KR20180054851A

KR20180054851A - 항-cgrp/항-il-23 이중특이적 항체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20180054851A
Application number: KR1020187012053A
Authority: KR
Inventors: 로버트 잔 벤쇼프; 바렛 앨런; 론 리 주니어 밀리칸; 캐서린 브라우티감 베이들러
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2018-05-24
Also published as: IL258534A; US20180291093A1; CA3003243A1; CN108135983A; AU2015413277A1; JP2019501114A; JP6592600B2; EP3368066A1; BR112018007214A2; MX2018005135A; EA201890741A1; WO2017074428A1

Abstract

칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP) 및 인터류킨-23 (IL-23)에 결합하고 CGRP 및 IL-23 둘 다에 대해 높은 친화도 및 강한 동시 중화 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체가 제공된다. 본 발명의 이중특이적 항체는 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 및 궤양성 결장염, 건선성 관절염 (PsA) 및 강직성 척추염 (AS)을 포함한 다양한 자가면역 질환을 치료하는데 유용하다.

Description

항-CGRP/항-IL-23 이중특이적 항체 및 그의 용도

본 발명은 의약의 분야, 특히 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP) 및 인터류킨-23 (IL-23)에 대해 지시된 이중특이적 항체의 신규 분야이다. 본 발명의 이중특이적 항체는 염증성 장 질환 (IBD), 예컨대 크론병 (CD) 및 궤양성 결장염 (UC), 건선성 관절염 (PsA) 및 강직성 척추염 (AS)을 포함한 자가면역 질환을 치료하는데 유용한 것으로 예상된다.

자가면역 질환은 신체에서의 그 자신의 조직에 대한 면역 반응 생성에서 비롯된다. 자가면역 질환은 종종 만성이고, 쇠약하게 만들고 심지어 생명을 위협할 수 있다. 포괄적으로 CD 및 UC와 같은 장애의 군을 나타내는, IBD는 병리학상으로 장 염증 및 상피 손상을 특징으로 하는 흔한 만성 재발성 자가면역 질환이다. 만성 자가면역 질환의 다른 형태, 예컨대 PsA 및 AS는 체간 및/또는 말초 골격에 영향을 미칠 수 있다.

인터류킨 23 (IL-23)은 만성 염증의 유도에 요구되는 다양한 염증 세포의 활성화에서 중요한 것으로 여겨진 이종이량체 시토카인이다. IL-6, IL-17, GM-CSF 및 IL-22 분비의 상류 조절제인 것으로 여겨지는 IL-23은 p40 서브유닛에 공유적으로 쌍형성된 p19 서브유닛 (IL23p19)으로 구성된다 (p40 서브유닛은 또한 시토카인 IL-12와 공유됨). 추가적으로, IL-23은 기억 / 병원성 T-세포 염증 반응에서 중요한 역할을 하는데 뿐만 아니라 선천성 림프성 세포 염증 활성의 조절에서 역할을 하는데 관련되어 있다. 시토카인 IL-6, IL-17, GM-CSF 및 IL-22의 IL-23 조절은 IBD 및 다른 자가면역 질환을 포함한 염증성 질환과 연관된다는 증거이다.

CGRP는 중추 및 말초 신경계의 신경에 의해 분비된 37개의 아미노산 뉴로펩티드이다. CGRP는 말초 및 중추 신경계 둘 다에서, 감각 신경에 넓게 분포되고 수많은 상이한 생물학적 활성을 나타낸다. 예를 들어, 이는 미세혈관계가 그에 감수성인 강력한 혈관확장제이다. 삼차신경 및 다른 신경 섬유로부터 방출될 때, CGRP는 특이적 세포 표면 수용체에 결합함으로써 그의 생물학적 반응을 매개하는 것으로 생각된다. CGRP는 통증 신호전달의 조정 및/또는 전송에서 및 신경원성 염증에서 역할을 하는 것으로 여겨진다. CGRP는 감각 신경의 자극 시 방출되기 때문에 CGRP이 편두통에서 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다. CGRP의 방출은 이들 섬유의 자극 시 삼차 신경 섬유에 의해 신경지배된 조직에서 혈관 투과성 및 후속적 혈장 단백질 누출 (혈장 단백질 혈관외유출)을 증가시킨다. 추가로, 연구는 편두통을 앓고 있는 환자에서의 CGRP의 주입이 편두통-유사 증상을 유발한다는 것으로 보고한 바 있다.

자가면역 질환 예컨대 IBD에 대한 현재 FDA 승인된 치료제는 종종 급성 염증을 치료하는데 사용된 코르티코스테로이드, 및 신체에서 TNFα를 표적화하고 중화시키는 것을 시도하는 많은 바이오제품 (예컨대 레미케이드(REMICADE)®, 엔브렐(ENBREL)® 및 휴미라(HUMIRA)®)을 포함한다. PsA의 치료를 위해 승인된 또 다른 바이오제품은 시토카인 IL-12 및 IL-23의 공유된 p40 서브유닛을 표적화하는 것을 시도하는 스텔라라(STELARA)®를 포함한다. 현재 치료제는 환자의 하위세트에서 증상을 감소시키고 부분 자가면역 질환의 진행을 저속화하기 위한 효능이 입증된 바 있다. 그러나, 환자의 큰 백분율이 현재 이용가능한 치료제에 비반응성이다 (예를 들어, 완화의 유도는 TNFα 중화로 치료된 CD 환자의 단지 30-50%에서 발생하고, TNFα 중화에 대한 반응의 손실은 치료 12개월 후에 환자의 23 내지 46%에서 발생함). 자가면역 질환에 대한 대체 요법은 IL-23의 p19 서브유닛에 결합하는 항체, 예컨대 미국 특허 번호 9,023,358에 개시된 것들을 포함한다.

자가면역 질환에 대한 현재 승인된 치료제가 질환의 염증 측면을 치료하지만, 상기 치료제는 연관된 통증을 치료하는데 비효과적인 것으로 입증되었다. 심지어 항-TNFα 요법에 반응성인 IBD (CD 및 UC)를 앓고 있는 환자에서, 통증은 남아있다. 자가면역 질환과 연관된 염증은 통증에 대한 중추 감작을 구동시켜 통각과민 및 이질통으로 이어진다고 생각된다. 결과는 심지어 염증이 가라앉은 후에도 통증은 진통제를 계속 복용하는 환자의 높은 백분율로 존재할 수 있다는 것이다. IBD를 앓고 있는 환자에서 통증에 대한 표준 요법은 NSAID, COX-2 억제제 및 오피에이트를 포함한 진통제이다. 현재, IBD를 앓고 있는 환자는 생물학적 요법의 도입 전에 및 후에 둘 다 유사한 수의 진통제 처방을 이행하고 있다. CGRP에 결합하는 항체, 예컨대 미국 특허 번호 9,073,991에 기재된 것들은 편두통을 위한 치료제로 제안된 바 있다.

이러한 대체 요법에 대한 하나의 접근법은 자가면역 질환의 상이한 측면 (예를 들어 질환 및 연관된 통증의 병리상태)을 치료하는 2개의 상이한 바이오제품 (예를 들어, 항체)의 공동-투여를 포함할 수 있다. 공동-투여는 2개의 별개의 생성물의 주입 또는 2개의 상이한 항체의 공동-제제의 단일 주입을 요구한다. 2개의 주입이 투여량 및 시기의 유연성을 허용하는 동안, 순응도 및 통증 둘 다에 대해 환자에게는 불편하다. 더욱이, 공동-제제가 투여량의 부분 유연성을 제공할 수 있는 동안, 허용가능한 점도 (비교적 높은 농도에서)를 갖고 2개의 항체의 상이한 분자 특징으로 인해 항체 둘 다의 화학적 및 물리적 안정성을 촉진시키는 제제 조건을 찾는 것은 종종 상당히 도전적이거나 불가능하다. 추가적으로, 공동-투여 및 공동-제제는 환자 및/또는 지급인 비용을 증가시킬 수 있는 2개의 상이한 약물 요법의 추가적인 비용을 수반한다.

따라서, 질환 변형 및 통증 관리 특성 둘 다를 갖는 자가면역 질환의 치료를 위한 대체 요법의 필요가 남아있고 바람직하게는 이러한 대체 요법은 이중특이적 항체를 포함한다.

본 발명은 이뮤노글로불린 G 항체 (IgG) 및 2개의 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 IgG 및 2개의 scFv를 포함하는 이중특이적 항체이며, 여기서

(a) 상기 IgG는 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄 (LC)를 포함하며, 각각의 HC는 중쇄 CDR (HCDR) 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR1)을 포함하고 각각의 경쇄는 경쇄 CDR (LCDR) 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR1)을 포함하며, 여기서 HCDR1의 아미노산 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 10이고, HCDR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 11이고, HCDR3의 아미노산 서열은 서열식별번호: 12이고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 16이고, LCDR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 17이고, LCDR3의 아미노산 서열은 서열식별번호: 18이고;

(b) 각각의 scFv는 중쇄 가변 영역 (HCVR2) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR2)을 포함하며, HCVR2는 HCDR 4-6을 포함하고 LCVR2는 LCDR 4-6을 포함하고, 여기서 HCDR4의 아미노산 서열은 서열식별번호: 13이고, HCDR5의 아미노산 서열은 서열식별번호: 14이고, HCDR6의 아미노산 서열은 서열식별번호: 15이고, LCDR4의 아미노산 서열은 서열식별번호: 19이고, LCDR5의 아미노산 서열은 서열식별번호: 20이고, LCDR6의 아미노산 서열이 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 22이며,

여기서 각각의 scFv는 각각의 scFv의 HCVR2의 N-말단에서 상기 IgG 항체에 각각의 IgG HC의 C-말단에서 폴리펩티드 링커 (L1)를 통해 연결되고,

여기서 각각의 scFv의 HCVR2는 HCVR2의 C-말단에서 동일한 scFv의 LCVR2에 동일한 scFv의 LCVR2의 N-말단에서 제2 폴리펩티드 링커 (L2)를 통해 연결되는 것인

이중특이적 항체를 제공한다.

본 발명의 이중특이적 항체는 CGRP 및 IL-23의 p19 서브유닛에 결합한다.

바람직하게는, LCDR6의 아미노산 서열은 서열식별번호: 21이다.

추가로 바람직하게는, LCDR6의 아미노산 서열은 서열식별번호: 22이다.

본 발명의 이중특이적 항체의 추가의 실시양태에서, 각각의 HC의 HCVR1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 5이고, 각각의 LC의 LCVR1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7이고, 각각의 scFv의 HCVR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6이고, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9이다.

바람직하게는, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8이다.

추가로 바람직하게는, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 9이다.

본 발명의 이중특이적 항체의 또 다른 추가의 실시양태에서, 각각의 HC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4이고, 각각의 LC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3이고, 각각의 scFv의 HCVR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6이고, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9이다.

본 발명의 상기 실시양태의 바람직한 측면에서, L1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 23이고, L2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 24이다.

본 발명의 이중특이적 항체의 바람직한 실시양태에서, 각각의 HC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4이고, 각각의 LC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3이고, 각각의 scFv의 HCVR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6이고, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8이고, L1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 23이고, L2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 24이다.

본 발명의 이중특이적 항체의 추가의 바람직한 실시양태에서, 각각의 HC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4이고, 각각의 LC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3이고, 각각의 scFv의 HCVR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6이고, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 9이고, L1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 23이고, L2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 24이다.

본 발명의 이중특이적 항체를 구축할 때 화학적 및 물리적 안정성과 연관된 유의한 문제가 다루어졌다. 이중특이적 항체와 연관될 수 있는 무수한 문제, 예컨대 모두가 표적화된 항원; CGRP 및 IL-23의 p19 서브유닛 둘 다에 대한 결합 친화도를 유지하면서, 물리적으로 안정한 분자의 발현, 단일 쇄 단편 가변 영역 (scFv)의 VH/VL 계면의 안정화, 열 및 염-의존적 안정성의 증가, 응집의 감소, 높은 농도에서 용해도의 증가, 및/또는 이중특이적 항체의 결합 표면에서의 정전기적 분포의 재균형화를 충분히 극복하기 위해 많은 변화가 출발 이중특이적 항체에서 요구되었다.

본 발명의 이중특이적 항체는 열적으로 안정하고 물리적으로 안정하다. 더욱이, 본 발명의 이중특이적 항체는 또한 낮은 응집을 나타낼 수 있다. 게다가, 본 발명의 이중특이적 항체는 또한 인간 CGRP 및 인간 IL23p19 (IL-23의 p19 서브유닛)를 중화시킬 수 있을 뿐만 아니라 리간드 둘 다에 동시에 결합할 수 있다. 본 발명에 청구된 항체는 또한 2개의 상이한, 별개의 항체의 상이한 분자 특징을 충족시켜야 하는 제제 조건을 찾는 도전과제를 피할 수 있다.

본 발명의 제1 이중특이적 항체의 IgG 부분은 2개의 동일한 중쇄 (IgG HC) (서열식별번호: 4)를 포함한다.

각각의 IgG HC는 그의 C-말단에서 제1 폴리펩티드 링커 (L1)(서열식별번호: 23)을 통해 IL-23의 p19 서브유닛에 특이적으로 결합하는 동일한 scFv 부분에 부착된다.

각각의 중쇄 scFv 부분 (HCVR2)(서열식별번호: 6)은 그의 C-말단에서 제2 폴리펩티드 링커 (L2)(서열식별번호: 24)를 통해 scFv 경쇄 (LCVR2)(서열식별번호: 8)에 부착된다.

IgG₄ HC의 N-말단 잔기에서 시작하고 scFv LC의 C-말단 잔기에서 종료하는, 본 발명의 제1 이중특이적 항체의 각각의 동일한 중쇄 부분의 완전 선형 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제공된다.

유사하게, 가변 도메인의 N-말단 잔기에서 시작하고 LC 카파 불변 영역의 C-말단 잔기에서 종료하는, 본 발명의 제1 이중특이적 항체의 각각의 동일한 LC의 완전 아미노산 서열은 서열식별번호: 3에 제공된다.

본 발명의 예시된 제1 이중특이적 항체의 다양한 영역 및 링커의 관계는 하기와 같다 (아미노산의 넘버링은 선형 넘버링을 적용하고; 가변 도메인에 대한 아미노산의 할당은 www.imgt.org에서 이용가능한 국제 면역유전학 정보 시스템(International Immunogenetics Information System)^®을 기반으로 하고; CDR 도메인에 대한 아미노산의 할당은 표 1(a)-(c)에 반영된 바와 같이 널리 알려된 카바트(Kabat) (문헌 [Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication number 91-3242 (1991)]) 및 노쓰(North) (문헌 [North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011)]) 넘버링 규정을 기반으로 함):

표 1(a): 이중특이적 항체 1의 아미노산 영역 - IgG HC-L1-scFv HCVR2-L2-scFv LCVR2

표 1(b): 이중특이적 항체 1의 아미노산 영역 - IgG LC

본 발명의 제2 예시된 이중특이적 항체에 따르면, LCDR6은 서열식별번호: 1의 위치 684에서 트레오닌 (T)으로 글루타민 (Q)을 치환하는 조작된 단일 아미노산 변화 (Q684T)를 혼입하여, 본 발명의 제2 예시된 이중특이적 항체의 LCDR6이 하기 서열 QTYWSTPFT (서열식별번호: 22)를 갖도록 한다. 어떠한 추가의 변화도 이루어지지 않았고, 결과적으로, 본 발명의 제2 예시된 이중특이적 항체의 모든 남아있는 아미노산 서열은 상기 기재된 제1 예시된 이중특이적 항체의 것들과 동일하다.

IgG₄ HC의 N-말단 잔기에서 시작하고 scFv LC의 C-말단 잔기에서 종료하는, 서열식별번호: 22를 갖는 LCDR6을 포함하는, 본 발명의 제2 이중특이적 항체의 각각의 동일한 중쇄 부분의 완전 선형 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 제공된다.

유사하게, LC 가변 도메인의 N-말단 잔기에서 시작하고 LC 불변 영역의 C-말단 잔기에서 종료하는, 본 발명의 제2 이중특이적 항체의 각각의 동일한 LC의 완전 아미노산 서열은 서열식별번호: 3에 제공된다.

본 발명은 각각의 HC가 각각의 LC와 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 이중특이적 항체이며; 여기서 각각의 HC는 다른 HC와 쇄간 디술피드 결합을 형성하고; 여기서 각각의 scFv는 HCVR2 및 LCVR2 사이의 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 것인 이중특이적 항체를 추가로 제공한다. 표 1(a) 및 (b)에 제시된 본 발명의 예시된 이중특이적 항체에 따르면, 각각의 HC 및 각각의 LC의 쇄간 디술피드 결합은 HC의 (서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2의) 시스테인 잔기 133, 및 LC의 (서열식별번호: 3의) 시스테인 잔기 214 사이에 형성되고; 적어도 2개의 쇄간 디술피드 결합은 2개의 HC 사이에 형성되고, 제1 쇄간 디술피드 결합은 HC의 (서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의) 시스테인 잔기 225 및 다른 HC의 (서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의) 시스테인 잔기 225 사이에 형성되고, 제2 쇄간 디술피드 결합은 HC의 (서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의) 시스테인 잔기 228 및 다른 HC의 (서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의) 시스테인 잔기 228 사이에 형성되고; scFv의 쇄간 디술피드 결합은 HCVR2의 (서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의) 시스테인 잔기 503 및 LCVR2의 (서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의) 시스테인 잔기 694 사이에 형성된다.

본 발명의 일부 실시양태에 따르면, HC의 글리코실화를 포함하는 이중특이적 항체가 제공된다. 표 1(a) 및 (b)에 제시된 본 발명의 예시된 이중특이적 항체에 따르면, HC의 글리코실화는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아스파라긴 잔기 296에서 발생한다.

본원에 제공된 아미노산 서열을 고려하면, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이 지식을 사용하여 상기 기재된 임의의 이중특이적 항체, 또는 그의 단편을 코딩하고 발현하는 DNA 분자를 디자인할 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명에 따른 이중특이적 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 모든 DNA 서열을 포괄한다.

특히, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체의 HC, scFv, 제1 폴리펩티드 링커 L1 및 제2 폴리펩티드 링커 L2를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다.

본 발명의 한 실시양태에 따르면, 코딩된 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1이다.

본 발명의 대안적 실시양태에 따르면, 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2이다.

본 발명은 또한 서열식별번호: 1의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 3의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 서열식별번호: 2의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 3의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체의 HC, scFv, 제1 폴리펩티드 링커 L1 및 제2 폴리펩티드 링커 L2를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 DNA 분자, 및 본 발명의 이중특이적 항체의 LC를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 LC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3인 DNA 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포이며, 여기서 세포는 본 발명의 이중특이적 항체를 발현할 수 있고, 상기 이중특이적 항체는 IL23p19에 결합하는 2개의 scFv에 접합된 CGRP에 결합하는 IgG를 포함하는 것인 재조합 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체의 HC, scFv, 제1 폴리펩티드 링커 L1 및 제2 폴리펩티드 링커 L2를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 DNA 분자, 및 본 발명의 이중특이적 항체의 LC를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 LC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3이고, 상기 이중특이적 항체는 IL23p19에 결합하는 2개의 scFv에 접합된 CGRP에 결합하는 IgG를 포함하는 것인 DNA 분자로 형질전환된 재조합 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체를 생성하는 방법이며, 상기 방법은 본 발명의 재조합 숙주 세포를 이중특이적 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 배양하는 것, 및 발현된 이중특이적 항체를 회수하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 방법에 의해 생성된 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 제공한다.

바람직하게는, 재조합 숙주 세포는 CHO, NS0, HEK293 및 COS 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물 숙주 세포이다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체의 유효량을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체의 유효량을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, IBD, 예컨대 CD 및/또는 UC를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체의 유효량을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것 포함하는, PsA 및/또는 강직성 척추염을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 IBD, 예컨대 CD 및/또는 UC를 포함한 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 PsA 및/또는 강직성 척추염을 포함한 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 궤양성 결장염 및/또는 크론병의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 이중특이적 항체의 용도를 포함한다.

본 발명의 추가적인 실시양태는 건선성 관절염 및/또는 강직성 척추염의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 이중특이적 항체의 용도를 포함한다.

정의

본원에 사용될 때 용어 "이중특이적 항체"는 2개의 단일 쇄 가변 단편 (scFv)에 접합된 이뮤노글로불린 G 항체 (IgG)를 포함하는 분자를 지칭한다. 본원에 지칭된 바와 같이, 본 발명의 이중특이적 항체는 IgG 및 2개의 scFv를 포함하며, 여기서 각각의 scFv는 각각의 scFv의 HCVR2의 N-말단에서 상기 IgG 항체에 각각의 IgG HC의 C-말단에서 폴리펩티드 링커 (L1)을 통해 연결되고, 여기서 각각의 scFv의 HCVR2는 HCVR2의 C-말단에서 동일한 scFv의 LCVR2에 동일한 scFv의 LCVR2의 N-말단에서 제2 폴리펩티드 링커 (L2)를 통해 연결된다. 본 발명의 이중특이적 항체의 IgG 및 scFv는 상이한 항원 (각각, CGRP 및 IL-23의 p19 서브유닛)에 특이적으로 결합한다. 명백하게, 본 발명의 이중특이적 항체는 IL-23의 p19 서브유닛에 결합하지만 IL-12와 공유된 IL-23의 p40 서브유닛에는 결합하지 않는다.

본원에 지칭된 바와 같이, 용어 "단일 쇄 가변 단편" (scFv)은, 폴리펩티드 링커 (L2)를 통해 연결된 중쇄 가변 영역 (HCVR2) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR2)를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 지칭한다. 추가적으로, 본원에 지칭된 바와 같이 (및 하기 개략도에 나타낸 바와 같이), 각각의 scFv의 HCVR2는: a) 그의 N-말단에서, IgG의 하나의 HC의 C-말단에 폴리펩티드 링커 (L1)를 통해 연결되고; b) L1은, 그의 C-말단에서, 동일한 scFv의 LCVR2의 N-말단에 제2 폴리펩티드 링커 (L2)를 통해 연결된다. 추가로, 본 발명의 각각의 scFv는 (하기 개략도에 나타낸 바와 같이) 동일한 폴리펩티드 쇄의 HCVR2의 시스테인 잔기 및 LCVR2의 시스테인 잔기 사이에 형성된 디술피드 결합을 포함한다:

본원에 상호교환가능하게 사용된 바와 같이, "모체 항체" 또는 "모 항체"는, 예를 들어 아미노산 치환 및 구조적 변경을 통해, 이중특이적 항체의 IgG 및 scFv 중 하나의 제조에서 사용되는 아미노산 서열에 의해 코딩된 항체이다. 모체 항체는 뮤린, 키메라, 인간화 또는 인간 항체일 수 있다.

용어 "카바트 넘버링" 또는 "카바트 라벨링"은 본원에 상호교환가능하게 사용된다. 관련 기술분야에서 인지된, 이들 용어는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기보다 더 가변적인 (즉, 초가변적인) 아미노산 잔기의 넘버링 시스템을 지칭한다 (문헌 [Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication number 91-3242 (1991)]).

용어 "노쓰 넘버링" 또는 "노쓰 라벨링"은 본원에 상호교환가능하게 사용된다. 관련 기술분야에서 인지된, 이들 용어는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기보다 더 가변적인 (즉, 초가변적인) 아미노산 잔기의 넘버링 시스템을 지칭하며, 적어도 부분적으로, 문헌 [North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011)]에 기재된 바와 같은, 수많은 결정 구조로 클러스터링하는 친화도 전파를 기반으로 한다.

본원에 상호교환가능하게 사용된, 용어 "환자", "대상체" 및 "개체"는 동물을 지칭하고, 바람직하게는 상기 용어는 인간을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 대상체, 바람직하게는 인간은, IL-23 및 CGRP 둘 다의 감소된 수준 또는 감소된 생물활성으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애 또는 상태 (예를 들어, 자가면역 장애)를 추가로 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서 대상체, 바람직하게는 인간은, IL-23 및 CGRP 둘 다의 감소된 수준 또는 감소된 생물활성으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 장애 또는 상태를 발생할 위험이 있는 것을 추가로 특징으로 한다.

이중특이적 항체 조작

본 발명의 이중특이적 항체를 구축할 때 화학적 및 물리적 안정성과 연관된 유의한 문제에 직면하게 되었다. 직면하게 된 문제는 불량한 발현 내지 발현 없음, 불량한 정제 회수, 낮은 열안정성, 높은 염-의존성 응집, 디아바디 형성 (및 정제를 통해 디아바디를 감소시키는 도전과제), 높은 용액 점도, 낮은 결합 친화도 및 교차-반응성이 포함된다.

예를 들어, IgG-scFv 포맷화된 이중특이적 항체를 구축하려는 초기 시도는 모 IL-23 항체 (미국 특허 번호 9,023,358에 기재된 IL-23 항체)가 IgG 항체 부분을 포함하고 모 CGRP 항체 (예를 들어 미국 특허 번호 9,073,991 참조)가 이중특이적 항체의 scFv 부분을 포함하는 구축물을 포함하였다. 다른 초기에 시도된 구축물은 CGRP 항체가 이중특이적 항체의 IgG 부분을 포함하였던 반면 scFv 부분을 포함하는 모 IL-23 항체를 포함하였다. 추가적으로, 초기 구축물은 각각 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대한 아미노-말단 또는 카르복실 말단에서 포함한, 다양한 배위로 IgG 부분에 접합되어 있는 scFv 부분을 포함하였다. 더욱이, 초기 구축물은 HCVR2 및 LCVR2의 배열에서 변하는 scFv 부분을 포함하였다 (예를 들어, IgG 부분 (C 또는 N 말단) - 링커 1 - LCVR2 또는 HCVR2 - 링커 2 - LCVR2 또는 HCVR2 중 나머지). 추가로, 모 IL-23 항체 구축물은 중쇄 배선 프레임워크 VH 5-51 및 1-69, 및 경쇄 배선 프레임워크 VK 02, VK 12 및 VK B3의 조합을 포함하였다. 모 CGRP 항체 구축물은 (IgG 부분을 포함할 때) 불변 영역 (CH) 내에 (천연 IgG₄로부터의) 3개의 아미노산 돌연변이를 갖는 IgG₄ 하위부류 구조를 포함하였다. 초기 구축물은 인간 IgG4-Fc 포유동물 발현 벡터로 클로닝되었다. 그러나, 초기에 생성된 이중특이적 구축물 (상기 기재된 바와 같음)은 상기 기재된 하나 이상의 화학적 및/또는 물리적 문제(들)를 나타내었다. 예를 들어, scFv 부분이 N-말단에서 위치된 구축물은 scFv 부분이 C-말단에서 위치된 구축물과 비교 시 다중 안정성 문제를 나타낸다.

이중특이적 항체의 정전기적 표면이 계산되었고, 하전된 패치가 확인되고 파괴되었다. 광범위한 단백질 안정성 연구가 수행되었고, 구축된 이중특이적 항체는 열안정성 특성 뿐만 아니라 CGRP 및 IL-23 결합 (각각 모 항체와 관련하여) 특성에 대해 스크리닝되었다.

따라서 화학적 및 물리적 변형은 이루어져 본 발명의 이중특이적 항체의 화학적 및 물리적 안정성을 개선시켰다. 모 IL-23 항체에 대한 변형은, scFv 포맷에서, HCDR4, HCDR5, LCDR4, LCDR5 및 LCDR6에서 이루어져 화학적 및 물리적 안정성을 개선시켰다. 구축된 HCVR 및 LCVR은 하기 식에 따라 IL-23 scFv 포맷으로 조합되었다: CGRP IgG (C-말단) - L1 - HCVR2 - L2 - LCVR2. IL-23 scFv를 안정화시키기 위해, 디술피드 결합은 IL-23 scFv의 HCVR2 (G503C) 및 LCVR2 (G694C) 사이에 조작되었다 (아미노산의 넘버링은 표 1(a) 및 (b)에 제시된 예시된 이중특이적 항체를 기반으로 한 선형 넘버링을 적용함). 추가적으로, 모 CGRP 항체는, 이중특이적 항체의 IgG 부분에서, Fc 수용체-매개된 염증성 메카니즘에 관여하거나 또는 감소된 이펙터 기능을 유발하는 보체를 활성화시키는 감소된 능력 때문에 IgG₄ 하위부류로 조작되었다. 이들 화학적 및 물리적 변형을 포함하는, 조작된 IL-23 scFv 구축물 및 CGRP IgG 구축물은 발현 벡터에 삽입되었다.

보다 구체적으로, 본 발명의 이중특이적 항체는 IgG₄-PAA Fc 부분을 함유한다. IgG₄-PAA Fc 부분은 위치 227에서의 세린의 프롤린으로의 돌연변이 (S227P; 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2), 위치 233에서의 페닐알라닌의 알라닌으로의 돌연변이 (F233A; 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2) 및 위치 234에서의 류신의 알라닌으로의 돌연변이 (L234A; 서열식별번호: 1)를 갖는다. S227P 돌연변이는 절반-항체 형성 (IgG₄ 항체에서의 절반-분자의 동적 교환의 현상)을 방지하는 힌지 돌연변이이다. F233A 및 L234A 돌연변이는 이미 낮은 인간 IgG₄ 이소형의 이펙터 기능을 추가로 감소시킨다.

IgG₄ 하위부류로서의 CGRP IgG, 및 6개의 CDR 돌연변이를 갖는 IL-23 scFv (미국 특허 번호 9,023,358에 기재된 모 IL-23 항체 대비: K28P 및 T58V에서 HCVR2 (서열식별번호: 6); 및 L30G, L54K, E55L 및 M90Q/M90T에서 LCVR2 (서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9)(표 1(a) 및 (b)에 반영된 예시된 이중특이적 항체에 제시된 바와 같음: K487P 및 T517V에서 HCVR2; 및 L624G, L648K, E649L 및 M684Q/M684T에서 LCVR2, 아미노산의 넘버링은 표 1(a) 및 (b)에 제시된 예시된 이중특이적 항체를 기반으로 한 선형 넘버링을 적용함)를 함유하는 이중특이적 항체는 초기 구축물에서 입증된 발현, 친화도 (모 분자 대비 IL-23에 대해) 및 열안정성 문제를 개선시키려는 것으로 확인되었다. M90T 돌연변이 (서열식별번호: 9; (미국 특허 번호 9,023,358에 기재된 모 IL-23 항체 대비)는 CGRP 및 IL-23p19에 대한 결합에 불리하게 영향을 미치지 않으면서 분자의 광안정성을 개선시키는 것으로 밝혀진 바 있다. 추가적으로, 이들 돌연변이는 시노몰구스 원숭이에서 유의하게 감소된 클리어런스율을 유발하였다. 상기 변형 중 어떠한 것도 모 단일 항체의 초기 특징화에서 확인되지 않았다.

이중특이적 항체 결합 및 활성

본 발명의 이중특이적 항체는 인간 CGRP 및 인간 IL23p19 둘 다에 결합하고 시험관내 또는 생체내 적어도 하나의 인간 CGRP 생물활성 및 적어도 하나의 인간 IL-23 생물활성을 중화시킨다. 본 발명의 이중특이적 항체는 시험관내 CGRP의 존재 또는 부재 하에서의 IL-23의 억제제이다. 본 발명의 이중특이적 항체는 시험관내 IL-23의 존재 또는 부재 하에서의 CGRP의 억제제이다.

본 발명의 제1 예시된 이중특이적 항체 (이중특이적 항체 1)는 37℃에서 26.0 ± 26.0 pM 범위의 인간 CGRP에 대한 및 213.0 ± 184.0 pM 범위의 인간 IL23p19에 대한 결합 친화도 (K_D)를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제2 예시된 이중특이적 항체 (이중특이적 항체 2)는 37℃에서 대략 77.0 pM의 인간 CGRP에 대한 및 215 pM의 인간 IL23p19에 대한 결합 친화도 (K_D)를 갖는 것을 특징으로 한다.

이중특이적 항체는 CGRP를 효과적으로 중화시키고 이 중화는 포화량의 인간 IL-23의 존재에 의해 영향을 받지 않는다. 이중특이적 항체는 인간 IL-23을 효과적으로 중화시키고 이 중화는 포화량의 인간 CGRP의 존재에 의해 영향을 받지 않는다.

이중특이적 항체 발현

작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 발현 벡터는 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 폴리펩티드(들)의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드일 수 있다. 제1 폴리펩티드 쇄 (HC, scFv, L1 및 L2를 포함함) 및 제2 폴리펩티드 쇄 (LC를 포함함)는 하나의 벡터에서 작동가능하게 연결되어 있는 상이한 프로모터와 독립적으로 발현될 수 있거나, 또는 대안적으로, 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄는 2개의 벡터 - 제1 폴리펩티드 쇄를 발현하는 1개의 벡터 및 제2 폴리펩티드 쇄를 발현하는 1개의 벡터에서 작동가능하게 연결되어 있는 상이한 프로모터와 독립적으로 발현될 수 있다.

숙주 세포는 본 발명의 제1 폴리펩티드 쇄, 제2 폴리펩티드 쇄 또는 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄 둘 다를 발현하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염, 형질전환, 형질도입 또는 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 이중특이적 항체를 생성하는 숙주 세포주의 생성 및 단리는 관련 기술분야에 알려진 표준 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 포유동물 세포는 이중특이적 항체의 발현을 위해 바람직한 숙주 세포이다. 특정한 포유동물 세포는 HEK 293, NS0, DG-44, 및 CHO이다. 바람직하게는, 이중특이적 항체는 숙주 세포가 배양된 배지로 분비되며, 이로부터 이중특이적 항체가 회수되거나 정제될 수 있다.

항체의 포유동물 발현이 글리코실화를 유발한다는 것은 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 전형적으로, 글리코실화는 항체의 Fc 영역 내에서 고도로 보존된 N-글리코실화 부위에서 발생한다. N-글리칸은 전형적으로 아스파라긴에 부착한다. 예로서, 표 1(a) 및 (b)에 제시된 예시된 이중특이적 항체의 각각의 HC는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아스파라긴 잔기 296에서 글리코실화된다.

이중특이적 항체가 분비되어 있는 배지는 통상적인 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 배지는 통상적인 방법을 사용하여 단백질 A 또는 G에 적용되고 그로부터 용리될 수 있다. 가용성 응집체 및 다량체는 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함한 통상의 기술에 의해 효과적으로 제거될 수 있다. 생성물은, 예를 들어, -70℃에서 즉시 냉동될 수 있거나, 냉장될 수 있거나, 또는 동결건조될 수 있다.

일부 경우에서, 본 발명의 이중특이적 항체를 생성하는 방법은 디아바디의 형성을 유발할 수 있다. 디아바디는 scFv의 2가 형성물이며, 여기서 HCVR2 및 LCVR2 영역은 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 가변 도메인은 동일한 폴리펩티드 쇄의 상보성 도메인과 쌍형성하는 대신에, 가변 도메인은 다른 폴리펩티드 쇄 또는 상이한 분자의 상보성 도메인과 쌍형성한다. 예를 들어, 이중특이적 항체가 2개의 제1 폴리펩티드 (편의를 위해, 1A 및 1B, 여기서 각각의 1A 및 1B는 HC, scFv, L1 및 L2를 포함함), 및 2개의 제2 폴리펩티드 (편의를 위해, 2A 및 2B, 여기서 각각의 2A 및 2B는 LC를 포함함)를 포함하는 경우에, 1A의 HCVR2는 1A의 LCVR2와 쌍형성하는 대신에 1B의 LCVR2의 상보성 도메인과 쌍형성한다.

치료 용도

본원에 사용된 바와 같이, "치료" 및/또는 "치료하는"은 본원에 기재된 장애의 진행을 저속화, 방해, 정지, 제어, 또는 중단시킬 수 있지만, 반드시 모든 장애 증상을 완전하게 제거하는 것을 나타내는 것은 아닌, 모든 과정을 지칭하는 것으로 의도된다. 치료는 CGRP 및/또는 IL-23의 감소된 수준 또는 CGRP 및/또는 IL-23의 감소된 생물활성으로부터 이익을 얻을 수 있는, 포유동물, 특히 인간에서의 질환 또는 상태의 치료를 위한 본 발명의 이중특이적 항체의 투여를 포함하고, (a) 질환의 추가의 진행을 억제하며, 즉, 그의 발생을 정지시키고; (b) 질환을 경감시키며, 질환 또는 장애의 퇴행을 유발하거나 또는 증상 또는 그의 합병증을 완화하는 것을 포함한다.

본 발명의 이중특이적 항체는 IBD (예컨대 CD 및 UC), PsA 및 강직성 척추염을 포함한 자가면역 질환을 치료하는 것으로 예상된다.

제약 조성물

본 발명의 이중특이적 항체는 환자에게의 투여에 적합한 제약 조성물 내로 혼입될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체 및/또는 희석제와 함께 단일 또는 다중 용량으로 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 제약 조성물은 선택된 투여 방식에 적절하도록 디자인되고, 제약상 허용되는 희석제, 담체, 및/또는 부형제 예컨대 분산제, 완충제, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등이 적절한 경우에 사용된다. 상기 조성물은 일반적으로 의사에게 알려져 있는 바와 같은 제제화 기술에 관한 일람을 제공하는, 예를 들어 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd Edition, Loyd V, Ed., Pharmaceutical Press, 2012]에 개시된 통상적인 기술에 따라 디자인될 수 있다. 제약 조성물에 적합한 담체는, 본 발명의 이중특이적 항체와 조합될 때, 분자의 활성을 보유하고 환자의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 본 발명의 제약 조성물은 이중특이적 항체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.

본 발명의 이중특이적 항체를 포함하는 제약 조성물은 표준 투여 기술을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애를 나타내거나 또는 나타낼 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 "유효량"의 본 발명의 이중특이적 항체를 함유한다. 유효량은 목적하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 (투여량에서 및 투여 시간 동안 및 수단에 대한) 양을 지칭한다. 이중특이적 항체의 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유출하는 항체 또는 항체 부분의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 또한, 이중특이적 항체의 임의의 독성 또는 해로운 효과가 치료상 유익한 효과에 의해 능가되는 양이다.

실시예

달리 나타낸 경우를 제외하고는, 실시예 전반에 걸쳐 지칭된 예시된 이중특이적 항체는 상기 표 1(a) 및 (b)에 제시된 본 발명의 예시된 이중특이적 항체를 지칭한다.

이중특이적 항체 발현 및 정제

상기 표 1(a) 및 (b)에 제시된 본 발명의 예시된 이중특이적 항체 (이중특이적 항체 1)를 본질적으로 하기와 같이 발현하고 정제하였다. IgG HC-링커 L1-scFv HCVR2-링커 L2-scFv LCVR2를 포함하는 폴리펩티드 (서열식별번호: 1의 폴리펩티드)를 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드 서열 및 IgG LC를 포함하는 폴리펩티드 (서열식별번호: 3의 폴리펩티드)를 코딩하는 제2 DNA 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 글루타민 신테타제 (GS) 발현 벡터를 전기천공에 의해 GS-녹아웃 차이니즈 햄스터 세포주 (CHO)로 형질감염시켰다. 발현 벡터는 SV 초기 프로모터 (원숭이 바이러스 40E) 및 GS에 대한 유전자를 코딩하였다. GS의 발현은 CHO 세포에 의해 요구된 아미노산인 글루타민의 생화학적 합성을 허용하였다. 형질감염후 세포는 50μM L-메티오닌 술폭시민 (MSX)으로의 벌크 선별에 적용하였다. MSX에 의한 GS의 억제를 활용하여 선별의 엄격도를 증가시켰다. 발현 벡터 cDNA가 숙주 세포 게놈의 전사 활성 영역 내로 통합되어 있는 세포는 내인성 수준의 GS를 발현하는 CHO 야생형 세포에 대하여 선별될 수 있다. 형질감염된 풀을 저밀도로 플레이팅하여 안정한 발현 세포의 클론-대-클론 생장을 허용하였다. 이들 마스터웰을 이중특이적 항체 발현에 대해 스크리닝한 후 생성을 위해 사용된 무혈청 현탁 배양물로 규모 확장하였다. 예시된 이중특이적 항체가 분비되어 있는 정화된 배지를 상용성 완충제 예컨대 20mM TRIS (pH 8.0)로 평형화되어 있는 단백질 A 친화도 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 세척하여 비특이적 결합 성분을 제거하였다. 결합된 이중특이적 항체를, 예를 들어, pH 단계 또는 구배 예컨대 20mM 시트레이트 (pH 3.0)에 의해 용리하고 Tris (pH 8) 완충제로 중화시켰다. 이중특이적 항체 분획을, 예컨대 SDS-PAGE 또는 분석용 크기 배제에 의해 검출한 후 풀링하였다. 가용성 응집체 및 다량체는 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함한 통상의 기술에 의해 효과적으로 제거될 수 있다. 양이온-교환 크로마토그래피를 이중특이적 항체 1에 대해 사용하였다. 이중특이적 항체 1을 통상의 기술을 사용하여 농축 및/또는 멸균 여과하였다. 이들 크로마토그래피 단계 후에 이중특이적 항체 1의 순도는 97% 초과였다 (단량체). 이중특이적 항체는 -70℃에서 즉시 냉동되거나 또는 4℃에서 수개월 동안 저장될 수 있다.

이중특이적 항체 1에 비해, 위치 684에서 트레오닌 (T)으로 글루타민 (Q)을 치환하는 조작된 단일 아미노산 변화 (Q684T)를 혼입하는, 본 발명의 제2 예시된 이중특이적 항체 (이하에서 이중특이적 항체 2로서 지칭됨) (서열식별번호: 1 vs. 서열식별번호: 2)를, 일시적으로 형질감염된 CHO에서 및 단백질 A 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 발현하였다. IgG HC-링커 L1-scFv HCVR2-링커 L2-scFv LCVR2를 포함하는 폴리펩티드 (서열식별번호: 2의 폴리펩티드)를 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드 서열 및 IgG LC를 포함하는 폴리펩티드 (서열식별번호: 3의 폴리펩티드)를 코딩하는 제2 DNA 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 글루타민 신테타제 (GS) 발현 벡터를 폴리에틸렌이민으로의 화학적 처리에 의해 GS-녹아웃 차이니즈 햄스터 세포주 (CHO)로 일시적으로 형질감염시켰다. 남아있는 발현 및 정제 단계는 이중특이적 항체 1에 대한 것과 동일하였다. 이들 크로마토그래피 단계 후에 이중특이적 항체 2의 순도는 98% 초과였다 (단량체).

IL-23 및 CGRP에 대한 이중특이적 항체 결합 친화도

인간 CGRP 및 인간 IL-23의 결합 친화도를 37℃로 제어된 온도에서 HBS-EP+ (10 mM Hepes pH7.4 + 150 mM NaCl + 3 mM EDTA + 0.05% (w/v) 계면활성제 P20) 전개 완충제로 프라이밍된 비아코어(Biacore) 3000 기기 상에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검정에 의해 결정하였다. 모든 4개의 유동 세포 (Fc) 상에 고정화된 단백질 A (표준 NHS-EDC 아민 커플링을 사용하여 생성됨)를 함유하는 CM5 칩 (비아코어 P/N BR-1000-12)을 사용하여 포획 방법론을 이용하였다. 이중특이적 항체 샘플을 전개 완충제로의 희석에 의해 대략 2μg/mL로 제조하였다. 인간 IL-23을 전개 완충제로의 희석에 의해 25, 12.5, 6.25, 3.13, 0.78, 0.39, 0.20, 0.10 및 0 (블랭크) nM의 최종 농도로 제조하였다. 인간 CGRP를 전개 완충제로의 희석에 의해 12.5, 6.25, 3.13, 0.78, 0.39, 0.20, 0.10 및 0 (블랭크) nM의 최종 농도에 제조하였다.

각각의 분석 사이클은 (1) 인간 IL-23 또는 CGRP 중 어느 하나로부터의 20-100RU 최대 반응 신호를 용이하게 하는 수준으로 별개의 유동 세포 (Fc2, Fc3, 및 Fc4) 상에 상이한 이중특이적 항체 샘플을 포획하는 것; (2) 120초 동안 100 μL/분으로 모든 4개의 Fc에 대하여 각각의 인간 IL-23 또는 인간 CGRP 농도의 주입 후 해리 상을 모니터링하기 위해 600초 동안 완충제 유동으로 복귀하는 것; (3) 모든 세포에 대하여 10 μL/분으로 30초 동안, 10 mM 글리신, pH 1.5를 주입하여 칩 표면을 재생하는 것; 및 (5) HBS-EP+ 전개 완충제 중에서 칩 표면을 평형화하는 것으로 이루어진다. 데이터를 표준 이중-참조를 사용하여 처리하고, 비아이밸루에이션(BiaEvaluation) 소프트웨어, 버전 4.1을 사용하여 1:1 결합 모델에 피팅하여 회합 속도 (k_on, M^-1s^-1 단위), 해리 속도 (k_off, s^-1 단위), 및 R_max (RU 단위)를 결정하였다. 평형 해리 상수 (K_D)를 관계식 K_D = k_off/k_on으로 계산하였고, 몰 단위이다.

표 2: 37℃에서의 예시된 이중특이적 항체의 인간 IL-23에 대한 결합 친화도

*K_D는 개별 K_D 값의 평균을 기반으로 하여 계산됨

표 3: 37℃에서의 예시된 이중특이적 항체의 인간 CGRP에 대한 결합 친화도

**K_D는 개별 K_D 값의 평균을 기반으로 하여 계산됨

이들 결과는 본 발명의 예시된 이중특이적 항체가 37℃에서 인간 IL-23 및 인간 CGRP에 결합한다는 것을 입증한다.

이중특이적 항체 용해도 및 안정성 분석

(a) 용해도

이중특이적 항체 1을 10mM 시트레이트, pH 6, 150mM NaCl의 존재 및 부재 (각각 C6 및 C6N으로 축약됨)로 투석하였다. 샘플을 분자량 필터 (아미콘 30kDa 한외여과 필터, 밀리포어 카탈로그 # UFC903024)를 통해 원심분리에 의해 50 또는 대략 100mg/mL 중 어느 하나로 농축시켰다. 2개 샘플의 일부에, 트윈-80을 0.02%의 최종 농도로 첨가하였다 (v/v; 각각 C6T 및 C6NT로 추가로 축약됨). 선별 제제를 냉장 및 실온 조건 하에 용해도, 동결-해동 안정성, 및 저장 안정성에 대해 분석하였다.

용해도는 C6 및 C6N 제제 중 이중특이적 항체 농도 > 95mg/mL를 특징으로 하였다. 상기 기재된 바와 같은 농축 후에, 샘플을 침전 또는 상 분리를 위해 실온에서 시각적으로 조사하고, 후속적으로 4℃에서 어둠속에서 1주 동안 저장하고, 시각적으로 재조사하였다. 이 절차를 -5℃에서 1주 동안 및 -10℃에서 추가의 주 동안 저장한 후에 동일한 샘플에서 반복하였다 (용해된 물질의 수준으로 인해 샘플은 동결되지 않음을 주의함). 용해도 분석의 결과는 표 4에 제시된다. 이중특이적 항체 1은 제제 또는 저장 온도 중 어느 하나에서 어떠한 시각적 침전 또는 상 분리도 제시하지 않았다.

표 4: 용해도

(b) 동결-해동 안정성

제조 동안 정제된 활성 제약 성분 (API)은 전형적으로 약물 제품 (DP)으로 선행 가공까지 동결 상태로 유지하였다. 이중특이적 항체 1을 높은 농도에서 동결-해동 안정성에 대해 시험하였다. C6 및 C6N 중 50 및 100mg/mL 제제를 느린 동결 해동 3 사이클에 적용하였다. 동결 및 해동의 속도를 더 큰 제조 용기에서 발생할 수 있는 것과 유사하도록 제어하였다. 진공 부재 하에 셸프 동결건조기를 사용하여 표 5에 제시된 바와 같은 온도 사이클을 제어하였다.

표 5: 느린 동결-해동 연구에서 사용된 동결 및 해동 속도

3 사이클 후에 물질을 고분자량 (HMW) 중합체 형성에 대한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 10 마이크로미터 초과의 입자에 대한 광 차폐에 의해 분석하였다. 결과는 표 6에 제시된다. 이중특이적 항체 1은 시험된 모든 조건 하에 낮은 백분율의 HMW 중합체를 지속적으로 산출하였다.

표 6: 느린 냉동-해동 3 사이클에 대한 안정성 (nd = 결정되지 않음)

(c) 냉장 및 실온 안정성

제네릭 약물 제품 (DP) 제제, 10mM 시트레이트, 0.02% 트윈-80, pH 6.0, 150mM NaCl의 존재 및 부재 (각각 C6T 및 C6NT로 축약됨) 하의 냉장 및 실온 안정성을 2 및 4주 유지 시간 후에 SEC 및 입자 카운트에 의해 평가하였다. 결과는 각각 표 7 및 8에 제시된다. 데이터는 이중특이적 항체 1이 낮은 가용성 (%HMW) 및 불용성 (≥10 마이크로미터 입자 카운트) 안정성을 갖는다는 것을 입증한다.

표 7: 50mg/mL에서 제네릭 약물 제품 (DP) 제제 중 안정성, HMW 형성

표 8: 50mg/mL에서 제네릭 약물 제품 (DP) 제제 중 안정성, 마이크로미터 크기 입자 형성

(d) 점도

이중특이적 항체 1의 점도를 실온에서 4개의 제제 (C6, C6N, C6T, 및 C6NT) 중에서 100mg/mL로 분석하였다. 측정을 25℃에서 1000 초-1의 전단율을 사용하여 m-VROC (레오센스)에서 수행하였다. 결과는 표 9에 제시되고 C6N 및 C6NT 제제 둘 다 중에서 이중특이적 항체 1에 대해 유의하게 낮은 점도를 예시하였다. 점도에서의 유의한 감소는 염-함유 제제 중 이중특이적 항체 1에 대해 관찰하였다.

표 9: 다양한 제제 중 실온에서의 100mg/mL 이중특이적 항체 1의 용액 점도

(e) 광안정성

이중특이적 항체 1 및 이중특이적 항체 2의 광안정성은 하나의 제제 조건 (C6NT) 하에 50mg/mL 단백질 농도를 특징으로 하였다. 이중특이적 항체 1을 국제 조화 회의 (ICH) 전문가 작업 집단 권고된 노출 수준 (Q1B-안정성 시험: 신규 약물 물질 및 생성물의 광안정성 시험, 1996년 11월)의 20%에 노출시켰다. 이는 240,000 룩스-시간의 가시 광 및 40 와트-시간/m² 근-UV 광과 동등하였다. 카탈로그 04030-307-CW 가시 및 04030-308UV 근-UV 램프가 장착된 반손 ES2000 포토챔버 (인바이런멘탈 스페셜리티스(Environmental Specialties), 반손 그룹 캄파니(Bahnson Group Company))를 사용하였다. 샘플을 30시간 동안 8,000 룩스 강도로 가시 광에 및 4시간 동안 10 와트/m² 근-UV에 노출시켰다. 모든 노출은 25℃에서 유형 I 보로실리케이트 유리 HPLC 바이알에서 수행하였다. 노출 후에, 퍼센트 HMW 중합체 형성을 SEC에 의해 결정하였고, 표 10에 제시된다. 결과는 이중특이적 항체 2에서의 Q684T 돌연변이 (서열식별번호: 1 vs. 서열식별번호: 2)가 분자의 광안정성을 유의하게 개선시킨다는 것을 입증한다.

표 10: C6NT 제제 중 50mg/mL에서의 이중특이적 항체 1의 광안정성

IL-23 및 CRGP의 동시 결합

비아코어 3000 기기 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences))를 사용하여 본 발명의 이중특이적 항체가 인간 IL-23 및 인간 CGRP에 동시에 결합할 수 있는지를 결정하였다. 상기 기기를 25℃에서 평형화된 HBS-EP+ (10 mM Hepes pH 7.4 + 150 mM NaCl + 3 mM EDTA + 0.05% (w/v) 계면활성제 P20) 전개 완충제로 프라이밍하였다. 모든 4개의 유동 세포 (Fc) 상에 고정화된 단백질 A (표준 NHS-EDC 아민 커플링을 사용하여 생성됨)를 함유하는 CM5 칩 (비아코어 P/N BR1000-12)을 사용하여 이중특이적 항체 포획 방법론을 이용하였다. 이중특이적 항체 1 및 2를 전개 완충제 중에 희석하고 개별 유동 레인 상에 주입하여 대략 900RU의 항체를 포획하였다. 전개 완충제 중 10 nM로 인간 CGRP를 이중특이적 항체 표면 상에 주입하고 결합을 관찰하였다. 이중특이적 항체에서의 모든 CGRP 결합 부위가 포화된다는 것을 보장하기 위해, 20 및 이어서 40 nM CGRP 펩티드의 추가적인 주입을 수행하였다. 모든 이용가능한 항-CGRP 결합 부위가 점유된다는 것을 증명하는 결합 신호에서의 어떠한 최소 증가도 관찰되지 않았다. 이후에, 인간 IL-23의 150 nM 용액을 주입하였다. 이중특이적 항체가 CGRP 및 IL-23 둘 다에 동시에 결합할 수 있는 경우에, 신호 증가가 관찰되어야 한다. 이중특이적 항체 1 및 2에 대한 결합 신호에서의 유의한 증가가 관찰되었고 이에 따라 이들 이중특이적 항체가 인간 IL-23 및 인간 CGRP 둘 다에 동시에 결합할 수 있다는 것을 입증하였다.

이중특이적 항체 1은 인간 IL-12에 결합하지 않는다

비아코어 2000 기기를 사용하여 본 발명의 이중특이적 항체가 인간 IL-12에 결합할지를 결정하였다. 나타내지 않는 한, 시약 및 물질을 지이 헬스케어 라이프 사이언시스 (스웨덴 웁살라)로부터 구입하고; 측정을 25℃에서 수행하고, HBS-P 완충제 (150 mM 염화나트륨, 0.005 % (w/v) 계면활성제 P-20, 및 10 mM Hepes, pH 7.4)를 전개- 및 샘플-완충제로서 사용하였다. 단백질 A (칼바이오켐(Calbiochem))를 아민 커플링 키트를 사용하여 CM5 센서 칩의 유동 세포 1, 2, 3 및 4 상에 고정화하였다. 이중특이적 항체 1 (2 μg/mL로 희석됨)을 먼저 유동 세포 2 상에서 포획하였다 (80 μL/분으로 5초 주입하여, 이중특이적 항체 1 포획의 460개 반응 유닛 (Δ RU)을 산출함). 유동 세포 1은 단백질-A-단독 대조군이다. 이어서, 인간 IL-12 (페프로테크(Peprotech))를 2분 동안 주입하였고 (667 nM), 어떠한 추가의 결합 신호 (0 Δ RU)도 관찰되지 않았다. IL-12에 특이적인 상업용 항체 (상표명 스텔라라® 하에 판매된 항-인간 IL-12 항체)는 인간 IL-12에 결합한다. 결과는 이중특이적 항체 1이 인간 IL-12에 결합하지 않는다는 것을 입증한다. 더욱이, 동일한 칩을 사용하여, 항-IL-12 특이적 항체는 인간 IL-12에 결합한다.

Kit225 세포에서의 시험관내 IL-23-매개된 Stat 3 활성의 억제

Kit225는 T-세포 만성 림프구성 백혈병을 갖는 환자로부터 확립된 인간 T-세포주이다. Kit225 세포는 IL-23R을 자연적으로 발현하고 STAT3의 인산화 및 STAT3 경로의 활성화에 의해 인간 IL-23에 반응한다. STAT3 경로를 활성화시키는 IL-23의 능력은 STAT3-루시페라제 구축물로 안정하게 형질감염된 Kit225 세포에서 루시페라제 활성을 측정함으로써 평가하였다.

Kit225-Stat3-luc (클론 3) 세포를 검정 배지 (10% FBS, 10 ng/mL 인간 IL-2, 및 1x 페니실린 + 퓨로마이신을 함유하는 RPMI 1640)에서 통상적으로 배양하였다. 검정일에, 세포를 500Xg로 5분 동안 (RT) 원심분리에 의해 수집하고, 큰 부피의 무혈청 RPMI 1640 배지로 세척하고 무혈청 OPTI-MEM 배지에서 재현탁시켰다. 웰당 50,000개 Kit225 세포 (50 μL)를 백색/투명 바닥 TC 처리된 96 웰 플레이트의 웰에 첨가하고 인간 IL-23의 존재 하에 항체로 처리하였다.

각각의 시험을 위해 25μL의 4X 항체 용액을 웰당 첨가하였다. 0 내지 126790 pM의 이중특이적 항체 1의 용량 범위를 평가하였다 (이중특이적 항체 1의 MW를 기반으로 하는 최종 농도; MW= 197178Da). 25 μL의 4X 인간 IL-23 (hIL-23)을 50 pM의 최종 농도 (MW =60000Da를 기반으로 함)로 각각의 웰에 첨가하였다. 검정 배지 단독은 "배지 단독" 및 "hIL-23 단독" 대조군을 위해 사용하였다. 0 내지 100000 pM의 용량 범위 (항체 2의 MW를 기반으로 하는 최종 농도 MW = 150000Da)에서 시험된, IL-23의 p19 서브유닛을 표적화하는, IL-23 중화 항체 (양성 대조군 항체)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 0 내지 126, 790 pM (MW= 150000Da를 기반으로 하는 최종 농도)의 용량 범위에서 시험된 이소형 대조군 항체 (인간 IgG4-PAA)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 시험을 삼중으로 수행하였다. 96-웰 플레이트를 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 95% 상대 습도, 5% CO2)에 4시간 동안 두었다. 100 μL/웰의 브라이트-글로 루시페라제(Bright-Glo Luciferase) 용액 (프로메가(Promega))을 첨가하여 처리 시 검정을 중단시켰다. 루미노미터 (퍼킨 엘머 빅터3(Perkin Elmer Victor3))를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 결과는 IL-23-유도된 Stat 3 활성의 50%가 이중특이적 항체 1 또는 양성 대조군 항체 중 어느 하나에 의해 억제된 (IC₅₀) 농도로 표현하고 데이터의 4 파라미터 S자형 피트 (시그마 플롯)를 사용하여 계산하였다.

결과는 항체 1이 농도-의존성 방식으로 Kit225 세포에서 인간 IL-23 유도된 Stat 3 활성을 억제한다는 것을 입증한다. 억제는 양성 대조군 항체로 관찰된 것과 필적한다 (이중특이적 항체 1의 경우 1671 ± 236 pM 대 양성 대조군 항-IL-23p19 항체의 경우 466 ± 31 pM의 IC₅₀).

검정에 대한 50nM의 CGRP의 첨가는, CGRP의 존재 하의 IC₅₀이 상기 기재된 것과 필적하기 때문에, 이중특이적 항체 1의 활성을 변형시키지 않는다.

음성 대조군 항체는 시험된 임의의 농도에서 Kit225 세포에서의 Stat 3 활성을 억제하지 않는다.

이중특이적 항체 1은 인간 IL-23을 효과적으로 중화시키고 IL-23 억제는 CGRP의 존재에 의해 영향을 받지 않는다.

시험관내 SK-N-MC 세포에서의 CGRP에 의해 유도된 cAMP 생성의 억제

SK-N-MC 세포는 CGRP 수용체를 내인성으로 발현하는 인간 신경모세포종 세포주이다. 이 수용체는 세포내 Gαs 단백질에 기능적으로 커플링된다. 수용체의 그의 천연 효능제, CGRP 펩티드로의 자극은 cAMP의 증가된 합성을 유발한다. 세포 내에 존재하는 cAMP의 양은 표준 시험관내 기술을 사용하여 검출될 수 있기 때문에, 이 파라미터는 수용체 활성의 척도로서 사용된다.

배양된 SK-N-MC를 10% 열-불활성화 FBS (깁코(Gibco)), 비-필수 아미노산 (깁코), 1 mM 피루브산나트륨, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL의 페니실린, 및 10 μg/mL의 스트렙토마이신으로 보충된 MEM (하이클론(Hyclone))에서 약 70% 전면생장률로 성장시켰다. 신선한 배지를 제공한 후에, 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 검정일에, 세포를 아큐타제(Accutase) (엠피 바이오메디칼스(MP Biomedicals))를 사용하여 탈착시키고, 검정 완충제 (1:2로 혼합된 Mg⁺⁺ 및 Ca⁺⁺를 함유하는 HBSS/DPBS, 3.3 mM HEPES, 0.03% BSA, 0.5 mM IBMX)에서 재현탁시키고, 384-웰, 폴리-D-리신 코팅된 백색 플레이트 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)) 내에 3-5K/웰로 시딩하였다.

이중특이적 항체 1을 10 nM 내지 0.5 pM (이중특이적 항체의 MW는 200 kDa임)의 검정 완충액으로 1:3 희석하였다. 희석된 이중특이적 항체 1, 양성 대조군 항체 (미국 특허 번호 9,073,991에 기재된 CGRP 중화 항체) 또는 이소형 대조군 항체 (인간 IgG4-PAA)를 인간 IL-23 (10 nM, 최종 농도) 또는 동등 부피의 완충제와 혼합하고 실온에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 인간 CGRP 펩티드 (바켐 H-1470)를 그의 EC₈₀ 농도 (0.8 nM)로 첨가하고, 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 신호 윈도우를 10 nM BIBN 4096 (토크리스(Tocris)), 소분자 참조 길항제 (Kb = 0.01 nM)를 사용하여 확립하였다. 세포내 cAMP의 양을 HTRF 기술 (균질 시간 분해 형광; 시스바이오(Cisbio))을 사용하여 판매업체 지침서에 따라 정량화하였다. 간략하게, 용해 완충제 중 cAMP-d2 접합체 및 항-cAMP-크립테이트 접합체를 처리된 세포와 함께 실온에서 60-90분 동안 인큐베이션하였다. HTRF 신호를 엔비전(EnVision) 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머)를 사용하여 즉시 검출하여 665 내지 620 nM에서의 형광의 비를 계산하였다. 미가공 데이터를 각각의 실험에 대해 생성된 cAMP 표준 곡선을 사용하여 cAMP 양 (pmol/웰)으로 전환시켰다. 상대 EC₅₀ 값을 4-파라미터 로지스틱 곡선 피팅 프로그램 (액티비티베이스(ActivityBase) v5.3.1.22 또는 진데이터 스크리너(Genedata Screener) v12.0.4)을 사용하여 농도 반응 곡선의 최상-최저 범위로부터 계산하고, Kb 값을 하기 식을 사용하여 효능제-보정된 IC50으로 추정하였다: Kb = (IC50) / [1 + ([Ag] / EC50)].

결과는 이중특이적 항체 1이, 0.02nM의 추정된 Kb 및 참조 길항제 및 양성 대조군 항체에 의해 생성된 것과 동일한 최대 효과로, 용량-의존성 방식으로 CGRP-자극된 cAMP 생성을 억제한다는 것을 입증한다. 10nM 인간 IL-23의 존재는 이중특이적 항체 1 또는 양성 대조군 항체에 의한 억제에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 이소형 대조군 항체는 시험된 임의의 농도에서 CGRP-유도된 cAMP 생성을 억제하지 않았다.

표 11: 시험 항체에 의해 CGRP-유도된 cAMP 생성의 억제

생체내 인간 IL-23-유도된 마우스 IL-22 생성의 억제

인간 IL-23의 투여는 생체내 정상 Balb/c 마우스에서의 마우스 IL-22의 발현을 유도한다.

이중특이적 항체 1이 생체내 마우스 IL-22의 인간 IL-23-유도된 발현을 차단할지를 이해하기 위해, 정상 Balb/c 마우스 (N=5)에 67 nm/kg의 예시된 이중특이적 항체 1 (분자량 200kDa) 또는 이소형 대조군 항체 (음성 대조군 항체로서 사용된 인간 IgG4-PAA, 67 nmol/kg, 분자량 150kDa) 중 어느 하나를 복강내로 주입하였다. 주입 2일 후에, 마우스를 50 nmol/kg의 인간 IL-23의 복강내 주사에 의해 챌린지하였다. 주입 5시간 후에 인간 IL-23 챌린지 마우스를 희생시키고 혈청을 수집하였다. 수집된 혈청을 시판용 ELISA (이바이오사이언스(eBioscience), Cat. # 88-7422-88)를 사용하여 제조업체의 지침서에 따라 마우스 IL-22 발현에 대해 분석하였다.

표 12: 생체내 인간 IL-23-유도된 마우스 IL-22 생성의 억제

결과는 이중특이적 항체 1이 mIL-22 발현에서 인간 IL-23-유도된 증가를 차단한다는 것을 입증한다. 이중특이적 항체 1로 처리된 마우스의 혈청에서의 마우스 IL-22 수준은 나이브 마우스의 혈청에서 관찰된 마우스 IL-22 수준과 필적한다 (p < 0.0001, 동등하지 않는 분산을 갖는 t 검정). 이소형 대조군 항체는 마우스 IL-22의 인간 IL-23-유도된 발현을 억제하지 않는다. 이중특이적 항체 1은 생체내 인간 IL-23을 효과적으로 중화시킨다.

이중특이적 항체 1의 투여는 래트 진피 혈류에서의 캡사이신-유도된 증가를방지한다

캡사이신 유도된 레이저 도플러 영상화 (LDI) 혈류 방법은 LDI를 사용하여 모니터링될 수 있는 혈류에서의 국부 변화에 의해 검출된 염증을 유도하는 피부에 국소적으로 적용된 캡사이신 용액을 기반으로 한다. 이 방법은 피부에서 일시적 수용체 전위 양이온 채널 서브패밀리 V 구성원 1 (TRPV1) 수용체의 캡사이신 활성화에 이어서 혈관에서 CGRP의 국부 방출 및 CGRP 수용체의 활성화에 의존한다. 캡사이신-유도된 진피 혈관확장 모델은 임상전 (래트, 비-인간 영장류 (NHP)) 모델에서 표적 결속을 평가하기 위해 적용된 바 있고, 클리닉에 중개된다. 이 연구의 목적은 이중특이적 항체 1이 래트 복부 피부에서 CGRP-매개된 캡사이신-유도된 진피 혈관확장을 방지할 수 있는지를 결정하는 것이다.

이중특이적 항체 1, 양성 대조군 (미국 특허 번호 9,073,991에 기재된 CGRP 중화 항체) 및 이소형 대조군 항체 (인간 IgG4-PAA)를 PBS에서 제조하였다. 루이스 래트를 LDI 측정 5일 전에 4 mg/kg으로 각각의 항체로 피하로 처리하고 (그룹당 n=8) 실험 전에 밤새 금식시켰다. 연구 작동자를 처리에 대해 맹검화하였다. 실험일에, 래트 복부를 면도하고 래트를 LDI 기기 (무어 LDI 레이저 도플러 이미저, 모델 LDI2-IR) 하에 가열 패드 상의 가열된 공기 챔버에 두었다. 직장 온도계와 혈압 커프를 온도 및 BP 모니터링을 위해 연구 전반에 걸쳐 사용하였다. 래트를 스캐닝 전에 대략 20분 동안 2.0 ± 0.5% 이소플루란 마취 하에 안정화시켰다. 이 안정화 주기 동안, 예비 스캔을 3개의 네오프렌 O-고리 (가시 혈관 및 높은 기저 혈류 부위로부터 떨어짐)의 정확한 배치를 위해 수득하였다. 기준선 온도 (대략 37℃)를 안정화시키면, 2개의 기준선 스캔으로 영상화 스캔을 시작하였다. 제2 스캔이 완료된 후에, 8 μL의 캡사이신 용액을 각각의 3개의 O-고리에 적용하였다 (60μL EtOH, 40μL 트윈 20 및 100 μL 정제된 H₂O의 용액 중 50mg의 캡사이신). 스캐닝을 추가로 25분 동안 2.5분마다 계속 스캔하였다. 스캔이 완료되면, 혈액 샘플을 혈장 분석을 위해 심장 천자를 통해 수득하였다. LDI 반복 스캔을 관심 분석 영역에 대한 무어 v.5.3 소프트웨어 및 주어진 시점에서 관심 영역으로부터의 신호를 평균화하기 위한 마이크로소프트 엑셀 워크시트를 사용하여 분석하고 혈류에서의 변화의 분석을 기준선으로부터의 퍼센트 변화로서 보고하였다 (기준선 값은 2개의 기준선 스캔의 평균임). 분석된 데이터를 그래프화를 위해 그래프패드 프리즘 6에 입력하였다. ANOVA에 이어서 터키 다중 비교를 통계적 분석을 위해 사용하였다. 결과는 도 1에 예시된다 (n=8, ANOVA와 함께 터키 다중 비교, 이소형 대조군 항체와 비교 시 ***p< 0.001).

이중특이적 항체 1 및 양성 대조군 항체는 CGRP-매개된 캡사이신-유도된 진피 혈관확장을 억제한다. 대조적으로, 이소형 대조군 항체는 CGRP-매개된 캡사이신-유도된 진피 혈관확장을 억제하지 않는다.

원숭이에서의 이중특이적 항체 1의 비임상 PK

이중특이적 항체 1의 혈청 약동학을 하기와 같이 결정하였다: 수컷 시노몰구스 원숭이에 6.7 mg/kg의 본 발명의 이중특이적 항체 1 (PBS (PH7.4)의 용액에서 제조됨)을 정맥내 (N=1) 또는 피하 (N=2) 중 어느 하나로 투여하였다.

혈액 샘플 (~1 mL) (정맥내로 대퇴 정맥으로부터 혈청 분리기 튜브 (예를 들어, 항응고제를 함유하지 않음)로 및 혈청으로 가공됨)을 투여 전에 및 후속적으로, 1-, 6-, 12-, 24-, 48-, 72-, 96-, 120-, 144-, 168-, 240-, 336-, 504-, 및 672-시간에서 투여 후에 수집하였다. 혈청 샘플을 총 IgG에 대한 정량적 MS에 의해 분석하였다. 샘플을 비오티닐화 염소 항-hIgG (서던 바이오테크(Southern Biotech), 2049-08) 및 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드로 면역침전시켰다. 면역침전 후에, 샘플을 환원시키고, 알킬화시키고, 트립신으로 소화시켰다. 총 IgG 농도를 항체 노출의 대응 척도로서 선택된 트립신 펩티드를 사용하여 결정하였다. 데이터의 검출 및 통합을 써모 Q-이그잭티브 오비트랩(Thermo Q-Exactive Orbitrap) LC/MS 시스템을 사용하여 수행하였다.

시험된 항체에 대한 표준 곡선을 기지의 양의 예시된 이중특이적 항체를 100% 시노몰구스 원숭이 혈청 (바이오리클레메이션(Bioreclamation))으로 희석하여 생성하였다. 이중특이적 항체 1의 표준 곡선 범위는 25-12,800ng/mL이다 (각각 12,800ng/mL 및 25ng/mL의 정량 상한치 및 하한치).

약동학적 파라미터 (클리어런스 값)를 시간 0 (항체의 투여)부터 투여 후 672시간까지의 농도 대 시간 프로파일을 사용하여 계산하고, 피닉스(Phoenix) (윈논린(WinNonLin) 6.4, 코넥트(Connect) 1.4)를 사용하여 비-구획 분석을 통해 결정하였다. 결과는 표 13에 요약된다.

표 13: 단일 정맥내 또는 피하 투여 후 시노몰구스 원숭이에서의 이중특이적 항체 1의 클리어런스

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> ANTI-CGRP/ANTI-IL-23 BISPECIFIC ANTIBODIES <130> X20879 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 701 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe 50 55 60 Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly 435 440 445 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val 450 455 460 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser 465 470 475 480 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Arg Tyr Val Met His Trp Val 485 490 495 Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro 500 505 510 Tyr Asn Asp Gly Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr 515 520 525 Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser 530 535 540 Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Trp Asp 545 550 555 560 Thr Gly Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 565 570 575 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 580 585 590 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 595 600 605 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Gly 610 615 620 Lys Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 625 630 635 640 Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Ser Lys Leu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe 645 650 655 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 660 665 670 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr 675 680 685 Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 690 695 700 <210> 2 <211> 701 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe 50 55 60 Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly 435 440 445 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val 450 455 460 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser 465 470 475 480 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Arg Tyr Val Met His Trp Val 485 490 495 Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro 500 505 510 Tyr Asn Asp Gly Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr 515 520 525 Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser 530 535 540 Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Trp Asp 545 550 555 560 Thr Gly Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 565 570 575 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 580 585 590 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 595 600 605 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Gly 610 615 620 Lys Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 625 630 635 640 Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Ser Lys Leu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe 645 650 655 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 660 665 670 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Trp Ser Thr 675 680 685 Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 690 695 700 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Gly Tyr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 4 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe 50 55 60 Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 435 440 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe 50 55 60 Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Trp Asp Thr Gly Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Gly Tyr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Gly Lys Phe 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Ser Lys Leu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Gly Lys Phe 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Ser Lys Leu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 10 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr Trp Met Gln 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 11 Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe Ala 1 5 10 15 Asp <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 12 Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 13 Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Arg Tyr Val Met His 1 5 10 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 14 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 15 Ala Arg Asn Trp Asp Thr Gly Leu 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 16 Arg Ala Ser Lys Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 17 Tyr Tyr Thr Ser Gly Tyr His Ser 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 18 Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 19 Lys Ala Ser Asp His Ile Gly Lys Phe Leu Thr 1 5 10 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 20 Tyr Gly Ala Thr Ser Lys Leu Thr 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 21 Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 22 Gln Thr Tyr Trp Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 23 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 25 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys 20 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 26 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 27 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 27 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 28 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 29 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys 20 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 30 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 31 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 32 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 33 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 34 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 34 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 <210> 35 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 35 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 36 Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 37 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 38 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 <210> 39 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 39 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 40 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 41 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 41 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu 325 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 42 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims

이뮤노글로불린 G (IgG) 항체 및 2개의 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는 이중특이적 항체이며, 여기서
(a) 상기 IgG는 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄 (LC)를 포함하며, 각각의 HC는 중쇄 CDR (HCDR) 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR1)을 포함하고 각각의 경쇄는 경쇄 CDR (LCDR) 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR1)을 포함하며, 여기서 HCDR1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 10이고, HCDR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 11이고, HCDR3의 아미노산 서열은 서열식별번호: 12이고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 16이고, LCDR2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 17이고, LCDR3의 아미노산 서열은 서열식별번호: 18이고;
(b) 각각의 scFv는 중쇄 가변 영역 (HCVR2) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR2)을 포함하며, HCVR2는 HCDR 4-6을 포함하고 LCVR2는 LCDR 4-6을 포함하고, 여기서 HCDR4의 아미노산 서열은 서열식별번호: 13이고, HCDR5의 아미노산 서열은 서열식별번호: 14이고, HCDR6의 아미노산 서열은 서열식별번호: 15이고, LCDR4의 아미노산 서열은 서열식별번호: 19이고, LCDR5의 아미노산 서열은 서열식별번호: 20이고, LCDR6의 아미노산 서열이 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 22이며,
여기서 각각의 scFv는 각각의 scFv의 HCVR2의 N-말단에서 상기 IgG 항체에 각각의 IgG HC의 C-말단에서 폴리펩티드 링커 (L1)를 통해 연결되고,
여기서 각각의 scFv의 HCVR2는 HCVR2의 C-말단에서 동일한 scFv의 LCVR2에 동일한 scFv의 LCVR2의 N-말단에서 제2 폴리펩티드 링커 (L2)를 통해 연결되고,
여기서 이중특이적 항체는 인간 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP) 및 인간 IL-23의 p19 서브유닛에 결합하는 것인
이중특이적 항체.
제1항에 있어서, LCDR6의 아미노산 서열이 서열식별번호: 21인 이중특이적 항체.
제1항에 있어서, LCDR6의 아미노산 서열이 서열식별번호: 22인 이중특이적 항체.
제1항에 있어서, 각각의 HC의 HCVR1의 아미노산 서열이 서열식별번호: 5이고, 각각의 LC의 LCVR1의 아미노산 서열이 서열식별번호: 7이고, 각각의 scFv의 HCVR2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 6이고, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9인 이중특이적 항체.
제4항에 있어서, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 8인 이중특이적 항체.
제4항에 있어서, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 9인 이중특이적 항체.
제1항 또는 제4항에 있어서, 각각의 HC의 아미노산 서열이 서열식별번호: 4이고, 각각의 LC의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3이고, 각각의 scFv의 HCVR2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 6이고, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9인 이중특이적 항체.
제7항에 있어서, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 8인 이중특이적 항체.
제7항에 있어서, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 9인 이중특이적 항체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, L1의 아미노산 서열이 서열식별번호: 23이고, L2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 24인 이중특이적 항체.
제1항, 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 HC의 아미노산 서열이 서열식별번호: 4이고, 각각의 LC의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3이고, 각각의 scFv의 HCVR2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 6이고, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 8이고, L1의 아미노산 서열이 서열식별번호: 23이고, L2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 24인 이중특이적 항체.
제1항, 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 HC의 아미노산 서열이 서열식별번호: 4이고, 각각의 LC의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3이고, 각각의 scFv의 HCVR2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 6이고, 각각의 scFv의 LCVR2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 9이고, L1의 아미노산 서열이 서열식별번호: 23이고, L2의 아미노산 서열이 서열식별번호: 24인 이중특이적 항체.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체의 HC, scFv, 제1 폴리펩티드 링커 L1 및 제2 폴리펩티드 링커 L2를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자.
제13항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열이 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 DNA 분자.
제13항 또는 제14항에 따른 DNA 분자 및 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체의 LC를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터이며, 여기서 LC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3인 발현 벡터.
제14항의 DNA 분자 및 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체의 LC를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포이며, 여기서 LC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3이며, 이러한 세포는 제11항 또는 제12항에 따른 이중특이적 항체를 발현할 수 있는 것인 재조합 숙주 세포.
하기 단계를 포함하는, 제11항 또는 제12항에 따른 이중특이적 항체를 생성하는 방법:
a) 제16항의 재조합 숙주 세포를 상기 이중특이적 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
b) 상기 숙주 세포로부터 발현된 이중특이적 항체를 회수하는 단계.
제17항의 방법에 의해 생성된 이중특이적 항체.
제1항 내지 제12항 및 제18항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
제1항 내지 제12항 및 제18항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 유효량을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법.
제20항에 있어서, 자가면역 질환이 염증성 장 질환인 방법.
제21항에 있어서, 염증성 장 질환이 크론병 또는 궤양성 결장염인 방법.
제20항에 있어서, 자가면역 질환이 건선성 관절염 또는 강직성 척추염인 방법.
제1항 내지 제12항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 이중특이적 항체.
제1항 내지 제12항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 이중특이적 항체.
제25항에 있어서, 자가면역 질환이 염증성 장 질환인 이중특이적 항체.
제26항에 있어서, 염증성 장 질환이 크론병 또는 궤양성 결장염인 이중특이적 항체.
제25항에 있어서, 자가면역 질환이 건선성 관절염 또는 강직성 척추염인 이중특이적 항체.