較佳抗體係hE8L。 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺游離鹼係較佳化合物(BACE抑制劑)，且N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽係尤佳化合物(BACE抑制劑)。 抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該HCVR包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，選自由以下組成之群： a) LCDR1係SEQ ID. NO: 17，LCDR2係SEQ ID. NO: 18，LCDR3係SEQ ID. NO: 19，HCDR1係SEQ ID. NO: 20，HCDR2係SEQ ID. NO: 21，且HCDR3係SEQ ID. NO: 22 b) LCDR1係SEQ ID. NO: 4，LCDR2係SEQ ID. NO: 6，LCDR3係SEQ ID. NO: 7，HCDR1係SEQ ID. NO: 1，HCDR2係SEQ ID. NO: 2，且HCDR3係SEQ ID. NO: 3；及 c) LCDR1係SEQ ID. NO: 4，LCDR2係SEQ ID. NO: 5，LCDR3係SEQ ID. NO: 7，HCDR1係SEQ ID. NO: 1，HCDR2係SEQ ID. NO: 2，且HCDR3係SEQ ID. NO: 3。 在其他實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR及該HCVR係選自由以下組成之群： a) SEQ ID NO: 23之LCVR及SEQ ID NO: 24之HCVR b) SEQ ID NO: 9之LCVR及SEQ ID NO: 8之HCVR；及 c) SEQ ID NO: 10之LCVR及SEQ ID NO: 8之HCVR。 在其他實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中該LC及該HC係選自由以下組成之群： a) SEQ ID NO: 25之LC及SEQ ID NO: 26之HC； b) SEQ ID NO: 12之LC及SEQ ID NO: 11之HC；及 c) SEQ ID NO: 13之LC及SEQ ID NO: 11之HC。 在其他實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體包含兩條輕鏈(LC)及兩條重鏈(HC)，其中每一LC及每一HC選自由以下組成之群： a) SEQ ID NO: 25之LC及SEQ ID NO: 26之HC； b) SEQ ID NO: 12之LC及SEQ ID NO: 11之HC；及 c) SEQ ID NO: 13之LC及SEQ ID NO: 11之HC。 抗N3pGlu Aβ抗體進一步包含hE8L，其具有分別SEQ ID NO: 25及26之輕鏈(LC)及重鏈(HC)。hE8L進一步具有分別SEQ ID NO: 23及24之輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)。hE8L之HCVR進一步包含分別定義於SEQID NO: 20、21及22中之HCDR1、HCDR2及HCDR3。最後，hE8L進一步包含分別定義於SEQID NO: 17、18及19中之LCDR1、LCDR2及LCDR3。 另外，抗N3pGlu Aβ抗體包含抗體I，其具有分別在SEQ ID NO: 12及11中概述之輕鏈(LC)及重鏈(HC)。抗體I進一步具有分別在SEQ ID NO: 9及8中概述之輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)。抗體I之HCVR進一步包含分別定義於SEQID NO: 1、2及3中之HCDR1、HCDR2及HCDR3。最後，抗體I進一步包含分別定義於SEQID NO: 4、6及7中之LCDR1、LCDR2及LCDR3。 抗N3pGlu Aβ抗體進一步包含抗體II，其具有分別於SEQ ID NO: 13及11中概述之輕鏈(LC)及重鏈(HC)。抗體I進一步具有分別於SEQ ID NO: 10及8中概述之輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)。抗體I之HCVR進一步包含分別定義於SEQ ID NO: 1、2及3中之HCDR1、HCDR2及HCDR3。最後，抗體I進一步包含分別定義於SEQ ID NO: 4、7及7中之LCDR1、LCDR2及LCDR3。 下式化合物：
， 或其醫藥上可接受之鹽經揭示作為BACE抑制劑且可由熟習此項技術者如美國專利第8,841,293 B1號中所陳述來製備，該案之標題為「Tetrahydropyrrolothiazine Compounds」，其係於2014年9月23日發佈(美國系列號14/195,897)；具體而言參見實例4，N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺。 熟習此項技術者將進一步明瞭且認識到，「抗N3pGlu Aβ抗體」及特定抗體「hE8L」可由熟習此項技術者鑑別且連同製備及使用該等抗體之方法一起揭示於2014年3月25日發佈標題為「Anti-N3pGlu Amyloid Beta Peptide Antibodies and Uses Thereof」之美國專利第8,679,498 B2號中(美國申請號13/810,895)。例如，參見美國專利第8,679,498 B2號之表1。可使用抗體hE8L作為本發明之抗N3pGlu Aβ抗體。在其他實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體可包含本文所闡述之抗體「抗體I」。在其他實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體可包含本文所概述之「抗體II」。 另外，本發明中所使用之某些抗體之胺基酸序列提供於下表A中： 表A-抗體SEQ ID NO
關於「hE8L」、「抗體I」及「抗體II」，該等抗體之其他胺基酸序列提供於表B中： 表B-「hE8L」、「抗體I」及「抗體II」之其他SEQ ID NO
本發明之抗體結合至N3pGlu Aβ。N3pGlu Aβ之序列係SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。 如本文所用「抗體」係包含藉由二硫鍵互連之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)之免疫球蛋白分子。每一LC及HC之胺基末端部分均包括經由含於其中之互補決定區(CDR)負責抗原識別之可變區。CDR夾雜有稱為框架區之更保守之區。胺基酸至本發明抗體之LCVR區及HCVR區內CDR結構域之分配係基於眾所周知之Kabat編號規定，例如以下：Kabat等人，Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生及公共服務部，NIH公開號91-3242 (1991))，及North編號規定(North等人，A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011))。 如本文所用術語「經分離」係指在自然界中未發現且不含或基本上不含在細胞環境中發現之其他巨分子物質之蛋白質、肽或核酸。如本文所用「基本上不含」意指所述蛋白質、肽或核酸佔所存在巨分子物質之80%以上(在莫耳基礎上)，較佳地90%以上且更佳地95%以上。 在抗體表現及分泌之後，將培養基澄清以去除細胞且使用許多常用技術中之任一者純化澄清之培養基。可根據眾所周知用於調配用於非經腸投與、特別是用於皮下、鞘內或靜脈內投與之蛋白質及抗體之方法將經純化之抗體調配成醫藥組合物。抗體可連同適當的醫藥上可接受之賦形劑一起凍乾，且然後稍後在使用前用基於水之稀釋劑復原。在任一情形下，抗體之醫藥組合物之儲存形式及注射形式將含有一或多種醫藥上可接受之賦形劑，該等賦形劑係抗體以外之成分。成分是否為醫藥上可接受取決於其對醫藥組合物之安全性及有效性或安全性、純度及功效之效應。若成分經判斷對安全性或有效性(或對安全性、純度或功效)具有十分不利的效應而承認不得將其用於投與人類之組合物中，則該成分就不是醫藥上可接受可用於抗體之醫藥組合物中。 術語「以Aβ之沈積為特徵之疾病」係在病理學上特徵在於Aβ在腦或腦血管系統中沈積之疾病。此包括諸如阿茲海默氏病、唐氏症候群(Down's syndrome)及腦類澱粉血管病變等疾病。阿茲海默氏病之臨床診斷、分期或進展可由熟習此項技術者之主治診斷醫生或健康照護專業人員藉由使用已知技術並藉由觀察結果輕易地確定。此通常包括一些形式之腦斑成像、心智或認知評估(例如臨床失智評定彙總量表(Clinical Dementia Rating- summary of boxes, CDR-SB)、25迷你心智狀態檢查(Mini-Mental State Exam 25, MMSE)或阿茲海默氏病認知評估量表(Alzheimer's Disease Assessment Scale-Cognitive, ADAS-Cog))或功能評估(例如阿茲海默氏病合作研究-日常生活活動(Alzheimer's Disease Cooperative Study-Activities of Daily Living, ADCS-ADL))。如本文所用，「臨床阿茲海默氏病」係阿茲海默氏病之診斷階段。其包括診斷為前驅性阿茲海默氏病、輕度阿茲海默氏病、中度阿茲海默氏病及嚴重阿茲海默氏病之病況。術語「臨床前阿茲海默氏病」係在臨床阿茲海默氏病前之階段，其中生物標記物(例如藉由類澱粉PET之CSP Aβ42含量或沈積之腦斑)之可量測變化指示具有阿茲海默氏病理學之患者進展至臨床阿茲海默氏病之最早體徵。此通常係在諸如記憶喪失及混淆症狀顯著之前。 本文所用術語「治療(treating)」、擬治療(to treat)或「治療(treatment)」包括遏止、減緩、停止、減少或逆轉現有症狀、病症、病況或疾病之進展或嚴重程度。 如本文中所使用，術語「患者」係指人類。 術語「抑制Aβ肽之產生」可視為意指降低患者中Aβ肽之活體內含量。 如本文所用術語「有效量」係指下式化合物：
， 或其醫藥上可接受之鹽之量或劑量，且指選自由hE8L、抗體I及抗體II組成之群之抗N3pGlu Aβ抗體之量或劑量，其在單一或多劑量投與患者後，在處於診斷或治療下之患者中提供期望效應。應瞭解本發明之組合療法係藉由以下來實施：以如下方式連同選自由hE8L、抗體I及抗體II組成之群之抗N3pGlu Aβ抗體一起投與下式化合物：
， 或其醫藥上可接受之鹽：在體內提供有效含量之下式化合物：
， 及選自由hE8L、抗體I及抗體II組成之群之抗N3pGlu Aβ抗體。 有效量可由作為熟習此項技術者之主治診斷醫師藉由使用已知技術並藉由觀察類似情況下所獲得之結果來容易地確定。為確定患者之有效量，主治診斷醫師考慮多種因素，該等因素包括(但不限於)：患者之物種；其大小、年齡及整體健康狀況；所涉及之特定疾病或病症；該疾病或病症之涉及程度或嚴重性；個體患者之反應；所投與之具體化合物；投與方式；所投與製劑之生物利用度特徵；所選劑量方案；伴隨藥劑之使用；及其他相關情況。 下式化合物：
， 或其醫藥上可接受之鹽在本發明之組合中通常在寬劑量範圍內係有效的。例如，下式化合物每天之劑量：
通常在約0.1 mg/天至約500 mg/天、較佳地約0.1 mg/天至約200 mg/天且最佳地約0.1 mg/天至約100 mg/天之範圍內。在一些實施例中，下式化合物之劑量：
為約0.1 mg/天至約25 mg/天。另外，選自由hE8L、抗體I及抗體II組成之群之抗N3pGlu Aβ抗體在本發明之組合中通常在寬劑量範圍內係有效的。在一些情形下，低於上述範圍下限之劑量值可能係過量的，而在其他連同考量可接受不利事件的情形下仍可採用更大劑量，且因此上述劑量範圍並非意欲以任一方式限制本發明之範圍。 較佳地，將本發明之BACE抑制劑及抗體調配為可藉由任何使得化合物生物可利用之途徑投與之醫藥組合物。投與途徑可以任一方式變化，其受藥物之物理性質及患者及照護者之便利性所限。較佳地，抗N3pGlu Aβ抗體組合物係用於非經腸投與，例如靜脈內或皮下投與。另外，下式之BACE抑制劑化合物：
， 或其醫藥上可接受之鹽係用於經口或非經腸投與，包括靜脈內或皮下投與。該等醫藥組合物及其製備製程在業內已眾所周知。(例如參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen編輯，第22版，Pharmaceutical Press, 2012)。 如本文所用片語「與……組合」係指與選自由hE8L、抗體I及抗體II組成之群之抗N3pGlu Aβ抗體同時或以任一順序依序或以其任一組合投與BACE抑制劑，例如下式化合物：
, 或其醫藥上可接受之鹽。該兩種分子可作為同一醫藥組合物之一部分或以單獨醫藥組合物來投與。下式化合物：
， 或其醫藥上可接受之鹽可在投與抗N3pGlu Aβ抗體之前、與此同時或在此之後或以其某一組合來投與。倘若抗N3pGlu Aβ抗體係以重複間隔投與(例如在標準治療過程期間)，則BACE抑制劑可在抗N3pGlu Aβ抗體之每一投與之前、與此同時或在此之後或以其某一組合進行投與，或相對於利用抗N3pGlu Aβ抗體之療法以不同間隔進行投與，或在利用抗N3pGlu Aβ抗體治療過程之前、在此期間之任一時間或在此之後以單一劑量或一系列劑量進行投與。 下式化合物：
, 或其醫藥上可接受之鹽可藉由業內已知之各種程序來製備(例如參見美國專利第8,841,293 B1號，實例4)，該等程序中之一部分闡釋於下文製備及實例中。所闡述途徑中之每一者之特定合成步驟可以不同方式進行組合或與來自不同程序之步驟結合，以製備式I化合物或其鹽。每一步驟之產物可藉由業內眾所周知之習用方法回收，包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、研磨、及結晶。另外，除非另有指示，否則所有取代基皆如先前所定義。熟習此項技術者可容易地獲得試劑及起始材料。 如本文所用之「BSA」係指牛血清白蛋白；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「ee」係指鏡像異構過量；「Ex」係指實例；「F12」係指哈姆氏F12培養基(Ham’s F12 medium)；「hr係指小時(hour或hours)；「HRP」係指辣根過氧化物酶；「IC
50
」係指產生藥劑可達到最大抑制反應之50%之該藥劑之濃度；「min」係指分鐘(minute或minutes)；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「PDAPP」係指斑源性類澱粉前體蛋白質；「Prep」係指製備；「psi」係指磅/平方英吋；「R
t
」係指滯留時間；「SCX」係指強陽離子交換層析；「THF」係指四氫呋喃且「TMB」係指3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺。
實例 1 N-[3-[(4aR,7aS)-2- 胺基 -6-(5- 氟嘧啶 -2- 基 )-4,4a,5,7- 四氫吡咯并 [3,4-d][1,3] 噻嗪 -7a- 基 ]-4- 氟 - 苯基 ]-5- 甲氧基 - 吡嗪 -2- 甲醯胺鹽酸鹽。 將N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(0.350 g，0.58 mmol，異構物1)溶解於THF (2 mL)中且然後添加甲醇(4 mL)及乙醇(4 mL)。將O-甲基羥胺鹽酸鹽(495 mg, 5.81 mmol)及吡啶(470 µL, 5.81 mmol)添加至混合物中並使反應物升溫至50℃並攪拌過夜。將矽膠(約10 g)添加至反應物中並濃縮混合物。將在矽膠上乾燥之試樣加載至空筒柱上並用7N氨甲醇於二氯甲烷中之0-10%梯度溶析進行純化。使用3:1二氯甲烷:甲醇且然後於甲醇中之2:1二氯甲烷:7 N氨在SCX管柱上再一次純化產物。用7 N氨甲醇於二氯甲烷中之0%至10%梯度在矽膠上最後一次純化產物以得到標題化合物之游離鹼。將此物質溶解於二氯甲烷(5 mL)中並添加於乙醚中之1 M鹽酸(0.20 mL, 660 µmol)。在真空中去除溶劑以得到標題化合物(71 mg, 23%)。ES/MS (m/e): 498 (M+H)。
實例 2 製備結晶形式 2N-[3-[(4aR,7aS)-2- 胺基 -6-(5- 氟嘧啶 -2- 基 )-4,4a,5,7- 四氫吡咯并 [3,4-d][1,3] 噻嗪 -7a- 基 ]-4- 氟 - 苯基 ]-5- 甲氧基 - 吡嗪 -2- 甲醯胺 ( 水合 ) 之一般程序。
在約23℃下，N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺於THF中之漿液之濃度為約71 mg/mL溶劑。在攪拌下加熱漿液以溶解，該溶解係在約60℃至約63℃下發生。將水添加至熱溶液中以提供約95:5之THF:水溶劑比。添加形式2N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之晶種晶體(約3重量%負荷)。將所得稀漿液在約60℃至約63℃下保持約20分鐘，隨後經約2至約4小時添加約5.3至約5.5體積水，得到約69:31之THF:水溶劑比。然後將漿液在約60℃至約63℃下保持約30分鐘且然後經約1小時冷卻至約23℃，且然後攪拌約8-12小時。然後過濾漿液，用THF:水(35:65)輕輕沖洗，且在減壓真空下在約40℃下乾燥約8-12小時，以得到期望之結晶形式2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺，其係水合的。
X 射線粉末繞射 (XRD)
在配備有CuKa源(λ = 1.54060 Å)及Vantec檢測器之Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀上以35 kV及50 mA操作，獲得結晶固體之XRD圖案。以0.009° (2θ)之步階大小及0.5秒/步階之掃描速率及0.6 mm散度、5.28之固定防散射係數及9.5 mm之檢測器狹縫，在4°與40° (2θ)之間掃描試樣。將乾燥粉末充填於石英試樣架上且使用載玻片獲得光滑表面。在環境溫度及相對濕度下收集晶體形式繞射圖案。在結晶業內眾所周知，對於任一給定晶體形式，繞射峰之相對強度可因由諸如晶體形態及習性等因素引起之較佳定向而變化。倘若存在較佳定向之效應，則峰強度有所變化，但多形體之特徵峰位置不改變。例如參見The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18，第1843頁至第1844頁，1995。此外，在結晶業內亦眾所周知對於任一給定晶體形式，角峰位置可稍稍變化。例如，峰位置可因分析試樣之溫度或濕度之變化、試樣置換或內部標準品之存在或不存在而移位。在本發明情形下，在2θ中±0.2之峰值位置可變性將考慮到該等電勢變化，而不會妨礙所指示晶體形式之明確鑑別。可基於區別峰(以° 2θ之單位劑) (通常更顯著的峰)之任一獨特組合證實晶體形式。基於8.853度2θ及26.774度2θ處之NIST 675標準峰調整在環境溫度及相對濕度下收集之晶體形式繞射圖案。 結晶形式2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之製備試樣之特徵在於具有如下表C中所闡述之繞射峰(2θ值)之XRD圖案(使用CuKa輻射)。特定而言，圖案含有11.8°處之峰與選自由18.6°、19.3°及26.7°組成之群之峰中之一或多者之組合；且繞射角之公差為0.2度。
表 C
：結晶形式2之X射線粉末繞射峰。
在室溫及大於約15%之相對濕度下，結晶形式2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺係穩定晶體形式。
實例 3 結晶形式 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2- 胺基 -6-(5- 氟嘧啶 -2- 基 )-4,4a,5,7- 四氫吡咯并 [3,4-d][1,3] 噻嗪 -7a- 基 ]-4- 氟 - 苯基 ]-5- 甲氧基 - 吡嗪 -2- 甲醯胺。
用N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺加載熱重分析盤並將其加熱至約170℃並在170℃下保持約5分鐘。使混合物冷卻至室溫以得到標題化合物。 結晶形式3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之替代製備。 在小瓶中將N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(121 mg)與ACN (5 mL)合併，並在90℃攪拌盤上加熱。約30分鐘後，大部分固體溶解，得到渾濁溶液。添加形式3晶種並在約90℃下將試樣攪拌約1小時。去除加熱並攪拌混合物以得到亮白色固體。藉由真空過濾分離固體，在空氣流下乾燥約10分鐘，且然後在減壓真空下在約80℃下乾燥約8至12小時，以得到標題化合物。 結晶形式3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之製備試樣之特徵在於具有如下表D中隨闡述之繞射峰(2θ值)之XRD圖案(使用CuKa輻射)。特定而言，圖案含有15.7°處之峰與選自由18.1°、27.0°及19.7°組成之群之峰中之一或多者之組合；且繞射角之公差為0.2度。 表D：結晶形式3之X射線粉末繞射峰。
實例 4 N-[3-[(4aR,7aS)-2- 胺基 -6-(5- 氟嘧啶 -2- 基 )-4,4a,5,7- 四氫吡咯并 [3,4-d][1,3] 噻嗪 -7a- 基 ]-4- 氟 - 苯基 ]-5- 甲氧基 - 吡嗪 -2- 甲醯胺 ；甲苯磺酸之製備。 將結晶形式2水合N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(149.15 mg)添加至乙酸乙酯(2 mL)中。在80℃之溫度下以1000 rpm攪拌試樣。將對甲苯磺酸(70 mg溶解於乙酸乙酯(1 mL)中)添加至攪拌溶液中，並將其在80℃下攪拌過夜，以產生白色固體之漿液，藉由真空過濾分離該漿液以得到標題化合物(甲苯磺酸鹽)。 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺；甲苯磺酸之替代製備A。 將N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(9.5 g, 19 mmol)及對甲苯磺酸(3.80 g, 19.8 mmol)添加至四氫呋喃(31 mL)、水(7.9 mL)及2-丙醇(8.6 mL)中。將溶液加熱至40℃。經約3小時向溫熱溶液中添加2-丙醇(200.0 mL)。在開始添加2-丙醇後不久，利用一部分標題化合物(500 mg, 0.75 mmol)對混合物加晶種。在完成溶劑添加之後，經1-3小時使混合物冷卻至約20℃。經2小時之目標時間將混合物自約20℃加熱至約55℃。將溫度在55℃下保持1小時且然後經約4小時冷卻至約20℃。在約20℃下將漿液攪拌至少10小時。過濾漿液並用水(57 mL)洗滌濕濾餅。在真空中在45℃下將產物乾燥至少10小時，以得到標題化合物(10.4 g, 81%)。ES/MS (m/z): 500 (M+H)。 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺；甲苯磺酸之替代製備B。 在500 mL 3頸圓底燒瓶中在60:40 THF:H
2
O (85 mL)中以170 rpm漿液化水合N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(20.7 g)，該燒瓶配備有氮鼓泡器、附接至玻璃軸具有鐵氟龍(teflon)香蕉狀葉片之IKA
®
機械馬達/攪動器，及連接至可程式J-KEM
®
溫度控制器之熱電偶。在23℃下將對甲苯磺酸一水合物(7.6 g, 1.03 eq)溶解於60:40 THF:H
2
O (20 mL)之混合物中，並將溶液一次性添加至攪拌N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺漿液中，隨即產生澄清的紅棕色溶液。然後經15分鐘使攪動速率增加至200 rpm，將水(22 mL)添加至溶液中，然後用N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺甲苯磺酸對其加晶種(750 mg, 3 wt %晶種負荷)且然後在23℃下攪拌另外15分鐘。經6小時，將水(226 mL，總溶劑353 mL；或13.6體積，最終溶劑比為17.5:82.5 THF:H
2
O)添加至漿液中，然後在23℃下將其攪拌過夜(22小時)。經由真空過濾漿液，用15:85 THF:H
2
O (2×20 mL)沖洗，然後在真空下保持20分鐘，同時手動按壓閉合在產物濕濾餅中形成之裂縫。在40℃下在真空下將濕固體乾燥約72小時，以得到白色結晶固體裝標題化合物(24.07 g, 90.0 wt %)。 結晶N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺；甲苯磺酸之特徵在於具有如下表E中所闡述之繞射峰(2θ值)之XRD圖案(使用CuKa輻射)，且具體而言該圖案具有5.0°繞射角度2θ處之峰與選自由19.6°、13.8°及18.5°組成之群之峰中之一或多者之組合；且繞射角之公差為0.2度。 表E：結晶實例4之X射線粉末繞射峰
經改造 N3pGlu A β 抗體之表現及純化
本發明之抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I或II)基本上可如下表現及純化。藉由電穿孔使用含有編碼SEQ ID NO: 12或13之LC胺基酸序列之DNA序列及編碼SEQ ID NO: 11之HC胺基酸序列之DNA序列之麩醯胺酸合成酶(GS)表現載體來轉染中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)。該表現載體編碼SV早期(猿猴病毒40E)啟動子及GS之基因。在轉染後，細胞以0-50 μM L-甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)進行混合選擇(bulk selection)。然後在欲用於生產之無血清懸浮培養物中擴大所選批量細胞(bulk cells)或主要槽孔細胞。 將抗體已分泌至其中之澄清培養基施加至已經相容性緩衝液(例如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4))平衡之蛋白質A親和性管柱。用1 M NaCl洗管柱以去除非特異性結合組份。用例如pH(約)3.5之檸檬酸鈉溶析所結合之抗N3pGlu Aβ抗體，並用1M Tris緩衝液中和流份。藉由諸如SDS-PAGE或分析型尺寸排阻來檢測抗N3pGlu Aβ抗體流份，且然後彙集。在pH 7.4之PBS緩衝液或10 mM檸檬酸鈉緩衝液、pH約6之150 mM NaCl中濃縮本發明之抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I或抗體II)。可使用常用技術無菌過濾最終物質。抗N3pGlu Aβ抗體之純度大於95%。本發明之抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I或抗體II)可在-70℃立即冷凍或在4℃儲存數月。
結合親和性及動力學
使用BIACORE® 3000 (GE Healthcare)藉由表面電漿共振來量測抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I或抗體II)與pE3-42 Aβ肽或與Aβ 1-40肽之結合親和力及動力學。藉由以下量測結合親和力：經由BIACORE® CMS晶片上之固定蛋白質A捕獲抗N3pGlu Aβ抗體，並使pE3-42 Aβ肽或Aβ 1-40肽自100 nM開始以2倍連續稀釋至3.125 nM流過。該等實驗係在25℃在HBS-EP緩衝液(GE Healthcare BR100669；10 mM HEPES，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.05%表面活性劑P20，pH 7.4)中實施。 對於每一循環，用5 μL濃度為10 μg/mL之抗體溶液之注射液以10 μL/min流速捕獲抗體。以50 μL/min使肽與250 μL注射液結合，且然後解離10分鐘。用5 μL pH為1.5之甘胺酸緩衝液之注射液以10 μL/mL流速使晶片表面再生。使數據擬合至1: 1朗格繆爾結合模型(Langmiur binding model)以導出k
on
、k
off
並計算K
D
。在基本上如上文所闡述之程序之後，觀察以下參數(顯示於表2中)。
表 2. 結合親和性及動力學。
未檢測到至Aβ 1-40之可覺察結合，指示與Aβ 1-40相比，抗體I及抗體II特異性結合至pE3-42 Aβ肽。
離體靶點 作用 (Target Engagement)
為測定對來自經固定PDAPP腦之腦切片之離體靶點作用，利用以外源方式添加之抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I或抗體II)實施免疫組織化學分析。將來自老化PDAPP小鼠(25月齡)之低溫恒溫器連續冠狀切片與20 μg/mL例示之本發明N3pGlu Aβ抗體(抗體I或抗體II)一起培育。採用特異於人類IgG之二級HRP試劑並用DAB-Plus (DAKO)對所沈積斑進行可視化。使用後接有二級Step-HRP之生物素化鼠類3D6抗體作為陽性對照。陽性對照抗體(生物素化3D6)在PDAPP海馬體中標記顯著量之沈積之Aβ，且抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I或抗體II)標記沈積物之子集。該等組織學研究證實抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I及抗體II)離體作用於沈積之Aβ靶標
。
以下實例及分析證實研究可如何進行設計以驗證(在動物模型中)本發明抗體與本文所概述化合物之組合之組合可用於治療以Aβ之沈積為特徵之疾病，例如阿茲海默氏病、唐氏症候群及CAA。然而，應瞭解以下闡述係以說明性而非限制性方式陳述，且熟習此項技術者可作出各種修改。
組合研究 BACE 抑制劑飼餵先驅性研究
在飼餵含有BACE抑制劑之飼料之PDAPP小鼠中實施先驅性藥物代謝動力學及藥效學研究，該抑制劑係例如下式化合物：
或其醫藥上可接受之鹽，以便定義藉由單獨BACE抑制提供最少至顯著的血漿及腦Aβ減少之劑量。以含有飼料且含有3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg之「準一天兩次(quasi-bid)」等效劑量之BACE抑制劑的膳食飼餵年幼PDAPP小鼠達14天。在Sorvall混合器中將BACE抑制劑以約0.05 mg、0.15 mg、0.5 mg或1.5 mg/克合格齧齒類動物膳食編號8728CM (Harlan labs)混合10分鐘，且然後用Hobart混合器混合15分鐘，之後進行粒化。將32隻年幼雌性PDAPP小鼠依據親代系隨機化至4個組中，每組8隻，該4個組由媒劑治療組及三個劑量之BACE抑制劑組成。使小鼠隨意獲得食物達14天且隨後將其處死。用CO
2
將小鼠麻醉並藉由心臟穿刺將血液收集至EDTA塗佈之微離心管中並在冰上儲存。隨後，藉由在室溫下將血液試樣以14,000 rpm離心4分鐘收集血漿，將其轉移至未處理之微離心管，然後在乾冰上冷凍並在-80℃下儲存直至分析為止。藉由斷頭術將小鼠處死，將腦快速顯微解剖成兩半，在冰上急速冷凍並在-80℃下儲存直至分析為止(一半用於Aβ分析且另一半用於化合物暴露量測)。為分析實質Aβ，用組織均質器(型號985-370)以速度5將腦試樣在5.5 M鹽酸胍緩衝液(每一半腦0.5 mL)中均質化約1分鐘。在室溫下使均質化腦試樣振動過夜。 為進行Aβ ELISA分析，收集提取物並在酪蛋白緩衝液(1× PBS，具有0.25%酪蛋白、0.05% Tween 20、0.1%乙汞硫柳酸鈉，pH 7.4，具有蛋白酶抑制劑混合劑(Sigma P9340，0.01 mg/mL))中以至少1:10稀釋並以14000 rpm離心10分鐘。為分析血漿Aβ，試樣在樣品緩衝液(PBS；0.05% Triton X-405；0.04%乙汞硫柳酸鈉，0.6% BSA)中1:2稀釋，之後藉由ELISA進行分析。藉由夾心ELISA分別使用m266.2 (抗Aβ
13-28
)及生物素化3D6 (抗Aβ1-5)作為捕獲及報導抗體測定血漿人類Aβ
1-x
。以一式兩份分析未知物且藉由以下測定pg/mL：自8點標準曲線內插(Soft Max Pro v. 5.0.1, Molecular Dynamics，使用參照曲線之4參數擬合)且然後針對稀釋進行調節。藉由如上文所闡述之夾心ELISA測定實質Aβ且將該等值正規化為蛋白質含量(一式兩份藉由Bradford Coomassie Plus Protein方法測定)且表示為pg/mg蛋白質。 為測定組織及血漿中BACE抑制劑之含量，採用以下方法：用甲醇/水(1:1, v/v)連續稀釋0.1 mg/mL之BACE抑制劑原液，以製備工作溶液，然後使用該等工作溶液來增加對照血漿及腦均質物以產生1、5、10、20、50、100、500、1000、2000、4000及5000 ng/mL之分析物濃度。在分析之前，用超音波破裂器在3體積甲醇/水(1:4, v/v)中均質化腦試樣。將每一研究試樣之等份試樣、適當校正標準品及對照基質試樣轉移至96孔板且然後與含有內標準品之乙腈混合。在混合後，對試樣實施離心以粒化沈澱之蛋白質。然後將所得上清液之等份試樣轉移至清潔96孔板中且用甲醇/水(1:1, v/v)稀釋，且藉由LC-MS/MS分析10微升等份試樣。使用藉由校正曲線試樣之多元回歸確定之反應對濃度的關係計算分析物濃度。
活體內組合研究
為評估抗N3pGlu Aβ抗體(例如hE8L、抗體I或抗體II)及BACE抑制劑(例如下式化合物：
或其醫藥上可接受之鹽)之組合斑減少療法，首先使一大群PDAPP小鼠老化至16至18個月齡。基於性別、親代系及年齡將老化PDAPP小鼠隨機化至五個治療組。每一治療組有20至30隻老化PDAPP小鼠。在研究開始時將群組1處死作為時間零以便確定在治療性治療前之病理學基線值(屍體剖檢闡述於下文中)。然後如下治療剩餘的四個群組：群組2，接受安慰劑飼料及每週12.5 mg/kg對照同型IgG2a抗體之注射液之對照動物；群組3，接受每週12.5 mg/kg抗N3pGlu-Aβ抗體之注射液之動物；群組4，接受先前在先驅性飼餵研究中定義之劑量(但通常為約3 mg/kg/天至30 mg/kg/天)之BACE抑制劑飼料之動物；群組5，接受BACE抑制劑飼料(約3 mg/kg/天至30 mg/kg/天)及每週12.5 mg/kg抗N3pGlu-Aβ抗體之注射液之動物。自由存於PBS緩衝液中之抗體組成之無菌原液稀釋抗N3pGlu-Aβ抗體，且藉由腹膜內注射將該抗體投與動物。將BACE抑制劑與鬆散飼料混合(每克食料約0.15至1.5 mg化合物，端視期望劑量而定)，並將其壓縮成食料糰粒。在研究開始時及隨後對於治療之第一個月每週及然後對於研究持續時間每月記錄動物重量。亦在研究過程中以規則間隔監測食物攝取。動物接受總共4個月之研究治療。動物保持其各別膳食直至屍體剖檢為止，該屍體剖檢係在最後抗體注射後一周進行。在屍體剖檢時，將動物麻醉且使用EDTA預先經沖洗之1ml注射器藉由心臟穿刺獲得血液。在冰上收集血液試樣並藉由標準離心分離血漿。隨後，用冷肝素化鹽水灌注動物且移除腦並將其解剖成左半球及右半球。將一個腦半球急速冷凍並加以保存用於組織學分析。將剩餘腦半球解剖成由海馬體、皮質、小腦及中腦組成之組織區段且隨後在冰上冷凍。將血漿及組織試樣在-80℃下儲存直至分析時間為止。
藥物動力學評估
在屍體剖檢時獲得之血漿試樣上測定血漿藥物動力學。在抗原結合ELISA分析中測定血漿抗體含量，其中用抗原(Aβ
p3-42
)塗佈板，且隨後與經稀釋血漿試樣或由抗N3pGlu抗體於分析緩衝液(PBS + 對照鼠類血漿)中之連續稀釋液組成之參照標準品一起培育。在洗滌板之後，用抗鼠類-HRP偶聯之抗體檢測結合之鼠類抗體，隨後用TMB實施顯色。為測定組織(中腦)及血漿中BACE抑制劑之含量，採用以下方法：用甲醇/水(1:1, v/v)連續稀釋0.1 mg/mL之BACE抑制劑原液，以製備工作溶液，然後使用該等工作溶液增加對照血漿及腦均質物以產生1、5、10、20、50、100、500、1000、2000、4000及5000 ng/mL之分析物濃度。在分析之前，用超音波破裂器在3體積甲醇/水(1:4, v/v)中均質化腦試樣。將每一研究試樣之等份試樣、適當校正標準品及對照基質試樣轉移至96孔板且然後與含有內標準品之乙腈混合。在混合後，對試樣實施離心以粒化沈澱之蛋白質。然後將所得上清液之等份試樣轉移至清潔96孔板中且用甲醇/水(1:1, v/v)稀釋，且藉由LC-MS/MS分析10微升等份試樣。使用藉由校正曲線試樣之多元回歸確定之反應對濃度的關係計算分析物濃度。
藥效學評估
藉由夾心ELISA在胍增溶之組織均質物中測定實質Aβ濃度。利用珠粒敲打器技術實施組織提取，其中在含有1 ml矽化玻璃珠之2 ml深孔盤在1 ml 5.5 M胍/50 mM Tris/ 0.5×蛋白酶抑制劑混合劑(pH 8.0)中提取冷凍組織(將密封板振盪兩個時段(各3分鐘))。藉由夾心ELISA針對Aβ
1-40
及Aβ
1-42
分析所得組織溶解物：在2% BSA/PBS-T中1:10稀釋珠粒敲打器試樣且藉助試樣濾板(Millipore)過濾。在於2% BSA/PBST中之0.55 M胍/5 mM Tris中進一步稀釋試樣、空白、標準品、品質控制試樣，之後加載試樣板。在試樣稀釋劑中稀釋參照標準品。將塗佈有15 µg/ml捕獲抗體21F12 (抗Aβ
42
)或2G3 (抗Aβ
40
)之板與試樣一起培育，並利用在2% BSA/PBS-T中稀釋之生物素化3D6 (抗Aβ
1-x
)、隨後中性抗生物素蛋白-HRP (Pierce)於2% BSA/PBS-T中之1:20 K稀釋液實現檢測，且用TMB (Pierce)顯色。自標準曲線內插Aβ含量且以奈克Aβ/毫克組織濕重之形式計算最終組織濃度。在組織學上測定海馬體及皮質中由沈積之Aβ佔據之區域之百分比。將低溫恒溫器連續冠狀切片(7µm至10µm厚)與10 µg/ml生物素化3D6 (抗Aβ
1-x
)或陰性對照鼠類IgG (生物素化)一起培育。採用特異於生物素之二級HRP試劑且用DAB-Plus (DAKO)對沈積之Aβ進行可視化。藉由用Image Pro plus軟體(Media Cybernetics)分析所捕獲影像，在海馬體或皮質內所關注之定義區域中量化免疫反應性Aβ沈積物。 該等研究可顯示，相對於個別單一療法，抗N3pGlu-Aβ抗體(例如hE8L、抗體I或抗體II)與BACE抑制劑(例如下式化合物：
， 或其醫藥上可接受之鹽)之組合療法可增強Aβ減少。 序列 ＜SEQ ID NO: 1；PRT1；人工＞ (HCDR1 -抗體I及抗體II) KASGYTFTDYYIN ＜SEQ ID NO: 2；PRT1；人工＞ (HCDR2 -抗體I及抗體II) WINPGSGNTKYNEKFKG ＜SEQ ID NO: 3；PRT1；人工＞ (HCDR3 -抗體I及抗體II) TREGETVY ＜SEQ ID NO: 4；PRT1；人工＞ (LCDR1 -抗體I及抗體II) KSSQSLLYSRGKTYLN ＜SEQ ID NO: 5；PRT1；人工＞ (LCDR2 -抗體II) YAVSKLDS ＜SEQ ID NO: 6；PRT1；人工＞ (LCDR2 -抗體I) YDVSKLDS ＜SEQ ID NO: 7；PRT1；人工＞ (LCDR3 -抗體I及抗體II) VQGTHYPFT ＜SEQ ID NO: 8；PRT1；人工＞ (HCVR -抗體I及抗體II) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC
KASGYTFTDYYIN
WVRQAPGQGLEWMG
WINPGSGNTKYNEKFKG
RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
TREGETVY
WGQGTLVTVSS ＜SEQ ID NO: 9；PRT1；人工＞ (LCVR - 抗體I) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC
KSSQSLLYSRGKTYLN
WFQQRPGQSPRRLI
YDVSKLDS
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
VQGTHYPFT
FGQGTKLEIK ＜SEQ ID NO: 10；PRT1；人工＞ (LCVR - 抗體II) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC
KSSQSLLYSRGKTYLN
WLQQKPGKAPKLLI
YAVSKLDS
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYY
CVQGTHYPFT
FGQGTKLEIK ＜SEQ ID NO: 11；PRT1；人工＞ (HC - 抗體I及抗體II) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC
KASGYTFTDYYIN
WVRQAPGQGLEWMG
WINPGSGNTKYNEKFKG
RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYY
CTREGETVY
WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ＜SEQ ID NO: 12；PRT1；人工＞ (LC - 抗體I) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC
KSSQSLLYSRGKTYLN
WFQQRPGQSPRRLI
YDVSKLDS
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
VQGTHYPFT
FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ＜SEQ ID NO: 13；PRT1；人工＞ (LC) - 抗體II) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC
KSSQSLLYSRGKTYLN
WLQQKPGKAPKLLI
YAVSKLDS
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYY
CVQGTHYPFT
FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ＜SEQ ID NO: 14；DNA；人工＞用於表現SEQ ID NO: 11之抗體重鏈之例示DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGACTATTATATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTGGCAGTGGTAATACAAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACAAGAGAAGGCGAGACGGTCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT ＜SEQ ID NO: 15；DNA；人工＞用於表現SEQ ID NO: 12之抗體輕鏈之例示DNA GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAAGTCTAGTCAAAGCCTCCTGTACAGTCGCGGAAAAACCTACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATGATGTTTCTAAACTGGACTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCGTGCAAGGTACACACTACCCTTTCACTTTTGGCCAAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGGACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC ＜SEQ ID NO: 16；DNA；人工＞用於表現SEQ ID NO: 13之抗體輕鏈之例示DNA GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTCCTGTACAGTCGCGGAAAAACCTATTTGAACTGGCTCCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGTCTCCAAACTGGACAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCGTGCAGGGTACACATTATCCTTTCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGGACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC ＜SEQ ID NO: 17；PRT1；人工＞ (LCDR1 - hE8L) KSSQSLLYSRGKTYLN ＜SEQ ID NO: 18；PRT1；人工＞ (HCDR2-hE8L) AVSKLDS ＜SEQ ID NO: 19；PRT1；人工＞ (LCDR3-hE8L) VQGTHYPFT ＜SEQ ID NO: 20；PRT1；人工＞ (HCDR1-hE8L) GYTFTDYYIN ＜SEQ ID NO: 21；PRT1；人工＞ (HCDR2-hE8L) WINPGSGNTKYNEKFKG ＜SEQ ID NO: 22；PRT1；人工＞ (HCDR3-hE8L) EGETVY ＜SEQ ID NO: 23；PRT1；人工＞ (LCVR-hE8L) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC
KSSQSLLYSRGKTYLN
WLLQKPGQSPQLLIY
AVSKLDS
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
VQGTHYPFT
FGQGTKLEIK ＜SEQ ID NO: 24；PRT1；人工＞ (HCVR-hE8L) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS
GYTFTDYYIN
WVRQAPGQGLEWMG
WINPGSGNTKYNEKFKG
RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
EGETVY
WGQGTTVTVSS ＜SEQ ID NO: 25；PRT1；人工＞ (LC-hE8L) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC
KSSQSLLYSRGKTYLN
WLLQKPGQSPQLLIY
AVSKLDS
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
VQGTHYPFT
FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ＜SEQ ID NO, 26；PRTl；人工＞ HC-hE8L) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS
GYTFTDYYIN
WVRQAPGQGLEWMG
WINPGSGNTKYNEKFKG
RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
EGETVY
WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ＜ SEQ ID NO: 27 PRT1；人工＞ N3pGlu Aβ [pE]FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA ＜SEQ ID NO: 28；PRT1；人工＞ (Aβ 1-42) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA