BR112018015535B1 - Mistura, composição, material de propagação de plantas, uso de uma mistura e método de controle, supressão de patógenos em plantas ou prevenção de infecção de plantas por patógenos - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a misturas que compreendem, como componentes ativos, pelo menos uma linhagem bacteriana isolada, que é um membro do gênero Paenibacillus, ou um extrato livre de células da mesma ou pelo menos um metabólito da mesma, e pelo menos um pesticida químico. A presente invenção também se refere a composições compreendendo pelo menos uma dessas linhagens bacterianas, caldo de cultura total ou um extrato livre de células ou uma sua fração ou pelo menos um metabólito da mesma e pelo menos um pesticida químico. A presente invenção também se refere a um método de controle ou supressão de patógenos de plantas ou prevenção de infecções de patógenos de plantas pela aplicação de tal composição. A presente invenção também se refere a misturas de fusaricidinas que são metabólitos pesticidas produzidos pelas linhagens anteriormente referidas, e pesticida químico.

Description

DESCRIÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a novas misturas que compreendem, como componentes ativos, pelo menos uma linhagem bacteriana isolada, que é um membro do gênero Paenibacillus, ou um extrato livre de células da mesma ou pelo menos um dos metabólitos do mesmo e, pelo menos, um pesticida químico. A presente invenção também se refere a composições compreendendo pelo menos uma dessas linhagens de bactéria, caldo de cultura completa ou um extrato livre de células ou uma fração do mesmo ou pelo menos um metabólito da mesma, e pelo menos um pesticida químico. A presente invenção também se refere a um método de controle ou supressão de patógenos de plantas ou de prevenção de infecções por patógenos de plantas através da aplicação de tal composição. A presente invenção também se refere a misturas de fusaricidinas que são metabólitos pesticidas produzidos pelas linhagens referidas anteriormente, e pesticida químico.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] No campo técnico de controle de fungos fitopatogênicos que afetam plantas ou culturas é bem conhecido aplicar biopesticidas, por exemplo selecionados a partir de bactérias, como bactérias formadoras de esporos, ou fungos que não são prejudiciais para a planta ou cultura a ser tratada e os quais os agentes de controle biológico podem ainda ser combinados com antagonistas químicos orgânicos clássicos de agentes patogênicos de plantas.
[003] Os biopesticidas têm sido definidos como uma forma de pesticidas com base em micro-organismos (bactérias, fungos, vírus, nemátodos, etc.) ou produtos naturais (compostos ou extratos a partir de fontes biológicas) (Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos: http://www.e pa.gov/pesticides/biopesticides/).
[004] Os biopesticidas são geralmente criados por crescimento e concentração de organismos e / ou os metabólitos do mesmo que ocorrem naturalmente, incluindo bactérias e outros micróbios, fungos, vírus, nemátodos, proteínas, etc. Eles são muitas vezes considerados componentes importantes de programas de gerenciamento integrado de pragas (IPM), e têm recebido atenção muito prática como substitutos para produtos químicos sintéticos de proteção de plantas (PPPs).
[005] Os biopesticidas se dividem em duas classes principais, pesticidas microbianos e bioquímicos: (1) Pesticidas microbianos consistem de bactérias, fungos ou vírus (e muitas vezes incluem os metabólitos que as bactérias e os fungos produzem). Os nematoides entomopatogênicos também são classificados como pesticidas microbianos, embora sejam multi-celulares; (2) Os pesticidas bioquímicos são substâncias de ocorrência natural que controlam as pragas ou fornecem outros usos de proteção de culturas, conforme definido abaixo, mas são relativamente não tóxicos para os mamíferos.
[006] Para o controle de fungos fitopatogênicos, vários pesticidas microbianos compreendendo bactérias que formam esporos, como o Bacillus subtilis, foram descritos mais precocemente, ver, por exemplo, WO 1998/050422; WO 2000/029426; WO 1998/50422 e WO 2000/58442.
[007] O WO 2009/0126.473 descreve composições aquosas agricolamente aceitáveis compreendendo esporos de bactérias ou fungos contidos em um solvente aquoso/orgânico, e que pode ainda compreender agentes para controle de insetos, pesticidas, fungicidas ou as combinações dos mesmos. Esporos de bactérias do gênero Bacillus são uma espécie preferida.
[008] A publicação WO 2006/017361 revela composições para o controle de agentes patogênicos de plantas e compreendendo pelo menos uma bactéria benéfica, pelo menos um fungo benéfico, pelo menos em nutrientes e pelo menos um composto que prolonga o tempo de vida efetivo de uma tal composição. O grupo de bactérias benéficas compreende bactérias de Paenibacillus polymyxa e Paenibacillus durum.
[009] A publicação WO 1999/059412 divulga uma linhagem PKB1 de Paenibacillus polymyxa (com o número de acesso ATCC 202127) ativos contra vários fungos fitopatogênicos.
[010] A publicação WO 2011/069227 revela uma linhagem JB05- 01-1 de P. polymyxa (com o número de acesso ATCC PTA-10436) tendo um efeito altamente inibidor contra bactérias patogênicas, predominantemente bactérias patogênicas humanas de origem alimentar.
[011] A publicação Raza et al. (Brazilian Arch. Biol. Techol. 53, 1145-1154, 2010; Eur. J. Plant Pathol.125: 471-483, 2009) descrevem uma linhagem SQR-21 de Paenibacillus polymyxa que produz fusaricidina efetiva contra Fusarium oxysporum.
[012] Outra linhagem de Paenibacillus polymyxa de chamada AC- 1 é conhecida da Microbial Research 2016 (impressa doi: 10.1016/j.micres.2016.01.004) e do produto Topseed de Green Biotech Co., Ltd. 45-70 Yadang-ri, Gyoha-Eup Paju Kyungki-Do, Coréia do Sul 413-830.
[013] Uma outra linhagem de Paenibacillus polymyxa presumivelmente chamada HY96-2 é conhecida a partir de Biocontrol Science e Technology 24 (4), 426-435 (2014) e deve ser comercializado sob o nome KangDiLeiDe por Shanghai Zeyuan Marine Biotechnology Co., Ltd.
[014] O genoma de várias linhagens de Paenibacillus polymyxa foi publicado até agora: inter alia para a linhagem M-1 (número de acesso NCBI NC_017542; J. Bacteriol. 193 (29), 5862-63, 2011; BMC Microbiol. 13, 137, 2013), linhagem CR1 (número de acesso GenBank CP006941; Genome Announcements 2 (1), 1, 2014) e linhagem SC2 (números de acesso GenBank CP002213 e CP002214; número de acesso NCBI NC_014622; J. Bacteriol. 193 (1), 311-312, 2011), para outras linhagens veja a legenda da Figura 12 aqui apresentada. A linhagem M-1 de P. polymyxa foi depositada na China Geral Microbiological Culture Collection Center (CGMCC) sob número de acesso CGMCC 7581.
[015] No pedido PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371), novas linhagens do gênero Paenibacillus foram caracterizadas. As referidas linhagens bacterianas Lu16774, Lu17007 e Lu17015 foram isoladas a partir de superfície de culturas na Alemanha e depositada sob o Tratado de Budapeste com Deutsche Sammlung von o Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) em 20 de Fevereiro de 2013 pela BASF SE, Alemanha: 1) Linhagem de Paenibacillus Lu16774 depositada com o N° de Acesso DSM 26969, 2) Linhagem de Paenibacillus Lu17007 depositada com o N° de Acesso DSM 26970, e 3) Linhagem de Paenibacillus Lu17015 depositada sob o N° de Acesso DSM 26971.
[016] Como usado aqui, o termo linhagem de Paenibacillus é idêntico ao termo linhagem de Paenibacillus sp. e significa uma linhagem bacteriana do gênero Paenibacillus. O gênero Paenibacillus inclui todas as espécies Paenibacillus spp..
[017] No documento supracitado PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371), as linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 foram determinadas a pertencer ao gênero Paenibacillus nas seguintes observações morfológicas e fisiológicas (ver Exemplo 2.3 em PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) e aqui): - células em forma de bastonete - esporos elipsoidais - esporângio inchado - crescimento anaeróbio - fermentação de uma variedade de açúcares incluindo glicose, arabinose, xilose, manitoba, frutose, rafinose, trealose e glicerol com formação de ácido - produção de gás a partir de glicose - negativo para arginina di-hidrolase - sem utilização de citrato - sem crescimento na presença de 5% ou mais de cloreto de sódio - produção de enzimas hidrolíticas extracelulares degradando amido, gelatina, caseína e esculina.
[018] Além disso, estas linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 também foram determinadas a pertencer ao gênero Paenibacillus por análise de rDNA 16S tendo a sequência de 22-base específica para Paenibacillus no rDNA 16S (5’ para 3’): 5’-TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT-3 ‘ (ver SEQ ID NO: 1 (nucleotídeos 840-861), SEQ ID NO: 2 (840861), SEQ ID NO: 3 (844-865) e SEQ ID NO: 4 (840-861) em listagem de sequências de PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) e aqui).
[019] Além disso, o sequenciamento do rDNA 16S completo em comparação com 24 linhagens diferentes de Paenibacillus resultou no agrupamento das linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 com as linhagens tipo Paenibacillus brasiliensis, P. kribbensis, P. jamilae, P. peoriae, e P. polymyxa, mais preferencialmente a P. peoriae, em particular a linhagem de Paenibacillus peoriae BD-62 (ver Figuras 1 e 2 em PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) e aqui). Sabe-se que P. polymyxa e P. peoriae têm valores de identidade de sequência de rDNA 16S de 99,6 a 99,7% (J. Gen. Appl. Microbiol. 48, 281-285 (2002)).
[020] “Porcentagem de identidade” ou “porcentagem de similaridade” entre duas sequências de nucleotídeos significa a identidade percentual dos resíduos ao longo de todo o comprimento das sequências alinhadas e é determinada pela comparação de duas sequências localmente alinhadas otimamente em uma janela de comparação definida pelo comprimento do alinhamento sítio entre as duas sequências, tais como, por exemplo, a identidade calculada (para sequências bastante similares) após alinhamento manual com o auxílio do programa AE2 (Alignment Editor 2). O sítio de alinhamento entre duas sequências inclui apenas segmentos de cada sequência que são considerados suficientemente semelhantes de acordo com o critério que depende do algoritmo utilizado para realizar o alinhamento (por exemplo, AE2, BLAST, estrutura secundária da molécula de rRNA ou semelhante). A identidade percentual é calculada determinando o número de posições nas quais o ácido nucleico idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100.
[021] Para determinar a porcentagem de identidade de sequência de duas sequências de ácido nucleico (por exemplo, uma das sequências nucleotídicas da Tabela 1 e um homólogo do mesmo), as sequências são alinhadas para fins de comparação otimizada (por exemplo, podem ser introduzidas lacunas na sequência de um ácido nucleico para o alinhamento ótimo com o outro ácido nucleico). As bases nas posições correspondentes são então comparadas. Quando uma posição em uma sequência é ocupada pela base como o posição correspondente na outra sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. É para ser entendido que, para os fins de determinar a identidade de sequência quando se compara uma sequência de DNA com uma sequência de RNA, um nucleotídeo de timidina é equivalente a um nucleotídeo uracila.
[022] Para alinhamento, os dados da sequência foram colocados no programa AE2 (http://iubio.bio.indiana.edu/macio/molbio/UNIX/ae2.readme), alinhadas manualmente de acordo com a estrutura secundária da molécula de rRNA resultante e comparadas com sequências do gene rRNA 16S representativas de organismos pertencentes aos Firmicutes (Nucl. Acids Res. 27, 171-173, 1999). Para obter os valores de% de identidade de múltiplas sequências, todas as sequências foram alinhadas umas com as outras (o alinhamento de sequência múltipla). Além disso, para obter valores de% de identidade entre duas sequências ao longo de um longo trecho de sequências alinhadas em comparação com alinhamento múltiplo, foi realizado um alinhamento manual de sequências pareadas (manual pairwise) como descrito acima utilizando AE2 (alinhamento de sequência par a par).
[023] Ribotipagem padronizada e automatizada foi realizada utilizando o Qualicon RiboPrintersystem com as linhagens de Paenibacillus Lu16774, Lu17007 e Lu17015 em comparação com a P. peoriae BD-62 utilizando a enzima de restrição EcoRI resultou em semelhança de todas as três linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 com P. peoriae BD-62 entre 0,24 e 0,5 (ver Exemplo 2.2, Figura 12 em PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) e aqui). As linhagens de Paenibacillus Lu16774 e Lu17007, foram verificadas como pertencentes à espécie Paenibacillus polymyxa.
[024] De acordo com os resultados da análise filogenética apresentada no documento supracitado PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) (Figuras 12 a 22 naquele e aqui) e resultados não publicados do Professor Borriss, Alemanha, a espécie Paenibacillus polymyxa necessitou uma nova classificação taxonômica em duas subespécies: 1) Paenibacillus polymyxa ssp. polymyxa e 2) Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum; e 3) uma nova espécie Paenibacillus nov. spec. epiphyticus.
[025] O tipo de linhagem de P. polymyxa DSM 36 em conjunto com as linhagens de P. polymyxa SQR-21, CF05, CIC 10580, NRRL B-30509 e A18 formadas em cada um dos dendrogramas de máxima probabilidade analisados para cinco genes housekeeping conservados (dnaN, gyrB, recA, recN e rpoA) um grupo separado (Figuras 17 a 21 do documento PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) e aqui).
[026] Resultados muito semelhantes foram obtidos por determinação da Identidade Média de Aminoácidos (AAI), que é frequentemente usada para determinar a relação filogenética entre espécies bacterianas. Este método baseia-se no cálculo da identidade média de um genoma nuclear ao nível dos aminoácidos (Proc. Natl. Acad. USA 102, 2567-2572, 2005). De acordo com a matriz AAI resultante na Figura 22 em PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) e aqui, P. polymyxa DSM 36 forma em conjunto com a linhagem de P. polymyxa SQR-21, um subgrupo que é diferente do dois outros subgrupos mostrados aqui.
[027] As linhagens Lu16674 e Lu17007 juntamente com a linhagem de P. polymyxa M-1, 1-43, SC2 e Sb3-1 formam o segundo subgrupo em cada um dos dendrogramas de máxima probabilidade analisados para cinco genes house keeping conservados (dnaN, gyrB, recA, recN e rpoA) (Figuras 17 a 21). De acordo com a matriz AAI na Figura 22 do documento PCT/EP2015/067925 (Documento WO 2016/020371) e aqui, com base na análise do genoma principal, este segundo subgrupo é confirmado pelas suas linhagens representativas Lu16674 e Lu17007 em conjunto com as linhagens de P. polymyxa M-1 e SC2.
[028] A diferença entre os dois subgrupos foi encontrada não tão significativa para justificar uma nova espécie, mas os níveis de identidade AAI entre os representantes de ambos os grupos são de cerca de 97,5% justificando a classificação em duas subespécies separadas
[029] Assim, foi proposto no documento PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) nomear o primeiro subgrupo de acordo com a linhagem de P. polymyxa tipo DSM 36T Paenibacillus polymyxa ssp. polymyxa. Além disso, a linhagem DSM 36, as linhagens de P. polymyxa SQR-21, CF05, CICC 10580, NRRL B-30509 e A18 devem pertencer à subespécie Paenibacillus polymyxa ssp. polymyxa.
[030] Além disso, foi proposto nomear o segundo subgrupo como novas subespécies de Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum. Além das linhagens Lu16674 e Lu17007, as linhagens de P. polymyxa M-1, 1-43, SC2 e Sb3-1 devem pertencer a Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum.
[031] A linhagem Lu17015 possui apenas 94,9% de identidade AAI entre os genes do genoma principal com a linhagem tipo Paenibacillus polymyxa DSM36 = ATCC 842 (Figura 22 no documento PCT/EP2015/067925). (WO 2016/020371) e aqui). Assim, a linhagem Lu17015 não poderia ter sido designada para a espécie Paenibacillus polymyxa nem a qualquer outra espécie conhecida como Paenibacillus. Valores similares são encontrados para as linhagens E681 (94,7%) e CR2 (94,9%). Entre si, estas três linhagens têm pelo menos 98,1% de identidade (AAI). De acordo com a definição de espécies de Konstantinides e Tiedje (Proc Natl. Acad. Sei. USA. 102, 2567-2572, 2005), a linhagem Lu17015 e também as linhagens E681 e CR2 podem ser designadas como uma nova espécie. Assim, uma nova espécie Paenibacillus spec. nov. epiphyticus como proposto em PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371). Consequentemente, a linhagem Lu17015 pertence a Paenibacillus epiphyticus. Foi proposto que a referida linhagem deve ser a linhagem tipo. Da mesma forma, os dendrogramas baseados nas comparações de sequência dos cinco genes house keeping (Figuras 17 a 21 em PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371) e aqui) mostraram que este grupo está distante de todas as outras linhagens de P. polymyxa. Além de Lu17015, foi proposto que as linhagens de P. polymyxa E681, CR2 TD94, DSM 365 e WLY78 devem pertencer a Paenibacillus spec. nov. epiphyticus.
[032] Sabe-se que Paenibacillus produz muitos metabólitos antibióticos que são lipopeptídeos, por exemplo, polimixinas, octapeptinas, polipeptinas, pelgipeptinas e fusaricidinas. Fusaricidinas são um grupo de antibióticos isolados de Paenibacillus spp. da classe de lipodepsipeptídeos cíclicos que frequentemente compartilham as seguintes características estruturais: um anel macrocíclico que consiste em 6 resíduos de aminoácidos, três dos quais são L- Thr, D-allo-Thr e D-Ala, bem como a cauda do ácido 15- guanidino-3-hidroxipentadecanoico ligado ao resíduo L- Thr N-terminal por uma ligação amida (ChemMedChem 7, 871-882, 2012; J. Microbiol. Meth. 85, 175182, 2011, Tabela 1 aqui). Estes compostos são ciclizados por uma ponte de lactona entre o grupo L-Thr hidroxila N-terminal e o grupo D-Ala carbonila C- terminal. A posição dos resíduos de aminoácidos dentro do anel depsipeptídico são geralmente numerados começando com o L-Thr acima mencionado, que ele mesmo também transporta a cadeia GHPD e termina com o D-Ala C-terminal. Exemplos não limitantes de fusaricidinas isoladas de Paenibacillus são designados LI-F03, LI-F04, LI-F05, LI-F07 e LI-F08 (J. Antibiotics 40 (11), 1506-1514, 1987; Heterocycles 53 (7), 1533-1549, 2000; Peptides 32, 1917-1923, 2011) e fusaricidinas A (também denominadas LI-F04a), B (também denominadas LI-F04b), C (também denominadas LI-F03a) e D (também designadas LI-F03b) (J. Antibiotics 49 (2), 129-135, 1996; J. Antibiotics 50 (3), 220-228, 1997). A cadeia de aminoácidos de uma fusaricidina não é gerada por ribossomos, mas é gerada por um peptídeo sintetase não ribossômica. Fórmulas estruturais de fusaricidinas conhecidas são mostradas na Tabela 1 (Biotechnol Lett. 34, 1327-1334, 2012; Figura 1 naquele). Os compostos designados como LI-F03a, LI-F03b até LI-F08a e LI-F08b e as fusaricidinas de fórmulas I e I.1 como aqui descritas são também referidas como fusaricidinas LI-F03a, LI-F03b até LI-F08a e LI-F08b devido à sua estrutura dentro da família das fusaricidinas (ver, por exemplo, a Tabela 1).
[033] Entre os antibióticos de fusaricidina isolada, fusaricidina A tem mostrado atividade antimicrobiana mais promissora contra uma variedade de fungos clinicamente relevantes e bactérias gram-positivas, tais como Staphylococcus aureus (faixa de valores MIC: 0,78 a 3,12 μg/ml) (ChemMedChem 7, 871-882, 2012). A síntese de análogos de fusaricidina que contenham ácido 12-guanidino-dodecanoico (12-GDA) ou ácido 12-amino- dodecanoico (12-ADA) em vez de GHPD de ocorrência natural foi estabelecida, mas a substituição de GHPD por 12-ADA resultou na perda completa da atividade antimicrobiana enquanto a substituição de GHPD por 12-GDA reteve a atividade antimicrobiana (Tetrahedron Lett. 47, 8587-8590, 2006; ChemMedChem 7, 871-882, 2012). TABELA 1: ESTRUTURAS DA FAMÍLIA DA FUSARICIDINA
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em que uma seta define uma ligação simples (amida) entre a porção carbonila de GHPD e o grupo amino de L-Thr (L-treonina) ou entre o grupo carbonila de um aminoácido e o grupo amino de um aminoácido vizinho, em que a ponta da seta indica a ligação ao grupo amino do referido aminoácido L-Thr ou do referido aminoácido vizinho; e em que a linha única sem uma ponta de seta define uma ligação simples (éster) entre o grupo carbonila de D-Ala (D-alanina) e o grupo hidroxila de L-Thr; e em que o GHPD é o ácido 15-guanidino-3-hidroxipentadecanoico. * no caso destas duas fusaricidinas 1A e 1B conhecidas a partir do documento PCT não publicado PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371), a configuração estéreo dos seis aminoácidos do peptídeo cíclico não foi elucidada.
[034] As fusaricidinas A, B, C e D são também relatadas para inibir fungos patógenos de plantas, tais como Fusarium oxysporum, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, e Penicillum thomii (J. Antibiotics 49 (2), 129-135, 1996; J. Antibiotics 50 (3), 220-228, 1997). Descobriu-se que as fusaricidinas tais como Li-F05, LI-F07 e LI-F08 têm uma certa atividade antifúngica contra vários fungos patógenos de plantas tais como Fusarium moniliforme, F. oxysporum, F. roseum, Giberella fujkuroi, Helminthosporium sesamum e Penicillium expansum (J. Antibiotics 40 (11), 1506-1514, 1987). As fusaricidinas também têm atividade antibacteriana para bactérias Gram-positivas incluindo Staphylococcus aureus (J. Antibiotics 49, 129-135, 1996; J. Antibiotics 50, 220-228, 1997). Adicionalmente, as fusaricidinas têm atividade antifúngica contra Leptosphaeria maculans que causa podridão de raiz negra de canola (Can. J. Microbiol. 48, 159-169, 2002). Além disso, as fusaricidinas A e B e dois compostos relacionados das mesmas, em que D-allo-Thr está ligado através do seu grupo hidroxila a uma alanina adicional usando uma ponte de éster, produzido por certas linhagens de Paenibacillus foram deparados como indutores de reações de resistência em células de salsa em cultura e inibidores de crescimento de Fusarium oxysporum (WO 2006/016558; EP 1 788 074 A1).
[035] O documento WO 2007/086645 descreve a enzima fusaricidina sintetase e o seu gene que a codifica tal como isolada da linhagem de Paenibacillus polymyxa E681, a qual a enzima é envolvida na síntese de fusaricidinas A, B, C, D, LI-F03, LI-F04, LI-F05, LI-F07 e LI-F08.
[036] Na publicação acima mencionada PCT/EP2015/067925 (WO 2016/020371), verificou-se que o caldo de cultura inteiro, o meio de cultura e extratos livres de células das linhagens bacterianas Lu16774, Lu17007 e Lu17015 mostram atividade inibidora inter alia contra Alternaria spp., Botrytis cinerea e Phytophthora infestans. O fracionamento guiado por bioatividade de extratos orgânicos destas linhagens conduziu aos isolamento de dois novos compostos do tipo fusaricidina (aqui referidos como fusaricidina 1A e 1B), a estrutura dos quais foram elucidadas por espectroscopia 1D- e 2D-RMN assim uma espectrometria de massa:
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[037] Biopesticidas para uso contra doenças de culturas já se estabeleceram em uma variedade de culturas. Por exemplo, biopesticidas já desempenham um papel importante no controle doenças do míldio. Seus benefícios incluem: um intervalo de pré-colheita de 0 dias e a capacidade de usar sob pressão moderada à grave.
[038] No entanto, biopesticidas, sob certas condições também podem ter desvantagens, tais como elevada especificidade (que requerem uma identificação exata da praga/ agente patogênico e a utilização de vários produtos), a velocidade de ação lenta (tornando-os inadequados se um surto das pragas é uma ameaça imediata para uma colheita), eficácia variável devido às influências de vários fatores bióticos e abióticos (uma vez que biopesticidas são geralmente organismos vivos, que provocam o controle de pragas/ agente patogênico multiplicando dentro do alvo de pragas de insetos/ agente patogênico), e o desenvolvimento de resistência.
[039] A experiência agrícola prática tem demonstrado que a aplicação repetida e exclusiva de um componente ativo individual no controle de fungos, insetos ou outras pragas nocivas leva, em muitos casos, a uma rápida seleção de linhagens de fungos ou pragas que desenvolveram resistência natural ou adaptada contra o componente ativo em questão. Controle eficaz destes fungos ou pragas com o componente ativo em questão, em seguida, deixa de ser possível.
[040] Para reduzir o risco da seleção de linhagens de fungos resistentes ou isolados de insetos, misturas de diferentes componentes ativos são hoje convencionalmente empregadas para controlar fungos nocivos ou insetos ou outras pragas. Combinando compostos e / ou biopesticidas com atividade pesticida com diferentes mecanismos de ação, é possível assegurar um controle bem-sucedido durante um período de tempo relativamente longo.
[041] É um objetivo da presente invenção supera as desvantagens acima mencionadas e proporciona, com vista a uma gestão eficaz da resistência e controle eficaz de fungos nocivos fitopatogênicos, insetos ou outras pragas ou a uma regulação eficaz no crescimento das plantas, a taxas de aplicação que são tão baixas quanto possível, composições que, a uma quantidade total reduzida de composto ativo aplicados, melhoraram a atividade contra fungos nocivos ou pragas ou melhoraram a atividade de regulação do crescimento das plantas (misturas sinérgicas) e um espectro de atividade alargado, em particular para determinadas indicações.
[042] Um problema típico que surge no campo do controle de pragas reside na necessidade de reduzir as taxas de dosagem do ingrediente ativo, a fim de reduzir ou evitar efeitos ambientais ou toxicológicos desfavoráveis enquanto ainda permite um controle eficaz das pragas. No que diz respeito à presente invenção, o termo pragas abrange pragas animais e fungos nocivos.
[043] Foi, portanto, um objetivo da presente invenção fornecer misturas pesticidas que resolvam os problemas de reduzir a taxa de dosagem e / ou aumentar o espectro de atividade e / ou combinar atividade de derrubada com controle prolongado e / ou gerenciamento de resistência e / ou promover (melhorar) a saúde das plantas.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[044] Revelamos, portanto, que este objetivo é alcançado pelas misturas e composições aqui definidas, compreendendo pelo menos uma linhagem bacteriana do gênero Paenibacillus (linhagem Paenibacillus), ou um extrato livre de células da mesma ou pelo menos um metabólito da mesma, e um pesticida químico como aqui definido.
[045] Assim, a presente invenção refere-se a misturas que compreendem, como componentes ativos 1) pelo menos uma linhagem de Paenibacillus, o meio de cultura ou um extrato livre de células da mesma ou, pelo menos, um metabólito da mesma; e 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir dos grupos A) a N): A) Inibidores de respiração - Inibidores do complexo III no sítio de Qo: azoxistrobin (A.1.1), coumetoxistrobin (A.1.2), coumoxistrobin (A.1.3), dimoxistrobin (A.1.4), enestroburin (A.1.5), fenaminstrobin (A.1.6), fenoxistrobin/flufenoxistrobin (A.1.7), fluoxastrobin (A.1.8), cresoxim- metil (A.1.9), mandestrobin (A.1.10), metominostrobin (A.1.11), orisastrobin (A.1.12), picoxistrobin (A.1.13), piraclostrobin (A.1.14), pirametostrobin (A.1.15), piraoxistrobin (A.1.16), trifloxistrobin (A.1.17), 2- (2- (3- (2,6- diclorofenil) - 1- metil- allilideno- amino- oximetil) - fenil) - 2- metoxiimino- N- metil- acetamida (A.1.18), piribencarb (A.1.19), triclopiricarb/clorodincarb (A.1.20), famoxadona (A.1.21), fenamidona (A.1.21), metil- N- [2- [(1,4- dimetil- 5- fenil- pirazol- 3- il) oxilmetil] fenil] - N- metoxi- carbamato (A.1.22), 1- [3- cloro- 2- [[1- (4- clorofenil) - 1H- pirazol- 3- il] oximetil] fenil] - 4- metil- tetrazol- 5- ona (A.1.23), 1- [3- bromo- 2- [[1- (4- clorofenil) pirazol- 3- il] oximetil] fenil] - 4- metil- tetrazol- 5- ona (A.1.24), 1- [2[[1- (4- clorofenil) pirazol- 3- il] oximetil] - 3- metil- fenil] - 4- metil- tetrazol- 5- ona (A.1.25), 1- [2- [[1- (4- clorofenil) pirazol- 3- il] oximetil] - 3- fluoro- fenil] - 4- metil- tetrazol- 5- ona (A.1.26), 1- [2- [[1- (2,4- diclorofenil) pirazol- 3- il] oximetil] - 3- fluoro- fenil] - 4- metil- tetrazol- 5- ona (A.1.27), 1- [2- [[4- (4- clorofenil) tiazol- 2- il] oximetil] - 3- metil- fenil] - 4- metil- tetrazol- 5- ona (A.1.28), 1- [3- cloro- 2- [[4- (p- tolil) tiazol- 2- il] oximetil] fenil] - 4- metil- tetrazol- 5- ona (A.1.29), 1- [3- ciclopropil- 2- [[2- metil- 4- (1- metilpirazol- 3- il) fenoxi] metil] fenil] - 4- metil- tetrazol- 5- ona (A.1.30), 1- [3- (difluorometoxi) - 2- [[2- metil- 4- (1- metilpirazol- 3- il) fenoxi] metil] fenil] - 4- metil- tetrazol- 5- ona (A.1.31), 1- metil- 4- [3- metil- 2- [[2- metil- 4- (1- metilpirazol- 3- il) fenoxi] metil] fenil] tetrazol- 5- ona (A.1.32), 1- metil- 4- [3- metil- 2- [[1- [3- (trifluorometil) fenil] - etilidenoamino] oximetil] fenil] tetrazol- 5- ona (A.1.33), (Z,2E) - 5- [1- (2,4- diclorofenil) pirazol- 3- il] -oxi- 2- metoxiimino- N,3- dimetil- pent- 3- enamida (A.1.34), (Z,2E) - 5- [1- (4- clorofenil) pirazol- 3- il] oxi- 2- metoxiimino- N,3- dimetil- pent- 3- enamida (A.1.35), piriminostrobin (A.1.36), bifujunzhi (A.1.37), ácido 2- (orto- ( (2,5- dimetilfenil- oximetilen) fenil) - 3- metoxi- acrilico metilester (A.1.38); - Inibidores do complexo III no sítio de Qi: ciazofamid (A.2.1), amisulbrom (A.2.2), [(6S,7R,8R) - 8- benzil- 3- [(3- hidroxi- 4- metoxi- piridina- 2- carbonil) amino] - 6- metil- 4,9- dioxo- 1,5- dioxonan- 7- il] 2- metilpropanoato (A.2.3), [2- [[(7R,8R,9S) - 7- benzil- 9- metil- 8- (2- metilpropanoiloxi) - 2,6- dioxo- 1,5- dioxonan- 3- il] carbamoil] - 4- metoxi- 3- piridil] oximetil 2- metilpropanoato (A.2.4), [(6S,7R,8R) - 8- benzil- 3- [[4- metoxi- 3- (propanoiloximetoxi) piridina- 2- carbonil] amino] - 6- metil- 4,9- dioxo- 1,5- dioxonan- 7- il] 2- metilpropanoato (A.2.5); - Inibidores do complexo II: benodanil (A.3.1), benzovindiflupir (A.3.2), bixafen (A.3.3), boscalid (A.3.4), carboxin (A.3.5), fenfuram (A.3.6), fluopiram (A.3.7), flutolanil (A.3.8), fluxapiroxad (A.3.9), furametpir (A.3.10), isofetamid (A.3.11), isopirazam (A.3.12), mepronil (A.3.13), oxicarboxin (A.3.14), penflufen (A.3.15), pentiopirad (A.3.16), sedaxano (A.3.19), tecloftalam (A.3.20), tifluzamida (A.3.21), 3- (difluorometil) - 1- metil- N- (1,1,3- trimetilindan- 4- il) pirazol- 4- carboxamida (A.3.22), 3- (trifluorometil) - 1- metil- N- (1,1,3- trimetilindan- 4- il) pirazol- 4- carboxamida (A.3.23), 1,3- dimetil- N- (1,1,3- trimetilindan- 4- il) pirazol- 4- carboxamida (A.3.24), 3- (trifluorometil) - 1,5- dimetil- N- (1,1,3- trimetilindan- 4- il) pirazol- 4- carboxamida (A.3.25), 1,3,5- trimetil- N- (1,1,3- trimetilindan- 4- il) pirazol- 4- carboxamida (A.3.26), 3- (difluorometil) - 1,5- dimetil- N- (1,1,3- trimetilindan- 4- il) pirazol- 4- carboxamida (A.3.27), 3- (difluorometil) - N- (7- fluoro- 1,1,3- trimetil- indan- 4- il) - 1- metil- pirazol- 4- carboxamida (A.3.28), metil (E) - 2- [2- [(5- ciano- 2- metil- fenoxi) metil] fenil] - 3- metoxi- prop- 2- enoato (A.3.30); - Outros inibidores dr respiração: diflumetorim (A.4.1); nitrofenil derivatos: binapacril (A.4.2), dinobuton (A.4.3), dinocap (A.4.4), fluazinam (A.4.5), ferimzona (A.4.7); compostos organometálicos: sais de fentin, por exemplo, fentin- acetato (A.4.8), fentin cloreto (A.4.9) ou fentin hidróxido (A.4.10); ametoctradin (A.4.11); siltiofam (A.4.12); B) Inibidores da biossíntese de esteróis (fungicidas SBI) - Inibidores da desmetilase C14: triazois: azaconazol (B.1.1), bitertanol (B.1.2), bromuconazol (B.1.3), ciproconazol (B.1.4), difenoconazol (B.1.5), diniconazol (B.1.6), diniconazol- M (B.1.7), epoxiconazol (B.1.8), fenbuconazol (B.1.9), fluquinconazol (B.1.10), flusilazol (B.1.11), flutriafol (B.1.12), hexaconazol (B.1.13), imibenconazol (B.1.14), ipconazol (B.1.15), metconazol (B.1.17), miclobutanil (B.1.18), oxpoconazol (B.1.19), paclobutrazol (B.1.20), penconazol (B.1.21), propiconazol (B.1.22), protioconazol (B.1.23), simeconazol (B.1.24), tebuconazol (B.1.25), tetraconazol (B.1.26), triadimefon (B.1.27), triadimenol (B.1.28), triticonazol (B.1.29), uniconazol (B.1.30), 1- [rel- (2S;3R) - 3- (2- clorofenil) - 2- (2,4- difluorofenil) - oxiranilmetil] - 5- tiocianato- 1H- [1,2,4] triazol (B.1.31), 2- [rel- (2S;3R) - 3- (2- clorofenil) - 2- (2,4- difluorofenil) - oxiranilmetil] - 2H- [1,2,4] triazol- 3- tiol (B.1.32), 2- [2- cloro- 4- (4- clorofenoxi) fenil] - 1- (1,2,4- triazol- 1- il) pentan- 2- ol (B.1.33), 1- [4- (4- clorofenoxi) - 2- (trifluorometil) fenil] - 1- ciclopropil- 2- (1,2,4- triazol- 1- il) etanol (B.1.34), 2- [4(4- clorofenoxi) - 2- (trifluorometil) fenil] - 1- (1,2,4- triazol- 1- il) butan- 2- ol (B.1.35), 2- [2- cloro- 4- (4- clorofenoxi) fenil] - 1- (1,2,4- triazol- 1- il) butan- 2- ol (B.1.36), 2- [4- (4- clorofenoxi) - 2- (trifluorometil) fenil] - 3- metil- 1- (1,2,4- triazol- 1- il) butan- 2- ol (B.1.37), 2- [4- (4- clorofenoxi) - 2- (trifluorometil) fenil] - 1- (1,2,4- triazol- 1- il) propan- 2- ol (B.1.38), 2- [2- cloro- 4- (4- clorofenoxi) fenil] - 3- metil- 1- (1,2,4- triazol- 1- il) butan- 2- ol (B.1.39), 2- [4- (4- clorofenoxi) - 2- (trifluorometil) fenil] - 1- (1,2,4- triazol- 1- il) pentan- 2- ol (B.1.40), 2- [4- (4- fluorofenoxi) - 2- (trifluorometil) fenil] - 1- (1,2,4- triazol- 1- il) propan- 2- ol (B.1.41), 2- [2- cloro- 4- (4- clorofenoxi) fenil] - 1- (1,2,4- triazol- 1- il) pent- 3- in- 2- ol (B.1.42), 2- (clorometil) - 2- metil- 5- (p- tolilmetil) - 1- (1,2,4- triazol- 1- ilmetil) ciclopentanol (B.1.43); imidazois: imazalil (B.1.44), pefurazoato (B.1.45), procloraz (B.1.46), triflumizol (B.1.47); pirimidinas, piridinas e piperazinas: fenarimol (B.1.49), pirifenox (B.1.50), triforina (B.1.51), [3- (4- cloro- 2- fluoro- fenil) - 5- (2,4- difluorofenil) isoxazol- 4- il] - (3- piridil) metanol (B.1.52); - Inibidores da Delta14- redutase: aldimorf (B.2.1), dodemorf (B.2.(2) dodemorf- acetato (B.2.3), fenpropimorf (B.2.4), tridemorf (B.2.5), fenpropidin (B.2.6), piperalin (B.2.7), espiroxamina (B.2.8); - Inibidores da 3- ceto redutase: fenhexamid (B.3.1); - Outros inibidores da biossíntese de esterol: clorfenomizol (B.4.1); C) Inibidores da síntese de ácidos nucleicos - Fungicidas de fenilamidas ou de aminoácidos de acila: benalaxil (C.1.1), benalaxil- M (C.1.2), ciralaxil (C.1.3), metalaxil (C.1.4), metalaxil- M (C.1.5), ofurace (C.1.6), oxadixil (C.1.7); - Outros inibidores da síntese de ácidos nucleicos: himexazol (C.2.1), octilinona (C.2.2), ácido oxolinico (C.2.3), bupirimato (C.2.4), 5- fluorocitosina (C.2.5), 5- fluoro- 2- (p- tolilmetoxi) pirimidin- 4- amina (C.2.6), 5- fluoro- 2- (4- fluorofenilmetoxi) pirimidin- 4- amina (C.2.7), 5- fluoro- 2- (4- clorofenilmetoxi) pirimidin- 4 amina (C.2.8); D) Inibidores da divisão celular e do citoesqueleto - Inibidores da tubulina: benomil (D1.1), carbendazim (D.1.2), fuberidazol (D1.3), tiabendazol (D1.4), tiofanato- metil (D1.5), 3- cloro- 4- (2,6- difluorofenil) - 6- metil- 5- fenil- piridazina (D.1.6), 3- cloro- 6- metil- 5- fenil- 4(2,4,6- trifluorofenil) piridazina (D.1.7), N- etil- 2- [(3- etinil- 8- metil- 6- quinolil) oxi] butanamida (D.1.8), N- etil- 2- [(3- etinil- 8- metil- 6- quinolil) oxi] - 2- metilsulfanil- acetamida (D.1.9), 2- [(3- etinil- 8- metil- 6- quinolil) oxi] - N- (2- fluoroetil) butanamida (D.1.10), 2- [(3- etinil- 8- metil- 6- quinolil) oxi] - N- (2- fluoroetil) - 2- metoxi- acetamida (D.1.11), 2- [(3- etinil- 8- metil- 6- quinolil) oxi] - N- propil- butanamida (D.1.12), 2- [(3- etinil- 8- metil- 6- quinolil) oxi] - 2- metoxi- N- propil- acetamida (D.1.13), 2- [(3- etinil- 8- metil- 6- quinolil) oxi] - 2- metilsulfanil- N- propil- acetamida, (D.1.14), 2- [(3- etinil- 8- metil- 6- quinolil) oxi] - N- (2- fluoroetil) - 2- metilsulfanil- acetamida (D.1.15), 4- (2- bromo- 4- fluoro- fenil) - N- (2- cloro- 6- fluoro- fenil) - 2,5- dimetil- pirazol- 3- amina (D.1.16); - Outros inibidores da divisão celular: dietofencarb (D.2.1), etaboxam (D.2.2), pencicuron (D.2.3), fluopicolida (D.2.4), zoxamida (D.2.5), metrafenona (D.2.6), piriofenona (D.2.7); E) Inibidores da síntese de aminoácidos e proteínas - Inibidores da síntese de metionina: ciprodinil (E.1.1), mepanipirim (E.1.2), pirimetanil (E.1.3); - Inibidores da síntese de proteínas: blasticidin- S (E.2.1), casugamicin (E.2.2), casugamicin hidrocloreto- hidrato (E.2.3), mildiomicin (E.2.4), streptomicin (E.2.5), oxitetraciclin (E.2.6); F) Inibidores de transdução de sinal - Inibidores da MAP / histidina quinase: fluoroimid (F.1.1), iprodiona (F.1.2), procimidona (F.1.3), vinclozolin (F.1.4), fludioxonil (F.1.5); - Inibidores da proteína G: quinoxifen (F.2.1); G) Inibidores de síntese de lipídios e membranas - Inibidores da biossíntese de fosfolipídios: edifenfos (G.1.1), iprobenfos (G.1.2), pirazofos (G.1.3), isoprotiolana (G.1.4); - Peroxidação lipídica: dicloran (G.2.1), quintozena (G.2.2), tecnazena (G.2.3), tolclofos- metil (G.2.4), bifenil (G.2.5), cloronab (G.2.6), etridiazol (G.2.7); - Biossíntese de fosfolipídios e deposição de parede celular: dimetomorf (G.3.1), flumorf (G.3.2), mandipropamid (G.3.3), pirimorf (G.3.4), bentiavalicarb (G.3.5), iprovalicarb (G.3.6), valifenalato (G.3.7); - Compostos que afetam a permeabilidade da membrana celular e ácidos graxos: propamocarb (G.4.1); - Inibidores da proteína ligante de oxiesterol: oxatiapiprolin (G.5.1), 2- {3- [2- (1- { [3,5- bis (difluorometil- 1H- pirazol- 1- il] acetil} piperidin- 4- il) - 1,3- tiazol- 4- il] - 4,5- dihidro- 1,2- oxazol- 5- il} fenil metanosulfonato (G.5.2), 2- {3- [2- (1- { [3,5- bis (difluorometil) - 1H- pirazol- 1- il] acetil} piperidin- 4- il) 1,3- tiazol- 4- il] - 4,5- dihidro- 1,2- oxazol- 5- il} - 3- clorofenil metanosulfonato (G.5.3); H) Inibidores com ação em multiplos sítios - Substâncias ativas inorgânicas: Mistura de bordeaux (H.1.1), cobre (H.1.2), cobre acetato (H.1.3), cobre hidróxido (H.1.4), cobre oxicloreto (H.1.5), cobre sulfato básico (H.1.6), enxofre (H.1.7); - Tiocarbamatos e ditiocarbamatos: ferbam (H.2.1), mancozeb (H.2.2), maneb (H.2.3), metam (H.2.4), metiram (H.2.5), propineb (H.2.6), tiram (H.2.7), zinab (H.2.8), ziram (H.2.9); - Compostos organoclorados: anilazina (H.3.1), clorotalonil (H.3.2), captafol (H.3.3), captan (H.3.4), folpet (H.3.5), diclofluanid (H.3.6), diclorofen (H.3.7), hexaclorobenzena (H.3.8), pentaclorfenole (H.3.9) e sais do mesmo, ftalida (H.3.10), tolilfluanid (H.3.11); - Guanidinas e outros: guanidina (H.4.1), dodina (H.4.2), dodina de base livre (H.4.3), guazatina (H.4.4), guazatina- acetato (H.4.5), iminoctadina (H.4.6), iminoctadina- triacetato (H.4.7), iminoctadina- tris (albesilato) (H.4.8), ditianon (H.4.9), 2,6- dimetil- 1H,5H- [1,4] ditiino [2,3- c:5,6- c'] dipirrolo- 1,3,5,7 (2H,6H) - tetraona (H.4.10); I) Inibidores da síntese da parede celular - Inibidores da síntese de glucano: validamicin (I.1.1), polioxin B (I.1.2); - Inibidores da síntese de melanina: piroquilon (I.2.1), triciclazol (I.2.2), carpropamid (I.2.3), diciclomet (I.2.4), fenoxanil (I.2.5); J) Indutores de defesa da planta - acibenzolar- S- metil (J.1.1), probenazol (J.1.2), isotianil (J.1.3), tiadinil (J.1.4), prohexadiona- cálcio (J.1.5); fosfonatos: fosetil (J.1.6), fosetil- alumínio (J.1.7), ácido fosfórico e sais do mesmo (J.1.8), bicarbonato de potássio ou sódio (J.1.9); C) Modo de ação desconhecido - bronopol (C.1.1), cinometionat (C.1.2), ciflufenamid (C.1.3), cimoxanil (C.1.4), dazomet (C.1.5), debacarb (C.1.6), diclocimet (C.1.7), diclomezina (C.1.8), difenzoquat (C.1.9), difenzoquat- metilsulfato (C.1.10), difenilamin (C.1.11), fenitropan (C.1.12), fenpirazamina (C.1.13), flumetover (C.1.14), flusulfamida (C.1.15), flutianil (C.1.16), harpin (C.1.17), metasulfocarb (C.1.18), nitrapirin (C.1.19), nitrotal- isopropil (C.1.20), tolprocarb (C.1.21), oxin- cobre (C.1.22), proquinazid (C.1.23), tebufloquin (C.1.24), tecloftalam (C.1.25), triazóxido (C.1.26), N'- (4- (4- cloro- 3- trifluorometil- fenoxi) - 2,5- dimetil- fenil) - N- etil- N- metil formamidina (C.1.27), N'- (4- (4- fluoro- 3- trifluorometil- fenoxi) - 2,5- dimetil- fenil) - N- etil- N- metil formamidina (C.1.28), N'- [4- [[3- [(4- clorofenil) metil] - 1,2,4- tiadiazol- 5- il] oxi] - 2,5- dimetil- fenil] - N- etil- N- metil- formamidina (C.1.29), N'- (5- bromo- 6- indan- 2- iloxi- 2- metil- 3- piridil) - N- etil- N- metil- formamidina (C.1.30), N'- [5- bromo- 6- [1- (3,5- difluorofenil) etoxi] - 2- metil- 3- piridil] - N- etil- N- metil- formamidina (C.1.31), N'- [5- bromo- 6- (4- isopropilciclohexoxi) - 2- metil- 3- piridil] - N- etil- N- metil- formamidina (C.1.32), N'- [5- bromo- 2- metil- 6- (1- feniletoxi) - 3- piridil] - N- etil- N- metil- formamidina (C.1.33), N'- (2- metil- 5- trifluorometil- 4- (3- trimetilsilanil- propoxi) - fenil) - N- etil- N- metil formamidina (C.1.34), N'- (5- difluorometil- 2- metil- 4- (3- trimetilsilanil- propoxi) - fenil) - N- etil- N- metil formamidina (C.1.35), 2- (4- cloro- fenil) - N- [4- (3,4- dimetoxi- fenil) - isoxazol- 5- il] - 2- prop- 2- iniloxi- acetamida (C.1.36), 3- [5- (4- cloro- fenil) - 2,3- dimetil- isoxazolidin- 3- il] - piridina (pirisoxazol) (C.1.37), 3- [5- (4- metilfenil) - 2,3- dimetil- isoxazolidin- 3- il] - piridina (C.1.38), 5- cloro- 1- (4,6- dimetoxi- pirimidin- 2- il) - 2- metil- 1H- benzoimidazol (C.1.39), etil (Z) - 3- amino- 2- ciano- 3- fenil- prop- 2- enoato (C.1.40), picarbutrazox (C.1.41), pentil N- [6- [[(Z) - [(1- metiltetrazol- 5- il) - fenil- metileno] amino] oximetil] - 2- piridil] carbamato (C.1.42), 2- [2- [(7,8- difluoro- 2- metil- 3- quinolil) oxi] - 6- fluoro- fenil] propan- 2- ol (C.1.44), 2- [2- fluoro- 6- [(8- fluoro- 2- metil- 3- quinolil) oxi] fen- il] propan- 2- ol (C.1.45), 3- (5- fluoro- 3,3,4,4- tetrametil- 3,4- dihidroiso- quinolin- 1- il) quinolina (C.1.46), 3- (4,4- difluoro- 3,3- dimetil- 3,4- dihidroisoquinolin- 1- il) quinolina (C.1.47), 3- (4,4,5- trifluoro- 3,3- dimetil- 3,4- dihidroisoquinolin- 1- il) quinolina (C.1.48), 9- fluoro- 2,2- dimetil- 5(3- quinolil) - 3H- 1,4- benzoxazepina (C.1.49), 2- (6- benzil- 2- piridil) quinazolina (C.1.50), 2- [6- (3- fluoro- 4- metoxi- fenil) - 5- metil- 2- piridil] quinazolina (C.1.51), 3- [(3,4- dicloroisotiazol- 5- il) metoxi] - 1,2- benzotiazol 1,1- dióxido (C.1.52); L) Reguladores de crescimento ácido abscisico, amidoclor, ancimidol, 6- benzilaminopurina, brassinolida, butralin, clormequat, clormequat cloreto, colina cloreto, ciclanilida, daminozida, dicegulac, dimetipin, 2,6- dimetilpuridina, etefon, flumetralin, flurprimidol, flutiacet, forclorfenuron, ácido giberéllico, inabenfida, ácido indol- 3- acético, hidrazida maleica, mefluidida, mepiquat, mepiquat cloreto, ácido naftalenoacético, N- 6- benziladenina, paclobutrazol, prohexadiona, prohexadiona- cálcio, prohidrojasmon, tidiazuron, triapentenol, tributil fosforotritioato, ácido 2,3,5- tri- iodobenzoico, trinexapac- etil, uniconazol; M) Herbicidas das classes M.1 a M.15 M.1 Inibidores da biossíntese de lipídios: alloxidim, alloxidim- sódio, butroxidim, cletodim, clodinafop, clodinafop- propargil, cicloxidim, cihalofop, cihalofop- butil, diclofop, diclofop- metil, fenoxaprop, fenoxaprop- etil, fenoxaprop- P, fenoxaprop- P- etil, fluazifop, fluazifop- butil, fluazifop- P, fluazifop- P- butil, haloxifop, haloxifop- metil, haloxifop- P, haloxifop- P- metil, metamifop, pinoxaden, profoxidim, propaquizafop, quizalofop, quizalofop- etil, quizalofop- tefuril, quizalofop- P, quizalofop- P- etil, quizalofop- P- tefuril, setoxidim, tepraloxidim, tralcoxidim, 4- (4'- cloro- 4- ciclopropil- 2'- fluoro [1,1'- bifenil] - 3- il) - 5- hidroxi- 2,2,6,6- tetrametil- 2H- piran- 3 (6H) - ona (CAS 1312337- 72- 6); 4- (2',4'- dicloro- 4- ciclopropil [1,1'- bifenil] - 3- il) - 5- hidroxi- 2,2,6,6- tetrametil- 2H- piran- 3 (6H) - ona (CAS 1312337- 45- 3); 4- (4'- cloro- 4- etil- 2'- fluoro [1,1'- bifenil] - 3- il) - 5- hidroxi- 2,2,6,6- tetrametil- 2H- piran- 3 (6H) - ona (CAS 1033757- 93- 5); 4- (2',4'- dicloro- 4- etil [1,1'- bifenil] - 3- il) - 2,2,6,6- tetrametil- 2H- piran- 3,5 (4H,6H) - diona (CAS 1312340- 84- 3); 5- (acetiloxi) - 4(4'- cloro- 4- ciclopropil- 2'- fluoro [1,1'- bifenil] - 3- il) - 3,6- dihidro- 2,2,6,6- tetrametil- 2H- piran- 3- ona (CAS 1312337- 48- 6); 5- (acetiloxi) - 4- (2',4‘- dicloro- 4- ciclopropil- [1,1'- bifenil] - 3- il) - 3,6- dihidro- 2,2,6,6- tetrametil- 2H- piran- 3- ona; 5- (acetiloxi) - 4- (4'- cloro- 4- etil- 2'- fluoro [1,1'- bifenil] - 3- il) - 3,6- dihidro- 2,2,6,6- tetrametil- 2H- piran- 3- ona (CAS 1312340- 82- 1); 5- (acetiloxi) - 4- (2',4'- dicloro- 4- etil [1,1'- bifenil] - 3- il) - 3,6- dihidro- 2,2,6,6- tetrametil- 2H- piran- 3- ona (CAS 1033760- 55- 2); ácido 4- (4'- cloro- 4- ciclopropil- 2'- fluoro [1,1'- bifenil] - 3- il) - 5,6- dihidro- 2,2,6,6- tetrametil- 5- oxo- 2H- piran- 3- il carbonico metil ester (CAS 1312337- 51- 1); ácido 4- (2',4‘- dicloro - 4- ciclopropil- [1,1'- bifenil] - 3- il) - 5,6- dihidro- 2,2,6,6- tetrametil- 5- oxo- 2H- piran- 3- il carbonico metil ester; ácido carbonico 4- (4'- cloro- 4- etil- 2'- fluoro [1,1'- bifenil] - 3- il) - 5,6- dihidro- 2,2,6,6- tetrametil- 5- oxo- 2H- piran- 3- il metil ester (CAS 1312340- 83- 2); ácido carbonico 4- (2',4'- dicloro- 4- etil [1,1'- bifenil] - 3- il) - 5,6- dihidro- 2,2,6,6- tetrametil- 5- oxo- 2H- piran- 3- il metil ester (CAS 1033760- 58- 5); benfuresato, butilato, cicloato, dalapon, dimepiperato, EPTC, esprocarb, etofumesato, flupropanato, molinato, orbencarb, pebulato, prosulfocarb, TCA, tiobencarb, tiocarbazil, triallato e vernolato; M.2 Inibidores da ALS: amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, bensulfuron- metil, clorimuron, clorimuron- etil, clorsulfuron, cinosulfuron, ciclosulfamuron, etametsulfuron, etametsulfuron- metil, etoxisulfuron, flazasulfuron, flucetosulfuron, flupirsulfuron, flupirsulfuron- metil- sódio, foramsulfuron, halosulfuron, halosulfuron- metil, imazosulfuron, iodosulfuron, iodosulfuron- metil- sódio, iofensulfuron, iofensulfuron- sódio, mesosulfuron, metazosulfuron, metsulfuron, metsulfuron- metil, nicosulfuron, ortosulfamuron, oxasulfuron, primisulfuron, primisulfuron- metil, propirisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron, pirazosulfuron- etil, rimsulfuron, sulfometuron, sulfometuron- metil, sulfosulfuron, tifensulfuron, tifensulfuron- metil, triasulfuron, tribenuron, tribenuron- metil, trifloxisulfuron, triflusulfuron, triflusulfuron- metil, tritosulfuron, imazametabenz, imazametabenz- metil, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir; cloransulam, cloransulam- metil, diclosulam, flumetsulam, florasulam, metosulam, penoxsulam, pirimisulfan e piroxsulam; bispiribac, bispiribac- sódio, piribenzoxim, piriftalid, piriminobac, piriminobac- metil, piritiobac, piritiobac- sódio, ácido- 1- metiletil 4- [[ [2- [(4,6- dimetoxi- 2- pirimidinil) oxi] fenil] metil] amino] - benzoico ester (CAS 420138- 41- 6), ácido 4[[ [2- [(4,6- dimetoxi- 2- pirimidinil) oxi] fenil] metil] amino] - benzoico propil ester (CAS 420138- 40- 5), N- (4- bromofenil) - 2- [(4,6- dimetoxi- 2- pirimidinil) oxi] benzenemetanamina (CAS 420138- 01- 8); flucarbazona, flucarbazona- sódio, propoxicarbazona, propoxicarbazona- sódio, tiencarbazona, tiencarbazona- metil; triafamona; M.3 Inibidores da fotossíntese: amicarbazona; clorotriazina; ametrin, atrazina, cloretozona, cianazina, desmetrin, dimetametrin,hexazinona, metribuzin, prometon, prometrin, propazina, simazina, simetrin, terbumeton, terbutilazin, terbutrin, trietazin; clorobromuron, clorotoluron, cloroxuron, dimefuron, diuron, fluometuron, isoproturon, isouron, linuron, metamitron, metabenztiazuron, metobenzuron, metoxuron, monolinuron, neburon, siduron, tebutiuron, tiadiazuron, desmedifam, carbutilat, fenmedifam, fenmedifam- etil, bromofenoxim, bromoxinil e sais e esteres do mesmo, ioxinil e sais e esteres do mesmo, bromacil, lenacil, terbacil, bentazon, bentazon- sódio, piridato, piridafol, pentanoclor, propanil; diquat, diquat- dibromida, paraquat, paraquat- dicloreto, paraquat- dimetilsulfato; M.4 Inibidores da protoporfirinogênio- IX oxidase: acifluorfen, acifluorfen- sódio, azafenidin, bencarbazona, benzfendizona, bifenox, butafenacil, carfentrazona, carfentrazona- etil, clormetoxifen, cinidon- etil, fluazolato, flufenpir, flufenpir- etil, flumiclorac, flumiclorac- pentil, flumioxazin, fluoroglicofen, fluoroglicofen- etil, flutiacet, flutiacet- metil, fomesafen, halosafen, lactofen, oxadiargil, oxadiazon, oxifluorfen, pentoxazona, profluazol, piraclonil, piraflufen, piraflufen- etil, saflufenacil, sulfentrazona, tidiazimin, tiafenacil, trifludimoxazin, etil [3- [2- cloro- 4- fluoro- 5- (1- metil- 6- trifluorometil- 2,4- dioxo- 1,2,3,4- tetrahidropirimidin- 3- il) fenoxi] - 2- piridiloxi] acetato (CAS 353292- 316), N- etil- 3- (2,6- dicloro- 4- trifluoro- metilfenoxi) - 5- metil- 1H- pirazol- 1- carboxamida (CAS 452098- 92- 9), N tetrahidrofurfuril- 3- (2,6- dicloro- 4- trifluorometilfenoxi) - 5- metil- 1H- pirazol- 1- carboxamida (CAS 915396- 43- 9), N- etil- 3- (2- cloro- 6- fluoro- 4- trifluorometilfenoxi) - 5- metil- 1H- pirazol- 1- carboxamida (CAS 452099- 05- 7), N- tetrahidrofurfuril- 3- (2- cloro- 6- fluoro- 4- trifluorometilfenoxi) - 5- metil- 1H- pirazol- 1- carboxamida (CAS 452100- 03- 7), 3- [7- fluoro- 3- oxo- 4- (prop- 2- inil) - 3,4- dihidro- 2H- benzo [1,4] oxazin- 6- il] - 1,5- dimetil- 6- tioxo- [1,3,5] triazinan- 2,4- diona (CAS 451484- 50- 7), 2- (2,2,7- trifluoro- 3- oxo- 4- prop- 2- inil- 3,4- dihidro- 2H- benzo [1,4] oxazin- 6- il) - 4,5,6,7- tetrahidro- isoindol- 1,3- diona (CAS 1300118- 96- 0), 1- metil- 6- trifluorometil- 3- (2,2,7- tri- fluoro- 3- oxo- 4- prop- 2- inil- 3,4- dihidro- 2H- benzo [1,4] oxazin- 6- il) - 1H- pirimidina- 2,4- diona (CAS 1304113- 05- 0), metil (E) - 4- [2- cloro- 5- [4- cloro- 5- (difluorometoxi) - 1H- metil- pirazol- 3- il] - 4- fluoro- fenoxi] - 3- metoxi- but- 2- enoato (CAS 948893- 00- 3), 3- [7- cloro- 5- fluoro- 2- (trifluorometil) - 1H- benzimidazol- 4- il] - 1- metil- 6- (trifluorometil) - 1H- pirimidina- 2,4- diona (CAS 212754- 02- 4); M.5 Herbicidas branqueadores: beflubutamid, diflufenican, fluridona, flurocloridona, flurtamona, norflurazon, picolinafen, 4- (3- trifluorometilfenoxi) - 2- (4- trifluorometilfenil) pirimidina (CAS 180608- 33- 7); benzobiciclon, benzofenap, biciclopirona, clomazona, fenquintriona, isoxaflutole, mesotriona, pirasulfotole, pirazolinato, pirazoxifen, sulcotriona, tefuriltriona, tembotriona, tolpiralato, topramezona; aclonifen, amitrole, flumeturon; M.6 Inibidores da EPSP sintase: glifosato, glifosato- isopropilamônio, glifosato- potássio, glifosato- trimesio (sulfosato); M.7 Inibidores da glutamina sintase: bilanafos (bialafos), bilanafos- sódio, glufosinato, glufosinato- P, glufosinato- amônio; M.8 Inibidores da DHP sintase: asulam; M.9 Inibidores da mitose: benfluralin, butralin, dinitramina, etalfluralin, flucloralin, orizalin, pendimetalin, prodiamina, trifluralin; amiprofos, amiprofos- metil, butamifos; clortal, clortal- dimetil, ditiopir, tiazopir, propizamida, tebutam; carbetamida, clorprofam, flamprop, flamprop- isopropil, flamprop- metil, flamprop- M- isopropil, flamprop- M- metil, profam; M.10 Inibidores de VLCFA: acetoclor, alaclor, butaclor, dimetaclor, dimetenamid, dimetenamid- P, metazaclor, metolaclor, metolaclor- S, petoxamid, pretilaclor, propaclor, propisoclor, tenilclor, flufenacet, mefenacet, difenamid, naproanilida, napropamida, napropamida- M, fentrazamida, anilofos, cafenstrole, fenoxasulfona, ipfencarbazona, piperofos, piroxasulfona, compostos isoxazolina de fórmula II.1, II.2, II.3, II.4, II.5, II.6, II.7,
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M.11 Inibidores da biossíntese de celulose: clortiamid, diclobenil, flupoxam, indaziflam, isoxaben, triaziflam, 1- ciclohexil- 5- pentafluorfeniloxi- 14-[1,2,4,6] tiatriazin- 3- ilamina (CAS 175899- 01- 1); M.12 Herbicidas desacopladores: dinoseb, dinoterb, DNOC e sais do mesmo; M.13 Herbicidas auxínicos: 2,4- D e sais e esteres do mesmo, clacifos, 2,4- DB e sais e esteres do mesmo, aminociclopiraclor e sais e esteres do mesmo, aminopiralid e sais do mesmo, tais como aminopiralid- dimetilamônio, aminopiralid- tris (2- hidroxipropil) amônio e esteres do mesmo, benazolin, benazolin- etil, cloramben e sais e esteres do mesmo, clomeprop, clopiralid e sais e esteres do mesmo, dicamba e sais e esteres do mesmo, diclorprop e sais e esteres do mesmo, diclorprop- P e sais e esteres do mesmo, fluroxipir, fluroxipir- butometil, fluroxipir- meptil, halauxifen e sais e esteres do mesmo (CAS 943832- 60- 8); MCPA e sais e esteres do mesmo, MCPA- tioetil, MCPB e sais e esteres do mesmo, mecoprop e sais e esteres do mesmo, mecoprop- P e sais e esteres do mesmo, picloram e sais e esteres do mesmo, quinclorac, quinmerac, TBA (2,3,6) e sais e esteres do mesmo, triclopir e sais e esteres do mesmo, ácido 4- amino- 3- cloro- 6- (4- cloro- 2- fluoro- 3- metoxifenil) - 5- fluoropiridina- 2- carboxilico, benzil 4- amino- 3- cloro- 6- (4- cloro- 2- fluoro- 3- metoxifenil) - 5- fluoropiridina- 2- carboxilato (CAS 1390661- 72- 9); M.14 Inibidores do transporte de auxina: diflufenzopir, diflufenzopir- sódio, naptalam e naptalam- sódio; M.15 Outros herbicidas: bromobutide, clorflurenol, clorflurenol- metil, cinmetilin, cumiluron, ciclopirimorato (CAS 499223- 49- 3) e sais e esteres do mesmo, dalapon, dazomet, difenzoquat, difenzoquat- metilsulfato, dimetipin, DSMA, dimron, endotal e sais do mesmo, etobenzanid, flurenol, flurenol- butil, flurprimidol, fosamina, fosamina- amônio, indenofan, hidrazida maleica, mefluidida, metam, metiozolin (CAS 403640- 27- 7), metil azida, metil bromida, metil- dimron, metil iodida, MSMA, ácido oleico, oxaziclomefona, ácido pelargonico, piributicarb, quinoclamina, tridifano; N) Inseticidas das classes N.1 a N.29 N.1 Inibidores da acetilcolinesterase (ACE): aldicarb, alanicarb, bendiocarb, benfuracarb, butocarboxim, butoxicarboxim, carbaril, carbofuran, carbosulfan, etiofencarb, fenobucarb, formetanato, furatiocarb, isoprocarb, metiocarb, metomil, metolcarb, oxamil, pirimicarb, propoxur, tiodicarb, tiofanox, trimetacarb, XMC, xililcarb e triazamato; acefato, azametifos, azinfos- etil, azinfosmetil, cadusafos, cloretoxifos, clorfenvinfos, clormefos, clorpirifos, clorpirifos- metil, coumafos, cianofos, demeton- S- metil, diazinon, diclorvos/ DDVP, dicrotofos, dimetoato, dimetilvinfos, disulfoton, EPN, etion, etoprofos, famfur, fenamifos, fenitrotion, fention, fostiazato, heptenofos, imiciafos, isofenfos, isopropil O- (metoxiaminotio- fosforil) salicilato, isoxation, malation, mecarbam, metamidofos, metidation, mevinfos, monocrotofos, naled, ometoato, óxidometon- metil, paration, paration- metil, fentoato, forato, fosalona, fosmet, fosfamidon, foxim, pirimifos- metil, profenofos, propetamfos, protiofos, piraclofos, piridafention, quinalfos, sulfotep, tebupirimfos, temefos, terbufos, tetraclorvinfos, tiometon, triazofos, triclorfon, vamidotion; N.2 Antagonistas dos canais de cloreto controlados pelo GABA: endosulfan, clordane; etiprole, fipronil, flufiprole, pirafluprole, piriprole; N.3 Moduladores do canal de sódio: acrinatrin, alletrin, d- cis- trans alletrin, d- trans alletrin, bifentrin, bioalletrin, bioalletrin S- cilclopentenil, bioresmetrin, cicloprotrin, ciflutrin, beta- ciflutrin, cihalotrin, lambda- cihalotrin, gamma- cihalotrin, cipermetrin, alfa- cipermetrin, beta- cipermetrin, teta- cipermetrin, zeta- cipermetrin, cifenotrin, deltametrin, empentrin, esfenvalerato, etofenprox, fenpropatrin, fenvalerato, flucitrinato, flumetrin, tau- fluvalinato, halfenprox, heptaflutrin, imiprotrin, meperflutrin, metoflutrin, momfluorotrin, permetrin, fenotrin, pralletrin, proflutrin, piretrin (piretrum), resmetrin, silafluofen, teflutrin, tetrametilflutrin, tetrametrin, tralometrin e transflutrin; DDT, metoxiclor; N.4 Agonistas do receptor acetilcolina nicotínico (naCR) acetamiprid, clotianidin, cicloxaprid, dinotefuran, imidacloprid, nitenpiram, tiacloprid, tiametoxam; (2E-) - 1- [(6- cloropiridin- 3- il) metil] - N'- nitro- 2- pentilidenohidrazinacarboximidamida; 1- [(6- cloropiridin- 3- il) metil] - 7- metil- 8- nitro- 5- propoxi- 1,2,3,5,6,7- hexahidroimidazo [1,2- a] piridina; nicotina; N.5 Ativadores alostéricos do receptor acetilcolina nicotínico: espinosad, espinetoram; N.6 Ativadores de canal de cloreto: abamectin, emamectin benzoato, ivermectin, lepimectin, milbemectin; N.7 Mimetizadores do hormônio juvenil: hidroprene, cinoprene, metoprene; fenoxicarb, piriproxifen; N.8 Inibidores não específicos diversos (multi- sítio): metil bromida e outros alcil halidas; cloropicrin, sulfuril fluoride, borax, tartar emetic; N.9 Bloqueadores seletivos de alimentação de homopteros: pimetrozina, flonicamid; N.10 Inibidores do crescimento de ácaros: clofentezina, hexitiazox, diflovidazin; etoxazol; N.11 Disruptores microbianos das membranas do intestino de inseto: Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaericus e as proteínas insecticidas que produzem: Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bacillus sphaericus, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. te- nebrionis, as proteínas da cultura Bt: Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fa, Cry2Ab, mCry3A, Cry3Ab, Cry3Bb, Cry34/35Ab1; N.12 Inibidores da ATP sintase mitocondrial: diafentiuron; azociclotin, cihexatin, fenbutatin óxido, propargita, tetradifon; N.13 Desacopladores da fosforilação oxidativa através da ruptura do gradiente de prótons: clorfenapir, DNOC, sulfluramid; N.14 Bloqueadores dos canais do receptor acetilcolina nicotínico (naCR): bensultap, cartap hidrocloreto, tiociclam, tiosultap sódio; N.15 Inibidores da biossíntese de quitina tipo 0: bistrifluron, clorfluazuron, diflubenzuron, flucicloxuron, flufenoxuron, hexaflumuron, lufenuron, novaluron, noviflumuron, teflubenzuron, triflumuron; N.16 Inibidores da biossíntese de quitina tipo 1: buprofezin; N.17 Disruptores de muda: ciromazina; N.18 Agonistas do receptor de ecdison: metoxifenozida, tebufenozida, halofenozida, fufenozida, cromafenozida; N.19 Agonistas dos receptores da octopamina: amitraz; N.20 Inibidores do transporte de elétrons do complexo mitocondrial III: hidrametilnona, acequinocil, fluacripirim; N.21 Inibidores do transporte de elétrons do complexo mitocondrial I: fenazaquin, fenpiroximato, pirimidifen, piridaben, tebufenpirad, tolfenpirad; rotenona; N.22 Bloqueadores dos canais de sódio dependentes de tensão: indoxacarb, metaflumizona, 2- [2- (4- cianofenil) - 1- [3- (trifluorometil) fenil] etilideno] - N- [4- (difluorometoxi) fenil] - hidrazinacarboxamida, N- (3- cloro- 2- metilfenil) - 2- [(4- clorofenil) - [4- [metil (metilsulfonil) amino] fenil] metileno] - hidrazinacarboxamida; N.23 Inibidores da acetil- CoA carboxilase: espirodiclofen, espiromesifen, espirotetramat; N.24 Inibidores do transporte de elétrons do complexo mitocondrial IV: alumínio fosfida, cálcio fosfida, fosfina, zinc fosfida, cianida; N.25 Inibidores do transporte de elétrons do complexo mitocondrial II: cienopirafen, ciflumetofen; N.28 Moduladores do receptor da rianodina: flubendiamida, clorantraniliprole, ciantraniliprole, ciclaniliprole, tetraniliprole; (R) - 3- cloro- N1- {2- metil- 4- [1,2,2,2 - tetrafluoro- 1- (trifluorometil) etil] fenil} - N2- (1- metil- 2- metilsulfoniletil) ftalamida, (S) - 3- cloro- N1- {2- metil- 4- [1,2,2,2 - tetrafluoro- 1- (trifluorometil) etil] fenil} - N2- (1- metil- 2- metilsulfoniletil) ftalamida, metil- 2- [3,5- dibromo- 2- ( { [3- bromo- 1- (3- cloropiridin- 2- il) - 1H- pirazol- 5- il] carbonil} amino) benzoil] - 1,2- dimetilhidrazinacarboxilato; N- [4,6- dicloro- 2- [(dietil- lambda- 4- sulfanilideno) carbamoil] - fenil] - 2- (3- cloro- 2- piridil) - 5- (trifluorometil) pirazol- 3- carboxamida; N- [4- cloro- 2- [(dietil- lambda- 4- sulfanilideno) carbamoil] - 6- metil- fenil] - 2- (3- cloro- 2- piridil) - 5- (trifluorometil) pirazol- 3- carboxamida; N- [4- cloro- 2- [(di- 2- propil- lambda- 4- sulfanilideno) carbamoil] - 6- metil- fenil] - 2- (3- cloro- 2- piridil) - 5- (trifluorometil) pirazol- 3- carboxamida; N- [4,6- dicloro- 2- [(di- 2- propil- lambda- 4- sulfanilideno) carbamoil] - fenil] - 2- (3- cloro- 2- piridil) - 5- (trifluorometil) pirazol- 3- carboxamida; N- [4,6- dibromo- 2- [(dietil- lambda- 4- sulfanilideno) carbamoil] - fenil] - 2- (3- cloro- 2- piridil) - 5- (trifluorometil) pirazol- 3- carboxamida; N- [2- (5- amino- 1,3,4- tiadiazol- 2- il) - 4- cloro- 6- metilfenil] - 3- bromo- 1- (3- cloro- 2- piridinil) - 1H- pirazol- 5- carboxamida; 3- cloro- 1- (3- cloro- 2- piridinil) - N- [2,4- dicloro- 6- [[(1- ciano- 1- metiletil) amino] carbonil] fenil] - 1H- pirazol- 5- carboxamida; 3- bromo- N- [2,4- dicloro- 6- (metilcarbamoil) fenil] - 1- (3,5- dicloro- 2- piridil) - 1H- pirazol- 5- carboxamida; N- [4- cloro- 2- [[(1,1- dimetiletil) amino] carbonil] - 6- metilfenil] - 1- (3- cloro- 2- piridinil) - 3- (fluorometoxi) - 1H- pirazol- 5- carboxamida; cihalodiamida; N.29. Compostos ativos inseticidas de modo de ação desconhecido ou incerto: afidopiropen, afoxolaner, azadiractin, amidoflumet, benzoximato, bifenazato, broflanilida, bromopropilato, cinometionat, criolite, dicloromezotiaz, dicofol, flufenerim, flometoquin, fluensulfona, fluhexafon, fluopiram, flupiradifurona, fluralaner, metoxadiazona, piperonil butóxido, piflubumida, piridalil, pirifluquinazon, sulfoxaflor, tioxazafen, triflumezopirim, 11- (4- cloro- 2,6- dimetilfenil) - 12- hidroxi- 1,4- dioxa- 9- azadispiro [4.2.4.2] - tetradec- 11- en- 10- ona, 3- (4’- fluoro- 2,4- dimetilbifenil- 3- il) - 4- hidroxi- 8- oxa- 1- azaspiro [4.5] dec- 3- en- 2- ona, 1- [2- fluoro- 4- metil- 5- [(2,2,2- trifluoroetil) sulfinil] fenil] - 3- (trifluorometil) - 1H- 1,2,4- triazol- 5- amina, Bacillus firmus; (E/Z) - N- [1- [(6- cloro- 3- piridil) metil] - 2- piridilideno] - 2,2,2- trifluoro- acetamida; (E/Z) - N- [1[(6- cloro- 5- fluoro- 3- piridil) metil] - 2- piridilideno] - 2,2,2- trifluoro- acetamida; (E/Z) - 2,2,2- trifluoro- N- [1- [(6- fluoro- 3- piridil) metil] - 2- piridilideno] acetamida; (E/Z) - N- [1- [(6- bromo- 3- piridil) metil] - 2- piridilideno] - 2,2,2- trifluoro- acetamida; (E/Z) - N- [1- [1- (6- cloro- 3- piridil) etil] - 2- piridilideno] - 2,2,2- trifluoro- acetamida; (E/Z) - N- [1- [(6- cloro- 3- piridil) metil] - 2- piridilideno] - 2,2- difluoro- acetamida; (E/Z) - 2- cloro- N- [1- [(6- cloro- 3- piridil) metil] - 2- piridilideno] - 2,2- difluoro- acetamida; (E/Z) - N- [1- [(2- cloropirimidin- 5- il) metil] - 2- piridilideno] - 2,2,2- trifluoro- acetamida; (E/Z) - N- [1- [(6- cloro- 3- piridil) metil] - 2- piridilideno] - 2,2,3,3,3- pentafluoro- propanamida.); N- [1- [(6- cloro- 3- piridil) metil] - 2- piridilideno] - 2,2,2- trifluoro- tioacetamida; N- [1- [(6- cloro- 3- piridil) metil] - 2- piridilideno] - 2,2,2- trifluoro- N'- isopropil- acetamidina; fluazaindolizina; 4- [5- (3,5- diclorofenil) - 5- (trifluorometil) - 4H- isoxazol- 3- il] - 2- metil- N- (1- oxotietan- 3- il) benzamida; fluxametamida; 5- [3- [2,6- dicloro- 4(3,3- dicloroalliloxi) fenoxi] propoxi] - 1H- pirazol; 3- (benzoilmetilamino) - N- [2- bromo- 4- [1,2,2,3,3,3- hexafluoro- 1- (trifluorometil) propil] - 6- (trifluorometil) fenil] - 2- fluoro- benzamida; 3- (benzoilmetilamino) - 2- fluoro- N- [2- iodo- 4[1,2,2,2- tetrafluoro- 1- (trifluorometil) etil] - 6- (trifluorometil) fenil] - benzamida; N- [3- [[ [2- iodo- 4- [1,2,2,2- tetrafluoro- 1- (trifluorometil) etil] - 6- (trifluorometil) fenil] amino] carbonil] fenil] - N- metil- benzamida; N- [3- [[ [2- bromo- 4- [1,2,2,2- tetrafluoro- 1- (trifluorometil) etil] - 6- (trifluorometil) fenil] amino] carbonil] - 2- fluorofenil] - 4- fluoro- N- metil- benzamida; 4- fluoro- N- [2- fluoro- 3- [[ [2- iodo- 4- [1,2,2,2- tetrafluoro- 1- (trifluorometil) etil] - 6- (trifluorometil) fenil] amino] carbonil] fenil] - N- metil- benzamida; 3- fluoro- N- [2- fluoro- 3- [[ [2- iodo- 4[1,2,2,2- tetrafluoro- 1- (trifluorometil) etil] - 6 (trifluorometil) fenil] amino] carbonil] fenil] - N- metil- benzamida; 2- cloro- N- [3- [[ [2- iodo- 4- [1,2,2,2- tetrafluoro- 1- (trifluorometil) etil] - 6- (trifluorometil) fenil] amino] carbonil] fenil] - 3- piridinacarboxamida; 4- ciano- N- [2- ciano- 5- [[2,6- dibromo- 4- [1,2,2,3,3,3- hexafluoro- 1- (trifluorometil) propil] fenil] carbamoil] fenil] - 2- metil- benzamida; 4- ciano- 3- [(4- ciano- 2- metil- benzoil) amino] - N- [2,6- dicloro- 4- [1,2,2,3,3,3- hexafluoro- 1- (trifluorometil) propil] fenil] - 2- fluoro- benzamida; N- [5- [[2- cloro- 6- ciano- 4- [1,2,2,3,3,3- hexafluoro- 1- (trifluorometil) propil] fenil] carbamoil] - 2- ciano- fenil] - 4- ciano- 2- metil- benzamida; N- [5- [[2- bromo- 6- cloro- 4- [2,2,2- trifluoro- 1- hidroxi- 1- (trifluorometil) etil] fenil] carbamoil] - 2- ciano- fenil] - 4- ciano- 2- metil- benzamida; N- [5- [[2- bromo- 6- cloro- 4- [1,2,2,3,3,3- hexafluoro- 1- (trifluorometil) propil] fenil] carbamoil] - 2- ciano- fenil] - 4- ciano- 2- metil- benzamida; 4- ciano- N- [2- ciano- 5- [[2,6- dicloro- 4- [1,2,2,3,3,3- hexafluoro- 1- (trifluorometil) propil] fenil] carbamoil] fenil] - 2- metil- benzamida; 4- ciano- N- [2- ciano- 5- [[2,6- dicloro- 4- [1,2,2,2- tetrafluoro- 1- (trifluorometil) etil] fenil] carbamoil] fenil] - 2- metil- benzamida; N- [5- [[2- bromo- 6- cloro- 4- [1,2,2,2- tetrafluoro- 1- (trifluorometil) etil] fenil] carbamoil] - 2- ciano- fenil] - 4- ciano- 2- metil- benzamida; 2- (1,3- dioxan- 2- il) - 6- [2- (3- piridinil) - 5- tiazolil] - piridina; 2- [6- [2- (5- fluoro- 3- piridinil) - 5- tiazolil] - 2- piridinil] - pirimidina; 2- [6- [2- (3- piridinil) - 5- tiazolil] - 2- piridinil] - pirimidina; N- metilsulfonil- 6- [2- (3- piridil) tiazol- 5- il] piridina- 2- carboxamida; N- metilsulfonil- 6- [2- (3- piridil) tiazol- 5- il] piridina- 2- carboxamida; N- etil- N- [4- metil- 2- (3- piridil) tiazol- 5- il] - 3- metiltio- propanamida; N- metil- N- [4- metil- 2- (3- piridil) tiazol- 5- il] - 3- metiltio- propanamida; N,2- dimetil- N- [4- metil- 2- (3- piridil) tiazol- 5- il] - 3- metiltio- propanamida; N- etil- 2- metil- N- [4- metil- 2- (3- piridil) tiazol- 5- il] - 3- metiltio- propanamida; N- [4- cloro- 2- (3- piridil) tiazol- 5- il] - N- etil- 2- metil- 3- metiltio- propanamida; N- [4- cloro- 2- (3- piridil) tiazol- 5- il] - N,2- dimetil- 3- metiltio- propanamida; N- [4- cloro- 2- (3- piridil) tiazol- 5- il] - N- metil- 3- metiltio- propanamida; N- [4- cloro- 2- (3- piridil) tiazol- 5- il] - N- etil- 3- metiltio- propanamida; 1- [(6- cloro- 3- piridinil) metil] - 1,2,3,5,6,7- hexahidro- 5- metoxi- 7- metil- 8- nitro- imidazo [1,2- a] piridina; 1- [(6- cloropiridin- 3- il) metil] - 7- metil- 8- nitro- 1,2,3,5,6,7- hexahidroimidazo [1,2- a] piridin- 5- ol; 1- isopropil- N,5- dimetil- N- piridazin- 4- il- pirazol- 4- carboxamida; 1- (1,2- dimetilropil) - N- etil- 5- metil- N- piridazin- 4- il- pirazol- 4- carboxamida; N,5- dimetil- N- piridazin- 4- il- 1- (2,2,2- trifluoro- 1- metil- etil) pirazol- 4- carboxamida; 1- [1- (1- cianociclopropil) etil] - N- etil- 5- metil- N- piridazin- 4- il- pirazol- 4- carboxamida; N- etil- 1- (2- fluoro- 1- metil- propil) - 5- metil- N- piridazin- 4- il- pirazol- 4- carboxamida; 1- (1,2- dimetilpropil) - N,5- dimetil- N- piridazin- 4- il- pirazol- 4- carboxamida; 1- [1- (1- cianociclopropil) etil] - N,5- dimetil- N- piridazin- 4- il- pirazol- 4- carboxamida; N- metil- 1- (2- fluoro- 1- metil- propil] - 5- metil- N- piridazin- 4- il- pirazol- 4- carboxamida; 1- (4,4- difluorociclohexil) - N- etil- 5- metil- N- piridazin- 4- il- pirazol- 4- carboxamida; 1- (4,4- difluorociclohexil) - N,5- dimetil- N- piridazin- 4- il- pirazol- 4- carboxamida, N- (1- metiletil) - 2- (3- piridinil) - 2H- indazol- 4- carboxamida; N- ciclopropil- 2- (3- piridinil) - 2H- indazol- 4- carboxamida; N- ciclohexil- 2- (3- piridinil) - 2H- indazol- 4- carboxamida; 2- (3- piridinil) - N- (2,2,2- trifluoroetil) - 2H- indazol- 4- carboxamida; 2- (3- piridinil) - N- [(tetrahidro- 2- furanil) metil] - 2H- indazol- 5- carboxamida; metil 2- [[2- (3- piridinil) - 2H- indazol- 5- il] carbonil] hidrazinacarboxilato; N- [(2,2- difluorociclopropil) metil] - 2- (3- piridinil) - 2H- indazol- 5- carboxamida; N- (2,2- difluoropropil) - 2- (3- piridinil) - 2H- indazol- 5- carboxamida; 2- (3- piridinil) - N- (2- pirimidinilmetil) - 2H- indazol- 5- carboxamida; N- [(5- metil- 2- pirazinil) metil] - 2- (3- piridinil) - 2H- indazol- 5- carboxamida, N- [3- cloro- 1- (3- piridil) pirazol- 4- il] - N- etil- 3- (3,3,3- trifluoropropilsulfanil) propanamida; N- [3- cloro- 1- (3- piridil) pirazol- 4- il] - N- etil- 3- (3,3,3- trifluoropropilsulfinil) propanamida; N- [3- cloro- 1- (3- piridil) pirazol- 4- il] - 3- [(2,2- difluorociclopropil) metilsulfanil] - N- etil- propanamida; N- [3- cloro- 1- (3- piridil) pirazol- 4- il] - 3- [(2,2- difluorociclopropil) metilsulfinil] - N- etil- propanamida; sarolaner, lotilaner. As substâncias ativas referidas como componente 2), a sua preparação e a sua atividade pesticida são conhecidas (cf.: http://www.alanwood.net/pesticides/); estas substâncias estão comercialmente disponíveis. Os compostos descritos pela nomenclatura IUPAC, a sua preparação e a sua atividade pesticida são também conhecidos (por exemplo, Can. J. Plant Sci. 48(6), 587-94, 1968; EP-A 141 317; EP-A 152 031; EP-A 226 917; EP-A 243 970; EP-A 256 503; EP-A 428 941; EP-A 532 022; EP-A 1 028 125; EP-A 1 035 122; EP-A 1 201 648; EP-A 1 122 244, JP 2002316902; DE 19650197; DE 10021412; DE 102005009458; US 3,296,272; US 3,325,503; WO 98/46608; WO 99/14187; WO 99/24413; WO 99/27783; WO 00/29404; WO 00/46148; WO 00/65913; WO 01/54501; WO 01/56358; WO 02/22583; WO 02/40431; WO 03/10149; WO 03/11853; WO 03/14103; WO 03/16286; WO 03/53145; WO 03/61388; WO 03/66609; WO 03/74491; WO 04/49804; WO 04/83193; WO 05/120234; WO 05/123689; WO 05/123690; WO 05/63721; WO 05/87772; WO 05/87773; WO 06/15866; WO 06/87325; WO 06/87343; WO 07/82098; WO 07/90624, WO 10/139271, WO 11/028657, WO 2012/168188, WO 2007/006670, WO 2011/77514; WO 13/047749, WO 10/069882, WO 13/047441, WO 03/16303, WO 09/90181, WO 13/007767, WO 13/010862, WO 13/127704, WO 13/024009, WO 13/024010 and WO 13/047441, WO 13/162072, WO 13/092224, WO 11/135833, CN 1907024, CN 1456054).
[046] É preferível que as misturas compreendam como pesticidas II compostos fungicidas que são, independentes uns dos outros, selecionados a partir dos grupos A), B), C), D), E), F), G), H), I), J) e K); De acordo com outra forma de realização da invenção, as misturas compreendem como pesticida II um composto regulador do crescimento de plantas que é selecionado a partir do grupo L); De acordo com outra forma de realização da invenção, as misturas compreendem, como pesticida II, um composto herbicida que é selecionado a partir do grupo M); De acordo com uma outra forma de realização, as misturas compreendem como pesticida II um composto inseticida que é selecionado a partir do grupo N); Também é dada preferência a misturas que compreendem como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir de inibidores do complexo III no sítio Qo no grupo A), mais preferencialmente selecionado dentre os compostos (A.1.1), (A.1.4), (A.1.8), (A.1.9), (A.1.10), (A.1.12), (A.1.13), (A.1.14), (A.1.17), (A.1.21), (A.1.24), (A.1.25), (A.1.26), (A.1.27), (A.1.28), (A.1.29), (A.1.30), (A.1.31), (A.1.32), (A.1.33), (A.1.34) and (A.1.35); particularly selected from (A.1.1), (A.1.4), (A.1.8), (A.1.9), (A.1.13), (A.1.14), (A.1.17), (A.1.24), (A.1.25), (A.1.26), (A.1.27), (A.1.28), (A.1.29), (A.1.30), (A.1.31), (A.1.32), (A.1.33), (A.1.34) e (A.1.35); Também é dada preferência a misturas que compreendem como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir de inibidores do complexo III no sítio Qi no grupo A), mais preferencialmente selecionado dentre os compostos (A.2.1), (A.2.3), (A.2.4) e (A.2.5); particularmente selecionados a partir de (A.2.3), (A.2.4) e (A.2.5); Também é dada preferência a misturas que compreendem como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir de inibidores do complexo II no grupo A), mais preferencialmente selecionado a partir de compostos (A.3.2), (A.3.3), (A.3.4), (A.3.7), (A.3.9), (A.3.11), (A.3.12), (A.3.14), (A.3.16), (A.3.19), (A.3.20), (A.3.21), (A.3.22), (A.3.23), (A.3.24), (A.3.25), (A.3.27) e (A.3.28); particularmente selecionados a partir de (A.3.2), (A.3.3), (A.3.4), (A.3.7), (A.3.9), (A.3.12), (A.3.14), (A.3.17), (A.3.19), (A.3.22), (A.3.23), (A.3.24), (A.3.25), (A.3.27), (A.3.28) e (A.3.29); Também é dada preferência a misturas compreendendo como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir de outros inibidores de respiração no grupo A), mais preferencialmente selecionado a partir dos compostos (A.4.4) e (A.4.11); em particular (A.4.11); Também é dada preferência a misturas compreendendo como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir de inibidores de desmetilase C14 no grupo B), mais preferencialmente selecionado a partir de compostos (B.1.4), (B.1.5), (B.1.8), (B.1.10), (B.1.11), (B.1.12), (B.1.13), (B.1.(17) (B.1.18), (B.1.21), (B.1.22), (B.1.23), (B.1.25), (B.1.26), (B.1.29), (B.1.(31) (B.1.32), (B.1.33), (B.1.34), (B.1.35), (B.1.36), (B.1.37), (B.1.38), (B.1.(39) (B.1.40), (B.1.41), (B.1.42), (B.1.43) e (B.1.46); selecionado particularmente de (B.1.5), (B.1.8), (B.1.10), (B.1.17), (B.1.23), (B.1.25), (B.1.31), (B.1.32), (B.1.33), (B.1.34), (B.1.35), (B.1.36), (B.1.37), (B.138), (B.1.39), (B.1.(40) (B.1.41), (B.1.42), (B.1.43) e (B.1.46); Também é dada preferência a misturas compreendendo como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir de inibidores da Delta 14-reductase no grupo B), mais preferencialmente selecionado a partir de compostos (B.2.4), (B.2.5), (B.2.6) e (B.2.8); em particular (B.2.4); Também é dada preferência a misturas que compreendem como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir de fenilamidas e fungicidas de aminoácidos de acila no grupo C), mais preferencialmente selecionados a partir de compostos (C.1.1), (C.1.2), (C .1.4) e (C.1.5); particularmente selecionados a partir de (C.1.1) e (C.1.4); Também é dada preferência a misturas compreendendo como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir de outros inibidores da síntese de ácidos nucleicos no grupo C), mais preferencialmente selecionados a partir de compostos (C.2.6) e (C.2.7); Também é dada preferência a misturas compreendendo como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir do grupo D), mais preferencialmente selecionado a partir de compostos (D.1.1), (D.1.2), (D.1.5), (D. 2.4) e (D.2.6); particularmente selecionados a partir de (D.1.2), (D.1.5) e (D.2.6); Também é dada preferência a misturas compreendendo como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir do grupo E), mais preferencialmente selecionado a partir de compostos (E.1.1), (E.1.3), (E.2.2) e (E. 2,3); em particular (E.1.3); Também é dada preferência a misturas que compreendem como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir do grupo F), mais preferencialmente selecionado a partir de compostos (F.1.2), (F.1.4) e (F.1.5); Também é dada preferência a misturas que compreendem como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir do grupo G), mais preferencialmente selecionado a partir de compostos (G.3.1), (G.3.3), (G.3.6), (G. 5.1), (G.5.2) e (G.5.3); particularmente selecionados a partir de (G.3.1), (G.5.1), (G.5.2) e (G.5.3); Também é dada preferência a misturas compreendendo como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir do grupo H), mais preferencialmente selecionado a partir de compostos (H.2.2), (H.2.3), (H.2.5), (H. 2,7), (H.2.8), (H.3.2), (H.3.4), (H.3.5), (H.4.9) e (H.4.10); particularmente selecionados a partir de (H.2.2), (H.2.5), (H.3.2), (H.4.9) e (H.4.10); Também é dada preferência a misturas que compreendem como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir do grupo I), mais preferencialmente selecionado a partir de compostos (I.2.2) e (I.2.5); Também é dada preferência a misturas compreendendo como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir do grupo J), mais preferencialmente selecionado a partir de compostos (J.1.2), (J.1.5) e (J.1.8); em particular (J.1.5).
[047] Também é dada preferência a misturas compreendendo como componente 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir do grupo K), mais preferencialmente selecionado a partir de compostos (K.1.41), (K.1.42), (K.1.44), (K. 1,45), (K.1.46), (K.1.47), (K.1.48) e (K.1.49); particularmente selecionados a partir de (K.1.41), (K.1.44), (K.1.45), (K.1.46), (K.1.47), (K.1.48) e (K.1.49).
[048] Uma outra forma de realização refere-se a misturas compreendendo como componente 1) um caldo de cultura total, um meio de cultura ou um extrato livre de células ou uma fração ou pelo menos um metabólito de pelo menos um dos micro-organismos acima definidos que exibem preferencialmente atividade antagonista contra pelo menos um patógeno vegetal.
[049] Tal como aqui utilizado, “caldo de cultura total” refere-se a uma cultura líquida de um micro-organismo contendo células e / ou esporos vegetativos em suspensão no meio de cultura e, opcionalmente, metabólitos produzidos pelo respectivo micro-organismo.
[050] Como aqui utilizado, “meio de cultura”, refere-se a um meio obtenível cultivando a micro-organismo no referido meio, preferivelmente um caldo líquido, e permanecendo quando as células crescidas no meio são removidas, por exemplo, o sobrenadante permanescente quando as células crescidas em um caldo líquido são removidas por centrifugação, filtração, sedimentação ou outros meios bem conhecidos na técnica; compreendendo, por exemplo, metabólitos produzidos pelo respectivo micro-organismo e secretados para o meio de cultura. O “meio de cultura”, por vezes também referido como “sobrenadante” pode ser obtido por exemplo, por centrifugação a temperaturas de cerca de 2 a 30 °C (mais preferencialmente a temperaturas de 4 a 20 °C) durante cerca de 10 a 60 minutos (mais preferivelmente cerca de 15 a 30 min) a cerca de 5.000 a 20.000 x g (mais preferencialmente a cerca de 15.000 x g).
[051] Tal como aqui utilizado, “extrato livre de células” refere-se a um extrato das células vegetativas, esporos e / ou o caldo de cultura total de um micro-organismo compreendendo metabólitos celulares produzidos pelo respectivo micro-organismo pode ser obtido por métodos de ruptura celular conhecidas na arte, tais como solventes (por exemplo, solventes orgânicos, tais como álcoois, por vezes em combinação com sais adequados), aplicação de forças de cisalhamento à base de temperatura, ruptura de células com um ultra- sonicador. O extrato desejado pode ser concentrada através de técnicas de concentração convencionais, tais como secagem, evaporação, centrifugação ou similares. Certas etapas de lavagem utilizando solventes orgânicos e / ou meios à base de àgua também podem ser aplicados ao extrato em bruto preferencialmente antes da utilização.
[052] Tal como aqui utilizado, o termo “metabólito” refere-se a qualquer componente, composto, substância ou co-produto (incluindo mas não se limitando a pequenas moléculas de metabólito secundários, policetidos, produtos da sintase de ácidos graxos, peptídeos não ribossomais, peptídeos ribossomais, proteínas e enzimas) produzidos por um micro-organismo (tal como fungos e bactérias, em particular as linhagens da invenção) que tem qualquer efeito benéfico, tal como descrito aqui, tal como atividade pesticida ou de melhoramento de crescimento da planta, a eficiência do uso da água da planta, saúde da planta, aparência da planta, ou a população de micro-organismos benéficos no solo ao redor da atividade da planta, aqui.
[053] Como aqui utilizado, “isolado” refere-se a uma cultura microbiana pura separada da sua origem natural, tal isolado obtido por cultura de uma única colônia microbiana. Um isolado é uma cultura pura derivada de uma população heterogênea, selvagem de micro-organismos.
[054] Tal como aqui utilizado, “linhagem” refere-se a um isolado bacteriano ou um grupo de isolados que apresentaram características fenotípicas e / ou genotípicas pertencentes à mesma linhagem, distintas das dos outros isolados ou linhagens de uma mesma espécie.
[055] Como aqui utilizado, “um meio de cultura da mesma” refere- se a um meio de cultura da linhagem bacteriana como definido imediatamente antes do termo “meio de cultura da mesma”, como no seguinte caso: “linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015, e um meio de cultura da mesma” significa as linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 e o meio de cultura de cada uma das linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015. Da mesma forma, a mesma lógica se aplica a termos similares como “um extrato livre de células da mesma”, “caldo de cultura total do mesmo” e “metabólito da mesma” assim como combinações de termos tais como “um extrato livre de células ou pelo menos um dos metabólitos da mesma”.
[056] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem como componente 1) pelo menos uma linhagem de Paenibacillus tendo as seguintes características: - células em forma de bastonete de estrutura Gram-positiva, - reação fraca com a coloração Gram, muitas vezes até manchando negativamente, - diferenciação em endosporos elipsoidais que distintamente incham o esporângio (célula mãe), - crescimento anaeróbio facultativo com forte crescimento na ausência de ar, independentemente do nitrato estar presente ou não, - fermentação de uma variedade de açúcares, - formação de ácidos e gases a partir de vários açúcares, incluindo glicose, - sem produção de ácido a partir de adonitol e sorbitol, - negativo para Urease (com exceção de P. validus), - arginina di-hidrolase negativa, - sem utilização de citrato, - sem crescimento na presença de cloreto de sódio a 10%, - secreção de numerosas enzimas hidrolíticas extracelulares que degradam o DNA, proteína, amido; e / ou - teor G + C de DNA de 40% a 54%; ou um meio de cultura, um extrato livre de células ou pelo menos um metabólito dos mesmos.
[057] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem como componente 1) pelo menos uma linhagem de Paenibacillus selecionada a partir das espécies Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus epiphyticus, Paenibacillus peoriae, Paenibacillus terrae, Paenibacillus jamilae, Paenibacillus kribbensis; Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus barcinonensis, Paenibacillus tundra, Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus taichungensis, Paenibacillus glycanilyticus e Paenibacillus odorifer; ou um meio de cultura, um extrato livre de células ou pelo menos um metabólito dos mesmos.
[058] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem como componente 1) pelo menos uma linhagem de Paenibacillus selecionada a partir das espécies Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus epiphyticus, Paenibacillus peoriae, Paenibacillus terrae, Paenibacillus jamilae e Paenibacillus kribbensis; ou um meio de cultura, um extrato livre de células ou pelo menos um metabólito dos mesmos.
[059] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem, como componente 1), pelo menos, uma linhagem bacteriana selecionada a partir das espécies Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus epiphyticus, Paenibacillus peoriae e Paenibacillus jamilae, ou um meio de cultura, um extrato livre de células ou pelo menos um metabólito dos mesmos.
[060] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem como componente 1) pelo menos uma linhagem bacteriana selecionada a partir das espécies Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus epiphyticus e Paenibacillus peoriae, ou um meio de cultura, um extrato livre de células ou pelo menos um metabólito dos mesmos.
[061] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem como componente 1) pelo menos uma linhagem bacteriana selecionada a partir das espécies Paenibacillus polymyxa e Paenibacillus epiphyticus, ou um meio de cultura, um extrato livre de células ou pelo menos um metabólito dos mesmos.
[062] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem como componente 1) pelo menos uma linhagem de Paenibacillus selecionada a partir de 1) Lu16774 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26969, 2) Lu17007 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26970, e 3) Lu17015 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26971; ou um meio de cultura, um extrato livre de células ou pelo menos um metabólito dos mesmos.
[063] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem como componente 1) pelo menos uma linhagem de Paenibacillus selecionada a partir de 1) a linhagem de Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum Lu16774 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26969, 2) a linhagem de Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum Lu17007 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26970, e 3) a linhagem de Paenibacillus epiphyticus Lu17015 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26971; ou um meio de cultura, um extrato livre de células ou pelo menos um metabólito dos mesmos.
[064] Além das misturas que compreendem como componente 1) pelo menos uma das linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015, a invenção refere- se a misturas que compreendem como componente 1) qualquer linhagem de Paenibacillus, quer derivada fisicamente do depósito original de qualquer uma das linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 ou isolados independentemente, desde que retenham pelo menos uma das características de identificação das linhagens de Paenibacillus Lu16774, Lu17007 e Lu17015 depositadas. Tais linhagens de Paenibacillus da invenção incluem qualquer progênie de qualquer uma das linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015, incluindo mutantes das referidas linhagens.
[065] O termo “mutante” refere-se um micro-organismo obtido por seleção direta de mutante mas também inclui micro-organismos que foram ainda submetidos a mutagênese ou de outro modo manipulados (por exemplo, através da introdução de um plasmídeo). Por conseguinte, as formas de realização incluem mutantes, variantes e / or derivados do respectivo micro-organismo, ambos mutantes ocorrendo naturalmente e induzidos artificialmente. Por exemplo, os mutantes podem ser induzidos sujeitando o micro-organismo a mutagênios conhecidos, tais como raios-X, radiação UV ou N-metil- nitrosoguanidina, usando métodos convencionais. Subsequente aos referidos tratamentos uma triagem para as linhagens mutantes que mostram a característica desejada pode ser realizada.
[066] Linhagens mutantes podem ser obtidas por quaisquer métodos conhecidos na arte, tais como seleção direta de mutante, mutagênese química ou manipulação genética (por exemplo, através da introdução de um plasmídeo). Por exemplo, tais mutantes são obtidos por aplicação de um mutagênio conhecido, tal como raios X, radiação UV ou N-metil-nitrosoguanidina. Subsequente aos referidos tratamentos uma triagem para as linhagens mutantes que mostram a característica desejada pode ser realizada.
[067] Uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1) pelo menos uma linhagem bacteriana que compreende uma sequência de DNA exibindo pelo menos pelo menos 99,6%, preferencialmente pelo menos 99,8%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99,9%, e em particular 100,0% de identidade de sequência de nucleotídeo para qualquer uma das sequências de rDNA 16S das linhagens de Lu16774, Lu17007 e Lu17015, isto é, para qualquer uma destas sequências de nucleotídeos definidas na listagem de sequências sendo a SEQ ID nO: 1, SEQ ID nO: 2 e SEQ ID NO: 3.
[068] De acordo com uma outra forma de realização, uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1), pelo menos, uma linhagem bacteriana que compreende uma sequência de DNA que exibe 100% de identidade de sequência de nucleotídeos com qualquer uma das sequências de rDNA 16S das linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015, isto é, a qualquer uma dessas sequências nucleotídicas apresentadas na listagem de sequências sendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
[069] De acordo com uma outra forma de realização, uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1), pelo menos, uma linhagem bacteriana cuja sequência de DNAr 16S completa tem após alinhamento ótimo dentro da janela de sequência alinhada, pelo menos 99,6% de identidade com pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 99,8% de identidade com SEQ ID NO: 3; preferencialmente pelo menos 99,8% de identidade com pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 1, SEQ ID: 2 e SEQ ID NO: 3; mais preferivelmente pelo menos 99,9% de identidade com pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; ainda mais preferencialmente a 99,9% de identidade com pelo menos uma das sequências de SEQ ID NO: 1, SEQ ID: 2 e SEQ ID NO: 3; em particular, 100% de identidade com pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 1, SEQ ID: 2 e SEQ ID NO: 3.
[070] De acordo com uma outra forma de realização, uma mistura da invenção é em especial uma que compreende como componente 1), pelo menos, uma linhagem bacteriana selecionada a partir do grupo que consiste em: a) Lu16774 depositado na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26969; b) Lu17007 depositado na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26970; c) Lu17015 depositado na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26971; e d) uma linhagem que compreende uma sequência de DNA exibindo: d1) pelo menos 99,6% de identidade da sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 9; ou d2) pelo menos 99,8% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 14; ou d3) pelo menos 99,9% de identidade da sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 10; ou d4) pelo menos 99,2% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 15; ou d5) pelo menos 99,2% de identidade da sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 11; ou d6) pelo menos 99,8% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 16; ou d7) pelo menos 99,8% de identidade da sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 12; ou d8) pelo menos 99,3% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 17; ou d9) 100,0% de identidade da sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 13; ou d10) pelo menos 99,9% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 18.
[071] Uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1) pelo menos uma linhagem bacteriana que compreende uma sequência de DNA dnaN exibindo pelo menos 99,6% de identidade da sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 9 ou que compreende uma sequência de DNA que exibe pelo menos 99,8% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 14.
[072] De acordo com uma outra forma de realização, uma mistura da invenção é uma que compreende como componente 1), pelo menos, uma linhagem bacteriana cuja sequência de DNA dnaN completa tem depois do alinhamento ótimo dentro da janela de sequência alinhada, pelo menos 99,6% de identidade com pelo menos uma das sequências de DNA de SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 9 ou pelo menos 99,8% de identidade com SEQ ID NO: 14; preferivelmente pelo menos 99,9% de identidade com a SEQ ID NO: 14; em particular, 100% de identidade com a SEQ ID NO: 14.
[073] Uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1) pelo menos uma linhagem bacteriana que compreende uma sequência de DNA exibindo pelo menos 99,8%, em particular 100,0% de identidade da sequência de nucleotídeos com qualquer uma das sequências de DNA dnaN das linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015, isto é, a qualquer uma dessas sequências de DNA de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 14.
[074] Uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1) pelo menos uma linhagem bacteriana que compreende uma sequência de DNA gyrB exibindo pelo menos 99,9% de identidade da sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 10 ou que compreende uma sequência de DNA exibindo pelo menos 99,2% de identidade de sequência nucleotica com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 15.
[075] De acordo com uma outra forma de realização, uma mistura da invenção é uma que compreende como componente 1), pelo menos, uma linhagem bacteriana cuja sequência de DNA gyrB completa tem depois do alinhamento ótimo dentro da janela de sequência alinhada, pelo menos 99,9% de identidade com pelo menos uma das sequências de DNA de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 10ou pelo menos 99,9% de identidade com SEQ ID NO: 15; preferencialmente pelo menos 99,9% de identidade com a SEQ ID NO: 15; em particular, 100% de identidade com a SEQ ID NO: 15.
[076] Uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1), pelo menos, uma linhagem bacteriana que compreende uma sequência de DNA exibindo 100,0% de sequência identidade de nucleotídeos com qualquer uma das sequências de DNA gyrB das linhagens de Lu16774, Lu17007 e Lu17015, isto é, a qualquer uma dessas sequências de DNA de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 15.
[077] Uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1) pelo menos uma linhagem bacteriana que compreende uma sequência de DNA recF que exibe pelo menos 99,2% de identidade da sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 11 ou que compreende uma sequência de DNA que exibe pelo menos 99,8% de identidade de sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 16.
[078] De acordo com uma outra forma de realização, uma mistura da invenção é uma que compreende como componente 1), pelo menos, uma linhagem bacteriana cuja sequência de DNA recF completa tem depois do alinhamento ótimo dentro da janela de sequência alinhada, pelo menos 99,2% de identidade com pelo menos uma das sequências de DNA de SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 11 ou pelo menos 99,8% de identidade com SEQ ID NO: 16; preferencialmente pelo menos 99,9% de identidade com a SEQ ID NO: 16; em particular, 100% de identidade com a SEQ ID NO: 16.
[079] Uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1) pelo menos uma linhagem bacteriana que compreende uma sequência de DNA exibindo pelo menos 99,8%, em particular 100,0% de identidade da sequência de nucleotídeos com qualquer uma das sequências de DNA recF das linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015, isto é, a qualquer uma dessas sequências de DNA de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 16.
[080] Uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1) pelo menos uma linhagem bacteriana que compreende uma sequência de DNA recN exibindo pelo menos 99,8% de identidade da sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 12 ou que compreende uma sequência de DNA que exibe pelo menos 99,3% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 17.
[081] De acordo com uma outra forma de realização, uma mistura da invenção é uma que compreende como componente 1), pelo menos, uma linhagem bacteriana cuja sequência de DNA recN completa tem depois do alinhamento ótimo dentro da janela de sequência alinhada, pelo menos 99,8% de identidade com pelo menos uma das sequências de DNA de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 12 ou pelo menos 99,3% de identidade com SEQ ID NO: 17; preferencialmente pelo menos 99,6% de identidade com a SEQ ID NO: 17; em particular, 100% de identidade com a SEQ ID NO: 17.
[082] Uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1) pelo menos uma linhagem bacteriana que compreende uma sequência de DNA exibindo pelo menos 99,8%, em particular 100,0% de identidade da sequência de nucleotídeos com qualquer uma das sequências de DNA recN das linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015, isto é, a qualquer uma dessas sequências de DNA de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 17.
[083] Uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1) pelo menos uma linhagem bacteriana que compreende uma sequência de DNA rpoA exibindo uma identidade de sequência de nucleotídeos de 100,0% com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 13 ou que compreende uma sequência de DNA que exibe pelo menos 99,9% de identidade de sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 18.
[084] De acordo com uma outra forma de realização, uma mistura da invenção é uma que compreende como componente 1), pelo menos, uma linhagem bacteriana cuja sequência de DNA rpoA completa tem depois do alinhamento ótimo dentro da janela de alinhamento de sequência 100,0% de identidade com, pelo menos, uma das sequências de DNA de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 13 ou pelo menos 99,9% de identidade com SEQ ID NO: 18; de preferência pelo menos 99,9% de identidade com a SEQ ID NO: 17; em particular, 100% de identidade com a SEQ ID NO: 18.
[085] Uma mistura da invenção é em particular uma que compreende como componente 1), pelo menos, uma linhagem bacteriana que compreende um sequência de DNA exibindo 100,0% identidade de sequência de nucleotídeos com qualquer uma das sequências de DNA rpoA das linhagens de Lu16774, Lu17007 e Lu17015, isto é, a qualquer uma dessas sequências de DNA de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 18.
[086] Uma outra forma de realização refere-se a uma mistura que compreende como componente 1), pelo menos um micro-organismo isolado, sendo um membro do gênero Paenibacillus, tendo, pelo menos, uma das características de identificação de uma das seguintes linhagens: 1) Linhagem de Paenibacillus Lu16774 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26969, 2) Linhagem de Paenibacillus Lu17007 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26970, ou 3) Linhagem de Paenibacillus Lu17015 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26971.
[087] Uma outra forma de realização refere-se a uma mistura que compreende como componente 1) pelo menos uma linhagem de Paenibacillus, que é selecionada a partir do grupo que consiste em: 1) Linhagem Lu16774 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26969, 2) Linhagem Lu17007 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26970, 3) Linhagem Lu17015 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26971, e 4) Linhagens com pelo menos uma das caracterticas de identificação de uma das referidas linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015.
[088] Uma outra forma de realização refere-se a uma mistura que compreende como componente 1), pelo menos um micro-organismo isolado selecionado a partir de linhagens: 1) Linhagem de Paenibacillus Lu16774 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26969, 2) Linhagem de Paenibacillus Lu17007 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26970, e 3) Linhagem de Paenibacillus Lu17015 depositada na DSMZ com o N° de Acesso DSM 26971; que mostra atividade antagonista contra pelo menos um patógeno de planta, e sendo capaz de produzir, pelo menos, uma fusaricidina; ou uma linhagem mutante da mesmo mantendo a referida capacidade, isto é, mantendo a referida atividade antagonista contra pelo menos um patógeno de planta, e mantendo a referida capacidade de produzir, pelo menos, uma fusaricidina.
[089] Uma outra forma de realização refere-se a uma mistura que compreende como componente 1), pelo menos, um micro-organismo selecionado a partir de: 1) Linhagem de Paenibacillus Lu16774 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26969, 2) Linhagem de Paenibacillus Lu17007 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26970, 3) Linhagem de Paenibacillus Lu17015 depositada na DSMZ com o N° de Acesso DSM 26971; ou uma sua linhagem mutante tendo todas as características de identificação de uma das referidas linhagens.
[090] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem como componente 1) o meio de cultura de pelo menos uma linhagem de Paenibacillus conforme definida em qualquer uma das formas de realização preferidas acima.
[091] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem como componente 1) o extrato livre de células de pelo menos uma linhagem de Paenibacillus conforme definida em qualquer uma das formas de realização preferidas acima.
[092] Uma outra forma de realização refere-se a misturas compreendendo como componente 1), pelo menos, um metabólito de pelo menos uma linhagem de Paenibacillus conforme definida em qualquer uma das formas de realização preferidas acima; preferivelmente, pelo menos um metabólito sendo um lipopeptídeo e ainda mais preferencialmente selecionado a partir dos grupos das polimixinas, octapeptinas, polipeptinas, pelgipeptinas e fusaricidinas.
[093] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem como componente 1) pelo menos uma fusaricidina.
[094] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem como componente 1) pelo menos uma fusaricidina de fórmula I
Figure img0006
em que Ré selecionado a partir de ácido 15-guanidino-3- hidroxipentadecanoico (GHPD) e 12-ácido guanidinododecanoico (12-GDA); X1 é treonina; X2 é selecionado a partir de isoleucina e valina; X3 é selecionado a partir de tirosina, valina, isoleucina e fenilalanina; X4 é treonina; X5 é selecionado a partir de glutamina e asparagina; X6 é alanina; e em que uma seta define uma ligação simples (amida), quer entre a porção carbonila de Re o grupo amino do aminoácido X1 ou entre o grupo carbonila de um aminoácido e o grupo amino de um aminoácido vizinho, no qual a ponta da seta indica a ligação ao grupo amino do referido aminoácido X1 ou do referido aminoácido vizinho; e em que a linha única sem uma ponta de seta define uma ligação simples (éster) entre o grupo carbonila de X6 e o grupo hidroxila de X1.
[095] Uma outra forma de realização refere-se a misturas que compreendem como componente 1) pelo menos uma fusaricidina da forumula I.1
Figure img0007
em que Ré selecionado a partir de ácido 15-guanidino-3- hidroxiypentadecanoico (GHPD) e ácido 12-guanidinodecanoico (12-GDA); X1 é treonina; X2 é isoleucina; X3 é tirosina; X4 é treonina; X5 é selecionado a partir de glutamina e asparagina; X6 é alanina; e em que uma seta define uma ligação simples (amida), quer entre a porção carbonila de Re o grupo amino do aminoácido X1 ou entre o grupo carbonila de um aminoácido e o grupo amina de um aminoácido vizinho, no qual a ponta da seta indica a ligação ao grupo amino do referido aminoácido X1 ou do referido aminoácido vizinho; e em que a linha única sem uma ponta de seta define uma ligação simples (éster) entre o grupo carbonila X6e o grupo hidroxila X1.
[096] De acordo com uma outra forma de realização, X1 na fórmula I é de um modo preferido L-treonina. De acordo com uma outra forma de realização, X2 na fórmula I é de preferência D-isoleucina ou D-allo-isoleucina. De acordo com uma outra forma de realização, X3na fórmula I é de um modo preferido L-tirosina. De acordo com uma outra forma de realização, X4 na fórmula I é de preferência D-allo- treonina. De acordo com uma outra forma de realização, X5 na fórmula I é de preferência D-glutamina ou D-asparagina. De acordo com uma outra forma de realização, Rna fórmula I é preferencialmente GHPD.
[097] O esboço de fórmula I.1 para fusaricidina de fórmula I.1 pode também ser representada como se segue:
Figure img0008
em que X é selecionado a partir de NH-(C=O)-CH2-CH(OH)-(CH2)12-NH- C(=NH)NH2, e -NH-(C=O)- (CH2)11-NH-C(=NH)NH2; R1 é 1-hidroxietila; R2 é 1-metilpropila (sec-butila); R3 é 4-hidroxibenzila; R4 é 1-hidroxietila; R5 é selecionado a partir de carbamoiletila e carbamoilmetila; R6 é um grupo metila.
[098] Do mesmo modo, as formas de realização preferidas baseadas no esboço alternativo acima mencionado da fórmula I.1 são as seguintes: R1 nesta fórmula I é de preferência (1S, 2R)-1-hidroxietila. R2 nesta fórmula I é de preferência (1R, 2R)-1-metilpropila ou (1R, 2S)-1-metilpropila. R3 nesta fórmula I, é de preferência (S)-4-hidroxi-benzila. R4 nesta fórmula I é de preferência (1S, 2R)-1-hidroxietila. R5 na presente fórmula I, é de preferência (R)-carbamooletil e (R)- carbamoilmetil. X nesta fórmula I é de preferência -NH-(C=O)-CH2-CH(OH)- (CH2)12-NH-C(=NH)NH2.
[099] De acordo com uma outra forma de realização, a invenção diz ainda respeito a misturas que compreendem, como componente 1) pelo menos uma fusaricidina selecionada a partir de fusaricidina 1A e 1B, que são de fórmula I, em que R é GHPD e em que X5 é asparagina em caso de fusaricidina 1A e X5 é glutamina no caso da fusaricidina 1B:
Figure img0009
[100] Além disso, as fusaricidinas de fórmula I incluindo aquelas em que R é GHTD podem ser sintetizadas em analogia com métodos conhecidos na técnica (Biopolymers 80 (4), 541, 2005; J. Peptide Sci. 12S, 219, 2006; Tetrahedron Lett. 47 (48), 8587-90, 2006; Biopolymers 88 (4), 568, 2007; ChemMedChem 7, 871-882, 2012).
[101] A presente invenção refere-se ainda a composições compreendendo as misturas das invenções que compreendem como componente 1) as linhagens, caldo de cultura total, extratos livres de células, meios de cultura, ou fusaricidinas de fórmula I e os seus sais da invenção, como bem como o uso das referidas composições para controlar ou suprimir patógenos de plantas ou prevenir infecção por patógeno de planta ou para a proteção de materiais contra a destruição por infestação de micro-organismos nocivos, e a métodos correspondentes que compreendem o tratamento dos agentes patogênicos, o seu habitat ou os materiais ou plantas a serem protegidos contra o ataque de agentes patogênicos, ou o solo ou o material de de propagação com uma quantidade eficaz das composições, linhagens, caldo de cultura total, extratos livres de células, meio de cultura, ou fusaricidinas de fórmula I e os seus sais da invenção.
[102] Outras formas de realização da invenção são divulgadas na seguinte descrição detalhada da invenção, nas reivindicações e nas figuras.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[103] Uma característica de identificação das linhagens de Paenibacillus Lu16774, Lu17007 e Lu17015 depositadas é que elas são capazes de produzir, pelo menos, uma fusaricidina de fórmula I, de um modo preferido selecionada a partir de fusaricidinas 1A e 1B, em particular produzindo fusaricidinas 1A e 1B, que são metabólitos da respectivas linhagens.
[104] Assim, de acordo com um aspecto da invenção, as linhagens de Paenibacillus de componente 1) das misturas da invenção são capazes de produzir pelo menos uma fusaricidina de fórmula I, mais preferivelmente produzindo fusaricidinas 1A ou 1B, em particular produzindo fusaricidinas 1A e 1B; mais preferivelmente em um meio de crescimento compreendendo pelo menos uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio como aqui definido.
[105] Assim, de acordo com um outro aspecto da invenção, as linhagens de Paenibacillus de componente 1) das misturas da presente invenção produzem, pelo menos, uma fusaricidina de fórmula I, mais de preferência, produzem fusaricidinas 1A ou 1B, em particular, produzem fusaricidinas 1A e 1B; em um meio de crescimento compreendendo pelo menos uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio como aqui definido.
[106] Outra forma de realização da invenção refere-se a misturas que compreendem como componente 1) pelo menos um micro-organismo isolado selecionado a partir de 1) Linhagem de Paenibacillus Lu16774 depositada na DSMZ sob o No. de acesso DSM 26969, 2) A linhagem de Luenibacillus Lu17007 depositada na DSMZ sob o No. de acesso DSM 26970, e 3) Linhagem de Paenibacillus Lu17015 depositada na DSMZ sob o No. de acesso DSM 26971; que mostra atividade antagonista contra pelo menos um patógeno de planta, e sendo capaz de produzir, pelo menos, uma fusaricidina de fórmula I, de um modo preferido selecionada a partir de fusaricidinas 1A e 1B, em parcular produzir fusaricidinas 1A e 1B; ou uma linhagem mutante da mesma mantendo a referida capacidade, isto é, mantendo a referida atividade antagonista contra pelo menos um patógeno de planta, e mantendo a referida capacidade de produção pelo menos uma fusaricidina de fórmula I, de um modo preferido selecionada a partir de fusaricidinas 1A e 1B, em particular que produzem fusaricidinas 1A e 1B.
[107] Uma característica identificadora adicional das linhagens de Paenibacillus Lu16774, Lu17007 e Lu17015 ou uma linhagem mutante é que elas são capazes de produzir, pelo menos, uma fusaricidina selecionada a partir do grupo que consiste em fusaricidina A, fusaricidina B, fusaricidina C, fusaricidina D, LI-F06a, LI-F06b e LI-F08b, além da sua capacidade para produzir pelo menos uma fusaricidina de fórmula I, preferivelmente selecionada a partir de fusaricidina 1A e 1B, em particular produzindo fusaricidina 1A e 1B.
[108] Assim, de acordo com um outro aspecto da invenção, as linhagens de Paenibacillus de componente 1) das misturas da invenção são capazes de produzir, pelo menos, uma fusaricidina de fórmula I, de prefrência selecionada a partir de fusaricidinas 1A e 1B, em particular que produzem fusaricidinas 1A e 1B, como aqui divulgado, e são capazes de produzir pelo menos um composto selecionado a partir do grupo que consiste em fusaricidina A, fusaricidina B, fusaricidina C, fusaricidina D, LI-F06a, LI-F06b e LI-F08b.
[109] De acordo com um outro aspecto da invenção, as linhagens de Paenibacillus de componente 1) das misturas da invenção são capazes de produzir, pelo menos, uma fusaricidina de fórmula I, de preferência selecionada a partir de fusaricidinas 1A e 1B, em particular produzindo fusaricidinas 1A e 1B, como aqui divulgado, e são capazes de produzir pelo menos três compostos selecionados a partir do grupo que consiste em fusaricidina A, fusaricidina B, fusaricidina C, fusaricidina D, LI-F06a, LI-F06b e LI-F08b.
[110] Uma outra característica identificadora da linhagem de Paenibacillus é a sua atividade antifúngica. Em particular, estas linhagens foram encontradas como sendo eficazes contra infestação com agentes patogênicos de plantas incluindo Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, e Sclerotinia sclerotiorum; em que Alternaria spp. É preferencialmente selecionada a partir de A. solani e A. alternata, em particular A. solani.
[111] Assim, de acordo com um outro aspecto da invenção, as linhagens de Paenibacillus de componente 1) das misturas da invenção têm uma atividade antifúngica, particularmente contra um agente patogênico de planta selecionada a partir do grupo que consiste em Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, e Sclerotinia sclerotiorum, em que Alternaria spp. é preferencialmente selecionada a partir de A. solani e A. alternata, em particular A. solani. Mais particularmente, as linhagens de Paenibacillus da invenção têm atividade antifúngica contra pelo menos dois ou contra todos os quatro dos referidos agentes patogênicos.
[112] De acordo com um outro aspecto da invenção, as linhagens de Paenibacillus da invenção têm uma atividade anttifúngica contra agentes patogênicos de planta Alternaria solani, Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, e Sclerotinia sclerotiorum.
[113] A atividade antagonista das linhagens de Paenibacillus contra agentes patogênicos de plantas pode ser mostrada em um ensaio de confrontação in vitro utilizando os fungos fitopatogênicos desejados tais como Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, e Sclerotinia sclerotiorum, em que Alternaria spp. é preferencialmente selecionada a partir de A. solani e A. alternata, em particular A. solani:
[114] Como meio de crescimento para estes fungos fitopatogênicos, o meio ISP2 é usado compreendendo por litro: 10 g de extrato de malte (Sigma Aldrich, 70167); 4 g de extrato de levedura Bacto (Becton Dickinson, 212750); 4 g de glucose monohidratada (Sigma Aldrich, 16301); 20 g de ágar (Becton Dickinson, 214510), pH cerca de 7, Aq. lance. Como meio de crescimento para PHYTIN, o meio V8 é usado compreendendo por litro: 200 ml de caldo de vegetais, 3 g de carbonato de cálcio (Merck Millipore, 1020660250); 30 g de ágar (Becton Dickinson, 214510), pH 6,8, Aq. lance.
[115] As linhagens de Paenibacillus são inoculadas por pontos em um lado de uma placa de ágar. Um bloco de ágar (aprox. 0,3 cm2) contendo um agente patogênico com crescimento ativo foi colocado no centro da placa. Após incubação durante 7-14 dias a cerca de 25 °C, o crescimento do agente patogênico da planta é examinado, especialmente para zonas de inibição. Os seguintes efeitos antagonistas podem ser avaliados: Antibiose é pontuada por avaliação do diâmetro da zona livre de fungos (zona de inibição). Competição é pontuada por comparação com o diâmetro do crescimento do fungo patógeno nas placas com as linhagens bacterianas em comparação com as placas controle. O micoparasitismo pode ser documentado no caso das bactérias superarem o fungo patógeno e também os micoparasitas, os patógenos. Isso pode ser visualizado por microscopia.
[116] Mais especificamente, a presente invenção refere-se a misturas compreendendo como componente 1), pelo menos, uma linhagem bacteriana selecionada a partir de linhagens de Paenibacillus Lu16774, Lu17007 e Lu17015 e qualquer linhagem de Paenibacillus tendo um, dois, três ou mais das características de identificação da linhagem depositada, em que as características de identificação são selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) atividade antifúngica contra um patógeno de planta selecionado a partir do grupo que consiste em Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, e Sclerotinia sclerotiorum, em que Alternaria spp. é preferencialmente selecionada a partir de A. solani e A. alternata, em particular A. solani, como aqui divulgado; (b) a capacidade de produzir pelo menos uma fusaricidina de fórmula I, em particular fusaricidinas 1A e / ou 1B, como aqui divulgado; (c) a capacidade de produzir pelo menos uma fusaricidina selecionada a partir do grupo que consiste em fusaricidinas A, B, C, D, IL-F06a, LI-F06b e LI-F08b, como aqui divulgado; e (d) a capacidade de produzir e segregar pelo menos uma enzima lítica selecionada a partir do grupo que consiste em quitinase, celulose e amilase, como aqui divulgado.
[117] Mais preferencialmente, a referida linhagem de Paenibacillus tem as capacidades referidas como (b), (c) e (d) em um meio de crescimento que compreende pelo menos uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio, como aqui definido.
[118] Em particular, as linhagens de Paenibacillus de componente 1) das misturas da invenção têm duas ou mais das características de identificação da linhagem depositada, com as linhagens tendo pelo menos as características (a) e (b) sendo particularmente preferidas. Por exemplo, de acordo com uma forma de realização preferida, as linhagens de Paenibacillus de componente 1) das misturas da invenção (a) têm uma atividade antifúngica contra um patógeno de plantas selecionado a partir do grupo que consiste em Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, e Sclerotinia sclerotiorum, em que Alternaria spp. é preferencialmente selecionada a partir de A. solani e A. alternata, em particular A. solani e (b) são capazes de produzir pelo menos uma fusaricidina de fórmula I e particularmente uma fusaricidina 1B. De acordo com uma outra forma de realização preferida, as linhagens de Paenibacillus de componente 1) das misturas da invenção (a) tem uma atividade antifúngica contra três ou contra todos os agentes patogênicos de plantas selecionados a partir do grupo que consiste de Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, e Sclerotinia sclerotiorum, em que Alternaria spp. é preferencialmente selecionada a partir de A. solani e A. alternata, em particular A. solani e (b) são capazes de produzir, pelo menos, uma fusaricidina de fórmula I, produzindo mais de preferência uma fusaricidina 1A ou 1B, em particular de produzindo fusaricidina 1A e 1B.
[119] De acordo com uma forma de realização da invenção, as linhagens de Paenibacillus do componente 1) das misturas da invenção são fornecidas na forma isolada ou substancialmente purificada.
[120] Os termos “isolado” ou “substancialmente purificado” pretendem denotar que as linhagens da invenção foram removidas de um ambiente natural e foram isoladas ou separadas e estão pelo menos 60% livres, preferencialmente pelo menos 75% livres, e mais preferencialmente pelo menos 90% livres, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% livre, e mais preferencialmente pelo menos 99% livre de outros componentes com os quais elas estavam naturalmente associados. Um isolado obtido por cultura de uma única colônia microbiana é um exemplo de uma linhagem isolada da invenção.
[121] As misturas da invenção compreendem como componente 1) a pelo menos uma linhagem de Paenibacillus em qualquer estado fisiológico tal como ativo ou dormente. Linhagens dormentes de Paenibacillus podem ser fornecidas por exemplo na forma congelada, seca ou liofilizada ou parcialmente dessecada (procedimentos para produzir organismos parcialmente dessecados são dados no documento WO 2008/002371) ou na forma de esporos.
[122] De acordo com uma forma de realização da invenção, as misturas compreendem como componente 1) a pelo menos uma linhagem de Paenibacillus na forma de esporos.
[123] De acordo com uma forma de realização da invenção, as misturas compreendem como componente 1) a pelo menos uma linhagem de Paenibacillus na forma de um caldo de cultura total.
[124] A cultura é de preferência uma cultura isolada ou substancialmente purificada.
[125] Uma “cultura isolada” ou “cultura substancialmente purificada” refere-se a uma cultura das linhagens da invenção que não inclui quantidades significativas de outros materiais que normalmente são encontrados em habitat natural em que a linhagem cresce e / ou a partir da qual a linhagem normalmente pode ser obtida. Consequentemente, tal “cultura isolada” ou “cultura substancialmente purificada” é pelo menos 60% livre, preferivelmente pelo menos 75% livre e mais preferivelmente pelo menos 90% livre, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% livre, e mais preferivelmente pelo menos 99% livre de outros materiais que normalmente são encontrados no habitat natural em que a linhagem cresce e / ou a partir do qual a linhagem normalmente pode ser obtida. Tal “cultura isolada” ou “cultura substancialmente purificada” normalmente não inclui qualquer outro micro-organismo em quantidades suficientes para interferir com a replicação da linhagem da invenção.
[126] As linhagens de Paenibacillus como usadas nas misturas da invenção podem ser cultivadas continuamente ou descontinuamente no processo em batelada ou na batelada alimentada ou em processo de batelada alimentada repetida. Uma revisão dos métodos conhecidos de cultivo podem ser encontrados no livro texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgat, 1991)) ou no livro texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
[127] O meio que está para ser utilizado para o cultivo do micro-organismo deve satisfazer os requirementos das linhagens particulares de uma maneira apropriada. Descrições de meios de cultura para vários micro- organismos são dados no livro “Manual of Methos for General Bacteriology” da Sociedade Americana de Bacteriologia (Washington DC, EUA, 1981).
[128] Estes meios que podem ser utilizados de acordo com a invenção compreendem geralmente uma ou mais fontes de carbono, fontes de nitrogênio, sais inorgânicos, vitaminas e / ou elementos traço. Fontes preferidas de carbono são açúcares, tais como mono-, di- ou polissacarídeos. Muito boas fontes de carbono são por exemplo glicose, frutose, manose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sacarose, rafinose, amido ou celulose. Os açúcares também podem ser adicionados aos meios através de compostos complexos, tais como melaços, ou outros subprodutos da refinação de açúcar. Pode também ser vantajoso adicionar misturas de várias fontes de carbono. Outras possíveis fontes de carbono são os óleos e gorduras tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco, ácidos graxos tal como ácido palmítico, ácido esteárico ou ácido linoleico, álcoois, tais como glicerol, metanol ou etanol e os ácidos orgânicos, tais como ácido acético ou ácido láctico. As fontes de nitrogênio são geralmente ou compostos orgânicos ou inorgânicos de nitrogênio ou materiais que contenham estes compostos. Exemplos de fontes de nitrogênio incluem gás de amônia ou de sais de amônio, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio ou nitrato de amônio, nitratos, ureia, aminoácidos ou fontes complexas de nitrogênio, tais como milhocina, farinha de soja, proteína de soja, extrato de levedura, extrato de carne e outros. As fontes de nitrogênio podem ser usadas separadamente ou como uma mistura. Compostos de sais inorgânicos que podem estar presentes no meio compreendendo os sais de cloreto, fosfato ou sulfato de cálcio, de magnésio, de sódio, de cobalto, de molibdênio, de potássio, de manganês, de zinco, de cobre e de ferro. Compostos contendo enxofre inorgânico, por exemplo sulfatos, sulfitos, ditionitos, tetrationatos, tiossulfatos, sulfuretos, mas também compostos orgânicos de enxofre, tais como mercaptanos e tiois, podem ser utilizados como fontes de enxofre. Ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de dipotássio ou os sais correspondentes contendo sódio podem ser usados como fontes de fósforo. Agentes quelantes podem ser adicionados ao meio, a fim de manter os íons metálicos em solução. Agentes quelantes especialmente adequados compreendem dihidroxifenois, tais como catecol ou protocatecoato, ou ácidos orgânicos, tais como ácido cítrico. Os meios de fermentação utilizados de acordo com a invenção podem também conter outros fatores de crescimento, tais como vitaminas ou promotores de crescimento, que incluem por exemplo biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato e piridoxina. Fatores de crescimento e sais geralmente vêm de componentes complexos do meio, tal como extrato de levedura, melaços, milhocina e similares. Além disso, precursores adequados podem ser adicionados ao meio. A composição precisa dos compostos no meio é fortemente dependente do experimento em particular, e deve ser decidido individualmente para cada caso específico. Informações sobre otimização de meio pode ser encontrada no livro “Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (Publ. PM Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). O meio de crescimento também pode ser obtido de fornecedores comerciais, como Padrão 1 (Merck) ou BHI (Infusão de Cérebro no Coração, DIFCO), etc.
[129] Os meios de crescimento preferidos que podem ser utilizados de acordo com a invenção compreendem uma ou mais fontes de carbono selecionadas a partir de L-arabinose, N-acetil-D-glucosamina, D- galactose, ácido L-aspartárico, D-trealose, D-manose, glicerol, ácido D- glucônico, D-xilase, D-manitol, D-ribose, D-frutose, α-D-glucose, maltose, D- melibiose, timidina, α-metil-D-galactosideo, α-D-lactose, lactulose, sacarose, uridina, ácido α-hidroxi glutárico—Y—lactona, β-metil-D-glucosideo, adonitol, maltotriose, 2-desoxiadenosina, adenosina, ácido cítrico, ácido múcio, D- celobiose, inosina, L-serina, L-alanil-glicina, ácido D-galacturônico, α ciclodextrina, β-ciclodextrina, dextrina, inulina, pectina, amigdalina, gentiobiose, lactitol, D-melezitose, α-metil-D-glucosideo, β-metil-D-galactosideo, β-metil-D- xilosídio, palatinose, D-rafinose, estaquiose, turanose, ácido Y-amino butírico, D- gluosamina, ácido D-láctico, L-lisina, 3-hidroxi 2-butanona; e uma ou mais fontes de nitrogênio selecionadas a partir de amônia, nitrito, nitrato, L-alanina, L- asparagina, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, glicina, duplas de aminoácidos: Ala-Asp, Ala-Gln, Ala-Glu, Ala-His, Gly-Gln, Gly-Glu, Gly-Met e Met-Ala; em particular nitrato. Estes meios podem ser suplementados com sais inorgânicos e vitaminas e / ou oligoelementos. As linhagens são capazes de produzir fusaricidinas 1A e 1B, com estes meios de crescimento.
[130] Todos os componentes do meio são esterilizados, seja por aquecimento (20 minutos a 2,0 bar e 121 °C) ou por filtração estéril. Os componentes podem ser esterilizados em conjunto ou, se necessário, de forma separada. Todos os componentes do meio podem estar presentes no início do crescimento, ou opcionalmente podem ser adicionados continuamente ou por alimentação em batelada.
[131] A temperatura da cultura está normalmente entre 15 °C e 36 °C, de preferência entre 25 °C e 33 °C e pode ser mantida constante ou pode variar durante o experimento. O valor de pH do meio deve estar no intervalo de 5 a 8,5, de preferência em torno de 7,0. O valor de pH para crescimento pode ser controlado durante o crescimento por adição de compostos básicos como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou água de amônia ou compostos ácidos como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. Os agentes antiespumantes, por exemplo ésteres de poliglicol de ácido graxo, podem ser utilizados para controlar a formação de espuma. Para manter a estabilidade dos plasmídeos, substâncias adequadas com ação seletiva, por exemplo, antibióticos, podem ser adicionadas ao meio. Oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio, por exemplo, o ar ambiente, são alimentados na cultura para manter as condições aeróbicas. A temperatura da cultura é normalmente de 20 °C a 45 °C. A cultura é continuada até que um máximo do produto desejado tenha sido formado. Isto é normalmente alcançado dentro de 10horas a 160 horas.
[132] Em particular, as linhagens da presente invenção podem ser cultivadas em um meio de uma variedade de meios de microbiologia convencionais, tais como caldo de Luria-Bertani (LB), caldo de tripticase de soja (TSB), extrato de levedura/ extrato de malte/ caldo de glicose (YMG, ISP2) a uma temperatura entre 15 °C e 36 °C durante 18 a 360 horas em meio líquido ou em meio ágar solidificado sobre placa de petri. Aeração pode ser necessária. As células bacterianas (células vegetativas e esporos) podem ser lavadas e concentradas (por exemplo, por centrifugação à temperaturas de cerca de 15 a 30 °C durante cerca de 15 minutos a 7000 x g).
[133] A invenção também se refere a misturas compreendendo como componente 1) um meio de cultura que pode ser obtido através da cultura de pelo menos um uma linhagem de Paenibacillus, tal como definida em qualquer uma das formas de realização preferidas acima em um meio e separar o meio do caldo de cultura (assim, permanescendo quando as células crescidas no meio são removidas de todo o caldo de cultura), por exemplo, o sobrenadante de um caldo de cultura total, isto é, o caldo líquido permanesce quando as células crescidas no caldo e outros detritos são removidos por centrifugação, filtração, sedimentação, ou outros meios bem conhecidos na arte. O sobrenadante pode ser obtido, por exemplo, por centrifugação a temperaturas de cerca de 2 a 30 °C (mais preferivelmente a temperaturas de 4 a 20 °C) durante cerca de 10a 60 minutos (mais preferencialmente cerca de 15 a 30 minutos) a cerca de 5000 a 20000 x g (mais preferencialmente a cerca de 15000 x g).
[134] Esse meio de cultura contém metabólitos pesticidas que são produzidos pela linhagem cultivada.
[135] A invenção também se refere a misturas que compreendem, como componente 1) um extrato livre de células que pode ser obtido de, pelo menos, uma linhagem de Paenibacillus, tal como definida em qualquer uma das formas de realização preferidas acima. Para produzir um extrato livre de células, a linhagem pode ser cultivada como descrito acima. As células podem ser rompidas também por ultrassons de alta frequência, por alta pressão, por exemplo em uma célula francesa de pressão, por osmólise, pela ação de detergentes, enzimas líticas ou solventes orgânicos, por meio de homogenizadores ou por uma combinação de vários métodos listados. A extração pode ser realizada de preferência com um solvente orgânico ou mistura de solvente, mais preferencialmente um álcool (por exemplo, metanol, etanol, n- propanol, 2-propanol ou afins), ainda mais preferencialmente com 2-propanol (por exemplo, em uma razão de 1: 1 com o volume de cultura). A separação de fases pode ser melhorada pela adição de sais, tais como NaCl. A fase orgânica pode ser recolhida e o solvente ou a mistura de solventes pode ser removida por destilação convencional e / ou secagem seguida por ressuspensão em metanol e filtração.
[136] Tal extrato contém metabólitos pesticidas que são produzidos pela linhagem cultivada.
[137] Os metabólitos pesticidas que são específicos para as linhagens da invenção podem ser recuperados a partir desse meio ou extrato de acordo com métodos convencionais, em particular quando as linhagens da invenção forem cultivadas como descrito acima.
[138] A metodologia da presente invenção pode ainda incluir uma etapa de recuperação de metabólitos pesticidas individuais.
[139] O termo “recuperação” inclui a extração, colheita, isolamento ou purificação do composto a partir de meios de cultura ou extratos livres de células. Recuperação do composto pode ser realizada de acordo com qualquer metodologia de isolamento ou purificação convencional conhecida na arte, incluindo, mas não se limitando a, tratamento com uma resina convencional (por exemplo, resina de troca aniônica ou catiônica, uma resina de adsorção não iônica, etc.), tratamento com um adsorvente convencional (por exemplo, carvão vegetal ativado, ácido silícico, gel de sílica, celulose, alumina, etc.), alteração de pH, extração com solventes (por exemplo, com um solvente convencional tal como um álcool, acetato de etila, hexano e semelhantes), destilação, diálise, filtração, concentração, cristalização, recristalização, ajuste de pH, liofilização e semelhantes. Por exemplo, os metabólitos podem ser recuperados a partir de meios de cultura removendo primeiro os micro-organismos. O caldo remanescente é então passado através ou sobre uma resina de troca catiônica para remover cátions indesejados e, em seguida, através ou sobre uma resina de troca aniônica para remover ânions inorgânicos indesejados e ácidos orgânicos.
[140] Consequentemente, a invenção também se refere a uma mistura que compreende como componente 1) um caldo de cultura total de um micro-organismo que compreende, pelo menos, uma fusaricidinas de fórmula I de um modo preferido selecionado a partir das fusaricidinas 1A e 1B, em particular, o referido caldo de cultura total compreende fusaricidinas 1A e 1B.
[141] De acordo com uma forma de realização adicional, a invenção também se refere a uma mistura compreendendo como componente 1) um caldo de cultura total de um micro-organismo da linhagem de Paenibacillus compreendendo pelo menos uma fusaricidina de fórmula I, preferencialmente selecionada a partir de fusaricidinas 1A e 1B, em particular o dito caldo de cultura total compreende fusaricidinas 1A e 1B.
[142] Os referidos metabólitos do tipo fusaricidina são secretados para o meio de cultura do respectivo micro-organismo capaz de produzí-lo.
[143] Por conseguinte, a invenção também se refere a uma mistura que compreende como componente 1) um meio de cultura e / ou um extrato livre de células de um micro-organismo compreendendo pelo menos uma fusaricidina de fórmula I, de um modo preferido selecionada a partir de fusaricidinas 1A e 1B, em particular, o referido meio de cultura e / ou um extrato livre de células compreende fusaricidinas 1A e 1B.
[144] De acordo com uma outra forma de realização, a invenção também se refere a uma mistura compreendendo como componente 1) um meio de cultura e / ou um extrato livre de células de um micro-organismo do gênero Paenibacillus compreendendo pelo menos uma fusaricidina de fórmula I, preferencialmente selecionada a partir de as fusaricidinas 1A e 1B, em particular o referido meio de cultura e / ou um extrato livre de células, compreendem as fusaricidinas 1A e 1B.
[145] De acordo com uma outra forma de realização, a invenção também se refere a uma mistura que compreende como componente 1) um meio de cultura e / ou um extrato livre de células de pelo menos uma linhagem de Paenibacillus da invenção, tal como definida em qualquer uma das formas de realização preferidas acima, que compreende pelo menos uma fusaricidina de fórmula I como definida acima, de um modo preferido selecionada a partir de fusaricidinas 1A e 1B, em particular, o referido meio de cultura e / ou um extrato livre de células compreende fusaricidinas 1A e 1B.
[146] A invenção ainda se relaciona a composições agroquímicas que compreendem um auxiliar como definido abaixo e a mistura da invenção compreendendo como componente 1) pelo menos uma linhagem bacteriana, caldo de cultura total, extrato livre de células, meio de cultura e / ou fusaricidina de fórmula I, como definida em qualquer uma das formas de realização preferidas acima, respectivamente.
[147] Tal como aqui utilizado, “composição”, em referência a um produto (linhagem, agente ou formulação microbiana) da presente invenção refere-se a uma combinação de ingredientes, em que “formulação” é o processo de utilização de uma fórmula, tal como uma receita, para uma combinação de ingredientes, a serem adicionados para formar a formulação. Tal composição é também aqui referida como formulação.
[148] As misturas que compreendem, como componente 1) as linhagens bacterianas, caldos de cultura total, extratos livres de células, meios de cultura, fusaricidinas de fórmula I, como definido em qualquer uma das formas de realização acima, e como componente 2) pelo menos um pesticida químico como definido em qualquer uma das formas de realização preferidas acima; e composições da invenção, respectivamente, são adequadas como agentes antifúngicos ou fungicidas. Distinguem-se por uma excelente eficácia contra um amplo espectro de fungos fitopatogênicos, incluindo fungos transmitidos pelo solo, que derivam especialmente das classes Plasmodiophoromycetes, Peronosporomycetes (sin. Oomycetes), Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes e Deuteromycetes (sin. Fungi imperfecti). Alguns são sistemicamente eficazes e podem ser usados na proteção de cultivos como fungicidas foliares, fungicidas para a cobertura de sementes e fungicidas para o solo. Além disso, são adequados para o controle de fungos nocivos, que ocorrem, nomeadamente, na madeira ou raízes de plantas.
[149] As misturas e composições da invenção, respectivamente, são particularmente importantes no controle de uma multiplicidade de fungos fitopatogênicos em várias plantas cultivadas, tais como cereais, por exemplo trigo, centeio, cevada, triticale, aveias ou arroz; beterraba, por exemplo, beterraba sacarina ou beterraba forrageira; frutos, tais como pomoides, frutos de caroço ou frutos moles, por exemplo, maçãs, pêras, ameixas, pêssegos, amêndoas, cerejas, morangos, framboesas, amoras ou groselhas; plantas leguminosas, tais como lentilhas, ervilhas, alfafa ou soja; plantas oleaginosas, tais como colza, mostarda, azeitonas, girassois, coco, cacau, mamona, dendezeiros, amendoim ou soja; cucurbitáceas, tais como abóboras, pepinos ou melões; plantas fibrosas, tais como algodão, linho, cânhamo ou juta; frutas cítricas, como laranjas, limões, toranjas ou tangerinas; vegetais, como espinafre, alface, aspargo, couves, cenouras, cebolas, tomates, batatas, cucurbitáceas ou páprica; plantas lauráceas, tais como abacates, canela ou cânfora; plantas de energia e matérias-primas, como milho, soja, canola, cana de açúcar ou óleo de palma; milho; tabaco; nozes; café; chá; bananas; videiras (uvas de mesa e sucos de uva de vinhas de uva); lúpulo; relva; folha doce (também chamada Stevia); plantas de borracha naturais, ou plantas ornamentais e florestais, tais como flores, arbustos, árvores de folha larga ou sempre verdes, por exemplo coníferas; e no material de propagação de plantas, tais como sementes, e o material de colheita destas plantas.
[150] De preferência, as misturas e composições da invenção, respectivamente, são usadas para controlar uma multiplicidade de fungos em culturas de campo, tais como beterrabas sacarinas, batatas, tabaco, trigo, centeio, cevada, aveias, arroz, milho, algodão, soja, colza, legumes, girassol, café ou cana-de-açúcar; frutas; videiras; ornamentais; ou vegetais, como pepinos, tomates, feijões ou abóboras.
[151] O termo “material de propagação de planta” deve ser entendido para designar todas as partes generativas da planta, tais como sementes e material vegetativo das plantas, tais como estacas e tubérculos (por exemplo, batatas), os quais podem ser utilizados para a multiplicação da planta. Isto inclui sementes, raízes, frutas, tubérculos, bulbos, rizomas, brotos, gemas e outras partes de plantas, incluindo mudas e plantas jovens, que serão transplantadas após germinação ou após a emergência do solo. Estas plantas jovens também podem ser protegidas antes de serem transplantadas por um tratamento total ou parcial por imersão ou derramamento.
[152] De um modo preferido, o tratamento de materiais de propagação de plantas com as linhagens, caldos de cultura total, meios de cultura de extratos livres de células, fusaricidinas de fórmula I; e composições da invenção, respectivamente, é usado para controlar uma multiplicidade de fungos em cereais, tais como trigo, centeio, cevada e aveias; arroz, milho, algodão e soja.
[153] O termo “plantas cultivadas” deve ser entendido como incluindo plantas que foram modificadas por cruzamento, mutagênese ou engenharia genética, incluindo mas não se limitando aos produtos agrícolas geneticamente modificados no mercado ou em desenvolvimento (cf. http://cera- GMC.org/, ver nele a base de dados GM crop). As plantas geneticamente modificadas são plantas, que o material genético foi modificado pela utilização de técnicas de DNA recombinante, que sob circunstâncias naturais não poderia ser prontamente obtida por cruzamentos. Normalmente, um ou mais genes foram integrados no material genético de uma planta geneticamente modificada, a fim de melhorar certas propriedades da planta. Tais modificações genéticas incluem, mas não estão limitadas a modificação dirigida de proteína(s) pós- translacional, oligo- ou polipeptídeos, por exemplo por glicosilação ou adição de polímeros, tais como porções preniladas, acetiladas ou farnesiladas ou de PEG.
[154] Plantas que foram modificadas por cruzamento, mutagênese ou engenharia genética, por exemplo, ficaram tolerantes para aplicações de classes específicas de herbicidas, tais como herbicidas de auxina tais como dicamba ou 2,4-D; herbicidas lixiviadores, tais como inibidores de hidroxilfenilpiruvato dioxigenase (HPPD) ou inibidores de fitoeno dessaturase (PDS); inibidores da acetolactato sintase (ALS) tais como sulfonil ureias ou imidazolinonas; inibidores da enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), tais como glifosato; inibidores da glutamina sintetase (GS) tais como o glufosinato; inibidores de protoporfirinogeno-IX oxidase; inibidores da biossíntese lipídica, tais como inibidores da acetil-CoA carboxilase (ACCase); ou herbicidas de oxinila (isto é, bromoxinila ou ioxinila) como resultado de métodos convencionais de reprodução ou engenharia genética. Além disso, as plantas se tornaram resistentes a múltiplas classes de herbicidas através de múltiplas modificações genéticas, tais como a resistência a ambos glifosato e glufosinato ou a ambos glifosato e um herbicida de outra classe, tais como inibidores de ALS, inibidores de HPPD, herbicidas da auxina, ou inibidores de ACCase. Estas tecnologias de resistência a herbicidas estão descritas, por exemplo, em Pest Managem. Sci. 61, 2005, 246; 61, 2005, 258; 61, 2005, 277; 61, 2005, 269; 61, 2005, 286; 64, 2008, 326; 64, 2008, 332; Weed Sci. 57, 2009, 108; Austral. J. Agricult. Res. 58, 2007, 708; Science 316, 2007, 1185; e referências citadas aqui. Diversas plantas cultivadas se tornaram tolerantes aos herbicidas por meio de métodos convencionais de reprodução (mutagênese), por exemplo Clearfield® colza de verão (Canola, BASF SE, Alemanha) sendo tolerante a imidazolinonas, e. g. imazamox ou girassois ExpressSun® (DuPont, EUA) sendo tolerantes a sulfonil ureias, por exemplo, tribenuron. Métodos de engenharia genética têm sido usados para tornar plantas cultivadas, tais como de soja, algodão, milho, beterraba e a colza, telerantes a herbicidas tais como glifosato e glufosinato, algumas das quais estão comercialmente disponíveis sob os nomes comerciais RoundupReady® (tolerante ao glifosato, da Monsanto, EUA), Cultivance® (tolerante a imidazolinona, BASF SE, Alemanha) e LibertyLink® (tolerante ao glufosinato, Bayer CropScience, Alemanha).
[155] Além disso, as plantas que também estão protegidas são aquelas pela utilização de técnicas de DNA recombinante capazes de sintetizar uma ou mais proteínas inseticidas, especialmente aquelas conhecidas do gênero de bactéria Bacillus, particularmente a partir de Bacillus thuringiensis, tais como δ-endotoxinas, por exemplo, CryIA(b), CryIA(c), CryIF, CryIF(a2), CryIIA(b), CryIIIA, CryIIIB(b1) ou Cry9c; proteínas inseticidas vegetativas (VIP), por exemplo, VIP1, VIP2, VIP3 ou VIP3A; proteínas inseticidas de bactérias colonizadoras de nemátodos, por exemplo, Photorhabdus spp. ou Xenorhabdus spp.; toxinas produzidas por animais, tais como toxinas de escorpião, toxinas aracnídeas, toxinas de vespa ou outras neurotoxinas específicas de insetos; toxinas produzidas por fungos, tais como toxinas de Streptomycetes, lectinas vegetais, tais como lectinas de ervilhas ou cevada; aglutininas; inibidores de proteinase, tais como inibidores de tripsina, inibidores de serina protease, patatina, cistatina ou inibidores de papaína; proteínas inativadoras de ribossomas (RIP), tais como ricina, milho-RIP, abrina, luffina, saporina ou briodina; enzimas do metabolismo dos esteroides, tais como 3-hidroxiesteroide oxidase, ecdisteroide-IPD-glicosil-transferase, oxidases de colesterol, inibidores de ecdisona ou HMG-CoA-redutase; bloqueadores dos canais iônicos, tais como bloqueadores dos canais de sódio ou cálcio; esterae de hormônio juvenil; receptores hormonais diuréticos (receptores de helicocinina); stilbeno sintase, bibenzil sintase, quitinases ou glucanases. No contexto da presente invenção, estas proteínas inseticidas ou toxinas devem ser entendidas expressamente também como pré-toxinas, proteínas híbridas, proteínas truncadas ou modificadas de outro modo. As proteas híbridas são caracterizadas por uma nova combinação de domínios proteicos (ver, por exemplo, o documento WO 02/015701). Outros exemplos de tais toxinas ou plantas geneticamente modificadas capazes de sintetizar tais toxinas são reveladas, por exemplo, no documento EP A 374 753, WO 93/007278, WO 95/34656, EP A 427 529, EP A 451 878, WO 03/18810e WO 03/52073. Os métodos para produzir tais plantas geneticamente modificadas são geralmente conhecidos do técnico no assunto e são descritos, por exemplo nas publicações acima mencionadas. Estas proteínas inseticidas contidas nas plantas geneticamente modificadas conferem às plantas que produzem estas proteínas tolerância a pragas prejudiciais de todos os grupos taxonômicos de um artrópodes, especialmente de besouros (Coeloptera), insetos de duas asas (Diptera), e traças (Lepidoptera) e a nemátodos (Nematoda). Plantas geneticamente modificadas capazes de sintetizar um ou mais proteinas inseticidas são, por exemplo, descritas nas publicações mencionadas acima, e algumas das quais estão comercialmente disponíveis, tais como YieldGard® (cultivares de milho que produzem a toxina Cry1Ab), YieldGard® Plus (cultivares de milho que produzem as toxinas Cry1Ab e Cry3Bb1), Starlink® (cultivares de milho produtoras da toxina Cry9c), Herculex® RW (cultivares de milho produtoras de Cry34Ab1, Cry35Ab1 e da enzima Fosfinotricin-N-Acetiltransferase [PAT]); NuCOTN® 33B (cultivares de algodão produtoras da toxina Cry1Ac), Bollgard® I (cultivares de algodão produtoras da toxina Cry1Ac), Bollgard® II (cultivares de algodão produtoras das toxinas Cry1Ac e Cry2Ab2); VIPCOT® (cultivares de algodão que produzem uma toxina VIP); NewLeaf® (cultivares de batata que produzem a toxina Cry3A); Bt-Xtra®, NatureGard®, KnockOut®, BiteGard®, Pro tecta®, Bt11 (por exemplo, Agrisure® CB) e Bt176 de Syngenta Seeds SAS, França, (cultivares de milho que produzem a toxina Cry1Ab e enzima PAT), MIR604 de Syngenta Seeds SAS, França (cultivares de milho que produzem uma versão modificada da toxina Cry3A, c.f. WO 03/018810), MON 863 da Monsanto Europe SA, Bélgica (cultivares de milho que produzem a toxina Cry3Bb1), IPC 531 da Monsanto Europe SA, Bélgica (cultivares de algodão que produzem uma versão modificada da toxina Cry1Ac) e 1507 da Pioneer Overseas Corporation, Bélgica (cultivares de milho produtoras da toxina Cry1F e enzima PAT).
[156] Além disso, as plantas que também estão cobertas são pela utilização de técnicas de DNA recombinante capazes de sintetizar uma ou mais proteínas para aumentar a resistência ou tolerância destas plantas a agentes patogênicos bacterianos, virais ou fúngicos. Exemplos de tais proteínas são as assim chamadas “proteínas relacionadas com agentes patogênicos” (proteínas PR, ver, por exemplo, EP-A 392 225), genes de resistência a doenças de plantas (por exemplo, cultivos de batata, que expressam os genes de resistência que atuam contra Phytophthora infestans derivados da batata mexicana selvagem de Solanum bulbocastanum) ou T4-Lisozima (por exemplo, cultivares de batatas capazes de sintetizar estas proteínas com aumento da resistência contra bactéria, tais como Erwinia amylvora). Os métodos para produzir tais plantas geneticamente modificadas são geralmente conhecidos do técnico no assunto e são descritos, por exemplo nas publicações mencionadas acima.
[157] Além disso, as plantas que também são cobertas pelo uso de técnicas de DNA recombinante capazes de sintetizar uma ou mais proteínas para aumentar a produtividade (por exemplo produção de biomassa, produção de grãos, teor de amido, teor de óleo ou teor de proteína), tolerância à seca, salinidade ou outros fatores ambientais limitantes de crescimento ou tolerância a pragas e fungos, bactérias e patógenos virais destas plantas.
[158] Além disso, as plantas que também são cobertas contêm pelo uso de técnicas de DNA recombinante um teor modificado de substâncias de conteúdo ou novas substâncias de conteúdo, especificamente para melhorar a nutrição humana ou animal, por exemplo, culturas de oleaginosas que produzem ácidos graxos de ômega-3 de cadeia longa promotores de saúdeou ácidos graxos de omega-9 insaturados (por exemplo, Nexera® rape, da Dow Agro Sciences, Canadá).
[159] Além disso, as plantas que também são cobertas contêm pelo uso de técnicas de DNA recombinante um teor modificado de substâncias de conteúdo ou novas substâncias de conteúdo, especificamente para melhorar a produção de matéria-prima, por exemplo, batatas que produzem quantidades aumentadas de amilopectina (por exemplo, Amflora® potato, BASF SE, Alemanha).
[160] As misturas e composições da invenção, respectivamente, são particularmente adequadas para controlar as seguintes doenças de plantas: Albugo spp. (ferrugem branca) em plantas ornamentais, vegetais (por exemplo, A. candida) e girassois (por exemplo, A. tragopogonis); Alternaria spp. (Mancha foliar de Alternaria) em vegetais, colza (A. brassicola ou brassicae), beterraba sacarina (A. tenuis), frutos, arroz, soja, batata (por exemplo, A. solani ou A. alternata), tomates (por exemplo, A. solani ou A. alternata) e trigo; Aphanomyces spp. em beterraba sacarina e legumes; Ascochyta spp. em cereais e vegetais, por exemplo, A. tritici (antracnose) em trigo e A. hordei em cevada; Bipolaris e Drechslera spp. (teleomorfo: Cochliobolus spp. ), por exemplo, Ferrugem-da-folha (D. maydis) ou ferrugem- do-norte (B. zeicola) em milho, por exemplo, mancha manchada (B. sorokiniana) em cereais e, por exemplo, B. oryzae em arroz e turfa; Blumeria (anteriormente Erysiphe) graminis (oídio) em cereais (por exemplo, em trigo ou cevada); Botrytis cinerea (teleomorfo: Botryotinia fuckeliana: mofo cinzento) em frutos e bagas (por exemplo, morangos), legumes (por exemplo, alface, cenoura, aipo e couves), colza, flores, vinhas, plantas florestais e trigo; Bremia lactucae (míldio) na alface; Ceratocystis (sin. Ophiostoma spp.) (podridão ou murcha) em árvores de folhas largas e sempre-vivas, por exemplo, C. ulmi (doença dos olmos holandeses) em olmos; Cercospora spp. (Manchas foliares de Cercospora) em milho (por exemplo, Mancha cinzenta da folha: C. zeae-maydis), arroz, beterraba sacarina (por exemplo, C. beticola), cana-de-açúcar, vegetais, café, soja (por exemplo, C. sojina ou C. kikuchii) e arroz; Cladosporium spp. em tomates (por exemplo, C. fulvum: bolor da folha) e cereais, por exemplo, C. herbarum (orelha negra) em trigo; Claviceps purpurea (ergot) em cereais; Cochliobolus (anamorfo: Helminthosporium de Bipolaris) spp. (manchas de folhas) em milho (C. carbonum), cereais (por exemplo, C. sativus anamorfo: B. sorokiniana) e arroz (por exemplo, C. miyabeanus anamorfo: H. oryzae); Colletotrichum (teleomorfo: Glomerella) spp. (antracnose) em algodão (por exemplo, C. gossypii), milho (por exemplo, C. graminicola: Podridão do pedúnculo da antracnose), frutos moles, batatas (por exemplo, C. coccodes: ponto preto), feijão (por exemplo, C. lindemuthianum) e soja (por exemplo, C. truncatum ou C. gloeosporioides); Corticium spp., por exemplo, C. sasakii (ferrugem da bainha) em arroz; Corynespora cassiicola (manchas foliares) em soja e plantas ornamentais; Cycloconium spp., por exemplo, C. oleaginum em oliveiras; Cylindrocarpon spp. (por exemplo, declínio do câncer da árvore ou videira jovem, teleomorfo: Nectria ou Neonectria spp.) em árvores frutíferas, videiras (por exemplo, C. liriodendri, teleomorfo: Neonectria liriodendri: Doença do pé preto) e plantas ornamentais; Dematophora (teleomorfo: Rosellinia) necatrix (raiz e podridão do caule) na soja; Diaporthe spp., por exemplo, D. phaseolorum (amortecimento) na soja; Drechslera (sin. Helminthosporium teleomorfo: Pyrenophora) spp. em milho, cereais, tais como cevada (por exemplo, D. teres, mancha líquida) e trigo (por exemplo, D. tritici-repentis: mancha bronzeada), arroz e turfa; Esca (dieback, apoplexi) em videiras, causada por Formitiporia (sin. Phellinus) punctata, F. mediterranea, Phaeomoniella chlamydospora (anteriormente Phaeoacremonium chlamydosporum), Phaeoacremonium aleophilum e / ou Botryosphaeria obtusa; Elsinoe spp. em frutos de pevides (E. pyri), frutas macias (E. veneta: antracnose) e videiras (E. ampelina: antracnose); Entyloma oryzae (folha de carvão) no arroz; Epicoccum spp. (bolor negro) em trigo; Erysiphe spp. (oídio) em beterraba sacarina (E. betae), legumes (por exemplo, E. pisi), tais como cucurbitáceas (por exemplo, E. cichoracearum), couves, colza (por exemplo, E. cruciferarum); Eutypa lata (Eutypa canker ou dieback, anamorfo: Cytosporina lata, sin. Libertella blepharis) em árvores frutíferas, videiras e madeiras ornamentais; Exserohilum (sin. Helminthosporium) spp. no milho (por exemplo, E. turcicum); Fusarium (teleomorfo: Gibberella) spp. (murcha, podridão da raiz ou caule) em várias plantas, tais como F. graminearum ou F. culmorum (podridão da raiz, sarna ou ferrugem da cabeça) em cereais (por exemplo, trigo ou cevada), F. oxysporum em tomates, F. solani (f. sp., glycines agora sin. F. virguliforme) e F. tucumaniae e F. brasiliense, cada um causando síndrome de morte súbita em soja, e F. verticillioides em milho; Gaeumannomyces graminis (take-all) em cereais (por exemplo, trigo ou cevada) e milho; Gibberella spp. em cereais (por exemplo, G. zeae) e arroz (por exemplo, G. fujikuroi: doença de Bakanae); Glomerella cingulata em videiras, fruta pome e outras plantas e G. gossypii em algodoeiro; Mancha de grão complexa em arroz; Guignardia bidwellii (podridão negra) em videiras; Gymnosporangium spp. em plantas rosáceas e zimbros, por exemplo, G. sabinae (ferrugem) nas peras; Helminthosporium spp. (sin. Drechslera teleomorfo: Cochliobolus) em milho, cereais e arroz; Hemileia spp., por exemplo, H. vastatrix (ferrugem da folha de café) no café; Isariopsis clavispora (sin. Cladosporium vitis) em videiras; Macrophomina phaseolina (sin. phaseoli) (podridão da raiz e do caule) em soja e algodão; Microdochium (sin. Fusarium) nivale (mofo de neve Rosa) em cereais (por exemplo, trigo ou cevada); Microsphaera diffusa (oídio) na soja; Monilinia spp., por exemplo, M. laxa, M. fructicola e M. fructigena (flor branca e podridão do galho, podridão parda) em frutos de caroço e outras plantas rosáceas; Mycosphaerella spp. em cereais, bananas, frutos macios e amendoins, tais como por exemplo, M. graminicola (anamorfo: Septoria tritici, mancha Septoria) em trigo ou M. fijiensis (doença da Sigatoka negra) em bananas; Peronospora spp. (míldio) em repolho (por exemplo, P. brassicae), colza (por exemplo, P. parasitica), cebolas (por exemplo, P. destructor), tabaco (P. tabacina) e soja (por exemplo, P. manshurica); Phakopsora pachyrhizi e P. meibomiae (ferrugem da soja) em soja; Phialophora spp. por exemplo, em vinhas (por exemplo, P. tracheiphila e P. tetraspora) e soja (por exemplo, P. gregata: podridão da haste); Phoma lingam (podridão da raiz e do caule) em colza e repolho e P. betae (podridão da raiz, mancha foliar e amortecimento) em beterrabas sacarinas; Phomopsis spp. em girassois, videiras (por exemplo, P. viticola: lata e mancha da folha) e soja (por exemplo, podridão da haste: P. phaseoli, teleomorfo: Diaporthe phaseolorum); Physoderma maydis (manchas marrons) no milho; Phytophthora spp. (murcha, raiz, folha, fruto e raiz do caule) em várias plantas, tais como páprica e cucurbitáceas (por exemplo, P. capsici), soja (por exemplo, P. megasperma sin. P. sojae), batatas e tomates (por exemplo, P. infestans: requeima tardia) e árvores de folhas largas (por exemplo, P. ramorum: morte súbita de carvalho); Plasmodiophora brassicae (raiz batida) em repolho, colza, rabanete e outras plantas; Plasmopara spp., por exemplo, P. viticola (míldio da videira) em videiras e P. halstedii em girassois; Podosphaera spp. (oídio) em plantas rosáceas, lúpulo, pomo e frutos macios, por exemplo, P. leucotricha em maçãs; Polymyxa spp., por exemplo, sobre cereais, tais como cevada e trigo (P. graminis) e beterraba sacarina (P. betae) e por doenças virais transmitidas por ela; Pseudocercosporella herpotrichoides (eyespot, telemorfo: Tapesia yallundae) em cereais, por exemplo, trigo ou cevada; Pseudoperonospora (míldio) em várias plantas, por exemplo, P. cubensis em cucurbitáceas ou P. humili em lúpulo; Pseudopezicula tracheiphila (doença do fogo vermelho ou “rotbrenne”, anamorfo: Phialophora) em videiras; Puccinia spp. (ferrugem) em várias plantas, por exemplo, P. triticina (marrom ou ferrugem da folha), P. striiformis (ferrugem listrada ou amarela), P. hordei (ferrugem anã), P. graminis (ferrugem caules ou negra) ou P. recondita (ferrugem castanha ou das folhas) em cereais, tais como por exemplo, trigo, cevada ou centeio, P. kuehnii (ferrugem alaranjada) na cana- de-açúcar e P. asparagi nos espargos; Pyrenophora (anamorfo: Drechslera) tritici-repentis (mancha bronzeada) em trigo ou P. teres (mancha líquida) em cevada; Pyricularia spp., por exemplo, P. oryzae (teleomorfo: Magnaporthe grisea, golpe do arroz) em arroz e P. grisea em turfa e cereais; Pythium spp. (amortecimento) na turfa, arroz, milho, trigo, algodão, colza, girassol, soja, beterraba sacarina, legumes e várias outras plantas (por exemplo, P. ultimum ou P. aphanidermatum); Ramularia spp., por exemplo, R. collo-cygni (manchas foliares de Ramularia, manchas foliares fisiológicas) em cevada e R. beticola em beterraba sacarina; Rhizoctonia spp. em algodão, arroz, batatas, turfa, milho, colza, batatas, beterraba sacarina, vegetais e várias outras plantas, por exemplo, R. solani (podridão de raiz e caule) em soja, R. solani (bainha de ferrugem) em arroz ou R. cerealis (Praga de Rhizoctonia) em trigo ou cevada; Rhizopus stolonifer (bolor negro, podridão mole) em morangos, cenouras, repolho, videiras e tomates; Rhynchosporium secalis (escaldadura) em cevada, centeio e triticale; Sarocladium oryzae e S. attenuatum (podridão da bainha) no arroz; Sclerotinia spp. (podridão da haste ou mofo branco) em vegetais e culturas de campo, como colza, girassois (por exemplo, S. sclerotiorum) e soja (por exemplo, S. rolfsii ou S. sclerotiorum); Septoria spp. em várias plantas, por exemplo, S. glycines (mancha marrom) em soja, S. tritici (mancha Septoria) em trigo e S. (sin. Stagonospora) nodorum (mancha de Stagonospora) em cereais; Uncinula (sin. Erysiphe) necator (oídio, anamorfo: Oidium tuckeri) em videiras; Setospaeria spp. (ferrugem da folha) em milho (por exemplo, S. turcicum sin. Helminthosporium turcicum) e turfa; Sphacelotheca spp. (smut) em milho, (por exemplo, S. reiliana: cabeça suja), sorgo e cana-de-açúcar; Sphaerotheca fuliginea (oídio) em cucurbitáceas; Spongospora subterranea (sarna pulverulenta) em batatas e assim transmitia doenças virais; Stagonospora spp. em cereais, por exemplo, S. nodorum (mancha Stagonospora, teleomorfo: Leptosphaeria [sin. Phaeosphaeria] nodorum) em trigo; Synchytrium endobioticum em batatas (verruga de batata); Taphrina spp., por exemplo, T. deformans (doença da folha enrolada) em pêssegos e T. pruni (bolso de ameixeira) em ameixas; Thielaviopsis spp. (podridão da raiz negra) no tabaco, frutos de pomo, vegetais, soja e algodão, por exemplo, T. basicola (sin. Chalara elegans); Tilletia spp. (vulgar ou fedorento) em cereais, tais como por exemplo, T. tritici (sin. T. caries, gorgulho de trigo) e T. controversa (gorgulho anão) em trigo; Typhula incarnata (mofo cinzento) na cevada ou no trigo; Urocystis spp., por exemplo, U. occulta (ferrugem da haste) em centeio; Uromyces spp. (ferrugem) em vegetais, tais como feijões (por exemplo, U. appendiculatus sin. U. phaseoli) e beterraba sacarina (por exemplo, U. betae); Ustilago spp. (sujeira solta) em cereais (por exemplo, U. nuda e U. avaenae), milho (por exemplo, U. maydis: sujeira de milho) e cana-de-açúcar; Venturia spp. (sarna) em maçãs (por exemplo, V. inaequalis) e peras; e Verticillium spp. (murcha) em várias plantas, tais como frutas e plantas ornamentais, videiras, frutos macios, vegetais e culturas, por exemplo, V. dahliae em morangos, colza, batata e tomate.
[161] As misturas e composições da invenção, respectivamente, são também adequadas para o controle de patógenos nocivos, especialmente fungos, na proteção de produtos armazenados ou colhidos e na proteção de materiais. O termo “proteção de materiais” é para ser entendido como denotando o proteção de materiais técnicos e não vivos, tais como adesivos, colas, madeira, papel e papelão, têxteis, couro, dispersões de tinta, plásticos, lubrificantes arefecedores, fibras ou tecidos contra a infestação e destruição por microorganismos nocivos, como fungos e bactérias. Com relação à proteção da madeira e de outros materiais, a atenção especial é dada ao seguintes fungos nocivos: Ascomicetes tais como Ophiostoma spp., Ceratocystis spp., Aureobasidium pullulans, Sclerophoma spp., Chaetomium spp., Humicola spp., Petriella spp., Trichurus spp.; Basidiomicetes tais como Coniophora spp., Coriolus spp., Gloeophyllum spp., Lentinus spp., Pleurotus spp., Poria spp., Serpula spp. e Tyromyces spp., Deuteromicetos tais como Aspergillus spp., Cladosporium spp., Penicillium spp., Trichoderma spp., Alternaria spp., Paecilomyces spp. e Zigomicetes como Mucor spp., e além disso na proteção de produtos armazenados e colheita os seguintes fungos de levedura são dignos de nota: Candida spp. e Saccharomyces cerevisae.
[162] O método de tratamento de acordo com a invenção também pode ser usado no campo da proteção de produtos armazenados ou colheita contra ataque de fungos e micro-organismos. De acordo com a presente invenção, o termo “produtos armazenados” é entendido como denotando substâncias naturais de origem vegetal ou animal e suas formas processadas, que foram retiradas do ciclo de vida natural e para as quais se deseja proteção a longo prazo. Produtos armazenados de origem vegetal, tais como plantas ou partes destes, por exemplo, caules, folhas, tubérculos, sementes, frutos ou grãos, podem ser protegidos no estado recém-colhido ou em forma processada, tais como pré-seco, umidecido, triturado, moído, prensado ou torrado, processo esse que também é conhecido como tratamento pós-colheita. Também se enquadra na definição de produtos armazenados a madeira, seja na forma de madeira bruta, como madeira de construção, postes de eletricidade e barreiras, ou na forma de artigos acabados, como móveis ou objetos feitos de madeira. Produtos armazenados de origem animal são couro cru, couro, peles, cabelos e similares. As combinações de acordo com a presente invenção pode prevenir os efeitos desvantajosos tais como decaimento, descoloração ou bolor. “Produtos armazenados” é de preferência entendido como denotando substâncias naturais de origem vegetal e as suas formas processadas, mais preferencialmente frutas e suas formas processadas, tais como pomos, frutos de caroço, frutos macios e frutos cítricos e suas formas processadas.
[163] As misturas e composições de acordo com a invenção são particularmente importantes no controle de uma multiplicidade de insetos fitopatogênicos ou outras pragas (por exemplo, lepidópteros, besouros, dípteros, tripes, heterópteros, hemípteros, homópteros, térmitas, ortópteros, aracnídeos e nemátodos) em várias plantas cultivadas, tais como cereais, por exemplo, trigo, centeio, cevada, triticale, aveias ou arroz; beterraba, por exemplo, beterraba sacarina ou beterraba forrageira; frutos, tais como pomoides, frutos de caroço ou frutos moles, por exemplo, maçãs, pêras, ameixas, pêssegos, amêndoas, cerejas, morangos, framboesas, amoras ou groselhas; plantas leguminosas, tais como ervilhas, lentilhas, alfafa ou soja feijão; plantas oleaginosas, tais como colza, mostarda, azeitonas, girassois, coco, cacau, mamona, dendezeiros, amendoim ou sojas; cucurbitáceas, tais como abóboras, pepino ou melões; plantas fibrosas, tais como algodão, linho, cânhamo ou juta; frutas cítricas, tais como laranjas, limões, toranjas ou tangerinas; begetais, tais como espinafre, alface, aspargo, couves, cenouras, cebolas, tomates, batatas, cucúrbitas ou páprica; plantas lauráceas, tais como abacates, canela ou cânfora; plantas de energia e matérias-primas, tais como milho, soja, canola, cana de açúcar ou óleo de palma; milho; tabaco; nozes; co café; chá; bananas; videiras (uvas de mesa e vinhas de uva); lúpulo; turfa; plantas de borracha naturais, ou plantas ornamentais e florestais, tais como flores, arbustos, árvores de folha larga ou sempre verdes, por exemplo coníferas; e sobre o material de reprodução vegetal, tais como sementes, e o material de colheita destas plantas.
[164] De preferência, as misturas e composições inventivas são utilizadas para controlar uma multiplicidade de pragas em culturas de campo, tais como batatas, beterrabas sacarinas, tabaco, trigo, centeio, cevada, aveia, arroz, milho, algodão, soja, colza, legumes, girassol, café ou cana de açúcar; frutas; videiras; ornamentais; ou vegetais, como pepinos, tomates, feijões ou abóboras.
[165] As misturas inventivas e as suas composições, respectivamente, são particularmente adequadas para controlar os seguintes insetos nocivos da ordem dos: - lepidópteros (Lepidoptera), por exemplo Agrotis ypsilon, Agrotis segetum, Alabama argillacea, Anticarsia gemmatalis, Argyresthia conjugella, Autographa gamma, Bupalus piniarius, Cacoecia murinana, Capua reticulana, Cheimatobia brumata, Choristoneura fumiferana, Choristoneura occidentalis, Cirphis unipuncta, Cydia pomonella, Dendrolimus pini, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Earias insulana, Elasmopalpus lignosellus, Eupoecilia ambiguella, Evetria bouliana, Feltia subterranea, Galleria mellonella, Grapholitha funebrana, Grapholitha molesta, Heliothis armigera, Heliothis virescens, Heliothis zea, Hellula undalis, Hibernia defoliaria, Hyphantria cunea, Hyponomeuta malinellus, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria, Laphygma exigua, Leucoptera coffeella, Leucoptera scitella, Lithocolletis blancardella, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Lymantria monacha, Lyonetia clerkella, Malacosoma neustria, Mamestra brassicae, Orgyia pseudotsugata, Ostrinia nubilalis, Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Peridroma saucia, Phalera bucephala, Phthorimaea operculella, Phyllocnistis citrella, Pieris brassicae, Plathypena scabra, Plutella xylostella, Pseudoplusia includens, Rhyacionia frustrana, Scrobipalpula absoluta, Sitotroga cerealella, Sparganothis pilleriana, Spodoptera frugiperda, Spodoptera littoralis, Spodoptera litura, Thaumatopoea pityocampa, Tortrix viridana, Trichoplusia ni e Zeiraphera canadensis, - besouros (Coleoptera), por exemplo Agrilus sinuatus, Agriotes lineatus, Agriotes obscurus, Amphimallus solstitialis, Anisandrus dispar, Anthonomus grandis, Anthonomus pomorum, Atomaria linearis, Blastophagus piniperda, Blitophaga undata, Bruchus rufimanus, Bruchus pisorum, Bruchus lentis, Byctiscus betulae, Cassida nebulosa, Cerotoma trifurcata, Ceuthorrhynchus assimilis, Ceuthorrhynchus napi, Chaetocnema tibialis, Conoderus vespertinus, Crioceris asparagi, Diabrotica longicornis, Diabrotica speciosa, Diabrotica 12-punctata, Diabrotica virgifera, Diloboderus abderus, Epilachna varivestis, Epitrix hirtipennis, Eutinobothrus brasiliensis, Hylobius abietis, Hypera brunneipennis, Hypera postica, Ips typographus, Lema bilineata, Lema melanopus, Leptinotarsa decemlineata, Limonius californicus, Lissorhoptrus oryzophilus, Melanotus communis, Meligethes aeneus, Melolontha hippocastani, Melolontha melolontha, Oulema oryzae, Ortiorrhynchus sulcatus, Oryazophagus oryzae, Otiorrhynchus ovatus, Phaedon cochleariae, Phyllotreta chrysocephala, Phyllophaga sp., Phyllophaga cuyabana, Phyllophaga triticophaga, Phyllopertha horticola, Phyllotreta nemorum, Phyllotreta striolata, Popillia japonica, Sitona lineatus e Sitophilus granaria, - dípteros (Diptera), por exemplo Aedes aegypti, Aedes vexans, Anastrepha ludens, Anopheles maculipennis, Ceratitis capitata, Chrysomya bezziana, Chrysomya hominivorax, Chrysomya macellaria, Contarinia sorghicola, Cordylobia anthropophaga, Culex pipiens, Dacus cucurbitae, Dacus oleae, Dasineura brassicae, Fannia canicularis, Gasterophilus intestinalis, Glossina morsitans, Haematobia irritans, Haplodiplosis equestris, Hylemyia platura, Hypoderma lineata, Liriomyza sativae, Liriomyza trifolii, Lucilia caprina, Lucilia cuprina, Lucilia sericata, Lycoria pectoralis, Mayetiola destructor, Musca domestica, Muscina stabulans, Oestrus ovis, Oscinella frit, Pegomya hysocyami, Phorbia antiqua, Phorbia brassicae, Phorbia coarctata, Rhagoletis cerasi, Rhagoletis pomonella, Tabanus bovinus, Tipula oleracea e Tipula paludosa, - tripes (Thysanoptera), por exemplo, Frankliniella fusca, Frankliniella occidentalis, Frankliniella tritici, Scirtothrips citri, Thrips oryzae, Thrips palmi e Thrips tabaci, - himenópteros (Hymenoptera), por exemplo, Acromyrmex ambuguus, Acromyrmex crassispinus, Acromyrmex heiery, Acromyrmex landolti, Acromyrmex subterraneus, Athalia rosae, Atta capiguara, Atta cephalotes, Atta laevigata, Atta robusta, Atta sexdens, Atta texana, Hoplocampa minuta, Hoplocampa testudinea, Monomorium pharaonis, Solenopsis geminata e Solenopsis invicta, - heterópteros (Heteroptera), por exemplo, Acrosternum hilare, Blissus leucopterus, Cyrtopeltis notatus, Dichelops furcatus, Dysdercus cingulatus, Dysdercus intermedius, Euchistos heros, Eurygaster integriceps, Euschistus impictiventris, Leptoglossus phyllopus, Lygus lineolaris, Lygus pratensis, Nezara viridula, Piesma quadrata, Piezodorus guildini, Solubea insularis e Thyanta perditor, - Hemiptera e Homóptera, por exemplo, Acrosternum hilare, Blissus leucopterus, Cyrtopeltis notatus, Diaphorina citri, Dysdercus cingulatus, Dysdercus intermedius, Eurygaster integriceps, Euschistus impictiventris, Leptoglossus phyllopus, Lygus lineolaris, Lygus pratensis, Nezara viridula, Piesma quadrata, Solubea insularis, Thyanta perditor, Acyrthosiphon onobrychis, Adelges laricis, Aphidula nasturtii, Aphis fabae, Aphis forbesi, Aphis pomi, Aphis gossypii, Aphis grossulariae, Aphis schneideri, Aphis spiraecola, Aphis sambuci, Acyrthosiphon pisum, Aulacorthum solani, Brachycaudus cardui, Brachycaudus helichrysi, Brachycaudus persicae, Brachycaudus prunicola, Brevicoryne brassicae, Capitophorus horni, Cerosipha gossypii, Chaetosiphon fragaefolii, Cryptomyzus ribis, Dreyfusia nordmannianae, Dreyfusia piceae, Dysaphis radicola, Dysaulacorthum pseudosolani, Dysaphis plantaginea, Dysaphis pyri, Empoasca fabae, Hyalopterus pruni, Hyperomyzus lactucae, Macrosiphum avenae, Macrosiphum euphorbiae, Macrosiphon rosae, Megoura viciae, Melanaphis pyrarius, Metopolophium dirhodum, Myzodes persicae, Myzus ascalonicus, Myzus cerasi, Myzus varians, Nasonovia ribis-nigri, Nilaparvata lugens, Pemphigus bursarius, Perkinsiella saccharicida, Phorodon humuli, Psylla mali, Psylla piri, Rhopalomyzus ascalonicus, Rhopalosiphum maidis, Rhopalosiphum padi, Rhopalosiphum insertum, Sappaphis mala, Sappaphis mali, Schizaphis graminum, Schizoneura lanuginosa, Sitobion avenae, Trialeurodes vaporariorum, Toxoptera aurantiiand, Viteus vitifolii, Cimex lectularius, Cimex hemipterus, Reduvius senilis, Triatoma spp., e Arilus critatus, - cupins (Isoptera), por exemplo, Calotermes flavicollis, Cornitermes cumulans, Heterotermes tenuis, Leucotermes flavipes, Neocapritemes opacus, Procornitermes triacifer; Reticulitermes lucifugus, Syntermes molestus, e Termes natalensis, - ortópteros (Orthoptera), por exemplo, Acheta domestica, Blatta orientalis, Blattella germanica, Forficula auricularia, Gryllotalpa gryllotalpa, Locusta migratoria, Melanoplus bivittatus, Melanoplus femur-rubrum, Melanoplus mexicanus, Melanoplus sanguinipes, Melanoplus spretus, Nomadacris septemfasciata, Periplaneta americana, Schistocerca americana, Schistocerca peregrina, Stauronotus maroccanus e Tachycines asynamorus, - Arachnoidea, tais como aracnídeos, por exemplo, das famílias Argasidae, Ixodidae e Sarcoptidae, tais como Amblyomma americanum, Amblyomma variegatum, Argas persicus, Boophilus annulatus, Boophilus decoloratus, Boophilus microplus, Dermacentor silvarum, Hyalomma truncatum, Ixodes ricinus, Ixodes rubicundus, Ornithodorus moubata, Otobius megnini, Dermanyssus gallinae, Psoroptes ovis, Rhipicephalus appendiculatus, Rhipicephalus evertsi, Sarcoptes scabiei, e Eriophyidae spp. tais como Aculus schlechtendali, Phyllocoptrata oleivora e Eriophyes sheldoni; Tarsonemidae spp. tais como Phytonemus pallidus e Polyphagotarsonemus latus; Tenuipalpidae spp. tais como Brevipalpus phoenicis; Tetranychidae spp. tais como Tetranychus cinnabarinus, Tetranychus kanzawai, Tetranychus pacificus, Tetranychus telarius e Tetranychus urticae, Panonychus ulmi, Panonychus citri, e Oligonychus pratensis.
[166] Em particular, as misturas inventivas são adequadas para combater pragas das ordens Coleoptera, Lepidoptera, Thysanoptera, Homoptera, Isoptera e Orthoptera.
[167] São também adequadas para o controle dos seguintes nemátodos parasitários de plantas, tais como nemátodos de galhas, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne chitwoodi, Meloidogyne exigua, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica e other Meloidogyne species; cyst nemátodos, Globodera rostochiensis, Globodera pallida, Globodera tabacum e other Globodera species, Heterodera avenae, Heterodera glycines, Heterodera schachtii, Heterodera trifolii, e outras espécies de Heterodera; nemátodos de galhas de sementes, Anguina funesta, Anguina tritici e outras espécies de Anguina; Nemátodos de gema e foliares, Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides fragariae, Aphelenchoides ritzemabosi e outras espécies de Aphelenchoides; nemátodos da picada, Belonolaimus longicaudatus e outras espécies de Belonolaimus; nemátodos de pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus e outras espécies de Bursaphelenchus; nemátodos de anel, espécies Criconema, espécies Criconemella, espécies Criconemoides, e espécies Mesocriconema; nemátodos de caule e de bulbo, Ditylenchus destructor, Ditylenchus dipsaci, Ditylenchus myceliophagus e outras espécies de Ditylenchus; nemátodos de furúnculo, espécies de Dolichodorus; nemátodos em espiral, Helicotenchus dihystera, Helicotylenchus multicinctus e outras espécies de Helicotylenchus, Rotylenchus robustus e outras espécies de Rotylenchus; nemátodos de bainha, espécies de Hemicycliophora e espécies de Hemicriconemoides; espécies de Hirshmanniella; nemátodos da lança, Hoplolaimus columbus, Hoplolaimus galeatus e outras espécies de Hoplolaimus; nemátodos-das-galhas falsos, Nacobbus aberrans e outras espécies Nacobbus; nemátodos de agulha, Longidorus alongates e outras espécies de Longidorus; nemátodos de pino, espécies de Paratylenchus; nemátodos de lesão, Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus coffeae, Pratylenchus curvitatus, Pratylenchus goodeyi, Pratylencus neglectus, Pratylenchus penetrans, Pratylenchus scribneri, Pratylenchus vulnus, Pratylenchus zeae e outras espécies de Pratylenchus; Radinaphelenchus cocophilus e outros espécies de Radinaphelenchus; nemátodos de tocas, Radopholus similis e outras espécies de Radopholus; nemátodos reniformes, Rotylenchulus reniformis e outras espécies de Rotylenchulus; espécies de Scutellonema; nemátodos das raízes grossas, Trichodorus primitivus e outras espécies de Trichodorus; Paratrichodorus minor e outras espécies Paratrichodorus; nemátodos de acrobacia, Tylenchorhynchus claytoni, Tylenchorhynchus dubius e outras espécies de Tylenchorhynchus e espécies de Merlinius; nemátodos de cítricos, Tylenchulus semipenetrans e outras espécies de Tylenchulus; nemátodos de punhais, Xiphinema americanum, Xiphinema index, Xiphinema diversicaudatum e outras espécies Xiphinema; e outras espécies de nemátodos parasitas de plantas.
[168] Em uma forma de realização igualmente preferida, a presente invenção refere-se a um método para controlar pragas animais (insetos, ácaros ou nemátodos), em que as pragas animais (insetos, ácaros ou nemátodos), o seu habitat, locais de reprodução, o seu sítio ou as plantas a serem protegidas contra ataques de pragas animais (insetos, acarídeos ou nemátodos) são tratados com uma quantidade eficaz de uma mistura inventiva compreendendo uma linhagem de Paenibacillus como definida acima e pesticida II.
[169] Em geral, “quantidade eficaz como pesticida” significa que a quantidade das misturas da invenção ou das composições que compreendem as misturas necessárias para atingir um efeito observável sobre o crescimento, incluindo os efeitos de necrose, morte, retardamento, prevenção, e remoção, destruição ou de outra forma diminuir a ocorrência e a atividade do organismo alvo. A quantidade eficaz como pesticida pode variar para as várias misturas/ composições usadas na invenção. Uma quantidade eficaz como pesticida das composições/ misturas também irá variar de acordo com as condições prevalecentes, tais como efeito desejado pesticida e duração, clima, as espécies alvo, sítio, modo de aplicação, e semelhantes.
[170] Materiais de propagação de plantas podem ser tratados com as misturas e composições da invenção profilaticamente quer no ou antes do plantio ou transplante.
[171] Em particular, a presente invenção refere-se a um método para proteção de material de propagação de planta das pragas, em que o material de propagação de planta é tratado com uma quantidade eficaz de uma mistura da invenção.
[172] Em uma forma de realização igualmente preferida, a presente invenção refere-se a um método para a proteção de material de propagação de planta de fungos prejudiciais, em que o material de propagação de planta é tratado com uma quantidade eficaz de uma mistura da invenção.
[173] Em uma forma de realização igualmente preferida, a presente invenção refere-se a um método para melhorar a saúde de plantas, em que as plantas são tratadas com uma quantidade eficaz de uma mistura inventiva.
[174] O termo “quantidade eficaz para a saúde de planta” denota uma quantidade das misturas inventivas, que é suficiente para alcançar os efeitos na saúde da planta como definido abaixo. Para informação mais exemplificativa sobre teores, formas de aplicação e razões adequadas a serem utilizados são fornecidos abaixo. De certa forma, um técnico no assinto está bem ciente do fato de que tal quantidade pode variar em uma ampla faixa e depende de vários fatores, por exemplo, a planta ou material cultivado tratado e as condições climáticas.
[175] As plantas mais saudáveis são desejáveis, uma vez que resultam, entre outras, em melhores rendimentos e / ou melhor qualidade das plantas ou culturas, especificamente melhor qualidade das partes da planta colhidas. Plantas mais saudáveis também resistem melhor ao estresse biótico e / ou abiótico. Uma alta resistência contra stress biótico, por sua vez, permite que o técnico no assunto reduza a quantidade de pesticidas aplicada e consequentemente diminua o desenvolvimento de resistências contra os respectivos pesticidas.
[176] Foi, portanto, um objetivo da presente invenção fornecer uma composição pesticida que resolva os problemas delineados acima, e que deve, em particular, melhorar a saúde das plantas, em particular o rendimento das plantas.
[177] O termo “saúde de uma planta” ou “fitossanidade” é definido como uma condição da planta e / ou de seus produtos, que é determinada por vários aspectos isolados ou combinados entre si, como maior rendimento, vigor da planta, qualidade das partes de plantas coletadas e tolerância ao estresse abiótico e / ou biótico.
[178] Tem que ser salientado que os efeitos acima mencionados das misturas da invenção, ou seja, saúde da planta melhorada, estão também presentes quando a planta não está sob stress biótico e em particular quando a planta não está sob pressão de pragas.
[179] Para o tratamento de sementes, por exemplo como inoculante e / ou formas de aplicação foliar, é evidente que uma planta que sofre ataque de fungos ou de insetos produz uma biomassa menor e leva a um rendimento reduzido, em comparação com uma planta que tenha sido submetida a tratamento curativo ou preventivo contra o fungo patógeno ou qualquer outra praga relevante e que pode crescer sem o dano causado pelo fator de stress biótico. No entanto, os métodos de acordo com a invenção levam a uma melhor saúde das plantas mesmo na ausência de qualquer stress biótico. Isto significa que os efeitos positivos das misturas da invenção não pode ser explicada apenas pelas atividades pesticidas das linhagens bacterianas do componente 1) e do pesticida II, mas baseiam-se em outros perfis de atividade. Consequentemente, a aplicação das misturas da invenção também pode ser realizada na ausência de pressão das pragas.
[180] Cada indicador de saúde de plantas listados abaixo, que é selecionado a partir dos grupos que consiste em rendimento, vigor da planta, a qualidade e a tolerância da planta ao stress abiótico e / ou biótico, é para ser entendido como uma forma de realização preferida da presente invenção, quer cada um por conta própria ou preferencialmente em combinação um com o outro.
[181] De acordo com a presente invenção, “rendimento aumentado” de uma planta significa que o rendimento de um produto da respectiva planta é aumentado por uma quantidade mensurável sobre o rendimento do mesmo produto da planta produzida sob as mesmas condições, mas sem a aplicação da mistura inventiva.
[182] Para o tratamento de sementes, por exemplo, como inoculante e / ou as formas de aplicação foliar, o aumento do rendimento pode ser caracterizado, entre outros, pelas seguintes propriedades melhoradas da planta: aumento do peso da planta; e / ou aumento da altura das plantas; e / ou biomassa aumentada tal como maior peso fresco global (FW); e / ou aumento do número de flores por planta; e / ou maior rendimento de grãos e / ou frutos; e / ou mais mudas ou brotos laterais (ramos); e / ou folhas maiores; e / ou aumento do crescimento de brotos; e / ou aumento do teor de proteína; e / ou aumento do teor de óleo; e / ou aumento do teor de amido; e / ou aumento do teor de pigmentos; e / ou aumento do teor de clorofila (o teor de clorofila tem uma correlação positiva com a taxa de fotossíntese da planta e, por conseguinte, quanto maior o teor de clorofila, maior o rendimento de uma planta), e / ou aumento da qualidade de uma planta.
[183] “Grão” e “fruto” devem ser entendidos como qualquer produto vegetal que seja posteriormente utilizado após a colheita, por exemplo, frutas no sentido próprio, vegetais, nozes, grãos, sementes, madeira (por exemplo, no caso de plantas de silvicultura), flores (por exemplo, no caso de plantas de jardinagem, plantas ornamentais, etc., ou seja, qualquer item de valor econômico que é produzido pela planta.
[184] De acordo com a presente invenção, o rendimento é aumentado em pelo menos 4%. Em geral, o aumento do rendimento pode ser ainda maior, por exemplo 5 a 10%, mais preferível em 10a 20%, ou mesmo 20 a 30%
[185] De acordo com a presente invenção, o rendimento - se medido na ausência de pressão de praga - é aumentado em pelo menos 2%. Em geral, o aumento de rendimento pode ser ainda maior, por exemplo até 4% a 5% ou até mais.
[186] Outro indicador para a condição da planta é o vigor da planta. O vigor da planta se manifesta em vários aspectos, como a aparência visual geral.
[187] Para aplicações foliares, vigor das plantas melhorado pode ser caracterizado, entre outros, pelas seguintes propriedades melhoradas da planta: melhoria da vitalidade das plantas; e / ou melhoria do crescimento das plantas; e / ou melhoria do desenvolvimento das plantas; e / ou melhor aparência visual; e / ou melhora na firmeza das plantas (menos planta acamadas/ alojamento e / ou lâmina de folha maior, e / ou tamanho maior, e / ou aumento da altura da planta, e / ou aumento do número de brotos; e / ou aumento do número de ramos laterais; e / ou aumento do número de flores por planta e / ou aumento do crescimento da parte aérea e / ou aumento da atividade fotossintética (por exemplo, com base no aumento da condutância estomática e / ou aumento da taxa de assimilação de CO2); e / ou floração precoce; e / ou frutificação precoce; e / ou maturidade de grãos precoce; e / ou menos brotos não produtivos; e / ou menos folhas basais mortas; e / ou menor adição necessária (como fertilizantes ou água); e / ou folhas mais verdes; e / ou maturação completa em períodos curtos de vegetação; e / ou colheita mais fácil; e / ou maturação mais rápida e uniforme; e / ou maior prazo de validade; e / ou panículas mais longas; e / ou atraso da senescência; e / ou brotos mais fortes e / ou mais produtivos; e / ou melhor extração dos ingredientes; e / ou melhoria da qualidade das sementes (por serem semeadas nas safras seguintes para produção de sementes); e / ou produção reduzida de etileno e / ou a inibição da sua recepção pela planta.
[188] Outro indicador para a condição da planta é a “qualidade” de uma planta e / ou seus produtos. De acordo com a presente invenção, a qualidade melhorada significa que certas características das plantas, tais como o teor ou a composição de determinados ingredientes são aumentados ou melhorados por uma quantidade que pode ser medida ou perceptível sobre o mesmo fator da planta produzido nas mesmas condições, mas sem a aplicação das misturas da presente invenção. A qualidade melhorada pode ser caracterizada, entre outras coisas, pela melhoria das propriedades da planta ou do seu produto: aumento do teor de nutrientes; e / ou aumento do teor de proteína; e / ou aumento do teor de óleo; e / ou aumento do teor de amido; e / ou aumento do teor de ácidos graxos; e / ou aumento do teor de metabólitos; e / ou aumento do teor de carotenoides; e / ou aumento do teor de açúcar; e / ou aumento da quantidade de aminoácidos essenciais; e / ou melhor composição de nutrientes; e / ou melhor composição de proteinas; e / ou composição melhorada de ácidos graxos; e / ou composição de metabólitos melhorada; e / ou composição de carotenoide melhorada; e / ou composição de açúcar melhorada; e / ou composição melhorada de aminoácidos; e / ou cor de frutos melhorada ou ótima; e / ou cor de folha melhorada; e / ou maior capacidade de armazenamento; e / ou melhor processabilidade dos produtos colhidos.
[189] Outro indicador para a condição da planta é a tolerância ou resistência da planta a fatores de estresse bióticos e / ou abióticos. Os estresses biótico e abiótico, especialmente em períiodos mais longos, pode ter efeitos prejudiciais nas plantas.
[190] O stress biótico é causada pelos organismos vivos, enquanto ao stress abiótico, é causada por exemplo por ambientes extremos. De acordo com a presente invenção, “tolerância aumentada ou resistência a fatores de stress biótico e / ou abiótico” significa (1.) que determinados fatores negativos causados por stress biótico e / ou abiótico são diminuídos em uma quantidade mensurável ou perceptível em comparação com plantas expostas às mesmas condições, mas sem serem tratadas com uma mistura inventiva e (2.) que os efeitos negativos não são diminuídos por uma ação direta da mistura da invenção sobre os fatores de estresse, por exemplo, por sua ação fungicida ou inseticida que destroi diretamente os micro-organismos ou pragas, mas sim por uma estimulação das próprias reações defensivas das plantas contra os referidos fatores de stresse.
[191] Fatores negativos causados pelo stress biótico, tais como agentes patogênicos e pragas são amplamente conhecidos e são causados por organismos vivos, tais como plantas competidoras (por exemplo as ervas daninhas), micro-organismos (tais como fungos fitopatogênicos e / ou bactérias) e / ou vírus.
[192] Fatores negativos causados pelo estresse abiótico também são bem conhecidos e podem ser observados como vigor vegetal reduzido (ver acima), por exemplo: menor rendimento e / ou menos vigor, para ambos os exemplos de efeitos podem ser folhas queimadas, menos flores, amadurecimento prematuro, posterior maturação da colheita, valor nutricional reduzido, entre outros.
[193] O estresse abiótico pode ser causado, por exemplo, por extremos de temperatura, tais como calor ou frio (estresse por calor/ estresse por frio); e / ou fortes variações de temperatura; e / ou temperaturas incomuns para a estação específica; e / ou seca (estresse hídrico); e / ou umidade extrema; e / ou alta salinidade (estresse salino); e / ou radiação (por exemplo pelo aumento da radiação UV devido à redução da camada de ozônio); e / ou aumento dos níveis de ozônio (stress de ozônio); e / ou a poluição orgânica (por exemplo, por quantidades fitotóxicas de pesticidas); e / ou poluição inorgânica (por exemplo, por contaminantes de metais pesados).
[194] Como resultado de fatores de estresse bióticos e / ou abióticos, a quantidade e a qualidade das plantas estressadas diminuem. No que diz respeito à qualidade (conforme definido acima), o desenvolvimento reprodutivo é geralmente severamente afetado, com consequências nas culturas que são importantes para as frutas ou sementes. Síntese, acúmulo e armazenamento de proteínas são afetados principalmente pela temperatura; o crescimento é retardado por quase todos os tipos de estresse; a síntese de polissacarídeos, tanto estrutural quanto de armazenamento é reduzida ou modificada: estes efeitos resultam em uma diminuição na biomassa (rendimento) e em mudanças no valor nutricional do produto.
[195] Como apontado acima, os indicadores identificados acima para o estado de saúde de uma planta podem ser interdependentes e podem resultar um do outro. Por exemplo, um aumento da resistência a estresses bióticos e / ou abióticos pode levar a um melhor vigor das plantas, por exemplo, a colheitas melhores e maiores e, portanto, a um aumento no rendimento. Inversamente, um sistema radicular mais desenvolvido pode resultar em um aumento da resistência ao estresse biótico e / ou abiótico. No entanto, essas interdependências e interações não são conhecidas nem totalmente compreendidas e, portanto, os diferentes indicadores são descritos separadamente.
[196] Em uma forma de realização, as misturas inventivas promovem um rendimento aumentado de uma planta ou do seu produto. Em outra forma de realização, as misturas inventivas promovem um aumento do vigor de uma planta ou do seu produto. Em outra forma de realização, as misturas inventivas promovem um aumento da qualidade de uma planta ou do seu produto. Em ainda outra forma de realização as misturas da invenção promovem uma tolerância aumentada e / ou resistência de uma planta ou do seu produto contra o stress biótico. Ainda em outra forma de realização, as misturas inventivas promovem um aumento da tolerância e / ou resistência de uma planta ou do seu produto contra o stress abiótico.
[197] A invenção também se relaciona com composições agroquímicas que compreendem um auxiliar e pelo menos uma linhagem de Paenibacillus, tal como aqui definido, ou um extrato livre de células da mesma ou, pelo menos, um metabólito da mesma, e, pelo menos, um pesticida II de acordo com a invenção.
[198] Uma composição agroquímica compreende uma quantidade eficaz fungicida ou inseticida, pelo menos, uma linhagem de Paenibacillus, tal como aqui definida, ou um extrato livre de células da mesma ou, pelo menos, uma metabólito da mesma, e, pelo menos, um pesticida II. O termo “quantidade eficaz” denota uma quantidade da composição ou de pelo menos uma linhagem de Paenibacillus como aqui definida, ou um extrato livre células da mesma ou pelo menos um metabólito da mesma, e pelo menos um pesticida II, que é suficiente para promover a saúde de planta, controle de fungos nocivos ou pragas nocivas em plantas cultivadas ou na proteção de materiais e que não resulte em danos substanciais aos vegetais ou materiais tratados. Tal quantidade pode variar em uma ampla faixa e depende de vários fatores, tais como as espécies de fungos ou pragas a serem controladas, a planta ou material cultivado tratado, as condições climáticas.
[199] A pelo menos uma linhagem de Paenibacillus como aqui definida, ou um extrato livre de células da mesma ou pelo menos um metabólito da mesma, e pelo menos um pesticida II pode ser convertida em tipos habituais de composições agroquímicas, por exemplo, soluções, emulsões, suspensões, poeiras, pós, pastas, grânulos, prensas, cápsulas e misturas das mesmas. Exemplos de tipos de composição são as suspensões (por exemplo, SC, OD, FS), concentrados emulsionáveis (por exemplo, EC), emulsões (por exemplo, EW, EO, ES, ME), cápsulas (por exemplo, CS, ZC), pastas, pastilhas, pós molháveis ou poeiras (por exemplo, WP, SP, WS, DP, DS), prensados (por exemplo, BR, TB, TD), grânulos (por exemplo, WG, SG, GR, FG, GG, MG), artigos inseticidas (por exemplo, LN), bem como formulações em gel para o tratamento de materiais de propagação de plantas, tais como sementes (por exemplo, GF). Estes e outros tipos de composições são definidos no “Catalogue of pesticide formulation types e international coding system”, Monografia Técnica no. 2, 6a Ed. Maio de 2008, CropLife International.
[200] As misturas da invenção podem ser formuladas como um inoculante para uma planta. O termo “inoculante” significa uma composição que inclui uma linhagem isolada da invenção e, opcionalmente, um veículo, que pode incluir um meio biologicamente aceitável.
[201] Tais inoculantes e outras composições adequadas podem ser preparadas como composições compreendendo além dos ingredientes ativos, pelo menos um auxiliar (ingrediente inerte) por meios habituais (ver por exemplo, H.D. Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998).
[202] Para produzir uma formulação seca, as células bacterianas, preferivelmente esporos, podem ser suspensas em um veículo seco adequado (por exemplo, argila). Para produzir uma formulação líquida, as células, de preferência esporos, podem ser ressuspensas em um veículo líquido adequado (por exemplo, à base de água) para a densidade de esporos desejada. O número de densidade de esporos de esporos por ml pode ser determinado identificando o número de unidades formadoras de colônias ( CFU) em meio ágar, por exemplo ágar de dextrose de batata após incubação durante vários dias a temperaturas de cerca de 20 a cerca de 30 °C.
[203] De acordo com uma forma de realização, os componentes individuais da composição de acordo com a invenção, tais como partes de um kit ou partes de uma mistura binária ou ternária, podem ser misturados pelo próprio usuário em um tanque de pulverização ou qualquer outro tipo de recipiente utilizado para aplicações (por exemplo tambores tratador de sementes, máquinas de peletização de sementes, mochila pulverizadora) e outros auxiliares podem ser adicionados, se apropriado. Quando micro-organismos vivos, tais como as linhagens de Paenibacillus da presente invenção, fazem parte de tal kit, deve ser tomado cuidado para que a escolha e quantidades dos outros componentes do kit (por exemplo, agentes pesticidas químicos) e das outras substâncias auxiliares não deve influenciar a viabilidade dos pesticidas microbianos na composição misturada pelo usuário. Especialmente para bactericidas e solventes, a compatibilidade com o respectivo pesticida microbiano deve ser levada em conta.
[204] As linhagens de Paenibacillus, como aqui definida, caldos de cultura total, extratos livres de células, meios de cultura e / ou fusaricidinas de fórmula I, em conjunto com o pelo menos um pesticida pode ser convertido em tipos habituais de composições agroquímicas, por exemplo, soluções, emulsões, suspensões, poeiras, pós, pastas, grânulos, prensados, cápsulas, e misturas das mesmas. Exemplos de tipos de composição são as suspensões (por exemplo, SC, OD, FS), concentrados emulsionáveis (por exemplo, EC), emulsões (por exemplo, EW, EO, ES, ME), cápsulas (por exemplo, CS, ZC), pastas, pastilhas, pós molháveis ou poeiras (por exemplo, WP, SP, WS, DP, DS), prensados (por exemplo, BR, TB, DT), grânulos (por exemplo, WG, SG, GR, FG, GG, MG), artigos inseticidas (por exemplo, LN) como formulações em gel para o tratamento de materiais de propagação de plantas, tais como sementes (por exemplo, GF). Estas e outras composições tipos são definidas no “Catalogue of pesticide formulation types e international coding system”, Monografia Técnica no. 2, 6a Ed. Maio de 2008, CropLife International.
[205] As composições são preparadas de um modo conhecido, tal como descrito por Mollet e Grubemann, Tecnologia de Formulação, Wiley VCH, Weinheim, 2001; ou Knowles, New developments in crop protection product formulation, Agrow Reports DS243, T & F Informa, Londres, 2005.
[206] Auxiliares adequados são solventes, veículos líquidos, veículos ou cargas sólidas, tensoativos, dispersantes, emulsionantes, molhantes, adjuvantes, solubilizantes, melhoradores de penetração, coloides protetores, agentes de adesão, espessantes, umectantes, repelentes, atrativos, estimulantes de alimentação, compatibilizadores, bactericidas, agentes anti- congelamento, agentes anti-espuma, corantes, agentes de adesividade e aglutinantes.
[207] Solventes e veículos líquidos adequados são a água e solventes orgânicos, tais como frações de óleo mineral de médio a alto ponto de ebulição, por exemplo, querosene, óleo diesel; óleos de origem vegetal ou animal; hidrocarbonetos alifáticos, cíclicos e aromáticos, por exemplo, tolueno, parafina, tetrahidronaftaleno, naftalenos alquilados; álcoois, por exemplo etanol, propanol, butanol, álcool benzílico, ciclohexanol; glicois; DMSO; cetonas, por exemplo, ciclohexanona; ésteres, por exemplo, lactatos, carbonatos, ésteres de ácidos graxos, gama-butirolactona; ácidos graxos; fosfonatos; aminas; amidas, por exemplo N-metil pirrolidona, ácido graxo dimetil amidas; e misturas dos mesmos.
[208] Veículos ou cargas sólidos adequados são terras minerais, por exemplo, silicatos, sílica gel, talco, caolins, calcário, cal, giz, argilas, dolomita, terra de diatomáceas, bentonita, sulfato de cálcio, sulfato de magnésio, óxido de magnésio; polissacarídeos, por exemplo, celulose, amido; fertilizantes, por exemplo, sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, ureias; produtos de origem vegetal, por exemplo, farinha de cereais, farinha de casca de árvore, farinha de madeira, farinha de casca de nozes e misturas dos mesmos.
[209] Tensoativos adequados são compostos de superfície ativa, tais como tensoativos aniônicos, catiônicos, não-iônicos e anfotéricos, polímeros em bloco, polieletrólitos e misturas dos mesmos. Tais tensoativos podem ser utilizados como emulsionante, dispersante, solubilizante, molhante, melhorador de penetração, coloide protetor ou adjuvante. Exemplos de tensoativos estão listados em McCutcheon’s, Vol. 1: Emulsifiers & Detergents, McCutcheon’s Directories, Glen Rock, EUA, 2008 (International Ed. ou North American Ed.).
[210] Agentes tensoativos aniônicos adequados são alcalinos, alcalino-terrosos ou sais de amônio de sulfonatos, sulfatos, fosfatos, carboxilatos, e misturas dos mesmos. Exemplos de sulfonatos são os sulfonatos de alquilarila, sulfonatos de difenila, sulfonatos de alfa-olefina, sulfonatos de lignina, sulfonatos de ácidos graxos e óleos, sulfonatos de alquilfenois etoxilados, sulfonatos de arilfenois alcoxilados, sulfonatos de naftalenos condensados, sulfonatos de dodecil- e tridecilbenzenos, sulfonatos de naftalenos e alquil naftalenos, sulfossuccinatos ou sulfosuccinamatos. Exemplos de sulfatos são sulfatos de ácidos graxos e óleos, de alquilfenois etoxilados, de álcoois, de álcoois etoxilados, ou de ésteres de ácidos graxos. Exemplos de fosfatos são ésteres de fosfato. Exemplos de carboxilatos são alquil carboxilatos, e álcool carboxilado ou alquilfenol etoxilados.
[211] Tensoativos não iônicos adequados são alcoxilatos, amidas de ácidos graxos N-substituídos, óxidos de amina, ésteres, tensoativos à base de açúcar, tensoativos poliméricos e misturas dos mesmos. Exemplos de alcoxilatos são compostos tais como álcoois, alquilfenois, aminas, amidas, arilfenois, ácidos graxos ou ésteres de ácidos graxos que foram alcoxilados com 1 a 50 equivalentes. Óxido de etileno e / ou óxido de propileno podem ser utilizados para a alcoxilação, preferencialmente óxido de etileno. Exemplos de amidas de ácido graxo N-substituídas são glucamidas de ácido graxo ou alcanolamidas de ácido graxo. Exemplos de ésteres são ésteres de ácidos graxos, ésteres de glicerol ou monoglicerídeos. Exemplos de tensoativos à base de açúcar são sorbitanos, sorbitanos etoxilados, sacarose e ésteres de glicose ou alquilpoliglicosídeos. Exemplos de tensoativos poliméricos são os homo- ou copolímeros de vinilpirrolidona, álcoois vinílicos ou acetato de vinila.
[212] Tensoativos catiônicos adequados são tensoativos quaternários, por exemplo, compostos de amônio quaternário com um ou dois grupos hidrofóbicos, ou sais de aminas primárias de cadeia longa. Tensoativos anfotéricos adequados são alquilbetainas e imidazolinas. Polímeros em bloco adequados são polímeros em bloco do tipo A-B ou A-B-A, compreendendo blocos de óxido de polietileno e óxido de polipropileno, ou do tipo A-B-C compreendendo alcanol, óxido de polietileno e óxido de polipropileno. Polieletrólitos adequados são poliácidos ou polibases. Exemplos de poliácidos são sais alcalinos de ácido poliacrílico ou polímeros em pente de poliácido. Exemplos de polibases são polivinil aminas ou polietileno aminas.
[213] Adjuvantes adequados são compostos que têm uma atividade pesticida insignificante ou mesmo não a possuem, e que melhoram o desempenho biológico do composto I no alvo. Exemplos são surfactantes, óleos minerais ou vegetais e outros auxiliares. Outros exemplos são listados por Knowles, Adjuvants e additives, Agrow Reports DS256, T&F Informa UK, 2006, capítulo 5.
[214] Os espessantes adequados são polissacarídeos (por exemplo, goma xantana, carboximetil celulose), argilas inorgânicas (organicamente modificadas ou não modificadas), policarboxilatos, e silicatos.
[215] Bactericidas adequados são derivados de bronopol e de isotiazolinona, tais como alquilisotiazolinonas e benzisotiazolinonas.
[216] Agentes anti-congelantes adequados são etileno glicol, propileno glicol, ureia e glicerina.
[217] Agentes anti-espuma adequados são silicones, álcoois de cadeia longa e sais de ácidos graxos.
[218] Corantes adequados (por exemplo, em vermelho, azul ou verde) são pigmentos de baixa solubilidade em água e corantes solúveis em água. Exemplos são corantes inorgânicos (por exemplo, óxido de ferro, óxido de titânio, hexacianoferrato de ferro) e corantes orgânicos (por exemplo, corantes de alizarina-, azo- e ftalocianina).
[219] Agentes de adesividade ou aglutinantes adequados são polivinil pirrolidonas, polivinil acetatos, polivinil álcoois, poliacrilatos, ceras biológicas ou sintéticas e éteres de celulose.
[220] Quando micro-organismos vivos, tais como bacterianas linhagens do gênero Paenibacillus em forma de células ou esporos, formam parte de composições, tais composições podem ser preparadas como composições que compreendem além dos ingredientes ativos, pelo menos um auxiliar (ingrediente inerte) por meios usuais (ver por exemplo, H.D. Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998). Tipos habituais adequados de tais composições são suspensões, poeiras, pós, pastas, grânulos, prensados, cápsulas e misturas dos mesmos. Exemplos de tipos de composição são as suspensões (por exemplo, SC, OD, FS), cápsulas (por exemplo, CS, ZC), pastas, pastilhas, pós molháveis ou poeiras (por exemplo, WP, SP, WS, DP, DS), prensados (por exemplo, BR, TB, DT), grânulos (por exemplo, WG, SG, GR, FG, GG, MG), artigos inseticidas (por exemplo, LN) bem como formulações em gel para o tratamento de materiais de propagação de plantas, tais como sementes (por exemplo, GF). Aqui, se deve levar em consideração que cada tipo de formulação ou escolha de auxiliar não deve influenciar a viabilidade do microorganismo durante o armazenamento da composição e quando finalmente aplicado ao solo, planta ou material de propagação de planta. Formulações adequadas são, por exemplo, mencionadas em WO 2008/002371, US 6,955,912, US 5,422,107.
[221] Exemplos para auxiliares adequados são os mencionados anteriormente aqui, em que deve ser tomado cuidado para que a escolha e as quantidades de tais auxiliares não devem influenciar a viabilidade dos pesticidas microbianos na composição. Especialmente para bactericidas e solventes, a compatibilidade com o respectivo micro-organismo do respectivo pesticida microbiano tem que ser levada em conta. Além disso, composições com pesticidas microbianos podem ainda conter estabilizadores ou nutrientes e protetores UV. Estabilizadores adequados ou nutrientes são por exemplo, alfa- tocoferol, trealose, glutamato, sorbato de potássio, vários açúcares como a glicose, sacarose, lactose e maltodextrina (H.D. Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998). Protetores UV adequados são, por exemplo os compostos inorgânicos como dióxido de titânio, óxido de zinco e pigmentos de óxido de ferro ou compostos orgânicos como benzofenonas, benzotriazois e fenilltriazinas. As composições podem, além dos auxiliares mencionados para as composições aqui incluídas, compreender opcionalmente 0,1 a 80% de estabilizantes ou nutrientes e 0,1 a 10% de protetores UV.
[222] As composições agroquímicas compreendem, geralmente, entre 0,01 e 95%, de um modo preferido entre 0,1 e 90%, e em particular entre 0,5 e 75%, em peso, de substância ativa. As substâncias ativas são empregues em uma pureza de 90% a 100%, preferencialmente de 95% a 100% (de acordo com o espectro de RMN).
[223] Exemplos para tipos de composição e sua preparação são: i) Concentrados solúveis em água (SL, LS) 10) a 60% em peso de uma mistura da invenção e 5 a 15% em peso de agente molhante (por exemplo, alcoxilatos de álcool) são dissolvidos em água e / ou em um solvente solúvel em água (por exemplo, álcoois) até 100% em peso. A substância ativa dissolve-se após diluição com água; 11) Concentrados Dispersáveis (DC) 5 a 25% em peso de uma mistura da invenção e 1 a 10% em peso de dispersante (por exemplo, polivinil pirrolidona) são dissolvidos em solvente orgânico (por exemplo, ciclohexanona) até 100% em peso. A diluição com água proporciona uma dispersão; 111) Concentrados emulsionáveis (CE) 15 a 70% em peso de uma mistura da invenção e 5 a 10% em peso de emulsionantes (por exemplo, dodecilbenzenosulfonato de cálcio e etoxilato de óleo de rícino) são dissolvidos em solvente orgânico insolúvel em água (por exemplo, hidrocarboneto aromático) até 100% em peso. A diluição com água proporciona uma emulsão; iv) Emulsões (EW, EO, ES) 5 a 40% em peso de uma mistura da invenção e 1 a 10% em peso de emulsionantes (por exemplo, dodecilbenzenosulfonato de cálcio e de etoxilato de óleo de rícino) são dissolvidas em 20 a 40% em peso de solvente orgânico insolúvel em água (por exemplo, hidrocarboneto aromático). Esta mistura é introduzida em água até 100% em peso por meio de uma máquina emulsionadora e transformada em uma emulsão homogênea. A diluição com água proporciona uma emulsão; v) Suspensões (SC, OD, FS) Em um moinho de bolas agitado, 20 a 60% em peso de uma mistura da invenção é triturada com a adição de 2 a 10% em peso de dispersantes e agentes molhantes (por exemplo, lignosulfonato de sódio e álcool etoxilato), 0,1 a 2% em peso de espessante (por exemplo, goma xantana) e água até 100% em peso para dar uma suspensão fina da substância ativa. A diluição com água proporciona uma suspensão estável da substância ativa. Para composição do tipo FS, é adicionado até 40% em peso de aglutinante (por exemplo, álcool polivinílico); vi) Grânulos dispersíveis em água e grânulos solúveis em água (WG, SG) 50 a 80% em peso de uma mistura da invenção é finamente moída com adição de dispersantes e agentes molhantes (por exemplo, lignosulfonato de sódio e álcool etoxilado) até 100% em peso e preparados na forma de grânulos dispersíveis em água ou solúveis em água por meio de aparelhos técnicos (por exemplo, extrusão, torre de pulverização, leito fluidizado). A diluição com água proporciona uma dispersão ou solução estável da substância ativa; vii) Pós dispersíveis em água e pós solúveis em água (WP, SP, WS) 50 a 80% em peso de uma mistura da invenção é moída em um moinho de rotor-estator com adição de 1 a 5% em peso de dispersantes (por exemplo, lignossulfonato de sódio), 1 a 3% em peso de agentes molhantes (por exemplo, álcool etoxilado) e veículo sólido (por exemplo, sílica gel) até 100% em peso. A diluição com água proporciona uma dispersão ou solução estável da substância ativa; viii) Gel (GW, GF) Em um moinho de bolas agitado, 5 a 25% em peso de uma mistura da invenção é triturada com a adição de 3 a 10% em peso de dispersantes (por exemplo, lignossulfonato de sódio), 1 a 5% em peso de espessante (por exemplo, carboximetil celulose) e água até 100% em peso para proporcionar uma suspensão fina da substância ativa. A diluição com água proporciona uma suspensão estável da substância ativa; ix) Microemulsion (ME) 5 a 20% em peso de uma mistura da invenção são adicionados a uma mistura de 5 a 30% em peso de uma mistura de solvente orgânico (por exemplo dimetilamida de ácido graxo e ciclohexanona), 10a 25% em peso de mistura de tensoativo (por exemplo álcool etoxilado e arilfenol etoxilato) e água até 100%. Esta mistura é agitada durante 1 hora para produzir espontaneamente uma microemulsão termodinamicamente estável; x) Microcápsulas (CS) Uma fase oleosa que compreende 5 a 50% em peso de uma mistura da invenção, 0 a 40% em peso de solvente orgânico insolúvel em água (por exemplo, hidrocarboneto aromático), 2 a 15% em peso de monômeros acrílicos (por exemplo, metilmetacrilato, ácido metacrílico e um di- ou triacrilato) são dispersos em uma solução aquosa de um coloide protetor (por exemplo, álcool polivinílico). A polimerização radical iniciada por um iniciador de radical resulta na formação de microcápsulas de poli(met) acrilato; Alternativamente, uma fase oleosa compreendendo 5 a 50% em peso de um caldo de cultura total, extrato livre de células, meio de cultura ou metabólito da invenção, 0 a 40% em peso de solvente orgânico insolúvel em água (por exemplo, hidrocarboneto aromático) e um monômero de isocianato (por exemplo, difenilmeteno-4,4’-diisocianato) são dispersos em uma solução aquosa de um coloide protetor (por exemplo, álcool polivinílico). A adição de uma poliamina (por exemplo, hexametilenodiamina) resulta na formação de microcápsulas de poliureia. O teor de monômetos a 1 a 10% em peso. As % em peso referem-se à composição total da composição CS; xi) Pós Empoeiráveis (DP, DS) 1 a 10% em peso de um caldo de cultura total, extrato livre de células, meio de cultura ou metabólito da invenção são moídos finamente e misturados intimamente com um veículo sólido (por exemplo, caolin finamente dividido) até 100% em peso; xii) Grânulos (GR, FG) 0,5 a 30% em peso de um caldo de cultura total, extrato livre de células, meio de cultura ou metabólito da invenção são moídos finamente e associado ao veículo sólido (por exemplo, silicato) até 100% em peso. A granulação é alcançada por extrusão, secagem por pulverização ou leito fluidizado;e xiii) Líquidos de volume ultrabaixo (UL) 1 a 50% em peso de um caldo de cultura total, extrato livre de células, meio de cultura ou metabólito da invenção são dissolvidos em solvente orgânico (por exemplo, hidrocarboneto aromático) até 100% em peso.
[224] As composições dos tipos i) a xiii) podem opcionalmente compreender outros auxiliares, tais como 0,1 a 1% em peso de bactericidas, 5 a 15% em peso de agentes anti-congelantes, 0,1 a 1% em peso de agentes anti- espumantes, e 0,1 a 1% em peso de corantes.
[225] Soluções para tratamento de sementes (LS), suspoemulsões (SE), concentrados fluidos (FS), pós para tratamento a seco (DS), pós dispersíveis em água para tratamento de lama (WS), pós solúveis em água (SS), emulsões (ES), os concentrados emulsionáveis (EC) e os géis (GF) são normalmente utilizados para fins de tratamento de materiais de propagação de plantas, particularmente sementes.
[226] Exemplos preferidos de tipos de formulação de tratamento de sementes ou aplicação em solo para composições de pré-mistura são de tipo WS, LS, ES, FS, WG ou CS.
[227] Tipicamente, uma formulação de pré-mistura para aplicação de tratamento de sementes compreende 0,5 a 99,9 por cento, especialmente 1 a 95 por cento, dos ingredientes desejados e 99,5 a 0,1 por cento, especialmente 99 a 5 por cento, de um adjuvante sólido ou líquido (incluindo, por exemplo, um solvente tal como a água), em que os auxiliares podem ser um agente tensoativo em uma quantidade de 0 a 50 por cento, especialmente 0,5 a 40 por cento, com base na formulação pré-mistura. Enquanto os produtos comerciais serão preferencialmente formulados como concentrados (por exemplo, composição pré-mistura (formulação)), o usuário final normalmente empregará formulações diluídas (por exemplo, composição de mistura de tanque).
[228] Métodos de tratamento de sementes para aplicar ou tratar as linhagens, caldos de cultura total, extratos livres de células, meios de cultura, fusaricidinas de fórmula I e composições da invenção, respectivamente, para material de propagação de plantas, especialmente sementes, são conhecidas na técnica e incluem métodos de aplicação de cobertura, revestimento, peliculação, peletização e imersão do material de propagação. Tais métodos são também aplicáveis às combinações de acordo com a invenção. Em uma forma de realização preferida, as misturas e composições da invenção, respectivamente, são aplicadas ou tratadas no material de propagação de planta por um método de tal forma que a germinação não é impactada negativamente. Por conseguinte, exemplos de métodos adequados para aplicar (ou tratar) um material de propagação de plantas, tal como uma semente, são a cobertura de sementes, o revestimento de sementes ou a peletização de sementes e semelhantes.
[229] É preferível que o material de propagação de plantas seja uma semente, um pedaço de semente (isto é, pedúnculo) ou um bulbo de sementes.
[230] Embora se acredite que o presente método possa ser aplicado a uma semente em qualquer estado fisiológico, é preferível que a semente esteja em um estado suficientemente durável que não incorra em danos durante o processo de tratamento. Tipicamente, a semente seria uma semente que foi colhida do campo; removido da planta; e separada de qualquer espiga, caule, casca exterior e polpa circundante ou outro material vegetal sem sementes. A semente seria preferencialmente também biologicamente estável, na medida em que o tratamento não causaria danos biológicos à semente. Acredita-se que o tratamento pode ser aplicado à semente a qualquer momento entre a colheita da semente e a semeadura da semente ou durante o processo de semeadura (aplicações direcionadas à semente). A semente também pode ser preparada antes ou depois do tratamento.
[231] A distribuição uniforme dos ingredientes nas misturas e composições da invenção, respectivamente, e a sua aderência às sementes é desejada durante o tratamento do material de propagação. O tratamento pode variar de uma película fina (cobertura) da formulação contendo a combinação, por exemplo, uma mistura de ingrediente(s) ativo(s), em um material de propagação de planta, como uma semente, onde o tamanho original e / ou forma são reconhecíveis a um estado intermediário (tal como um revestimento) e depois a uma película mais espessa (tal como peletizar com muitas camadas de diferentes materiais (tais como veículos, por exemplo, argilas; formulações diferentes, tais como outros ingredientes ativos; polímeros; e corantes) onde a forma original e / ou tamanho da semente não é mais reconhecível.
[232] Um aspecto da presente invenção inclui a aplicação das misturas e composições da invenção, respectivamente, sobre o material de propagação de plantas de um modo direcionado, incluindo o posicionamento dos ingredientes na combinação sobre todo o material de propagação de plantas ou em apenas partes do mesmo, incluindo em apenas um único lado ou parte de um único lado. Um técnico no assunto entenderá estes métodos de aplicação a partir da descrição fornecida nos documentos EP 0 954 213B1 e WO 06/112700.
[233] As linhagens, os caldos de cultura total, extratos livres de células, meios de cultura, fusaricidinas de fórmula I e composições da invenção, respectivamente, também podem ser utilizados na forma de uma “pílula” ou “pélete” ou um substrato adequado e colocado, ou semeado, a pílula ou substrato tratado, junto a um material de propagação de plantas. Tais técnicas são conhecidas na arte anterior, particularmente em EP 1 124 414, WO 07/67042 e WO 07/67044. Aplicação das linhagens, caldos de cultura total, extratos livres de células, meios de cultura, fusaricidinas de fórmula I e composições, respectivamente, aqui descritas sobre o material de propagação de plantas também inclui a proteção do material de propagação de plantas tratado com a combinação da presente invenção colocando uma ou mais partículas contendo pesticida junto a uma semente tratada com pesticida, em que a quantidade de pesticida é tal que a semente tratada com pesticida e as partículas que contêm pesticidas, em conjunto, contêm uma dose eficaz do pesticida e a dose de pesticida contido na semente tratada com pesticida é menos do que ou igual a dose máxima não fitotóxica do pesticida. Tais técnicas são conhecidas na técnica, particularmente no documento WO 2005/120226.
[234] Aplicação das linhagens, caldos de cultura total, extratos livres de células, meios de cultura, fusaricidinas de fórmula I e composições da invenção, respectivamente, sobre a semente também inclui revestimentos de liberação controlada nas sementes, em que os ingredientes das combinações são incorporados em materiais que liberam os ingredientes ao longo do tempo. Exemplos de tecnologias de tratamento de sementes de liberação controlada são geralmente conhecidas na técnica e incluem películas poliméricas, ceras ou outros revestimentos de sementes, em que os ingredientes podem ser incorporados no material de liberação controlada ou aplicados entre camadas de materiais, ou ambos.
[235] A semente pode ser tratada aplicando-lhe as misturas e composições da invenção, respectivamente, em qualquer sequência desejada ou simultaneamente.
[236] O tratamento de sementes ocorre a uma semente não semeada, e o termo “semente não semeada” pretende incluir sementes em qualquer período entre a colheita da semente e a semeadura da semente no solo para efeitos de germinação e crescimento da planta.
[237] O tratamento para uma semente não semeada não inclui aquelas práticas nas quais o ingrediente ativo é aplicado ao solo, mas incluiria qualquer prática de aplicação que visasse a semente durante o processo de plantio.
[238] De preferência, o tratamento ocorre antes da semeadura da semente, de modo a que a semente semeada tenha sido pré-tratada com as misturas e composições da invenção, respectivamente. Em particular, o revestimento de sementes ou a peletização de sementes são os preferidos. Como resultado do tratamento, os ingredientes são aderidos à semente e, portanto, disponíveis para o controle de pragas.
[239] As sementes tratadas podem ser armazenadas, manuseadas, semeadas e cultivadas da mesma maneira que qualquer outra semente tratada com ingredientes ativos.
[240] Em particular, a presente invenção refere-se a um método para proteção de material de propagação de plantas contra pragas, fungos nocivos e / ou melhoria da saúde das plantas cultivadas a partir do referido material de propagação, em que o solo, onde o material de propagação de plantas é semeado, é tratado com uma quantidade eficaz de uma mistura ou composição da invenção, respectivamente.
[241] O usuário aplica as composições da invenção usualmente a partir de um dispositivo de pré-dosagem, um pulverizador de mochila, um tanque de pulverização, um avião de pulverização ou um sistema de irrigação. Usualmente, a composição agroquímica é preparada com água, tampão e / ou outros auxiliares para a concentração de aplicação desejada e o licor de pulverização pronto para uso ou a composição agroquímica de acordo com a invenção é assim obtida. Usualmente, 20 a 2000 litros, de preferência 50 a 400 litros, do licor de pulverização pronto para uso são aplicados por hectare de área útil agrícola.
[242] Quando se trata do tratamento de material de propagação de plantas, especialmente sementes, as composições aqui descritas fornecem, após diluição de duas a dez vezes, concentrações de componentes ativos de 0,01 a 60% em peso, preferivelmente de 0,1 a 40%, nas preparações prontas para uso. A aplicação pode ser realizada antes ou durante a semeadura. Os métodos para aplicar uma linhagem, um extrato livre de células, meio de cultura, metabólito ou composição da invenção, respectivamente, sobre material de propagação de plantas, especialmente sementes, incluem métodos de aplicação de cobertura, revestimento, peletização, empoeiramento e aplicação em sulco em material de propagação de plantas. De preferência, as linhagens, caldos de cultura total, extratos livres de células, meios de cultura, fusaricidinas de fórmula I ou composições da invenção, respectivamente, são aplicados sobre o material de propagação de plantas por um método tal que a germinação não é induzida, por exemplo, por cobertura, peletização, revestimento e empoeiramento de sementes.
[243] Quando as linhagens bacterianas são empregues na proteção de culturas, em que as linhagens são aplicadas como tratamento foliar ou no solo, as taxas de aplicação variam geralmente de cerca de 1 x 106 a 5 x 1016 (ou mais) CFU/ha, de preferência de cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x 1016 CFU/ha, ainda mais preferencialmente de 1 x 1012 a 5 x 1015 CFU/ha.
[244] Quando as linhagens da invenção são empregues no tratamento de sementes, as taxas de aplicação em relação ao material de propagação de plantas variam geralmente de cerca de 1 x 101 a 1 x 1012 (ou mais) CFU/semente, preferivelmente de cerca de 1 x 103 a cerca de 1 x 1010 CFU/semente, e ainda mais preferivelmente de cerca de 1 x 103 a cerca de 1 x 106 CFU/semente. Alternativamente, as taxas de aplicação em relação ao material de propagação de planta variam preferencialmente de cerca de 1 x 107 a 1 x 1016 (ou mais) CFU por 100 kg de semente, preferivelmente de 1 x 109 a cerca de 1 x 1015 CFU por 100 kg de semente, ainda mais preferencialmente de 1 x 1011 a cerca de 1 x 1015 CFU por 100 kg de semente.
[245] Quando extratos livres de células, meios de cultura e / ou metabólitos, tais como fusaricidinas de fórmula I são empregues, o material sólido (matéria seca) é considerado como componente ativo, por exemplo para ser obtido após secagem ou evaporação do meio de extração ou meio de suspensão no caso de formulações líquidas. Quando empregues em proteção de planta, as quantidades de componentes ativos aplicadas são, dependendo do tipo de efeito desejado, de 0,001 a 2 kg por ha, preferivelmente de 0,005 a 2 kg por ha, mais preferivelmente de 0,05 a 0,9 kg por ha, e em particular de 0,1 a 0,75 kg por ha. No tratamento de materiais de propagação de plantas tais como sementes, por exemplo, por pulverização, revestimento ou imersão de sementes, quantidades de componentes ativos de 0,1 a 1000 g, preferencialmente de 1 a 1000 g, mais preferencialmente de 1 a 100 g e mais preferivelmente de 5 a 100 g, por 100 kg de material de propagação de plantas (de preferência sementes) são geralmente necessários. Quando utilizado na proteção de materiais ou produtos armazenados, a quantidade de componentes ativos aplicados depende do tipo de área de aplicação e do efeito desejado. As quantidades habitualmente aplicadas na proteção de materiais são de 0,001 g a 2 kg, de preferência 0,005 g a 1 kg, de componentes ativos por metro cúbico de material tratado.
[246] De acordo com uma forma de realização, os componentes individuais da composição da invenção, tais como partes de um kit ou partes de uma mistura binária ou ternária, podem ser misturados pelo próprio usuário em um tanque de pulverização ou qualquer outro tipo de recipiente utilizado para aplicações (por exemplo, tambores de tratamento de sementes, máquinas de peletização de sementes, pulverizador de mochila) e outros auxiliares podem ser adicionados, se apropriado.
[247] Se os micro-organismos vivos, tais como as linhagens bacterianas do gênero Paenibacillus, fizerem parte desse kit, se deve ter o cuidado de que a escolha e as quantidades dos componentes (por exemplo, agentes químicos pesticidas) e os auxiliares adicionais não influenciem a viabilidade dos micro-organismos na composição misturados pelo usuário. Especialmente para bactericidas e solventes, a compatibilidade com os respectivos micro-organismos deve ser levada em conta.
[248] Consequentemente, uma forma de realização da invenção é um kit para preparar uma composição pesticida utilizável, o kit compreendendo a) uma composição compreendendo o componente 1) como aqui definido e pelo menos um auxiliar; e b) uma composição compreendendo o componente 2) como aqui definido e pelo menos um auxiliar; e opcionalmente c) uma composição compreendendo pelo menos um componente auxiliar adicional e opcionalmente um componente ativo adicional 3) como aqui definido.
[249] Vários tipos de óleos, agentes molhantes, adjuvantes, fertilizantes ou micronutrientes e outros pesticidas (por exemplo, herbicidas, inseticidas, fungicidas, reguladores de crescimento, protetores, biopesticidas) podem ser adicionados às linhagens, extratos sem células, meio de cultura, metabólitos, fusaricidinas de fórmula I e composição da invenção, respectivamente como pré-mistura ou, se apropriado, não até imediatamente antes da utilização (mistura de tanque). Estes agentes podem ser misturados com as composições de acordo com a invenção em uma razão em peso de 1: 100 a 100: 1, preferivelmente 1:10 a 10: 1. De um modo preferido, uma composição da invenção compreende um biopesticida adicional. Ainda mais preferencialmente, uma composição da invenção compreende, além de um auxiliar e pelo menos uma fusaricidinas de fórmula I, um pesticida microbiano.
[250] Um pesticida é geralmente um agente químico ou biológico (como um vírus, bactéria, antimicrobiano ou desinfetante) que, por meio de seu efeito, impede, incapacita, mata ou de outra forma desencoraja pragas. As pragas alvo podem incluir insetos, patógenos de plantas, ervas daninhas, moluscos, aves, mamíferos, peixes, nemátodos (vermes redondos) e micróbios que destroem propriedades, causam incômodos, disseminam doenças ou são vetores de doenças. O termo pesticidas inclui também reguladores de crescimento de plantas que alteram o crescimento, a floração ou a taxa de reprodução esperada das plantas; desfolhantes que fazem com que folhas ou outras folhas caiam de uma planta, geralmente para facilitar a colheita; dessecantes que promovem a secagem de tecidos vivos, tais como ápices indesejados de plantas; ativadores de plantas que ativam a fisiologia das plantas para defesa contra certas pragas; protetores que reduzem a ação herbicida indesejada de pesticidas em plantas cultivadas; e promotores de crescimento de plantas que afetam a fisiologia das plantas para aumentar o crescimento das plantas, biomassa, rendimento ou qualquer outro parâmetro de qualidade dos produtos que podem ser colhidos de uma planta de cultura.
[251] Aplicando pelo menos uma linhagem de Paenibacillus como definida em qualquer uma das formas de realização preferidas acima, ou o meio de cultura ou um extrato livre de células da mesma ou pelo menos um metabólito da mesma em conjunto com pelo menos um pesticida II dos grupos A) a N) um efeito sinérgico pode ser obtido, ou seja, mais do que a simples adição dos efeitos individuais é obtida (misturas sinérgicas).
[252] De acordo com uma forma de realização, as misturas compreendem o componente 1) e o componente 2) em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[253] O termo “efeito sinérgico” é entendido como referindo-se em particular àquele definido pela fórmula de Colby (Colby, S. R., “Calculating synergistic e antagonistic responses of herbicide combinations”, Weeds, 15, pp. 20-22, 1967).
[254] O termo “efeito sinérgico” também é entendido como referindo-se àquele definido pela aplicação do método de Tammes, (Tammes, PML, “Isoboles, a graphic representation of synergism in pesticides”, Netherl. J. Plant Pathol. 70, 1964).
[255] Isto pode ser obtido aplicando pelo menos uma linhagem de Paenibacillus, como definida em qualquer uma das formas de realização preferidas acima, ou o meio de cultura ou um extrato livre de células ou pelo menos um metabólito da mesma e pelo menos um pesticida II simultaneamente, quer conjuntamente (por exemplo, como mistura de tanque) ou separadamente, ou em sucessão, em que o intervalo de tempo entre as aplicações individuais é selecionado para assegurar que a substância ativa aplicada em primeiro lugar ainda ocorre no sítio de ação em uma quantidade suficiente no momento da aplicação da(s) ativa(s) substância(s) adicional(is). A ordem de aplicação não é essencial para o trabalho da presente invenção.
[256] Ao aplicar uma linhagem de Paenibacillus tal como definida em qualquer uma das formas de realização preferidas acima, ou o meio de cultura ou um extrato livre de células ou um metabólito da mesma e um pesticida II sequencialmente, o tempo entre ambas as aplicações podem variar, por exemplo, entre 2 horas a 7 dias. Também é possível uma variação mais ampla que varia de 0,25 hora a 30 dias, preferencialmente de 0,5 hora a 14 dias, particularmente de 1 hora a 7 dias ou de 1,5 horas a 5 dias, e ainda mais preferidos de 2 horas a 1 dia. É preferível que o pesticida II seja aplicado como primeiro tratamento.
[257] As razões de peso total de composições compreendendo pelo menos um pesticida microbiano na forma de células microbianas viáveis incluindo formas dormentes, podem ser determinadas usando a quantidade de CFU do micro-organismo específico para calcular o peso total do respectivo componente ativo com o seguinte equação que 1 x 1010 CFU é igual a um grama de peso total do respectivo componente ativo. Unidade formadora de colônia é a medida de células microbianas viáveis, em particular células fúngicas e bacterianas.
[258] Nas misturas e composições de acordo com a invenção, a razão em peso do componente 1) e do componente 2) depende geralmente das propriedades dos componentes ativos utilizados, normalmente está na faixa de 1: 10.000 a 10.000: 1, frequentemente encontra-se na faixa de 1: 100 a 100: 1, regularmente na faixa de 1: 50 a 50: 1, preferivelmente na faixa de 1: 20 a 20: 1, mais preferencialmente na faixa de 1: 10 a 10: 1, ainda mais preferencialmente na faixa de 1: 4 a 4: 1 e em particular na faixa de 1: 2 a 2: 1.
[259] De acordo com outras formas de realização das misturas e composições, a razão em peso do componente 1) e do componente 2) situa-se geralmente entre 1000: 1 e 1: 1, frequentemente na faixa de 100: 1 a 1: 1, regularmente na faixa de 50: 1 a 1: 1, preferivelmente na faixa de 20: 1 a 1: 1, mais preferencialmente na faixa de 10: 1 a 1: 1, ainda mais preferencialmente na faixa de 4: 1 a 1: 1 e, em particular, na faixa de 2: 1 a 1: 1.
[260] De acordo com outras formas de realização das misturas e composições, a razão em peso do componente 1) e do componente 2) situa-se habitualmente na faixa de 20.000: 1 a 1: 10, frequentemente na faixa de 10.000: 1 a 1: 1, regularmente na faixa de 5.000: 1 a 5: 1, preferencialmente na faixa de 5.000: 1 a 10: 1, mais preferencialmente na faixa de 2.000: 1 a 30: 1, ainda mais preferencialmente na faixa de 2.000: 1 a 100: 1 e, em particular, na faixa de 1.000: 1 a 100: 1.
[261] De acordo com outras formas de realização das misturas e composições, a razão em peso do componente 1) e do componente 2) situa-se normalmente na faixa de 1: 1 a 1: 1000, muitas vezes na faixa de 1: 1 a 1: 100, regularmente na faixa de 1: 1 a 1: 50, preferivelmente na faixa de 1: 1 a 1: 20, mais preferencialmente na faixa de 1: 1 a 1: 10, ainda mais preferencialmente na faixa de 1: 1 a 1: 4 e, em particular, na faixa de 1: 1 a 1: 2.
[262] De acordo com outras formas de realização das misturas e composições, a razão em peso do componente 1) e do componente 2) está geralmente na faixa de 10: 1 a 1: 20.000, frequentemente na faixa de 1: 1 a 1: 10.000, regularmente na faixa de 1: 5 a 1: 5.000, preferivelmente na faixa de 1: 10 a 1: 5.000, mais preferencialmente na faixa de 1: 30 a 1: 2.000, ainda mais preferencialmente na faixa de 1: 100 a 1: 2000 e, em particular, na faixa de 1: 100 a 1: 1000.
[263] As misturas e composições das mesmas de acordo com a invenção podem, na forma de utilização como fungicidas e / ou inseticidas, também estar presentes em conjunto com outras substâncias ativas, por exemplo, com herbicidas, inseticidas, reguladores de crescimento, fungicidas ou ainda com fertilizantes, como pré-mistura ou, se apropriado, não até imediatamente antes do uso (mistura de tanque).
[264] Misturar as misturas binárias da invenção ou as composições compreendendo-as com outros fungicidas i resulta em muitos casos, em uma expansão do espectro fungicida da atividade ou em uma prevenção do desenvolvimento de resistência a fungicidas. Além disso, em muitos casos, efeitos sinérgicos são obtidos.
[265] Misturar as misturas binárias da invenção ou as composições compreendendo-as com outros inseticidas resulta em muitos casos, em uma expansão do espectro inseticida de atividade ou em uma prevenção do desenvolvimento da resistência aos inseticidas. Além disso, em muitos casos, efeitos sinérgicos são obtidos.
[266] De acordo com a presente invenção, pode ser preferível que as misturas e composições que as compreendem, compreendam além de pelo menos uma linhagem de Paenibacillus, como definida em qualquer uma das formas de realização preferidas acima, ou o meio de cultura ou um seu extrato livre de células ou pelo menos um metabólito da mesma (componente 1) e um pesticida II (componente 2), e como componente 3) um outro pesticida, preferencialmente em uma quantidade sinergicamente eficaz. Outra forma de realização refere-se a misturas em que o componente 3) é um pesticida III selecionado a partir dos grupos SF) e SI), como definidos abaixo, desde que em cada uma destas misturas ternárias o pesticida III seja diferente do pesticida II escolhido. Estas misturas ternárias são especialmente adequadas para o tratamento de materiais de propagação de plantas (isto é, tratamento de sementes).
[267] A seguinte lista de pesticidas III, em conjunto com a qual as misturas binárias de acordo com a invenção podem ser usadas, destina-se a ilustrar as possíveis combinações, mas não as limita ela: SF) Fungicidas - inibidores de complexo III no sítio de Q0 selecionados a partir de: piraclostrobina, azoxistrobina, picoxistrobina, trifloxistrobina, dimoxistrobina, enestroburina, fenaminstrobina, fluoxastrobina, cresoxime-metila, mandestrobina, metominostrobina, orisastrobina, pirametostrobina, pyraoxistrobina; - inibidores de piridina e pirazole de largo espectro do complexo II selecionados a partir de: fluxapiroxade, boscalide, benzovindiflupir, penflufen, pentiopirid, sedaxano, fluopirame, bixafen, isopirazam; - Inibidores específicos dos basidiomicetes do complexo II selecionados a partir de: carboxina, benodanil, fenfuram, flutolanil, furametpir, mepronil, oxicarboxina, tifluzamida; - Inibidor da produção de ATP: silthiofam; - compostos fungicidas azol selecionados a partir de: ipconazol, difenoconazol, protioconazol, procloraz, triticonazol, flutriafol, ciproconazol, diniconazol, diniconazol-M, fluquinconazol, flusilazol, hexaconazol, imazalil, imibenconazol, metconazol, miclobutanil, simeconazol, tebuconazol, triadimenol, uniconazol, tiabendazol; - fungicidas de Oomicetes selecionados de: oxathiapiprolin, valifenalate, metalaxil, metalaxil-M, etaboxam, dimetomorf, zoxamida, flumorfe, mandipropamid, pirimorf, bentiavalicarb, iprovalicarb; - inibidor de MAP/ histidina quinase: fludioxonil; - compostos de benzimidazol selecionados a partir de: tiofanato-metila, carbendazim; - compostos de ditiocarbamato selecionados a partir de: tirame, zirame; SI) Inseticidas - compostos antagonistas de GABA selecionados a partir de: fipronil, etiprole, vaniliprole, pirafluprole, piriprole, ácido 5-amino-1-(2,6-dicloro- 4-metil-fenil)-4-sulfinamoil-1H-pirazole-3-carbotioico amida; - inibidores do receptor de rianodina específicos para lepidópteros selecionados a partir de: clorantraniliprole e flubendiamida; - inibidor do receptor de rianodina de espectro cruzado: ciantraniliprole; - moduladores do canal de sódio piretroide selecionados a partir de: teflutrina, bifentrina, cipermetrina, alfa-cipermetrina, ciflutrina, beta- ciflutrina, lambda-cialotrina, deltametrina, esfenvalerato, etofenprox, fenvalerato, flucitrinato, permetrina; - compostos neonicotinoides sistemicamente ativos: clotianidina, imidaclopride, tiametoxam, dinotefurano, acetamipride, flupiradifurona, tiaclopride, triflumezopirim, nitenpiram; - Inibidores da acetilcolinesterase, ativadores dos canais de cloreto e sulfoximinas: sulfoxaflor, acefato, clorpirifos, tiodicarbe, abamectina, espinosade; - outro inseticida: tioxazafen. Mais preferencialmente, os pesticidas III são selecionados dos seguintes grupos SF) e SI): SF) Fungicidas - azoxistrobina, trifloxistrobina, picoxistrobina, piraclostrobins, sedaxane, pentiopirad, penflufen, fluopiram, fluxapiroxad, boscalid, oxatiapiprolin, metalaxil, metalaxil-M, e taboxam, dimetomorf, valifenalato, ciproconazole, cifenoconazol, protioconazole, flutriafol, tiabendazole, ipconazole, tebuconazole, triadimenol, procloraz, fluquinconazole, triticonazole, fludioxinil, carboxina, siltiofam, ziram, tirame, carbendazim, tiofanato-metila; SI) Inseticidas fipronil, clotianidin, tiametoxam, acetamiprid, dinotefurano, imidaclopride, tiaclopride, sulfoxaflor, metiocarbe, teflutrina, bifentrina, cipermetrina, alfa-cipermetrina, spinosade, clorantraniliprole, ciantraniliprole, tiodicarbe, triflumezopirim, acefato, clorpirifos, flupiradifurone, abamectina, tioxazafen. EXEMPLOS
[268] A presente invenção será descrita em maior detalhe por meio dos exemplos seguintes. Os exemplos seguintes são para fins ilustrativos e não pretendem limitar o escopo da invenção.
EXEMPLOS RELATIVOS ÀS LINHAGENS DE PAENIBACILLUS E AOS METABÓLITOS DA MESMA EXEMPLO 1: ISOLAMENTO DE LINHAGENS DE PAENIBACILLUS
[269] Amostras de solo de uma variedade de locais europeus, incluindo a Alemanha, foram coletadas. Aplicando procedimentos de isolamento microbiano comumente conhecidos a estes solos, os inventores obtiveram uma variedade de bactérias que foram ainda submetidas a técnicas de isolamento convencionais para proporcionar isolados puros como aqui descrito.
[270] Técnica padrão de enriquecimento microbiano (C. A. Reddy, T. J. Beveridge, J. A. Breznak, G. A. Marzluf, T. M. Schmidt e L. R. Snyder (eds.). Methods for General e Molecular Microbiology, Am. Soc. Microbiol., Washington, Distrito de Columbia) para isolar cada tipo de bactéria.
[271] As seguintes linhagens foram isoladas e depositadas sob o Tratado de Budapeste com o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) em 20 de fevereiro de 2013: a) Lu16774 conforme depositada na DSMZ com o número de depósito DSM 26969 b) Lu17007 como depositada na DSMZ com o número de depósito DSM 26970 c) Lu17015 como depositada na DSMZ com o número de depósito DSM 26971.
EXEMPLO 2 - CARACTERIZAÇÃO DE LINHAGENS DE PAENIBACILLUS EXEMPLO 2.1: SEQUENCIAMENTO DE RDNA 16S
[272] As sequências do gene rRNA 16S das linhagens de Paenibacillus foram determinadas por sequenciamento direto de rDNA 16S amplificado por PCR na DSMZ, Braunschweig, Alemanha.
[273] A extração do DNA genômico foi realizada utilizando o Kit de Purificação de DNA Gram Positivo MasterPureTM da Epicenter Biotechnologies, de acordo com as instruções do fabricante. A amplificação mediada por PCR do DNAr 16S e a purificação do produto de PCR foi realizada como descrito anteriormente (Int. J. Syst. Bacteriol. 46, 1088-1092, 1996). Os produtos de PCR purificados foram sequenciados utilizando o kit de sequenciamento Big Die® Terminator v1.1 Cycle (Applied Biosystems) conforme as instruções do protocolo do fabricante. As reações da sequência foram submetidas a eletroforese utilizando o Analisador Genético 3500xL da Applied Biosystems. As ambiguidades da sequência podem ser devidas à existência de vários cistons codificando rRNAs 16S com diferentes sequências dentro de um único genoma (J. Bacteriol. 178 (19), 5636-5643, 1996).
[274] Os dados de sequência resultantes das linhagens foram colocados no editor de alinhamento AE2 (http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/unix/ae2.readme), alinhados manualmente de acordo com a estrutura secundária da molécula de rRNA resultante e comparados com sequências do gene de rRNA 16S representativas de organismos pertencentes aos Firmicutes (Nucl. Acids Res. 27, 171-173, 1999). Para comparação, as sequências de rRNA 16S foram obtidas a partir das bases de dados EMBL e RDP.
[275] As sequências de DNAr 16S das linhagens da invenção são apresentadas na Listagem de Sequências como indicado na Tabela 2. TABELA 2: REFERÊNCIAS DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS DO RDNA 16S DAS
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[276] Os valores de identidade do gene de rDNA 16S em % foram calculados por comparação par a par das sequências dentro do alinhamento das sequências comparadas.
[277] A comparação realizada apenas de duas sequências com base no alinhamento de sequências em pares é denotada aqui como valores binários. Os outros valores são baseados em um alinhamento de múltiplas sequências de todas as sequências dentro da comparação. Valores de identidade mais altos de comparações multi-sequência resultam do problema que os dados de sequência das sequências comparadas eram de comprimento diferente resultando em um alinhamento mais curto.
[278] A % de identidade de comparações pareadas das sequências completas de rDNA entre as três linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 estava entre 99,5 e 99,9% (Tabela 3, valores binários). TABELA 3: IDENTIDADE EM % DAS SEQUÊNCIAS COMPLETAS DE RRNA 16S DE TRÊS LINHAGENS DE PAENIBACILLUS (VALORES BINÁRIOS ENTRE PARÊNTESES).
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[279] A comparação da sequência completa de rRNA 16S das três linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 com a taxa relacionada (ver Figura 9) revelou uma alta porcentagem de identidade para Paenibacillus peoriae (linhagem tipo DSM 8320) com 99,8%. Os valores binários para os alinhamentos de sequência pareados de P. peoriae com as linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 foram os seguintes: Lu16774: 99,5%, Lu17007: 99,5%; e Lu17015: 99,7% de identidade, respectivamente.
[280] Uma avaliação final das espécies às quais pertencem as linhagens de Paenibacillus Lu16774, Lu17015 e Lu17007 baseou-se nos dados da sequência de rRNA 16S não possíveis.
[281] O sequenciamento do rDNA completo resultou em Paenibacillus peoriae NRRL BD-62 em 100% de identidade com P. peoriae (linhagem tipo DSM 8320), confirmando a designação da espécie P. peoriae para esta linhagem BD-62 (Figura 9).
[282] A estreita relação de todas as três linhagens de Paenibacillus Lu16774, Lu17007 e Lu17015 com P. peoriae foi confirmada pela comparação com a sequência de rRNA 16S da linhagem de P. peoriae BD-62 que resultou em valores de identidade de 99,8% (ver Figura 9).
[283] Para a construção das operações de dendrograma filogenético do pacote ARB (Nucl. Acids Res. 35, 7188-7196, 2007) foram utilizados: com base nos valores de distância evolutiva a árvore filogenética foi construída pelo método neighbor-joining (Jukes, T. H. & Cantor C. R. (1969), Evolution of protein molecules, In Mammalian protein metabolism, pp. 21-132 Editado por H. N. Munro, Nova York: Academic Press) usando a correção de Jukes e Cantor (Mol. Biol. Evol. 4, 406-425, 1987). A raiz da árvore foi determinada incluindo a sequência do gene de rRNA 16S de Cohnella thermotolerans na análise. A barra de escala abaixo do dendrograma indica 1 substituição de nucleotídeo por 100 nucleotídeos. Os resultados são apresentados na Figura 10.
[284] O dendrograma filogenético dessas sequências (Figura 10) mostra que as três linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 estão mais intimamente relacionadas entre si e que seu parente mais próximo conhecido por cada uma delas foi a linhagem de Paenibacillus peoriae NRRL BD-62.
EXEMPLO 2.2: ANÁLISE RIBOPRINT
[285] A ribotipagem padronizada e automatizada é realizada usando o sistema RiboPrinter da Qualicon. O sistema RiboPrinter combina etapas de processamento molecular para ribotipagem em um instrumento automatizado autônomo. O procedimento inclui lise celular, digestão de DNA cromossômico com a enzima de restrição EcoRI, separação de fragmentos por eletroforese, transferência de fragmentos de DNA para membrana de nailon, hibridação com uma sonda gerada a partir do operon rrnB de E. coli, detecção quimioluminescente da sonda para os fragmentos contendo sequências de operon rrn, detecção de imagem e análise computadorizada de padrões RiboPrint (Food Technology 50 (1), 77-81, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5229-5233, 1995; Int. Journ. Syst Bact 44 (3), 454-460, 1994).
[286] A ribotipagem foi executada pela DSMZ, Alemanha, com as linhagens de Paenibacillus Lu16774, Lu17007 e Lu17015, em comparação com a linhagem de P. peoriae BD-62, utilizando a enzima de restrição EcoRI. Os padrões resultantes foram comparados usando o Software do sistema RiboPrinter, a Biblioteca de Identificação DuPont integrada, bem como o Software BioNumerics (Applied Maths, Bélgica).
[287] A semelhança de todas as três linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 a BD-62 foi entre 0,24 e 0,5 (Figura 11). As três linhagens agrupam- se em dois grupos, compreendendo primeiramente Lu17015, enquanto o segundo grupo compreende as linhagens Lu16774 e Lu17007. Nenhuma das linhagens tem uma similaridade maior que 0,84 para qualquer linhagem dentro da Biblioteca de Identificação DuPont e, portanto, não foi identificada automaticamente.
[288] A linhagem BD-62 foi identificada como Paenibacillus peoriae com base na entrada DUP-13142 da biblioteca de identificação da DuPont (entrada baseada em Paenibacillus peoriae DSM 8320).
EXEMPLO 2.3: CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FISIOLÓGICA
[289] As linhagens foram caracterizadas na DSMZ em analogia aos métodos descritos em Gordon, R.E., Haynes, W.C. & Pang. C.H.-N. (1973): The Genus Bacillus, Agriculture Manual no. 427. Washington DC: Departamento de Agricultura dos EUA. Os resultados são apresentados na Tabela 4. TABELA 4: DADOS DE CARACTERIZAÇÃO DAS LINHAGENS DE PAENIBACILLUS DA INVENÇÃO E COMPARAÇÃO COM A LINHAGEM DE PAENIBACILLUS PEORIAE NRRL BD- 62 CONHECIDA.
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*n.g. = sem crescimento.
[290] A análise dos ácidos graxos celulares realizados na DSMZ resultou que todas as linhagens apresentaram um perfil típico para Paenibacillus spp..
[291] Utilizando os dados genéticos, fisiológicos e bioquímicos disponíveis, mostra-se que as linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 pertencem ao gênero Paenibacillus. Como as linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015, assim como BD-62, produzem gás a partir da glicose, nenhuma delas pertence a Paenibacillus jamilae.
[292] Uma diferenciação fenotípica entre Paenibacillus peoriae e Paenibacillus polymyxa é principalmente possível utilizando características de produção de ácido de certos substratos (Int. J. Syst. Bacteriol. 43 (2), 388-390, 1993; In. J. Syst. Bacteriol. 46 (6), 988-1003, 1996). Nenhuma das linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 combinou completamente com as suas características descritas na Tabela 4 completamente para qualquer uma destas duas espécies, mas na soma dos dados genéticos, fisiológicos e bioquímicos disponíveis mais provavelmente apontam para as espécies Paenibacillus peoriae e P. polymyxa ou, pelo menos, a outra espécie intimamente relacionada com Paenibacillus peoriae e P. polymyxa.
[293] Devido à multiplicidade de espécies de Paenibacillus descritas até agora, é impossível determinar as espécies taxonômicas corretas dos três isolados testados com base em critérios fisiológicos e morfológicos da Tabela 4 (Rainer Borriss, Humboldt University Berlin, resultados não publicados).
[294] No entanto, não foi possível determinar completamente as espécies dentro deste gênero. Verificou-se que as espécies e linhagens mais intimamente relacionadas eram Paenibacillus peoriae BD-62, com base na análise de rDNA 16S (ver, por exemplo, a Figura 11).
EXEMPLO 2.4: ANÁLISE FILOGENÉTICA BASEADA NA CODIFICAÇÃO DE GENES PARA DNAN, GYRB, RECF, RECN E RPOA
[295] As sequências nucleotídicas dos genes que codificam para DnaN, GyrB, RecF, RecN e RpoA foram extraídas de sequências genômicas completas ou de bases de dados públicas (Listagens de sequências, conforme descrito na Tabela 28).
[296] As tabelas de identidade (Figuras 12 a 16) foram geradas com uma abordagem de todos contra todos, onde cada sequência é alinhada com todas as outras sequências. O alinhamento da sequência foi realizado com um programa agulha (pacote EMBOSS 6.6.0; Trends in Genetics 16 (6), 276277). Parâmetros padrão foram utilizados (criação de lacunas 10.0; extensão de lacunas 0.5). Os Índices de Identidade são calculados com base nos alinhamentos, sem considerar quaisquer lacunas.
[297] Para as árvores filogenéticas (Figuras 17 a 21), alinhamentos de múltiplas sequências que foram realizados com Clustal Omega (versão 1.2.0; Molecular Systems Biology 7: 539, doi: 10.1038/msb.2011.75). As árvores filogenéticas são calculadas pelo método de probabilidade máxima com o software Dnaml (implementado no pacote Phylip 3.696; Felsenstein 1981, http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html). Os dendrogramas foram estabelecidos usando um modelo de distância F84 enquanto se aplica uma relação de transição-transversão de dois (2). As árvores são plotadas com a ferramenta Dendroscope (http://dendroscope.org/). TABELA 28: REFERÊNCIAS DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS DAS SEQUÊNCIAS DE DNA DNAN, GYRB, RECF, RECN E RPOA DAS LINHAGENS DE PAENIBACILLUS.
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EXEMPLO 2.5: COMPARAÇÕES DO GENOMA PRINCIPAL E MATRIZ AAI
[298] As comparações do genoma foram realizadas usando o pacote de software EDGAR da universidade Gieβen (BMC Bioinformatics 10, 154, 2009; (https://edgar.computational.bio.uni-giessen.de/cgi-bin/edgar.cgi). A determinação do genoma principal, os dendrogramas filogenéticos com base nas sequências completas do genoma e os valores da matriz de AAI foram realizados usando o pacote de software EDGAR. Os resultados são mostrados na Figura 22.
EXEMPLO 3: CRESCIMENTO (FERMENTABILIDADE) DE LINHAGENS PARA TESTES IN VIVO
[299] Para ensaios em estufa e de campo, as linhagens de Paenibacillus foram primeiramente cultivadas em placas ISP2 (ágar pronto para uso da BD [EUA], número de catálogo 277010). Depois, os frascos de agitação com defletores (baffled) contendo meio ISP2 líquido foram inoculados com uma colônia da placa de ágar e incubados durante 5 a 7 dias a 150 rpm e 25 °C. Dependendo do teste, quer o caldo de cultura total, ou o pélete centrifugado e lavado com H2O ou o sobrenadante foi aplicado às plantas. Uma escala de até 10L de fermentadores foi possível.
[300] As linhagens de Paenibacillus foram cultivadas em meio líquido ISP2 (10g/L de extrato de malte, 4 g/L de extrato de levedura Bacto, 4 g/L de glucose monohidratada) durante 6 dias a 22 °C a 150 rpm. OD600nm indicando crescimento bacteriano, foi medido em diferentes momentos. TABELA 5: CRESCIMENTO BACTERIANO DE LINHAGENS DE PAENIBACILLUS EM MEIO LÍQUIDO ISP2.
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EXEMPLO 4 - ENSAIO DE CONFRONTO IN VITRO PARA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA
[301] A atividade antagonista do Linhagens de Paenibacillus contra patógenos de plantas foi mostrado no ensaio in vitro de confronto. Os fungos fitopatogênicos utilizados são Sclerotina sclerotiorum (SCLSCL), Botrytis cinerea (BOTRCI), Alternaria sp. (ALTESP) e Phytophthora infestans (PHYTIN).
[302] Como meio de crescimento para o meio BOTRCI, ALTESP, SCLSCL, ISP2 é utilizado compreendendo por litro: 10 g de extrato de malte (Sigma Aldrich, 70167); 4 g de extrato de levedura de Bacto (Becton Dickinson, 212750); 4 g de glucose monohidratada (Sigma Aldrich, 16301); 20 g de ágar (Becton Dickinson, 214510), pH a cerca de 7, Aq. lance. Como meio de crescimento para PHYTIN, utiliza-se meio V8 compreendendo por litro: 200 ml de caldo de vegetais, 3 g de carbonato de cálcio (Merck Millipore, 1020660250); 30 g de ágar (Becton Dickinson, 214510), pH 6,8, Aq. lance.
[303] As linhagens de Paenibacillus foram inoculadas em um dos lados de uma placa de ágar. Um bloco de ágar (aprox. 0,3 cm2) contendo um agente patogênico de crescimento ativo foi colocado no centro da placa. Após incubação durante 7 a 14 dias a 25 °C, o crescimento do agente patogênico da planta foi examinado, especialmente para zonas de inibição.
[304] Depois disso, as placas de ágar são incubadas a °C durante cerca de 7 a 14 dias antes da avaliação. A antibiose é pontuada pela avaliação do diâmetro da zona livre de fungos (zona de inibição). A competição é pontuada comparando o diâmetro do crescimento do fungo patogênico em placas com linhagens bacterianas em comparação com as placas de controle. O micoparasitismo pode ser documentado no caso das bactérias superarem o patógeno fúngico e também parasitarem os patógenos. Isto pode ser visualizado por microscopia.
[305] As linhagens de Paenibacillus mostraram atividade antifúngica contra todos os patógenos testados nas plantas. TABELA 6: RESULTADOS DO ENSAIO DE CONFRONTAÇÃO IN VITRO
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EXEMPLO 5 - TESTES EM ESTUFA PARA ATIVIDADE CONTRA FUNGOS PATÓGENOS DE PLANTAS EXEMPLO DE USO 5.1: ATIVIDADE CONTRA A QUEIMA PRECOCE (LATE BLIGHT) EM TOMATE CAUSADA POR PHITOPHTHORA INFESTANS COM APLICAÇÃO PROTETORA
[306] Plantas jovens de tomate comercialmente disponíveis (“Goldene Konigin”) foram utilizadas para o ensaio em estufa descrito. Foram utilizadas 2 repetições (vasos com 1 planta cada) por tratamento. As plantas foram cultivadas em substrato disponível comercialmente (Universal, Floragard) a aproximadamente 22 °C na estufa. A umidade foi controlada usando um dispositivo especial (~ 90% de umidade). As plantas foram pulverizadas até escoar com caldo de cultura bruto/ inteiro de culturas com 6 dias de idade da respectiva linhagem de Paenibacillus (dependendo da configuração) utilizando um armário de pulverização. As condições de cultura para as linhagens são descritas no Exemplo 3. Um dia após a aplicação, as plantas tratadas foram inoculadas com uma suspensão de esporângios de Phytophthora infestans (PHYTIN). Após a inoculação, as plantas experimentais foram imediatamente transferidas para uma câmara úmida. A extensão do ataque fúngico nas folhas foi avaliada visualmente 5 a 7 dias após a inoculação. O ataque fúngico no controle não tratado foi entre 80 a 100% e definido para 100% para o motivo de comparação.
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EXEMPLO DE USO 5.2: ATIVIDADE CONTRA FUNGOS CINZENTOS EM PIMENTA CAUSADA POR BOTRYTIS CINEREA COM APLICAÇÃO PROTETORA
[307] Foram utilizadas mudas jovens de pimenta comercialmente disponíveis (“Neusiedler Ideal”) para o ensaio em estufa descrito. Foram utilizadas 2 repetições (vasos com 1 planta cada) por tratamento. As plantas foram cultivadas em substrato comercialmente disponível (Universal, Floragard) a aproximadamente 22 °C na estufa. A umidade foi controlada usando um dispositivo especial (~ 90% de umidade). As plantas foram pulverizadas até escoar com caldo de cultura bruto de culturas com 6 dias de idade da respectiva linhagem de Paenibacillus (dependendo da configuração) utilizando um armário de pulverização. As condições de cultura para as linhagens são descritas no Exemplo 3. Um dia após a aplicação, as plantas tratadas foram inoculadas com uma suspensão de esporos de Botrytis cinerea (BOTRCI). Após a inoculação, as plantas experimentais foram imediatamente transferidas para uma câmara úmida. A extensão do ataque fúngico nas folhas foi avaliada visualmente 5 a 7 dias após a inoculação. O ataque fúngico no controle não tratado foi entre 80 a 100% e definido para 100% para o motivo de comparação.
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EXEMPLO DE USO 5.3: ATIVIDADE CONTRA A QUEIMA PRECOCE DO TOMATEIRO CAUSADA POR ALTERNARIA SOLANI COM APLICAÇÃO PROTETORA
[308] Plantas jovens de tomate comercialmente disponíveis (“Goldene Konigin”) foram utilizadas para o ensaio em estufa descrito. Foram utilizadas 2 repetições (vasos com 1 planta cada) por tratamento. As plantas foram cultivadas em substrato disponível comercialmente (Universal, Floragard) a aproximadamente 22 °C. A umidade foi controlada usando um dispositivo especial (~ 90% de umidade). As plantas foram pulverizadas até escoar com caldo de cultura bruto/ total de culturas com 6 dias de idade da respectiva linhagem de Paenibacillus (dependendo da configuração) utilizando um armário de pulverização. As condições de cultura para as linhagens são descritas no Exemplo 3. Um dia após a aplicação, as plantas tratadas foram inoculadas com uma suspensão de esporos de Alternaria solani (ALTESO). Após a inoculação, as plantas experimentais foram imediatamente transferidas para uma câmara úmida. A extensão do ataque fúngico nas folhas foi avaliada visualmente 5 a 7 dias após a inoculação. O ataque fúngico no controle não tratado foi entre 80 a 100% e definido para 100% para o motivo de comparação.
Figure img0021
EXEMPLO 5.4: ATIVIDADE CONTRA A FERRUGEM DA SOJA EM SOJA CAUSADA POR PHAKOPSORA PACHYRHIZI COM APLICAÇÃO PROTETORA
[309] Foram utilizadas mudas jovens de soja comercialmente disponíveis (“Mentor”) para o ensaio em estufa descrito. Foram utilizadas 2 repetições (vasos com 1 planta cada) por tratamento. As plantas foram cultivadas em substrato disponível comercialmente (Universal, Floragard) a aproximadamente 22 °C. A umidade foi controlada usando um dispositivo especial (~ 90% de umidade). As plantas foram pulverizadas até escoar com caldo de cultura bruto de culturas com 2 a 6 dias de idade de Paenibacillus spp. (dependendo da configuração) usando um armário de pulverização. Um dia após a aplicação, as plantas tratadas foram inoculadas com uma suspensão de esporos de Phakopsora pachyrhizi (PHAKPA). Após a inoculação, as plantas experimentais foram imediatamente transferidas para uma câmara úmida. A extensão do ataque fúngico nas folhas foi avaliada visualmente 5 a 7 dias após a inoculação.
EXEMPLO DE USO 5.5: ATIVIDADE CONTRA A FUSARIOSE DO TRIGO (FUSARIUM HEAD BLIGHT) NO TRIGO CAUSADA POR FUSARIUM GRAMINEARUM COM APLICAÇÃO PROTETORA
[310] Plântulas jovens de trigo comercialmente disponíveis foram usadas para o ensaio em estufa descrito. Foram utilizadas 2 repetições (vasos com 1 planta cada) por tratamento. As plantas foram cultivadas em substrato disponível comercialmente (Universal, Floragard) a aproximadamente 22 °C. A umidade foi controlada usando um dispositivo especial (~ 90% de umidade). As plantas foram pulverizadas até escoar com caldo de cultura bruto de culturas com 2 a 6 dias de idade de Paenibacillus spp. (dependendo da configuração) usando um armário de pulverização. As condições de cultura são descritas no Exemplo 3. Um dia após a aplicação, as plantas tratadas foram inoculadas com uma suspensão de esporos de Fusarium graminearum (GIBBZE). Após a inoculação, as plantas experimentais foram imediatamente transferidas para uma câmara úmida. A extensão do ataque fúngico nas folhas foi avaliada visualmente 5 a 7 dias após a inoculação.
EXEMPLO DE USO 5.6: ATIVIDADE CONTRA MANCHA DE FOLHAS PONTILHADA NO TRIGO CAUSADA POR SEPTORIA TRITICI COM APLICAÇÃO PROTETORA
[311] Plântulas jovens de trigo comercialmente disponíveis foram usadas para o ensaio em estufa descrito. Foram utilizadas 2 repetições (vasos com 1 planta cada) por tratamento. As plantas foram cultivadas em substrato disponível comercialmente (Universal, Floragard) a aproximadamente 22 °C. A umidade foi controlada usando um dispositivo especial (~ 90% de umidade). As plantas foram pulverizadas até escoar com caldo de cultura bruto de culturas com 2 a 6 dias de idade de Paenibacillus spp. (dependendo da configuração) usando um armário de pulverização. As condições de cultura são descritas no Exemplo 3. Um dia após a aplicação, as plantas tratadas foram inoculadas com uma suspensão de esporos de Septoria tritici (SEPTTR). Após a inoculação, as plantas experimentais foram imediatamente transferidas para uma câmara úmida. A extensão do ataque fúngico nas folhas foi avaliada visualmente 21 a 28 dias após a inoculação.
EXEMPLO DE USO 5.7: ATIVIDADE DAS CÉLULAS DE PAENIBACILLUS E DO SOBRENADANTE CONTRA VÁRIOS PATÓGENOS COM APLICAÇÃO PROTETORA
[312] O caldo de cultura total de culturas com 6 dias de idade da linhagem de Paenibacillus Lu17007 foi obtido de acordo com o Exemplo de uso 3 e utilizado como na configuração experimental do Exemplo de uso 5.1 a 5.3. Alternativamente, esse caldo de cultura total foi filtrado através de um filtro com tamanho de poro de 0,2 μm para obter o meio de cultura e a fração celular bruta. A fração celular bruta pode ainda ser lavada três vezes com os volumes originais de solução salina tamponada com fosfato para obter células lavadas.
[313] Os ensaios em estufa foram realizados como descrito nos Exemplos de Uso 5.1, 5.2 e 5.3 acima para os respectivos patógenos Phytophthora infestans, Botrytis cinerea e Alternaria solani. A extensão do ataque fúngico nas folhas foi avaliada visualmente 5 a 7 dias após a inoculação. O ataque fúngico no controle não tratado foi entre 80 a 100% e definido para 100% para o motivo de comparação.
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EXEMPLO 6 - ENSAIOS ENZIMÁTICOS EXEMPLO DE USO 6.1: QUITINASE
[314] Meio sólido para teste de quitinase: 2 g/l de NaNO3, 1 g/l de K2HPO4, 0,5 g/l de MgSO4, 0,5 g/l de KCl, 0,2 g/l de peptona, 15 g/l de ágar, 10 g/l de quitina de casca de caranguejo (Sigma-Aldrich C7170).
[315] O meio sólido de teste é autoclavado e introduzido em placas de Petri de 9 cm. As linhagens de Paenibacillus são inoculadas no centro das placas e incubou-se durante dois dias a 27 °C. Em seguida, as placas são coradas com uma solução Lugol diluída 1: 3 (Carl Roth N052.2) por 5 a 10 min. A solução de Lugol é derramada e as placas são fotografadas e avaliadas. O crescimento das diferentes linhagens não foi superior a 5 a 10 mm. Zonas não coradas (correlacionadas com a atividade da quitinase) variaram de 0 mm (sem atividade; “-” na Tabela 11) a vários cm (“+” na Tabela 11).
EXEMPLO DE USO 6.2: CELULASE
[316] Meio sólido para teste de celulase: 2 g/l de NaNO3, 1 g/l de K2 HPO4, 0,5 g/l de MgSO4, 0,5 g/l de KCl, 0,2 g/l de peptona, 15 g/l de ágar, carboximetil celulose, sal de sódio (Sigma- Aldrich 419273).
[317] O meio é autoclavado e vertido em placas de Petri de 9 cm. As linhagens de Paenibacillus são inoculadas no centro das placas e incubadas por dois dias a 27 °C. Após a incubação, as placas são coradas com uma solução diluída de Lugol 1: 3 (Carl Roth N052.2) por 5 a 10 min. A solução de Lugol é derramada e as placas fotografadas.
EXEMPLO DE USO 6.3: AMILASE
[318] Meio sólido para teste de amilase: 2 g/l de NaNO3, 1 g/l de K2 HPO4, 0,5 g/l de MgSO4, 0,5 g/l de KCl, 0,2 g/l de peptona, 15 g/l de ágar, 10 g/l de amido solúvel (Merck 1,01252).
[319] O meio é autoclavado e vertido em placas de Petri de 9 cm. As linhagens de Paenibacillus são inoculadas no centro das placas e incubadas por dois dias a 27 °C. Após a incubação, as placas são coradas com uma solução diluída de Lugol 1: 3 (Carl Roth N052.2) por 5 a 10 min. A solução de Lugol é derramada e as placas fotografadas. TABELA 11: ATIVIDADES DE QUITINASE, CELULASE E AMILASE DE LINHAGENS DE PAENIBACILLUS
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-, sem atividade; (+), baixa atividade; + atividade regular; ++, alta atividade.
EXEMPLO 7 - METABÓLITOS DO TIPO FUSARICIDINA OBTIDOS A PARTIR DE LINHAGENS DE PAENIBACILLUS EXEMPLO 7.1: CULTIVO EM LARGA ESCALA DE ISOLADOS BACTERIANOS E EXTRAÇÃO DE METABÓLITOS DO TIPO FUSARICIDINA (a) Cultivo
[320] As linhagens de Paenibacillus foram cultivadas em placas de ágar contendo meio GYM (10 g/l de glicose, 4 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de extrato de malte; pH 5,5, ajustado antes da autoclavagem) e 20 g/l de ágar. O cultivo foi realizado durante 10 a 20 dias à temperatura ambiente. Para a manutenção declives de ágar com o mesmo meio, foram usados e armazenados a 4 °C.
[321] Culturas líquidas de pequena escala (250 ml de meio GYM em frascos de 500 ml) foram inoculadas com 4 a 5 partes de uma cultura de ágar bem cultivada e cultivadas em um agitador orbital a 120 rpm à temperatura ambiente (20 a 23 °C).
[322] Fermentações em larga escala foram realizadas em fermentadores de 20 l com 15 L de meio GYM (a capacidade total de fermentadores não foi usada devido à formação de espuma) inoculada com 250 ml de cultura líquida bem desenvolvida e a fermentação foi realizada à temperatura ambiente (20 a 23 °C) com agitação (120 rpm) e arejamento (3 l/min) durante 5 a 8 dias. b) Extração
[323] Um volume igual de isopropanol foi adicionado ao caldo de cultura total (não foi realizada separação da biomassa da cultura líquida). Após agitação e incubação durante 2 a 16 horas, adicionou-se sal de cozinha comum (cloreto de sódio - 100 a 200 g/l) à mistura até a separação de fases da fase orgânica e aquosa ser visível.
[324] A fase de isopropanol foi concentrada in vacuo. O extrato resultante, ainda contendo grande quantidade de sal, foi dissolvido em metanol, centrifugado para melhor precipitação dos resíduos salinos e a fase orgânica foi novamente concentrada. Esta etapa foi repetida até não haver mais precipitado de sal. c) Purificação i) Cromatografia em gel de sílica
[325] 30 gramas de extrato foram dissolvidos em metanol e ligado a 50 g de sílica gel (Merck, K60, malha 70-230), secou-se a 40 °C e disposto em camadas sobre 1 kg de sílica gel (coluna de 10 cm de diâmetro, 30 cm de altura, aproximadamente).
[326] A eluição foi realizada em quatro etapas como segue: - Etapa 1 - 4 l de acetato de etila - Etapa 2 - 4 l de acetato de etila: metanol (3: 1, v/v) - Etapa 3 - 7 l de acetato de etila: metanol (1: 1, v/v) - Etapa 4 - 4 l de metanol
[327] A terceira fração (intermediário 1), contendo os compostos ativos, foi seca in vacuo e dissolvida em 40% de metanol (MeOH) em 0,1% de ácido fórmico (FA) (concentração: 100 mg/mL). As outras frações foram descartadas. ii) Fracionamento em Chromabond HR-X Carregou-se 20 ml de intermediário 1 em um cartucho Chromabond HR-X (Macherey-Nagel, 1000 mg, ref 730941)previamente equilibrado (com 40% de MeOH em 0,1% de FA). O cartucho foi lavado com 100 ml de 40% de MeOH em 0,1% de FA e eluído com 60 ml de 70% de MeOH em 0,1% de FA. Este intermediário 1-1 foi então seco in vacuo. iii) HPLC preparativa em uma coluna Sunfire C18
[328] O intermediário 1-1 foi dissolvido em DMSO (concentração: 200 mg/mL) e 300 de intermediário 1-1 foram cromatografados em uma coluna Sunfire C18 (19 x 250 mm, 5 μm, Waters) como se segue: - 16 min a 10ml/min, isocrático 70% 0,2 de FA; 30% de acetonitrila (ACN), - 1 min a 14 mL/min, gradiente a 65% 0,2% de FA; 35% de ACN, - 5 min a 14 mL/min, isocrático 65% 0,2% de FA; 35% de ACN.
[329] Cinco frações puderam ser detectadas. Todas as cinco frações resultantes foram secas in vacuo e dissolvidas em DMSO (concentração: 125 mg/ml). Purificação adicional foi realizada usando a mesma coluna e condições isocráticas (fluxo: 10,5 ml/min) ajustadas para cada fração (12,5 mg por corrida): Fração 1: 69% 0,2 de FA; 31% de ACN; dois picos detectados (1-1 e 1-2) Fração 2: 69% 0,2 de FA; 31% de ACN; dois picos detectados (2-1 e 2-2) Fração 3: 69% 0,2 de FA; 31% de ACN; três picos detectados (31, 3-2 e 3-3) Fração 4/5: 67% 0,2 de FA; 33% de ACN; um pico detectado (4/5) Fração 6: 65% 0,2 de FA; 35% de ACN; dois picos detectados (6-1 e 6-2)
[330] A pureza e a quantidade das seguintes amostras foram suficientes para análise de RMN e elucidação da estrutura: picos 1-2, 2-1, 3-2, 4/5 e 6-1.
EXEMPLO 7.2: ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DOS COMPOSTOS 1A E 1B
[331] De pico 2-1 de fração 2, uma mistura de compostos 1A e 1B (razão de cerca de 3: 7) foi obtida como um óleo castanho ( [ α ] D 25 = 20,9 (c = 0,6, DMSO-d6)).
[332] A fórmula molecular C47H78N10O12 do componente principal, composto 1B, foi deduzida a partir do espectro de HR-ESI-MS que deu um pico a m/z 975,5863 [M + H]+; ESI-MS: 975,6 (100%, [M + H]+), 488,4 (51%, [M + 2H]2+).
[333] Além disso, a mistura também continha um componente menor, o homólogo mais leve 1A, e a diferença de massa entre os dois compostos era de 14 amu. Esta observação foi suportada por um segundo pico observado no espectro de ESI-MS a m/z 961,6.
[334] Os espectros de RMN (Tabela 12) incluíram além dos sinais de prótons permutáveis entre δ 6,83 e 8,58, ressonâncias de carbonila no intervalo de δ 166,0 a 174,5 e sinais de metina entre δ 47,8 e δ 60,4 indicativos de um peptídeo.
[335] A extensão da análise dos dados de RMN 1D e 2D do composto 1B revelou a presença de seis aminoácidos incluindo tirosina (Tyr), glutamina (Gln), alanina (Ala), duas treoninas (Thr1 e Thr2) e isoleucina (Ile). As sequências destes compostos foi encontrada usando duas ou três correlações de ligações entre as funções da amida. Assim, os espectros COSY, NOESY (Figura 2) e HMBC (Figura 3) descreveram as correlações do próton nitrogênio de Thr2 a δ 8,58 para o sinal do próton de metina de Thr2 a δ 3,84 e a carbonila a δ 166,7 de Tyr enquanto a mesma relação foi observada entre o nitrogênio- próton de Tyr a δ 8,52 e o sinal de próton de metileno de Tyr a δ 2,60 e o carbonila a δ 170,4 de Ile. Além disso, o hidrogênio de metino de Ile a δ 4,16 tinha uma forte correlação com o sinal de carbonila de Ile a δ 170,4 e um contato fraco com aquele de Thr1 a δ 168,6; o sinal do próton p-metino a δ 5,30 de Thr1 correlaciona-se com o sinal de carbonila a δ 170,4 de Ala. Adicionalmente às correlações acima mencionadas, outras foram apresentadas a partir do N-próton a δ 7,27 de Ala à metina próton a δ 4,20 do mesmo aminoácido, enquanto este último próton teve a mesma interação com o carbonila de seu amino e o de Gln. Além disso, um pico transversal foi revelado a partir do próton permutável a δ 8,20 de Gln para o hidrogênio de metano a δ 3,87 de Gln e o carbonila de Thr2 a δ 170,6; estes dados acima mencionados sugeriram a estrutura ciclodepsipeptídica para o composto 1B.
[336] Este c ciclodepsipeptídio 1B continha um ácido graxo de guanidina β-hidroxi ligado a Thr1 uma vez que foi observada uma correlação chave entre o sinal do seu próton α-metino a δ 4,39 e a ressonância de uma carbonila a δ 171,9; os contatos de HMBC dessa carbonila a δ 171,9 para os prótons de α-metileno em δ 2,35 e o próton de β-metina a δ 3,77 foram ainda observados, bem como entre os prótons de metileno em δ 3,03 e o carbono de guanidina em δ 157,2. A cadeia lateral foi deduzida como contendo doze grupos metileno entre o grupo β-hidroxi e guanidina com base no íon fragmentado observado no espectro APCI-MS-MS do íon parental [M + H]+ em m/z 256.2. Da mesma forma, este espectro forneceu informação (Figura 4b) que confirmou a sequência de ligação de aminoácidos e levou a elucidar a estrutura do composto 1B como mostrado na Figura 1.
[337] Os sinais de um grupo CH2 a 2.80, 2.52/36.3 nos espectros 1D- e 2D- corresponderam presumivelmente ao grupo β-CH2 de asparagina (Asn) no composto 1A. Esta conclusão foi suportada por dados reportados (Heterocycles 53, 1533-1549, 2000) em conjunção com fragmentos obtidos de MS/MS do pico parental a m/z 961.6 (Figura 4a). Da mesma forma, as últimas análises forneceram informações (Figuras 4a, 4b) que confirmaram a sequência de conexão de aminoácidos em ambos os compostos e levaram a elucidar a estrutura dos compostos 1A e 1B como mostrado na Figura 1.
EXEMPLO 7.3: IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DOS COMPOSTOS 2A E 2B COMO FUSARICIDINAS C E D
[338] A partir do pico 1-2 da fração 1, obteve-se uma mistura de compostos 2A e 2B (razão de cerca de 1: 1) como um óleo castanho. A fórmula molecular do componente mais pesado, o composto 2B, foi determinada como sendo C46H76N10O12, com base em espectrometria de massa de baixa resolução. A análise dos dados de RMN (Tabela 13) permitiu identificar o composto 2B como fusaricidina D. O componente mais leve da mistura, composto 2A, foi identificado da mesma forma como fusaricidina C, na qual o resíduo Gln da fusaricidina C é substituído por Asn.
[339] O padrão de fragmentação de espectrometria de massa dos íons parentais de m/z 961.6 e 947.6 para os compostos 2B e 2A, respectivamente (Figuras 5a, 5b), confirmou que o comprimento da cadeia lateral do ácido graxo substituído era idêntico como no composto 1B. Fusaricidinas C e D foram relatadas anteriormente por Kajimura et al. (J. Antibiot. 50, 220-228, 1997).
EXEMPLO 7.4: IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DO COMPOSTO 3 COMO LI-F08B
[340] A partir do pico 6-1 da fração 6, o composto 3 foi isolado como um óleo castanho e a sua baixa resolução apresentou um pico a m/z 925,6 [M + H]+ que, combinado com dados de RMN (Tabela 14), conduziu a fórmula molecular C44H80N10O11. O composto 3 mostrou características semelhantes nos espectros de RMN como o composto 1B e o composto 2B (fusaricidina D), exceto quanto à presença de sinais aromáticos (Tabela 14). Assim, observaram- se ressonâncias características de um peptídeo, nomeadamente dez sinais de prótons ligados a nitrogênio entre δ 6,89 e 8,49, oito ressonâncias de carbonila variaram entre δ 168,1 e 174,3 e seis sinais de N-metina compreendidos entre δ 48,0 e 59,5. Uma análise detalhada dos espectros de HMQC, COSY e TOCSY revelou a presença de seis aminoácidos incluindo Gln, duas unidades de Thr, duas unidades de Ile e Ala. Além disso, esses espectros mostraram mudanças químicas atribuíveis ao mesmo ácido graxo β-hidroxila uma guanidina terminal como nos compostos 1A, 1B e fusaricidinas C (2A) e D (2B). A posição desta cadeia lateral foi determinada com base em uma correlação de faixa longa encontrada no espectro HMBC entre o sinal de próton da N-metina em δ 4,44 de Thr1 e o sinal de carbonila a δ 172,1 do ácido graxo. A sequência dos aminoácidos foi deduzida das interações de NOESY e do padrão de fragmentação (Figura 6).
[341] A combinação dos dados de RMN (Tabela 14) e espectrometria de massa levou a identificar o composto metabólito 3 como LI- F08b, também chamado aqui de fusaricidina LI-F08b, relatado pela primeira vez por Kuroda et al. (Heterocycles 53, 1533-1549, 2000).
EXEMPLO 7.5: IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DOS COMPOSTOS 4A E 4B COMO LI- F06A E LI-F06B E DOS COMPOSTOS 5A E 5B COMO FUSARICIDINA A E B, RESPECTIVAMENTE
[342] A partir do pico 4/5 da fração 4/5, obteve-se uma mistura de dois metabólitos adicionais, compostos 4A e 4B (relação de cerca de 1: 3) que originaram dois picos a m/z 897,5 (4A) e 911,6 (4B) no espectro ESI-MS, sugerindo mais dois ciclodepsipeptídeos homólogos. Ressonâncias indicativas de peptídeos foram observadas nos seus espectros de RMN (Tabela 15) bem como os de um ácido graxo β-hidroxila terminando em um grupo guanidina. Os padrões de fragmentação de ambos os íons parentais encontrados para os compostos 4A e 4B (Figuras 7a, 7b) permitiram determinar a sequência de aminoácidos e identificar os constituintes da mistura como LI-F06a (4A) e LI- F06b (4B), respectivamente.
[343] Obtida a partir do pico 3-2 da fração 3, a mistura dos compostos 5A e 5B (razão de cerca de 1: 3) foi analisada da mesma maneira. O espectro de massa ESI da mistura apresentou dois picos a m/z 883,6 (5A) e 897,5 (5B) e os padrões de fragmentação destes íons parentais (Figuras 8a, 8b) em conjunto com dados de RMN (Tabela 16) permitiram identificar os componentes como fusaricidina A (5A) e fusaricidina B (5B). Os dados encontrados para 4A, 4B, 5A e 5B foram compatíveis com os relatados anteriormente. (J. Antibiot. 50, 220-228, 1997; Heterocycles 53, 1533-1549, 2000). TABELA 12. DADOS DE 1H (DMSO-D6, 600 MHZ) E 13C-RMN (DMSO-D6, 150 MHZ) DOS COMPOSTOS 1A E 1B
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*Pos. = posição; FA = ácido graxo; Gu = guanidina; nf = não encontrado. A legenda também se aplica às Tabelas 13 a 16. TABELA 13. DADOS DE 1H (DMSO-D6, 600 MHZ) E 13C-RMN (DMSO-D6, 150 MHZ) DOS COMPOSTOS 2A E 2B
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TABELA 14. DADOS DE 1H (DMSO-D6, 600 MHZ) E 13C-RMN (DMSO-D6, 150 MHZ) DO COMPOSTO 3 SENDO LI-F08B.
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TABELA 15. DADOS DE 1H (DMSO-D6, 600 MHZ) E 13C-RMN (DMSO-D6, 150 MHZ) DOS COMPOSTOS 4A E 4B
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TABELA 16. DADOS DE 1H (DMSO-D6, 600 MHZ) E 13C-RMN (DMSO-D6, 150 MHZ) DOS COMPOSTOS 5A E 5B
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[344] Não foram realizados experimentos de hidrólise para determinar a configuração dos aminoácidos constituintes.
EXEMPLO 8 - METABÓLITOS PRODUZIDOS POR LINHAGENS DE PAENIBACILLUS EXEMPLO 8.1: PRODUÇÃO DE METABÓLITOS POR LINHAGENS DE PAENIBACILLUS
[345] A presença de fusaricidinas em geral e em particular das fusaricidinas A, B, C, D, LI-F06a, LI-F06b, LI-F08b, 1A e 1B foi determinada para as linhagens de Paenibacillus seguindo as etapas do procedimento descritas em Exemplo 7.1 acima. TABELA 17: PRODUÇÃO DO METABÓLITO DO TIPO FUSARICIDINA DAS LINHAGENS DE PAENIBACILLUS
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Legenda: -, composto não detectável; +, composto detectável; ++, composto detectável em quantidades maiores em comparação com a escala +.
[346] O caldo de cultura total de todas as linhagens de Paenibacillus Lu16774, Lu17007 e Lu17015 continha pelo menos uma fusaricidina identificada no Exemplo 7 (Tabela 17). Nenhuma destas fusaricidinas foi detectada no caldo de cultura total da linhagem de P. peoriae BD-62.
[347] O caldo de cultura total das linhagens de Paenibacillus Lu16774, Lu17007 e Lu17015 todos continham fusaricidinas 1A e 1B. Além disso, o caldo de cultura total das linhagens de Paenibacillus Lu16774, Lu17007 e Lu17015 todos continham as fusaricidinas A, B, C e D, bem como LI-F08b. Além disso, o caldo de cultura total das linhagens de Paenibacillus Lu17007 e Lu17015 continha fusaricidinas LI-F06a e LI-F06b.
[348] As fusaricidinas 1A e 1B não foram detectadas no caldo de cultura total da linhagem de P. peoriae BD-62 intimamente relacionada. As fusaricidinas A, B, C e D, LI-F06a, LI-F06b e LI-F08b também não estavam presentes no caldo de cultura total da linhagem de P. peoriae BD-62.
EXEMPLO 9: ATIVIDADE DE METABÓLITOS POR LINHAGENS DE PAENIBACILLUS CONTRA VÁRIOS AGENTES FÚNGICOS PATOGÊNICOS
[349] As fusaricidinas A, B, D, 1A e 1B foram obtidas e foram utilizados nos seguintes experimentos.
[350] Ensaios de crescimento fúngico foram realizados em placas com 96 poços com suspensão de esporos do patógeno Botrytis cinerea (BOTRCI, em YBA [10 g de Bacto peptona (Becton Dickinson 211677), 10 g de extrato de levedura (Becton Dickinson 212750), 20 g de acetato de sódio, adição de 1000 mL de água bidestilada] ou Alternaria solani (ALTESO, em YBG [10 g de Bacto peptona (Becton Dickinson 211677), 10 g de extrato de levedura (Becton Dickinson 212750), 20 g de glicerina a 99%, e adição de 1000 mL de água bidestilada]). As fusaricidinas e os compostos 1A e 1B foram dissolvidos e diluídos em DMSO. As concentrações diferentes que variam de 60 μM até 0,3 μM foram pipetadas na placa de microtitulação. Uma suspensão aquosa de 104 esporos/ml foi adicionado. As placas foram incubadas a cerca de 18 °C. O crescimento fúngico foi determinado medindo a densidade ótica a 600 nm em um leitor de microplacas, 3 e 7 dias após a inoculação dos esporos e comparado com o controle não tratado (DMSO). IC50 (concentração [μM] do respectivo metabólito necessária para uma inibição de 50% do crescimento dos fungos) foi determinada a partir daí.
[351] Notavelmente, os compostos 1A e 1B apresentaram a maior eficácia antifúngica com valores de IC50 de 0,4 a 0,6 μM (Tabela 18). TABELA 18. INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO ANTIFÚNGICO DOS VALORES DE IC50 DOS METABÓLITOS DE PAENIBACILLUS
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[352] Além disso, ensaios em estufa foram realizados com fusaricidinas 1A e 1B, conforme descrito nos Exemplos de Uso 5.1 a 5.5 acima para os respectivos patógenos Botrytis cinerea (BOTRCI), Alternaria solani (ALTESO), Phytophthora infestans (PHYTIN), Phakopsora pachyrhizi (PHAKPA) e Fusarium graminearum (GIBBZE). A extensão do ataque fúngico nas folhas foi avaliada visualmente 5 a 7 dias após a inoculação.
[353] Notavelmente, os compostos 1A e 1B foram eficazes no controle de doenças fúngicas importantes em plantas cultivadas já em níveis de dose tão baixos quanto 7,2 ppm e mostraram maior eficácia antifúngica do que a Fusaricidina A, B e D (Tabelas 19 a 21). TABELA 19. EFICÁCIA ANTIFÚNGICA DOS METABÓLITOS DETERMINADOS IN PLANTA
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TABELA 20. EFICÁCIA DE METABÓLITOS CONTRA A QUEIMA PRECOCE NO TOMATE CAUSADA POR PHYTOPHTHORA INFESTANS COM APLICAÇÃO PROTETORA
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TABELA 21. EFICÁCIA DE METABÓLITOS CONTRA O MÍLDIO (HEAD BLIGHT) DO TRIGO CAUSADO POR FUSARIUM GRAMINEARUM COM APLICAÇÃO PROTETORA
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TABELA 22. EFICÁCIA DE METABÓLITOS CONTRA O MÍLDIO DO TRIGO CAUSADO POR SEPTORIA TRITICI COM APLICAÇÃO PROTETORA
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EXEMPLO 10: COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE DAS LINHAGENS DE PAENIBACILLUS POLYMYXA NOV. SSP. PLANTARUM LU16674 E LU17007 COM PAENIBACILLUS POLYMYXA NOV. SSP. PLANTARUM M-1 CONTRA VÁRIOS PATÓGENOS EM ENSAIOS EM
ESTUFAS
[354] O caldo de cultura total de culturas com 6 dias de idade da linhagem de Paenibacillus Lu17007, Lu16674 e M1 foi obtido de acordo com o Exemplo de uso 3 e utilizado como na configuração experimental do Exemplo de uso 5.1 a 5.5. Os ensaios em estufa foram realizados como descrito nos Exemplos de uso 5.1 a 5.5 acima para os respectivos patógenos. A extensão do ataque fúngico nas folhas foi avaliada visualmente 5a 7 dias após a inoculação.
[355] Notavelmente, as linhagens de Paenibacillus Lu16774 e Lu17007 foram eficazes no controle de doenças fúngicas em plantas de cultura importantes, mesmo em elevados fatores de diluição e mostraram maior eficácia antifúngica do que a linhagem intimamente relacionada M-1 (Tabelas 22 a 27).
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EXEMPLO 11 - EXEMPLOS RELATIVOS ÀS MISTURAS E COMPOSIÇÕES DA INVENÇÃO
[356] Os compostos ativos foram formulados separadamente como uma solução estoque tendo uma concentração de 10000 ppm em dimetil sulfóxido. Paenibacillus LU17007 foi utilizada como uma formulação experimental e diluída com água até à concentração determinada do composto ativo. O produto picarbutrazox foi utilizado como formulações acabadas comerciais e diluído com água até à concentração determinada do composto ativo. 1. ATIVIDADE CONTRA O FUNGO CINZENTO BOTRYTIS CINEREA NO TESTE DE MICROTÍTULO (BOTRCI)
[357] As soluções estoque foram misturadas de acordo com a razão, pipetadas para uma placa de microtitulação (MTP) e diluídas com água até às concentrações indicadas. Uma suspensão de esporos de Botrci cinerea em uma solução aquosa de biomalte ou levedura-bactopeptona-acetato de sódio foi então adicionada. As placas foram colocadas em uma câmara saturada com vapor de água a uma temperatura de 18 °C. Usando um fotômetro de absorção, os MTPs foram medidos a 405 nm, 7 dias após a inoculação. Os resultados estão representados na Tabela 28. 2. ATIVIDADE CONTRA A EXPLOSÃO DE ARROZ PYRICULARIA ORYZAE NO TESTE DE MICROTÍTULO (PYRIOR)
[358] As soluções estoque foram misturadas de acordo com a razão, pipetadas para uma placa de microtitulação (MTP) e diluídas com água até às concentrações indicadas. Uma suspensão de esporos de Pyricularia oryzae em uma solução aquosa de biomalte ou levedura-bactopeptona-glicerina foi então adicionada. As placas foram colocadas em uma câmara saturada com vapor de água a uma temperatura de 18 °C. Usando um fotômetro de absorção, os MTPs foram medidos a 405 nm, 7 dias após a inoculação. Os resultados estão representados na Tabela 29. 3. ATIVIDADE CONTRA A MANCHA FOLIAR DO TRIGO CAUSADA POR SEPTORIA TRITICI (SEPTTR)
[359] As soluções estoque foram misturadas de acordo com a razão, pipetadas para uma placa de microtitulação (MTP) e diluídas com água até às concentrações indicadas. Uma suspensão de esporos de Septoria tritici em uma solução aquosa de biomalte ou levedura-bactopeptona-glicerina foi então adicionada. As placas foram colocadas em uma câmara saturada com vapor de água a uma temperatura de 18 °C. Usando um fotômetro de absorção, os MTPs foram medidos a 405 nm, 7 dias após a inoculação. Os resultados estão representados na Tabela 30. 4. ATIVIDADE CONTRA A REQUEIMA CAUSADA POR ALTERNARIA SOLANI (ALTESO)
[360] As soluções estoque foram misturadas de acordo com a razão, pipetadas para uma placa de microtitulação (MTP) e diluídas com água até às concentrações indicadas. Uma suspensão de esporos de Alternaria solani em uma solução aquosa de biomalte ou levedura-bactopeptona-glicerina foi então adicionada. As placas foram colocadas em uma câmara saturada com vapor de água a uma temperatura de 18 °C. Usando um fotômetro de absorção, os MTPs foram medidos a 405 nm, 7 dias após a inoculação. Os resultados estão representados na Tabela 31. 5. ATIVIDADE CONTRA MANCHAS FOLIARES DO TRIGO CAUSADAS POR LEPTOSPHAERIA NO-DORUM (LEPTNO)
[361] As soluções estoque foram misturadas de acordo com a razão, pipetadas para uma placa de microtitulação (MTP) e diluídas com água até às concentrações indicadas. Uma suspensão de esporos de Leptosphaeria nodorum em uma solução aquosa de biomalte ou levedura-bactopeptona- glicerina foi então adicionada. As placas foram colocadas em uma câmara saturada com vapor de água a uma temperatura de 18 °C. Usando um fotômetro de absorção, os MTPs foram medidos a 405 nm, 7 dias após a inoculação. Os resultados estão representados na Tabela 32.
[362] Os parâmetros medidos foram comparados com o crescimento da variante controle sem composto ativo (100%) e o valor em branco livre de composto ativo livre de fungos para determinar o crescimento relativo em % dos patógenos nos respectivos compostos ativos. Estas percentagens foram convertidas em eficácias. cálculo da eficácia esperada (E colby) usando a fórmula de colby
[363] As eficácias esperadas das combinações de compostos ativos foram determinadas utilizando a fórmula de Colby (Colby, S.R. “Calculating sinergistic and antagonistic responses of herbicide combinations”, Weeds 15, pp. 20-22, 1967) e comparadas com as eficácias observadas. Fórmula de Colby: EColby = PA + PB - PA* PB / 100 - eficácia esperada de EColby, expressa em % do controle não tratado, quando se utiliza a mistura dos compostos ativos A e B nas concentrações a e b - eficácia PA, expressa em % do controle não tratado, quando se utiliza o composto ativo A na concentração a - eficácia PB, expressa em % do controle não tratado, quando se utiliza o composto ativo B na concentração b. Cálculo do fator de sinergia (SF)
[364] Para uma determinação do sinergismo do Fator de sinergia (SF) entre a eficácia experimental observada das misturas Emedido e a eficácia esperada da mistura EColby é calculado como SF = Emedido / EColby
[365] Um fator de sinergia maior ou menor que 1 indica um desvio da hipótese de ação independente, o que significa que, biologicamente, os dois componentes agem juntos ou uns contra os outros. Se SF > 1, sinergismo é observado; se SF < 1, o antagonismo é observado. TABELA 28. BOTRCI
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O mefentrifluconazol é 2- [4- (4-clorofenoxi) -2- (trifluormetil) fenil] -1- (1H-1,2,4- triazol-1-il) propan-2-ol.
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O mefentrifluconazol é 2- [4- (4-clorofenoxi) -2- (trifluormetil) fenil] -1- (1H-1,2,4- triazol-1-il) propan-2-ol.
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O mefentrifluconazol é 2- [4- (4-clorofenoxi) -2- (trifluormetil) fenil] -1- (1H-1,2,4- triazol-1-il) propan-2-ol.
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O mefentrifluconazol é 2- [4- (4-clorofenoxi) -2- (trifluormetil) fenil] -1- (1H-1,2,4- triazol-1-il) propan-2-ol.
[366] Os documentos aqui citados são incorporados por referência.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:
[367] Figura 1. Compostos 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4A, 4B, 5A e 5B.
[368] Figura 2. Correlações chave de NOESY e COSY do composto 1B.
[369] Figura 3. Correlação de HMBC do composto 1B.
[370] Figura 4. Padrões de fragmentação a) de composto 1A e b) de um composto B.
[371] Figura 5. Padrões de fragmentação a) do composto 2A (fusaricidina C) e b) do composto 2B (fusaricidina D).
[372] Figura 6. Padrão de fragmentação do composto 3 (LI-F08b).
[373] Figura 7. Padrões de fragmentação a) do composto 4A (LI- F06a) e b) do composto 4B (LI-F06b).
[374] Figura 8. Padrões de fragmentação a) do composto 5A (fusaricidina A) e b) do composto 5B (fusaricidina B).
[375] A Figura 9 mostra a identidade percentual da sequência completa de rDNA 16S das linhagens de Paenibacillus da invenção para os táxons relacionados após o alinhamento de múltiplas sequências.
[376] Legenda: * Números de linhagens: 1 = linhagem de Paenibacillus Lu16774; 2 = linhagem de Paenibacillus Lu17015; 3 = linhagem de Paenibacillus Lu17007; 4 = Paenibacillus peoriae NRRL BD-62; 5 = Paenibacillus anaericanus MH21; 6 = Paenibacillus brasiliensis PB172; 7 = Paenibacillus campinasensis 324; 8 = Paenibacillus chibensis JCM 9905; 9 = Paenibacillus glucanolyticus DSM 5162; 10 = Paenibacillus hunanensis FeL05; 11 = Paenibacillus jamilae CECT 5266; 12 = Paenibacillus kribbensis AM49; 13 = Paenibacillus lactis MB 1871; 14 = Paenibacillus lautus JCM 9073; 15 = Paenibacillus macerans IAM 12467; 16 = Paenibacillus massiliensis 2301065; 17 = Paenibacillus pabuli HSCC 492; 18 = Paenibacillus peoriae DSM 8320 (BD- 57); 19 = Paenibacillus pini S22; 20 = Paenibacillus polymyxa IAM 13419; 21 = Paenibacillus purispatii ES_MS17; 22 = Paenibacillus sediminis GT-H3; 23 = Paenibacillus terrae AM141; 24 = Paenibacillus terrigena A35; 25 = Paenibacillus timonensis 2301032; 26 = Paenibacillus turicensis MOL722; 27 = Paenibacillus uliginis N3/975; 28 = Cohnella thermotolerans CCUG 47242. As linhagens 6 a 28 são linhagens tipo para as espécies respectivas.
[377] As semelhanças entre as linhagens Lu16774, Lu17007 e Lu17015 com Paenibacillus peoriae (NRRL BD-62 e DSM 8320) foram marcadas a negrito.
[378] A Figura 10 mostra um dendrograma filogenético calculado a partir da % de identidade das sequências de rDNA 16S das linhagens de Paenibacillus da invenção com outros táxons (Figura 9). A raiz da árvore foi determinada incluindo a sequência do gene rRNA 16S de Cohnella thermotolerans na análise. A barra de escala abaixo do dendrograma indica 1 substituições de nucleotídeo por 100 nucleotídeos.
[379] A Figura 11 mostra o padrão RiboPrint obtido a partir de amostras das linhagens de Paenibacillus da invenção em comparação com uma amostra da linhagem de P. peoriae BD-62 intimamente relacionada utilizando o Sistema de Caracterização Microbiana RiboPrinter e um dendrograma filogenético daí resultante.
[380] A Figura 12 mostra a porcentagem de identidade da sequência de DNA do gene dnaN das linhagens de Paenibacillus da invenção em relação a linhagens de Paenibacillus relacionadas após alinhamento de sequências múltiplas.
[381] Legenda: * Números de linhagens: 1 = linhagem de Paenibacillus Lu16774; 2 = linhagem de Paenibacillus Lu17007; 3 = linhagem de Paenibacillus Lu17015; 4 = P. peoriae DSM 8320T = KCTC 3763T (número de acesso GenBank AGFX00000000; J. Bacteriol. 194, 1237-1238, 2012); 5 = P. polymyxa 1-43 (número de acesso GenBank ASRZ01000000; depósito n° GCMCC 4965; CN 102352332 B); 6 = P. polymyxa A18 (número de acesso GenBank JWJJ00000000.1; NCBI Project ID 225496); 7 = P. polymyxa ATCC 842T = DSM 36T = KCTC 3858T (número de acesso GenBank AFOX00000000; J. Bacteriol. 193 (18), 5026-5027, 2011); 8 = P. polymyxa CF05 (número de acesso GenBank CP009909; Genome Announc 3 (2): e00198-15. Doi: 10.1128/genomeA.00198-15); 9 = P. polymyxa CICC 10580 (número de acesso GenBank JNCB00000000; Genome Announc. 2 (4): e00854-14. Doi: 10.1128/genomeA.00854-14); 10= P. polymyxa DSM 365 (número de acesso GenBank JMIQ00000000; J. Biotechnol. 195, 72-73, 2015); 11 = P. polymyxa E681 (número de acesso GenBank CP000154; GenomeNet Ref Seq NC_014483.2; J. Bacteriol. 192 (22), 6103-6104, 2010); 12 = P. polymyxa M-1 (número de acesso GenBank HE577054.1; GenomeNet Ref Seq NC_017542.1); 13 = P. polymyxa NRRL B-30509 (número de acesso GenBank JTHO00000000; Genome Announc. 2015 mar-Abr; 3 (2): e00372-15); 14 = P. polymyxa SC2 (GenBank n° de acesso CP002213; J. Bacteriol. 193 (1), 311 -312, 2011); 15 = P. polymyxa SQR-21 (número de acesso GenBank CP006872; GenomeNet Ref Seq NZ_CP006872.1; Genome Announc. 2014 mar-Abr; 2 (2): e00281-14); 16 = P. polymyxa Sb3-1 (número de acesso GenBank CP010268; Genome Announc. 2015 mar-abr; 3 (2): e00052-15); 17 = P. polymyxa TD94 (número de acesso GenBank ASSA00000000); 17 = P. polymyxa WLY78 (GenBank acc. no. ALJV00000000); P. terrae HPL-003 (número de acesso GenBank CP003107; NCBI Ref Seq NC_016641.1); P. polymyxa CR1 (número de acesso GenBank CP006941; Genome Announc. 2014 Jan-Feb; 2 (1): e01218-13).
[382] A Figura 13 mostra a porcentagem de identidade da sequência de DNA do gene gyrB completo das linhagens de Paenibacillus da invenção em relação a linhagens de Paenibacillus relacionadas após alinhamento de sequências múltiplas. Os números das linhagens estão descritos na Legenda da Figura 12.
[383] A Figura 14 mostra a porcentagem de identidade da sequência de DNA do gene recF completo das linhagens de Paenibacillus da invenção em relação a linhagens de Paenibacillus relacionadas após alinhamento de sequências múltiplas. Os números das linhagens estão descritos na Legenda da Figura 12.
[384] A Figura 15 mostra a porcentagem de identidade da sequência de DNA do gene recN completo das linhagens de Paenibacillus da invenção em relação a linhagens de Paenibacillus relacionadas após alinhamento de sequências múltiplas. Os números das linhagens estão descritos na legenda da Figura 12.
[385] A Figura 16 mostra a porcentagem de identidade da sequência de DNA do gene rpoA completo das linhagens de Paenibacillus da invenção em relação a linhagens de Paenibacillus relacionadas após alinhamento de sequências múltiplas. Os números das linhagens estão descritos na legenda da Figura 12.
[386] A Figura 17 mostra o dendrograma de máxima verossimilhança com base na sequência completa do gene dnaN das linhagens do complexo de P. polymyxa. A escala de 0,1 mostrada corresponde a 1% de trocas de nucleotídeos.
[387] A Figura 18 mostra o dendrograma de máxima verossimilhança com base na sequência completa do gene gyrB das linhagens do complexo de P. polymyxa. A escala de 0,1 mostrada corresponde a 1% de trocas de nucleotídeos.
[388] A Figura 19 mostra o dendrograma de máxima verossimilhança com base na sequência completa do gene recF de linhagens do complexo de P. polymyxa. A escala de 0,1 mostrada corresponde a 1% de trocas de nucleotídeos.
[389] A Figura 20 mostra o dendrograma de máxima verossimilhança com base na sequência completa do gene recN das linhagens do complexo P. polymyxa. A escala de 0,1 mostrada corresponde a 1% de trocas de nucleotídeos.
[390] A Figura 21 mostra o dendrograma de máxima verossimilhança com base na sequência completa do gene rpoA das linhagens do complexo de P. polymyxa. A escala de 0,1 mostrada corresponde a 1% de trocas de nucleotídeos.
[391] A Figura 22 mostra a matriz do Índice de Aminoácidos (AAI) de genomas representativos do complexo de P. polymyxa realizada de acordo com o Exemplo 2.5. Os números das linhagens estão descritos na legenda da Figura 12.

Claims (10)

1. MISTURA, caracterizada por compreender como componentes ativos: 1) pelo menos uma linhagem de Paenibacillus; em que pelo menos uma linhagem de Paenibacillus é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) linhagem de Paenibacillus Lu16774 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26969; b) linhagem de Paenibacillus Lu17007 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26970; c) linhagem de Paenibacillus Lu17015 depositada na DSMZ sob o N° de Acesso DSM 26971; e d) uma linhagem bacteriana que compreende uma sequência de DNA exibindo: d1) sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 9; ou d2) sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 14; ou d3) sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 10; ou d4) sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 15; ou d5) sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 11; ou d6) sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 16; ou d7) sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 12; ou d8) sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 17; ou d9) sequência de nucleotídeos com as sequências de DNA de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 13; ou d10) sequência de nucleotídeos com a sequência de DNA de SEQ ID NO: 18, em que pelo menos uma linhagem de Paenibacillus é capaz de produzir pelo menos um dos seguintes compostos:
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em um meio de crescimento compreendendo pelo menos uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio, e 2) pelo menos um pesticida II selecionado a partir dos grupos A) a K): A) Inibidores de respiração - Inibidores do complexo III no sítio de Qo: azoxistrobin, dimoxistrobin, orisastrobin, picoxistrobin, piraclostrobin, trifloxistrobin; - Inibidores do complexo II: benzovindiflupir, bixafen, fluopiram, fluxapiroxad, penflufen, pentiopirad, sedaxano, siltiofam; B) Inibidores da biossíntese de esteróis (fungicidas SBI) - Inibidores da desmetilase C14: difenoconazol, epoxiconazol, ipconazol, metconazol, protioconazol, tebuconazol, triadimenol, triticonazol, 2[4- (4- clorofenoxi) - 2- (trifluorometil) fenil] - 1- (1,2,4- triazol- 1- il) propan- 2- ol, procloraz; C) Inibidores da síntese de ácidos nucleicos - Fungicidas de fenilamidas ou de aminoácidos de acila: metalaxil, metalaxil- M; D) Inibidores da divisão celular e do citoesqueleto - Inibidores da tubulina: tiabendazol, tiofanato- metil, etaboxam; E) Inibidores da síntese de aminoácidos e proteínas - Inibidores da síntese de metionina: pirimetanil; F) Inibidores de transdução de sinal - Inibidores da MAP / histidina quinase: fludioxonil; G) Inibidores de síntese de lipídios e membranas - Biossíntese de fosfolipídios e deposição de parede celular: dimetomorf; H) Inibidores com ação em multiplos sítios - Tiocarbamatos e ditiocarbamatos: tiram; C) Modo de ação desconhecido - Picarbutrazox; em que a mistura compreende o componente 1) e componente 2) em uma quantidade sinergisticamente eficaz.
2. MISTURA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela referida pelo menos uma linhagem de Paenibacillus possuir atividade antifúngica contra pelo menos dois patógenos de planta selecionados a partir do grupo que consiste em Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans e Sclerotinia sclerotiorum.
3. MISTURA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo componente 1) compreender uma cultura substancialmente purificada de pelo menos uma linhagem de Paenibacillus, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.
4. MISTURA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo componente 1) compreender pelo menos um metabólito selecionado a partir dos grupos das polimixinas, octapeptinas, polipeptinas, pelgipeptinas e fusaricidinas.
5. MISTURA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por pelo menos um metabólito ser selecionado a partir de fusaricidinas de fórmula I
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em que R é selecionado a partir de ácido 15-guanidino-3- hidroxipentadecanoico (GHPD) e ácido 12-guanidinododecanoico (12-GDA); X1 é treonina; X2 é selecionado a partir de isoleucina e valina; X3 é selecionado a partir de tirosina, valina, isoleucina e fenilalanina; X4 é treonina; X5 é selecionado a partir de glutamina e asparagina; X6 é alanina; e em que uma seta define uma ligação simples (amida), quer entre a porção carbonila de R e o grupo amino do aminoácido X1 ou entre o grupo carbonila de um aminoácido e o grupo amino de um aminoácido vizinho, no qual a ponta da seta indica a ligação ao grupo amino do referido aminoácido X1 ou do referido aminoácido vizinho; e em que a linha única sem uma ponta de seta define uma ligação simples (éster) entre o grupo carbonila de X6 e o grupo hidroxila de X1.
6. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender uma mistura, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um auxiliar.
7. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por compreender adicionalmente um pesticida III, selecionado a partir de entre os grupos SF) e SI): SF) Fungicidas - inibidores de complexo III no local de Q0 selecionados a partir de: piraclostrobina, azoxistrobina, picoxistrobina, trifloxistrobina, dimoxistrobina, enestroburina, fenaminstrobina, fluoxastrobina, cresoxime-metila, mandestrobina, metominostrobina, orisastrobina, pyrametostrobina, pyraoxystrobin; - inibidores de piridina e pirazole de largo espectro do complexo II selecionados a partir de: fluxapiroxade, boscalide, benzovindiflupir, penflufen, pentiopirid, sedaxano, fluopirame, bixafen, isopirazam; - inibidores específicos dos basidiomicetes do complexo II selecionados a partir de: carboxina, benodanil, fenfuram, flutolanil, furametpir, mepronil, oxicarboxina, tifluzamida; - inibidor da produção de ATP: silthiofam; - compostos fungicidas azol selecionados a partir de: ipconazol, difenoconazol, protioconazol, procloraz, triticonazol, flutriafol, ciproconazol, diniconazol, diniconazol-M, fluquinconazol, flusilazol, hexaconazol, imazalil, imibenconazol, metconazol, miclobutanil, simeconazol, tebuconazol, triadimenol, uniconazol, tiabendazol; - fungicidas de Oomicetos selecionados de: oxathiapiprolin, valifenalato, metalaxyl, metalaxil-M, etaboxam, dimetomorf, zoxamida, flumorfe, mandipropamid, pirimorf, bentiavalicarb, iprovalicarb; - inibidor de MAP/ histidina quinase: fludioxonil; - compostos de benzimidazol selecionados a partir de: tiofanato-metila, carbendazim; - compostos de ditiocarbamato selecionados a partir de: tirame, zirame; SI) Inseticidas - compostos antagonistas de GABA selecionados a partir de: fipronil, etiprole, vaniliprole, pirafluprole, piriprole, ácido 5-amino-1-(2,6-dicloro- 4-metil-fenil)-4-sulfinamoil-1H-pirazole-3-carbotioico amida; - inibidores do receptor de rianodina específicos para lepidópteros selecionados a partir de: clorantraniliprole e flubendiamida; - inibidor do receptor de rianodina de espectro cruzado: ciantraniliprole; - moduladores do canal de sódio piretroide selecionados a partir de: teflutrina, bifentrina, cipermetrina, alfa-cipermetrina, ciflutrina, beta- ciflutrina, lambda-cialotrina, deltametrina, esfenvalerato, etofenprox, fenvalerato, flucitrinato, permetrina; - compostos neonicotinoides sistemicamente ativos: clotianidina, imidaclopride, tiametoxam, dinotefurano, acetamipride, flupiradifurona, tiaclopride, triflumezopirim, nitenpiram; - Inibidores da acetilcolinesterase, ativadores dos canais de cloreto e sulfoximinas: sulfoxaflor, acefato, clorpirifos, tiodicarbe, abamectina, espinosade; - outro inseticida: tioxazafen.
8. MATERIAL DE PROPAGAÇÃO DE PLANTAS, caracterizado por possuir um revestimento compreendendo uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 7.
9. USO DE UMA MISTURA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado por ser para controlar ou suprimir patógenos de plantas em plantas ou prevenir infecção por patógenos de plantas ou para proteção de materiais contra destruição e infestação por microorganismos nocivos.
10. MÉTODO DE CONTROLE, SUPRESSÃO DE PATÓGENOS EM PLANTAS OU PREVENÇÃO DE INFECÇÃO DE PLANTAS POR PATÓGENOS, caracterizado pelos patógenos, seu habitat ou os materiais ou plantas a serem protegidas contra o ataque de agentes patogênicos, ou o solo ou o material de propagação serem tratados com uma quantidade eficaz de uma mistura, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou com uma quantidade eficaz de uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 7.
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