CN111253467B - 新型镰孢菌素及其制备方法和应用 - Google Patents

新型镰孢菌素及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了新型镰孢菌素及其制备方法和应用。具体的，本发明的镰孢菌素具有式I结构：
Figure DDA0001889126870000011
式中，R为

Description

新型镰孢菌素及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及农业化学领域，具体涉及新型镰孢菌素及其制备方法和应用。
背景技术
小麦赤霉病是由多种镰孢菌引发小麦常见的农业病害。镰孢菌为兼性寄生菌，属子囊真菌亚门肉座菌目(Hypocreales)。小麦赤霉病和小麦茎基腐的病原优势菌种为禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)，湿热、风雨等气候条件有助于其快速扩散繁殖。选育优良的小麦抗病品系是防治小麦赤霉病的根本措施，但是目前仍未培育出高效、稳定的抗病小麦品种。一方面，与其他病害相比，小麦赤霉病高效抗性种质资源非常缺乏，给选育抗性植株带来难度；另一方面，禾谷镰孢菌侵染小麦的病理机制十分复杂，目前尚未得到完全解析，从而阻碍了小麦赤霉病抗性育种的研究进展。通过深入解析禾谷镰孢菌侵染小麦植物细胞过程时的致病分子机制有助于研发持久有效的抗病小麦品系。
禾谷镰孢菌全基因组数据分析表明禾谷镰孢菌中含有67个次级代谢产物生物合成基因簇，仅有11个基因簇负责产生的次级代谢产物化学结构被鉴定，但目前尚未确定禾谷镰孢菌侵染小麦过程中发挥实效的毒素分子，无法为小麦赤霉病病病理分子机制研究提供有效可靠的化学结构信息。
因此，本领域急需分离鉴定影响禾谷镰孢菌能否侵染小麦的新型毒素分子，从而为小麦赤霉病病理分子机制研究提供化学依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种影响禾谷镰孢菌能否侵染小麦的新型镰孢菌素。
本发明的第一方面，提供了一种镰孢菌素或其盐、或其酯，所述的镰孢菌素具有式I结构：
Figure BDA0001889126850000021
式中，
R为
Figure BDA0001889126850000022
在另一优选例中，所述的镰孢菌素选自下组：镰孢菌素A、镰孢菌素B、或其组合，
Figure BDA0001889126850000023
镰孢菌素A(fusaoctoxin A)、
Figure BDA0001889126850000024
镰孢菌素B(fusaoctaxin B)。
在另一优选例中，所述的镰孢菌素是从镰孢菌属真菌中分离得到的。
在另一优选例中，所述的镰孢菌素是化学合成的。
在本发明的第二方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的镰孢菌素素或其盐、或其酯的方法，包括步骤：
(a)提供镰孢菌属真菌的发酵产物，惰性溶剂提取得提取液；
(b)将提取物经小孔吸附树脂(MCI)色谱柱分离，收集含有所述镰孢菌素的组分I；
(c)将组分I经凝胶色谱柱分离，收集含有所述镰孢菌素的组分II；
(d)将组分II经反相硅胶色谱柱分离，得到所述镰孢菌素。
在另一优选例中，所述镰孢菌属真菌选自下组：禾谷镰孢菌(F.graminearum PH-1)NRRL 31084、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)NRRL32931、小麦冠腐病菌(F.pseudograminearum)CS3096、黄色镰刀菌(F.culmorum)CS7071、燕麦镰刀菌(F.avenaceum)Fa05001和锐顶镰刀菌(F.acuminatum)CS5907。
在另一优选例中，所述用于发酵的镰孢菌属真菌为禾谷镰孢菌(F.graminearumPH-1)NRRL 31084的fgm4基因过表达突变株。
在另一优选例中，所述提取具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述提取的惰性溶剂选自下组：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿，及其组合，较佳地为甲醇、乙腈，更佳地为甲醇；
2)所述提取的次数为1-5次，较佳地为2-4次，更佳地为3-4次；
3)所述提取的时间为每次10-60min，较佳地为20-40min，更佳地为25-35min。
在另一优选例中，在每次色谱分离进样前，所述提取液、组分I、组分II在色谱进样前经过合并、浓缩、复溶。
在另一优选例中，所述小孔吸附树脂(MCI)色谱柱分离的洗脱方法具有选自下组的一个或多个特征：
1)洗脱程序为10％-30％-50％-70％-90％甲醇-水，(按洗脱液总体积计)，等梯度洗脱；
2)小孔吸附树脂用量为进样样品质量的20-100倍，较佳地为30-60倍；
3)每个梯度的洗脱液用量为1-30倍柱体积，较佳地为2-20倍，更佳地为3-15倍。
在另一优选例中，所述组分I为50％甲醇洗脱液。
在另一优选例中，所述凝胶色谱柱分离具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述凝胶色谱柱的凝胶选自：羟丙基葡聚糖凝胶或交联葡聚糖凝胶；
2)洗脱液选自：甲醇、乙腈，较佳地为，甲醇。
在另一优选例中，所述反相硅胶色谱柱分离具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述反相硅胶色谱柱为C18色谱柱；
2)洗脱液为含有0.1％甲酸的30％乙腈-水等度洗脱，按洗脱液总体积计。
在另一优选例中，所述的发酵产物为镰孢菌属真菌在大米培养基上进行发酵的发酵产物。
在本发明的第三方面，还提供了一种制备如本发明第一方面所述的镰孢菌素或其盐、或其酯的方法，包括步骤：
(a)按照式I化合物的结构，以树脂作为固定相，采用相应构型的标准氨基酸为原料，通过固相合成法从D-亮氨酸开始合成，得到结构式I中不含L-亮氨醇的肽链；
(b)使用切割液将肽链从固定相中离去；
(c)将肽链C端羧基在偶联试剂存在下，与N-羟基琥珀酰亚胺反应生成N-羟基琥珀酰亚胺酯后与L-亮氨醇发生酰胺反应；
(d)脱保护后最终得到所述镰孢菌素。
在另一优选例中，所述固相合成法的树脂选自：交联聚苯乙烯类、聚酰胺类、聚乙烯乙二醇类。
在另一优选例中，所述步骤(a)期间用检测试剂茚三酮检测合成产物。
在另一优选例中，所述切割液组成为95％TFA(三氟乙酸)，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水，按切割液总体积计。
在另一优选例中，所述偶联试剂选自：二环己基碳二亚胺(DCC)、碳二亚胺(EDC)。
在另一优选例中，所述脱保护的脱保护液为95％三氟乙酸-水溶液，按脱保护液总体积计。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(e)将步骤(d)得到的镰孢菌素经色谱分离纯化得到镰孢菌素精品。
在另一优选例中，所述色谱分离具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述反相硅胶色谱柱为C18色谱柱；
2)洗脱液为含有0.1％甲酸的30％乙腈-水等度洗脱，按洗脱液总体积计。
在另一优选例中，所述镰孢菌素精品纯度≥98％，按总质量计。
在本发明的第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述的镰孢菌素或其盐、或其酯的对照品或标准品，所述对照品或标准品中权利要求1所述的寡肽衍生物含量≥95％，较佳地为≥98％，更佳地为≥99％，最佳地为≥99.8％,按所述对照品或标准品总质量计。
在本发明的第五方面，提供了一种筛选用于防治小麦赤霉病的潜在化合物的方法，包括步骤：
(a)在测试组中，在测试化合物存在下，培养禾谷镰孢菌；同时，在对照组中，在测试化合物不存在下，培养禾谷镰孢菌；
(b)测定测试组中的禾谷镰孢菌发酵产物中的镰孢菌素的数量M1或浓度C1，并与对照组中的禾谷镰孢菌发酵产物中的镰孢菌素的数量M0或浓度C0进行比较；
其中，如果所述数量M1显著低于所述数量M0或所述浓度C1显著低于所述浓度C0，则提示所述测试化合物是防治小麦赤霉病的潜在化合物。
在另一优选例中，所述的镰孢菌素选自下组：镰孢菌素A、镰孢菌素B、或其组合。
在另一优选例中，所述的显著低于指M1/M0≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述的显著低于指C1/C0≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述测试组和对照组中除了测试化合物存在和不存在之外，其他条件相同或基本相同。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明实施例3的分离纯化技术路线图。
图2为镰孢菌素fusaoctaxin A的核磁1H-1H相关信号(COSY)和1H-13C相关信号(HMBC)示意图。
图3为镰孢菌素fusaoctaxin A绝对构型鉴定和H、C化学位移数据归属：a，Marfey方法分析fusaoctaxin A中氨基酸构型的提取离子色谱图；b，异亮氨酸C-9、C-10手性中心相对构型分析示意图；c，天然fusaoctaxin A与合成的fusaoctaxin A的核磁H、C化学位移数据归属。
图4为镰孢菌素fusaoctaxin B的1H-1H相关信号(COSY)和1H-13C相关信号(HMBC)示意图。
图5为化合物B的结构表征谱图。镰孢菌素fusaoctaxin B绝对构型鉴定和H、C化学位移数据归属：a，Marfey方法分析fusaoctaxin B中氨基酸构型的提取离子色谱图；b，异亮氨酸C-9、C-10手性中心相对构型分析示意图；c，天然fusaoctaxin B的H、C化学位移数据归属。
图6为实施例7的无菌、禾谷镰孢菌和禾谷镰孢菌fg3_54敲除株侵染后小麦胚芽鞘(上)和麦穗(下)的LCMS提取离子色谱图和质谱图。
图7为小麦侵染部位病斑图片。
图8为小麦侵染部位病斑面积统计直方图。
图9为fusaoctaxin A的1H-13C异核单量子相关谱(HSQC)。
图10为fusaoctaxin A的1H-1H化学位移相关谱(1H-1H COSY)。
图11为fusaoctaxin A的1H-13C异核多健相关谱(HMBC)。
图12为fusaoctaxin A的旋转坐标系核Overhauser效应相关谱(ROESY)。
图13为fusaoctaxin B的1H-13C异核单量子相关谱(HSQC)。
图14为fusaoctaxin B的1H-1H化学位移相关谱(1H-1H COSY)。
图15为fusaoctaxin B的1H-13C异核多健相关谱(HMBC)。
图16为fusaoctaxin B的旋转坐标系核Overhauser效应相关谱(ROESY)。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，首次分离鉴定了新型的镰孢菌素分子，令人惊讶地，本发明的镰孢菌素在禾谷镰孢菌侵染小麦时产生并对禾谷镰孢菌能否侵染小麦产生重要影响，当不存在本发明的镰孢菌素时，禾谷镰孢菌不能或基本上不能侵染小麦，可见本发明的镰孢菌素可为小麦赤霉病的致病机理和防治研究提供有效可靠的化学结构信息。在此基础上完成本发明
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“敲除株”、“FG-Δfg3_54突变株”、“敲除突变株”可互换使用，指本发明所用野生型禾谷镰孢菌F.graminearum PH-1(NRRL 31084)的Δfg3_54基因簇敲除突变株(FG-Δfg3_54)。
如本文所用，术语“镰孢菌素A”“Fusaoctaxin A”、“FA”可互换使用，指本发明分离鉴定的禾谷镰孢菌新型毒素A，同样地，“镰孢菌素B”“FusaoctaxinB”、“FB”可互换使用，指本发明分离鉴定的禾谷镰孢菌新型毒素B。
如本文所用，本发明的镰孢菌素A可表示为序列“GABA1-L-Ala2-D-allo-Ile3-D-Ser4-D-Val5-D-Ser6-D-Leu7-L-Leuol8”、镰孢菌素B可表示为序列GAA1-L-Ala2-D-allo-Ile3-D-Ser4-D-Val5-D-Ser6-D-Leu7-L-Leuol8。
分离纯化制备方法
本发明提供了一种从发酵液分离纯化制备本发明所述的镰孢菌素或其盐、或其酯的方法，包括步骤：
(a)提供镰孢菌属真菌的发酵产物，惰性溶剂提取得提取液；
(b)将提取物经小孔吸附树脂(MCI)色谱柱分离，收集含有所述镰孢菌素的组分I；
(c)将组分I经凝胶色谱柱分离，收集含有所述镰孢菌素的组分II；
(d)将组分II经反相硅胶色谱柱分离，得到所述镰孢菌素。
在另一优选例中，所述镰孢菌属真菌选自下组：禾谷镰孢菌(F.graminearumPH-1)NRRL 31084、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)NRRL32931、小麦冠腐病菌(F.pseudograminearum)CS3096、黄色镰刀菌(F.culmorum)CS7071、燕麦镰刀菌(F.avenaceum)Fa05001和锐顶镰刀菌(F.acuminatum)CS5907。
在另一优选例中，所述用于发酵的镰孢菌属真菌为禾谷镰孢菌(F.graminearumPH-1)NRRL 31084的fgm4基因过表达突变株。
在另一优选例中，所述提取具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述提取的惰性溶剂选自下组：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿，及其组合，较佳地为甲醇、乙腈，更佳地为甲醇；
2)所述提取的次数为1-5次，较佳地为2-4次，更佳地为3-4次；
3)所述提取的时间为每次10-60min，较佳地为20-40min，更佳地为25-35min。
在另一优选例中，在每次色谱分离进样前，所述提取液、组分I、组分II在色谱进样前经过合并、浓缩、复溶。
在另一优选例中，所述小孔吸附树脂(MCI)色谱柱分离的洗脱方法具有选自下组的一个或多个特征：
1)洗脱程序为10％-30％-50％-70％-90％甲醇-水，(按洗脱液总体积计)，等梯度洗脱；
2)小孔吸附树脂用量为进样样品质量的20-100倍，较佳地为30-60倍；
3)每个梯度的洗脱液用量为1-30倍柱体积，较佳地为2-20倍，更佳地为3-15倍。
在另一优选例中，所述组分I为50％甲醇洗脱液。
在另一优选例中，所述凝胶色谱柱分离具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述凝胶色谱柱的凝胶选自：羟丙基葡聚糖凝胶或交联葡聚糖凝胶；
2)洗脱液选自：甲醇、乙腈，较佳地为，甲醇。
在另一优选例中，所述反相硅胶色谱柱分离具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述反相硅胶色谱柱为C18色谱柱；
2)洗脱液为含有0.1％甲酸的30％乙腈-水等度洗脱，按洗脱液总体积计。
在另一优选例中，所述的发酵产物为镰孢菌属真菌在大米培养基上进行发酵的发酵产物。
合成制备方法
还提供了一种合成制备如本发明所述的镰孢菌素素或其盐、或其酯的方法，包括步骤：
(a)按照式I化合物的结构，以树脂作为固定相，采用相应构型的标准氨基酸为原料，通过固相合成法从D-亮氨酸开始合成，得到结构式I中不含L-亮氨醇的肽链；
(b)使用切割液将肽链从固定相中离去；
(c)将肽链C端羧基在偶联试剂存在下，与N-羟基琥珀酰亚胺反应生成N-羟基琥珀酰亚胺酯后与L-亮氨醇发生酰胺反应；
(d)脱保护后最终得到所述镰孢菌素。
在另一优选例中，所述固相合成法的树脂选自：交联聚苯乙烯类、聚酰胺类、聚乙烯乙二醇类。
在另一优选例中，所述步骤(a)期间用检测试剂茚三酮检测合成产物。
在另一优选例中，所述切割液组成为95％三氟乙酸(TFA)，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水，按切割液总体积计。
在另一优选例中，所述偶联试剂选自：二环己基碳二亚胺(DCC)、碳二亚胺(EDC)。
在另一优选例中，所述脱保护的脱保护液为95％三氟乙酸-水溶液，按脱保护液总体积计。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(e)将步骤(d)得到的镰孢菌素经色谱分离纯化得到镰孢菌素精品。
在另一优选例中，所述色谱分离具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述反相硅胶色谱柱为C18色谱柱；
2)洗脱液为含有0.1％甲酸的30％乙腈-水等度洗脱，按洗脱液总体积计。
在另一优选例中，所述镰孢菌素精品纯度≥98％，按总质量计。
镰孢菌素盐的合成
本发明所述的镰孢菌素可通过常规方法转化盐，例如，可将相应的酸的溶液加入到所述的镰孢菌素的溶液中，成盐完全后减压除去溶剂即得本发明所述毒素相应的盐。
一类适合形成盐的酸包括(但并不限于)：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
用于防治小麦赤霉病的潜在化合物的筛选方法
在本发明中，提供了一种筛选用于防治小麦赤霉病的潜在化合物的方法，包括步骤：
(a)在测试组中，在测试化合物存在下，培养禾谷镰孢菌；同时，在对照组中，在测试化合物不存在下，培养禾谷镰孢菌；
(b)测定测试组中的禾谷镰孢菌发酵产物中的镰孢菌素的数量M1或浓度C1，并与对照组中的禾谷镰孢菌发酵产物中的镰孢菌素的数量M0或浓度C0进行比较；
其中，如果所述数量M1显著低于所述数量M0或所述浓度C1显著低于所述浓度C0，则提示所述测试化合物是防治小麦赤霉病的潜在化合物。
在另一优选例中，所述的镰孢菌素选自下组：镰孢菌素A、镰孢菌素B、或其组合。
在另一优选例中，所述的显著低于指M1/M0≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述的显著低于指C1/C0≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述测试组和对照组中除了测试化合物存在和不存在之外，其他条件相同或基本相同。
本发明的主要优点包括：
1.本发明首次分离鉴定了新型的镰孢菌素分子。
2.实验证明，本发明的镰孢菌素在禾谷镰孢菌侵染小麦时产生并对禾谷镰孢菌能否侵染小麦产生重要影响，当不存在本发明的镰孢菌素时，禾谷镰孢菌不能或基本上不能侵染小麦，可见本发明的镰孢菌素可为小麦赤霉病的致病机理和防治研究提供有效可靠的化学结构信息。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
菌株的制备
产生菌株：野生型禾谷镰孢菌F.graminearum PH-1(NRRL 31084)的fgm4基因过表达突变株(WT-OE::FGM4)。FGM4是fg3_54基因簇内的转录调控因子，可通过增加fgm4基因表达量促使fg3_54基因簇的表达。利用反转录获得禾谷镰孢菌fgm4基因的cDNA并进行体外PCR克隆，将fgm4基因片段构建到含有pEF1启动子的载体上，随后将构建完成的质粒线性化，利用聚乙二醇介导的原生质体转化方法将线性化质粒整合到野生型禾谷镰孢菌基因组中，使fgm4能够在野生型菌株中组成型表达。
对照菌株：野生型禾谷镰孢菌F.graminearum PH-1(NRRL 31084)的Δfg3_54基因簇敲除突变株(FG-Δfg3_54)。禾谷镰孢菌F.graminearum PH-1(NRRL 31084)作为野生型菌株(FG-WT)，利用同源重组及聚乙二醇介导的原生质体转化方法将野生型菌株中目的基因(fg3_54)替换为抗性基因(hph)，利用抗生素平板进行筛选以获取基因敲除突变体(FG-Δfg3_54)。
实施例2
发酵培养
产生菌株(WT-OE::FGM4)接种CM固体平板中央，28℃培养箱中静置活化培养3天。无菌竹签挑取边缘菌丝转接至含有150mL CM液体培养基的500mL锥形瓶中，28℃、150rpm摇瓶培养3天制备种子液。吸取5ml种子液转接到大米培养基中，28℃静置培养4天。
实施例3
FA和FB的提取和分离纯化：
分离纯化路线图如图1所示。
甲醇浸泡大米培养物，超声提取三次，每次30min，过滤获得甲醇提取液。合并甲醇提取液，旋蒸浓缩除去甲醇获得粗提物浸膏。粗提物浸膏甲醇复溶，干法上样小孔吸附树脂(MCI)色谱柱，洗脱方法采用10％-30％-50％-70％-90％等梯度洗脱，每个梯度洗脱500mL洗脱液。浓缩合并含有fusaoctaxins化合物组分F3(50％甲醇洗脱液)，甲醇复溶后上样Sephadex LH-20凝胶柱色谱甲醇洗脱得到馏分F3-2。F3-2通过半制备型HPLC(agilent1200)经过phenomenex luna C18(10*250,5um)色谱柱，含有0.1％甲酸的30％乙腈-水等度洗脱条件下分离纯化得到fusaoctaxin A和fusaoctaxin B。
实施例4
化学合成Fusaoctaxin A
合成顺序：从序列C端到N端，步骤如下：
a.称取n当量树脂(2-氯三苯甲基氯树脂)放入反应器，加入DCM(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽滤DCM，加入2n当量D-亮氨酸(D-Leu)、2n当量DIEA(二甲基甲酰胺)，适量的DMF，DCM(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，得到的混合物氮气鼓泡反应60min。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，滤去反应液，用DMF、MEOH洗净；
b.往反应器中加入2n当量D-丝氨酸(D-Ser)、2n当量HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)及2n当量DIEA，N2鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱保护液(95％TFA-水溶液)去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测；
c.重复步骤b，依次加入D-缬氨酸(D-Val)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-别-异亮氨酸(D-allo-Ile)、L-丙氨酸(L-Ala)、γ-氨基丁酸(GABA)并进行各种修饰；
d.将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10ml/克的比例)的切割液(组成是95％TFA，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水)，震荡，过滤除去树脂；
e.得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列C端不含亮氨醇的产物；
f.得到的产物溶解于DMF中，加入DCC/NHS和L-亮氨醇原料低温反应过夜后得到序列粗产物。
g.得到的粗产物用95％TFA搅拌反应2小时脱掉保护基团，得到式I结构产物。
h.经半制备型HPLC(agilent 1200)经过phenomenex luna C18(10*250,5um)色谱柱，含有0.1％甲酸的30％乙腈-水等度洗脱条件下分离纯化得到fusaoctaxin A。
最终合成产率为30％，样品纯度达到98％。
实施例5
化学合成Fusaoctaxin B
与实施例基本相同，不同之处在于步骤(c)中，加入的γ-氨基丁酸(GABA)替换成胍基乙酸(GAA)，以得到Fusaoctaxin B。
最终合成产率为10％，经纯化后的样品纯度达到98％。
实施例6
结构鉴定：
检测方法、仪器、试剂
Marfey方法：
Fusaoctaxin A和Fusaoctaxin B水解产物的FDAA衍生物制备，取Fusaoctaxin A或Fusaoctaxin B(50ug)溶解于6N HCl(100uL),110℃加热反应12小时。真空浓缩得到水解产物用1M NaHCO3(20uL)处理后，加入1％L-FDAA丙酮溶液(40uL)在40℃加热反应1小时。反应获得的混合物用1M HCl(20uL)中和处理后加入乙腈(100uL)溶解，有机相针头滤器(0.22um)过滤后进入液质联用仪器(LC/MS)进行分析。
标准氨基酸FDAA衍生物制备，50mM标准氨基酸(50uL)与1M NaHCO3(20uL)混合后加入1％L-FDAA丙酮溶液(100uL)40℃反应1小时。反应混合液中加入1M HCl(20uL)中和后加入810uL乙腈稀释，稀释液用有机相针头滤器(0.22um)后进入液质联用仪器(LC/MS)进行分析。
LC/MS分析仪器：型号：LTQ-XL,Thermo scientific；色谱柱：phenomenex LunaC18column(5μm,250*10mm)；分析条件：A相，0.1％甲酸水相；B相，0.1％甲酸乙腈有机相25％-75％B相55分钟线性梯度洗脱，正离子模式电喷雾质谱(+ESI)检测。
反应试剂：L-FDAA(Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺)购自赛默飞(ThermoFisher)
高分辨质谱仪(ESI-HRMS)：Bruke maXis 4G，正离子模式(+ESI)。
核磁共振仪：布鲁克(Bruker Advance III)，500MHz，溶剂：氘代二甲亚砜
Fusaoctaxin A
Fusaoctaxin A以白色不定型固体状态被分离得到，通过ESI-HRMS分析化合物准分子离子峰[M+H]+的分子量为m/z 773.5135可以确定化合物的分子式为C36H68N8O10(计算值为m/z 773.5131)，通过分子式可以说明该化合物含有7个不饱和度。经过13C and HSQC核磁图谱(图9)分析表明该化合物含有36个碳信号，其中8个为酰胺羰基碳，11个次甲基碳(7个与氮原子相连)，9个亚甲基碳(3个羟甲基和1个与氮原子相连的亚甲基)，9个甲基碳。1H核磁图谱上有7个NH质子双峰信号(δH 8.11,7.87,8.07,7.66,7.94,7.87,7.43)和相应的7个典型的氨基酸α质子信号(δH 4.41,4.42,4.36,4.23,4.30,4.23,3.74)。根据以上一维核磁信息可以推测该化合物应该是八肽结构。从1H-1H COSY核磁图谱(图10)中可以看到H-2与H-3的相关信号及H-3与H-4的相关信号，结合H-2到C-1的HMBC相关信号(图11)确定该化合物含有γ-氨基丁酸(GABA)的结构片段(如图2)。更多详细的二维核磁共振谱的相关信号(如图3c)归属了该化合物含有其他7个氨基酸和氨基酸的序列(GABA1-Ala2-Ile3-Ser4-Val5-Ser6-Leu7-Leuol8)。
Fusaoctaxin A化合物的立体构型通过Marfey方法，核磁分析和合成多肽作为标准品进行对比分析最终得以确定。首先，Fusaoctaxin A通过6N盐酸进行水解反应，得到的产物用Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺(L-FDAA)进行衍生反应获得L-FDAA的衍生混合物。混合物与相应的标准氨基酸FDAA衍生物分别进入LCMS色谱分析(图3a)后可以确定Ile3、Ser4、Val5、Ser6、Leu7的构型为D(即α位手性碳为R构型)，Ala2和Leuol8的构型为L。
异亮氨酸(Ile3)含有两个手性中心，H-9Ile和H-10Ile的大耦合常数表明其处于对位，结合H-10/15-NH,H-12/9-NH和H-9/H-13的ROESY(图12)相关信号表明C-9、C-10为赤式构型，结合已确定的C-9R构型推断C-10为S构型，因而最终推断Ile3为D-allo构型(图3b)。最后，通过天然分离得到的Fusaoctaxin A与化学合成的八肽化合物(GABA1-L-Ala2-D-allo-Ile3-D-Ser4-D-Val5-D-Ser6-D-Leu7-L-Leuol8)的化学位移(图3c)进行比对分析表明Fusaoctaxin A结构与合成八肽的化学结构一致，Fusaoctaxin A结构如下所示。
Figure BDA0001889126850000141
Fusaoctaxin B
Fusaoctaxin B为白色不定型固体，其高分辨质谱图(ESI-HRMS)在m/z 787.5044处给出[M+H]+峰(计算值为m/z 787.5036)，由此可推测该化合物的分子式为C35H66N10O10，不饱和度为8。与Fusaoctaxin A具有相似的核磁特征信号，在1H NMR图谱中δ7.4-8.3范围内显示有八个与氨基酸α-H相耦合的NH质子双峰信号，另外在δ3.7-4.5区域内含有八组氨基酸α位质子信号，这暗示该化合物为八肽结构。然而高分辨质谱得到的分子式中含有10个氮原子，另外13C NMR图谱中的δ157.3特征信号表明该化合物含有胍基基团。2-NH/H-2的1H-1HCOSY相关信号，H-2/C-1和H-2/C-3的HMBC相关信号证明该化合物含有胍基乙酸结构单元(GAA)。综合二维相关谱(1H-1H COSY，HMBC，HSQC和ROESY，如图13-16)，分析表明该化合物含有其他与Fusaoctaxin A结构一致的氨基酸，从而确定氨基酸序列为GAA1-Ala2-Ile3-Ser4-Val5-Ser6-Leu7-Leuol8。
Fusaoctaxin B立体构型同样采用Marfey方法(图5a)和核磁分析(图5b)确定该化合物的氨基酸立体构型与fusaoctaxin A的其他组成氨基酸立体构型一致，结构为GAA1-L-Ala2-D-allo-Ile3-D-Ser4-D-Val5-D-Ser6-D-Leu7-L-Leuol8，Fusaoctaxin B结构如下所示。
Figure BDA0001889126850000151
实施例7
生物验证试验：
禾谷镰孢菌在侵染小麦时是否释放FA和FB的生物验证试验：
野生型禾谷镰孢菌F.graminearum PH-1(NRRL 31084)侵染小麦组织检测FA、FB分子：
为验证化合物FA、FB是由禾谷镰孢菌在侵染小麦时释放，野生型禾谷镰孢菌侵染小麦胚芽鞘和小麦麦穗后取相应受感染部位的植物组织进行成分分析。
野生型禾谷镰孢菌(FG-WT)和基因簇fg3_54敲除株(FG-Δfg3_54)分别接种小麦胚芽鞘和成熟小麦麦穗部位伤口部位，高温高湿培养7天后取相应受感染部位组织(0.2g)用甲醇超声提取，旋转蒸发浓缩获得提取物。LCMS分析提取物，如图6所示，提取离子色谱图显示受FG-WT侵染的小麦胚芽鞘和麦穗部位均含有化合物FA(m/z 773.51)和化合物FB(m/z787.50)，而基因簇敲除株(FG-Δfg3_54)和无菌(Mock)侵染的小麦胚芽鞘和麦穗部位不含有化合物FA和FB。以上结果表明化合物FA、FB是禾谷镰孢菌侵染小麦后产生的新次级代谢产物。
禾谷镰孢菌侵染小麦时是否依赖FA和FB的生物验证实验：
为确定禾谷镰孢菌侵染小麦时是否依赖fusaoctaxin A(FA)和fusaoctaxinB(FB)，FA和FB分别在禾谷镰孢菌fg3_54敲除株(FG-Δfg3_54)接种小麦胚芽鞘后涂抹至胚芽鞘伤口。由图7、图8所示，相对于FG-Δfg3_54突变株接种小麦后涂抹溶媒作为实验空白对照组，涂抹3nmol(将FA溶于5％toween20溶媒中，连续三天涂抹，最终施加用量达到3nmol/株)天然纯化得到的FA和化学合成的FA小麦生长7天后病斑面积显著增加，涂抹6nmol化学合成的FA时，病斑面积与野生型禾谷镰孢菌侵染小麦程度相当。类似地，当FG-Δfg3_54突变株接种小麦后涂抹3nmol天然纯化得到的FB后小麦侵染部位病斑面积同样得到恢复，且病症面积稍高于FA涂抹后的侵染病斑面积。
以上生物学实验结果显示当FA和FB不存在时，禾谷镰孢菌不能或基本不能侵染小麦，而当施加低剂量的化合物FA和FB时，均能明显恢复禾谷镰孢菌侵染小麦所产生的病症，表明化合物FA和FB在禾谷镰孢菌侵染小麦过程中扮演着重要角色。
对比例1
使用3nmol八肽类似物L-Gly-L-Ile-L-Ala-L-Val-L-Ser-L-Thr-L-Ala-L-Gly(GIAVSTAG，购自强耀生物)涂抹小麦伤口进行侵染实验作为阴性对照(mut.)，没有产生相应病斑。
讨论
化合物FA和FB属于寡肽结构，由非蛋白氨基酸组成。两个化合物区别在于N端的首个氨基酸，FA的首个氨基酸为γ-氨基丁酸(GABA)，FB的首个氨基酸为胍基乙酸(GAA)，GABA与GAA均为碱性结构单元。从GABA和GAA化学结构上不难发现，两个结构单元链长一致且碱性官能团处于末端，这一特殊结构可能是化合物的关键活性基团。活性寡肽的两端通常是化合物的重要活性部位，大多数肽类化合物的C端一般为羧基基团，而化合物FA和FB的C端为亮氨醇结构单元，C端的羧基基团还原成羟基基团，因而推测该基团在FA、FB的生物功能活性中有着非常重要的作用。值得注意的是肽段中间的五个氨基酸D-allo-Ile3，D-Ser4，D-Val5，D-Ser6，D-Leu7均为D型氨基酸，化合物手性差异是化合物活性功能的关键因素，手性的变化很可能就会导致化合物生物活性功能的丧失。综上所述，寡肽FA和FB的链长、N端的碱性基团、C端的醇羟基基团以及寡肽中间5个氨基酸的D构型对其生物活性功能至关重要。
禾谷镰孢菌致病毒素分子的鉴定为小麦赤霉病致病机理提供了有效可靠的化学结构信息，通过该分子可进行更加深入的机理研究。首先，以化合物FA和FB化学结构为基础，通过化学修饰手段连接荧光基团可定位该毒素分子作用的植物细胞的具体亚细胞结构上；或者通过化学修饰在FA和FB的任一基团上连接生物素等类似结构单元，可用于钓取该毒素分子在小麦等禾谷植物细胞内的作用靶点。进一步地，在不影响植物正常生长的前提下，可通过遗传操作改造靶点蛋白的结构从而获得抗病小麦品系。第二，毒素分子FA、FB为寡肽结构，化学结构中的酰胺键容易被生物体内广泛存在的肽酶或者水解酶裂解从而破坏FA、FB的原始化学结构，相应的致病毒性也会消失。以FA、FB分子为探针挖掘特异性裂解该毒素分子的裂解酶，在小麦等植物稳定遗传表达特异性识别FA、FB分子的裂解酶可以增强植物的抗病能力。第三，在长期的遗传进化中，小麦等植物中存在天然抗性植株，以FA、FB作为筛选分子搭建抗性植株快速筛选平台从而获得自然界中天然存在的抗性植株或者抗性基因。
在本发明中，我们鉴定了小麦赤霉病致病菌-禾谷镰孢菌在侵染小麦时释放的毒素分子FA、FB，该分子真实、有效地帮助禾谷镰孢菌侵入小麦组织细胞造成棕色腐烂病理现象。基于FA、FB的化学结构信息，进一步的抗病作物研究才得以开展。这一研究成果对我国主要粮食作物-小麦产量和食品安全有着非常重要的意义。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种镰孢菌素或其盐、或其酯，其特征在于，所述的镰孢菌素为式I结构所示的化合物：
Figure FDA0004008368710000011
式中，
R为
Figure FDA0004008368710000012
2.如权利要求1所述的镰孢菌素或其盐、或其酯，其特征在于，所述的镰孢菌素选自下组：镰孢菌素A、镰孢菌素B、或其组合，
Figure FDA0004008368710000013
3.一种制备如权利要求1所述镰孢菌素或其盐、或其酯的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供镰孢菌属真菌的发酵产物，惰性溶剂提取得提取液；
(b)将提取物经小孔吸附树脂(MCI)色谱柱分离，收集含有所述镰孢菌素的组分I；
(c)将组分I经凝胶色谱柱分离，收集含有所述镰孢菌素的组分II；
(d)将组分II经反相硅胶色谱柱分离，得到所述镰孢菌素。
4.如权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述提取具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述提取的惰性溶剂选自下组：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿，及其组合；
2)所述提取的次数为1-5次；
3)所述提取的时间为每次10-60min。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述小孔吸附树脂(MCI)色谱柱分离的洗脱方法具有选自下组的一个或多个特征：
1)洗脱程序为10％-30％-50％-70％-90％甲醇-水，按洗脱液总体积计，等梯度洗脱；
2)小孔吸附树脂用量为进样样品质量的20-100倍；
3)每个梯度的洗脱液用量为1-30倍柱体积。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱分离具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述凝胶色谱柱的凝胶选自：羟丙基葡聚糖凝胶或交联葡聚糖凝胶；
2)洗脱液选自：甲醇、乙腈。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述反相硅胶色谱柱分离具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述反相硅胶色谱柱为C18色谱柱；
2)洗脱液为含有0.1％甲酸的30％乙腈-水等度洗脱，按洗脱液总体积计。
8.一种制备权利要求1所述的镰孢菌素的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)按照式I化合物的结构，以树脂作为固定相，采用相应构型的标准氨基酸为原料，通过固相合成法从D-亮氨酸开始合成，得到结构式I中不含L-亮氨醇的肽链；
(b)使用切割液将肽链从固定相中离去；
(c)将肽链C端羧基在偶联试剂存在下，与N-羟基琥珀酰亚胺反应生成N-羟基琥珀酰亚胺酯后与L-亮氨醇发生酰胺反应；
(d)脱保护后最终得到所述镰孢菌素。
9.一种如权利要求1所述的镰孢菌素或其盐、或其酯的对照品或标准品，其特征在于，所述对照品或标准品中权利要求1所述的镰孢菌素或其盐、或其酯的含量≥95％按所述对照品或标准品总质量计。
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