ES2695173T3

ES2695173T3 - Partículas de sílice modificadas con S-nitrosotiol que liberan óxido nítrico y procedimientos de fabricación de las mismas

Info

Publication number: ES2695173T3
Application number: ES12752627T
Authority: ES
Inventors: Mark Schoenfisch; Daniel Riccio; Julia Nugent; Nathan Stasko
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Novan Inc
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; NVN Liquidation Inc
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2019-01-02
Anticipated expiration: 2032-02-28
Also published as: US8981139B2; EP2681286A4; WO2012118829A3; WO2012118819A3; US20130344334A1; US9713652B2; EP2681286A2; EP2681286B1; US20140017121A1; WO2012118819A2; WO2012118829A2

Abstract

Un procedimiento de formación de partículas de sílice co-condensadas funcionalizadas con S-nitrosotiol que comprende: hacer reaccionar un silano que contiene tiol y un alcoxisilano de cadena principal en una solución de precursor de sol que comprende agua para formar partículas de sílice co-condensada funcionalizadas con tiol, en el que el silano que contiene tiol comprende un silano que contiene tiol terciario y el alcoxisilano de cadena principal es un alcoxisilano que no contiene un grupo funcional tiol y, en el que las partículas de sílice co-condensada funcionalizadas con tiol comprenden una matriz de polisiloxano y al menos algunos de los grupos tiol están presentes dentro de la matriz de polisiloxano; y hacer reaccionar las partículas de sílice co-condensada funcionalizadas con tiol con un agente de nitrosación para proporcionar las partículas de sílice co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol.

Description

DESCRIPCION

Partmulas de s l^ice modificadas con S-nitrosotiol que liberan oxido mtrico y procedimientos de fabricacion de las mismas

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a partmulas liberadoras de oxido mtrico. Mas particularmente, la presente solicitud se refiere a partmulas de s l^ice modificadas con S-nitrosotiol.

Antecedentes de la invencion

Desde el descubrimiento de las funciones fisiologicas del oxido mtrico (NO), muchas investigaciones se han centrado en la smtesis de materiales/vehmulos que liberan NO para obtener las caractensticas del NO como agente antimicrobiano, mediador de la reparacion de heridas o cofactor angiogenico. Los S-nitrosotioles (RSNO) son una clase de donador de NO endogeno que se cree que almacena/transporta la mayor parte del reservorio natural de NO del cuerpo. Como tal, una gran cantidad de trabajo ha utilizado RSNO de bajo peso molecular (por ejemplo, S-nitroso-glutation (GSNO), S-nitroso-N-acetilcistema (SNAC) y S-nitroso-N-acetil-penicilamina (SNAP)) como donadores para liberar espontaneamente NO. Aunque es prometedor, la aplicacion clmica de donadores de NO de bajo peso molecular ha sido lenta debido a la falta de direccion espedfica de tejido y la cinetica de liberacion de NO incontrolable. Para abordar dichas deficiencias, los precursores de donadores de NO se han conjugado en armazones mas grandes (por ejemplo, protemas, dendnmeros y nanopartmulas), permitiendo asf un alto almacenamiento de NO por vehmulo de entrega y perfiles de liberacion similares a sus analogos moleculares pequenos.

Las partmulas de sflice estan entre los armazones macromoleculares mas ampliamente empleados para aplicaciones biomedicas debido a las estrategias sinteticas faciles y la citotoxicidad minima.

Anteriormente, la superficie de partmulas de sflice pirogena (7-10 nm de diametro) se ha injertado con SNAP, SNAC y S-nitrosocistema (CysNO) para crear partmulas de sflice modificadas con S-nitrosotiol. Sin embargo, el almacenamiento de NO se limito a 0,021-0,138 pmol mg-1 porque la funcionalizacion de tiol estaba restringida al exterior de la partmula. Ademas, estos sistemas no son capaces de ajustar el tamano de partmula para adaptarse a un sistema terapeutico de interes. Como alternativa, la hidrolisis y cocondensacion de los precursores de organosilano y tetraalcoxisilano mediante qmmica de sol-gel puede representar un procedimiento para preparar una red de sflice con una concentracion mas alta de funcionalidades organicas. De hecho, el procedimiento Stober (qmmica de sol-gel con un disolvente de alcohol y un catalizador de amomaco) ha demostrado ser eficaz para sintetizar partmulas de sflice modificadas con N-diazeniodiolato de diverso tamano y capacidad de almacenamiento de NO. Vease, por ejemplo, la publicacion de los EE.UU. n.° 2009/0214618 (Schoenfisch y col.). La ventaja del procedimiento Stober sobre el injerto de superficie es que la co-condensacion proporciona una incorporacion uniforme de la funcionalidad organica (es decir, donador de NO) a traves de la red de sflice resultante en oposicion a la funcionalizacion restringida solo en la superficie. Como resultado, dichas partfculas pueden mostrar un almacenamiento de NO significativamente mayor.

Riccio y col., (Biomaterials, 2009, 30, 4494-4502) describen la smtesis, caracterizacion del material y biocompatibilidad in vitro de pelfculas de xerogel modificadas con S-nitrosotiol (RSNO). Frost y col., (Journal of Biomedical Materials Research, 2005, 72A, 409-419) describen S-nitrosotioles anclados a partfculas de sflice pirogena.

Sumario de la invencion

Los aspectos de la presente invencion se definen en las reivindicaciones adjuntas.

Un primer aspecto de la presente invencion comprende un procedimiento para formar partfculas de sflice cocondensada funcionalizadas con S-nitrosotiol que comprende:

hacer reaccionar un silano que contiene tiol y un alcoxisilano de cadena principal en una solucion de precursor de sol que comprende agua para formar partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol, en el que el silano que contiene tiol comprende un silano que contiene tiol terciario y el alcoxisilano de cadena principal es un alcoxisilano que no contiene un grupo funcional tiol, y en el que las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol comprenden una matriz de polisiloxano y al menos algunos de los grupos tiol estan presentes dentro de la matriz de polisiloxano; y

hacer reaccionar las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol con un agente de nitrosacion para proporcionar las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol.

Un segundo aspecto de la presente invencion comprende partfculas de sflice co-condensada monodispersas funcionalizadas con S-nitrosotiol que tienen un diametro medio de partfcula en un intervalo de 200 nm a 700 nm.

Un aspecto adicional de la presente invencion comprende parffculas de s l^ice co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol que tienen un almacenamiento de NO en un intervalo de 0,01 pmol a 10 pmol de NO por mg de parffcula.

Otro aspecto de la presente invencion comprende una parffcula de sflice co-condensada funcionalizada con S-nitrosotiol que comprende grupos funcionales de nitrosotiol terciarios.

Tambien se describe en el presente documento un compuesto que tiene la siguiente estructura:

en la que R, R' y R" son cada uno independientemente alquilo y n es 0 en un intervalo de 0 a 10.

Breve descripcion de los dibujos

Los dibujos adjuntos, que se incluyen para proporcionar una comprension adicional de la invencion y se incorporan y constituyen una parte de esta solicitud, ilustran determinada(s) realizacion/es de la invencion.

La Figura 1 proporciona un esquema para la smtesis de N-acetilpenicilamina propiltrimetoxisilano (NAPTMS). La Figura 2 proporciona un espectro 1H RMN del compuesto NAPTMS.

La Figura 3 muestra un espectro 29SiRMN en estado solido por polarizacion cruzada/giro al angulo magico (CP/MAS) de sflice sintetizada con (A) 0, (B) 25, (C) 40, (D) 60, (E) 75, y (F) 85 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS). Las bandas Q y T han sido designadas.

La Figura 4 muestra las micrograffas electronicas de barrido de (A) 25, (B) 40, (C) 60, (D) 75 y (E) 85 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS) y (F) 75 y (G) 85 % en moles de parffculas MPTMS (equilibrio T^eO^s) sintetizadas con 16,0 M de agua, 5,5 M de amomaco y 0,1 M de silano.

La Figura 5 muestra las micrograffas electronicas de barrido de (A) 25, (B) 40, (C) 60, (D) 75 y (E) 85 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS) y (F) 75 y (G) 85 % en moles de parffculas MPTMS (equilibrio Te Os ) sintetizadas a traves de un procedimiento semicontinuo con una velocidad de alimentacion de silano de 0,5 ml min-1.

La Figura 6 muestra las micrograffas electronicas de barrido de 75 % en moles de MPTMS (equilibrio TEOS) sintetizadas con (A) 47,0, (B) 42,0, (C) 40,6, (D) 36,5, (E) 32,5 y (F) 24,9 M de agua.

La Figura 7 muestra las micrograffas electronicas de barrido de (A-B) 25, (C-D) 40, (E-F) 60, (G-H) 75 y (I-J) 85 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS) y (K-L) 85 % en moles de parffculas MPTMS (equilibrio TEOS) sintetizadas con (A, C, E, F, G, I, K) 32,5 y (B, D, F, H, J, L) 24,9 M de agua.

La Figura 8 muestra un esquema de las vfas de descomposicion de S-nitrosotiol.

La Figura 9 muestra la liberacion de oxido mtrico a partir de 75 % de parffculas de MPTMS modificadas con RSNO (equilibrio TEOS) en presencia de (A) 0 (-), 60 (--), 100 (■■■) y 200 (- ■) W de irradiacion a 0 °C y (B) 0 (-), 10 (- -), y solucion de CuBr2/PBS 25 (■■■) pM a 0 °C. Nota: CuBr20 pM es DTPA 500 pM (pH PBS 7,4). La insercion de A proporciona una vista ampliada del perfil de liberacion de NO sin irradiacion.

La Figura 10 muestra imagenes MEB de parffculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol terciario de acuerdo con algunas realizaciones de la invencion antes de los ultrasonidos.

La Figura 11 muestra imagenes MEB de parffculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol terciario de acuerdo con algunas realizaciones de la invencion despues de 30 minutos de ultrasonidos seguido de nitrosacion.

La Figura 12 muestra imagenes MEB de parffculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol terciario de acuerdo con algunas realizaciones de la invencion despues de 60 minutos de ultrasonidos seguido de nitrosacion.

Descripcion detallada de las realizaciones de la invencion

Los aspectos anteriores y otros de la presente invencion se describiran ahora con mas detalle con respecto a la descripcion y a las metodologfas proporcionadas en el presente documento. Debe apreciarse que la invencion puede realizarse de diferentes formas y no debe interpretarse como limitada a las realizaciones expuestas en el presente documento. En su lugar, estas realizaciones se proporcionan de modo que esta divulgacion sera minuciosa y completa, y transmitira completamente el ambito de la invencion a los expertos en la tecnica.

La terminologfa usada en la descripcion de la invencion en el presente documento tiene el fin de describir realizaciones particulares solamente y no pretende ser limitativa de la invencion. Como se usa en la descripcion de las realizaciones de la invencion y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" pretenden incluir tambien las formas plurales, salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Ademas, tal como se usa en el presente documento, el termino "y/o", se refiere y abarca cualquiera y todas las combinaciones posibles de uno o mas de los artfculos enumerados asociados. Ademas, el termino "aproximadamente", tal como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad de un compuesto, dosis, tiempo, temperatura y similares, pretende abarcar variaciones del 20 %, 10%, 5%, 1 %, 0,5 % o incluso 0,1 % de la cantidad especificada. Se entendera ademas que los terminos "comprende" y/o "que comprende", cuando se usan en esta memoria descriptiva, especifican la presencia de las caractensticas, numeros enteros, etapas, operaciones, elementos y/o componentes indicados, pero no excluyen la presencia o adicion de una o mas caractensticas, numeros enteros, etapas, operaciones, elementos, componentes y/o grupos diferentes de los mismos. A menos que se indique lo contrario, todos los terminos, incluidos los terminos tecnicos y cientificos usados en la descripcion, tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica a la que pertenece la presente invencion. En el caso de una terminologfa conflictiva, la presente memoria descriptiva es controladora. Las realizaciones descritas en un aspecto de la presente invencion no estan limitadas al aspecto descrito. Las realizaciones tambien se pueden aplicar a un aspecto diferente de la invencion siempre que las realizaciones no eviten que estos aspectos de la invencion operen para su fin previsto.

Definiciones qû micas

Tal como se usa en el presente documento, el termino "alquilo" se refiere a cadenas de hidrocarburos C1-20 incluido, lineales (es decir "de cadena lineal"), ramificados, o dclicos, saturados o al menos parcial y en algunos casos completamente insaturados (es decir, alquenilos y alquinilos), que incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, octilo, etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, octenilo, butadienilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, heptinilo y grupos alenilo. "Ramificado" se refiere a un grupo alquilo en el que un grupo alquilo inferior, tal como metilo, etilo o propilo, esta unido a una cadena de alquilo lineal. Los grupos ejemplares de alquilo ramificado incluyen, pero sin limitacion, isopropilo, isobutilo, terc-butilo. "Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a aproximadamente 8 atomos de carbono (es decir, un alquilo C1-8), por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 atomos de carbono. "Alquilo superior" se refiere a un grupo alquilo que tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 atomos de carbono, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 atomos de carbono. En determinadas realizaciones, "alquilo" se refiere, en particular, a alquilos de cadena lineal C1-5. En otras realizaciones, "alquilo" se refiere, en particular, a alquilos de cadena ramificada C1-5.

El termino "mercapto" o "tio" se refiere al grupo -SH.

En el presente documento se proporcionan de acuerdo con algunas realizaciones de la invencion procedimientos para formar partfculas de sflice co-condensadas mediante el procedimiento Stober. Vease, por ejemplo, Stober, W.; Fink, A.; Bohn, EJ Colloid Interface Sci. 1968, 26, 62. La formacion de partfculas bajo el procedimiento de Stober se produce por hidrolisis y condensacion de precursores de silano en los que las velocidades de hidrolisis relativas para los precursores dictan tanto la velocidad del crecimiento de partfculas como la probabilidad de la incorporacion de cada silano a la red de sflice. Las disparidades excesivas entre las velocidades de reaccion de diferentes silanos pueden conducir a la ausencia de formacion de partfculas cuando se intenta la co-condensacion.

Se proporcionan de acuerdo con algunas realizaciones de la invencion procedimientos para formar partfculas de sflice co-condensada funcionalizas con S-nitrosotiol que incluyen hacer reaccionar un silano que contiene tiol y un alcoxisilano de cadena principal en una solucion de precursor de sol que incluye agua para formar partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol, en el que las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol incluyen una matriz de polisiloxano y al menos algunos de los grupos tiol estan presentes dentro de la matriz de polisiloxano. Los procedimientos incluyen ademas hacer reaccionar las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol con un agente de nitrosacion para proporcionar las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol. En el procedimiento de acuerdo con la invencion, el silano que contiene tiol comprende un silano que contiene un tiol terciario. Tambien se pueden usar combinaciones de diferentes silanos. Un silano que contiene tiol adecuado sera un silano que permitira la formacion de partfculas y, en algunas realizaciones, la formacion de partfculas monodispersas. Por lo tanto, algunos silanos que contienen tiol pueden ser adecuados con algunos alcoxisilanos de cadena principal y no adecuados con otros. En algunas divulgaciones, el silano que contiene tiol primario es mercaptopropiltrimetoxisilano. En algunas realizaciones, el tiol alcoxisilano terciario tiene la siguiente estructura: (OR)(OR')(OR")Si(Rx), en la que R, R' y R" son cada uno independientemente H, alquilo o alquilo sustituido y Rx es un grupo funcional que comprende un grupo tiol terciario. En realizaciones particulares, el tiol alcoxisilano terciario tiene la estructura:

en la que R, R' y R" son cada uno independientemente H, alquilo o alquilo sustituido, y n es 0-10. En algunas realizaciones, R, R' y R" son cada uno independientemente alquilo y n es 0-5. Ademas, en realizaciones particulares de la invencion, el tiol terciario es un compuesto que tiene la estructura:

Se puede usar cualquier alcoxisilano de cadena principal adecuado. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "alcoxisilano de cadena principal" se refiere a un alcoxisilano que no contiene un grupo funcional tiol. Ejemplos incluyen tetrametoxisilano, tetraetoxisilano, metiltrimetoxisilano, metiltrietoxisilano y butiltrimetoxisilano. Un silano de cadena principal adecuado sera un silano que permitira la formacion de partfculas y, en algunas realizaciones, la formacion de partfculas monodispersas.

Se puede usar cualquier concentracion adecuada de agua. En algunas realizaciones, la concentracion de agua en la solucion del precursor de sol esta en un intervalo de aproximadamente 8 M a aproximadamente 32,5 M.

En algunas realizaciones, se incluye un catalizador, tal como un catalizador de amomaco, en la solucion de precursor de sol. Se puede usar cualquier concentracion adecuada de catalizador. Sin embargo, en algunas realizaciones, se incluye un catalizador de amomaco en la solucion de precursor de sol, en algunas realizaciones, a una concentracion en un intervalo de aproximadamente 1,9 M a aproximadamente 5,5 M.

En una divulgacion, el mercaptopropiltrimetoxisilano y el tetrametoxisilano se hacen reaccionar en presencia de agua y un catalizador de amomaco para formar partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol. En algunas realizaciones, la reaccion se produce en una solucion que incluye mercaptopropiltrimetoxisilano y tetrametoxisilano a una concentracion total de monomero de silano en un intervalo de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,4 M, en la que el monomero de silano incluye aproximadamente 25 a aproximadamente 85 % en moles de mercaptopropiltrimetoxisilano. En algunas realizaciones, el agua esta presente en la solucion a una concentracion en un intervalo de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 32,5 M y el catalizador de amomaco esta presente a una concentracion en un intervalo de aproximadamente 1,9 M a aproximadamente 5,5 M.

En una divulgacion, el mercaptopropiltrimetoxisilano y el tetrametoxisilano se hacen reaccionar en presencia de agua y un catalizador de amomaco para formar partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol. En una divulgacion, la reaccion se produce en una solucion que incluye mercaptopropiltrimetoxisilano y tetrametoxisilano a una concentracion total de monomero de silano en un intervalo de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,4 M, en la que el monomero de silano incluye aproximadamente 75 a aproximadamente 85 % mol de mercaptopropiltrimetoxisilano. En algunas realizaciones, el agua esta presente en la solucion a una concentracion en un intervalo de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 32,5 M y el catalizador de amomaco esta presente a una concentracion en un intervalo de aproximadamente 1,9 M a aproximadamente 5,5 M.

En algunas realizaciones, los procedimientos para formar partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol incluyen hacer reaccionar un silano que contiene tiol terciario y un alcoxisilano de cadena principal en las presencias de agua y un catalizador de amomaco para formar partfculas de s l^ice co-condensada funcionalizadas con tiol. En algunas realizaciones, la reaccion se produce en una solucion que incluye silano que contiene tiol terciario y alcoxisilano a una concentracion total de monomero de silano en un intervalo de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,4 M, en la que el monomero silano incluye aproximadamente 25 a aproximadamente 85 % en moles de silano que contiene que contiene tiol terciario. En algunas realizaciones, el agua esta presente en la solucion a una concentracion en un intervalo de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 32,5 M y el catalizador de amomaco esta presente a una concentracion en un intervalo de aproximadamente 1,9 a aproximadamente 5,5 M. La solucion de precursor de sol tambien se puede remover/agitar como conocen los expertos en la tecnica, y se pueden incluir otros aditivos o monomeros de silano usados en qmmica sol en algunas realizaciones de la invencion. En algunas realizaciones de la invencion, los procedimientos proporcionados en el presente documento se pueden usar para formar partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con nitrosotiol, que en algunas realizaciones, son monodispersas. Tal como se usa en el presente documento, el termino "monodispersa" se refiere a partfculas que tienen un tamano de partfcula uniforme, en algunas realizaciones, que tienen un diametro medio de partfcula ± 100 nm como se mide a partir de micrograffas electronicas; un promedio Z ± 60 nm como se mide a partir de la dispersion dinamica de la luz; y/o que tienen un mdice de polidispersidad <0,1 como se mide mediante la dispersion dinamica de la luz. En una divulgacion, los procedimientos descritos en el presente documento proporcionan partfculas monodispersas que tienen un diametro medio de partfcula de menos de 100 micrometres, y en algunas realizaciones, de menos de 1 micrometre. En una divulgacion, los procedimientos usados en el presente documento pueden proporcionar partreulas monodispersas que tienen un diametro medio de partreula en un intervalo de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 pm. En algunas realizaciones, las partreulas tienen un diametro medio de partreula en un intervalo de 200 a 700 nm.

Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para nitrosar las partreulas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol. Ademas, se puede usar cualquier agente de nitrosacion adecuado. Sin embargo, en algunas realizaciones, el agente de nitrosacion incluye nitrito de sodio acidificado, nitritos de alquilo, incluyendo nitrito de tercbutilo y nitrito de isopentilo, y diversos oxidos de nitrogeno que incluyen oxido nitroso, N2O3, N2O4 y NO2. Se pueden encontrar ejemplos de nitrosacion en Williamns, DLH Acc. Che. Res. 1999, 32, 869.

En algunas realizaciones de la invencion, la qmmica de nitrosacion conserva la integridad del tamano de partreula y produce partreulas de sflice co-condensada monodispersas funcionalizadas con S-nitrosotiol. No se han observado cambios en el tamano de partreula despues de la adicion de la funcionalidad del oxido mtrico a la estructura macromolecular, un inconveniente que se ha observado con otros donadores macromoleculares modificados con nitrosotiol. Ademas, como se muestra a continuacion en los Ejemplos, las partreulas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol pueden someterse a ultrasonidos antes de la nitrosacion sin afectar perjudicialmente el almacenamiento de NO y/o la morfologfa de las partreulas.

Las partreulas de sflice co-condensadas pueden incluir grupos S-nitrosotiol en toda la partreula y, como tales, pueden proporcionar propiedades de almacenamiento de NO potenciadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la invencion, se proporcionan partreulas de sflices co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol que tienen un almacenamiento de NO en un intervalo de 0,01 pmol a 10 pmol de NO por mg de partreula, y en algunas realizaciones, de 0,09 pmol a 4,40 pmol de NO por mg de partreula.

La incorporacion de los grupos S-nitrosotiol en todo el interior de la estructura de partreulas de sflice tambien puede proporcionar una estabilidad inesperada. El experto en la tecnica sabe que el glutation y otros tioles son un accionador de vial para la descomposicion de RSNO y liberan una diversidad de especies de NOx. En algunas realizaciones de la invencion, la baja porosidad de las partreulas de sflice co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol protege a los donadores de RSNO de la descomposicion prematura por glutation u otros componentes sangmneos, anadiendo un nivel de estabilidad de oxido mtrico cuando se usan en aplicaciones de entrega de farmacos.

Ejemplos

Preparacion de NAPTMS

S^ntesis de N-Acetil Penicilamina (NAP) Tiolactona. Se anadio anlmdrido acetico (96 mmol, 9,80 g) gota a gota a una solucion bien agitada de D-(-) penicilamina (40 mmol, 5,97 g) en piridina (50 ml) a 0 °C. Despues de 30 minutos, el matraz se retiro del hielo y se dejo agitar a temperatura ambiente durante 15 h. La solucion naranja resultante se repartio entre cloroformo y HCl diluido y se lavo 4 veces con HCl diluido. Despues de secar sobre MgSO4, la fase organica se evaporo para producir un residuo naranja. El residuo se disolvio primero en etanol absoluto (20 ml), y luego precipito en pentano a -78 °C. El producto cristalino amarillo claro se aislo por filtracion (2,07 g, 30 %). 1HRMN (CDCl3) 81,65 (s, CH3), 1,86 (s, CH3), 2, 05 (s, NHCOCH3), 5,68-5. 70 (d, CH(CH3)2), 6,56 (NHCOCH3), 13C RMN (CDCl3) 822,52 (NHCOCH3), 26, 20 (CH(CH3)2), 30, 22 (CH(CH3)2), 51,23 (CH), 169,37 (NHCOCH3), 192,21 (SCO). Sntesis de N-Acetil Penicilamina Propiltrimetoxisilano (NAPTMS). Se anadio APTMS (10 mmol, 1,78 g) a una solucion en agitacion de NAP tiolactona (10 mmol, 1,72 g) en cloruro de metileno (20 ml). La solucion amarilla clara se agito durante 4 h a temperatura ambiente antes de la destilacion del cloruro de metileno para producir NAPTMS en forma de un aceite transparente viscoso. 1H RMN (CDCI3) 50. 54 (t, SiCH2), 1,24 y 1,39 (s, CH(CH3)2SH), 1,54 (m, SiCH2CH2), 1,96 (s, NHCOCH3), 2, 96 y 3,21 (m, SiCH2CH2CH2), 3, 44 (s, Si(OCHa)3), 4,63 (d, CHC(CH3)2SH), 6,99 (d, CHNHCOCH3), 7,70 (t, CH2NHCOCH). 13CRMN (CDCI3) 5 ^6,59 (SiCH2), 22,42 y 22,97 (CH(CH3)2SH), 28,64 (NHCOCH3), 30, 80 (SiCH2CH2), 41, 93 (CHC(CH3)2SH), 46,23 (SiCH2CH2CH2), 50, 35 (Si(OCH3)3), 60,32 (CHC(CH3)2SH), 169,64 (CHNHCOCH3), 170,17 (CHCONH).

La preparacion de precursores basados en tiol terciario se investigo para el desarrollo de dispositivos biomedicos/terapeutica con liberacion continua y fotoactivable de NO. Por lo tanto, se sintetizo una NAP tiolactona para disenar dicho precursor para la smtesis de xerogeles liberadores de NO. La penicilamina se hizo reaccionar en presencia de anlmdrido acetico para generar NAP tiolactona in situ. Despues de la caracterizacion por 1H y 13CRMN, la NAP tiolactona se acoplo directamente con APTMS para dar lugar a un silano portador de tiol terciario, denominado NAPTMS (vease la Figura 1). La smtesis exitosa de este silano que porta tiol terciario se verifico mediante caracterizacion de 1H RMN (Figura 2).

Ejemplo 1: MPTMS

Las relaciones de mercaptosilano y alcoxisilano (25-85 % en moles de MPTMS, equilibrio TMOS o TEOS) se anadieron como una inyeccion en embolada o gota a gota a traves de una bomba de jeringa Kent Scientific Genie Plus a un caudal de 0,25-3,0 ml/min a traves de una aguja de 4,67 mm a una solucion de etanol, agua e hidroxido de amonio. La solucion se agito durante 2 h a temperatura ambiente, se recogio por centrifugacion a 4500 rpm (10 minutos), se lavo dos veces con 40 ml de EtOH, se recogio y se seco durante una noche en condiciones ambientales.

El intento inicial de los investigadores de sintetizar partmulas de sflice que contengan tiol se baso en una inyeccion en embolada de 3-mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTMS) y alcoxisilano en una solucion de EtOH/NH4OH. Las concentraciones resultantes de amomaco, agua y silano totales fueron 3,3, 8,0 y 0,2 M, respectivamente. El tetrametoxisilano (TMOS) demostro ser un silano de cadena principal suficiente para la condensacion conjunta con MPTMS ya que su combinacion (en diversos porcentajes molares) dio como resultado la formacion de un precipitado blanco. (~300 mg de rendimiento).

Como se indica por la turbidez de la solucion, se observo un marcado aumento en el tiempo de reaccion al aumentar la concentracion de MPTMS hasta 85 % en moles. A esta concentracion, el tiempo para formar un producto visible despues de combinar los silanos fue aproximadamente de 15 minutos. No se observo formacion de producto a concentraciones de MPTMS> 85 % en moles. La incapacidad de formar partmulas a mayores concentraciones de MPTMS se puede atribuir a las velocidades de hidrolisis dispares entre los silanos, lo que sugiere que la cocondensacion requiere una concentracion minima del silano mas facilmente hidrolizable (es decir, TMOS) para iniciar el crecimiento de partmulas.

Los materiales se sintetizaron a traves de la co-condensacion de MPTMS y el tetraetoxisilano (TEOS) se formo solo en el intervalo de concentracion de 75-85 % en moles de MPTMS. A diferencia del sistema TMOS, los productos con concentraciones mas bajas de MPTMS (por ejemplo, 25 % en moles) no se formaron usando TEOS como cadena principal, incluso en tiempos de reaccion prolongados (hasta 48 h).

Ejemplo 2: MPMDMS

Otro monomero funcionalizado con tiol, el 3-mercaptopropilmetil-dimetoxisilano (MPMDMS), tambien se investigo. Desafortunadamente, el rendimiento del producto (~5 mg) formado usando MPMDMS con TMOS o TEOS fue significativamente menor que MPTMS. La sustitucion de uno de los grupos metoxi hidrolizables por un enlace metflico no hidrolizable en MPMDMS (frente a MPTMS) parece disminuir la velocidad de hidrolisis resultante en condiciones basicas, posiblemente debido al efecto inductivo de la donacion de densidad de electrones al atomo de Si. Como resultado, la reaccion con anion hidroxido para hidrolizar el silano puede inhibirse. La formacion de partmulas puede limitarse aun mas ya que cada molecula de MPMDMS es capaz de formar solo dos puentes de siloxano. En consecuencia, la formacion de partmulas usando MPMDMS no tuvo exito.

Ejemplo 3: Caracterizacion de particulas de sflice de primera generacion basadas en mercaptosilano

La espectroscopfa de resonancia magnetica nuclear en estado solido (RMN) 29Si (frecuencia de 71,548 MHz) por polarizacion cruzada/giro al angulo magico (CP/MAS) se realizo en un espectrometro Bruker 360 MHz DMX (Billerica, MA). Las particulas se embalaron en rotores de 4 mm y se centrifugaron a 8,0 kHz. Los espectros se recogieron en 5000 escaneos con la determinacion de los desplazamientos qrnmicos en partes por millon en relacion con un patron externo de TMS. Se midio la liberacion de oxido mtrico en tiempo real (intervalos de 1 segundo) usando un analizador por quimioluminiscencia de oxido nftrico Sievers 5 NOATM 280i (NOA) (Boulder, CO). La calibracion del NOA se realizo tanto con aire pasado a traves de un filtro cero Sievers de NO y 26,39 ppm de NO gas (equilibrio N2). Las particulas liberadoras de oxido mtrico se sumergieron en 25 ml de solucion desoxigenada y se burbujearon con una corriente de N2 de 80 ml min-1. Se suministro N2 adicional al matraz de reaccion para que coincidera con la velocidad de recogida del NOA en 200 ml min-1.

El control de la temperatura se mantuvo usando un bano de agua a 37 °C. Se estudio la liberacion de NO termica y fotoiniciada realizando los experimented en DTPA 500 pM (pH PBS 7,4) para quelar trazas de cobre e iluminar el matraz de muestra con bombillas incandescentes de 60, 100 y 200 W, respectivamente. La liberacion de NO iniciada por cobre se estudio anadiendo las partteulas a 25 ml de CuBr2(ac) 10 o 25 pM. El matraz de muestra NOA se protegio de la luz con papel de aluminio para experimentos en los que la luz no era el iniciador deseado de la liberacion de NO. El tamano de partteula se determino usando un instrumento de dispersion de luz dinamica (DLS) Zetasizer Nano ZS (Malvern, R.U.) de potencial zeta y de tamano de partteula. Las muestras se suspendieron en PBS a una concentracion de 1 mg ml-1 y se sometieron a ultrasonidos durante 15 minutos antes del analisis. Las microgrartas electronicas de barrido se registraron en un microscopio electronico de barrido Hitachi S-4700 (Pleasanton, CA).

Para confirmar la incorporacion de mercaptosilano dentro de la red de sflice y comparar diversas composiciones, se uso la resonancia magnetica nuclear 29S en estado solido por polarizacion cruzada/giro al angulo magico (RMN CP/MAS) para caracterizar los productos de MPTMS/TMOS como una funcion de la concentracion de MPTMS. Los atomos de silicio de tetraalcoxisilanos aparecen en los espectros de RMN como bandas Qn mientras que los de organotrialcoxisilanos aparecen como bandas Tn. En ambos casos, n indica el numero de enlaces de siloxano unidos al atomo de Si. Cuanto mayor sea el numero de enlaces de siloxano al atomo de Si, mas lejos se desplazara la banda de RMN en el campo. La Figura 3 muestra sflice sintetizada con (A) 0, (B) 25, (C) 40, (D) 60, (E) 75, y (F) 85 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS). Las partteulas sintetizadas por completo de TMOS mostraron solo bandas Q. Al aumentar la concentracion de MPTMS en la solucion usada para preparar las partteulas, las bandas T aumentaron en relacion con las bandas Q, confirmando una mayor incorporacion de MPTMS en la partteula de sflice. El porcentaje en peso de azufre de cada composicion se determino usando analisis elemental y corroboro adicionalmente la incorporacion covalente del mercaptosilano. El porcentaje en peso de azufre en la sflice fue de 4,92, 7,11, 11,67, 13,56 y 17,30 para las composiciones de 25, 40, 60, 75 y 85 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS), respectivamente. Se encontro que las partteulas basadas en TEOS teman porcentajes en peso de azufre de 16,15 y 19,34 para 75 y 85 % en moles de MPTMS, respectivamente. Como era de esperar, el porcentaje en peso de azufre aumento linealmente al aumentar la concentracion de MPTMS en la solucion inicial.

Las mediciones de dispersion de luz dinamica (DLS) indicaron que la muestra era demasiado polidispersa para medir con precision el tamano de partteula. Las micrograffas electronicas de barrido (MEB) indicaron ademas que la sflice que contema tiol era polidispersa y mostraba una morfologfa no esferica mas indicativa de sflice coloidal que de partteulas individuales. (datos no mostrados).

Ejemplo 4: Variacion de las concentraciones de agua, amomaco y silano y velocidad de alimentacion Sistematicamente, los investigadores variaron los parametros sinteticos (es decir, concentraciones de agua, amomaco y silano) para ajustar la morfologfa de la partteula resultante y lograr una forma mas esferica. La composicion de 25 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS) se eligio como el sistema modelo para la comparacion debido al caracter organico mmimo.

Para partteulas MPTMS, los investigadores encontraron que aumentar el contenido de agua de 8,0 a 16,2 M promovio la formacion de partteulas esfericas y evito la agregacion/fusion. Se demostro que concentraciones mas bajas de amomaco daban como resultado partteulas que caredan de forma esferica y se agregaban. Por lo tanto, los investigadores descubrieron que la relacion de agua y amomaco a silano fue un factor cntico durante la smtesis de partteulas. Al considerar todos los datos, los investigadores determinaron que las partteulas mas esfericas y monodispersas eran las partteulas de 25 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS) que se formaron usando 5,5 M de amomaco, 0,1 M de silano y 16,2 M de agua. Cabe destacar que, el rendimiento del producto (~70 mg) con esta smtesis fue menor que el obtenido para la sflice coloidal polidispersa. El rendimiento disminuido se debio a la disminucion de 4 veces en la concentracion de silano usada en la smtesis optimizada.

A continuacion, se aumento la concentracion de MPTMS en la solucion para potenciar el grado de funcionalidad de tiol y el potencial almacenamiento de NO de las partteulas. La Figura 4 representa las partteulas resultantes a medida que la concentracion de MPTMS se aumento de 25-85 % en moles y el alcoxisilano de cadena principal vario entre TMOS y TEOS. Las partteulas se sintetizaron con 16,0 M de agua, 5,5 M de amomaco y 0,1 M de silano. Al igual que con el sistema de sflice coloidal polidisperso, la formacion de partteulas no se observo para 25-60 % en moles de MPTMS (equilibrio TEOS). Solo las concentraciones de 75 y 85 % en moles de MPTMS produjeron partteulas con TEOS, que ilustran como las disparidades en la hidrolisis y la cinetica de condensacion afectan y dificultan adversamente la formacion de partteulas. Las partteulas de 75 % en moles de MPTMS (equilibrio TEOS) se formaron en una distribucion de tamano estrecha y mostraron morfologfas esfericas (Figura 4F). En cambio, las partteulas de 85 % en moles de MPTMS (equilibrio TEOS) paredan partteulas agregadas (Figura 4G). Al usar TMOS, 25 % en moles MPTMS fue la untea concentracion que produjo partteulas monodispersas esfericas (Figura 4A). Las partteulas con MPTMS > 40 % en mol (equilibrio TMOS) mostraron morfologfas ideales, pero con distribuciones de tamano bimodales concomitantes (Figura 4B-E).

Para remediar la distribucion del tamano bimodal que se observo para determinadas composiciones de MPTMS, se evaluo el efecto de una velocidad de alimentacion de silano de 0,5 ml min-1 sobre las morfologfas de las partteulas en todo el intervalo de composiciones (Figura 5). La velocidad de alimentacion mas lenta mejoro la dispersion de la distribucion de tamano ya estrecha para 25 % en MPTMS (Figura 5A). Tambien se observo una mejora pronunciada en la monodispersidad para el 40 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS, Figura 5B), con MEB que indica un diametro de partfcula de 293 ± 24 nm. Las velocidades de alimentacion de silano mas lentas (por ejemplo, 0,25 ml min-1) dieron como resultado ligeras mejoras de monodispersidad (datos no mostrados), pero a rendimientos mas bajos (por ejemplo, -40 frente a 70 mg para una composicion MPTMS de 40 % en moles (equilibrio TMOS). Por lo tanto, se determino que 0,5 ml min-1 era la velocidad de alimentacion optima ya que permitfa un equilibrio entre el rendimiento de partfculas suficiente y la monodispersidad. De forma similar a 25 % en moles de MPTMS (equilibrioTMOS), la monodispersidad de 75 % en moles de MPTMS (equilibrio TEOS) mejoro, mientras que el sistema de 85 % en moles de MPTMS (equilibrio TEOS) permanecio agregado (Figura 5F y 5G, respectivamente).

Ademas, el rendimiento del producto aumento a ~170 mg para estas dos composiciones y se puede atribuir a la mayor concentracion del MPTMS mayor en las partfculas. Desafortunadamente, el procedimiento semicontinuo resulto problematico para 60, 75 y 85 % en moles de partfculas MPTMS (equilibrio TMOS). Como se muestra en la Figura 5C-E, la adicion de silano ralentizada dio como resultado tanto la agregacion como la formacion de una gran red de sflice en lugar de partfculas esfericas monodispersas. Para examinar este fenomeno adicionalmente, se variaron las velocidades de alimentacion de silano (0,25-3,0 ml min-1) para 60 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS). Las velocidades de alimentacion <2,0 ml min-1 dieron como resultado sflice polidispersa y agregada, mientras que las velocidades de alimentacion mas rapidas (2,0-3,0 ml min-1) produjeron partfculas de tamano bimodal (datos no mostrados).

Luego, los inventores intentaron disminuir el tamano de las partfculas para mejorar la monodispersidad de las partfculas. Las partfculas de 75 % en moles de MPTMS (equilibrio TEOS) se eligieron como un sistema modelo para examinar el efecto de la concentracion de agua sobre el tamano de partfcula y la morfologfa. Como se muestra en la Figura 6, el 75 % en moles de MPTMS (equilibrio TEOS) se sintetizo con (A) 47,0, (B) 42,0, (C) 40,6, (D) 36,5, (E) 32.5 y (F) 24,9 M de agua. Las concentraciones de agua >40,6 M favorecieron la rapida hidrolisis del silano y la cinetica de condensacion, lo que condujo a una red altamente condensada en lugar de partfculas esfericas discretas. A una concentracion de agua de 36,5 M, se formaron partfculas discretas, pero con morfologfas que presentan agregacion excesiva. Las partfculas monodispersas (333 ± 48 nm) se observaron por primera vez a una concentracion de agua ligeramente inferior (32,5 M). El tamano de partfcula aumento con la disminucion de las concentraciones de agua (456 ± 68 nm y 635 ± 63 nm para 24,9 y 16,2 M, respectivamente). Ademas, los tamanos de partfcula mas pequenos se acompanaron con rendimientos ligeramente mas bajos para cada composicion. Los rendimientos para partfculas de 75 % en moles de MPTMS (equilibrio TEOS) fueron ~65, 150, y 170 mg para concentraciones de agua de 32,5, 24,9 y 16,2 M, respectivamente. Las diferencias en el rendimiento pueden ser factores de la eficiencia de la recogida de partfculas (es decir, centrifugacion rpm y duracion) para las partfculas mas pequenas en lugar de diferencias qrnmicas.

Las concentraciones de agua adecuadas (32,5 y 24,9 M) se usaron a continuacion para ajustar el tamano de partfcula y reducir la caractenstica de distribucion bimodal de las partfculas de 60, 75 y 85 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS). Como se muestra en la Figura 7, la concentracion intermedia de agua (24,9 M) proporciono partfculas con tamanos de 179 ± 22 y 196 ± 25 nm para las composiciones de 25 y 40 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS), respectivamente. La mayor concentracion de agua (32,5 M) aumento drasticamente la cinetica de reaccion para la mayona de los sistemas basados principalmente en TMOS, dando como resultado redes de sflice altamente condensadas. Al aumentar la concentracion de MPTMS (75 % en moles) se obtuvieron partfculas esfericas monodispersas de 363 ± 51 y 279 ± 49 nm usando 24,9 y 32,5 M de agua, respectivamente. Las partfculas agregadas y condensadas se formaron para la mayor concentracion de MPTMS (85 % en moles) cuando se uso agua 24,9 M. Sin embargo, se formaron partfculas monodispersas (440 ± 84 nm) cuando se sintetizaron con agua 32.5 M.

La contraparte basada en TEOS de este sistema se comporto de forma similar produciendo solo partfculas discretas (506 ± 77 nm) cuando se sintetizo con la mayor concentracion de agua. En cantidades de agua mas bajas, se observo la formacion de partfculas agregadas. La tendencia de disminucion del rendimiento de partfculas con el contenido de agua creciente que se observo para la composicion de 75 % en moles de MPTMS (equilibrio TEOS) se reflejo para todas las demas composiciones evaluadas. Los rendimientos para las partfculas de 75 % en moles (equilibrio TMOS) disminuyeron de ~120 a 60 mg al aumentar el contenido de agua de 24,9 a 32,5 M. Analogamente, el rendimiento de partfculas de 25 % en mol de MPTMS (equilibrio TMOS) disminuyo de ~90 a 20 mg mientras que el 40 % en moles del sistema MPTMS mostro una disminucion de ~50 a 9 mg al aumentar la concentracion de agua de 16,2 a 24,9 M. Los rendimientos para ambas composiciones de MPTMS 85 % en moles (es decir, equilibrio TMOS y TEOS) a una concentracion de agua de 32,5 M fueron de ~160 mg. Tal vez de mayor importancia, las elevadas concentraciones de agua usadas para sintetizar las partfculas modificadas con tiol resolvieron con exito la naturaleza bimodal de determinadas composiciones que no se pueden resolver usando solo un procedimiento semicontinuo. Cabe destacar que, el 60 % en moles de MPTMS (equilibrio TMOS) fue la unica composicion que produjo sistematicamente partfculas de naturaleza bimodal. El aumento del contenido de agua independientemente del procedimiento de adicion (embolado frente a semicontinuo) dio como resultado una red de sflice altamente condensada.

Los tamanos de partmula tambien se midieron mediante DLS para corroborar la monodispersidad de las partmulas y el tamano medido usando MEB. Como se muestra en la Tabla 1, las mediciones de DLS estuvieron de acuerdo con los tamanos calculados a partir de las imagenes MEB. Los diametros medios ligeramente aumentados observados con DLS se pueden atribuir a la hidratacion de partmulas (mediciones de DLS realizadas en solucion). Al igual que MEB, las mediciones de DLS indicaron una distribucion de tamano estrecha, como lo demuestran los bajos indices de polidispersidad para cada composicion.

TABLA 1

Composicion de partmulas Contenido de Tamano de Tamano medio Z Indice de (MPTMS % en moles) agua (M) partmula a (nm) b (nm) polidispersidad 75 % (equilibrio TEOS) 32,5 333 ± 48 416,2 ± 23,4 0,027 75 % (equilibrio TEOS) 24,9 456 ± 68 529,6 ± 23,7 0,018 75 % (equilibrio TEOS) 16,2 635 ± 63 718,0 ± 51,7 0,046 85 % (equilibrio TEOS) 32,5 506 ± 77 668,7 ± 46,0 0,040 25 % (equilibrio TMOS) 24,9 179 ± 22 258,4 ± 15,1c 0,031 25 % (equilibrio TMOS) 16,2 252 ± 20 469,0 ± 24,8c 0,025 40 % (equilibrio TMOS) 24,9 196 ± 25 240,7 ± 17,9c 0,064 40 % (equilibrio TMOS) 16,2 293 ± 24 404,8 ± 28,2 0,045 75 % (equilibrio TMOS) 32,5 279 ± 49 431,2 ± 29,5 0,043 75 % (equilibrio TMOS) 24,9 363 ± 51 507,6 ± 30,8 0,032 85 % (equilibrio TMOS) 32,5 440 ± 84 696,2 ± 44,4 0,042 a Tamano calculado a partir de micrograffas electronicas de barrido de n = 120 partmulas

b Tamanos adquiridos a partir de mediciones de dispersion de luz dinamica en pH PBS 7,4 para n = 3 smtesis c Etanol usado como dispersante

Cabe destacar que, se uso PBS como un dispersante para composiciones con una gran concentracion de MPTMS. Sin embargo, las partmulas mas pequenas con un alto grado de caracter inorganico (es decir, < 40 % en moles de MPTMS) se agregaron rapidamente en este dispersante y provocaron mediciones erraticas de DLS. Esta agregacion puede atribuirse a una gran densidad superficial de grupos silanol protonados que conducen a una interaccion de partmulas desfavorable. Mientras que las condiciones basicas dieron como resultado mediciones de DLS no uniformes debido a la disolucion de las partmulas, el etanol fue un dispersante alternativo viable como se demuestra por la correlacion entre las mediciones de DLS y MEB.

El analisis elemental se uso para caracterizar la composicion de las partmulas. Como era de esperar, los porcentajes en peso de azufre en las partmulas aumentaron en consecuencia con el % en moles de MPTMS usado para hacer que las partmulas indicaran la incorporacion de la funcionalidad tiol (Tabla 2).

TABLA 2

Composicion de partfculas (MPTMS % en

_moles)Contenido de agua (M) Contenido de azufre a (% p) 75 % (equilibrio TEOS) 32,5 13,83 ±3,01 75 % (equilibrio TEOS) 24,9 16,01 ± 1,71 75 % (equilibrio TEOS) 16,2 15,62 ± 1,90 85 % (equilibrio TEOS) 32,5 20,02 ± 3,88 25 % (equilibrio TMOS) 24,9 < 0,0b

25 % (equilibrio TMOS) 16,2 0,51 ± 0,36

40 % (equilibrio TMOS) 24,9 1,09 ± 0,58

40 % (equilibrio TMOS) 16,2 3,08 ± 2,57

75 % (equilibrio TMOS) 32,5 18,29 ± 5,34 75 % (equilibrio TMOS) 24,9 15,30 ± 5,32 85 % (equilibrio TMOS) 32,5 20,55 ± 5,70 a Los porcentajes de peso medio se calculan a partir de n = 3 smtesis

b El porcentaje en peso fue inferior que el lfmite de deteccion del instrumento

Las smtesis que promueven la formacion de partmulas esfericas discretas tienden a obtenerse preferentemente de un precursor, como lo demuestra un gran hueco en la transicion de 40 a 75 % en moles de MPTM^s(% en peso 3,08 ± 2,57 y 15,62 ± 1,90, respectivamente). Estos valores estaban en marcado contraste con el % en peso de azufre de la sflice coloidal. Aunque el mayor contenido % en peso de azufre era mas linealmente proporcional a la sflice coloidal, la falta de particulas esfericas discretas no era ideal. La comparacion de los dos sistemas (coloidales frente a particulas discretas) y la smtesis revela que existe un equilibrio entre la incorporacion de silano y determinados criterios de diseno.

Ejemplo 5: Smtesis de particulas con NAPTMS

Procedimiento para el equilibrio 25 % de NAPTMS TMOS/TEOS:

1. Se disolvieron 85,4 mg NAPTMS (precursor terciario) en 3,95 ml de etanol mediante agitacion con formacion de vortice

2. A la mezcla de reaccion se le anadieron 4,09 ml de agua y luego se anadio una mezcla de TMOS/etanol (71,9 |jl de TMOS y 200 j l de etanol) mediante una bomba de jeringa a una velocidad de 1,0 ml/min.

3. Se anadieron 6 ml de HCl 5M y se dejo sometida a ultrasonidos (120 %) durante 1 hora.

4. Se anadieron 4 ml de hidroxido de amonio y se dejo sometida a ultrasonidos (120 %) durante 30 minutos.

Concentraciones finales de particulas TMOS y TEOS:

[Silano] = 0,0352 M [Etanol] = 3,85 M

[Agua] = 42,8 M [NH3] = 3,43 M

[HCl] = 1,57 M

Caracterizacion de tamano:

Ejemplo 6: Nitrosacion de particulas de sflice basadas en mercaptosilano

Los tioles dentro de las particulas se nitrosaron por reaccion con acido nitroso, 12 Particulas (~200 mg) se anadieron primero a 4 ml de metanol (MeOH). Mientras se agitaba, se anadieron 2 ml de acido clorltidrico (5 M) a la suspension. Despues se anadio a la suspension de particulas una solucion acuosa de 2 ml que contema nitrito de sodio (exceso 2 molar respecto al tiol) y DTPA (500 ^jM), y la mezcla se agito durante 2 h en la oscuridad y sobre hielo. Las particulas se recogieron por centrifugacion a 4500 rpm (5 min), se lavaron con 40 ml de DTPA (ac) 500 jM enfriado, se recogieron, se lavaron con 40 ml de MeOH enfriado, se recogieron y se secaron al vado durante 30 min. mientras se protegfan de la luz. Las particulas se almacenaron a -20 ° C al vado hasta su posterior estudio.

Las particulas modificadas con MPTMS se nitrosaron para permitir el almacenamiento y la liberacion de NO. En resumen, las particulas fueron tratadas con nitrito de sodio acidificado, generando acido nitroso, un agente de nitrosacion que reacciona con tioles para formar los RSNO (vease la Ec. 1).

RSH HN02 ^ RSNO H20 (1)

Dado que los S-nitrosotioles preparados a partir de tioles primarios absorben la luz a 330-350 y 550-600 nm, la formacion satisfactoria de RSNo se confirmo por el color rojo resultante de las particulas despues de la nitrosacion. Ademas, la intensidad del color aumento con el % en moles de MPTMS indicando una mayor formacion de RSNO. Como es ampliamente conocido, los S-nitrosotioles se descomponen a traves de una multitud de vfas (Figura 8). Tanto la foto como la irradiacion termica de RSNO dan como resultado la escision homolftica del enlace SN, produciendo NO y un radical tiilo. El radical tiilo puede reaccionar posteriormente con un RSNO para generar un disulfuro y un equivalente adicional de NO. Se ha demostrado que el Cu (I), que resulta de la reduccion de Cu (II) a traves de iones traza de tiolato, es activo en un mecanismo de descomposicion de RSNO cataltiico. Tambien puede producirse la transnitrosacion entre un tiol y un RSNO, lo que da como resultado la transferencia de la funcionalidad nitrosa y la formacion de una nueva especie de RSNO que puede descomponerse a traves de las vfas mencionadas anteriormente.

Para evaluar el almacenamiento y la liberacion de NO, se anadieron particulas modificadas con RSNO (~2 mg) a 500 jM de DTPA (pH PBS 7,4) a una temperatura de 0 °C, mientras que se media la liberacion de NO resultante en funcion de la descomposicion fotolftica. Como se muestra en la Figura 9A, las particulas de silice modificadas con RSNO mostraron una liberacion de NO fotoiniciada al exponerse a luz blanca de banda ancha. Los mayores niveles de irradiacion (es decir, la potencia) dieron como resultado una liberacion elevada de NO de las particulas. Cabe destacar que, se observaron bajos niveles de liberacion de NO (~15 ppb mg-1 s'1) a 0 °C y en la oscuridad (insercion de la Figura 9A). Otros han demostrado que el oxfgeno puede reaccionar con NO para formar trioxido de dinitrogeno (N2O3), un oxidante que tambien descompone los RSNO. Por lo tanto, se esperana que la eliminacion de oxfgeno del entorno de almacenamiento de las particulas modificadas con RSNO aumentara la estabilidad de almacenamiento de NO de las particulas. De hecho, no se midio ninguna perdida significativa en la capacidad de liberacion de NO al almacenar las particulas durante 2 meses a -20 °C al vado y en la oscuridad.

Debido a la rapida cinetica de la descomposicion fotoiniciada, el almacenamiento total de NO de las partmulas se evaluo exponiendo las partmulas a 200 W de luz de banda ancha. De hecho, > 95 % del NO almacenado se libero despues de 5 h de irradiacion a 200 W. Como se indica en la Tabla 3, el NO total liberado de las partmulas vario de 0,09-4,39 pmol mg-1. Estos niveles de almacenamiento de NO son un orden de magnitud mayor que las partmulas de sflice modificadas con RSNO anteriormente indicadas. Usando los porcentajes en peso de azufre medio junto con los valores medios de almacenamiento de NO, el porcentaje de conversion de tiol a RSNO para las diferentes composiciones de partmulas se calculo en 58-78 % para los sistemas de 75 y 85 % en moles de MPTMS/TMOS y MPTMS/TEOS. Se encontro que las partmulas de 25 y 40 % en moles de MPTMS teman menores conversiones de tiol a RSNO (54-63 %).

TABLA3

Composicion de particulas (MPTMS % en moles) Contenido de agua (M) Total de NO liberado a (pmol mg-1)

75 % (equilibrio TEOS) 32,5 3,24 ± 0,61 75 % (equilibrio TEOS) 24,9 3,58 ± 0,39 75 % (equilibrio TEOS) 16,2 3,15 ± 0,60 85 % (equilibrio TEOS) 32,5 3,95 ± 0,66 25 % (equilibrio TMOS) 24,9 0,09 ± 0,02 25 % (equilibrio TMOS) 16,2 0,10 ± 0,02 40 % (equilibrio TMOS) 24,9 0,34 ± 0,02 40 % (equilibrio TMOS) 16,2 0,52 ± 0,22 75 % (equilibrio TMOS) 32,5 3,31 ± 0,85 75 % (equilibrio TMOS) 24,9 3,73 ± 0,62 85 % (equilibrio TMOS) 32,5 4,39 ± 0,02 a Los promedios se calculan a partir de n = 3 smtesis y despues de 5 h de 200 W de irradiacion

El efecto del cobre en la liberacion de NO se investigo como una funcion de la concentracion de cobre. Estos ensayos se realizaron con Cu (II) a traves de CuBr2 debido a la insolubilidad de los compuestos de Cu (I) en soluciones acuosas. Como era de esperar, la liberacion de NO de las partmulas modificadas con RSNO se correlaciono con la concentracion de cobre (Figura 9B) con la mayor concentracion de cobre examinada (25 ^{j M )}generando la liberacion maxima de NO (~45 ppb mg-1 s"1).

El uso de partmulas modificadas con RSNO para aplicaciones biomedicas probablemente requiera un accionador de liberacion de NO que no sea la luz o grandes concentraciones de iones de cobre libres. Por lo tanto, los investigadores evaluaron la liberacion de NO de las partmulas a traves de la degradacion termica a 37 °C usando 75 % en mol de MPTMS (equilibrio TEOS, 718,0 ± 51,7 nm) como un sistema modelo. Las partmulas se introdujeron en DTPA 500 ^{j M}(pH PBS 7,4), se mantuvieron a 37 °C y se protegieron de la luz externa mientras se monitorizaba la liberacion de NO durante 48 h (Tabla 4). En estas condiciones, las partmulas liberaron un total de 1,17 pmol NO mg-1 con una semivida correspondiente de 2,95 h. Cuando se compara con la cantidad total liberada despues de 5 h usando 200 W de irradiacion (3,15 pmol mg-1, Tabla 3) la discrepancia puede atribuirse a la incapacidad de medir el NO a niveles bajos mas alla de las 48 h y/o la perdida de NO a traves de su reaccion con el oxfgeno presente en las soluciones de remojo. Como es evidente por un matiz rosado, las partmulas aun conteman una porcion de su carga util de NO incluso despues de 48 h de liberacion.

TABLA 4

Tiempo (h) Liberacion instantanea de NO (ppb mg-1 s-1)a

0 1205,7 ± 22,4

0,5 481,2 ± 7,7

1 355,7 ± 7,7

6 74,9 ± 0,7

12 33,2 ± 0,4

24 12,6 ± 0,2

48 2,50 ± 0,07

a Los promedios se calculan a partir de n = 3 smtesis

Ejemplo 7: Caracterizacion de la liberacion de NO iniciada termicamente de particulas RSNO primarias y terciarias

Para cada composicion de partmulas, se anadieron aproximadamente 3 mg de particulas al matraz de recogida que contema PBS (DTPA 500 ^jM) y la liberacion de NO se monitorizo durante 75 minutos. Las caractensticas de almacenamiento y liberacion de NO se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5

Tambien se investigaron las caractensticas de almacenamiento y liberacion de NO de la muestra de 25 % NAPTMS bajo irradiacion. Usando 200 W de iluminacion, y 0,3 m de distancia, los resultados se muestran en la Tabla 6.

TABLA 6

Los resultados que se muestran en las Tablas 5 y 6 mostraron que la estabilidad de NO de las partfculas puede aumentarse significativamente usando partfculas de sflice funcionalizadas con nitrosotiol terciario.

Ejemplo 8: Influencia de los ultrasonidos de particulas antes/despues de la nitrosacion

Experimento 8A: Partfculas nitrosas sin ultrasonidos

1. Haga nitrosar 15 mg de partfculas en metanol, HCl 5 M, y 2 mol X (frente a tiol) de NaNO2/DTPA 500 uM. 2. Recoja y lave con dtpa fno y metanol fno. Seque al vacfo durante 45 minutos en la oscuridad (cubierto con papel de aluminio).

3. Anada 1 mg de particulas nitrosadas a 5 ml de PBS (DTPA)

4. Exponga a 200 W de iluminacion (30 cm desde el interior de la caja)

Experimento 8B: Nitrosacion de particulas despues de ultrasonidos

1. Haga nitrosar 15 mg de particulas en metanol, HCl 5 M, y 2 mol X (frente a tiol) de NaNO2/DTPA 500 uM. 2. Recoja y lave con dtpa fno y metanol fno. Seque al vacfo durante 45 minutos en la oscuridad (cubierto con papel de aluminio).

3. Anada 1 mg de particulas nitrosadas a 5 ml de PBS (DTPA) y someta a ultrasonidos durante 30 minutos en hielo a una amplitud = 50 %.

4. Exponga a 200 W de iluminacion (30 cm desde el interior de la caja)

Experimento 8C: Ultrasonidos de partfculas (30 minutos a una amplitud = 50 %) seguido de nitrosacion

1. Someta a ultrasonidos 15 mg de partfculas no nitrosadas en 4 ml de metanol sobre hielo durante 30 minutos en hielo a una amplitud = 50 %.

2. Haga nitrosar las partfculas sometidas a ultrasonidos en 4 ml de metanol, HCl 5 M, y 2 mol X (frente a tiol) de NaNO2/DTPA 500 uM.

3. Recoja y lave con dtpa fno y metanol fno. Seque al vacfo durante 45 minutos en la oscuridad (cubierto con papel de aluminio).

4. Anada 1 mg de particulas nitrosadas a 5 ml de PBS (DTPA)

5. Exponga a 200 W de iluminacion (30 cm desde el interior de la caja)

Experimento 8D: Ultrasonidos de particulas (60 minutos a una amplitud = 50 %) seguido de nitrosacion

1. Someta a ultrasonidos 15 mg de partfculas no nitrosadas en 4 ml de metanol sobre hielo durante 60 minutos en hielo a una amplitud = 50 %.

3. Recoja y lave con dtpa frte y metanol frte. Seque al vado durante 45 minutes en la oscuridad (cubierto con papel de aluminio).

4. Anada 1 mg de partteulas nitrosadas a 5 ml de PBS (DTPA)

5. Exponga a 200 W de iluminacion (30 cm desde el interior de la caja)

Los resultados de los Experimented 8A-8D se muestran en

Las imagenes MEB de las partteulas formadas en el Ejemplo 7A se proporcionan en la Figura 10. Las imagenes MEB de las partteulas formadas en el Ejemplo 7C se proporcionan en la Figura 11. Las imagenes MEB de las partteulas formadas en el Ejemplo 7D se muestran en la Figura 12. Estos resultados muestran que la morfologfa de las partteulas y el almacenamiento de oxido nftrico no se ven significativamente influenciados por el procedimiento de ultrasonidos. Por lo tanto, las partteulas de ultrasonidos pueden usarse para estrechar la distribucion de tamanos y/o fabricar partteulas mas pequenas.

En los dibujos y la memoria descriptiva, se han desvelado realizaciones de la invencion y, aunque se emplean terminos espedficos, se usan en un sentido generico y descriptivo unicamente y no con fines de limitacion, exponiendose el ambito de la invencion en las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de formacion de partfculas de s l^ice co-condensadas funcionalizadas con S-nitrosotiol que comprende:

hacer reaccionar un silano que contiene tiol y un alcoxisilano de cadena principal en una solucion de precursor de sol que comprende agua para formar partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol, en el que el silano que contiene tiol comprende un silano que contiene tiol terciario y el alcoxisilano de cadena principal es un alcoxisilano que no contiene un grupo funcional tiol y, en el que las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol comprenden una matriz de polisiloxano y al menos algunos de los grupos tiol estan presentes dentro de la matriz de polisiloxano; y

2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la solucion de precursor de sol comprende un catalizador de amomaco a una concentracion en un intervalo de 1,9 a 5,5 M;

en el que la concentracion total de monomero de silano en la solucion de precursor de sol esta en un intervalo de 0,1 M a 0,4 M;

en el que la concentracion total de monomero de silano comprende 25 a 85 % en moles de mercaptopropiltrimetoxisilano; y

en el que el agua esta presente en la solucion de precursor de sol a una concentracion en un intervalo de 8,0 M a 32,5 M.

3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el silano que contiene tiol terciario comprende un tiol terciario que tiene la siguiente estructura:

en la que R, R' y R" son cada uno independientemente alquilo y n esta en un intervalo de 0 a 10, mas preferentemente, en el que el silano que contiene tiol terciario tiene la siguiente estructura:

4. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que el alcoxisilano de cadena principal comprende tetraetoxisilano.

5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol se someten a ultrasonidos antes de hacer reaccionar las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con tiol con un agente de nitrosacion.

6. Partfculas de sflice co-condensada monodispersas funcionalizadas con S-nitrosotiol que tienen un diametro medio de partfcula en un intervalo de 200 nm a 700 nm.

7. Las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol de la reivindicacion 6, en las que las partfculas tienen al menos algunos grupos funcionales de nitrosotiol distribuidos dentro de una matriz de polisiloxano de las partfculas.

8. Las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol de la reivindicacion 6, en las que los grupos funcionales de S-nitrosotiol comprenden grupos funcionales de nitrosotiol primarios.

9. Las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol de la reivindicacion 6, en las que los grupos funcionales de S-nitrosotiol comprenden grupos funcionales de nitrosotiol terciarios.

10. Partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol que tienen un almacenamiento de NO en un intervalo de 0,01 jmol a 10 jmol de NO por mg de partfcula,

preferentemente en las que las partfculas tienen un almacenamiento de NO en un intervalo de 0,09 jmol a 4,40 |jmol de NO por mg de partfcula.

11. Las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol de la reivindicacion 10, en las que las partfculas tienen al menos algunos grupos funcionales de nitrosotiol distribuidos dentro de una matriz de polisiloxano de las partfculas.

12. Las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol de la reivindicacion 10, en las que los grupos funcionales de S-nitrosotiol comprenden grupos funcionales de nitrosotiol primarios.

13. Las partfculas de sflice co-condensada funcionalizadas con S-nitrosotiol de la reivindicacion 10, en las que los grupos funcionales de S-nitrosotiol comprenden grupos funcionales de nitrosotiol terciarios.

14. Una partfcula de sflice co-condensada funcionalizada con S-nitrosotiol que comprende grupos funcionales de nitrosotiol terciarios.