso de biotina no conjugada se eliminó de las proteínas biotiniladas mediante desalinización en PBS 1x usando una columna de centrifugación Zeba con un límite de peso molecular (MWCO) de 7 kD (Thermo Scientific, Logan, UT), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La biotinilación exitosa de las proteínas del CD38 ED se confirmó usando una combinación de electroforesis en gel de poliacrilamida y transferencia de Western. Las transferencias de Western se analizaron con estreptavidina-HRP (BD Biosciences, San Diego, CA) y se desarrollaron usando TMB (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para cada antígeno, se detectó el CD38 ED biotinilado monomérico.
Generación de anticuerpos anti-CD38 mediante presentación en fagos
Se aislaron FAb que se unen a los CD38 ED humanos y de macaco cangrejero a partir de una biblioteca de fagémidos sin tratar que comprende aproximadamente 2,5 x 1011 fragmentos FAb humanos individuales. Los métodos para generar bibliotecas de fragmentos de anticuerpos en fagos se analizan en "Phage display: A Practical Approach" (Eds. Clackson y Lowman; Oxford University Press, Oxford, Reino Unido) y "Antibody Phage Display Methods and Protocols" (Eds. O'Brien y Aitken; Humana Press Inc, NJ 07512). Brevemente, se amplificaron regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpo basándose en el ARN de muestras de donantes. A continuación, se insertaron regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpo en vectores fagémidos para generar una biblioteca de fragmentos de anticuerpos fusionados a una proteína de la cubierta del fago. La biblioteca de anticuerpos usada en el presente documento fue una biblioteca de fagémidos sin tratar de alta diversidad que expresaba fragmentos de anticuerpos en formato Fab.
Se aislaron FAb anti-CD38 de la biblioteca de presentación en fagos durante dos "campañas" de selección (es decir, experimentos de presentación en fagos discretos con diferentes reactivos o condiciones de selección). El protocolo general siguió el método descrito por Markset al.(Marks, J.D. y Bradbury, A., 2004, Methods Mol Biol, 248, 161-76).
Cada campaña de presentación de fagos implicó tres rondas de selección. Para cada ronda, se bloquearon aproximadamente 2,5 x 1012 partículas de fagos mezclando 1:1 con tampón de bloqueo (leche desnatada al 4 % en PBS, pH 7,4) e incubación durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, la biblioteca de fagos bloqueada se agotó previamente para eliminar cualquier agente de unión del motivo de marcador proteico biotinilado usado en la selección mediante incubación durante 45 min con 50-200 pmoles de un antígeno irrelevante que contenía un motivo de marcador biotinilado idéntico. Los agentes de unión de marcador y estreptavidina se capturaron añadiendo un exceso (75-300 j l) de Dynabeads recubiertas con estreptavidina (Invitrogen), que se bloquearon como se describe para la biblioteca. Las perlas (incluyendo los agentes de unión de marcador y estreptavidina unidos a ellas) se inmovilizaron usando un imán y se desecharon.
La selección de la biblioteca se realizó mezclando la biblioteca bloqueada y previamente agotada con 50-200 pmoles del CD38 ED recombinante biotinilado en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y rotando durante 2 h a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 100 j l de Dynabeads acopladas a estreptavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la mezcla se incubó durante 15 minutos más, como se ha descrito previamente. Los fagos no específicamente unidos se eliminaron usando una serie de lavados. Cada lavado implicó retirar los complejos de perlas de la solución sobre la pared del tubo usando una gradilla magnética, aspirar el sobrenadante y, a continuación, suspender de nuevo las perlas en tampón de lavado nuevo. Esto se repitió varias veces con tampón de lavado PBS (PBS 1x con leche desnatada al 0,5 %) o tampón de lavado PBS-T (PBS 1x complementado con TWEEN-20 al 0,05 % [Sigma-Aldrich, St. Louis, MO] y leche desnatada al 0,5 %). Los fagos que permanecieron unidos tras el proceso de lavado se eluyeron de los complejos CD38 ED biotinilado-perlas mediante incubación con un exceso de veinte veces de CD38 ED no biotinilado durante 1 h a temperatura ambiente o con 0,5 ml de trietilamina (TEA) 100 mM (Merck Chemicals, Darmstadt) durante 20 min a temperatura ambiente. Los fagos de "salida" eluidos con TEA se neutralizaron mediante la adición de 0,25 ml de Tris-HCl 1 M a pH 7,4 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Al finalizar la primera y la segunda rondas de selección, los fagos resultantes se añadieron a un cultivo de 10 ml deE. coliTG1 en crecimiento exponencial (medio de cultivo 2x de levadura-triptona (2YT)) y se dejó que infectara las células durante una incubación de 30 minutos a 37 °C sin agitación, y a continuación con agitación a 250 rpm durante 30 minutos más. A continuación, los fagémidos que codifican la salida de la presentación en fagos se recuperaron como partículas de fagos siguiendo un protocolo estándar (Marks, J.D. & Bradbury, A., 2004, Methods Mol Biol, 248, 161-76). Al final de la tercera ronda de selección, las células TG1 se infectaron con el fago de salida y se sembraron en agar 2YT (complementado con glucosa al 2 % y 100 jg/m l de carbenicilina) a una dilución suficiente para producir colonias discretas deE. coli.Estas colonias se usaron para inocular 1 ml de cultivos líquidos para permitir la expresión de fragmentos FAb en experimentos de cribado.
Cribado de FAb basado en ELISA para determinar la unión a CD38
Cada colonia deE. colise usó para expresar un FAb que pudiera cribarse para determinar su actividad de unión al CD38 ED. Las colonias se inocularon en 1 ml de cultivos iniciadores (complementados con 100 jg/m l de carbenicilina y glucosa al 2 %) en placas de 96 pocillos profundos (Costar) y se incubaron durante una noche a 37 °C con agitación a 350 rpm (agitador Innova R44; órbita de 2,54 cm (1 pulgada)). Estos cultivos iniciadores se diluyeron 1:100 en 1 ml de cultivo de expresión (2YT complementado con 100 jg/m l de carbenicilina) y se cultivaron hasta una densidad óptica (600 nm) de 0,5-0,8. La expresión de FAb se indujo añadiendo isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM. Los cultivos se incubaron a 25 °C durante 16 h.
Las muestras de FAb se prepararon recogiendo células mediante centrifugación (2.000 g, 10 min) y realizando una extracción de lisozimas. El sedimento celular se suspendió de nuevo en 200 j l de tampón de lisis (160 jg/m l de lisozima, 10 jg/m l de ARNasa A, 5 jg/m l de ADNasa e inhibidores completos de proteasa (Roche, Nutley, NJ)) y se agitó a 400 rpm durante 30 minutos a 21 °C. Después de la adición de 100 j l más de tampón de lisis, las reacciones se incubaron durante 30 minutos más, como se ha descrito previamente. Los lisados clarificados se aislaron tras la centrifugación a 3.000 g durante 10 min y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.
Para el cribado mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de agentes de unión del CD38 ED humano procedentes de la bioselección de presentación en fagos, se capturó el dominio extracelular (ED) de CD38 humana (producido en células HEK 293-6E y biotinilado como se ha descrito anteriormente) en placas ELISA recubiertas con estreptavidina (Nunc) a 1 pg/ml. A continuación, las placas se lavaron y se añadieron muestras individuales de FAb (preparadas como se ha descrito anteriormente) a pocillos individuales de las placas ELISA. Se dejó que los FAb se unieran al CD38 ED capturado durante una hora a temperatura ambiente y, a continuación, se lavaron tres veces con PBS-T (PBS 1x complementado con Tween®20 al 0,1 %). Los FAb que se unieron al CD38 ED se detectaron mediante incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente con un anticuerpo conjugado anti-V5-HRP (Invitrogen, Carlsbad, CA) para detectar el marcador V5 fusionado al extremo C de la cadena pesada de FAb. Las placas se lavaron para eliminar el anticuerpo no unido y la señal de ensayo se desarrolló mediante incubación con 50 pl de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Sigma-Adrich, St. Louis, MO) e inactivación con 50 pl de HCl 1 M. Las señales de ensayo se leyeron a A450 nm usando un lector de microplacas (BMG Labtech). Los resultados se expresaron como el valor en bruto de A450 nm, donde cualquier señal 2 veces mayor que el fondo promedio del ensayo se definió como "positiva".
En ensayos posteriores, se evaluó la reactividad cruzada de FAb con el CD38 ED de macaco cangrejero mediante el recubrimiento del CD38 ED de macaco cangrejero biotinilado en placas ELISA recubiertas con estreptavidina, procediendo como se ha descrito anteriormente. Se aislaron y se secuenciaron plásmidos que codificaban FAb con reactividad cruzada con el CD38 ED humano y de macaco cangrejero. De aproximadamente 1000 FAb cribados para determinar su unión al CD38 ED humano y de macaco cangrejero, se identificaron seis FAb genéticamente únicos. La Tabla 21 resume los datos de secuencia de FAb obtenidos. Las regiones variables de algunos de estos anticuerpos se muestran en la figura 13.
Tabla 21
Todos los FAb se convirtieron al formato IgG1 mediante clonación en los vectores pTT5 (descritos anteriormente), se expresaron en células HEK293-6E y las IgG resultantes se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A, como se ha descrito anteriormente.
Evaluación de la unión de las IgG a la estirpe celular humana CD38 positiva RPMI-8226
Se ensayó la capacidad de los anticuerpos procedentes de fagos para unirse a la estirpe celular de mieloma humano CD38 positivo modelo RPMI-8226 (obtenida en Health Protection Agency Culture Collections, Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, Reino Unido) en ensayos basadosen citometría de flujo. Brevemente, se incubaron células RPMI-8226 viables (2 x 105, como se determinó por exclusión con azul tripán) con cada anticuerpo o con una preparación de anticuerpo de control de isotipo de IgG1 humana (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a diversas concentraciones en 100 pl de tampón FACS (PBS más suero fetal bovino al 1 %, FCS) en placas de 96 pocillos durante 20 minutos sobre hielo y en oscuridad. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS antes de la incubación durante 20 minutos en 100 pl de tampón FACS que contenía anti-IgG humana de cabra (específico para Fc, conjugado con isotiocianato de fluoresceína, FITC; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Después del lavado con tampón FACS, las células se suspendieron de nuevo en tampón FACS y se analizaron para determinar la unión de anticuerpos mediante citometría de flujo en un FACS Canto (BD Biosciences, San Diego, CA) usando EV, dispersión lateral y selección de FL-1. Los resultados se expresan como la intensidad de fluorescencia media (IFM) representada gráficamente frente a la concentración de proteína (figura 14).
Generación de anticuerpos anti-CD38 mediante inmunización genética
Se generaron anticuerpos monoclonales contra el CD38 ED humano mediante inmunización genética con la correspondiente inmunización proteica convencional de ratas. Para la inmunización genética, la secuencia de ADN del CD38 ED humano se proporciona en la SEQ ID NO:129. La secuencia proteica traducida conceptualmente correspondiente se proporciona en la SEQ ID NO:130. La secuencia de ADN de la SEQ ID NO:129 se clonó en un plásmido para la inmunización genética mediante tecnología de enzimas de restricción. La expresión del plásmido resultante permitió la secreción de CD38 ED soluble marcado con un epítopo c-myc en el extremo N o C. El epítopo c-myc se utilizó para confirmar la expresión de CD38 ED.
A continuación, las ratas se inmunizaron seis veces con el plásmido usando una pistola génica Helios (Bio-Rad, Alemania), de acuerdo con un procedimiento publicado (Kilpatricket al.,Hybridoma 17: 569-576, 1998). Una semana después de la última aplicación del plásmido de inmunización, cada rata recibió una dosis de refuerzo mediante inyección intradérmica de CD38 ED humano recombinante sin marcar. Para este fin, se produjo CD38 ED humano sin marcar mediante la eliminación de los marcadores proteicos de la SEQ ID NO: 127 mediante escisión con trombina, seguida de purificación en una columna de exclusión por tamaño.
Cuatro días después, las ratas se sacrificaron y sus linfocitos se fusionaron con células de mieloma usando polietilenglicol (HybriMax™; Sigma-Aldrich, Alemania), se sembraron a razón de 100.000 células por pocillo en placas de microvaloración de 96 pocillos y se cultivaron en medio DMEM complementado con suero fetal bovino al 10 % y aditivo HAT para la selección de hibridomas (Kilpatricket al.,1998, anteriormente).
Cribado de sobrenadantes de hibridoma para determinar la reactividad cruzada de CD-38 humano y de macaco cangrejero
Muestras duplicadas de 100 pl de cada sobrenadante de hibridoma recubrieron pocillos separados de una placa ELISA Maxisorp (Nunc Plasticware, Thermo Scientific, Rochester, NY 14625, EE. UU.) mediante incubación a temperatura ambiente durante una hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS-T 1x y posteriormente se bloquearon mediante la adición de BSA al 2 %/PBS 1x. Después de una incubación de 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron como se ha descrito previamente. A un pocillo de cada pocillo duplicado de anticuerpo de rata se le añadieron 0,1 pg de CD38 humano biotinilado en un volumen final de 100 pl de PBS 1x. A un pocillo de cada pocillo duplicado de anticuerpo de rata se le añadieron 0,1 pg de CD38 ED de macaco cangrejero biotinilado en un volumen final de 100 pl de PBS 1x. Los pocillos de la placa se lavaron como se ha descrito previamente antes de la detección del CD38 ED biotinilado unido usando un conjugado de estreptavidina-HRP (BD Biosciences, San Diego, CA). Las placas se lavaron como anteriormente para eliminar el conjugado de estreptavidina-HRP no unido y la señal de ensayo se desarrolló mediante incubación con 50 pl de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Sigma-Aldrich) e inactivación con 50 pl de HCl 1 M. Las señales de ensayo se leyeron a A450 nm usando un lector de microplacas (BMG Labtech, Cary, NC). De los 15 sobrenadantes de hibridoma ensayados, los quince CD38 ED humanos unidos y los siete CD38 ED de macaco cangrejero unidos (Tabla 22), como se determinó mediante ELISA. Los anticuerpos con reactividad cruzada se denominan R5D1, R7F11, R5E8, R10A2, R10B10, R3A6 y R7H11.
Unión por citometría de flujo de anticuerpos de rata a la estirpe celular humana CD38 positiva RPMI-8226
Se incubaron células RPMI-8226 viables (2 x 105, como se determinó por exclusión con azul tripán) con 100 pl de sobrenadante de hibridoma de rata durante 20 minutos sobre hielo en la oscuridad. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS (PBS 1x más FCS al 1 %) antes de la incubación durante 20 minutos en 100 pl de tampón FACS que contenía conjugado anti-IgG de rata-FITC (Sigma-Aldrich). Después de lavar las células en tampón FACS, se suspendieron de nuevo en tampón FACS y se analizaron para determinar la unión de anticuerpos mediante citometría de flujo en un FACS Canto (BD Biosciences, San Diego, CA) usando EV, dispersión lateral y selección de FL-1. Los resultados se expresaron como intensidad de fluorescencia media (IFM). De los 15 anticuerpos de rata que mostraron una unión positiva al CD38 ED humano mediante ELISA, cinco mostraron una unión débil o insignificante al CD38 expresado en la estirpe celular de mieloma humano RPMI-8226 mediante FACS (Tabla 22).
Tabla 22
Caracterización molecular de anticuerpos de rata
Se seleccionaron seis hibridomas de anticuerpos de rata - R5D1, R7F11, R5E8, R10A2, R10B10 y R7H11 - para la caracterización molecular. La extracción de ARN de las células de hibridoma sedimentadas de cada clon se realizó usando el reactivo TRI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las regiones variables de cada anticuerpo se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE), de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit SMART RACE de Clontech [Mountain View, CA]; kit RLM-RACE de Ambion Life Technologies [Foster City, CA]). Se diseñaron cebadores de PCR inversa específicos de genes para amplificar los dominios variables de cadena pesada de rata mediante 5'-RACE, con el fin de que se hibridaran con las secuencias de región constante de cadena pesada de rata disponibles. De manera similar, se diseñaron cebadores de PCR inversa específicos de genes para amplificar las cadenas ligeras de rata, con el fin de que se hibridaran con las secuencias de región constante de cadena kappa de rata, mientras que otros cebadores se diseñaron para que se hibridaran con las secuencias de región constante de cadena lambda de rata.
La PCR 5'-RACE se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Life Technologies; Clontech) usando la polimerasa PfuUltraII (Agilent). Tras la PCR 5'-RACE, los productos se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se extrajeron de los geles bandas de aproximadamente el tamaño previsto, según la ubicación del cebador inverso en la región constante. El ADN se purificó a partir de cortes de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel Qiaquick Spin (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN insertado se clonó y se propagó enE. coliusando el kit de clonación de PCR StrataClone Blunt (Agilent, Santa Clara, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cultivaron colonias individuales de las transformaciones y se preparó ADN plasmídico usando un kit de minipreparación de plásmidos GenElute™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, m O). Se secuenciaron las inserciones de ADN y se identificaron las regiones variables de anticuerpo en las secuencias proteicas traducidas conceptualmente.
Se construyeron vectores usando las secuencias de región variable de anticuerpo de rata injertadas en secuencias constantes de IgG1 humana para la región variable de cadena pesada y, las cadenas principales kappa o lambda humanas (manteniendo el mismo isotipo de cadena ligera que en los anticuerpos de rata). Las secuencias de región variable resultantes de cada clon se enumeran en la Tabla 23. La coexpresión posterior de las cadenas pesada y ligera correspondientes en células HEK293-6E, en el contexto de los vectores pTT5, vino seguida de la purificación con proteína A de las IgG resultantes, como se ha descrito anteriormente.
Tabla 23
Afinidad de los anticuerpos anti-CD38 por CD38 humano y de macaco cangrejero
Se midieron las afinidades de unión de una selección de anticuerpos producidos contra el CD38 humano y de macaco cangrejero. Brevemente, usando un Biacore T200, se inmovilizó la proteína A en la celda de flujo (FC) 1 (FC1) y FC2 (o, como alternativa, FC3 y FC4) de un chip sensor CM5 de calidad de investigación usando acoplamiento de amina, dando aproximadamente 2000 UR. Se usó FC1 como blanco durante los experimentos. Los experimentos se realizaron en tampón HBS-P (HEPES 0,01 M a pH 7,4, NaCl 0,15 M, tensioactivo P20 al 0,005 % v/v). A un caudal de 20 pl/min, se pasaron 20 pl de 5 pg/ml de anticuerpo sobre FC2. CD38 ED humano o, por separado, CD38 ED de macaco cangrejero se pasó sobre la superficie de FC1 y FC2 a concentraciones que variaban de 25 nM a 200 nM. La regeneración de la superficie se realizó con glicina 10 mM, pH 1,0. Los datos del sensorgrama de FC1 se restaron del FCS y las curvas se ajustaron mediante una ecuación de Langmuir 1:1 para generar los valores de kd, ka y Kd. Estos datos muestran que la reactividad cruzada para el CD38 humano y de macaco cangrejero se mantiene tras la conversión de los Fab procedentes de fago humano en IgG humanas y de los anticuerpos de rata en IgG quiméricas de rata-humanas (Tabla 24).
Tabla 24
(continuación
g g j ,
Construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFN atenuado
Para determinar si el sorprendente resultado obtenido con un anticuerpo anti-CD20 fusionado a un IFNa atenuado podía replicarse con otros anticuerpos, en particular con anticuerpos dirigidos a un antígeno no relacionado con CD20, se crearon construcciones de proteína de fusión que comprendían el anticuerpo IgG1:kappa anti-CD38 completamente humano G005 (compuesto por las SEQ ID NOS: 135 (cadena pesada) y 134 (cadena ligera)) e IFNa (S<e>Q ID NO:3), con o sin diversas mutaciones atenuantes. La figura 15 muestra los resultados del "ensayo inespecífico" (como se ha descrito anteriormente) usando el kit iLite. Debido a que se observó una débil señal de CD38 en la estirpe celular iLite mediante citometría de flujo (no se muestra), el antígeno CD38 se bloqueó mediante la adición de un exceso de anticuerpo anti-CD38 desproteinizado (por ejemplo, sin IFN ni variantes de IFN fusionadas a éste) en todos los experimentos con iLite que usaron construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFN; en cada caso, la concentración de anticuerpo CD38 desproteinizado de bloqueo fue de 0,5 mg/ml. Además, en cada caso, se usó el mismo clon de anticuerpo ensayado como construcción de proteína de fusión de IFN o variante de IFN para bloquear cualquier interacción con CD38.
La figura 15 muestra la actividad inespecífica del IFNa2b de tipo natural libre (IFNa) (SEQ ID NO:3, que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones) frente al IFNa2b de tipo natural fusionado al extremo C del anticuerpo CD38 G005 (que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones; De Weerset al.(Patente de EE. UU. 7829673)). Esta última construcción de proteína de fusión (G005-HC-L0-IFNa IgG4) era del isotipo IgG4:kappa y no presentaba un enlazador intermedio entre el extremo C de la cadena pesada y el primer residuo del IFNa, y se describe mediante las SEQ ID NOS:150 (cadena pesada) y 134 (cadena ligera). Como se ilustra en la figura 15, la construcción de proteína de fusión anticuerpo anti CD38-IFNa2b no atenuado era 27 veces menos potente (19,5/0,726 = 27) que el IFNa2p libre en el ensayo inespecífico (por ejemplo, en ausencia de direccionamiento a CD38). La figura 16 muestra una comparación entre las mismas dos construcciones en el "ensayo específico (ARP1)", en el que se permitió que el anticuerpo anti-CD38 se uniera a CD38, que se expresó en altos niveles en la estirpe celular a RP-1. La construcción de proteína de fusión G005-HC-L0-IFNa IgG4 era 3,6 veces (14,7/4,08 = 3,6) más potente que el IFNa2b libre, presumiblemente debido al suministro dirigido del IFN a las células de mieloma CD38+. Por lo tanto, la construcción de proteína de fusión G005-HC-L0-IFNa IgG4 tiene un índice de especificidad antigénica (ASI) de 97 (27 x 3,6 = 97; Tabla 25).
T l 2 - L m l r r n r ♦ n nr n f r l l n l r ivin i i n
(continuación
(continuación
g
Para determinar si el ASI podía aumentar, como se observó en las construcciones de proteína de fusión anti-CD20-IFNa, se construyeron varias variantes atenuando la porción IFN de la construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNa mediante mutación. Se realizaron numerosas mutaciones atenuantes en el contexto de G005 u otros anticuerpos monoclonales CD38. Además, se crearon construcciones de diferentes isotipos de IgG (IgG1 e IgG4) y longitudes de enlazador (L0, sin enlazador; L6, enlazador de 6 aminoácidos (SGGGGS, SEQ ID NO:132)). Se realizaron el ensayo inespecífico y dos tipos de ensayos específicos (usando Daudi y ARP-1), ambos descritos en detalle anteriormente, y los resultados se muestran en las figuras 17-38 y se representan en las Tablas 25-33. El análisis a continuación resume estos resultados con referencias a los datos de estas tablas (todos derivados de las figuras 17-38).
La Tabla 26 caracteriza el anticuerpo CD38 G005, fusionado en diversas configuraciones a través del extremo C de la cadena pesada a IFNa con la mutación atenuante R144A. Los ejemplos en esta tabla son de isotipo IgG1 e IgG4 y no presentan un enlazador entre la cadena pesada del anticuerpo y el IFN, L0, o presentan un enlazador de 6 aminoácidos intermedio, L6 (compuesto por las SEQ ID NOS:138,140,152,146 (cadena pesada), cada una combinada con 134 (cadena ligera)). En todos los casos, las construcciones de proteína de fusión tenían una potencia drásticamente reducida en células iLite negativas para antígeno (una reducción de 8.300 a 100.000 veces en comparación con el IFNa libre), pero mantuvieron sustancialmente la potencia exhibida por el IFNa libre en células CD38 positivas (Daudi). La construcción G005-HC-L0-IFNa (R144A) IgG4 (compuesta por las SEQ ID NOS:152 (cadena pesada) y 134 (cadena ligera)), por ejemplo, tiene una potencia 105 veces menor que el IFNa libre de tipo natural en las células negativas para antígeno pero su potencia se reduce solo 3,5 veces (2,7/0,77 = 3,5) frente al IFNa libre de tipo natural en las células positivas para antígeno (Tabla 26). Esto proporciona un índice de especificidad antigénica (ASI) de 29.000 para esta construcción de proteína de fusión.
T l 2 - L m l r r n r ♦ n nr n f r l l n l r ivin i i n
g
La Tabla 27 muestra ejemplos que usan otra mutación atenuante de IFNa, A145G (que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones), como una construcción con el mismo anticuerpo G005 en los isotipos IgG1 o IgG4, sin enlazador o con el enlazador L6 (compuesto por las SEQ ID NOS:142,144,148 (cadena pesada), cada una combinada con la SEQ ID 134 (cadena ligera)). La construcción G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG4 (compuesta por las SEQ ID NOS:148 (cadena pesada) y 134 (cadena ligera)), por ejemplo, mostró un ASI de 20.000.
Tabla 27 - Estos ejemplos se encuentran fuera l l n l r ivin i i n
La Tabla 28 muestra ejemplos en los que el IFNa mutado se une a la cadena ligera en lugar de a la cadena pesada, sin enlazador intermedio o con el enlazador L6 (compuesto por las SEQ ID NOS:210 o 208 (cadena ligera), respectivamente, cada una combinada con la SEQ ID NO:135 (cadena pesada)). En ambos casos, las construcciones de proteína de fusión demostraron un ASI alto de 5.900 y 7.200, respectivamente.
T l 2 - E m l n nr n f r l l n l r ivin i i n
Las Tablas 29 y 30 muestran el ASI para las mismas construcciones de proteína de fusión, pero usan una estirpe celular alternativa (ARP-1, un mieloma) para determinar la actividad en células CD38+. Usando este método, los ASI para estas construcciones de proteína de fusión variaron de 1.200-55.000.
T l 2 - L m l r r n r ♦ n nr n f r l l n l r ivin i i n
g (continuación
g
Tabla 30 - Estos ejemplos se encuentran fuera l l n l r ivin i i n
En la Tabla 25 se exponen numerosos ejemplos diferentes de versiones mutadas de IFNa, en el contexto de la construcción de proteína de fusión G005-HC-L0-IFNa IgG4. La mayoría de estos mutantes (R144 mutado a A, S, E, G, H, N, Q, T, Y, I, L o V (compuestos por las SEQ ID NOS:152,172,156,158,160,168,170,174,178,162,166,176 (cadena pesada), respectivamente, cada una combinada con la SEQ ID NO:134 (cadena ligera); R144 mutado a E, G, H, N, Q y V se encuentran fuera del alcance de las reivindicaciones) y A145 mutado a G, D, H, I, K, L, N, Q, R o Y (SEQ ID NOS:184,180,186,188,190,192,194,196,198,206 (cadena pesada), respectivamente, cada una combinada con la SEQ ID NO:134 (cadena ligera); A145 mutado a G, I, L, N, Q y R se encuentran fuera del alcance de las reivindicaciones) mostró una atenuación significativa de la actividad de IFNa en comparación con el IFNa libre de tipo natural. En este contexto, los mutantes A145V y A145S (ambos de los cuales se encuentran fuera del alcance de las reivindicaciones) no mostraron una atenuación apreciable. Cualquiera de estas versiones atenuadas y con mutaciones puntuales de IFNa podría usarse en el contexto de la presente invención o divulgación como construcciones de proteínas de fusión de anticuerpos. Determinadas variantes de IFN pueden ser preferidas debido a que muestran valores de ASI más altos. Otras consideraciones, tales como nivel de expresión, inmunogenicidad, características biofísicas, etc., también pueden tenerse en cuenta al evaluar las construcciones para una utilidad óptima. De las numerosas variantes de IFNa descritas en el presente documento, las que se muestra en este caso que producen un alto ASI el contexto de una construcción de proteína fusión de anticuerpo incluyen R144A, R144S, Rl44T, R144Y, R144I, R144L, A145G (que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones), A145D, A145H, A145Y (Tabla 25), R33A+YNS (como se ilustra en la construcción que comprende las SEQ ID NOS:286 (cadena pesada) y 276 (cadena ligera)), R33A (como se ilustra en la construcción que comprende las SEQ ID NOS:436 (cadena pesada) y 276 (cadena ligera)) y R144A+YNS (tal como se ilustra en la construcción que comprende las SEQ ID NOS:288 (cadena pesada) y 276 (cadena ligera)).
La mutación de A145D en la construcción de las SEQ ID NOS:180 (cadena pesada) y 134 (cadena ligera) en comparación con la mutación A145E (que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones) en la construcción de la SEQ ID NO:182 (cadena pesada) y 134 (cadena ligera) produjo resultados inesperados. Aunque ambas construcciones tienen secuencias de aminoácidos similares, difiriendo solo por un único grupo metileno, mostraron efectos drásticamente diferentes sobre la actividad no dirigida del IFNa. La mutación A145E tuvo un impacto mínimo en la actividad del IFNa, sin embargo, la mutación A145D redujo drásticamente la actividad (20.000 veces) y dio como resultado una construcción con un alto ASI (9.840).
En las Tablas 31-33 se muestran otros ejemplos de construcciones de proteína de fusión anticuerpo anti-CD38-IFNa atenuado. Además de las construcciones de anticuerpo G005, estas tablas muestran la actividad específica, la actividad inespecífica y el ASI para las construcciones de proteína de fusión anticuerpo anti-CD38-IFNa atenuado basadas en determinados anticuerpos novedosos. Las construcciones de proteínas de fusión de estos anticuerpos con las mutaciones A145D o R144A de IFNa incluyen lo siguiente:
X910/12-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 compuesta por las SEQ ID NOS:248 (cadena pesada) y la SEQ ID NO:242 (cadena ligera)
X910/12-HC-L0 IFNa (R144A) IgG4 compuesta por las SEQ ID NOS:246 (cadena pesada) y la SEQ ID NO:242 (cadena ligera);
X913/15-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 compuesta por las SEQ ID NOS:256 (cadena pesada) y la SEQ ID NO:250 (cadena ligera));
X913/15-HC-L0 IFNa (R144A) IgG4 compuesta por las SEQ ID NOS: 254 (cadena pesada) y la SEQ ID NO:250 (cadena ligera))
X355/02-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 compuesta por las SEQ ID NOS:232 (cadena pesada) y la SEQ ID NO:226 (cadena ligera);
X355/02-HC-L0 IFNa (R144A) IgG4 puesta por las SEQ ID NOS:230 y la SEQ ID NO:226 (cadena ligera);
X355/07-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 compuesta por las SEQ ID NOS:240 (cadena pesada) y la SEQ ID NO:234 (cadena ligera);
X355/07-HC-L0 IFNa (R144A) IgG4 puesta por las SEQ ID NOS:238 y la SEQ ID NO:234 (cadena ligera);
R5D1-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 compuesta por las SEQ ID NOS:262 (cadena pesada) y 258 (cadena ligera); R5E8-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 compuesta por las SEQ ID NOS:268 (cadena pesada) y 264 (cadena ligera); y R10A2-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 compuesta por las SEQ ID NOS:274 (cadena pesada) y 270 (cadena ligera). Todas estas construcciones de proteína de fusión mostraron altos ASI, que variaron de 3.820 (X910/12-HC-L0-IFNa (R144A) IgG4) a 166.000 (X355/02-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4).
T l 1 - L m l r r n r ♦ n nr n f r l l n l r ivin i i n
Tabla 32 - Los ejemplos representados por ♦ se encuentran fuera del alcance de las reivindicaciones
(continuación
g
Tabla 33 - Los ejemplos representados por ♦ se encuenr n f r l l n l r ivin i i n
Los ejemplos anteriores demuestran que las formas mutadas y atenuadas de IFNa, unidas a anticuerpos dirigidos contra CD20 (SEQ ID NO:430) o CD38 (SEQ ID NO:131), muestran una potencia considerablemente mayor en la señalización de IFN en células diana positivas para antígeno que en células inespecíficas negativas para antígeno. Los resultados a continuación proporcionan ejemplos adicionales usando anticuerpos que dirigen el IFNa atenuado a otros dos antígenos: CD138 y MHC de clase I.
CD138 (SEQ ID NO:432), también llamado sindecano-1, es un proteoglicano de sulfato de heparina que se cree que funciona como una molécula de adhesión. Se expresa en la mayoría de las células de mieloma múltiple (Dhodapkar, Blood; 91: 2679, 1998). Se generaron construcciones de proteína de fusión que consistían en IFNa mutado y atenuado y el anticuerpo dirigido a CD138 nBT062 (Ikeda, Clin Can Res., 15:4028, 2009; USPTO N.° 20090175863, compuesto por las SEQ ID NOS:330 (cadena pesada) y 326 (cadena ligera)). Como se muestra en la figura 39, esta construcción de proteína de fusión, como la construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNa atenuado, mostró una potencia antiproliferativa mucho mayor en células de mieloma múltiple (ARP-1, ensayo específico) que una proteína de fusión de isotipo no dirigida (basada en el anticuerpo 2D12). La figura 39 muestra que una concentración de 28 pM (la 4.a concentración más alta ensayada) de nBT062-HC-L0-IFNa (A145D) muestra una mayor actividad antiproliferativa en la estirpe celular de mieloma ARP-1 que 6 nM (la concentración más alta ensayada) de la proteína isotipo HC-L0-IFNa (A145D).
Otro antígeno que se ha descrito como una posible diana para la terapia con anticuerpos para tratar el cáncer es el MHC de clase I (véase, por ejemplo, Stein, Leuk. Lymphhoma 52(2):273-84, 2011). Para determinar si era posible aplicar la presente invención en relación con esta diana, se obtuvo el anticuerpo W6/32 (Barnstableet al.(1978), Cell 14:9-20) en la ATCC (HB95). Este anticuerpo reacciona con determinantes monomórficos en las moléculas HLA A, B y C humanas. Las regiones variables de anticuerpo se clonaron y se secuenciaron usando el kit de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech, Mountain View, CA) y conjuntos de cebadores de Ig de ratón (Novagen/EMD Chemicals, San Diego, CA). Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera se muestran como las SEQ ID NOS:411 y 410, respectivamente. Se expresó la versión quimérica de HB95, con las regiones variables murinas y las regiones constantes kappa de IgG4 humana, fusionada a IFNa con la mutación A145D (HB95-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4, compuesta por las SEQ ID NOS:316 (cadena pesada) y 312 (cadena ligera)), y su actividad se comparó con la de un anticuerpo de control de isotipo fusionado de la misma manera al mismo mutante de IFNa (Isotipo-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4, donde las regiones variables de isotipo se obtuvieron del anticuerpo 2D12). El "ensayo específico (ARP-1)" se realizó como se ha descrito anteriormente para los anticuerpos dirigidos a CD38 (ARP-1 es positivo para el MHC de clase I). Los resultados se muestran en la figura 40a. El IFNa atenuado dirigido al MHC de clase I es órdenes de magnitud más potente que la construcción de proteína de fusión control de isotipo-IFNa atenuado en las mismas células, alcanzando una potencia aproximadamente 9 veces (139/16 = 8,7) del IFNa de tipo natural. Mientras que HB95-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4 muestra una actividad significativa por debajo de 100 pM, la isotipo-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4 no muestra actividad significativa ni siquiera a 6 nM.
La figura 40b demuestra que los fragmentos de anticuerpos pueden sustituir a los anticuerpos de longitud completa y proporcionar propiedades similares, concretamente altos ASI. Esta figura muestra los efectos de diversas construcciones de proteína de fusión Fab-IFNa atenuado en la proliferación de células ARP-1. Dos construcciones no dirigidas a ARP-1, "Palivizumab-HC-L6-IFNa (A145D) Fab" (compuesta por las SEQ ID NOS:298 (cadena pesada) y 290 (cadena ligera)) y "2D12-HC-L6-IFNa (A145D) Fab" (compuesta por las SEQ ID NOS:356 (cadena pesada) y 344 (cadena ligera)), muestran una potencia muy baja en esta estirpe celular (CE50 de 2.410-17.000). Por el contrario, cuando la porción Fab de la construcción de proteína de fusión se dirige a un antígeno de superficie celular, en este caso al MHC de clase I, como en el caso de la construcción de proteína de fusión "HB95-HC-L6-IFNa (A145D) Fab" (compuesta por las SEQ ID NOS:320 (cadena pesada) y 312 (cadena ligera)), la potencia es incluso mayor que la del IFNa libre de tipo natural. La construcción de atenuada dirigida al antígeno es 2.760-19.450 veces más potente que las construcciones atenuadas no dirigidas.
Actividad antivírica del IFNa atenuado dirigido
La actividad antivírica del IFNa es bien conocida y el IFNa recombinante es un tratamiento aprobado por la FDA para las infecciones por el virus de la hepatitis C. Se compara el efecto de una construcción de protevna de fusión anticuerpo-IFNa atenuado, dirigida a la superficie de la célula hospedadora frente a no dirigida, sobre la actividad citopática del virus de la EMC en células A549, que son positivas para el MHC de clase I.
Métodos:
La actividad de IFN se midió mediante el ensayo de inhibición del efecto citopático (CPE), como se describe por Rubinstein (J. Virol. 37, 755-8, 1981). Brevemente, se incubaron 104 células de adenocarcinoma humano A549 (ATCC, Manassas, Kansas) por pocillo con la muestra de prueba o IFN (IFN-a2A humano) durante una noche. A continuación, las células se expusieron al virus de la EMC durante 48-56 horas, seguido de una tinción con cristal violeta. Se realizó una determinación visual de CPE, seguida de la solubilización del cristal violeta y la medición de la absorbancia a 570 nm. Se realizó un análisis de regresión no lineal usando un ajuste sigmoideo de 4 parámetros con pendiente variable (GraphPad Prism). Una unidad de actividad de IFNa se define como la cantidad de interferón necesaria para reducir el efecto citopático en un 50 %. Las unidades se determinan con respecto al estándar de referencia internacional para el lFNa2 humano, proporcionado por los National Institutes of Health (véase Pestka, S. "Interferon Standards and General Abbreviations", en Methods in Enzymology (S. Pestka, ed.), Academic Press, Nueva York, vol.
119, págs. 14-23, 1986). Las muestras ensayas en este ensayo fueron IFNa (Intron A, triángulos invertidos), IFNa atenuado dirigido contra el MHC de clase I, denominado HB95-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4 (cuadrados de color negro), y control de isotipo (2D12)-IFNa atenuado (isotipo-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4; triángulos). Los datos se representan gráficamente como viabilidad frente a equivalentes molares de IFNa.
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 41. En este ensayo, el IFNa protege a las células A549 de la muerte celular citopática (CPE) inducida por virus, como se esperaba, mostrando una CE50 de 0,18 pM. La introducción de la mutación A145D en el IFNa (y su unión a un anticuerpo que no se une a las células A549) reduce su potencia antivírica en 108.000 veces (19.461/0,18 = 108.167). Por el contrario, al unir el mismo IFN mutante a un anticuerpo dirigido a A549 (HB95), la potencia aumenta en ~17.000 veces (19.461/1,15 = 16.923). Esto corresponde a un<a>S<i>de 16.900 (19.461/1,15 = 16.922).
IFNp dirigido y atenuado: Este ejemplo se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones
También se ha demostrado en numerosas publicaciones (véase anteriormente) que el IFNp tiene actividad antiproliferativa en diversos tipos de células cancerosas. Por lo tanto, se creó una construcción de proteína de fusión entre un anticuerpo anti-CD38 (G005) e IFNp (SEQ ID NO:91), G005-HC-L0-IFNp IgG4 (compuesta por las SEQ ID NOS:212 (cadena pesada) y 134 (cadena ligera)), así como una construcción idéntica, pero con una única mutación puntual (R35A), conocida por reducir la potencia del IFNp (Runkelet al.J. Biol. Chem. 273:8003-8 (1998), compuesta por las SEQ ID NOS:214 (cadena pesada) y 134 (cadena ligera)). En ambas construcciones, la cisteína no emparejada en la posición 17 del IFNp se mutó a una serina para mejorar el rendimiento de expresión y la homogeneidad del producto. La figura 42 muestra la actividad de estas tres proteínas en condiciones donde no hay direccionamiento asistido por anticuerpo ("ensayo inespecífico" usando el kit iLite). En este ensayo, la unión de una IgG al extremo N de IFNp atenúa su potencia 72 veces (57,6/0,799 = 72). Al realizar la mutación R35A en esta construcción de proteína de fusión, su potencia se reduce aún más en 280 veces (16.100/57,6 = 280), de modo que es 20.150 veces (16.100/0,799 = 20.150) menos potente que el IFNp libre de tipo natural. En marcado contraste, la figura 43 muestra que la potencia de estas tres proteínas en condiciones en las que el anticuerpo CD38 puede dirigir el IFNp a las células es bastante similar. En este ensayo, la construcción de proteína de fusión anticuerpo-IFNp atenuado (G005-HC-L0-IFNp (R35A) IgG4) es solo 1,4 veces (46,9/32,7 = 1,4) menos potente que la construcción de proteína de fusión anticuerpo-IFNp no atenuado y solo 4,5 veces (46,9/10,5 = 4,5) menos potente que el IFNp libre de tipo natural. Estos datos se resumen en la Tabla 34. Esto demuestra que el sorprendente hallazgo de que las mutaciones atenuantes en un interferón que forma parte de una construcción de proteína de fusión anticuerpo-IFN puede afectar desproporcionadamente a las células no dirigidas frente a las dirigidas, como se observó para el IFNa (Tabla 20), también es válido para el IFNp. En el presente ejemplo de las construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNp, la mutación atenuante redujo la potencia solo 1,4 veces en condiciones en las que el anticuerpo podía dirigir el IFN a las células diana, frente a 280 veces en las células en las que la construcción de proteína de fusión no podía dirigirse al antígeno de superficie celular. Como resultado, la construcción de proteína de fusión anticuerpo-IFNp atenuado en el presente ejemplo muestra un ASI de 4630 (Tabla 34). Se encontró que la mutación R147A en IFNp, como alternativa a la mutación R35A, también produce construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNp con un ASI significativamente mayor que el del IFNp libre (datos no mostrados). Los ejemplos a continuación mostrarán que esta "atenuación selectiva" también se puede observar con ligandos estructuralmente no relacionados con IFNa y p, concretamente con IL-4 e IL-6, que se encuentran fuera del alcance de las reivindicaciones.
Tabla 34
Interleucina-4 (IL-4) - Este ejemplo se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones
La IL-4 es una citocina de haz helicoidal con múltiples actividades fisiológicas, incluyendo la capacidad de sesgar el desarrollo de linfocitos T auxiliares hacia Th2 y alejarlos de Th1. Dado que los linfocitos Th1 desempeñan un papel patológico en determinados contextos autoinmunitarios, podría ser terapéuticamente ventajoso usar la IL-4 para influir en el desarrollo de linfocitos T auxiliares en detrimento de Th1, es decir, para crear una "desviación de Th1". Para evitar los efectos secundarios relacionados con la actividad de la IL-4 en otros tipos de células, sería ventajoso atenuar la actividad de IL-4 mediante mutación y a continuación unirla a un anticuerpo que la dirija hacia linfocitos T auxiliares activados (preferentemente, recién activados). El anticuerpo elegido para este propósito fue J110, un clon murino anti-PD-1 humano descrito por Iwaiet al.(Immunol Lett. 83:215-20, 2002). PD-1 (SEQ ID NO:431) se expresa en linfocitos Th0 recientemente activados.
El anticuerpo J110 (regiones variables murinas y regiones constantes IgG1:kappa humana; las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de J110 se muestran como SEQ ID NOS:409 y 408, respectivamente) se fusionó con IL-4 humana (SEQ ID NO:119), estando esta última unida al extremo C de las cadenas pesadas con un enlazador de seis aminoácidos intermedio, L6 (SGGGGS, SEQ ID NO:132). Además de esta proteína 1110-HC-L6-IL4 IgG1 (compuesta por las SEQ ID NOS:304 (cadena pesada) y 300 (cadena ligera)), se creó una variante de esta con una sola sustitución en el componente IL-4, J110-HC-L6-IL-4 (R88Q) IgG1 (compuesta por las SEQ ID NOS:306 (cadena pesada) y 300 (cadena ligera)). Se ha indicado que la mutación R88Q en IL-4 reduce su potenciain vitro(Kruse, EMBO Journal vol. 12, n.° 13, págs. 5121-5129, 1993).
Métodos:
El "ensayo inespecífico (HB-IL4)" se realizó, en gran medida, según lo descrito por el fabricante de la estirpe celular IL4/IL13 HEK-Blue. Las células IL-4/IL-13 HEK-Blue™ están diseñadas específicamente para monitorizar la activación de la vía STAT6, que se induce por IL-4. Las células se generaron introduciendo el gen STAT6 humano en células HEK293 para obtener una vía de señalización STAT6 completamente activa. Las células IL-4/IL-13 HEK-Blue™ expresan de forma estable un gen indicador, fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP), bajo el control del promotor mínimo de IFNp fusionado a cuatro sitios de unión de STAT6. La activación de la vía STAT6 en las células IL-4/IL-13 HEK-Blue™ induce la expresión del gen indicador SEAP. A continuación, SEAP se secreta al medio y se puede cuantificar usando el reactivo colorimétrico QUANTI-Blue™. Brevemente, las células IL4/IL13 HEK-Blue (Invivogen, San Diego, CA, N.° de cat. hkb-stat6) se descongelaron y se cultivaron en medio DMEM (Mediatech, Manassas VA, N.° de cat. 10-013-CV) FBS al 10 % (Hyclone, Logan UT, N.° de cat. SH30070.03) que se había inactivado por calor (HI FBS). Después de un pase, se añadieron al medio de cultivo 10 pg/ml de blasticidina (Invivogen, N.° de cat. ant-bl-1) y 100 microgramos/ml de zeocina (Invivogen, N.° de cat. ant-zn-1). Después de un pase más, se dejó que las células alcanzaran una confluencia del 60-80 % y a continuación se recogieron con Cell Stripper (Mediatech, N.° de cat. 25-056-Cl). Las células se lavaron dos veces en DMEM HI FBS y se contaron. Las células se ajustaron a 2,8 x 105 células viables/ml en DMEM HI FBS y se dividieron en alícuotas 180 pl por pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano (en lo sucesivo, la "placa experimental"). A continuación, se añadieron por pocillo 20 pl de IL-4 o construcción de proteína de fusión, diluidos en DMEM HI FBS. La placa se incubó a 37 °C con CO2 al 5 % durante 16-24 horas. Se preparó QUANTI-Blue (Invivogen, N.° de cat. rep-qb1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. QUANTI-Blue (160 pl) se dividió en alícuotas en cada pocillo de una planta de fondo plano (en lo sucesivo, la "placa de ensayo"). A continuación, se transfirieron 40 pl de sobrenadante por pocillo de la placa experimental a la placa de ensayo. A continuación, la placa de ensayo se incubó a 37 °C durante 1-3 horas. La absorbancia de la placa de ensayo a 630 nm se leyó en un contador Victor 3V Multilabel modelo 1420 41 de Perkin-Elmer. Los datos se analizaron usando Graph Pad Prism.
El "ensayo específico (desviación de Th1)" se diseñó para monitorizar el porcentaje de linfocitos T CD4+ que eran de fenotipo Th1, como se define por su expresión de IFN-y. De este modo, la desviación de Th1 se cuantifica mediante una disminución de los linfocitos T CD4 IFN-y positivos. El ensayo se realizó de la siguiente manera: Se prepararon Dynabeads "cargadas" (perlas de epoxi M450, Invitrogen Dynal, Oslo, Noruega, N.° de cat. 140.11), como se describe por el fabricante, con 1,0 pg/107 perlas de anticuerpo anti-CD3 épsilon humano (R&D Systems, Minneapolis MN, N.° de cat. MAB100), 1,0 pg/107 perlas de anticuerpo anti-CD28 humano (R&D Systems, N.° de cat. MAB342) y 3 pg/107 perlas de IgG humana (R&D Systems, N.° de cat. 1-001-A). Las PBm C se obtuvieron del Stanford Blood Center; Palo Alto CA. Los linfocitos T CD4+ sin tratar se purificaron a partir de conos del sistema de reducción de leucocitos (LRS) usando el kit de CD4+ sin tratar (Miltenyi Biotech, N.° de cat. 130-094-131) siguiendo las instrucciones del fabricante. Un total de 4,0 x 105 linfocitos T CD4+ sin tratar purificados se dividieron en alícuotas en cada pocillo de una plata de cultivo tisular de 24 pocillos (en lo sucesivo, la "placa experimental") en 1,3 ml de RPMI 1640 (Mediatech, N.° de cat.
10-040-CV) HI FBS al 10 % 100 unidades/ml de IL-2 (Peprotech, N.° de cat. 200-02), en lo sucesivo denominado Media-Q. A continuación, se añadieron 4,0 x 105 Dynabeads "cargadas" por pocillo. Se diluyó IL-12 (Peprotech, N.° de cat. 200-12) en Media-Q y se añadieron 100 pl en los pocillos apropiados, dando una concentración final de 10 ng/ml. Se diluyeron las construcciones de proteína de fusión o IL-4 en Media-Q y se añadieron 100 pl en los pocillos apropiados. Se añadió Media-Q en los pocillos apropiados para llevar el volumen total de cada pocillo a 1,5 ml. La placa experimental se incubó a 37 °C con CO2 al 5 % durante cinco días. En la mañana del quinto día, se añadió miristato acetato de forbol (PMA) a todos los pocillos a una concentración final de 50 ng/ml y también se añadió ionomicina a todos los pocillos a una concentración final de 1,0 pg/ml. Se añadió brefeldina A a una concentración final de 1,0 pg/ml de cultivo. La placa experimental se incubó a 37 °C con CO2 al 5 % durante un mínimo de cuatro horas. A continuación, se recuperó aproximadamente 1/3 del volumen de cada pocillo de la placa experimental y se sometió a preparación para citometría de flujo intracelular de acuerdo con las instrucciones suministradas con el kit mencionado anteriormente y utilizando los reactivos suministrados con el kit. Las células se tiñeron para detectar el interferón gamma intracelular con un anticuerpo anti-interferón gamma humano conjugado con AF647 (eBiosciences.com, N.° de cat. 51-7319-42). Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo en un Becton Dickinson FACSort usando el software Cell Quest. Las muestras adquiridas se analizaron usando el software FloJo y los datos se representaron gráficamente usando el software Graph Pad Prism.
Resultados:
En ausencia de direccionamiento basado en anticuerpos, según lo medido mediante el "ensayo inespecífico (HB-IL4)", la IL4 mostró una CE50 de 1,26 pM (figura 44; Tabla 35). La unión de una IgG1 a IL4 (por ejemplo, la construcción J110-HC-L6-IL4 IgG1, en la que la secuencia de IL-4 humana de tipo natural se unió al extremo C del anticuerpo quimérico J110 que reconoce PD-1, con un enlazador intermedio L6) redujo la potencia en 5,46 veces (6,88/1,26 = 5,46). Al introducir la mutación puntual R88Q en la porción IL-4 de esta construcción, la potencia se redujo aún más, hasta 35.600 veces (44.800/1,26 = 35.555) por debajo de la IL-4 libre. Una segunda construcción de proteína de fusión anticuerpo-IL-4 (R88Q) (isotipo-HC-L6-IL4 (R88Q) IgG1, compuesta por las SEQ ID NOS:358 (cadena pesada) y 344 (cadena ligera)) mostró una potencia similar. El anticuerpo de isotipo usado en este experimento fue 2D12.
T a b la 35
, , , (continuación
g
Los resultados del "ensayo específico (desviación de Th1)" se muestran en la figura 45. La activación de las células CD4 sin tratar (Th0) induce la expresión de PD-1, de modo que las construcciones de proteína de fusión anti-PD1-IL-4 pueden dirigir la IL-4 hacia ellas. En este ensayo, la IL4 libre de tipo natural muestra una CE50 de 11,4 pM. Cabe destacar que la construcción de proteína de fusión anti-PD1-IL-4 atenuada (J110-HC-L6-IL4 (R88Q) IgG1), que era 35.600 veces menos potente que la IL-4 libre de tipo natural en el "ensayo inespecífico (HB-IL4)", fue casi tan potente como la IL-4 en este ensayo específico (1/4 de su potencia; 11,4/46,1 = 0,25). La construcción de proteína de fusión no atenuada dirigida a PD-1 (J110-HC-L6-IL4 IgG1) fue solo ligeramente más potente que la forma atenuada (1,45 veces más potente; 46,1/31,8 = 1,45). La construcción de proteína de fusión<i>L-4 atenuada no dirigida (Isotipo-HC-L6-IL4 R88Q) IgG1, fue significativamente menos potente que la construcción de proteína de fusión atenuada dirigida, pero su potencia fue demasiado baja para determinar con precisión una CE50 en este experimento.
Interleucina-6 (IL-6) - Este ejemplo se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones
La IL-6 (SEQ ID NO:123) posee numerosas actividades en diferentes tipos de células y puede ser ventajoso aprovechar algunas de estas actividades en detrimento de otras. Por ejemplo, al dirigirse a los linfocitos T CD4+ recién activados (mediante la unión a un anticuerpo anti-PD1, como en el ejemplo anterior con IL-4 dirigida, por ejemplo), se puede desviar la población de linfocitos T auxiliares de la vía Treg a favor de la vía Th17. Esto podría ser ventajoso para un paciente con cáncer.
Métodos:
El "bioensayo de IL-6" se realiza usando las células IL-6 HEK-Blue™ (Invivogen, N.° de cat. hkb-il6), una estirpe celular indicadora genomanipulada que monitoriza la activación de la vía JAK-STAT por IL-6. Estas células se generaron introduciendo el gen IL-6R humano en las células HEK293. Además, las células se transfectaron además con un gen indicador que expresaba SEAP bajo el control del promotor mínimo de IFNp fusionado a cuatro sitios de unión de STAT3. En estas células, IL-6 estimula la activación de STAT3 y conduce a la secreción de SEAP. A continuación, la SEAP se monitoriza mediante el medio de detección de SEAP QUANTI-Blue™. El ensayo se realizó esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invivogen). Brevemente, las células IL6 HEK-Blue se descongelaron y se cultivaron en DMEM (Mediatech, Manassas VA, N.° de cat. 10-013-CV) FBS al 10 % (Hyclone, Logan UT, N.° de cat. SH30070.03) que se había inactivado por calor (HI FBS). Después de un pase, al medio de cultivo se le añadieron 200 |jg/ml de HygroGold (Invivogen, N.° de cat. ant-hg-1) y 100 jg/m l de zeocina (Invivogen, N.° de cat. ant-zn-1). Después de un pase más, se dejó que las células alcanzaran una confluencia del 60-80 % y a continuación se recogieron con Cell Stripper (Mediatech, N.° de cat. 25-056-Cl). A continuación, las células se lavaron dos veces en DMEM HI FBS y se contaron. Las células se ajustaron a 2,8 x 105 células viables/ml en DMEM HI FBS y se dividieron en alícuotas 180 ul por pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano (en lo sucesivo, la "placa experimental"). A continuación, se añadieron por pocillo 20 j l de IL-6 o construcción de proteína de fusión, diluidos en D<m>EM HI FBS. La placa se incubó a 37 °C con CO2 al 5 % durante 16-24 horas. A continuación, QUANTI-Blue (Invivogen, N.° de cat. rep-qb1), preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se dividió en alícuotas (160 j l por pocillo) en cada pocillo de una placa de fondo plano (en lo sucesivo, la "placa de ensayo"). A continuación, se transfirieron 40 j l de sobrenadante por pocillo de la placa experimental a los pocillos de la placa de ensayo. La placa de ensayo se incubó a 37 °C durante 1-3 horas. La absorbancia de la placa de ensayo a 630 nm se leyó en un contador Victor 3V Multilabel modelo 1420-41 de Perkin-Elmer. Los datos se analizaron usando Graph Pad Prism.
Para evaluar si la IL-6 se puede atenuar y dirigir, de modo que pueda lograrse un alto índice de especificidad antigénica (ASI), la IL-6, que porta un enlazador de 16 meros (L16, Sg Gg GSGGGGSGGGGS, SEQ ID n O:133) en el extremo N se fusionó a un anticuerpo dirigido al MHC de clase I, usando el anticuerpo HB95 (que se une al antígeno del MHC de clase I humano, como se ha descrito anteriormente) frente a un anticuerpo de control de isotipo, 2D12 (también descrito anteriormente). La construcción de proteína de fusión de control de isotipo no dirigida, 2D12-HC-L16-IL6 IgG1 (compuesta por las SEQ ID NOS:360 (cadena pesada) y 344 (cadena ligera)), se comparó con la IL-6 libre en el "bioensayo de IL-6" descrito anteriormente (figura 46). La fusión de anticuerpo mostró una potencia aproximadamente 10 veces menor que la de la IL-6 libre (10,9/1,04 = 10,5). Al introducir la mutación R179E (que se sabe que reduce la potencia de la IL-6; Kalai, Blood 89(4):1319-33, 1997)) en esta construcción de proteína de fusión, la construcción resultante (2D12-HC-L16-IL6(R179E) IgG1, compuesta por las SEQ ID NOS:362 (cadena pesada) y 344 (cadena ligera)) se atenuó aún más, mostrando una potencia 79.400 veces menor que la de la IL-6 libre de tipo natural (82.600/1,04 = 79.400). Por el contrario, cuando la IL-6 atenuada se unió a un anticuerpo (HB95) que se une a un antígeno (MHC de clase I) en las células IL-6 HEK-Blue™ (HB95-HC-L16-IL-6(R179E) IgG1, compuesta por las SEQ ID NOS:324 (cadena pesada) y 312 (cadena ligera)), la potencia aumentó 953 veces en comparación con la construcción de proteína de fusión anticuerpo-IL-6 atenuada no dirigida (82600/86,7 = 953). Esta potencia es solo 6,99 veces menor que la de la construcción de proteína de fusión IL-6 de tipo natural dirigida (HB95-HC-L16-IL6 IgG1, compuesta por las SEQ ID NOS:322 (cadena pesada) y 312 (cadena ligera); 86,7/12,4 = 6,99). En otras palabras, en ausencia de direccionamiento de anticuerpo-antígeno y en el contexto de construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IL-6, la mutación R179E reduce la potencia de IL-67.580 veces (82.600/10,9 = 7.580) en comparación con tan solo 6,99 veces en presencia de direccionamiento.
Estudios in vivo de IFNa atenuado dirigido por anticuerpos
Para confirmar que las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-ligando atenuado de la presente invención eran activasin vivo,se realizaron varios experimentos, usando construcciones que consistían en anticuerpos contra CD38, que se expresa en la superficie de células de mieloma múltiple, y versiones atenuadas de IFNa2b. En la mayoría de los estudios, esto se comparó con construcciones de proteína de fusión de control no dirigidas, denominadas a continuación "control de isotipo". Las regiones variables de los anticuerpos de control de isotipo se obtuvieron del anticuerpo 2D12, que se generó contra el virus de la fiebre amarilla (Shlesinger, Virology 125: 8-17, 1983).
En el primer experimento, se usó un modelo de xenoinjerto en el que la estirpe celular de mieloma múltiple NCI-H929 (ATCC CRL-9068, Gazdar, Blood 67: 1542-1549, 1986) se cultiva por vía subcutánea en ratones inmunodeprimidos (SCID).
Métodos:
A ratones CB.17 SCID de 8 a 12 semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea en el costado 1 x 107 células tumorales NCI-H929 en Matrigel al 50 %. Cuando el tamaño promedio del tumor alcanzó 120-150 mm3, los ratones se agruparon en 5 cohortes de 10 ratones cada una y el tratamiento comenzó en el tiempo cero (T0). Todos los tratamientos se administraron mediante inyección intraperitoneal (i.p.) dos veces a la semana durante 5 semanas (indicado por la barra debajo del gráfico). Todos los compuestos se dosificaron a razón de 200 pg/dosis (aproximadamente 10 mg/kg), excepto para el interferón-a. IFNa2b (Intron A®, Schering Corp., Merck, Whitehouse Station, NJ) se administró a razón de 2 millones de unidades/dosis. El volumen tumoral se midió dos veces a la semana con un calibrador. El criterio de valoración fue un volumen tumoral de 2.000 mm3.
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 47. El tratamiento de este tumor sólido subcutáneo (s.c.) de mieloma múltiple con interferón-a (rombos de color negro) retrasó ligeramente el crecimiento tumoral en estos ratones en comparación con el vehículo(P<0,05, círculos de color negro). El tratamiento con anticuerpo anti-CD38 desproteinizado (G005 IgG1, compuesto por las SEQ ID NOS:135 (cadena pesada) y 134 (cadena ligera)), (cuadrados de color negro) no tuvo un efecto significativo sobre el crecimiento tumoral en comparación con el vehículo. Todos los ratones de estos dos grupos alcanzaron el criterio de valoración (2000 mm3) el día 30. La construcción de proteína de fusión control de isotipo-IFNa atenuado no dirigida (Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1, compuesta por las SEQ ID NOS:348 (cadena pesada) y 344 (cadena ligera), que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones) (triángulos invertido de color blanco) no mostró actividad significativa en el retraso del crecimiento tumoral, presumiblemente debido a la larga semivida de la construcción de proteína de fusión anticuerpo-IFNa y el consiguiente aumento de la exposición sistémica. La construcción de proteína de fusión de IFNa atenuado dirigida a CD38 (G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1, compuesta por las SEQ ID n OS:144 (cadena pesada) y 134 (cadena ligera), que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones), por el contrario, mostra una drástica actividad antitumoral en comparación con la construcción de protevna de fusión no dirigida (P <0,0001) o las otras sustancias de prueba. La construcción de protevna de fusión anti-CD38-IFNa atenuado dirigida resolvió completamente los tumores en todos los ratones (10/10) hasta niveles indetectables el día 22, sin recidiva durante todo el estudio.
La construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNa atenuado (G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1, que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones) se ensayó en un modelo de mieloma múltiple sistémico basado en la estirpe celular MM1S (Crown Bioscience Inc., Santa Clara; Greenstein, Exp Hematol. abril;31(4):271 -82,2003).
Métodos:
A ratones NOD-SCID de 6 a 8 semanas de edad se les inyectaron por vía intravenosa 1 x 107 células tumorales MM1S en 0,1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 24 horas después de la irradiación con 200 rad (60Co). Los ratones se agruparon en 4 cohortes de 10 ratones cada una en el tiempo cero y los tratamientos comenzaron 7 días después. Todos los tratamientos se administraron i.p. dos veces a la semana durante 9 semanas. Todos los compuestos se dosificaron a razón de 200 pg/dosis (aproximadamente 10 mg/kg) excepto el interferón-a (administrado a razón de 2 millones de unidades/dosis). Se controlaron el peso corporal y la salud general dos veces a la semana y la supervivencia fue el criterio de valoración.
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 48. El tratamiento de este tumor de mieloma múltiple sistémico con interferóna (Intron A) solo aumentó el tiempo de supervivencia medio (MST, por sus siglas en inglés) en 18 días en comparación con el vehículo (MST 74 frente a 56, respectivamente). El tratamiento con anticuerpo anti-CD38 desproteinizado (G005) sólo aumentó ligeramente la supervivencia (MST 62 días). Ninguno de los ratones de la cohorte tratada con anti-cD38-IFNa atenuado dirigido (G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1) mostró signos de enfermedad durante todo el estudio. Todos los ratones (10/10) parecían sanos al término.
Se realizó un estudioin vivousando un tercer modelo de cáncer, basado en la estirpe celular de linfoma de Burkitt Daudi (ATCC CCL-213, Klein, Cancer Res. 28: 1300-1310, 1968). Las células Daudi son CD38+.
Métodos:
A ratones NOD-SCID de seis a ocho semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea en el costado 1 x 107 células tumorales de linfoma de Burkitt Daudi en Matrigel al 50 % un día después de la irradiación con 200 rad (60Co). Cuando el tamaño medio del tumor alcanzó 169 mm3 (día 20), los ratones se agruparon en 5 cohortes de 10 ratones cada una y se inició el tratamiento. Todos los tratamientos se administraron i.p. dos veces a la semana durante 4 semanas. Todos los compuestos se dosificaron a razón de 200 pg/dosis (aproximadamente 10 mg/kg), excepto para el interferón-a, que se administró a 2 millones de unidades (MIU)/dosis. El volumen tumoral se midió dos veces a la semana con un calibrador. El criterio de valoración fue un volumen tumoral de 2.000 mm3.
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 49. El tratamiento de este tumor s.c. de linfoma de Burkitt con el anticuerpo anti-CD38 desproteinizado (cuadrado de color negro) no retrasó significativamente el crecimiento tumoral en estos ratones en comparación con el vehículo (círculos de color negro). El tratamiento con IFNa produjo un retraso significativo en el crecimiento tumoral en comparación con el vehículo (5,5 días), sin embargo este grupo alcanzó el criterio de valoración de 2.000 mm3 el día 40. La construcción de proteína de fusión de control de isotipo no dirigida (Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1; triángulos invertidos de color blanco, que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones) mostró una actividad significativa en el retraso del crecimiento tumoral, pero este grupo alcanzó el criterio de valoración de 2.000 mm3 el día 57. Como se observa en el modelo H929 (arriba), esta actividad no dirigida probablemente se deba a la prolongada semivida del interferón, lo que aumenta la exposición del tumor a la citocina. La construcción de proteína de fusión anti-CD38-interferón atenuado dirigida (triángulos de color negro) resolvió drásticamente los tumores, de modo que ninguno de los ratones presentó tumores palpables el día 30. Algunos ratones de este grupo, sin embargo, mostraron recrecimiento tumoral tras la interrupción del tratamiento. En la Tabla 36 se presenta un análisis más detallado de estos datos.
Tabla 36. - Estos ejemplos se encuentran fuera del alcance de las reivindicaciones Tratamiento Tamaño medio del tumor (mm3) el Día 37 T/Cb (%) Valor de Pc Vehículo 3034 /- 340 -- --Anti-CD38 (G005) IgG1 2443+/-196 81 0,575 G005-HC-L6-IFNa (145G) IgG1 0 0 <0,0001 Isotipo-HC-L6-IFNa (145G) IgG1 15 0,5 <0,0001 IFNa 1440+/-154 47 0,007 a. Media /- EEM
b. Relación del tamaño del tumor del grupo de tratamiento dividido por el tamaño del tumor del grupo de vehículo el día 37
c. Frente al control de vehículo el día 37
Este experimento de xenoinjerto demuestra que las construcciones de proteína de fusión de IFNa atenuado dirigidas a CD38 pueden ser eficaces en el tratamiento de linfomas, además de mielomas múltiples.
El efecto de diferentes dosis de la construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNa atenuado, se comparó con la construcción de proteína de fusión no dirigida a CD38, sobre el crecimiento tumoral del mieloma. Para estas comparaciones, se usó el modelo de mieloma múltiple s.c. NCI-H929.
Métodos:
A ratones CB.17 SCID de 8 a 12 semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea en el costado 1 x 107 células tumorales NCI-H929 en Matrigel al 50 %. Cuando los tamaños medios del tumor alcanzaron 120-150 mm3, los ratones se agruparon en 9 cohortes de 10 ratones cada una y el tratamiento comenzó (tiempo cero). Todos los tratamientos se administraron i.p. dos veces a la semana durante 5 semanas. En este estudio se compararon dos compuestos, anti-CD38-interferón atenuado dirigido (símbolos de color gris) y control de isotipo-interferón no dirigido (símbolos de color blanco), en diferentes dosis (véase la leyenda para las dosis). El volumen tumoral se midió dos veces a la semana con un calibrador. El criterio de valoración fue un volumen tumoral de 2.000 mm3.
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 50. La valoración de la dosis de la construcción de proteína de fusión IFNa atenuado dirigida a anti-CD38 (G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1, que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones) demostró una eficacia significativa con todas las dosis del compuesto ensayado, incluso con 0,01 mg/kg. Se observó la eliminación completa del tumor en 10/10 ratones solo con la dosis más alta (10 mg/kg). Por el contrario, el compuesto control de isotipo-IFN atenuado (Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1, que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones) mostró una actividad significativa solo con la dosis más alta (10 mg/kg). La dosis de 0,01 mg/kg del IFN atenuado dirigido a CD38 mostró una actividad antitumoral similar a la de la construcción de proteína de fusión control de isotipo-IFN atenuado, a una dosis 1.000 veces mayor (10 mg/kg), lo que subraya la importancia del direccionamiento a CD38.
El siguiente ejemplo muestra que los anticuerpos de la presente invención también incluyen los del isotipo IgG4.
Métodos:
A ratones CB.17 SCID de 8 a 12 semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea en el costado 1 x 107 células tumorales NCI-H929 en Matrigel al 50 %. Cuando el tamaño promedio del tumor alcanzó 120-150 mm3, los ratones se agruparon en 5 cohortes de 10 ratones cada una y el tratamiento comenzó (tiempo cero). Todos los tratamientos se administraron i.p. dos veces a la semana durante 5 semanas. Todos los compuestos se dosificaron a razón de 70 pg/dosis (aproximadamente 3,5 mg/kg). El volumen tumoral se midió dos veces a la semana con un calibrador. El criterio de valoración fue de 2.000 mm3.
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 51. Este estudio comparó la actividad de las construcciones de proteínas de fusión dirigidas frente a no dirigidas en dos formatos de isotipo diferentes; se compararon el isotipo IgG1 (G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1 (dirigida, cuadrados de color negro) e Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1 (no dirigida, cuadrados de color blanco), que se encuentran fuera del alcance de las reivindicaciones) e isotipo IgG4 (G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG4, compuesta por las SEQ ID NOS:148 (cadena pesada) y 134 (cadena ligera) (dirigida, rombos de color negro) e Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgG4, compuesta por las SEQ ID NOS:350 (cadena pesada) y 344 (cadena ligera) (no dirigida, rombos de color blanco), que se encuentran fuera del alcance de las reivindicaciones). Es importante señalar que los ratones en este estudio fueron tratados con una dosis más baja que en estudios anteriores donde se observó una eliminación del tumor del 100 %. Los volúmenes tumorales indican que, sorprendentemente, el formato IgG4 es más potente que el formato IgG1 en este modelo. Dado que los anticuerpos IgG1 humanos tienen una mayor función efectora que los anticuerpos IgG4 (Hooper, Ann Clin Lab Sci.;8:201, 1978; Ward, Ther Immunol, 2:77, 1995), se habría esperado que el formato IgG1 fuera al menos igual de eficaz, o incluso más, que el formato IgG4. Al final del estudio, 8 de 10 ratones del grupo tratado con IFN atenuado, IgG4 y dirigido a CD38 (rombos de color negro) estaban libres de tumor, mientras que solo 3 de 10 estaban libres de tumor en el homólogo en formato IgG1 (cuadrados de color negro).
El siguiente ejemplo extiende la observación de la eficaciain vivode un IFN dirigido por anticuerpo a una segunda forma mutada de IFNa, en la que A145 se ha mutado a ácido aspártico (D). Además, el experimento a continuación utiliza un anticuerpo CD38 diferente, es decir, uno basado en las regiones variables del clon de anticuerpo humano X355/02; (SEQ ID NOS:391 (VH) y 390 (VA)). Una tercera diferencia entre esta construcción y la presentada en los experimentosin vivoanteriores es que se elimina el enlazador (denominado "L0"), es decir, el IFNa mutado se fusiona directamente al extremo C de la cadena pesada de anticuerpo.
Métodos:
A ratones CB.17 SCID de 8 a 12 semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea en el costado 1 x 107 células tumorales NCI-H929 en Matrigel al 50 %. Cuando el tamaño promedio del tumor alcanzó 120-150 mm3, los ratones se agruparon en 3 cohortes de 10 ratones cada una y, a continuación, el tratamiento comenzó (tiempo cero). Todos los tratamientos se administraron i.p. dos veces a la semana durante 5 semanas. Todos los compuestos se dosificaron a razón de 60 pg/dosis (aproximadamente 3 mg/kg). El volumen tumoral se midió dos veces a la semana con un calibrador. El criterio de valoración fue un volumen tumoral de 2.000 mm3.
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 52. Esta construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFNa atenuado (X355/02-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4, compuesta por las SEQ ID N<o>S:232 (cadena pesada) y 226 (cadena ligera)) también fue muy eficaz en la eliminación de tumores, lo que demuestra que la capacidad de las construcciones de proteína de fusión anti-CD38-IFNa atenuado para tratar eficazmente el mieloma humano en un modeloin vivono se limita a un único dominio variable, mutación de IFNa o enlazador entre el anticuerpo y el IFN. La construcción de proteína de fusión de control de isotipo mostró una actividad antimieloma significativamente menor, en consonancia con el direccionamiento basado en CD38.
El siguiente ejemplo muestra que una construcción de proteína de fusión anticuerpo anti-CD38-IFNa atenuado es más eficaz que los fármacos estándar usados para tratar el mieloma múltiple en el mismo modelo de xenoinjerto descrito anteriormente.
Métodos:
A ratones CB.17 SCID de 8 a 12 semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea en el costado 1 x 107 células tumorales NCI-H929 en Matrigel al 50 %. Cuando los tamaños medios del tumor alcanzaron 120-150 mm3, los ratones se agruparon en cohortes de 10 ratones cada una y el tratamiento comenzó (tiempo cero). Los tratamientos se administraron en las dosis y pautas descritas en la leyenda. El volumen tumoral se midió dos veces a la semana con un calibrador. El criterio de valoración fue de 2.000 mm3.
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 53. En este estudio, la actividad de la construcción de proteína de fusión dirigida a anti-CD38 (G005-HC-L0-IFNa (A145D)IgG4, compuesta por las SEQ ID NOS:180 (cadena pesada) y 134 (cadena ligera)) se comparó con terapias estándar bortezomib (Velcade), melfalán (Alkeran) y dexametasona. Del grupo con interferón atenuado dirigido por anti-CD38, 8 de 10 estaban libres de tumores el día 60 (triángulos de color negro), mientras que todos los ratones de los otros grupos habían alcanzado el criterio de valoración el día 50.
El siguiente ejemplo muestra que una construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFN atenuado puede eliminar por completo los tumores de mieloma múltiple humano establecidos en un modelo murino, incluso cuando la construcción de proteína de fusión se administra en una sola dosis.
Métodos:
A ratones CB.17 SCID de 8 a 12 semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea en el costado 1 x 107 células tumorales NCI-H929 en Matrigel al 50 %. Cuando el tamaño medio de los tumores alcanzó 120-150 mm3, los ratones se agruparon en cohortes de 10 ratones cada una y a continuación se inició el tratamiento (T0). Los tratamientos con la construcción de proteína de fusión anticuerpo anti-CD38-interferón atenuado se administraron de acuerdo con las siguientes pautas: dosis única el día 0 (triángulos de color negro), dos dosis (el día 0 y el día 3; cuadrados de color negro), 4 dosis (los días 0, 3, 8 y 11; rombos de color negro) y 6 dosis (los días 0, 3, 8, 11, 15 y 18; círculos de color negro). Una cohorte recibió 6 dosis de la construcción de proteína de fusión control de isotipo-interferón atenuado los días 0, 3, 8, 11, 15 y 18 (cuadrados de color blanco). El grupo de tratamiento con vehículo se muestra en círculos de color gris. El volumen tumoral se midió dos veces a la semana con un calibrador. El criterio de valoración fue de 2.000 mm3.
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 54. Este estudio demostró sorprendentemente que una dosis única de la construcción de proteína de fusión G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG4, que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones, fue suficiente para eliminar los tumores establecidos en los 10 ratones para el día 15; además, para el día 60, ningún tumor había vuelto a crecer en ninguno de los ratones de este grupo de dosis única. Esto se observó en las 4 pautas posológicas con el interferón atenuado dirigido. El grupo de control de isotipo solo se evaluó con la pauta posológica de 6 dosis y mostró una actividad considerablemente menor. Que una dosis única de un compuesto pueda curar eficazmente a animales con tumores de mieloma múltiple establecidos es inédito y sumamente sorprendente, ya que las terapias antitumorales típicamente se dosifican varias veces para observar su eficacia.
El siguiente ejemplo demuestra que incluso tumores muy grandes se pueden eliminar mediante el tratamiento con una construcción de proteína de fusión anti-CD38-IFN atenuado.
Métodos:
Una cohorte (n = 9) del estudio inmediatamente anterior no recibió tratamiento hasta que el volumen tumoral medio alcanzó 730 mm3. Esta cohorte recibió 6 dosis de interferón atenuado dirigido por anti-CD38 los días 12, 15, 19, 22, 26 y 29 (flechas).
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 55. 8 de 9 ratones de esta cohorte mostraron eliminación completa del tumor el día 30 y ningún tumor reapareció en ninguno de estos ratones al final del estudio. Tres de estos ratones tenían tumores iniciales >1000 mm3 El único ratón que falleció a causa del mieloma fue uno que tenía un volumen tumoral de 1800 mm3 al inicio del tratamiento; alcanzó el criterio de valoración de 2000 mm3 al día siguiente. Este resultado es muy sorprendente, ya que no se ha notificado ningún otro compuesto que elimine tumores de mieloma de este tamaño en ningún modelo animal.
Se demostró que, en los experimentosin vitroanteriores (Tabla 27), la construcción de proteína de fusión G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG4, que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones, tiene aproximadamente 25.000 veces menos potencia que el IFNa2b libre de tipo natural en condiciones donde el anticuerpo no dirige el IFNa atenuado a las células bajo ensayo (ensayo inespecífico). Los siguientes experimentos tuvieron como objetivo determinar si la construcción de la proteína de fusión también mostró una atenuación drástica de la actividad del IFN en un ensayoex vivode la actividad del IFN, que es relevante para la toxicidad del IFNa. Este efecto del IFNa sobre la hematopoyesis se puede medirex vivodeterminando el efecto del IFNa sobre el número de unidades formadoras de colonias procedentes de células mononucleares primarias de médula ósea humana. Se compararon las construcciones de proteína de fusión de IFNa frente a anticuerpo-IFNa atenuado en cuanto a su efecto sobre la formación de colonias.
Métodos:
Células mononucleares de médula ósea humana normales congeladas (AllCells, Inc., Emeryville, CA) de 3 donantes se descongelaron en medio RPMI-1640 más suero fetal bovino (FBS) al 10 % (medio completo) y se lavaron con el mismo medio dos veces. Después del lavado, las células se mantuvieron en este medio a razón de 1,75 x 106 células/ml. Las suspensiones celulares se diluyeron con medio MethoCult H4434 Classic (Stem Cell Technologies, N.° de cat. 04434) hasta una concentración celular final de 0,7 x 105 células/ml. A continuación, las células se mezclaron bien y 3 ml de esta mezcla se dividieron en alícuotas en cada tubo.
Intron A (Schering Corp. Merck, NJ) y las construcciones de proteína de fusión (G005-HC-L0-IFNa (145D) IgG4 e Isotipo-HC-L0-IFNa (145D) IgG4) se diluyeron en diluciones en serie décuples en medio completo y se añadieron 150 |jl de cada dilución a tubos que contenían 3 ml de células de médula ósea en el medio Methocult H4434. Las mezclas se sembraron en placas a razón de 1,1 ml por placa de cultivo tisular de 35 mm (Stem Cell Technologies, N.° de cat. 27115). A continuación, las placas se incubaron en una incubadora bien humidificada a 37 °C con CO2 al 5 % durante dos semanas. Se realizó el recuento de colonias al microscopio usando una placa de puntuación cuadriculada (Stem Cell Technologies, N.° de cat. 27500) y se registró el número de colonias/placa. El porcentaje de recuperación de colonias para una sustancia de prueba determinada se calculó dividiendo el número de colonias por placa entre el número de colonias en las placas sin sustancia de prueba añadida. Se ensayaron un total de tres MNC de médula ósea humana usando este método.
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 56. Los datos indican que tanto las construcciones de proteína de fusión de interferón atenuado dirigidas (anti-CD38, G005) como no dirigidas (isotipo; 2D12), tenían una actividad similar, lo que indica que la expresión de CD38 observada en células normales de médula ósea probablemente no se exprese en las células formadoras de colonias, ya que se observó muy poca inhibición de la formación de colonias con el tratamiento dirigido. Ambas construcciones de proteína de fusión tenían una actividad aproximadamente 10.000 veces menor en la inhibición de la formación de colonias que el IFNa libre de tipo natural, lo que confirma que la mutación A145D atenúa la actividad del IFN de las construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFNa y sugiere que dichas construcciones de proteína de fusión anticuerpo-IFN atenuado tendrán un perfil de seguridad superior al del propio IFNa.
Otra actividad del IFNa que se puede medirex vivoes la estimulación de la secreción de citocinas y quimiocinas. Se estimularon PBMC humanas normales con diversas concentraciones de IFNa frente a la construcción de proteína de fusión anticuerpo-IFNa atenuado Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1, que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones, (basándose en el anticuerpo 2D12), y se midió la producción de citocinas resultante.
Métodos:
Se lavaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) normales de cuatro donantes normales con medio Xvivo-15 (Lonza, N.° de cat. 04-418Q) y se suspendieron de nuevo en el mismo medio a una densidad celular de 1 x 106 células/ml. A continuación, las células se incubaron con IgG humana a razón de 4 mg/ml y se incubaron a 37 °C durante 30 min para bloquear cualquier unión inespecífica de IgG. Sin lavar, se añadieron a continuación alícuotas de 250 j l de células a pocillos de placas de cultivo tisular de 24 pocillos tratadas. A continuación, a estos pocillos se les añadieron 250 j l de IFNa libre o una construcción de proteína de fusión de IFNa atenuado por IgG (Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1, que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones; el isotipo del anticuerpo es 2D12) a diversas concentraciones. A continuación, las placas se incubaron durante una noche a 37 °C en CO2 al 5 %. Al día siguiente, las placas se centrifugaron y se recogieron 200 |jl de sobrenadante de cada pocilio. Los sobrenadantes se mantuvieron congelados hasta su análisis mediante un ensayo de citocinas Luminex.
Ensayo Luminex: Usando la premezcla de 42 plex de Millipore (N.° de cat. MPXHCYT060KPMX42), se pudo medir el nivel de citocinas humanas producidas por las PBMC estimuladas por las sustancias de prueba. Los sobrenadantes de cultivo se incubaron con las perlas de poliestireno premezcladas, que se recubrieron con anticuerpos anticitocina, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del lavado, se añadió el cóctel de anticuerpos de detección biotinilados al analito capturado en las perlas. Finalmente, la mezcla de reacción se incubó con estreptavidina PE y la intensidad de fluorescencia de PE se midió en el analizador Luminex. Los resultados se interpolaron mediante la curva estándar construida a partir de los controles incluidos en el kit.
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 57. Cuatro citocinas (IP-10, MCP-1, MCP-3 e IL-1a) se regularon positivamente de manera consistente en respuesta a la exposición a IFNa. La construcción de proteína de fusión anticuerpo-IFNa atenuado (Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgG1, que se encuentra fuera del alcance de las reivindicaciones) mostró 1.000-5.000 veces menos potencia en comparación con la estimulación de IFNa de tipo natural. Esto confirma que la mutación produjo una atenuación significativa de la actividad biológica. El panel (a) muestra las curvas de respuesta a la dosis para IP-10 (con una atenuación estimada de ~1000 veces) y MCP-1 (con una atenuación estimada de ~5000 veces); el panel (b) muestra las curvas de respuesta a la dosis para MCP-3 (con una atenuación estimada de ~2.500 veces) y IL1a (con una atenuación estimada de ~1.300 veces).
TABLAS DE SECUENCIAS
Tabla 37 - Secuencias monocatenarias polipeptídicas
S
(continuación
(continuación
Tabla 38 - SEQ ID NO relacionadas con las proteína m r n n 2 n li í i
(continuación
(continuación
(continuación
(continuación
(continuación
(continuación
(continuación
(continuación
(continuación
(continuación
(continuación
Tabla 39 - Dominios variables
(continuación)
Tabla 40 - Otras secuencias monocatenarias polipeptídicas

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una construcción polipeptídica que comprende un interferón (IFN) unido a un anticuerpo, o a una porción de unión a antígeno del mismo, que se une a un antígeno asociado a la superficie celular, en donde el IFN es un interferón a (IFNa) atenuado que comprende, en relación con el tipo natural, una mutación como se representa en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en R144A (SEQ ID NO:30), R144S (SEQ ID NO:40), R144T (SEQ ID NO:41), R144Y (SEQ ID NO:43), R144I (SEQ ID NO:35), R144L (SEQ ID NO:37), A145D (SEQ ID NO:44), A145H (SEQ ID NO:47), A145Y (SEQ ID NO:58), A145K (SEQ ID NO:49), R33A+YNS (SEQ ID NO:65), R33A (SEQ ID NO:16) y R144A+YNS (SEQ ID NO:68).
  2. 2. La construcción polipeptídica según la reivindicación 1, en la que el IFN está unido al anticuerpo, o a la porción de unión a antígeno del mismo, a través de un enlace peptídico.
  3. 3. La construcción polipeptídica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el IFN está unido al anticuerpo, o a la porción de unión a antígeno del mismo, directamente o mediante un enlazador de 1 a 20 aminoácidos de longitud.
  4. 4. La construcción polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el IFN está unido al extremo C de la región constante de cadena ligera o de cadena pesada del anticuerpo, o de la porción de unión a antígeno del mismo.
  5. 5. La construcción polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, se une al antígeno asociado a la superficie celular con una afinidad de 50 nM, de 25 nM, de 10 nM o de 5 nM a 1 pM.
  6. 6. La construcción polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el antígeno asociado a la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en CD38, HM1.24, CD56, CS1, CD20, CD74, IL-6R, Blys (BAFF), BCMA, HLA-SR, quininógeno, beta2 microglobulina, FGFR3, ICAM-1, matriptasa, Ep-CAM, CD52, EGFR, GM2, integrina alfa 4, IFG-1R, KIR, CD3, CD4, CD8, CD24, CD44, CD69, CD70, CD71, CD83, CD86, CD96, HLA-DR, PD-1, ICOS, CD33, CD115, CD11c, CD14, CD52, CD14, FSP1, FAP, PDGFR alfa, PDGFR beta, ASGR1, ASGR2, FSP1, RTI140/Ti-alfa, HT156, receptor de VEGF, CD241, el producto del gen RCHE, CD117 (c-kit), CD71 (receptor de transferrina), CD36 (receptor de trombospondina), CD34, CD45RO, CD45RA, CD115,<c>D168, CD235, C<d>236, CD237, CD238, CD239 y CD240.
  7. 7. La construcción polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo o un fragmento Fab.
  8. 8. La construcción polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la construcción tiene un índice de especificidad antigénica superior a 50, preferentemente superior a 100, preferentemente superior a 1000.
  9. 9. Una composición que comprende la construcción polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un portador o un diluyente farmacéuticamente aceptables.
  10. 10. La construcción polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento del cáncer.
  11. 11. La construcción polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el cáncer es mieloma múltiple o linfoma no Hodgkin.
ES12843185T 2011-10-28 2012-10-29 Polypeptide constructs and uses thereof Active ES3033729T3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2011904502A AU2011904502A0 (en) 2011-10-28 Polypeptide constructs and uses thereof
PCT/AU2012/001323 WO2013059885A2 (en) 2011-10-28 2012-10-29 Polypeptide constructs and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3033729T3 true ES3033729T3 (en) 2025-08-07

Family

ID=48168677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12843185T Active ES3033729T3 (en) 2011-10-28 2012-10-29 Polypeptide constructs and uses thereof

Country Status (16)

Country Link
US (3) US9611322B2 (es)
EP (1) EP3559049B1 (es)
JP (3) JP6184965B2 (es)
KR (2) KR102037541B1 (es)
CN (2) CN104203982B (es)
AU (2) AU2012327877B2 (es)
BR (1) BR112014009925B1 (es)
CA (1) CA2851892C (es)
EA (2) EA201700111A1 (es)
ES (1) ES3033729T3 (es)
IL (2) IL232247B (es)
MX (1) MX360741B (es)
NZ (1) NZ756727A (es)
SG (2) SG10201603411WA (es)
WO (1) WO2013059885A2 (es)
ZA (1) ZA201402819B (es)

Families Citing this family (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1578397T3 (da) * 2002-11-15 2013-03-11 Genmab As Humane monoklonale antistoffer mod CD25
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CN102268089A (zh) 2011-07-05 2011-12-07 上海交通大学 Agr2阻断抗体及其用途
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
EP3559049B1 (en) 2011-10-28 2025-06-11 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
US9492562B2 (en) * 2012-01-20 2016-11-15 Vib Vzw Targeted human-interferon fusion proteins
EP2822575B1 (en) 2012-03-03 2020-05-06 ImmunGene, Inc. Engineered antibody-interferon mutant fusion molecules
AU2014205086B2 (en) 2013-01-14 2019-04-18 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
ES2938708T3 (es) * 2013-04-29 2023-04-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anticuerpos anti-CD38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
ES2757501T3 (es) 2013-07-18 2020-04-29 Vib Vzw Fusocinas que implican citocinas con afinidades de unión al receptor fuertemente reducidas
EP3022226B1 (en) 2013-07-19 2018-12-05 Vib Vzw Targeted modified il-1 family members
JP6475712B2 (ja) 2013-07-19 2019-02-27 ヴィブ ブイゼットダブリュー サイトカインアンタゴニストの標的化
JP6595988B2 (ja) 2013-07-19 2019-10-23 ヴィブ ブイゼットダブリュー ターゲットされる修飾ｔｎｆファミリーメンバー
SG11201603088RA (en) * 2013-10-31 2016-05-30 Sanofi Sa Specific anti-cd38 antibodies for treating human cancers
JP6752148B2 (ja) * 2014-02-07 2020-09-09 マクマスター ユニバーシティー 三官能性ｔ細胞−抗原カプラ及び方法並びにこれらの使用
US9603927B2 (en) 2014-02-28 2017-03-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US9732154B2 (en) 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
JP6775422B2 (ja) 2014-03-28 2020-10-28 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３８及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体
UA119352C2 (uk) * 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
US10786578B2 (en) 2014-08-05 2020-09-29 Novartis Ag CKIT antibody drug conjugates
US10617757B2 (en) * 2014-08-08 2020-04-14 The Regents Of The University Of California Methods for treating multiple myeloma
ES2890669T3 (es) 2014-09-09 2022-01-21 Janssen Biotech Inc Terapias de combinación con anticuerpos anti-CD38
EA037749B1 (ru) * 2014-10-29 2021-05-18 Тева Фармасьютикалз Острэйлиа Пти Лтд ВАРИАНТЫ ИНТЕРФЕРОНА 2b
AU2015353409B2 (en) 2014-11-26 2019-05-09 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US10526417B2 (en) * 2014-11-26 2020-01-07 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38
TWI721959B (zh) * 2014-12-04 2021-03-21 美商健生生物科技公司 治療急性骨髓性白血病之抗ｃｄ３８抗體
PE20180671A1 (es) * 2015-05-20 2018-04-19 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-cd38 para el tratamiento de amiloidosis de cadena ligera y otras enfermedades malignas hematologicas positivas para cd38
JP2018516950A (ja) * 2015-06-12 2018-06-28 イミュンジーン, インコーポレイテッドImmunGene, Inc. がん治療のための集中インターフェロン免疫療法
PE20181323A1 (es) 2015-06-22 2018-08-14 Janssen Biotech Inc Terapias de combinacion para enfermedades malignas hematologicas con anticuerpos anti-cd38 e inhibidores de survivina
US20170044265A1 (en) 2015-06-24 2017-02-16 Janssen Biotech, Inc. Immune Modulation and Treatment of Solid Tumors with Antibodies that Specifically Bind CD38
RU2611685C2 (ru) * 2015-07-20 2017-02-28 Илья Владимирович Духовлинов Гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1
CN105254717B (zh) * 2015-08-18 2018-08-24 中山大学 与cd34分子特异性结合的多肽及其应用
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
BR112018008901A8 (pt) 2015-11-03 2019-02-26 Janssen Biotech Inc formulações subcutâneas de anticorpos anti-cd 38 e seus usos
US11702477B2 (en) 2015-11-06 2023-07-18 Orionis Biosciences BV Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
US10227410B2 (en) 2015-12-07 2019-03-12 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
US11661455B2 (en) 2016-02-05 2023-05-30 Orionis Biosciences BV Chimeric protein comprising an interferon alpha 2mutant and a PD-L1 binding moiety
JP6991979B2 (ja) 2016-02-05 2022-03-04 オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ Ｃｄ８結合物質
US11248057B2 (en) 2016-03-07 2022-02-15 Vib Vzw CD20 binding single domain antibodies
CN106065033A (zh) * 2016-03-17 2016-11-02 中国药科大学 一种细胞因子融合抗体的制备及其应用
CN109715803B (zh) * 2016-04-25 2023-07-07 巴塞尔大学 等位基因编辑及其应用
EP3455245A2 (en) * 2016-05-13 2019-03-20 Orionis Biosciences NV Therapeutic targeting of non-cellular structures
CA3023883A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
CN110352070B (zh) 2016-06-14 2024-09-17 Xencor股份有限公司 双特异性检查点抑制剂抗体
EP4050032A1 (en) 2016-06-28 2022-08-31 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US20190233533A1 (en) 2016-06-28 2019-08-01 Umc Utrecht Holding B.V. Treatment Of IgE-Mediated Diseases With Antibodies That Specifically Bind CD38
EA037848B1 (ru) 2016-07-14 2021-05-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Биохимический Агент" Гибридный белок, полинуклеотид, генетическая конструкция, продуцент, препарат для регенерации хряща (варианты)
WO2018014068A1 (en) * 2016-07-19 2018-01-25 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Attenuated type i ifn cd47 combination therapy
WO2018014067A1 (en) * 2016-07-19 2018-01-25 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd47 combination therapy
CN110114368B (zh) * 2016-10-24 2024-08-02 奥睿尼斯生物科学私人有限公司 靶向突变干扰素-γ及其用途
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
CN106854248A (zh) * 2016-12-09 2017-06-16 中国药科大学 一种细胞因子突变体融合抗体的制备及其应用
IL267113B2 (en) 2016-12-21 2024-09-01 Cephalon Llc Antibodies that bind specifically to human IL-15 and their uses
WO2018141964A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences Nv Targeted chimeric proteins and uses thereof
EP3576765B1 (en) * 2017-02-06 2025-07-16 Orionis Biosciences, Inc. Targeted engineered interferon and uses thereof
WO2018146074A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Vib Vzw Immune-cell targeted bispecific chimeric proteins and uses thereof
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
EP3618870A4 (en) * 2017-05-01 2021-04-21 The Trustees of The University of Pennsylvania MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ALPHA-SYNUCLEIN FIBRILLES
US20200362058A1 (en) * 2017-05-24 2020-11-19 Novartis Ag Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
KR20200037781A (ko) * 2017-07-03 2020-04-09 토크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 면역자극 융합 분자 및 이의 용도
WO2019023156A1 (en) * 2017-07-24 2019-01-31 Rutgers, The State University Of New Jersey PHOSPHATIDYLSERIN-TARGETING FUSION MOLECULES AND METHODS OF USE
US11541103B2 (en) * 2017-08-03 2023-01-03 Amgen Inc. Interleukin-21 mutein/ anti-PD-1 antibody conjugates
BR112020002706A2 (pt) 2017-08-09 2020-08-25 Orionis Biosciences Inc. agentes de ligação a clec9a e uso dos mesmos
CA3069994A1 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Orionis Biosciences Inc. Pd-1 and pd-l1 binding agents
CN111511763B (zh) * 2017-08-09 2024-05-31 奥里尼斯生物科学有限公司 Cd8结合剂
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
WO2019071358A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Mcmaster University Y182T MUTATION T CELL ANTIGEN COUPLEUR AND METHODS AND USES THEREOF
MA50514A (fr) 2017-10-31 2020-09-09 Janssen Biotech Inc Méthodes de traitement du myélome multiple à haut risque
EP3706793A1 (en) 2017-11-08 2020-09-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
MX2020007291A (es) 2018-01-12 2020-09-10 Amgen Inc Anticuerpos anti-pd-1 y metodos de tratamiento.
US20200354424A1 (en) * 2018-01-26 2020-11-12 Orionis Biosciences, Inc. Xcr1 binding agents and uses thereof
CA3090406A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast binding agents and use thereof
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
AR114789A1 (es) 2018-04-18 2020-10-14 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de los mismos
TW202019962A (zh) * 2018-07-10 2020-06-01 法商賽諾菲公司 標靶CD38及TGF-β的組合療法
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
US10640562B2 (en) 2018-07-17 2020-05-05 Mcmaster University T cell-antigen coupler with various construct optimizations
EP3833391A4 (en) 2018-08-08 2022-08-10 Orionis Biosciences, Inc. CHIMERIC PROTEINS TARGETED AT SIRP1alpha AND THEIR USES
US12162947B2 (en) * 2018-09-04 2024-12-10 Nanjing Umab-Biopharma Co., Ltd. Fusion protein and its applicaton in preparing medicine for treating tumor and/or viral infection
EP3890773A4 (en) 2018-11-08 2022-11-09 Orionis Biosciences, Inc. MODULATION OF DENDRITIC CELL LINES
SG11202104012QA (en) 2018-12-14 2021-05-28 Morphosys Ag Antibody formulations
AU2020244880A1 (en) * 2019-03-28 2021-10-28 Orionfs Biosciences, Inc. Clec9A-based chimeric protein complexes
WO2020198654A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-01 Orionis Biosciences, Inc. Therapeutic interferon alpha 1 proteins
MA55761A (fr) * 2019-04-23 2022-03-02 Sanofi Sa Formulations et anticorps anti-cd38
US11655302B2 (en) * 2019-06-10 2023-05-23 Sanofi Anti-CD38 antibodies and formulations
WO2020257412A1 (en) 2019-06-19 2020-12-24 Orionis Biosciences, Inc. Combination therapy with cd13-targeted chimeric proteins or chimeric protein complexes
EP3999101A1 (en) 2019-07-18 2022-05-25 ENYO Pharma Method for decreasing adverse-effects of interferon
CN119264273A (zh) 2019-12-03 2025-01-07 埃沃特克国际有限责任公司 干扰素相关抗原结合蛋白及其用途
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
CN113717942B (zh) * 2020-05-26 2024-04-30 华东师范大学 一种联合嵌合抗原受体和i型干扰素的免疫治疗方法及其应用
IL300666A (en) 2020-08-19 2023-04-01 Xencor Inc ANTI–CD28 COMPOSITIONS
WO2022072495A2 (en) * 2020-10-01 2022-04-07 Academia Sinica Potent neutralizing antibodies for prevention and treatment of covid-19
CR20230263A (es) 2020-12-17 2023-08-21 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de estos
JP2024511319A (ja) 2021-03-09 2024-03-13 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｃｌｄｎ６に結合するヘテロ二量体抗体
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
CA3207652A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Stephanie Cornen Cytokine anchors for nkp46-binding nk cell engager proteins
CA3173810A1 (en) 2021-06-01 2022-12-01 Andreas Bader Claudin 18.2 t cell-antigen couplers and uses thereof
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
JP2024521405A (ja) 2021-06-09 2024-05-31 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム Ｎｋｐ４６、サイトカイン受容体、腫瘍抗原およびｃｄ１６ａに結合する多特異性タンパク質
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2023052846A2 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Ildong Pharmaceutical Co., Ltd. Immunocytokine containing il-21r mutein
WO2023178253A2 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Igm Biosciences, Inc. Use of a multimeric anti-pd-l1 binding molecule in combination with a monoclonal antibody therapy
TW202413442A (zh) 2022-06-16 2024-04-01 美商希佛隆有限責任公司 抗pd-1抗體減弱之il-2免疫結合物及其用途
CN115057946B (zh) * 2022-06-30 2023-05-16 四川省医学科学院·四川省人民医院 干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用
US20240067691A1 (en) 2022-08-18 2024-02-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon receptor agonists and uses thereof
WO2024040247A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon proproteins and uses thereof
EP4619422A1 (en) * 2022-11-16 2025-09-24 TJ Biopharma (Hangzhou) Co., Ltd. Attenuated interferon proteins and fragments and multifunctional polypeptides and conjugates
US12421288B2 (en) * 2023-03-16 2025-09-23 A-Alpha Bio Interferon alpha-2 variants
AU2024274130A1 (en) 2023-05-12 2026-01-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon receptor antagonists and uses thereof
WO2025038726A2 (en) 2023-08-14 2025-02-20 A-Alpha Bio Interleukin 21 variants
CN119119263B (zh) * 2023-10-08 2025-02-14 安徽千诚生物技术有限公司 一种pct蛋白抗体、定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备
CN117430716B (zh) * 2023-10-16 2024-05-31 珠海臻谱基因科技有限公司 靶向保守的HIV gp41亚基近膜端外区的重组干扰素药物及其应用

Family Cites Families (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2148299B (en) 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
US4908431A (en) 1986-01-22 1990-03-13 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Monoclonal antibodies to human kininogen and methods of preparing same
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5846534A (en) 1988-02-12 1998-12-08 British Technology Group Limited Antibodies to the antigen campath-1
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5976531A (en) 1990-04-19 1999-11-02 The Dow Chemical Company Composite antibodies of human subgroup IV light chain capable of binding to tag-72
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
CZ333796A3 (cs) 1991-03-06 1998-06-17 MERCK Patent Gesellschaft mit beschränkter Haftung Chimérická monoklonální protilátka, expresní vektory a farmaceutický prostředek
AU668349B2 (en) 1991-04-25 1996-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
US5545533A (en) 1991-05-25 1996-08-13 Boehringer Mannheim Gmbh Monoclonal antibodies against c-kit and method of detecting a malignancy using c-kit specific antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5824307A (en) 1991-12-23 1998-10-20 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
US6042828A (en) 1992-09-07 2000-03-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Humanized antibodies to ganglioside GM2
DE69232604T2 (de) 1992-11-04 2002-11-07 City Of Hope Duarte Antikörperkonstrukte
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5441734A (en) * 1993-02-25 1995-08-15 Schering Corporation Metal-interferon-alpha crystals
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
DE69529649T2 (de) 1994-03-17 2003-12-18 Merck Patent Gmbh Anti-egfr einkettige fvs und anti-egfr antikoerper
ES2167391T3 (es) 1994-09-16 2002-05-16 Merck Patent Gmbh Inmunoconjugados ii.
US20020164788A1 (en) 1994-12-02 2002-11-07 The Wellcome Foundation Limited Humanized antibodies to CD38
EP0831917A2 (en) 1995-06-07 1998-04-01 Innogenetics N.V. Immunotoxins specific for cd80 and cd86 expressing cells
EP0873363B1 (en) 1995-06-14 2010-10-06 The Regents of The University of California High affinity human antibodies to tumor antigens
AU725609C (en) 1995-08-18 2002-01-03 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
WO1997042329A1 (en) 1996-05-04 1997-11-13 Zeneca Limited Monoclonal antibody to cea, conjugates comprising said antibody, and their therapeutic use in an adept system
US6417337B1 (en) 1996-10-31 2002-07-09 The Dow Chemical Company High affinity humanized anti-CEA monoclonal antibodies
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6872568B1 (en) 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
GB9709421D0 (en) * 1997-05-10 1997-07-02 Zeneca Ltd Chemical compounds
CA2296770A1 (en) 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
HK1042098B (zh) 1998-10-16 2009-10-30 拜奥根Idec马萨诸塞公司 干扰素-β融合蛋白及用途
DE69942636D1 (de) 1998-12-09 2010-09-09 Phyton Holdings Llc Verfahren zur herstellung von glycoprotein mit menschlichem glycosylierungsbild
US7223397B1 (en) 1999-01-07 2007-05-29 Research Development Foundation Potentiation of anti-CD38-Immunotoxin cytotoxicity
MX353234B (es) 1999-01-15 2018-01-08 Genentech Inc Variantes de polipeptidos con función efectora alterada.
US7355015B1 (en) 1999-03-12 2008-04-08 Georgetown University School Of Medicine Matriptase, a serine protease and its applications
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
US7521047B2 (en) 2000-05-12 2009-04-21 Gpc Biotech Ag Human polypeptides causing or leading to the killing of cells including lymphoid tumor cells
JP3597140B2 (ja) 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
AU6541801A (en) 2000-06-22 2002-01-02 Idec Pharma Corp Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
PT1522590E (pt) 2000-06-28 2009-10-26 Glycofi Inc Métodos para a produção de glicoproteínas modificadas
EP1174440A1 (en) 2000-07-19 2002-01-23 U-BISys B.V. A selectively-expressed epitope on the human CD38 molecule detected by a phage display library-derived human scFv antibody fragment
US7323552B2 (en) 2000-07-31 2008-01-29 The General Hospital Corporation Variant integrin polypeptides and uses thereof
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
EA012079B3 (ru) 2001-01-05 2018-07-31 Пфайзер Инк. Моноклональное антитело к рецептору инсулиноподобного фактора роста i (igf-i) и способы его применения
FR2823764B1 (fr) 2001-04-24 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides du gene ifn alpha-17
US20020193569A1 (en) 2001-06-04 2002-12-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
WO2003066661A2 (en) 2001-07-03 2003-08-14 Genentech, Inc. Human dr4 antibodies and uses thereof
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
AR035119A1 (es) 2001-08-16 2004-04-14 Lilly Co Eli Anticuerpos humanos antagonistas anti-htnfsf13b
JP3665324B2 (ja) 2001-10-15 2005-06-29 麒麟麦酒株式会社 抗ｈｌａ−ｄｒ抗体
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20040185040A1 (en) 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
KR100668538B1 (ko) 2002-01-09 2007-01-16 메다렉스, 인코포레이티드 Ｃｄ３０에 대한 인간 모노클로날 항체
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
EP2865688A1 (en) 2002-03-01 2015-04-29 Immunomedics, Inc. Internalizing anti-CD74 antibodies and methods of use
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
US7332580B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The University Of California Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
CA2491017A1 (en) 2002-07-03 2004-01-15 Immunogen, Inc. Antibodies to non-shed muc1 and muc16, and uses thereof
EP1539950A1 (en) 2002-09-09 2005-06-15 Nautilus Biotech Rational directed protein evolution using two-dimensional rational mutagenesis scanning
WO2004022593A2 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
MXPA05004712A (es) 2002-11-07 2005-11-23 Immunogen Inc Anticuerpos anti-cd33 y metodo para tratamiento de leucemia mieloide aguda utilizando los mismos.
KR20050107435A (ko) 2003-02-18 2005-11-11 메르크 파텐트 게엠베하 개선된 특성의 인터페론 알파 뮤테인의 융합 단백질
US7709610B2 (en) 2003-05-08 2010-05-04 Facet Biotech Corporation Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
CA2544365A1 (en) 2003-11-01 2005-05-12 Biovation, Ltd. Modified anti-cd52 antibody
EP1684869B1 (en) 2003-11-04 2011-07-20 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Methods of therapy for b cell-related cancers
US8354507B2 (en) 2003-12-15 2013-01-15 Dendreon Corporation HLA-DR specific antibodies, compositions and methods
CA2555185C (en) 2004-02-06 2020-03-24 Morphosys Ag Anti-cd38 human antibodies and uses therefor
PT2511297E (pt) 2004-02-06 2015-08-24 Morphosys Ag Anticorpos humanos anti-cd38 e utilizações dos mesmos
US8034352B2 (en) 2005-04-06 2011-10-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Tetrameric cytokines with improved biological activity
WO2005086875A2 (en) 2004-03-11 2005-09-22 City Of Hope A humanized anti-cea t84.66 antibody and uses thereof
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
AU2005259221B2 (en) 2004-07-01 2011-02-10 Innate Pharma Antibodies binding to receptors KIR2DL1, -2, 3 but not KIR2DS4 and their therapeutic use
JP2008513356A (ja) * 2004-08-09 2008-05-01 アリオス バイオファーマ インク． 合成高度糖鎖付加プロテアーゼ耐性ポリペプチド変異体、それを使用する経口製剤および方法
WO2006044643A2 (en) 2004-10-15 2006-04-27 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
EP1842857B1 (en) * 2004-11-12 2011-03-09 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Mutant interferon proteins and use thereof
IL296666A (en) 2005-03-23 2022-11-01 Genmab As Antibodies against 38cd for the treatment of multiple myeloma
US20090123950A1 (en) 2005-05-24 2009-05-14 Morphosys Ag Generation And Profiling Of Fully Human Hucal Gold®-Derived Therapeutic Antibodies Specific For Human CD38
JP2008545409A (ja) 2005-05-26 2008-12-18 シェーリング コーポレイション インターフェロン−ＩｇＧ融合体
US7736647B2 (en) 2005-06-15 2010-06-15 Monoclonal Antibodies Therapeutics Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells
US7767799B2 (en) 2005-06-29 2010-08-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Nucleic acid molecules encoding recombinant interferon-α2 (IFNα2) mutants
EP2397497A3 (en) 2005-07-18 2013-11-27 Amgen, Inc Human anti-B7RP1 neutralizing antibodies
EP1922081B1 (en) 2005-09-09 2012-08-15 Imperial Innovations Limited Interferon lambda therapy for treatment of respiratory diseases
ES2527961T3 (es) 2005-09-26 2015-02-02 Medarex, L.L.C. Anticuerpos monoclonales humanos para CD70
US20070190068A1 (en) * 2005-10-10 2007-08-16 Richard Hart uPAR-binding molecule-drug conjugates and uses thereof
SI2860192T1 (en) 2005-10-12 2018-04-30 Morphosys Ag Generating and profiling fully human HuCAL GOLD-specific therapeutic antibodies specific to human CD38
JP2009513147A (ja) 2005-10-31 2009-04-02 アメリカ合衆国 ヒト糖タンパクｎｍｂをターゲットにする抗体および免疫毒素
GB0525214D0 (en) 2005-12-12 2006-01-18 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
CN101045156B (zh) * 2006-03-29 2012-05-02 刘宏利 特异靶向性药物及其用途
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
FR2905375A1 (fr) 2006-08-29 2008-03-07 Biomethodes Sa Variants ameliores de l'interferon alpha humain
AU2007299843B2 (en) 2006-09-18 2012-03-08 Xencor, Inc Optimized antibodies that target HM1.24
HRP20191115T1 (hr) 2006-09-26 2019-09-20 Genmab A/S Anti-cd38 u kombinaciji s kortikosteroidima zajedno s jednim ne-kortikosteroidnim kemoterapeutikom za liječenje tumora
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
WO2008124086A2 (en) 2007-04-05 2008-10-16 President And Fellows Of Harvard College Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof
KR20100017514A (ko) 2007-05-07 2010-02-16 메디뮨 엘엘씨 항 ｉｃｏｓ 항체, 및 종양, 이식 및 자가면역성 질환 치료에서의 이의 용도
EP2144628B1 (en) 2007-05-08 2012-10-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
EP2152751A1 (en) 2007-05-31 2010-02-17 Genmab A/S Fusion or linked proteins with extended half life
US8248984B2 (en) 2007-06-20 2012-08-21 I Squared Llc System and method for interfacing devices
WO2009017838A2 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Exelixis, Inc. Combinations of jak-2 inhibitors and other agents
WO2009017823A2 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health Of Human Services, National Institutes Of Health A fold-back diabody diphtheria toxin immunotoxin and methods of use
US20090076249A1 (en) 2007-09-19 2009-03-19 Michel De Weers Antibodies against CD38 for treatment of multiple myeloma
JP5591701B2 (ja) * 2007-09-21 2014-09-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 強力なアポトーシス活性および抗腫瘍活性を示すターゲティング化インターフェロン
US20100261275A1 (en) 2007-12-10 2010-10-14 Yves Durocher Production of Recombinant Interferon Proteins
US8092804B2 (en) 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
MX2010007101A (es) 2007-12-26 2011-07-01 Biotest Ag Metodos y agentes para mejorar el reconocimiento de celulas de tumor que expresan cd138.
HRP20140604T1 (hr) 2007-12-26 2014-09-12 Biotest Ag Sredstva koja djeluju na cd138 i njihova upotreba
US8470977B2 (en) 2008-03-14 2013-06-25 Transgene S.A. Antibody against the CSF-1R
US8187601B2 (en) 2008-07-01 2012-05-29 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) binding proteins
WO2010105290A1 (en) 2009-03-16 2010-09-23 Cephalon Australia Pty Ltd Humanised antibodies with anti-tumour activity
CN110016081A (zh) 2009-05-13 2019-07-16 基酶有限公司 抗人cd52免疫球蛋白
SG185035A1 (en) 2010-05-04 2012-11-29 Five Prime Therapeutics Inc Antibodies that bind csf1r
PL2580243T3 (pl) 2010-06-09 2020-05-18 Genmab A/S Przeciwciała przeciwko ludzkiemu CD38
US8909257B2 (en) 2010-06-19 2014-12-09 Qualcomm Incorporated Positioning protocol conveyance
HUE031956T2 (en) 2010-09-27 2017-08-28 Morphosys Ag Anti-CD38 antibody and lenalidomide or bortezomib for the treatment of multiple myeloma and NHL
UA112062C2 (uk) 2010-10-04 2016-07-25 Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх Cd33-зв'язувальний агент
CN103429261A (zh) 2010-12-22 2013-12-04 塞法隆澳大利亚股份有限公司 半寿期改进的修饰抗体
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
EP3559049B1 (en) 2011-10-28 2025-06-11 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
US9492562B2 (en) 2012-01-20 2016-11-15 Vib Vzw Targeted human-interferon fusion proteins
EP2822575B1 (en) 2012-03-03 2020-05-06 ImmunGene, Inc. Engineered antibody-interferon mutant fusion molecules
WO2014028502A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 ImmunGene Inc. Engineered antibody-interferon fusion molecules for treatment of autoimmune diseases
EP2948427A2 (de) 2013-01-25 2015-12-02 Covestro Deutschland AG Sicherheitselement mit volumenhologramm und druckmerkmal
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
ES2938708T3 (es) 2013-04-29 2023-04-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anticuerpos anti-CD38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
EA037749B1 (ru) 2014-10-29 2021-05-18 Тева Фармасьютикалз Острэйлиа Пти Лтд ВАРИАНТЫ ИНТЕРФЕРОНА 2b

Also Published As

Publication number Publication date
JP6184965B2 (ja) 2017-08-23
NZ734996A (en) 2019-09-27
EA034989B1 (ru) 2020-04-15
WO2013059885A3 (en) 2014-07-17
AU2012327877A1 (en) 2014-05-15
IL232247B (en) 2018-07-31
KR102037541B1 (ko) 2019-10-29
KR102096224B1 (ko) 2020-04-03
MX360741B (es) 2018-11-14
WO2013059885A2 (en) 2013-05-02
CN109022465B (zh) 2022-04-29
IL260045A (en) 2018-07-31
NZ623812A (en) 2016-02-26
US20170233449A1 (en) 2017-08-17
CN104203982B (zh) 2018-08-31
CN104203982A (zh) 2014-12-10
CN109022465A (zh) 2018-12-18
CA2851892C (en) 2021-09-14
US20140248238A1 (en) 2014-09-04
CA2851892A1 (en) 2013-05-02
AU2018200221A1 (en) 2018-02-01
EA201400488A1 (ru) 2014-11-28
BR112014009925B1 (pt) 2022-09-20
KR20190123353A (ko) 2019-10-31
BR112014009925A2 (pt) 2020-09-24
JP2015500796A (ja) 2015-01-08
SG10201603411WA (en) 2016-07-28
US20160367695A1 (en) 2016-12-22
IL232247A0 (en) 2014-06-30
JP7111669B2 (ja) 2022-08-02
EP3559049A2 (en) 2019-10-30
JP2017193580A (ja) 2017-10-26
EP3559049B1 (en) 2025-06-11
ZA201402819B (en) 2015-08-26
EP3559049A4 (en) 2019-12-04
MX2014005108A (es) 2015-02-12
SG11201401518TA (en) 2014-05-29
EA201700111A1 (ru) 2018-02-28
NZ756727A (en) 2022-12-23
KR20140101744A (ko) 2014-08-20
US10981986B2 (en) 2021-04-20
IL260045B (en) 2020-06-30
EP3559049C0 (en) 2025-06-11
AU2018200221B2 (en) 2020-01-16
US9611322B2 (en) 2017-04-04
NZ715807A (en) 2019-07-26
JP2020010697A (ja) 2020-01-23
AU2012327877B2 (en) 2017-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES3033729T3 (en) Polypeptide constructs and uses thereof
US11261245B2 (en) Ultra-potent neutralization of GM-CSF by multispecific antibodies and uses thereof
ES2774976T3 (es) Anticuerpos anti-CD38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado
ES2887299T3 (es) Cadena J modificada
CN107106656B (zh) 干扰素α2b变体
US20210244825A1 (en) Il-21 antibodies
KR20230110303A (ko) 폴레이트 수용체 알파에 결합하는 중쇄 항체
CA2977321C (en) Ultra-potent neutralization of cytokines by multispecific antibodies and uses thereof
EA040832B1 (ru) Полипептидные конструкции и их применение
NZ623812B2 (en) Polypeptide constructs and uses thereof
NZ734996B2 (en) Polypeptide constructs and uses thereof
NZ715807B2 (en) Polypeptide constructs and uses thereof