CN108135983A - 抗cgrp /抗il-23双特异性抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了结合降钙素基因相关肽(CGRP)和白介素‑23(IL‑23)的双特异性抗体，并且其特征在于对CGRP和IL‑23两者都具有高亲和力和强的同时中和特性。本发明的双特异性抗体可用于治疗各种自身免疫疾病，包括炎性肠病，诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、银屑病关节炎(PsA)和强直性脊柱炎(AS)。

Description

抗CGRP /抗IL-23双特异性抗体及其用途
本发明属于医学领域，尤其属于针对降钙素基因相关肽(CGRP)和白介素-23 (IL-23)的双特异性抗体的新型领域。本发明的双特异性抗体预期可用于治疗自身免疫疾病，包括炎性肠病(IBD)，诸如克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)、银屑病关节炎(PsA)和强直性脊柱炎(AS)。
自身免疫疾病由人体产生针对其自身组织的免疫应答引起。自身免疫疾病通常是慢性的且可以使人虚弱且甚至危及生命。一般代表一组病症诸如CD和UC的IBD是常见的慢性复发性自身免疫疾病，其病理特征在于肠道炎症和上皮损伤。慢性自身免疫疾病的其他形式诸如PsA和AS，可以影响中轴和/或外周骨骼。
白介素23 (IL-23)是据信为对诱导慢性炎症所需的一系列炎性细胞的活化重要的异二聚体细胞因子。据信为IL-6、IL-17、GM-CSF和IL-22分泌的上游调节因子的IL-23，由与p40亚基(p40亚基也与细胞因子IL-12共享)共价配对的p19亚基(IL23p19)构成。此外，IL-23已表明为在记忆/病原T细胞炎性反应方面发挥重要作用并在调节先天淋巴样细胞炎性活性方面发挥作用。有证据表明细胞因子IL-6、IL-17、GM-CSF和IL-22的IL-23调节与炎性疾病(包括IBD)和其他自身免疫疾病相关。
CGRP是由中枢和外周神经系统的神经分泌的37个氨基酸的神经肽。CGRP广泛分布于外周和中枢神经系统的感觉神经中，并且表现出大量不同的生物活性。例如，其为微血管对其敏感的有效血管舒张剂。当从三叉神经和其他神经纤维释放时，CGRP被认为通过结合特定细胞表面受体来介导其生物反应。据信CGRP在调节和/或传递疼痛信号传导和神经源性炎症中发挥作用。据报道CGRP在偏头痛中发挥作用，因为CGRP在刺激感觉神经后释放。在刺激这些纤维后，CGRP的释放增加血管通透性和随后由三叉神经纤维支配的组织中的血浆蛋白渗漏(血浆蛋白外渗)。此外，研究已报道，在患有偏头痛的患者中CGRP的输注导致偏头痛样症状。
当前FDA批准的针对自身免疫疾病诸如IBD的治疗包括通常用于治疗急性炎症的皮质类固醇和生物产品，其中许多(诸如REMICADE®、ENBREL®和HUMIRA®)尝试靶向且中和体内的TNFα。批准用于治疗PsA的另一种生物产品包括STELARA®，其尝试靶向细胞因子IL-12和IL-23的共享的p40亚基。当前治疗已表明在患者子集中减少一些自身免疫疾病的症状且减缓其进展的效力。然而，大多数患者对当前可用的治疗无反应(例如，在用TNFα中和治疗的CD患者中仅30%-50%中出现缓解的诱导，且在12个月治疗后，在23%至46%的患者中出现对TNFα中和的反应的丧失)。自身免疫疾病的替代疗法包括结合IL-23的p19亚基的抗体，诸如美国专利号9,023,358中公开的那些。
尽管目前批准的自身免疫疾病的治疗方法治疗疾病的炎性方面，但所述治疗方法已被证明在治疗相关疼痛中是无效的。甚至在对抗TNFα疗法有反应的患有IBD (CD和UC)的患者中，仍然存在疼痛。据认为，与自身免疫疾病相关的炎症驱使对疼痛中枢敏化，导致痛觉过敏和触摸痛。结果是，甚至在炎症已减弱后仍可以存在疼痛，且高比例的患者继续服用止痛药。患有IBD的患者中的疼痛的标准疗法是镇痛药，包括NSAIDS、COX-2抑制剂和阿片剂。目前，患有IBD的患者在引入生物疗法之前和之后都按照类似数量的镇痛处方配药。已经提出结合CGRP的抗体，诸如美国专利号9,073,991中所述的那些，作为偏头痛的治疗剂。
此类替代疗法的一种方法可包括共同施用两种不同的生物产品(例如抗体)，所述生物产品(例如抗体)治疗自身免疫疾病的不同方面(例如疾病的病理学和相关疼痛)。共同施用需要注射两种分开的产品或单次注射两种不同抗体的共制剂。尽管两次注射允许给药量和时机的灵活性，但对于患者而言在顺应性和疼痛方面是不方便的。此外，尽管共制剂可能提供给药量的一定灵活性，但找到(在相对高浓度下)中具有可接受的粘度且促进两种抗体的化学和物理稳定性的配制条件通常相当具有挑战性或是不可能的，这是由于两种抗体的不同分子特征。此外，共同施用和共制剂涉及两种不同药物疗法的累加成本，其可以增加患者和/或支付者成本。
因此，仍然需要用于治疗自身免疫疾病的替代疗法，其具有疾病修饰和疼痛管理特性，并且优选此类替代疗法包括双特异性抗体。
本发明提供了包含免疫球蛋白G抗体(IgG)和两个单链可变片段(scFv)的双特异性抗体。
更具体地，本发明提供了包含IgG和两个scFv的双特异性抗体，其中
(a) 所述IgG包含两条重链(HC)和两条轻链(LC)，每条HC含有包含重链CDR (HCDR) 1-3的重链可变区(HCVR1)且每条轻链含有包含轻链CDR (LCDR) 1-3的轻链可变区(LCVR1)，其中HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:10，HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:11，HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:12，LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:16，LCDR2的氨基酸序列为SEQID NO:17，且LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:18；且
(b) 每个scFv包含重链可变区(HCVR2)和轻链可变区(LCVR2)，所述HCVR2包含HCDR 4-6，且所述LCVR2包含LCDR 4-6，其中HCDR4的氨基酸序列为SEQ ID NO:13，HCDR5的氨基酸序列为SEQ ID NO:14，HCDR6的氨基酸序列为SEQ ID NO:15，LCDR4的氨基酸序列为SEQ IDNO:19，LCDR5的氨基酸序列为SEQ ID NO:20，且LCDR6的氨基酸序列为SEQ ID NO:21或SEQID NO:22，
其中每个scFv在每个scFv的HCVR2的N末端处经由多肽接头(L1)在每个IgG HC的C末端处连接至所述IgG抗体，
且其中每个scFv的HCVR2在HCVR2的C末端处经由第二多肽接头(L2)在相同scFv的LCVR2的N末端处连接至相同scFv的LCVR2。
本发明的双特异性抗体结合CGRP和IL-23的p19亚基。
优选地，LCDR6的氨基酸序列为SEQ ID NO:21。
进一步优选地，LCDR6的氨基酸序列为SEQ ID NO:22。
在本发明的双特异性抗体的一个进一步实施方案中，每个HC的HCVR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，每个LC的LCVR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，每个scFv的HCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:6且每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9。
优选地，每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。
进一步优选地，每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:9。
在本发明的双特异性抗体的又一个进一步实施方案中，每个HC的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，每个LC的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，每个scFv的HCVR2的氨基酸序列为SEQID NO:6且每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9。
优选地，每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。
进一步优选地，每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:9。
在本发明的上述实施方案的优选方面，L1的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，且L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24。
在本发明的双特异性抗体的一个优选实施方案中，每个HC的氨基酸序列为SEQ IDNO:4，每个LC的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，每个scFv的HCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，L1的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，且L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24。
在本发明的双特异性抗体的一个进一步优选实施方案中，每个HC的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，每个LC的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，每个scFv的HCVR2的氨基酸序列为SEQID NO:6，每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，L1的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，且L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24。
当构建本发明的双特异性抗体时，与化学和物理稳定性相关的显著问题得到解决。在起始双特异性抗体中需要许多改变以充分解决大量可以与双特异性抗体相关的问题，诸如表达物理稳定的分子、稳定单链片段可变区(scFv)的VH/VL界面、增加热和盐依赖的稳定性、降低聚集、增加在高浓度下的溶解度和/或使双特异性抗体的结合表面中的静电分布再平衡，同时都维持分别针对两种靶向抗原CGRP和IL-23的p19亚基的结合亲和力。
本发明的双特异性抗体是热稳定且物理稳定的。而且，本发明的双特异性抗体也可以表现出低聚集。此外，本发明的双特异性抗体还可以中和人CGRP和人IL23p19 (IL-23的p19亚基)，以及同时结合两种配体。目前请求保护的抗体也可以避免这一挑战，即发现必须满足两种不同的单独抗体的不同分子特征的制剂条件。
本发明的第一双特异性抗体的IgG部分包含两条相同的重链(IgG HC)(SEQ IDNO:4)。
每个IgG HC在其C末端处经由第一多肽接头(L1)(SEQ ID NO:23)连接至特异性结合IL-23的p19亚基的相同scFv部分。
每个重链scFv部分(HCVR2)(SEQ ID NO:6)在其C末端处经由第二多肽接头(L2)(SEQ ID NO:24)连接至scFv轻链(LCVR2)(SEQ ID NO:8)。
本发明的第一双特异性抗体的每个相同重链部分的完全线性氨基酸序列，从IgG4HC的N末端残基开始且在scFv LC的C末端残基处结束，提供于SEQ ID NO:1中。
类似地，本发明的第一双特异性抗体的每个相同LC的完全氨基酸序列，从可变结构域的N末端残基开始且在LC κ恒定区的C末端残基处结束，提供于SEQ ID NO:3中。
本发明的示例性第一双特异性抗体的各个区域和接头的关系如下(氨基酸的编号应用线性编号；对可变结构域的氨基酸指定基于在www.imgt.org可得的InternationalImmunogenetics Information System®；对CDR结构域的氨基酸指定基于如表1(a)-(c)中所反映的众所周知的Kabat (Kabat等人, Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971);Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991))和North (North等人, A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations,Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011))编号惯例)：
根据本发明的第二示例性双特异性抗体，LCDR6引入工程改造的单一氨基酸改变，其在SEQ ID NO:1的位置684处用苏氨酸(T)取代谷氨酰胺(Q)(Q684T)，使得本发明的第二示例性双特异性抗体的LCDR6具有以下序列QTYWSTPFT (SEQ ID NO:22)。没有做出额外改变，且，因此本发明的第二示例性双特异性抗体的所有其余氨基酸序列与上述第一示例性双特异性抗体的那些相同。
本发明的第二双特异性抗体的每个相同重链部分的完全线性氨基酸序列(其包含具有SEQ ID NO:22的LCDR6)，从IgG4 HC的N末端残基开始且在scFv LC的C末端残基处结束，提供于SEQ ID NO:2中。
类似地，本发明的第二双特异性抗体的每个相同LC的完全氨基酸序列，从LC可变结构域的N末端残基开始且在LC恒定区的C末端残基处结束，提供于SEQ ID NO:3中。
本发明进一步提供了双特异性抗体，其中HC各自与LC各自形成链间二硫键；其中HC各自与另一HC形成链间二硫键；且其中scFv各自在HCVR2和LCVR2之间形成链内二硫键。根据表1(a)和(b)中所示的本发明的示例性双特异性抗体，HC各自 和LC各自的链间二硫键形成于HC的(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的)半胱氨酸残基133和LC的(SEQ ID NO:3的)半胱氨酸残基214之间；至少两个链间二硫键形成于两个HC之间，第一链间二硫键形成于HC的(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的)半胱氨酸残基225和另一HC的(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的)半胱氨酸残基225之间，第二链间二硫键形成于HC的(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的)半胱氨酸残基228和另一HC的(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的)半胱氨酸残基228之间；且scFv的链内二硫键形成于HCVR2的(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的)半胱氨酸残基503和LCVR2的(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的)半胱氨酸残基694之间。
根据本发明的一些实施方案，提供了包含HC的糖基化的双特异性抗体。根据表1(a)和(b)中所示的本发明的示例性双特异性抗体，HC的糖基化发生于SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的天冬酰胺残基296处。
鉴于本文提供的氨基酸序列，本领域普通技术人员可以使用该知识来设计DNA分子以编码和表达上文所述的任何双特异性抗体或其片段。因此，本发明涵盖编码根据本发明的双特异性抗体或其片段的所有DNA序列。
具体而言，本发明提供了DNA分子，其包含编码多肽链的多核苷酸序列，所述多肽链包含本发明的双特异性抗体的HC、scFv、第一多肽接头L1和第二多肽接头L2。
根据本发明的一个实施方案，编码的多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:1。
根据本发明的一个替代实施方案，编码的多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。
本发明还提供了包含编码SEQ ID NO:1的多肽的多核苷酸序列和编码SEQ ID NO:3的多肽的多核苷酸序列的表达载体。
本发明还提供了包含编码SEQ ID NO:2的多肽的多核苷酸序列和编码SEQ ID NO:3的多肽的多核苷酸序列的表达载体。
本发明还提供了重组宿主细胞，其含有包含编码包含本发明的双特异性抗体的HC、scFv、第一多肽接头L1和第二多肽接头L2的多肽链的多核苷酸序列的DNA分子(其中所述多肽链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)以及包含编码包含本发明的双特异性抗体的LC的多肽链的多核苷酸序列的DNA分子(其中所述LC的氨基酸序列是SEQ ID NO:3)，其中所述细胞能够表达本发明的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含结合这样的CGRP的IgG，所述CGRP缀合至两个结合IL23p19的scFv。
本发明还提供了重组宿主细胞，其用含有包含编码包含本发明的双特异性抗体的HC、scFv、第一多肽接头L1和第二多肽接头L2的多肽链的多核苷酸序列的DNA分子(其中所述多肽链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)以及包含编码包含本发明的双特异性抗体的LC的多肽链的多核苷酸序列的DNA分子(其中所述LC的氨基酸序列是SEQ ID NO:3)转化，所述双特异性抗体包含结合这样的CGRP的IgG，所述CGRP缀合至两个结合IL23p19的scFv。
本发明还提供了用于产生本发明的双特异性抗体的方法，所述方法包括在使得表达所述双特异性抗体的条件下培养本发明的重组宿主细胞，和回收表达的双特异性抗体。
本发明还提供了通过所述方法产生的根据本发明的双特异性抗体。
优选地，所述重组宿主细胞是选自CHO、NS0、HEK293和COS细胞的哺乳动物宿主细胞。
本发明还提供了治疗自身免疫疾病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本发明的双特异性抗体。
本发明还提供了治疗IBD(诸如CD和/或UC)的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本发明的双特异性抗体。
本发明还提供了治疗PsA和/或强直性脊柱炎的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本发明的双特异性抗体。
本发明还提供了本发明的双特异性抗体，其用于疗法中。
本发明还提供了本发明的双特异性抗体，其用于治疗自身免疫疾病(包括IBD、诸如CD和/或UC)。
本发明还提供了本发明的双特异性抗体，其用于治疗自身免疫疾病(包括PsA和/或强直性脊柱炎)。
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的双特异性抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的另一个实施方案包括本发明的双特异性抗体在制造用于治疗溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病的药物中的用途。
本发明的一个额外实施方案包括本发明的双特异性抗体在制造用于治疗银屑病关节炎和/或强直性脊柱炎的药物中的用途。
定义
当在本文中使用时，术语“双特异性抗体”是指包含与两个单链可变片段(scFv)缀合的免疫球蛋白G抗体(IgG)的分子。如本文所提及，本发明的双特异性抗体包含IgG和两个scFv，其中每个scFv在每个scFv的HCVR2的N末端处经由多肽接头(L1)在每个IgG HC的C末端处连接至所述IgG抗体，且其中每个scFv的HCVR2在HCVR2的C末端处经由第二多肽接头(L2)在相同scFv的LCVR2的N末端处连接至相同scFv的LCVR2。本发明的双特异性抗体的IgG和scFv特异性结合不同的抗原(分别为CGRP和IL-23的p19亚基)。值得注意的是，本发明的双特异性抗体结合IL-23的p19亚基，但不结合与IL-12共有的IL-23的p40亚基。
如本文中所提及，术语“单链可变片段”(scFv)是指包含经由多肽接头(L2)连接的重链可变区(HCVR2)和轻链可变区(LCVR2)的多肽链。此外，如本文所提及(且如以下示意图中所表示)，各scFv的HCVR2：a)在其N末端处经由多肽接头(L1)连接至IgG的一个HC的C末端；且b)L1在其C末端处经由第二多肽接头(L2)连接至相同scFv的LCVR2的N末端。此外，本发明的各scFv包括形成于相同多肽链的HCVR2的半胱氨酸残基和LCVR2的半胱氨酸残基之间的二硫键(如以下示意图中所表示)：
如本文中可互换使用的“亲本抗体(parent antibody)”或“亲本抗体(parentalantibody)”是由如下氨基酸序列编码的抗体，所述氨基酸序列用于例如通过氨基酸取代和结构改变来制备双特异性抗体的IgG和scFv之一。亲本抗体可以是鼠、嵌合、人源化或人类抗体。
术语“Kabat编号”或“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域中公认的这些术语是指对比抗体的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基可变性更高(即高变)的氨基酸残基进行编号的系统(Kabat,等人, Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department ofHealth and Human Services, NIH公开号91-3242 (1991))。
术语“North编号”或“North标记”在本文中可互换使用。本领域中公认的这些术语是指对比抗体的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基可变性更高(即高变)的氨基酸残基进行编号的系统且至少部分基于用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)，如(North等人, A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011)中所述。
本文中可互换使用的术语“患者”、“主体”和“个体”是指动物，优选地，该术语是指人类。在某些实施方案中，主体，优选人类进一步被表征为患有将受益于IL-23和CGRP两者的水平降低或生物活性降低的疾病或病症或病况(例如自身免疫病症)。在另一个实施方案中，主体，优选人类，进一步被表征为处于发生将受益于IL-23和CGRP两者的水平降低或生物活性降低的病症、疾病或病况的风险中。
双特异性抗体工程改造
当构建本发明的双特异性抗体时，遇到与化学和物理稳定性相关的显著问题。所遇到的问题包括表达差至无表达、纯化回收差、低热稳定性、高盐依赖性聚集、双抗体形成(和通过纯化减少双抗体中的挑战)、高溶液粘度、低结合亲和力和交叉反应性。
例如，构建IgG-scFv格式化的双特异性抗体的初始尝试包括如下构建体，其中亲本IL-23抗体(美国专利号9,023,358中所述的IL-23抗体)包含IgG抗体部分且亲本CGRP抗体(参见例如美国专利号9,073,991)包含双特异性抗体的scFv部分。其他初始尝试的构建体包括包含scFv部分的亲本IL-23抗体，同时CGRP抗体包含双特异性抗体的IgG部分。此外，初始构建体包括以各种构型与IgG部分缀合的scFv部分，包括分别在重链和轻链的氨基末端或羧基末端处与IgG部分缀合。此外，初始构建体包括在HCVR2和LCVR2的排列方面不同的scFv部分(例如IgG部分(C或N末端)-接头1-LCVR2或HCVR2-接头2-LCVR2或HCVR2中的另一者)。此外，亲本IL-23抗体构建体包括重链种系构架VH 5-51和1-69和轻链种系构架VK 02、VK 12和VK B3的组合。亲本CGRP抗体构建体(当包含IgG部分时)包括在恒定区(CH)内具有三个氨基酸突变(来自天然IgG4)的IgG4亚类结构。将初始构建体克隆至人类IgG4-Fc哺乳动物表达载体中。然而，(如上文所述的)最初产生的双特异性构建体展现出一种或多种上文所述的化学和/或物理问题。例如，与其中scFv部分位于C末端的构建体相比时，其中scFv部分位于N末端的构建体表现出多个稳定性问题。
计算双特异性抗体的静电表面，且鉴定和破坏带电的片(charged patches)。进行广泛的蛋白稳定性研究，且针对热稳定性以及CGRP和IL-23结合(相对于各亲本抗体)特性筛选构建的双特异性抗体。
因此进行化学和物理修饰以改善本发明的双特异性抗体的化学和物理稳定性。在HCDR4、HCDR5、LCDR4、LCDR5和LCDR6中对scFv形式的亲本IL-23抗体进行修饰以改善化学和物理稳定性。将构建的HCVR和LCVR组合入根据下式的IL-23 scFv形式：CGRP IgG (C末端)-L1-HCVR2-L2-LCVR2。为了使IL-23 scFv稳定，在IL-23 scFv的HCVR2 (G503C)和LCVR2(G694C)之间工程改造二硫键(氨基酸的编号应用基于表1(a)和(b)中所示的示例性双特异性抗体的线性编号)。此外，双特异性抗体的IgG部分中的亲本CGRP抗体被工程改造为IgG4亚类，这是因为参与Fc受体介导的炎性机制或者活化补体的能力降低，导致效应子功能降低。将包含这些化学和物理修饰的工程改造的IL-23 scFv构建体和CGRP IgG构建体插入表达载体中。
更具体地，本发明的双特异性抗体含有IgG4-PAA Fc部分。IgG4-PAA Fc部分在位置227具有丝氨酸至脯氨酸突变(S227P；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)，在位置233具有苯丙氨酸至丙氨酸突变(F233A；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)并且在位置234具有亮氨酸至丙氨酸突变(L234A；SEQ ID NO:1)。S227P突变是防止半抗体形成(IgG4抗体中的半分子的动态交换的现象)的铰链突变。F233A和L234A突变进一步降低了已经低的人IgG4同种型的效应子功能。
包含作为IgG4亚类的CGRP IgG和具有6个CDR突变的IL-23 scFv(相对于美国专利号9,023,358中描述的亲本IL-23抗体：HCVR2，在K28P和T58V处 (SEQ ID NO: 6)；和LCVR2，在L30G、L54K、E55L和M90Q/M90T处 (SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9)(如在表1(a)和(b)中反映的示例性双特异性抗体中所表示：HCVR2，在K487P和T517V处；以及LCVR2，在L624G、L648K、E649L和M684Q/M684T处，氨基酸编号应用基于表1(a)和(b)中所示的示例性双特异性抗体的线性编号)的双特异性抗体被鉴定为改善初始构建体中所示的表达、亲和力(对于IL-23，相对于亲本分子)和热稳定性。已经发现M90T突变(SEQ ID NO:9；(相对于美国专利号9,023,358中所述的亲本IL-23抗体)改善了分子的光稳定性，而不会不利地影响与CGRP和IL-23p19的结合。另外，这些突变导致食蟹猴中的清除率显著降低。在亲本单一抗体的初始表征中未鉴定到上述修饰。
双特异性抗体结合和活性
本发明的双特异性抗体在体外或体内结合人CGRP和人IL23p19两者且中和至少一种人CGRP生物活性和至少一种人IL-23生物活性。本发明的双特异性抗体在体外在CGRP存在和不存在的情况下为IL-23的抑制剂。本发明的双特异性抗体在体外在IL-23存在或不存在的情况下为CGRP的抑制剂。
在37℃下，本发明的第一示例性双特异性抗体(双特异性抗体1)被表征为对于人CGRP具有26.0 ± 26.0 pM的范围内的结合亲和力(KD)，且对于人IL23p19具有213.0 ±184.0 pM的范围内的结合亲和力(KD)。
在37℃下，本发明的第二示例性双特异性抗体(双特异性抗体2)被表征为对于人CGRP具有近似77.0 pM的结合亲和力(KD)，且对于人IL23p19具有215 pM的结合亲和力(KD)。
双特异性抗体有效地中和CGRP，且该中和不受饱和量的人IL-23的存在的影响。双特异性抗体有效地中和人IL-23，且该中和不受饱和量的人CGRP的存在的影响。
双特异性抗体表达
能够直接表达与之可操作连接的基因的表达载体是本领域中众所周知的。表达载体可以编码有助于从宿主细胞分泌多肽的信号肽。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。第一多肽链(包含HC、scFv、L1和L2)和第二多肽链(包含LC)可在一个载体中由与其可操作连接的不同启动子独立地表达，或者可替代地，第一和第二多肽链可在两个载体中由与其可操作连接的不同启动子独立地表达——一个表达第一多肽链且一个表达第二多肽链。
宿主细胞包括用一个或多个表达本发明的第一多肽链、第二多肽链或第一和第二多肽链两者的表达载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染的细胞。产生本发明的双特异性抗体的宿主细胞系的产生和分离可使用本领域中已知的标准技术实现。哺乳动物细胞是用于表达双特异性抗体的优选的宿主细胞。特定哺乳动物细胞是HEK 293、NS0、DG-44和CHO。优选地，将双特异性抗体分泌至培养宿主细胞的培养基中，可从其回收或纯化双特异性抗体。
本领域中众所周知抗体的哺乳动物表达导致糖基化。通常，糖基化发生在抗体的Fc区中的高度保守的N-糖基化位点。N-聚糖通常与天冬酰胺连接。通过实例的方式，表1(a)和(b)中所示的示例性双特异性抗体的各HC在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的天冬酰胺残基296处糖基化。
已将双特异性抗体分泌至其中的培养基可通过常规技术纯化。例如，可使用常规方法将培养基应用于蛋白A或G柱且由其洗脱。可通过常用技术，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石色谱，有效地移除可溶性聚集体和多聚体。可以将产物立即冷冻，例如在-70℃下，冷藏，或可以冻干。
在一些情况下，用于产生本发明的双特异性抗体的方法可以导致形成双抗体。双抗体是scFv的二价形式，其中HCVR2和LCVR2区表达于单一多肽链上，但并非可变结构域与相同多肽链的互补结构域配对，而是可变结构域与另一多肽链或不同分子的互补结构域配对。例如，如果双特异性抗体包含两个第一多肽(为了方便起见，1A和1B，其中1A和1B各自包含HC、scFv、L1和L2)和两个第二多肽(为了方便起见，2A和2B，其中2A和2B各自包含LC)，则1A的HCVR2与1B的LCVR2的互补结构域配对，而不是与1A的LCVR2配对。
治疗用途
如本文所用，“治疗(treatment)”和/或“治疗(treating)”意指其中可存在本文所述的病症的进展的减缓、中断、遏制、控制或停止的全部方法，但未必指示全部病症症状的完全消除。治疗包括施用本发明的双特异性抗体用于治疗哺乳动物、尤其人类中将受益于CGRP和/或IL-23的水平降低或CGRP和/或IL-23的生物活性降低的疾病或病况，且包括：(a)抑制疾病的进一步进展，即遏制其发展；和(b)缓解疾病，即引起疾病或病症消退或缓解其症状或并发症。
预期本发明的双特异性抗体治疗自身免疫疾病，包括IBD(诸如CD和UC)、PsA和强直性脊柱炎。
药物组合物
可以将本发明的双特异性抗体并入适用于向患者施用的药物组合物中。本发明的双特异性抗体可以单独或与药学上可接受的载体和/或稀释剂一起以单一或多个剂量施用于患者。此类药物组合物被设计成适于所选的施用模式，且适当时使用药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂，诸如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等张剂、稳定剂等。所述组合物可以根据公开于例如Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 第22版, Loyd V, 编, Pharmaceutical Press, 2012中的常规技术设计，其提供如从业者通常已知的配制技术的概要。用于药物组合物的合适载体包括与本发明的双特异性抗体组合时保留分子的活性且与患者的免疫系统无反应性的任何材料。本发明的药物组合物包含双特异性抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
包含本发明的双特异性抗体的药物组合物可以使用标准施用技术向处于如本文所述的疾病或病症的风险中或展现出如本文所述的疾病或病症的患者施用。
本发明的药物组合物含有“有效”量的本发明的双特异性抗体。有效量是指实现所希望的治疗结果(在剂量上和关于时间段和关于施用方式)所必需的量。双特异性抗体的有效量可根据因素诸如个体的疾病状况、年龄、性别和体重，和抗体或抗体部分在个体中引起期望的反应的能力而变化。有效量也是治疗有益作用超过双特异性抗体的任何毒性或有害作用的量。
实施例
除非另外指出，否则整个实施例中所提及的示例性双特异性抗体是指如上文表1(a)和(b)中所述的本发明的示例性双特异性抗体。
双特异性抗体表达和纯化
上文表1(a)和(b)中所述的本发明的示例性双特异性抗体(双特异性抗体1)基本上如下表达和纯化。将含有编码包含IgG HC-接头L1-scFv HCVR2-接头L2-scFv LCVR2的多肽(SEQ ID NO:1的多肽)的DNA多核苷酸序列和编码包含IgG LC的多肽(SEQ ID NO:3的多肽)的第二DNA多核苷酸序列的谷氨酰胺合成酶(GS)表达载体通过电穿孔转染至GS-敲除中国仓鼠细胞系(CHO)中。该表达载体编码SV早期启动子(猿猴病毒40E)和GS的基因。GS的表达允许生物化学合成谷氨酰胺（CHO细胞所必需的氨基酸）。转染后，细胞经历用50μM L-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的成批选择。利用MSX对GS的抑制来增加选择的严格性。可相针对表达内源水平的GS的CHO野生型细胞选择将表达载体cDNA整合至宿主细胞基因组的转录活性区域中的细胞。将转染的合并物以低密度铺板以允许稳定表达细胞的近克隆生长(close-to-clonal outgrowth)。针对双特异性抗体表达筛选这些主要孔，且然后在用于生产的无血清的悬浮培养物中按比例扩大。将示例性双特异性抗体已分泌至其中的澄清的培养基施加至已用相容缓冲液诸如20mM TRIS (pH 8.0)平衡的蛋白A亲和柱。洗涤该柱以移除非特异性结合组分。结合的双特异性抗体例如通过pH步骤或梯度(诸如20mM柠檬酸盐(pH 3.0))洗脱并用Tris (pH 8)缓冲液中和。双特异性抗体级分诸如通过SDS-PAGE或分析型大小排阻检测，且然后合并。可通过常见技术，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石色谱有效地移除可溶性聚集体和多聚体。对于双特异性抗体1使用阳离子-交换色谱。使用常用技术浓缩和/或无菌过滤双特异性抗体1。这些色谱步骤后的双特异性抗体1的纯度大于97%(单体)。双特异性抗体可在-70℃下立即冷冻或在4℃下储存数月。
在瞬时转染的CHO中表达本发明的第二示例性双特异性抗体(以下称为双特异性抗体2)(其相对于双特异性抗体1并入工程改造的单一氨基酸改变，其在位置684用苏氨酸(T)取代谷氨酰胺(Q)(Q684T)(SEQ ID NO:1 vs. SEQ ID NO:2))且通过蛋白A和疏水相互作用色谱纯化。将含有编码包含IgG HC-接头L1-scFv HCVR2-接头L2-scFv LCVR2的多肽(SEQ ID NO:2的多肽)的DNA多核苷酸序列和编码包含IgG LC的多肽(SEQ ID NO:3的多肽)的第二DNA多核苷酸序列的谷氨酰胺合成酶(GS)表达载体通过用聚乙烯亚胺化学处理瞬时转染至GS-敲除中国仓鼠细胞系(CHO)中。剩余的表达和纯化步骤与双特异性抗体1相同。在这些色谱步骤之后的双特异性抗体2的纯度大于98％(单体)。
双特异性抗体与IL-23和CGRP的结合亲和力
在Biacore 3000仪器上通过表面等离子共振(SPR)测定法测定人CGRP和人IL-23的结合亲和力，所述仪器用HBS-EP+ (10 mM Hepes pH7.4 + 150 mM NaCl + 3 mM EDTA +0.05% (w/v)表面活性剂P20)运行缓冲液预处理(primed)，温度被控制在37℃。在全部四个流动室(Fc)上使用含有固定蛋白A(使用标准NHS-EDC胺偶联生成)的CM5芯片(Biacore P/NBR-1000-12)以采用捕获方法。通过稀释至运行缓冲液中来以近似2μg/mL制备双特异性抗体样品。通过稀释至运行缓冲液中来以25、12.5、6.25、3.13、0.78、0.39、0.20、0.10和0 (空白) nM的最终浓度制备人IL-23。通过稀释至运行缓冲液中来以12.5、6.25、3.13、0.78、0.39、0.20、0.10和0(空白) nM的最终浓度制备人CGRP。
每个分析周期由以下组成：(1)在分开的流动室(Fc2、Fc3和Fc4)上将不同的双特异性抗体样品捕获至促进来自人IL-23或CGRP的20-100RU最大应答信号的水平；(2)在所有四个Fc上，以100μL/min注射每种人IL-23或人CGRP浓度，持续120秒，随后返回至缓冲液流，持续600秒，以监测解离相；(3)通过在所有小室上以10 μL/min注射10mM甘氨酸，pH 1.5，持续30秒，再生芯片表面；和(5)在HBS-EP+运行缓冲液中平衡芯片表面。使用标准双重参考处理数据并使用BiaEvaluation软件，版本4.1拟合至1：1结合模型，以测定缔合速率(kon，M-1s-1单位)、解离速率(koff，s-1单位)和Rmax (RU单位)。由关系KD = koff/kon计算平衡解离常数(KD)，且其以摩尔单位计。
表 2：在37℃下示例性双特异性抗体与人IL-23的结合亲和力
*基于单个K D 值的平均值计算的K D 。
表 3：在37℃下示例性双特异性抗体与人CGRP的结合亲和力
**基于单个K D 值的平均值计算的K D 。
这些结果证明，本发明的示例性双特异性抗体在37℃下结合人IL-23和人CGRP。
双特异性抗体溶解度和稳定性分析
(a) 溶解度
将双特异性抗体1透析至具有和不具有150 mM NaCl的10mM柠檬酸盐，pH6 (分别缩写为C6和C6N)中。通过经分子量过滤器(Amicon 30kDa超滤过滤器，Millipore目录号UFC903024)离心，将样品浓缩至50或近似100mg/mL。向两份样品的一部分中添加Tween-80至0.02%的最终浓度(v/v；分别进一步缩写为C6T和C6NT)。分析选择的制剂在冷藏和室温条件下的溶解度、冻-融稳定性和储存稳定性。
溶解度被表征为在C6和C6N制剂中双特异性抗体浓度> 95mg/mL。如上所述浓缩之后，在室温下目视检查样品的沉淀或相分离，随后在4℃下在黑暗中储存一周，并重新目视检查。在-5℃下再储存一周和在-10℃下再储存一周之后对相同样品重复该程序(注意由于溶解的物质的水平，样品没有冷冻)。溶解度分析的结果显示于表4中。双特异性抗体1在配制或储存温度下均未显示目测的沉淀或相分离。
表 4：溶解度
。
(b) 冻-融稳定性
在制造期间，纯化的活性药物成分(API)通常保持在冷冻状态下，直到继续加工成药物产品(DP)。在高浓度下测试双特异性抗体1的冻-融稳定性。将C6和C6N中的50和100mg/mL制剂进行三次缓慢冻融循环。控制冷冻和解冻的速率以模拟在较大制造容器中会发生的情况。使用非真空下的架式冻干器来控制温度循环，如表5中所示。
表 5：缓慢冻-融研究中使用的冷冻和解冻速率
步骤 目标温度(℃) 温度变化速率(℃/min) 在温度下的保持时间(min)
1 5 1.0 10
2 -1 0.05 750
3 -30 0.2 1
4 -70 1.0 60
5 -30 1.0 1
6 -1 0.2 1000
7 0.5 0.2 1
8 15 1 1
在三个循环之后，通过大小排阻色谱(SEC)分析材料的高分子量(HMW)聚合物形成和大于10微米的颗粒的不透光度。结果显示于表6中。双特异性抗体1在所有测试条件下始终产生低百分比的HMW聚合物。
表 6：针对三个缓慢冻-融循环的稳定性(nd =未测定)
。
(c) 冷藏和室温稳定性
通过SEC和2和4周保持时间后的颗粒计数评估在含有或不含150mM NaCl的通用药物产品(DP)制剂、10mM柠檬酸盐、0.02% Tween-80、pH 6.0(分别缩写为C6T和C6NT)下的冷藏和室温稳定性。结果分别显示于表7和8中。数据表明，双特异性抗体1具有低可溶性(％HMW)和不溶性(≥10微米颗粒计数)稳定性。
表 7：在50mg/mL的通用药物产品(DP)制剂中的稳定性，HMW形成
。
表8：在50mg/mL的通用药物产品(DP)制剂中的稳定性，微米大小颗粒形成
。
(d) 粘度
在室温下在四种制剂(C6、C6N、C6T和C6NT)中以100mg/mL分析双特异性抗体1的粘度。在25℃下在m-VROC(Rheosense)上使用1000 sec-1的剪切速率进行测量。结果显示于表9中，并且说明C6N和C6NT制剂中双特异性抗体1的显著低的粘度。在含盐制剂中对于双特异性抗体1观察到粘度的显著降低。
表 9：在各种制剂中在室温下100mg/mL双特异性抗体1的溶液粘度
分子ID C6 C6N C6T C6NT
双特异性抗体1 9.2 2.9 13.2 3.8
(e) 光稳定性
在一种制剂条件(C6NT)下在50mg/mL蛋白浓度下表征双特异性抗体1和双特异性抗体2的光稳定性。将双特异性抗体1暴露于20％的国际协调会议(ICH)专家工作组推荐的暴露水平(Q1B-稳定性测试：新药物和产品的光稳定性测试，1996年11月)。这等同于240,000勒克斯-小时的可见光和40瓦-小时/m2近UV光。使用配备有目录04030-307-CW可见和04030-308UV近UV灯的Bahnson ES2000光室(Environmental Specialties, a Bahnson GroupCompany)。将样品暴露于8000勒克斯强度的可见光30小时和10瓦/m2近UV光4小时。在I型硼硅酸盐玻璃HPLC小瓶中，所有暴露都在25℃下。暴露后，HMW聚合物形成百分比通过SEC测定，且显示于表10中。结果证明，双特异性抗体2中的Q684T突变(SEQ ID NO:1 vs. SEQ IDNO:2)显著改善了该分子的光稳定性。
表10：C6NT制剂中50mg/mL的双特异性抗体1的光稳定性
分子ID % HMW增加 (240,000 勒克斯-小时可见) % HMW增加(240,000 勒克斯-小时可见加上40 瓦-小时/m2近UV)
双特异性抗体1 5.5% 11.7 ± 2.2 (n =3，平均值±标准偏差)
双特异性抗体2 未测定 5.3
IL-23和CRGP的同时结合
使用BIAcore 3000仪器(GE Healthcare Life Sciences)来确定本发明的双特异性抗体是否可以同时结合人IL-23和人CGRP。该仪器用在25℃下平衡的HBS-EP+ (10 mM HepespH 7.4 + 150 mM NaCl + 3 mM EDTA + 0.05% (w/v)表面活性剂P20)运行缓冲液预处理。在全部四个流动室(Fc)上使用含有固定的蛋白A(使用标准NHS-EDC胺偶联生成)的CM5芯片(Biacore P/N BR1000-12)以采用双特异性抗体捕获方法。将双特异性抗体1和2在运行缓冲液中稀释并注射至单独的流动泳道上以捕获近似900RU的抗体。将运行缓冲液中10 nM的人CGRP注射至双特异性抗体表面上并观察结合。为了确保双特异性抗体中的所有CGRP结合位点都是饱和的，再进行20 nM CGRP肽的注射，然后进行40 nM CGRP肽的注射。观察到结合信号没有增加至最小增加，证明所有可用的抗CGRP结合位点都被占据。其后，注射人IL-23的150 nM溶液。如果双特异性抗体能够同时结合CGRP和IL-23两者，则应该观察到信号增加。对于双特异性抗体1和2，观察到结合信号的显著增加，因此证明这些双特异性抗体能够同时结合人IL-23和人CGRP两者。
双特异性抗体1不结合人IL-12
使用BIAcore 2000仪器来确定本发明的双特异性抗体是否将结合人IL-12。除非指出，试剂和材料购自GE Healthcare Life Sciences (Upsala, Sweden)；在25℃下进行测量，并使用HBS-P缓冲液(150 mM氯化钠，0.005 % (w/v)表面活性剂P-20和10 mM HEPES，pH7.4)作为运行和样品缓冲液。使用胺偶联试剂盒将蛋白A(Calbiochem)固定在CM5传感器芯片的流通室1、2、3和4上。首先将双特异性抗体1 (稀释至2μg/mL)捕获在流动室2上(以80μL/min注射5秒，产生460个响应单位(Δ RU)的双特异性抗体1捕获)。流动室1是仅蛋白A的对照。接下来，注射人IL-12 (Peprotech)(667 nM)2分钟，并且没有观察到额外的结合信号(0 Δ RU)。对于IL-12特异性的商业抗体(以商品名STELARA®销售的抗人IL-12抗体)结合人IL-12。
结果证明，双特异性抗体1不结合人IL-12。而且，使用相同的芯片，抗IL-12特异性抗体结合人IL-12。
在Kit225细胞中体外抑制IL-23介导的Stat3活性
Kit225是由患有T细胞慢性淋巴细胞白血病的患者建立的人T细胞系。Kit225细胞天然表达IL-23R并通过STAT3的磷酸化和STAT3途径的活化对人IL-23应答。通过测量用STAT3-荧光素酶构建体稳定转染的Kit225细胞中的荧光素酶活性来评价IL-23活化STAT3途径的能力。
在测定培养基(含有10% FBS、10ng/mL人IL-2和1x青霉素加嘌呤霉素的RPMI1640)中常规培养Kit225-Stat3-luc(克隆3)细胞。在测定当天，将细胞通过以500Xg离心5分钟(RT)来收集，用大体积的无血清RPMI 1640培养基洗涤并重新悬浮于无血清OPTI-MEM培养基中。将每孔50,000个Kit225细胞(在50μL中)添加至白色/透明底TC处理的96孔板的孔中，并在人IL-23存在的情况下用抗体处理。
对于每次测试，每孔添加25 μL的4X抗体溶液。评估0至126790 pM的双特异性抗体1的剂量范围(基于双特异性抗体1的MW的最终浓度；MW= 197178Da)。向每个孔中添加25μL4X人IL-23 (hIL-23)至50 pM的最终浓度(基于MW =60000Da)。单独的测定培养基用于“单独的培养基”和“单独的hIL-23”对照。使用以0至100000 M的剂量范围(基于抗体2的MW (MW= 150000Da)的最终浓度)测试的靶向IL-23的p19亚基的IL-23中和抗体(阳性对照抗体)作为阳性对照。使用以0至126, 790 pM(基于MW = 150000Da的最终浓度)的剂量范围测试的同种型对照抗体(人IgG4-PAA)作为阴性对照。一式三份进行测试。将96孔板置于组织培养保温箱中(37℃，95％相对湿度，5% CO2) 4小时。在处理后添加100 μL/孔的Bright-Glo荧光素酶溶液(Promega)以停止测定。使用发光计(Perkin Elmer Victor3)以读取板。结果被表示为通过双特异性抗体1或阳性对照抗体抑制IL-23诱导的Stat 3活性的50％ (IC50)并且使用数据的4参数S形拟合(Sigma图)计算的浓度。
结果证明，抗体1以浓度依赖性方式在Kit225细胞中抑制人IL-23诱导的Stat 3活性。抑制与用阳性对照抗体观察到的抑制相当(其中对于双特异性抗体1的IC50为1671 ±236 pM，相比之下，对于阳性对照抗IL-23p19抗体的IC50为466 ± 31 pM。
向测定中添加50 nM的CGRP不会改变双特异性抗体1的活性，因为在CGRP存在的情况下的IC50与上述的相当。
在任何测试浓度下，阴性对照抗体不抑制Kit225细胞中的Stat 3活性。
双特异性抗体1有效地中和人IL-23并且IL-23抑制不受CGRP的存在的影响。
体外在SK-N-MC细胞中由CGRP诱导的cAMP产生的抑制
SK-N-MC细胞是内源性表达CGRP受体的人神经母细胞瘤细胞系。该受体在功能上与细胞内Gαs蛋白偶联。用其天然激动剂CGRP肽刺激受体导致cAMP合成增加。由于细胞内存在的cAMP的量可以使用标准体外技术检测，因此该参数用作受体活性的量度。
培养的SK-N-MC在补充有10％热灭活的FBS (Gibco)、非必需氨基酸(Gibco)、1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和10μg/mL链霉素的MEM (Hyclone)中生长至约70％汇合度。提供新鲜培养基之后，将细胞在37℃下孵育过夜。在测定当天，使用Accutase (MP Biomedicals)分离细胞，将其重新悬浮于测定缓冲液(HBSS/DPBS，含有1:2混合的Mg++和Ca++，3.3 mM HEPES，0.03％ BSA，0.5 mM IBMX)中，并以3-5K/孔接种至384孔聚-D-赖氨酸包被的白色板(BD Biosciences)中。
将双特异性抗体1从10 nM至0.5 pM以1:3稀释于测定缓冲液中(双特异性抗体的MW为200 kDa)。将稀释的双特异性抗体1、阳性对照抗体(美国专利号9,073,991中描述的CGRP中和抗体)或同种型对照抗体(人IgG4-PAA)与人IL-23(10 nM，最终浓度)或等体积的缓冲液混合并与细胞在室温下孵育30分钟。人CGRP肽(Bachem H-1470)以其EC80浓度(0.8nM)添加，并将板在室温下孵育60分钟。信号窗口使用10 nM BIBN 4096 (Tocris)(一种小分子参考拮抗剂)(Kb = 0.01nM)建立。根据供应商说明，使用HTRF技术(均相时间分辨的荧光；Cisbio)定量细胞内cAMP的量。简而言之，将在裂解缓冲液中的cAMP-d2缀合物和抗cAMP-穴状化合物缀合物与处理的细胞在室温下孵育60-90分钟。使用EnVision读板器(Perkin-Elmer)立即检测HTRF信号以计算665 nM处的荧光与620 nM处的荧光的比率。使用为每个实验生成的cAMP标准曲线将原始数据转化为cAMP量(皮摩尔/孔)。使用四参数逻辑曲线拟合程序(ActivityBase v5.3.1.22或Genedata Screener v12.0.4)从浓度响应曲线的顶部-底部范围计算相对EC50值，并将Kb值使用以下方程估计为激动剂校正的IC50值：Kb= (IC50) / [ 1+ ([Ag] / EC50) ]。
结果证明，双特异性抗体1以剂量依赖性方式抑制CGRP刺激的cAMP产生，其中估计的Kb为0.02 nM，且最大效应等于由参考拮抗剂和阳性对照抗体产生的最大效应。10 nM人IL-23的存在对由双特异性抗体1或阳性对照抗体的抑制没有影响。在任何测试浓度下，同种型对照抗体不抑制CGRP诱导的cAMP产生。
表 11：通过测试抗体对CGRP诱导的cAMP产生的抑制
。
体内人IL-23诱导的小鼠IL-22产生的抑制
人IL-23的施用在正常Balb/c小鼠中体内诱导小鼠IL-22的表达。
为了理解双特异性抗体1是否将体内阻断人IL-23诱导的小鼠IL-22的表达，将正常Balb/c小鼠(N = 5)腹膜内注射67 nm/kg示例性双特异性抗体1(分子量200kDa)或同种型对照抗体(用作阴性对照抗体的人IgG4-PAA，67 nmol/kg，分子量150kDa)。注射后两天，通过腹膜内注射50 nmol/kg的人IL-23来攻击小鼠。人IL-23攻击后5小时，将小鼠处死并收集血清。根据制造商的说明书使用商业ELISA (eBioscience，目录号88-7422-88)分析收集的血清的小鼠IL-22表达。
表12：体内人IL-23诱导的小鼠IL-22产生的抑制
双特异性抗体1 + 人IL-23 未处理小鼠 同种型对照抗体 + 人IL-23
小鼠IL-22水平(pg/mL) 3.6 ± 2.2 0 ± 0 577 ± 57
结果证明，双特异性抗体1阻断人IL-23诱导的mIL-22表达的增加。用双特异性抗体1处理的小鼠的血清中的小鼠IL-22水平与未处理(naïve)小鼠的血清中观察到的小鼠IL-22水平相当(p <0.0001，不等方差的t检验)。同种型对照抗体不抑制人IL-23诱导的小鼠IL-22的表达。双特异性抗体1在体内有效地中和人IL-23。
双特异性抗体1的施用防止辣椒素诱导的大鼠真皮血流的增加
辣椒素诱导的激光多普勒成像(LDI)血流方法基于诱发炎症的局部应用于皮肤的辣椒素溶液，其通过可以使用LDI监测的血流中的局部变化来检测。该方法依赖于瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1 (TRPV1)受体的辣椒素活化，随后局部释放CGRP并活化皮肤中的血管上的CGRP受体。已经应用辣椒素诱导的真皮血管舒张模型以评价临床前(大鼠，非人灵长类动物(NHP))模型中的目标参与并且被转化至临床。本研究的目的是确定双特异性抗体1是否能够预防CGRP介导的辣椒素诱导的大鼠腹部皮肤中的真皮血管舒张。
在PBS中制备双特异性抗体1、阳性对照(在美国专利号9,073,991中描述的CGRP中和抗体)和同种型对照抗体(人IgG4-PAA)。将Lewis大鼠在LDI测量前5天用各个抗体以4mg/kg皮下处理(每组n = 8)，并在实验前禁食过夜。研究操作者对治疗不知情。在实验当天，将大鼠腹部剃毛并将大鼠置于LDI仪器(Moor LDI Laser Doppler Imager，型号LDI2-IR)下在加热垫上的热空气室中。在整个研究中使用直肠温度计和血压袖带用于温度和BP监测。在扫描前，将大鼠在2.0 ± 0.5%异氟烷麻醉下稳定近似20分钟。在该稳定时段期间，对于三个氯丁橡胶O形环的正确定位(远离可见血管和高基础血流区域)获得初步扫描。一旦稳定基线温度(近似37℃)，成像扫描用2次基线扫描开始。在完成第二次扫描之后，将8μL辣椒素溶液应用于三个O形环中的每一个(在60μL EtOH、40µL Tween 20和100μL纯净水的溶液中的50mg辣椒素)。每2.5分钟扫描一次持续扫描额外25分钟。一旦扫描完成，经由心脏穿刺获取血液样品用于血浆分析。分析LDI重复扫描，其使用Moor v.5.3软件用于目标区域分析，且使用Microsoft Excel工作表用于在给定时间点将来自目标区域的信号平均化，并分析报告为距基线的百分比变化的血流中的变化(基线值是两次基线扫描的平均值)。将分析的数据输入Graphpad Prism 6中用于绘图。使用ANOVA，随后使用Tukey氏多重比较，用于统计分析。结果显示于图1中(n=8，ANOVA与Tukey氏多重比较，***与同种型对照抗体相比p<0.001)。
双特异性抗体1和阳性对照抗体抑制CGRP介导的辣椒素诱导的真皮血管舒张。相反，同种型对照抗体不抑制CGRP介导的辣椒素诱导的真皮血管舒张。
猴中的双特异性抗体1的非临床PK
如下测定双特异性抗体1的血清药代动力学：将雄性食蟹猴静脉内(N=1)或皮下(N=2)施用6.7 mg/kg本发明的双特异性抗体1(在PBS (PH7.4)的溶液中制备)。
在给药前和随后给药后1-、6-、12-、24-、48-、72-、96-、120-、144-、168-、240-、336-、504-和672-小时收集血液样品(~1 mL)(从股静脉静脉内注入血清分离管(例如，不含抗凝血剂)并加工成血清)。通过定量MS分析血清样品的总IgG。用生物素化的山羊抗hIgG(Southern Biotech, 2049-08)和链霉抗生物素蛋白包被的磁珠免疫沉淀样品。在免疫沉淀后，将样品还原，烷基化并用胰蛋白酶消化。使用选择的胰蛋白酶肽作为抗体暴露的替代量度来测定总IgG浓度。使用Thermo Q-Exactive Orbitrap LC/MS系统进行数据的检测和整合。
通过将已知量的示例性双特异性抗体稀释至100％食蟹猴血清(Bioreclamation)中来生成测试抗体的标准曲线。双特异性抗体1的标准曲线范围是25-12,800ng/mL (分别12,800ng/mL和25ng/mL的定量上限和下限)。
使用从时间零(施用抗体)至施用后672小时的浓度与时间曲线计算药代动力学参数(清除率值)，并使用Phoenix (WinNonLin 6.4, Connect 1.4)经由非隔室分析进行测定。结果概述于表13中。
表13：单次静脉内或皮下施用后食蟹猴中的双特异性抗体1的清除率。
施用的抗体 静脉内清除率 (mL/hr/kg) 皮下清除率(mL/hr/kg)
双特异性抗体1 0.448 0.768
序列
第一编码的多肽；IgG HC, L1, scFv HCVR2, L2和scFv LCVR2 (SEQ ID NO:1)
第二编码的多肽；IgG HC, L1, scFv HCVR2, L2和scFv LCVR2 (SEQ ID NO:2)
第三编码的多肽；IgG LC (SEQ ID NO:3)
IgG重链(SEQ ID NO:4)
IgG重链可变区1 (HCVR1)(SEQ ID NO:5)
scFv重链可变区2 (HCVR2)(SEQ ID NO:6)
IgG轻链可变区1 (LCVR1)(SEQ ID NO:7)
scFv轻链可变区2 (LCVR2)(SEQ ID NO: 8)
scFv轻链可变区2 (SEQ ID NO:9)
HCDR1 (SEQ ID NO:10)
HCDR2 (SEQ ID NO:11)
HCDR3 (SEQ ID NO:12)
HCDR4 (SEQ ID NO:13)
HCDR5 (SEQ ID NO:14)
HCDR6 (SEQ ID NO:15)
LCDR1 (SEQ ID NO:16)
LCDR2 (SEQ ID NO:17)
LCDR3 (SEQ ID NO:18)
LCDR4 (SEQ ID NO:19)
LCDR5 (SEQ ID NO:20)
LCDR6 (SEQ ID NO:21)
LCDR6 (SEQ ID NO:22)
多肽接头1 (SEQ ID NO:23)
多肽接头2 (SEQ ID NO:24)
FRH1-1 (SEQ ID NO:25)
FRH1-2 (SEQ ID NO:26)
FRH1-3 (SEQ ID NO:27)
FRH1-4 (SEQ ID NO:28)
FRH2-1 (SEQ ID NO:29)
FRH2-2 (SEQ ID NO:30)
FRH2-3 (SEQ ID NO:31)
FRH2-4 (SEQ ID NO:32)
FRL2-1 (SEQ ID NO:33)
FRL2-2 (SEQ ID NO:34)
FRL2-3 (SEQ ID NO:35)
FRL2-4 (SEQ ID NO:36)
FRL1-1 (SEQ ID NO:37)
FRL1-2 (SEQ ID NO:38)
FRL1-3 (SEQ ID NO:39)
FRL1-4 (SEQ ID NO:40)
重链恒定区(SEQ ID NO:41)
轻链恒定区(SEQ ID NO:42)
序列表
<110> Eli Lilly and Company
<120> 抗CGRP/抗IL-23双特异性抗体及其用途
<130> X20879
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 701
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe
50 55 60
Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
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Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
450 455 460
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser
465 470 475 480
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Arg Tyr Val Met His Trp Val
485 490 495
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro
500 505 510
Tyr Asn Asp Gly Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr
515 520 525
Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
530 535 540
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Trp Asp
545 550 555 560
Thr Gly Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
565 570 575
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
580 585 590
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
595 600 605
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Gly
610 615 620
Lys Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Ser Lys Leu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
645 650 655
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
660 665 670
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr
675 680 685
Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 701
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr
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Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe
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Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
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Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
450 455 460
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser
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Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Arg Tyr Val Met His Trp Val
485 490 495
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500 505 510
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Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Trp Asp
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Thr Gly Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
565 570 575
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
580 585 590
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
595 600 605
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Gly
610 615 620
Lys Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Trp Ser Thr
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Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
690 695 700
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Gly Tyr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 4
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe
50 55 60
Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Trp Asp Thr Gly Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Gly Tyr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Gly Lys Phe
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Ser Lys Leu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Gly Lys Phe
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Ser Lys Leu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Trp Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr Trp Met Gln
1 5 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe Ala
1 5 10 15
Asp
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Arg Tyr Val Met His
1 5 10
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Ala Arg Asn Trp Asp Thr Gly Leu
1 5
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Arg Ala Ser Lys Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Tyr Tyr Thr Ser Gly Tyr His Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Lys Ala Ser Asp His Ile Gly Lys Phe Leu Thr
1 5 10
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Tyr Gly Ala Thr Ser Lys Leu Thr
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Gln Thr Tyr Trp Ser Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 25
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys
20
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys
20
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 33
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10
<210> 35
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 37
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10
<210> 39
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 41
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu
325
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (28)

1.包含免疫球蛋白G (IgG)抗体和两个单链可变片段(scFv)的双特异性抗体，其中,
(a) 所述IgG包含两条重链(HC)和两条轻链(LC)，每条HC含有包含重链CDR (HCDR) 1-3的重链可变区(HCVR1)且每条轻链含有包含轻链CDR (LCDR) 1-3的轻链可变区(LCVR1)，其中HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:10，HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:11，HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:12，LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:16，LCDR2的氨基酸序列为SEQID NO:17，且LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:18；且
(b) 每个scFv包含重链可变区(HCVR2)和轻链可变区(LCVR2)，所述HCVR2包含HCDR 4-6，且所述LCVR2包含LCDR 4-6，其中HCDR4的氨基酸序列为SEQ ID NO:13，HCDR5的氨基酸序列为SEQ ID NO:14，HCDR6的氨基酸序列为SEQ ID NO:15，LCDR4的氨基酸序列为SEQ IDNO:19，LCDR5的氨基酸序列为SEQ ID NO:20，且LCDR6的氨基酸序列为SEQ ID NO:21或SEQID NO:22，
其中每个scFv在每个scFv的HCVR2的N末端处经由多肽接头(L1)在每个IgG HC的C末端处连接至所述IgG抗体，
其中每个scFv的HCVR2在HCVR2的C末端处经由第二多肽接头(L2)在相同scFv的LCVR2的N末端处连接至相同scFv的LCVR2，
且其中所述双特异性抗体结合人降钙素基因相关肽(CGRP)和人IL-23的p19亚基。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中LCDR6的氨基酸序列为SEQ ID NO:21。
3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中LCDR6的氨基酸序列为SEQ ID NO:22。
4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中每个HC的HCVR1的氨基酸序列为SEQ IDNO:5，每个LC的LCVR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，每个scFv的HCVR2的氨基酸序列为SEQID NO:6且每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9。
5.根据权利要求4所述的双特异性抗体，其中每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ IDNO:8。
6.根据权利要求4所述的双特异性抗体，其中每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ IDNO:9。
7.根据权利要求1或权利要求4所述的双特异性抗体，其中每个HC的氨基酸序列为SEQID NO:4，每个LC的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，每个scFv的HCVR2的氨基酸序列为SEQ IDNO:6且每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9。
8.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其中每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ IDNO:8。
9.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其中每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ IDNO:9。
10.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其中L1的氨基酸序列为SEQ IDNO:23，且L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24。
11.根据权利要求1、4或7中任一项所述的双特异性抗体，其中每个HC的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，每个LC的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，每个scFv的HCVR2的氨基酸序列为SEQID NO:6，每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，L1的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，且L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24。
12.根据权利要求1、4或7中任一项所述的双特异性抗体，其中每个HC的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，每个LC的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，每个scFv的HCVR2的氨基酸序列为SEQID NO:6，每个scFv的LCVR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，L1的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，且L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24。
13.DNA分子，其包含编码多肽链的多核苷酸序列，所述多肽链包含权利要求1-12中任一项所述的双特异性抗体的HC、scFv、第一多肽接头L1和第二多肽接头L2。
14.根据权利要求13所述的DNA分子，其中编码的多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
15.表达载体，其包含根据权利要求13或权利要求14所述的DNA分子和包含编码多肽链的多核苷酸序列的DNA分子，所述多肽链包含权利要求1-12中任一项所述的双特异性抗体的LC，其中所述LC的氨基酸序列是SEQ ID NO:3。
16.重组宿主细胞，其包含权利要求14所述的DNA分子和包含编码多肽链的多核苷酸序列的DNA分子，所述多肽链包含权利要求1-12中任一项所述的双特异性抗体的LC，其中所述LC的氨基酸序列是SEQ ID NO:3，所述细胞能够表达根据权利要求11或权利要求12所述的双特异性抗体。
17.用于产生根据权利要求11或权利要求12所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 在使得表达所述双特异性抗体的条件下培养权利要求16所述的重组宿主细胞；和
b) 从所述宿主细胞中回收表达的双特异性抗体。
18.通过权利要求17所述的方法产生的双特异性抗体。
19.药物组合物，其包含根据权利要求1-12和18中任一项所述的双特异性抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
20.治疗自身免疫疾病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的根据权利要求1-12和18中任一项所述的双特异性抗体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述自身免疫疾病是炎性肠病。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述炎性肠病是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述自身免疫疾病是银屑病关节炎或强直性脊柱炎。
24.根据权利要求1-12和18中任一项所述的双特异性抗体，其用于疗法中。
25.根据权利要求1-12和18中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗自身免疫疾病。
26.根据权利要求25所用的双特异性抗体，其中所述自身免疫疾病是炎性肠病。
27.根据权利要求26所用的双特异性抗体，其中所述炎性肠病是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
28.根据权利要求25所用的双特异性抗体，其中所述自身免疫疾病是银屑病关节炎或强直性脊柱炎。
CN201580084102.9A 2015-10-30 2015-10-30 抗cgrp /抗il-23双特异性抗体及其用途 Pending CN108135983A (zh)

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