BR112012031501B1

BR112012031501B1 - Anticorpos anti- cgrp engenheirado humano, fragmento dos mesmos, e composições farmacêuticas

Info

Publication number: BR112012031501B1
Application number: BR112012031501-3A
Authority: BR
Inventors: Barrett Allan; Robert Jan BENSCHOP; Mark Geoffrey CHAMBERS; Ryan James DARLING
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 2010-06-10
Filing date: 2011-06-07
Publication date: 2020-02-11
Also published as: CA2802102C; RS56638B1; KR20130034024A; PT2579894T; SG185648A1; US20110305711A1; HRP20171992T1; AU2011265050B2; CY1119789T1; EP3318272B1; KR101489566B1; NO2019017I1; CN104292332B; BR112012031501A2; LUC00112I1; AU2011265050A1; US20150259415A1; CN104292332A; HK1203211A1; EP2579894A1

Abstract

anticorpos de cgrp. a presente invenção fornece anticorpos de peptideos relacionado com o gene da calcitonina planejado humano (cgrp) ou seus fragmentos de ligação de peptídeo relacionado com o gene da calcitonina planejado humano (cgrp) ou seus fragmentos de ligação ao antígeno para o tratamento da dor de osteoartrite.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS ANTI- CGRP ENGENHEIRADO HUMANO, FRAGMENTO DOS MESMOS, E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS.

A presente invenção está no campo da medicina, particularmente no campo de anticorpos para o peptídeo relacionado com o gene da calcitonina (CGRP). Mais especificamente, a invenção refere-se aos anticorpos de CGRP e ao uso dos anticorpos de CGRP para a terapia da dor de osteoartrite ou enxaquecas.

O peptídeo relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) é um neuropeptídeo de 37 aminoácidos secretado pelos nervos dos sistemas nervosos central e periférico. O CGRP é amplamente distribuído nos nervos sensoriais, no sistema nervoso tanto periférico quanto central e apresenta um grande número de diferentes atividades biológicas. O CGRP é relatado de desempenhar um papel. Quando liberado a partir das fibras do nervo trigeminal e outro, o CGRP é suposto de mediar as suas respostas biológicas mediante a ligação aos receptores específicos da superfície celular.

O CGRP foi relatado de desempenhar um papel nas enxaquecas quando o CGRP é liberado após a estimulação dos nervos sensoriais e possui potente atividade vasodilatadora. A liberação de CGRP aumenta a permeabilidade vascular e o subsequente derrame de proteínas do plasma (vazamento de proteína plasmática) nos tecidos inervados pelas fibras nervosas trigeminais após o estímulo dessas fibras. Além disso, estudos têm relatado que a infusão de CGRP em pacientes que sofrem de enxaquecas resultou em sintomas similares aos da enxaqueca.

O CGRP também é relatado de desempenhar um papel na osteoartrite (OA). A OA é uma condição crônica que afeta uma grande porcentagem de pessoas no mundo. A dor na artrite é caracterizada pela hiperalgesia (excessivamente sensível aos estímulos normalmente não nocivos) e dor espontânea (dor em repouso). A inflamação da articulação causa sensibilização periférica e central. Na sensibilização periférica, os nociceptores contendo CGRP de limiar normalmente elevada começam a responder à uma leve pressão associada com o movimento articular normal. O CGRP atua como um facilitador local de processos inflamatórios. Este processo contínuo

Petição 870190077218, de 09/08/2019, pág. 12/13

2/27 eventualmente leva à sensibilização central na medula espinhal de tal modo que os neurônios se tornam sensíveis ao estímulo do tecido inflamado assim como do não inflamado. Em modelos pré-clínicos da dor de OA no rato, um aumento do número de fibras nervosas positivas de CGRP foi observado, 5 positivamente correlacionado com a quantidade de dor.

O padrão atual de tratamento para a dor de OA consiste de medicamentos anti-inflamatórios não esteróides (NSAIDs) e inibidores seletivos de COX-2. Ao longo do tempo, muitos pacientes se tomarão insensíveis a estes tratamentos ou não são capazes de tolerar as altas doses necessárias - 10 para aliviar a dor efetiva. Os tratamentos frequentes consistem em injeções intra-articulares (ácido hialurônico) ou opiáceos. O tratamento final é a substituição cirúrgica total da articulação. Muitos destes tratamentos possuem efeitos colaterais negativos, que variam de gastrointestinal (NSAIDs) a cardiovascular (inibidores de COX-2), são incômodos e/ou não muito eficazes 15 (injeções intra-articulares), carregam o risco de abuso (opiáceos), ou são restritos a apenas uma articulação (injeções intra-articulares, cirurgia).

Embora os anticorpos de CGRP para o tratamento de enxaqueca e para o tratamento da dor da inflamação tenham sido divulgados (enxaquecas, WO 2007/076336 e WO 2007/054809; OA ver, Antibody G1 da WO 20 2009/109908A1), ainda existe uma necessidade de alternativas. De preferência, o tratamento alternativo é seguro e eficaz. Mais preferivelmente, o tratamento alternativo para a OA irá fornecer alívio duradouro da dor através de múltiplas articulações que é tolerável para pacientes sem o risco de dependência e/ou abuso.

A presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma região variável da cadeia leve (LCVR) e uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que dita LCVR compreende as sequências de aminoácido LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e a HCVR compreende as sequências de aminoácido HCDR1, HCDR2 e HCDR3 que são se30 lecionadas do grupo consistindo de:

a) LCDR1 é RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 é YTSEYHS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 é QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 é

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GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 é AIYEGTGDTRYIQKFAG (SEQ ID NO: 13), e HCDR3 é LSDYVSGFSY (SEQ ID NO: 14);

b) LCDR1 é RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 é YTSE-

YHS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 é QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 é

GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 é AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15), e HCDR3 é LSDYVSGFSY (SEQ ID NO: 14);

c) LCDR1 é RASKDISKYLN (SEQ ID NO: 6), LCDR2 é YTSGYHS (SEQ ID NO: 7), LCDR3 é QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 é GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 é AIYEGTGKTVYIQKFAD (SEQ . 10 ID NO: 16), e HCDR3 é LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39);

d) LCDR1 é RASRPIDKYLN (SEQ ID NO: 8), LCDR2 é YTSE' YHS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 é QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 é

GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 é AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15), e HCDR3 é LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39); e

e) LCDR1 é RASQDIDKYLN (SEQ ID NO: 9), LCDR2 é YTSGYHS (SEQ ID NO: 7), LCDR3 é QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 é GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 é AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15), e HCDR3 é LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39), em que o anticorpo de CGRP planejado humano se liga ao ΟΣΟ GRP humano.

A presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma LCVR e uma HCVR em que LCDR1 é SEQ ID NO: 3, LCDR2 é SEQ ID NO: 4, LCDR3 é SEQ ID NO: 5, HCDR1 é SEQ ID NO: 12, HCDR2 é SEQ ID NO: 13, e HCDR3 é SEQ ID NO: 14, em que o 25 anticorpo de CGRP planejado humano liga-se ao CGRP humano. A presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreendendo uma LCVR e uma HCVR em que a LCDR1 é SEQ ID NO: 3, LCDR2 é SEQ ID NO: 4, LCDR3 é SEQ ID NO: 5, HCDR1 é SEQ ID NO: 12, HCDR2 é SEQ ID NO: 15, e HCDR3 é 30 SEQ ID NO: 14, em que o anticorpo de CGRP planejado humano liga-se ao CGRP humano. A presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma LCVR e uma HCVR em que a LCDR1 é

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SEQ ID NO: 6, LCDR2 é SEQ ID NO: 7, LCDR3 é SEQ ID NO: 5, HCDR1 é

SEQ ID NO: 12, HCDR2 é SEQ ID NO: 16, e HCDR3 é SEQ ID NO: 39, em que o anticorpo de CGRP planejado humano liga-se ao CGRP humano. A presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano com5 preendendo uma LCVR e uma HCVR em que a LCDR1 é SEQ ID NO: 8,

LCDR2 é SEQ ID NO: 4, LCDR3 é SEQ ID NO: 5, HCDR1 é SEQ ID NO: 12,

HCDR2 é SEQ ID NO: 15, e HCDR3 é SEQ ID NO: 39, em que o anticorpo de CGRP planejado humano se liga ao CGRP humano. A presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma - 10 LCVR e uma HCVR em que a LCDR1 é SEQ ID NO: 9, LCDR2 é SEQ ID

NO: 7, LCDR3 é SEQ ID NO: 5, HCDR1 é SEQ ID NO: 12, HCDR2 é SEQ

ID NO: 15, e HCDR3 é SEQ ID NO: 39, em que o anticorpo de CGRP planejado humano se liga ao CGRP humano.

A presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma LCVR e uma HCVR em que a LCDR1 é

RASXiX₂IX₃X4YLN (SEQ ID NO: 10), a LCDR2 é YTSX₅YHS (SEQ ID NO:

11), a LCDR3 é QQGDALPPT(SEQ ID NO: 5) e a HCDR1 é

GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), a HCDR2 é AIYEGTGX₆TX₇YIQKFAX₈ (SEQ ID NO: 37), e a HCDR3 é LSDYVSGFX₉Y (SEQ ID NO: 38), em que

Xi é Q, R, ou K; X₂ é D ou P, X₃ é D ou S, X4 é N ou K, X5 é G ou E, X₈ é K ou D, X₇ é V ou R, X₈ é D ou G, e X₉ é G ou S, em que o anticorpo se liga ao CGRP humano.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma região variável da cadeia leve (LCVR) e uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que a LCVR compreende

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASXiX₂IX₃X₄YLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSX₅YHSGVPSRFSGSGSGTD

FTX₆TISSLQPEDX₇ATYYCQQGDALPPTFGX₈GTKX₉EIK em que X1 é Q, K, ou R; X₂é D ou P; X₃ é D ou S; X4é K ou N; X₅é E ou G; X₆ é F ou L; X₇é I ou F; X₈ é Q ou G; e X₉ é L ou V. (SEQ ID NO: 42) e a HCVR compreende

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QVQLVQSGAEVKKPGX1SVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTG X₂TX₃YIQKFAX4RVTX₅TX₆DX₇STSTX₈YMELSSLRSEDTAVYYCARLSDWS GFX9YWGQGTX10VTVSS, em que Xi = A ou S; X₂= K ou D; X₃=V ou R; X4=

G ou D; X₅= M ou I; X₆=R ou A; X₇=T ou K; X₈=V ou A; Xg=G ou S; e Xio=L ou T. (SEQ ID NO: 43), em que o anticorpo se liga ao CGRP humano.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma região variável da cadeia leve (LCVR) e uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que a ΙΟΙ 0 VR e a HCVR são sequências de aminoácidos selecionados do grupo consistindo de:

a. LCVR é SEQ ID NO: 17 e HCVR é SEQ ID NO: 22;

b. LCVR é SEQ ID NO: 18 e HCVR é SEQ ID NO: 23;

c. LCVR é SEQ ID NO: 19 e HCVR é SEQ ID NO: 24;

d. LCVR é SEQ ID NO: 20 e HCVR é SEQ ID NO: 25; e

e. LCVR é SEQ ID NO: 21 e HCVR é SEQ ID NO: 26.

A presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma LCVR de SEQ ID NO: 17 e uma HCVR de SEQ ID NO: 22. Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece 20 um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma LCVR de SEQ ID NO: 18 e uma HCVR de SEQ ID NO: 23. A presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma LCVR de SEQ ID NO: 19 e uma HCVR de SEQ ID NO: 24. A presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma LCVR de 25 SEQ ID NO: 20 e uma HCVR de SEQ ID NO: 25. A presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma LCVR de SEQ ID NO: 21 e uma HCVR de SEQ ID NO: 26.

A presente invenção também fornece um anticorpo de CGRP planejado humano que compreende uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pe30 sada (HC), em que as sequências de aminoácido de LC e HC são selecionadas do grupo consistindo de:

a) LC é SEQ ID NO: 27 e HC é SEQ ID NO: 32;

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b) LC é SEQ ID NO: 28 e HC é SEQ ID NO: 33;

c) LC é SEQ ID NO: 29 e HC é SEQ ID NO: 34;

d) LC é SEQ ID NO: 30 e HC é SEQ ID NO: 35; e

e) LC é SEQ OD NO: 31 e HC é SEQ ID NO: 36.

Em uma modalidade, o anticorpo de CGRP planejado humano compreende uma LC de SEQ ID NO: 27 e uma HC de SEQ ID NO: 32. Em outra modalidade, o anticorpo de CGRP planejado humano compreende uma LC de SEQ ID NO: 28 e uma HC de SEQ ID NO: 33. Em outra modalidade, o anticorpo de CGRP planejado humano compreende uma LC de SEQ -10 ID NO: 29 e uma HC de SEQ ID NO: 34. Em outra modalidade, o anticorpo de CGRP planejado humano compreende uma LC de SEQ ID NO: 30 e uma HC de SEQ ID NO: 35. Em outra modalidade, o anticorpo de CGRP planejado humano compreende uma LC de SEQ ID NO: 31 e uma HC de SEQ ID NO: 36. Em uma modalidade, o anticorpo de CGRP planejado humano com15 preende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas em que cada sequência de aminoácido de LC é SEQ ID NO: 27 e cada sequência de aminoácido de HC é SEQ ID NO: 32. Em uma modalidade, o anticorpo de CGRP planejado humano compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas onde cada sequência de aminoácido de LC é SEQ ID NO: 28 e cada sequência de 20 aminoácido de HC é SEQ ID NO: 33. Em uma modalidade, o anticorpo de CGRP planejado humano compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas em que cada sequência de aminoácido de LC é SEQ ID NO: 29 e cada sequência de aminoácido de HC é SEQ ID NO: 34. Em uma modalidade, o anticorpo de CGRP planejado humano compreende duas cadeias le25 ves e duas cadeias pesadas em que cada sequência de aminoácido de LC é SEQ ID NO: 30 e cada sequência de aminoácido de HC é SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade, o anticorpo de CGRP planejado humano compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas em que cada sequência de aminoácido de LC é SEQ ID NO: 31 e cada sequência de aminoácido de HC é SEQ ID NO: 36. A presente invenção também fornece fragmento de ligação ao antígeno dos anticorpos aqui descritos.

A presente invenção também fornece anticorpos de CGRP pia

7/27 nejados humanos que têm uma IC50 < 1,0 nM em um ensaio essencialmente conforme descrito no Exemplo 4. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma

LCVR e uma HCVR em que a LCDR1 é SEQ ID NO: 6, LCDR2 é SEQ ID 5 NO: 7, LCDR3 é SEQ ID NO: 5, HCDR1 é SEQ ID NO: 12, HCDR2 é SEQ

ID NO: 16, e HCDR3 é SEQ ID NO: 39, e em que o anticorpo de CGRP planejado humano liga-se ao CGRP humano e também possui um IC50 <1,0 nM em um ensaio essencialmente como descrito no Exemplo 4. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado

- 10 humano compreendendo uma sequência de aminoácido de LCVR de SEQ

ID NO: 19 e uma sequência de aminoácido de HCVR de SEQ ID NO: 24, em que o anticorpo de CGRP planejado humano possui uma IC50 <1,0 nM em um ensaio essencialmente como descrito no Exemplo 4. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma sequência de aminoácido de LC da SEQ ID NO: 29 e uma sequência de aminoácido de HC da SEQ ID NO: 34, em que o anticorpo de CGRP planejado humano possui uma IC50 < 1,0 nM em um ensaio essencialmente comoo descrito no Exemplo 4.

A presente invenção também fornece anticorpos de CGRP pla20 nejados humanos que possuem uma IC₅₀ < 0,5 nM em um ensaio essencialmente como descrito no Exemplo 4. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma LCVR e uma HCVR em que a LCDR1 é SEQ ID NO: 6, a LCDR2 é

SEQ ID NO: 7, a LCDR3 é SEQ ID NO: 5, a HCDR1 é SEQ ID NO: 12, a

HCDR2 é SEQ ID NO: 16, e a HCDR3 é SEQ ID NO: 39, e em que o anticorpo de CGRP planejado humano liga-se ao CGRP humano e também possui uma IC₅o < 0,5 nM em um ensaio essencialmente conforme descrito no Exemplo 4. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo uma sequência de ami30 noácido de LCVR da SEQ ID NO: 19 e uma sequência de aminoácido de

HCVR da SEQ ID NO: 24, em que o anticorpo de CGRP planejado humano possui uma IC50 < 0,5 nM em um ensaio essencialmente como descrito no

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Exemplo 4. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano compreendendo um sequência de aminoácido de LC da SEQ ID NO: 29 e uma sequência de aminoácido de HC da SEQ ID NO: 34, em que o anticorpo de CGRP planejado humano possui uma IC50 < 5 0,5 nM em um ensaio essencialmente conforme descrito no Exemplo 4.

A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de CGRP planejado humano ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção e um portador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção ainda - 10 fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo de CGRP da presente invenção juntamente com um portador farmaceuticamente aceitável e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento da dor de osteoartrite compreendendo a administração à um 15 paciente com sua necessidade de um anticorpo de CGRP planejado humano ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de enxaqueca compreendendo a administração a um paciente com sua necessidade de um anticorpo de CGRP planejado humano ou fragmento de ligação ao 20 antígeno deste da presente invenção.

A presente invenção também fornece um anticorpo de CGRP planejado humano ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção para uso em terapia. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano ou seu fragmento de ligação 25 ao antígeno da presente invenção para o tratamento da dor de osteoartrite.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um anticorpo de CGRP planejado humano ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção para 0 tratamento de enxaquecas.

A presente invenção também fornece 0 uso de um anticorpo de 30 CGRP planejado humano ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção para uso no tratamento da dor de osteoartrite. Em outro aspecto, a presente invenção também fornece a utilização de um anticorpo de

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CGRP planejado humano ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção para uso no tratamento de enxaquecas. A presente invenção também fornece o uso de um anticorpo de CGRP planejado humano ou seu fragmento de ligação ao antígeno na fabricação de um medicamento para o 5 tratamento de osteoartrite. A presente invenção também fornece a utilização de um anticorpo de CGRP planejado humano ou fragmento de ligação ao antígeno deste na fabricação de um medicamento para o tratamento de enxaquecas.

Um anticorpo de comprimento total como existe naturalmente é

- 10 uma molécula de imunoglobulina que compreende 2 cadeias pesadas (H) e cadeias leves (L) interligadas por pontes de dissulfeto. A porção aminoterminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno através das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) neles contidas. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constante principalmente responsável pela função efetora.

As CDRs são intercaladas com as regiões que são mais conservadas, denominadas por regiões de estrutura (FR). Cada região variável de cadeia leve (LCVR) e região variável de cadeia pesada (HCVR) é composta 20 de 3 CDRs e 4 FRs, dispostas a partir do amino-terminal até o carbóxiterminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As

CDRs da cadeia leve são referidas como LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e as 3 CDRs da cadeia pesada são referidas como HCDR1, HCDR2 e HCDR3. As CDR contêm a maior parte dos resíduos que formam as interações espe- cíficas com o antígeno. A numeração e posicionamento dos resíduos de aminoácido da CDR dentro das regiões LCVR e HCVR estão de acordo com a convenção de numeração de Kabat bem conhecida.

As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda, e são caracterizadas por uma região constante particular como conhecida na téc30 nica. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, e definem o isótipo de um anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, respectivamente. Os anticorpos IgG podem ser ainda divididos em subclas

10/27 ses, por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4. Cada tipo de cadeia pesada é caracterizado por uma região constante particular com uma sequência bem conhecida na técnica.

Como aqui usado, o termo anticorpo monoclonal (Mab) refere5 se à um anticorpo que é derivado de uma única cópia ou clone incluindo, por exemplo, qualquer clone eucariótico, procariótico ou fago, e não o método pelo qual é produzido. Os Mabs da presente invenção de preferência existem em uma população homogênea ou substancialmente homogênea. Os Mabs completos contêm 2 cadeias pesadas e 2 cadeias leves. Os fragmen-10 tos de ligação ao antígeno de tais anticorpos monoclonais incluem, por exemplo, fragmentos Fab, fragmentos, Fab’, fragmentos F(ab’)2, θ os fragmentos Fv de cadeia isolada. Os anticorpos monoclonais e os seus fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser produzidos, por exemplo, através das tecnologias recombinantes, tecnologias de exibição 15 em fagos, tecnologias sintéticas, por exemplo, enxerto da CDR, ou combinações de tais tecnologias, ou outras tecnologias conhecidas na técnica. Por exemplo, camundongos podem ser imunizados com CGRP humano ou seus fragmentos, os anticorpos resultantes podem ser recuperados e purificados, e a determinação se eles possuem propriedades de ligação e funcionais se20 melhantes ou as mesmas que os compostos de anticorpo aqui divulgados, pode ser avaliada pelos métodos divulgado nos Exemplos abaixo. Os fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser preparados por métodos convencionais. Os métodos para a produção e purificação de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno são bem conhecidos na técnica e podem 25 ser observados, por exemplo, em Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15, ISBN 0-87969-314-2.

A expressão anticorpos de CGRP planejados humanos referese aos anticorpos monoclonais criados e/ou manipulados para ter proprieda30 des de ligação e funcionais de acordo com a invenção, ligam-se ao CGRP humano e que possuem regiões estruturais que são substancialmente humanas ou totalmente humanas circundantes às CDRs derivadas de um anti11/27 corpo não humano. Os fragmentos de ligação ao antígeno de tais anticorpos planejados humanos incluem, por exemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)2, e fragmentos Fv de cadeia isolada. A região estrutural ou sequência estrutura refere-se a qualquer uma das regiões estrutu5 rais de 1 a 4. Os anticorpos planejados humanos e seus fragmentos de ligação ao antígeno incluídos pela presente invenção incluem moléculas em que qualquer uma ou mais das regiões estruturais de 1 a 4 é substancial ou completamente humanos, isto é, em que qualquer uma das possíveis combinações de regiões estruturais substancial ou completamente humanas de -10 1 a 4, está presente. Por exemplo, isto inclui moléculas em que a região estrutural 1 e a região estrutural 2, e a região estrutural 1 e a região estrutural 3, a região estrutural 1, 2 e 3, etc., são substancial ou completamente humanas. As estruturas substancialmente humanas são aquelas que possuem pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência à uma sequência de 15 estrutura da linha germinativa humana conhecida. De preferência, as estruturas substancialmente humanas possuem pelo menos cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 95 %, ou cerca de 99 % de identidade de sequência à uma sequência de estrutura da linha germinativa humana conhecida.

As completamente humanas são aquelas que são idênticas à uma sequência de estrutura da linha germinativa humana conhecida. As sequências da linha germinativa de estrutura humana podem ser obtidas da ImMunoGeneTics (IMGT) através de seu website http://imgt.cines.fr, ou da The Immunoglobulin FactsBook by Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por exemplo, as estruturas de ca25 deia leve da linha germinal podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste de: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L15, L6, L8, 012, 02, e 08, e as regiões de estrutura da linha germinativa de cadeia pesada podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo de: VH25, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH430 31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30,

VH3-48, VH4-39, VH4-59, e VH5-51.

Os anticorpos planejados humanos além daqueles aqui divulga12/27 dos que apresentam propriedades funcionais similares de acordo com a presente invenção podem ser gerados utilizando vários métodos diferentes. Os compostos específicos de anticorpos aqui descritos podem ser usados como modelos ou compostos de anticorpo de origem para a preparação de com5 postos de anticorpo adicionais. Em uma abordagem, as CDRs de composto de anticorpo de origem são enxertadas em uma estrutura humana que possui uma identidade de sequência elevada com a estrutura de composto de anticorpo de origem. A identidade de sequência da nova estrutura será geralmente pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos - 10 cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 99 % idêntica à sequência da estrutura correspondente no composto de anticorpo de origem. Esse enxerto pode resultar em uma redução na afinidade de ligação em comparação com aquela do anticorpo de origem. Se este for o caso, a estrutura pode ser transformada de volta para a estrutura de origem em certas posições com base nos critérios específicos divulgados por Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2869. As referências adicionais que descrevem os métodos úteis na humanização de anticorpos de camundongo incluem as Patentes US n~ 4.816.397; 5.225.539 e 5.693.761; programas de computador ABMOD e ENCAD como descritos em Levitt (1983) J. Mol. Biol.

Biol. 168:595-620; e o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; e Verhoeyen etal. (1988) Science 239:1534-1536.

A identificação dos resíduos para considerar a mutação de volta pode ser realizada como se segue:

Quando um aminoácido cai sob a seguinte categoria, o aminoácido estrutural da sequência da linha germinativa humana que está sendo utilizada (a estrutura aceitante) é substituído por um aminoácido estrutural de uma estrutura do composto de anticorpo de origem (a estrutura doadora):

(a) o aminoácido na região estrutural humana da estrutura aceitante é incomum para as estruturas humanas naquela posição, enquanto que o aminoácido correspondente na imunoglobulina doadora é típico para

13/27 as estruturas humanas naquela posição;

(b) a posição do aminoácido é imediatamente adjacente á uma das CDRs; ou (c) qualquer átomo da cadeia lateral de um aminoácido estrutural está dentro de cerca de 5 a 6 angstrons (centro a centro) de qualquer átomo de um aminoácido da CDR em um modelo de imunoglobulina tridimensional.

Quando cada um dos aminoácidos na região estrutural humana da estrutura aceitante e um aminoácido correspondente na estrutura doadora for geralmente incomum para as estruturas humanas naquela posição, tal aminoácido pode ser substituído por um aminoácido típico para as estruturas humanas nessa posição. Este critério de mutação de volta se permite recuperar a atividade do composto de anticorpo de origem.

Outra abordagem para gerar anticorpos planejados humanos que apresentam propriedades funcionais similares aos compostos de anticorpo aqui divulgados envolve os aminoácidos de mutação aleatória dentro das CDRs enxertadas sem alterar a estrutura, e a triagem das moléculas resultantes para a afinidade de ligação e outras propriedades funcionais que são tão boas quanto ou melhores do que aquelas dos compostos de anticorpo de origem. As mutações isoladas também podem ser introduzidas em cada posição de aminoácido em cada CDR, seguido pela avaliação dos efeitos de tais mutações sobre a afinidade de ligação e outras propriedades funcionais. As mutações isoladas que produzem propriedades melhoradas podem ser combinadas para avaliar os seus efeitos na combinação entre si.

Além disso, uma combinação de ambas as abordagens anteriores é possível. Após o enxerto de CDR, pode-se retornar às regiões estruturais específicas além da introdução de alterações de aminoácido nas CDRs. Esta metodologia é descrita em Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162.

Aplicando-se os ensinamentos da presente invenção, uma pessoa versada na técnica pode utilizar técnicas comuns, por exemplo, a mutagênese direcionada ao local, para substituir os aminoácidos dentro da CDR presentemente descrita e as sequências estruturais, e assim gerar outras sequências de aminoácido da região variável a partir das presentes sequên

14/27 cias. Todos os aminoácidos de ocorrência natural alternativos podem ser introduzidos em um sítio de substituição específico. Os métodos aqui divulgados podem depois ser utilizados para controlar estas sequências de aminoácido da região variável adicionais para identificar as sequências tendo as 5 funções in vivo indicadas. Desta forma, outras sequências adequadas para a preparação de anticorpos planejados humanos e as suas partes de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção podem ser identificadas. De preferência, a substituição de aminoácido dentro das estruturas é restrita a uma, duas ou três posições dentro de qualquer um ou mais das 4 regiões . 10 estruturais cadeia leve e/ou de cadeia pesada aqui divulgadas. De preferência, a substituição de aminoácido dentro das CDRs se restringe a uma, duas, ou três posições dentro de qualquer uma ou mais das 3 CDRs de cadeia leve e/ou de cadeia pesada. As combinações das várias mudanças dentro destas regiões de estrutura e CDRs descritas acima também são possíveis.

O termo tratamento (ou tratar) refere-se aos processos que envolvem um retardo, interrupção, detenção, controle, parada, redução ou inversão da progressão ou gravidade de um sintoma, distúrbio, condição ou doença, mas não envolve necessariamente uma eliminação total de todos os sintomas, condições ou distúrbios relacionados com a doença associada 20 com a atividade de CGRP.

O termo enxaqueca como aqui utilizado se refere às enxaquecas sem aura (anteriormente enxaqueca comum) e enxaquecas com aura (anteriormente enxaquecas clássicas) de acordo com o Headache Classification Committee of the International Headache Society (International 25 Headache Society, 2004). Por exemplo, as enxaquecas sem aura, tipicamente podem ser caracterizados como tendo uma qualidade pulsante, uma intensidade moderada ou severa, são agravadas pela atividade física de rotina, são unilateralmente localizadas e são associadas com as náuseas e com a fotofobia e fonofobia. As enxaquecas com aura podem incluir distúr30 bios na visão, distúrbios em outros sentidos, fraqueza unilateral, e, em alguns casos, dificuldade com a fala.

Os anticorpos planejados humanos da presente invenção podem

15/27 ser usados como medicamentos na medicina humana, administrados por uma variedade de vias. Mais preferivelmente, tais composições são para a administração parenteral. Tais composições farmacêuticas podem ser preparadas pelos métodos bem conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) e compreendem um anticorpo planejado humano como aqui divulgado, e um portador, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Os resultados dos ensaios que se seguem demonstram que os anticorpos monoclonais exemplificados e os seus fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser utilizados para o tratamento da dor de osteoartrite.

Exemplo 1 - Produção de Anticorpos

Os anticorpos de I a V podem ser produzidos e purificados como se segue. Uma célula hospedeira apropriada, tal como HEK 293 EBNA ou CHO, é transiente ou estavelmente transfectada com um sistema de expressão para segregar os anticorpos usando uma relação de vetor de HC:LC predeterminada ou um sistema de vetor isolado que codifica tanto a LC, tal como a SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 31 quanto a HC tal como a SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36. Meios clarificados em que o anticorpo foi segregado são purificados utilizando qualquer uma das muitas técnicas comumente utilizadas. Por exemplo, o meio pode ser convenientemente aplicado à uma coluna Proteína A ou G Sepharose FF que foi equilibrada com um tampão compatível, tal como salina tamponada de fosfato (pH 7,4). A coluna é lavada para remover os componentes de ligação não específicos. O anticorpo ligado é eluído, por exemplo, pelo gradiente de pH (tal como 0,1 M tampão de fosfato sódico pH 6,8 com 0,1 M tampão de citrato sódico pH 3,0). As frações de anticorpo são detectadas, tais como por SDS-PAGE, e depois são reunidas. Outra purificação é opcional, dependendo do uso planejado. O anticorpo pode ser concentrado e/ou filtrado estéril usando técnicas comuns. O agregado solúvel e multímeros podem ser efi

16/27 cazmente removidos usando técnicas comuns, incluindo a exclusão por tamanho, interação hidrofóbica, troca iônica ou cromatografia de hidroxiapatita. A pureza do anticorpo após estas etapas de cromatografia é maior do que 99 %. O produto pode ser imediatamente congelado a -70 °C ou pode ser liofilizado. As sequências de aminoácido para estes anticorpos exemplificados são fornecidos abaixo.

Tabela 1 - Anticorpo SEQ IP Nos

Anticorpo	Cadeia Pesada	Cadeia Leve	LCVR	HCVR
I	32	27	17	22
II	33	28	18	23
III	34	29	19	24
IV	35	30	20	25
V	36	31	21	26

Anticorpo	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCDR1	LCDR2	LCDR3
I	12	13	14	3	4	5
II	12	15	14	3	4	5
III	12	16	39	6	7	5
IV	12	15	39	8	4	5
V	12	15	39	9	7	5

Exemplo 2: Medidas de Afinidade (Kd) para os anticorpos de CGRP planejados humanos

A afinidade de ligação dos anticorpos exemplificados para o CGRP é determinada usando um ensaio de ressonância de plásmon superficial em um instrumento Biacore T100 provido com tampão de operação HBS-EP+ (GE Healthcare, 10 mM Hepes pH 7,4 + 150 mM NaCI + 3 mM EDTA + 0,05 % tensoativo P20) e temperatura de análise ajustada em 37 °C. Um chip CM5 contendo proteína A imobilizada (gerada usando o acoplamento de amina NHS-EDC padrão) em todas as quatro células de fluxo (Fc) é utilizado para empregar uma metodologia de captura. As amostras de anticorpo são preparadas em 2 pg/ml mediante a diluição em tampão de operação. As amostras de CGRP humano são preparadas em concentrações finais de 5,0, 2,5, 1,3, 0,63, 0,31 e 0 (branco) nM através da diluição em tam

17/27 pão de operação. Uma nova alíquota de uso único de CGRP é utilizada para cada experiência repetida para evitar múltiplos ciclos de congelamentodescongelamento. Cada ciclo de análise consiste de (1) captura das amostras de anticorpo nas células de fluxo separadas (Fc2, Fc3 e Fc4), (2) inje5 ção de 350 pl (210 seg) de CGRP sobre todas as Fc em 100 μΙ/min, (3) retorno ao fluxo tampão durante 10 minutos para monitorar a fase de dissociação, (4) regeneração das superfícies do chip com uma injeção de 5 μΙ (15 seg) de glicina, pH 1,5, (5) equilíbrio das superfícies do chip com uma injeção de 5 μΙ (15 seg) de HBS-EP+. Cada concentração de CGRP é injetada • 10 em duplicata. Os dados são processados utilizando referência dupla padrão e ajuste para um modelo de ligação de 1:1 utilizando o software Biacore T100 Evaluation, versão 2.0.1, para determinar a taxa de associação (unidades k_on, M’¹s’¹), taxa de dissociação (unidades (kOff, s'¹), θ Rmax (unidades RU). A constante de dissociação em equilíbrio (Kd) é calculada a partir da 15 conexão KD = k_on/kon. θ está em unidades molares. Os valores fornecidos na

Tabela 2 são as médias de n números de experiências. A Tabela 2 demonstra que os anticorpos exemplificados da presente invenção se ligam ao CGRP com afinidades < 200 pM.

Tabela 2 - Afinidades de Ligação ao Anticorpo.

Anticorpo	K_D (pM) Média + SD	n
I	190	1
II	26 + 6	3
III	31 + 19	6
IV	24 + 10	4
V	24 + 6	2

Exemplo 3 - Redução da Dor em um modelo de MIA.

A injeção de ácido monoiodoacético (MIA) na articulação do joelho de ratos produz um insulto inflamatório agudo que depois se desenvolve em degeneração crônica dos tecidos articulares na articulação injetada. A dor resultante da lesão articular pode ser medida através do comportamento 25 de peso diferencial das patas traseiras usando um verificador incapacidade.

O modelo de MIA foi bem descrito na literatura e foi usado para demonstrar a eficácia vs. dor de uma variedade de mecanismos e compostos. A eficácia

18/27 é rotineiramente medida pela capacidade de um composto de parcialmente normalizar a distribuição do peso.

Para determinar a capacidade dos anticorpos exemplificados da presente invenção para reduzir a dor, ratos Lewis machos (Harlan, Indiana5 polis, IN) de aproximadamente oito semanas de idade na época da injeção de MIA são usados. Os ratos são alojados em grupos de dois ou três por gaiola e mantidos em uma temperatura constante e em um ciclo de 12 horas de luz/12 horas no escuro. Os animais têm livre acesso à comida e água em todos os momentos, exceto durante a coleta de dados. Todas as experiên- 10 cias foram realizadas de acordo com os protocolos aprovados pelo Eli Lilly Institutional Animal Care and Use Committee.

Os joelhos direitos de cada rato foram injetados com 0,3 mg de MIA em 50 pl de salina e os joelhos esquerdos com 50 μΙ de salina no dia 0. Em um dia determinado após aplicação de MIA, controle de lgG4 humano ou 15 anticorpo de CGRP de teste é administrado por via subcutânea em PBS (n = 6 por grupo). Três dias após a dosagem com anticorpo de CGRP de teste, a dor é medida usando o teste incapacidade que mede a diferença de comportamento de peso da pata traseira entre os joelhos tratados com MIA e injetados com salina. Cada medição é a média de três medições separadas de 20 cada medida durante 1 segundo.

Os dados são apresentados como percentagem de inibição da dor calculada pela divisão da média do grupo tratado com anticorpo de CGRP pela média do grupo de anticorpo de controle, subtraindo esse valor de 1 e multiplicando esse valor resultante por 100. Os grupos tratados com 25 CGRP também foram comparados com os grupos de veículo por um meio de análise das médias e pelo teste de Dunnett, utilizando o programa de análise estatística JMP (versões 5.1 e 6) (SAS Institute Inc., Cary, NC). As diferenças devem consideradas significativas se o valor de P for menor do que 0,05. Como mostrado na Tabela 3, os dados demonstram que os anti30 corpos de CGRP exemplificados da presente invenção significativamente reduzem a dor.

Tabela 3 - Percentagem de Inibição da Dor Induzida por MIA

19/27

Anticorpo	Dose e via	% de inibição com MIA	Significativo pelo teste de Dunnett (p < 0,05)
I	20 mg/kg sc	20%	Sim
II	4 mg/kg sc	30%	Sim
III	4 mg/kg sc	37%	Sim
IV	4 mg/kg sc	37%	Sim
V	4 mg/kg sc	19%	Sim

EXEMPLO 4 - Inibição da formação de cAMP induzida por CGRP em células SK-N-MC

Para comparar a capacidade de um anticorpo da presente invenção com o Anticorpo G1 (LCVR - SEQ ID NO: 40 e HCVR - SEQ ID NO: 41), a inibição da formação de cAMP induzida por CGRP em SK-N-MC é determinada. A ligação do CGRP ao seu receptor resulta no estímulo da produção de cAMP. O receptor de CGRP é um complexo heterotrimérico consistindo do Receptor semelhante ao receptor de Calcitonina (CLR, um receptor acoplado à proteína G) e da Proteína de Modificação da Atividade do Receptor (RAMP)-1, acoplado de forma citoplásmica à Proteína do Componente do Receptor (RCP). A linhagem celular de neuroepitelioma humana SK-N-MC expressa essas três moléculas naturalmente e pode, portanto, ser utilizada para avaliar o efeito do CGRP sobre os eventos de transdução de sinal. A produção de cAMP é uma medida padrão para a ativação do receptor acoplado à proteína G.

As células SK-N-MC são cultivadas em MEM, contendo 10 % FBS, 1X MEM aminoácidos não essenciais, 1X 100 mM MEM Piruvato de Sódio, 1X Pen/Strep, e 2 mM L-glutamina. Após a colheita, as células são lavadas uma vez e colocadas novamente em suspensão em tampão de ensaio (tampão de estímulo (HBSS com Mg e Ca, 5 mM HEPES, 0,1% BSA, 100 uM ácido ascórbico) diluído 1:2 com PBS da Dulbecco contendo uma concentração final de 0,5 mM IBMX ) e plaqueadas em placas de 96 reservatórios em 15000 células por poço. O anticorpo de teste ou um anticorpo lgG4 humano de controle é adicionado (diluições seriais de 4 vezes em tampão de ensaio, 10 concentrações) nas células, seguido por uma quantidade fixa de α-CGRP humano (2 nM; Bachem H1470). As placas são incubadas

20/27 durante 1 hora na temperatura ambiente. Os níveis de cAMP são medidos por um sistema de ensaio de fluorescência determinada pelo tempo homogêneo (HTRF) (Cisbio).

A quantidade de cAMP induzida por 2 nM CGRP humano na presença de concentrações variáveis de anticorpo é calculada como uma percentagem de inibição em comparação com o CGRP isoladamente. A concentração de anticorpo que produz uma inibição de 50 % de produção de cAMP (IC₅o) é então calculada a partir de um modelo de ajuste da curva de 4 parâmetros. Após os procedimentos como aqui descritos, o anticorpo III (IC50 de 0,41 nM) inibiu a quantidade de cAMP induzido por CGRP em um grau muito maior do que o anticorpo G1 (IC50 de 5,36 nM), possivelmente devido a taxa K_on mais rápida do Anticorpo III (taxa Kon medida pela Biacore). EXEMPLO 5 - Modelo de Extravasamento de Proteína Plasmática Durai em Rato (PPE)

O modelo de PPE de rato é um modelo pré-clínico bem estabelecido que pode ser utilizado para avaliar a eficácia de anticorpos anti-CGRP para o tratamento de enxaqueca.

Uma solução de 2 mg/ml de um anticorpo anti-CGRP (Ab) é preparada em solução salina. Todas as diluições subsequentes são preparadas com salina. Uma solução de 2 mg/ml de anticorpo de controle isotipo monoclonal (IgG) também é preparada em salina.

Ratos machos Sprague-Dawley da Harlan Laboratories (250 a 350 g) foram anestesiados com Nembutal (60 mg / kg, ip.) e colocados em uma estrutura estereotáxica (David Kopf Instruments) com a barra incisiva fixada em -2,5 mm. Seguinte à uma incisão no couro cabeludo sagital da linha média, dois pares de orifícios bilaterais foram perfurados através do crânio (3,2 mm posteriormente, 1,8 e 3,8 mm lateralmente, todas as coordenadas referidas ao bregma). Pares de elétrodos de estimulação de aço inox (Rhodes Medical Systems Inc), isolados exceto nas pontas, são reduzidos através dos orifícios em ambos os hemisférios em uma profundidade de 9,2 mm abaixo da dura-máter. Os anticorpos de teste ou veículo de salina são administrados por via intravenosa através da veia femoral (1 ml/kg). Oito mi

21/27 nutos depois uma solução de tintura de isotiocianato de fluoresceína (FITC)albumina de soro bovino rotulada (BSA) (FITC-BSA, Sigma A9771) (20 mg/kg, iv.) é injetada na veia femoral para funcionar como um marcador para o extravasamento da proteína. Dez minutos após a dosagem com os anti5 corpos de teste ou veículo, o gânglio trigeminal esquerdo é estimulado durante 5 minutos em uma intensidade de corrente de 1,0 mA (5 Hz, 5 ms de duração) com um Model S48 Grass Instrument Stimulator. Cinco minutos após o estímulo, os ratos são mortos por exsanguinação com 40 ml de salina. A exsanguinação também enxágua o FITC residual/BSA para fora dos - 10 vasos sanguíneos. A parte superior do crânio é removida para coletar as membranas durais. As amostras de membrana são removidas de ambos os hemisférios, enxaguadas com água, e dispensadas horizontalmente nas lâminas de microscópio. As lâminas são secadas durante 15 minutos em um aquecedor de lâmina e cobertas-deslizadas com uma solução de glice15 rol/água a 70 %.

Um microscópio de fluorescência (Zeiss) equipado com um monocromador de grade e um espectrofotômetro são utilizados para quantificar a quantidade de tintura FITC-BSA em cada amostra durai. O microscópio é equipado com um estágio motorizado em interface com um computador pes20 soai. Isto facilita o movimento controlado pelo computador do estágio, com medições de fluorescência em 25 pontos (etapas de 500 pm) em cada amostra durai. O extravasamento induzido pelo estímulo elétrico do gânglio trigeminal é um efeito ipsilateral (isto é, ocorre apenas sobre o lado da duramáter em que o gânglio trigeminal é estimulado). Isto permite que a outra 25 metade (não estimulada) da dura-máter seja utilizada como um controle. A relação de extravasamento (isto é, a relação da quantidade de extravasamento na dura-máter a partir do lado estimulado em comparação com o lado não estimulado) é calculada.

22/27

SEQUÊNCIAS

ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGWKNNFVPTNVGSKAF (SEQ ID NO: 1) ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF (SEQ ID NO: 2)

Anticorpo	LCDR1	LCDR2	LCDR3
I	RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 3)	YTSEYHS (SEQ ID NO: 4)	QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5)
II	RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 3)	YTSEYHS (SEQ ID NO: 4)	QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5)
III	RASKDISKYLN (SEQ ID NO: 6)	YTSGYHS (SEQ ID NO: 7)	QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5)
IV	RASRPIDKYLN (SEQ ID NO: 8)	YTSEYHS (SEQ ID NO: 4)	QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5)
V	RASQDIDKYLN (SEQ ID NO: 9)	YTSGYHS (SEQ ID NO: 7)	QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5)
Consenso	RASX1X2IX3X4YLN (SEQ ID NO: 10)	YTSX5YHS (SEQ ID NO: 11)	QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5)

X) é Q, R ou K;

X₂ é D ou P;

X₃ é D ou S;

X4 é N ou K; e

X₅ é G ou E.

Anticorpo	HCDR1	HCDR2	HCDR3
I	GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12)	AIYEGTGDTRYIQKFAG (SEQ ID NO: 13)	LSDYVSGFSY (SEQ ID NO: 14)
II	GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12)	AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15)	LSDYVSGFSY (SEQ ID NO: 14)
III	GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12)	AIYEGTGKTVYIQKFAD (SEQ ID NO: 16)	LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39)
IV	GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12)	AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15)	LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39)
V	GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12)	AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15)	LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39)

23/27

Anticorpo	HCDR1	HCDR2	HCDR3
Consenso	GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12)	Alyegtgx₆tx₇yiq kfax₈(SEQ ID NO: 37)	LSDYVSGFX9Y (SEQ ID NO: 38)

X₆ é K ou D;

X₇ é V ou R;

X₈ é D ou G; e

X₉ é G ou S.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDNYLNWYQQKPGKA PKLLIYYTSEYHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALP PTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 17)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDNYLNWYQQKPGKA PKLLIYYTSEYHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALP PTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 18)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKDISKYLNWYQQKPGKA PKLLIYYTSGYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALP PTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 19)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIDKYLNWYQQKPGKA PKLLIYYTSEYHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALP PTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 20)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDKYLNWYQQKPGKA PKLLIYYTSGYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALP PTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 21)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQA

PGQGLEWMGAIYEGTGDTRYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSED TAVYYCARLSDYVSGFSYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 22)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQA

PGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSED

TAVYYCARLSDYVSGFSYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 23)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQA

PGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFADRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 24)

24/27

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQA

PGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSED TAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 25)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQA

PGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFAGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 26)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDNYLNWYQQKPGKA PKLLIYYTSEYHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALP PTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ - 10 WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 27)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDNYLNWYQQKPGKA PKLLIYYTSEYHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALP PTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ

WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT

HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 28)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKDISKYLNWYQQKPGKA

PKLLIYYTSGYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALP PTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ

WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT

HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 29)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIDKYLNWYQQKPGKA PKLLIYYTSEYHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALP PTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ

WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT

HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 30)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDKYLNWYQQKPGKA PKLLIYYTSGYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALP PTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ

WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT

HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 31)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQA

25/27

PGQGLEWMGAIYEGTGDTRYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSED

TAVYYCARLSDYVSGFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES

TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP

SSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFL

FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR

EEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT

TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL

SLG (SEQ ID NO: 32) . 10 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQA

PGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSED

TAVYYCARLSDYVSGFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES

TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFL

FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR

TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL

SLG (SEQ ID NO: 33)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQA

PGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFADRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDT

AVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSEST AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS

SSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLF

PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

EQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT

PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS

LG (SEQ ID NO: 34)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQA

PGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSED

TAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES

26/27

TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP

REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SLG (SEQ ID NO: 35)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQA PGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFAGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDT . 10 AVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSEST AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS SSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR 15 EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS LG (SEQ ID NO: 36)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQA PRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYP 20 YTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 40)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPG KGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT AVYYCLAYFDYGLAIQNYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT25 CRASX1X2IX3X4YLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSX5YHSGVPSRFSGSGSGTD FTXeTISSLQPEDXyATYYCQQGDALPPTFGXsGTKXgEIK

Xt = Q, K, ou R;

X₂ = D ou P;

X₃ D ou S;

X4 ⁼ K ou N;

X₅=EouG;

X₆ = F ou L;

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	X₇= I ou F; X₈ = Q ou G; e X₉=Lou V. (SEQ ID NO: 42) QVQLVQSGA-
5	EVKKPGXiSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTG X₂TX₃YIQKFAX4RVTX₅TX₆DX₇STSTX₈YMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVS GFX9YWGQGTX1 oVTVSS Xi = A ou S; X₂ = K ou D;
. 10	X₃ =V ou R; X₄= G ou D; X₅=Mou I; X₆ = R ou A; X₇ = T ou K;
15	X₈= Vou A; X₉ = G ou S; e Xio= L ou T. (SEQ ID NO: 43)

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) engenheirado humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia leve (LCVR) e uma região variável de cadeia pesada (HCVR) com as regiões de estrutura humanas completas 1-4, em que a referida LCVR compreende as sequências de aminoácidos de LCDR1 (região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1), LCDR2 (região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2), LCDR3 (região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3) e a referida HCVR compreende as sequências de aminoácidos HCDR1 (região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1), HCDR2 (região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2), HCDR3 (região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3), selecionada dentre o grupo que consiste em:

(a) LCDR1 é RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 é YTSEYHS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 é QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 é GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO : 12), HCDR2 é AIYEGTGDTRYIQKFAG (SEQ ID NO: 13), e HCDR3 é LSDYVSGFSY (SEQ ID NO: 14);

(b) LCDR1 é RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 é YTSEYHS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 é QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 é GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 é AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15), e HCDR3 é LSDYVSGFSY (SEQ ID NO: 14);

(c) LCDR1 é RASKDISKYLN (SEQ ID NO: 6), LCDR2 é YTSGYHS (SEQ ID NO: 7), LCDR3 é QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 é GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 é AIYEGTGKTVYIQKFAD (SEQ ID NO: 16), e HCDR3 é LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39);

(d) LCDR1 é RASRPIDKYLN (SEQ ID NO: 8), LCDR2 é YTSEYHS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 é QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 é GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 é AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15), e HCDR3 é LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39); e (e) LCDR1 é RASQDIDKYLN (SEQ ID NO: 9), LCDR2 é

Petição 870190077218, de 09/08/2019, pág. 5/13
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YTSGYHS (SEQ ID NO: 7), LCDR3 é QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 é GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 é AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15), e HCDR3 é LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39).

2. Fragmento de ligação ao antígeno do CGRP, caracterizado pelo fato de que é do anticorpo anti-CGRP engenheirado humano como definido na reivindicação 1.
3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-CGRP engenheirado humano como definido na reivindicação 1 e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
4. Anticorpo anti-CGRP engenheirado humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma LCVR e uma HCVR, em que as referidas LCVR e HCVR são sequências de aminoácidos selecionadas dentre o grupo consistindo de:

(a) LCVR de SEQ ID NO: 17 e HCVR de SEQ ID NO: 22;

(b) LCVR de SEQ ID NO: 18 e HCVR de SEQ ID NO: 23;

(c) LCVR de SEQ ID NO: 19 e HCVR de SEQ ID NO: 24;

(d) LCVR de SEQ ID NO: 20 e HCVR de SEQ ID NO: 25; e (e) LCVR de SEQ ID NO: 21 e HCVR de SEQ ID NO: 26.
5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-CGRP engenheirado humano como definido na reivindicação 4 e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
6. Anticorpo anti-CGRP engenheirado humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que as sequências de aminoácidos das cadeias leve e pesada são selecionadas dentre o grupo consistindo de:

(a) cadeia leve de SEQ ID NO: 27 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 32;

(b) cadeia leve de SEQ ID NO: 28 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 33;

(c) cadeia leve de SEQ ID NO: 29 e cadeia pesada de SEQ ID

Petição 870190077218, de 09/08/2019, pág. 6/13

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NO: 34;

(d) cadeia leve de SEQ ID NO: 30 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 35; e (e) cadeia leve de SEQ ID NO: 31 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 36.
7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-CGRP engenheirado humano como definido na reivindicação 6 e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
8. Anticorpo anti-CGRP engenheirado humano, caracterizado pelo fato de que compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que cada sequência de aminoácidos das cadeias leves e pesadas é selecionada dentre o grupo consistindo de:

(a) cadeia leve de SEQ ID NO: 27 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 32;

(b) cadeia leve de SEQ ID NO: 28 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 33;

(c) cadeia leve é SEQ ID NO: 29 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 34;

(d) cadeia leve de SEQ ID NO: 30 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 35; e (e) cadeia leve de SEQ ID NO: 31 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 36.
9. Anticorpo anti-CGRP engenheirado humano, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que cada sequência de aminoácidos de cadeia leve é SEQ ID NO: 29 e cada sequência de aminoácidos de cadeia pesada é SEQ ID NO: 34.
10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-CGRP engenheirado humano como definido na reivindicação 8 e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.