CN105483091A - 小鼠抗人Calcitonin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 - Google Patents

Abstract

一种小鼠抗人Calcitonin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌Calcitonin单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为7D5，保藏编号为：CGMCC？No.？6919。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株7D5产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ？ID？NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ？ID？NO:10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测Calcitonin表达。

Description

小鼠抗人Calcitonin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株

技术领域

本发明涉及以原核表达的Calcitonin蛋白免疫小鼠获得的分泌Calcitonin单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D5，属于生物工程技术领域。

背景技术

Calcitonin即降钙素（Calcitonin，CT）是由C细胞中位于11号染色体短臂上的相关基因编码产生的32个氨基酸组成的多肽类激素，由哺乳动物甲状旁腺滤泡的C-细胞或鱼和鸟等非哺乳类脊椎动物后鳃体分泌，分子量约为3.5kDa。

Calcitonin基因复合物由α和β基因组成。α基因有6个外显子，其中前3个与降钙素基因相关肽（CGRP）共有，外显子4为Calcitonin专用，外显子5、6为降钙素基因相关肽（CGRP）专用。β基因除3’端和5’端的非编码区与α基因不同外，其余均相同。Calcitonin的分泌主要受细胞外钙离子浓度调节，另外五肽促胃泌素、β肾上腺能激动剂、生长素释放激素和胃肠肽等都会促进Calcitonin的分泌。

甲状腺髓样癌（medullarcarcinomaofthyroid,MCT）是起源于甲状旁腺滤泡细胞（C细胞或称降钙素分泌细胞）的一种非常少见的内分泌系统恶性肿瘤，易于复发和转移。由于甲状腺髓样癌恶性程度高且预后较差，因此早期发现、早期诊断、早期治疗有着十分重要的临床意义，而术前、术后对肿瘤标志物的检测尤为突出。许多研究显示，降钙素（Calcitonin）是特异的甲状腺髓样癌标志物，通过免疫组织化学检测可以看出降钙素（Calcitonin）水平能够直接反映出肿瘤组织中降钙素（Calcitonin）的合成情况，进而反映出肿瘤的生长情况。降钙素（Calcitonin）可以作为一个预测甲状腺髓样癌颈淋巴结转移以及判断治疗效果的重要指标，对于甲状腺髓样癌的早期诊断、判断手术效果及预后观察，具有重要意义。Calcitonin抗体可以应用于甲状腺C细胞增生、甲状腺髓样癌及部分神经内分泌肿瘤的研究。

目前，国内外已经获得了多种Calcitonin的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的Calcitonin的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测Calcitonin表达的小鼠抗人Calcitonin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

（1）根据Calcitonin的基因序列（NM_001033952.2）的编码框，设计1对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增Calcitonin基因，构建重组表达载体PET28a-Calcitonin，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。

（2）采用经典的细胞融合技术制备Calcitonin单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。

（3）采用免疫印迹法通过免疫组织化学分析Calcitonin单克隆抗体染色人甲状旁腺石蜡切片。

（4）根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体Calcitonin重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体Calcitonin的重链和轻链可变区序列。

本发明提供的以原核表达的Calcitonin蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌Calcitonin单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为7D5，分类命名为小鼠抗人Calcitonin杂交瘤细胞系，该细胞株7D5已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCCNo.6919。

本发明还提供了所述杂交瘤细胞株7D5，CGMCCNo.6919产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:10。

本发明的优点和有益效果

本发明应用重组人的Calcitonin蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠,采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗Calcitonin抗体的杂交瘤细胞株，命名为7D5，亚型鉴定为IgG1，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用ProteinA亲和层析法对Calcitonin单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上；ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1:100000以上。人甲状旁腺石蜡切片经抗Calcitonin抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆中出现均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的Calcitonin单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的Calcitonin蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测Calcitonin表达。

附图说明

图1SDS-PAGE分析纯化后的Calcitonin单克隆抗体。

图2ELISA法测定Calcitonin单克隆抗体滴度。

图3是免疫组织化学检测分析Calcitonin单克隆抗体染色人甲状旁腺石蜡切片。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。

实施例1：杂交瘤细胞株7D5及其产生的单克隆抗体的获得

1、抗原制备

（1）获得目的基因

在该实施例中，根据Calcitonin的基因序列（NM_001033952.2）的编码框，设计1对特异引物：

引物1：5'-TCAGGATCCATGGGCTTCCAAAAGTTCT-3'(SEQIDNO:1)

引物2：5'-TTACTCGAGTTAGTTGGCATTCTGGG-3'；(SEQIDNO:2)

TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增Calcitonin基因。

（2）构建重组表达载体

将步骤（1）获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒PET28a-Calcitonin。

（3）获得含重组表达质粒的表达菌种

将步骤（2）获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的

固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

（4）诱导表达和蛋白纯化

将步骤（2）提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至10ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，37℃，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mMIPTG诱导表达，16℃诱导过夜，收集菌液超声，取上清用Ni-NTA琼脂糖亲和层析法纯化Calcitonin蛋白。

2、单抗的制备和纯化

(1)、免疫动物

一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。

首次免疫。纯化的重组蛋白Calcitonin（用适量生理盐水稀释）+完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；

二次免疫（间隔两周）。纯化的重组蛋白Calcitonin（用适量生理盐水稀释）+不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；

三次免疫（间隔两周）。纯化的重组蛋白Calcitonin（用适量生理盐水稀释），不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；

三次免疫后7~10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。

加强免疫（融合前3天），用纯化的重组蛋白50μg腹腔注射。3天后，取脾脏融合。

(2)、细胞融合

采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合（1:5~1:10），并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。

用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：以纯化的Calcitonin蛋白（10μg/ml）包被酶标板，每孔100μl，4℃包板过夜。甩掉包被液，加入200μl5%的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清100μl（阴性对照为PBS100μl），37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗（羊抗鼠IgG-HRP），37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μl，室温静置5分钟，加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗Calcitonin杂交瘤细胞株，命名为7D5，亚型鉴定为IgG1。

将选出的阳性杂交瘤细胞株7D5单克隆化培养（有限稀释法），获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人Calcitonin杂交瘤细胞系7D5，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.6919。

(3)、单克隆抗体的大量制备与纯化

将步骤（2）获得的细胞株7D5接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。

单克隆抗体Calcitonin的纯化：采用ProteinA亲和层析法。首先制备proteinA亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗Calcitonin的腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/L的pH2.5的甘氨酸-HCl溶液（pH）洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上(参见图1)。

(4)直接ELISA法测定纯化抗体的滴度

以纯化的Calcitonin蛋白（10μg/ml）包被酶标板，每孔100μl，4℃包板过夜。甩掉包被液，加入200μl5%的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，洗涤3次，将纯化的抗体按1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800进行稀释，以每孔100μl加入酶标板中（阴性对照为PBS100μl），37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗（羊抗鼠IgG-HRP），37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μl，室温静置5分钟，加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1:10000以上（参见图2）。

实施例2：单克隆抗体免疫组化应用检测

用Calcitonin单抗，按常规法作病理切片，对人甲状旁腺石蜡切片进行免疫组化染色。

具体方法为

(1)脱蜡

切片依次置于二甲苯I、II、III中脱蜡，每次5分钟，移至无水乙醇I、II中各浸泡4分钟，移至95%酒精中浸泡4分钟，移至85%酒精中浸泡4分钟，再移至70%酒精中浸泡4分钟，流水冲洗2分钟。

(2)抗原修复

将已冲洗干净的组织切片放入高压锅内，加入约3000ml左右的柠檬酸盐抗原修复液（pH6.0），高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟，关掉电磁炉开关，两分钟后将高压锅移至冷水中冷却，待高压锅内抗原修复液完全冷却后，打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟。

(3)阻断

将组织切片置于3%H₂O₂中浸泡10分钟，以流水和蒸馏水分别冲洗。取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈，注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性。PBS缓冲液冲洗。

(4)滴加一抗

甩去待测组织切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗为实施例1步骤（3）制备并纯化的抗Calcitonin单克隆抗体，稀释度为1:200。放置在孵育盒内4℃冰箱中孵育约12小时。

(5)滴加二抗

将孵育盒从冰箱中取出，恢复至室温后取出切片，用PBS洗3次，每次5分钟。滴加通用型二抗-HRP聚合物。将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37℃恒温箱中孵育30分钟。

(6)显色、衬染、封片

取出切片，擦掉组织周围的多余的PBS，加入DAB显色液中显色3～5分钟，在显微镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗5～10分钟，苏木素染液复染1分钟，0.5%盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗5～10分钟，脱水、透明、封片、镜检。

结果判定：按照国外学者对组织中Calcitonin的判定标准，Calcitonin蛋白阳性反应为黄到棕黄色细小颗粒，定位于胞浆。人甲状旁腺石蜡切片（参见图3）经抗Calcitonin抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆中出现均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。说明此Calcitonin小鼠单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。

实施例3：单克隆抗体可变区测序

根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物：

zh075'-GGGGATATCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3'(SEQIDNO:3)

zhr115'-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3'(SEQIDNO:4)

zl015'-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3'(SEQIDNO:5)

zlr055'-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3'(SEQIDNO:6)

TrizolReagent试剂分别提取5×10⁶杂交瘤细胞7D5的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。用zh07和zhr11为引物进行PCR扩增单克隆抗体Calcitonin重链可变区，用zl01和zlr05为引物进行PCR扩增单克隆抗体Calcitonin轻链可变区，PCR反应均采用热启动，反应条件:94℃5分钟；94℃45秒，60℃45秒，72℃1分10秒，30个循环；72℃7分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段（轻链长度391bp，重链长度420bp）。克隆到pGEM-T(Promega)载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后在IPTGIX-gal平板上进行筛选，取白色菌斑接种于含有氨韦青霉素的LB液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序，确定了抗Calcitonin单克隆抗体的重链和轻链可变区序列。

单克隆抗体Calcitonin可变区的DNA序列和氨基酸序列：

单克隆抗体Calcitonin重链可变区DNA序列(5'→3'，327bp)(SEQIDNO:7)；

单克隆抗体Calcitonin的轻链可变区DNA序列(5'→3'，389bp)(SEQ1DNO:8)；

单克隆抗体Calcitonin重链可变区的推断氨基酸序列(109氨基酸)(SEQIDNO:9)；

单克隆抗体Calcitonin轻链可变区的推断氨基酸序列(129氨基酸)(SEQ10IDNO:10)。

序列表SEQUENCELISTING

<110>天津三箭生物技术股份有限公司

<120>小鼠抗人Calcitonin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株

<130>DNA

<160>10

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>1

tcaggatccatgggcttccaaaagttct28

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>2

ttactcgagttagttggcattctggg26

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>引物

<400>3

ggggatatccaccatggratgsagctgkgtmatsctctt39

<210>4

<211>38

<212>DNA

<213>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>nisa,c,g,ort

<400>4

gachgatggggstgtygtgctagctgnrgagacdgtga38

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>引物

<400>5

ggggatatccaccatggagacagacacactcctgctat38

<210>6

<211>42

<212>DNA

<213>引物

<400>6

ggatacagttggtgcagtcgacttacgtttkatttccarctt42

<210>7

<211>327

<212>DNA

<213>小鼠（Musmusculus）

<400>7

ctcttctgtcagactgcaggtgtccactctgaggtccagctgcagcagtctggacctgag60

ctggtaaagcctgggacttcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggatacacattcact120

agctatgttatacactgggtgaagcagaagcctgggcagggccttgagtggattggatat180

attaatccttacaatgttggtactaaatacaatgagaagttcagagacaaggccacactg240

acttcagacaaatcctccaacacagcctacatggagctcagcagcctgacctctgaggac300

tttgcggtctattactgtgtaagatcg327

<210>8

<211>389

<212>DNA

<213>小鼠（Musmusculus）

<400>8

ggcgttcccccctcgacgtgtaagctccctaatgtgctgacagtaataggttgcagcatc60

ctcctcctccacaggatggatgttgagggtgaagtctgtcccagacccactgccactgaa120

cctggcagggaccccagattctaggttggatacaagatagatgaggagtctgggtggctg180

tcctggtttctgttggttccagtgcatataactatagccagatgtactgacacttttgct240

ggccctgtatgagatggtggccctctgccccagagatacagctaaggaagcaggagactg300

tgtcagcacaatgtcaccagtggaacctggaacccagagcagcagtacccatagcaggag360

tgtgtctgtctccatggtgaatatcccca389

<210>9

<211>109

<212>PRT

<213>小鼠（Musmusculus）

<400>9

LeuPheCysGlnThrAlaGlyValHisSerGluValGlnLeuGlnGln

151015

SerGlyProGluLeuValLysProGlyThrSerValLysMetSerCys

202530

LysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyrValIleHisTrpValLys

354045

GlnLysProGlyGlnGlyLeuGluTrpIleGlyTyrIleAsnProTyr

505560

AsnValGlyThrLysTyrAsnGluLysPheArgAspLysAlaThrLeu

65707580

ThrSerAspLysSerSerAsnThrAlaTyrMetGluLeuSerSerLeu

859095

ThrSerGluAspPheAlaValTyrTyrCysValArgSer

100105

<210>10

<211>129

<212>PRT

<213>小鼠（Musmusculus）

<400>10

GlyIlePheThrMetGluThrAspThrLeuLeuLeuTrpValLeuLeu

151015

LeuTrpValProGlySerThrGlyAspIleValLeuThrGlnSerPro

202530

AlaSerLeuAlaValSerLeuGlyGlnArgAlaThrIleSerTyrArg

354045

AlaSerLysSerValSerThrSerGlyTyrSerTyrMetHisTrpAsn

505560

GlnGlnLysProGlyGlnProProArgLeuLeuIleTyrLeuValSer

65707580

AsnLeuGluSerGlyValProAlaArgPheSerGlySerGlySerGly

859095

ThrAspPheThrLeuAsnIleHisProValGluGluGluAspAlaAla

100105110

ThrTyrTyrCysGlnHisIleArgGluLeuThrArgArgGlyGlyAsn

115120125

Ala

Claims (2)

1.一种以原核表达的Calcitonin蛋白免疫小鼠获得的分泌Calcitonin单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D5，保藏编号为CGMCCNo.6919。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株7D5产生的重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:10的免疫球蛋白。