CN113667621B - 一种吉伦伯不动杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种吉伦伯不动杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明一方面提供了吉伦伯不动杆菌jzc708，另一方面提供了该吉伦伯不动杆菌jzc708在降解农药中的应用。本发明从金针虫虫体内分离得到一株不动杆菌，该菌株经可靠的多重鉴定方法被鉴定为吉伦伯不动杆菌(Acinetobacter gyllenbergii)，该菌能够有效降解农药，为后续生物降解农药提供了一种新思路。

Description

一种吉伦伯不动杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种吉伦伯不动杆菌及其应用。
背景技术
农药是防控病虫害发生与危害的重要方法，由于长期使用带来农林产品农药残留超标、作物药害、环境污染及食品安全等问题，在土壤中难以降解尤为严重，已经成为农业环境污染的主要污染源之一，对人们生命健康造成威胁。
目前，农药污染的处理方法很多，但是与其他化学、物理以及动植物降解法相比，微生物具有降解速度快、降解彻底、不产生二次污染的优势。不动杆菌(Acinetobacterspp.)是蚕、夜蛾、蚊子等昆虫肠道中一种优势共生菌，在昆虫的卵和幼虫肠道中均有分布，不仅参与血液的消化吸收，还能够通过降解寄主植物分泌的毒性化合物以及农药，从而保护其宿主昆虫进食后不受毒性影响。
吉伦伯不动杆菌(Acinetobacter gyllenbergii)jzc708菌株是从地下害虫金针虫虫体中分离获得，农药降解效果显著，是解决土壤中农药残留问题，实现农林业绿色发展不可或缺的产品。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种吉伦伯不动杆菌及其应用的技术方案。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明一方面提供了吉伦伯不动杆菌jzc708，其保藏号为CGMCC No.22934，保藏时间为2021年07月21日，建议分类命名为吉伦伯不动杆菌(Acinetobactergyllenbergii)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明另一方面提供了吉伦伯不动杆菌的培养方法，具体为将所述吉伦伯不动杆菌接种于发酵NA培养基中，封口后置于温度为28℃的摇床中震荡培养。
本发明另一方面提供了吉伦伯不动杆菌(Acinetobacter gyllenbergii)jzc708在降解农药中的应用。
进一步，所述农药为硫代磷酸酯类农药或苯基吡唑类农药。
进一步，所述农药为毒死蜱或氟虫腈。
本发明另一方面提供了农药降解剂，其由吉伦伯不动杆菌(Acinetobactergyllenbergii)jzc708制备得到。
进一步，所述农药降解剂包括吉伦伯不动杆菌(Acinetobacter gyllenbergii)jzc708的菌体和代谢产物中的至少一种。
进一步，所述农药为硫代磷酸酯类农药或苯基吡唑类农药。
进一步，所述农药为毒死蜱或氟虫腈。
本发明从金针虫虫体内分离得到一株不动杆菌，该菌株经可靠的多重鉴定方法被鉴定为吉伦伯不动杆菌(Acinetobacter gyllenbergii)，该菌能够有效降解农药，为后续生物降解农药提供了一种新思路。
附图说明
图1为金针虫组织液细菌菌落；
图2为基于不动杆菌16s rRNA构建的NJ树；
图3为吉伦伯不动杆菌形态图；
图4为吉伦伯不动杆菌生长曲线；
图5为吉伦伯不动杆菌对农药的降解能力，图中从左至右分为毒死蜱、氟虫腈、噻虫胺和辛硫磷。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1：吉伦伯不动杆菌jzc708的分离和鉴定
1实验材料
1.1供试昆虫
金针虫于4月初在浙江省湖州市德清县上柏村竹笋市场(119°57′27″E，30°29′13″N)采集，挑选虫体大小一致，质量为1.2g-1.4g，饲养于423cm×283cm×222cm塑料箱中暗处理，土壤装箱至2/3处，(全年室温22±1℃，相对湿度60％±10％，土壤湿度10％±1％)，笋期喂养鲜笋，供试。
1.2培养基
表1培养基配方
Figure BDA0003263777120000031
1.3试剂及主要实验仪器
DNA提取试剂盒(No.9765)(TaKaRa，日本)、非发酵细菌生化编码鉴定试剂盒(广东环凯微生物科技有限公司，中国)、PCR Mix(KT201)(天根生化科技有限公司，中国)；KQ-250DV型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司，中国)、LifeECO-PCR仪(杭州博日科技有限公司，中国)、SIGMA-3K15离心机(北京五洲东方科技发展有限公司，德国)、凝胶电泳仪DYCP-31DN(北京六一仪器厂，中国)、凝胶拍照系统JS-2000(上海培清科技有限公司，中国)。引物由杭州市尚亚生物科技公司合成。
2实验方法
2.1金针虫内含物提取
随机选择足量金针虫断食3d后，超声波水浴震荡清洗5min，置于4℃冰箱10min使其活力减弱，75％酒精消毒浸泡90s，无菌水漂洗3次；每3头虫一个重复，无菌条件下解刨刮取体内所有体液与组织，装入1.5mL离心管并滴加1mL无菌水混匀备用。
2.2金针虫体内不动杆菌分离纯化
将2.1所得组织液进行10-1梯度稀释，得到10-1、10-2、10-3混合液分别划线涂板，28℃恒温培养箱中培养48h，每12h观察一次。根据菌落颜色、培养状态分离每一单菌落，随后纯化培养单菌株，重复3次，每个纯化的不动杆菌菌株25％甘油-80℃冷冻保存。
2.3不动杆菌分子生物学鉴定
挑取分离提纯的单菌落置于30mL NA培养基中，28℃、150r/min摇床培养12h，取1.5mL菌液12000rpm离心2min，收集菌体进行DNA的提取。分子生物学鉴定针对16S rDNA的V3、V4片段序列分析鉴定，按照试剂盒使用说明对不动杆菌进行DNA的提取，PCR扩增采用16S rDNA通用引物(表2)。
PCR反应体系为：
Figure BDA0003263777120000042
PCR反应参数为：
Figure BDA0003263777120000041
将测序得到的16S rDNA序列与NCBI GenBank数据库进行比对，选取近缘序列与不动杆菌常见近缘种群序列，使用MEGA6进行序列比对，利用jModeltest软件(Posada etal.，2008)获取构建邻位相接法(Neighbor-Joining)树最优模型，基于不动杆菌16s rRNA构建NJ系统进化树。
表2 16S rDNA V3-V4区引物
Figure BDA0003263777120000051
2.4不动杆菌形态学观察、生理生化检验
分别对不动杆菌在NA固态与液态培养基上生长情况、单菌落形态进行观察，进行革兰氏染色，利用电子显微镜对不动杆菌的形态特征进行观察；生理生化鉴定参照《非发酵细菌生化鉴定编码册》的鉴定系统。
3分离结果
3.1金针虫体内细菌的分离纯化
组织液稀释10-3时，单一菌落明显(图1)，依据形态、大小与颜色等差异从NA培养基挑取纯化单菌落共计43个菌株，并编号(表3)。
表3菌株及编号
Figure BDA0003263777120000052
注：xx表示菌株对应数字编号Note:‘xx’denote number
3.2吉伦伯不动杆菌分子生物学鉴定
将测得的16S rDNA的序列与GenBank数据库进行比对，其中jzc303、jzc314、jzc708、jzc711四个菌株与吉伦伯不动杆菌(Acinetobacter gyllenbergii)同源性高达100％，比对长度为1393bp(图2)。
3.3吉伦伯不动杆菌形态及生化测定
结果显示，NA培养基培养16h后出现单菌落，24h时菌落直径约为1mm，菌体乳白色、不透明、表面光滑湿润、边缘整齐，有刺激性气味(图3左)，显微镜观察下为球杆状、单个存在、无鞭毛、无芽孢(图3右)；生理生化鉴定革兰氏呈阴性，非发酵细菌生化编码鉴定试剂盒结果见表4，结合“单盒生化鉴定管使用说明”与《非发酵细菌生化鉴定编码册》的鉴定准则，可判定该4个菌株均为不动杆菌(Acinetobacter spp.)。
表4候选不动杆菌生理生化特征
Figure BDA0003263777120000061
注：“-”表示反应呈阴性；“+”表示反应呈阳性。
Note.‘-’means negative；‘+’means positive.
4小结
不动杆菌分布范围广，是一种重要的昆虫次生共生菌。已有报道在家蚕、夜蛾、褐飞虱、背蚁等多种昆虫肠道中，不动杆菌作为优势共生菌存在，对宿主的生理学、生态学等方面有不同程度的影响(杨焊，2012；张君等，2016；Sun et al.，2016；王天召等，2019)。然而，昆虫体内不动杆菌种类鉴定知之甚少，不同种群间在功能上是否存在差异等问题亟待解决。
为了更进一步了解金针虫体内不动杆菌的功能，明晰金针体内不动杆菌种群结构是这一研究的基石。经过形态、生理生化、16S rDNA分子比对等多种方法鉴定，并通过建立系统发育树(NJ树)确定了该4株细菌为吉伦伯不动杆菌(Acinetobacter gyllenbergii)。吉伦伯不动杆菌在昆虫体内报道较少，其功能尚未明晰。
为了进一步研究jzc708菌株，将本实施例中得到的jzc708菌株进行保藏，其保藏号为CGMCC No.22934，保藏时间为2021年07月21日，建议分类命名为吉伦伯不动杆菌(Acinetobacter gyllenbergii)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例2：不动杆菌对农药的降解
1实验材料
1.1供试农药及处理
本试验筛选了不同类型具有高效毒杀地下害虫的农药：氟虫腈(苯基吡唑类)、毒死蜱(氯吡硫磷)(硫代磷酸酯类)、噻虫胺(新烟碱类)、辛硫磷(有机磷类)。用石油醚配置辛硫磷、丙酮配置毒死蜱、氟虫腈、噻虫胺溶液100μg/mL(μL/mL)。
1.2供试细菌
吉伦伯不动杆菌(Acinetobacter gyllenbergii)jzc708，25％甘油，-80℃保存。活化时，取100μL菌种于100mL NA培养基中，28℃、150rpm摇床中震荡培养，供试。
1.3培养基：NA(细菌培养基)
2实验方法
2.1吉伦伯不动杆菌生长曲线的测量
采用比浊法进行生长曲线的测定，挑取jzc708单菌落接入150mL NA培养基中，NA液态培养基为对照，28℃、150rpm培养，每隔2h取样，测定600nm波长处光密度(OD值)，3个重复，以培养基OD值为起始点，绘制生长曲线。
2.2吉伦伯不动杆菌降解农药试验
根据细菌生长曲线，无菌条件下取49mL稳定期的不动杆菌，加入50mL NA培养基与1mL农药溶液(农药最终浓度为1μg/mL)，99mL NA培养基加入1mL农药溶液为对照。28℃、150rpm培养分别培养8h，24h，48h后，10000rpm离心2min后取上清液，重复3次，取上清液测定农药含量。氟虫腈依据GB23200.113，毒死蜱、噻虫胺、辛硫磷测定方法参照张爱芝等(2016)，农药含量由中国水稻研究所检测中心检测。
2.3数据处理与分析
利用GraphPad Prism 8软件，细菌生长曲线采用折线图绘制；采用单因素方差分析法对不同代谢农药时间进行分析、组间两两比较采用t检验，农药代谢含量采用小提琴图绘制。
3结果与分析
3.1吉伦伯不动杆菌生长曲线
吉伦伯不动杆菌迟缓期时间较长(图4)，约为10h，10-26h为该菌的对数生长期，26h进入稳定期，该时期生物量最大，OD值为1.94±0.006，降解农药试验中应采取的26h作用的菌液效果最佳。
3.2吉伦伯不动杆菌对农药的降解
如图5所示，4种农药中，吉伦伯不动杆菌对毒死蜱和氟虫腈具有降解作用。其中，不动杆菌对毒死蜱具有强烈的降解能力，在处理仅8h条件下，残留量极显著低于CK组(P<0.01，F(3，8)＝402.90)，且各处理组间差异不显著(P值均>0.05，F(3，8)＝402.9)；氟虫腈残留量随处理时间增加而呈下降趋势，不动杆菌对氟虫腈具有一定的降解能力；噻虫胺与辛硫磷残留量不随处理时间的增加而变化，处理组与CK组差异均不显著(P值均>0.05，F噻虫胺(3，8)＝0.22；F辛硫磷(3，8)＝2.88)，表明该两种农药不受不动杆菌影响。
4小结
生长曲线可表示细菌开始发酵过程的动态，生长曲线受物种、培养条件等因素影响，因此测定生长曲线对了解和掌握细菌的生长规律具有重要意义。本实施例对吉伦伯不动杆菌jzc708菌株进行生长曲线的测定，发现该菌迟缓期为10h，生物量最大的时期为26h左右。4种类型的农药中，吉伦伯不动杆菌对毒死蜱、氟虫腈均具有显著降解作用，但对噻虫胺和辛硫磷的降解无明显影响。

Claims (5)

1.吉伦伯不动杆菌（Acinetobacter gyllenbergii）jzc708，其保藏号为CGMCCNo.22934。
2.如权利要求1所述的吉伦伯不动杆菌（Acinetobacter gyllenbergii）jzc708的培养方法，其特征在于将所述吉伦伯不动杆菌接种于发酵NA培养基中，封口后置于温度为28 ℃的摇床中震荡培养。
3.如权利要求1所述的吉伦伯不动杆菌（Acinetobacter gyllenbergii）jzc708在降解农药中的应用，所述农药为毒死蜱或氟虫腈。
4.农药降解剂，其特征在于由权利要求1所述的吉伦伯不动杆菌（Acinetobacter gyllenbergii）jzc708制备得到，所述农药为毒死蜱或氟虫腈。
5.如权利要求4所述的农药降解剂，其特征在于包括吉伦伯不动杆菌（Acinetobacter gyllenbergii）jzc708的菌体。
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