CN101892170B

CN101892170B - 昆虫病原线虫共生菌及其应用

Info

Publication number: CN101892170B
Application number: CN2009100842812A
Authority: CN
Inventors: 王勤英; 孔繁芳; 宋萍; 南宫自艳; 曹克强
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2009-05-20
Filing date: 2009-05-20
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2029-05-20
Also published as: CN101892170A

Abstract

本发明公开了一种昆虫病原线虫共生菌及其应用。具体该昆虫病原线虫共生菌，为嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004。该菌株的发酵液、发酵液上清液、菌体或其发酵液上清液的乙酸乙酯萃取物具有对多种农业害虫的杀虫或杀卵作用。

Description

昆虫病原线虫共生菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种昆虫病原线虫共生菌及其应用，特别涉及一种昆虫病原线虫共生菌及其在生产杀虫和/或杀卵剂中的应用。

背景技术

昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫肠道内的一类革兰氏阴性细菌，属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(Hominick WM.Wallingford：CABI Publishing UK，2002.266-264)，包括致病杆菌属(Xenorhabdus)和光杆状菌属(Photorhabdus)，其分别与斯氏线虫属(Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis)的线虫共生(ChalabaevS.，Turlin E.，Bay S.，et al.Applied and Environmental Microbiology，2008，74：1717-1725；Forst S.，Dowds B.，Boemare N.，et al.Annual review of microbiogy，1997，51：47-72.)。

在自然界，此类细菌存在于3龄侵染期线虫的肠道内，随着线虫对昆虫的侵染，共生菌被携带到昆虫体内并释放到寄主血腔中，共生菌在昆虫血腔中大量繁殖，产生毒素，在48h之内就能杀死寄主昆虫。此外，共生菌也能分解昆虫组织，并产生多种抑菌物质，为线虫的生长与繁殖提供营养和良好的环境。线虫经几代的繁殖，侵染期线虫携带着共生菌从寄主昆虫尸体内钻出，重新寻找新寄主。

昆虫病原线虫共生菌在离体人工培养时，也能够产生多种物质。随着对昆虫病原线虫共生菌研究的不断深入，这些产物的功能亦不断被发现(Webster J.M.et al.，(2002)Bacterial Metabolites.In：Gaugler，R.(Ed.)，Entomopathogenic Nematology.CAB International，Wallingford UK，pp99-111.)。共生菌产生多种抗生素，对多种动植物及人类病原菌有广泛的抑菌活性(杨怀文，张志明，杨秀芬等.中国生物防治，2000，16(3)：111-113；杨秀芬，杨怀文，简恒.大豆科学，2002，24(1)：52-55.)。共生菌可分泌产生一些抗肿瘤物质，对人类多种肿瘤细胞有较强的抑制作用，为研制抗癌新药物提供了新材料(Jarosz J.Parasitology，1996，112：545-552；吕秋军，简恒，刘卫京等.中国新药杂志，2002，11：850-852；Paik S.，Park S.，et al.，Bull koreanchem.Soc 2001，22：372-374)。某些昆虫病原线虫共生菌可以产生对昆虫具有口服杀虫活性的Tc或Xpt蛋白毒素等(Bowen D，Rocheleau T.A.，Blackburn M.，et al.Science，1998，280：2129-2132；Morgan，J.A.W.，Sergeant，M.，Ellis，D.，Ousley，M.andJarrett，P.Appilied and Environmental Microbiology，2001，2062-2069；ffench-Constant，R.H.，Dowling A.and Waterfield N.R.Toxicon，2007，49，436-451.)，共生菌口服杀虫毒素的发现为开发生物杀虫剂提供了新的途径。昆虫病原线虫共生菌已成为一类新型的具有开发潜力和应用前景的能够杀虫防病的生物资源。所有已发表或公开的文献指出，昆虫病原线虫的共生细菌或共生细菌分泌的杀虫蛋白对昆虫有口服杀虫活性，但是仍不清楚其杀虫谱，特别是未发现这类细菌的上清代谢产物具有杀昆虫或螨类卵的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种昆虫病原线虫共生菌及其应用。

本发明的昆虫病原线虫共生菌，为致病杆菌属Xenorhabdus嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)HB408。

上述嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)HB408，已于2009年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3004。

本发明提供的昆虫病原线虫共生菌的应用是嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdusnematophila)CGMCC №.3004在生产杀虫和/或杀卵剂中的应用。

本发明还提供一种杀虫和/或杀虫剂，该杀虫和/或杀虫剂的活性成分为嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004的发酵液和/或嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004的发酵液上清液和/或嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004菌体和/或嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004的发酵液上清液的乙酸乙酯萃取物。

所述嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004的发酵液的获得方法为将嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004接种于液体培养基中，在28℃～30℃培养36～48小时得到发酵液。

所述嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004的发酵液菌体的获得方法为嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004接种于液体培养基中，在28℃～30℃培养36～48小时得到发酵液，然后将发酵液过滤和/或离心得到滤渣或沉淀部分，即为嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004的发酵液菌体。

所述嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004的发酵液上清液的获得方法为嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004接种于液体培养基中，在28℃～30℃培养36～48小时得到发酵液，然后将发酵液过滤和/或离心得到液体部分，即为嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004的发酵液上清液。

所述嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004的发酵液上清液的乙酸乙酯萃取物的获得方法为嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004接种于液体培养基中，在28℃～30℃培养36～48小时得到发酵液，然后将发酵液过滤或者离心收集液体，将液体中加入乙酸乙酯萃取收集有机相，得到嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004的发酵液上清液的乙酸乙酯萃取物。

所述液体培养基为含牛肉蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L的培养基。

上述杀虫和/或杀卵剂中还可加入可接受的辅剂如防腐剂、粘着剂、引诱剂、保护剂和增效剂，配制成水剂、可湿性粉剂、颗粒剂、油剂和浓缩剂等不同的剂型。

上述杀虫和/或杀卵剂是对鳞翅目昆虫和/或鞘翅目昆虫和/或直翅目昆虫和/或膜翅目昆虫和/或螨类的杀虫和/或杀卵剂。

本发明的嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004的发酵液具有对多种农业害虫的杀虫杀卵作用。利用该菌株的发酵液制备的杀虫杀卵剂可用于植物表面和生长环境中，防治鳞翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目和螨类等多种农业害虫。施用量和施用次数根据所防治害虫的发生期、发生数量以及气候条件等而定。

具体实施方式

下列实例是进一步对本发明的说明，不应当成为对本发明的限制。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1、嗜线虫致病杆菌HB408菌株的获得

本发明人自1997年-2006年，利用大蜡螟诱集法从采自河北省不同地区的土样中分离出多个昆虫病原线虫品系。按下列方法分离初生型的共生细菌：用昆虫病原线虫感染大蜡螟5龄幼虫，虫体死亡后，用75％(体积百分浓度)酒精浸泡10min后，用无菌水冲洗3遍，并用灭菌滤纸吸干虫体上的水分。用灭菌镊子将虫体的头和尾夹起，再用灭菌的剪子剪去一只腹足，将流出的体液直接滴到NBTA鉴别培养基(营养琼脂45g，氯化三本基四氮唑0.04g，溴百里酚蓝0.025g，水1000mL，pH 7.2-7.4)上，用接种环划线后，放于28℃生化培养箱中培养48h～72h时，挑取蓝色单菌落为初生型共生菌。应用生物测定的方法对这些菌株的杀虫活性行进到了测定，发现其中HB408菌株对小菜蛾、菜粉蝶等多种供试昆虫的幼虫的口服杀虫活性最强。根据Akhurst(1980)(Akhurst R.J.Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp.，bacteria symbioticallyassociate with the instect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis[J].Journal of General Microbiology，1980，121：303-309)描述的方法结合部分16s rDNA序列测定对HB408菌株进行种类鉴定，确定该菌株为嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdusnematophila)。其中，HB408菌株的生理生化特征如表1所示，16s rDNA序列如序列表中序列1。

表1HB408菌株主要生理生化特征

生理生化特征	结果	生理生化特征	结果
				生长温度32℃37℃	+-	利用糖产酸水杨苷	-
接触酶	-	蔗糖	-
				生物荧光	-	葡萄糖	-
溴百里酚蓝的吸收	+	麦芽糖	+
				酯酶(Tween80)	-	蜜二糖	-
苯丙氨酸脱氨酶	+	糖原	-
				磷酸酶	-	甘油产酸	-
七叶灵水解	-	乙酸盐	+
				营养琼脂上色素	u	脲酶	-
硝酸盐还原酶	-	柠檬酸盐	-

注：+，阳性；-，阴性；u，奶酪色。

上述致嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)HB408菌株，已于2009年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3004。

实施例2、嗜线虫致病杆菌HB408菌株的口服杀虫活性及杀虫谱的测定

将嗜线虫致病杆菌HB408菌种划线于NBTA培养基(营养琼脂45g，氯化三本基四氮唑0.04g，溴百里酚蓝0.025g，水1000mL，pH 7.2-7.4)平板上，在28℃-30℃培养36h～48h，挑取初生型单菌落接入20mL牛肉汤培养基(牛肉蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH 7.2-7.4，121℃下高压灭菌30min)中，置于28℃-30℃、200rpm/min恒温振荡培养过夜，得到种子菌液。然后将种子菌液按1％(体积比1∶100)接菌量转接于200mL牛肉汤培养基中，继续振荡培养48h，得到的HB408发酵菌液，直接用于杀虫活性的测定。

以室内饲养的云斑粉蝶、菜粉蝶、小菜蛾、杨扇舟蛾、黄翅菜叶蜂、苹掌舟蛾、马铃薯二十八星瓢虫、东亚飞蝗、枸杞负泥虫、蓼蓝齿胫叶甲和月季叶蜂幼虫为试虫，采用浸叶法进行生测；具体方法为：以上述嗜线虫致病杆菌CGMCC №.3004HB408菌液为处理样品(样品中含0.3％的土温-80)，设无菌牛肉汤培养基为对照(样品中含0.3％的土温-80)，取新鲜的寄主植物叶片在HB408发酵上清液或无菌牛肉汤培养基中浸渍10s，自然晾干，放入无菌的6.5cm×10cm塑料养虫盒内，每盒根据试虫大小接入5～20头(具体虫态如表1所示)，置于(27±1)℃、14h光照的生化培养箱中。每个处理设3个重复，每个重复不少于20头试虫。每天检查死亡虫数，最后记录活虫数并称量活虫体重。

以棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、粘虫、甘蓝夜蛾和黄地老虎(具体虫态如表1所示)为试虫，以嗜线虫致病杆菌HB408发酵液为处理样品，以无菌牛肉汤培养基为对照。每一处理设三个重复，每个重复24头幼虫。按照1mL∶10g的比例将嗜线虫致病杆菌HB408发酵液或无菌牛肉汤培养基分别与各试虫的人工饲料混合作为饲喂食物(棉铃虫、甘蓝夜蛾、黄地老虎和芳香木蠹蛾人工饲料配方：玉米粉20g，黄豆粉10g，酵母粉9g，山梨酸0.2g，尼泊金0.2g，Vc 0.6g，复合V_B 3.14g，蔗糖5g，琼脂2g，无菌水100mL；甜菜夜蛾人工饲料的配方：玉米粉10g，黄豆粉15g，酵母粉8g，麦麸5g，菜叶粉1g，防微灵0.6g，干酪素0.5g，Vc 0.4g，复合V_B 3.77g，红霉素0.006g，山梨酸0.3g，尼泊金0.2g，柠檬酸0.3g，胆固醇0.1g，氯化胆碱0.1g，蔗糖1g，琼脂2g，水110mL；玉米螟人工饲料配方：玉米糁19g，酵母粉9g，大豆糁15g，多维葡萄糖7.5g，山梨酸0.5g，琼脂2g，甲醛0.2mL，水110mL；粘虫人工饲料配方：玉米叶粉6g，黄豆粉3.4g，酵母粉6.8g，干酪素1.5g，胆固醇0.7g，抗坏血酸0.5g，山梨酸0.15g，尼泊金0.3g，复合V_B3.93g，蔗糖2.8g，琼脂2.5g，水100mL)，混匀后分装于24孔培养板内，每孔放一头供试幼虫，为防止试虫逃逸，先覆一层保鲜膜，然后盖上盒盖，置于(26±1)℃、14h光照的生化培养箱中。每天记录死亡虫数，72h或120h时记录活虫数并称量活虫体重。

按1g麦麸加150μL嗜线虫致病杆菌HB408发酵液或无菌牛肉汤培养基，拌匀后分装入10cm×6.5cm的塑料养虫盒内，每盒放10头2龄黄粉虫幼虫，每个处理60头，放入(26±1)℃、14h光照的生化培养箱中，每天记录死亡虫数，最后称量活虫体重。

校正死亡率＝(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)×100％。

用上述方法对嗜线虫致病杆菌HB408发酵液的口服杀虫活性的生测结果如表1所示。由表2可以看出嗜线虫致病杆菌HB408发酵液对鳞翅目、鞘翅目和膜翅目中的18种昆虫都显示了一定程度的口服杀虫活性，但是不同昆虫对嗜线虫致病杆菌HB408的敏感性差异比较大，小菜蛾2龄幼虫、云斑粉蝶1龄幼虫、马铃薯瓢虫1龄幼虫、枸杞负泥虫2龄幼虫、黄翅菜叶蜂2龄幼虫、月季叶蜂2龄幼虫对嗜线虫致病杆菌HB408敏感性强，在饲毒72h时这几种试虫的校正死亡率均达到100％，其次是菜粉蝶1龄幼虫、叶甲、舟形毛虫1龄幼虫和东亚飞蝗2龄蝗蝻，在饲毒72h时死亡率也达到55.51％～91.52％。尽管对芳香木蠹蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫、粘虫、玉米螟、甘蓝夜蛾初孵幼虫、杨扇舟蛾2龄幼虫和黄地老虎的致死作用较低(0～39.24％)，但是对这些幼虫的生长有较高抑制作用，对活虫的相对生长抑制率分别为15.21％、93.87％、97.24％、52.75％、85.43％、68.52％、72.60％和32.53％；对黄粉虫也有一定的活性，处理120h时对其相对生长抑制率达到29.39％。

表2.HB408菌株对18种昆虫的口服胃毒活性

实施例3、嗜线虫致病杆菌HB408的发酵液中的上清液和菌体的杀虫活性

按实施例2中的方法制备嗜线虫致病杆菌HB408菌液，然后将部分HB408菌液在10000r/min、4℃条件下离心15min，吸取上清经0.45μm滤膜过滤后得到HB408菌液上清液备用。离心后所得沉淀加适量的PBS缓冲液(0.02mol/L，pH为7.4)在10000r/min、4℃离心15min洗涤2次后，所得菌体用PBS缓冲液(0.02mol/L，pH为7.4)重新悬浮至与HB408原菌液同样的体积的菌体细胞悬液备用。

将甘蓝叶片(饲喂小菜蛾幼虫)或玉米叶片(饲喂东亚飞蝗)分别在供试HB408菌液、HB408菌液上清液、菌体细胞悬液或无菌水(内含0.3％(质量含量)的土温80，CK)中浸渍5s，自然凉干后分别放入养虫盒内，盒内再放入供试昆虫，每个处理重复3次，每个重复20头幼虫，放入(26±1)℃、光照时间为14h的光照培养箱内，每隔24h检查其死亡情况，连续检查3d。结果如表3所示，结果表明HB408菌液、HB408菌液上清液、菌体细胞悬液对小菜蛾幼虫和东亚飞蝗均有很高的杀虫活性。

表3嗜线虫致病杆菌HB408菌液及其不同组分对小菜蛾的杀虫活性(72h)

实施例4、嗜线虫致病杆菌HB408菌液杀卵活性测定

采用浸渍法检测嗜线虫致病杆菌HB408发酵液昆虫卵或螨类卵的杀卵活性。实验所用昆虫的卵为新产1日龄的小菜蛾卵、菜粉蝶卵、山楂叶螨卵和朱砂叶螨卵，将这些虫卵分别在按实施例2中的方法制备嗜线虫致病杆菌HB408菌液中浸泡5s，取出后室温条件下待其自然晾干，然后将其放入经过灭菌且有透气孔内装有甘蓝叶的养虫盒(φ＝9cm)中，置于(25±1)℃、14h光照培养箱中培养，每个处理进行3次重复(每个重复约30粒卵)。本实验同时设灭菌水和无菌牛肉汤培养基对照，所有供试样品以及灭菌水和无菌牛肉汤培养基对照中均加入0.3％(质量百分含量)的土温-80。处理后定期检查小菜蛾、菜青虫、朱砂叶螨和山楂叶螨的孵化虫数并计算孵化率。

结果如表4所示，实验证明，用嗜线虫致病杆菌HB408培养的菌液对小菜蛾、菜粉蝶、朱砂叶螨和山楂叶螨卵有明显的触杀作用。120h后(表4)，发现未经过HB408菌液处理的小菜蛾、菜粉蝶、山楂叶螨和朱砂叶螨卵已经全部孵化，而经过HB408菌液处理的小菜蛾、菜粉蝶、山楂叶螨和朱砂叶螨、卵还完全没有孵化，孵化率分别为3.33％、18.33％、0％和0％，由此可见HB408菌液对小菜蛾、菜粉蝶、山楂叶螨和朱砂叶螨卵具有很好的触杀作用。

表4.HB408发酵液对不同卵的活性测定(120h)

实施例5、嗜线虫致病杆菌HB408的菌液不同组分的的杀卵活性

将按照实施例3所述方法获得的嗜线虫致病杆菌HB408发酵上清液，用0.45μm滤膜过滤，澄清液用等体积的乙酸乙酯进行萃取，连续萃取3次，然后将有机相合并后减压浓缩得到萃取浸膏，用乙酸乙酯溶解后浓度为20mg/mL作为昆虫的杀卵剂，按照实施例4所述的方法进行杀卵活性检测。同时将按照实施例3所述方法获得的嗜线虫致病杆菌HB408发酵液，HB408发酵上清液，HB408菌体悬液，作为杀卵剂，它们原始菌液体积和作为杀卵剂的体积与上述乙酸乙酯萃取得到的杀卵剂相同，进行同样的杀卵活性检测。以无菌水和无菌牛肉汤培养基为对照。

结果表5所示，结果证明，嗜线虫致病杆菌HB408菌液的上清液用乙酸乙酯萃取后，所得的萃取物及其各组分处理小菜蛾的卵，在96h后嗜线虫致病杆菌HB408菌液，上清液及其上清液的乙酸乙酯提取物使小菜蛾卵不能正常发育，孵化率分别为4.54％、3.33％和0％，和对照有明显的差异，而经细胞处理96h孵化率为76.51％，可见其杀卵作用的物质主要存在于发酵液的上清液中，对小菜蛾的卵有明显的抑制生长发育作用。

表5.HB408发酵液各组分对小菜蛾卵的活性(96h)

序列表

<160>1

<210>1

<211>432

<212>DNA

<213>嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)

<400>1

gccagggggc cgccttcgcc accggtattc ctccacatct ctacgcattt caccgctaca 60

cgtggaattc tacccccctc tacgagactc cagccaacca gtcttggatg ccgttcccgg 120

gttaagcccg gggatttcac atccaactta attgaccgcc tgcgtgcgct ttacgcccag 180

taattccgat taacgcttgc accctccgta ttaccgcggc tgctggcacg gagttagccg 240

gtgcttcttc tgcgggtaac gtcaatcgta agccctgttc agacttacgc cttcctcccc 300

gctgaaagta ctttacaacc cgaaggcctt cttcatacac gcggcatggc tgcatcaggc 360

ttgcgcccat tgtgcaatat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc 420

agtcccagtg ta 432

Claims

1.嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)CGMCC №.3004。

2.嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)CGMCC №.3004在生产杀虫和/或杀卵剂中的应用。

3.一种杀虫和/或杀卵剂，其活性成分为如下(1)或(2)或(3)或(4)：

(1)嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004的发酵液；

(2)嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004的发酵液上清液；

(3)嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004菌体；

(4)嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004的发酵液上清液的乙酸乙酯萃取物。

4.根据权利要求3所述的杀虫和/或杀卵剂，其特征在于：所述嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004的发酵液的获得方法为将嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004接种于液体培养基中，在28℃～30℃培养36～48小时得到发酵液。

5.根据权利要求3所述的杀虫剂，其特征在于：所述嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004的发酵液上清液和菌体的获得方法为嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004接种于液体培养基中，在28℃～30℃培养36～48小时得到发酵液，然后将发酵液过滤和/或离心，得到液体部分即为嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004的发酵液上清液，得到滤渣或沉淀部分即为嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004的发酵液菌体。

6.根据权利要求3所述的杀卵剂，其特征在于：所述嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004的发酵液上清液的乙酸乙酯萃取物的获得方法为嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004接种于液体培养基中，在28℃～30℃培养36～48小时得到发酵液，然后将发酵液过滤或者离心收集液体，将液体中加入乙酸乙酯萃取收集有机相，得到嗜线虫致病杆菌CGMCC№.3004的发酵液上清液的乙酸乙酯萃取物。

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的杀虫和/或杀卵剂，其特征在于：所述液体培养基为含牛肉蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L的培养基。