CN112063564A - 一种高效降解拟除虫菊酯农药的都柏林克罗诺杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效降解拟除虫菊酯农药的都柏林克罗诺杆菌(Cronobacter dublinensis)，命名为都柏林克罗诺杆菌SM‑4，于2019年12月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19218，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株可有效修复被拟除虫菊酯类农药污染的水体和土壤环境，为解决农产品中拟除虫菊酯类农药残留超标及环境污染问题提供一种新思路，丰富了农药降解菌的种质资源库，应用前景广阔。

Description

一种高效降解拟除虫菊酯农药的都柏林克罗诺杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物降解技术领域，具体涉及一种高效降解拟除虫菊酯农药的都柏林克罗诺杆菌及其应用。

背景技术

拟除虫菊酯农药是从天然除虫菊花中提取杀虫化合物除虫菊素，进行人工合成的一类仿生型农药，也是模拟植物源农药结构开发化学农药的成功典范之一。近几年，随着大部分有机磷、有机氯等农药的禁用，拟除虫菊酯类农药因其广谱、高效、低毒等特点迅速占据市场成为治理害虫的主要农药。但有研究发现，拟除虫菊酯类农药及其代谢产物不仅会残留于水体和土壤中，而且在果蔬以及人体尿液中也被检测出。多项研究表明，拟除虫菊酯类农药是一种神经毒剂，作用在神经细胞轴突，会导致轴突上离子通道开合的延迟进一步阻碍神经兴奋产地造成中毒现象；其次，对非靶细胞的生殖系统、免疫系统、内分泌系统和心血管系统也有很大影响。拟除虫菊酯类农药的残留已直接或间接影响着食品安全、人类健康和生态环境，因此，有效去除环境中拟除虫菊酯类农药已受到广泛关注。

溴氰菊酯(deltamethrin)是最常用的拟除虫菊酯类农药之一，因具有高效杀虫活性被广泛应用于农作物中害虫的防治。但随着溴氰菊酯的频繁使用，有关该农药的残留问题及其危害性也日益暴露出来。已有研究显示溴氰菊酯对某些有益昆虫及水生生物具有很高的毒性，对人体具有神经毒性、蓄积毒性及生殖毒性，已被美国环境保护局列为致癌物质。因此，寻找高效消除农产品及环境中溴氰菊酯农药残留的方法至关重要。

在目前已有的处理农药残留方法中，利用微生物的新陈代谢作用，对残留的农药进行转化，使其无毒化，也是目前的研究热点。但目前对于溴氰菊酯降解菌株的研究报道有限，且由于土壤环境复杂，菌株实际降解能力难以达到实验室水平，可应用于降解环境农药残留的微生态制剂的制备更是少有报道。

因此筛选可有效降解溴氰菊酯残留的环境友好型菌株，开发可应用于环境修复的微生态制剂，不仅可以丰富溴氰菊酯降解菌群，而且可为其在自然环境中生物修复的应用提供理论依据。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本发明的第一个目的是提供一种高效降解拟除虫菊酯农药的都柏林克罗诺杆菌(Cronobacter dublinensis)，命名为都柏林克罗诺杆菌SM-4，于2019年12月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19218，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二个目的是上述菌株SM-4在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用，具体为菌株SM-4可用于降解和修复被拟除虫菊酯类农药污染的水体或土壤等自然环境。

进一步地，拟除虫菊酯类农药为溴氰菊酯。

进一步地，将包含菌株SM-4用于降解拟除虫菊酯类农药污染的水体或土壤时，降解温度为30～37℃，降解pH为5.5～7.5，优选降解温度为32.6℃，降解pH为6.1。

本发明的第三个目的是提供一种生物制剂，该生物制剂包括上述菌株SM-4，该生物制剂可以是菌株SM-4的发酵液或者直接将菌株SM-4菌体制成固体制剂如悬浮剂或粉剂等，或者以菌株SM-4作为唯一活性成分或者主要活性成分再与辅料配合制成的制剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次公开了都柏林克罗诺杆菌(Cronobacter dublinensis)对溴氰菊酯等拟除虫菊酯类农药的降解作用，并筛选得到一株可高效快速降解溴氰菊酯等拟除虫菊酯类农药的都柏林克罗诺杆菌菌株SM-4，丰富了农药降解菌的种质资源库，在该类农药残留污染的水体和土壤生物修复中具有重大应用价值，为解决农业生产中拟除虫菊酯类农药残留超标及环境污染问题提供一种新思路。

附图说明

图1为本发明提供的菌株SM-4在Luria-Bertani(LB)固态培养基上的菌落形态。

图2为本发明提供的菌株SM-4的扫描电镜图。

图3为本发明提供的菌株SM-4的16S rRNA系统进化分析。

图4为本发明提供的菌株SM-4生长与降解溴氰菊酯的动态关系图。

图5为本发明提供的菌株SM-4降解溴氰菊酯(DM)的响应曲面图；其中，(A)为pH和温度交互影响菌株SM-4降解溴氰菊酯的响应曲面图；(B)为pH和DM浓度交互影响菌株SM-4降解溴氰菊酯的响应曲面图；(C)为温度和DM浓度交互影响菌株SM-4降解溴氰菊酯的响应曲面图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1菌株SM-4的分离、纯化与鉴定

1、溴氰菊酯降解菌株的筛选分离

从四川金堂地区长期受拟除虫菊酯类农药污染的草莓根系土壤和沙参根系土壤中采集样本，经自然风干过80目筛备用。取1.0g土样加入溴氰菊酯浓度为50mg/L的MSM培养基，于35℃振荡(180rpm)培养96h后，取5％(v/v)培养液转接至溴氰菊酯浓度为100mg/L的MSM中，按照上述操作连续转接多次，培养基中溴氰菊酯浓度逐次提高至2000mg/L。

上述基础盐培养基培养基(MSM)包括以下重量百分数的组分：(NH₄)₂SO₄ 0.05～0.25％，KH₂PO₄ 0.05～0.25％，K₂HPO₄ 0.05～0.25％，MgSO₄0.05～0.25％，NaCl 0.05～0.25％，蒸馏水1000mL，pH 6.8～7.5。121℃灭菌20min。灭菌后在无菌条件下加入一定体积的溴氰菊酯溶液使其为试验所需浓度，混匀备用。

2、溴氰菊酯降解菌株的纯化

将分离得到的菌株，取末级培养液梯度稀释涂布转接到溴氰菊酯浓度为100mg/L的固体平板上，35℃培养，待固体平板上长出单菌落后，挑取单菌落于LB固体平板连续划线纯化三代，挑选出菌落形态规则、生长速度最快的溴氰菊酯降解菌株，并将其保存于种子斜面，备用。

上述Luria-Bertani培养基(LB)包括以下重量百分数的组分：胰蛋白胨0.5～1.5％，酵母浸出粉0.25～1％，NaCl 0.25～1.5％，蒸馏水1000mL，pH6.5～7.5；固体培养基同液体培养基中加入2.0％的琼脂。121℃灭菌20min。灭菌后在无菌条件下加入一定体积的溴氰菊酯溶液使其为试验所需浓度，混匀备用。

3、溴氰菊酯降解菌株的鉴定

(1)形态学鉴定

将纯化后的菌株接种于LB固体平板上静置培养48h，其菌落形态呈现黄色、圆形、全缘、光滑、微凸起、有光泽(见图1)。扫描电镜下观察该细胞呈短杆状，不产生芽孢，大小约为3μm，宽约为1μm(见图2)。

(2)生理生化鉴定

菌株的主要生物学特征为好氧、革兰氏阴性菌株。在吲哚试验、明胶水解、蔗糖发酵、H₂O₂酶试验、运动性试验呈阳性；在葡萄糖发酵、甲基红试验、丙二酸盐、D-山梨醇、乳糖发酵、硫化氢试验呈阴性。

(3)16S rRNA分子生物学鉴定

采用土壤细菌总DNA试剂盒提取菌株SM-4的基因组DNA，以提取的总DNA为模板进行PCR扩增反应，扩增体系为：DNA模板1μL，Eu27F、1492R引物(20mg/L)各0.5μL，2PCR Mix12.5μL，ddH₂O 10.5μL；PCR反应条件如下：95℃5min；94℃1min；50℃1min；72℃2min，循环30次；72℃10min。采用PCR回收试剂盒进行胶回收，将目的片段与pGEM-T载体通过T4DNA连接酶与25℃过夜连接，以热激法转入感受态细胞DH5α，提取重组质粒。最后将酶切实验初步鉴定含有目的片段的重组质粒送到成都擎科生物技术有限公司进行测序，测序结果提交至GenBank数据库并进行注册，注册号为：MK038914。同时测得的序列经BLAST进行比对分析后，选择同源性较高的相关序列采用MEGA7.0中Neighbor-Joining法绘制系统发育树(见图3)。

本发明分离纯化得到的菌株经形态学特征、生理生化、分子鉴定为都柏林克罗诺杆菌(Cronobacter dublinensis)。该菌株命名为都柏林克罗诺杆菌SM-4，于2019年12月17日进行保藏；保藏编号为CGMCC NO.19218；保藏单位为：在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2菌株SM-4对溴氰菊酯的降解动力学试验

1、种子液制备：从实施例1中保存的种子斜面中挑取都柏林克罗诺杆菌SM-4菌落，接种于50mL LB培养基中，初始pH 7.0，35℃振荡(180rpm)培养24h，用无菌生理盐水(0.9％NaCl)调节OD₆₀₀至1.0，即为种子液。

2、生长降解动力学测定：取5％(v/v)种子液接种至50mL LB培养基中(含有75mg/L溴氰菊酯)，以不接菌的培养基作为对照，每组试验重复三次。在35℃，180rpm恒温培养5d，前24h每隔2h取样一次，后84h每隔12h取样一次，采用分光光度计测定菌株的生长情况(OD₆₀₀)，同时采用Waters2695HPLC色谱仪分析检测其对溴氰菊酯的含量变化。

3、溴氰菊酯含量的检测及其标准曲线方程的建立

(1)样品前处理

试验为每个处理3个重复，每个重复摇匀吸取，取培养液1.0mL并加入适量乙腈于10mL具塞试管中，超声波(40kHz，100W)辅助提取60min后用乙腈定容，混匀后离心(12000r/min)30min，取上清液用0.45μm有机相滤膜过滤，收集滤液进行HPLC检测。

(2)检测条件及其标准曲线方程建立

HPLC条件：色谱柱为Inertsil ODS-3(5.0μm，150mm×4.60mm(i.d.))，流动相为乙腈-超纯水(90：10，v/v)，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，紫外波长为230nm，进样量为10μL。

标准曲线线性方程：配制浓度为100mg/L的溴氰菊酯标准液，上机进样量依次为1、2、4、6、8、10μL，即质量分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg；拟合溴氰菊酯质量-峰面积的标准曲线线性方程为：y＝1E+06x-1210；R²＝0.9993。

实验中溴氰菊酯降解率计算公式按下式进行：

式中，C为实验组溴氰菊酯残留浓度；C₀为对照组中溴氰菊酯残留浓度。

4、实验结果

实验结果如图4所示，溴氰菊酯的残留量与菌株的生长呈现负相关性。在以溴氰菊酯为唯一碳源条件下，菌株SM-4经过10h的延滞期进入生长对数期，在此时期菌株SM-4对溴氰菊酯的降解最快；72h后，菌株进入稳定生长期，此时已有60.07％的溴氰菊酯被降解，表明SM-4菌株具有较好的溴氰菊酯降解活性；培养96h后菌株开始进入衰亡期，菌群密度下降，相应的菌株对溴氰菊酯的利用明显减少；培养108h，测得菌株SM-4对溴氰菊酯降解率为61.21％。

实施例3菌株SM-4对溴氰菊酯的最优降解工艺条件

1、试验方法

对菌株SM-4进行单因素降解试验，通过依次改变影响其生长和降解的因素，如温度、pH、降解浓度、接种量等，测定菌株SM-4对溴氰菊酯的降解率，从而确定影响菌株SM-4降解效率的关键因素。

利用Design Expert 12.0软件根据响应曲面法Box-Behnken设计原则进行试验设计(表1)，以影响菌株SM-4降解的关键因素底物浓度(X₁)、温度(X₂)、pH(X₃)作为自变量，以菌株SM-4对溴氰菊酯的降解率作为响应值(Y₁)，建立一个多元二次回归方程。根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应曲面图。最后对多元二次回归方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的极值点，即菌株SM-4降解溴氰菊酯的最佳工艺条件。

表1响应曲面法Box-Behnken设计试验结果

2、试验结果

通过Design Expert 12.0软件分析，获得菌株SM-4降解溴氰菊酯多元二次回归方程如下：

Y₁＝78.52-4.99X₁+0.16X₂-0.57X₃+0.96X₁X₂+1.29X₁X₃-0.14X₂X₃-0.21X₁ ²-1.82X₂ ²-2.61X₃ ²

表2响应面设计的回归方程系数显著性检验及方差分析

根据表2的统计分析结果表明，回归方程的决定系数R²＝0.9235，R² _Adj＝0.8252，整体模型的P<0.0001，达到显著水平，表明该方程能正确反映溴氰菊酯降解率与各因素之间的关系；模型失拟项P>0.05，差异不显著，表明该回归模型与实际试验值拟合较好，模型有效。利用软件Design Expert12.0绘制各因素交互作用响应曲面图(图5)，图5(A)、图5(B)曲面陡峭，说明pH对菌株降解溴氰菊酯的影响最为显著。对回归模型方程求导，得到最高降解率为83.38％，此时对应变量的最佳条件为底物浓度53mg/L、温度32.59℃、pH 6.1。菌株SM-4在较宽pH(5.5～7.5)和温度范围内(30～37℃)，均能较好降解溴氰菊酯，为其在复杂环境中的应用提供了保证。

实施例4菌株SM-4降解菌剂的制备

1、将菌株SM-4制备降解菌剂的主要生产工艺流程为：斜面培养-种子液制备-发酵-收集菌体-真空冷冻干燥-产品(剂型可为悬浮剂或粉剂)。

2、试验方法

(1)试验过程中涉及到的冻干保护剂以及发酵培养基均是由重量体积比计的组分组成，配方如下：

冻干保护剂：脱脂奶粉5～20wt％，葡萄糖0.5％～5wt％，蒸馏水1000mL，pH 6.3～6.8，115℃灭菌20min。

发酵培养基：胰蛋白胨0.3～1.5wt％，酵母浸出粉0.3～1.5wt％，NaCl0.3～1.5wt％，MnSO₄ 0.01～0.25wt％，蒸馏水1000mL，pH 6.5～7.5，121℃灭菌20min。

(2)种子液制备：如实施例2。

(3)发酵培养：以5％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，锥形瓶装液量为250mL/500mL，初始pH 7.0，35℃振荡(180rpm)培养48h。

(4)收集菌体：将发酵培养液以4000rpm离心20min，在无菌条件下，去除发酵上清液，收集菌泥复溶于0.9％NaCl溶液中，4000rpm离心20min，除去上清液，将冻干保护剂与二次离心菌泥按1:1～5的质量比均匀混和，制备成菌悬液备用。

(5)真空冷冻干燥：将菌泥混合物于-20℃的冰箱中进行预冻，冻结完全后将其放入-40℃真空冷冻干燥12h，得到均匀的淡黄色晶体形固体。在无菌密封条件捣碎下制成都柏林克罗诺杆菌SM-4菌粉，置于铝膜袋中，抽真空得成品。

本发明中活化计数方法为：取0.100g都柏林克罗诺杆菌SM-4菌粉复溶于100mL无菌水中，摇匀使其充分溶解，30℃水浴30min，共三组平行，在无菌条件下将复溶菌粉悬液连续稀释5次，每次三个重复，使其稀释倍数依次为10、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵，再分别取0.1mL稀释液于平板中，倾注发酵培养基混匀于37℃倒置培养16h观察菌落生长情况；最终在三组稀释倍数为1×10⁵的平板中平均菌落数依次为52、94、247，即本发明的都柏林克罗诺杆菌SM-4菌粉含菌量为0.5～2.5×10¹¹CFU/g。

实施例5菌株SM-4降解菌剂降解土壤中溴氰菊酯的效果实验

1、试验方法

草坪表层土(5～10cm)，取自成都市西华大学草坪，属紫色土壤，土壤中未检测到溴氰菊酯等拟除虫菊酯类农药。

取500g土壤样品置于阴凉干燥通风处自然风干，风干后碾磨过筛(2mm)。取一定量的溴氰菊酯溶于乙腈中，然后浸泡硅胶土，使溴氰菊酯完全被吸附。将浸泡后的硅胶土置于通风橱中吹干，后拌入土壤中，使土壤样品中溴氰菊酯浓度达60mg/L，土壤持水量保持在40％。

在无菌条件下，准确称取0.100g都柏林克罗诺杆菌SM-4菌粉复溶于100mL无菌水中，以3％(v/v)的接种量接种至含60mg/L溴氰菊酯的土壤样品中；对照组为无菌粉悬液的含溴氰菊酯的土壤样品。在37℃条件下连续培养15d，每间隔72h取样，采用HPLC法测定实验组和对照组的溴氰菊酯残留量。

降解率的计算方法如实施例2。

2、试验结果

土壤中溴氰菊酯残留测定结果见表3，由表3可知，实验组溴氰菊酯降解迅速，尤其在3～6d时，溴氰菊酯的降解速率较大；经过15d培养后，对照组溴氰菊酯浓度由最初的59.35mg/L降至54.26mg/L，实验组溴氰菊酯浓度降至6.81mg/L，降解率达87.4％。在降解过程中降解性能稳定，为菌株SM-4菌剂修复受溴氰菊酯等拟除虫菊酯类农药污染的的土壤提供了科学依据。

表3 SM-4菌粉对土壤中溴氰菊酯残留量的变化

实施例6菌株SM-4降解菌剂降解水体中溴氰菊酯的效果实验

1、试验方法

水体前处理：在成都某工业园区及周边河流设置水样采集点，在采集位点用棕色瓶采集水下20cm处水样500mL，采用0.45μm滤膜过滤。固相萃取柱活化：依次取10mL超纯水、10mL甲醇、10mL乙腈分别通过HLB固相萃取柱，并保持浸润5min，使填料与溶剂完全接触。然后将500mL水样过固相萃取柱富集，流速10～15mL/min；然后用15mL乙酸乙酯浸泡、洗脱，收集洗脱液，于氮吹仪吹至近干，残渣用乙酸乙酯定容至1mL，上机进行气相色谱分析。

在无菌条件下，准确称取0.100g都柏林克罗诺杆菌SM-4菌粉复溶于100mL无菌水中，以3％(v/v)的接种量接种水体样品中；对照组为不含菌粉悬液的水体样品。在37℃条件下连续培养15d，每间隔72h取样，气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定水体实验组和对照组的农药残留量并计算降解率。降解率计算方法与实施例2中相同。

2、仪器分析

气相条件：色谱柱：TG-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度：250℃；进样量1μL；载气：高纯度氦气(99.999％)，流量1.5mL/min；进样方式：分流进样。色谱柱升温程序：初始温度90℃保持2min，以6℃/min升温至150℃保持1min，再以10℃/min升温至180℃保持4min，最后以10℃/min升温至260℃保持20min。

质谱条件：选择离子方式(SIM)；电子能：70eV；MS传输线温度：250℃，离子俘获器温度：280℃；数据采集方式：选择反应监测模式(SRM)。

3、试验结果

对采集的水样进行成分测定，发现该水样中除溴氰菊酯外，同时含有甲氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯和氰戊菊酯。对这五种农药的系列标准溶液(10μg/mL)进行气相色谱分析，以各农残的色谱峰面积为纵坐标、溶液的浓度为横坐标，绘制线性方程如表4。

都柏林克罗诺杆菌SM-4菌粉对水体中溴氰菊酯的降解效果如表4所示，可以看出，菌粉在加入水体中后，能够快速降解水体中的溴氰菊酯，降解性较稳定；且对其它拟除虫菊酯类农药也有一定的降解效果，为菌株SM-4对拟除虫菊酯类农药的水体修复提供了一定的科学依据。

表4 SM-4菌粉对水体农药残留量的变化

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种高效降解拟除虫菊酯农药的都柏林克罗诺杆菌(Cronobacter dublinensis)，命名为都柏林克罗诺杆菌SM-4，于2019年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19218，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.权利要求1所述的都柏林克罗诺杆菌SM-4在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将都柏林克罗诺杆菌SM-4用于修复被拟除虫菊酯类农药污染的自然环境。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，自然环境为土壤或水体。

5.根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，将都柏林克罗诺杆菌SM-4制成液体制剂或固体制剂用于降解拟除虫菊酯类农药。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，拟除虫菊酯类农药为溴氰菊酯。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，降解温度为30～37℃，降解pH为5.5～7.5。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，降解温度为32.6℃，降解pH为6.1。

9.一种生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的都柏林克罗诺杆菌SM-4。

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