ES2959636T3 - Mezclas y composiciones que comprenden cepas de Paenibacillus o fusaricidinas y pesticidas químicos - Google Patents

Mezclas y composiciones que comprenden cepas de Paenibacillus o fusaricidinas y pesticidas químicos Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a mezclas que comprenden, como componentes activos, al menos una cepa bacteriana aislada, que es miembro del género Paenibacillus, o un extracto libre de células de la misma o al menos un metabolito de la misma, y al menos un pesticida químico. La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden al menos una de dichas cepas bacterianas, un caldo de cultivo completo o un extracto libre de células o una fracción del mismo o al menos un metabolito del mismo, y al menos un pesticida químico. La presente invención también se refiere a un método para controlar o suprimir patógenos de plantas o prevenir infecciones por patógenos de plantas mediante la aplicación de dicha composición. La presente invención también se refiere a mezclas de fusaricidinas, que son metabolitos pesticidas producidos por las cepas mencionadas anteriormente, y pesticidas químicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Mezclas y composiciones que comprenden cepas de Paenibacillus o fusaricidinas y pesticidas químicos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevas mezclas que comprenden, como componentes activos, al menos una cepa bacteriana aislada, que es miembro del géneroPaenibacillus,y al menos un pesticida químico. La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden al menos una de tales cepas bacterianas y al menos un pesticida químico. La presente invención también se refiere a un método para controlar o suprimir patógenos de plantas o prevenir infecciones por patógenos de plantas mediante la aplicación de dicha composición.
Antecedentes de la invención
En el campo técnico del control de hongos fitopatógenos que afectan a plantas o cultivos, es bien conocido aplicar biopesticidas, por ejemplo seleccionados entre bacterias, como bacterias formadoras de esporas, u hongos que no son perjudiciales para la planta o cultivo a tratar y cuyo control biológico Los agentes se pueden combinar además con antagonistas químicos orgánicos clásicos de patógenos vegetales.
Los biopesticidas se han definido como una forma de pesticidas basados en microorganismos (bacterias, hongos, virus, nematodos, etc.) o productos naturales (compuestos o extractos de fuentes biológicas) (Agencia de Protección Ambiental de EE. UU.: http://www.epa .gov/pesticides/biopesticides/).
Los biopesticidas generalmente se crean cultivando y concentrando organismos naturales y/o sus metabolitos, incluidas bacterias y otros microbios, hongos, virus, nematodos, proteínas, etc. A menudo se los considera componentes importantes de los programas de manejo integrado de plagas (IPM, por sus siglas en inglés), y han recibido mucha atención práctica como sustitutos de los productos químicos sintéticos para la protección de plantas (PPP).
Los biopesticidas se dividen en dos clases principales, pesticidas microbianos y bioquímicos:
(1) Los pesticidas microbianos consisten en bacterias, hongos o virus (y a menudo incluyen los metabolitos que producen las bacterias y los hongos). Los nematodos entomopatógenos también se clasifican como pesticidas microbianos, aunque son multicelulares.
(2) Los pesticidas bioquímicos son sustancias naturales que controlan plagas o brindan otros usos para la protección de cultivos como se define a continuación, pero que son relativamente no tóxicos para los mamíferos.
Para controlar hongos fitopatógenos se han descrito anteriormente varios pesticidas microbianos que comprenden bacterias formadoras de esporas tales comoBacillus subtilis,véase, por ejemplo, WO 1998/050422; Documento WO 2000/029426; WO 1998/50422 y WO 2000/58442.
WO 2009/0126473 describe composiciones acuosas agrícolamente aceptables que comprenden esporas bacterianas o fúngicas contenidas en un disolvente acuoso/orgánico y que pueden comprender además agentes de control de insectos, pesticidas, fungicidas o combinaciones de los mismos. Esporas de bacterias del género.Baciloson una especie preferida.
Documento WO 2006/017361 describe composiciones para controlar patógenos vegetales y que comprenden al menos una bacteria beneficiosa, al menos un hongo beneficioso, al menos un nutriente y al menos un compuesto que extiende la vida útil efectiva de dicha composición. El grupo de bacterias beneficiosas comprende bacterias dePaenibacillus polymyxayPaenibacillus durum.
WO 1999/059412 revela unCepa de Paenibacillus polymyxaPKB1 (con el número de acceso de la ATCC 202127) activo contra varios hongos fitopatógenos.
WO 2011/069227 revela unCepa de P.polymyxaJB05-01-1 (con número de acceso ATCC PTA-10436) que tiene un efecto altamente inhibidor contra bacterias patógenas, predominantemente bacterias patógenas humanas transmitidas por alimentos.
Raza et al. (Brazilian Arch. Biol. Techol. 53, 1145-1154, 2010; Eur. J. Plant Pathol.125: 471-483, 2009) describió un producto productor de fusaricidinaPaenibacillus polymyxacepa SQR-21 eficaz contraFusarium oxisporum.
Otra cepa dePaenibacillus polymyxallamada AC-1 es conocida por Investigación microbiana 2016 (en prensa doi:10.1016/j.micres.2016.01.004) y el producto Topseed de Green Biotech Co., Ltd. 45-70 Yadang-ri, Gyoha-Eup Paju Kyungki-Do, Corea (Sur) 413 -830.
OtroPaenibacillus polymyxaLa cepa presumiblemente llamada HY96-2 se conoce de Biocontrol Ciencia y Tecnología 24 (4), 426-435 (2014) y será comercializado bajo el nombre KangDiLeiDe por Shanghai Zeyuan Marine Biotechnology Co.,Ltd.
Hasta ahora se ha publicado el genoma de varias cepas dePaenibacillus polymyxa: entre otras, para la cepa M-1 (n.° de acuerdo NCBI NC_017542; J. Bacteriol. 193 (29), 5862-63, 2011; BMC Microbiol. 13, 137, 2013), cepa CR1 (n.° de acuerdo GenBank CP006941; Anuncios del genoma 2 (1), 1, 2014) y cepa SC2 (GenBank acc. nos. CP002213 y CP002214; NCBI según No. NC_014622; J. Bacteriol. 193 (1), 311-312, 2011), para más cepas ver la leyenda de la Figura 12 del presente documento. Lacepa dePpolymyxaM-1 se ha depositado en el Centro General de Colección de Cultivos<Microbiológicos de China>(CGM<c>C)<según el acc. No. CGMCC 7581.>
En la solicitud PCT PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) nuevas cepas del géneroPaenibacillushan sido caracterizadas. Dichas cepas bacterianas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 habían sido aisladas de superficies de cultivo en Alemania y depositadas en virtud del Tratado de Budapest en laDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ) el 20 de febreroth, 2013 por BASF SE, Alemania:
1) Paenibacilluscepa Lu16774 depositada con el número de acceso DSM 26969,
2) Paenibacilluscepa Lu17007 depositada con el número de acceso DSM 26970, y
3) Paenibacilluscepa Lu17015 depositada con el número de acceso DSM 26971.
Tal como se utiliza en este documento, el término cepa dePaenibacilluscepa es idéntico al término cepa dePaenibacillussp. cepa y significa una cepa bacteriana del géneroPaenibacillus.El generoPaenibacillusincluye todas las especiesPaenibacillusspp.
En el antes mencionado PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371), se determinó que las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 pertenecen al géneroPaenibacillusen las siguientes observaciones morfológicas y fisiológicas (ver Ejemplo 2.3 en PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) y aquí):
- células en forma de bastón
- esporas elipsoidales
- esporangios hinchados
- crecimiento anaeróbico
- fermentación de una variedad de azúcares, incluyendo glucosa, arabinosa, xilosa, manit, fructosa, rafinosa, trehalosa y glicerol con formación de ácido
- producción de gas a partir de glucosa
- arginina dihidrolasa negativa
- no utilización de citrato
- sin crecimiento en presencia de 5% o más de cloruro de sodio
- producción de enzimas hidrolíticas extracelulares que degradan el almidón, la gelatina, la caseína y la esculina.
Además, también se determinó que estas cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 pertenecen al géneroPaenibacillusmediante análisis de ADNr 16S al tener la-secuencia de 22 bases específica dePaenibacillusen ADNr 16S (5' a 3'):5'-TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT-3' (ver SEQ ID NO:1 (nucleótidos 840-861), SEQ ID NO:2 (840-861), SEQ ID NO:3 (844-865) y SEQ ID NO:4 (840-861) en listados de secuencias de PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) y en este documento).
Además, la secuenciación del ADNr 16S completo en comparación con 24 diferentes cepas dePaenibacillusdieron como resultado la agrupación de las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 con las cepas tipo dePaenibacillus brasiliensis,Pkribbensis,Pjamilae,Ppeoriae,y Ppolymyxa,más preferiblemente a Ppeoriae,En particularPaenibacillus peoriaecepa BD-62 (ver Figs. 1 y 2 en PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) y en este documento). Se sabe que Ppolymyxay Ppeoriaetienen valores de identidad de secuencia de ADNr 16S del 99,6 al 99,7% (J. Gen. Appl. Microbiol. 48, 281 285 (2002)).
"Porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud" entre dos secuencias de nucleótidos significa el porcentaje de identidad de los residuos en la longitud completa de las secuencias alineadas y se determina comparando dos secuencias alineadas localmente de forma óptima en una ventana de comparación definida por la longitud del alineamiento local entre las dos secuencias, como por ejemplo la identidad calculada (para secuencias bastante similares) después de la alineación manual con ayuda del programa AE2 (Alignment Editor 2). El alineamiento local entre dos secuencias solo incluye segmentos de cada secuencia que se consideran suficientemente similares según el criterio que depende del algoritmo utilizado para realizar el alineamiento (por ejemplo, AE2, BLAST, estructura secundaria de la molécula de ARNr o similares). El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece el ácido nucleico idéntico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado. por 100.
Para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, una de las secuencias de nucleótidos de la Tabla 1 y un homólogo de la misma), las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en la secuencia de un ácido nucleico para una óptima alineación con el otro ácido nucleico). Luego se comparan las bases en las posiciones correspondientes. Cuando una posición en una secuencia está ocupada por la base que la posición correspondiente en la otra secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Debe entenderse que a los efectos de determinar la identidad de la secuencia al comparar una secuencia de ADN con una secuencia de ARN, un nucleótido de timidina es equivalente a un nucleótido de uracilo.
Para la alineación, los datos de la secuencia se colocaron en el programa AE2 (http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/unix/ae2.readme), alineado manualmente de acuerdo con la estructura secundaria de la molécula de ARNr resultante y comparado con secuencias representativas del gen 16S rRNA de organismos pertenecientes alFirmicutes(Nucl. Acids Res. 27, 171-173, 1999). Para obtener valores de % de identidad para secuencias múltiples, todas las secuencias se alinearon entre sí (alineación de secuencias múltiples). Además, para obtener valores de % de identidad entre dos secuencias en un tramo más largo de secuencias alineadas en comparación con el alineamiento múltiple, se realizó un alineamiento manual de secuencias por pares como se describió anteriormente usando AE2 (alineamiento de secuencias por pares).
La ribotipificación automatizada y estandarizada se ha realizado utilizando el sistema Qualicon RiboPrinter con las cepasde PaenibacillusLu16774, Lu17007 y Lu17015 en comparación con el PpeoriaeBD-62 usando la enzima de restricción EcoRl dio como resultado una similitud de las tres cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 con PpeoriaeBD-62 de entre 0,24 y 0,5 (ver Ejemplo 2.2, Fig. 12 en PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) y en este documento). Se descubrió que las cepas dePaenibacillusLu16774 y Lu17007 pertenecen a la especiePaenibacillus polymyxa.
Según los resultados del análisis filogenético presentado en el mencionado PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) (Figs. 12 a 22 en el mismo y en este documento) y resultados no publicados del Profesor Borriss, Alemania, la especiePaenibacillus polymyxarequirió una nueva clasificación taxonómica en dos subespecies: 1)Paenibacillus polymyxassp.polymixay 2)Paenibacillus polymyxassp.plantarum;y 3) una nueva especiePaenibacillusnov. spec.epiphytiCUS.
La cepa tipo PpolymyxaDSM 36 junto con las cepas Ppo/ymyxaSQR-21, CF05, CICC 10580, NRRL B-30509 y A18 se formaron en cada uno de los dendrogramas de máxima verosimilitud analizados para cinco genes constitutivos conservados(dnaN, gyrb, recA, recNyrpoA)un grupo separado (Figs. 17 y 21 en PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) y en este documento).
Se han obtenido resultados muy similares mediante la determinación de la identidad promedio de aminoácidos (AAI), que se utiliza frecuentemente para determinar la relación filogenética entre especies bacterianas. Este método se basa en el cálculo de la identidad promedio de un genoma central a nivel de aminoácidos (Proc. Natl. Acad. EE.UU. 102, 2567-2572, 2005). Según la matriz AAI resultante en la Fig. 22 en PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) y aquí, PpolymyxaEl DSM 36 se forma junto con elP. polymyxaLa cepa SQR-21 es un subgrupo que es diferente de los otros dos subgrupos que se muestran allí.
Las cepas Lu16674 y Lu17007 junto con la cepa PpolymyxaM-1, 1-43, SC2 y Sb3-1 forman el segundo subgrupo en cada uno de los dendrogramas de máxima probabilidad analizados para cinco genes constitutivos conservados(dnaN, gyrb, recA, recN y rpoA)(Figs. 17-21). Según la matriz AAI en la Fig. 22 en PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) y aquí, basándose en el análisis del genoma central, este segundo subgrupo se confirma por sus cepas representativas Lu16674 y Lu17007 junto con las cepas M-1 y SC2 de Ppolymyxa.
Se encontró que la diferencia entre los dos subgrupos no era tan significativa como para justificar una nueva especie, pero los niveles de identidad de AAI entre los representantes de ambos grupos es de aproximadamente el 97,5 %, lo que justifica la clasificación en dos subespecies separadas.
Así, se propuso en PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) para nominar el primer subgrupo según el tipo Ppolymyxacepa DSM 36tPaenibacillus polymyxassp.polymyxa.Además de la cepa DSM 36, la Pcepas polymyxasSQR-21, CF05, CICC 10580, NRRL B-30509 y A18 pertenecerán a la subespeciePaenibacillus polymyxassp.polymyxa.
Además, se propuso nominar el segundo subgrupo como nueva subespecie.Paenibacillus polymyxassp.plantarum.Además de las cepas Lu16674 y Lu17007, las cepas PpolymyxaM-1, 1-43, SC2 y Sb3-1 pertenecerán aPaenibacillus polymyxassp.plantarum.
La cepa Lu17015 tiene solo un 94,9 % de identidad AAI entre los genes del genoma central con la cepa tipo.Paenibacillus polymyxaDSM36 = ATCC 842 (Fig.22 en PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) y en este documento). Por tanto, la cepa Lu17015 no podría haber sido designada a la especiePaenibacillus polymyxani a ningún otra especie conocida dePaenibacilus.Se encuentran valores similares para las cepas E681 (94,7 %) y CR2 (94,9 %). Entre sí, estas tres cepas tienen al menos un 98,1 % de identidad (AAI). Según la definición de especie de Konstantinides y Tiedje (Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU. 102, 2567-2572, 2005), la cepa Lu17015 y también las cepas E681 y CR2 pueden designarse como nuevas especies. Así, una nueva especiede Paenibacillus specnov.epiphyticusha sido propuesto en PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371). En consecuencia, la cepa Lu17015 pertenece aPaenibacillus epiphyticus.Se propuso que dicha cepa sea la cepa tipo. Asimismo, los dendrogramas basados en las comparaciones de secuencias de los cinco genes constitutivos (Figs. 17-21 en PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) y aquí) mostró que este grupo está distante de todas las demás cepas de Ppo/ymyxa.Además de Lu17015, se propuso que las cepas de PpolymyxaE681, CR2 TD94, DSM 365 y WLY78 pertenecerán aPaenibacillusspec. nov.epiphyticus.
Se sabe quePaenibacillusproduce muchos metabolitos de antibióticos que son lipopéptidos, por ejemplo polimixinas, octapeptinas, polipeptinas, pelgipeptinas y fusaricidinas. Las fusaricidinas son un grupo de antibióticos aislados dePaenibacillus spp.de la clase de lipodepsipéptidos cíclicos que a menudo comparten las siguientes características estructurales: un anillo macrocíclico que consta de 6 residuos de aminoácidos, tres de los cuales son L-Thr, D-alo-Thr y D-Ala, así como el ácido 15-guanidino- Cola de 3-hidroxipentadecanoico unida al residuo N-terminal L-Thr mediante un enlace amida (ChemMedChem 7, 871-882, 2012; J. Microbiol. Meth. 85, 175-182, 2011, Tabla 1 en la presente). Estos compuestos se ciclan mediante un puente de lactona entre el grupo hidroxilo L-Thr N-terminal y el grupo carbonilo D-Ala C-terminal. La posición de los residuos de aminoácidos dentro del ciclo depsipeptídico suele estar numerada comenzando con el L-Thr mencionado anteriormente, que también lleva la cadena GHPD, y terminando con el D-Ala C-terminal. Ejemplos no limitantes de fusaricidinas aisladas dePaenibacillusse denominan LI-F03, LI-F04, LI-F05, LI-F07 y LI-F08 (J. Antibiotics 40(11), 1506-1514, 1987; Heterociclos 53(7), 1533-1549, 2000; Péptidos 32, 1917-1923, 2011) y fusaricidinas A (también llamada LI-F04a), B (también llamada LI-F04b), C (también llamada LI-F03a) y D (también llamada LI-F03b) (J. Antibiotics 49(2), 129-135, 1996; J. Antibiotics 50(3), 220-228, 1997). La cadena de aminoácidos de una fusaricidina no se genera ribosomalmente sino que se genera mediante una péptido sintetasa no ribosomal. Las fórmulas estructurales de fusaricidinas conocidas se muestran en la Tabla 1 (Biotechnol Lett. 34, 1327-1334, 2012; Fig. 1 del mismo). Los compuestos designados como LI-F03a, LI-F03b hasta LI-F08a y LI-F08b y las fusaricidinas de fórmulas I y I.1 como se describen en el presente documento también se denominan fusaricidinas LI-F03a, LI-F03b hasta LI- F08a y LI-F08b debido a su estructura dentro de la familia de las fusaricidinas (ver, por ejemplo, la Tabla 1).
Entre los antibióticos fusaricidina aislados, la fusaricidina A ha demostrado la actividad antimicrobiana más prometedora contra una variedad de hongos clínicamente relevantes y bacterias grampositivas comoStaphylococcus aureus(Rango de valores MIC: 0,78-3,12 pg/ml) (ChemMedChem 7, 871-882, 2012). Se ha establecido la síntesis de análogos de fusaricidina que contienen ácido 12-guanidino-dodecanoico (12-GDA) o ácido 12-amino-dodecanoico (12-ADA) en lugar de GHPD natural, pero la sustitución de GHPD por 12-ADA dio lugar a una completa pérdida de la actividad antimicrobiana, mientras que la sustitución de GHPD por 12-GDA mantuvo la actividad antimicrobiana (Tetraedron Lett. 47, 8587-8590, 2006; ChemMedChem 7, 871-882, 2012).
Tabla 1: Estructuras de la familia de fusaricidina
donde una flecha define un enlace simple (amida) ya sea entre el resto carbonilo de GHPD y el grupo amino de L-Thr (L-treonina) o entre el grupo carbonilo de un aminoácido y el grupo amino de un aminoácido vecino, donde la punta de la flecha indica la unión al grupo amino de dicho aminoácido L-Thr o de dicho aminoácido vecino; y
en donde la línea simple sin punta de flecha define un enlace simple (éster) entre el grupo carbonilo de D-Ala (D-alanina) y el grupo hidroxilo de L-Thr; y en el que GHPD es ácido 15-guanidino-3-hidroxipentadecanoico.
* en el caso de estas dos fusaricidinas 1A y 1B conocido por la solicitud PCT no publicada PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371), no se ha dilucidado la configuración estereoscópica de los seis aminoácidos del péptido cíclico.
También se ha informado que las fusaricidinas A, B, C y D inhiben hongos patógenos de plantas comoFusarium oxysporum, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,yPenicillum thomii(J. Antibiotics 49(2), 129-135, 1996; J. Antibiotics 50(3), 220-228, 1997). Se ha descubierto que las fusaricidinas como Li-F05, LI-F07 y LI-F08 tienen cierta actividad antifúngica contra varios hongos patógenos de plantas comoFusarium moniliforme, F oxysporum, F roseum, Giberella fujkuroi, Helminthosporium sesamumyPenicillium expansivo(J. Antibiotics 40(11), 1506-1514, 1987). Las fusaricidinas también tienen actividad antibacteriana contra las bacterias grampositivas, incluidasStaphylococcus aureus(J. Antibiotics 49, 129-135, 1996; J. Antibiotics 50, 220-228, 1997). Además, las fusaricidinas tienen actividad antifúngica contraLeptosphaeria maculansque causa la pudrición negra de la raíz de canola (Can. J. Microbiol. 48, 159-169, 2002). Además, se descubrió que las fusaricidinas A y B y dos compuestos relacionados de las mismas, en las que D-alo-Thr está unido a través de su grupo hidroxilo a una alanina adicional usando un puente éster, producido por ciertas cepas dePaenibacillusinducen reacciones de resistencia en células cultivadas de perejil e inhiben el crecimiento deFusarium oxysporum(Documento WO 2006/016558; Documento EP 1788074 A1).
WO 2007/086645 describe la enzima fusaricidina sintetasa y su gen codificante aislado dePaenibacillus po/ymyxacepa E681 cuya enzima interviene en la síntesis de fusaricidinas A, B, C, D, LI-F03, LI-F04, LI-F05, LI-F07 y LI-F08.
En la antes mencionada PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) se encontró que el caldo de cultivo completo, el medio de cultivo y los extractos libres de células de las cepas bacterianas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 muestran actividad inhibidora, entre otras cosas, contraAlternariaspp.,Botrytis cinereayPhytophthora infestans.El fraccionamiento guiado por bioactividad de extractos orgánicos de estas cepas condujo al aislamiento de dos nuevos compuestos de tipo<fusaricidina (aquí denominados fusaricidina 1A y 1B), cuya estructura se esclareció mediante espectroscopía de RMN>1<d>y 2D, así como espectrometría de masas:
Los biopesticidas para uso contra enfermedades de los cultivos ya se han establecido en una variedad de cultivos. Por ejemplo, los biopesticidas ya desempeñan un papel importante en el control de las enfermedades del mildiú. Sus beneficios incluyen: un intervalo previo a la cosecha de 0 días y la capacidad de utilizarlo bajo presión de enfermedades de moderada a grave.
Sin embargo, en determinadas condiciones, los biopesticidas también pueden tener desventajas, como una alta especificidad (que requiere una identificación exacta de la plaga/patógeno y el uso de múltiples productos), una velocidad de acción lenta (lo que los hace inadecuados si un brote de plaga es una amenaza inmediata a un cultivo), eficacia variable debido a las influencias de diversos factores bióticos y abióticos (ya que los biopesticidas suelen ser organismos vivos, que provocan el control de plagas/patógenos al multiplicarse dentro del insecto plaga/patógeno objetivo) y el desarrollo de resistencia.
La experiencia agrícola práctica ha demostrado que la aplicación repetida y exclusiva de un componente activo individual en el control de hongos o insectos dañinos u otras plagas conduce en muchos casos a una selección rápida de aquellas cepas de hongos o aislados de plagas que han desarrollado resistencia natural o adaptada contra el componente activo en cuestión. Entonces ya no es posible un control eficaz de estos hongos o plagas con el componente activo en cuestión.
Para reducir el riesgo de selección de cepas de hongos o aislados de insectos resistentes, hoy en día se emplean convencionalmente mezclas de diferentes componentes activos para combatir hongos o insectos dañinos u otras plagas. Combinando compuestos pesticidamente activos y/o biopesticidas que tienen diferentes mecanismos de acción, es posible asegurar un control exitoso durante un período de tiempo relativamente largo.
Un objeto de la presente invención es superar las desventajas antes mencionadas y proporcionar, con miras a una gestión eficaz de la resistencia y un control eficaz de hongos, insectos u otras plagas fitopatógenos dañinos o a una regulación eficaz del crecimiento de las plantas, a tasas de aplicación que sean tan bajas como posible, composiciones que, con una cantidad total reducida de compuestos activos aplicados, tienen una actividad mejorada contra hongos o plagas nocivas o una actividad reguladora del crecimiento de las plantas mejorada (mezclas sinérgicas) y un espectro de actividad ampliado, en particular para ciertas indicaciones.
Un problema típico que surge en el campo del control de plagas reside en la necesidad de reducir las dosis del ingrediente activo para reducir o evitar efectos ambientales o toxicológicos desfavorables y al mismo tiempo permitir un control eficaz de las plagas. Con respecto a la presente invención, el término plagas abarca plagas de animales y hongos dañinos. Por lo tanto, un objeto de la presente invención era proporcionar mezclas de pesticidas que resuelven los problemas de reducir la tasa de dosificación y/o mejorar el espectro de actividad y/o combinar la actividad de derribo con un control prolongado y/o para el manejo de la resistencia y/o promover (aumentar) la salud de las plantas.
Descripción de la invención
Por consiguiente, hemos descubierto que este objetivo se logra mediante las mezclas y composiciones definidas en el presente documento, que comprenden al menos una cepa bacteriana del géneroPaenibacillus(cepa dePaenibacillus)y un pesticida químico como se define en este documento.
Por lo tanto, la presente invención se relaciona con mezclas que comprende, como componentes activos
1) al menos una cepa dePaenibacillus;
en donde al menos una cepa dePaenibacillusse selecciona del grupo que consiste en:
A) Paenibacilluscepa Lu16774 depositada con el número de acceso DSM 26969;
B) Paenibacilluscepa Lu17007 depositada con el número de acceso DSM 26970;
C) Paenibacilluscepa Lu17015 depositada con el número de acceso DSM 26971; y
d) una cepa bacteriana que comprende una secuencia de ADN que exhibe
d1) al menos 99,6 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:9; o
d2) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:14; o
d3) al menos 99,9 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:10; o
d4) al menos 99,2 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:15; o
d5) al menos 99,2 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11; o
d6) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:16; o
d7) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:12; o
d8) al menos 99,3 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:17; o
d9) 100,0 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:13; o d10) al menos 99,9 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:18.
en donde dicha al menos una cepa dePaenibacilluses capaz de producir al menos uno de los siguientes compuestos:
en un medio de crecimiento que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno y
2) al menos un pesticida II seleccionado entre los siguientes compuestos
A) Inhibidores de la respiración
- Inhibidores del complejo III en Qo sitio: azoxistrobina (A.1.1), dimoxistrobina (A.1.4), orisastrobina (A.1.12), piraclostrobina (A.1.14), trifloxistrobina (A.1.17);
- inhibidores del complejo II: benzovindiflupir (A.3.2), bixafeno (A.3.3), fluopiram (A.3.7), fluxapiroxad (A.3.9), penflufeno (A.3.15), pentiopirad (A.3.16), sedaxano ( A.3.19);
- otros inhibidores de la respiración: siltiofam (A.4.12);
B) Inhibidores de la biosíntesis de esteroles (fungicidas SBI)
- Inhibidores de la desmetilasa C14: triazoles: difenoconazol (B.1.5), epoxiconazol (B.1.8), ipconazol (B.1.15), metconazol (B.1.17), protioconazol (B.1.23), tebuconazol (B.1.25), triadimenol. (B.1.28), triticonazol (B.1.29), 2-[4-(4-clorofenoxi)-2-(trifluorometil)fenil]-1-(1,2,4-triazol-1-il)propan-2 -ol (B.1.38), procloraz (B.1.46);
C) Inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos
- fungicidas de fenilamidas o acilaminoácidos: metalaxil (C.1.4), metalaxil-M (C.1.5);
D) Inhibidores de la división celular y del citoesqueleto
-inhibidores de tubulina: tiabendazol (D1.4), tiofanato de metilo (D1.5);
-otros inhibidores de la división celular: etaboxam (D.2.2);
E) Inhibidores de la síntesis de aminoácidos y proteínas
-inhibidores de la síntesis de metionina: pirimetanilo (E.1.3);
F) Inhibidores de la transducción de señales
-Inhibidores de MAP/histidina quinasa: fludioxonil (F.1.5);
G) Inhibidores de la síntesis de lípidos y membranas
-biosíntesis de fosfolípidos y depósito de pared celular: dimetomorfo (G.3.1);
-tio- y ditiocarbamatos: tiram (H.2.7);
K) Modo de acción desconocido
-picarbutrazox (K.1.41)
en donde la mezcla comprende el componente 1) y el componente 2) en una cantidad sinérgicamente eficaz.
Se conocen las sustancias activas denominadas componente 2), su preparación y su actividad pesticida (cf.: http://www.alanwood.net/pesticides/); estas sustancias están disponibles comercialmente. También se conocen los compuestos descritos por la nomenclatura IUPAC, su preparación y su actividad pesticida (p. ej. Can. J. Plant Sci. 48(6), 587-94, 1968; EP-A 141 317; EP-A 152031; EP-A 226917; EP-A 243970; EP-A 256503; EP-A 428941; EP-A 532022; EP-A 1028 125; EP-A 1035 122; EP-A 1201 648; EP-A 1 122244, JP 2002316902; DE 19650197; DE 10021412; DE 102005009458; US 3,296,272; US 3,325,503; WO 98/46608; WO 99/14187; WO 99/24413; WO 99/27783; WO 00/29404; WO 00/46148; WO 00/65913; WO 01/54501; WO 01/56358; WO 02/22583; WO 02/40431; WO 03/10149; WO 03/11853; WO 03/14103; WO 03/16286; WO 03/53145; WO 03/61388; WO 03/66609; WO 03/74491; WO 04/49804; WO 04/83193; WO 05/120234; WO 05/123689; WO 05/123690; WO 05/63721; WO 05/87772; WO 05/87773; WO 06/15866; WO 06/87325; WO 06/87343; WO 07/82098; WO 07/90624, WO 10/139271, WO 11/028657, WO2012/168188, WO 2007/006670, WO 2011/77514; WO13/047749, WO 10/069882, WO 13/047441, WO 03/16303, WO 09/90181, WO 13/007767, WO 13/010862, WO 13/127704, WO 13/024009, WO 13/024010 y WO 13/047441, WO 13/162072, WO 13/092224, WO 11/135833, CN 1907024, CN 1456054).
Se prefiere que las mezclas comprendan como pesticidas II compuestos fungicidas que se seleccionan independientemente entre sí de los grupos A), B), C), D), E), F), G), H) y K).
También se prefieren mezclas que contienen como componente 2) al menos un pesticida II seleccionado entre los inhibidores del complejo III en Qoh sitio en el grupo A), más preferiblemente seleccionado de compuestos (A.1.1), (A.1.4), (A.1.12), (A.1.14) y (A.1.17).
También se prefieren mezclas que contienen como componente 2) al menos un pesticida II seleccionado entre los inhibidores del complejo II del grupo A), más preferiblemente seleccionado entre los compuestos (A.3.3), (A.3.7), (A.3.9), (A.3.16) y (A.3.19).
También se prefieren mezclas que contienen como componente 2) al menos un pesticida II seleccionado entre los inhibidores de la desmetilasa C14 del grupo B), especialmente seleccionado entre los compuestos (B.1.5), (B.1.8), (B.1.17), ( B.1.23), (B.1.25), (B.1.29), (B.138) y (B.1.46).
También se prefieren mezclas que contienen como componente 2) al menos un pesticida II seleccionado entre fenilamidas y fungicidas de acilaminoácidos del grupo C), siendo (C.1.5).
También se prefieren mezclas que contienen como componente 2) al menos un pesticida II seleccionado del grupo E), siendo (E.1.3).
También se prefieren mezclas que contienen como componente 2) al menos un pesticida II seleccionado del grupo F), siendo (F.1.5).
También se prefieren mezclas que contienen como componente 2) al menos un pesticida II seleccionado del grupo G), siendo (G.3.1).
También se prefieren mezclas que contienen como componente 2) al menos un pesticida II seleccionado del grupo H), siendo (H.2.7).
También se prefieren mezclas que contienen como componente 2) al menos un pesticida II seleccionado del grupo K), siendo (K.1.41).
Como se usa en el presente documento, el término "metabolito" se refiere a cualquier componente, compuesto, sustancia o subproducto (incluidos, entre otros, metabolitos secundarios de molécula pequeña, policétidos, productos de ácido graso sintasa, péptidos no ribosómicos, péptidos ribosómicos, proteínas y enzimas) producidos. por un microorganismo (tal como hongos y bacterias, en particular las cepas de la invención) que tiene cualquier efecto beneficioso como se describe en el presente documento, tal como actividad pesticida o mejora del crecimiento de las plantas, eficiencia en el uso del agua de la planta, salud de las plantas, apariencia de las plantas, o la población de microorganismos benéficos en el suelo alrededor de la actividad vegetal en el mismo.
Como se usa en el presente documento, "aislado" se refiere a un cultivo microbiano puro separado de su origen natural, tal aislado se obtiene cultivando una única colonia microbiana. Un aislado es un cultivo puro derivado de una población silvestre heterogénea de microorganismos.
Como se usa en el presente documento, "cepa" se refiere a un aislado bacteriano o un grupo de aislados que exhiben rasgos fenotípicos y/o genotípicos pertenecientes al mismo linaje, distintos de los de otros aislados o cepas de la misma especie.
Otra realización se refiere a mezclas que comprenden como componente 1) al menos una cepa dePaenibacillus,seleccionada de
1) Lu16774 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26969,
2) Lu17007 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26970 y
3) Lu17015 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26971.
Otra realización se refiere a mezclas que comprenden como componente 1) al menos una cepa dePaenibacillus,seleccionada de
1) Paenibacillus polymyxassp.plantarumcepa Lu16774 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26969, 2)Paenibacillus polymyxassp.plantarumcepa Lu17007 depositada en DSMZ con el número de acceso. DSM 26970, y 3)Paenibacillus epiphyticuscepa Lu17015 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26971.
Además de las mezclas que comprenden como componente 1) al menos una de las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015, la invención se refiere a mezclas que comprenden como componente 1) cualquier cepa dePaenibacillusya sea derivada físicamente del depósito original de cualquiera de las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 o aislada de forma independiente, siempre que conserve al menos una de las características identificativas de las cepas depositadas. dePaenibacillusLu16774, Lu17007 y Lu17015 y comprende una secuencia de ADN que exhibe
d1) al menos 99,6 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:9; o
d2) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:14; o
d3) al menos 99,9 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:10; o
d4) al menos 99,2 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:15; o
d5) al menos 99,2 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11; o
d6) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:16; o
d7) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:12; o
d8) al menos 99,3 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:17; o
d9) 100,0%de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:13; o d10) al menos 99,9 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:18.
en donde dicha al menos una cepa dePaenibacilluses capaz de producir al menos uno de los siguientes compuestos:
en un medio de crecimiento que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno y. Tales cepas dePaenibacillusde la invención incluyen cualquier progenie de cualquiera de las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015, incluidos mutantes de dichas cepas.
El término "mutante" se refiere a un microorganismo obtenido mediante selección mutante directa pero también incluye microorganismos que han sido mutagenizados adicionalmente o manipulados de otro modo (por ejemplo, mediante la introducción de un plásmido). Por consiguiente, las realizaciones incluyen mutantes, variantes y/o derivados del microorganismo respectivo, tanto mutantes naturales como inducidos artificialmente. Por ejemplo, se pueden inducir mutantes sometiendo el microorganismo a mutágenos conocidos, tales como rayos X, radiación UV o N-metilnitrosoguanidina, utilizando métodos convencionales. Después de dichos tratamientos se puede realizar una selección de cepas mutantes que muestren las características deseadas.
Las cepas mutantes se pueden obtener mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como selección mutante directa, mutagénesis química o manipulación genética (por ejemplo, mediante la introducción de un plásmido). Estos mutantes se pueden obtener, por ejemplo, aplicando un mutágeno conocido, como por ejemplo rayos X, radiación UV o N-metil-nitrosoguanidina. Después de dichos tratamientos se puede realizar una selección de cepas mutantes que muestren las características deseadas.
Una mezcla de la invención es en particular aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana que comprende una secuencia de ADN que presenta al menos un 99,6 %, preferiblemente al menos un 99,8 %, incluso más preferiblemente al menos un 99,9 %, y en particular 100,0 % de identidad de secuencia de nucleótidos con cualquiera de las secuencias de ADNr 16S de las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015, es decir, con cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en el listado de secuencias que son SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 3.
Según una realización adicional, una mezcla de la invención es en particular una que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana que comprende una secuencia de ADN que muestra una identidad de secuencia de nucleótidos del 100% con cualquiera de las secuencias de ADNr 16S de las cepas Lu16774. Lu17007 y Lu17015, es decir, a cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en el listado de secuencias que son SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3.
Según una realización adicional, una mezcla de la invención es en particular una que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana cuya secuencia completa de ADNr 16S tiene, después de un alineamiento óptimo dentro de la ventana de secuencia alineada, al menos un 99,6 % de identidad con al menos uno de las secuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 o al menos 99,8 % de identidad con SEQ ID NO:3; preferentemente al menos un 99,8 % de identidad con al menos una de las secuencias SEQ ID NO:1, SEQ ID:2 y SEQ ID NO:3; más preferiblemente al menos un 99,9 % de identidad con al menos una de las secuencias SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3; incluso más preferiblemente más del 99,9 % de identidad con al menos una de las secuencias SEQ ID NO:1, SEQ ID:2 y SEQ ID NO:3; en particular 100 % de identidad con al menos una de las secuencias SEQ ID NO:1, SEQ ID:2 y SEQ ID NO:3.
Según otra forma de realización, una mezcla de la invención es en particular aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana seleccionada del grupo que consiste en:
a) Lu16774 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26969;
b) Lu17007 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26970;
c) Lu17015 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26971 y
d) una cepa bacteriana que comprende una secuencia de ADN que exhibe
d1) al menos 99,6 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:9; o
d2) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:14; o
d3) al menos 99,9 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:10; o
d4) al menos 99,2 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:15; o
d5) al menos 99,2 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11; o
d6) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:16; o
d7) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:12; o
d8) al menos 99,3 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:17; o
d9) 100,0 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:13; o d10) al menos 99,9 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:18.
Una mezcla de la invención es en particular aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana que comprende una secuencia de adnNADNque presenta al menos un 99,6 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:9 o que comprende una secuencia de ADN que presenta al menos un 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:14.
Según otra realización, una mezcla de la invención es aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana cuya secuencia de adnNADNcompleta tiene, después de un alineamiento óptimo dentro de la ventana de secuencia alineada, al menos un 99,6 % de identidad con al menos una de las secuencias de ADN SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:9 o al menos un 99,8 % de identidad con SEQ ID NO:14; preferentemente al menos un 99,9 % de identidad con SEQ ID NO:14; en particular 100% de identidad con SEQ ID NO:14.
Una mezcla de la invención es en particular aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana que comprende una secuencia de ADN que presenta al menos un 99,8 %, en particular 100,0 % de identidad de secuencia de nucleótidos con cualquiera de las secuencias de adnNADNde las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015, es decir, con<cualquiera de las secuencias de ADN SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:9 y>S<e>Q<ID NO: 14.>
Una mezcla de la invención es en particular aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana que comprende una secuencia de agyrBADN que presenta al menos un 99,9 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:10 o que comprende una secuencia de ADN que presenta al menos un 99,2 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:15.
Según otra realización, una mezcla de la invención es aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana cuya secuencia degyrbADN completa tiene, después de un alineamiento óptimo dentro de la ventana de secuencia alineada, al menos un 99,9 % de identidad con al menos una de las secuencias de ADN SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:10 o al menos un 99,9 % de identidad con SEQ ID NO:15; preferentemente al menos un 99,9 % de identidad con SEQ ID NO:15; en particular 100% de identidad con SEQ ID NO:15.
Una mezcla de la invención es en particular aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana que comprende una secuencia de ADN que presenta al menos un en particular 100,0 % de identidad de secuencia de nucleótidos con cualquiera de las secuencias degyrbADN de las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015, es decir, con cualquiera de las secuencias de ADN SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO: 15.
Una mezcla de la invención es en particular aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana que comprende una secuencia de recFADN que presenta al menos un 99,2 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11 o que comprende una secuencia de ADN que presenta al menos un 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:16.
Según otra realización, una mezcla de la invención es aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana cuya secuencia de recFADN completa tiene, después de un alineamiento óptimo dentro de la ventana de secuencia alineada, al menos un 99,2 % de identidad con al menos una de las secuencias de ADN SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:11 o al menos un 99,8 % de identidad con SEQ ID NO:16; preferentemente al menos un 99,9 % de identidad con SEQ ID NO:16; en particular 100% de identidad con SEQ ID NO:16.
Una mezcla de la invención es en particular aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana que comprende una secuencia de ADN que presenta al menos un 99,8 %, en particular 100,0 % de identidad de secuencia de nucleótidos con cualquiera de las secuencias de recf ADN de las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015, es decir, con<cualquiera de las secuencias de ADN SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:11 y s>E<q ID NO: 16.>
Una mezcla de la invención es en particular aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana que comprende una secuencia de arecNADN que presenta al menos un 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:12 o que comprende una secuencia de ADN que presenta al menos un 99,3 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:17.
Según otra realización, una mezcla de la invención es aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana cuya secuencia derecNADN completa tiene, después de un alineamiento óptimo dentro de la ventana de secuencia alineada, al menos un 99,9 % de identidad con al menos una de las secuencias de ADN SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:12 o al menos un 99,9 % de identidad con SEQ ID NO:17; preferentemente al menos un 99,9 % de identidad con SEQ ID NO:17; en particular 100% de identidad con SEQ ID NO:17.
Una mezcla de la invención es en particular aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana que comprende una secuencia de ADN que presenta al menos un 99,8 %, en particular 100,0 % de identidad de secuencia de nucleótidos con cualquiera de las secuencias de recN ADN de las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015, es decir, con cualquiera de las secuencias de ADN SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO: 17.
Una mezcla de la invención es en particular aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana que comprende una secuencia de arpoAADNque presenta al menos un 100,0 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:13 o que comprende una secuencia de ADN que presenta al menos un 99,9 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:18.
Según otra realización, una mezcla de la invención es aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana cuya secuencia de rpoA ADN completa tiene, después de un alineamiento óptimo dentro de la ventana de secuencia alineada, al menos un 100,0 % de identidad con al menos una de las secuencias de ADN SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:13 o al menos un 99,9 % de identidad con SEQ ID NO:18; preferentemente al menos un 99,9 % de identidad con SEQ ID NO:17; en particular 100% de identidad con SEQ ID NO:18.
Una mezcla de la invención es en particular aquella que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana que comprende una secuencia de ADN que presenta al menos un en particular 100,0 % de identidad de secuencia de nucleótidos con cualquiera de las secuencias de rpoA ADN de las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015, es decir, con cualquiera de las secuencias de ADN SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO: 18.
Otra realización se refiere a unas mezclas que comprenden como componente 1) al menos una cepa dePaenibacillus,seleccionada del grupo que consiste de:
1) cepa Lu16774 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26969,
2) cepa Lu17007 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26970,
3) cepa Lu17015 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26971 y
4) cepas que tienen al menos una de las características identificativas de una de dichas cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015.
Otra realización se refiere a mezclas que comprenden como componente 1) al menos un microorganismo seleccionado de las cepas:
1)cepa dePaenibacillusLu16774 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26969,
2)cepa dePaenibacillusLu17007 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26970 y
3)cepa dePaenibacillusLu17015 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26971;
que muestran actividad antagonista contra al menos un patógeno vegetal y siendo capaces de producir al menos una fusaricidina; o una cepa mutante de la misma que conserva dicha capacidad, es decir, que conserva dicha actividad antagonista contra al menos un patógeno vegetal, y que conserva dicha capacidad de producir al menos una fusaricidina.
La presente invención se refiere además a composiciones que comprenden las mezclas de las invenciones que comprenden las cepas como componente 1), así como al uso de dichas composiciones para controlar o suprimir patógenos de plantas o prevenir la infección por patógenos de plantas o para proteger materiales contra la destrucción de infestaciones por microorganismos dañinos, y a los métodos correspondientes que comprenden tratar los patógenos, su hábitat o los materiales o plantas a proteger contra el ataque de patógenos, o el suelo o material de propagación con una cantidad eficaz de las composiciones, cepas, caldo de cultivo completo, libre de células. extractos, medios de cultivo o fusaricidinas de fórmula I y sus sales de la invención.
Otras realizaciones de la invención se describen en la siguiente descripción detallada de la invención, las reivindicaciones y las figuras.
Una característica identificativa de las cepas dePaenibacillusdepositadas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 es que son capaces de producir al menos una fusaricidina de fórmula I, preferentemente seleccionada entre fusaricidinas1Ay1B, en particular produciendo fusaricidinas1Ay1B, que son metabolitos de las respectivas cepas.
Así, según un aspecto de la invención, las cepas dePaenibacillusdel componente 1) de las mezclas de la invención son capaces de producir al menos una fusaricidina de fórmula I, más preferiblemente producir fusaricidinas.1Ao1B, en particular produciendo fusaricidinas1Ay1B; más preferiblemente en un medio de crecimiento que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno como se define en el presente documento.
Así, según otro aspecto de la invención, las cepas dePaenibacillusdel componente 1) de las mezclas de la invención producen al menos una fusaricidina de fórmula I, más preferiblemente producen fusaricidinas.1Ao1B, en particular producen fusaricidinas1Ay1B; en un medio de crecimiento que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno como se define en el presente documento.
Otra realización de la invención se refiere a mezclas que comprenden como componente 1) al menos un microorganismo aislado seleccionado de
1)cepa dePaenibacillusLu16774 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26969,
2)cepa dePaenibacillusLu17007 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26970 y
3)cepa dePaenibacillusLu17015 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26971;
que muestra actividad antagonista contra al menos un patógeno vegetal, y que es capaz de producir al menos una fusaricidina de fórmula I, preferiblemente seleccionada entre fusaricidinas1Ay1B, en particular produciendo fusaricidinas1Ay1B; o una cepa mutante de la misma que conserva dicha capacidad, es decir, que conserva dicha actividad antagonista contra al menos un patógeno vegetal, y que conserva dicha capacidad de producir al menos una fusaricidina de fórmula I, preferiblemente seleccionada de fusaricidinas.1Ay1B, en particular produciendo fusaricidinas1Ay1B.
Otra característica identificativa de las cepas dePaenibacillusLu16774, Lu17007 y Lu17015 o una cepa mutante de las mismas es que son capaces de producir al menos una fusaricidina seleccionada del grupo que consiste en fusaricidina A, fusaricidina B, fusaricidina C, fusaricidina D, LI-F06a, LI-F06b y LI- F08b además de su capacidad de producir al menos una fusaricidina de fórmula I, preferiblemente seleccionada de fusaricidina1Ay1B, en particular produciendo fusaricidina1Ay1B.
Así, según un aspecto adicional de la invención, las cepas dePaenibacillusdel componente 1) de las mezclas de la invención son capaces de producir al menos una fusaricidina de fórmula I, preferentemente seleccionada entre fusaricidinas.1Ay1B, en particular produciendo fusaricidinas1Ay1B, como se describe en el presente documento, y son capaces de producir al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en fusaricidina A, fusaricidina B, fusaricidina C, fusaricidina D, LI-F06a, LI-F06b y Ll-F08b.
Según un aspecto adicional de la invención, las cepas dePaenibacillusdel componente 1) de las mezclas de la invención son capaces de producir al menos una fusaricidina de fórmula I, preferentemente seleccionada entre fusaricidinas.1Ay1B, en particular produciendo fusaricidinas1Ay1B, como se describe en el presente documento, y son capaces de producir al menos tres compuestos seleccionados del grupo que consiste en fusaricidina A, fusaricidina B, fusaricidina C, fusaricidina D, LI-F06a, LI-F06b y Ll-F08b.
Otra característica identificativa de las cepas dePaenibacillusson su actividad antifúngica. En particular, se descubrió que estas cepas eran eficaces contra la infestación por patógenos vegetales, incluidosAlternariaspp.,Botrytis cinerea, Phytophthora infestans,andSclerotinia sclerotiorum;dondeAlternaria spp.se selecciona preferentemente entreA. solani y A. alternas,en particular A.solani.
Así, según un aspecto adicional de la invención, las cepas dePaenibacillusdel componente 1) de las mezclas de la invención tienen actividad antifúngica, particularmente contra un patógeno vegetal seleccionado del grupo que consiste enAlternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans,yEsclerotinia sclerotiorum,dondeAlternariaspp se selecciona preferentemente entreA. solani y A. alternate,en particularA. solani.Más particularmente, las cepas dePaenibacillusde la invención tienen actividad antifúngica contra al menos dos o contra los cuatro patógenos mencionados.
Según un aspecto adicional de la invención, las cepas dePaenibacillusde la invención tienen actividad antifúngica contra los patógenos de las plantas.Alternaria solani, Botrytis cinerea, Phytophthora infestans,ySclerotinia sclerotiorum.
Actividad antagónica de lacepas de Paenibacilluscontra patógenos vegetales se puede demostrar en ensayos de confrontaciónin vitroutilizando los hongos fitopatógenos deseados comoAlternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans,ySclerotinia sclerotiorumdondeAlternariaspp se selecciona preferentemente entreA. solani y A. alternate, en particular A. solani:Como medio de crecimiento de estos hongos fitopatógenos se utiliza medio ISP2 que comprende por litro: 10 g de extracto de malta (Sigma Aldrich, 70167); 4 g de extracto de levadura Bacto (Becton Dickinson, 212750); 4 g de glucosa monohidrato (Sigma Aldrich, 16301); 20 g de Agar (Becton Dickinson, 214510), pH aproximadamente 7, Ac. bidest. Como medio de crecimiento de PHYTIN se utiliza medio V8 que comprende por litro: 200 ml de jugo de verduras, 3 g de carbonato cálcico (Merck Millipore, 1020660250); 30 g de Agar (Becton Dickinson, 214510), pH 6,8, Ac. bidest.
Las cepas dePaenibacillusse inoculan puntualmente en un lado de una placa de agar. Un bloque de agar (aprox. 0,3 cm2) que contenía un patógeno vegetal en crecimiento activo se colocó en el centro de la placa. Después de una incubación de 7 a 14 días a aproximadamente 25°C, se examina el crecimiento del patógeno vegetal, especialmente en busca de zonas de inhibición. Se pueden evaluar los siguientes efectos antagónicos: La antibiosis se califica mediante la evaluación del diámetro de la zona libre de hongos (zona de inhibición). La competencia se puntúa comparando el diámetro de crecimiento del hongo patógeno en placas con cepas bacterianas en comparación con placas de control. El micoparasitismo se puede documentar en caso de que la bacteria crezca demasiado sobre el patógeno fúngico y también el micoparásito de los patógenos. Esto se puede visualizar mediante microscopía.
Más específicamente, la presente invención se refiere a mezclas que comprenden como componente 1) al menos una cepa bacteriana seleccionada entrecepas de PaenibacillusLu16774, Lu17007 y Lu17015 y cualquier cepas dePaenibacillusque tiene una, dos, tres o más de las características de identificación de la cepa depositada, en donde las características de identificación se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) actividad antifúngica contra un patógeno vegetal seleccionado del grupo que consiste enAlternaríaspp.,Botrytis cinerea, Phytophthora infestans,ySclerotinia sclerotiorum,en dondeAlternariaspp. se selecciona preferentemente entreA. solani y A. alternate,in particularA. solani,como se divulga en este documento;
(b) la capacidad de producir al menos una fusaricidina de fórmula I, en particular fusaricidinas1Ay/o1B, como se divulga en este documento;
(c) la capacidad de producir al menos una fusaricidina seleccionada del grupo que consiste en fusaricidinas A, B, C, D, LI-F06a, LI-F06b y LI-F08b, como se describe en el presente documento; y
(d) la capacidad de producir y secretar al menos una enzima lítica seleccionada del grupo que consiste en quitinasa, celulosa y amilasa, como se describe en el presente documento.
Más preferiblemente, dicha cepa dePaenibacillustiene las capacidades denominadas (b), (c) y (d) en un medio de crecimiento que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno como se define en el presente documento.
En particular, las cepas dePaenibacillusdel componente 1) de las mezclas de la invención tienen dos o más de las características identificativas de la cepa depositada, siendo particularmente preferidas las cepas que tienen al menos las características (a) y (b). Así, según un aspecto adicional de la invención, las cepas dePaenibacillusdel componente 1) de las mezclas de la invención (a) tienen actividad antifúngica, particularmente contra un patógeno vegetal seleccionado del grupo que consiste enAlternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans,yEsclerotinia sclerotiorum,dondeAlternariaspp se selecciona preferentemente entreA. solani y A. alternate,en particularA. solani y (b) son capaces de producir al menos una fusaricidina de formula I, y particularmente fusaricidina 1B.Según otra realización preferida, las cepas dePaenibacillusdel componente 1) de las mezclas de la invención (a) tienen una actividad antifúngica contra tres o contra todos los patógenos vegetales seleccionados del grupo que consiste enAlternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans,ySclerotinia sclerotiorum,dondeAlternaria spp.se selecciona preferentemente entreA. solaniand A. alternate,en particularA. solaniand(b) son capaces de producir al menos una fusaricidina de fórmula I, más preferiblemente producir fusaricidina1Ao1B, en particular de producir fusaricidina1Ay1B.
Según una realización de la invención, las cepas dePaenibacillusdel componente 1) de las mezclas de la invención se proporcionan en forma aislada o sustancialmente purificada.
Los términos "aislado" o "sustancialmente purificado" pretenden indicar que las cepas de la invención han sido eliminadas de un entorno natural y han sido aisladas o separadas, y están al menos en un 60% libres, preferiblemente al menos en un 75% libres, y más preferentemente al menos un 90 % libre, incluso más preferentemente al menos un 95 % libre y lo más preferentemente al menos un 99 % libre de otros componentes con los que estaban asociados de forma natural. Un aislado obtenido cultivando una única colonia microbiana es un ejemplo de una cepa aislada de la invención.
Las mezclas de la invención comprenden como componente 1) el al menos una cepa dePaenibacillusen cualquier estado fisiológico como activo o inactivo. Las cepas dePaenibacilluslatentes pueden proporcionarse, por ejemplo, congeladas, secas, liofilizadas o parcialmente desecadas (los procedimientos para producir organismos parcialmente desecados se dan en WO 2008/002371) o en forma de esporas.
Según una realización de la invención, las mezclas comprenden como componente 1) la al menos una cepa dePaenibacillusen forma de esporas.
Según una realización de la invención, las mezclas comprenden como componente 1) la al menos una cepa dePaenibacillusen forma de caldo de cultivo completo.
El cultivo es preferiblemente un cultivo aislado o sustancialmente purificado.
Como se usa en el presente documento, "caldo de cultivo completo" se refiere a un cultivo líquido de un microorganismo que contiene células vegetativas y/o esporas suspendidas en el medio de cultivo y opcionalmente metabolitos producidos por el microorganismo respectivo.
Como se usa en el presente documento, "medio de cultivo" se refiere a un medio que se puede obtener cultivando el microorganismo en dicho medio, preferiblemente un caldo líquido, y que queda cuando se eliminan las células cultivadas en el medio, p. ej., el sobrenadante que queda cuando las células cultivadas en un caldo líquido se eliminan mediante centrifugación, filtración, sedimentación u otros medios bien conocidos en la técnica; que comprende por ejemplo metabolitos producidos por el respectivo microorganismo y secretados al medio de cultivo. El "medio de cultivo" al que a veces también se hace referencia como "sobrenadante" se puede obtener, por ejemplo mediante centrifugación a temperaturas de aproximadamente 2 a 30 °C (más preferiblemente a temperaturas de 4 a 20 °C) durante aproximadamente 10 a 60 min (más preferiblemente aproximadamente 15 a 30 min) a aproximadamente 5.000 a 20.000 x g (más preferiblemente a aproximadamente 15.000 xg).
Un "cultivo aislado" o "cultivo sustancialmente purificado" se refiere a un cultivo de las cepas de la invención que no incluye cantidades significativas de otros materiales que normalmente se encuentran en el hábitat natural en el que crece la cepa y/o a partir del cual la cepa normalmente se puede obtener. En consecuencia, tal "cultivo aislado" o "cultivo sustancialmente purificado" está al menos un 60% libre, preferiblemente al menos un 75% libre, y más preferiblemente al menos un 90% libre, incluso más preferiblemente al menos un 95% libre, y lo más preferiblemente al menos 99 % libre de otros materiales que normalmente se encuentran en el hábitat natural en el que crece la cepa y/o del que normalmente se puede obtener la cepa. Dicho "cultivo aislado" o "cultivo sustancialmente purificado" normalmente no incluye ningún otro microorganismo en cantidades suficientes para interferir con la replicación de la cepa de la invención.
Las cepas dePaenibacillusutilizadas en las mezclas de la invención se pueden cultivar de forma continua o discontinua en el proceso discontinuo o en el proceso discontinuo alimentado o en el proceso discontinuo alimentado repetidamente. Una revisión de los métodos de cultivo conocidos se encontrará en el libro de texto de Chmiel (Bioprocesamiento técnico 1. Introducción a la ingeniería de bioprocesos (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Biorreactores y dispositivos periféricos (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio que se utilizará para el cultivo del microorganismo debe satisfacer los requisitos de las cepas particulares de manera adecuada. Las descripciones de los medios de cultivo para diversos microorganismos se encuentran en el manual "Manual de Métodos para Bacteriología General" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington DC, EE.UU., 1981).
Estos medios utilizables según la invención comprenden generalmente una o varias fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/o oligoelementos. Las fuentes preferidas de carbono son azúcares, tales como mono, di o polisacáridos. Muy buenas fuentes de carbono son, por ejemplo, glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa. También se pueden agregar azúcares a los medios a través de compuestos complejos, como melaza u otros subproductos del refinado del azúcar. También puede resultar ventajoso añadir mezclas de diversas fuentes de carbono. Otras posibles fuentes de carbono son aceites y grasas como el aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, ácidos grasos como el ácido palmítico, ácido esteárico o ácido linoleico, alcoholes como el glicerol, metanol o etanol y ácidos orgánicos como el acético. ácido o ácido láctico. Las fuentes de nitrógeno suelen ser compuestos de nitrógeno orgánicos o inorgánicos o materiales que contienen estos compuestos. Ejemplos de fuentes de nitrógeno incluyen gas amoniaco o sales de amonio, como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes complejas de nitrógeno, como licor de maíz, harina de soja proteína de soja, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar por separado o en mezcla. Los compuestos de sales inorgánicas que pueden estar presentes en los medios comprenden las sales de cloruro, fosfato o sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, zinc, cobre y hierro. Como fuentes de azufre se pueden utilizar compuestos inorgánicos que contienen azufre, por ejemplo sulfatos, sulfitos, ditionitos, tetrationatos, tiosulfatos, sulfuros, pero también compuestos orgánicos de azufre, como por ejemplo mercaptanos y tioles. Como fuentes de fósforo se pueden utilizar ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato de dipotasio o las correspondientes sales que contienen sodio. Se pueden agregar agentes quelantes al medio para mantener los iones metálicos en solución. Agentes quelantes especialmente adecuados son dihidroxifenoles, como catecol o protocatecuato, o ácidos orgánicos, como por ejemplo ácido cítrico. Los medios de fermentación utilizados según la invención también pueden contener otros factores de crecimiento, tales como vitaminas o promotores del crecimiento, que incluyen, por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales a menudo provienen de componentes complejos del medio, tales como extracto de levadura, melaza, licor de maíz y similares. Además, se pueden añadir al medio precursores adecuados. La composición precisa de los compuestos en el medio depende en gran medida del experimento particular y debe decidirse individualmente para cada caso específico. Puede encontrar información sobre la optimización de medios en el libro de texto "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Publ. PM. Rhodes, PF. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19963577 3). Los sustratos de cultivo también se pueden obtener de proveedores comerciales, como Standard 1 (Merck) o BHI (Brain heart infusion, DIFCO), etc.
Los medios de crecimiento preferidos que pueden usarse según la invención comprenden una o más fuentes de carbono seleccionadas entre L-arabinosa, N-acetil-D-glucosamina, D-galactosa, ácido L-aspartaico, D-trehalosa, D-manosa, glicerol. , ácido D-glucónico, D-xilosa, D-manitol, D-ribosa, D-fructosa, a-D-glucosa, maltosa, D-melibiosa, timidina, ametil-D-galactósido, a-D-lactosa, lactulosa, sacarosa, uridina, ácido a-hidroxiglutárico-Y-lactona, p-metil-D-glucósido, adonitol, maltotriosa, 2-desoxiadenosina, adenosina, ácido cítrico, ácido múcico, D-celobiosa, inosina, L-serina, L-alanilglicina, ácido D-galacturónico, a-ciclodextrina, p-ciclodextrina, dextrina, inulina, pectina, amigdalina, gentiobiosa, lactitol, D-melezitosa, a-metil-D-glucósido, p-metil-D-galactósido , p-metil-D-xilosido, palatinosa, D-rafinosa, estaquiosa, turanosa, ácido Y-aminobutírico, D-gluosa-mina, ácido D-láctico, L-lisina, 3-hidroxi 2-butanona; y una o más fuentes de nitrógeno seleccionadas entre amoníaco, nitrito, nitrato, L-alaninia, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido L-glutámico, L-glutamina, glicina, dimes de aminoácidos: Ala-Asp, AlaGIn, Ala-Glu, Ala-His, Gly-Gln, Gly-Glu, Gly-Met y Met-Ala; en particular nitrato. Estos medios pueden complementarse con sales inorgánicas y vitaminas y/o oligoelementos. Las cepas son capaces de producir fusaricidinas 1A y 1B en estos medios de crecimiento.
Todos los componentes del medio se esterilizan, ya sea mediante calentamiento (20 min a 200kPa (2,0 bar) y 121°C) o mediante filtración estéril. Los componentes se pueden esterilizar juntos o, si es necesario, por separado. Todos los componentes del medio pueden estar presentes al inicio del crecimiento u, opcionalmente, pueden agregarse de forma continua o mediante alimentación por lotes.
La temperatura del cultivo normalmente está entre 15°C y 36°C, preferiblemente entre 25°C y 33°C y puede mantenerse constante o variarse durante el experimento. El valor del pH del medio debería estar en el intervalo de 5 a 8,5, preferentemente alrededor de 7,0. El valor del pH para el cultivo se puede controlar durante el cultivo añadiendo compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o agua con amoníaco o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Agentes antiespumantes, por ejemplo, los ésteres de poliglicol de ácidos grasos se pueden utilizar para controlar la formación de espuma. Para mantener la estabilidad de los plásmidos se utilizan sustancias adecuadas con acción selectiva, por ejemplo se pueden añadir antibióticos al medio. Oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, por ejemplo. el aire ambiente, se introducen en el cultivo para mantener las condiciones aeróbicas. La temperatura del cultivo es normalmente de 20°C a 45°C. El cultivo continúa hasta que se haya formado un máximo del producto deseado. Esto normalmente se logra entre 10 y 160 horas.
En particular, las cepas de la invención se pueden cultivar en un medio de una variedad de medios microbiológicos estándar tales como caldo Luria-Bertani (LB), caldo tripticasa-soja (TSB), extracto de levadura/extracto de malta/caldo de glucosa (YMG, ISP2 ) de 15°C a 36°C durante 18 a 360 h en medio líquido o en medio solidificado con agar en una placa de Petri. Puede ser necesaria aireación. Las células bacterianas (células vegetativas y esporas) se pueden lavar y concentrar (por ejemplo, mediante centrifugación a temperaturas de aproximadamente 15 a 30 °C durante aproximadamente 15 min a 7.000 x g).
Según una realización adicional, la invención también se refiere a una mezcla que comprende como componente 1) un caldo de cultivo completo que comprende una cepa dePaenibacillusen la que al menos una cepa dePaenibacillusse selecciona del grupo que consiste en:
e) Paenibacilluscepa Lu16774 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26969;
f) Paenibacilluscepa Lu17007 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26970;
g) Paenibacilluscepa Lu17015 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26971; y
h) una cepa bacteriana que comprende una secuencia de ADN que exhibe
d1) al menos 99,6%de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:9; o
d2) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:14; o
d3) al menos 99,9 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:10; o
d4) al menos 99,2 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:15; o
d5) al menos 99,2 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11; o
d6) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:16; o
d7) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:12; o
d8) al menos 99,3 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:17; o
d9) 100,0 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:13; o d10) al menos 99,9 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:18.
en donde dicha al menos una cepa dePaenibacilluses capaz de producir al menos uno de los siguientes compuestos:
en un medio de crecimiento que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno y el caldo de cultivo completo comprende al menos una fusaricidina seleccionada de fusaricidinas1Ay1B, en particular dicho caldo de cultivo completo comprende fusaricidinas1Ay1B.
Dichos metabolitos de tipo fusaricidina son secretados al medio de cultivo del respectivo microorganismo capaz de producirlo.
La invención se refiere además a composiciones agroquímicas que comprenden un auxiliar como se define a continuación y la mezcla de la invención que comprende como componente 1) al menos una cepa bacteriana como se define en cualquiera de las realizaciones preferidas anteriores, respectivamente.
Como se usa en el presente documento, "composición" en referencia a un producto (cepa microbiana, agente o formulación) de la presente invención se refiere a una combinación de ingredientes, en donde "formulación" es el proceso de usar una fórmula, tal como una receta, para un combinación de ingredientes, que se agregarán para formar la formulación. Esta composición también se denomina aquí formulación.
Las mezclas que comprenden como componente 1) las cepas bacterianas, como se define en cualquiera de las realizaciones preferidas anteriores, y como componente 2) al menos un pesticida químico como se define en cualquiera de las realizaciones preferidas anteriores; y las composiciones de la invención, respectivamente, son adecuadas como agentes antifúngicos o fungicidas. Se distinguen por una extraordinaria eficacia contra un amplio espectro de hongos fitopatógenos, incluidos los hongos del suelo, que se derivan especialmente de las clases de Plasmodiophoromycetes, Peronosporomycetes (sin. Oomycetes), Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y Deuteromycetes (sin. Fungi imperfecti). Algunos son sistémicamente eficaces y pueden utilizarse en la protección de cultivos como fungicidas foliares, fungicidas para el tratamiento de semillas y fungicidas del suelo. Además, son adecuados para combatir hongos nocivos que se encuentran, entre otros, en la madera o en las raíces de las plantas.
Las mezclas y composiciones de la invención, respectivamente, son particularmente importantes en el control de una multitud de hongos fitopatógenos en diversas plantas cultivadas, tales como cereales, por ejemplo. trigo, centeno, cebada, triticale, avena o arroz; remolacha, por ejemplo. remolacha azucarera o forrajera; frutas, tales como pepitas, frutas de hueso o frutas blandas, por ejemplo. manzanas, peras, ciruelas, melocotones, almendras, cerezas, fresas, frambuesas, moras o grosellas; plantas leguminosas, como lentejas, guisantes, alfalfa o soja; plantas oleaginosas, tales como colza, mostaza, aceitunas, girasoles, coco, granos de cacao, ricino, palma aceitera, nueces molidas o soja; cucurbitáceas, como calabazas, pepinos o melones; plantas fibrosas, como algodón, lino, cáñamo o yute; cítricos, como naranjas, limones, pomelos o mandarinas; hortalizas, tales como espinacas, lechugas, espárragos, coles, zanahorias, cebollas, tomates, patatas, cucurbitáceas o pimentón; plantas lauráceas, como el aguacate, la canela o el alcanfor; plantas energéticas y de materias primas, como maíz, soja, colza, caña de azúcar o palma aceitera; maíz; tabaco; nueces; café; té; plátanos; vides (uvas de mesa y vides de uva para jugo); brincar; césped; hoja dulce (también llamada Stevia); plantas de caucho natural o plantas ornamentales y forestales, como flores, arbustos, árboles de hoja ancha o árboles de hoja perenne, por ejemplo. coníferas; y sobre el material de propagación de plantas, tales como semillas, y el material de cultivo de estas plantas.
Preferiblemente, las mezclas y composiciones de la invención, respectivamente, se usan para controlar una multitud de hongos en cultivos de campo, tales como patatas, remolacha azucarera, tabaco, trigo, centeno, cebada, avena, arroz, maíz, algodón, soja, colza, legumbres, girasoles, café o caña de azúcar; frutas; vides; ornamentales; o verduras, como pepinos, tomates, frijoles o calabazas.
El término “material de propagación de plantas” se refiere a todas las partes generativas de la planta, tales como semillas y material vegetal vegetativo, tales como esquejes y tubérculos (por ejemplo, papas), que pueden usarse para la multiplicación de la planta. Esto incluye semillas, raíces, frutos, tubérculos, bulbos, rizomas, retoños, brotes y otras partes de plantas, incluidas plántulas y plantas jóvenes, que se trasplantarán después de la germinación o después de emerger del suelo. Estas plantas jóvenes también podrán protegerse antes del trasplante mediante un tratamiento total o parcial por inmersión o vertido.
Preferiblemente, tratamiento de materiales de propagación de plantas con las cepas, caldos de cultivo completos que comprenden dichas cepas; y las composiciones de la invención, respectivamente, se usan para controlar una multitud de hongos en cereales, tales como trigo, centeno, cebada y avena; arroz, maíz, algodón y soja.
Debe entenderse que el término "plantas cultivadas" incluye plantas que han sido modificadas mediante mejoramiento genético, mutagénesis o ingeniería genética, incluidos, entre otros, productos biotecnológicos agrícolas en el mercado o en desarrollo (cf. http://cera-gmc.org/, ver base de datos de cultivos transgénicos en el mismo). Las plantas genéticamente modificadas son plantas cuyo material genético ha sido modificado de tal manera mediante el uso de técnicas de ADN recombinante que, en circunstancias naturales, no se puede obtener fácilmente mediante cruzamiento, mutaciones o recombinación natural. Normalmente, se han integrado uno o más genes en el material genético de una planta modificada genéticamente para mejorar determinadas propiedades de la planta. Dichas modificaciones genéticas también incluyen, entre otras, modificaciones postraduccionales dirigidas a proteínas, oligopéptidos o polipéptidos, por ejemplo mediante glicosilación o adiciones de polímeros tales como restos prenilados, acetilados o farnesilados o restos de p Eg .
Plantas que han sido modificadas mediante reproducción, mutagénesis o ingeniería genética, por ejemplo se han vuelto tolerantes a aplicaciones de clases específicas de herbicidas, tales como herbicidas auxínicos como dicamba o 2,4-D; herbicidas blanqueadores tales como inhibidores de hidroxilfenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) o inhibidores de fitoeno desaturasa (PDS); inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS) tales como sulfonilureas o imidazolinonas; inhibidores de la enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), tales como glifosato; inhibidores de la glutamina sintetasa (GS) tales como glufosinato; inhibidores de la protoporfirinógeno-IX oxidasa; inhibidores de la biosíntesis de lípidos tales como inhibidores de acetil CoA carboxilasa (ACCasa); o herbicidas de oxinilo (es decir, bromoxinilo o ioxinilo) como resultado de métodos convencionales de reproducción o ingeniería genética. Además, las plantas se han vuelto resistentes a múltiples clases de herbicidas a través de múltiples modificaciones genéticas, como la resistencia tanto al glifosato como al glufosinato o tanto al glifosato como a un herbicida de otra clase, como inhibidores de ALS, inhibidores de HPPD, herbicidas auxina o inhibidores de ACCasa. Estas tecnologías de resistencia a herbicidas se describen por ejemplo, en Pest Managem. Sci. 61, 2005, 246; 61, 2005, 258; 61, 2005, 277; 61, 2005, 269; 61, 2005, 286; 64, 2008, 326; 64, 2008, 332; Weed Sci. 57, 2009, 108; Austral. J. Agricult.Res.58, 2007, 708; Science 316, 2007, 1185; y referencias citadas en los mismos. Varias plantas cultivadas se han vuelto tolerantes a los herbicidas mediante métodos convencionales de reproducción (mutagénesis), por ejemplo, Clearfield® colza de verano (Canola, BASF SE, Alemania) que es tolerante a las imidazolinonas, por ejemplo, imazamox o ExpressSun® los girasoles (DuPont, EE. UU.) son tolerantes a las sulfonilureas, por ejemplo, el Tribenuron. Se han utilizado métodos de ingeniería genética para hacer que plantas cultivadas como la soja, el algodón, el maíz, la remolacha y la colza sean tolerantes a herbicidas como el glifosato y el glufosinato, algunos de los cuales están disponibles comercialmente con los nombres comerciales RoundupReady.® (tolerante al glifosato, Monsanto, EE. UU.), Cultivo® (tolerante a imidazolinona, BASF SE, Alemania) y LibertyLink® (tolerante al glufosinato, Bayer CropScience, Alemania).
Además, también se incluyen plantas que, mediante el uso de técnicas de ADN recombinante, son capaces de sintetizar una o más proteínas insecticidas, especialmente las conocidas del género bacteriano.Bacillus,particularmente deBacillus thuringiensis,tales como 5-endotoxinas, por ejemplo CrylA(b), CrylA(c), CrylF, CrylF(a2), CryllA(b), CrylIIA, CryIIIB(b1) o Cry9c; proteínas insecticidas vegetativas (VIP), por ejemplo VIP1, VIP2, VIP3 o VlP3A; proteínas insecticidas de bacterias que colonizan nematodos, p. ej.Photorhabdusspp. oXenorhabdusspp; toxinas producidas por animales, tales como toxinas de escorpión, toxinas de arácnidos, toxinas de avispas u otras neurotoxinas específicas de insectos; toxinas producidas por hongos, tales como toxinas de Streptomycetes, lectinas de plantas, tales como lectinas de guisantes o cebada; aglutininas; inhibidores de proteinasa, tales como inhibidores de tripsina, inhibidores de serina proteasa, inhibidores de patatina, cistatina o papaína; proteínas inactivadoras de ribosomas (RIP), tales como ricina, maize-RIP, abrina, luffin, saporina o briodina; enzimas del metabolismo de esteroides, tales como 3-hidroxiesteroide oxidasa, ecdisteroide-IDP-glicosil-transferasa, colesterol oxidasas, inhibidores de ecdisona o HMG-CoA-reductasa; bloqueadores de canales iónicos, tales como bloqueadores de canales de sodio o calcio; esterasa de hormona juvenil; receptores de hormonas diuréticas (receptores de helicoquinina); estilbeno sintasa, bibencil sintasa, quitinasas o glucanasas. En el contexto de la presente invención, estas proteínas o toxinas insecticidas deben entenderse expresamente también como pretoxinas, proteínas híbridas, proteínas truncadas o modificadas de otro modo. Las proteínas híbridas se caracterizan por una nueva combinación de dominios proteicos (ver, por ejemplo WO 02/015701). Otros ejemplos de tales toxinas o plantas genéticamente modificadas capaces de sintetizar tales toxinas se describen, por ejemplo, en EP-A 374 753, Documento WO 93/007278, Documento WO 95/34656, EP-A 427529, EP-A 451 878, WO 03/18810 y WO 03/52073. Los métodos para producir tales plantas genéticamente modificadas son generalmente conocidos por el experto en la técnica y se describen, por ejemplo. en las publicaciones mencionadas anteriormente. Estas proteínas insecticidas contenidas en las plantas genéticamente modificadas confieren a las plantas que producen estas proteínas tolerancia a plagas dañinas de todos los grupos taxonómicos de artrópodos, especialmente a escarabajos (Coeloptera), insectos de dos alas (Diptera), polillas (Lepidoptera) y nematodos. (Nematoda). Las plantas genéticamente modificadas capaces de sintetizar una o más proteínas insecticidas se describen, por ejemplo, en las publicaciones mencionadas anteriormente, y algunas de las cuales están disponibles comercialmente, como YieldGard® (cultivares de maíz que producen la toxina Cry1Ab), YieldGard® Plus (cultivares de maíz que producen toxinas Cry1Ab y Cry3Bb1), Starlink® (cultivares de maíz que producen la toxina Cry9c), Herculex® RW (cultivares de maíz que producen Cry34Ab1, Cry35Ab1 y la enzima fosfinotricina-N-acetiltransferasa [PAT]); NuCOTN® 33B (cultivares de algodón que producen la toxina Cry1Ac), Bollgard® I (cultivares de algodón que producen la toxina Cry1Ac), Bollgard® II (cultivares de algodón que producen toxinas Cry1Ac y Cry2Ab2); VIPCOT® (cultivares de algodón que producen una toxina VIP); Nueva hoja® (cultivares de papa que producen la toxina Cry3A); Bt-Xtra®, NaturalezaGard®, Knockear®, mordida®, Protecta®, Bt11 (por ejemplo, Agrisure® CB) y Bt176 de Syngenta Seeds SAS, Francia, (cultivares de maíz que producen la toxina Cry1Ab y la enzima PAT), MIR604 de Syngenta Seeds SAS, Francia (cultivares de maíz que producen una versión modificada de la toxina Cry3A, cf. WO 03/018810), MON 863 de Monsanto Europe SA, Bélgica (cultivares de maíz que producen la toxina Cry3Bb1), IPC 531 de Monsanto Europe SA, Bélgica (cultivares de algodón que producen una versión modificada de la toxina Cry1Ac) y 1507 de Pioneer Overseas Corporation, Bélgica (cultivares de maíz produciendo la toxina Cry1F y la enzima PAT).
Además, también se incluyen plantas que mediante el uso de técnicas de ADN recombinante son capaces de sintetizar una o más proteínas para aumentar la resistencia o tolerancia de dichas plantas a patógenos bacterianos, virales o fúngicos. Ejemplos de tales proteínas son las denominadas "proteínas relacionadas con la patogénesis" (proteínas PR, véase, por ejemplo, EP-A 392225), genes de resistencia a enfermedades de las plantas (por ejemplo, cultivares de papa, que expresan genes de resistencia que actúan contraPhytophthora infestansderivado de la papa silvestre mexicanaSolanum bulbocastanum)o T4-lisozima (por ejemplo, cultivares de papa capaces de sintetizar estas proteínas con mayor resistencia contra bacterias comoErwinia amilvora).Los métodos para producir tales plantas genéticamente modificadas son generalmente conocidos por el experto en la técnica y se describen, por ejemplo. en las publicaciones mencionadas anteriormente.
Además, también se incluyen las plantas que, mediante el uso de técnicas de ADN recombinante, son capaces de sintetizar una o más proteínas para aumentar la productividad (por ejemplo, producción de biomasa, rendimiento de cereales, contenido de almidón, contenido de aceite o contenido de proteínas), tolerancia a la sequía, salinidad. u otros factores ambientales que limitan el crecimiento o la tolerancia a plagas y patógenos fúngicos, bacterianos o virales de esas plantas.
Además, también están cubiertas las plantas que contienen, mediante el uso de técnicas de ADN recombinante, una cantidad modificada de sustancias de contenido o nuevas sustancias de contenido, específicamente para mejorar la nutrición humana o animal, por ejemplo, cultivos oleaginosos que producen omega-3 de cadena larga que promueven la salud. ácidos grasos o ácidos grasos omega-9 insaturados (por ejemplo, Nexera® colza, DOW Agro Sciences, Canadá).
Además, también están cubiertas las plantas que contienen mediante el uso de técnicas de ADN recombinante una cantidad modificada de sustancias de contenido o nuevas sustancias de contenido, específicamente para mejorar la producción de materia prima, por ejemplo, patatas que producen mayores cantidades de amilopectina (por ejemplo,<Amflora® patata, BASF>S<e>,<Alemania).>
Las mezclas y composiciones de la invención, respectivamente, son particularmente adecuadas para controlar las siguientes enfermedades de las plantas:Albugo spp.(roya blanca) en plantas ornamentales, hortalizas (p. ej.A. cándida)y girasoles (p. ej.A. tragopogonis); Alternaría spp.(Mancha foliar de Alternaria) en hortalizas, colza (A.brasicolaobrassicae),remolacha azucarera (A.tenuis),frutas, arroz, soja, patatas (p. ej.A. solanior A.alternate), tomates (p. ej.A. solanioA. alternate)y trigo;Aphanomycesspp sobre remolacha azucarera y hortalizas;Ascochytaspp. en cereales y verduras, por ejemploA. tritici (antracnosis)sobre trigo yA. hordei encebada;BipolarisyDrechsleraspp.(teleomorfo:Cochliobolusspp.), por ejemplo, el tizón foliar meridional(D. maydis) oTizón foliar del norte(S. zeicola)en el maíz, por ejemplo, mancha(B. sorokiniana)en cereales y, por ejemplo,B. oryzaesobre arroz y césped;Blumería(antesErysiphe) graminis(mildiú polvoriento) en cereales (por ejemplo, en trigo o cebada);Botritis cinerea(teleomorfo:Botryotinia fuckeliana,moho gris) en frutas y bayas (por ejemplo, fresas), verduras (por ejemplo, lechuga, zanahoria, apio y coles), colza, flores, vides, plantas forestales y trigo;Bremia lactucae(mildiú velloso) en lechuga;Ceratociytis(sin.Ophiostoma)spp. (podredumbre o marchitez) en árboles de hoja ancha y árboles de hoja perenne, por ejemploC. ulmi( enfermedad del olmoholandés)en olmos;Cercospora spp.(Manchas foliares por Cercospora) en maíz (por ejemplo, Mancha foliar gris:C. zeae maydis),arroz, remolacha azucarera (p. ej.C. beticola),caña de azúcar, hortalizas, café, soja (p. ej.C. sojinaoC. kikuchii)y arroz;Cladosporiumspp. en tomates (por ejemploC.fulvum: moho de la hoja) y cereales, p. ej.C. herbarum(oreja negra) sobre trigo;Claviceps purpurea(ergot) en cereales;Cochliobolus(anamorfo:HelminthosporiumdeBipolaris)spp. (manchas en las hojas) en el maíz (C.carbonum),cereales (por ejemploC. sativus,anamorfo:B. Soro-chino)y arroz (p. ej.C. miyabeanus,anamorfo:H. oryzae); Colletotrichum(teleomorfo:Glomerella)spp. (antracnosis) sobre algodón (p. ej.C. gossypii),maíz (por ejemploC. graminicola:podredumbre del tallo por Anthracnose), frutos suaves, patatas (p. ej.C. coccods:punto negro), frijoles (p. ej.C. lindemuthianum)y soja (p. ej.C.truncatumoC. gloeosporioides); especies de Corticium spp.p.ejC. sasakii(tizón de la vaina) en el arroz;Corynespora cassiicola(manchas foliares) en soja y plantas ornamentales;Cycloconiumspp., por ejemploC. oleaginumen olivos;Cylindrocarponspp (por ejemplo, cancro de árboles frutales o decadencia de vides jóvenes, teleomorfo:NectriaoNeonectriaspp.) en árboles frutales, vides (p. ej.C. liriodendri,teleomorfo:Neonectria liriodendri.Enfermedad del Pie Negro) y ornamentales;Dematophora(teleomorfo:Rosellinia)necatrix (pudrición de raíces y tallos) en soja;Diaporthe spp.,p.ejD. phaseolorum(damping off) en la soja;Drechslera(syn.Helminthosporium,teleomorfo: Pyrenophora) spp. en maíz, cereales, como cebada (por ejemplo, D. teres, mancha neta) y trigo (por ejemplo, D. tritici-repentis: mancha bronceada), arroz y césped; Esca (muerte regresiva, apoplejía) en las vides, causada por Formitiporia (syn. Phellinus) punctata, F. mediterranea, Phaeomoniella chlamydospora (antes Phaeoacremonium chlamydosporum), Phaeoacremonium aleophilum y/o Botryosphaeria obtusa, Eisinoe spp. en frutos de pepita (E. pyri), frutos rojos (E. veneta: antracnosis) y vides (E. ampelina: antracnosis); Entyloma oryzae (carbón de las hojas) en arroz; Epicoccum spp. (moho negro) en trigo; Erysiphe spp. (mildiú polvoriento) en remolacha azucarera (E. betae), hortalizas (p. ej. E. pisi), como cucurbitáceas (p. ej. E. cichoracearum), coles, colza (p. ej. E. cruciferarum); Eutypa lata (cancro o muerte regresiva de Eutypa, anamorfo:Cytosporina lata,syn.Libertella bipharis)en frutales, vides y maderas ornamentales;Exserohilum(syn.Helmintosporio)spp. en maíz (por ejemploE. turcicum); Fusarium (teleomorfo:Gibberella) spp. (marchitez, pudrición de la raíz o del tallo) en diversas plantas, como F. graminearum o F. culmorum (pudrición de la raíz, sarna o tizón de la espiga) en cereales (por ejemplo, trigo o cebada), F. oxysporum en tomates, F. solani (f. sp. glicinas ahora syn. F. virguliforme) y F. tucumaniae y F. brasiliense cada uno de los cuales causa el síndrome de muerte súbita en la soja, y F. verticillioides en el maíz; Gaeumannomyces graminis (toma todo) en cereales (por ejemplo, trigo o cebada) y maíz; Gibberella spp. en cereales (p. ej. G. zeae) y arroz (p. ej. G. fujikuroi. enfermedad de Bakanae);Glomerella cingulataen vides, frutos de pepita y otras plantas yG. gossypii enalgodón; Complejo colorante de granos en arroz;Guignardia bidwellii(podredumbre negra) en vides;Gymnosporangiumspp en plantas rosáceas y enebros, por ejemplosabinae(óxido) en peras;Helminthosporiumspp (syn.Drechslera,teleomorfo:Cochliobolus)en maíz, cereales y arroz;Hemileiaspp., por ejemploH. vastatrix(roya del café) en el café;Isariopsis clavispora(syn. Cladosporium vitis) en vides; Macrophomina Phaseolina (syn. phaseoli) (pudrición de raíces y tallos) en soja y algodón; Microdochium (syn. Fusarium) nivale (moho rosa de la nieve) en cereales (por ejemplo, trigo o cebada); Microsphaera diffusa (mildiú polvoriento) en la soja; Monilinia spp., por ejemplo. M. laxa, M. fructicola y M. fructigena (tizón de las flores y las ramitas, podredumbre parda) en frutas con hueso y otras plantas rosáceas; Mycosphaerella spp. en cereales, plátanos, frutos rojos y nueces molidas, como por ejemplo. M. graminicola (anamorfo: Septoria tritici, Septoria blotch) en el trigo o M. fijiensis (enfermedad de la Sigatoka negra) en los plátanos; Peronospora spp. (mildiú velloso) en col (p. ej. P brassicae), colza (p. ej. P parasitica), cebollas (p. ej. P destructor), tabaco (P tabacina) y soja (p. ej. P manshurica); Phakopsora pachyrhizi y P meibomiae (roya de la soja) en soja; Phialophora spp. por ejemplo. en vides (p. ej. P tracheiphila y P tetraspora) y soja (p. ej. P gregata. podredumbre del tallo); Phoma lingam (pudrición de raíces y tallos) en colza y repollo y P betae (pudrición de raíces, manchas foliares y marchitez) en remolachas azucareras; Phomopsis spp. en girasoles, vides (por ejemplo, P viticola: mancha de lata y hoja) y soja (por ejemplo, pudrición del tallo: Pfaseoli,teleomorfo:Diaporthe faseolorum); Fisoderma maydis(manchas marrones) en el maíz;Phytophthoraspp.(marchitez, raíz, hoja, fruto y raíz del tallo) en diversas plantas, como pimentón y cucurbitáceas (p. ej. Pcapsici),soja (p. ej. Pmegasperma,syn. Psojae),patatas y tomates (p. ej. Pinfestans.tizón tardío) y árboles de hoja ancha (p. ej. Pramorum:muerte súbita del roble);Plasmodiophora brassicae(raíz club) en repollo, colza, rábano y otras plantas;Plasmopara spp.,p.ej Pviticola (vidmildiú velloso) en vides y Phaistediongirasoles;Podosphaera spp.(mildiú polvoriento) en plantas rosáceas, lúpulo, pepitas y frutos rojos, por ejemplo Pleucotricha enmanzanas;Polimixa spp.,por ejemplo, en cereales como la cebada y el trigo (Pgraminis)y remolacha azucarera (Pbetae)y, por lo tanto, enfermedades virales transmitidas;Pseudocercosporella herpotrichoides(mancha ocular, teleomorfo:Tapesia yal-lundae)sobre cereales, por ejemplo trigo o cebada;Pseudoperonospora(mildiú velloso) en varias plantas, por ejemplo Pcubensisen cucurbitáceas o Phumili enbrincar;Pseudopezicula tracheiphila(enfermedad del fuego rojo o "rotbrenner", anamorfo: Phialophora) en vides; Puccinia spp. (óxido) en diversas plantas,por ejemplo P triticina (roya parda o de la hoja), P striiformis (roya rayada u amarilla), P hordei (roya enana), P graminis (roya negra del tallo o) o P recondita (roya parda o de la hoja) en cereales, como por ejemplo por ejemplo. trigo, cebada o centeno, P kuehnii (roya anaranjada) en la caña de azúcar y P asparagion espárragos; Pyrenophora (anamorfo:Drechslera) tritici-repentis(mancha bronceada) en trigo o Pteres(mancha neta) en cebada;Pyriculariaspp., por ejemplo Poryzae(teleomorfo: Magnaporthe grisea, añublo del arroz) en arroz y P grisea en césped y cereales; Pythium spp. (amortiguación) en césped, arroz, maíz, trigo, algodón, colza, girasoles, soja, remolacha azucarera, hortalizas y otras plantas (p. ej. P ultimum o P aphanidermatum); Ramularia spp., por ejemplo. R. collo-cygni (manchas foliares de Ramularia, manchas foliares fisiológicas) en cebada y R. beticola en remolacha azucarera; Rhizoctonia spp. en algodón, arroz, patatas, césped, maíz, colza, patatas, remolacha azucarera, hortalizas y otras plantas diversas, por ejemplo. R. solani (pudrición de la raíz y el tallo) en la soja, R. solani (tizón de la vaina) en el arroz o R. cerealis (tizón primaveral por Rhizoctonia) en el trigo o la cebada; Rhizopus stolonifer (moho negro, podredumbre blanda) en fresas, zanahorias, repollo, vides y tomates; Rhynchosporium secalis (escaldado) en cebada, centeno y triticale; Sarocladium oryzae y S. attenuatum (pudrición de la vaina) en arroz; Sclerotinia spp. (podredumbre del tallo o moho blanco) en hortalizas y cultivos extensivos, como colza, girasoles (por ejemplo, S. sclerotiorum) y soja (por ejemplo, S. rolfsii o S. sclerotiorum); Septoria spp. en varias plantas, por ejemplo. S. glicinas (mancha marrón) en la soja, S. tritici (mancha de Septoria) en el trigo y S. (syn.Stagonospora)nodorum (mancha de Stagonospora) en cereales;Uncínula(syn. Erysiphe) necator (oídio, anamorfo:Oidio tuckeri)en vides;Setospaeriaspp.(tizón de las hojas) en el maíz (p. ej. S.turcicum,syn. Helminthosporium turcicum) y césped; Sphacelotheca spp. (carbón) en maíz (por ejemplo, S. reiliana: carbón de cabeza), sorgo y caña de azúcar; Sphaerotheca fuliginea (mildiú polvoriento) en cucurbitáceas; Spongospora subterranea (sarna polvorienta) en las patatas y, por lo tanto, transmite enfermedades virales; Stagonospora spp. sobre cereales, por ejemplo. S. nodorum (mancha de Stagonospora, teleomorfo:Leptosphaeria[syn. Phaeosphaeria] nodorum) sobre trigo; Synchytrium endobioticum en patatas (enfermedad de las verrugas de la patata); Taphrina spp., por ejemplo. T deformans (enfermedad de la curvatura de las hojas) en melocotones y T pruni (ciruela de bolsillo) en ciruelas; Thielaviopsis spp. (podredumbre negra de la raíz) en tabaco, frutas de pepita, hortalizas, soja y algodón, por ejemplo. T basicola (syn. Chalara elegans); Tilletia spp. (carbón común o carbón apestoso) en cereales, como por ejemplo. T tritici (syn. T. caries, carbón vegetal del trigo) y T. controversa ( carbón vegetal enano) en el trigo; Typhula incarnata (moho gris de la nieve) sobre cebada o trigo; Urocystis spp., por ejemplo. U. occulta (carbón del tallo) en centeno; Uromyces spp. (óxido) en vegetales, como frijoles (p. ej. U. appendiculatus, syn. U. Phaseoli) y remolacha azucarera (p. ej. U. betae); Ustilago spp. (carbón suelto) en cereales (p. ej. U. nuda y U. avaenae), maíz (p. ej. U. maydis: carbón de maíz) y caña de azúcar; Venturia spp. (sarna) en manzanas (p. ej. V. inaequalis) y peras; y Verticillium spp. (marchitez) en diversas plantas, como frutas y ornamentales, vides, frutos rojos, hortalizas y cultivos extensivos, por ejemplo. V. dahliae en fresas, colza, patatas y tomates.
Las mezclas y composiciones de la invención, respectivamente, también son adecuadas para controlar patógenos nocivos, especialmente hongos, en la protección de productos almacenados o de cosecha y en la protección de materiales. Por protección de materiales se entiende la protección de materiales técnicos y no vivos, como adhesivos, colas, madera, papel y cartón, textiles, cuero, dispersiones de pinturas, plásticos, lubricantes refrigerantes, fibras o tejidos. , contra la infestación y destrucción por microorganismos dañinos, como hongos y bacterias. En cuanto a la protección de la madera y otros materiales, se presta especial atención a los siguientes hongos dañinos: Ascomicetos tales comoOphiostoma spp., Ceratocystis spp., Aureobasidium pullulans, Sclerophoma spp., Chaetomium spp., Humicola spp., Petriella spp., Trichurus spp.;Basidiomicetos tales comoConiophora spp., Coriolus spp., Gloeophyllum spp., Lentinus spp., Pleurotus spp., Poria spp., Serpula spp.yTyromyces spp.,Deuteromicetos tales comoAspergillus spp., Cladosporium spp., Penicillium spp., Trichorma spp., Alternaria spp., Paecilomyces spp.y Zygomicetos comoMucorspp.,y además en la protección de productos almacenados y cosechas destacan las siguientes levaduras:Candida spp.ySaccharomyces cerevisiae.El método de tratamiento según la invención también se puede utilizar en el campo de la protección de productos almacenados o de cosecha contra el ataque de hongos y microorganismos. Según la presente invención, bajo el término "productos almacenados" se entienden sustancias naturales de origen vegetal o animal y sus formas procesadas, que han sido tomadas del ciclo de vida natural y para las cuales se desea una protección a largo plazo. Los productos almacenados de origen vegetal, como plantas o partes de las mismas, por ejemplo tallos, hojas, tubérculos, semillas, frutos o granos, pueden protegerse en estado recién cosechado o en forma procesada, como presecada, humedecida, triturada. , molido, prensado o tostado, proceso que también se conoce como tratamiento poscosecha. También se incluye en la definición de productos almacenados la madera, ya sea en forma de madera en bruto, como madera de construcción, postes eléctricos y barreras, o en forma de artículos terminados, como muebles u objetos de madera. Los productos almacenados de origen animal son cueros, pieles, pelos y similares. Las combinaciones según la presente invención pueden evitar efectos desventajosos tales como deterioro, decoloración o moho. Preferiblemente se entiende por productos almacenados sustancias naturales de origen vegetal y sus formas procesadas, más preferiblemente frutas y sus formas procesadas, tales como pepitas, frutas de hueso, frutos rojos y cítricos y sus formas procesadas.
Las mezclas y composiciones de la invención, respectivamente, son particularmente importantes en el control de una multitud de hongos fitopatógenos en diversas plantas cultivadas, tales como cereales, por ejemplo. trigo, centeno, cebada, triticale, avena o arroz; remolacha, por ejemplo. remolacha azucarera o forrajera; frutas, tales como pepitas, frutas de hueso o frutas blandas, por ejemplo. manzanas, peras, ciruelas, melocotones, almendras, cerezas, fresas, frambuesas, moras o grosellas; plantas leguminosas, como lentejas, guisantes, alfalfa o soja; plantas oleaginosas, tales como colza, mostaza, aceitunas, girasoles, coco, granos de cacao, ricino, palma aceitera, nueces molidas o soja; cucurbitáceas, como calabazas, pepinos o melones; plantas fibrosas, como algodón, lino, cáñamo o yute; cítricos, como naranjas, limones, pomelos o mandarinas; hortalizas, tales como espinacas, lechugas, espárragos, coles, zanahorias, cebollas, tomates, patatas, cucurbitáceas o pimentón; plantas lauráceas, como el aguacate, la canela o el alcanfor; plantas energéticas y de materias primas, como maíz, soja, colza, caña de azúcar o palma aceitera; maíz; tabaco; nueces; café; té; plátanos; vides (uvas de mesa y vides de uva para jugo); brincar; césped; hoja dulce (también llamada Stevia); plantas de caucho natural o plantas ornamentales y forestales, como flores, arbustos, árboles de hoja ancha o árboles de hoja perenne, por ejemplo. coníferas; y sobre el material de propagación de plantas, tales como semillas, y el material de cultivo de estas plantas.
Preferiblemente, las mezclas y composiciones de la invención, respectivamente, se usan para controlar una multitud de hongos en cultivos de campo, tales como patatas, remolacha azucarera, tabaco, trigo, centeno, cebada, avena, arroz, maíz, algodón, soja, colza, legumbres, girasoles, café o caña de azúcar; frutas; vides; ornamentales; o verduras, como pepinos, tomates, frijoles o calabazas.
Las mezclas inventivas y las composiciones de las mismas, respectivamente, son particularmente adecuadas para controlar los siguientes insectos dañinos del orden de lepidópteros (Lepidoptera), por ejemploAgrotis ypsilon, Agrotis segetum, Alabama argillacea, Anticarsia gemmatalis, Argyresthia conjugella, Autographa gamma, Bupalus piniarius, Cacoecia murinana, Capua reticulana, Cheimatobia brumata, Choristoneura fumiferana, Choristoneura occidentalis, Cirphis unipuncta, Cydia pomonella, Dendrolimus pini, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Earias insulana, Elasmopalpus lignosellus, Eupoecilia ambiguella, Evetria bouliana, Feltia subterranea, Galleria mellonella, Grapholitha funebrana, Grapholitha molesta, Heliothis armigera, Heliothis virescens, Heliothis zea, Hellula undalis, Hibernia defoliaria, Hyphantria cunea, Hyponomeuta malinellus, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria, Laphygma exigua, Leucoptera coffeella, Leucoptera scitella, Lithocolletis blancardella, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Lymantria monacha, Lyonetia clerkella, Malacosoma neustria, Mamestra brassicae, Orgyia pseudotsugata, Ostrinia nubilalis, Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Peridroma saucia, Phalera bucephala, Phthorimaea operculella, Phyllocnistis citrella, Pieris brassicae, Plathypena scabra, Plutella xylostella, Pseudoplusia includens, Rhyacionia frustrana, Scrobipalpula absolute, Sitotroga cerealella, Sparganothis pilleriana, Spodoptera frugiperda, Spodoptera littoralis, Spodoptera litura, Thaumatopoea pityocampa, Tortrix viridana, Trichoplusia niyZeiraphera canadensis,escarabajos (Coleoptera), por ejemploAgrilus sinuatus, Agriotes lineatus, Agriotes obscurus, Amphimallus solstitialis, Anisandrus dispar, Anthonomus grandis, Anthonomus pomorum, Atomaria linearis, Blastophagus piniperda, Blitophaga undata, Bruchus rufimanus, Bruchus pisorum, Bruchus lentis, Byctiscus betulae, Cassida nebulosa, Cerotoma trifurcate, Ceuthorrhynchus assimilis, Ceuthorrhynchus napi, Chaetocnema tibialis, Conoderus vespertinus, Crioceris asparagi, Diabrotica longicornis, Diabrotica speciosa, Diabrotica 12-punctata, Diabrotica virgifera, Diloboderus abderus, Epilachna varivestis, Epitrix hirtipennis, Eutinobothrus brasiliensis, Hylobius abietis, Hypera brunneipennis, Hypera postica, Ips typographus, Lema bilineata, Lema melanopus, Leptinotarsa decemlineata, Limonius californicus, Lissorhoptrus oryzophilus, Melanotus communis, Meligethes aeneus, Melolontha hippocastani, Melolontha melolontha, Oulema oryzae, Ortiorrhynchus sulcatus, Oryazophagus oryzae, Otiorrhynchus ovatus, Phaedon cochleariae, Phyllotreta chrysocephala, Phyllophaga sp., Phyllophaga cuyabana, Phyllophaga triticophaga, Phyllopertha horticola, Phyllotreta nemorum, Phyllotreta striolata, Popilliajaponica, Sitona lineatusySitophilus granaria,dípteros (Diptera), por ejemploAedes aegypti, Aedes vexans, Anastrepha ludens, Anopheles maculipennis, Ceratitis capitata, Chrysomya bezziana, Chrysomya hominivorax, Chrysomya macellaria, Contarinia sorghicola, Cordylobia anthropophaga, Culex pipiens, Dacus cucurbitae, Dacus oleae, Dasineura brassicae, Fannia canicularis, Gasterophilus intestinalis, Glossina morsitans, Haematobia irritans, Haplodiplosis equestris, Hylemyia platura, Hypoderma lineata, Liriomyza sativae, Liriomyza trifolii, Lucilia caprina, Lucilia cuprina, Lucilia sericata, Lycoria pectoralis, Mayetiola destructor, Musca domestica, Muscina stabulans, Oestrus ovis, Oscinella frit, Pegomya hysocyami, Phorbia antiqua, Phorbia brassicae, Phorbia coarctata, Rhagoietis cerasi, Rhagoletis pomonella, Tabanus bovinus, Tipula oleraceayTipula paludosa,trips (Thysanoptera), por ejemplo,Frankliniella fusca, Frankliniella occidentalis, Frankliniella tritici, Scirtothrips citri, Thrips oryzae, Thrips palm iyThrips tabaci,himenópteros (Hymenoptera), por ejemplo,Acromyrmex ambuguus, Acromyrmex crassispinus, Acromyrmex heiery, Acromyrmex landolti, Acromyrmex subterraneus, Athalia rosae, Atta capiguara, Atta cephalotes, Atta laevigata, Atta robusta, Atta sexdens, Atta texana, Hoplocampa minuta, Hoplocampa testudinea, Monomorium pharaonis, Solenopsis geminataySolenopsis in victa,heterópteros (Heteroptera), por ejemploAcrosternum hilare, Blissus leucopterus, Cyrtopeltis notatus, Dichelops furcatus,Dysdercus cingulatus, Dysdercus intermedius, Euchistos heros, Eurygaster integriceps, Euschistus impictiventris, Leptoglossus phyllopus, Lygus lineolaris, Lygus pratensis, Nezara viridula, Piesma quadrata, Piezodorus guildini, Solubea insularisyThyanta perditor,Hemiptera y Homoptera, por ejemplo,Acrosternum hilare, Blissus leucopterus, Cyrtopeltis notatus, Diaphorina citri, Dysdercus cingulatus, Dysdercus intermedius, Eurygaster integriceps, Euschistus impictiventris, Leptoglossus phyllopus, Lygus lineolaris, Lygus pratensis, Nezara viridula, Piesma quadrata, Solubea insularis,Thyanta perditor, Acyrthosiphon onobrychis, Adelges laricis, Aphidula nasturtii, Aphis fabae, Aphis forbesi, Aphis pomi, Aphis gossypii, Aphis grossulariae, Aphis schneideri, Aphis spiraecola, Aphis sambuci, Acyrthosiphon pisum, Aulacorthum solani, Brachycaudus cardui, Brachycaudus helichrysi, Brachycaudus persicae, Brachycaudus prunicola, Brevicoryne brassicae, Capitophorus horni, Cerosipha gossypii, Chaetosiphon fragaefolii, Cryptomyzus ribis, Dreyfusia nordmannianae, Dreyfusia piceae, Dysaphis radicola, Dysaulacorthum pseudosolani, Dysaphis plantaginea, Dysaphis pyri, Empoasca fabae, Hyalopterus pruni, Hyperomyzus lactucae, Macrosiphum avenae, Macrosiphum euphorbiae, Macrosiphon rosae, Megoura viciae, Melanaphis pyrarius, Metopoiophium dirhodum, Myzodes persicae, Myzus ascalonicus, Myzus cerasi, Myzus varians, Nasonovia ribis-nigri, Nilaparvata lugens, Pemphigus bursarius, Perkinsiella saccharicida, Phorodon humuli, Psyiia mali, Psylla piri, Rhopalomyzus ascalonicus, Rhopalosiphum maidis, Rhopalosiphum padi, Rhopalosiphum insertum, Sappaphis mala, Sappaphis mali, Schizaphis graminum, Schizoneura lanuginosa, Sitobion avenae, Trialeurodes vaporariorum, Toxoptera aurantiiand, Viteus vitifolii, Cimex lectularius, Cimex hemipterus, Reduvius senilis, Triatoma spp., y Arilus critatus,termitas (Isoptera),por ejemplo Calotermes flavicollis, Cornitermes cumulans, Heterotermes tenuis, Leucotermes flavipes, Neocapritemes opacus, Procornitermes triacifer; Reticulitermes lucifugus, Syntermes molestus, y Termes natalensis,ortópteros (Orthoptera), por ejemplo,Acheta domestica, Blatta orientalis, Blattella germanica, Forficula auricularia, Gryllotalpa grylliotalpa, Locusta migratoria, Melanoplus bivittatus, Melanoplus femur-rubrum, Melanoplus mexicanus, Melanoplus sanguinipes, Melanoplus spretus, Nomadacris septemfasciata, Periplaneta americana, Schistocerca americana, Schistocerca peregrina, Stauronotus maroccanusyTachycines asynamorus,Arachnoidea, tal como arácnidos popr ejemplo de las familias Argasidae, Ixodidae y Sarcoptidae, tal comoAmblyomma americanum, Amblyomma variegatum, Argas persicus, Boophilus annulatus, Boophilus decoloratus, Boophilus microplus, Dermacentor silvarum, Hyalomma truncatum, lxodes ricinus, Ixodes rubicundus, Ornithodorus moubata, Otobius megnini, Dermanyssus gallinae, Psoroptes ovis, Rhipicephalus appendiculatus, Rhipicephalus evertsi, Sarcoptes scabiei,yEriophyidae spp.tal comoAculus schlechtendali, Phyllocoptrata oleivorayEriophyes sheldoni; Tarsonemidae spp.tal comoPhytonemus pallidusyPolyphagotarsonemus latus; Tenuipalpidae spp.tal comoBrevipalpus phoenicis; Tetranychidae spp.tal comoTetranychus cinnabarinus, Tetranychus kanzawai, Tetranychus pacificus, Tetranychus telariusyTetranychus urticae, Panonychus ulmi, Panonychus citri,yOligonychus pratensis.En particular, las mezclas según la invención son adecuadas para combatir plagas de los órdenes Coleoptera, Lepidoptera, Thysanoptera, Homoptera, Isoptera y Orthoptera.
También son adecuados para controlar los siguientes nematodos parásitos de las plantas, como nematodos agalladores,Meloidogyne arenaria, Meloidogyne chitwoodi, Meloidogyne exigua, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanicay otras especies de Meloidogyne; nematodos del quiste,Globodera rostochiensis, Globodera pallida, Globodera tabacumy otras especies de Globodera,Heterodera avenae, Heterodera glicinas, Heterodera schachtii, Heterodera trifoliiy otras especies de Heterodera; nematodos de las agallas de las semillas,Anguina funesta, Anguina triticiy otras especies de Anguina; nematodos del tallo y las hojas,Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides fragariae, Aphelenchoides ritzemabosiy otras especies de Aphelenchoides; nematodos picantes,Belonolaimus longicaudatusy otras especies de Belonolaimus; nematodos del pino,Bursaphelenchus xylophilusy otras especies de Bursaphelenchus; nematodos anulares, especies de Criconema, especies de Criconemella, especies de Criconemoides y especies de Mesocriconema; nematodos del tallo y del bulbo, Ditylenchus destructor,Ditylenchus dipsaci, Ditylenchus myceliophagusy otras especies de Ditylenchus; nematodos punzón, especie Dolichodorus; nematodos espirales, Helicotylenchus dihystera, Helicotylenchus multicinctus y otras especies de Helicotylenchus,Rotylenchus robustusy otras especies de Rotylenchus; nematodos de la vaina, especies de Hemiciclephora y especies de Hemicriconemoides; especies de Hirshmanniella; nematodos lanza,Hoplolaimus columbus, Hoplolaimus galeatusy otras especies de Hoplolaimus; falsos nematodos agalladores, Nacobbus aber-rans y otras especies de Nacobbus; nematodos agujas,Longidorus elongatesy otras especies de Longidorus; nematodos pin, especie Paratylenchus; nematodos lesionadores,Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus coffeae, Pratylenchus curvitatus, Pratylenchus goodeyi, Pratylenchus negligus, Pratylenchus penetrans, Pratylenchus scribneri, Pratylenchus vulnus, Pratylenchus zeaey otras especies de Pratylenchus;Radinaphelenchus cocophilusy otras especies de Radinaphelenchus; nematodos excavadores, Radopholus similis y otras especies de Radopholus; nematodos reniformes, Rotylenchulus reniformis y otras especies de Rotylenchulus; Especies de escutelónema; nematodos de raíces rechonchas, Trichodorus primitivos y otras especies de Trichodorus;Paratrichodorus m inory otras especies de Paratrichodorus, nematodos acrobáticos,Tylenchorhynchus claytoni, Tylenchorhynchus dubiusy otras especies de Tylenchorhynchus y especies de Merlinius; nematodos de los cítricos,Tylenchulus semipenetransy otras especies de Tylenchulus; nematodos daga,Xiphinema americanum, Xiphinema index, Xiphinema diversicaudatumy otras especies de Xiphinema; y otras especies de nematodos fitoparásitos
En una realización igualmente preferida, la presente invención se refiere a un método para controlar plagas de animales (insectos, ácaros o nematodos), en el que las plagas de animales (insectos, ácaros o nematodos), su hábitat, zonas de reproducción, su lugar o las plantas a ser protegidos contra el ataque de plagas de animales (insectos, ácaros o nematodos) se tratan con una cantidad eficaz de una mezcla inventiva que comprende una cepas dePaenibacilluscomo se define anteriormente y pesticida II.
En general, “cantidad pesticida eficaz” significa la cantidad de las mezclas de la invención o de las composiciones que comprenden las mezclas necesarias para lograr un efecto observable en el crecimiento, incluyendo los efectos de necrosis, muerte, retraso, prevención, y eliminación, destrucción, o de otra manera disminuir la ocurrencia y actividad del organismo objetivo. La cantidad pesticida eficaz puede variar para las diversas mezclas/composiciones utilizadas en la invención. Una cantidad pesticida eficaz de las mezclas/composiciones también variará de acuerdo con las condiciones prevalecientes, tales como el efecto pesticida deseado y la duración, el clima, la especie objetivo, el locus, el modo de aplicación, y similares.
Los materiales de propagación de plantas se pueden tratar con las mezclas y composiciones de la invención de forma profiláctica ya sea durante o antes de la plantación o el trasplante.
En particular, la presente invención se refiere a un método para proteger el material de propagación de plantas contra plagas, en el que el material de propagación de plantas se trata con una cantidad eficaz de una mezcla inventiva.
En una realización igualmente preferida, la presente invención se refiere a un método para proteger el material de propagación de plantas contra hongos dañinos, en el que el material de propagación de plantas se trata con una cantidad eficaz de una mezcla inventiva.
En una realización igualmente preferida, la presente invención se refiere a un método para mejorar la salud de las plantas, en el que las plantas se tratan con una cantidad eficaz de una mezcla inventiva.
La expresión "cantidad eficaz para la salud de las plantas" denota una cantidad de las mezclas inventivas que es suficiente para lograr efectos para la salud de las plantas como se define a continuación en el presente documento. A continuación se proporciona información más ejemplar sobre cantidades, formas de aplicación y proporciones adecuadas a utilizar. De todos modos, el experto en la técnica es muy consciente del hecho de que dicha cantidad puede variar en un amplio rango y depende de diversos factores, por ejemplo la planta o material cultivado tratado y las condiciones climáticas.
Son deseables plantas más sanas ya que dan como resultado, entre otras cosas, mejores rendimientos y/o una mejor calidad de las plantas o cultivos, específicamente una mejor calidad de las partes de las plantas cosechadas. Las plantas más sanas también resisten mejor el estrés biótico y/o abiótico. Una alta resistencia contra el estrés biótico permite a su vez al experto en la técnica reducir la cantidad de pesticidas aplicados y, en consecuencia, frenar el desarrollo de resistencias contra los respectivos pesticidas.
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención era proporcionar una composición pesticida que resuelva los problemas descritos anteriormente y que debería, en particular, mejorar la salud de las plantas, en particular el rendimiento de las plantas.
El término "salud de una planta" o "sanidad vegetal" se define como una condición de la planta y/o de sus productos que está determinada por varios aspectos solos o en combinación entre sí, como el aumento del rendimiento, el vigor de la planta, la calidad de la cosecha. partes de la planta y tolerancia al estrés abiótico y/o biótico.
Hay que destacar que los efectos antes mencionados de las mezclas inventivas, es decir, una salud mejorada de la planta, también están presentes cuando la planta no está bajo estrés biótico y, en particular, cuando la planta no está bajo presión de plagas.
Para el tratamiento de semillas, p. como forma de aplicación inoculante y/o foliar, es evidente que una planta que sufre un ataque fúngico o insecticida produce una menor biomasa y conduce a un rendimiento reducido en comparación con una planta que ha sido sometida a un tratamiento curativo o preventivo contra el hongo patógeno o cualquier otra plaga relevante y que pueda crecer sin el daño causado por el factor de estrés biótico. Sin embargo, los métodos según la invención conducen a una salud vegetal mejorada incluso en ausencia de estrés biótico. Esto significa que los efectos positivos de las mezclas según la invención no pueden explicarse únicamente por la actividad pesticida de las cepas bacterianas del componente 1) y del pesticida II, sino que se basan en otros perfiles de actividad. Por consiguiente, la aplicación de las mezclas según la invención también se puede realizar sin presión de plagas.
Cada indicador de salud vegetal enumerado a continuación, que se selecciona de los grupos que consisten en rendimiento, vigor de la planta, calidad y tolerancia de la planta al estrés abiótico y/o biótico, debe entenderse como una realización preferida de la presente invención ya sea cada uno por su cuenta. propios o preferiblemente en combinación entre sí.
Según la presente invención, "mayor rendimiento" de una planta significa que el rendimiento de un producto de la planta respectiva aumenta en una cantidad mensurable con respecto al rendimiento del mismo producto de la planta producido en las mismas condiciones, pero sin la aplicación de la mezcla inventiva.
Para el tratamiento de semillas, p. como forma de aplicación inoculante y/o foliar, el aumento del rendimiento se puede caracterizar, entre otras, por las siguientes propiedades mejoradas de la planta: aumento del peso de la planta; y/o mayor altura de la planta; y/o mayor biomasa, como un mayor peso fresco (FW, por sus siglas en inglés);general y/o mayor número de flores por planta; y/o mayor rendimiento de cereales y/o frutos; y/o más macollos o brotes laterales (ramas); y/o hojas más grandes; y/o mayor crecimiento de los brotes; y/o mayor contenido de proteínas; y/o mayor contenido de aceite; y/o mayor contenido de almidón; y/o mayor contenido de pigmento; y/o mayor contenido de clorofila (el contenido de clorofila tiene una correlación positiva con la tasa de fotosíntesis de la planta y, en consecuencia, cuanto mayor es el contenido de clorofila, mayor es el rendimiento de una planta) y/o mayor calidad de una planta.
Por "cereales" y "frutas" se entiende cualquier producto vegetal que se utilice posteriormente después de la cosecha, por ejemplo, frutas en sentido estricto, hortalizas, nueces, cereales, semillas, madera (por ejemplo, en el caso de plantas silvícolas), flores (por ejemplo, en el caso de plantas de jardinería, ornamentales), etc., es decir, cualquier cosa de valor económico producida por la planta.
Según la presente invención, el rendimiento aumenta al menos un 4%. En general, el aumento del rendimiento puede ser incluso mayor, por ejemplo del 5 al 10 %, más preferiblemente del 10 al 20 %, o incluso del 20 al 30 %.
Según la presente invención, el rendimiento - si se mide en ausencia de presión de plagas - aumenta en al menos un 2 %. En general, el aumento del rendimiento puede incluso ser mayor, por ejemplo hasta un 4 % a un 5 % o incluso más.
Otro indicador del estado de la planta es su vigor. El vigor de la planta se manifiesta en varios aspectos como el aspecto visual general.
Para aplicaciones foliares, el vigor mejorado de la planta se puede caracterizar, entre otras, por las siguientes propiedades mejoradas de la planta: vitalidad mejorada de la planta; y/o crecimiento vegetal mejorado; y/o desarrollo vegetal mejorado; y/o apariencia visual mejorada; y/o soporte de plantas mejorado (menos verso/acame de la planta y/o lámina foliar más grande; y/o mayor tamaño; y/o mayor altura de la planta; y/o mayor número de macollos; y/o mayor número de brotes laterales; y/ o mayor número de flores por planta; y/o mayor crecimiento de brotes; y/o actividad fotosintética mejorada (por ejemplo, basada en una mayor conductancia estomática y/o una mayor tasa de asimilación de CO2)); y/o floración más temprana; y/o fructificación más temprana;; y/o madurez más temprana del grano; y/o macollos menos improductivos; y/o hojas basales menos muertas; y/o se necesitan menos insumos (como fertilizantes o agua); y/o hojas más verdes; y/o maduración completa bajo períodos de vegetación más cortos; y/o cosecha más fácil; y/o maduración más rápida y uniforme; y/o vida útil más larga; y/o panículas más largas; y/o retraso de la senescencia; y/o macollos más fuertes y/o más productivos; y/o mejor extractabilidad de los ingredientes; y/o calidad mejorada de las semillas (para sembrarlas en las siguientes temporadas para la producción de semillas); y/o producción reducida de etileno y/o la inhibición de su recepción por la planta.
Otro indicador del estado de la planta es la “calidad” de una planta y/o sus productos. Según la presente invención, calidad mejorada significa que ciertas características de la planta, como el contenido o la composición de ciertos ingredientes, aumentan o mejoran en una cantidad mensurable o notable con respecto al mismo factor de la planta producida en las mismas condiciones, pero sin la aplicación de las mezclas de la presente invención. La calidad mejorada se puede caracterizar, entre otras cosas, por las siguientes propiedades mejoradas de la planta o su producto: mayor contenido de nutrientes; y/o mayor contenido de proteínas; y/o mayor contenido de aceite; y/o mayor contenido de almidón; y/o mayor contenido de ácidos grasos; y/o mayor contenido de metabolitos; y/o mayor contenido de carotenoides; y/o mayor contenido de azúcar; y/o mayor cantidad de aminoácidos esenciales; y/o composición de nutrientes mejorada; y/o composición proteica mejorada; y/o composición mejorada de ácidos grasos; y/o composición de metabolitos mejorada; y/o composición de carotenoides mejorada; y/o composición de azúcar mejorada; y/o composición de aminoácidos mejorada; y/o color de fruta mejorado u óptimo; y/o color de hoja mejorado; y/o mayor capacidad de almacenamiento; y/o mejor procesabilidad de los productos cosechados.
Otro indicador del estado de la planta es la tolerancia o resistencia de la planta a factores de estrés bióticos y/o abióticos. El estrés biótico y abiótico, especialmente a largo plazo, puede tener efectos nocivos en las plantas.
El estrés biótico es causado por organismos vivos, mientras que el estrés abiótico es causado, por ejemplo, por extremos ambientales. Según la presente invención, "tolerancia o resistencia mejorada a factores de estrés biótico y/o abiótico" significa (1) que ciertos factores negativos causados por el estrés biótico y/o abiótico disminuyen en una cantidad mensurable o notable en comparación con las plantas expuestas. a las mismas condiciones, pero sin ser tratado con una mezcla inventiva y (2) que los efectos negativos no sean disminuidos por una acción directa de la mezcla inventiva sobre los factores de estrés, por ejemplo, por su acción fungicida o insecticida que destruye directamente los microorganismos o plagas, sino por una estimulación de las propias reacciones defensivas de las plantas frente a dichos factores de estrés.
Los factores negativos causados por el estrés biótico, como patógenos y plagas, son ampliamente conocidos y son causados por organismos vivos, como plantas competidoras (por ejemplo, malas hierbas), microorganismos (como hongos y/o bacterias fitopatógenos) y/o virus.
Los factores negativos causados por el estrés abiótico también son bien conocidos y a menudo se pueden observar como un vigor reducido de la planta (ver arriba), por ejemplo: menor rendimiento y/o menos vigor; ambos efectos pueden ser hojas quemadas, menos flores, maduración pre-madura, madurez tardía del cultivo, valor nutricional reducido, entre otros.
El estrés abiótico puede ser causado, por ejemplo, por: temperaturas extremas como el calor o el frío (estrés por calor/estrés por frío); y/o fuertes variaciones de temperatura; y/o temperaturas inusuales para la estación específica; y/o sequía (estrés por sequía); y/o humedad extrema; y/o alta salinidad (estrés salino); y/o radiación (por ejemplo mediante una mayor radiación UV debido a la disminución de la capa de ozono); y/o aumento de los niveles de ozono (estrés por ozono); y/o contaminación orgánica (por ejemplo, por cantidades fitotóxicas de pesticidas); y/o contaminación inorgánica (por ejemplo, por contaminantes de metales pesados).
Como resultado de factores de estrés bióticos y/o abióticos, la cantidad y la calidad de las plantas estresadas disminuyen. En lo que respecta a la calidad (como se define anteriormente), el desarrollo reproductivo suele verse gravemente afectado con consecuencias en los cultivos que son importantes para frutos o semillas. La síntesis, acumulación y almacenamiento de proteínas se ven afectados principalmente por la temperatura; el crecimiento se ve frenado por casi todos los tipos de estrés; La síntesis de polisacáridos, tanto estructural como de almacenamiento, se reduce o modifica: estos efectos se traducen en una disminución de la biomasa (rendimiento) y en cambios en el valor nutricional del producto.
Como ya se ha señalado anteriormente, los indicadores anteriormente identificados para la afección de la salud de una planta pueden ser interdependientes y pueden ser consecuencia unos de otros. Por ejemplo, una mayor resistencia al estrés biótico y/o abiótico puede conducir a un mejor vigor de la planta, por ejemplo a mejores y mayores cosechas y, por tanto, a un mayor rendimiento. Inversamente, un sistema radicular más desarrollado puede resultar en una mayor resistencia al estrés biótico y/o abiótico. Sin embargo, estas interdependencias e interacciones no se conocen ni se comprenden completamente y, por lo tanto, los diferentes indicadores se describen por separado.
En una realización, las mezclas inventivas producen un mayor rendimiento de una planta o su producto. En otra realización, las mezclas inventivas producen un mayor vigor de una planta o su producto. En otra realización, las mezclas inventivas producen una mayor calidad de una planta o su producto. En otra realización más, las mezclas inventivas efectúan una mayor tolerancia y/o resistencia de una planta o su producto contra el estrés biótico. En otra realización más, las mezclas inventivas efectúan una mayor tolerancia y/o resistencia de una planta o su producto contra el estrés abiótico.
La invención también se refiere a composiciones agroquímicas que comprenden un auxiliar y al menos una cepa dePaenibacilluscomo se define en el presente documento, o un extracto libre de células de la misma o al menos un metabolito de la misma, y al menos un pesticida II según la invención.
Una composición agroquímica comprende una cantidad fungicida o insecticidamente eficaz de al menos una cepas dePaenibacilluscomo se define en el presente documento, o un extracto libre de células de la misma o al menos un metabolito de la misma, y al menos un pesticida II. El término "cantidad eficaz" denota una cantidad de la composición o de al menos una cepa dePaenibacilluscomo se define en el presente documento, o un extracto libre de células de la misma o al menos un metabolito de la misma, y al menos un pesticida II, que es suficiente para promover la sanidad vegetal, controlar hongos nocivos o plagas nocivas en plantas cultivadas o en la protección de materiales y que no resulte en un daño sustancial a las plantas o materiales tratados. Tal cantidad puede variar en un amplio rango y depende de diversos factores, tales como las especies de hongos o plagas a controlar, la planta o material cultivado tratado y las condiciones climáticas.
El al menos una cepa dePaenibacilluscomo se define en el presente documento, o un extracto libre de células de la misma o al menos un metabolito de la misma, y al menos un pesticida II se pueden convertir en tipos habituales de composiciones agroquímicas, por ejemplo soluciones, emulsiones, suspensiones, polvos, pastas, gránulos, prensados, cápsulas y mezclas de los mismos. Ejemplos de tipos de composición son las suspensiones (por ejemplo,<s>C, OD, FS), concentrados emulsionables (por ejemplo, EC), emulsiones (por ejemplo, EW, EO, ES, ME), cápsulas (por ejemplo, CS, ZC), pastas, pastillas, polvos humectables o polvos (por ejemplo, W p, SP, WS, DP, DS), prensados (por ejemplo, BR, TB, DT), gránulos (por ejemplo, WG, SG, GR, FG, GG, MG), artículos insecticidas (por ejemplo, LN), así como formulaciones en gel para el tratamiento de materiales de propagación de plantas, tales como semillas (por ejemplo, GF). Estos y otros tipos de composiciones se definen en “Catalogue of pesticide formulation types and international coding system", Technical Monograph No. 2, 6° Ed. Mayo 2008, CropLife International.
Las mezclas de la invención se pueden formular como inoculante para una planta. El término "inoculante" significa una composición que incluye una cepa aislada de la invención y opcionalmente un vehículo, que puede incluir un medio biológicamente aceptable.
Dichos inoculantes y otras composiciones adecuadas se pueden preparar como composiciones que comprenden además de los ingredientes activos al menos un auxiliar (ingrediente inerte) por medios habituales (ver, por ejemplo, H.D. Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998).
Para producir una formulación seca, se pueden suspender células bacterianas, preferiblemente esporas, en un vehículo seco adecuado (por ejemplo, arcilla). Para producir una formulación líquida, las células, preferiblemente esporas, se pueden resuspender en un vehículo líquido adecuado (por ejemplo, a base de agua) hasta la densidad de esporas deseada. El número de densidad de esporas por ml se puede determinar identificando el número de unidades formadoras de colonias (UFC) en medio agar, por ejemplo agar patata dextrosa después de incubación durante varios días a temperaturas de aproximadamente 20 a aproximadamente 30°C.
De acuerdo con una realización, los componentes individuales de la composición de acuerdo con la invención, tales como partes de un kit o partes de un mezcla binaria o ternaria, pueden ser mezclados por el propio usuario en un tanque de pulverización y otros auxiliares pueden ser añadidos, si corresponde. Cuando los microorganismos vivos, como las cepas dePaenibacillusde la invención, forman parte de dicho kit, se debe tener cuidado de que la elección y las cantidades de las otras partes del kit (por ejemplo, agentes pesticidas químicos) y de los auxiliares adicionales no influyan en la viabilidad de los pesticidas microbianos en la composición. mezclado por el usuario. Especialmente en el caso de bactericidas y disolventes se debe tener en cuenta la compatibilidad con el respectivo pesticida microbiano.
Las cepas dePaenibacillustal como se definen en el presente documento, los caldos de cultivo completos, los extractos libres de células, los medios de cultivo y/o las fusaricidinas de fórmula I, junto con al menos un pesticida, se pueden convertir en tipos habituales de composiciones agroquímicas, por ejemplo soluciones, emulsiones, suspensiones, polvos, pastas, gránulos, prensas, cápsulas y mezclas de los mismos. Ejemplos de tipos de composición son las suspensiones (por ejemplo, SC, OD, FS), concentrados emulsionables (por ejemplo, EC), emulsiones (por ejemplo, EW, EO, ES, ME), cápsulas (por ejemplo, CS, ZC), pastas, pastillas, polvos humectables o polvos (por ejemplo, W<p>, SP, WS, DP, DS), prensados (por ejemplo, BR, TB, DT), gránulos (por ejemplo, WG, SG, GR, FG, GG, MG), artículos insecticidas (por ejemplo, LN), así como formulaciones en gel para el tratamiento de materiales de propagación de plantas, tales como semillas (por ejemplo, GF). Estos y otros tipos de composiciones se definen en “Catalogue of pesticide formulation types and international coding system", Technical Monograph No. 2, 6° Ed. Mayo 2008, CropLife International.
Las composiciones se preparan de una manera conocida, tal como se describe por Mollet and Grubemann, Formulation technology, Wiley VCH, Weinheim, 2001; o Knowles, New developments in crop protection product formulation, Agrow Reports DS243, T&F Informa, London, 2005.
Los auxiliares adecuados son los disolventes, portadores líquidos, portadores sólidos o materiales de relleno, tensoactivos, dispersantes, emulsionantes, humectantes, adyuvantes, solubilizantes, potenciadores de la penetración, coloides protectores, agentes de adhesión, espesantes, agentes retenedores de humedad, repelentes, atrayentes, estimulantes de la alimentación, compatibilizantes, bactericidas, anticongelantes, antiespumantes, colorantes, adhesivos y aglutinantes.
Los disolventes y portadores líquidos adecuados son el agua y los disolventes orgánicos, tales como las fracciones de aceite mineral de punto de ebullición medio a alto, por ejemplo, queroseno, gasóleo; aceites de origen vegetal o animal; hidrocarburos alifáticos, cíclicos y aromáticos, por ejemplo, tolueno, parafina, tetrahidronaftaleno, naftalenos alquilados; alcoholes, por ejemplo, etanol, propanol, butanol, alcohol bencílico, ciclohexanol; glicoles; DMSO; cetonas, por ejemplo, ciclohexanona; ésteres, por ejemplo, lactatos, carbonatos, ésteres de ácidos grasos, gamma-butirolactona; ácidos grasos; fosfonatos; aminas; amidas, por ejemplo, N-metilpirrolidona, dimetilamidas de ácidos grasos; y mezclas de los mismos.
Los portadores sólidos o materiales de relleno adecuados son las tierras minerales, por ejemplo, silicatos, geles de sílice, talco, caolines, caliza, cal, tiza, arcillas, dolomita, tierra de diatomeas, bentonita, sulfato de calcio, sulfato de magnesio, óxido de magnesio; polisacáridos en polvo, por ejemplo, celulosa, almidón; fertilizantes, por ejemplo, sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, ureas; productos de origen vegetal, por ejemplo, harina de cereales, harina de corteza de árbol, harina de madera, harina de cáscara de nuez, y mezclas de los mismos.
Los tensoactivos adecuados son compuestos activos superficiales, tales como tensoactivos aniónicos, catiónicos, no iónicos y anfotéricos, polímeros en bloque, polielectrolitos, y mezclas de los mismos. Tales tensoactivos se pueden utilizar como emusificador, dispersante, solubilizante, humectante, potenciador de la penetración, coloide protector o adyuvante. Se enumeran ejemplos de tensioactivos en McCutcheon, Vol.1: Emulsifiers & Detergents, McCutcheon's Directories, Glen Rock, USA, 2008 (International Ed. or North American Ed.).
Los tensoactivos aniónicos adecuados son sales alcalinas, alcalinotérreas o amónicas de sulfonatos, sulfatos, fosfatos, carboxilatos, y mezclas de los mismos. Ejemplos de sulfonatos son los alquilarilsulfonatos, difenilsulfonatos, sulfonatos de alfa-olefina, sulfonatos de lignina, sulfonatos de ácidos grasos y aceites, sulfonatos de alquilfenoles etoxilados, sulfonatos de arilfenoles alcoxilados, sulfonatos de naftalenos condensados, sulfonatos de dodecilbencenos y tridecilbencenos, sulfonatos de naftalenos y alquilnaftalenos, sulfosuccinatos o sulfosuccinamatos. Ejemplos de sulfatos son los sulfatos de ácidos grasos y aceites, de alquilfenoles etoxilados, de alcoholes, de alcoholes etoxilados, o de ésteres de ácidos grasos. Ejemplos de fosfatos son los ésteres de fosfato. Ejemplos de carboxilatos son alquilcarboxilatos, alcohol carboxilado o etoxilatos de alquilfenol.
Los tensoactivos no iónicos adecuados son alcoxilatos, amidas de ácidos grasos sustituidos en N, óxidos de amina, ésteres, tensoactivos a base de azúcar, tensoactivos poliméricos, y mezclas de los mismos. Ejemplos de alcoxilatos son compuestos tales como alcoholes, alquilfenoles, aminas, amidas, arilfenoles, ácidos grasos o ésteres de ácidos grasos que han sido alcoxilados con 1 a 50 equivalentes. Se puede emplear óxido de etileno y/u óxido de propileno para la alcoxilación, preferiblemente óxido de etileno. Ejemplos de amidas de ácidos grasos N sustituidas son las glucamidas de ácidos grasos o las alcanolamidas de ácidos grasos. Ejemplos de ésteres son los ésteres de ácidos grasos, ésteres de glicerol o monoglicéridos. Ejemplos de tensoactivos a base de azúcar son los sorbitanos, sorbitanos etoxilados, sacarosa y ésteres de glucosa, o alquilpoliglucósidos. Ejemplos de tensoactivos poliméricos son homo- o copolímeros de vinilpirrolidona, vinilalcoholes o vinilacetato.
Los tensoactivos catiónicos adecuados son los tensoactivos cuaternarios, por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario con uno o dos grupos hidrófobos, o sales de aminas primarias de cadena larga. Los tensoactivos anfotéricos adecuados son alquilbetaínas e imidazolinas. Los polímeros en bloque adecuados son polímeros en bloque tipo A-B o A-B-A que comprenden bloques de óxido de polietileno y óxido de polipropileno, o tipo A-B-C que comprende alcanol, óxido de polietileno y óxido de polipropileno. Los polielectrolitos adecuados son poliácidos o polibases. Ejemplos de poliácidos son las sales alcalinas de poliacrílico o polímeros peine de poliácido. Ejemplos de polibases son las polivinilaminas o polietilenaminas.
Los adyuvantes adecuados son compuestos que tienen por sí mismos una actividad pesticida insignificante o incluso nula, y que mejoran el comportamiento biológico del extracto libre de células, medio de cultivo o metabolito sobre el objetivo. Algunos ejemplos son tensoactivos, aceites minerales o vegetales y otros auxiliares. Otros ejemplos se enumeran en Knowles, Adjuvants and Additives, Agrow Reports DS256, T&F Informa UK, 2006, capítulo 5.
Los espesantes adecuados son polisacáridos (por ejemplo, goma xantana, carboximetilcelulosa), arcillas anorgánicas (modificadas orgánicamente o no modificadas), policarboxilatos y silicatos.
Los bactericidas adecuados son los derivados de bronopol e isotiazolinona, tales como alquiisotiazolinonas y bencisotiazolinonas. Los agentes anticongelantes adecuados son etilenglicol, propilenglicol, urea y glicerina. Los agentes antiespumantes adecuados son siliconas, alcoholes de cadena larga y sales de ácidos grasos. Los colorantes adecuados (por ejemplo, en rojo, azul o verde) son pigmentos de baja solubilidad en agua y tintes solubles en agua. Algunos ejemplos son colorantes inorgánicos (por ejemplo, óxido de hierro, óxido de titanio, hexacianoferrato de hierro) y colorantes orgánicos (por ejemplo, colorantes alizarina, azoína y ftalocianina). Los adhesivos o aglutinantes adecuados son polivinilpirrolidones, polivinilacetatos, alcoholes polivinílicos, poliacrilatos, ceras biológicas o sintéticas, y éteres de celulosa.
Cuando los microorganismos vivos, como las cepas bacterianas del géneroPaenibacillusen forma de células o esporas, forman parte de las composiciones, dichas composiciones se pueden preparar como composiciones que comprenden además de los ingredientes activos al menos un auxiliar (ingrediente inerte) por medios habituales (ver, por ejemplo, H.D. Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998). Tipos habituales adecuados de tales composiciones son suspensiones, polvos, pastas, granulados, prensados, cápsulas y mezclas de los mismos. Ejemplos de tipos de composición son suspensiones (p. ej. SC, OD, FS), cápsulas (p. ej. c S, ZC), pastas, pastillas, polvos o polvos humectables (p. ej. WP, SP, WS, DP, DS), prensados (p. ej. BR, TB , D<t>), gránulos (p. ej. WG, SG, G<r>, FG, GG, MG), artículos insecticidas (p. ej. LN), así como formulaciones en gel para el tratamiento de materiales de propagación de plantas tales como semillas (p. ej. GF). Aquí, se debe tener en cuenta que cada tipo de formulación o elección de auxiliar no debe influir en la viabilidad del microorganismo durante el almacenamiento de la composición y cuando finalmente se aplica al suelo, planta o material de propagación de plantas. Las formulaciones adecuadas se mencionan, por ejemplo, en WO 2008/002371, Estados Unidos 6.955.912, Estados Unidos 5.422.107.
Ejemplos de auxiliares adecuados son los mencionados anteriormente en el presente documento, en los que se debe tener cuidado de que la elección y las cantidades de dichos auxiliares no influyan en la viabilidad de los pesticidas microbianos en la composición. Especialmente en el caso de bactericidas y disolventes se debe tener en cuenta la compatibilidad con el respectivo pesticida microbiano. Además, las composiciones con pesticidas microbianos pueden contener además estabilizadores o nutrientes y protectores UV. Estabilizadores o nutrientes adecuados son, por ejemplo, alfa-tocoferol, trehalosa, glutamato, sorbato de potasio, diversos azúcares como glucosa, sacarosa, lactosa y maltodextrina (H.D. Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998). Los protectores UV adecuados son por ejemplo compuestos inorgánicos como dióxido de titanio, óxido de zinc y pigmentos de óxido de hierro o compuestos orgánicos como benzofenonas, benzotriazoles y feniltriazinas. Las composiciones pueden, además de los auxiliares mencionados para las composiciones en el presente documento, comprender opcionalmente de 0,1 a 80 % de estabilizadores o nutrientes y de 0,1 a 10 % de protectores UV.
Las composiciones agroquímicas generalmente comprenden entre 0,01 y 95%, preferiblemente entre 0,1 y 90%, y en particular entre 0,5 y 75%, en peso de principio activo. Los principios activos se emplean en una pureza de 90 % a 100 %, preferiblemente de 95 % a 100 % (de acuerdo con el espectro de RMN).
Ejemplos de tipos de composición y su preparación son:
i) Concentrados solubles en agua (SL, LS) Se disuelven del 10 al 60 % en peso de una mezcla de la invención y del 5 al 15 % en peso de agente humectante (p. ej., alcoxilatos de alcohol) en agua y/o en un disolvente soluble en agua (p. ej. alcoholes) hasta 100% en peso. El principio activo se disuelve al diluirlo con agua.
ii) Concentrados dispersables (DC) Se disuelven 5-25 % en peso de una mezcla de la invención y 1-10 % en peso de dispersante (por ejemplo, polivinilpirrolidona) en disolvente orgánico (por ejemplo, ciclohexanona) hasta 100 % en peso. La dilución con agua da una dispersión.
iii) Concentrados emulsionables (EC) Se disuelven del 15 al 70 % en peso de una mezcla de la invención y del 5 al 10 % en peso de emulsionantes (por ejemplo, dodecilbencenosulfonato de calcio y etoxilato de aceite de ricino) en un disolvente orgánico insoluble en agua (por ejemplo, hidrocarburo aromático) hasta 100% en peso. La dilución con agua proporciona una emulsión.
iv) Emulsiones (EW, EO, ES) Se disuelven 5-40% en peso de una mezcla de la invención y 1-10% en peso de emulsionantes (por ejemplo, dodecilbencenosulfonato de calcio y etoxilato de aceite de ricino) en 20-40% en peso de disolvente orgánico insoluble en agua. (por ejemplo, hidrocarburo aromático). Este mezcla se introduce en hasta un 100 % en peso de agua mediante una máquina emulsionante y se convierte en una emulsión homogénea. La dilución con agua proporciona una emulsión.
v) Suspensiones (SC, OD, FS) En un molino de bolas agitado, se tritura del 20 al 60 % en peso de una mezcla de la invención con la adición del 2 al 10 % en peso de dispersantes y agentes humectantes (por ejemplo, lignosulfonato de sodio y etoxilato de alcohol). 0,1-2% en peso de espesante (por ejemplo, goma xantana) y agua hasta 100% en peso para dar una suspensión fina de sustancia activa. La dilución con agua proporciona una suspensión estable del principio activo. Para composiciones de tipo FS, se añade hasta un 40 % en peso de aglutinante (por ejemplo, alcohol polivinílico). vi) Gránulos dispersables en agua y gránulos solubles en agua (WG, SG) 50-80% en peso de una mezcla de la invención se muelen finamente con la adición de dispersantes y agentes humectantes (por ejemplo, lignosulfonato de sodio y etoxilato de alcohol) hasta 100% en peso y preparado como gránulos dispersables en agua o solubles en agua mediante aparatos técnicos (por ejemplo, extrusión, torre de pulverización, lecho fluidizado). La dilución con agua proporciona una disolución estable del principio activo.
vii) Polvos dispersables en agua y polvos solubles en agua (WP, SP, WS) Se muelen del 50 al 80 % en peso de una mezcla de la invención en un molino de rotor-estator con la adición de 1 al 5 % en peso de dispersantes (por ejemplo, lignosulfonato de sodio), 1-3% en peso de agentes humectantes (por ejemplo, etoxilato de alcohol) y vehículo sólido (por ejemplo, gel de sílice) hasta 100% en peso. La dilución con agua proporciona una disolución estable del principio activo. viii) Gel (GW, GF) En un molino de bolas agitado, se tritura entre el 5 y el 25 % en peso de una mezcla de la invención con la adición de entre el 3 y el 10 % en peso de dispersantes (por ejemplo, lignosulfonato de sodio), entre el 1 y el 5 % en peso de espesante (por ejemplo, carboximetilcelulosa) y agua al 100% en peso para dar una suspensión fina de la sustancia activa. La dilución con agua proporciona una suspensión estable del principio activo.
ix) Microemulsión (ME) Se añaden del 5 al 20 % en peso de una mezcla de la invención a una mezcla de disolventes orgánicos del 5 al 30 % en peso (por ejemplo, dimetilamida de ácido graso y ciclohexanona), a una mezcla de tensioactivos del 10 al 25 % en peso (por ejemplo, etoxilato de alcohol y arilfenol). etoxilato) y agua al 100 %. Este mezcla se agita durante 1 h para producir espontáneamente una microemulsión termodinámicamente estable.
x) Microcápsulas (CS)
Una fase de aceite que comprende 5-50 % en peso de un compuesto de la invención, 0-40 % en peso de disolvente orgánico insoluble en agua (por ejemplo, hidrocarburos aromáticos), 2-15 % en peso de monómeros acrílicos (por ejemplo, metilmetacrilato, ácido metacrílico y un di- o triacrilato) se dispersan en una disolución acuosa de un coloide protector (por ejemplo, alcohol polivinílico)- La polimerización radical iniciada por un iniciador de radical da como resultado la formación de microcápsulas de poli(met)acrilato.
Alternativamente, una fase de aceite que comprende 5-50 % en peso de un compuesto de fórmula (I), 0-40 % en peso de disolvente orgánico insoluble de agua (por ejemplo, hidrocarburo aromático) y un monómero isocianato (por ejemplo, difenilmeteno-4,4'-diisocianatos) se dispersan en una disolución acuosa de un coloide protector (por ejemplo, alcohol polivinílico). La adición de una poliamina (por ejemplo, hexametilenediamina) da como resultado la formación de una microcápsula de poliurea. Los monómeros ascienden a 1-10 % en peso. El % en peso se relaciona con la composición total de CS.
xi) Polvos espolvoreables (DP, DS) 1-10% en peso de un caldo de cultivo completo, extracto libre de células, medio de cultivo o metabolito de la invención se muelen finamente y se mezclan íntimamente con un vehículo sólido (por ejemplo, caolín finamente dividido) hasta 100% en peso.
xii) Gránulos (GR, FG) Se muelen finamente entre 0,5 y 30 % en peso de un caldo de cultivo completo, extracto libre de células, medio de cultivo o metabolito de la invención y se asocian con un vehículo sólido (por ejemplo, silicato) hasta un 100 % en peso. La granulación se logra mediante extrusión, secado por aspersión o lecho fluidizado.
xiii) Líquidos de volumen ultrabajo (UL) del 1 al 50 % en peso de un caldo de cultivo completo, extracto libre de células, medio de cultivo o metabolito de la invención se disuelven en disolvente orgánico (por ejemplo, hidrocarburo aromático) hasta el 100 % en peso.
Las composiciones de tipos i) a xiii) pueden comprender opcionalmente auxiliares adicionales, tales como 0,1-1 % en peso de bactericidas, 5-15 % en peso de agentes anticongelantes, 0,1-1 % en peso de agentes antiespumantes y 0,1-1 % en peso de colorantes. .
Soluciones para tratamiento de semillas (LS), suspoemulsiones (SE), concentrados fluidos (FS), polvos para tratamiento en seco (DS), polvos dispersables en agua para tratamiento de lodos (WS), polvos solubles en agua (SS), emulsiones (ES) , los concentrados emulsionables (EC) y los geles (GF) se emplean habitualmente para el tratamiento de materiales de propagación de plantas, en particular semillas.
Ejemplos preferidos de tipos de formulación de tratamiento de semillas o aplicación al suelo para composiciones premezcladas son de tipo WS, LS, ES, FS, WG o CS.
Normalmente, una formulación premezcla para aplicación de tratamiento de semillas comprende del 0,5 al 99,9 por ciento, especialmente del 1 al 95 por ciento, de los ingredientes deseados, y del 99,5 al 0,1 por ciento, especialmente del 99 al 5 por ciento, de un adyuvante sólido o líquido (incluido, por ejemplo). por ejemplo, un disolvente tal como agua), donde los auxiliares pueden ser un tensioactivo en una cantidad de 0 a 50 por ciento, especialmente de 0,5 a 40 por ciento, basado en la formulación de premezcla. Mientras que los productos comerciales se formularán preferiblemente como concentrados (por ejemplo, composición de premezcla (formulación)), el usuario final normalmente empleará formulaciones diluidas (por ejemplo, composición de mezcla en tanque).
Los métodos de tratamiento de semillas para aplicar o tratar las cepas, caldos de cultivo completos, extractos libres de células, medios de cultivo, fusaricidinas de fórmula I y composiciones de la invención, respectivamente, al material de propagación de plantas, especialmente semillas, son conocidos en la técnica e incluyen Métodos de aplicación de apósito, recubrimiento, recubrimiento con película, granulación y remojo del material de propagación. Tales métodos también son aplicables a las combinaciones según la invención. En una realización preferida, las mezclas y composiciones de la invención, respectivamente, se aplican o tratan sobre el material de propagación de plantas mediante un método tal que la germinación no se vea afectada negativamente. Por consiguiente, ejemplos de métodos adecuados para aplicar (o tratar) un material de propagación de plantas, tal como una semilla, son el tratamiento de semillas, el recubrimiento de semillas o la granulación de semillas y similares.
Se prefiere que el material de propagación de plantas sea una semilla, un trozo de semilla (es decir, un tallo) o un bulbo de semilla.
Aunque se cree que el presente método puede aplicarse a una semilla en cualquier estado fisiológico, se prefiere que la semilla esté en un estado suficientemente duradero como para que no sufra daños durante el proceso de tratamiento. Normalmente, la semilla sería una semilla que se había cosechado en el campo; retirado de la planta; y separado de cualquier mazorca, tallo, cáscara exterior y pulpa circundante u otro material vegetal que no sea semilla. Preferiblemente, la semilla también sería biológicamente estable en la medida en que el tratamiento no causaría daño biológico a la semilla. Se cree que el tratamiento se puede aplicar a la semilla en cualquier momento entre la cosecha de la semilla y la siembra de la semilla o durante el proceso de siembra (aplicaciones dirigidas a la semilla). La semilla también puede imprimarse antes o después del tratamiento.
Durante el tratamiento del material de propagación se desea una distribución uniforme de los ingredientes en las mezclas y composiciones de la invención, respectivamente, y su adherencia a las semillas. El tratamiento podría variar desde una película delgada (apósito) de la formulación que contiene la combinación, por ejemplo, una mezcla de ingrediente(s) activo(s), sobre un material de propagación de plantas, como una semilla, donde el tamaño y/o la forma original son reconocibles. a un estado intermedio (como un recubrimiento) y luego a una película más gruesa (como un granulado con muchas capas de diferentes materiales (como portadores, por ejemplo, arcillas; diferentes formulaciones, como de otros ingredientes activos; polímeros; y colorantes) cuando la forma y/o el tamaño original de la semilla ya no sean reconocibles.
Un aspecto de la presente invención incluye la aplicación de las mezclas y composiciones de la invención, respectivamente, sobre el material de propagación de plantas de manera específica, incluida la colocación de los ingredientes en la combinación en todo el material de propagación de plantas o solo en partes del mismo, incluyendo sólo un lado o una porción de un solo lado. Un experto habitual en la técnica entendería estos métodos de aplicación a partir de la descripción proporcionada en EP954213B1 y WO06/112700.
Las cepas, caldos de cultivo completos, extractos libres de células, medios de cultivo, fusaricidinas de fórmula I y composiciones de la invención, respectivamente, también pueden usarse en forma de una "pastilla" o "gránulo" o un sustrato adecuado y colocarse, o siembra, la pastilla tratada, o sustrato, junto a un material de propagación de plantas. Tales técnicas son conocidas en la técnica, particularmente en EP1124414, WO07/67042, y WO 07/67044. La aplicación de las cepas, caldos de cultivo completos, extractos libres de células, medios de cultivo, fusaricidinas de fórmula I y composiciones, respectivamente, descritos en el presente documento sobre material de propagación de plantas también incluye proteger el material de propagación de plantas tratado con la combinación de la presente invención colocando uno o más partículas que contienen pesticidas junto a una semilla tratada con pesticidas, en donde la cantidad de pesticida es tal que la semilla tratada con pesticidas y las partículas que contienen pesticidas juntas contienen una Dosis Efectiva del pesticida y la dosis de pesticida contenida en el pesticida- la semilla tratada es menor o igual a la dosis máxima no fitotóxica del pesticida. Tales técnicas son conocidas en la técnica, particularmente en WO2005/120226.
La aplicación de las cepas, caldos de cultivo completos, extractos libres de células, medios de cultivo, fusaricidinas de fórmula I y composiciones de la invención, respectivamente, sobre la semilla también incluye recubrimientos de liberación controlada sobre las semillas, en los que los ingredientes de las combinaciones se incorporan en Materiales que liberan los ingredientes con el tiempo. Los ejemplos de tecnologías de tratamiento de semillas de liberación controlada son generalmente conocidos en la técnica e incluyen películas poliméricas, ceras u otros recubrimientos de semillas, en los que los ingredientes pueden incorporarse al material de liberación controlada o aplicarse entre capas de materiales, o ambos.
Las semillas pueden tratarse aplicándoles las mezclas y composiciones de la invención, respectivamente, en cualquier secuencia deseada o simultáneamente.
El tratamiento de la semilla ocurre con una semilla no sembrada, y el término "semilla no sembrada" pretende incluir semillas en cualquier período entre la cosecha de la semilla y la siembra de la semilla en el suelo con el propósito de germinación y crecimiento de la planta.
El tratamiento de una semilla no sembrada no pretende incluir aquellas prácticas en las que el ingrediente activo se aplica al suelo, pero incluiría cualquier práctica de aplicación dirigida a la semilla durante el proceso de plantación.
Preferiblemente, el tratamiento ocurre antes de la siembra de la semilla de modo que la semilla sembrada haya sido pretratada con las mezclas y composiciones de la invención, respectivamente. En particular, se prefiere el recubrimiento de semillas o el granulado de semillas. Como resultado del tratamiento, los ingredientes se adhieren a la semilla y, por lo tanto, están disponibles para el control de plagas.
Las semillas tratadas se pueden almacenar, manipular, sembrar y labrar de la misma manera que cualquier otra semilla tratada con ingrediente activo.
En particular, la presente invención se refiere a un método para proteger el material de propagación de plantas contra plagas, hongos dañinos y/o mejorar la salud de las plantas cultivadas a partir de dicho material de propagación de plantas, en donde el suelo, en el que se siembra el material de propagación de plantas, se trata con una cantidad eficaz de una mezcla o composición de la invención, respectivamente.
El usuario aplica la composición de acuerdo con la invención generalmente de un dispositivo de predosificación, un pulverizador de mochila, un tanque de pulverización, un avión de pulverización o un sistema de irrigación. Por lo general, la composición agroquímica se compone de agua, disolución amortiguadora y/o auxiliares adicionales a la concentración de aplicación deseada y se obtiene el líquido de pulverización listo para usar o la composición agroquímica de acuerdo con la invención. Por lo general, se aplican de 20 a 2000 litros, preferiblemente de 50 a 400 litros, del líquido de pulverización listo para usar por hectárea de área útil agrícola.
Cuando se trata del tratamiento de material de propagación de plantas, especialmente semillas, las composiciones aquí descritas dan, después de una dilución de dos a diez veces, concentraciones de componentes activos de 0,01 a 60% en peso, preferiblemente de 0,1 a 40%, en las preparaciones listas para usar. La aplicación se puede realizar antes o durante la siembra. Los métodos para aplicar una cepa, extracto libre de células, medio de cultivo, metabolito o composición de la invención, respectivamente, sobre material de propagación de plantas, especialmente semillas, incluyen métodos de preparación, recubrimiento, granulación, espolvoreado, remojo y aplicación en surco del material de propagación. Preferiblemente, las cepas, caldos de cultivo completos, extractos libres de células, medios de cultivo, fusaricidinas de fórmula I o composiciones de la invención, respectivamente, se aplican sobre el material de propagación de plantas mediante un método tal que no se induzca la germinación, por ejemplo. mediante tratamiento de semillas, granulación, recubrimiento y espolvoreado.
Cuando las cepas bacterianas se emplean en la protección de cultivos, en donde las cepas se aplican como tratamiento foliar o al suelo, las tasas de aplicación generalmente oscilan entre aproximadamente 1 * 106 a 5 * 1016 (o más) UFC/ha, preferiblemente de aproximadamente 1 * 107 a aproximadamente 1 * 1016 UFC/ha, incluso más preferiblemente de 1 * 1012 a 5 * 1015 UFC/ha.
Cuando las cepas de la invención se emplean en el tratamiento de semillas, las tasas de aplicación con respecto al material de propagación de plantas normalmente oscilan entre aproximadamente 1 * 101 a 1*1012 (o más) UFC/semilla, preferiblemente de aproximadamente 1 * 103 a aproximadamente 1 * 1010 UFC/semilla, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 1 * 103 a aproximadamente 1 * 106 UFC/semilla. Alternativamente, las tasas de aplicación con respecto al material de propagación de plantas oscilan preferiblemente entre aproximadamente 1 * 107 a 1*1016(o más) UFC por 100 kg de semilla, preferiblemente de 1 * 109 a aproximadamente 1 * 1015 UFC por 100 kg de semilla, aún más preferentemente a partir de 1*1011 a aproximadamente 1 * 1015 UFC por 100 kg de semilla.
Cuando se emplean extractos libres de células, medios de cultivo y/o metabolitos tales como fusaricidinas de fórmula I, el material sólido (materia seca) se considera como componentes activos, por ejemplo. que se obtendrá después del secado o evaporación del medio de extracción o del medio de suspensión en el caso de formulaciones líquidas. Cuando se emplean en protección de plantas, las cantidades de componentes activos aplicadas son, dependiendo del tipo de efecto deseado, de 0,001 a 2 kg por ha, preferiblemente de 0,005 a 2 kg por ha, más preferiblemente de 0,05 a 0,9 kg por ha, y en particular de 0,1 a 0,75 kg por ha. En el tratamiento de materiales de propagación de plantas como semillas, por ejemplo espolvoreando, recubriendo o empapando las semillas, se pueden obtener cantidades de componentes activos de 0,1 a 1000 g, preferiblemente de 1 a 1000 g, más preferiblemente de 1 a 100 g y lo más preferiblemente de 5 a 100 g, por 100 kilogramos de material de propagación de plantas ( generalmente se requieren semillas). Cuando se utiliza en la protección de materiales o productos almacenados, la cantidad de componentes activos aplicados depende del tipo de área de aplicación y del efecto deseado. Las cantidades habitualmente aplicadas en la protección de materiales son de 0,001 g a 2 kg, preferiblemente de 0,005 g a 1 kg, de componentes activos por metro cúbico de material tratado.
Según una realización, los componentes individuales de la composición de la invención, tales como partes de un kit o partes de una mezcla binaria o ternaria, pueden ser mezclados por el propio usuario en un tanque de pulverización o cualquier otro tipo de recipiente utilizado para aplicaciones (por ejemplo, semillas tambores de tratamiento, maquinaria de granulación de semillas, pulverizador de mochila) y otros auxiliares, si procede.
Cuando los microorganismos vivos, como las cepas dePaenibacillusde la invención, forman parte de dicho kit, se debe tener cuidado de que la elección y las cantidades de las otras partes del kit (por ejemplo, agentes pesticidas químicos) y de los auxiliares adicionales no influyan en la viabilidad de los pesticidas microbianos en la composición. mezclada por el usuario. Especialmente en el caso de bactericidas y disolventes se debe tener en cuenta la compatibilidad con el respectivo pesticida microbiano.
En consecuencia, una realización de la invención es un kit para preparar una composición pesticida utilizable, comprendiendo el kit a) una composición que comprende el componente 1) como se define en el presente documento y al menos un auxiliar; y b) una composición que comprende el componente 2) como se define en el presente documento y al menos un auxiliar; y opcionalmente c) una composición que comprende al menos un auxiliar y opcionalmente un componente activo adicional 3) como se define en el presente documento.
Varios tipos de aceites, humectantes, adyuvantes, fertilizantes o micronutrientes, y otros pesticidas (por ejemplo, herbicidas, insecticidas, fungicidas, reguladores del crecimiento, protectores) pueden añadirse a los principios activos o a las composiciones que las comprenden como premezcla o, si corresponde, no hasta inmediatamente antes de su uso (mezcla de tanque). Estos agentes pueden mezclarse con las composiciones de acuerdo con la invención en una relación en peso de 1:l0o a 100:1, preferiblemente de 1:10 a 10:1. Preferiblemente, una composición de la invención comprende otro biopesticida. Aún más preferiblemente, una composición de la invención comprende además de un auxiliar y al menos una fusaricidina de fórmula I, un pesticida microbiano.
Un pesticida es generalmente un agente químico o biológico (como un virus, una bacteria, un antimicrobiano o un desinfectante) que a través de su efecto disuade, incapacita, mata o de otro modo disuade a las plagas. Las plagas objetivo pueden incluir insectos, patógenos de plantas, malezas, moluscos, aves, mamíferos, peces, nematodos (gusanos intestinales) y microbios que destruyen propiedades, causan molestias, propagan enfermedades o son vectores de enfermedades. El término pesticidas incluye también reguladores del crecimiento de las plantas que alteran la tasa esperada de crecimiento, floración o reproducción de las plantas; defoliantes que hacen que las hojas u otro follaje caigan de una planta, generalmente para facilitar la cosecha; desecantes que promueven el secado de tejidos vivos, como las copas de las plantas no deseadas; activadores de plantas que activan la fisiología de las plantas para la defensa contra ciertas plagas; protectores que reducen la acción herbicida no deseada de los pesticidas en las plantas de cultivo; y promotores del crecimiento de las plantas que afectan la fisiología de las plantas para aumentar el crecimiento de las plantas, la biomasa, el rendimiento o cualquier otro parámetro de calidad de los productos cosechables de una planta de cultivo.
Aplicando al menos una cepa dePaenibacilluscomo se define en cualquiera de las realizaciones preferidas anteriores, o el medio de cultivo o un extracto libre de células de la misma o al menos un metabolito de la misma junto con al menos un pesticida II de los grupos A) a N) se puede obtener un efecto sinérgico, es decir, se obtiene más que una simple suma de los efectos individuales (mezclas sinérgicas).
Según una forma de realización, las mezclas contienen el componente 1) y el componente 2) en una cantidad sinérgicamente eficaz.
Se entiende que el término "efecto sinérgico" se refiere en particular al definido por la fórmula de Colby (Colby, SR, "Cálculo de respuestas sinérgicas y antagónicas de combinaciones de herbicidas", Weeds, 15, págs. 20-22, 1967).
Por "efecto sinérgico" se entiende también el definido por aplicación del método Tammes, (Tammes, PML, "Isoboles, una representación gráfica del sinergismo en pesticidas", Países Bajos. J. Plant Pathol. 70, 1964).
Esto se puede obtener aplicando al menos una cepa dePaenibacilluscomo se define en cualquiera de las realizaciones preferidas anteriores, o el medio de cultivo o un extracto libre de células del mismo o al menos un metabolito del mismo y al menos un pesticida II simultáneamente, ya sea de forma conjunta (por ejemplo, como mezcla en tanque) o por separado, o sucesivamente, eligiéndose el intervalo de tiempo entre las aplicaciones individuales para garantizar que la sustancia activa aplicada primero todavía se encuentre en el lugar de acción en cantidad suficiente en el momento de la aplicación de la(s) otra(s) sustancia(s) activa(s). El orden de aplicación no es esencial para el funcionamiento de la presente invención.
Al aplicar una cepa dePaenibacilluscomo se define en cualquiera de las realizaciones preferidas anteriores, o el medio de cultivo o un extracto libre de células del mismo o un metabolito del mismo y un pesticida II secuencialmente el tiempo entre ambas aplicaciones puede variar, por ejemplo, entre 2 horas y 7 días. También es posible un intervalo más amplio que oscila entre 0,25 horas y 30 días, preferentemente entre 0,5 horas y 14 días, particularmente entre 1 hora y 7 días o entre 1,5 horas y 5 días, incluso más preferentemente entre 2 horas y 1 día. Se prefiere que el pesticida II se aplique como primer tratamiento.
Las proporciones en peso total de las composiciones que comprenden al menos un pesticida microbiano en forma de células microbianas viables, incluidas las formas latentes, se pueden determinar usando la cantidad de UFC del microorganismo respectivo para calcular el peso total del componente activo respectivo con la siguiente ecuación que 1 x io 10 UFC equivale a un gramo del peso total del respectivo componente activo. La unidad formadora de colonias es una medida de células microbianas viables, en particular células fúngicas y bacterianas.
En las mezclas y composiciones según la invención, la relación en peso del componente 1) y el componente 2) depende generalmente de las propiedades de los componentes activos utilizados, normalmente está en el intervalo de 1:10.000 a 10.000:1, a menudo está en el rango de 1:100 a 100:1, regularmente en el rango de 1:50 a 50:1, preferiblemente en el rango de 1:20 a 20:1, más preferiblemente en el rango de 1:10 a 10:1, incluso más preferentemente en el intervalo de 1:4 a 4:1 y en particular en el intervalo de 1:2 a 2:1.
Según realizaciones adicionales de las mezclas y composiciones, la relación en peso del componente 1) y el componente 2) normalmente está en el intervalo de 1000:1 a 1:1, a menudo en el intervalo de 100: 1 a 1:1, regularmente en el rango de 50:1 a 1:1, preferiblemente en el rango de 20:1 a 1:1, más preferiblemente en el rango de 10:1 a 1:1, incluso más preferentemente en el intervalo de 4:1 a 1:1 y en particular en el intervalo de 2:1 a 1:1.
Según realizaciones adicionales de las mezclas y composiciones, la relación en peso del componente 1) y el componente 2) normalmente está en el intervalo de 20.000:1 a 1:10, a menudo en el intervalo de 10.000:1 a 1: 1, regularmente en el rango de 5.000:1 a 5:1, preferiblemente en el rango de 5.000:1 a 10:1, más preferiblemente en el rango de 2.000:1 a 30:1, incluso más preferiblemente en el en el intervalo de 2.000:1 a 100:1 y en particular en el intervalo de 1.000:1 a 100:1.
Según realizaciones adicionales de las mezclas y composiciones, la relación en peso del componente 1) y el componente 2) normalmente está en el intervalo de 1:1 a 1:1000, a menudo en el intervalo de 1:1 a 1: 100, regularmente en el rango de 1:1 a 1:50, preferiblemente en el rango de 1:1 a 1:20, más preferiblemente en el rango de 1:1 a 1:10, incluso más preferiblemente en el en el intervalo de 1:1 a 1:4 y en particular en el intervalo de 1:1 a 1:2.
Según realizaciones adicionales de las mezclas y composiciones, la relación en peso del componente 1) y el componente 2) normalmente está en el intervalo de 10:1 a 1:20.000, a menudo en el intervalo de 1:1 a 1: 10.000, regularmente en el rango de 1:5 a 1:5.000, preferiblemente en el rango de 1:10 a 1:5.000, más preferiblemente en el rango de 1:30 a 1:2.000, incluso más preferiblemente en el en el intervalo de 1:100 a 1:2.000 y en particular en el intervalo de 1:100 a 1:1.000.
Las mezclas y composiciones según la invención pueden estar presentes también, en su forma de uso como fungicidas y/o insecticidas, junto con otras sustancias activas, por ejemplo. con herbicidas, insecticidas, reguladores de crecimiento, fungicidas o bien con fertilizantes, como premezcla o, en su caso, no hasta inmediatamente antes de su uso (mezcla en tanque).
Mezclar las mezclas binarias de la invención o las composiciones que las contienen con otros fungicidas da como resultado en muchos casos una ampliación del espectro de actividad fungicida o una prevención del desarrollo de resistencia a los fungicidas. Además, en muchos casos se obtienen efectos sinérgicos.
Mezclar las mezclas binarias de la invención o las composiciones que las contienen con otros insecticidas da como resultado en muchos casos una expansión del espectro de actividad insecticida o una prevención del desarrollo de resistencia a los insecticidas. Además, en muchos casos se obtienen efectos sinérgicos.
Según la presente invención, puede preferirse que las mezclas y composiciones que las comprenden comprendan además de al menos una cepa dePaenibacilluscomo se define en cualquiera de las realizaciones preferidas anteriores, o el medio de cultivo o un extracto libre de células del mismo o al menos un metabolito del mismo (componente 1), y un pesticida II (componente 2), como componente 3) un pesticida adicional , preferiblemente en una cantidad sinérgicamente eficaz. Otra realización se refiere a mezclas en las que el componente 3) es un pesticida III seleccionado de los grupos SF) y SI) tal como se definen a continuación, siempre que en cada una de estas mezclas ternarias el pesticida III sea diferente del pesticida II elegido. Estas mezclas ternarias son especialmente adecuadas para el tratamiento de materiales de propagación de plantas (es decir, tratamiento de semillas).
La siguiente lista de pesticidas III, junto con los cuales se pueden utilizar las mezclas binarias según la invención, pretende ilustrar las posibles combinaciones, pero no las limita:
SF) Fungicidas
- inhibidores del complejo III en Qoh sitio seleccionado de: piraclostrobina, azoxistrobina, picoxistrobina, trifloxistrobina, dimoxistrobina, enestroburina, fenaminstrobina, fluoxastrobina, kresoxim-metilo, mandestrobina, metominostrobina, orisastrobina, pirametostrobina, piraoxistrobina;
- inhibidores de piridina y pirazol de amplio espectro del complejo II seleccionados entre: fluxapiroxad, boscalid, benzovindiflupir, penflufen, pentiopirad, sedaxano, fluopiram, bixafen, isopirazam;
- inhibidores del complejo II específicos de basidiomicetos seleccionados entre: carboxina, benodanil, fenfuram, flutolanil, furametpir, mepronil, oxicarboxina, tifluzamida; inhibidor de la producción de ATP, siltiofam;
- compuestos fungicidas de azol seleccionados entre: ipconazol, difenoconazol, protioconazol, procloraz, triticonazol, flutriafol, ciproconazol, diniconazol, diniconazol-M, fluquinconazol, flusilazol, hexaconazol, imazalil, imibenconazol, metconazol, miclobutanil, simeconazol, tebuconazol, triadimenol, uniconazol, tiabendazol;
- fungicidas oomicetos seleccionados entre: oxatiapiprolina, valifenalato, metalaxil, metalaxil-M, etaboxam, dimetomorfo, zoxamida, flumorfo, mandipropamida, pirimorfo, bentiavalicarb, iprovalicarb;
-Inhibidores de MAP/histidina quinasa: fludioxonil;
- compuestos de bencimidazol seleccionados entre: tiofanato de metilo, carbendazim;
- compuestos de ditiocarbamato seleccionados entre: tiram, ziram;
SI) Insecticidas
- Compuestos antagonistas de GABA seleccionados entre: fipronil, etiprol, vaniliprol, pirafluprol, piriprol, 5-amino-1-(2,6-dicloro-4-metil-fenil)-4-sulfinamoil-1 H-pirazol-3-carbotioico amida ácida;
- inhibidores del receptor de rianodina específicos de lepidópteros seleccionados entre: clorantraniliprol y flubendiamida; - inhibidor del receptor de rianodina de espectro cruzado: ciantraniliprol;
- moduladores piretroides de los canales de sodio seleccionados entre: teflutrina, bifentrina, cipermetrina, alfacipermetrina, ciflutrina, beta-ciflutrina, lambda-cialotrina, deltametrina, esfenvalerato, etofenprox, fenvalerato, flucitrinato, permetrina;
- compuestos neonicotinoides sistémicamente activos: clotianidina, imidacloprid, tiametoxam, dinotefurano, acetamiprid, flupiradifurona, tiacloprid, triflumezopirim, nitenpiram;
- Inhibidores de la acetilcolinesterasa, activadores de los canales de cloruro y sulfoximinas: sulfoxaflor, acefato, clorpirifos, tiodicarb, abamectina, espinosad;
- otro insecticida: tioxazafen.
Más preferentemente, los pesticidas III se seleccionan de los siguientes grupos SF) y SI):
SF) Fungicidas
azoxistrobina, trifloxistrobina, picoxistrobina, piraclostrobina, sedaxano, pentiopirad, penflufeno, fluopiram, fluxapiroxad, boscalid, oxatiapiprolina, metalaxil, metalaxil-M, etaboxam, dimetomorfo, valifenalato, ciproconazol, cifenoconazol, protioconazol, flutriafol, tiabendazol, ipconazol, te buconazol, triadimenol, procloraz, fluquinconazol, triticonazol, fludioxinil, carboxina, siltiofam, ziram, tiram, carbendazim, tiofanato de metilo;
SI) Insecticidas: fipronil, clotianidina, tiametoxam, acetamiprid, dinotefurano, imidacloprid, tiacloprid, sulfoxaflor, metiocarb, teflutrina, bifentrina, cipermetrina, alfa-cipermetrina, espinosad, clorantraniliprol, ciantraniliprol, tiodicarb, triflumezopirim, acefato, clorpirifos, flupiradifurona, abamectina, tioxazafeno.
Ejemplos
La presente invención se describirá con más detalle mediante ejemplos específicos. Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplos relativos a las cepas dePaenibacillusy metabolitos de las mismas
Ejemplo 1: A islam iento de cepas dePaenibacillus
Se recogieron muestras de suelo de diversos lugares europeos, incluida Alemania. Al aplicar procedimientos de aislamiento microbiano comúnmente conocidos a estos suelos, los inventores obtuvieron una variedad de bacterias que se sometieron además a técnicas de aislamiento convencionales para proporcionar aislados puros como se describe en el presente documento.
Técnica de enriquecimiento microbiano estándar (C. A. Reddy, T J. Beveridge, J. A. Breznak, G. A. Marzluf, T M. Schmidt, y L. R. Snyder (eds.). Métodos de microbiología general y molecular, Am. Soc. Microbiol., Washington, Distrito de Columbia) se siguió para aislar cada tipo de bacteria.
Las siguientes cepas han sido aisladas y depositadas bajo el Tratado de Budapest con elColección alemana de microorganismos y cultivos celulares.(DSM<z>) el 20 de febrero de 2013:
a) Lu16774 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26969
b) Lu17007 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26970
c) Lu17015 depositada en DSMZ con el número de depósito DSM 26971.
Ejemplo 2 - Caracterización de cepas dePaenibacillus
Ejemplo 2.1: Secuenciación de ADNr 16S
Las secuencias del gen 16S rRNA de las cepas dePaenibacillusse determinaron mediante secuenciación directa del ADNr 16S amplificado por PCR en DSMZ, Braunschweig, Alemania.
La extracción de ADN genómico se realizó mediante MasterPure.™ Kit de purificación de ADN Gram Positivo de Epicenter Biotechnologies según las instrucciones del fabricante. La amplificación mediada por PCR del ADNr 16S y la purificación del producto de la PCR se llevaron a cabo como se describió anteriormente (En t. J. Sistema. Bacteriol. 46, 1088-1092, 1996). Los productos de PCR purificados se secuenciaron utilizando BigDye® Kit de secuenciación de ciclos Terminator v1.1 (Applied Biosystems) como se indica en el protocolo del fabricante. Las reacciones de secuencia se sometieron a electroforesis utilizando el analizador genético 3500xL de Applied Biosystems. Las ambigüedades en las secuencias pueden deberse a la existencia de varios cistrones que codifican ARNr 16s con diferentes secuencias dentro de un solo genoma.J. Bacteriol. 178(19), 5636-5643, 1996).
Los datos de la secuencia de las cepas se colocaron en el editor de alineación AE2 (http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/unix/ae2.readme), alineado manualmente de acuerdo con la estructura secundaria de la molécula de ARNr resultante y comparado con secuencias representativas del gen 16S rRNA de organismos pertenecientes alFirmicutes(Nucl. Acids Res. 27, 171-173, 1999). A modo de comparación, las secuencias de ARNr 16S se obtuvieron de las bases de datos EMBL y RDP.
Las secuencias de ADNr 16S de las cepas de la invención se exponen en el Listado de secuencias como se indica en la Tabla 2.
Tabla 2: Referencias de listado de secuencias del ADNr 16S de las cepas dePaenibacillus.
Los valores de identidad del gen 16S ADNr en % se calcularon mediante comparación por pares de las secuencias dentro del alineamiento de las secuencias comparadas.
La comparación realizada de sólo dos secuencias basada en la alineación de secuencias por pares se indica en el presente documento como valores binarios. Los demás valores se basan en una alineación de secuencias múltiples de todas las secuencias dentro de la comparación. Los valores de identidad más altos de las comparaciones de múltiples secuencias resultan del problema de que los datos de las secuencias comparadas tenían diferentes longitudes, lo que daba como resultado una alineación más corta.
El porcentaje de identidad de las comparaciones por pares de las secuencias completas de ADNr entre las tres cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 estuvo entre 99,5 y 99,9% (Tabla 3, valores binarios).
Tabla 3: Identidad en % de las secuencias completas de ARNr 16S de tres cepas dePaenibacillus(valores binarios n r r n i .
La comparación de la secuencia completa de ARNr 16S de las tres cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 con taxones relacionados (ver Fig. 9) reveló un alto porcentaje de identidad conPaenibacillus peoriae(cepa tipo DSM 8320) con 99,8%. Los valores binarios para alineamientos de secuencias por pares de Ppeoriaecon las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 fueron los siguientes: Lu16774: 99,5%, Lu17007: 99,5%; y Lu17015: 99,7% de identidad, respectivamente.
Una evaluación final de las especies a las que las cepas dePaenibacillusa las que pertenecen Lu16774, Lu17015 y Lu17007 no fueron posibles basándose en los datos de la secuencia de ARNr 16S.
La secuenciación del ADNr completo resultó enPaenibacillus peoriaeNRRL BD-62 en 100,0% identidad a Ppeoriae(cepa tipo DSM 8320) que confirma la designación de especie Ppeoriaepara esta cepa BD-62 (ver Fig. 9).
La estrecha relación de las tres. cepas dePaenibacillusLu16774, Lu17007 y Lu17015 para Ppeoriaefue confirmado por la comparación con la secuencia de ARNr 16S de Ppeoriaecepa BD-62 que dio como resultado valores de identidad del 99,8% (ver Fig. 9).
Para la construcción de las operaciones de dendrograma filogenético del paquete ARB (Núcleo. Acids Res. 35, 71887196, 2007): basándose en los valores de distancia evolutiva, el árbol filogenético se construyó mediante el método de unión de vecinos (Jukes, TH y Cantor CR (1969). Evolución de las moléculas de proteínas. En Metabolismo de proteínas de mamíferos, págs. 21-132. Editado por H. N. Munro. Nueva York: Prensa académica) utilizando la corrección de Jukes y Cantor (Mol. Biol. Evol. 4, 406-425, 1987). La raíz del árbol se determinó incluyendo la secuencia del gen 16S rRNA deCohnella termotolerantesen el análisis. La barra de escala debajo del dendrograma indica sustituciones de 1 nucleótido por cada 100 nucleótidos. Los resultados se proporcionan en la Figura 10.
El dendrograma filogenético de estas secuencias (Fig. 10) muestra que las tres cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 están más estrechamente relacionadas entre sí y que su pariente más cercano conocido por cada una de ellas era la cepaPaenibacillus peoriaeNRRL BD-62.
Ejemplo 2.2: Análisis RiboPrint
La ribotipificación automatizada y estandarizada se realiza utilizando el sistema Qualicon RiboPrinter. El sistema RiboPrinter combina pasos de procesamiento molecular para ribotipado en un instrumento automatizado independiente. El procedimiento incluye lisis celular, digestión de ADN cromosómico con la enzima de restricción EcoRl, separación de fragmentos mediante electroforesis, transferencia de fragmentos de ADN a una membrana de nailon, hibridación a una sonda generada a partir del operón rrnB de E. coli, detección quimioluminiscente de la sonda a los fragmentos que contienen secuencias del operón rrn, detección de imágenes y análisis computarizado de patrones RiboPrint (Tecnología de los alimentos 50(1), 77-81, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92, 5229-5233, 1995; Int. Journ. Syst. Bact. 44(3), 454 460, 1994).
La ribotipificación ha sido realizada por el DSMZ, Alemania, con lascepas de PaenibacillusLu16774, Lu17007 y Lu17015 en comparación con la cepa PpeoriaeBD-62 usando la enzima de restricción EcoRl. Los patrones resultantes se compararon utilizando el software del sistema RiboPrinter, la biblioteca de identificación DuPont integrada y el software BioNumerics (Applied Maths, Bélgica).
La similitud de las tres cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 con BD-62 estuvo entre 0,24 y 0,5 (Fig. 11). Las tres cepas se agrupan en dos grupos, el primero que comprende Lu17015, mientras que el segundo grupo comprende las cepas Lu16774 y Lu17007. Ninguna de las cepas tiene una similitud superior a 0,84 con ninguna cepa de la Biblioteca de identificación de DuPont y, por lo tanto, no se identificó automáticamente.
La cepa BD-62 ha sido identificada comoPaenibacillus peoriaebasado en la entrada DUP-13142 de la biblioteca de identificación de DuPont (entrada basada enPaenibacillus peoriaeDSM 8320).
Ejemplo 2.3: Caracterización morfológica y fisiológica.
Las cepas se caracterizaron en el DSMZ de forma análoga a los métodos descritos en Gordon, RE, Haynes, WC & Pang. C.H.-N. (1973): The Genus Bacillus, Agriculture Handbook no. 427. Washington DC: Departamento de Agricultura de EE. UU.. Los resultados se proporcionan en la Tabla 4.
Tabla 4: Datos de caracterización de cepas dePaenibacillusde la invención y comparación con la cepa conocidaPaenibacillus eoriaeNRRL BD-62.
El análisis de los ácidos grasos celulares realizado en DSMZ dio como resultado que todas las cepas mostraron un perfil típico paraPaenibacillus spp..
Utilizando los datos genéticos, fisiológicos y bioquímicos disponibles, se demuestra que las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 pertenecen al géneroPaenibacillus.Dado que las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015, así como la BD-62, producen gas a partir de glucosa, ninguna de ellas pertenece aPaenibacillus jamilae.
Una diferenciación fenotípica entrePaenibacillus peoriaeyPaenibacillus polymyxaes principalmente posible utilizando las características de producción de ácido a partir de ciertos sustratos (Int. J. Syst. Bacteriol. 43(2), 388-390, 1993; In. J. Syst. Bacteriol. 46(6), 988-1003, 1996). Ninguna de las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 coincidió completamente con sus características descritas en la Tabla 4 con ninguna de estas dos especies, pero en suma, los datos genéticos, fisiológicos y bioquímicos disponibles probablemente apunten a la especie.Paenibacillus peoriaey Ppolymyxao al menos a otra especie muy relacionada conPaenibacillus peoriaey Ppolymyxa.
Debido a la multitud de especies dePaenibacillusdescritas hasta ahora, es imposible determinar las especies taxonómicas correctas de los tres aislados probados basándose en criterios fisiológicos y morfológicos de la Tabla 4 (Rainer Borriss, Universidad Humboldt de Berlín, resultados no publicados).
Sin embargo, no fue posible determinar completamente las especies dentro de este género. Se encontró que la especie y cepa más estrechamente relacionada eraPaenibacillus peoriaeBD-62 basado en análisis de 16S-ADNr (ver, por ejemplo, Fig. 11).
Ejemplo 2.4: Análisis filogenético basado en genes que codifican DnaN, GyrB, RecF, RecN y RpoA.
Las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican DnaN, GyrB, RecF, RecN y RpoA se han extraído de secuencias genómicas completas o de bases de datos públicas (listados de secuencias como se describe en la Tabla 28).
Las tablas de identidad (Figs. 12 a 16) se han generado con un enfoque de todos contra todos donde cada secuencia está alineada con todas las demás secuencias. La alineación de la secuencia se realizó con una aguja de programa (paquete EMBOSS 6.6.0; Tendencias en Genética 16 (6), 276-277). Parámetros estándar donde se utilizan (creación de espacios 10,0; extensión de espacios 0,5). Las puntuaciones de identidad se calculan sobre la base de las alineaciones sin tener en cuenta ninguna brecha.
Para los árboles filogenéticos (Figs. 17 a 21), múltiples alineamientos de secuencias que se han realizado con Clustal Omega (versión 1.2.0; Molecular Systems Biology 7: 539, doi: 10.1038.msb.2011.75. Los árboles filogenéticos se calculan mediante el método de máxima verosimilitud con el software Dnaml (implementado en el paquete Phylip 3.696; Felsenstein 1981, http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html). Los dendrogramas se han establecido utilizando un modelo de distancia F84 aplicando una relación de transición - transversión de dos (2). Los árboles se trazan con la herramienta Dendroscope (http://dendroscope.org/).
Tabla 28: Referencias del listado de secuencia de las secuencias dednaN, gyrB, recF, recNyrpoAde las cepas de
Paenibacillus.
Ejemplo 2.5: Comparaciones del genoma central y matriz AAI
Las comparaciones del genoma se han realizado utilizando el paquete de software EDGAR de la Universidad de GielJen (BMC Bioinformática 10, 154, 2009; (https://edgar.computational.bio.uni-giessen.de/cgi-bin/edgar.cgi). La determinación del genoma central, los dendrogramas filogenéticos a partir de las secuencias completas del genoma y los valores de la matriz AAI se realizaron utilizando el paquete de software EDGAR. Los resultados se muestran en las Figura 22.
Ejemplo 3: Crecimiento (fermentabilidad) de cepas para pruebasin vivo
Para ensayos de invernadero y de campo, las cepas dePaenibacillusse cultivaron por primera vez en placas ISP2 (agar listo para usar de BD [EE. UU.], número de catálogo 277010). Posteriormente, se inocularon matraces de agitación con deflectores que contenían medio ISP2 líquido con una colonia de la placa de agar y se incubaron durante 5-7 días a 150 rpm y 25°C. Dependiendo de la prueba, se aplicó a las plantas caldo de cultivo completo, o el sedimento celular centrifugado y lavado con H2O, o el sobrenadante. Fue posible ampliar la escala a fermentadores de 10 litros.
Las cepas dePaenibacilluscultivaron en medio líquido ISP2 (10 g/l de extracto de malta, 4 g/l de extracto de levadura Bacto, 4 g/l de monohidrato de glucosa) durante 6 días a 22 °C a 150 rpm. OD-600nm lo que indica que el crecimiento bacteriano se midió en diferentes momentos.
Tabla 5: Crecimiento bacteriano de cepas dePaenibacillusen medio líquido ISP2.
Ejemplo 4 -Ensayo de confrontaciónin vitropara la actividad antifúngica
Actividad antagónica de lacepas de Paenibacilluscontra patógenos vegetales se demostró en el ensayo de confrontación.in vitro.Los hongos fitopatógenos utilizados sonScierotina sclerotiorum(SCLSCL),Botritis cinerea(BOTRCI),Alternaríasp. (ALTESP) yPhytophthora infestans(PHYTIN).
Como medio de crecimiento de BOTRCI, ALTESP, SCLSCL se utiliza medio ISP2 que comprende por litro: 10 g de extracto de malta (Sigma Aldrich, 70167); 4 g de extracto de levadura Bacto (Becton Dickinson, 212750); 4 g de glucosa monohidrato (Sigma Aldrich, 16301); 20 g de Agar (Becton Dickinson, 214510), pH aproximadamente 7, Ac. bidest. Como medio de crecimiento de PHYTIN se utiliza medio V8 que comprende por litro: 200 ml de jugo de verduras, 3 g de carbonato cálcico (Merck Millipore, 1020660250); 30 g de Agar (Becton Dickinson, 214510), pH 6,8, Ac. bidest.
Las cepas dePaenibacillusse inoculan puntualmente en un lado de una placa de agar. Un bloque de agar (aprox. 0,3 cm2) que contenía un patógeno vegetal en crecimiento activo se colocó en el centro de la placa. Después de una incubación de 7 a 14 días a aproximadamente 25°C, se examina el crecimiento del patógeno vegetal, especialmente en busca de zonas de inhibición.
Posteriormente, las placas de agar se incuban a °C durante aproximadamente 7 a 14 días antes de la evaluación. La antibiosis se califica mediante la evaluación del diámetro de la zona libre de hongos (zona de inhibición). La competencia se puntúa comparando el diámetro de crecimiento del hongo patógeno en placas con cepas bacterianas en comparación con placas de control. El micoparasitismo se puede documentar en caso de que la bacteria crezca demasiado sobre el patógeno fúngico y también el micoparásito de los patógenos. Esto se puede visualizar mediante microscopía.
Las cepas dePaenibacillusmostraron actividad antifúngica contra todos los patógenos vegetales probados.
Tabla 6: Resultados del ensa o de confrontación.in vitro
Ejemplo 5 - Pruebas en invernadero para determinar la actividad contra hongos patógenos de plantas.
Ejemplo de uso 5.1: Actividad contra el tizón tardío en tomate causado porPhytophthora infestanscon aplicación protectora
Para el ensayo en invernadero descrito se utilizaron plántulas de tomate jóvenes disponibles comercialmente ("Goldene Konigin"). Se utilizaron 2 repeticiones (macetas con 1 planta cada una) por tratamiento. Las plantas se cultivaron en sustrato disponible comercialmente (Universal, Floragard) a aprox. 22 °C en invernadero. La humedad se controló mediante un dispositivo especial (-90% de humedad). Las plantas se pulverizaron hasta escurrir con caldo de cultivo crudo/completo de cultivos de 6 días de edad de la respectiva cepa dePaenibacillus(según la configuración) utilizando una cabina de pulverización. Las condiciones de cultivo se describen en el Ejemplo 3. Un día después de la aplicación las plantas tratadas fueron inoculadas con una suspensión de esporangios dePhytophthora infestans(PHYTIN). Después de la inoculación, las plantas de prueba se transfirieron inmediatamente a una cámara húmeda. El alcance del ataque fúngico a las hojas se evaluó visualmente 5-7 días después de la inoculación. El ataque de hongos en el control no tratado estuvo entre 80-100 % y se estableció en 100 % por razones de comparación.
Tabla 7:
Ejemplo de uso 5.2: Actividad contra el moho gris del pim iento provocado porBotrytis cinereacon aplicación protectora
Para el ensayo en invernadero descrito se utilizaron plántulas de pimiento jóvenes disponibles comercialmente ("Neusiedler Ideal"). Se utilizaron 2 repeticiones (macetas con 1 planta cada una) por tratamiento. Las plantas se cultivaron en sustrato disponible comercialmente (Universal, Floragard) a aprox. 22 °C en invernadero. La humedad se controló mediante un dispositivo especial (-90% de humedad). Las plantas se pulverizaron hasta escurrir con caldo de cultivo crudo de cultivos de 6 días de edad de la respectiva cepa dePaenibacillus(según la configuración) utilizando una cabina de pulverización. Las condiciones de cultivo se describen en el Ejemplo 3. Un día después de la aplicación las plantas tratadas fueron inoculadas con una suspensión de esporangios dePhytophthora infestans(BOTRCI). Después de la inoculación, las plantas de prueba se transfirieron inmediatamente a una cámara húmeda. El alcance del ataque fúngico a las hojas se evaluó visualmente 5-7 días después de la inoculación. El ataque de hongos en el control no tratado estuvo entre 80-100 % y se estableció en 100 % por razones de comparación.
Tabla 8:
Ejemplo de uso 5.3: Actividad contra el tizón temprano en tomate causado por Alternaría solani con aplicación protectora
Para el ensayo en invernadero descrito se utilizaron plántulas de tomate jóvenes disponibles comercialmente ("Goldene Konigin"). Se utilizaron 2 repeticiones (macetas con 1 planta cada una) por tratamiento. Las plantas se cultivaron en sustrato disponible comercialmente (Universal, Floragard) a aprox. 22 °C en invernadero. La humedad se controló mediante un dispositivo especial (-90% de humedad). Las plantas se pulverizaron hasta escurrir con caldo de cultivo crudo/completo de cultivos de 6 días de edad de la respectiva cepa dePaenibacillus(según la configuración) utilizando una cabina de pulverización. Las condiciones de cultivo se describen en el Ejemplo 3. Un día después de la aplicación las plantas tratadas fueron inoculadas con una suspensión de esporangios deAlternaria solani(ALTESO). Después de la inoculación, las plantas de prueba se transfirieron inmediatamente a una cámara húmeda. El alcance del ataque fúngico a las hojas se evaluó visualmente 5-7 días después de la inoculación. El ataque de hongos en el control no tratado estuvo entre 80-100 % y se estableció en 100 % por razones de comparación.
Tabla 9:
Ejemplo de uso 5.4: Actividad contra la roya de la soja causada porPhakopsora pachyrhizicon aplicación protectora
Para el ensayo en invernadero descrito se utilizaron plántulas de soja jóvenes disponibles comercialmente ("Mentor"). Se utilizaron 2 repeticiones (macetas con 1 planta cada una) por tratamiento. Las plantas se cultivaron en sustrato disponible comercialmente (Universal, Floragard) a aprox. 22 °C en invernadero. La humedad se controló mediante un dispositivo especial (-90% de humedad). Las plantas se pulverizaron hasta escurrir con caldo de cultivo crudo de cultivos de 2- 6 días de edad de la respectiva cepa dePaenibacillusspp.(según la configuración) utilizando una cabina de pulverización. Un día después de la aplicación las plantas tratadas fueron inoculadas con una suspensión de esporangios dePhakopsora pachyrhizi(PHAKPA). Después de la inoculación, las plantas de prueba se transfirieron inmediatamente a una cámara húmeda. El alcance del ataque fúngico a las hojas se evaluó visualmente 5-7 días después de la inoculación.
Ejemplo de uso 5.5: Actividad contra el tizón de la espiga por Fusarium en trigo causado porFusarium graminearumcon aplicación protectora
Para el ensayo en invernadero descrito se utilizaron plántulas de trigo jóvenes disponibles comercialmente. Se utilizaron 2 repeticiones (macetas con 1 planta cada una) por tratamiento. Las plantas se cultivaron en sustrato disponible comercialmente (Universal, Floragard) a aprox. 22 °C en invernadero. La humedad se controló mediante un dispositivo especial (-90% de humedad). Las plantas se pulverizaron hasta escurrir con caldo de cultivo crudo de cultivos de 2- 6 días de edad de la respectiva cepa dePaenibacillusspp.(según la configuración) utilizando una cabina de pulverización. Las condiciones de cultivo se describen en el Ejemplo 3. Un día después de la aplicación las plantas tratadas fueron inoculadas con una suspensión de esporangios deFusarium graminearum(GIBBZE). Después de la inoculación, las plantas de prueba se transfirieron inmediatamente a una cámara húmeda. El alcance del ataque fúngico a las hojas se evaluó visualmente 5-7 días después de la inoculación.
Ejemplo de uso 5.6: Actividad contra la mancha fo lia r moteada en trigo causada por Septoria tritic i con aplicación protectora
Para el ensayo en invernadero descrito se utilizaron plántulas de trigo jóvenes disponibles comercialmente. Se utilizaron 2 repeticiones (macetas con 1 planta cada una) por tratamiento. Las plantas se cultivaron en sustrato disponible comercialmente (Universal, Floragard) a aprox. 22 °C en invernadero. La humedad se controló mediante un dispositivo especial (-90% de humedad). Las plantas se pulverizaron hasta escurrir con caldo de cultivo crudo de cultivos de 2- 6 días de edad de la respectiva cepa dePaenibacillusspp.(según la configuración) utilizando una cabina de pulverización. Las condiciones de cultivo se describen en el Ejemplo 3. Un día después de la aplicación las plantas tratadas fueron inoculadas con una suspensión de esporangios deSeptoria tritici(SEPTTR). Después de la inoculación, las plantas de prueba se transfirieron inmediatamente a una cámara húmeda. El alcance del ataque fúngico a las hojas se evaluó visualmente 21-28 días después de la inoculación.
Ejemplo de uso 5.7: Actividad de las células dePaenibacillusy del sobrenadante contra diversos patógenos con aplicación protectora
Caldo de cultivo entero procedente de cultivos de 6 días de antigüedad. de la cepa dePaenibacillusLu17007 se obtuvo según el Ejemplo de uso 3 y se usó como en la configuración experimental del Ejemplo de uso 5.1 a 5.3. Alternativamente, dicho caldo de cultivo completo se filtró a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 |jm para obtener el medio de cultivo y la fracción celular cruda. La fracción celular cruda podría lavarse además tres veces con los volúmenes originales de solución salina tamponada con fosfato para obtener células lavadas.
Las pruebas en invernadero se realizaron como se describe en los Ejemplos de uso 5.1, 5.2 y 5.3 anteriores para los patógenos respectivos.Phytophthora infestans, Botrytis cinereayAlternaria solani.El alcance del ataque fúngico a las hojas se evaluó visualmente 5-7 días después de la inoculación. El ataque de hongos en el control no tratado estuvo entre 80-100 % y se estableció en 100 % por razones de comparación.
Tabla 10:
Ejemplo 6 - Pruebas enzimáticas
Ejemplo de uso 6.1: Quitinasa
Medio sólido de prueba de quitinasa: 2 g/l NaNO3, 1g/lK2HPO4, 0,5 g/l MgSO4, 0,5 g/l de KCI, 0,2 g/l de peptona, 15 g/l de agar, 10 g/l de quitina de caparazones de cangrejo (Sigma-Aldrich C7170).
El medio sólido de prueba se esteriliza en autoclave y se introduce en placas de Petri de 9 cm. Las cepas dePaenibacillusse inoculan en el centro de las placas y se incuban durante dos días a 27 °C. A continuación, las placas se tiñen con una solución de Lugol diluida 1:3 (Carl Roth N052.2) durante 5 a 10 minutos. Se vierte la solución de Lugol y se fotografían y evalúan las placas. El crecimiento de las diferentes cepas no superó los 5-10 mm. Las zonas no teñidas (que se correlacionan con la actividad quitinasa) variaron desde 0 mm (sin actividad; "-" en la Tabla 11) hasta varios cm ("+" en la Tabla 11).
Ejemplo de uso 6.2: Celulasa
Medio sólido de prueba de Celulasa: 2 g/l NaNO3, 1g/lK2HPO4, 0,5 g/l MgSO4, 0,5 g/l de KCI, 0,2 g/l de peptona, 15 g/l de agar, 10 g/l de quitina de caparazones de cangrejo (Sigma-Aldrich 419273).
El medio se esteriliza en autoclave y se vierte en placas de Petri de 9 cm. Las cepas dePaenibacillusse inoculan en el centro de las placas y se incuban durante dos días a 27 °C. Despues de la incubación, las placas se tiñen con una solución de Lugol diluida 1:3 (Carl Roth N052.2) durante 5 a 10 minutos. Se vierte la solución de Lugol y se fotografían las placas. Ejemplo de uso 6.3: Amilasa
Medio sólido de prueba de Amilasa: 2 g/l NaNO3, 1g/lK2HPO4, 0,5 g/l MgSO4, 0,5 g/l de KCI, 0,2 g/l de peptona, 15 g/l de agar, 10 g/l de almidón soluble (Merck 1.01252).
El medio se esteriliza en autoclave y se vierte en placas de Petri de 9 cm. Las cepas dePaenibacillusse inoculan en el centro de las placas y se incuban durante dos días a 27 °C. Despues de la incubación, las placas se tiñen con una solución de Lugol diluida 1:3 (Carl Roth N052.2) durante 5 a 10 minutos. Se vierte la solución de Lugol y se fotografían las placas.
Tabla 11: Actividades quitinasa, celulosa amilasa de cepas dePaenibacillus.
Ejemplo 7 - Metabolitos de tipo fusaricid ina obtenidos de cepas dePaenibacillus
Ejemplo 7.1: Cultivo a gran escala de aislados bacterianos y extracción de metabolitos tipo fusaricidina. a) Cultivo
Las cepas dePaenibacillusse cultivaron en placas de agar que contenían medio GYM (10 g/l de glucosa, 4 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de extracto de malta; pH 5,5, ajustado antes del tratamiento en autoclave) y 20 g/l de agar. El cultivo se realizó durante 10 a 20 días a temperatura ambiente. Para el mantenimiento se utilizaron agar inclinados con el mismo medio y se almacenaron a 4 °C.
Se inocularon cultivos líquidos a pequeña escala (250 ml de medio GYM en matraces de 500 ml) con 4-5 piezas de un cultivo de agar bien desarrollado y se cultivaron en un agitador orbital a 120 rpm a temperatura ambiente (20-23°C). Las fermentaciones a gran escala se realizaron en fermentadores de 20 l con 15 l de medio GYM (no se utilizó la capacidad total de los fermentadores debido a la formación de espuma) inoculados con 250 ml de cultivo líquido bien desarrollado y la fermentación se llevó a cabo a temperatura ambiente (20-23°C). con agitación (120 rpm) y aireación (3 l/min) durante 5 a 8 días.
b) Extracción
Se añadió un volumen igual de isopropanol al caldo de cultivo completo (no se realizó ninguna separación de la biomasa del cultivo líquido). Después de agitación e incubación durante 2 a 16 horas, se añadió a la mezcla sal de mesa común (cloruro de sodio - 100 a 200 g/l) hasta que fue visible la separación de fases de la fase orgánica y acuosa.
Entonces, el residuo se concentró al vacío. El extracto resultante, que todavía contenía una gran cantidad de sal, se disolvió en metanol, se centrifugó para una mejor precipitación de los residuos de sal y la fase orgánica se concentró nuevamente. Este paso se repitió hasta que ya no quedó presente ningún precipitado de sal.
c) Purificación
i) Cromatografía en gel de sílice
Se disolvieron 30 gramos de extracto en metanol y se unieron a 50 g de gel de sílice (Merck, K60, malla 70-230), se secaron a 40 °C y se colocaron en capas sobre 1 kg de gel de sílice (columna de 10 cm de diámetro, 30 cm de altura aprox. ).
La elución se llevó a cabo en cuatro pasos de la siguiente manera:
Paso 1- 4 I acetato de etilo
Paso 2- 4 I acetato de etilo:metanol (3:1, v/v)
Paso 3- 7 I acetato de etilo:metanol (1:1, v/v)
Paso 4- 4 I metanol
La tercera fracción (intermedia 1), que contenía los compuestos activos, se secó al vacío y se disolvió en metanol (MeOH) al 40 % en ácido fórmico (FA) al 0,1 % (concentración: 100 mg/ml). Las demás fracciones fueron descartadas.
ii) Fraccionamiento Chromabond HR-X
Se cargaron 20 ml del intermedio 1 en un cartucho Chromabond HR-X previamente equilibrado (con 40 % de MeOH en 0,1 % FA) (Macherey-Nagel, 1000 mg, ref 730941). El cartucho se lavó con 100 ml de MeOH al 40 % en FA al 0,1 % y se eluyó con 60 ml de MeOH al 70 % en FA al 0,1 %. A continuación, este intermedio 1-1 se secó al vacío.
iii) HPLC preparativa en una columna Sunfire C18
El intermedio 1-1 se disolvió en DMSO (concentración: 200 mg/ml) y 300 |jl del intermedio 1-1 se cromatografíaron en una columna Sunfire C18 (19 x 250 mm, 5 jm , Waters) de la siguiente manera:
16 min a 10 ml/min, isocrático 70% 0,2 FA; 30% acetonitrilo (ACN),
1 min a 14 ml/min, gradiente hasta 65 % 0,2 % FA; 35% A<c>N,
5 min a 14 ml/min, isocrático 65 % 0,2 % FA; 35% ACN.
Se pudieron detectar cinco fracciones. Las cinco fracciones resultantes se secaron al vacío y se disolvieron en DMSO (concentración: 125 mg/ml). Se realizó una purificación adicional utilizando la misma columna y condiciones isocráticas (flujo: 10,5 ml/min) ajustado para cada fracción (12,5 mg por ejecución):
Fracción 1: 69% 0,2 FA; 31% ACN; dos picos detectados (1-1 y 1-2)
Fracción 2: 69% 0,2 FA; 31% ACN; dos picos detectados (2-1 y 2-2)
Fracción 3: 69% 0,2 FA; 31% ACN; dos picos detectados (3- 1, 3-2 y 3-3)
Fracción 4/ 5: 67% 0,2 FA; 33% ACN; un pico detectado (4/5)
Fracción 6: 65% 0,2 FA; 35% ACN; dos picos detectados (6-1 y 6-2)
La pureza y cantidad de las siguientes muestras fueron suficientes para el análisis de RMN y la elucidación de la estructura: picos 1-2, 2-1, 3-2, 4/5 y 6-1.
Ejemplo 7.2: Elucidación estructural de los compuestos 1A y 1B.
Del pico 2-1 de la fracción 2, se obtiene una mezcla de compuestos 1A y 1B (proporción de aproximadamente 3:7) se obtuvo como un aceite marrón ([a]D25 = 20,9 (c = 0,6, DMSO-d6)).
La fórmula molecular C.47H78N10OH12 del componente principal, compuesto 1B, se dedujo del espectro HR-ESI-MS que dio un pico enm/z975,5863 [M+H]+; ESI-MS: 975,6 (100%, [M+H]+), 488,4 (51%, [M+2H]2+).
Además, la mezcla también contenía como componente menor, el homólogo más ligero. 1A, y la diferencia de masa entre ambos compuestos fue de 14 amu. Esta observación fue respaldada por un segundo pico observado en el espectro ESI-MS enm/z961,6.
Los espectros de RMN (Tabla 12) incluyeron además de señales de protones intercambiables entre 5 6,83 y 8,58, resonancias de carbonilo en el intervalo de 5 166,0-174,5 y señales de metino entre 547,8 y 560,4 indicativas para un péptido.
Análisis exhaustivo de los datos de RMN 1D y 2D del compuesto. 1B reveló la presencia de seis aminoácidos, entre ellos tirosina (Tyr), glutamina (Gln), alanina (Ala), dos treoninas (Thr1 y Thr2) e isoleucina (Ile). Su secuencia se encontró utilizando correlaciones de dos o tres enlaces entre funciones amida. Por lo tanto, los espectros COSY, NOESY (Fig. 2) y HMBC (Fig. 3) representaron correlaciones entre el protón nitrógeno de Thr2 en 5 8,58 y la señal del protón metino de Thr2 en 53,84 y el carbonilo en 5 166,7 de Tyr, mientras que Se observó la misma relación entre el protón nitrógeno de Tyr en 5 8,52 y la señal del protón metileno de Tyr en 52,60 y el carbonilo en 5 170,4 de Ile. Además, el hidrógeno de metino de lie en 54,16 tenía una fuerte correlación con la señal de carbonilo de lie en 5170,4 y un contacto débil con la de Thr1 en 5168,6; la señal del protón p-metino en 55,30 de Thr1 se correlacionaba con la señal del carbonilo en 5170,4 de Ala. Además de las correlaciones antes mencionadas, se mostraron otras desde el N-protón en 57,27 de Ala al protón metino en 54,20 del mismo aminoácido mientras que este último protón tuvo la misma interacción con el carbonilo de su amino y el de Gln. Además, se reveló un pico cruzado desde el protón intercambiable en 58,20 de Gln hasta el hidrógeno metino en 53,87 de Gln y el carbonilo de Thr2 en 5170,6; Estos datos mencionados anteriormente sugirieron la estructura ciclodepsipeptídica del compuesto. 1B.
Este ciclodepsipéptido 1B contenía un ácido graso p-hidroxi guanidina terminal unido a Thr1 ya que se observó una correlación clave entre la señal de su protón a-metino en 54,39 y la resonancia de un carbonilo en 5171,9; Se observaron además los contactos de HMBC desde ese carbonilo en 5 171,9 con los protones de a-metileno en 52,35 y el protón de p-metino en 53,77, así como entre los protones de metileno en 53,03 y el carbono de guanidina en 5 157,2. Se dedujo que la cadena lateral contenía doce grupos metileno entre el grupo p-hidroxi y el grupo guanidina basándose en el ion fragmento observado en el espectro APCI-MS-MS del [M+H]+ ion original.enm/z256,2. Asimismo, este espectro proporcionó información (Fig. 4b) que confirmó la secuencia de conexión de los aminoácidos y condujo a dilucidar la estructura del compuesto. 1B como se muestra en la figura 1.
Señales de un grupo CH2 en 2,80, 2,52/36,3 en los espectros 1D y 2D correspondía presumiblemente al grupo P-CH2 de asparagina (Asn) en el compuesto 1A. Esta conclusión fue respaldada por los datos reportados (Heterociclos 53, 1533 1549, 2000) junto con fragmentos obtenidos de MS/MS del pico original enm/z961,6 (figura 4a). Asimismo, estos últimos análisis proporcionaron información (Figs. 4a, 4b) que confirmó la secuencia de conexión de los aminoácidos en ambos compuestos y condujo a dilucidar la estructura de los compuestos. 1A y 1B como se muestra en la figura 1.
Ejemplo 7.3: Identificación estructural de los compuestos 2A y 2B como fusaricidinas C y D.
Del pico 1-2 de la fracción 1, se obtiene una mezcla de compuestos 2A y 2B (proporción de aproximadamente 1:1) se obtuvo como un aceite marrón. La fórmula molecular del componente más pesado, el compuesto. 2B, se determinó que era C46H76N10OH12 sobre la base de la espectrometría de masas de baja resolución. El análisis de los datos de<r>M<n>(Tabla 13) permitió identificar el compuesto 2B como fusaricidina D. El componente más ligero de la mezcla, compuesto 2A, también se identificó como fusaricidina C, en la que el residuo Gln de fusaricidina C se reemplaza por Asn.
El patrón de fragmentación espectrométrica de masas de los iones originales dem/z961,6 y 947,6 para compuestos 2B y 2A, respectivamente, (Figs. 5a, 5b) confirmó que la longitud de la cadena lateral del ácido graso sustituido es idéntica a la del compuesto 1B. Las fusaricidinas C y D han sido reportadas anteriormente por Kajimura et al. (J. Antibiot. 50, 220 228, 1997).
Ejemplo 7.4: Identificación estructural del compuesto 3 como LI-F08b.
Del pico 6-1 de la fracción 6, compuesto 3 se aisló como un aceite marrón y su baja resolución presentó un pico en m/z 925,6 [M+H]+ que, combinado con datos de RMN (Tabla 14), condujo a la fórmula molecular C44H80N10OH11. Compuesto 3 mostró características similares en los espectros de RMN como compuesto 1B y compuesto 2B (fusaricidina D) excepto por la presencia de señales aromáticas (Tabla 14). Así, se observaron resonancias características de un péptido, a saber, diez señales de protones unidos a nitrógeno entre 56,89 y 8,49, ocho resonancias de carbonilo oscilaron entre 5 168,1 y 174,3, y seis señales de N-metino comprendido entre 548,0 y 59,5. Un análisis detallado de los espectros HMQC, COSY y TOCSY reveló la presencia de seis aminoácidos, incluido Gln, dos unidades de Thr, dos unidades de lie y Ala. Además, estos espectros mostraron cambios químicos atribuibles al mismo ácido graso p-hidroxilo con una guanidina terminal como en los compuestos 1A, 1B y fusaricidinas C (2A) y D (2B). La posición de esta cadena lateral se determinó sobre la base de una correlación de largo alcance encontrada en el espectro HMBC entre la señal de protones de N-metino en 5 4,44 de Thr1 y la señal de carbonilo en 5 172,1 del ácido graso. La secuencia de los aminoácidos se dedujo de las interacciones NOESY y el patrón de fragmentación (Fig. 6).
La combinación de los datos de RMN (Tabla 14) y la espectrometría de masas llevaron a identificar el compuesto metabolito. 3 como LI-F08b, aquí también llamado fusaricidina LI-F08b, reportado por primera vez por Kuroda et al. (Heterocycles 53, 1533-1549, 2000).
Ejemplo 7.5: Identificación estructural de los compuestos 4A y 4B como LI-F06a y LI-F06b y de los compuestos 5A y 5B como fusaricidina A y B, respectivamente
Del pico 4/5 de la fracción 4/5, una mezcla de dos metabolitos más, compuestos 4A y 4B (relación de aproximadamente 1:3), se obtuvo lo que dio dos picos enm/z897,5 (4A) y 911, 6 (4B) en el espectro ESI-MS, lo que sugiere dos cidodepsipéptidos homólogos más. Se observaron resonancias indicativas de péptidos en sus espectros de RMN (Tabla 15), así como las de un ácido graso p-hidroxilo que termina en un grupo guanidina. Los patrones de fragmentación de ambos iones originales encontrados para los compuestos. 4A y 4B (Figs. 7a, 7b) permitieron determinar la secuencia de aminoácidos e identificar los constituyentes de la mezcla como LI-F06a. (4A) y LI-F06b (4B), respectivamente.
Del pico 1-2 de la fracción 1, se obtiene una mezcla de compuestos 5A y 5B (proporción de aproximadamente 1:1) se analizó de la misma manera. El espectro de masas ESI de la mezcla mostró dos picos enm/883,6(5A) y 897, 5 (5B) y los patrones de fragmentación de estos iones originales (Figs. 8a, 8b) junto con los datos de RMN (Tabla 16) permitieron identificar los componentes como fusaricidina A. (5A) y fusaricidina B (5B). Los datos encontrados para 4A, 4B, 5A y 5B coincidieron con los reportados anteriormente. (J. Antibiot. 50, 220-228, 1997; Heterocycles 53, 1533-1549, 2000).
Tabla 12. 1H DMSO-d6, 600 MHz 13C-RMN DMSO-d6, 150 MHz datos de compuestos 1A 1B.
Tabla 13. 1H (DIVISOR, 600 MHz) y 13C-RMN (DIVISOR, 150 MHz) datos de compuestos 2A y 2B.
Tabla 14. 1H (DMSO-da, 600 MHz) y 13C-RMN (DMSO-da, 150 MHz) datos del compuesto 3 siendo LI-F08b.
Tabla 15. 1H (DMSO-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (DMSO-d6, 150 MHz) datos de compuestos 4A y 4B.
Tabla 16. 1H (DMSO-da, 600 MHz) y 13C-RMN (DMSO-da, 150 MHz) datos de compuestos 5A y 5B.
No se llevaron a cabo experimentos de hidrólisis para determinar la configuración de los aminoácidos constituyentes.
Ejemplo 8 - Caracterización de metabolitos producidos por las cepas dePaenibacillus
Ejemplo 8.1: Producción de metabolitos por cepas dePaenibacillus
La presencia de fusaricidinas en general y en particular de las fusaricidinas A, B, C, D, Ll-F06a, LI-F06b, LI-F08b, 1A y 1B fue determinado para las cepas dePaenibacillussiguiendo los pasos del procedimiento que se describen en el Ejemplo 7.1 anterior.
Tabla 17: Producción de metabolitos tipo fusaricidina de las cepas dePaenibacillus.
El caldo de cultivo completo de todas las cepas dePaenibacillusLu16774, Lu17007 y Lu17015 contenían al menos una fusaricidina identificada en el Ejemplo 7 (Tabla 17). Ninguna de estas fusaricidinas fue detectada en el caldo de cultivo completo de Ppeoriaecepa BD-62.
El caldo de cultivo completo de las cepas dePaenibacillusLu16774, Lu17007 y Lu17015 contenían fusaricidinas 1A y 1B. Además, el caldo de cultivo completo de las cepas dePaenibacillusLu16774, Lu17007 y Lu17015 contenían fusaricidinas A, B, C y D, así como LI-F08b. Además, el caldo de cultivo completo de las cepas dePaenibacillusLu17007 y Lu17015 contenían fusaricidinas LI-F06a y LI-F06b.
Fusaricidinas 1A y 1B no se detectaron en el caldo de cultivo completo de la cepa estrechamente relacionadaP. peoriaecepa BD-62. Las fusaricidinas A, B, C y D, LI-F06a, LI-F06b y LI-F08b tampoco estaban en el caldo de cultivo completo de Ppeoriaecepa BD-62.
Ejemplo 9: Actividad de los metabolitos por cepas dePaenibacilluscontra diversos patógenos fúngicos Las fusaricidinas A, B, D, 1A y 1B Se obtuvieron y se utilizaron en los siguientes experimentos.
Los ensayos de crecimiento fúngico se realizaron en placas de 96 pocillos con suspensión de esporas del patógeno.Botritis cinerea(BOTRCI, en YBA [10 g de Bacto peptona (Becton Dickinson 211677), 10 g de extracto de levadura (Becton Dickinson 212750), 20 g de acetato de sodio, y 1000 ml de agua bidest] oAlternaría solani(ALTESO, en YBG [10 g de Bacto peptona (Becton Dickinson 211677), 10 g de extracto de levadura (Becton Dickinson 212750), 20 g de glicerina al 99 %, y 1000 ml de agua bidest]). Las fusaricidinas y los compuestos 1A y 1B se disolvieron y diluyeron en DMSO. Se pipetearon en la placa de microtitulación diferentes concentraciones que oscilaban desde 60 |jM hasta 0,3 |jM. Se agregó una suspensión acuosa de 104 esporas/ml. Las placas se incubaron a aproximadamente 18 °C. El crecimiento fúngico se determinó midiendo la densidad óptica a 600 nm en un lector de microplacas 3 y 7 días después de la inoculación de las esporas y se comparó con el control no tratado (DMSO). IC50 (la concentración [|jM] del respectivo metabolito necesaria para una inhibición del 50 % del crecimiento fúngico) se ha determinado a continuación.
En particular, los compuestos 1A y 1B mostraron la mayor eficacia antifúngica con valores de IC50 de 0,4-0,6 j M (Tab. 18).
Tabla 18. Inhibición del crecimiento antifún ico de metabolitos dePaenibacillusvalores de IC50
Además, se realizaron ensayos en invernadero con fusaricidinas 1A y 1B como se describe en los Ejemplos de uso 5.1 a 5.5 anteriores para los patógenos respectivos.Botritis cinerea(BOTRCI),Alternaria solani(ALTESO),Phytophthora infestans(PHYTlN),Phakopsora pachyrhizi(PHAKPA) yFusarium graminearum(GIBBZE). El alcance del ataque fúngico a las hojas se evaluó visualmente 5-7 días después de la inoculación.
En particular, los compuestos 1A y 1B fueron eficaces para controlar enfermedades fúngicas importantes en plantas de cultivo ya a niveles de dosis tan bajas como 7,2 ppm y mostraron una eficacia antifúngica mayor que la fusaricidina A, B y D (Tablas 19 a 21).
Tabla 19. Se determina la eficacia antifún ica de los metabolitos.in lanta.
Tabla 20. Eficacia de los metabolitos contra el tizón tardío en tomate causado porPhytophthora infestanscon aplicación r r .
Tabla 21. Eficacia de los metabolitos contra el tizón de la espiga en trigo causado porFusarium graminearumcon aplicación protectora.
Tabla 22. Eficacia de los metabolitos contra el tizón de la espiga del trigo causado porSeptoria triticicon aplicación rotectora.
Ejemplo 10: Comparación de la actividad dePaenibacillus polymyxanov. ssp.plantarumcepas Lu16674 y Lu17007 conPaenibacillus polymyxanov. ssp.plantarumM-1 contra diversos patógenos en ensayos en invernadero
Caldo de cultivo completo procedente de cultivos de 6 días de antigüedad. de la cepa dePaenibacillusLu17007, Lu16674 Lu17007 se obtuvo según el Ejemplo de uso 3 y se usó como en la configuración experimental del Ejemplo de uso 5.1 a 5.5. Las pruebas en invernadero se realizaron como se describe en los Ejemplos de uso 5.2 y 5.5 anteriores para los patógenos respectivos.. El alcance del ataque fúngico a las hojas se evaluó visualmente 5-7 días después de la inoculación.
Notablemente, las cepas dePaenibacillusLu16774 y Lu17007 fueron efectivas para controlar enfermedades fúngicas importantes en plantas de cultivo incluso con factores de dilución altos y mostraron una mayor eficacia antifúngica que la cepa M-1 estrechamente relacionada (Tablas 22 a 27).
Tabla 22.
Tabla 23.
Ejemplo 11: Ejemplos relativos a las mezclas y composiciones de la invención.
Los compuestos activos se formularon por separado como una solución madre que tenía una concentración de 10.000 ppm en dimetilsulfóxido. Como formulación experimental se utilizóPaenibacillusLU 17007 y se diluyó con agua hasta la concentración indicada del compuesto activo. El producto picarbutrazox se usó como formulaciones comerciales terminadas y se diluyó con agua hasta la concentración indicada del compuesto activo.
1. Actividad contra el moho gris.Botritis cinereaen la prueba de microtitulación (Botrci)
Las soluciones madre se mezclaron según la proporción, se pipetearon sobre una placa de microtitulación (MTP, por sus siglas en inglés) y se diluyeron con agua hasta las concentraciones indicadas. Luego se añadió una suspensión de esporas deBotrci cinereauna solución acuosa de biomalta o levadura-bactopeptona-acetato de sodio. Las placas se colocaron en una cámara saturada de vapor de agua a una temperatura de 18°C. Utilizando un fotómetro de absorción, se midieron las MTP a 405 nm 7 días después de la inoculación. Los resultados se muestran en la Tabla 28.
2. Actividad contra el tizón del arrozPyriculafia oryzaeen la prueba de microtitulación (Pyrior)
Las soluciones madre se mezclaron según la proporción, se pipetearon sobre una placa de microtitulación (MTP, por sus siglas en inglés) y se diluyeron con agua hasta las concentraciones indicadas. Luego se añadió una suspensión de esporas deBotrci cinereauna solución acuosa de biomalta o levadura-bactopeptona-acetato de sodio. Las placas se colocaron en una cámara saturada de vapor de agua a una temperatura de 18°C. Utilizando un fotómetro de absorción, se midieron las MTP a 405 nm 7 días después de la inoculación. Los resultados se muestran en la Tabla 29.
3. Actividad contra la mancha foliar moteada en trigo causada porSeptoria tritici(Septtr)
Las soluciones madre se mezclaron según la proporción, se pipetearon sobre una placa de microtitulación (MTP, por sus siglas en inglés) y se diluyeron con agua hasta las concentraciones indicadas. Luego se añadió una suspensión de esporas deSeptoria triticiuna solución acuosa de biomalta o levadura-bactopeptona-acetato de sodio. Las placas se colocaron en una cámara saturada de vapor de agua a una temperatura de 18°C. Utilizando un fotómetro de absorción, se midieron las MTP a 405 nm 7 días después de la inoculación. Los resultados se muestran en la Tabla 30.
4. Actividad contra el tizón temprano causado porAlternaria solani(Alteso)
Las soluciones madre se mezclaron según la proporción, se pipetearon sobre una placa de microtitulación (MTP, por sus siglas en inglés) y se diluyeron con agua hasta las concentraciones indicadas. Luego se añadió una suspensión de esporas deAlternaria solanien una solución acuosa de biomalta o levadura-bactopeptona-acetato de sodio. Las placas se colocaron en una cámara saturada de vapor de agua a una temperatura de 18°C. Utilizando un fotómetro de absorción, se midieron las MTP a 405 nm 7 días después de la inoculación. Los resultados se muestran en la Tabla 31.
5. Actividad contra las manchas foliares del trigo causadas porLeptosphaeria nodorum(Leptno)
Las soluciones madre se mezclaron según la proporción, se pipetearon sobre una placa de microtitulación (MTP, por sus siglas en inglés) y se diluyeron con agua hasta las concentraciones indicadas. Luego se añadió una suspensión de esporas deLeptosphaeria nodorumen una solución acuosa de biomalta o levadura-bactopeptona-acetato de sodio. Las placas se colocaron en una cámara saturada de vapor de agua a una temperatura de 18°C. Utilizando un fotómetro de absorción, se midieron las MTP a 405 nm 7 días después de la inoculación. Los resultados se muestran en la Tabla 32. Los parámetros medidos se compararon con el crecimiento de la variante de control libre de principio activo (100 %) y el valor en blanco libre de hongo y libre de principio activo para determinar el crecimiento relativo en % de los patógenos en los respectivos compuestos activos.
Estos porcentajes se convirtieron en eficacias.
Cálculo de la eficacia esperada (Ecolby) usando la fórmula de Colby
Las eficacias esperadas de las combinaciones de compuestos activos se determinaron utilizando la fórmula de Colby (Colby, SR. "Cálculo de respuestas sinérgicas y antagónicas de combinaciones de herbicidas", Weeds 15, págs. 20-22, 1967) y se compararon con las eficacias observadas.
Fórmula de Colby: EColby = P<a>+ P<b>- P<a>* P<b>/ 100
Ecolby eficacia esperada, expresada en % del control no tratado, cuando se utiliza la mezcla de los compuestos activos A y B en las concentraciones a y b
P<a>eficacia, expresada en % del control no tratado, cuando se utiliza el compuesto activo A en la concentración a P<b>eficacia, expresada en % del control no tratado, cuando se utiliza el compuesto activo B en la concentración b.
Cálculo del Factor de Sinergia (SF)
Para una determinación de sinergismo el Factor de Sinergia (SF) entre la eficacia experimental observada de las mezclas EMedido y la eficacia esperada de la mezcla Ecolby se calcula como
SF = Emedido/EColby
Un factor de sinergia mayor o menor que 1 indica una desviación de la hipótesis de acción independiente, lo que significa que biológicamente los dos componentes actúan juntos o uno contra el otro. Si SF > 1, se observa sinergismo; si SF <1, se observa antagonismo.
Tabla 28. Botrci
T l 2. P ri r
T l . r
Tabla 31. Alteso
El mefentrifluconazol es 2-[4-(4-clorofenoxi)-2-(trifluorometil)fenil]-1-(1H-1,2,4-triazol-1-il)propan-2-ol.
Tabla 32. Le tno
El mefentrifluconazol es 2-[4-(4-clorofenoxi)-2-(trifluorometil)fenil]-1-(1H-1,2,4-triazol-1-il)propan-2-ol.
Breve descripción de las figuras:
Figura 1. Compuestos 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4A, 4B, 5A y 5B.
Figura 2. Correlaciones clave NOESY y COZY del compuesto 1B.
Figura 3. Correlación HMBC del compuesto. 1B.
Figura 4. Patrones de fragmentación a) de compuesto 1A y b) de compuesto 1B.
Figura 5. Patrones de fragmentación a) de compuesto 2A (fusaricidina C) y b) de compuesto 2B (fusaricidina D).
Figura 6. Patrón de fragmentación del compuesto 3 (LI-F08b).
Figura 7. Patrones de fragmentación a) de compuesto 4A (LI-F06a) y b) de compuesto 4B(- F06b).
Figura 8. Patrones de fragmentación a) de compuesto 5A (fusaricidina A) y b) de compuesto 5B (fusaricidina B).
Figura 9 muestra el porcentaje de identidad de la secuencia completa de ADNr 16S de las cepas dePaenibacillusde la invención a taxones relacionados después de un alineamiento de secuencias múltiples.
Leyenda: * Números de cepa: 1 =Paenibacilluscepa Lu16774; 2 =Paenibacilluscepa Lu17015; 3 =Paenibacilluscepa Lu17007; 4 =Paenibacilluspeoriae NRRL BD-62; 5 =Paenibacillusanaericanus MH21; 6 =Paenibacillusbrasiliensis PB172; 7 =Paenibacilluscampinasensis 324; 8 =Paenibacilluschibensis JCM 9905; 9 =Paenibacillusglucanolyticus DSM 5162; 10 =Paenibacillushunanensis FeL05; 11 =Paenibacillusjamilae CECT 5266; 12 =Paenibacilluskribbensis AM49:
13 =Paenibacilluslactis MB 1871; 14 =Paenibacilluslautus JCM 9073; 15 =Paenibacillusmacerans IAM 12467: 16 =Paenibacillus massiliensis2301065: 17 =Paenibacillus pabuliHSCC 492; 18 =Paenibacillus peoriaeDSM 8320 (BD-57); 19 =pino PaenibacillusS22; 20 =Paenibacillus polymyxaIAM 13419; 21 =Paenibacillus purispatiiES_MS17; 22 =Paenibacillus sediminisGT-H3; 23 =Paenibacillus terraeAM141; 24 =Paenibacillus terrigenaA35; 25 =Paenibacillus timonensis2301032; 26 =Paenibacillus turicensisMOL722; 27 =Paenibacillus uliginisN3/975; 28 =Cohnella termotoleranteCCUG 47242. Las cepas 6 a 28 son cepas tipo para las respectivas especies.
Similitudes de las cepas Lu16774, Lu17007 y Lu17015 conPaenibacillus peoriae(N<r>RL BD-62 y DSM 8320) se han marcado en negrita.
Figura 10 muestra un dendrograma filogenético calculado a partir del % de identidad de las secuencias de ADNr 16S de las cepas dePaenibacillusde la invención con otros taxones (Fig. 9). La raíz del árbol se determinó incluyendo la secuencia del gen 16S rRNA deCohnella termotolerantesen el análisis. La barra de escala debajo del dendrograma indica sustituciones de 1 nucleótido por cada 100 nucleótidos.
Figura 11 muestra el patrón RiboPrint obtenido de muestras de las cepas dePaenibacillusde la invención en comparación con una muestra de las cepas estrechamente relacionadas Ppeoriaecepa BD-62 utilizando el sistema de caracterización microbiana Ribo-Printer y un dendrograma filogenético resultante del mismo.
Figura 12 muestra el porcentaje de identidad de la secuencia completa de ADNr 16S de las cepas dePaenibacillusde la invención a taxones relacionados después de un alineamiento de secuencias múltiples. Leyenda: * Números de cepa: 1 =Paenibacilluscepa Lu16774; 2 =Paenibacilluscepa Lu17007; 3 =Paenibacilluscepa Lu17015; 4 = P. peoriae DSM 8320T = KCTC 3763T (núm ero de acc GenBank AGFX00000000; J. Bacteriol. 194, 1237-1238, 2012); 5 = Ppolymyxa1-43 (número de acceso de GenBank ASRZ01000000; número de depósito GCMCC 4965; CN 102352332B); 6 = PpolymyxaA18 (número de acceso de GenBank JWJJ00000000.1; ID de proyecto NCBI 225496); 7 = PpolymyxaATCC 842t = DSM 36t = KCTC 3858t (número de acceso de GenBank AFCX00000000; J. Bacteriol. 193(18), 5026-5027, 2011); 8 = PpolymyxaCF05 (número de acceso GenBank CP009909; Genome Annunc 3(2):e00198-15. Doi:10.1128/genomaA.00198-15); 9 = PpolymyxaCICC 10580 (número de acceso de GenBank<j>N<c>B00000000; Genome Annunc. 2(4):e00854-14. doi:10.1128/genomaA.00854-14); 10 = PpolymyxaDSM 365 (número de acceso GenBank JMIQ00000000; J. Biotecnología. 195(18), 72-73, 2015); 11 = PpolymyxaE681 (número de acceso GenBank CP000154; Genome Annunc 3(2):e00198-15. 192(22), 6103-6104, 2010); 12 = PpolymyxaM-1 (número de acceso GenBank HE577054.1; GenomeNet Ref Seq NC_017542.1); 13 = PpolymyxaNr Rl B-30509 (número de acceso de GenBank JTHO00000000; Genome Annunc. 2015 marzo-abril; 3(2): e00372-15); 14 = PpolymyxaSC2 (número de acceso GenBank CP002213; J. Bacteriol. 193(1), 311-312, 2011); 15 = PpolymyxaSQR-21 (número de acceso GenBank CP006872; Genome Annunc 3(1):e00198-15. 2014 Mar-Apr; 2(2): e00281-14); 16 = PpolymyxaSb3 -1 (número de acceso de GenBank CP010268; Genome Annunc. 2015 marzo-abril; 3(2): e00052-15); 17 = PpolymyxaTD94 (número de acceso de GenBank ASSA00000000); 17 = PpolymyxaWLY78 (número de acceso de GenBank ALJV00000000);P.terraeHPL-003 (número de acceso de GenBank CP003107; NCBI Ref Seq NC_016641.1); PpolymyxaCR1 (número de acceso GenBank CP006941; Genome Annunc. 2014 Jan-Feb; 2(1): e01218-13).
La Figura 13 muestra el porcentaje de identidad de la secuencia de ADN del gen gyrB completo de las cepas dePaenibacillusde la invención con cepas dePaenibacillusrelacionadas después de un alineamiento de secuencia múltiple. Los números de cepa se describen en la leyenda de la Fig. 12.
La Figura 14 muestra el porcentaje de identidad de la secuencia de ADN del gen recF completo de las cepas dePaenibacillusde la invención con cepas dePaenibacillusrelacionadas después de un alineamiento de secuencias múltiples. Los números de cepa se describen en la leyenda de la Fig. 12.
La Figura 15 muestra el porcentaje de identidad de la secuencia de ADN del gen recN completo de las cepas dePaenibacillusde la invención con cepas dePaenibacillusrelacionadas después de un alineamiento de secuencias múltiples. Los números de cepa se describen en la leyenda de la Fig. 12.
La Figura 16 muestra el porcentaje de identidad de la secuencia de ADN del gen rpoA completo de las cepas dePaenibacillusde la invención con cepas dePaenibacillusrelacionadas después de un alineamiento de secuencias múltiples. Los números de cepa se describen en la leyenda de la Fig. 12.
La Figura 17 muestra el denrograma de máxima verosimilitud basándose en la secuencia del gen completoadnNde cepas del complejo Ppolymyxa .La escala de 0,1 mostrada corresponde a un 1 % de intercambios de nucleótidos.
Figura 18 muestra el denrograma de máxima verosimilitud basándose en la secuencia del gen completogyrBde cepas del complejo Ppolymyxa.La escala de 0,1 mostrada corresponde a un 1 % de intercambios de nucleótidos.
La Figura 19 muestra el denrograma de máxima verosimilitud basándose en la secuencia del gen completo recF de cepas del complejo Ppolymyxa .La escala de 0,1 mostrada corresponde a un 1 % de intercambios de nucleótidos.
La Figura 20 muestra el denrograma de máxima verosimilitud basándose en la secuencia del gen completo recN de cepas del complejo Ppolymyxa.La escala de 0,1 mostrada corresponde a un 1 % de intercambios de nucleótidos.
La Figura 21 muestra el denrograma de máxima verosimilitud basándose en la secuencia del gen completorpoAde cepas del complejo Ppolymyxa .La escala de 0,1 mostrada corresponde a un 1 % de intercambios de nucleótidos.
Figura 22 muestra la matriz del índice de aminoácidos (AAI) de genomas representativos de la Ppolymyxacomplejo realizado según el Ejemplo 2.5. Los números de cepa se describen en la leyenda de la Fig. 12.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una mezcla que comprende como componentes activos 1) al menos una cepa dePaenibacillus, en donde al menos una cepa dePaenibacillusse selecciona del grupo que consiste en: a) Paenibacilluscepa Lu16774 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26969; b) Paenibacilluscepa Lu17007 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26970; c) Paenibacilluscepa Lu17015 depositada en DSMZ con el número de acceso DSM 26971; y d) una cepa bacteriana que comprende una secuencia de ADN que exhibe d1) al menos 99,6 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:9; o d2) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:14; o d3) al menos 99,9 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:10; o d4) al menos 99,2 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:15; o d5) al menos 99,2 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11; o d6) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:16; o d7) al menos 99,8 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:12; o d8) al menos 99,3 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:17; o d9) 100,0 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de ADN SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:13; o d10) al menos 99,9 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de ADN SEQ ID NO:18. donde dicha al menos una cepa dePaenibacilluses capaz de producir al menos uno de los siguientes compuestos:
    en un medio de crecimiento que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno y 2) al menos un pesticida II seleccionado entre los siguientes compuestos: A) Inhibidores de la respiración - Inhibidores del complejo III en el sitio Qo: azoxistrobina, dimoxistrobina, orisastrobina, picoxistrobina, piraclostrobina, trifloxistrobina; - inhibidores del complejo II: benzovindiflupir, bixafeno, fluopiram, fluxapiroxad, penflufeno, pentiopirad, sedaxano, siltiofam; B) Inhibidores de la biosíntesis de esteroles (fungicidas SBI) - Inhibidores de la desmetilasa C14: difenoconazol, epoxiconazol, ipconazol, metconazol, protioconazol, tebuconazol, triadimenol, triticonazol, 2-[4-(4-clorofenoxi)-2-(trifluorometil)fenil]-1-(1,2,4-triazol) -1-il)propan-2-ol, procloraz, C) Inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos - fungicidas de fenilamidas o acilaminoácidos: metalaxil, metalaxil-M; D) Inhibidores de la división celular y del citoesqueleto -inhibidores de tubulina: tiabendazol, tiofanato de metilo, etaboxam; E) Inhibidores de la síntesis de aminoácidos y proteínas -inhibidores de la síntesis de metionina: pirimetanilo; F) Inhibidores de la transducción de señales -Inhibidores de MAP/histidina quinasa: fludioxonil; G) Inhibidores de la síntesis de lípidos y membranas -biosíntesis de fosfolípidos y depósito de pared celular: dimetomorfo; H) Inhibidores con acción multisitio -tio- y ditiocarbamatos: tiram: K) Modo de acción desconocido -picarbutrazox, en donde la mezcla comprende el componente 1) y el componente 2) en una cantidad sinérgicamente eficaz. 2.
  2. 2. La mezcla según la reivindicación 1, donde dicho al menos una cepa dePaenibacillustiene actividad antifúngica contra al menos dos de los patógenos vegetales seleccionados del grupo que consiste enAlternaríaspp.,Botrytis cinerea, Phytophthora infestansySclerotinia sclerotiorum. 3.
  3. 3. La mezcla según la reivindicación 1 ó 2, donde el componente 1) comprende un cultivo sustancialmente purificado de al menos una cepas dePaenibacilluscomo se define en la reivindicación 1 o 2. 4.
  4. 4. La mezcla según una de las reivindicaciones 1 a 3, donde el componente 1) contiene al menos un metabolito seleccionado entre los grupos de polimixinas, octapeptinas, polipeptinas, pelgipeptinas y fusaricidinas. 5.
  5. 5. La mezcla de la reivindicación 4, donde al menos un metabolito se selecciona de fusaricidinas de
    en donde R se selecciona entre ácido 15-guanidino-3-hidroxipentadecanoico (GHPD) y ácido 12-guanidinododecanoico (12-GDA); X1 es treonina: X2 se selecciona de entre isoleucina y valina; X3 se selecciona de entre tirosina, valina, isoleucina y fenilalanina; X4 es treonina: X5 se selecciona de entre glutamina y asparagina; X6 es alanina; y donde una flecha define un enlace simple (amida) ya sea entre el resto carbonilo de R y el grupo amino del aminoácido X1 o entre el grupo carbonilo de un aminoácido y el grupo amino de un aminoácido vecino, donde la punta del la flecha indica la unión al grupo amino de dicho aminoácido X1 o de dicho aminoácido vecino; y donde la línea simple sin punta de flecha define un enlace simple (éster) entre el grupo carbonilo de X6 y el grupo hidroxilo de X1.
  6. 6. Una composición que comprende una mezcla como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un auxiliar. 7.
  7. 7. La composición de la reivindicación 6, que comprende además un pesticida III seleccionado de los grupos SF) y SI): SF) Fungicidas - inhibidores del complejo III en el sitio Qo seleccionado de: piraclostrobina, azoxistrobina, picoxistrobina, trifloxistrobina, dimoxistrobina, enestroburina, fenaminstrobina, fluoxastrobina, kresoxim-metilo, mandestrobina, metominostrobina, orisastrobina, pirametostrobina, piraoxistrobina; - inhibidores de piridina y pirazol de amplio espectro del complejo II seleccionados entre: fluxapiroxad, boscalid, benzovindiflupir, penflufen, pentiopirad, sedaxano, fluopiram, bixafen, isopirazam; - inhibidores del complejo II específicos de basidiomicetos seleccionados entre: carboxina, benodanil, fenfuram, flutolanil, furametpir, mepronil, oxicarboxina, tifluzamida; inhibidor de la producción de ATP, siltiofam; - compuestos fungicidas de azol seleccionados entre: ipconazol, difenoconazol, protioconazol, procloraz, triticonazol, flutriafol, ciproconazol, diniconazol, diniconazol-M, fluquinconazol, flusilazol, hexaconazol, imazalil, imibenconazol, metconazol, miclobutanil, simeconazol, tebuconazol, triadimenol, uniconazol, tiabendazol; - fungicidas oomicetos seleccionados entre: oxatiapiprolina, valifenalato, metalaxil, metalaxil-M, etaboxam, dimetomorfo, zoxamida, flumorfo, mandipropamida, pirimorfo, bentiavalicarb, iprovalicarb; -Inhibidores de MAP/histidina quinasa: fludioxonil; - compuestos de bencimidazol seleccionados entre: tiofanato de metilo, carbendazim; - compuestos de ditiocarbamato seleccionados entre: tiram, ziram; SI) Insecticidas - Compuestos antagonistas de GABA seleccionados entre: fipronil, etiprol, vaniliprol, pirafluprol, piriprol, 5-amino-1-(2,6-dicloro-4-metil-fenil)-4-sulfinamoil-1 H-pirazol-3-carbotioico amida ácida; - inhibidores del receptor de rianodina específicos de lepidópteros seleccionados entre: clorantraniliprol y flubendiamida; - inhibidor del receptor de rianodina de espectro cruzado: ciantraniliprol; - moduladores piretroides de los canales de sodio seleccionados entre: teflutrina, bifentrina, cipermetrina, alfacipermetrina, ciflutrina, beta-ciflutrina, lambda-cialotrina, deltametrina, esfenvalerato, etofenprox, fenvalerato, flucitrinato, permetrina; - compuestos neonicotinoides sistémicamente activos: clotianidina, imidacloprid, tiametoxam, dinotefurano, acetamiprid, flupiradifurona, tiacloprid, triflumezopirim, nitenpiram; - Inhibidores de la acetilcolinesterasa, activadores de los canales de cloruro y sulfoximinas: sulfoxaflor, acefato, clorpirifos, tiodicarb, abamectina, espinosad; - otro insecticida: tioxazafen. 8. 8. Un material de propagación de plantas que tiene un recubrimiento que comprende una composición como se define en la reivindicación 6 o 7. 9.
  8. 8. El uso de una mezcla como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición como se define en la reivindicación 6 o 7 para controlar o suprimir patógenos vegetales en plantas o prevenir la infección de plantas por patógenos vegetales o para proteger materiales contra la infestación y destrucción por microorganismos dañinos. 10. Un método para controlar, suprimir patógenos en plantas o prevenir la infección de plantas por patógenos, donde los patógenos, su hábitat o los materiales o plantas a proteger contra el ataque de patógenos, o el suelo o material de propagación se tratan con una cantidad eficaz de una mezcla como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o con una cantidad eficaz de una composición como se define en la reivindicación 6 o 7.
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