ES2764728T3 - Anticuerpos anti péptido Beta Amiloide N3pGlu y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti Aß N3pGlu que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que LCDR1 es KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 es AVSKLX4S (SEQ ID NO: 52), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) y HCDR1 es GYX5FTX6YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGX7TVY (SEQ ID NO: 54), en el que X1 es S o T; X2 es Q o R, X3 es G o S, X4 es D o G, X5 es D o T, X6 es R o D y X7 es I, T, E o V, para su uso en la prevención de la enfermedad de Alzheimer

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti péptido Beta Amiloide N3pGlu y usos de los mismos

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen selectivamente al péptido Beta Amiloide N3pGlu y a su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el péptido Beta Amiloide (Ap, también denominado Abeta). El péptido Ap en forma circulante se compone de 38-43 aminoácidos (principalmente 38, 40 o 42 aminoácidos) que resultan de la escisión de una proteína precursora, la proteína precursora amiloide (APP). La conversión de Ap de formas solubles a insolubles que tienen un alto contenido de lámina p y la deposición de estas formas insolubles como placas neuríticas y cerebrovasculares en el cerebro, se han asociado a una serie de afecciones y enfermedades, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (EA), el síndrome de Down y la angiopatía amiloide cerebral (AAC).

Los depósitos encontrados en las placas están compuestos principalmente por una mezcla heterogénea de péptidos Ap. Ap N3pGlu, también denominado N3pE o App3-42, es una forma truncada del péptido Ap encontrado solo en placas. Ap N3pGlu carece de los dos primeros restos de aminoácido del extremo N-terminal de Ap y tiene un piroglutamato que procede del ácido glutámico en la tercera posición de aminoácido. Aunque el péptido Ap N3pGlu es un componente minoritario del Ap depositado en el cerebro, los estudios han demostrado que el péptido Ap N3pGlu tiene propiedades de agregación agresivas y se acumula temprano en la cascada de deposición.

Aunque se han descrito previamente anticuerpos policlonales y monoclonales que se dirigen al péptido Ap N3pGlu (documentos US 7.122.374 y WO2010/009987), todavía existe una necesidad de anticuerpos monoclonales anti Ap N3pGlu de alta afinidad para acoplarse a la diana in vivo (es decir, unión a la placa) y, posteriormente, reducir los niveles de placa. Además, dado que los anticuerpos anti Ap carboxilo terminales y amino terminales conducen a un aumento de microhemorragia relacionada con la angiopatía amiloide cerebral (AAC), existe la necesidad de anticuerpos anti Ap N3pGlu que no den lugar a un aumento de la microhemorragia aunque el tratamiento crónico de como resultado una reducción significativa de la placa depositada.

La materia objeto de la invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Los anticuerpos dentro del ámbito de la presente invención son antagonistas del péptido Ap N3pGlu terapéuticamente útiles que poseen varias propiedades deseables. Los presentes anticuerpos se unen al péptido Ap N3pGlu humano con alta afinidad y muestran un descenso de la placa in vivo dependiente de la dosis sin un aumento de microhemorragia relacionada con la angiopatía amiloide cerebral (AAC).

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR) en el que LCDRI es KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 es AVSKLX4S (SEQ ID NO: 52), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) y HCDR1 es GYX5FTX6YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGX7TVY (SEQ ID NO: 54), en el que X1 es S o T; X2 es Q o R, X3 es G o S, X4 es D o G, X5 es D o T, X6 es R o D y X7 es I, T, E o V, para su uso en la prevención de la enfermedad de Alzheimer.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que LCDRI es KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 es AVSKLX4S (SEQ ID NO: 52), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) y HCDR1 es GYX5FTX6YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), y HCDR3 es EGX7TVY (SEQ ID NO: 54), en el que X1 es S o T; X2 es Q o R, X3 es G o S, X4 es D o G, X5 es D o T, X6 es R o D y X7 es I, T, E o V, para su uso en la prevención de una afección seleccionada de enfermedad de Alzheimer preclínica o clínica, enfermedad de Alzheimer prodrómica y AAC clínica o preclínica.

Preferentemente el anticuerpo anti Ap N3pGlu humano o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente invención comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que dicha LCVR comprende los polipéptidos Lc Dr I, LCDR2, LCDR3 y la HCVR comprende los polipéptidos HCDR1, HCDR2, HCDR3 que se seleccionan del grupo que consiste en:

a) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYDFTRYYIN (SEQ ID NO: 6), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGITVY (SEQ ID NO: 9);

b) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGTTVY (SEQ ID NO: 10);

c) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGETVY (SEQ ID NO: 41);

d) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLGS (SEQ ID NO: 35), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGTTVY (SEQ ID NO: 10); o

e) LCDR1 es KSTRSLLYSRSKTYLN (SEQ ID NO: 45), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGVTVY (SEQ ID NO: 46).

Un aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una Kd a 25 °C de menos de 1 x 10^-9 M para el péptido Ap N3pGlu humano. En una realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una Kd a 25 °C de menos de 9 x 10^-10 M para el péptido Ap N3pGlu humano. En otra realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una Kd a 25 °C de menos de 7 x 10^-10 M para el péptido Ap N3pGlu humano. En otra realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una Kd a 25 °C entre 9 x 10^-10 M y 1 x 10^-10 M para el péptido Ap N3pGlu humano. En otra realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una Kd a 25 °C entre 9 x 10^-10 M y 1 x 10^-10 M para el péptido Ap N3pGlu humano.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una Kd a 25 °C de menos de 1 x 10^-9 M o de menos de 9 x 10^-10 M o de menos de 7 x 10^-10 M o entre 9 x 10^-10 M y 1 x 10^-10 M para el péptido Ap N3pGlu humano y reduce la placa in vivo. En una realización preferida adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una Kd a 25 °C de menos de 1 x 10^-9 M o menos de 9 x 10^-10 M o de menos de 7 x 10^-10 M o entre 9 x 10^-10 M y 1 x 10^-10 M para el péptido Ap N3pGlu humano y reduce la placa in vivo sin aumentar la microhemorragia relacionada con AAC.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es KSX¹X²SLLYSRX³KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 es AVSKLX⁴S (SEQ ID NO: 52), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) y HCDR1 es GYX⁵FTX⁶YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGX⁷TVY (SEQ ID NO: 54), en el que X¹ es S o T; X² es Q o R, X³ es G o S, X⁴ es D o G, X⁵ es D o T, X^a es R o D y X⁷ es I, T, E o V.

Un aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que dicha LCVR comprende los polipéptidos LCDR1, LCDR2, LCDR3 y la HCVR comprende los polipéptidos HCDR1, HCDR2, HCDR3 que se seleccionan del grupo que consiste en:

a) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYDFTRYYIN (SEQ ID NO: 6), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGITVY (SEQ ID NO: 9);

b) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGTTVY (SEQ ID NO: 10);

c) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGETVY (SEQ ID NO: 41);

d) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLGS (SEQ ID NO: 35), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGTTVY (SEQ ID NO: 10); y

e) LCDR1 es KSTRSLLYSRSKTYLN (SEQ ID NO: 45), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGVTVY (SEQ ID NO: 46).

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 3, LCDR2 es la SEQ ID NO: 4, LCDR3 es la SEQ ID NO: 5, HCDR1 es la SEQ ID NO: 6, HCDR2 es la SEQ ID NO: 8 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 9. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 3, LCDR2 es la SEQ ID NO: 4, LCDR3 es la SEQ ID NO: 5, HCDR1 es la SEQ ID NO: 7, HCDR2 es la SEQ ID NO: 8 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 10. En una realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 3, LCDR2 es la SEQ ID NO: 4, LCDR3 es la SEQ ID NO: 5, HCDR1 es la SEQ ID NO: 40, HCDR2 es la SEQ ID NO: 8 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 41. En una realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 3, LCDR2 es la SEQ ID NO: 35, LCDR3 es la SEQ ID NO: 5, HCDR1 es la SEQ ID NO: 7, HCDR2 es la SEQ ID NO: 8 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 10. En una realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR y una HCVR, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 45, LCDR2 es la SEQ ID NO: 4, LCDR3 es la SEQ ID NO: 5, HCDR1 es la SEQ ID NO: 40, HCDR2 es la SEQ ID NO: 8 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 46.

En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti Ap N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que dichas LCVR y HCVR son polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en:

a. LCVR de SEQ ID NO: 11 y HCVR de SEQ ID NO: 12;

b. LCVR de SEQ ID NO: 11 y HCVR de SEQ ID NO: 13;

c. LCVR de SEQ ID NO: 11 y HCVR de SEQ ID NO: 42;

d. LCVR de SEQ ID NO: 36 y HCVR de SEQ ID NO: 37; y

e. LCVR de SEQ ID NO: 47 y HCVR de SEQ ID NO: 48.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR de SEQ ID NO: 11 y una HCVR de SEQ ID NO: 12. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR de SEQ ID NO: 11 y una ^{h C v R} de SEQ ID NO: 13. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR de SEQ ID NO: 11 y una ^{h C v R} de SEQ ID NO: 42. En una realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR de SEQ ID NO: 36 y una HCVR de SEQ ID NO: 37. En una realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR de SEQ ID NO: 47 y una HCVR de SEQ ID NO: 48.

La presente invención también proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en el que los polipéptidos de LC y HC son seleccionados del grupo que consiste en:

y

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LC de SEQ ID NO: 14 y una HC de SEQ ID NO: 15. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LC de SEQ ID NO: 14 y una HC de SEQ ID NO: 16. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LC de SEQ ID NO: 14 y una HC de SEQ ID NO: 44. En una realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LC de SEQ ID NO: 38 y una HC de SEQ ID NO: 39. En una realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LC de SEQ ID ^{n O :} 49 y una HC de ^{S e Q} ID ^{N o :} 50.

En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que cada LC es el polipéptido de SEQ ID NO: 14 y cada HC es el polipéptido de ^{s E q} ID NO: 15. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que cada LC es el polipéptido de SEQ ID NO: 14 y cada HC es el polipéptido de SEQ ID NO: 16. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que cada LC es el polipéptido de SEQ ID NO: 14 y cada HC es el polipéptido de SEQ ID NO: 44. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que cada LC es el polipéptido de SEQ ID NO: 38 y cada HC es el polipéptido de SEQ ID NO: 39. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que cada LC es el polipéptido de SEQ ID NO: 49 y cada HC es el polipéptido de SEQ ID NO: 50.

Según un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu de la presente invención o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu de la presente invención o fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida, la composición farmacéutica comprende adicionalmente uno o más ingredientes terapéuticos.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar una afección asociada con la actividad del péptido Ap, que comprende administrar a un paciente humano que lo necesita un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno de la presente invención.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar una afección seleccionada de un grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer preclínica o clínica, enfermedad de Alzheimer prodrómica, síndrome de Down y AAC preclínica o clínica, que comprende administrar a un ser humano que lo necesite un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu de la presente invención o fragmento de unión a antígeno del mismo. En un aspecto preferido, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar la enfermedad de Alzheimer. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en terapia. En una realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una afección seleccionada de enfermedad de Alzheimer preclínica o clínica, enfermedad de Alzheimer prodrómica, síndrome de Down o AAC preclínica o clínica. En una realización más preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. En otra realización preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso en la prevención de una afección seleccionada de enfermedad de Alzheimer preclínica o clínica, enfermedad de Alzheimer prodrómica, AAC preclínica o clínica. En una realización más preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso en la prevención de la enfermedad de Alzheimer.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un uso de un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección seleccionada de un grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer preclínica o clínica, enfermedad de Alzheimer prodrómica, síndrome de Down y AAC preclínica o clínica. En una realización preferida, la presente invención proporciona un uso de un anticuerpo monoclonal anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo , en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Un anticuerpo de longitud completa es un molécula de inmunoglobulina que comprende 2 cadenas pesadas (H) y 2 cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100-110 aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento del antígeno a través de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) contenidas en la misma. La porción carboxilo terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las CDR se entremezclan con regiones que están conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada región variable de cadena ligera (LCVR) y región variable de cadena pesada (HCVR) se compone de 3 CDR y 4 FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las 3 CDR de cadena ligera se denominan "LCDR1, LCDR2 y LCDR3" y las 3 CDR de cadena pesada se denominan "HCDR1, HCDR2 y HCDR3". Las CDR contienen la mayoría de los restos que forman interacciones específicas con el antígeno. La numeración y posicionamiento de los restos de aminoácido de CDR dentro de las regiones LCVR y HCVR están de acuerdo con la convención de numeración de Kabat bien conocida.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda y se caracterizan por una región constante particular como se conoce en la técnica. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon y definen el isotipo de un anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Los anticuerpos IgG se pueden dividir además en subclases, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Cada tipo de cadena pesada se caracteriza por una región constante particular con una secuencia bien conocida en la técnica.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" (Mab) se refiere a un anticuerpo que procede o se aísla de una única copia o clon que incluye, por ejemplo, cualquier eucariota, procariota o clon de fago y no al procedimiento mediante el cual se produce. Los Mab de la presente invención existen, preferentemente, en una población sustancialmente homogénea u homogénea. Los Mab completos contienen 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras. La frase "fragmento de unión a antígeno" incluye, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fv de cadena simple. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención y fragmentos de unión a antígeno de los mismos se pueden producir, por ejemplo, mediante tecnologías recombinantes, tecnologías de expresión en fagos, tecnologías sintéticas, por ejemplo, injerto de CDR o combinaciones de dichas tecnologías u otras tecnologías conocidas en la técnica. Por ejemplo, se pueden inmunizar ratones con anti Ap N3pGlu humano o fragmentos del mismo, los anticuerpos resultantes se pueden recuperar y purificar y, se puede evaluar la determinación de si poseen propiedades de unión y funcionales similares o iguales a los compuestos de anticuerpos desvelados en el presente documento mediante los procedimientos desvelados esencialmente como se describe en los ejemplos a continuación. Los fragmentos de unión a antígeno también se pueden preparar mediante procedimientos convencionales. Los procedimientos para producir y purificar anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, capítulos 5-8 y 15, ISBN 0-87969-314-2.

La frase "anticuerpos humanos diseñados mediante ingeniería genética" se refiere a anticuerpos monoclonales que tienen propiedades funcionales y de unión de acuerdo con la invención y que tienen regiones marco que son sustancialmente humanas o totalmente humanas que circundan CDR derivadas de un anticuerpo no humano. Los "fragmentos de unión a antígeno" de dichos anticuerpos humanos diseñados mediante ingeniería genética incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fv de cadena simple. La "región marco" o "secuencia marco" se refiere a una cualquiera de las regiones marco 1 a 4. Los anticuerpos humanos diseñados mediante ingeniería genética y fragmentos de unión a antígeno de los mismos englobados por la presente invención incluyen moléculas en las que una cualquiera o más de las regiones marco 1 a 4 es sustancialmente o totalmente humana, es decir, en las que está presente cualquiera de las combinaciones posibles de regiones marco individuales sustancialmente o totalmente humanas 1 a 4. Por ejemplo, esto incluye moléculas en las que la región marco 1 y la región marco 2, la región marco 1 y la región marco 3, la región marco 1, 2 y 3, etc., son sustancialmente o totalmente humanas. Son marcos sustancialmente humanos aquellos que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia con una secuencia marco de línea germinal humana conocida. Preferentemente, los marcos sustancialmente humanos tienen al menos aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia marco de línea germinal humana conocida.

Son marcos totalmente humanos aquellos que son idénticos a una secuencia marco de línea germinal humana conocida. Las secuencias marco de línea germinal humana se pueden obtener de ImMunoGeneTics (IMGT) a través de su página web http://imgt.cines.fr o de The Immunoglobulin FactsBook por Marie-Paule Lefranc y Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por ejemplo, pueden seleccionarse marcos de cadena ligera de línea germinal del grupo que consiste en: Al1, A17, A18, A19, A20, A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, 012, O2 y O8 y se pueden seleccionar regiones marco de cadena pesada de línea germinal del grupo que consiste en: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 y VH5-5I.

Usando varios procedimientos diferentes, pueden generarse anticuerpos humanos diseñados mediante ingeniería genética además de los desvelados en el presente documento, que exhiben propiedades funcionales similares según la presente invención,. Los compuestos de anticuerpos específicos desvelados en el presente documento se pueden usar como compuestos de anticuerpos parentales o moldes para preparar compuestos de anticuerpos adicionales. En un enfoque, las CDR del compuesto de anticuerpo parental se injertan en un marco humano que tiene una alta identidad de secuencia con el marco del compuesto de anticuerpo parental. La identidad de secuencia del nuevo marco será, generalmente, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia del marco correspondiente en el compuesto de anticuerpo parental. Este injerto puede dar como resultado una disminución en la afinidad de unión en comparación con la del anticuerpo parental. Si este es el caso, el marco se puede retromutar al marco parental en ciertas posiciones basándose en criterios específicos desvelados por Queen y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Otras referencias que describen procedimientos útiles para humanizar anticuerpos de ratón incluyen las patentes de Estados Unidos N.° 4.816.397; 5.225.539 y 5.693.761; los programas informáticos ABMOD y ENCAD descritos en Levitt (1983) J. Mol. Biol.

168:595-620; y el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann y col. (1988) Nature 332:323-327; y Verhoeyen y col. (1988) Science 239:1534-1536.

La identificación de restos a considerar para una retromutación se puede llevar a cabo de la siguiente manera: Cuando un aminoácido cae en la siguiente categoría, el aminoácido marco de la secuencia de línea germinal humana que se usa (el "marco aceptor") se reemplaza por un aminoácido marco de un marco del compuesto de anticuerpo parental (el "marco donante"):

(a) el aminoácido en la región marco humana del marco aceptor es inusual para marcos humanos en esa posición, mientras que el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante es típica para marcos humanos en esa posición;

(b) la posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CDR; o

(c) cualquier átomo de la cadena lateral de un aminoácido marco está dentro de aproximadamente 5-6 angstroms (centro a centro) de cualquier átomo de un aminoácido de CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional.

Cuando cada uno de los aminoácidos en la región marco humana del marco aceptor y un aminoácido correspondiente en el marco donante es, generalmente, inusual para marcos humanos en esa posición, dicho aminoácido se puede reemplazar por un aminoácido típico para marcos humanos en esa posición. Este criterio de retromutación permite recuperar la actividad del compuesto de anticuerpo parental.

Otro enfoque para generar anticuerpos humanos diseñados mediante ingeniería genética que exhiben propiedades funcionales similares a los compuestos de anticuerpos desvelados en el presente documento implica mutar aleatoriamente aminoácidos dentro de las CDR injertadas sin cambiar el marco y cribando las moléculas resultantes con respecto a la afinidad de unión y otras propiedades funcionales que sean tan buenas o mejores que aquellas de los compuestos de anticuerpos parentales. También se pueden introducir mutaciones sencillas en cada posición de aminoácido dentro de cada CDR, seguido de la evaluación de los efectos de dichas mutaciones en la afinidad de unión y otras propiedades funcionales. Se pueden combinar mutaciones sencillas que producen propiedades mejoradas para evaluar sus efectos en combinación entre sí.

Además, es posible una combinación de ambos enfoques anteriores. Después del injerto de CDR, se pueden retromutar regiones marco específicas además de introducir cambios de aminoácidos en las CDR. Este procedimiento se describe en Wu y col. (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162.

Aplicando las enseñanzas de la presente invención, una persona experta en la materia puede usar técnicas comunes, por ejemplo, mutagénesis dirigida, para sustituir aminoácidos dentro de las secuencias marco y CDR desveladas en el presente documento y, de este modo, generar secuencias de aminoácidos de la región variable adicionales derivadas de las presentes secuencias. Todos los aminoácidos alternativos de origen natural se pueden introducir en un sitio de sustitución específico. Los procedimientos desvelados en el presente documento se pueden utilizar luego para cribar estas secuencias de aminoácidos de la región variable adicionales para identificar secuencias que tienen las funciones in vivo indicadas. De este modo, se pueden identificar secuencias adicionales adecuadas para preparar anticuerpos humanos diseñados mediante ingeniería genética y porciones de unión a antígeno de los mismos según la presente invención. Preferentemente, la sustitución de aminoácidos dentro de los marcos se restringe a una, dos o tres posiciones dentro de una cualquiera o más de las 4 regiones marco de cadena ligera y/o cadena pesada desveladas en el presente documento. Preferentemente, la sustitución de aminoácidos dentro de las CDR se restringe a una, dos o tres posiciones dentro de una cualquiera o más de las 3 CDR de cadena ligera y/o cadena pesada. También son posibles combinaciones de los diversos cambios dentro de estas regiones marco y CDR descritas anteriormente.

El término "tratamiento" (o "tratar") se refiere a los procedimientos que implican una ralentización, interrupción, detención, control, paralización, reducción o inversión de la progresión o gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad existente, pero no necesariamente implica una eliminación total de todos los síntomas, afecciones o trastornos relacionados con enfermedades asociadas con el anticuerpo anti Ap N3pGlu.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar como medicamentos en medicina humana, administrados mediante una diversidad de rutas. Lo más preferentemente, tales composiciones son para administración parenteral. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed. (1995), A. Gennaro y col., Mack Publishing Co.) y comprenden un anticuerpo como el desvelado en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los resultados de los ensayos siguientes demuestran que los anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención son útiles para el tratamiento de una afección asociada con la actividad del péptido Ap tal como la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down y AAC.

Ejemplo1:Produccióndeanticuerpos

Generación inicial de anticuerpos: Se inmunizan ratones transgénicos FVB con el péptido amiloide p 3-42 humano modificado con piroglutamato y truncado en el extremo N terminal (N3pGlu) pretratado a 37 °C durante la noche para formar un agregado. Se cosechan células de bazo de los ratones y se reduce el número de células B reactivas frente a Ap1-40 mediante MACS. Se clasifican las células restantes para unirse al péptido Ap N3pGlu agregado. Se aísla ARN de las células B seleccionadas y se convierte en ADNc usando oligo dT. Se obtienen regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo mediante PCR usando cebadores de secuencia señal de anticuerpo y se clonan en vector de fago mediante mutagénesis de Kunkel para fabricar la biblioteca de Fab. La biblioteca de Fab se criba con respecto a la unión al péptido Ap N3pGlu agregado mediante ELISA de un solo punto (SPE) y se somete a contra-cribado frente a Ap1-4o. Se caracterizan los clones positivos mediante secuenciación de ADN, expresión de fab y unión al péptido Ap N3pGlu y falta de unión al péptido Ap1-42 o Ap1-40 soluble.

Se construyen y criban bibliotecas mutantes de aminoácidos sencillos mediante SPE para unirse al péptido Ap N3pGlu agregado, pero no al Ap1-42. Se combinan mutaciones beneficiosas en bibliotecas combinatorias. Se seleccionan y se convierten las variantes combinatorias optimizadas para la afinidad en IgG1 de ratón para la medición de la afinidad mediante BIACORE® y la unión a la placa Ap mediante inmunohistoquímica. A partir de un clon identificado, se fabrica la proteína mAb en isotipos IgG1 (mE8) e IgG2a (mE8c) de ratón para estudios de eficacia in vivo. mE8 no se une a la secuencia Ap N3pGlu de ratón (mpE3-16) o Ap1-42 humana.

Se utilizan marcos de línea germinal humana VH1-69/JH6 y Vk-A18/JK2 para la humanización inicial. Se injertan CDR del anticuerpo mE8 (con cuatro mutaciones de afinidad) en los marcos humanos, obteniéndose el anticuerpo hE8-C6. Se lleva a cabo una optimización de afinidad adicional en la cadena principal de hE8-C6 y se combinan mutaciones beneficiosas para obtener la variante humanizada de alta afinidad r 5, R17, R24 y 2420.

Segunda ronda de optimización para mejorar la capacidad de desarrollo de fármacos: Dos variantes humanizadas, hE8-C6 y R17, se eligen como cadena principal para una segunda ronda de optimización para mejorar la vida media del suero del anticuerpo mediante la disminución de la unión no específica a células y para aumentar la afinidad del anticuerpo al péptido Ap N3pGlu soluble. Se sintetiza un péptido soluble biotinilado que consiste en el aminoácido 14 del extremo N terminal de Ap N3pGlu (pE3-16B) y se evalúa si es equivalente al péptido Ap N3pGlu para la unión al anticuerpo mE8. Se desarrolla un ensayo de elevación de filtro de alto rendimiento utilizando pE3-16B y se aplica a todos los cribados posteriores de la biblioteca. Se confirman todos los aciertos del cribado de elevación de filtro mediante la unión a Ap N3pGlu agregado.

Se criban de nuevo bibliotecas de variantes de hE8-C6 usando el ensayo de elevación de filtro y se identifica un conjunto de mutaciones beneficiosas. Se utiliza un subconjunto de éstas para fabricar la biblioteca combinatoria. Se seleccionan cuatro variantes combi (CoII-E10, CoII-G2, CoII-G8 y CoII-E2) de este enfoque.

Se emplea modelado por ordenador para crear modelos estructurales de la región V de hE8-C6, R17, R24 y otras variantes. El análisis de modelo estructural identifica cargas positivas introducidas para la agrupación de optimización de afinidad en el sitio de unión, una causa potencial de unión no específica de anticuerpos a células. Basándose en el modelado, se seleccionan varias posiciones para introducir cambios para equilibrar el potencial electrostático de la superficie. Se sintetiza una biblioteca combinatoria mediante la combinación de algunas mutaciones beneficiosas del cribado de bibliotecas y los cambios definidos mediante modelado estructural. Se seleccionan tres variantes (R17m-B4, R17m-A12 y Rl7m-B12) de este esfuerzo para estudios adicionales.

El análisis de modelo estructural también descubre un choque estérico entre el resto de marco de cadena ligera Y36 y los restos en la CDR3 de cadena pesada. La mutación Y36L se introduce en la cadena ligera de hE8-C6 para producir la variante hE8L. Se encuentra que este cambio de marco solo tiene un impacto significativo tanto en el aumento de la afinidad del anticuerpo como en la reducción de la unión celular no específica.

El otro esfuerzo fue probar un marco humano diferente para la humanización. Se injertan CDR del anticuerpo mE8 en los marcos VH5-5l/VKO2 y VH3-23/VKA2. Se determina que el Fab humanizado con VH5-51/VKO2 (hE8-5102) es equivalente, si no mejor, que hE8-C6 en la unión de Ap N3pGlu. La introducción de mutaciones beneficiosas adicionales en hE8-51O2 genera variantes combi CI-A1, CI-B6, CI-C7 y CI-B8.

Después de pasar todos los ensayos in vitro, incluyendo ELISA y BIACORE® para especificidad y afinidad por antígenos, unión celular no específica y tinción de IHC, se seleccionan cinco variantes de los mAb, B12L, CI-C7, hE8L, R17L y R17.

Se pueden fabricar y purificar anticuerpos esencialmente de la siguiente manera. Una célula hospedadora apropiada, tal como h Ek 293 EBNA o CHO, se transfecta de forma estable o transitoria con un sistema de expresión para secretar anticuerpos usando una relación de vector HC:LC óptima predeterminada o un sistema de vector único que codifica tanto HC, tal como la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 43 y LC, tal como la SEQ ID NO: 55. El medio clarificado, en el que el anticuerpo se ha secretado, se purifica usando cualquiera de las numerosas técnicas utilizadas comúnmente. Por ejemplo, el medio puede aplicarse convenientemente a una columna de Sepharose FF con proteína A o G que se ha equilibrado con un tampón compatible, tal como tampón fosfato salino (pH 7,4). Se lava la columna para eliminar componentes de unión no específicos. Se eluye el anticuerpo unido, por ejemplo, mediante gradiente de pH (tal como tampón fosfato de sodio 0,1 M pH 6,8 a tampón citrato de sodio 0,1 M pH 2,5). Se detectan fracciones de anticuerpo, tal como por SDS-PAGE, y luego se combinan. La purificación adicional es opcional, dependiendo del uso previsto. El anticuerpo se puede concentrar y/o filtrar de forma estéril usando técnicas comunes. Se pueden eliminar eficazmente los multímeros y agregados solubles mediante técnicas comunes, que incluyen cromatografía de hidroxiapatita, de intercambio iónico, de interacción hidrófoba o de exclusión por tamaño. La pureza del anticuerpo después de estas fases de cromatografía es mayor que 99 %. El producto se puede congelar inmediatamente a -70 °C o se puede liofilizar. Las secuencias de aminoácidos para estos anticuerpos de la presente invención se proporcionan a continuación.

Tabla1-SEQIDNOdeanticuerpos

Ejemplo2:Afinidaddeunióna N3pGlusoluble

Se usa resonancia de plasmón superficial medida con el instrumento BIACORE® 2000 para medir la unión de Ap N3pGlu a anticuerpos anti N3pGlu. Salvo que se indique lo contrario, todos los reactivos y materiales son de BIACORE® AB (Uppsala, Suecia). Todas las mediciones se realizan a 25 °C. Se disuelven las muestras en tampón HBS-EP (cloruro de sodio 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P-20 al 0,005 % (p/v) y HEPES 10 mM, pH 7,4).

Se sintetiza una serie de péptidos Abeta con cambios posicionales (mutantes de glicina) para evaluar el impacto de un resto dado sobre la unión a anticuerpo y, por lo tanto, identificar las características y la secuencia requeridas para el reconocimiento del anticuerpo:

Nombre del péptido Secuencia Abeta 3-16

pE3-16 Pir-EFRHDSGYEVHHQK-biotina SEQ ID NO: 25

E3-16 EFRHDSGYEVHHQK-biotina SEQ ID NO: 26

pEG4 Pir-EGRHDSGYEVHHQK-biotina SEQ ID NO: 27

mpE3-16 Pir-EFGHDSGFEVHHQK-biotina (roedor) SEQ ID NO: 28

pEG6 Pir-EFRGDSGYEVHHQK-biotina SEQ ID NO: 29

pEG7 Pir-EFRHGSGYEVHHQK-biotina SEQ ID NO: 30

pEG8 Pir-EFRHDGGYEVHHQK-biotina SEQ ID NO: 37

pEF10 Pir-EFRHDSGFEVHHQK-biotina SEQ ID NO: 39

La importancia de una forma modificada y truncada (des 1,2) de ácido glutámico (3 pir-E o 3 pir-Glu) se evalúa mediante la comparación de la unión Ap 1-42 frente a Ap 3-16 frente a pE3-16 (SEQ ID NO: 1 frente a SEQ ID NO: 26 frente a SEQ ID NO: 25 respectivamente). Se disuelven los péptidos en PBS a 5 mg/ml antes de la dilución para experimentos de unión.

Se evalúa la unión usando ciclos analíticos múltiples de captura de anticuerpos, asociación/inyección de péptidos, flujo de tampón prolongado para disociación y regeneración de superficie. Para la fase de captura de anticuerpo, dependiendo del tipo de anticuerpo a capturar, se inmoviliza una micromatriz CM5 con proteína A o Fc de cabra anti ratón. Excepto para anticuerpos de ratón, cada ciclo consiste en: inyección de ~5-7 j l de anticuerpo anti N3pGlu 10 |jg/ml a 5 jl/min (aplicación de captura 3.000 RU), inyección de 100 j l de péptido a 50 jl/min (1000 nM - 62,5 nM en diluciones seriadas a la mitad para cada ciclo), seguido de 10 minutos para la disociación. Para un anticuerpo de ratón, la velocidad de flujo es 50 jl/min y se inyectan 20 j l de anticuerpo de ratón a 50 jg/ml. En ambos casos, se regenera la superficie de la micromatriz usando 20 j l de hidrocloruro de glicina 10 mM, pH 1,5. Luego se obtiene la afinidad de unión (K^d) a partir de la tasa de disociación y asociación para cada ciclo usando un modelo de unión 1:1 en el software de análisis BIAevaluation. Los anticuerpos anti N3pGlu, B12L y R17L y el anticuerpo de ratón precursor (mE8C) reconocen Ap N3pGlu^ específicamente, con una K^d menor de 1 nM. Los anticuerpos anti N3pGlu, B12L y R17L y el anticuerpo de ratón precursor (mE8C) también se unen a pE3-16 con afinidad similar, indicando que el epítopo se localiza dentro de esta región de los péptidos. El análisis de unión de anticuerpos a péptidos mutantes de glicina muestra que los restos críticos para la unión eran de 3 a 7: piroE en posición 3, F en posición 4, R en posición 5, H en posición 6, D en posición 7. No se detecta unión detectable a Apn-i-40 para los anticuerpos de la presente invención.

Ejemplo3:Afinidaddeunióna N3pGluagregado

También se realizan experimentos con BIACORE® para controlar la unión de anticuerpos anti N3pGlu a Ap N3pGlu agregado. En este experimento, se inmoviliza el péptido Ap N3pGlu a diferentes densidades en celdas de flujo 2 (densidad baja, LD), 3 (densidad media, MD) y 4 (densidad alta, HD) en una micromatriz CM-5 a través de la química de acoplamiento de amina. Se inmovilizan diferentes niveles de péptido Ap N3pGlu para examinar el impacto de la densidad de superficie en la unión a anticuerpos anti N3pGlu. Tras la inmovilización, la mayor parte de N3pGlu se agrega en la superficie, como lo demuestra la falta de la unión a un Mab de control que solo reconoce el péptido monomérico. Esta forma agregada del péptido simula la propiedad del péptido abeta agregado en forma de amiloide o fibrilla, en el que la región N terminal de los péptidos está expuesta y se puede establecer como diana con anticuerpos.

La unión se evalúa usando múltiples ciclos analíticos a 25 °C. Cada ciclo se realiza a un caudal de 50 jl/min y consiste en las siguientes fases: inyección de 250 j l de solución de anticuerpo N3pGlu (comenzando a 500 nM y utilizando diluciones seriadas a la mitad para cada ciclo) seguido de 20 minutos para la disociación y regeneración usando ~30 j l de hidrocloruro de glicina 10 mM, pH 1,5. La tasa de asociación y disociación para cada ciclo se evalúan usando un modelo de ligando heterogéneo en el software BIAevaluation. Como el modelo de unión 1: 1 no se ajusta a los datos, el ajuste heterogéneo produce dos afinidades de unión (una afinidad baja y una alta). Los anticuerpos R17L y B12L y el anticuerpo mE8c murino precursor se unen al Ap N3pGlu agregado con alta afinidad K^d,1 <100 pM y una menor afinidad K^d,2 <10 nM. La señal de unión máxima (Rmax) se calculó como la suma de Rmax de la unión de alta y baja afinidad. Se muestra que Rmax aumenta a medida que aumenta la densidad del péptido en la superficie, como se esperaba ya que hay más sitios de unión disponibles en una superficie de mayor densidad. Estos estudios de unión demuestran que los anticuerpos de la presente invención se unen al Ap N3pGlu agregado.

Ejemplo4:EstudiosdeacoplamientoconladianaExVivo

Se realizan análisis inmunohistoquímicos con anticuerpos Ap añadidos exógenamente con el fin de determinar el acoplamiento con la diana ex vivo en secciones cerebrales de un cerebro PDAPP fijado (de 24 meses de edad). Se ha demostrado que el ratón transgénico PDAPP desarrolla gran parte de la patología asociada con la enfermedad de Alzheimer. Para anticuerpos murinos, se usó una etiqueta de biotina como marcador ya que este experimento se realizó en tejido murino y, por lo tanto, no es apropiada una comparación directa entre los anticuerpos anti N3pGlu no murinos no biotinilados. El anticuerpo 3D6 N terminal (1-5) biotinilado marca fuertemente cantidades significativas de Ap depositado en el hipocampo de PDAPP, mientras que el mE8 biotinilado marca solo un subconjunto de depósitos. A diferencia del cerebro humano con EA, la inmensa mayoría de Ap depositado en el cerebro de PDAPP es de longitud completa. Se observa un marcado de placa similar para los anticuerpos anti N3pGlu no biotinilados, tales como B12L y R17L (en comparación con el mE8). No se observa un marcado de placa específico para IgG de control humanas ni de ratón. Debido a que la composición y la estructura probable del Ap depositado es radicalmente diferente en el cerebro EA, se investigan los anticuerpos anti N3pGlu no biotinilados (3 ug/ml) para determinar si se unen a Ap depositados en secciones cerebrales de un cerebro EA recién congelado. El anticuerpo de control positivo (3D6 biotinilado) marca intensamente muchas placas Ap en el cerebro EA, mientras que los anticuerpos de control negativos (IgG humano y murino) carecen de cualquier unión apreciable. Varios de los anticuerpos anti N3pGlu no biotinilados tales como B12L y R17L se unen de forma similar a los Ap depositados. Estos estudios histológicos demuestran que los anticuerpos anti N3pGlu de la presente invención pueden acoplarse a la diana de Ap depositada ex vivo.

Ejemplo5:Estudiosdeacoplamientoconladianain vivo

Se mide la capacidad de los anticuerpos anti N3pGlu para acoplarse con la diana depositada in vivo. Se realiza un estudio subcrónico de 4 semanas con anticuerpos murinos biotinilados 3D6 y mE8c a 40 mg/kg administrados por vía intraperitoneal (IP) semanalmente. Se recogen los cerebros al término del experimento y el nivel de acoplamiento con la diana se determina mediante examen histológico del cerebro. Los animales inyectados con el 3D6 biotinilado tienen un marcado de placa solo a lo largo de la fisura del hipocampo, mientras que los ratones inyectados con mE8c biotinilado expresan un marcado de placas fuerte en el hipocampo y las regiones corticales. Se observan patrones de acoplamiento con la diana muy similares en un ensayo de 3 días más agudo (tinción de fisura de hipocampo 3D6 y marcaje de mE8 en hipocampo y regiones corticales). Estos resultados sugieren fuertemente que el anticuerpo 3D6, que se une tanto a Ap soluble como insoluble, se satura con Ap soluble y, por lo tanto, no puede acoplarse con la diana depositada deseada. En marcado contraste, el anticuerpo murino anti N3pGlu mE8c se acopla consistentemente con la diana prevista en ambas regiones críticas del cerebro. Se evalúan dosis altas y bajas de los anticuerpos anti N3pGlu R17L y B12L en un estudio in vivo de 3 días similar. Se inyectan los anticuerpos IP a 10 mg/kg (dosis baja) o 40 mg/kg (dosis alta). Al final del estudio, se recogen el plasma y los cerebros y se determina la PK del plasma. Se seccionan los cerebros y se realiza la inmunohistoquímica en secciones hermanas con un anticuerpo antihumano (para detectar el anticuerpo anti N3pGlu unido) y 3D6 (para detectar la cantidad total de diana depositada en la sección). A fin de una mejor cuantificación del nivel acoplamiento con la diana in vivo, el porcentaje de área unida por el anticuerpo anti N3pGlu se normaliza frente al % de área total de posible diana (Ap depositado total visualizado mediante inmunohistoquímica 3D6 exógena). Adicionalmente, el porcentaje global de acoplamiento con la diana se normaliza frente a los valores farmacocinéticos del plasma (PK) para cada ratón individual, ya que se detectan exposiciones significativas al término del estudio. Se encuentra que los anticuerpos anti N3pGlu tanto R17L como B12L se acoplan con la placa depositada con una distribución similar a la observada con el anticuerpo anti N3pGlu murino (mE8). Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti N3pGlu R17L y B12L, cuando se administran periféricamente, pueden cruzar la barrera sangre-cerebro y acoplarse con la diana prevista del Ap depositado, mientras que un anticuerpo que se une tanto a Ap soluble como insoluble se satura con el soluble y no puede acoplarse con la diana depositada prevista.

Ejemplo6:Estudiosdereduccióndeplacasterapéuticas

Se realiza un estudio de reducción de placas terapéuticas en ratones PDAPP de 23 meses de edad con los anticuerpos siguientes: anticuerpo de control negativo (IgG2a), 3D6, mE8 (IgG1) y mE8c (IgG2a). Se inyectan subcutáneamente los ratones PDAPP envejecidos con 12,5 mg/kg de cada anticuerpo semanalmente durante tres meses. Se realiza una necropsia a un grupo de ratones al principio del estudio (tiempo cero) a fin de determinar la carga de placa inicial a los 23 meses de edad. Al final del estudio, se obtiene plasma y se procesan los cerebros para obtener resultados bioquímicos e histológicos (un hemisferio cada uno). Se homogeneizan el hipocampo y las regiones corticales en guanidina 5 M y se mide el contenido Ap mediante geles de urea ácida seguido por transferencia de Western. Un análisis de los lisados de guanidina del hipocampo de las cohortes de tiempo cero de 23 meses de edad y anticuerpo de control negativo (de 26 meses de edad) muestran un aumento no significativo en Api-42 depositado; confirmando así que los cerebros de los ratones PDAPP están en la meseta de placa. De forma similar a los estudios previos en ratones PDAPP envejecidos, el tratamiento con el anticuerpo comparador 3D6 no tiene efecto sobre la reducción de placa. El tratamiento con anticuerpo N3pGlu, mE8 o mE8c, da como resultado una reducción de placa significativa comparado con el anticuerpo de control negativo IgG2a (p<0,01 y p<0,001 respectivamente) (Tabla 2). El mE8 y mE8c reduce el Api-42 del hipocampo en ~38 %y ~53 %, respectivamente. El anticuerpo N3pGlu mE8c con función efectora máxima tiende a ser más eficaz que el anticuerpo con función efectora mínima mE8 (en comparación con el control), sin embargo, esta diferencia no alcanza significación estadística. También, el anticuerpo mE8c tiene una disminución significativa de ~30 % de Api-42 en el hipocampo comparado con los ratones de tiempo cero (prueba t; p<0,0066), por lo tanto indica la eliminación de placa depositada previamente. Los análisis de los lisados de guanidina cortical producen resultados muy similares con la excepción de que solo el mE8c con función efectora máxima disminuye significativamente la deposición de Api-42. Estos resultados demuestran que el tratamiento crónico con anticuerpos N3pGlu de este ejemplo disminuye significativamente la deposición de placa en ratones PDAPP envejecidos de una forma dependiente de la función efectora. Adicionalmente, estos resultados apoyan la hipótesis de que el acoplamiento con la diana deficiente para anticuerpos Ap que se unen tanto a Ap solubles como insolubles (en oposición a la senescencia) fue el factor causante de su falta de eficacia cuando se usa en paradigmas terapéuticos.

Tabla2- Reduccióndeplacasdehipocampoycorteza(ngdeAPi-42/mgdepesohúmedo)

Ejemplo7:AnálisisdemicrohemorragiaenratonesPDAPPenvejecidos

Se realiza un estudio histológico para investigar si el mecanismo de acción de los anticuerpos N3pGlu que conduce a la reducción de la placa disminuida en ratones PDAPP envejecidos daría como resultado una exacerbación de la microhemorragia relacionada con AAC. Estudios previos han demostrado que el tratamiento de ratones transgénicos APP envejecidos con varios anticuerpos anti Ap amino terminal y carboxilo terminal conducirá a un aumento en la microhemorragia relacionada con AAC (Pfeifer y col. 2002; Wilcock y col. 2004; Racke y col. 2005). Aunque el mecanismo subyacente a este posible evento adverso no está claro, se han propuesto dos hipótesis que no se excluyen mutuamente: la redistribución de Ap en los vasos sanguíneos cerebrales (Wilcock y col. 2004) o la unión directa de anticuerpos a AAC existente (Racke y col. 2005). Análisis bioquímicos e histológicos demuestran que App3-x es un constituyente de AAC en pacientes EA y ratones PDAPP envejecidos. Se realiza un análisis histológico detallado para microhemorragia en ratones PDAPP envejecidos (23 a 26 meses de edad) que se han tratado terapéuticamente con anticuerpos de control y N3pGlu durante tres meses con inyecciones vía subcutánea semanalmente de 12,5 mg/kg. El control positivo para los análisis de microhemorragia es animales tratados crónicamente con 3D6 que han demostrado previamente que este anticuerpo anti Ap amino terminal exacerba significativamente la microhemorragia (Racke y col. 2005). Al final del estudio, medio cerebro de cada animal se fija a gotas en formaldehido al 4 % y se inserta en parafina. Las secciones coronales que abarcan 2 mm de tejido se seccionan en 50 cortes (cuatro secciones de 10 pm por corte). Once cortes de intervalos homogéneos a través de los 2 mm de tejido se tiñen con Perls Blue a fin de visualizar hemosiderina (acumulación de hierro celular debido a microhemorragia). Se recuentan manualmente dos secciones por corte con un diseño ciego. El tratamiento crónico de ratones PDSAPP envejecidos con 3D6 (control positivo) aumenta notablemente la microhemorragia (p<0,001). De forma importante, esto demuestra que el tratamiento con mE8 (IgGi) o mE8c (IgG2a) no exacerba la microhemorragia, aunque estos anticuerpos N3pGlu reducen significativamente el Ap depositado en estos animales. Estos resultados demuestran que los anticuerpos N3pGlu de este ejemplo no exacerban la microhemorragia relacionada con AAC en ratones PDAPP envejecidos.

Listadodesecuencias

<SEQ ID NO: i; PRT1; Artificial> DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (Ap 1-42)

<SEQ ID NO: 2; PRT1; Artificial> [pE]FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA (N3pE Ap) <SEQ ID NO: 3; PRT1; Artificiad KSSQSLLYSRGKTYLN (LCDR1-B12L/R17L/hE8L/R17) <SEQ ID NO: 4; PRT1; Artificiad AVSKLDS (LCDR2 - B12L/R17L/hE8L/CI-C7)

<SEQ ID NO: 5; PRT1; Artificiad VQGTHYPFT (LCDR3 - B12L/R17L/hE8L/R17/CI-C7)

<SEQ ID NO: 6; PRT1; Artificiad GYDFTRYYIN (HCDR1 - B12L)

<SEQ ID NO: 7; PRT1; Artificiad GYTFTRYYIN (HCDR1 - R17L/R17)

<SEQ ID NO: 8; PRT1; Artificiad WINPGSGNTKYNEKFKG (HCDR2 - B12L/R17L/R17/CI-C7)

<SEQ ID NO: 9; PRT1; Artificiad EGITVY (HCDR3 - B12L)

<SEQ ID NO: 10; PRT1; Artificiad EGTTVY (HCDR3 - R17L/R17)

<SEQ ID NO: 11; PRT1; Artificiad (LCVR - B12L/R17L/hE8L)

DIVMTOTPLSLSVTPGOPASISCKSSOSLLYSRGKTYLNWLLOKPGOSPOLLIYAVSKLDS

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVOGTHYPFTFGOGTKLEIK

<SEQ ID NO: 12; PRT1; Artificiad (HCVR - B12L)

O Y OLY O S GAEVKKPGS S VKVSCKAS G YDFTRYYINWYRO APGOGLE WMG WINPGS GN

TKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGITVYWGOGTTVTVS S

<SEQ ID NO: 13; PRT1; Artificiad (HCVR - R17L)

O V OLY O S GAEVKKPGS S VKVSCKAS GYTFTRYYINWVRO APGOGLE WMG WINPGS GNT KYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTTVYWGOGTTVTVS S

<SEQ ID NO: 14; PRT1; Artificial> (LC - B12L/R17L)

DIVMTOTPLSLSVTPGOPASISCKSSOSLLYSRGKTYLNWLLOKPGOSPOLLIYAVSKLDS

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVOGTHYPFTFGOGTKLEIKRTVAAPSVFI

FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS

STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

<SEQ ID NO: 15; PRT1; Artificiad (HC - B12L)

O V OLY O S GAEVKKPGS S VKVSCKAS G YDFTRYYINWYRO APGOGLE WMG WINPGS GN TKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGITVYWGOGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST Y R W S VLT VLHQD WLN GKEYKCKV SNKALP APIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPP SRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

<SEQ ID NO: 16; PRT1; Artificiad (HC - R17L)

O V OLV O SGAEVKKPGS S VKVSCKAS GYTFTRYYINWVRO APGOGLE WMG WINPGS GNT KYNEKFKGRYTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTTVYWGOGTTVTVSSAS

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST Y R W S YLT VLHQD WLN GKEYKCKV SNKALP APIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPP SRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

<SEQ ID NO: 17; ADN; Artificiad (LCVR ADN-B12L/R17L)

GATATTGTGATGACTCAGACTCCACTCTCCCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCT

CCATCTCCTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTCGCGGAAAAACCTATTTGAA TTGGCTCCTGCAGAAGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATGCGGTGTCTAAA

CT GGACT CT GGGGTCCC AGAC AGATT C AGCGGCAGT GGGT CAGGC AC AGATTT CACA

CT GAAAAT C AGCAGGGT GGAGGCCGAAGAT GTT GGGGTTTATTACT GCGT GCAAGGT

ACACATTACCCATTCACGTTTGGCCAAGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

<SEQ ID NO: 18; ADN; Artificiad (HCVR ADN-B12L)

C AGGT GCAGCT GGT GC AGT CT GGGGCT GAGGT GAAGAAGCCT GGGTCCT C AGT GAAG GTTTCCTGCAAGGCATCTGGTTACGACTTCACTAGATACTATATAAACTGGGTGCGAC AGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTAATCCTGGAAGCGGTAATA CTAAGTACAATGAGAAATTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCGCGGACGAATCCACGA

GCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACT

GTGCGAGAGAAGGCATCACGGTCTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCT CA

<SEQ ID NO: 19; ADN; Artificiad (HCVR ADN-R17L)

C AGGT GCAGCT GGT GC AGT CT GGGGCT GAGGT GAAGAAGCCT GGGTCCT C AGT GAAG

GTTTCCTGCAAGGCATCTGGTTACACCTTCACTAGATATTATATAAACTGGGTGCGAC

AGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTAATCCTGGAAGCGGTAATA CTAAGTACAATGAGAAATTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCGCGGACGAATCCACGA

GCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACT

GTGCGAGAGAAGGCACAACGGTCTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCT CA

<SEQ ID NO: 20; PRT1; Artificiad (LCVR - mE8)

NIVLT OTPLTLS VTIGOP ASI SCKS S O SLLYSRGKTYLNWLLORPGO SPKRLIYAV SKLD S G VPDRFIGSGS GTDFTLKISRVEAEDLGVYY C VO GTHYPFTFGSGTKLEIK

<SEQ ID NO: 21; PRT1; Artificiad (HCVR - mE8)

EVOLLESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKORPGOGLEWIGWINPGSGNTK

YNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMOLSSLTSEDSAVYFCTREGETVYWGOGTTLTVSS

<SEQ ID NO: 22; PRT1; Artificiad (LC - mE8 y mE8c) NIVLTOTPLTLSVTIGOPASISCKSSOSLLYSRGKTYLNWLLORPGOSPKRLIYAVSKLDSG VPDRFIGSGS GTDFTLKISRVEAEDLGVYY C VO GTHYPFTFGSGTKLEIKRAD AAPTV SIFP

PSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSST

LTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

<SEQ ID NO: 23; PRT1; Artificial> (HC - mE8)

EVOLLESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKORPGOGLEWIGWINPGSGNTK

YNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMOLSSLTSEDSAVYFCTREGETVYWGOGTTLTVSSAKT

TPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYT

LSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPK

D VLTITLTPKVT CW VDISKDDPE V QF S WF VDD VEVHTAQT QPREEQFN STFRS V SELPIM

HQD WLN GKEFKCRVN S AAFP APIEKTISKTKGRPKAPQ VYTIPPPKEQMAKDKV SLTCMI

TDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSV

LHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

<SEQ ID NO: 24; PRT1; Artificiad (HC - mE8c) EVOLLESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKORPGOGLEWIGWINPGSGNTK YNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMOLSSLTSEDSAVYFCTREGETVYWGOGTTLTVSSAKT TAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYT LSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIF PPKIKDVLMISLSPIVTCVWDVSEDDPDVQISWFYNNYEVHTAQTQTHREDYNSTLRW SALPIQHQDWMSGKEFKCKYNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQV TLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERN SYSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

<SEQ ID NO: 25; PRT1; Artificiad (pE3-16) Pir-EFRHDSGYEVHHQK-biotina

<SEQ ID NO: 26; PRT1; Artificiad (E3-16) EFRHDSGYEVHHQK-biotina

<SEQ ID NO: 27; PRT1; Artificiad (pEG4) Pir-EGRHDSGYEVHHQK-biotina

<SEQ ID NO: 28; PRT1; Artificiad (mpE3-16) Pir-EFGHDSGFEVHHQK-biotina

<SEQ ID NO: 29; PRT1; Artificiad (pEG6) Pir-EFRGDSGYEVHHQK -biotina

<SEQ ID NO: 30; PRT1; Artificiad (pEG7) Pir-EFRHGSGYEVHHQK-biotina

<SEQ ID NO: 31; PRT1; Artificiad (LCVR - hE8-C6) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSRGKTYLNWYLQKPGQSPQLLIYAVSKLDS GVPDRF SGS GS GTDFTLKI SRVEAED V GVYY CV Q GTHYPFTF GQ GTKLEIK

<SEQ ID NO: 32; PRT1; Artificiad (HCVR - hE8-C6)

Q V QLV Q S GAEVKKPGS S VKV S CKAS GYTFTD YYINWVRQ APGQGLE WMGWINPGS GNT

KYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGETVYWGQGTTVTVSS

<SEQ ID NO: 33; PRT1; Artificiad (LC - hE8-C6)

DIVMTOTPLSLSVTPGOPASISCKSSOSLLYSRGKTYLNWYLOKPGOSPOLLIYAVSKLDS

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVOGTHYPFTFGOGTKLEIKRTVAAPSVFI

FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPRQAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS

STLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC

<SEQ ID NO: 34; PRT1; Artificial> (HC - hE8-C6)

O V QLV O S GAEVKKPGS S VKVSCKAS GYTFTD YYINWVRQ APGQGLE WMGWINPGS GNT KYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGETVYWGOGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV

FLFPPKPKDTLMISRTPEYTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNYFSCSYMHEALHNHYTQKSLSLSPG

<SEQ ID NO: 35; PRT1; Artificiad (LCDR2 - R17) AVSKLGS

<SEQ ID NO: 36; PRT1; Artificiad (LCVR - R17) DIVMTOTPLSLSVTPGOPASISCKSSOSLLYSRGKTYLNWYLOKPGOSPOLLIYAVSKLGS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVOGTHYPFTFGOGTKLEIK

<SEQ ID NO: 37; PRT1; Artificiad (pEG8) Pir-EFRHDGGYEVHHQK-biotina

<SEQ ID NO: 38; PRT1; Artificial> (LC - R17) DIVMTOTPLSLSVTPGOPASISCKSSOSLLYSRGKTYLNWYLOKPGOSPOLLIYAVSKLGS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVOGTHYPFTFGOGTKLEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

<SEQ ID NO: 39; PRT1; Artificial> (pEF10) Pir-EFRHDSGFEVHHQK-biotina

<SEQ ID NO: 40; PRT1; Artificiad (HCDR1 - hE8L/CI-C7) GYTFTDYYIN

<SEQ ID NO: 41; PRT1; Artificiad (HCDR3 - hE8L) EGETVY

<SEQ ID NO: 42; PRT1; Artificiad (HCVR - hE8L)

O V QLV O S GAEVKKPGS S VKVSCKAS GYTFTD YYINWVRQ APGQGLE WMGWINPGS GNT KYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGETVYWGOGTTVTVSS

<SEQ ID NO: 43; ADN; Artificiad (HC ADN-R17L)

C AGGT GCAGCT GGT GC AGT CT GGGGCT GAGGT GAAGAAGCCT GGGTCCT C AGT GAAG GTTTCCTGCAAGGCATCTGGTTACACCTTCACTAGATATTATATAAACTGGGTGCGAC AGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTAATCCTGGAAGCGGTAATA CTAAGTACAATGAGAAATTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCGCGGACGAATCCACGA GCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACT GTGCGAGAGAAGGCACAACGGTCTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCT CAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTC TGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAAGTT GAGCCC AAAT CTT GT GACAAAACT C AC ACAT GCCCACCGT GCCCAGCA CCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAG ACCCT GAGGT C AAGTT C AACT GGTACGT GGACGGCGT GGAGGT GCATAAT GCC AAGA CAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG TC CT GC ACC AGGACT GGCT GA AT GGC AAGG AGT AC AAGT GC AAGGT CTC C AAC AAAG CCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCC TGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACG TCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCT CTCCCTGTCTCCGGGT

<SEQ ID NO: 44; PRT1; Artificiad (HC - hE8L)

O V OLV O SGAEVKKPGS S VKVSCKAS GYTFTD YYINWVRO APGOGLE WMG WINPGS GNT

KYNEKFKGRYTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGETVYWGOGTTVTVSSAS

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL

YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST

Y R W S YLT VLHQD WLN GKEYKCKV SNKALP APIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPP SRDELT

KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ<SEQ ID NO: 45; PRT1; Artificiad (LCDR1 - CI-C7) KSTRSLLYSRSKTYLN

<SEQ ID NO: 46; PRT1; Artificiad (HCDR3 - CI-C7) EGVTVY

<SEQ ID NO: 47; PRT1; Artificiad (LCVR - CI-C7)

DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCKSTRSLLYSRSKTYLNWYOOKPGKAPKLLIYAVSKLD

SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCVOGTHYPFTFGGGTKVEIK

<SEQ ID NO: 48; PRT1; Artificiad (HCVR - CI-C7)

EV OLV O S GAEVKKPGESLKISCKGS GYTFTD YYINWVROMPGKGLE WMGWINPGS GNT

KYNEKFKGOYTISADKSISTAYLOWSSLKASDTAMYYCAREGVTVYWGOGTLYTVSS

<SEQ ID NO: 49; PRT1; Artificiad (LC - CI-C7) DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCKSTRSLLYSRSKTYLNWYOOKPGKAPKLLIYAVSKLDS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCVOGTHYPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF

PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS

TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

<SEQ ID NO: 50; PRT1; Artificial> (HC - CI-C7) EVOLVOSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTDYYINWVROMPGKGLEWMGWINPGSGNT KYNEKFKGOVTISADKSISTAYLOWSSLKASDTAMYYCAREGVTVYWGOGTLVTVSSA

STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG

LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS T Y R W S VLT VLHQD WLN GKEYKCKV SNKALP APIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPP SRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

<SEQ ID NO: 51; PRT1; Secuencia Artificiad (LCDR1 consenso) KSX1X2SLLYSRX3KTYLN en la que x1 es S o T, x2 es Q o R, x3 es G o S

<SEQ ID NO: 52; PRT1; Secuencia Artificiad (LCDR2 consenso) AVSKLx4S en la que x4 es D o G

<SEQ ID NO: 53; PRT1; Secuencia Artificiad (HCDR1 consenso) GYx5FTx6YYIN en la que x5 es D o T, x6 es R o D

<SEQ ID NO: 54; PRT1; Secuencia Artificiad (HCDR3 consenso EGx7TVYen la que x7 es I, T, E o V

<SEQ ID NO: 55; PRT1; Secuencia Artificiad (LC ADN-B12L/R17L)

GATATTGTGATGACTCAGACTCCACTCTCCCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCT

CCATCTCCTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTCGCGGAAAAACCTATTTGAA

TTGGCTCCTGCAGAAGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATGCGGTGTCTAAA

CT GGACT CT GGGGT CCCAGACAGATT C AGCGGC AGT GGGT C AGGC ACAGATTT CACA

CTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCCGAAGATGTTGGGGTTTATTACTGCGTGCAAGGT

ACACATTACCCATTCACGTTTGGCCAAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTG

GCT GCACC AT CT GT CTT C AT CTTCCCGCCAT CT GAT GAGC AGTT GAAAT CT GGAACT G

CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGA

AGGT GGATAACGCCCT CC AAT CGGGTAACTCCC AGGAGAGT GT CAC AGAGC AGGAC

AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTA

CGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGT

CACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

<SEQ ID NO: 56; PRT1; Secuencia Artificiad (HC ADN- B12L)

C AGGT GCAGCT GGT GC AGT CT GGGGCT GAGGT GAAGAAGCCT GGGTCCT C AGT GAAG

GTTTCCTGCAAGGCATCTGGTTACGACTTCACTAGATACTATATAAACTGGGTGCGAC

AGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTAATCCTGGAAGCGGTAATA

CTAAGTACAATGAGAAATTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCGCGGACGAATCCACGA

GCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACT

GTGCGAGAGAAGGCATCACGGTCTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCT

CAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTC

TGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC

GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT

ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG

GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC

AAGAAAGTT GAGCCC AAAT CTT GT GACAAAACT C AC ACAT GCCCACCGT GCCCAGCA

CCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC

TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAG

ACCCT GAGGT C AAGTT C AACTGGTACGT GGACGGCGT GGAGGT GCAT AAT GCC AAGA

CAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG

TCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAG

CCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC

CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCC

TGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA

ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCT

C CTT CTT CCT CTATAGCAAGCT CACCGT GGACAAGAGCAGGT GGCAGC AGGGGAACG

TCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCT

CTCCCTGTCTCCGGGT

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti Ap N3pGlu que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que LCDR1 es KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 es AVSKLX4S (SEQ ID NO: 52), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) y HCDR1 es GYX5FTX6YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGX7TVY (SEQ ID NO: 54), en el que X1 es S o T; X2 es Q o R, X3 es G o S, X4 es D o G, X5 es D o T, X6 es R o D y X7 es I, T, E o V, para su uso en la prevención de la enfermedad de Alzheimer.

2. Un anticuerpo anti Ap N3pGlu que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que LCDR1 es KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 es AVSKLX4S (SEQ ID NO: 52), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) y HCDR1 es GYX5FTX6YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGX7TVY (SEQ ID NO: 54), en el que X1 es S o T; X2 es Q o R, X3 es G o S, X4 es D o G, X5 es D o T, X6 es R o D y X7 es I, T, E o V, para su uso en la prevención de una afección seleccionada de enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, enfermedad de Alzheimer prodrómica y AAC clínica o preclínica.

3. Un anticuerpo anti Ap N3pGlu o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 1 o para su uso según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que dicha LCVR comprende los polipéptidos LCDR1, LCd R2, LCDR3 y la HCVR comprende los polipéptidos hCd R1, HCDR2, HCDR3 que se seleccionan del grupo que consiste en:

a) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYDFTRYYIN (SEQ ID NO: 6), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGITVY (SEQ ID NO: 9);

b) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGTTVY (SEQ ID NO: 10);

c) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGETVY (SEQ ID NO: 41);

d) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLGS (SEQ ID NO: 35), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGTTVY (SEQ ID NO: 10); o

e) LCDR1 es KSTRSLLYSRSKTYLN (SEQ ID NO: 45), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGVTVY (SEQ ID NO: 46).