ES2930321T3

ES2930321T3 - Anticuerpos frente a CGRP

Info

Publication number: ES2930321T3
Application number: ES17201603T
Authority: ES
Inventors: Barrett Allan; Robert Jan Benschop; Mark Geoffrey Chambers; Ryan James Darling
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2010-06-10
Filing date: 2011-06-07
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2031-06-07
Also published as: US20150259415A1; TWI423818B; EP3318272B1; ME02862B; NL300979I1; US9505838B2; SI2579894T1; CA2802102A1; JP2013532143A; JP6021806B2; CN104292332B; PL2579894T3; IL222885B; LUC00112I1; NO2019017I1; JO3330B1; CY1119789T1; AR081434A1; KR20130034024A; JP6466883B2

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos de péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) modificados por ingeniería humana o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Además, la presente invención proporciona el uso de anticuerpos del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) modificado por ingeniería genética humana o fragmento de unión a antígeno del mismo para el tratamiento del dolor de la osteoartritis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos frente a CGRP

La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina, en particular en el campo de los anticuerpos frente al péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP). Más en concreto, la invención se refiere a anticuerpos frente al CGRP y el uso de los anticuerpos frente al CGRP para la terapia de las jaquecas.

El péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) es un neuropéptido de 37 aminoácidos que secretan los nervios de los sistemas nerviosos central y periférico. El CGRP está distribuido de forma general en los nervios sensitivos, tanto en el sistema nervioso periférico como el central, y presenta un gran número de distintas actividades biológicas. Se ha informado que el CGRP desempeña un papel. Cuando se libera en el nervio trigémino y otras fibras nerviosas, se cree que el CGRP media sus respuestas biológicas mediante la unión a receptores de la superficie celular específicos.

Se ha informado que el CGRP desempeña un papel en las jaquecas, dado que el CGRP se libera tras la estimulación de los nervios sensitivos y tiene una potente actividad vasodilatadora. La liberación de CGRP aumenta la permeabilidad vascular y la posterior filtración de proteínas plasmáticas (extravasación de proteínas plasmáticas) en los tejidos inervados por el nervio trigémino tras la estimulación de esta fibra. Además, los estudios han informado que la infusión de CGRP en pacientes que padecen jaquecas ha dado como resultado síntomas similares a la jaqueca.

También se ha informado que el CGRP desempeña un papel en la osteoartritis (OA). La OA es una afección crónica que afecta a un gran porcentaje de personas en todo el mundo. El dolor en la artritis se caracteriza por hiperalgesia (sensibilidad excesiva a los estímulos normalmente no nocivos) y dolor espontaneo (dolor en reposo). La inflamación de las articulaciones provoca sensibilización periférica y central. En la sensibilización periférica, los nocirreceptores que contienen CGRP de alto umbral normalmente comienzan a responder a la presión ligera asociada con el movimiento articular normal. El CGRP actúa como un mediador local de procesos inflamatorios. Este proceso continuado finalmente conduce a la sensibilización central en la médula espinal, de forma que las neuronas se hacen sensibles a la estimulación del tejido inflamado así como del no inflamado. En modelos preclínicos de dolor en la OA en ratas se observó un aumento de la cantidad de fibras nerviosas positivas para CGRP, lo que se correlaciona de forma positiva con la cantidad de dolor.

El tratamiento habitual actual para el dolor en la OA consiste en fármacos antinflamatorios no esteroides (los AINE) e inhibidores selectivos de Cox-2. Con el tiempo muchos pacientes se harán insensibles a estos tratamientos o no serán capaces de tolerar las altas dosis necesarias para un alivio eficaz del dolor. Los tratamientos de seguimiento consisten en inyecciones intrarticulares (hialuronano) u opiáceos. El tratamiento final es el reemplazo quirúrgico completo de la articulación. Muchos de estos tratamientos tienen efectos secundarios negativos, que varían de gastrointestinales (los AINE) a cardiovasculares (inhibidores de Cox-2), son engorrosos y/o no muy eficaces (inyecciones intrarticulares), conllevan el riesgo de adicción (opiáceos) o se restringen a solo una articulación (inyecciones intrarticulares, cirugía).

Aunque se han desvelado anticuerpos frente al CGRP para el tratamiento de las jaquecas y para el tratamiento del dolor inflamatorio (jaquecas - documento WO 2007/076336 y documento WO 2007/054809; O^a- véase, anticuerpo G1 del documento WO2009/109908A1), sigue habiendo una necesidad de alternativas. Preferentemente, el tratamiento alternativo debe ser seguro y eficaz. Más preferentemente, el tratamiento alternativo para la OA proporcionará un alivio duradero del dolor en múltiples articulaciones, que sea tolerable para los pacientes sin el riesgo de dependencia y/o abuso.

La presente invención proporciona un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en el que dicha secuencia de aminoácidos de LCVR es la SEQ ID NO: 17 y dicha secuencia de aminoácidos de HCVR es la SEQ ID NO: 22.

En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en la que dicha LCVR comprende las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3, y la HCVR comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3, que se seleccionan del grupo que consiste en:

a) LCDR1 es RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es YTSEYHS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 es AIYEGTGDTRYIQKFAG (SEQ ID NO: 13) y HCDR3 es LSDYVSGFSY (SEQ ID NO: 14);

b) LCDR1 es RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es YTSEYHS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 es AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15) y HCDR3 es LSDYVSGFSY (SEQ ID NO: 14);

c) LCDR1 es RASKDISKYLN (SEQ ID NO: 6), LCDR2 es YTSGYHS (SEQ ID NO: 7), LCDR3 es QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 es AIYEGTGKTVYIQKFAD (SEQ ID NO: 16) y HCDR3 es LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39);

d) LCDR1 es RASRPIDKYLN (SEQ ID NO: 8), LCDR2 es YTSEYHS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 es AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15) y HCDR3 es LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39); y

e) LCDR1 es RASQDIDKYLN (SEQ ID NO: 9), LCDR2 es YTSGYHS (SEQ ID NO: 7), LCDR3 es QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 es AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15) y HCDR3 es LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39),

en el que el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado se une a un CGRP humano.

En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 3, LCDR2 es la SEQ ID NO: 4, LCDR3 es la SEQ ID NO: 5, HCDR1 es la SEQ ID NO: 12, HCDR2 es la SEQ ID NO: 13 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 14, en el que el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado se une al CGRP humano. En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 3, LCDR2 es la SEQ ID NO: 4, LCDR3 es la SEQ ID NO: 5, HCDR1 es la SEQ ID NO: 12, HCDR2 es la SEQ ID NO: 15 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 14, en el que el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado se une al CGRP humano. En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 6, LCDR2 es la SEQ ID NO: 7, LCDR3 es la SEQ ID NO: 5, HCDR1 es la SEQ ID NO: 12, HCDR2 es la SEQ ID NO: 16 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 39, en el que el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado se une al CGRP humano. En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 8, LCDR2 es la SEQ ID NO: 4, LCDR3 es la SEQ ID NO: 5, HCDR1 es la SEQ ID NO: 12, HCDR2 es la SEQ ID NO: 15 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 39, en el que el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado se une al CGRP humano. En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 9, LCDR2 es la SEQ ID NO: 7, LCDR3 es la SEQ ID NO: 5, HCDR1 es la SEQ ID NO: 12, HCDR2 es la SEQ ID NO: 15 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 39, en el que el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado se une al CGRP humano.

En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es RASX1X2IX3X4YLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2 es YTSX5YHS (SEQ ID NO: 11), LCDR3 es QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5) y HCDR1 es GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 es AIYEGTGX6TX7YIQKFAX8 (SEQ ID NO: 37) y HCDR3 es LSDYVSGFX9Y (SEQ ID NO: 38), en las que X1 es Q, R, o K; X2 es D o P, X3 es D o S, X4 es N o K, X5 es G o E, X6 es K o D, X7 es V o R, X8 es D o G, y Xg es G o S, en el que el anticuerpo se une al CGRP humano.

Más adelante en el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en el que la LCVR comprende

D IQ M TQ SPSSLSASVG DRVTITCRASX ¹ X ² IX ³ X ⁴ YLNW YQQKPGK APK LLIYYTSX ⁵

YH SG VPSRFSG SG SG TDFTX ⁶ TISSLQPEDX ⁷ ATYYCQ QGDALPPTFGX ⁸ GTKX ⁹ EIK

en la que X1 es Q, K o R; X2 es D o P; X3 es D o S; X4 es K o N; X5 es E o G; X6 es F o L; X7 es I o F; X8 es Q o G, y X9 es L o V. (SEQ ID NO: 42)

y la HCVR comprende

Q VQ LVQ SG AEVK K PG XiSVK VSCK ASG YTFG NYW M Q W VRQ APG Q G LE

W M G AIYEG TG X ² TX ³ YIQ K FAX ⁴ R V TX ⁵ TX ⁶ D X ⁷ STSTX ⁸ Y M E LSSLRSEDTAVYYC

A R L SD Y V SG FX ⁹ YW G Q G TX ¹⁰ V TV SS,

en la que X1=A o S; X2=K o D; Xs=V o R; X4=G o D; Xa=M o I; X6=R o A; X7=T o K; X8=V o A; X9=G o S, y X10=L o T. (SEQ ID NO: 43), en el que el anticuerpo se une al CGRP humano.

En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en el que LCVR y HCVR son secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

a. LCVR es la SEQ ID NO: 18 y HCVR es la SEQ ID NO: 23;

b. LCVR es la SEQ ID NO: 19 y HCVR es la SEQ ID NO: 24;

c. LCVR es la SEQ ID NO: 20 y HCVR es la SEQ ID NO: 25 y

d. LCVR es la SEQ ID NO: 21 y HCVR es la SEQ ID NO: 26.

La presente invención proporciona un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LCVR de la SEQ ID NO: 17 y una HCVR de la SEQ ID NO: 22. Adicionalmente se desvela en el presente documento un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LCVR de la SEQ ID NO: 18 y una HCVR de la SEQ ID NO: 23. Adicionalmente se desvela en el presente documento un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LCVR de la SEQ ID NO: 19 y una HCVR de la SEQ ID NO: 24. Adicionalmente se desvela en el presente documento un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LCVR de la S^eQ ID NO: 20 y una HCVR de la SEQ ID NO: 25. Adicionalmente se desvela en el presente documento un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LCVR de la SEQ ID NO: 21 y una HCVR de la SEQ ID NO: 26.

La presente invención también proporciona un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en el que la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 27 y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 32.

En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en el que las secuencias de aminoácidos de la LC y la HC se seleccionan del grupo que consiste en:

a) LC es la SEQ ID NO: 28 and HC es la SEQ ID NO: 33;

b) LC es la SEQ ID NO: 29 and HC es la SEQ ID NO: 34;

c) LC es la SEQ ID NO: 30 and HC es la SEQ ID NO: 35 y

d) LC es la SEQ OD NO: 31 and HC es la SEQ ID NO: 36.

En una realización, el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado comprende una LC de la SEQ ID NO: 27 y una HC de la SEQ ID NO: 32. En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LC de la SEQ ID NO: 28 y una HC de la SEQ ID NO: 33. Adicionalmente en el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LC de la SEQ ID NO: 29 y una HC de la SEQ ID NO: 34. Adicionalmente en el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LC de la SEQ ID NO: 30 y una HC de la SEQ ID NO: 35. Adicionalmente en el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LC de la SEQ ID NO: 31 y una HC de la SEQ ID NO: 36. En una realización, el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en las que cada secuencia de aminoácidos de LC es la SEQ ID NO: 27 y cada secuencia de aminoácidos de HC es la SEQ ID NO: 32. Aún adicionalmente en el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas en las que cada secuencia de aminoácidos de la LC es la SEQ ID NO: 28 y cada secuencia de aminoácidos de HC es la SEQ ID NO: 33. En una realización, el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en las que cada secuencia de aminoácidos de LC es la SEQ ID NO: 29 y cada secuencia de aminoácidos de HC es la SEQ ID NO: 34. Aún adicionalmente en el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas en las que cada secuencia de aminoácidos de la LC es la SEQ ID NO: 30 y cada secuencia de aminoácidos de HC es la SEQ ID NO: 35. Aún adicionalmente en el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas en las que cada secuencia de aminoácidos de la LC es la SEQ ID NO: 31 y cada secuencia de aminoácidos de HC es la SEQ ID NO: 36. La presente invención también proporciona fragmentos de un antígeno de los anticuerpos descritos en el presente documento.

La presente invención también proporciona anticuerpos frente a CGRP humanos técnicamente diseñados que tienen una CI50 < 1,0 nM en un ensayo esencialmente como se describe en el Ejemplo 4. En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 6, LCDR2 es la SEQ ID NO: 7, LCDR3 es la SEQ ID NO: 5, HCDR1 es la SEQ ID NO: 12, HCDR2 es la SEQ ID NO: 16 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 39, y en el que el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado se une al CGRP humano y además tiene una CI50 < 1,0 nM en un ensayo que es esencialmente como se describe en el Ejemplo 4. Adicionalmente se desvela en el presente documento un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una secuencia de aminoácidos de LCVR de la SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoácidos de HCVR de la SEQ ID NO: 24, en el que el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado tiene una CI50 < 1,0 nM en un ensayo esencialmente como se describe en el Ejemplo 4. Adicionalmente se desvela en el presente documento un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una secuencia de aminoácidos de LC de la SEQ ID NO: 29 y una secuencia de aminoácidos de HC de la SEQ ID NO: 34, en el que el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado tiene una CI50 < 1,0 nM en un ensayo esencialmente como se describe en el Ejemplo 4.

La presente invención también proporciona anticuerpos frente a CGRP humanos técnicamente diseñados que tienen una CI50 < 0,5 nM en un ensayo esencialmente como se describe en el Ejemplo 4. En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 6, LCDR2 es la SEQ ID NO: 7, LCDR3 es la SEQ ID NO: 5, HCDR1 es la SEQ ID NO: 12, HCDR2 es la SEQ ID NO: 16 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 39, y en el que el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado se une al CGRP humano y además tiene una CI50 < 0,5 nM en un ensayo esencialmente como se describe en el Ejemplo 4. Adicionalmente se desvela en el presente documento un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una secuencia de aminoácidos de LCVR de la SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoácidos de HCVR de la SEQ ID NO: 24, en el que el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado tiene una CI50 < 0,5 nM en un ensayo esencialmente como se describe en el Ejemplo 4. Adicionalmente se desvela en el presente documento un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una secuencia de aminoácidos de LC de la SEQ ID NO: 29 y una secuencia de aminoácidos de HC de la SEQ ID NO: 34, en el que el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado tiene una CI50 < 0,5 nM en un ensayo esencialmente como se describe en el Ejemplo 4.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, y un transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La presente invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo frente a CGRP de la presente invención junto con un portador farmacéuticamente aceptable y, de forma opcional, otros ingredientes terapéuticos.

En el presente documento se desvela un procedimiento para el tratamiento del dolor por osteoartritis que comprende administrar a un paciente que lo necesite un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. En el presente documento se desvela adicionalmente un procedimiento para el tratamiento de las jaquecas que comprende administrar a un paciente que lo necesite un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención.

La presente invención también proporciona un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención para su uso en terapia. En el presente documento se desvela un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, para el tratamiento del dolor por osteoartritis. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención para el tratamiento de las jaquecas.

En el presente documento se desvela el uso de un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, para su uso del tratamiento del dolor por osteoartritis. En el presente documento se desvela adicionalmente el uso de un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, para su uso en tratamiento de las jaquecas. En el presente documento se desvela adicionalmente el uso de un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado o fragmento de unión a antígeno del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la osteoartritis. En el presente documento se desvela adicionalmente el uso de un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado o fragmento de unión a antígeno del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las jaquecas.

Un anticuerpo de longitud completa tal como existe de forma natural es una molécula de inmunoglobulina que comprende 2 cadenas pesadas (H) y 2 cadenas ligeras (L) interconectadas por medio de enlaces disulfuro. La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100-110 aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento del antígeno a través de las regiones determinantes de complementariedad (las CDR) contenidas en ella. La porción carboxilo terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.

Las CDR están intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada región variable de la cadena ligera (LCVR) y región variable de la cadena pesada (HCVR) consta de 3 CDR y 4 FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las 3 CDR de la cadena ligera se denominan “LCDR1, LCDR2 y LCDR3” y las 3 CDR de la cadena pesada se denominan “HCDR1, HCDR2 y HCDR3”. Las CDR contienen la mayoría de los restos que forman interacciones específicas con el antígeno. La numeración y ubicación de los restos de aminoácido de la CDR dentro de las regiones LCVR y HCVR están en conformidad con la bien conocida convención de la numeración de Kabat.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa y lambda, y se caracterizan por una región constante particular como se conoce en la técnica. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo de un anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Los anticuerpos IgG pueden dividirse adicionalmente en subclases, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Cada tipo de cadena pesada se caracteriza por una región constante particular con una secuencia bien conocida en la técnica.

Como se usa en el presente documento, la expresión “anticuerpo monoclonal” (Acm) se refiere a un anticuerpo que se obtiene a partir de una única copia o clon que incluye, por ejemplo, cualquier clon eucariótico, procariótico o de fago, y no al procedimiento por medio del cual se produce. Los Acm de la presente invención preferentemente existen en una población homogénea o sustancialmente homogénea. Los Acm completos contienen 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras. Los “fragmentos de unión a antígeno” de tales anticuerpos monoclonales incluye, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2y fragmentos Fv monocatenarios. Los anticuerpos monoclonales y fragmento de unión a antígeno de los mismos de la presente invención pueden producirse, por ejemplo, mediante tecnologías recombinantes, tecnologías de presentación en fagos, tecnologías sintéticas, por ejemplo, injertado de CDR o combinaciones de otras tecnologías, u otras tecnologías conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden inmunizarse ratones con CGRP o fragmentos del mismo, los anticuerpos resultantes pueden recuperarse y purificarse, y puede evaluarse mediante los procedimientos desvelados en los Ejemplos a continuación la determinación de si poseen propiedades de unión y funcionales similares a o las mismas que los compuestos de anticuerpo desvelados en el presente documento. Los fragmentos de unión a antígeno también pueden prepararse mediante procedimientos convencionales. Los procedimientos para producir y purificar anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno son bien conocidos en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, capítulo 5-8 y 15, ISBN 0-87969-314-2.

La frase “anticuerpos frente a CGRP humanos técnicamente diseñados” se refiere a anticuerpos monoclonales creados y/o manipulados para tener propiedades de unión y funcionales de acuerdo con la invención, se unen al CGRP humano y tienen regiones marco conservadas que son sustancialmente humanas o completamente humanas rodeando las CDR obtenidas de un anticuerpo no humano. Los “fragmentos de unión a antígeno” de tales anticuerpos humanos técnicamente diseñados incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fv monocatenarios. “Región marco conservada” o “secuencia marco conservada” se refiere a una cualquiera de las regiones marco conservadas 1 a 4. Los anticuerpos humanos técnicamente diseñados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos que abarca la presente invención incluyen moléculas en las que una o más de las regiones marco conservadas 1 a 4 son sustancialmente o completamente humanas, es decir, en las que está presente cualquiera de las posibles combinaciones de las regiones marco conservadas sustancialmente o completamente humanas 1 a 4 individuales. Por ejemplo, esto incluye moléculas en cuyas región marco conservada 1 y región marco conservada 2, región marco conservada 1 y región marco conservada 3, región marco conservada 1,2 y 3, etcétera, son sustancialmente o completamente humanas. Las regiones marco conservadas sustancialmente humanas son las que tienen al menos el 8o % de identidad de secuencia con una secuencia de región marco conservada de estirpe germinal humana conocida. Preferentemente, los armazones sustancialmente humanos tienen al menos aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % o aproximadamente el 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de armazón de estirpe germinal humana conocida.

Los armazones completamente humanos son los que son idénticos a una secuencia de armazón de estirpe germinal humana conocida. Las secuencias de estirpe germinal de armazón humana puedan tenerse de ImMunoGeneTics (IMGT) a través de su sitio en internet http://imgt.cines.fr o de The Immunoglobulin FactsBook por Marie-Paule Lefranc y Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por ejemplo, los armazones de la cadena ligera de la estirpe germinal pueden seleccionarse del grupo que consiste en: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L15, L6, L8, O12, O2 y O8, y las regiones marco conservadas de la cadena pesada de la línea germinal se pueden seleccionar del grupo que consiste en: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 y VH5-51.

Los anticuerpos humanos técnicamente diseñados además de los desvelados en el presente documento que presentan propiedades funcionales similares de acuerdo con la presente invención, se pueden generar mediante el uso de varios procedimientos distintos. Los compuestos de anticuerpo específicos desvelados en el presente documento pueden usarse como moldes o compuestos de anticuerpo parentales para preparar compuestos de anticuerpo adicionales. En una estrategia, las CDR del compuesto de anticuerpo parental se injertan en un armazón humano que tiene una alta identidad de secuencia con el armazón del compuesto de anticuerpo parental. La identidad de secuencia del nuevo armazón en general será de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a la secuencia del correspondiente armazón en el compuesto de anticuerpo parental. Este injertado puede dar como resultado una reducción de la afinidad de unión en comparación con la del anticuerpo parental. Si este es el caso, el armazón puede retromutarse en determinadas posiciones al armazón parental a base de los criterios concretos desvelados en Queen y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Las referencias adicionales que describen procedimientos útiles en la humanización de anticuerpos de ratón incluyen las Patentes de Estados Unidos n.° 4.816.397; 5.225.539 y 5.693.761; los programas de ordenador ABMOD y ENCAD, como se describe en Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595-620 y el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann y col. (1988) Nature 332:323-327 y Verhoeyen y col. (1988) Science 239:1534-1536.

La identificación de los restos a considerar para la retromutación se puede llevar a cabo de la siguiente manera:

Cuando un aminoácido está incluido en la siguiente categoría, el aminoácido de armazón de la secuencia de estirpe germinal humana que se está utilizando (el “armazón aceptador”) se reemplaza por un aminoácido de armazón de un armazón del compuesto de anticuerpo parental (el “armazón donante”).

(a) el aminoácido en la región marco conservada humana del armazón aceptador es inusual para los armazones humanos en esta posición, mientras que el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante es típico para los armazones humanos en esa posición;

(b) la posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CDR; o

(c) algún átomo de la cadena lateral de un aminoácido de armazón está dentro de aproximadamente los 5-6 angstroms (centro a centro) de algún átomo de un aminoácido de la CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional.

Cuando cada uno de los aminoácidos en la región marco conservada humana del armazón aceptador y un correspondiente aminoácido en el armazón donante es en general inusual para los armazones humanos en esa posición, dicho aminoácido se puede reemplazar por un aminoácido típico para los armazones humanos en esa posición. Este criterio de retromutación permite recuperar la actividad del compuesto de anticuerpo parental.

Otra estrategia para generar anticuerpos humanos técnicamente diseñados que presentan propiedades funcionales similares a los compuestos a anticuerpo desvelados en el presente documento, implica mutar de forma aleatoria aminoácidos dentro de las CDR injertadas sin cambiar el armazón y explorar la afinidad de unión y otras propiedades funcionales de las moléculas resultantes que son tan buenas o mejores que las de los compuestos de anticuerpo parental. También pueden introducirse mutaciones puntuales en cada posición de aminoácido dentro de cada CDR, seguido de la evaluación de los efectos de tales mutaciones sobre la afinidad de unión y otras propiedades funcionales. Las mutaciones puntuales que producen propiedades mejoradas pueden combinarse para evaluar sus efectos en combinación con otras.

Adicionalmente, es posible una combinación de las dos estrategias anteriores. Tras el injertado de las CDR, se pueden retromutar regiones marco conservadas específicas además de introducir cambios de aminoácido en las CDR. Esta metodología se describe en Wu y col. (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162.

Al aplicar las enseñanzas de la presente invención, un experto en la técnica puede usar técnicas comunes, por ejemplo mutagénesis dirigida, para sustituir aminoácidos dentro de las secuencias de las CDR y del armazón ahora desvelado y de este modo generar secuencias de aminoácidos de la región variable adicionales obtenidas de las presentes secuencias. En un sitio de sustitución específico pueden introducirse todos los aminoácidos de origen natural alternativos. Después, los procedimientos desvelados en el presente documento pueden utilizarse para explorar estas secuencias de aminoácidos de la región variable adicionales, para identificar secuencias que tengan las funciones indicadas in vivo. De este modo, pueden identificarse secuencias adicionales adecuadas para la preparación de anticuerpos humanos técnicamente diseñados y porciones de unión a antígeno de los mismos, en conformidad con la presente invención. Preferentemente, la sustitución de aminoácidos dentro de los armazones se restringen a una, dos o tres posiciones dentro de una cualquiera o más de las 4 regiones marco conservadas de la cadena ligera y/o la cadena pesada desveladas en el presente documento. Preferentemente, la sustitución de aminoácidos dentro de las CDR se restringen a una, dos o tres posiciones dentro de una cualquiera o más de las 3 CDR de la cadena ligera y/o la cadena pesada. También son posibles combinaciones de los diversos cambios dentro de estas regiones marco conservadas y las CDR descritas anteriormente.

La expresión “que trata” (o “trata” o “tratamiento”) se refiere a procedimientos que implican un enlentecimiento, interrupción, detención, control, parada, reducción o inversión de la progresión o gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad, pero no necesariamente implica una total eliminación de todos los síntomas, afecciones o trastornos relacionados con la enfermedad asociados con la actividad del CGRP.

El término “jaqueca (o jaquecas)” como se utiliza en el presente documento se refiere a “jaquecas no precedidas de aura” (anteriormente “jaqueca común”) y “jaquecas precedidas de aura” (anteriormente “jaquecas clásicas”) de acuerdo con el Comité de clasificación de las cefaleas de la Sociedad internacional de cefaleas (Sociedad internacional de cefaleas, 2004). Por ejemplo, las “jaquecas no precedidas de aura” normalmente se pueden caracterizar como que tienen característica pulsátil, una intensidad moderada o intensa, y se agravan por la actividad física rutinaria, se emplazan de forma unilateral y están asociadas con náuseas, y con fotofobia y fonofobia. Las “jaquecas precedidas de aura” pueden incluir alteraciones en la visión, alteraciones en otros sentidos, debilidad unilateral y en algunos casos dificultad en el habla.

Los anticuerpos humanos técnicamente diseñados de la presente invención se pueden utilizar como medicamentos en medicina humana, administrados por una diversidad de vías. Muy preferentemente, tales composiciones son para la administración parenteral. Tales composiciones farmacéuticas pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19° ed. (1995), A. Gennaro y col., Mack Publishing Co.) y comprenden un anticuerpo humano técnicamente diseñado como se desvela en el presente documento y un transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los resultados de los siguientes ensayos demuestran que los anticuerpos monoclonales ejemplificados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención se pueden utilizar para el tratamiento del dolor por osteoartritis.

Ejemplo 1-Producción de anticuerpos

Los anticuerpos I-V se pueden fabricar y purificar como sigue. Se transfectan de forma transitoria o estable células hospedadoras apropiadas, tal como h Ek 293 EBNA o CHO, con un sistema de expresión para la secreción de anticuerpos utilizando una proporción de vector HC:LC predeterminada o un sistema de vector único que codifica ambas LC, tal como la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31, y HC, tal como la SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36. El medio clarificado, en el que el anticuerpo se ha secretado, se purifica utilizando cualquiera de muchas técnicas utilizadas comúnmente. Por ejemplo, el medio puede aplicarse de forma conveniente en una columna de Proteína A o de Sefarosa G FF que se ha equilibrado con un tampón compatible, tal como solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). La columna se lava para eliminar componentes de unión no específicos. El anticuerpo unido se eluye, por ejemplo, mediante gradiente de pH (tal como tampón de fosfato de sodio 0,1 M pH 6,8 a tampón citrato de sodio 0,1 M pH 3,0). Las fracciones del anticuerpo se detectan, tal como mediante SDS-PAGE y después se agrupan. La purificación adicional es optativa, lo que depende del uso pretendido. El anticuerpo se puede concentrar y/o filtrar de forma estéril por medio de las técnicas habituales. Los agregados solubles y multímeros pueden eliminarse de forma eficaz mediante técnicas comunes, incluyendo la exclusión por tamaño, interacción hidrófoba, intercambio iónico o cromatografía por hidroxiapatita. La pureza del anticuerpo tras estas etapas de cromatografía es mayor al 99 %. El producto puede congelarse inmediatamente a -70 °C o pueden liofilizarse. A continuación se proporcionan las secuencias de aminoácidos de estos anticuerpos ejemplificados.

Tabla 1 - Anticuerpos SEQ ID NOs

EJEMPLO 2: Mediciones de la afinidad (Kd) para los anticuerpos frente a CGRP humanos técnicamente diseñados

La afinidad de unión de los anticuerpos ejemplificados frente a CGRP se determina mediante el uso de un ensayo de resonancia de plasmón superficial en un instrumento Biacore T100 preparado con tampón de corrida HBS-EP+ (GE Healthcare, Hepes 10 mM pH 7,4 NaCl 150 mM EDTA 3 mM tensioactivo P20 al 0,05 %) y la temperatura de análisis ajustada a 37 °C. Se utiliza un chip CM5 que contiene proteína A inmovilizada (generada mediante el uso del acoplamiento de aminas por NHS-EDC convencional) en las cuatro celdas de flujo (Fc) para emplear una metodología de captura. Se preparan muestras de anticuerpo a 2 pg/ml por dilución en tampón de corrida. Se preparan muestras de CGRP humano a concentraciones finales de 5,0, 2,5, 1,3, 0,63, 0,31 y 0 (blanco) nM por dilución en tampón de corrida. Para cada experimento por duplicado se utiliza una alícuota de CGRP de único uso recién preparada para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación. Cada ciclo de análisis consiste en (1) la captura de las muestras de anticuerpo en celdas de flujo distintas (Fc2, Fc3 y Fc4), (2) inyección de 350 pl (210 s) de CGRP sobre toda la Fc a 100 pl por minuto, (3) retorno al flujo de tampón durante 10 minutos para controlar la fase de disociación, (4) regeneración de las superficies del chip con inyección de 5 pl (15 s) de glicina, pH 1,5, (5) equilibrado de las superficies del chip con inyección de 5 pl (15 s) de HBS-EP+. Cada concentración de CGRP se inyecta por duplicado. Los datos se procesan utilizando doble referencia convencional y se ajustan a un modelo de unión 1:1 utilizando el programa informático de evaluación T100 de Biacore, versión 2.0.1, para determinar la velocidad de asociación (kon, unidades M 'V ) , la velocidad de disociación (koff, unidades s_1) y Rmáx (unidades de UR). La constante de disociación en equilibrio (K^d) se calcula a partir de la relación K^d= koff/kon, y se expresa en unidades molares. Los valores proporcionados en la Tabla 2 son las medias de n número de experimentos. La Tabla 2 demuestra que los anticuerpos ejemplificados de la presente invención se unen a la CGRP con afinidades < 200 pM.

Tabla 2 - Afinidades de unión de los anticuerpos.

EJEMPLO 3 - Reducción del dolor en un modelo de MIA.

La inyección de ácido monoyodoacético (MIA) en la articulación de la rodilla de ratas produce una lesión inflamatoria aguda que después progresa a una degeneración crónica en los tejidos articulares de la articulación inyectada. El dolor resultante de la lesión articular puede medirse a través de la carga de peso diferencial de las patas traseras utilizando un analizador de incapacidad. El modelo de MIA está bien descrito en la bibliografía y se ha utilizado para demostrar la eficacia frente al dolor para una diversidad de mecanismos y compuestos. La eficacia se mide de forma rutinaria por la capacidad de un compuesto para normalizar parcialmente la distribución de carga.

A fin de determinar la capacidad de reducir el dolor de los anticuerpos ejemplificados de la presente invención, se utilizan ratas Lewis macho (Harlan, Indianapolis, IN) de aproximadamente ocho semanas en el momento de la inyección de MIA. Las ratas se alojan en grupos de dos o tres por jaula y se mantienen a una temperatura constante, y en un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Los animales tienen libre acceso al alimento y al agua en cualquier momento, excepto durante la recolección de datos. Todos los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité institucional para el cuidado y uso de animales de Eli Lilly.

El día 0 se inyecta MIA 0,3 mg en 50 pl de solución salina en la rodilla derecha de cada una de las ratas y 50 pl de solución salina en la rodilla izquierda. En un día establecido después de la inyección de MIA se administra en PBS por vía subcutánea anticuerpo IgG4 humano de control o anticuerpo frente a CGRP de prueba (n=6 por grupo). Tres días después de la dosificación con el anticuerpo frente a CGRP de prueba se mide el dolor utilizando el análisis de incapacidad, que mide la diferencia de la carga de peso en la pata trasera entre las rodilla tratada con MIA y la inyectada con solución salina. Cada medición es el promedio de tres mediciones distintas, cada una medida durante 1 segundo.

Los datos se presentan como inhibición porcentual del dolor, calculado por medio de la división de la media del grupo tratado con anticuerpo frente a CGRP por la media del grupo del anticuerpo de control, restando este valor a 1 y multiplicando este valor resultante por l00. Los grupos tratados con CGRP también se compararon con los grupos de vehículo mediante análisis de una vía de las medias y la prueba de Dunnett, utilizando programa de análisis estadístico JMP (versiones 5.1 y 6) (SAS Institute Inc., Cary, ⁿC). Las diferencias se consideran como significativas si el valor P es menor de 0,05. Como se muestra en la Tabla 3, los datos demuestran que los anticuerpos frente a CGRP ejemplificados de la presente invención reducen significativamente el dolor.

Tabla 3 - Inhibición porcentual del dolor inducido por MIA

EJEMPLO 4 - Inhibición de la formación de AMPc inducida por CGRP en células SK-N-MC

A fin de comparar la capacidad de un anticuerpo de la presente invención con el Anticuerpo G1 (LCVR- SEQ ID NO: 40 y HCVR- SEQ ID n O: 41), se determina la inhibición de la formación de AMPc inducida por Cg RP en SK-N-MC. La unión del CGRP a su receptor da como resultado la estimulación de la producción de AMPc. El receptor de CGRP es un complejo heterotrimérico que consiste en el receptor similar al receptor de calcitonina (CLR, un receptor acoplado a proteína G) y la proteína modificadora de la actividad del receptor (RAMP)-1, acoplada de forma citoplasmática a la proteína componente del receptor (RCP). La línea celular de neuroepitelioma humano SK-N-MC expresa estas 3 moléculas de forma natural y puede, por lo tanto, utilizarse para evaluar el efecto del CGRP sobre los acontecimientos de transducción de señales. La producción de AMPc es una medida convencional de la activación de un receptor acoplado a proteína G.

Las células SK-N-MC se cultivan en MEM, conteniendo SFB al 10 %, aminoácidos no esenciales MEM 1X, piruvato de sodio MEM 100 mM 1X, pen/estrep 1X y L-glutamina 2 mM. Tras la recogida las células se lavan una vez y se resuspenden en tampón de ensayo (tampón de estimulación (HBSS con Mg y Ca, HEPES 5 mM, BSA al 0,1 %, ácido ascórbico 100 uM) diluido 1:2 con PBS de Dulbecco que contiene una concentración final de IBMX 0,5 mM) y se siembran en placas de 96 pocillos a 15.000 células por pocillo. Se añade a las células el anticuerpo de prueba o un anticuerpo IgG4 humano de control (diluciones en serie con factor 4 en tampón de ensayo, 10 concentraciones), seguido de una cantidad fija de a-CGRP humano (2 nM; Bachem H1470). Las placas se incuban durante 1 h a temperatura ambiente. Los niveles de AMPc se miden mediante un sistema de ensayo de fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) (Cisbio).

La cantidad de AMPc inducida por CGRP humano 2 nM en presencia de concentraciones variables de anticuerpo se calcula como una inhibición porcentual en comparación con CGRP solo. La concentración de anticuerpo que produce el 50 % de inhibición de la producción de AMPc (CI50) se calcula después a partir de un modelo de ajuste de curva de 4 parámetros. Siguiendo los procedimientos como se describe en el presente documento, el Anticuerpo III (CI50 de 0,41 nM) inhibió la cantidad de AMPc inducida por CGRP en un grado mucho mayor que el Anticuerpo G1 (CI50 de 5,36 nM), posiblemente debido a la velocidad Kon más rápida del anticuerpo III (velocidad Kon medida por Biacore).

EJEMPLO 5- Modelo de extravasación de proteínas plasmáticas (EPP) en la duramadre

El modelo de EPP en rata es un modelo preclínico bien establecido que se puede utilizar para evaluar la eficacia de los anticuerpos anti CGRP para el tratamiento de la jaqueca.

Se prepara en solución salina una solución de 2 mg/ml de un anticuerpo (Ac) anti CGRP. Todas las diluciones posteriores se preparan con solución salina. También se prepara en solución salina una solución de anticuerpo monoclonal de control de isotipo (IgG) de 2 mg/ml.

Se anestesian con Nembutal (60 mg/kg, ip.) ratas Sprague-Dawley macho de Harlan Laboratories (250 a 350 g) y se colocan en un marco estereotáctico (David Kopf Instruments) con la barra incisiva ajustada a -2,5 mm. Después de una incisión sagital media con bisturí, se perforan a través del cráneo dos pares de orificios bilaterales (3,2 mm de forma posterior, 1,8 y 3,8 mm de forma lateral, todas las coordenadas con referencia al bregma). Se hacen descender a través de los orificios en ambos hemisferios parejas de electrodos de estimulación de acero inoxidable (Medical Systems Inc), aislados excepto en las puntas, hasta una profundidad de 9,2 mm por debajo de la duramadre. Los anticuerpos de prueba o el vehículo de solución salina se administran por vía intravenosa en la vena femoral (1 ml/kg). Ocho minutos más tarde se inyecta en la vena femoral una solución de seroalbúmina bovina (BSA) marcada con colorante isotiocianato de fluoresceína (FITC) (FITC-BSA, Sigma A9771) (20 mg/kg, iv.) para que actúe como un marcador de la extravasación de proteínas. Diez minutos después de la dosificación de los anticuerpos de prueba o del vehículo, se estimula el ganglio de Gasser izquierdo durante 5 minutos a una intensidad de corriente de 1,0 mA (5 Hz, duración de 5 ms) con un estimulador Model S48 Grass Instrument. Cinco minutos después de la estimulación se sacrifican las ratas por desangrado con 40 ml de solución salina. El desangrado también elimina en los vasos sanguíneos la FITC/BSA residual. La parte superior del cráneo se retira para recoger las membranas de la duramadre. Las muestras de membrana se retiran de ambos hemisferios, se lavan con agua y se extienden de forma plana sobre portaobjetos de microscopio. Los portaobjetos se secan durante 15 minutos en un calentador de portaobjetos y se cubren con cubreobjetos con una solución de glicerol/agua al 70 %.

Se utiliza un microscopio de fluorescencia (Zeiss) provisto de una rejilla de difracción monocromadora y un espectrofotómetro para cuantificar la cantidad de colorante FITC-BSA en cada muestra de duramadre. El microscopio está provisto de una plataforma motorizada conectada a un ordenador personal. Esto facilita el movimiento controlado por ordenador de la plataforma, con mediciones de fluorescencia en 25 puntos (etapas de progresión de 500 pm) en cada muestra de duramadre. La extravasación inducida por la estimulación eléctrica del ganglio de Gasser es un efecto ipsilateral (es decir, se produce solo en el lado de la duramadre en que se estimula el ganglio de Gasser). Esto permite utilizar la otra mitad de la duramadre (no estimulada) como control. Se calcula la proporción de extravasación (es decir, la proporción de la cantidad de extravasación en la duramadre del lado estimulado en comparación con el lado no estimulado).

SECUENCIAS

ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF (SEQ ID NO:1)

ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF (SEQ ID NO:2)

Xi es Q, R o K;

X2 es D o P;

X3 es D o S;

X4 es N o K;

y X5 es G o E.

X6 es K o D;

X7 es V o R;

X8 es D o G;

y X9 es G o S.

DIQ M TQ SPSSLSASVG DRVTITCRASQ DIDNYLNW YQ Q K PG K APK LLIYYTSEYH

SGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALPPTFGQGTKLEIK (SEQ

ID NO: 17)

DIQM T Q SP S SL S AS VGDRVTIT C R ASQ DIDNYLNW Y QQKPGK APKLLIYYTSEYH

SGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALPPTFGQGTKLEIK (SEQ

ID NO: 18)

DIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASKDISKYLNW YQQKPGK APK LLIYYTSGYH

SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALPPTFGGGTKVEIK (SEQ

ID NO: 19)

DIQM T Q SPSSLSASV GDRVTIT CR ASRPIDK YLNW Y Q QKPGK APKLLI Y YT SE YHS

GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID

NO: 20)

DIQM T Q SP S SL S AS YGDRYTIT CR A S QDIDK YLNW Y Q QKPGK APKLLIY YT S GYH SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 21)

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Q VQLVQ SGAEVK KPGASVKVSCKASGYTFGNYW M QW VRQAPGQG LEW M GAI YEGT GKT V YIQKF AGR VTM TRDT S T S T VYM EL S SLRSEDT A V Y Y C ARL SD Y V S G FSYW G Q G TLVTVSS (SEQ ID NO: 23)

Q VQ LVQ SGAEVK KPGSSVKVSCKASGYTFGNYW M QW VRQAPGQGLEW M GAI YEGT GKT V YIQKF ADRVTIT ADK S T S T A YM EL S SLRSEDT A V Y Y C ARL SD Y V S GF GYW GQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 24)

Q VQLVQ SGAEVK KPGASVKVSCKASGYTFGNYW M QW VRQAPGQG LEW M GAI YEGT GKT V YIQKF AGRVTM TRDT S T ST VYM EL S SLRSEDT A V Y Y C ARL SD Y V S G FGYW GQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 25)

Q VQ LVQ SGAEVK KPGSSVKVSCKASGYTFGNYW M QW VRQAPGQGLEW M GAI YEGT GKT V YIQKF AGRVTIT ADK S T S T A YM EL S SLRSEDT A V Y Y C ARE SD Y V S GF GYW GQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 26)

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DIQ M TQ SPSSLSASVGDRVTITCRASKDISKYLNW YQQKPGK APK LLIYYTSGYH S GVP SRF SGSGSGTDF TLTIS SLQPEDF AT Y YCQQGD ALPPTF GGGTKVEIKRT V A APSVFIFPPSDEQ LK SG TASVVCLLNNFYPREAK VQ W K VDNALQ SG NSQ ESVTEQ D SKD S T Y SL S S TLTL SKAD YEKHK V Y ACEVTHQGL S SP VTK SFNRGEC (SEQ ID NO: 29)

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QVQLVQSGAEVK KPGASVKVSCKASGYTFGNYW M QW VRQAPGQG LEW M GAI YEGT GKT V YIQKF AGRVTM TRDT S T ST VYM EL S SLRSEDT A V Y Y C ARL SD Y V S G FSYW GQ GTLVTVSS ASTKGPS VFPLAPC SRSTSESTAALGCL VK D YFPEP VTVSW N S GALT S GVHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTKT YT CNVDHK P SNTK VDK RVESK Y GPPCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTC V V V D VSQEDPE VQ FNW YVDG VEVH NAK TK PREEQ FNSTYRVV S VLTVLHQDW LNGK EYKCKV S NKGLP S SIEKTI SK AKGQPREPQ V YTLPP S QEEMTKN Q V SLTCL VKGF YP SDIA VE W E SN GQPENNYKTTPP VLD SDGSFFL Y SRLTVDKSRW QEGNVF SC SVM HEALHN HYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 33)

QVQLVQ SGAEVK KPGSSVKVSCKASGYTFGNYW M QW VRQAPGQGLEW M GAI YEGT GKT V YIQKF ADRVTIT A D K S T S T A YMEL S SLRSEDT A V Y Y C ARL SD Y V S GF G YW GQG TTVTVSSASTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALG CL VKD YFPEP V TV SW N S GALT S GVHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTKT YT CNVDHKP SNTK VDKR VESKYGPPCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEV Q FNW YVDG VEVH NAK TK PREEQ FNSTYRVV S VLTVLHQDW LNGK EYKCKV SN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNG Q PENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTVDK SRW Q EG NVFSCSVM H EALH NH YTQK SLSLSLG (SEQ ID NO: 34)

QVQLVQSGAEVK KPGASVKVSCKASGYTFGNYW M QW VRQAPGQG LEW M GAI

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HYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 35)

Q VQL VQ SG AE VKKPGS S VK VSCK ASG YTF GNYW M QW YRQAPGQGLEW M GAI

YEGT GKT V YIQKF AGR VTIT A D K ST S T A YMEL S SLRSEDT A V Y Y C ARL SD Y V S GF

GYW GQ GTT VT V S S AS TKGP S VFPL APC SRS T SE ST AALGCL VKD YFPEP VT VS W N

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Q FNW YVDG VEVH NAK TK PREEQ FNSTYRVV S VLTVLHQDW LNGK EYKCKV SN

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E SNGQPENNYKTTPP VLD SDGSFFL Y SRLTVDKSRW QEGNVF SC SVM HEALHNH

YTQK SLSLSLG (SEQ ID NO: 36)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASK RVTTYVSW YQQKPG QAPRLLIYGASNRY

LGIP ARF S GS GS GTDF TLTIS SLEPEDF A V Y Y C S Q S Y N YP YTF GQGTKLEIK (SEQ

ID NO: 40)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYW ISW VRQAPGKGLEW VAEIRSE

SD AS ATH Y AEAVK G RFTISRDNAK N SLYLQM N SLRAEDT A V Y Y CL AYFD Y GL AI

QNYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41)

YHSGVPSRFSGSGSGTDFTXeTISSLQPEDXyATYYCQQGDALPPTFGXsGTKXgEIK Xi=Q, K o R;

X2=D o P;

X3 D o S;

X4=K o N;

X5=E o G;

X6= F o L;

X7=I o F;

X8=Q o G;

y X9=L o V. (SEQ ID NO: 42)

QVQLVQSGAEVKKPGXiSVKVSCKASGYTFGNYW M QW VRQAPGQGLEW M GAI YEGTGXjTX íYIQKFAX^RVTXíTXíD X tSTSTXsYM ELSSLRSEDTAVYYCARLSDY VSG FX ⁹ YW GQGTX ¹⁰ VTVSS

X1=A o S

X2=K o D

X3=V o R;

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en el que dicha secuencia de aminoácidos de LCVR es la SEQ ID NO: 17 y dicha secuencia de aminoácidos de HCVR es la SEQ ID NO: 22.

2. El anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 27 y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 32.

3. El anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado de la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que cada secuencia de aminoácidos de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 27 y cada secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 32.

4. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

5. Un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en terapia.

6. Un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento de las jaquecas.

7. El uso de un anticuerpo frente a CGRP humano técnicamente diseñado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las jaquecas.

8. Un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo CGRP humano de ingeniería de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, dicho fragmento comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que dicha secuencia de aminoácidos de LCVR es SEQ ID NO: 17 y dicha secuencia de aminoácidos de HCVR es la SEQ ID NO: 22.