ES2694288T3 - Terapia de combinación para tratar cáncer de mama - Google Patents

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Abstract

Un antagonista de TGFß para su uso en un método de inhibición del crecimiento tumoral asociado a cáncer de mama en un sujeto, comprendiendo el método administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista de TGFß en combinación con capecitabina e ixabepilona, en el que la administración de dicho antagonista de TGFß potencia la eficacia de capecitabina e ixabepilona para inhibir dicho crecimiento tumoral asociado a cáncer de mama.

Description

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DESCRIPCION
Terapia de combinacion para tratar cancer de mama Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud de patente provisional de Estado Unidos 61/313.515, presentada el 12 de marzo de 2010.
Campo de la invencion
La invencion se refiere a composiciones para tratar cancer de mama. Especificamente, la invencion se refiere a administrar un antagonista del factor de crecimiento transformante beta (TGFB) en combinacion con uno o mas agentes de quimioterapia para tratar cancer de mama.
Antecedentes de la invencion
La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta o TGFB) contiene muchas proteinas miembro que comparten elementos de secuencia y motivos estructurales comunes. Estas proteinas son conocidas por provocar un amplio espectro de respuestas biologicas en una variedad de tipos de celulas. La senalizacion celular desencadenada por los miembros de los miembros de la superfamilia del TGFB implica union cooperativa del ligando a tanto componentes del receptor transmembrana tipo II como tipo III de TGFp, que induce el ensamblaje de un complejo de receptor de serina/treonina cinasa activo con el receptor tipo I de TGFp. Este complejo de receptor inicia una via de transduccion de senales fosforilando proteinas Smad citoplasmicas, que entonces se translocan al nucleo y actuan suprimiendo o activando la transcripcion de genes diana.
Muchas proteinas de la superfamilia del TGFB tienen importantes funciones durante el desarrollo embrionario en la formacion de patrones y especificacion de tejido. La senalizacion inducida por las proteinas de la superfamilia del TGFB regula una variedad de procesos de diferenciacion, que incluyen adipogenesis, miogenesis, condrogenesis, hematopoyesis y diferenciacion de celulas epiteliales (para revision vease Massague, 1987, Cell 49:437; Siegel et al., 2003, Nature Review Cancer, 8:807-20). En tejidos adultos, las proteinas de la superfamilia del TGFB tambien participan en procesos tales como el crecimiento y la metastasis tumoral, cicatrizacion, reparacion osea y remodelacion osea. Los efectos supresores de tumores de TGFB se han demostrado en estudios previos. Vease Derynck et al., 2001, Nat Genet, 29:117-129.
Las moleculas de antagonistas de TGFB regulan la senalizacion mediada por TGFB. Ejemplos de tales antagonistas incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales dirigidos contra una o mas isoformas de TGFB (patente de EE.UU. n° 5.571.714 y solicitud de patente PCT WO 97/13844).
Se encontro que las moleculas de antagonista de TGFB inhibian la tumorigenicidad de celulas de cancer de mama y aumentaban la actividad de linfocitos citoliticos espontaneos de bazo de raton. Vease Arteaga et al., 1993, J. Clin. Invest., 92:6.
Existe una necesidad de modalidades de terapia de combinacion para tratar cancer.
Sumario de la invencion
La invencion proporciona un metodo terapeutico de combinacion para tratar cancer de mama en un sujeto. El metodo incluye las etapas de administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista del factor de crecimiento transformante beta (TGFB) en combinacion con capecitabina e ixabepilona. El uso del antagonista (TGFB) en combinacion con capecitabina e ixabepilona potencia la eficacia de la combinacion de capecitabina e ixabepilona para tratar un cancer de mama.
En una realizacion, el antagonista de TGFB es una molecula que bloquea la union de una proteina del TGFB a su receptor. En otra realizacion, el antagonista de TGFB es una molecula que es capaz de disminuir la actividad de un TGFB. En una realizacion particular, el antagonista de TGFB es un anticuerpo monoclonal anti-TGFB que se une a o neutraliza una o mas isoformas de TGFB (por ejemplo, un anticuerpo anti-TGFB especifico de pan).
En algunas realizaciones, el antagonista de TGFB se co-administra con una combinacion de capecitabina e ixabepilona. En otras realizaciones, el antagonista de TGFB se administra independientemente de la administracion de una combinacion de capecitabina e ixabepilona.
La terapia de combinacion de la invencion inhibe el crecimiento de tumor primario y adicionalmente inhibe metastasis de tumor primario a pulmon.
La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista de TGFB, en la que el antagonista de TGFB esta presente en una cantidad eficaz para potenciar la eficacia de la combinacion de capecitabina e ixabepilona para tratar un cancer de mama.
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La invencion proporciona ademas un kit que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista de TGFB, en el que el antagonista de TGFB esta presente en una cantidad eficaz para potenciar la eficacia de la combinacion de capecitabina e ixabepilona para tratar un cancer de mama.
Otras caracteristicas y ventajas de la presente invencion seran evidentes de la siguiente descripcion detallada, ejemplos y figuras. Debe entenderse, sin embargo, que la descripcion detallada y los ejemplos especificos, aunque indican realizaciones preferidas de la invencion, se dan a modo de ilustracion solo, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del espiritu y alcance de la invencion seran evidentes para aquellos expertos en la materia a partir de esta descripcion detallada.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra volumenes medios del tumor primario. Se observo la inhibicion del crecimiento tumoral en las cohortes de capecitabina, ixabepilona y capecitabina+ixabepilona en comparacion con la cohorte de anticuerpo solo.
La Figura 2 muestra que 1D11 como agente unico relativamente no tuvo efecto sobre el crecimiento tumoral de 4T1 (A). 1D11 mejoro la eficacia de capecitabina (B) pero no la eficacia de ixabepilona (C).
La Figura 3 muestra que la adicion de 1D11 mejoro la eficacia de la terapia de combinacion de capecitabina + ixabepilona en inhibir el crecimiento tumoral de 4T1 (A). La capecitabina inhibio el crecimiento tumoral de 4T1, pero no fue tan eficaz como la ixabepilona, aunque 1D11 mejoro la eficacia de la capecitabina, produciendo inhibicion del crecimiento tumoral de 4T1 similar a aquella con ixabepilona sola (B). No hubo ventaja significativa de la terapia de combinacion de capecitabina+ixabepilona con respecto a ixabepilona sola a menos que 1D11 tambien se incluyera en la terapia de combinacion (C).
La Figura 4 muestra una vision general de los efectos de 1D11 como agente unico o en combinacion de capecitabina y/o ixabepilona sobre el crecimiento tumoral de 4T1. La terapia mas eficaz es la combinacion triple de 1 D11+capecitabina+ixabepilona.
La Figura 5 muestra la curva de supervivencia para animales. La mediana de la supervivencia mas larga se observo en los animales tratados con 1D11 + capecitabina + ixabepilona.
La Figura 6 muestra que el tiempo necesario para alcanzar el punto final de un volumen de tumor primario de >2000 mm3 es significativamente diferente (p<0,0001) entre grupos de tratamiento. 1D11 aumento el tiempo hasta el punto final debido a la terapia con capecitabina y el tiempo mas largo hasta el punto final se logro en el grupo de 1 D11+capecitabina+ixabepilona.
La Figura 7 muestra el numero total de metastasis de pulmon a traves de todos los grupos de tratamiento (A) y el numero total de metastasis de pulmon > 1 mm de tamano a traves de todos los grupos de tratamiento (B). El mayor numero de metastasis de pulmon en cada cohorte era el grupo de tratamiento con el tiempo mas largo hasta el punto final; el grupo de tratamiento con 1D11 en cada caso.
La Figura 8 muestra el numero de metastasis de pulmon en la cohorte de agente individual (A), la cohorte de capecitabina (B), la cohorte de ixabepilona (C) y la cohorte de capecitabina+ixabepilona (D). En cada cohorte, el mayor numero de metastasis de pulmon se observo en el grupo de tratamiento con 1D11, probablemente debido a que estos grupos de tratamiento estuvieron en el estudio mas tiempo que sus controles respectivos dentro de cada cohorte.
La Figura 9 muestra que hubo una correlacion entre el numero de metastasis de pulmon y el tiempo en el estudio, independientemente del tratamiento.
La Figura 10 muestra volumenes medios del tumor primario. La inhibicion del crecimiento tumoral se observo en las cohortes de capecitabina, ixabepilona, y de capecitabina+ixabepilona en comparacion con la cohorte de anticuerpo solo.
La Figura 11 muestra que el tratamiento con 1D11 tuvo ligeros efectos como agente unico o en combinacion con tanto capecitabina como ixabepilona. A. la terapia con agente individual con 1D11 produjo una reduccion significativa en el tamano del tumor primario. B. 1D11, administrado en combinacion con capecitabina, produjo eficacia mejorada por encima de la de la capecitabina sola. C. 1D11 no mejoro la eficacia de la ixabepilona en una manera estadisticamente significativa. (A: * = p<0,05, prueba de comparaciones multiples de Tukey) (B: * = p<0,05, ** = p<0,01, prueba de la T).
La Figura 12 muestra que la terapia con 1D11 mejoro significativamente la eficacia de la combinacion de ixabepilona/capecitabina contra el volumen de tumor primario. A. 1D11 mejoro la eficacia de ixabepilona y capecitabina cuando se comparo con 13C4 combinado con ixabepilona y capecitabina. B. Ixabepilona mejoro significativamente la eficacia de 1D11 y capecitabina cuando se dosificaron juntos. C. La combinacion triple de 1D11, capecitabina e ixabepilona fue mas eficaz que 1D11 + ixabepilona. (A: * = p<0,05, prueba de la T) (B: *** = p<0,001, aNoVA unilateral) (C: * = p<0,05, prueba de la T).
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La Figura 13 muestra una vision general de los efectos de 1D11 como agente unico o en combinacion con capecitabina y/o ixabepilona sobre el crecimiento tumoral de 4T1. La terapia mas eficaz es la combinacion triple de 1 D11+capecitabina+ixabepilona.
La Figura 14 muestra metastasis de pulmon totales. 1D11 no inhibio el numero de metastasis al pulmon ni mejoro la eficacia de quimioterapeuticos.
La Figura 15 muestra el esquema de seleccion de celulas CD11 b+ aisladas de tumores primarios 4T1. (A) Seleccion por FSC hi de celulas basada en el tamano y la dispersion. (B) Live gate (dim, 52 %) de celulas viables mediante la seleccion por FSC hi. (C) Seleccion de MdScs (Gr-1 PE bright CD11b PerCP Cy5.5 bright, 74,1 %) y macrofagos (Gr-1 PE dim y CD11b PerCP Cy5.5 bright, 15,4 %) mediante live gate. (D) Seleccion de macrofagos M1 (F4/80 bright y CD206 Alexa 488 dim, 83 %) y macrofagos M2 (F4/80 bright y CD206 Alexa 488 bright, 15,7 %) seleccionados mediante macrofagos. (E) Confirmacion del estado CD206 negativo/bajo de MDC seleccionados mediante Gr-1+CD11b+.
La Figura 16 muestra volumenes medios del tumor primario. Se observo inhibicion del crecimiento tumoral en las cohortes de capecitabina, ixabepilona y de capecitabina+ixabepilona en comparacion con la cohorte de anticuerpo solo.
La Figura 17 muestra que 1D11 como agente unico no tuvo efecto sobre el crecimiento tumoral de 4T1 (A). 1D11 tampoco mejoro significativamente la eficacia de capecitabina (B) o ixabepilona (C).
La Figura 18 muestra que 1D11 mejoro la eficacia de la terapia de combinacion de capecitabina + ixabepilona en inhibir el crecimiento tumoral de 4T1 (A). La capecitabina inhibio el crecimiento tumoral de 4T1 ligeramente, pero fue mas eficaz cuando se combino con ixabepilona (B). La inhibicion del crecimiento tumoral entre ixabepilona y la terapia de combinacion de capecitabina+ixabepilona fue similar, a menos que 1D11 tambien se incluyera en la terapia de combinacion (C).
La Figura 19 muestra una vision general de los efectos de 1D11 como agente unico o en combinacion con capecitabina y/o ixabepilona sobre el crecimiento tumoral de 4T1. La terapia mas eficaz es la combinacion triple de 1 D11+capecitabina+ixabepilona.
La Figura 20 muestra que las metastasis pulmonares de ratones portadores de tumores 4T1 SQ disminuyeron por la terapia de combinacion de capecitabina + ixabepilona y la eficacia de este tratamiento mejoro significativamente mediante la adicion de 1D11.
La Figura 21 muestra que basandose en inmunofenotipificacion de macrofagos totales (F4/80+), macrofagos M1 (F480+CD206-) y macrofagos M2 (F4/80+CD206+) aislados de tumores primarios 4T1 en el estudio 09-4255, 1D11 tuvo poco efecto sobre el numero de macrofagos en tumores primarios. La barra en negro representa vehiculo; la barra en rojo representa 13C4 (control); y la barra en azul representa 1D11.
La Figura 22 muestra que la arginasa de celulas CD11b+ aisladas de tumores primarios 4T1 de ratones tratados con 1D11 disminuye significativamente en comparacion con ratones de control.
1D11 descrito en el presente documento representa un anticuerpo monoclonal anti-TGFB.
Descripcion detallada de la invencion
La invencion se refiere a composiciones y metodos de tratamiento de un cancer de mama. Especificamente, la invencion se refiere a administrar un antagonista de TGFB en combinacion con uno o mas agentes de quimioterapia para tratar un cancer de mama. El uso de antagonista de TGFB en combinacion con uno o mas agentes de quimioterapia potencia la eficacia del uno o mas agentes de quimioterapia para tratar un cancer de mama.
Los agentes de quimioterapia de la invencion incluyen, pero no se limitan a, capecitabina, ixabepilona, o una combinacion de las mismas.
En una realizacion, en el presente documento se proporciona un metodo para potenciar la eficacia de una quimioterapia para tratar un cancer de mama en un sujeto, comprendiendo el metodo: administrar a dicho sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista de TGFB en combinacion con capecitabina e ixabepilona, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFB potencia la eficacia de capecitabina e ixabepilona para tratar dicho cancer de mama.
En otra realizacion, en el presente documento se proporciona un metodo de inhibicion de un crecimiento tumoral asociado a cancer de mama en un sujeto, comprendiendo el metodo: administrar a dicho sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista de TGFB en combinacion con capecitabina e ixabepilona, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFB potencia la eficacia de capecitabina e ixabepilona para inhibir dicho crecimiento tumoral asociado a cancer de mama.
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Los inventores de la presente solicitud encontraron sorprendente e inesperadamente que la neutralizacion de TGFB en combinacion con uno o mas agentes de quimioterapia potencia la eficacia del uno o mas agentes de quimioterapia para tratar un cancer de mama. Por ejemplo, el uso de antagonista de TGFB en combinacion con capecitabina e ixabepilona potencia sorprendente e inesperadamente la eficacia de capecitabina e ixabepilona para tratar un cancer de mama.
Como se usa en el presente documento, “TGFB” se refiere a todas las isoformas de TGFB. Actualmente hay 5 isoformas conocidas de TGFB (1-5), todas las cuales son homologas (60-80 % de identidad) y todas las cuales forman homodimeros de aproximadamente 25 kD, y actuan en receptores celulares de TGFB comunes (tipos I, II y III). La biologia genetica y molecular de TGFB es muy conocida en la tecnica (veanse, por ejemplo, Roberts, 1998, Miner. Electrolyte and Metab., 24(2-3):111-119; Wrana, 1998, Miner. Electrolyte and Metab., 24(2-3):120-130.)
Como se usa en el presente documento, un “antagonista de TGFB” es cualquier molecula que es capaz de disminuir la cantidad o actividad de TGFB, tanto dentro de una celula como dentro de un sistema fisiologico. Preferentemente, el antagonista de TGFB actua reduciendo la cantidad o actividad de un TGFB 1, 2 o 3. Por ejemplo, un antagonista de TGFB puede ser una molecula que inhibe la expresion de TGFB al nivel de la transcripcion, traduccion, procesamiento o transporte; puede afectar la estabilidad de TGFB o la conversion de la molecula precursora a la forma madura activa; puede afectar la neutralizacion de TGFB o la capacidad de TGFB para unirse a uno o mas receptores celulares (por ejemplo, tipo I, II o III); o puede interferir con la senalizacion de TGFB.
Se conocen en la tecnica una variedad de antagonistas de TGFB y metodos para su produccion y muchos mas estan actualmente en desarrollo (vease, por ejemplo, Dennis et al., patente de EE.UU. N.° 5.821.227). El antagonista de TGFB especifico empleado no es una caracteristica limitante; cualquier antagonista de TGFB eficaz como se define en el presente documento puede ser util en los metodos y composiciones de la presente invencion. En una realizacion, el antagonista de TGFB es un antagonista de TGFB-1, TGFB-2 o TGFB-3. En una realizacion particular, el antagonista de TGFB es un anticuerpo anti-TGFB especifico de pan que se une a o neutraliza una o mas isoformas de TGFB.
Los efectos de TGFB estan mediados por la union de TGFB activo a receptores especificos presentes en las celulas, seguido de transduccion de senal a aquellas celulas. Los antagonistas de TGFB se definen como agentes que inhiben la transduccion de senales de TGFB, que incluyen antagonistas de TGFB que se conocen en la tecnica. Por ejemplo, agentes que se unen a TGFB y previenen que TGFB se una a un receptor de TGFB actuaran de antagonistas de TGFB.
Otros ejemplos no limitantes incluyen anticuerpos bloqueantes (neutralizantes) especificos para un TGFB humano (NAbs) tal como aquellos descrito por Dasch et al. (J. Immunol. (1989) 142:1536) y Lucas et al. (J. Immunol. (1990) 145:1415), receptores de TGFB solubles, receptores de TGFB unidos a la membrana, inhibidores de la proteasa que inactivan una proteasa responsable de activar un TGFB precursor en TGFB maduro, anticuerpos especificos para receptores de TGFB (tipos I, II o III) y que previenen la union de TGFB al receptor, y combinaciones de los mismos.
Aquellos expertos en la materia reconocen diversas formas en las que un anticuerpo derivado de una especie, por ejemplo, un raton, puede manipularse con el fin de ser terapeuticamente util en una segunda especie, por ejemplo, un ser humano. Ciertas de estas tecnicas se revisan brevemente en Harris y Emery, TIBTECH 11:42-44, 1993.
El TGFB es generalmente secretado como un precursor latente que consiste en TGFB no covalentemente asociado a una proteina designada proteina asociada a latencia (LAP; revisada en Harpel et al. (1992) Prog. Growth Factor Res. 4: 321). Se ha expresado un ADN que codifica un peptido de 278 aminoacidos correspondiente a pre-pro- TGFB, que termina justo antes de la forma madura de TGFB y que contiene una sustitucion de Cys33 a Ser33 (Derynck et al. (1985) Nature 316: 701), y se ha encontrado que se une a TGFB y lo convierte en latente.
Formas solubles de receptores de TGFB tambien se uniran a TGFB y prevendran la union a receptores de TGFB asociados a la membrana. Los receptores de TGFB se describen por Wang et al. (Cell (1991) 67: 797) y Lin et al. (Cell (1992) 68: 775). Pueden prepararse formas solubles de receptores de TGFB por metodos que se conocen en la tecnica. Por ejemplo, pueden prepararse mutantes de delecion que carecen del dominio transmembrana de un receptor de TGFB, que expresaran una proteina de union a TGFB soluble. Miyazono et al. (Adv. Immunol. (1994) 55: 181) han revisado receptores de TGFB
Tambien se conocen en la tecnica otros tipos de antagonistas de TGFB. Por ejemplo, Yamaguchi et al. (Nature (1990) 346: 281) tratan la decorina, un proteoglicano pequeno de condroitina-sulfato de dermatano que se une a TGFB y modula la actividad de este factor de crecimiento. Ohtsuki y Massague (Mol. Cell. Biol. 12:261-265, 1992) desvelan inhibidores de proteinas cinasas que bloquean ciertas actividades biologicas de TGFB. T. cruzi produce una cisteina proteasa (cruzaina o cruzipaina; Eakin et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 7411) que convierte el precursor de TGFB inactivo en TGFB maduro activo. El diseno y el uso de inhibidores de la proteasa como farmacos es muy conocido en la tecnica (Design of Enzyme Inhibitors as Drugs; Sandier and Smith, eds; 1989, Oxford University Press; Proteinase Inhibitors Medical and Biological Aspects; Katunuma, Umezawa and Holzer, eds., 1983, Springer- Verlag); asi, pueden prepararse inhibidores de cruzaina y seran utiles como antagonistas de TGFB.
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Todavia otros antagonistas de TGFB y metodos para su produccion son muy conocidos en la tecnica, con muchos mas actualmente en desarrollo. El antagonista de TGFB especifico empleado no es una caracteristica limitante, ya que cualquier antagonista de TGFB eficaz puede ser util en los metodos de la presente invencion. Ejemplos de tales antagonistas incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales dirigidos contra una o mas isoformas de TGFB (patente de EE.UU. N.° 5.571.714), receptores de TGFB, fragmentos de los mismos, derivados de los mismos y anticuerpos dirigidos contra receptores de TGFB (patentes de EE.UU. N.° 5.693.607, 6.008.011, 6.001.969 y 6.010.872); peptido asociado a latencia (documento WO 91/08291), TGFB latente grande (documento WO 94/09812), fetuina (patente de EE.UU. N.° 5.821.227), decorina y otros proteoglicanos tales como biglicano, fibromodulina, lumicano y endoglina (patentes de eE.UU. N.° 5.583.103, 5.654.270, 5.705.609, 5.726.149, 5.824.655, 5.830.847, y 6.015.693).
Otros ejemplos de tales antagonistas incluyen somatostatina (solicitud de patente PCT WO 98/08529), manosa-6- fosfato o manosa-1-fosfato (patente de EE.UU. N.° 5.520.926), prolactina (solicitud de patente PCT wO 97/40848), factor de crecimiento similar a la insulina II (solicitud de patente PCT WO 98/17304), IP-10 (solicitud de patente PCT WO97/00691), peptidos que contienen arg-gly-asp (patente de EE.UU. N.° 5.958.411 y solicitud de patente PCT WO 93/10808 y), extractos de plantas, hongos y bacteria (solicitud de patente europea 813875, solicitud de patente japonesa 8119984 y patente de EE.UU. N.° 5.693.610), oligonucleotidos antisentido (patentes de EE.Uu. N.° 5.683.988, 5.772.995, 5.821.234 y 5.869.462 y solicitud de patente PCT WO 94/25588), y un huesped de otras proteinas implicado en la senalizacion de TGFB, que incluyen SMAD y MAD (patentes de EE.UU. N.° 5.834.248, 5.807.708 y 5.948.639) y Ski y Sno (G. Vogel, Science, 286:665 (1999) y Stroschein et al., Science, 286:771-74 (1999)) y fragmentos y derivados de cualquiera de las moleculas anteriores que retienen la capacidad de inhibir la actividad de TGFB.
Los receptores de TGFB y fragmentos de union a TGFB de receptores de TGFB, especialmente fragmentos solubles, son antagonistas de TGFB utiles en los metodos de la presente invencion. Los receptores de TGFB y los acidos nucleicos que los codifica son muy conocidos en la tecnica. La secuencia de acidos nucleicos humana que codifica el receptor de TGFB tipo 1 se desvela, por ejemplo, en Numero de acceso de GenBank L15436 y en la patente de EE.UU. N.° 5.538.892 de Donahoe et al. La secuencia de acidos nucleicos humana del receptor de TGFB tipo 2 esta publicamente disponible, por ejemplo, con los Numeros de acceso de GenBank AW236001; AI35790; AI279872; AI074706; y AA808255. La secuencia de acidos nucleicos humana del receptor de TGFB tipo 3 tambien esta publicamente disponible, por ejemplo, con los numeros de acceso de GenBank NM 003243; AI887852; AI817295; y AI681599.
En una realizacion preferida, el antagonista de TGFB es un anticuerpo que bloquea la union de TGFB a su receptor, o fragmentos del mismo, tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios y otras formas de “anticuerpos” que retienen la capacidad para unirse a TGFB. En una realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo anti-TGFB especifico de pan. En un ejemplo, el anticuerpo anti-TGFB especifico de pan se une a y neutraliza una o mas isoformas de TGFB. En otro ejemplo, el anticuerpo anti-TGFB especifico de pan bloquea o inhibe la union de una proteina a una o mas isoformas de TGFB.
En una realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En otra realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En otra realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo quimerico. En una realizacion particular, el anticuerpo es una forma humanizada del anticuerpo
monoclonal murino 1D11, depositado con el numero de ATCC [..............1. En otra realizacion particular, el
anticuerpo es un anticuerpo anti-TGFB descrito en la solicitud de patente de EE.UU. numero 11/350.906, presentada el 8 de febrero de 2006 (documento U.S. 2006/0251658), que se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad. En otra realizacion particular, el anticuerpo comprende una o mas CDR de 1D11 descritas en la solicitud de patente de EE.UU. numero 11/350.906.
Como se usa en el presente documento, el termino “anticuerpo” incluye moleculas de inmunoglobulina intactas que comprenden 4 cadenas de polipeptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una region variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento VH) y una region constante de la cadena pesada. La region constante de la cadena pesada contiene tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una region variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento VL) y una region constante de la cadena ligera. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de los dos tipos claramente distintos, llamados kappa (K) y lambda (A), basados en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes. Las regiones variables de las cadenas ligeras kappa se denominan en el presente documento VK. La expresion VL, como se usa en el presente documento, pretende incluir tanto las regiones variables de las cadenas ligeras tipo kappa (VK) como de las cadenas ligeras tipo lambda. La region constante de la cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL incluyen regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, llamadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL esta compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. “CDRH1” se refiere a la primera region CDR en una cadena pesada del anticuerpo, “CDRH2” se refiere a la segunda region CDR en una cadena pesada del anticuerpo, y “CDRH3” se refiere a la tercera region CDR en una cadena pesada del anticuerpo. “CDRL1” se refiere a la primera
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region CDR en una cadena ligera del anticuerpo, “CDRL2” se refiere a la segunda region CDR en una cadena ligera del anticuerpo, y “CDRL3” se refiere a la tercera region CDR en una cadena ligera del anticuerpo.
Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden asignarse a diferentes clases. Hay 5 clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Varios de estos pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que se corresponden con las diferentes clases de anticuerpos se llaman alfa (a), delta (A), epsilon (e), gamma (y) y mu (g), respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas. La presente invencion incluye anticuerpos de cualquiera de las clases anteriormente mencionadas o subclases (isotipos).
El termino “anticuerpo”, como se usa en el presente documento, tambien pretende englobar anticuerpos intactos, fragmentos funcionales que se unen al antigeno, y variantes de los mismos que se unen al antigeno, que incluyen mimeticos de anticuerpos o que comprende porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o funcion de un anticuerpo o fragmento especificado o porcion del mismo; conteniendo cada uno al menos una CDR. Los anticuerpos de la invencion incluyen fragmentos de anticuerpos o variantes que tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas regiones CDR.
Los fragmentos de anticuerpos que estan englobados por la presente invencion incluyen Fab (por ejemplo, por digestion con papaina), Fab', F(ab')2, facb (por ejemplo, por digestion con plasmina), pFc' (por ejemplo, por digestion con pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, por digestion con pepsina, reduccion parcial y reagregacion), sVds, y Fv o scFv (por ejemplo, por tecnicas de biologia molecular). Los fragmentos de anticuerpos tambien pretenden incluir anticuerpos de dominios delecionados, diacuerpos, triacuerpos, anticuerpos lineales, moleculas de anticuerpo monocatenarias (incluyendo anticuerpos camelizados), y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
El termino “anticuerpo”, como se usa en el presente documento, tambien incluye anticuerpos “quimericos” en los que una porcion de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es identico u homologo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie (por ejemplo, raton o rata) o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, ademas de fragmentos de tales anticuerpos, mientras que presenten la actividad biologica deseada. Asi, la presente invencion incluye, por ejemplo, anticuerpos quimericos que comprenden una cadena pesada quimerica y/o una cadena ligera quimerica. La cadena pesada quimerica puede comprender cualquiera de las regiones variables (VH) de la cadena pesada descritas en el presente documento o mutantes o variantes de las mismas fusionadas con una region constante de la cadena pesada de un anticuerpo no humano. La cadena ligera quimerica puede comprender cualquiera de las regiones variables (VL) de la cadena ligera descritas en el presente documento o mutantes o variantes de las mismas fusionadas con una region constante de la cadena ligera de un anticuerpo no humano.
Los anticuerpos de la invencion tambien incluyen “anticuerpos humanizados”, que son moleculas de anticuerpo que tienen una o mas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una especie no humana y regiones estructurales de una molecula de inmunoglobulina humana. Frecuentemente, los residuos de la region estructural en las regiones estructurales humanas estaran sustituidos con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, o mejorar, la union al antigeno. Estas sustituciones de la region estructural son identificadas por tecnicas convencionales tales como por modelado de las interacciones de la CDR y los residuos de la region estructural para identificar residuos de la region estructural importantes para la union al antigeno y comparacion de secuencias para identificar residuos de la region estructural poco usuales en posiciones particulares. Los anticuerpos pueden humanizarse usando una variedad de tecnicas que incluyen injerto, inactivacion o remodelacion superficial de CDR, y barajado de cadenas.
El termino “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes correspondientes a secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invencion pueden incluir residuos de aminoacidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o especifica de sitio in vitro o por mutacion somatica in vivo), por ejemplo, en las CDR. El anticuerpo humano puede tener al menos una posicion sustituida con un resto de aminoacido, por ejemplo, un resto de aminoacido potenciador de la actividad que no esta codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la linea germinal humana. Sin embargo, el termino “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la linea germinal de otras especies de mamifero, tales como un raton, se han injertado sobre secuencias de la region estructural humana.
La expresion “anticuerpo humano recombinante” incluye anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresion recombinante transfectado en una celula huesped, anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes, anticuerpos aislados de un animal que es transgenico para genes de la inmunoglobulina humana, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme
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de secuencias de genes de la inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la lfnea germinal humana.
El termino “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son sustancialmente identicos, excepto por posibles mutaciones que existen de forma natural o variaciones post-traduccionales menores que pueden estar presentes. Los anticuerpos monoclonales son altamente especfficos, estando dirigidos contra un unico sitio antigenico (tambien conocido como determinante o epftope). Ademas, a diferencia de las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales) que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes, cada anticuerpo monoclonal se dirige a un unico determinante sobre el antfgeno. El adjetivo “monoclonal” indica el caracter del anticuerpo como que se obtiene de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la produccion del anticuerpo por cualquier metodo particular.
Los anticuerpos tambien incluyen polipeptidos con secuencias de aminoacidos sustancialmente similares a la secuencia de aminoacidos de las regiones variables o hipervariables de la cadena pesada y/o ligera. Sustancialmente la misma secuencia de aminoacidos se define en el presente documento como una secuencia con al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o el 99 % de identidad con una secuencia de aminoacidos comparada, como se ha determinado por el metodo de busqueda FASTA segun Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988).
Los anticuerpos de la invencion incluyen aquellos que son identicos a aquellos descritos en el presente documento, excepto por una o mas sustituciones de aminoacidos conservativas. Sustitucion de aminoacidos conservativa se define como un cambio en la composicion de aminoacidos mediante el cambio de uno o dos aminoacidos de un peptido, polipeptido o protefna, o fragmento de los mismos. La sustitucion es de aminoacidos con propiedades generalmente similares (por ejemplo, acido, basico, aromatico, tamano, positivamente o negativamente cargado, polaridad, no polaridad) de forma que las sustituciones no alteren sustancialmente las caracterfsticas del peptido, polipeptido o protefna (por ejemplo, carga, punto isoelectrico, afinidad, avidez, conformacion, solubilidad) o actividad. Sustituciones tfpicas que pueden realizarse para tal sustitucion de aminoacidos conservativa puede ser entre los siguientes grupos de aminoacidos: glicina (G), alanina (A), valina (V), leucina (L) y isoleucina (I); acido aspartico (D) y acido glutamico (E); alanina (A), serina (S) y treonina (T); histidina (H), lisina (K) y arginina (R); asparagina (N) y glutamina (Q); fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptofano (W).
Las sustituciones de aminoacidos conservativas pueden hacerse en las CDR o regiones estructurales, por ejemplo, regiones que flanquean las regiones hipervariables principalmente responsables de las caracterfsticas de union selectiva y/o especffica de la molecula, ademas de otras partes de la molecula, por ejemplo, casete variable de la cadena pesada.
Los anticuerpos de la presente invencion tambien incluyen aquellos que tienen su afinidad elevada o alterada por mutacion directa, maduracion por afinidad, presentacion en fagos, o barajado de cadenas. La afinidad y especificidad pueden modificarse o mejorarse mutando CDR y/o residuos de la region estructural y buscando sitios de union al antfgeno que tienen las caracterfsticas deseadas. Una forma es aleatorizar residuos individuales o combinaciones de residuos de manera que, en una poblacion de sitios de union al antfgeno de otro modo identicos, subconjuntos de dos a veinte aminoacidos se encuentren en posiciones particulares. Alternativamente, pueden inducirse mutaciones en una variedad de residuos por error usando metodos de PCR. En otro ejemplo, vectores de presentacion en fagos que contienen genes de la region variable de la cadena pesada y ligera pueden propagarse en cepas mutadas de E. coli.
Los anticuerpos preparados por barajado de cadenas incluyen aquellos en los que la cadena pesada o ligera esta aleatoriamente emparejada con otras cadenas pesadas o ligeras descritas en el presente documento. Asf, los anticuerpos de la invencion incluyen cualquier combinacion de cadenas pesadas y ligeras (tanto de longitud completa como porciones de las mismas).
Los anticuerpos de la presente invencion son especfficos para TGFB. Especificidad del anticuerpo se refiere al reconocimiento selectivo del anticuerpo por un epftope particular de un antfgeno. Los anticuerpos pueden presentar tanto selectividad por especie como por molecula, o pueden ser selectivos con respecto a molecula solo y unirse a TGFB de mas de una especie. Los anticuerpos de la invencion pueden unirse a TGFB humano, murino, de rata, perro y/o de conejo. En una realizacion, el anticuerpo se une a TGFB humano. Si un anticuerpo se une especfficamente a un TGFB puede determinarse, por ejemplo, por un ensayo de union tal como un ELISA, empleando un panel de antfgenos.
La especificidad de los anticuerpos puede determinarse basandose en afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociacion de un antfgeno con un anticuerpo (Kd), mide la intensidad de la union entre un determinante antigenico y un sitio de union al anticuerpo. La avidez es la medida de la intensidad de la union entre un anticuerpo con su antfgeno. La avidez esta relacionada con tanto la afinidad entre un epftope con su sitio de union al antfgeno sobre el anticuerpo como la valencia del anticuerpo, que se refiere al numero de sitios
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de union al antigeno de un epitope particular. Los anticuerpos normalmente se unen con una constante de disociacion (Kd) de aproximadamente 10-5 a aproximadamente 10-11 litros/mol (por ejemplo, Kd <100 nM). Cualquier Kd inferior a aproximadamente 10-4 litros/mol se considera generalmente que indica union no especifica. Cuanto menor sea el valor de Kd, mas fuerte sera la intensidad de union entre un determinante antigenico y el sitio de union al anticuerpo.
Los anticuerpos de la invencion se unen a TGFB con una Kd de preferentemente aproximadamente 1 x 10-8 M-1 o menos, mas preferentemente aproximadamente 1 x 10-9 M-1 o menos, mas preferentemente aproximadamente 1 x 10-10 M-1 o menos, y lo mas preferentemente aproximadamente 1 x 10-11 M-1 o menos.
Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser monoespecificos, biespecificos o multiespecificos. Los anticuerpos monoespecificos se unen a solo un antigeno. Los anticuerpos biespecificos (BsAbs) son anticuerpos que tienen dos especificidades de union a antigeno diferentes o sitios. Los anticuerpos multiespecificos tienen mas de dos especificidades de union a antigeno diferentes o sitios. Si un anticuerpo tiene mas de una especificidad, los epitopes reconocidos pueden asociarse a un unico antigeno o a mas de un antigeno.
En otro aspecto de la invencion, el anticuerpo se conjuga con otro resto, tanto directamente como indirectamente. La conjugacion puede ser quimica o biosintetica. Otros restos que pueden conjugarse con los anticuerpos incluyen toxinas, agentes antitumorales, marcas detectables, restos diana y restos indicadores. Toxinas adecuadas se describen en el presente documento.
En una realizacion, uno o mas agentes de quimioterapia de la invencion estan operativamente ligados al anticuerpo. Por ejemplo, capecitabina, ixabepilona, o ambas, pueden conjugarse con el anticuerpo anti-TGFB.
Los anticuerpos que estan conjugados con marcas detectables pueden usarse, por ejemplo, para diagnosticar una enfermedad, para ayudar en el pronostico y para localizar celulas tumorales, in vivo o in vitro. La marca detectable produce una senal medible que es detectable por medios externos. Las marcas detectables incluyen una enzima, un cromoforo, un radioisotopo, o una sustancia que emite luz por fluorescencia, fosforescencia o quimioluminiscencia. Enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa y acetilcolinesterasa. Los cromoforos incluyen colorantes que absorben luz en la region ultravioleta o visible, y pueden ser sustratos o productos de degradacion de reacciones catalizadas por enzima. Materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloruro de dansilo o ficoeritrina. Materiales de quimioluminiscencia adecuados incluyen luminol, luciferasa, luciferina y aecuorina. Materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 1311, 35S y 3H.
Los restos diana son los primeros miembros de los pares de union. Los agentes antitumorales, por ejemplo, pueden conjugarse con segundos miembros de tales pares y asi se dirigen al sitio en el que la proteina de union al antigeno esta unida. Un ejemplo comun de un par de union tal es avidina y biotina. La biotina puede conjugarse con un anticuerpo de la invencion, proporcionando asi una diana para un agente antitumoral u otro resto que esta conjugado con la avidina o la estreptavidina. Alternativamente, la biotina u otro resto tal esta ligado a una proteina de union al antigeno de la invencion y se usa como indicador, por ejemplo, una marca detectable se conjuga con avidina o estreptavidina.
La presente invencion tambien incluye moleculas de acidos nucleicos que codifican un anticuerpo anti-TGFB o porcion del mismo. Los acidos nucleicos pueden codificar una cadena pesada del anticuerpo, que comprende una cualquiera de las regiones VH o una porcion de las mismas, o una cualquiera de las CDR VH, que incluyen cualquier variante de las mismas, como se desvela en el presente documento. La invencion tambien incluye moleculas de acidos nucleicos que codifican una cadena ligera del anticuerpo que comprende una cualquiera de las regiones VL o una porcion de las mismas o una cualquiera de las CDR VL, que incluyen cualquier variante de las mismas, como se desvela en el presente documento. En ciertas realizaciones, el acido nucleico codifica tanto una cadena pesada como ligera, o porciones de las mismas.
La invencion tambien incluye vectores recombinantes que comprenden cualquiera de las moleculas de acidos nucleicos descritas en el presente documento. El vector puede comprender un acido nucleico que codifica solo una cadena del anticuerpo o una porcion de la misma (por ejemplo, la cadena pesada o ligera) o un acido nucleico que codifica ambas cadenas del anticuerpo o porciones de las mismas.
Vectores a modo de ejemplo incluyen plasmidos, fagemidos, cosmidos, virus y acidos nucleicos de fago u otras moleculas de acidos nucleicos que son capaces de replicacion en un huesped procariota o eucariota. Los vectores normalmente contienen un marcador para proporcionar un rasgo fenotipico para la seleccion de huespedes transformados tales como conferir resistencia a antibioticos tales como ampicilina o neomicina
El vector puede ser un vector de expresion, en el que el acido nucleico que codifica el anticuerpo esta operativamente ligado a una secuencia de control de la expresion. Vectores de expresion tipicos contienen terminadores de la transcripcion y de la traduccion, secuencias de iniciacion, y promotores utiles para la regulacion de la expresion de las moleculas de acidos nucleicos de la invencion. Los vectores tambien pueden contener casetes de expresion genetica que contiene una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten la replicacion del vector en tanto eucariotas como procariotas, es decir, vectores lanzadera y marcadores de seleccion
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para tanto sistemas procariotas como eucariotas. Cuando el vector contiene acidos nucleicos que codifican tanto una cadena pesada como ligera o porciones de la misma, el acido nucleico que codifica la cadena pesada puede estar bajo el mismo promotor o un promotor separado. Los promotores separados pueden ser identicos o pueden ser tipos diferentes de promotores.
Promotores adecuados incluyen promotores constitutivos y promotores inducibles. Secuencias/promotores de control de la expresion representativos incluyen el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, regiones promotoras y operadoras importantes del fago lambda, la region de control de proteina de la envuelta fd, los promotores glicoliticos de levadura, por ejemplo, un promotor para 3-fosfoglicerato cinasa, los promotores de fosfatasa acida de levadura, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de apareamiento alfa de levadura, promotores derivados del citomegalovirus humano, promotor de metalotionina, promotor del virus del tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de polihedrina y promotores derivados de polioma, adenovirus, retrovirus, y virus simio, por ejemplo, los promotores temprano y tardio del SV40.
La invencion tambien incluye huespedes no humanos tales como celulas u organismos que contienen una molecula de acido nucleico o un vector de la invencion. Por “huesped” se indica un organismo unicelular o multicelular no humano o una “celula huesped”, que se refiere a una celula o poblacion de celulas en la que una molecula de acido nucleico o vector de la invencion se introduce. “Una poblacion de celulas huesped” se refiere a un grupo de celulas cultivadas en el que una molecula de acido nucleico o vector de la presente invencion puede introducirse y expresarse. El huesped contiene un acido nucleico o vector que codifica solo una cadena o porcion de la misma (por ejemplo, la cadena pesada o ligera); o puede contener un acido nucleico o vector que codifica ambas cadenas o porciones de las mismas, tanto los mismos acidos nucleicos y/o vectores como separados.
Un huesped de la presente invencion puede ser procariota o eucariota. Huespedes procariotas adecuados incluyen, por ejemplo, E. coli, tal como SG-936 de E. coli, HB 101 de E. coli, W3110 de E. coli, X1776 de E. coli, X2282 de E. coli, DHI de E. coli y MRC1 de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, tales como Bacillus subtilis, y Streptomyces. Celulas eucariotas adecuadas incluyen levadura y otros hongos, celulas de insecto, celulas vegetales, celulas humanas y celulas de animales, que incluyen celulas de mamifero, tales como lineas de hibridoma, celulas COS, celulas NS0 y celulas CHO.
La invencion tambien incluye metodos de produccion de un anticuerpo de la presente invencion, que implican cultivar una celula huesped que expresa una o mas secuencias de acidos nucleicos que codifican un anticuerpo de la presente invencion, y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se purifica separandolo del medio de cultivo. Los anticuerpos que comprenden mas de una cadena pueden producirse expresando cada cadena junta en el mismo huesped; o como cadenas separadas, que se ensamblan antes o despues de la recuperacion del medio de cultivo.
Metodos de preparacion de otros antagonistas de TGFB son muy conocidos en la tecnica, como se ha descrito anteriormente.
La capecitabina se desvelo generalmente en la patente de EE.UU. N.° 4.966.891 y se desvelo especificamente en la patente de EE.UU. N.° 5.472.949. En composiciones farmaceuticas se comercializa bajo el nombre de marca XELODA por Roche Laboratories Inc. (EE.UU.). Se conocen en el estado de la tecnica diversos procesos sinteticos que conducen a la capecitabina, por ejemplo, se describen metodos de preparacion de la capecitabina en la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. 20080300399, que se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad.
Los metodos de preparacion de la ixabepilona tambien son muy conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la perla recubierta enterica que comprende ixabepilona, y la preparacion y administracion de la misma, se describen en la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. 20060153917, que se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad.
En otra realizacion, en el presente documento se proporciona una composicion farmaceutica para tratar un cancer de mama en un sujeto, que comprende: una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista de TGFB, capecitabina y/o ixabepilona, en el que dicho antagonista de TGFB esta presente en una cantidad eficaz para potenciar la eficacia de la capecitabina y/o ixabepilona para tratar dicho cancer de mama. En algunas realizaciones, una primera composicion farmaceutica comprende un antagonista de TGFB, una segunda composicion farmaceutica comprende capecitabina, y una tercera composicion farmaceutica comprende ixabepilona. Estas composiciones individuales y separadas pueden administrarse independientemente o juntas.
La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, acido nucleico, vector, celula huesped, o agentes de quimioterapia de la presente invencion y uno o mas vehiculos farmaceuticamente aceptables. “Vehiculos farmaceuticamente aceptables” incluyen cualquier excipiente que sea no toxico para la celula o mamifero que se expone a el a las dosificaciones y concentraciones empleadas. La composicion farmaceutica puede incluir un agente terapeutico o agentes terapeuticos adicionales.
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Vehiculos farmaceuticamente aceptables incluyen disolventes, medios de dispersion, tampones, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes humectantes, conservantes, tampones, agentes quelantes, antioxidantes, agentes isotonicos y agentes que retrasan la absorcion.
Vehiculos farmaceuticamente aceptables incluyen agua; solucion salina; solucion salina tamponada con fosfato; dextrosa; glicerol; alcoholes tales como etanol e isopropanol; fosfato, citrato y otros acidos organicos; acido ascorbico; polipeptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteinas, tales como albumina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polimeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos, y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; EDTA; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEEN, polietilenglicol (PEG), y PLURONICS; agentes isotonicos tales como azucares, polialcoholes tales como manitol y sorbitol, y cloruro sodico; ademas de combinaciones de los mismos. Los agentes antibacterianos y antifungicos incluyen parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico y timerosal.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden formularse en una variedad de formas, que incluyen, por ejemplo, formas de dosificacion liquida, semi-solida y solida, tales como disoluciones liquidas (por ejemplo, disoluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. En algunas realizaciones, las composiciones estan en forma de disoluciones inyectables o infusibles. La composicion esta en una forma adecuada para administracion oral, intravenosa, intrarterial, intramuscular, subcutanea, parenteral, transmucosa, transdermica o topica. La composicion puede formularse como una composicion de liberacion inmediata, controlada, prolongada o retardada.
Preparaciones para administracion parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones esteriles acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Vehiculos acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones alcoholicas/acuosas, que incluyen solucion salina y medios tamponados. En la invencion objeto, vehiculos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, tampon fosfato 0,01 - 0,1 M y preferentemente 0,05 M o 0,8 % de solucion salina. Otros vehiculos parenterales comunes incluyen disoluciones de fosfato de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sodico, Ringer con lactato, o aceites no volatiles. Vehiculos intravenosos incluyen reforzadores de fluidos y de nutrientes, reforzadores de electrolitos, tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer, y similares. Tambien pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes y similares.
Mas particularmente, composiciones farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones acuosas esteriles (solubles en agua) o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones inyectables esteriles. En tales casos, la composicion debe ser esteril y debe ser fluida hasta el punto de que exista facil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y preferentemente se preservara contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehiculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamano de particula requerido en el caso de dispersion y por el uso de tensioactivos. Formulaciones adecuadas para su uso en los metodos terapeuticos desvelados en el presente documento se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16s. (1980).
En algunas realizaciones, la composicion incluye agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, o cloruro sodico. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden prepararse disoluciones inyectables esteriles incorporando la molecula, por si misma o en combinacion con otros agentes activos, en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de los componentes enumerados en el presente documento, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehiculo esteril, que contiene un medio de dispersion basico y los otros componentes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, un metodo de preparacion es secado a vacio y liofilizacion, que da un polvo de un principio activo mas cualquier componente deseado adicional de una disolucion previamente esterilizada por filtracion del mismo. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se envasan en recipientes tales como ampollas, bolsas, botellas, jeringas o viales, y se sellan bajo condiciones asepticas segun metodos conocidos en la tecnica. Ademas, las preparaciones pueden envasarse y comercializarse en forma de un kit tal como aquellos descritos en publicacion de solicitud de EE.UU. N.° 2002/0102208 A1, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Tales articulos de fabricacion tendran preferentemente etiquetas o prospectos que indican que las composiciones asociadas son utiles para tratar un sujeto que padece, o tiene predisposicion a trastornos autoinmunitarios o neoplasicos.
Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invencion, para el tratamiento de las afecciones o enfermedades que se describen en el presente documento, varian dependiendo de muchos factores diferentes, que
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incluye medios de administracion, sitio diana, estado fisiologico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otras medicaciones administradas, y si tratamiento es profilactico o terapeutico. Normalmente, el paciente es un ser humano, pero tambien pueden tratarse mamiferos no humanos que incluyen mamiferos transgenicos. Las dosificaciones de tratamiento pueden valorarse usando metodos rutinarios conocidos para aquellos expertos en la materia para optimizar la seguridad y la eficacia.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir una “cantidad terapeuticamente eficaz”. Una “cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapeutico deseado. Una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula puede variar segun factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad de la molecula para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien es una en la que cualquier efecto toxico o perjudicial de la molecula se sobrepasa por los efectos terapeuticamente beneficiosos.
La invencion proporciona ademas un kit que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista de TGFB, capecitabina, ixabepilona, o combinacion de los mismos.
La invencion proporciona ademas metodos de tratamiento de una enfermedad o afeccion, que comprenden administrar a un mamifero en necesidad del mismo una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista de TGFB, capecitabina, ixabepilona, o combinacion de los mismos.
Como se usa en el presente documento, los terminos “tratar” y “tratamiento” se refieren a tratamiento terapeutico, que incluye medidas profilacticas o preventivas, en el que el objetivo es prevenir o ralentizar (reducir) un cambio fisiologico no deseado asociado a una enfermedad o afeccion. Resultados clinicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de sintomas, reduccion del grado de una enfermedad o afeccion, estabilizacion de una enfermedad o afeccion (es decir, en la que la enfermedad o afeccion no empeora), retraso o ralentizamiento de la progresion de una enfermedad o afeccion, mejora o paliacion de la enfermedad o afeccion, y remision (tanto parcial como total) de la enfermedad o afeccion, tanto detectable como no detectable. “Tratamiento” tambien puede significar prolongar la supervivencia en comparacion con la supervivencia esperada sino se recibe tratamiento. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con la enfermedad o afeccion, ademas de aquellos propensos a tener la enfermedad o afeccion, o aquellos en los que va a prevenirse la enfermedad o afeccion.
Canceres/tumores que pueden tratarse por la invencion incluyen cualquier cancer o tumor. Ejemplos de canceres/tumores que puede tratarse incluyen, pero no se limitan a, cancer de mama (incluyendo HER2+ y metastasico), un cancer tratado por capecitabina, ixabepilona, o ambas, o un cancer asociado a la senalizacion mediada por TGFB.
Metodos de tratamiento del cancer incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, inhibir la angiogenesis en el tumor, inhibir el crecimiento tumoral, inhibir la migracion tumoral, inhibir la proliferacion o inhibir la invasion de celulas tumorales.
Los canceres que expresan o expresan en exceso o estan asociados a la expresion o expresion en exceso de TGFB pueden tratarse por la invencion. Sin embargo, el cancer que va a tratarse por la terapia de combinacion en el presente documento puede ser cualquier cancer, no simplemente aquellos que expresan o expresan en exceso TGFB.
Los canceres que van a tratarse incluyen tumores primarios y tumores secundarios o metastasicos (incluyendo aquellos metastatizados de pulmon, mama o prostata), ademas de tumores recurrentes o resistentes al tratamiento. Los tumores recurrentes engloban tumores que parece que se inhiben mediante el tratamiento con tales agentes, pero vuelven a aparecer hasta cinco anos, algunas veces hasta diez anos o mas, despues de interrumpirse el tratamiento. Los tumores resistentes al tratamiento son tumores que han dejado de responder o son resistentes al tratamiento con una o mas terapias convencionales para el tipo de tumor particular. Los tumores resistentes al tratamiento incluyen aquellos que son resistentes al tratamiento con hormonas (por ejemplo, cancer de prostata independiente de androgenos; o cancer de mama resistente al tratamiento con hormonas, tal como cancer de mama que es resistente al tratamiento con tamoxifeno); aquellos que son resistentes al tratamiento con uno o mas agentes quimioterapeuticos; aquellos que son resistentes al tratamiento con radiacion; y aquellos que son resistentes al tratamiento con combinaciones de quimioterapia y radiacion, quimioterapia y terapia hormonal, o terapia hormonal y radiacion.
La terapia puede ser de “primera linea”, es decir, como tratamiento inicial en pacientes que no han tenido tratamientos previos contra el cancer, tanto solo como en combinacion con otros tratamientos; o de “segunda linea”, como un tratamiento en pacientes que han tenido una pauta de tratamiento previo contra el cancer, tanto solo como en combinacion con otros tratamientos; o como tratamientos de “tercera linea”, “cuarta linea “, etc., tanto solos como en combinacion con otros tratamientos.
La terapia tambien puede administrarse a pacientes que han tenido tratamientos previos que han sido parcialmente satisfactorios, pero son intolerantes al tratamiento particular. La terapia tambien puede administrarse como un
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tratamiento adyuvante, es decir, para prevenir la re-manifestacion del cancer en pacientes con enfermedad actualmente no detectable o despues de la extirpacion quirurgica del tumor.
Los canceres que pueden tratarse incluyen tumores que no estan vascularizados, o todavia no estan sustancialmente vascularizados, ademas de tumores vascularizados. Los canceres pueden estar comprendidos de tumores no solidos (tales como leucemias y linfomas) o pueden ser tumores solidos. Tipos de canceres que van a tratarse con los anticuerpos de la invencion incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, blastoma y sarcoma, y ciertas leucemias o tumores malignos linfoides, tumores benignos y malignos, y tumores malignos, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. Estan incluidos tumores/canceres en adultos y tumores/canceres pediatricos.
Puede administrarse mas de un antagonista de TGFB, tanto incorporado en la misma composicion como administrado como composiciones separadas.
El antagonista de TGFB puede administrarse solo, o en combinacion con uno o mas agentes terapeuticamente eficaces (por ejemplo, capecitabina, ixabepilona, o ambas) o tratamientos. El otro agente terapeuticamente eficaz puede conjugarse con el antagonista de TGFB, incorporarse en la misma composicion que el antagonista de TGFB, o puede administrarse como una composicion separada. El otro agente terapeutico o tratamiento puede administrarse antes, durante y/o despues de la administracion del antagonista de TGFB.
En una realizacion, el antagonista de TGFB se co-administra con capecitabina, ixabepilona, o una combinacion de las mismas. En otra realizacion, el antagonista de TGFB se administra independientemente de la administracion de la capecitabina, ixabepilona, o una combinacion de las mismas. En una realizacion, el antagonista de TGFB se administra primero, seguido de la administracion de la capecitabina, ixabepilona, o una combinacion de las mismas. En otra realizacion, la capecitabina, ixabepilona, o una combinacion de las mismas, se administra primero, seguido de la administracion del antagonista de TGFB.
Otros agentes / tratamientos terapeuticamente eficaces incluyen cirugia, antineoplasicos (incluyendo agentes quimioterapeuticos y radiacion), agentes antiangiogenesis, anticuerpos para otras dianas, moleculas pequenas, terapia fotodinamica, inmunoterapia, agentes citotoxicos, citocinas, quimiocinas, agentes inhibidores del crecimiento, agentes anti-hormonales, inhibidores de cinasas, cardioprotectores, agentes inmunoestimulantes, agentes inmunosupresores, agentes que promueven la proliferacion de celulas hematologicas, e inhibidores de proteinas tirosina cinasa (PTK).
Un agente quimioterapeutico puede administrarse como un profarmaco. El termino “profarmaco” se refiere a un precursor o derivado de una sustancia farmaceuticamente activa que es menos citotoxica para las celulas tumorales en comparacion con el farmaco original y es capaz de ser enzimaticamente activado o convertido en la forma original mas activa. Los profarmacos que pueden encontrar uso con las composiciones y metodos como se proporcionan en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, profarmacos que contienen fosfato, profarmacos que contienen tiofosfato, profarmacos que contienen sulfato, profarmacos que contienen peptidos, profarmacos modificados con D-aminoacidos, profarmacos glucosilados, profarmacos que contienen beta-lactama, profarmacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos o profarmacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros profarmacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el farmaco libre citotoxico mas activo. Ejemplos de farmacos citotoxicos que pueden derivatizarse en una forma de profarmaco para su uso con los anticuerpos y fusiones de Fc de las composiciones y metodos como se proporcionan en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los agentes quimioterapeuticos anteriormente mencionados.
La administracion del antagonista de TGFB con otros agentes (por ejemplo, capecitabina, ixabepilona, o ambas) y/o tratamientos puede producirse simultaneamente, o por separado, mediante la misma via o diferentes, al mismo tiempo o en momentos diferentes. Las pautas de dosificacion pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada optima (por ejemplo, una respuesta terapeutica o profilactica).
En un ejemplo, puede administrarse un unico bolo. En otro ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas con el tiempo. En otro ejemplo mas, una dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situacion terapeutica. Forma unitaria de dosificacion, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades fisicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para tratar sujetos mamiferos. Cada unidad puede contener una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir un efecto terapeutico deseado. En algunas realizaciones, las formas unitarias de dosificacion de la invencion estan impuestas por y son directamente dependientes de las caracteristicas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico o profilactico particular que va a lograrse.
La composicion de la invencion puede administrarse solo una vez, o puede administrarse multiples veces. Para dosificaciones multiples, la composicion puede administrarse, por ejemplo, tres veces al dia, dos veces al dia, una vez al dia, una vez cada dos dias, dos veces a la semana, semanalmente, una vez cada dos semanas, o mensualmente.
Debe observarse que los valores de dosificacion pueden variar con el tipo y gravedad de la afeccion que va a aliviarse. Debe entenderse adicionalmente que, para cualquier sujeto particular, las pautas de dosificacion
especificas deben ajustarse con el tiempo segun la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones, y que los intervalos de dosificacion expuestos en el presente documento son a modo de ejemplo solo y no pretenden limitar el alcance o la practica de la composicion reivindicada.
5 “Administracion” a un sujeto no se limita a ningun sistema de administracion particular y puede incluir, sin limitacion, parenteral (incluyendo inyeccion subcutanea, intravenosa, intramedular, intrarticular, intramuscular o intraperitoneal), rectal, topica, transdermica u oral (por ejemplo, en capsulas, suspensiones o comprimidos). La administracion a un huesped puede producirse en una dosis unica o en administraciones repetidas, y en cualquiera de una variedad de formas de sal fisiologicamente aceptables, y/o con un vehiculo farmaceutico aceptable y/o aditivo como parte de una 10 composicion farmaceutica (descrita anteriormente). De nuevo, las formas de sal fisiologicamente aceptable y las tecnicas de formulacion farmaceutica estandar son muy conocidas para los expertos en la materia (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.).
La composicion de la invencion (por ejemplo, antagonista de TGFB) puede administrarse por via parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutanea, intraperitoneal, intramuscular). Ademas, la composicion de la invencion puede 15 administrarse por infusion o inyeccion intravenosa. La composicion de la invencion puede administrarse por inyeccion intramuscular o subcutanea. En algunas realizaciones, la composicion de la invencion (por ejemplo, capecitabina y/o ixabepilona) puede administrarse por via oral. Como se usa en el presente documento, una “composicion” se refiere a cualquier composicion que contenga una cantidad farmaceuticamente eficaz de uno o mas principios activos (por ejemplo, un antagonista de TGFB, capecitabina, ixabepilona, o una combinacion de las 20 mismas).
Los metodos de tratamiento descritos en el presente documento pueden usarse para tratar cualquier mamifero adecuado, que incluye primates, tales como monos y seres humanos, caballos, vacas, gatos, perros, conejos y roedores tales como ratas y ratones. En una realizacion, el mamifero que va a tratarse es humano.
Todas las patentes y las referencias bibliograficas citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan por este 25 documento por referencia en su totalidad.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Estudio 1: Los efectos de 1D11, ixabepilona, capecitabina y combinaciones de estos terapeuticos sobre el crecimiento de tumores primarios y metastasis en un modelo de cancer de mama triple negativo singenico (4T1).
30 Clinicamente, se ha mostrado que la combinacion de los quimioterapeuticos ixabepilona y capecitabina es eficaz en el tratamiento de cancer de mama triple negativo (TNBC) metastasico o localmente avanzado que ha sido resistente a taxanos. Este estudio preclinico se realizo para: (1) determinar los efectos de 1D11, ixabepilona y capecitabina como agentes unicos sobre el crecimiento de tumores 4T1 subcutaneos y posterior metastasis a los pulmones, (2) determinar si las terapias de combinacion con estos agentes producen efectos aditivos o sinergicos sobre la eficacia 35 de agentes individuales, y (3) proporcionar percepcion en las posibles cuestiones de seguridad/toxicidad con estas terapias de combinacion.
Metodos experimentales:
Table 1: Resumen del estudio
Grupo N.°
Grupos de tratamiento Animales por grupo
1
Vehiculo de anticuerpo 10
2
13C4 10 mg/kg 10
3
1D11 10 mg/kg 10
4
Vehiculo de anticuerpo + Capecitabina 10
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13C4 + Capecitabina 10
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1D11 + Capecitabina 10
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Vehiculo de anticuerpo + Ixabepilona 10
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13C4 + Ixabepilona 10
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1D11 + Ixabepilona 10
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Grupo N.°
Grupos de tratamiento Animales por grupo
10
Vehiculo de anticuerpo + Capecitabina + Ixabepilona
10
11
13C4 + capecitabina + Ixabepilona 10
12
1D11 + Capecitabina + Ixabepilona 10
Momentos de tiempo: Dia 0: Los investigadores inyectan 50.000 celulas 4T1 + Matrigel por via
subcutanea en el flanco derecho
Dia 3: Los investigadores empiezan las mediciones de los tumores 2-3X/semana
Dia 6: El personal de DCM empieza a dosificar anticuerpo IP 3X/semana
El personal de DCM empieza a dosificar ixabepilona IV Q4Dx3
El personal de DCM empieza a dosificar capecitabina por sonda nasogastrica oral QDx14
Los animales se sacrificaron cuando los tumores primarios alcanzaron un volumen de 2000 mm3 o antes del cierre del estudio si se presentaron condiciones moribundas (falta de acicalamiento, respiracion fatigosa, caquexia, anorexia o letargo). Despues del sacrificio, el tumor primario se dividio en dos, incorporandose una mitad en OCT, y la otra se puso en formalina tamponada con cinc. Se recogieron los pulmones y cualquier otro tejido que llevara metastasis y se guardaron en formalina tamponada con cinc para el recuento de metastasis de pulmon e IHC.
Tejidos: Tumores primarios en OCT y formalina tamponada con cinc, pulmones recogidos en
formalina tamponada con cinc para la evaluacion de metastasis y posterior IHC.
En el dia 0, 150 ratones BALB/c hembra de doce semanas de edad recibieron cada uno inyecciones subcutaneas de
50.000 celulas 4T1 en Matrigel en el flanco derecho. Los ratones portadores de tumor se monitorizaron rutinariamente y se realizaron mediciones del tumor regulares 2-3X/semana empezando en el dia 6. El volumen del tumor se determino usando la siguiente formula:
Volumen del tumor = Longitud x Anchura2 x 0,52
Seis dias despues de la inyeccion de celulas tumorales, cuando los volumenes del tumor tuvieron en promedio 80 mm3, los animales se agruparon por tamano y se dividieron en doce grupos de tratamiento de diez ratones cada uno. Se sacaron del estudio treinta ratones con tumores primarios que fueron o bien significativamente mas grandes que el promedio o bien que no fueron palpables (0 mm3). En este momento, los investigadores se cegaron a las designaciones de los grupos de tratamiento y se inicio la administracion terapeutica. Todos los ratones recibieron 10 mg/kg de o bien 1D11, 13C4 o bien vehiculo de anticuerpo administrado en 100 gl IP tres veces por semana (Tabla 1). Cohortes especificas de ratones recibieron tratamientos adicionales de ixabepilona (6 mg/kg en 200 l IV Q4Dx3), capecitabina (360 mg/kg en 100 gl por sonda nasogastrica oral QDx14) o ambas.
Los ratones se sacrificaron una vez los volumenes del tumor primario alcanzaron 2000 mm3 o mayores o si los tumores llegaron a ulcerarse en >20 % del area superficial del tumor, o si los animales presentaron condiciones moribundas (falta de acicalamiento, respiracion fatigosa, caquexia, anorexia o letargo). Tras el sacrificio, se realizaron autopsias macroscopicas y se recogieron los tumores, pulmones y otros tejidos portadores de metastasis. Una porcion del tumor primario se congelo en OCT para IHC de inmunomarcadores, y el tumor restante y otros tejidos portadores de metastasis se fijaran en cinc-formalina para la incorporacion en parafina.
Resultados:
Estudio 09-3493 Los ratones del estudio recibieron tratamientos de vehiculo de anticuerpo, 13C4 o 1D11 tres veces a la semana durante siete semanas consecutivas. No hubo dificultad con la dosificacion de ixabepilona, capecitabina o terapeuticos de anticuerpo; probablemente debido al uso de ratones BALB/c de Charles River en este estudio.
Tabla 2. Acontecimientos adversos evidentes relacionados con el tratamiento en el estudio.
Grupo N.°
Raton ID N.° Estado Dia de estudio Observaciones
Vehiculo + Cape + Ixa
B7171 se encontro muerto 14 Demacrado y encorvado. Sin tumor primario palpable. Se encontro muerto por la tarde tras el quimioterapeutico.
Vehiculo + Cape + Ixa
B1741 moribundo 20 Demacrado y encorvado. Presento sacudidas musculares espasmodicas. Se sacrifico debido a estado moribundo.
Vehiculo + Cape + Ixa
B1793 se encontro muerto 17 Demacrado y encorvado. Sin tumor primario palpable.
Vehiculo + Cape + Ixa
B1835 moribundo 20 Demacrado y encorvado. Presento sacudidas musculares espasmodicas. Incapacidad para usar las patas traseras. Se sacrifico debido a estado moribundo.
13C4 + Cape + Ixa
B1718 se encontro muerto 16 Demacrado y encorvado. Sin tumor primario palpable.
13C4 + Cape + Ixa
B1765 se encontro muerto 18 Demacrado y encorvado. Pequeno tumor primario palpable. No se tomaron tejidos.
13C4 + Cape + Ixa
B1787 se encontro muerto 18 Demacrado y encorvado. Pequeno tumor primario palpable. No se tomaron tejidos.
13C4 + Cape + Ixa
B1804 moribundo 17 Demacrado y encorvado. Incapacidad para usar las patas traseras. Se sacrifico debido a estado moribundo
1D11 + Cape + Ixa
B1800 se encontro muerto 14 Demacrado y encorvado. Sin tumor primario palpable. Se encontro muerto por la tarde tras el quimioterapeutico.
1D11 + Cape + Ixa
B1808 se encontro muerto 18 Demacrado y encorvado. Sin tumor primario palpable. No se tomaron tejidos.
Varios ratones en este estudio en la cohorte de capecitabina+ixabepilona o bien se encontraron muertos o bien necesitaron ser sacrificados debido a la presentacion de condiciones moribundas. Estas toxicidades relacionadas con el tratamiento se describen en la Tabla 1. Los ratones que requirieron eutanasia estaban demacrados, 5 descuidados, encorvados y tenia dificultad para respirar. Algunos ratones en los grupos tratados con ixabepilona presentaron algo de neuropatia periferica; los ratones tuvieron dificultad para deambular con sus extremidades traseras. Sin embargo, como se observa en estudios previos que probaron ixabepilona en este modelo, la neuropatia se resolvio tras la ultima dosis de quimioterapeuticos. La adicion de 1D11 a los quimioterapeuticos no aumento ni disminuyo la incidencia de estas toxicidades.
10 Hubo efectos diferenciales sobre el crecimiento tumoral dependiendo del tratamiento proporcionado (Fig. 1). Como agente unico, 1D11 no tuvo efecto significativo sobre el crecimiento de tumores 4T1 SQ (Fig. 2A). Como monoterapia, la ixabepilona fue la mas eficaz en inhibir el crecimiento tumoral de 4T1 en comparacion con o bien la terapia con anticuerpos o bien capecitabina, aunque la capecitabina tambien inhibio el crecimiento tumoral. La adicion de 1D11 a la terapia con capecitabina produjo una eficacia mejorada con respecto a la capecitabina sola o 15 con 13C4 (Fig. 2B), sin embargo, 1D11 no mejoro la eficacia de la ixabepilona sola (Fig. 2C).
La inhibicion mas fuerte del crecimiento tumoral se observo en ratones que recibieron la terapia de combinacion de 1D11+capecitabina+ixabepilona que tuvo eficacia mejorada con respecto a capecitabina+ixabepilona sola o con 13C4 (Fig. 3A). La combinacion de capecitabina e ixabepilona fue mas eficaz que la capecitabina sola (Fig. 3B), sin embargo, esta combinacion no fue mas eficaz que la terapia de ixabepilona (Fig. 3C). Basandose en las terapias que 20 implican a 1D11, 1D11+capecitabina+ixabepilona fue mas eficaz que 1D11+ixabepilona, que fue mas eficaz que 1 D11+capecitabina, que fue mas eficaz que 1D11 como agente unico (Fig. 4).
Las diferentes pautas de tratamiento tuvieron efectos variables sobre la supervivencia. Los ratones tratados con terapias de anticuerpo o capecitabina sola tuvieron curvas de supervivencia similares (Fig. 5). Los ratones tratados con ixabepilona sola o en combinacion con capecitabina tuvieron supervivencia similar, que fue superior a la de tanto 25 el anticuerpo como las cohortes de capecitabina. 1D11 como agente unico no mejoro la supervivencia, pero 1D11+capecitabina tuvo supervivencia mejorada con respecto a la capecitabina sola. 1D11 tampoco mejoro el beneficio de supervivencia de ixabepilona sola, sin embargo, se observo la mayor mediana de la supervivencia en el grupo de tratamiento con 1D11+capecitabina+ixabepilona. Las curvas de supervivencia tambien han sido afectadas por la toxicidad debido a pautas quimioterapeuticas como se ha descrito anteriormente.
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1D11 no aumento el tiempo requerido para alcanzar el punto final del tamano de 2000 mm3 como agente unico y no mejoro el tiempo hasta el punto final en animales tratados con ixabepilona (Fig. 6). Sin embargo, 1D11 mejoro el tiempo hasta el punto final en la cohorte de capecitabina, y se observo tiempo mas largo hasta el punto final en el estudio en el grupo de 1D11 +capecitabina+ixabepilona.
El tratamiento con 1D11 condujo a un aumento en la metastasis a los pulmones dentro de cada cohorte (Fig. 7). El grupo de agente unico de 1D11 tuvo aumentos significativos en el numero de metastasis de pulmon en comparacion con el grupo tratado con vehiculo o el grupo tratado con 13C4 y se observaron aumentos similares debido al tratamiento con 1D11 en las cohortes de capecitabina, ixabepilona y de capecitabina+ixabepilona (Fig. 8). El numero de metastasis de pulmon aumento en funcion del tiempo que un animal estuvo en el estudio, y este efecto fue independiente del grupo de tratamiento (Fig. 9).
En la clinica, se ha informado que la terapia de combinacion de ixabepilona y capecitabina es mas eficaz que la capecitabina sola en cancer de mama triple negativo (TNBC) resistente a taxanos. El modelo de carcinoma mamario murino 4T1 se usa rutinariamente como un buen sustituto para TNBC humano y para prueba preclinica de terapeuticos contra TNBC. El fin del estudio era determinar si 1D11 mejoraria o no la eficacia de capecitabina, ixabepilona, o la combinacion de los dos quimioterapeuticos, contra el crecimiento de tumores primarios y/o posterior metastasis en el modelo de 4T1 singenico de TNBC.
Como se observa en estudios previos con este modelo, 1D11 como agente unico no inhibio significativamente el crecimiento de tumores 4T1 SQ primarios. Sin embargo, 1D11 mejoro la eficacia de capecitabina y la terapia de combinacion de capecitabina+ixabepilona contra tumores primarios. En realidad, la combinacion triple de 1D11+capecitabina+ixabepilona fue la mas eficaz en inhibir el crecimiento de tumores primarios 4T1, y tambien proporciono el mayor beneficio de supervivencia y produjo el tiempo mas largo hasta el punto final. Tomados conjuntamente, estos datos sugieren que combinar una estrategia de neutralizacion de TGFB con terapia de capecitabina+ixabepilona puede proporcionar un beneficio terapeutico con respecto al tratamiento con capecitabina+ixabepilona sola.
Estos datos representan la primera mejora de la eficacia de un quimioterapeutico en el modelo de tumor 4T1 SQ. Previamente en este modelo, 1D11 se habia combinado con paclitaxel, cisplatino o carboplatino y en cada uno de estos estudios 1D11 no mejoro la eficacia del quimioterapeutico probado.
En este estudio, el combinar 1D11 con capecitabina mejoro la eficacia observada con capecitabina sola, sugiriendo que la eficacia mejorada en el grupo de 1D11 + capecitabina + ixabepilona con respecto al grupo de capecitabina+ixabepilona puede ser debida a la mejora de los efectos de la capecitabina sobre el crecimiento tumoral. La capecitabina es un profarmaco oral que se convierte en 5-fluorouacilo, que bloquea la sintesis de ADN actuando como mimetico de pirimidina. El mecanismo antitumoral es similar al de la gemcitabina. De forma interesante, 1D11 no mejoro la eficacia de la gemcitabina en modelos de cancer pancreatico, sugiriendo que la mejora observada en este estudio depende del farmaco especifico, modelo de tumor, o ambos.
Sorprendentemente, el tratamiento con 1D11 produjo elevadas metastasis en cada cohorte en vez de una mejora del efecto de cada quimioterapeutico.
En este estudio, las toxicidades relacionadas con el tratamiento tales como perdida de peso, un aspecto descuidado y encorvado, y dificultad para respirar se observaron en ratones que recibieron las terapias de quimioterapeutico- combinacion. Los ratones que recibieron ixabepilona presentaron neuropatia periferica en forma de inmovilidad de las extremidades traseras que se resolvio una vez se completo la terapia de tratamiento. 1D11 no tuvo efecto sobre la incidencia o gravedad de estas toxicidades.
EJEMPLO 2
Estudio 2: Los efectos de 1D11, ixabepilona, capecitabina y combinaciones de estos terapeuticos sobre el crecimiento de tumores primarios y metastasis en un modelo de cancer de mama triple negativo singenico (4T1).
Metodos experimentales:
Los grupos de tratamiento, momentos de tiempo y tejidos fueron similares al estudio descrito anteriormente. En el dia 0, 150 ratones BALB/c hembra de doce semanas de edad recibieron cada uno inyecciones subcutaneas de
50.000 celulas 4T1 en Matrigel en el flanco derecho. Los ratones portadores de tumor se monitorizaron rutinariamente y se realizaron mediciones del tumor regulares 2-3X/semana empezando en el dia 6. El volumen del tumor se determino usando la siguiente formula:
Volumen del tumor = Longitud x Anchura2 x 0,52
Seis dias despues de la inyeccion de celulas tumorales, cuando los volumenes del tumor tuvieron en promedio ~70 mm3, los animales se agruparon por tamano y se dividieron en doce grupos de tratamiento de diez ratones cada uno. Se sacaron del estudio treinta ratones con tumores primarios que fueron o bien significativamente mas grandes que el promedio o bien que no fueron palpables (0 mm3). En este momento, los investigadores se cegaron a las
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designaciones de los grupos de tratamiento y se inicio la administracion terapeutica. Todos los ratones recibieron 10 mg/kg de o bien 1D11, 13C4 o bien vehiculo de anticuerpo administrado en 100 pl IP tres veces por semana (Fig. 10). Cohortes especificas de ratones recibieron tratamientos adicionales de ixabepilona (3 mg/kg en 200 pl IV Q4Dx3), capecitabina (360 mg/kg en 100 pl por sonda nasogastrica oral QDx14) o ambas.
Los ratones se monitorizaron para ulceracion excesiva o presentacion de condiciones moribundas (falta de acicalamiento, respiracion fatigosa, caquexia, anorexia o letargo). Para el analisis apropiado de las metastasis, todos los ratones se sacrificaron en el dia del estudio 23. Tras el sacrificio, se realizaron autopsias macroscopicas y se recogieron los tumores, pulmones y otros tejidos portadores de metastasis. El tumor primario se dividio en dos, congelandose una mitad en OCT y la otra mitad se guardo en RNA Later para el analisis por qPCR. Los pulmones se fijaron en formalina tamponada con cinc para el recuento de metastasis pulmonares y el posterior analisis de IHC.
Resultados:
En el dia de estudio 23, los ratones habian recibido ocho tratamientos de vehiculo de anticuerpo, 13C4 o 1D11. No se observaron problemas de toxicidad durante la dosificacion de o bien la ixabepilona, capecitabina o bien los terapeuticos de anticuerpo en este estudio. Todos los animales se sacaron en el dia de estudio 23, excepto un raton que se sacrifico antes del cierre debido a que el tumor se ulcero.
Los tumores en este estudio crecieron a una velocidad ligeramente mas lenta que en estudios previos, y por consiguiente fueron comparativamente pequenos cuando el estudio se termino en el dia de estudio 23.
A pesar del tamano reducido del tumor en este estudio, se observaron claras diferencias entre los volumenes medios del tumor entre grupos de tratamiento (Figs. 10 y 11). En particular, una reduccion significativa en el volumen del tumor estuvo presente en los dias de estudio 20 y 22 cuando se comparan animales dosificados con 1D11 como agente unico con aquellos que recibieron 13C4 solo, aunque el tratamiento con 1D11 produjo una tendencia estadisticamente insignificativa de la inhibicion del crecimiento debido a 1D11 en comparacion con animales tratados con vehiculo (Fig. 11A). El tratamiento con capecitabina produjo una tendencia hacia el crecimiento inhibido de los tumores primarios y se observo una reduccion significativa en el volumen del tumor tras el tratamiento con ixabepilona. La adicion de 1D11 a la terapia con capecitabina produjo una tendencia estadisticamente insignificativa hacia eficacia mejorada con respecto a la capecitabina sola (Fig. 11B). El combinar 1D11 con ixabepilona produjo eficacia mejorada en comparacion con ixabepilona sola, pero cuando se comparo con 13C4+ixabepilona (Fig. 11C).
El beneficio anadido de combinar ixabepilona y capecitabina con respecto a cualquier quimioterapeutico solo observado en el Estudio 09-3493 se confirmo en este estudio (Fig. 12A). La terapia de combinacion de capecitabina e ixabepilona fue significativamente mas eficaz en inhibir el crecimiento tumoral de 4T1 SQ que la capecitabina (Fig. 12B), y hubo un ligero beneficio con respecto a la ixabepilona sola (Fig. 12C). La inhibicion mas fuerte del crecimiento tumoral se observo en ratones que recibieron la terapia de combinacion de 1D11+capecitabina+ixabepilona que tuvo eficacia mejorada con respecto a capecitabina+ixabepilona sola o con 13C4 (Fig. 12A), confirmando los datos del Estudio 09-3493. Basandose en las terapias que implican a 1D11, 1 D11+capecitabina+ixabepilona fue mas eficaz que 1 D11+ixabepilona, que fue mas eficaz que 1 D11+capecitabina, que fue mas eficaz que 1D11 como agente unico (Fig. 13).
El tratamiento con 1D11 no inhibio el numero de metastasis pulmonares como agente unico (Fig. 14). La metastasis disminuyo significativamente en cohortes que recibieron terapias de combinacion y el numero promedio de metastasis en cada una de estas cohortes fue inferior a 10. Tanto 1D11+ixabepilona como 13C4+ixabepilona redujeron el numero de metastasis en comparacion con capecitabina, pero no hubo diferencias entre grupos de tratamiento en las cohortes de capecitabina o de capecitabina+ixabepilona.
Este estudio es el segundo estudio para determinar el efecto de anadir 1D11 a la combinacion de los quimioterapeuticos ixabepilona y capecitabina sobre la inhibicion del crecimiento de tumores primarios y la prevencion de metastasis pulmonares. Similar al primer estudio, 09-3493, 1D11 no tuvo mucho efecto sobre el crecimiento de tumores primarios como agente unico. Hubo una tendencia hacia la inhibicion en el grupo de 1D11 cuando se comparo con el grupo tratado con 13C4, pero esta significancia se perdio cuando se comparo con el grupo tratado con vehiculo. Tambien hubo tendencias que muestran que 1D11 mejoro la eficacia de capecitabina e ixabepilona, aunque en el ultimo caso, la mejora de la eficacia de la ixabepilona fue similar a aquella por 13C4. Sin embargo, en este estudio, como en 09-3493, la inhibicion mas significativa del crecimiento tumoral de 4T1 se observo en los ratones tratados con 1D11+capecitabina+ixabepilona. La mejora de la eficacia fue evidente aun cuando los animales se sacaron en un momento de tiempo en el que la separacion entre grupos de tratamiento estaba empezando a producirse. Tomados conjuntamente, los datos de estos dos estudios demuestran claramente que combinar una estrategia de neutralizacion de TGFB con terapia de capecitabina+ixabepilona puede proporcionar un beneficio terapeutico con respecto al tratamiento con capecitabina+ixabepilona sola.
Tomados conjuntamente, los datos de estos dos estudios representan la primera mejora de la eficacia de un quimioterapeutico en el modelo de tumor 4T1 SQ. Previamente en este modelo, 1D11 se ha combinado con paclitaxel, cisplatino o carboplatino y en cada uno de estos estudios 1D11 no mejoro la eficacia del quimioterapeutico probado.
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En el Estudio 09-3493, la mejora de la eficacia de capecitabina+ixabepilona podria atribuirse posiblemente a la mejora de la eficacia de la capecitabina, ya que 1D11 mejoro la eficacia de la capecitabina sola, pero no la de la ixabepilona. En este estudio hubo una tendencia hacia la mejora de la eficacia por 1D11 en la cohorte de capecitabina, pero no fue estadisticamente significativo. Parecio que 1D11 mejoro la eficacia de ixabepilona, pero se observo un resultado similar cuando la ixabepilona se combino con 13C4. Es probable que si hubiera habido mejor separacion de los grupos de tratamiento en cada cohorte el estudio se hubiera llevado a cabo mas tiempo. Esto tendra que tratarse en proximos estudios con el fin de determinar si la mejora de la eficacia de capecitabina+ixabepilona por 1D11 fue debida a la mejora de la actividad de capecitabina, ixabepilona, o es simplemente una funcion de cuando 1D11 se combina con ambos terapeuticos.
En el Estudio 09-3493, los animales que recibieron 6 mg/kg de ixabepilona normalmente presentaron neuropatia periferica, y muchos en la cohorte de ixabepilona+capecitabina llegaron a estar moribundos debido a la terapia y tuvieron que sacrificarse. En este estudio, la dosis de ixabepilona se redujo de 6 mg/kg a 3 mg/kg; una dosis que mostro eficacia contra el crecimiento tumoral de 4T1 en el estudio de MTD realizado mediante Pharm/Tox. Con esta dosis reducida de ixabepilona, ningun animal en el estudio presento signos de toxicidad en ningun momento durante el estudio. Adicionalmente, la dosis de 3 mg/kg demostro ser eficaz contra el crecimiento de tumores primarios y/o la incidencia metastasica en este estudio. Como tal, el utilizar esta dosis mas baja probablemente seria ventajoso en futuros estudios debido a la toxicidad reducida.
Ademas de ser capaz de observar efectos sobre el crecimiento de tumores primarios, este estudio se diseno de tal manera que los efectos de 1D11 como agente unico o en combinacion con quimioterapeuticos sobre la metastasis del tumor primario 4T1 SQ a los pulmones tambien fueran distinguibles. Los animales se sacaron todos en el dia 23 en vez de cuando cada tumor individual alcanzo 2000 mm3 (como en el Estudio 09-3493) con el fin de eliminar la posibilidad de una duracion mas larga del crecimiento tumoral que condujera a mas metastasis. Sorprendentemente, 1D11 no inhibio las metastasis en este estudio como se habia observado en otros modelos de tumor que incluyen el modelo intracardiaco de 4T1 de metastasis experimentales. Debe observarse, sin embargo, que el numero de metastasis de pulmon en la cohorte de anticuerpo de agente unico fue baja en cada grupo de tratamiento y especialmente baja en las cohortes de quimioterapeutico-combinacion, que indica que quizas estos animales se sacaron antes que lo que deberia haber sido. El tamano promedio de los tumores en el momento del cierre del estudio fue ~1000 mm3 en la cohorte de anticuerpo, ~700 mm3 en la cohorte de capecitabina y a o por debajo de 500 mm3 en las cohortes de ixabepilona e ixabepilona+capecitabina. La gran mayoria de las metastasis presentes fueron inferiores a 1 mm de tamano entre todas las cohortes. En estudios previos, numeros fiables de metastasis (50-100 por conjunto de pulmones) no estuvieron presentes hasta que los tumores primarios alcanzaron ~1500
mm3.
EJEMPLO 3
Estudio 3: Los efectos de 1D11, ixabepilona, capecitabina y combinaciones de estos terapeuticos sobre el crecimiento de tumores primarios y metastasis en un modelo de cancer de mama triple negativo singenico (4T1).
Metodos experimentales:
En el dia 0, 150 ratones BALB/c hembra de doce semanas de edad recibieron cada uno inyecciones subcutaneas de
50.000 celulas 4T1 en Matrigel en el flanco derecho. Los ratones portadores de tumor se monitorizaron rutinariamente y mediciones del tumor regulares 2-3X/semana empezaron en el dia 6. El volumen del tumor se determino usando la siguiente formula:
Volumen del tumor = Longitud x Anchura2 x 0,52
Seis dias despues de la inyeccion de celulas tumorales, los animales se agruparon por tamano y se dividieron en doce grupos de tratamiento de diez ratones cada uno. Los 30 animales restantes se incluyeron en un experimento de compania a este estudio, buscando los efectos de 1D11 sobre el reclutamiento y la actividad de macrofagos (vease mas adelante). En este momento, los investigadores se cegaron a las designaciones de los grupos de tratamiento y se inicio la administracion terapeutica. Todos los grupos de ratones recibieron tratamientos de o bien vehiculo de anticuerpo, 1D11 o bien 13C4 administrados en 100 gl IP tres veces por semana. Cohortes especificas de ratones recibieron tratamientos adicionales de capecitabina (360 mg/kg en 100 gl por sonda nasogastrica oral durante 14 dias consecutivos), ixabepilona (3 mg/kg en 200 gl IV cada cuatro dias para tres tratamientos) o ambas.
Se sacrifico una cohorte entera de ratones cuando el volumen del tumor promedio para un unico grupo dentro de esa cohorte alcanzo 1500 m3 o mayor. Se sacrificaron ratones individuales antes del punto final del tamano si los tumores se ulceraron o si los animales presentaron condiciones moribundas (falta de acicalamiento, respiracion fatigosa, caquexia, anorexia o letargo). Tras el sacrificio, se realizaron autopsias macroscopicas y se recogieron los tumores, pulmones y otros tejidos portadores de metastasis. Una porcion del tumor primario se congelo en OCT para IHC de inmunomarcadores, y el tumor restante y otros tejidos portadores de metastasis se fijaron en cinc-formalina para la incorporacion en parafina.
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Tabla 3: Resumen del estudio para experimentos con arginasa
Grupo N.°
Grupos de tratamiento Animales por grupo
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Vehfculo de anticuerpo 10
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13C4 10 mg/kg 10
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1D11 10 mg/kg 10
Momentos de tiempo:
Dfa 0: Los investigadores inyectan 50.000 celulas 4T1 + Matrigel por vfa subcutanea en el flanco
derecho
Dfa 3: Los investigadores empiezan las mediciones de los tumores 2-3X/semana
Dfa 6: El personal de DCM empieza a dosificar anticuerpo IP 3X/semana; siete tratamientos totales
Dfa 21: 13-15 ratones del grupo se sacrifican y se recogen los tumores primarios
Tejidos Los tumores primarios en RPMI 1640 + 10 % de FBS se mantienen sobre hielo humedo.
Los treinta ratones que no se pusieron en la porcion de quimioterapeutico-combinacion de este estudio se agruparon por tamano y se dividieron en tres grupos adicionales tratados con vehfculo de anticuerpo, 13C4 o 1D11 para evaluar la presencia de macrofagos M2 en el sitio del tumor primario (Tabla 3). Se recogieron los tumores primarios de estos ratones en el dfa de estudio 21. Los tumores se digirieron enzimaticamente en 5 ml de solucion salina equilibrada de Hank (HBSS) que contenfa 50 pg/ml de colagenasa I, 50 pg/ml de colagenasa IV, 25 pg/ml de hialuronidasa, 10 pg/ml de DNasa I y 0,2 U/ml de inhibidor de tripsina. Los tejidos se incubaron dos veces en la disolucion de enzima durante 20 minutos a 37 °C con balanceo constante y se creo una suspension de celulas usando el disociador de tejido gentleMACS. Las celulas disociadas y el tejido restante se pasaron a traves de un filtro de 100 pm, luego un filtro de 40 pm en tubos de centrffuga de 50 ml. Las celulas se lavaron dos veces con HBSS v se contaron las celulas viables. Para enriquecer en celulas CD11b+, las celulas viables se ajustaron a 1,0x107 celulas por 90 pl de PBS desgasificado que contenfa 0,5 % de BSA libre de endotoxina y EDTA 2 mM y se incubaron con microesferas magneticas anti-CD11b. Las celulas CD11b+ se seleccionaron positivamente usando AutoMacs Pro Separator. Las porciones de suspensiones de celulas CD11b+ individuales se tineron para CD11b, F4/80, CD206 y Gr-1. Las celulas CD11 b+ restantes se lisaron para extraer arginasa.
Para el ensayo de arginasa celular, celulas enriquecidas se lavaron con PBS y 1,0x106 celulas de cada tejido se anadieron a tubos de microcentrffuga de 0,5 ml separados. Las celulas se lavaron con PBS a 1000 g a 4 °C y las celulas sedimentadas se lisaron durante 10 minutos en Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) que contenfa 0,4 % de Triton X-100 e inhibidor de la proteasa. Los lisados se centrifugaron a 14.000 g y los sobrenadantes se almacenaron a -80 °C hasta la fecha del ensayo. Los niveles de arginasa, como se ha determinado midiendo la conversion de arginina a ornitina y urea contra una curva de patron de urea, se cuantificaron usando el kit Quantichrome Arginase (BioAssay System).
Para la inmunofenotipificacion de celulas, 1,0x106 celulas de cada tejido se bloquearon con 10 pg/ml de Fc Block (anti-CD16/32) durante 30 minutos antes de la tincion con anticuerpos para celulas derivadas de mieloide (CD11b), macrofagos (F4/80), macrofagos M2 (CD206) y MDSCs (Gr-1). La viabilidad celular se determino usando Live/Dead Fixable Dead Cell Stain (Invitrogen). Las celulas se fijaron durante 15 minutos en 1 % de paraformaldehfdo y los eventos se adquirieron en un citometro de flujo BD LSR II. El analisis de datos se realizo usando el software Flow Jo (Fig. 15).
Resultados:
Hubo efectos diferenciales sobre el crecimiento tumoral dependiendo del tratamiento proporcionado, observandose el crecimiento tumoral mas rapido en ratones tratados con terapia de anticuerpos sola, y el crecimiento mas lento en ratones tratados con anticuerpo + capecitabina + ixabepilona (Fig. 16). En este estudio, una cohorte entera de animales se sacrifico el dfa que el volumen del tumor promedio en esa cohorte alcanzo un punto final del tamano de 1500 mm3. Los ratones en la cohorte de terapia de anticuerpo sola alcanzaron un volumen medio del tumor de ~1500 mm3 en el dfa de estudio 23. Las cohortes de capecitabina y de ixabepilona demostraron crecimiento tumoral retardado, alcanzando el punto final en el dfa de estudio 27 y 29, respectivamente, mientras que la combinacion de capecitabina e ixabepilona tuvo el retraso mas largo ya que esta cohorte alcanzo el punto final a los 30 dfas.
Como agente unico, 1D11 no tuvo efecto significativo sobre el crecimiento de tumores 4T1 SQ (Fig. 17A). El tratamiento con capecitabina produjo inhibicion del crecimiento tumoral muy modesta, y la ixabepilona fue la mas
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eficaz en inhibir el crecimiento tumoral de 4T1 como monoterapia. La adicion de 1D11 no mejoro la eficacia de ni la capecitabina (Fig. 17B) ni la ixabepilona (Fig. 17C).
La inhibicion mas fuerte del crecimiento tumoral se observo en ratones que recibieron la terapia de combinacion de 1D11+capecitabina+ixabepilona que tuvo eficacia mejorada con respecto a capecitabina+ixabepilona sola o con 13C4 (Fig. 18A). Es muy sorprendente que la combinacion de 1D11, capecitabina e ixabepilona produjera el volumen del tumor medio mas pequeno, 1174,50 mm3, en el momento del sacrificio en comparacion con los grupos de tratamiento de combinacion de vehiculo (1689,06 mm3) y 13C4 (1651,24 mm3) en esta cohorte. La combinacion de capecitabina e ixabepilona fue mas eficaz que la capecitabina sola (Fig. 18B), sin embargo, esta combinacion solo fue ligeramente mas eficaz que la terapia de ixabepilona (Fig. 18C). Basandose en las terapias que implican a 1D11, 1D11+capecitabina+ixabepilona fue mas eficaz que 1D11+ixabepilona, que fue mas eficaz que 1 D11+capecitabina, que fue mas eficaz que 1D11 como agente unico (Fig. 19).
1D11 no tuvo efecto sobre el numero de metastasis que se desarrollaron en los pulmones de ratones portadores de tumores primarios 4T1 SQ. El tratamiento con capecitabina + ixabepilona inhibio la metastasis y la eficacia de esta terapia de combinacion, que se mejoro significativamente por 1D11 (Fig. 20).
Tabla 4: Porcentaje de MDSC totales y macrofagos de celulas CD11b+ aisladas de tumores primarios 4T1
Vehiculo de anticuerpo 10 mg/kg de 13C4 10 mg/kg de 1D11
Tumores primarios 4T1 (macrofagos totales)
22 % 23 % 26 %
Tumores primarios 4T1 (MDSC)
72 % 71 % 64 %
% total de celulas CD11 b+
94 % 94 % 90 %
La inmunofenotipificacion de macrofagos totales (CD11b+, F4/80+), macrofagos M1 (CD11b+, F4/80+, CD206-), macrofagos M2 (CD11b+, F4/80+CD206+) y MDSC (CD11b+, Gr-1+) revelo que la mayoria de CD11b+ aisladas de tumores primarios 4T1 son MDSC (Tabla 1). Parece haber un ligero aumento en TAM y una disminucion en el numero de MDSC en tumores primarios tratados con 1D11 en comparacion con controles. La medicion cuantitativa de macrofagos totales, macrofagos M1 y macrofagos M2 se hizo por extrapolacion al numero total de celulas aisladas de tumores primarios recogidos de cada raton individual (Fig. 21). Por este analisis, no hubo diferencia significativa en el numero de macrofagos entre los grupos de tratamiento. Sin embargo, hay una tendencia de macrofagos M1 CD206- elevados de tumores primarios (Fig. 21) de ratones tratados con 1D11.
Aunque el tratamiento con 1D11 no disminuyo el numero de macrofagos M2 asociados a los tumores, 1D11 parece tener un efecto inhibidor sobre la produccion de arginasa por TAM. Los niveles de arginasa disminuyeron significativamente de lisados de celulas CD11b+ de ratones tratados con 1D11 en comparacion con controles (Fig. 22, p <0,001 por analisis unilateral de ANOVA, prueba de multiples comparaciones de Tukey).
En la clinica, se ha informado que la terapia de combinacion de ixabepilona y capecitabina es mas eficaz que la capecitabina sola en cancer de mama triple negativo (TNBC) resistente a taxanos. El modelo de carcinoma mamario murino 4T1 se usa rutinariamente como un buen sustituto para TNBC humano y para prueba preclinica de terapeuticos contra TNBC. El fin del estudio anterior era determinar si 1D11 mejoraria la eficacia de la capecitabina, ixabepilona, o la combinacion de los dos quimioterapeuticos, contra el crecimiento de tumores primarios y/o posterior metastasis en el modelo de 4T1 singenico de TNBC.
Este estudio se diseno para determinar si 1D11 mejoraria el efecto de los quimioterapeuticos capecitabina e ixabepilona sobre la inhibicion del crecimiento de tumores primarios 4T1 y metastasis del tumor primario a los pulmones. La inhibicion del crecimiento tumoral mas fuerte se observo en el grupo de tratamiento de 1D11 mas capecitabina e ixabepilona. La combinacion de capecitabina e ixabepilona tambien inhibio la metastasis a los pulmones y este efecto mejoro adicionalmente cuando se anadio 1D11 a la terapia de combinacion. Como se ha observado en estudios previos con este modelo, 1D11 como agente unico no tuvo efecto sobre el crecimiento de tumores primarios, no inhibio la metastasis, y no mejoro significativamente la eficacia de ni la capecitabina ni la ixabepilona cuando estas se administraron como monoterapias.
Los resultados del Estudio 09-4255 confirman los resultados de dos estudios previos, 09-3493 y 09-3494, de que 1D11 puede mejorar significativamente la eficacia de la terapia de combinacion de capecitabina e ixabepilona contra el crecimiento de tumores primarios 4T1 y este estudio fue el primero en demostrar que 1D11 tambien podria mejorar la inhibicion de metastasis por capecitabina + ixabepilona. Estos datos representan la primera mejora de eficacia de un quimioterapeutico en el modelo de tumor 4T1 SQ. Previamente en este modelo, 1D11 se ha combinado con paclitaxel, cisplatino o carboplatino, y en cada uno de estos estudios 1D11 no mejoro la eficacia del quimioterapeutico probado.
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Como 1D11 como agente unico no tuvo efecto ni sobre el crecimiento de tumores primarios ni la metastasis, la adicion de 1D11 a capecitabina + ixabepilona produce un efecto sinergico. El motivo de esta sinergia todavia no se conoce. 1D11 solo mejora la eficacia de la combinacion de capecitabina e ixabepilona y 1D11 no mejoro coherentemente la eficacia ni de capecitabina ni de ixabepilona cuando estos quimioterapeuticos se administraron individualmente. La actividad antitumoral de la capecitabina, un profarmaco que se convierte en 5-flurouracilo, es debida a su capacidad para funcionar de antagonista de pirimidina y la ixabepilona es un estabilizador de microtubulos. En la clinica, la combinacion de capecitabina e ixabepilona fue mas eficaz que cualquier agente solo contra el cancer de mama triple negativo. En el modelo de tumor 4T1, la eficacia de la terapia de combinacion fue mas fuerte que la capecitabina sola y solo fue marginalmente mejor que la observada con ixabepilona sola. Se supone que el direccionamiento de TGFB con 1D11 mejora la inmunidad antitumoral neutralizando los efectos inmunosupresores de TGFB derivados de tumor y de estroma. Es posible que estos efectos potencialmente suaves en un modelo tumoral agresivo tal puedan solo mejorar la eficacia quimioterapeutica cuando los tumores son atacados por multiples terapeuticos que se dirigen a multiples vias.
En el Estudio 09-3493, se observo toxicidad significativa en animales portadores de tumor tratados con la combinacion de capecitabina e ixabepilona. Las dosis de cada terapeutico fueron 360 mg/kg y 6 mg/kg, respectivamente. La dosis de ixabepilona, que puede conducir a neuropatia, se redujo a 3 mg/kg en el segundo estudio en esta serie, 09-3494. Esto produjo una reduccion significativa en la toxicidad y neuropatia, y por tanto esta dosis se uso en el presente estudio. Aun cuando se observo perdida de peso en ratones que recibieron anticuerpo/tratamiento quimioterapeutico, hubo una reduccion significativa de acontecimientos adversos graves tales como la paralisis de las extremidades traseras y muerte que se observo en el Estudio 09-3493. La perdida de peso fue el efecto secundario mas comun de la terapia de combinacion, sin embargo, la adicion de 1D11 no aumento ni disminuyo la incidencia de esta toxicidad.
Tomados conjuntamente, estos datos muestran que combinar una estrategia de neutralizacion de TGFB con terapia de capecitabina+ixabepilona proporcionara un beneficio terapeutico con respecto al tratamiento con capecitabina+ixabepilona sola en la clinica.
Dada la eficacia que los presentes inventores ven con 1D11 contra las metastasis en otros modelos de tumor y la mejora de capecitabina + ixabepilona en esta serie de estudios, se han realizado varios estudios que investigan el mecanismo de accion de 1D11. Se encontro que los linfocitos T citotoxicos (CTL) son criticos para la capacidad de 1D11 para inhibir metastasis en el modelo de tumor de la almohadilla plantar B16-F10 de metastasis espontanea. En el Estudio 09-4255 se realizo un experimento de compania al estudio de eficacia principal para determinar si la neutralizacion de TGFB por 1D11 esta afectando el reclutamiento, fenotipo y/o actividad de TAM.
Los TAMs clinicamente activados, tambien conocidos como macrofagos M1, son tumoricidas en parte mediante la NO sintasa inducible (iNOS). En cambio, los TAM alternativamente activados, o macrofagos M2, se han asociado a la progresion del tumor, promoviendo la invasion, metastasis y angiogenesis tumoral. Se ha informado en la bibliografia de que los macrofagos M2 secretan arginasa y son capaces de promover la proliferacion de celulas tumorales mediante la via de arginasa. Otro tipo de celula, MDSC, se recluta al sitio de tumores primarios en el que desempenan una funcion inmunosupresora. Los MDSC y macrofagos tambien son grandes productores de TGFB que ayuda a promover la progresion del tumor.
La inmunofluorescencia de la co-localizacion de CD68/CD206 ha demostrado que los macrofagos M2 estan presentes en tumores primarios 4T1 de ratones portadores de tumor no tratados. En el estudio actual hubo una tendencia observada hacia elevados numeros de macrofagos M1 tumoricidas en tanto tumores primarios como pulmones de ratones tratados con 1D11. El tratamiento con 1D11 no condujo a una disminucion significativa de dos tipos de celulas, macrofagos M2 y MDSC, asociados a tumores primarios. Aunque el tratamiento con 1D1 no condujo a una disminucion en el numero de macrofagos M2 promotores de tumor o MDSC, hay una disminucion significativa de arginasa intracelular de celulas CD11b+ aisladas de ambos tumores primarios 4T1. Esto demuestra la actividad farmacodinamica de 1D11 en el modelo debido a que se ha mostrado que TGFB regula por incremento la sintesis de arginasa, producida por macrofagos M2pro-tumorigenicos, y regula por disminucion la sintesis de iNOS, que se produce por macrofagos M1antitumorigenicos. Se ha mostrado que la arginasa promueve la proliferacion de celulas tumorales, por lo que inhibir la produccion de arginasa por TGFB neutralizantes podria tener efectos perjudiciales sobre la proliferacion y el crecimiento tumoral.
EJEMPLO 4:
La neutralizacion de TGFB con el anticuerpo para TGFB neutralizante de pan, 1D11, potencia selectivamente la eficacia de quimioterapeuticos en modelos de tumor preclinico
Se probo la combinacion de neutralizacion de TGF-B, usando el anticuerpo monoclonal murino 1D11, y quimioterapeuticos seleccionados en modelos murinos de cancer de mama, cancer pancreatico, melanoma y carcinoma de celulas renales. De las combinaciones probadas, solo la adicion de 1D11 a la terapia de combinacion de capecitabina + ixabepilona produjo coherentemente eficacia mejorada con respecto a la pauta quimioterapeutica sola. 1D11 mejoro rutinariamente la eficacia de capecitabina+ixabepilona contra el crecimiento de tumores primarios
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e inhibio la metastasis en el modelo de tumor 4T1 subcutaneo (SQ) singenico y es la primera demostracion de efectos aditivos cuando 1D11 se combina con quimioterapeuticos en varios estudios de cancer.
Se combino 1D11 con paclitaxel en tanto un modelo de cancer de mama de xenoinjerto (MDA-MB-231) como el modelo de cancer de mama 4T1 singenico. En estos estudios, 1D11 no mejoro la inhibicion de tumores primarios por paclitaxel, y en los estudios de 4T1, 1D11 tampoco mejoro la capacidad de paclitaxel para inhibir las metastasis espontaneas de los tumores primarios a los pulmones. La combinacion de 1D11 y ciclofosfamida tambien se probo en el modelo de xenoinjerto MDA-MB-231, y de nuevo, 1D11 no mejoro la eficacia de ciclofosfamida contra el crecimiento de tumores primarios. Tambien se usaron los modelos de MDA-MB-231 y 4T1 para probar terapias de combinacion con 1D11 y los compuestos de platino cisplatino o carboplatino. En modelos de 4T1 SQ, 1D11 no mejoro la eficacia de carboplatino contra el crecimiento de tumores primarios. En un modelo de 4T1 de metastasis experimental, en el que las celulas tumorales se inyectan en el ventriculo izquierdo del corazon produciendo siembra metastasica de los huesos, glandulas suprarrenales, rinones y pulmones, tanto 1D11 como el cisplatino fueron capaces de inhibir las metastasis particularmente al hueso, pero no se observo eficacia mejorada cuando se combinaron los dos terapeuticos.
No se observo mejora de la eficacia cuando 1D11 se combino con quimioterapeuticos de referencia en modelos de cancer pancreatico o melanoma. La gemcitabina es el quimioterapeutico de primera linea para el cancer pancreatico y se probo la combinacion de 1D11 y gemcitabina en un modelo SQ de xenoinjerto (Panc-1), un modelo singenico SQ (Pan02) y un modelo de raton geneticamente manipulado (GEMM) de adenocarcinoma ductal pancreatico (PDAC) accionado por Kras/p53 mutante. En los estudios de Panc-1, 1D11 no tuvo efecto sobre la eficacia de gemcitabina contra tumores primarios SQ, y se observo un efecto similar en GEMM de PDAC. Sin embargo, en el modelo de Pan02, el combinar 1D11 con gemcitabina redujo en realidad la eficacia de la gemcitabina contra el crecimiento de tumores primarios produciendo, crecimiento tumoral acelerado cuando se comparo con controles.
Se uso el modelo de melanoma murino B16-F10 para evaluar los efectos de combinar 1D11 con dacarbazina, el quimioterapeutico usado como terapia de primera linea en melanoma. En un modelo de B16-F10SQ, 1D11 no mejoro la eficacia de dacarbazina contra el crecimiento de tumores primarios. Tambien se probo quimioterapeutico- combinacion de 1D11 y dacarbazina en un modelo de metastasis espontaneas de melanoma murino B16-F10. En este modelo, se inyectaron celulas tumorales por via subcutanea en la region plantar de ratones, en la que se desarrolla un tumor primario y metastatiza espontaneamente al ganglio linfatico popliteo regional. Al igual que en el modelo SQ, 1D11 no mejoro la eficacia de dacarbazina contra los tumores primarios, y adicionalmente no mejoro la eficacia de dacarbazina contra la metastasis al ganglio linfatico drenante.
Finalmente, 1D11 se probo en un modelo de xenoinjerto de carcinoma de celulas renales Caki-1 en combinacion con ciclofosfamida y paclitaxel, y en este estudio, parecio que 1D11 redujo la eficacia de cada uno de estos quimioterapeuticos.
En resumen, los datos muestran claramente que la neutralizacion de TGFB con 1D11 solo mejora la eficacia de quimioterapeuticos especificos. 1D11 mejoro la eficacia de la combinacion de capecitabina e ixabepilona en un modelo de cancer de mama preclinico, pero no mejoro la eficacia de paclitaxel, ciclofosfamida, cisplatino, carboplatino, gemcitabina o dacarbazina en modelos de tumor relevantes.
La invencion, como se define en las reivindicaciones originales de la solicitud original, se explican en los siguientes parrafos:
1. Un metodo de tratamiento de un cancer de mama en un sujeto, comprendiendo el metodo:
administrar a dicho sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista del factor de crecimiento transformante beta (TGFB) en combinacion con capecitabina e ixabepilona, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFB potencia la eficacia de capecitabina e ixabepilona para tratar dicho cancer de mama.
2. El metodo del parrafo 1 precedente, en el que dicho antagonista de TGFB es un agente que bloquea la union de una proteina de TGFB a su receptor.
3. El metodo del parrafo 2 precedente, en el que dicho agente es una proteina.
4. El metodo del parrafo 3 precedente, en el que dicho agente es un anticuerpo anti-TGFB.
5. El metodo del parrafo 4 precedente, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo anti-TGFB neutralizante de pan.
6. El metodo del parrafo 4 precedente, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-TGFB.
7. El metodo del parrafo 6 precedente, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado que comprende una o mas CDR de 1D11.
8. El metodo del parrafo 2 precedente, en el que dicha proteina de TGFB es TGFB-1, -2, -3, o una combinacion de las mismas.
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9. El metodo del parrafo 1 precedente, en el que dicho antagonista de TGFB es una molecula que es capaz de disminuir la actividad de un TGFB.
10. El metodo del parrafo 1 precedente, dicho antagonista de TGFB se co-administra con capecitabina, e ixabepilona.
11. El metodo del parrafo 1 precedente, dicho antagonista de TGFB se administra independientemente de la administracion de capecitabina e ixabepilona.
12. El metodo del parrafo 1 precedente, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFB en combinacion con capecitabina e ixabepilona inhibe el crecimiento de tumor primario.
13. El metodo del parrafo 1 precedente, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFB en combinacion con capecitabina e ixabepilona inhibe la metastasis.
14. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFB en combinacion con capecitabina e ixabepilona inhibe la metastasis de tumor primario al pulmon.
15. Un metodo de inhibicion de un crecimiento tumoral asociado a cancer de mama en un sujeto, comprendiendo el metodo: administrar a dicho sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista del factor de crecimiento transformante beta (TGFB) en combinacion con capecitabina e ixabepilona, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFB potencia la eficacia de capecitabina e ixabepilona para inhibir dicho crecimiento tumoral asociado a cancer de mama.
16. El metodo del parrafo 15 precedente, en el que dicho antagonista de TGFB es un agente que bloquea la union de una proteina de TGFB a su receptor.
17. El metodo del parrafo 16 precedente, en el que dicho agente es una proteina.
18. El metodo del parrafo 17 precedente, en el que dicho agente es un anticuerpo anti-TGFB.
19. El metodo del parrafo 18 precedente, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo anti-TGFB neutralizante de pan.
20. El metodo del parrafo 18 precedente, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-TGFB.
21. El metodo del parrafo 20 precedente, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado que comprende una o mas CDR de 1D11.
22. El metodo del parrafo 16 precedente, en el que dicha proteina de TGFB es TGFB-1, -2, -3, o una combinacion de las mismas.
23. El metodo del parrafo 15 precedente, en el que dicho antagonista de TGFB es una molecula que es capaz de disminuir la actividad de un TGFB.
24. El metodo del parrafo 15 precedente, dicho antagonista de TGFB se co-administra con capecitabina, e ixabepilona.
25. El metodo del parrafo 15 precedente, dicho antagonista de TGFB se administra independientemente de la administracion de capecitabina e ixabepilona.
26. El metodo del parrafo 15 precedente, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFB en combinacion con capecitabina e ixabepilona inhibe el crecimiento de tumor primario.
27. El metodo del parrafo 15 precedente, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFB en combinacion con capecitabina e ixabepilona inhibe la metastasis.
28. El metodo del parrafo 15 precedente, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFB en combinacion con capecitabina e ixabepilona inhibe la metastasis de tumor primario al pulmon.

Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un antagonista de TGFp para su uso en un metodo de inhibicion del crecimiento tumoral asociado a cancer de mama en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar a dicho sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz del antagonista de TGFp en combinacion con capecitabina e ixabepilona, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFp potencia la eficacia de capecitabina e ixabepilona para inhibir dicho crecimiento tumoral asociado a cancer de mama.
  2. 2. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho antagonista de TGFp es un agente que bloquea la union de una proteina de TGFp a su receptor.
  3. 3. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 2, en el que dicho agente es una proteina.
  4. 4. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 3, en el que dicho agente es un anticuerpo anti-TGFp.
  5. 5. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo anti- TGFp neutralizante de pan.
  6. 6. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-TGFp.
  7. 7. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 6, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado que comprende una o mas CDR de 1D11.
  8. 8. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 2, en el que dicha proteina de TGFp es TGFp-1, -2, - 3, o una combinacion de las mismas.
  9. 9. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho antagonista de TGFp es una molecula que es capaz de disminuir la actividad de un TGFp.
  10. 10. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho antagonista de TGFp se co- administra con capecitabina e ixabepilona.
  11. 11. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho antagonista de TGFp se administra independientemente de la administracion de capecitabina e ixabepilona.
  12. 12. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 1, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFp en combinacion con capecitabina e ixabepilona inhibe el crecimiento de tumor primario.
  13. 13. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 1, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFp en combinacion con capecitabina e ixabepilona inhibe la metastasis.
  14. 14. El antagonista de TGFp para su uso segun la reivindicacion 1, en el que la administracion de dicho antagonista de TGFp en combinacion con capecitabina e ixabepilona inhibe la metastasis de tumor primario al pulmon.
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