TW201902926A - 抗cgrp／抗il-23雙特異性抗體及其用途 - Google Patents

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史蒂芬 約翰 迪馬瑞斯特
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Abstract

本發明提供IgG雙特異性抗體，其結合人類降鈣素基因相關之肽(Calcitonin Gene Related Peptide；CGRP)及人類介白素-23 (human Interleukin-23；IL-23)，且具有對人類CGRP及人類IL-23二者具有高親和力及較強的同時中和特性之表徵。本發明之雙特異性抗體適用於治療各種自身免疫疾病，包括發炎性腸病，諸如克羅恩氏症(Crohn's Disease；CD)及潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis；UC)；及其他自身免疫疾病，諸如牛皮癬性關節炎(psoriatic Arthritis；PsA)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis；AS)及異位性皮膚炎(atopic dermatitis；AtD)。本發明之雙特異性抗體適用於治療與該等前述疾病相關聯之疼痛。

Description

抗CGRP／抗IL-23雙特異性抗體及其用途
本發明屬於藥品領域，特定言之屬於針對降鈣素基因相關之肽(CGRP)及介白素-23 (IL-23)之雙特異性抗體的新領域。本發明之雙特異性抗體預期適用於治療自身免疫發炎疾病，包括發炎性腸病(IBD)，諸如克羅恩氏症(Crohn's Disease；CD)及潰瘍性結腸炎(UC)；及其他自身免疫疾病，包括牛皮癬性關節炎(PsA)、僵直性脊椎炎(AS)及異位性皮膚炎(AtD)。
自身免疫疾病起因於人體對其自身組織產生免疫反應所產生。自身免疫疾病通常為慢性的且可致衰弱且甚至危及生命。IBD（通常表示一組病症，諸如CD及UC）為藉由腸炎及上皮損傷病理地表徵之常見慢性復發性自身免疫發炎疾病。慢性自身免疫疾病之其他形式（諸如PsA、AS及AtD）可影響中軸骨骼、周邊骨骼及/或皮膚。 介白素23 (IL-23)為雜二聚體細胞介素，咸信其在活化誘導慢性發炎所需之一系列發炎性細胞中為重要的。IL-23 (咸信其為IL-6、IL-17、GM-CSF及IL-22分泌物之上游調控因子)由與p40子單元(該p40子單元亦與細胞介素IL-12共用)共價配對之p19子單元(IL23p19)組成。另外，暗指IL-23在記憶/病原T細胞發炎反應中起重要作用且在調節固有淋巴細胞發炎性活性中起作用。有跡象表明，細胞介素IL-6、IL-17、GM-CSF及IL-22之IL-23調節與包括IBD之發炎疾病(諸如CD及UC)及包括牛皮癬、PsA、AS及AtD之其他自身免疫疾病相關聯。 CGRP為由中樞及周邊神經系統之神經分泌之37胺基酸神經肽。CGRP廣泛分佈於感覺神經中，均分佈於周邊及中樞神經系統中且顯示大量不同生物活性。舉例而言，其為強效血管擴張劑，其中微血管對其敏感。當自三叉神經及其他神經纖維釋放時，認為CGRP藉由與特定細胞表面受體結合而介導其生物反應咸信，CGRP在調節及/或傳輸疼痛信號傳導中及神經性炎症中起作用。CGRP經報導隨著在刺激感覺神經後釋放CGRP而在偏頭痛中起作用。在刺激此等纖維後，CGRP之釋放增加了由三叉神經纖維神經支配之組織中之血管滲透性及隨後的血漿蛋白洩漏(血漿蛋白滲出)。另外，研究報導，在罹患偏頭痛之患者中輸注CGRP導致偏頭痛樣症狀。 針對自身免疫疾病(諸如IBD)之當前經FDA批准之治療包括通常用於治療急性炎症之皮質類固醇及生物製品，其中許多(諸如REMICADE® 、ENBREL® 及HUMIRA® )試圖靶向且中和體內之TNFα。經批准用於治療PsA之另一種生物製品包括STELARA® ，其試圖靶向細胞介素IL-12及IL-23之共用p40子單元。當前治療已證實在患者之子集中減輕症狀及減緩一些自身免疫疾病之進展的功效。然而，較大百分比之患者對當前可利用治療無反應(例如，誘導緩解發生在用TNFα中和治療之僅30-50%之CD患者中，且對TNFα中和反應之損耗發生在治療12個月之後的23%與46%之間的患者中)。自身免疫疾病之替代療法包括與IL-23之p19子單元結合之抗體，諸如揭示於美國專利第9,023,358號中之彼等。 儘管用於自身免疫疾病之當前經批准治療治療疾病之發炎性態樣，但該等治療已證明在治療相關聯疼痛中無效。甚至在患有對抗TNFα療法起反應之IBD (CD及UC)的患者中，疼痛仍存在。認為與自身免疫疾病相關聯之炎症驅使中樞對疼痛敏感，從而導致痛覺過敏及觸摸痛。後果為疼痛可甚至在炎症消退之後存在，其中高百分比患者繼續服用止痛藥。患有IBD之患者中之疼痛的標準療法為包括NSAIDS、COX-2抑制劑及鴉片劑之鎮痛劑。目前，患有IBD之患者在引入生物療法之前及之後皆注射類似數目之鎮痛劑處方。與CGRP結合之抗體(諸如描述於美國專利第9,073,991號中之彼等)已表明作為偏頭痛之治療劑。 此等替代療法之一種方法可包括共投與兩種抗體，以供治療自體免疫疾病之不同態樣(例如，疾病及相關聯疼痛之病變)。共投與需要注射兩種分離製品或單次注射兩種不同抗體之共調配物。儘管兩次注射准許劑量及時序之靈活性，但就順應性及疼痛而言對於患者係不方便的。此外，儘管共調配可提供一些劑量靈活性，但通常具有挑戰性或不可能找到具有可接受黏度(呈相對較高濃度)之調配條件且由於兩種抗體之不同分子特性而促進兩種抗體之化學及物理穩定性。另外，共投與及共調配涉及兩種不同藥物療法之添加劑成本，其可增加患者及/或支付者成本。 與兩種不同抗原結合之雙特異性抗體經提出作為與共投與及/或共調配相關聯之問題的解決方案。與人類IL-17及人類IL-23結合之雙特異性抗體已由Mabry R等人描述(Protein Engineering Design and Selection, 第23卷, 第3期, 第115-127頁, 2010)，但似乎先前未描述靶向人類IL-23及人類CGRP之雙特異性抗體。 因此，仍需要用於治療具有疾病改變及疼痛管理特性二者之自身免疫疾病的替代療法，且較佳地此等替代療法包含雙特異性抗體。
本發明提供免疫球蛋白G (IgG)雙特異性抗體，其包含：第一重鏈(HC1)、第一輕鏈(LC1)、第二重鏈(HC2)及第二輕鏈(LC2)，其中HC1與LC1形成至少一個鏈間二硫鍵，HC2與LC2形成至少一個鏈間二硫鍵，且HC1與HC2形成至少一個鏈間二硫鍵，且其中該抗體與人類降鈣素基因相關之肽(CGRP)及人類IL-23之p19子單元結合。 本發明進一步提供IgG雙特異性抗體，其包含 a)第一重鏈(HC1)，其包含第一重鏈可變區(HC1VR)，其中HC1VR包含胺基酸序列H1CDR-1、H1CDR-2及H1CDR-3，且其中H1CDR-1為SEQ ID NO: 12，H1CDR-2為SEQ ID NO: 14，且H1CDR-3為SEQ ID NO: 16； b)第一輕鏈(LC1)，其包含輕鏈可變區(LC1VR)，其中LC1VR包含胺基酸序列L1CDR-1、L1CDR-2及L1CDR-3，且其中L1CDR-1為SEQ ID NO: 34，L1CDR-2為SEQ ID NO: 36，且L1CDR-3為SEQ ID NO: 38； c)第二重鏈(HC2)，其包含第二重鏈可變區(HC2VR)，其中HC2VR包含胺基酸序列H2CDR-1、H2CDR-2及H2CDR-3，且其中H2CDR-1為SEQ ID NO: 23，H2CDR-2為SEQ ID NO: 25，且H2CDR-3為SEQ ID NO: 27；及 d)第二輕鏈(LC2)，包含第二輕鏈可變區(LC2VR)，其中LC2VR包含胺基酸序列L2CDR-1、L2CDR-2及L2CDR-3，且其中L2CDR-1為SEQ ID NO: 42，L2CDR-2為SEQ ID NO: 44，且L2CDR-3為SEQ ID NO: 46， 其中HC1與LC1形成至少一個鏈間二硫鍵，HC2與LC2形成至少一個鏈間二硫鍵，且HC1與HC2形成至少一個鏈間二硫鍵，且其中該抗體與人類降鈣素基因相關之肽(CGRP)及人類IL-23之p19子單元結合。 在本發明之IgG雙特異性抗體之一較佳實施例中，HC1及HC2為人類IgG1 HC，LC1為人類κ LC且LC2為人類λ輕鏈，其中 (i)HC1具有HC1VR之位置39 (Kabat)處之酪胺酸殘基、HC1VR之位置105 (Kabat)處之麩醯胺酸殘基、HC1 CH 1結構域(HC1CH 1)之位置127 (Kabat)處之半胱胺酸殘基、HC1鉸鏈結構域之位置228 (Kabat)處之天冬胺酸殘基、HC1鉸鏈結構域之位置222 (Kabat)處之甘胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置356 (EU)處之甘胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置357 (EU)處之天冬胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置364 (EU)處之麩醯胺酸殘基以及HC1 CH 3結構域之位置407 (EU)處之丙胺酸殘基； (ii)HC2具有HC2VR之位置39 (Kabat)處之離胺酸殘基、HC2 CH 1結構域之位置166 (Kabat)處之丙胺酸殘基、HC2 CH 1結構域之位置170 (Kabat)處之甘胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置349 (EU)處之絲胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置366 (EU)處之甲硫胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置370 (EU)處之酪胺酸殘基以及HC2 CH 3結構域之位置409 (EU)處之纈胺酸殘基； (iii)LC1具有LC1VR之位置38 (Kabat)處之精胺酸殘基、LC1VR之位置42 (Kabat)處之天冬胺酸殘基及LC1 CL 結構域之位置122 (Kabat)處之離胺酸殘基； (iv)LC2具有LC2VR之位置1 (Kabat)處之精胺酸殘基、LC2VR之位置38處之天冬胺酸殘基、LC2 CL 結構域之位置135 (Kabat)處之酪胺酸殘基以及LC2 CL 結構域之位置176 (Kabat)處之色胺酸殘基。 在本發明之IgG雙特異性抗體之又一較佳實施例中，HC1具有HC1 CH 2結構域之位置234 (Kabat)處之丙胺酸殘基及HC1 CH 2結構域之位置235 (Kabat)處之丙胺酸殘基，且HC2具有HC2 CH 2結構域之位置234 (Kabat)處之丙胺酸殘基及HC2 CH 2結構域之位置235 (Kabat)處之丙胺酸殘基。 在本發明之IgG雙特異性抗體之一較佳實施例中，HC1及HC2為人類IgG4 HC，LC1為人類κ LC且LC2為人類λ輕鏈，其中 (i)HC1具有HC1VR之位置39 (Kabat)處之酪胺酸殘基、HC1VR之位置105 (Kabat)處之麩醯胺酸殘基、HC1 CH 1結構域(HC1CH 1)之位置127 (Kabat)處之半胱胺酸殘基、HC1鉸鏈結構域之位置228 (Kabat)處之天冬胺酸殘基、HC1鉸鏈結構域之位置222 (Kabat)處之甘胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置356 (EU)處之甘胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置357 (EU)處之天冬胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置364 (EU)處之麩醯胺酸殘基以及HC1 CH 3結構域之位置407 (EU)處之丙胺酸殘基； (ii)HC2具有HC2VR之位置39 (Kabat)處之離胺酸殘基、HC2 CH 1結構域之位置166 (Kabat)處之丙胺酸殘基、HC2 CH 1結構域之位置170 (Kabat)處之甘胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置349 (EU)處之絲胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置366 (EU)處之甲硫胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置370 (EU)處之酪胺酸殘基以及HC2 CH 3結構域之位置409 (EU)處之纈胺酸殘基； (iii)LC1具有LC1VR之位置38 (Kabat)處之精胺酸殘基、LC1VR之位置42 (Kabat)處之天冬胺酸殘基及LC1 CL 結構域之位置122 (Kabat)處之離胺酸殘基； (iv)LC2具有LC2VR之位置1 (Kabat)處之精胺酸殘基、LC2VR之位置38處之天冬胺酸殘基、LC2 CL 結構域之位置135 (Kabat)處之酪胺酸殘基以及LC2 CL 結構域之位置176 (Kabat)處之色胺酸殘基。 在本發明之IgG雙特異性抗體之另一實施例中，該雙特異性抗體包含 a)第一重鏈(HC1)，其包含具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的第一重鏈可變區(HC1VR)； b)第一輕鏈(LC1)，其包含具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的第一輕鏈可變區(LC1VR)； c)第二重鏈(HC2)，其包含具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的第二重鏈可變區(HC2VR)；及 d)第二輕鏈(LC2)，其包含具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的第二輕鏈可變區(LC2VR)， 其中HC1與LC1形成至少一個鏈間二硫鍵，HC2與LC2形成至少一個鏈間二硫鍵，且HC1與HC2形成至少一個鏈間二硫鍵，且其中抗體與人類CGRP及人類IL-23之p19子單元結合。 在本發明之IgG雙特異性抗體之一較佳實施例中，HC1及HC2為人類IgG1 HC，LC1為人類κ LC且LC2為人類λ LC，其中 (i)HC1具有HC1 CH 1結構域(HC1CH 1)之位置127 (Kabat)處之半胱胺酸殘基、HC1鉸鏈結構域之位置228 (Kabat)處之天冬胺酸殘基、HC1鉸鏈結構域之位置222 (Kabat)處之甘胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置356 (EU)處之甘胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置357 (EU)處之天冬胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置364 (EU)處之麩醯胺酸殘基以及HC1 CH 3結構域之位置407 (EU)處之丙胺酸殘基； (ii)HC2具有HC2 CH 1結構域之位置166 (Kabat)處之丙胺酸殘基、HC2 CH 1結構域之位置170 (Kabat)處之甘胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置349 (EU)處之絲胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置366 (EU)處之甲硫胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置370 (EU)處之酪胺酸殘基以及HC2 CH 3結構域之位置409 (EU)處之纈胺酸殘基； (iii)LC1具有LC1 CL 結構域之位置122 (Kabat)處之離胺酸殘基； (iv) LC2具有LC2 CL 結構域之位置135 (Kabat)處之酪胺酸殘基及LC2 CL 結構域之位置176 (Kabat)處之色胺酸殘基。 在本發明之IgG雙特異性抗體之又一較佳實施例中，HC1具有HC1 CH 2結構域之位置234 (Kabat)處之丙胺酸殘基及HC1 CH 2結構域之位置235 (Kabat)處之丙胺酸殘基，且HC2具有HC2 CH 2結構域之位置234 (Kabat)處之丙胺酸殘基及HC2 CH 2結構域之位置235 (Kabat)處之丙胺酸殘基。 在本發明之IgG雙特異性抗體之一較佳實施例中，HC1及HC2為人類IgG4 HC，LC1為人類κ LC且LC2為人類λ LC，其中 (i)HC1具有HC1 CH 1結構域(HC1CH 1)之位置127 (Kabat)處之半胱胺酸殘基、HC1鉸鏈結構域之位置228 (Kabat)處之天冬胺酸殘基、HC1鉸鏈結構域之位置222 (Kabat)處之甘胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置356 (EU)處之甘胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置357 (EU)處之天冬胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置364 (EU)處之麩醯胺酸殘基以及HC1 CH 3結構域之位置407 (EU)處之丙胺酸殘基； (ii)HC2具有HC2 CH 1結構域之位置166 (Kabat)處之丙胺酸殘基、HC2 CH 1結構域之位置170 (Kabat)處之甘胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置349 (EU)處之絲胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置366 (EU)處之甲硫胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置370 (EU)處之酪胺酸殘基以及HC2 CH 3結構域之位置409 (EU)處之纈胺酸殘基； (iii)LC1具有LC1 CL 結構域之位置122 (Kabat)處之離胺酸殘基；及 (iv)LC2具有LC2 CL 結構域之位置135 (Kabat)處之酪胺酸殘基及LC2 CL 結構域之位置176 (Kabat)處之色胺酸殘基。 在本發明之IgG雙特異性抗體之另一實施例中，該雙特異性抗體包含 a)第一重鏈(HC1)，其具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列； b)第一輕鏈(LC1)，其具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列； c)第二重鏈(HC2)，其具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列；及 d)第二輕鏈(LC2)，其具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列， 其中HC1與LC1形成鏈間二硫鍵，HC2與LC2形成鏈間二硫鍵，且HC1與HC2形成至少一個鏈間二硫鍵，且其中抗體與人類CGRP及人類IL-23之p19子單元結合。 本發明之雙特異性抗體為熱穩定及物理穩定的。此外，本發明之雙特異性抗體亦可展現低聚合。此外，本發明之雙特異性抗體亦可中和人類CGRP及人類IL23p19 (IL-23之p19子單元)，且同時結合兩個配位體。當前所主張之抗體亦可避免尋找必須滿足兩種不同分離抗體之不同分子特性之調配條件的挑戰。 此外，產生與具有完整IgG架構之人類CGRP及人類IL-23之p19子單元二者結合之雙特異性抗體的能力在抗體工程改造中為一挑戰。特定問題包括LC錯配(例如，抗IL-23輕鏈與抗CGRP重鏈錯配，及/或抗CGRP輕鏈與抗IL-23重鏈錯配)及半體形成。為最小化LC錯配及半體形成，突變經工程改造為HC-LC對以在以下介面中產生經設計殘基：重鏈-輕鏈可變(VH /VL )結構域、重鏈-輕鏈恆定(CH 1/CL )結構域及重鏈恆定域(CH 3)。突變誘導本發明之雜二聚體雙特異性抗體恰當組裝為完整IgG架構。 給出本文中所提供之胺基酸序列，一般熟習此項技術者可使用此知識來設計DNA分子以編碼及表現上文描述之任何IgG雙特異性抗體或其片段。本發明因此涵蓋編碼根據本發明之雙特異性抗體或其片段的所有DNA序列。 特定言之，本發明提供一種包含編碼重鏈(HC)多肽之聚核苷酸序列的DNA分子，該重鏈(HC)多肽包含具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的HCVR。 本發明進一步提供一種包含編碼輕鏈(LC)多肽之聚核苷酸序列的DNA分子，該輕鏈(LC)多肽包含具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的LCVR。 本發明又另外提供一種包含編碼HC多肽之聚核苷酸序列的DNA分子，該HC多肽包含具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCVR。 本發明又另外提供一種包含編碼LC多肽之聚核苷酸序列之DNA分子，該LC多肽包含具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的LCVR。 本發明又另外提供一種包含編碼HC多肽之聚核苷酸序列的DNA分子，該HC多肽具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。 本發明又另外提供一種包含編碼LC多肽之聚核苷酸序列的DNA分子，該LC多肽具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。 本發明又另外提供一種包含編碼HC多肽之聚核苷酸序列的DNA分子，該HC多肽具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。 本發明又另外提供一種包含編碼LC多肽之聚核苷酸序列的DNA分子，該LC多肽具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。 在一較佳實施例中，上文描述之本發明之聚核苷酸可操作地連接至表現控制序列。 本發明提供一種表現載體，其包含：編碼HC多肽之聚核苷酸序列，該HC多肽包含具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的HCVR；及編碼LC多肽之聚核苷酸序列，該LC多肽包含具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的LCVR，其中該等聚核苷酸序列可操作地連接至表現控制序列。 本發明進一步提供一種表現載體，其包含：編碼HC多肽之聚核苷酸序列，該HC多肽包含具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCVR；及編碼LC多肽之聚核苷酸序列，該LC多肽包含具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的LCVR，其中該等聚核苷酸序列可操作地連接至表現控制序列。 本發明又另外提供一種表現載體，其包含：編碼第一HC多肽之聚核苷酸序列，該第一HC多肽包含具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的HCVR；編碼第一LC多肽之聚核苷酸序列，該第一LC多肽包含具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的LCVR；編碼第二HC多肽之聚核苷酸序列，該第二HC多肽包含具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCVR；及編碼第二LC多肽之聚核苷酸序列，該第二LC多肽包含具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的LCVR，其中該等聚核苷酸序列可操作地連接至表現控制序列。 本發明提供一種表現載體，其包含：編碼HC多肽之聚核苷酸序列，該HC多肽具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列；及編碼LC多肽之聚核苷酸序列，該LC多肽具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列，其中該等聚核苷酸序列可操作地連接至表現控制序列。 本發明進一步提供一種表現載體，其包含：編碼HC多肽之聚核苷酸序列，該HC多肽具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列；及編碼LC多肽之聚核苷酸序列，該LC多肽具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，其中該等聚核苷酸序列可操作地連接至表現控制序列。 本發明又另外提供一種表現載體，其包含：編碼第一HC多肽之聚核苷酸序列，該第一HC多肽具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列；編碼第一LC多肽之聚核苷酸序列，該第一LC多肽具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列；編碼第二HC多肽之聚核苷酸序列，該第二HC多肽具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列；及編碼第二LC多肽之聚核苷酸序列，該第二LC多肽具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，其中該等聚核苷酸序列可操作地連接至表現控制序列。 本發明提供一種包含DNA分子之重組宿主細胞，該DNA分子包含：編碼第一HC多肽之聚核苷酸序列，該第一HC多肽包含具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的HCVR；編碼第一LC多肽之聚核苷酸序列，該第一LC多肽包含具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的LCVR；編碼第二HC多肽之聚核苷酸序列，該第二HC多肽包含具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCVR；及編碼第二LC多肽之聚核苷酸序列，該第二LC多肽包含具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的LCVR，其中該細胞能夠表現本發明之雙特異性抗體，其中第一HC與第一LC形成至少一個鏈間二硫鍵，第二HC與第二LC形成至少一個鏈間二硫鍵，且第一HC與第二HC形成至少一個鏈間二硫鍵，且其中抗體與人類CGRP及人類IL-23之p19子單元結合。 本發明提供一種重組宿主細胞，其包含：包含編碼第一HC多肽之聚核苷酸序列及編碼第一LC多肽之聚核苷酸序列的DNA分子，該第一HC多肽具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列，該第一LC多肽具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列；及包含編碼第二HC多肽之聚核苷酸序列及編碼第二LC多肽之聚核苷酸序列的DNA分子，該第二HC多肽具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，該第二LC多肽具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，其中該細胞能夠表現本發明之雙特異性抗體，其中第一HC與第一LC形成至少一個鏈間二硫鍵，第二HC與第二LC形成至少一個鏈間二硫鍵，且第一HC與第二HC形成至少一個鏈間二硫鍵，且其中抗體與人類CGRP及人類IL-23之p19子單元結合。 本發明亦提供一種用於產生本發明之雙特異性抗體的方法，該方法包含在使得雙特異性抗體表現之條件下培育本發明之重組宿主細胞，且回收經表現雙特異性抗體。 本發明亦提供一種由該方法產生之根據本發明之雙特異性抗體。 較佳地，重組宿主細胞為選自由以下組成之群的哺乳動物宿主細胞：CHO、NS0、HEK293及COS細胞。 本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之雙特異性抗體及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。 本發明提供一種治療發炎性腸病(IBD)的方法，其包含向有需要之患者投與有效量的根據本發明之IgG雙特異性抗體。 在一較佳實施例中，IBD為克羅恩氏症(CD)。 在另一較佳實施例中，IBD為潰瘍性結腸炎(UC)。 本發明進一步提供一種治療與發炎性腸病(IBD)相關聯之疼痛的方法，其包含向有需要之患者投與有效量的根據本發明之IgG雙特異性抗體。 在一較佳實施例中，IBD為克羅恩氏症(CD)且疼痛與CD相關聯。 在一另外較佳實施例中，IBD為潰瘍性結腸炎(UC)且疼痛與UC相關聯。 本發明又另外提供一種治療牛皮癬的方法，其包含向有需要之患者投與有效量的根據本發明之IgG雙特異性抗體。 本發明又另外提供一種治療與牛皮癬相關聯之疼痛的方法，其包含向有需要之患者投與有效量的根據本發明之IgG雙特異性抗體。 本發明又另外提供一種治療掌蹠膿皰病的方法，其包含向有需要之患者投與有效量的根據本發明之IgG雙特異性抗體。 本發明又另外提供一種治療與掌蹠膿皰病相關聯之疼痛的方法，其包含向有需要之患者投與有效量的根據本發明之IgG雙特異性抗體。 本發明又另外提供一種治療牛皮癬性關節炎(PsA)的方法，其包含向有需要之患者投與有效量的根據本發明之IgG雙特異性抗體。 本發明又另外提供一種治療與牛皮癬性關節炎(PsA)相關聯之疼痛的方法，其包含向有需要之患者投與有效量的根據本發明之IgG雙特異性抗體。 本發明又另外提供一種治療僵直性脊椎炎(AS)的方法，其包含向有需要之患者投與有效量的根據本發明之IgG雙特異性抗體。 本發明又另外提供一種治療與僵直性脊椎炎(AS)相關聯之疼痛的方法，其包含向有需要之患者投與有效量的根據本發明之IgG雙特異性抗體。 本發明又另外提供一種治療異位性皮膚炎(AtD)的方法，其包含向有需要之患者投與有效量的根據本發明之IgG雙特異性抗體。 本發明又另外提供一種治療與異位性皮膚炎(AtD)相關聯之疼痛的方法，其包含向有需要之患者投與有效量的根據本發明之IgG雙特異性抗體。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於療法。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於治療發炎性腸病(IBD)。 在一較佳實施例中，IBD為克羅恩氏症(CD)。 在一另外較佳實施例中，IBD為潰瘍性結腸炎(UC)。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於治療與發炎性腸病(IBD)相關聯之疼痛。 在一較佳實施例中，IBD為克羅恩氏症(CD)且疼痛與CD相關聯。 在一另外較佳實施例中，IBD為潰瘍性結腸炎(UC)且疼痛與UC相關聯。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於治療牛皮癬。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於治療與牛皮癬相關聯之疼痛。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於治療掌蹠膿皰病。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於治療與掌蹠膿皰病相關聯之疼痛。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於治療牛皮癬性關節炎(PsA)。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於治療與牛皮癬性關節炎(PsA)相關聯之疼痛。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於治療僵直性脊椎炎(AS)。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於治療與僵直性脊椎炎(AS)相關聯之疼痛。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於治療異位性皮膚炎(AtD)。 本發明又另外提供一種根據本發明之IgG雙特異性抗體，其用於治療與異位性皮膚炎(AtD)相關聯之疼痛。 本發明之另一實施例包含本發明之雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療自身免疫疾病用之藥劑。 本發明之又一實施例包含本發明之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療發炎性腸病(IBD)用之藥劑。 在一較佳實施例中，IBD為克羅恩氏症(CD)。 在一另外較佳實施例中，IBD為潰瘍性結腸炎(UC)。 本發明之一額外實施例包含本發明之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療與發炎性腸病(IBD)相關聯之疼痛用的藥劑。 在一較佳實施例中，IBD為克羅恩氏症(CD)且疼痛與CD相關聯。 在一另外較佳實施例中，IBD為潰瘍性結腸炎(UC)且疼痛與UC相關聯。 本發明之一額外實施例包含本發明之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療牛皮癬用之藥劑。 本發明之一額外實施例包含本發明之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療與牛皮癬相關聯之疼痛用的藥劑。 本發明之一額外實施例包含本發明之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療掌蹠膿皰病用之藥劑。 本發明之一額外實施例包含本發明之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療與掌蹠膿皰病相關聯之疼痛用的藥劑。 本發明之一額外實施例包含本發明之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療牛皮癬性關節炎(PsA)用之藥劑。 本發明之一額外實施例包含本發明之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療與牛皮癬性關節炎(PsA)相關聯之疼痛用的藥劑。 本發明之一額外實施例包含本發明之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療僵直性脊椎炎(AS)用之藥劑。 本發明之一額外實施例包含本發明之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療與僵直性脊椎炎(AS)相關聯之疼痛用的藥劑。 本發明之一額外實施例包含本發明之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療異位性皮膚炎(AtD)用之藥劑。 本發明之一額外實施例包含本發明之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療與異位性皮膚炎(AtD)相關聯之疼痛用的藥劑。
定義 在用於本文中時，術語「雙特異性抗體」係指雜二聚體IgG分子或其片段，亦即F(ab')2 片段，其中因為兩條不同重鏈及兩條不同輕鏈形成該抗體，因此IgG抗體之各臂對其同源抗原會展現出選擇性單價結合。在本發明中，該抗體其中之一個臂結合人類CGRP (SEQ ID NO: 1)，且另一個臂結合人類IL-23之p19子單元(SEQ ID NO: 2)，如圖1中所說明。 本發明之雙特異性抗體與人類IL-23之p19子單元結合，但不與同IL-12共用之人類IL-23之p40子單元結合，亦即雙特異性抗體與人類IL-23結合但不與人類IL-12結合。 本發明之抗體為IgG型抗體且具有經由鏈內及鏈間二硫鍵交聯的「重」鏈及「輕」鏈。各重鏈由N末端HCVR及重鏈恆定區(「HCCR」)組成。各輕鏈由LCVR及輕鏈恆定區(「LCCR」)組成。輕鏈各自與重鏈形成二硫鍵，且兩條重鏈在彼此之間形成兩個二硫鍵。 重鏈之恆定區含有CH 1、鉸鏈、CH 2及CH 3結構域。CH 1出現在HCVR之後；CH 1及HCVR形成Fab之重鏈部分。CH 2出現在鉸鏈區之後及CH 3之前。CH 3出現在CH 2之後且在重鏈之羧基端末端處。 輕鏈之恆定區含有一個域CL 。CL 出現在LCVR之後；CL 及LCVR形成Fab之輕鏈部分。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。 如在本文中可互換使用，「親本抗體(parent antibody/parental antibody)」為由胺基酸序列編碼之抗體，該胺基酸序列用於製備本發明之雙特異性抗體之IgG之一個臂，例如經由胺基酸取代及結構更改。親本抗體可為鼠類抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。 術語「Kabat編號」或「Kabat標記」在本文中可互換使用。此等術語(其在此項技術中為公認的)係指對比抗體之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基更可變(亦即，高變)之胺基酸殘基進行編號的系統(Kabat等人, Ann. NY Acad. Sci., 第190卷, 第382-93頁, 1971；Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication 第91-3242期, 1991)。 術語「EU編號」或「EU標記」在本文中可互換使用。此等術語(其在此項技術中為公認的)係指基於www.imgt.org上可利用之International Immunogenetics Information System® 將胺基酸殘基編號為可變及恆定結構域的系統。 在本文中可互換使用之術語「患者」、「個體」及「個人」係指動物，較佳地該術語係指人類。在某些實施例中，個體(較佳人類)進一步具有罹患會受益於人類IL-23及人類CGRP二者之減少水準或減少生物活性的疾病或病症或病況(例如，自體免疫病症)之特徵。在另一實施例中，個體(較佳人類)進一步具有處於罹患會受益於人類IL-23及人類CGRP二者之減少水準或減少生物活性的病症、疾病或病況的風險下的特徵。雙特異性抗體工程改造 本發明之IgG雙特異性抗體為雜二聚體，其中因為兩條不同重鏈及兩條不同輕鏈形成該抗體，所以該抗體之各臂對其同源抗原會展現出選擇性單價結合：該抗體其中一個臂結合人類CGRP (SEQ ID NO: 1)，而另一個臂結合人類IL-23之p19子單元(SEQ ID NO: 2)。 產生具有完整IgG架構之雙特異性抗體的能力在抗體工程改造中為長期以來的挑戰。關於產生完整IgG雙特異性抗體之一個方案需要共表現編碼兩個不同HC-LC對之核酸，當表現該等核酸時，組裝以形成包含兩個不同Fab之單一抗體。然而，此方法仍存在挑戰。特定言之，每一所需Fab之經表現多肽必須以良好特異性組裝以減少產生錯配副產物，且所得雜四聚體必須以良好穩定性組裝。藉由將修飾引入至HC-HC介面之區域中而導引特定HC-HC對之組裝的程序已揭示於此項技術中。(參見Klein等人, mAbs, 第4卷, 第6期, 第1-11頁, 2012；Carte等人, J. Immunol. Methods, 第248卷, 第7-15頁, 2001；Gunasekaran等人, J. Biol. Chem., 第285卷, 第19637-19646頁, 2010；Zhu等人, Protein Science, 第6卷, 第781-788頁, 1997；及Igawa等人, Protein Eng. Des. Sel., 第23卷, 第667-677頁, 2010)。然而，仍存在對替代方法之需求且本發明之雙特異性抗體經工程改造以驅使其之恰當組裝。 親本抗CGRP及抗IL-23抗體具有人類κ輕鏈恆定區。儘管如此，已發現將雙特異性抗體之IL-23部分改變為λ輕鏈恆定區改良了本發明之雙特異性抗體之恰當組裝。因此，對於本發明之雙特異性抗體，抗體之抗CGRP臂之輕鏈恆定區為κ輕鏈且抗體之抗IL-23p19臂之輕鏈恆定區為λ輕鏈。 另外，相對於生殖系參考序列之數個工程改造突變驅使特定雜二聚體作用。抗體之親本抗CGRP臂及經修飾親本抗IL-23臂(λ輕鏈)之生殖系參考序列具有如下之抗體： 抗CGRP重鏈：可變架構1-e/JH2及人類IgG1 (同種異型IGHG1*01)； 抗CGRP輕鏈：可變架構O12/JK4及κ常量(同種異型IGKC*01)； 抗IL-23p19重鏈：可變架構1-69/JH6及人類IgG1 (同種異型IGHG1*01)；及 抗IL-23p19輕鏈：可變架構L11/JK4及λ常量(同種異型IGLC2*01) 驅使雜二聚體作用之工程改造突變概括於下表1中。胺基酸之編號應用線性編號。Kabat/EU編號將提供於括弧中以允許將免疫球蛋白與不同互補決定區(CDR)長度及子類別進行比較。特定言之，Kabat編號將提供於括弧中以用於VH 、VL 、CH 1、鉸鏈及CL 結構域中進行之突變，且EU編號將提供於括弧中以用於CH 2及CH 3結構域中進行之突變。表 1 ：本發明之雙特異性抗體中之工程改造突變 將上文所描述之突變併入至VH 、CH 1、鉸鏈及CH 3結構域內之重鏈序列中及VL 及CL 結構域內之輕鏈序列中。進行VH 、VL 、鉸鏈、CH 1及CL 突變以有利於必需輕鏈及重鏈對之天然配對且不利於輕鏈錯配。進行CH 3突變以有利於對兩條不同重鏈之雜二聚體配對且不利於形成同源二聚體。 另外，HC及LC之C端之截斷可減少不均一性並改良穩定性。相對於上文提及之生殖系參考序列，抗CGRP HC可藉由移除位置448處之離胺酸(根據EU編號，des 448K；des 447K)截斷，抗IL-23 HC可藉由移除位置444處之離胺酸(根據EU編號，des 444K；des 447K)截斷，抗IL-23 LC可藉由移除位置212處之絲胺酸(根據EU編號，des S212；des S215)截斷。 視情況，本發明之某些抗體含有來源於人類IgG1 之Fc部分。IgG1 熟知可與Fc-γ受體家族(FcγR)之蛋白質以及C1q結合。與此等受體的相互作用可誘導抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。因此，對於本發明之某些抗體將某些胺基酸取代引入至IgG1 Fc中以去除免疫效應功能。抗體之抗CGRP部分之CH 2區域中之突變可包括位置236及237 (根據Kabat編號，234及235)。相對於上文提及之生殖系參考序列的特定突變包括L236A (L234A)及L237A (L235A)。抗體之抗IL-23部分之CH 2區域中之突變可包括位置232及233 (根據Kabat編號，234及235)。相對於上文提及之生殖系參考序列的特定突變包括L232A (L234A)及L233A (L235A)。 儘管工程改造突變為相對於上文提及之生殖系參考序列的經描述水準，熟習此項技術者將公認，可利用替代生殖系序列，限制條件為已定義胺基酸位於最終工程改造IgG雙特異性抗體中之經指示位置處。舉例而言，本發明之雙特異性抗體可具有不同IgG1 HC同種異型或IgG4 HC同型，限制條件為以下胺基酸位於最終工程改造IgG雙特異性抗體中之根據Kabat及EU編號的以下位置處： 抗CGRP HC：VH - Y39 (Kabat)、Q105 (Kabat) CH 1- C127 (Kabat) Hinge- D228 (Kabat)、C222G (Kabat) CH 3- G356 (EU)、D357 (EU)、Q364 (EU)、A407 (EU) 抗IL-23 HC：VH - K39 (Kabat)、A166 (Kabat)、G170 (Kabat) CH 3- S349 (EU)、M366 (EU)、Y370 (EU)、V409 (EU) 類似地，本發明之雙特異性抗體可具有不同κ或λ LC同種異型，限制條件為以下胺基酸位於最終工程改造IgG雙特異性抗體中之根據Kabat及EU編號的以下位置處： 抗CGRP LC：VL - R38 (Kabat)、D42 (Kabat) CL - K122 (Kabat) 抗IL-23 LC：VL - R1 (Kabat)、D38 (Kabat) CL - Y135 (Kabat)、W176 (Kabat) 當表現於某些生物系統中時，具有Fc序列之抗體在Fc區中糖基化。通常，在抗體Fc區中，在高度保守性N-糖基化位點發生糖基化。N-聚糖通常連接至天冬醯胺。抗體亦可在其他位置糖基化。 本發明之例示性IgG雙特異性抗體之各種區域之關係展示於表2(a)及2(b)中。胺基酸之編號應用線性編號。Kabat (對於VH 、VL 、CH 1、鉸鏈及CL 結構域)及EU (對於CH 2及CH 3結構域)編號可用於判定描述於表2(a)及2(b)中之例示雙特異性抗體中之工程改造突變之位置。表 2 ( a ) ：重鏈胺基酸序列 表 2 ( b ) ：輕鏈胺基酸序列 雙特異性抗體結合及活性 本發明之雙特異性抗體結合人類CGRP及人類IL23p19二者且活體外或活體內中和至少一個人類CGRP生物活性及至少一個人類IL-23生物活性。在活體外人類CGRP之存在及不存在下，本發明之雙特異性抗體為人類IL-23之抑制劑。在活體外人類IL-23之存在及不存在下，本發明之雙特異性抗體為人類CGRP之抑制劑。 本發明之例示性雙特異性抗體(抗體1)表徵為在37℃下具有在7.1 ± 3.8 pM範圍內之針對人類CGRP及在0.6 ± 0.1 nM範圍內之針對人類IL23p19的結合親和力(KD )。 本發明之雙特異性抗體有效地中和CGRP且此中和不受人類IL-23之飽和量之存在的影響。本發明之雙特異性抗體有效地中和人類IL-23且此中和不受人類CGRP之飽和量之存在的影響。雙特異性抗體表現 編碼HCVR區之經分離DNA可藉由將編碼HCVR之DNA可操作地連接至編碼重鏈恆定區之另一DNA分子而轉化成全長重鏈基因。人類以及其他哺乳動物重鏈恆定區基因之序列在本領域中已知。包涵此等區域之DNA片段可(例如)藉由PCR擴增獲得。 編碼LCVR區之經分離DNA可藉由將編碼LCVR之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區之另一DNA分子而轉化成全長輕鏈基因。人類以及其他哺乳動物輕鏈恆定區基因之序列在此項技術中已知。包含此等區域之DNA片段可藉由PCR擴增來獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。較佳地，對於本發明之抗體，抗體之抗CGRP部分之輕鏈恆定區為κ輕鏈且抗體之抗IL-23部分之輕鏈恆定區為λ輕鏈。 本發明之聚核苷酸在已將序列可操作地連接至表現控制序列之後表現於宿主細胞中。能夠導引可操作地連接至其的基因之表現的表現載體在此項技術中已知。表現載體可編碼有助於多肽自宿主細胞分泌的信號肽。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽。表現載體在宿主生物體中通常可以游離基因體或宿主染色體DNA之整體部分形式複製。通常，表現載體將含有選擇標記(例如，四環素、新黴素及二氫葉酸還原酶)以准許偵測經所需DNA序列轉化之彼等細胞。 第一HC多肽鏈(抗CGRP)及第一LC多肽鏈(抗CGRP)可由其可操作地連接之不同啟動子獨立地表現於一個載體中，或替代地，第一HC及LC多肽鏈(抗CGRP)可由其可操作地連接之不同啟動子獨立地表現於兩個載體中，一個表現第一HC多肽鏈(抗CGRP)且另一個表現第一LC多肽鏈(抗CGRP)。類似地，第二HC多肽鏈(抗IL-23)及第二LC多肽鏈(抗IL-23)可由其可操作地連接之不同啟動子獨立地表現於一個載體中，或替代地，第二HC及LC多肽鏈(抗IL-23)可由其可操作地連接之不同啟動子獨立地表現於兩個載體中，一個表現第二HC多肽鏈(抗IL-23)且另一個表現第二LC多肽鏈(抗IL-23)。 宿主細胞包括經表現第一HC多肽鏈、第一LC多肽鏈、第二HC多肽鏈及第二LC多肽鏈之一或多個表現載體穩定或瞬時轉染、轉化、轉導或感染之細胞。產生本發明之雙特異性抗體的宿主細胞株之產生及分離可使用此項技術中已知之標準技術實現。哺乳動物細胞為用於表現雙特異性抗體之較佳宿主細胞。特定哺乳動物細胞為HEK 293、NS0、DG-44及CHO。較佳地，將雙特異性抗體分泌至培養宿主細胞，可自其回收或純化雙特異性抗體之培養基中。 在此項技術中熟知，抗體之哺乳動物表現導致糖基化。通常，在抗體Fc區中，在高度保守性N-糖基化位點發生糖基化。N-聚糖通常連接至天冬醯胺。借助於實例，呈現於表2(a)中之例示性雙特異性抗體之CGRP臂之HC在N299 (根據EU編號，N297)處經糖基化，且呈現於表2(a)中之例示性雙特異性抗體之IL-23之HC在N295 (根據EU編號，N297)處經糖基化。 可藉由習知技術純化其中已分泌有雙特異性抗體之培養基。舉例而言，可使用習知方法將培養基塗覆至蛋白質A或G管柱且自蛋白質A或G管柱溶離。可藉由常見技術，包括尺寸排阻、疏水性相互作用、離子交換或羥磷灰石層析有效移除可溶聚集體及多聚體。產物可緊接著經冷凍(例如，在-70℃下)、冷藏或可經凍乾。可採用蛋白質提純之不同方法且此等方法為本領域中已知的且描述於例如Deutscher，Method in Enzymology 182: 83-89 (1990)及Scopes，Protein Purification:Principles and Practice , 第3版, Springer, NY (1994)中。治療用途 如本文中所使用，「治療(treatment/treating)」意欲指其中可存在減緩、中斷、遏制、控制或停止本文中所描述之病症之進展，但不必指示所有病症症狀之完全消除的所有方法。治療包括投與本發明之雙特異性抗體以用於治療哺乳動物(特定言之，人類)之疾病或病況，該疾病或病況受益於CGRP及/或IL-23之減少水準或CGRP及/或IL-23之減少生物活性，且包括：(a)抑制疾病之進一步進展，亦即遏制其發展；及(b)緩解疾病，亦即造成疾病或病症之消退或緩解其症狀或併發症。 本發明之雙特異性抗體預期治療自身免疫疾病，包括：自身免疫發炎疾病，諸如發炎性腸病(克羅恩氏症及潰瘍性結腸炎)；及其他自身免疫疾病，包括牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎及異位性皮膚炎。醫藥組合物 本發明之IgG雙特異性抗體可併入至適用於向患者投與之醫藥組合物中。本發明之IgG雙特異性抗體可單獨向患者投與或以單一劑量或多種劑量與醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑一起投與。此等醫藥組合物經設計以適用於經選擇之投與模式，且醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑及/或賦形劑(諸如分散劑、緩衝劑、界面活性劑、防腐劑、增溶劑、等滲性試劑、穩定劑及類似物)按合適形式使用。可根據例如提供如從業者一般已知之調配技術之概要的Remington , The Science and Practice of Pharmacy, 第22版, Loyd V編, Pharmaceutical Press, 2012中所揭示之習知技術來設計該等組合物。醫藥組合物之適合載劑包括任何材料，該材料在與本發明之雙特異性抗體組合時，保持分子之活性且不與患者的免疫系統反應。本發明之醫藥組合物包含IgG雙特異性抗體及一或多個醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。 包含本發明之IgG雙特異性抗體的醫藥組合物可使用標準投與技術投與至在如本文中所描述之疾病或病症之風險下或展現如本文中所描述之疾病或病症的患者。 本發明之醫藥組成物含有「有效」量之本發明之IgG雙特異性抗體。有效量係指達成所需治療結果所必需之量(在一定劑量下，及對於一定時間段而言，及對於投與方法而言)。有效量的IgG雙特異性抗體可根據諸如個人之疾病狀態、年齡、性別及體重之因素以及抗體或抗體部分引發個人之所要反應的能力而變化。有效量亦為其中IgG雙特異性抗體之治療上有益效應超過其任何毒性或有害效應的量。實例 以下實例進一步說明本發明。然而，應瞭解，實例借助於說明闡述且非限制，且各種修改可藉由一般熟習此項技術者作出。雙特異性抗體之產生 雙特異性抗體1包含兩條重鏈及兩條輕鏈，其中第一重鏈具有由SEQ ID NO: 7給出之胺基酸序列，第一輕鏈具有由SEQ ID NO: 8給出之胺基酸序列，第二重鏈具有由SEQ ID NO: 9給出之胺基酸序列，且第二輕鏈具有由SEQ ID NO: 10給出之胺基酸序列。雙特異性抗體1可如下製成及純化。合適宿主細胞(諸如HEK 293或CHO)經使用最佳預定HC:LC載體比率分泌雙特異性抗體之表現系統或編碼重鏈(SEQ ID NO:7及9)及輕鏈(SEQ ID NO:8及10)二者之單個載體系統瞬時或穩定轉染。使用多種常用技術中的任一者純化抗體分泌於其中的澄清培養基。舉例而言，將例示性雙特異性抗體1分泌至其中之澄清培養基塗覆至已用相容緩衝液(諸如20 mM TRIS (pH 8.0))平衡之蛋白質A親和力管柱。管柱用20 mM Tris (pH 7.0)洗滌以移除非特異性結合組分，隨後高度鹽洗滌以進一步移除非特異性組分。將管柱平衡回至20 mM Tris (pH7.0)中且接著經結合雙特異性抗體例如藉由pH步驟或梯度(諸如20 mM檸檬酸鹽(pH 3.0))溶離並用Tris (pH8)緩衝液中和。雙特異性抗體1藉由280nm處之吸收度偵測且因此進行收集。蛋白質-A捕獲之材料之特徵展示低LC錯組裝(2%)及低HMW聚合物(4%)。錯組裝雙特異性抗體1、可溶性聚集體及多聚體可藉由包括疏水相互作用層析法之常見技術有效地移除。舉例而言，使用疏水性的相互作用層析法，藉由使用第二純化管柱，LC錯組裝及低HMW聚合物形成之水準分別減小至0.6%及1%。雙特異性抗體1使用常見技術經濃縮及/或經無菌過濾。雙特異性抗體1在此等層析步驟之後之純度大於98.0% (單體)。雙特異性抗體1可緊接著歷經數月在-70℃下冷凍或在4℃下儲存。雙特異性抗體 1 與人類 IL - 23 及人類 CGRP 之結合親和力 使用Biacore T200儀器(BIAcore® AB, Upsala, Sweden)來量測雙特異性抗體1與人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及兔IL-23之親和力及動力。簡言之，使用標準胺偶合協議產生蛋白質-A偶合之CM5晶片。在操作緩衝液中將雙特異性抗體1稀釋至1 µg/mL，且將約100 RU捕獲至晶片表面。將各配位體之濃度系列以100微升/分鐘注射至所有流槽持續180秒，接著900秒解離階段，接著晶片再生。藉由流槽1基準減法連同0 nM空白減法在Biacore T200評估軟體版本1.0中分析資料。使用「1:1 (朗格繆爾(Langmuir))結合」結合模型總體地擬合人類、食蟹獼猴及兔IL-23資料以測定各配位體之締合速率(kon )及解離速率(koff )。根據關係式KD =koff /kon 根據結合動力學計算親和力(KD )。使用「穩態親和力結合模型」擬合小鼠IL-23結合資料以測定親和力(KD )。根據以下關係式計算結合之化學計量：根據關係式計算結合之化學計量：化學計量= [RUmax / RUBispecific Antibody 1] / [MWantigen / MWBispecific Antibody 1]，其中MWantigen為人類IL-23之分子量且MWBispecific Antibody 1為150 kDa。 來自不同物種之IL-23與雙特異性抗體1產生濃度依賴性結合反應。表3(a)概括雙特異性抗體1與各種IL-23分子之締合速率(kon )、解離速率(koff )、親和力(KD )及化學計量。雙特異性抗體1展示與人類及食蟹獼猴IL-23類似的親和力。雙特異性抗體1展示與小鼠、大鼠及兔IL-23之極微弱親和力至無親和力。雙特異性抗體1之KD 對於人類IL-23在37℃下為0.6 ± 0.1 × 10- 9 M (n=4)，對於食蟹獼猴IL-23在37℃下為1.3 ± 0.1 × 10- 9 M (n=2)，對於小鼠IL-23在37℃下為＞100 × 10- 9 M (n=2)，對於大鼠IL-23在37℃下觀測到無可辨別結合，且對於兔IL-23在37℃下為1,016 × 10- 9 M。表 3 ( a ) ： 雙特異性抗體 1 與人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及兔 IL - 23 之活體外結合參數 使用Biacore T100或T200儀器(BIAcore® AB, Upsala, Sweden)來量測雙特異性抗體1與人類/食蟹獼猴、小鼠/大鼠及兔CGRP之親和力及動力。簡言之，使用標準胺偶合協議產生蛋白質-A偶合之CM5晶片。對於CGRP親和力及動力，在操作緩衝液中將雙特異性抗體1稀釋至20 µg/mL，且在晶片表面上捕獲到約1000-1600 RU。將各配位體之濃度系列以70-100微升/分鐘注射至所有流槽持續180秒，接著1500-1800秒解離階段，接著晶片再生。 在37℃下獲得所有親和力及動力量測值。藉由流槽1基準減法連同0 nM空白減法分析資料。使用「1:1 (朗格繆爾)結合」結合模型總體地擬合各配位體之締合速率(kon )及解離速率(koff )。根據關係式KD = k off /k on 根據結合動力學計算親和力(KD )。根據關係式計算結合之化學計量：化學計量= [RUmax / RUBispecific Antibody 1] / [MWantigen / MWBispecific Antibody 1]，其中MWantigen為人類CGRP之分子量且MWBispecific Antibody 1為150 kDa。 來自不同物種之CGRP與雙特異性抗體1產生濃度依賴性結合反應。表3(b)概括雙特異性抗體1與各種CGRP分子之締合速率(kon )、解離速率(koff )及親和力(KD )。雙特異性抗體1展示與人類/食蟹獼猴及兔CGRP之較強親和力，但與小鼠/大鼠之略微較弱的親和力。雙特異性抗體1之KD 對於人類/食蟹獼猴CGRP在37℃下為7.1 ± 3.8 × 10- 12 M (n=3)，對於小鼠/大鼠CGRP在37℃下為169 × 10- 12 M，且對於兔CGRP在37℃下為21 × 10- 12 M。表 3 ( b ) ： 雙特異性抗體 1 與人類 / 食蟹獼猴、小鼠 / 大鼠及兔 CGRP 之活體外結合參數 人類 CGRP 及人類 IL - 23 之同時結合 為測試雙特異性抗體1是否可同時結合人類CGRP及人類IL-23二者，進行BIAcore實驗，其中將飽和量之一個配位體與所捕獲雙特異性抗體結合且接著注射第二配位體以測試結合。由於SPR信號之強度視分子量而非莫耳濃度而定，因此預期來自兩個配位體之反應幅度將極為不同(15倍；人類CGRP為約4 kDa，而人類IL-23為約60 kDa)。 BIAcore 3000儀器(GE Healthcare Life Sciences)用於判定雙特異性抗體1是否可同時與人類IL-23及人類CGRP結合。使用製造商的EDC/NHS胺偶合方法(Biacore P/N BR-1000-50)製備CM5晶片(Biacore P/N BR-1005-30)。簡言之，所有四個流槽之表面藉由以10微升/分鐘注射EDC/NHS之1:1混合物7分鐘來活化。在10 mM乙酸鹽、pH 4.5緩衝液中將蛋白質A (Calbiochem P/N 539202)稀釋至50 µg/mL，且藉由以10微升/分鐘之流速注射3分鐘在所有4個流槽上固定至約1300 RU。未反應之位點藉由以10微升/分鐘注射乙醇胺7分鐘阻斷。以10微升/分鐘注射甘胺酸pH-1.5持續30秒十次用於移除任何非共價相關聯蛋白質並使晶片符合條件要求。操作緩衝液為10 mM HEPES (pH 7.4)、150 mM氯化鈉、3 mM EDTA、0.05%聚山梨醇酯20 (Biacore P/N BR-1006-69)。 在操作緩衝液中將雙特異性抗體1稀釋至2 µg/mL，且在流槽(Fc) 2 (RUBispecific Antibody 1)上捕獲到約1200 RU。在操作緩衝液中將人類CGRP稀釋至40 nM且接著在操作緩衝液中兩倍連續稀釋至10 nM。在操作緩衝液中將人類IL-23稀釋至150 nM。以增加的濃度依序注射人類CGRP稀釋液以阻塞雙特異性抗體1上之所有人類CGRP結合位點。在人類CGRP注射之後緊接著注射人類IL-23。藉由流槽1基準減法分析資料。為確保人類CGRP結合位點為飽和的，根據以下關係式計算結合之化學計量：化學計量=[RUCGRP / RUBispecific Antibody 1] / [MWCGRP / MWantibody] ，其中人類CGRP及抗體之MW分別為3.8 kDa及150 kDa。在25℃下獲得結合量測值。 隨著人類CGRP濃度增加，化學計量及缺乏增加的SPR信號證實雙特異性抗體1上之所有結合位點為飽和的。隨後注射人類IL-23產生結合反應，從而顯示雙特異性抗體1同時結合兩個配位體。表4概括在人類CGRP飽和之後與人類IL-23結合之雙特異性抗體1。隨著人類CGRP之濃度增加，在20 nM注射之後未觀測到額外結合，從而指示所有可利用結合位點均被佔用。在CGRP注射之後，人類CGRP-比-雙特異性抗體1之化學計量為0.8，指示雙特異性抗體1上之人類CGRP結合位點呈飽和或極接近飽和。隨後注射人類IL-23產生與雙特異性抗體1同時結合人類CGRP及人類IL-23配位體二者一致的結合反應。表 4 ： 人類 IL - 23 與在 25 ℃ 下藉由表面電漿子共振 ( SPR ) 而經人類 CGRP 預飽和之例示性雙特異性抗體之同時活體外結合 雙特異性抗體 1 不與人類 IL - 12 、人類 IL - 27 或人類 IL - 35 結合 人類IL-23為由p19子單元及p40子單元組成之二硫鍵聯之雜二聚體細胞介素。連同人類IL-12、人類IL-27及人類IL-35，人類IL-23為細胞介素之IL-12家族之部分且與IL-12共用p40子單元及一個受體子單元。BIAcore生物感測器2000用於證實雙特異性抗體1不與人類IL-12、人類IL-27或人類IL-35結合。 使用N-乙基-N-(二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)之混合物，捕獲蛋白質(蛋白質A，Calbiochem)經由游離胺基偶合至CM5生物感測器晶片(GEHealthcare)之流槽1、2、3及4上之羧基。使用含有0.01 M HEPES (pH 7.4)、150 mM NaCl、0.005%界面活性劑P20之緩衝液以30微升/分鐘之流速監控流槽。在流槽2、3及4上捕獲到雙特異性抗體1，以得到總共100至150反應單位(RU；結果反映流槽2、3或4減去流槽1)。結合測試之後為在各循環之間使用甘胺酸-HC1 (pH 1.5)之再生步驟。流槽1用作監控所測試之分析物之非特異性結合的對照。雙特異性抗體1用人類IL-12、人類IL-27或人類IL-35各測試2次(所有皆在400 nM處)。 雙特異性抗體1不可量測地與人類IL-12、人類IL-27或人類IL-35結合(所有皆在400 nM處經測試，其為IL-23之飽和濃度的約40×)。雙特異性抗體 1 溶解度及穩定性分析 溶解度 將雙特異性抗體1滲析至具有及不具有150 mM NaCl (分別簡稱為C6及C6N)之10 mM檸檬酸鹽，pH 6中。藉由經由分子量過濾器(Amicon 30kDa超過濾過濾器，Millipore，目錄號# UFC903024)離心將樣本濃縮至50或約100 mg/mL。向兩種樣本之一部分添加Tween-80至0.02%之最終濃度(v/v；進一步分別縮寫為C6T及C6NT)。在冷藏及室溫條件下針對溶解度、凍融穩定性及儲存穩定性分析選擇調配物。 雙特異性抗體1分別在C6及C6N調配物中可濃縮至至少131 mg/mL或176 mg/mL。在如上文所描述之濃縮之後，在室溫下以肉眼偵測樣本之沈澱或相分離且隨後在4℃下在暗處儲存一週並以肉眼再次偵測。在-5℃下儲存額外一週且接著在-10℃下儲存額外一週後對相同樣本重複此程序(注意，由於經溶解物質之水準，不冷凍樣本)。溶解度分析之結果展示於表5(a)中。雙特異性抗體1展示在調配物或儲存溫度中無可見的沈澱或相分離。表 5 ( a ) ：雙特異性抗體 1 之溶解度 化學穩定性 化學穩定性的特徵在於經由pH 4-7在一個pH單位間隔下呈1 mg/ml。此等樣本在4℃、25℃及40℃下加壓4週且藉由SEC、CEX及LC-MS定量降解。化學穩定性經發現在pH 6下最佳。在40℃下在4週之後pH 6樣本上之LC-MS鑑別出CDR內之低水準降解。特定言之，觀測到色胺酸33 (Trp33)、甲硫胺酸34 (Met34)或色胺酸36 (Trp36)殘基處之抗CGRP HC (SEQ ID NO: 7)內之1.1%氧化反應及天冬胺酸56 (Asp56)處之抗IL-23 HC (SEQ ID NO: 9)內之3.9%異構化/外消旋化。凍融穩定性 在高濃度下測試雙特異性抗體1之凍融穩定性。C6T及C6NT中之50及100 mg/mL調配物經受三個緩慢凍融循環。控制凍結及解凍之速率以模擬在較大製造容器中將發生之情況。在非真空下之機箱凍乾器用於控制展示於表5(b)中之溫度循環。表 5 ( b ) ：在雙特異性抗體 1 之 緩慢凍融研究中使用之冷凍及解凍速率 在三個循環之後，藉由對高分子量(HMW)聚合物形成之尺寸排外層析法(SEC)且藉由使用AccuSizer 780 SIS (Particle Sizing Systems)對大於10微米之顆粒的光遮蔽來分析材料。結果展示於表5(c)中。雙特異性抗體1在所有經測試條件下始終展示HMW聚合物之低百分比及低粒子增加。表 5 ( c ) ：雙特異性抗體 1 針對三個緩慢凍融循環之穩定性 nd=未測定冷藏及室溫穩定性 在兩週及四週靜態保持時間之後，藉由SEC及粒子計數評估具有及不具有150 mM NaCl (分別簡稱為C6T及C6NT)之通用藥物產品(DP)調配物、10 mM檸檬酸鹽、0.02% Tween-80，pH 6.0下之冷藏及室溫穩定性。結果分別展示於表5(d)及5(e)中。資料證實，在培育之後，雙特異性抗體1具有低可溶性(HMW %)及不可溶的(≥10微米粒子計數)增加。表 5 ( d ) ： 雙特異性抗體 1 在 50 mg / mL 之穩定性 ， HMW 形成 表 5 ( e ) ：雙特異性抗體 1 在 50 mg / mL 之穩定性，微米大小粒子形成 黏度 在室溫下在四種調配物(C6、C6N、C6T及C6NT)中在100 mg/mL下分析雙特異性抗體1之黏度。在25℃下使用1000 sec- 1 之剪切率在m-VROC (Rheosense)上進行量測。結果展示於表5(f)中且說明雙特異性抗體1在含有150 mM鹽之調配物(C6N及C6NT)中之低黏度。表 5 ( f ) ： 100 mg / mL 雙特異性抗體 1 在室溫下在各種調配物中之溶液黏度 光穩定性 雙特異性抗體1之光穩定性特徵在於在一個調配物條件(C6NT)下之50 mg/mL蛋白質濃度。此調配物暴露於20%之國際協調會議(ICH)專家工作組(International Conference on Harmonization (ICH) Expert Working Group)推薦之暴露水準下(Q1B-Stability Testing: Photostability Testing of New Drug Substances and Products, 1996年11月)。此等於240,000勒克司-小時之可見光及40瓦特-小時/平方公尺近UV光。使用配備有目錄號04030-307-CW可見燈及04030-308UV 近UV燈之Bahnson ES2000光室(Environmental Specialties, a Bahnson Group Company)。樣本在8,000勒克司強度下暴露於可見光30小時及10瓦特/平方公尺近UV光4小時。所有暴露在25℃下在I型硼矽酸玻璃HPLC小瓶中。在暴露之後，HMW聚合物形成之百分比藉由SEC來測定且展示於表5(g)中。表 5 ( g ) ： 雙特異性抗體 1 在 50 mg / mL 下在 C6NT 調配物中之光穩定性 IL - 23 介導之 Stat 3 在 Kit225 細胞中之活體外活性的抑制 Kit225為由患有T細胞慢性淋巴球性白血病之患者建立之人類T細胞株此等細胞自然地表現IL-23R/IL12Rβ1且其對人類IL-23之反應導致Stat-3路徑之磷酸化及活化。藉由量測經Stat3-螢光素酶構築體穩定轉染之Kit225細胞中之螢光素酶活性來評估人類IL-23活化Stat-3路徑之能力。 Kit225-Stat-3-luc (純系3)細胞常規地在分析培養基中培養。在分析當天，細胞藉由離心收集，用較大體積之無血清培養基洗滌且再懸浮於無血清OPTI-MEM培養基中。將Kit225 (50,000)細胞添加至白色/澄清底部TC處理之96孔培養盤之孔中且在人類IL-23之存在下用感興趣之試劑(雙特異性抗體1)處理。評估0至208950 pM之雙特異性抗體1的劑量範圍。向各孔添加人類IL-23至50 pM之最終濃度。單獨的分析培養基用於「僅培養基」及「僅hIL-23」對照。 IL-23中和抗體(在0至100000 pM之劑量範圍中經測試)在分析中用作陽性對照。在0至126790 pM之劑量範圍中測試之同型對照抗體用作陰性對照。一式三份進行測試。將培養盤置放於組織培養恆溫箱中4小時且添加Bright-Glo螢光素酶溶液(Promega)以在處理後終止分析。使用光度計(Perkin Elmer Victor3)以讀取培養盤。結果表述為其中50%之IL-23誘導之Stat-3活性由雙特異性抗體1或陽性對照抗體抑制(IC50 )的濃度且使用資料之4個參數反曲擬合(Sigma曲線圖)計算。在一些實驗中，將50 nM人類CGRP添加至該等孔。 結果證實，雙特異性抗體1以濃度依賴性方式抑制Kit225細胞中之人類IL-23誘導之Stat 3活性。由於雙特異性抗體1僅具有與人類IL-23結合之一個結合位點，所觀測之抑制低於用陽性對照抗體發現之抑制，該陽性對照抗體具有兩個人類IL-23之結合位點，其中對於雙特異性抗體1，IC50 為1856.5 ± 384.5，而對於陽性對照抗體，IC50 為466 ± 31 pM。陰性同型對照抗體不以測試之任何濃度抑制Kit225細胞中之Stat-3活性。 將50 nM人類CGRP添加至分析並不改變雙特異性抗體1之活性，此係因為在人類CGRP (1193 pM)之存在下IC50 與上文所描述之IC50 類似。陰性同型對照抗體不以測試之任何濃度抑制Kit225細胞中之Stat-3活性。 雙特異性抗體1有效地活體外中和人類IL-23功能且IL-23抑制不受人類CGRP之存在影響。藉 由 SK - N - MC 細胞中之 CGRP 活體外誘導之 cAMP 產生的抑制 SK-N-MC細胞為內源性表現CGRP受體之人類神經母細胞瘤細胞株。此受體功能上偶合至胞內Gαs蛋白質。受體經其天然激動劑、人類CGRP胜肽之刺激導致cAMP之合成增加。由於存在於細胞內之cAMP量可使用標準活體外技術偵測，所以此參數用作受體活性之量測值。 使經培養之SK-N-MC在補充有10%加熱不活化FBS、非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉、2 mML-麩醯胺酸、100 U/mL青黴素及10 ug/mL鏈黴素之MEM中生長至約70%融合度。在提供新鮮培養基之後，在37℃下培育該等細胞隔夜。在分析當天，使用阿庫酶剝離細胞，再懸浮於分析緩衝液(具有以1:2混合之Mg++ 及Ca++ 、3.3 mM HEPES、0.03% BSA，0.5 mM IBMX的HBSS/DPBS)中，且以3-5K/孔接種至384孔、經聚-D-離胺酸塗佈之白色培養盤中。 雙特異性抗體1在分析緩衝液中以1:3自10 nM稀釋至0.5 pM (雙特異性抗體之Mw為150 kDa)。經稀釋之雙特異性抗體1、陽性對照抗體(描述於美國專利申請案第US 2011/305711A號中之CGRP中和抗體)或同型對照抗體與或不與人類IL-23 (10 nM，最終濃度)或相等體積之緩衝液混合且在室溫下與該等細胞一起培育30分鐘。人類CGRP胜肽(Bachem H-1470)以其EC80 濃度(0.8 nM)添加，且在室溫下培育該等培養盤60分鐘。 使用10 nM BIBN 4096 (olcegepant) (Tocris) (強效小分子參考拮抗劑(Kb=0.01 nM))建立信號窗口。根據供應商指示使用HTRF技術(均相時間分辨螢光(Homogeneous Time Resolved Fluorescence)；Cisbio)來定量胞內cAMP之量。簡言之，將含cAMP-d2共軛物及抗cAMP穴狀合物共軛物之裂解緩衝液在室溫下與經處理細胞一起培育60-90分鐘。緊接著使用EnVision盤式讀取器(Perkin-Elmer)偵測HTRF信號以計算665至620 nM處之螢光比率。使用各實驗產生之cAMP標準曲線將原始資料轉化為cAMP量(皮莫耳/孔)。使用四個參數對數曲線擬合程序(ActivityBase v5.3.1.22或Genedata Screener v12.0.4)根據濃度反應曲線之頂部-底部範圍計算相對EC50 值，且使用方程式：Kb = (IC50 ) / [ 1+ ([Ag] /EC50 )]將Kb值估算為經激動劑校正之IC50 值。 結果證實，雙特異性抗體1以劑量依賴性方式抑制CGRP刺激之cAMP產生，其中所評估Kb為0.04 nM，且最大效應等於由陽性對照抗體產生之效應(表6)。10 nM人類IL-23之存在對雙特異性抗體1或陽性對照之抑制無影響。相反，同型對照抗體不以測試之任何濃度抑制CGRP-誘導之cAMP產生。表 6 ：藉由測試抗體抑制 CGRP - 誘導之 cAMP 產生 。 人類 IL - 23 誘導之小鼠 IL - 22 產生的活體內抑制 投與人類IL-23誘導正常Balb/c小鼠活體內產生小鼠IL-22。為理解雙特異性抗體1是否將阻斷人類IL-23誘導之小鼠IL-22之產生，使Balb/c小鼠(n=5)活體內IP注射0.312、1.25或5 mg/kg之雙特異性抗體1或2.5 mg/kg之抗IL-23抗體(陽性對照)或5 mg/kg之同型對照抗體。注射後兩天，藉由IP注射50 nmol/kg之人類IL-23攻擊小鼠。人類IL-23攻擊後五個小時，處死小鼠且收集血清。使用商業ELISA針對小鼠IL-22產生且針對抗體之暴露分析血清。結果證實，用雙特異性抗體1處理以濃度依賴性方式中和了人類IL-23功能且與同型對照相比在所有劑量下產生統計學上顯著之抑制。藉由雙特異性抗體1觀測到之結果與陽性對照抗體之抑制類似。陰性對照抗體不會抑制人類IL-23誘導的小鼠IL-22之產生增加。此研究證實，雙特異性抗體1經由活體內中和人類IL-23功能來抑制小鼠IL-22之產生。抑制大鼠經皮血流中之辣椒鹼誘導之增加 辣椒鹼誘導之雷射多普勒成像(Laser Doppler Imaging；LDI)血流方法係基於局部塗覆至皮膚之辣椒鹼溶液，其誘導可使用LDI監測之經皮血流(DBF)中之局部變化。此方法依賴於瞬時受體電位陽離子通道子族V成員1 (TRPV1)受體之辣椒鹼活化，接著CGRP之局部釋放及皮膚中之血管上之CGRP受體之活化。應用辣椒鹼誘導之經皮血管擴張模型以分析臨床前模型中之靶向接合且轉譯至臨床。 在PBS中製備雙特異性抗體1、陽性對照(描述於美國專利申請案第US 2011/305711A號中之抗CGRP中和抗體)及同型對照(人類IgG1)。路易大鼠(每群組n=8)在LDI量測之前用8、4及1 mg/kg之雙特異性抗體1 SC、4 mg/kg之陽性對照或同型對照SC處理5天且在實驗之前禁食隔夜。研究操作者對該等處理不知情。 在LDI量測當天，用異氟醚麻醉大鼠且在掃描之前對其腹部進行刮毛。將大鼠置放於溫熱加熱墊上，在雷射器頭下且動物之體溫為穩定的，同時在掃描之前在約1%異氟醚麻醉下約15分鐘。在此穩定期期間，針對三個氯丁橡膠O形環之正確位置(遠離可見血管及高度基本血流區域)獲得初始掃描。掃描系列以兩個基線掃描開始。在完成掃描兩次之後，將8 µL (2 mg)之辣椒鹼溶液塗覆至三個O形環中之每一者(100 mg之辣椒鹼於120 μL ETOH、80 μL Tween 20、200 μL經純化H2 O之溶液中)。在每2.5分鐘掃描下繼續掃描額外25分鐘。在掃描完成後，獲得IV血液樣本之血清分析。藉由選擇O形環中之每一者內部之圓形感興趣區(ROI)用moorLDI版本5.3軟體分析原始資料。獲得灌注單元(PU)中之各ROI之像素平均值且用於計算各掃描之血流相對變化。各系列中之前兩次掃描之平均值用作基線，且使用公式((掃描PU - 平均基線PU)/平均基線PU)) × 100 = 血流之變化%用基線值來標準化隨後的掃描。分析資料鍵入至Graphpad Prism 6中以供繪圖且使用ANOVA以供統計分析。比較辣椒鹼投與之後LDI通量之曲線下面積(10至25分鐘)以測定經測試抗體之CGRP抑制性效果。 相較於所有劑量之同型對照IgG，用1、4及8 mg/kg之雙特異性抗體1處理產生統計學上顯著之抑制，其中辣椒鹼誘導之DBF減少分別為84.8% ± 4.7、88.5% ± 6.0及66.3% ± 10.0。用4 mg/kg之陽性對照處理產生統計學上顯著之82.9% ± 5.6抑制。在任何劑量之雙特異性抗體1與抗CGRP陽性對照抗體之間不存在統計學上顯著之差異。 結果展示，所有劑量之雙特異性抗體1防止CGRP介導之辣椒鹼誘導之DBF，而相反，對照IgG1不防止CGRP介導之辣椒鹼誘導之DBF，且抑制程度等於藉由陽性對照抗體達成之程度。獼猴中之雙特異性抗體 1 之非臨床 PK 如下測定雙特異性抗體1之血清藥代動力學：雄性食蟹獼猴經靜脈內(IV) (N=1)或皮下(SC) (N=2)投與5 mg/kg雙特異性抗體1。在PBS溶液(pH 7.4)中製備雙特異性抗體1。 給藥前及給藥後1、6、12、24、48、72、96、120、144、168、240、336、504及672小時收集血液樣本(約1 mL)。血液樣本自股骨靜脈經靜脈內收集至血清分離器套管(例如，不含抗凝血劑)中且處理為血清。 藉由定量LC/MS或抗原捕獲ELISA分析血清樣本之總IgG。對於抗原捕獲ELISA，培養盤經生物素化CGRP (Bachem 4038212.0500)塗佈。小鼠抗人類IgG-Fc辣根過氧化酶共軛物(SB 9040-05)用於偵測雙特異性抗體1。抗體定量範圍在獼猴血清中為1.56-100 ng/mL。對於定量LC/MS，用生物素化山羊抗hIgG (Southern Biotech，2049-08)及經抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁珠粒免疫沈澱樣本。免疫沈澱之後，樣本減少，烷基化，且用胰蛋白酶分解。使用經選擇胰蛋白酶肽作為抗體暴露之替代量測來測定總IgG濃度。使用Thermo Q-Exactive Orbitrap LC/MS系統執行資料之偵測及整合。定量範圍在獼猴血清中為25-12,800 ng/mL。 藥代動力學參數(清除率值)使用時間零(抗體投與)至投與後672小時的濃度比時間特徵曲線來計算且使用Phoenix (WinNonLin 6.4，Connect 1.4)經由非間隔分析來測定。結果概括於表7中。表 7 ： 單一 IV 或 SC 投與之後食蟹獼猴中之雙特異性抗體 1 之抗體清除率。 序列 人類 CGRP 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 1 ) 人類 IL - 23 胺基酸序列之成熟 p19 子單元 ( SEQ ID NO : 2 ) 第一重鏈可變區 ( 抗 CGRP ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 3 ) 第一輕鏈可變區 ( 抗 CGRP ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 4 ) 第二重鏈可變區 ( 抗 IL - 23 ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 5 ) 第二輕鏈可變區 ( 抗 IL - 23 ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 6 ) 第一重鏈 ( 抗 CGRP ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 7 ) 第一輕鏈 ( 抗 CGRP ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 8 ) 第二重鏈 ( 抗 IL - 23 ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 9 ) 第二輕鏈 ( 抗 IL - 23 ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 10 ) 第一重鏈 ( 抗 CGRP ) CDR 胺基酸序列 H1CDR-1 ( SEQ ID NO: 12) H1CDR-2 (SEQ ID NO: 14) H1CDR-3 (SEQ ID NO: 16) 第一重鏈 ( 抗 CGRP ) FR 胺基酸序列 H1FR-1 (SEQ ID NO: 11) H1FR-2 (SEQ ID NO: 13) H1FR-3 (SEQ ID NO: 15) H1FR-4 (SEQ ID NO: 17) 第一重鏈 ( 抗 CGRP ) 恆定區 ( HC1CR ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 18 ) 第一重鏈 ( 抗 CGRP ) CH 1 ( H1CH 1 ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 19 ) 第一重鏈 ( 抗 CGRP ) 鉸鏈區胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 49 ) 第一重鏈 ( 抗 CGRP ) CH 2 ( H1CH 2 ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 20 ) 第一重鏈 ( 抗 CGRP) CH 3 ( H1CH 3 ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 21 ) 第二重鏈 ( 抗 IL - 23 ) CDR 胺基酸序列 H2CDR-1 ( SEQ ID NO: 23) H2CDR-2 (SEQ ID NO: 25) H2CDR-3 (SEQ ID NO: 27) 第二重鏈 ( 抗 IL - 23 ) FR 胺基酸序列 H2FR-1 (SEQ ID NO: 22) H2FR-2 (SEQ ID NO: 24) H2FR-3 (SEQ ID NO: 26) H2FR-4 (SEQ ID NO: 28) 第二重鏈 ( 抗 IL - 23 ) 恆定區 ( HC2CR ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 29 ) 第二重鏈 ( 抗 IL - 23 ) CH 1 ( H2CH 1 ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 30 ) 第二重鏈 ( 抗 IL - 23 ) 鉸鏈區胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 50 ) 第二重鏈 ( 抗 IL - 23 ) CH 2 ( H2CH 2 ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 31 ) 第二重鏈 ( 抗 IL - 23 ) CH 3 ( H2CH 3 ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 32 ) 第一輕鏈 ( 抗 CGRP ) CDR 胺基酸序列 L1CDR-1 (SEQ ID NO: 34) L1CDR-2 (SEQ ID NO: 36) L1CDR-3 (SEQ ID NO: 38) 第一輕鏈 ( 抗 CGRP ) FR 胺基酸序列 L1FR-1 (SEQ ID NO: 33) L1FR-2 (SEQ ID NO: 35) L1FR-3 (SEQ ID NO: 37) L1FR-4 (SEQ ID NO: 39) 第一輕鏈 ( 抗 CGRP ) 恆定區 ( LC1CR ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 40 ) 第二輕鏈 ( 抗 IL - 23 ) CDR 胺基酸序列 L2CDR-1 (SEQ ID NO: 42) L2CDR-2 (SEQ ID NO: 44) L2CDR-3 (SEQ ID NO: 46) 第二輕鏈 ( 抗 IL23 ) FR 胺基酸序列 L2FR-1 (SEQ ID NO: 41) L2FR-2 (SEQ ID NO: 43) L2FR-3 (SEQ ID NO: 45) L2FR-4 (SEQ ID NO: 47) 第二輕鏈 ( 抗 IL23 ) 恆定區 ( LC2CR ) 胺基酸序列 ( SEQ ID NO : 48 )
圖1：本發明之雙特異性抗體之IgG架構。

Claims (48)

  1. 一種IgG雙特異性抗體，其包含： a)第一重鏈(HC1)，其包含具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的第一重鏈可變區(HC1VR)； b)第一輕鏈(LC1)，其包含具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的第一輕鏈可變區(LC1VR)； c)第二重鏈(HC2)，其包含具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的第二重鏈可變區(HC2VR)；及 d)第二輕鏈(LC2)，其包含具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的第二輕鏈可變區(LC2VR)， 其中HC1與LC1形成至少一個鏈間二硫鍵，HC2與LC2形成至少一個鏈間二硫鍵，且HC1與HC2形成至少一個鏈間二硫鍵，且其中該抗體與人類降鈣素基因相關之肽(calcitonin gene related peptide；CGRP)及人類IL-23之p19子單元結合。
  2. 如請求項1之IgG雙特異性抗體，其中HC1及HC2為人類IgG1 HC，LC1為人類κ LC，且LC2為人類λ輕鏈，其中 i)HC1具有以下胺基酸殘基：HC1 CH 1結構域(HC1CH 1)之位置127 (Kabat)處之半胱胺酸殘基、HC1鉸鏈結構域之位置228 (Kabat)處之天冬胺酸殘基、HC1鉸鏈結構域之位置222 (Kabat)處之甘胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置356 (EU)處之甘胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置357 (EU)處之天冬胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置364 (EU)處之麩醯胺酸殘基以及HC1 CH 3結構域之位置407 (EU)處之丙胺酸殘基； ii)HC2具有以下胺基酸殘基：HC2 CH 1結構域之位置166 (Kabat)處之丙胺酸殘基、HC2 CH 1結構域之位置170 (Kabat)處之甘胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置349 (EU)處之絲胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置366 (EU)處之甲硫胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置370 (EU)處之酪胺酸殘基以及HC2 CH 3結構域之位置409 (EU)處之纈胺酸殘基； iii)LC1具有以下胺基酸殘基：LC1 CL 結構域之位置122 (Kabat)處之離胺酸殘基；及 iv)LC2具有以下胺基酸殘基：LC2 CL 結構域之位置135 (Kabat)處之酪胺酸殘基及LC2 CL 結構域之位置176 (Kabat)處之色胺酸殘基。
  3. 如請求項2之IgG雙特異性抗體，其中HC1具有以下胺基酸殘基：HC1 CH 2結構域之位置234 (Kabat)處之丙胺酸殘基及HC1 CH 2結構域之位置235 (Kabat)處之丙胺酸殘基，且HC2具有以下胺基酸殘基：HC2 CH 2結構域之位置234 (Kabat)處之丙胺酸殘基及HC2 CH 2結構域之位置235 (Kabat)處之丙胺酸殘基。
  4. 如請求項1之IgG雙特異性抗體，其中HC1及HC2為人類IgG4 HC，LC1為人類κ LC，且LC2為人類λ輕鏈，其中 i)HC1具有以下胺基酸殘基：HC1 CH 1結構域(HC1CH 1)之位置127 (Kabat)處之半胱胺酸殘基、HC1鉸鏈結構域之位置228 (Kabat)處之天冬胺酸殘基、HC1鉸鏈結構域之位置222 (Kabat)處之甘胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置356 (EU)處之甘胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置357 (EU)處之天冬胺酸殘基、HC1 CH 3結構域之位置364 (EU)處之麩醯胺酸殘基以及HC1 CH 3結構域之位置407 (EU)處之丙胺酸殘基； ii)HC2具有以下胺基酸殘基：HC2 CH 1結構域之位置166 (Kabat)處之丙胺酸殘基、HC2 CH 1結構域之位置170 (Kabat)處之甘胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置349 (EU)處之絲胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置366 (EU)處之甲硫胺酸殘基、HC2 CH 3結構域之位置370 (EU)處之酪胺酸殘基以及HC2 CH 3結構域之位置409 (EU)處之纈胺酸殘基； iii)LC1具有以下胺基酸殘基：LC1 CL 結構域之位置122 (Kabat)處之離胺酸殘基；及 iv)LC2具有以下胺基酸殘基：LC2 CL 結構域之位置135 (Kabat)處之酪胺酸殘基及LC2 CL 結構域之位置176 (Kabat)處之色胺酸殘基。
  5. 如請求項1之IgG雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含 a)第一HC (HC1)，其具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列； b)第一LC (LC1)，其具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列； c)第二HC (HC2)，其具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列；及 d)第二LC (LC2)，其具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列， 其中該HC1與LC1形成鏈間二硫鍵，HC2與LC2形成鏈間二硫鍵，且HC1與HC2形成至少一個鏈間二硫鍵，且其中該抗體與人類降鈣素基因相關之肽(CGRP)及人類IL-23之p19子單元結合。
  6. 一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈(HC)多肽的聚核苷酸序列。
  7. 一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈(LC)多肽的聚核苷酸序列。
  8. 一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之HC多肽的聚核苷酸序列。
  9. 一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之LC多肽的聚核苷酸序列。
  10. 一種DNA分子，其包含以下聚核苷酸序列：編碼具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之HC多肽的聚核苷酸序列、編碼具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之LC多肽的聚核苷酸序列、編碼具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之HC多肽的聚核苷酸序列，以及編碼具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之LC多肽的聚核苷酸序列。
  11. 一種包含如請求項10之DNA分子之重組宿主細胞，其中該細胞能夠表現如請求項5之IgG雙特異性抗體。
  12. 如請求項11之重組宿主細胞，其中該宿主細胞為選自由以下組成之群的哺乳動物宿主細胞：CHO、NS0、HEK293及COS細胞。
  13. 一種用於產生如請求項5之IgG雙特異性抗體的方法，該方法包含以下步驟： a)在使得表現該雙特異性抗體之條件下，培育如請求項11或12之重組宿主細胞；及 b)自該宿主細胞回收該經表現雙特異性抗體。
  14. 一種IgG雙特異性抗體，其由如請求項13之方法產生。
  15. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體，及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  16. 一種如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療發炎性腸病(inflammatory bowel disease；IBD)用之藥劑。
  17. 如請求項16之用途，其中該IBD為克羅恩氏症(Crohn's Disease；CD)。
  18. 如請求項16之用途，其中該IBD為潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis；UC)。
  19. 一種如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療與發炎性腸病(IBD)相關聯之疼痛用的藥劑。
  20. 如請求項19之用途，其中該IBD為克羅恩氏症(CD)，且該疼痛與CD相關聯。
  21. 如請求項19之用途，其中該IBD為潰瘍性結腸炎(UC)，且該疼痛與UC相關聯。
  22. 一種如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療牛皮癬用之藥劑。
  23. 一種如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療與牛皮癬相關聯之疼痛用的藥劑。
  24. 一種如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療掌蹠膿皰病(palmoplantar pustulosis)用之藥劑。
  25. 一種如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療與掌蹠膿皰病相關聯之疼痛用的藥劑。
  26. 一種如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療牛皮癬性關節炎(psoriatic arthritis；PsA)用之藥劑。
  27. 一種如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療與牛皮癬性關節炎(PsA)相關聯之疼痛用的藥劑。
  28. 一種如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis；AS)用之藥劑。
  29. 一種如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療與僵直性脊椎炎(AS)相關聯之疼痛用的藥劑。
  30. 一種如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療異位性皮膚炎(atopic dermatitis；AtD)用之藥劑。
  31. 一種如請求項1至5或14中任一項之IgG雙特異性抗體的用途，其用於製造供治療與異位性皮膚炎(AtD)相關聯之疼痛用的藥劑。
  32. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於療法。
  33. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於治療發炎性腸病(IBD)。
  34. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體針對根據請求項33使用，其中該發炎性腸病(IBD)為克羅恩氏症(CD)。
  35. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體針對根據請求項33使用，其中該發炎性腸病為潰瘍性結腸炎(UC)。
  36. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於治療與發炎性腸病(IBD)相關聯之疼痛。
  37. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體針對根據請求項36使用，其中該發炎性腸病(IBD)為克羅恩氏症(CD)，且該疼痛與CD相關聯。
  38. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體針對根據請求項36使用，其中該發炎性腸病(IBD)為潰瘍性結腸炎(UC)，且該疼痛與UC相關聯。
  39. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於治療牛皮癬。
  40. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於治療與牛皮癬相關聯之疼痛。
  41. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於治療掌蹠膿皰病。
  42. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於治療與掌蹠膿皰病相關聯之疼痛。
  43. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於治療牛皮癬性關節炎(PsA)。
  44. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於治療與牛皮癬性關節炎(PsA)相關聯之疼痛。
  45. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於治療僵直性脊椎炎(AS)。
  46. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於治療與僵直性脊椎炎(AS)相關聯之疼痛。
  47. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於治療異位性皮膚炎(AtD)。
  48. 如請求項1至5或14中任一項之雙特異性抗體，其用於治療與異位性皮膚炎(AtD)相關聯之疼痛。
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