TR201816180T4 - Meme kanserini tedavi etmek için kombinasyonlu tedavi. - Google Patents

Abstract

Buluş, meme kanserini tedavi etmek için bileşimleri ve yöntemleri sağlar. Spesifik olarak buluş, meme kanserini tedavi etmek için kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak bir Dönüştürücü Büyüm Faktörü beta (TGFß) antagonistinin tatbik edilmesi ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME MEME KANSERINI TEDAVI ETMEK IÇIN KOMBINASYONLU TEDAVI ILGILI BASVURULARA ÇAPRAZ REFERANS Bu basvuru 12 Mart 2010 tarihinde tevdi edilen Birlesik Devletler Sartli Patent Basvurusu No. 61/313,515'e dayanarak rüçhan talep eder.

BULUSUN ALANI Bulus meme kanserini tedavi etmek için bilesimler ile ilgilidir. Spesifik olarak bulus meme kanserini tedavi etmek için bir ya da daha fazla kemoterapi ajani ile kombinasyonlu olarak bir Dönüstürücü Büyüme Faktörü beta (TGFß) antagonistinin BULUSUN ARKA PLANI Dönüstürücü büyüme faktörü beta (TGF-beta ya da TGFß) süper familyasi ortak sekans elemanlarini ve yapisal motifleri paylasan birçok üye proteini içerir. Bu proteinlerin çok çesitli hücre tiplerinde genis bir biyolojik yanit spektrumunu ortaya çikardigi bilinmektedir. TGFß süper familyasinin üyeleri tarafindan tetiklenen hücresel sinyallesme Iigandin hem TGFß Tip II hem de Tip III transmembran reseptör bilesenlerine kooperatif baglanmasini içerir ki bu da bir aktif serin/treonin kinaz reseptör kompleksinin TGFß Tip I reseptörü ile montajini indükler. Bu reseptör kompleksi, sitoplazmik Smad proteinlerini fosforilatlayarak bir sinyal transdüksiyon yolunu baslatir ve bu da ardindan çekirdege dogru yer degistirir ve hedef genlerin transkripsiyonunu baskilamak ya da aktive etmek için islev görür.

Birçok TGFß süper familyasi proteini örüntü olusumundaki ve doku spesifikasyonundaki embryonik gelisim esnasinda önemli islevlere sahiptir. TGFß süper familyasi protein indüklü sinyallesme, adipojenez, miyojenez, kondrojenez, hematopoiez ve Epitelyal hücre farklilasmasi gibi çok çesitli farklilasma proseslerini Nature Review Cancer, 8:807-20). Yetiskin dokularinda TGFß süper familyasi proteinleri de tümör büyümesi ve metastaz, yara iyilesmesi, kemik onarimi ve kemik yeniden modellemesi gibi proseslere dahil olmustur. TGFß'nin tümör baskilayici etkileri geçmisteki çalismalarda gösterilmistir. Bakiniz Derynck ve ark., 2001, Nat Genet, 29:117-129.

TGFß antagonist molekülleri TGFß aracili sinyallesmeyi düzenler. Bu tip antagonistlerin örnekleri arasinda TGFß'nin bir ya da daha fazla izoformuna karsi yönlendirilen monoklonal ve poliklonal antikorlar yer alir (ABD Pat. No. 5,571,714 ve PCT patent basvurusu WC 97/ 13844) TGFß antagonist moleküllerinin meme kanser hücresi tümörü olusturmasini önledigi ve fare dalagi dogal öldürücü hücre aktivitesini arttirdigini tespit etmistir. Bakiniz Arteaga ve ark., 1993, J. Clin. Invest., 92:63.

Kanseri tedavi etmek için kombinasyon terapisi modalitelerine bir ihtiyaç mevcuttur.

BULUSUN ÖZETI Bulus bir süjede meme kanserini tedavi etmek için bir kombinasyon terapötik yöntemini tedarik eder. Yöntem kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak bir Dönüstürücü Büyüme Faktörü beta (TGFß) antagonistinin terapötik olarak etkili bir miktarinin sujeye tatbik edilmesi adimlarini içerir. Kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak (TGFß) antagonistinin kullanimi bir meme kanserini tedavi etmek için kapesitabinin ve iksabepilonun kombinasyonunun etkililigini arttirir.

Bir uygulamada TGFß antagonisti bir TGFß proteininin reseptörüne baglanmasi bloke eden bir moleküldür. Baska bir uygulamada TGFß antagonisti bir TGFß'nin aktivitesini azaltabilen bir moleküldür. Belirli bir uygulamada TGFß antagonistii TGFß'nin bir ya da daha fazla izoformuna baglanan ya da bunlari nötralize eden bir anti-TGFß monoklonal antikorudur (örnegin bir pan-spesifik anti-TGFß antikorudur).

Bazi uygulamalarda TGFß antagonisti kapesitabinin ve iksabepilonun bir kombinasyonu ile birlikte tatbik edilir. Diger uygulamalarda TGFß antagonisti kapesitabinin ve iksabepilonun bir kombinasyonunun tatbikinden bagimsiz olarak tatbik Bulusun kombinasyon terapisi primer tümörün büyümesini inhibe eder ve ayrica primer tümörden akcigere metastazi inhibe eder.

Bulus ayni zamanda bir TGFß antagonistinin bir terapötik olarak etkili miktarini içeren bir farmasötik bilesimi saglar, burada TGFß antagonisti bir meme kanserini tedavi etmek için kapesitabinin ve iksabepilonun kombinasyonunun etkililigini arttirmak için Bulus ayrica bir TGFß antagonistinin bir terapötik olarak etkili miktarini içeren bir kiti saglar burada TGFß antagonisti bir meme kanserini tedavi etmek için kapesitabinin ve iksabepilonun kombinasyonunun etkililigini arttirmak için etkili bir miktarda mevcuttur.

Mevcut bulusun diger özellikleri ve avantajlari asagidaki detayli tarifname örneklerinden ve sekillerinden asikar olacaktir. Bununla birlikte bulusun tercih edilen uygulamalarini gösterirken detayli tarifnamenin ve spesifik örneklerin sadece sekillerle açiklama yoluyla verildigi anlasilmalidir çünkü bulusun ruhu ve kapsami dahilindeki çesitli degisiklikler ve modifikasyonlar bu detayli tarifname esas alinarak teknikte uzman kisiler için asikar hale gelecektir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, ortalama primer tümör hacimlerini gösterir. Tümör büyümesinin inhibisyonu kapesitabinde, Iksabepilonda ve kapesitabin + iksabepilon kohortlarinda, sadece kohort olan antikora kiyasla gözlemlenmistir.

Sekil 2, bir tekil ajan olarak 1011`in 4T1 tümör büyümesi (A) üzerinde nispeten hiçbir etkiye sahip olmadigini gösterir. 1D11, iksabepilonun (C) degil kapesitabinin (B) etkililigini arttirmistir.

Sekil 3 4T1 tümör büyümesinin (A) inhibe edilmesinde 1D11'in eklenmesinin kapesitabin + iksabepilonun kombinatoryal terapisinin etkililigini arttirdigini gösterir.

Kapesitabin 4T1 tümör büyümesini inhibe eder ancak 1D11 kapesitabinin etkililigini arttirmasina ragmen iksabepilon kadar etkili degildir ve bunun sonucunda tek basina iksabepilona (B) benzer olan 4T1 tümör büyümesi inhibisyonu ile sonuçlanir. 1D11 de ayni zamanda kombinatoryal terapiye (C) eklenmedikçe tek basina iksabepilon üzerinde kapesitabin + iksabepilon kombinasyonlu tedavisinin hiçbir önemli avantaji görülmemistir.

Sekil 4, 4T1 tümör büyümesinin üzerinde tek bir ajan olarak ya da kapesitabinin ve/veya iksabepilonun kombinasyonlu olarak 1D11 etkilerinin genel bir görünüsünü gösterir. En etkili terapi 1D11+ kapesitabin + iksabepilonun üçlü kombinasyonudur.

Sekil 5, hayvanlar için sag kalim egrisini gösterir. En uzun ortalama sagkalim 1D11 + kapesitabin + iksabepilon ile tedavi edilen hastalarda gözlemlenmistir.

Sekil 6, 22000mm3`|ük bir birincil tümör hacminin uç noktasina ulasmak için harcanan zamanin tedavi gruplari arasinda önemli oranda farkli oldugunu gösterir. 1D11, kapesitabin terapisine bagli olarak uç noktasina kadar geçen zamani arttirmistir ve uç noktasina kadar geçen en uzun süre 1D11+ kapesitabin + iksabepilonda basarilmistir.

Sekil 7, bütün tedavi gruplari (A) arasindaki akciger metastazlarinin toplam sayisini ve bütün tedavi gruplari (b) arasindaki > 1mm büyüklügündeki akciger metastazlarinin toplam sayisini gösterir. Her bir kohorttaki akciger metastazlarinin en yüksek sayisi, uç noktasina kadar en uzun süreye sahip tedavi grubudur; yani her bir durumda 1D11 tedavi grubudur.

Sekil 8, tek bir ajan kohortundaki (A), kapesitabin kohortundaki (B), iksabepilon kohortundaki (C) ve kapesitabin + iksabepilon kohortundaki (D) akciger metastazlarinin sayisini gösterir. Her bir kohortta, akciger metastazlarinin en yüksek sayisi 1D11 tedavi grubunda gözlemlenmistir çünkü bu tedavi gruplari her bir kohort içindeki ilgili kontrollerinden daha uzun süre arastirilmistir.

Sekil 9, tedavi göz önüne alinmaksizin akciger metastazlarinin sayisinin ve çalismada geçen sürenin arasinda bir korelasyon oldugunu gösterir.

Sekil 10, ortalama birincil tümör hacimlerini gösterir. Tümör büyümesinin inhibisyonu kapesitabinde, iksabepilonda ve kapesitabin+iksabepilon kohortlarinda sadece kohort olan antikora kiyasla gözlemlenmistir.

Sekil 11, 1D11 ile tedavinin tek bir ajan olarak ya da kapesitabin ya da iksabepilon ile kombinasyonlu olarak hafif etkileri bulundugunu gösterir. A. 1D11 ile tekli ajan terapisi birincil tümör büyüklügünde önemli bir azalma meydana gelmesi ile sonuçlanmistir. B. kapesitabin ile kombinasyonlu olarak tatbik edilen 1d11 tek basina kapesitabininkinden daha yüksek olacak sekilde arttirilmis etkililikle sonuçlanmistir. C. 1D11 istatistiki olarak önemli bir sekilde iksabepilonun etkililigini arttirmamistir. (A: * = p<0.05, Tukey'in Çogul Kiyaslama Testi) (B: * = p<0.05, ** = p<0.01, T-Testi).

Sekil 12, 1D11 ile tedavinin birincil tümör hacmine karsi iksabepilon/ kapesitabin kombinasyonunun etkililigini önemli oranda arttirdigini göstermektedir. A. 1D11, iksabepilon ve kapesitabin ile birlestirildiginde 13C4'e kiyasla iksabepilonun ve kapesitabinin etkililigini arttirmistir. B. Birlikte dozlandiginda iksabepilon 1D11'in ve kapesitabinin etkililigini önemli oranda arttirmistir. C. 1D11iin, kapesitabinin ve iksabepilonun üçlü kombinasyonu 1D11 + iksabepilondan daha etkili olmustur. (A: * = Sekil 13, 4T1 tümör büyümesi üzerinde tek bir ajan olarak ya da kapesitabin ve/veya iksabepilon ile kombinasyonlu olarak 1D11`in etkilerinin bir genel incelemesini gösterir.

En etkili terapi 1D11+ kapesitabin+ iksabepilonun üçlü kombinasyonudur.

Sekil 14, toplam akciger metastazlarini gösterir. 1D11 akcigerdeki metastazlarin sayisini inhibe etmemistir ya da kemoterapötiklerin etkililigini arttirmamistir.

Sekil 15, 4T1 birinci tümörlerden izole edilen CD11b* hücrelerinin geçitleme semasini gösterir. (A) Büyüklüge ve serpmeye dayanarak hücrelerin FSC hi geçitleme semasini gösterir. (B) FSC hi geçidi içinden canli hücrelerin canli geçidi (dim, %52). (C) MDSC'Ierin (Gr-1 PE parlak CD11b PerCP Cy5.5 parlak %74.1) ve makrofajlarin (Gr-1 PE dim ve CD11b PerCP Cy5.5 parlak, %15.4) canli geçit içinde geçitlemesi (D) dim, %83) ve M2 makrofajlarinin (F geçitlemesi (E) Gr-1*CD11b* içinden geçitlenen MDC'nin CD206 negatif/düsük statüsünün teyidi.

Sekil 16 ortalama birincil tümör hacimlerini gösterir. Tümör büyümesinin inhibisyonu sadece antikor içeren kohorta kiyasla kapesitabin, iksabepilon ve kapesitabin + iksabepilon kohortlari içinde gözlemlenmistir.

Sekil 17, tek bir ajan olarak 1D11'in 4T1 tümör büyümesi (A) üzerinde hiçbir etkisi bulunmadigini gösterir. 1D11 ayni zamanda kapesitabinin (B) ya da iksabepilonun (C) etkililigini önemli oranda arttirmamistir.

Sekil 18, 1D11'in 4T1 tümör büyümesinin (A) inhibe edilmesinde kapesitabin + iksabepilonun kombinatoryal terapisinin etkililigini arttirdigini gösterir. Kapesitabin 4T1 tümör büyümesini hafifçe inhibe etmistir ancak iksabepilon (B) ile birlestirildiginde daha etkili olmustur. iksabepilon ve kapesitabin+iksabepil0n kombinasyon terapisi arasindaki tümör büyümesi inhibisyonu 1D11 de ayni zamanda kombinatoryal terapiye (C) dahil edilmedikçe benzer olmustur.

Sekil 19, tek bir ajan olarak ya da kapesitabin ve/veya iksabepilon ile kombinasyonlu olarak 4T1 tümör büyümesi üzerinde 1D11'in etkilerinin bir genel incelemesini gösterir.

En etkili terapi 1D11+ kapesitabin+iksabepiIonun üçlü kombinasyonudur.

Sekil 20, 80 4T1 tümörlerini tasiyan farelerde pulmoner metastazlarinin kapesitabin+iksabepilonun kombinasyonlu terapisi ile azaltildigini ve bu tedavinin etkililiginin 1D1 1 'in eklenmesiyle önemli oranda gelistirildigini gösterir.

(F4/80*CD206*) immünofenotiplemesine dayanarak 1D11'in birincil tümörlerdeki makrofajlarin sayisi üzerinde çok az etkiye sahip oldugunu göstermistir. Koyu renk çubuk vehikülü temsil eder; kirmizi renk çubuk 1304 (kontrolü) temsil eder; ve mavi Sekil 22, 1D11 ile tedavi edilen farelerden alinan 4T1 birincil tümörlerinden izole edilen CD11b+ hücrelerinden alinan arginazin kontrol farelerine kiyasla önemli oranda azaltildigini gösterir.

Burada tarif edilen 1D11 bir anti-TGFß monoklonal antikoru temsil eder.

BULUSUN DETAYLI TARIFNAMESI Bulus bir meme kanserinin tedavi edilmesi için bilesimleri ve yöntemleri ile ilgilidir.

Spesifik olarak bulus bir meme kanserini tedavi etmek için bir ya da daha faza kemoterapi ajani ile kombinasyonlu olarak bir TGFß antagonistinin tatbik edilmesi ile ilgilidir. TGFß antagonistinin bir ya da daha fazla kemoterapi ajani ile kombinasyonlu olarak kullanilmasi bir meme kanserini tedavi etmek için bir ya da daha fazla kemoterapi ajaninin etkililigini arttirir.

Bulusun kemoterapi ajanlari arasinda kapesitabin, iksabepilon ya da bunlarin bir kombinasyonu bunlarla sinirli olmaksizin yer alir.

Bir uygulamada, bir süjede bir meme kanserinin tedavi edilmesi için bir kemoterapinin etkililiginin arttirilmasi için bir yöntem tedarik edilmis olup, burada yöntem asagidakileri içerir: adi geçen sujeye kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak bir TGFß antagonistinin bir terapötik olarak etkili miktarinin tatbik edilmesi, burada adi geçen TGFß antagonistinin tatbik edilmesi adi geçen meme kanserini tedavi etmek için kapesitabinin ve iksabepilonun etkililiginin arttirir.

Baska bir uygulamada, bir süjede bir meme kanseri ile iliskili tümör büyümesini inhibe etmek için bir yöntem saglanmis olup, yöntem asagidakileri içerir: adi geçen sujeye kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak bir TGFß antagonistinin bir terapötik olarak etkili miktarinin tatbik edilmesi, burada adi geçen TGFß antagonistinin tatbik edilmesi kapesitabinin ve iksabepilonun adi geçen meme kanseri ile iliskili tümör büyümesini inhibe etmek için etkililigini arttirir.

Mevcut basvurunun mucitleri sasirtici ve beklenmedik bir sekilde, bir ya da daha fazla kemoterapi ajani ile kombinasyonlu olarak TGFß'nin nötralizasyonunun, bir meme kanserini tedavi etmek için bir ya da daha fazla kemoterapi ajaninin etkililigini arttirdigini tespit etmistir. Örnegin kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak TGFß antagonistinin kullanilmasi sasirtici ve beklenmedik bir sekilde kapesitabinin ve iksabepilonun bir meme kanserini tedavi etmek için etkililigini arttirir.

Burada kullanildigi gibi, "TGFß" bütün TGFß izoformlarina atif eder. TGFB (1-5)'in mevcut 5 adet bilinen izoformu vardir ve hepsi homologtur (%60-80 özdeslik) ve hepsi yaklasik 25 kD'lik homodimerleri meydana getirir ve ortak TGFß hücresel reseptörler (Tip I, II ve lll) üzerinde etkilidir. TGFß'nin genetik ve moleküler biyolojisi teknikte çok iyi bilinmektedir (bakiniz örnegin, Roberts, 1998, Miner. Electrolyte and Metab., 24(2- Burada kullanildigi gibi bir "TGFß antagonisti" bir hücre içinde ya da birfizyolojik sistem içinde TGFß'nin miktarini ya da aktivitesini azaltabilen herhangi bir moleküldür.

Tercihen TGFß antagonisti bir TGFß'nin miktarini ya da aktivitesini 1, 2 ya da 3 olarak azaltma islevi görür. Örnegin bir TGFß antagonisti transkripsiyon, translasyon, islem ya da nakil seviyesinde TGFßlnin ekspresyonunu inhibe eden bir molekül olabilir; TGFß'nin stabilitesini ya da prekursör molekülün aktif olgun forma dönüstürülmesini etkileyebilir; TGFß'nin nötralizasyonunu ya da TGFß'nin bir ya da daha fazla hücresel reseptörü (örnegin, Tip l, II ya da III) baglama kabiliyetini etkileyebilir; ya da TGFß sinyallesmesi ile etkilesebilir. Çok çesitli TGFß antagonistleri ve üretim yöntemler teknikte bilinmektedir ve çok daha fazlasi günümüzde gelistirilmektedir (bakiniz örnegin, Dennis ve ark., ABD Pat. No. ,821,227). Kullanilan spesifik TGFß antagonisti sinirlayici bir özellik degildir; burada tanimlandigi gibi herhangi bir etkili TGFß antagonist bu bulusun yöntemlerinde ve bilesimlerinde kullanilabilir. Bir uygulamada, TGFß antagonisti bir TGFß-1, TGFß-2 ya da TGFß-3 antagonistidir. Belirli bir uygulamada TGFß antagonisti, TGFß'nin bir ya da daha fazla Izoformunun baglayan ya da nötralize eden bir pan-spesifik anti-TGFß antikorudur.

TGFß'nin etkilerine aktif TGFßlnin hücreler üzerinde mevcut olan spesifik reseptörlere baglanmasi aracilik eder ve ardindan bu hücrelere sinyal aktarimi yapilir. TGFß antagonistleri, teknikte bilinen TGFß antagonistleri dahil TGFß sinyal aktarimini inhibe eden ajanlar olarak tanimlanir. Örnegin TGFß'yi baglayan ve TGFß`nin bir TGFß reseptörüne baglanmasini önleyen ajanlar TGFß antagonistleri olarak islev görecektir.

TGFß (NAbs),i için spesifik olarak bloklayici (nötralize edici) antikorlar, çözünebilir TGFß reseptörleri, membrana bagli TGFß reseptörleri, bir prekursör TGFß'nin olgun TGFß'ye aktive edilmesinden sorumlu bir proteazi inaktive eden proteaz inhibitörleri, TGFß reseptörlerine özgü ve reseptöre TGFß'nin baglanmasini önleyen antikorlar (Tip Teknikte uzman kisiler içinde bir türden örnegin bir fareden türetilen bir antikorun örnegin bir insan gibi ikinci bir türde terapötik olarak yararli olmasi için yapilandirilabilecegi çesitli yollar oldugunu bilecektir. Bu tekniklerin belirli olanlari Harris TGFß genel olarak bir protein tarafindan tanimli gecikme ile iliskili protein ile kovalent olmayan bir sekilde iliskili TGFßiden meydana gelen bir Iatent prekursör olarak salgilanir (LAP; Harpel ve ark. (1992) Prog. Growth Factor Res. 4: 321'de incelenmistir). TGFß'nin olgun formundan hemen önce sona eren ve bir Cy333 ila Ser33 ikamesini içeren pre-pro- TGFß'ye karsilik gelen bir 278 amino asit peptidini TGFß'yi bagladigi ve bunun gecikmesini sagladigi tespit edilmistir.

TGFß reseptörlerinin çözünebilir formlari da TGFß'yi baglayacaktir ve membran ile iliskili TGFß reseptörlerine baglanmayi önleyecektir. TGFß reseptörleri Wang ve ark. reseptörlerinin çözünebilir formlari teknikte bilinen yöntemlerle hazirlanabilir. Örnegin, bir çözünebilir TGFß baglayici proteinini eksprese edecek bir TGFß reseptörünün transmembran alanini içermeyen delesyon mutantlari hazirlanabilir. Miyazono ve ark.

(Adv. lmmunol. (1994) 55: 181 ), TGFß reseptörlerini incelemistir.

TGFß antagonistlerinin diger türleri de teknikte bilinmektedir. Örnegin, Yamaguchi ve modüle eden küçük bir kondroitin-dermatan sülfat proteoglikani olan dekorini tartisir. aktivitelerini bloke eden protein kinaz inhibitörlerini açiklar. T. cruzi, inaktif TGFß prekursörünü aktif, olgun TGFß'ye dönüstüren bir sistein proteazini (kruzain ya da ilaçlar olarak tasarimi ve kullanimi teknikte çok iyi bilinmektedir (Design of Enzyme 1983, Springer-Verlag); bu yüzden kruzain inhibitörleri hazirlanabilir ve TGFß antagonistleri olarak kullanilacaktir.

Yine baska TGFß antagonistleri ve üretim yöntemleri teknikte çok iyi bilinmektedir ve bunlarin çok daha fazlasi günümüzde gelistirilmektedir. Kullanilan spesifik TGFß antagonisti bir sinirlayici özellik degildir çünkü herhangi bir etkili TGFß antagonisti bu bulusun yöntemlerinde yararli olabilir. Bu tip antagonistlerin örnekleri arasinda TGFßinin (ABD Pat. No. 5,571,714), TGFß reseptörlerinin, fragmanlarinin, türevlerinin bir ya da daha fazla izoformlarina karsi yönlendirilen monoklonal ve poliklonal antikorlari, TGFß reseptörlerine karsi yönlendirilen antikorlari (ABD Patent No.'lari dekorini ve biglikan, fibromodulin, Iumikan ve endoglin gibi diger proteoglikanlari (ABD 6,015,693) içerir.

Bu tip antagonistlerin diger örnekleri arasinda somatostatin (PCT patent basvurusu WO (PCT patent basvurusu WO 97/40848), insülin-benzeri büyüme faktörü Il (PCT patent basvurusu WO , arg-gIy-asp içeren peptitler (ABD Pat. No. , bitki hülasalan, mantarlar ve bakteriler (Avrupa patent basvurusu 813875, Japon patent basvurusu , antisens oligonükleotitleri (ABD Pat. 94/25588) ve SMAD,Iari ve MAD'Iari içeren TGFß sinyallesmesine dahil olan diger (1999)) ve TGFß“nin aktivitesini inhibe etme kabiliyetini muhafaza eden yukaridaki moleküllerden herhangi birinin fragmanlari ve türevleri yer alir.

TGFß reseptörleri ve TGFß reseptörlerinin TGFß-baglayici fragmanlari, özellikle çözünebilir fragmanlar mevcut bulusun yöntemlerindeki yararli TGFß antagonistleridir.

TGFß reseptörleri ve bunlari kodlayan nükleik asitler teknikte çok iyi bilinmektedir.

TGFß tip 1 reseptörünü kodlayan insan nükleik asit sekansi örnegin Donahoe ve ark. açiklanmistir. TGFß tip 2 reseptörünün insan nükleik asit sekansi örnegin GenBank kamuya açiktir. TGFß tip 2 reseptörünün insan nükleik asit sekansi da örnegin kamuya açiktir.

Tercih edilen bir uygulamada TGFß antagonisti, reseptörüne TGFß baglanmasini bloke eden bir antikordur ya da Fab, Fab', F(ab')2 fragmanlari, Fv fragmanlari, tek zincirli antikorlar ve TGFß'ye baglanma kabiliyetini muhafaza eden diger “antikor” formlari gibi bunlara ait fragmanlardir. Bir uygulamada, antikor bir pan-spesifik anti-TGFß antikorudur. Bir örnekte pan-spesifik anti-TGFß antikoru, TGFß'nin bir ya da daha fazla izoformuna baglanir ve bunlari nötralize eder. Baska bir örnekte pan-spesifik anti-TGFß antikoru, TGFß'nin bir ya da daha fazla izoformuna bir proteinin baglanmasini bloke ya da inhibe eder.

Bir uygulamada antikor, bir monoklonal antikordur. Baska bir uygulamada antikor bir insan antikorudur. Baska bir uygulamada antikor bir insanlastirilmis antikordur. Baska bir uygulamada antikor bir kimerik antikordur. Belirli bir uygulamada antikor, ATCC numarasi altinda kayit edilmis mürin monoklonal antikoru 1D11'in bir insancillastirilmis formudur. Baska bir belirli uygulamada antikor, buraya tamamen Baska bir belirli uygulamada antikor 11/350,906 no'lu ABD Patent basvurusunda tarif edilen 1D11'in bir ya da daha fazla CDR'sini içerir.

Burada kullanildigi gibi "antikor" terimi, 4 polipeptit zincirini, iki agir (H) zincirini ve disülfit baglari ile birbirlerine birlestirilmis iki hafif (L) zincirini içeren degistirilmemis immünoglobülin moleküllerini içerir. Her bir agir zincir (burada VH olarak kisaltilan) bir agir zincir degisken bölgesinden ve bir agir zincir sabit bölgesinden meydana gelir. Agir zincir sabit bölgesi CH1, CH2 ve CH3 olmak üzere üç alani içerir. Her bir hafif zincir (burada VL olarak kisaltilan) bir hafif zincir degisken bölgesinden ve bir hafif zincir sabit bölgesinden meydana gelir. Herhangi bir omurgali türünden elde edilen antikorlarin hafif zincirleri, sabit alanlarinin amino asit sekanslarina bagli olarak kappa (K) ve zincirlerinin degisken bölgelerine burada VK olarak atif edilir, burada kullanildigi gibi VL ifadesinin hem kappa tipi hafif zincirlerden (VK) hem de Iambda tipi hafif zincirlerden alinan degisken bölgeleri içermesi amaçlanir. Hafif zincir sabit bölgesi bir CL alanindan meydana gelir. VH ve VL bölgeleri daha korunmus, süreli çerçeve bölgeleri (FR) olan bölgelerin arasina serpistirilen tamamlayicilik belirleme bölgeleri (CDR'Ier) adi verilen hiper degiskenlik bölgelerini içerir. Her bir VH ve VL, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FR4 siralamasinda amino-ucundan karboksi ucuna kadar düzenlenir. "CDRH1" bir antikor agir zincirindeki birinci CDR bölgesine atif eder, "CDRH2" bir antikor agir zincirindeki ikinci CDR bölgesine atif eder ve "CDRH3" bir antikor agir zincirindeki üçüncü CDR bölgesine atif eder. "CDRL1" bir antikor hafif zincirindeki birinci CDR bölgesine atif eder, "CDRL2" bir antikor hafif zincirindeki ikinci CDR bölgesine atif eder ve "CDRL3" bir antikor hafif zincirindeki üçüncü CDR bölgesine atif eder.

Agir zincirlerinin sabit alaninin amino asit sekansina bagli olarak, antikorlar farkli siniflara tayin edilebilir. El degmemis antikorlarin 5 ana sinifi vardir: lgA, IgD. IgE, IgG ve IgM. Bunlarin birçogu ayrica alt siniflara (izotiplere) ayrilabilir, örnegin lgG1, IgGZ, alanlarina sirasiyla alfa (d), delta (A), epsilon (s), gama (y) ve mu (u) adi verilir.

Immünoglobülinlerin farkli siniflarinin alt bitim yapilari ve üç boyutlu konfigürasyonlari çok iyi bilinmektedir. Mevcut bulus, yukarida belirtilen siniflardan ya da alt siniflardan (izotiplerden) herhangi birinin antikorlarini içerir.

Burada kullanildigi gibi “antikor” teriminin ayni zamanda el degmemis antikorlari, antijeni baglayan fonksiyonel fragmanlari ve bunlara ait antijen baglayan varyantlari kapsamasi amaçlanir, bunlar antikor mimetiklerini içerir ya da bir antikorun ya da belirtilen fragmaninin ya da kisminin yapisini ve/veya islevini taklit eden antikorlarin kisimlarini içerir; burada her biri en az bir CDR içerir. Bulusun antikorlari bir, iki, üç, dört, bes, alti ya da daha fazla CDR bölgesine sahip antikor fragmanlarini ya da varya ntlarini içerir.

Mevcut bulusun kapsadigi antikor fragmanlari arasinda Fab (örn., papain sindirimi yoluyla), Fab', F(ab')2, facb (örn., plazmin sindirimi yoluyla), pFc' (örn., pepsin ya da plazmin sindirimi yoluyla), Fd (örn., pepsin sindirimi, kismi azaltma ve yeniden topaklanma yoluyla), sVds ve Fv ya da scFv (örn., moleküler biyoloji teknikleriyle).

Antikor fragmanlarinin ayni zamanda alandan silinmis antikorlari, diyabodiler, triyabodileri, dogrusal antikorlari, tek Zincirli antikor moleküllerini (yani kamelize antikorlari) ve antikor fragmanlarindan meydana gelen multispesifik antikorlari içermesi amaçlanir.

Burada kullanildigi gibi “antikor" terimi ayni zamanda “kimerik antikorlari içerir, burada agir ve/veya hafif zincirin bir kismi bir belirli türden türetilen ya da bir belirli antikor sinifina ya da alt sinifina ait olan antikorlardaki karsilik gelen sekanslarin özdesidir ya da benzeridir ancak zincir(ler)in geri kalani baska bir türden (örnegin fare ya da siçan) türetilen ya da baska bir antikor sinifina ya da alt sinifina ait olan antikorlardaki ve ayrica istenen biyolojik aktiviteyi sergiledikleri sürece bu tip antikorlarin fragmanlarindaki karsilik gelen sekanslarla özdestir ya da homologtur. Bu yüzden mevcut bulus örnegin bir kimerik agir zinciri ve/veya bir kimerik hafif zinciri içeren kimerik antikorlari içerir. Kimerik agir zincir, burada tarif edilen agir zincir degisken (VH) bölgelerinden ya da bir insan disi antikorun bir agir zincir sabit bölgesine birlestirilen bunlara ait mutantlardan ya da varyantlardan herhangi birini içerebilir. Kimerik hafif zincir, burada tarih edilen hafif zincir degisken (VL) bölgelerinden herhangi birini ya da bunlarin bir insan disi antikorun bir hadid zincir sabit bölgesine birlestirilen mutantlarini ya da varyantlarini içerebilir.

Bulusun antikorlari ayni zamanda, insan disi bir türden alinan bir ya da daha fazla tamamlayicilik belirleme bölgesine ve bir insan immünoglobülin molekülünden alinan çerçeve bölgelerine sahip olan antikor molekülleri olan “insancillastirilmis antikorlari” içerir. Siklikla insan çerçeve bölgelerindeki çerçeve kalintilari antijen baglanmasini degistirmek ya da iyilestirmek için CDR donör antikorundan alinan karsilik gelen kalinti ile ikame edilecektir. Bu çerçeve ikameleri belirli pozisyonlarda beklenmedik çerçeve kalintilarini tanimlamak için antijen baglanmasi ve sekans kiyaslamasi için önemli olan çerçeve kalintilarini tanimlamak için CDR ve çerçeve kalintilarinin etkilesimlerinin modellenmesi ile oldugu gibi tanimlanmis standart tekniklerdir. Antikorlar CDR- greftlemesini, kaplamasini ya da yeniden yüzey olusturmayi ve zincir karmasini içeren çok çesitli teknikler kullanilarak insancillastirilabilir.

Burada kullanildigi gibi “insan antikoru" terimi, insan germ hatti immünoglobülin sekanslarina karsilik gelen degisken ve sabit bölgelere sahip olan antikorlari içerir.

Bulusun insan antikorlari, örnegin CDR'Ierde olmak üzere insan germ hatti immünoglobülin sekanslari (örnegin in vitro rastgele ya da alana özgü mutajenez ya da in vivo somatik mutasyon yoluyla uygulanan mutasyonlar) tarafindan kodlanmayan amino asit kalintilarini içerebilir. Insan antikoru, örnegin insan germ hatti immünoglobülin sekansi tarafindan kodlanmayan amino asit kalintisini arttiran bir aktivite ile yer degistiren en az bir pozisyona sahip olabilir. Bununla birlikte burada kullanildigi gibi “insan antikoru" teriminin bir fare gibi baska bir memeli türünün germ hattindan türetilen CDR sekanslarinin insan çerçeve sekanslarinin üzerine greftlendigi antikorlari içermesi amaçlanmaz. olusturulan ya da izole edilen insan antikorlarini, yani bir konak hücrenin içine transfekte edilen bir rekombinant ekspresyon vektörü kullanilarak eksprese edilen antikorlari, bir rekombinant, kombinatoryal insan antikoru kütüphanesinden izole edilen antikorlari, insan immünoglobülin genleri için transgenik olan bir hayvandan izole edilen antikorlari ya da insan immünoglobülin gen sekanslarinin diger DNA sekanslarina ayrilmasini içeren herhangi baska bir yolla hazirlanan, eksprese edilen, olusturulan ya da izole edilen antikorlari içerir. Bu tip rekombinant insan antikorlari insan germ hatti immünoglobülin sekanslarindan türetilen degisken ve sabit bölgelere sahiptir.

Burada kullanildigi gibi “monoklonal antikor” terimi, büyük oranda homojen antikorlarin bir popülasyonundan elde edilen bir antikora atif eder, örnegin popülasyonu içeren bireysel antikorlar olasi dogal olarak meydana gelen mutasyonlar ya da mevcut olabilen küçük translasyon sonrasi varyasyonlar haricinde büyük oranda özdestir.

Monoklonal antikorlar, (ayni zamanda belirleyici ya da epitop olarak bilinen) tek bir antijenik alana yönlendirilmis olarak büyük oranda spesifiktir. Ayrica tipik olarak farkli belirleyicilere karsi yönlendirilmis farkli antikorlari içeren konvansiyonel (poliklonal) antikor preparasyonlarinin tam aksine her bir monoklonal antikor antijenin üzerindeki tek bir belirleyiciye karsi yönlendirilir. Modifiye edici “monoklonal” antikorlarin büyük oranda homojen bir popülasyonundan elde edilen antikorun karakterini gösterir ve herhangi bir belirli yöntemle antikorun üretimini gerektirdigi düsünülmemelidir.

Antikorlar ayni zamanda agir ve/veya hafif zincirin degisken ya da hiper degisken bölgelerinin amino asit sekansina büyük oranda benzer olan amino asit sekanslarina sahip olan polipeptitleri içerir. Büyük oranda ayni amino asit sekansi burada Pearson arastirma yöntemi ile belirlendigi gibi bir kiyaslanan amino asit sekansi ile en az %70, tanimlanmistir.

Bulusun antikorlari, bir ya da daha fazla koruyucu amino asit ikamesi haricinde burada tanimlananlarla özdes olanlari içerir. Koruyucu amino asit ikamesi, bir peptidin, polipeptidin ya da proteinin ya da fragmaninin bir ya da iki amino asidinin degistirilmesi yoluyla amino asit bilesimindeki bir degisiklik olarak tanimlanir. Genel olarak benzer özelliklere sahip amino asitlerde ikame yapilmistir (örnegin asidik, bazik, aromatik, büyüklük, pozitif ya da negatif yüklü, polariteli, polaritesiz) öyle ki ikameler peptit, polipeptit ya da protein karakteristiklerini (örnegin, yük, izoelektrik nokta, afinite, avidite, konformasyon, çözünürlük) ya da aktivitesini büyük oranda degistirmez. Bu tip koruyucu amino asit ikamesi için gerçeklestirilebilen tipik ikameler asagidaki gibi amino asit gruplarinin arasinda olabilir: glisin (G), alanin (A), valin (V), Iösin (L) ve izolösin (l); aspartik asit (D) ve glutamik asit (E); alanin (A), serin (S) ve treonin (T); histidin (H), lisin (K) ve arginin (R); asparagin (N) ve glutamin (Q): fenilalanin (F), tirozin (Y) ve triptofan (W).

Koruyucu amino asit ikameleri CDR ya da çerçeve bölgelerinde, örnegin molekülün seçici ve/veya spesifik baglama karakteristiginden esasen sorumlu olan hiper degisken bölgelerin yaninda bulunan bölgelerde ve ayrica molekülün diger kisimlarinda örnegin degisken agir zincir kasetinde yapilabilir.

Mevcut bulusun antikorlari ayni zamanda afiniteleri dogrudan mutasyon, afinite olgunlastirmasi, faj görüntülemesi ya da zincir karmasi yoluyla arttirilan ya da degistirilen antikorlari da içerir. Afinite ve spesifisite CDR ve/veya çerçeve kalintilarinin mutasyona ugratilmasi ve istenen karakteristiklere sahip antijen baglayici alanlar için tarama yapilmasi yoluyla modifiye edilebilir ya da iyilestirilebilir. Bunun bir yolu da bireysel kalintilarin ya da kalinti kombinasyonlarinin randomize edilmesidir, böylece iki ila yirmi arasindaki amino asit alt setlerin bir popülasyonunda aksi halde özdes antijen baglayici alanlarda bulunur. Alternatif olarak mutasyonlar PCR yöntemleri kullanilarak çesitli kalintilarin üzerinde indüklenebilir. Baska bir Örnekte, agir ve hafif degisken bölge genleri E. coli'nin mutasyonlu suslarinda çogaltilabilir.

Zincir karmasi yoluyla hazirlanan antikorlar arasinda agir ya da hafif zincirin burada açiklanan diger agir ya da hafif zincirlerle rastgele çift haline getirildigi antikorlari içerir.

Bu yüzden bulusun antikorlari agir ve hafif zincirlerin (tam uzunluklu ya da kismi olarak) herhangi bir kombinasyonunu içerir.

Mevcut bulusun antikorlari TGFß için spesifiktir. Antikor spesifisitesi bir antijenin belirli bir epitopu için antikorun seçici tanimlamasina atif eder. Antikorlar hem türleri hem de molekül seçiciligini sergileyebilir ya da sadece molekül bakimindan seçici olabilir ve birden fazla türün TGFß'sine baglanabilir. Bulusun antikorlari insan, mürin, siçan, köpek ve/veya tavsan TGFß'sine baglanabilir. Bir antikorun spesifik olarak bir TGFß'ye baglanip baglanmamasi örnegin bir antijen panelini kullanan bir ELISA gibi bir baglayici miktar tayini ile belirlenebilir.

Antikorlarin spesifisitesi afiniteye ve/veya aviditeye dayanarak belirlenebilir. Bir antijenin bir antikor (Kd) ile ayrilmasi için esitlik sabiti ile temsil edilen afinite, bir antijenik belirleyici ve bir antijen baglayici alan arasindaki baglanma direncini ölçer.

Avidite bir antikor ve antijeni arasindaki baglanma direncinin ölçümüdür. Avidite hem bir epitop ve antikor üzerindeki antijen baglayici alani arasindaki afinite hem de belirli bir epitopun antijen baglayici alanlarinin sayisina atif eden antikorun valansi ile ilgilidir.

Antikorlar tipik olarak yaklasik 10'5 ila yaklasik 10'11 litre/mol (ör., KD < arasindaki bir ayrisma sabiti (Ka) ile baglanir. Yaklasik 10'4 Iitre/mol'den daha düsük herhangi bir Kd'nin genel olarak spesifik olmayan baglanmayi gösterdigi düsünülür.

Kd'nin degeri ne kadar düsükse, bir antijenik belirleyici ve antikor baglayici alan arasindaki baglanma direnci o kadar güçlü olur.

Bulusun antikorlari, tercihen yaklasik 1 X 10'8 M'1 ya da daha az, daha tercihen yaklasik çok tercihen yaklasik 1 x 10“11 M“1 ya da daha az olan bir Kd ile TGFßiye baglanir.

Mevcut bulusun antikorlari monospesifik, bispesifik ya da multispesifik olabilir.

Monospesifik antikorlar sadece bir antijene baglanir. Bispesifik antikorlar (BsAbs) iki farkli antijen baglama spesifisitesine ya da alanina sahip olan antikorlardir.

Multispesifik antikorlar ikiden fazla farkli antijen baglayici spesifisiteye ya da alana sahiptir. Burada bir antikor, ikiden fazla farkli antijen baglayici spesifisiteye ya da alana sahiptir. Bir antikorun birden fazla spesifisiteye sahip oldugu yerde, kabul edilen epitoplar tek bir antijenle ya da birden fazla antijenle iliskili olabilir.

Bulusun baska bir yönünde, antikor dogrudan ya da dolayli olarak baska bir kisma konjuge edilir. konjugasyonu kimyasal ya da biyosentetik olabilir. Antikorlara konjugatlanabilen diger kisimlar arasinda toksinler, anti-tümör ajanlari, saptanabilir etiketler, hedef kisimlar ve raportör kisimlar yer alir. Uygun toksinler burada tarif edilir.

Bir uygulamada bulusun bir ya da daha fazla kemoterapi ajani faal olarak antikora baglanir. Örnegin kapesitabin, iksabepilon ya da her ikisi de anti-TGFß antikoruna konjuge edilebilir.

Saptanabilir etiketlere konjuge edilen antikorlar örnegin bir hastaligi teshis etmek, prognoza yardim etmek ve in vivo ya da in vitro olarak tümör hücrelerinin yerini tespit etme için kullanilabilir. Saptanabilir etiket harici yollarla saptanabilen bir ölçülebilir sinyal üretir. Saptanabilir etiketler arasinda bir enzim, bir kromofor, bir radyoizotop ya da isigi floresan, fosforesan ya da kemiluminesan yoluyla yayan bir madde yer alir.

Uygun enzimler arasinda, bayir turpu peroksidazi, alkalin fosfataz, ß-galaktosidaz ve asetilkolinesteraz yer alir. kromoforlar ultraviyole ya da görülebilir bölgede isigi absorbe eden boyalari içerir ve bunlar enzimle katalize edilmis reaksiyonlarin substratlarin ya da degradasyonu ürünleri olabilir. Uygun floresan materyalleri arasinda umbeliferon, floresan, floresan izotiyosiyanat, rodamin, diklorotriaznilamin floresan, dansil klorür ya da fikoeritrin yer alir. Uygun kemiluminesan materyalleri arasinda Iuminol, lusiferaz, Hedef kisimlar, baglayici çiftlerin birinci elemanlaridir. Anti-tümör ajanlari örnegin bu tip çiftlerin ikinci elemanlarina konjuge edilebilir ve bu nedenle antijen-baglayici proteinin baglandigi alana yönlendirilir. Bu sekilde bir baglayici çiftin ortak bir örnegi avidin ve biyotindir. Biyotin bulusun bir antikoruna konjuge edilebilir bu yüzden avidine ya da streptavidine konjuge edilen bir anti-tümör ajani ya da baska kisim için bir hedefi tedarik eder. Alternatif olarak biyotin ya da bu sekilde baska bir kisim bulusun bir antijen baglayici proteinine baglanir ve bir raportör olarak kullanilir, örnegin bir saptanabilir etiket avidine ya da streptavidine konjuge edilir.

Mevcut bulus ayni zamanda bir anti-TGFß antikorunu ya da bir kismini kodlayan nükleik asit moleküllerini içerir. Nükleik asitler, VH bölgelerinin ya da bir kisminin herhangi birini ya da burada tarif edildigi gibi herhangi bir varyantini içeren VH CDR'Ierin herhangi birini içeren bir antikor agir zincirini kodlayabilir. Bulus ayni zamanda VL bölgelerinin ya da bir kisminin herhangi birini ya da burada tarif edildigi gibi herhangi bir varyantini içeren VL CDR'Ierin herhangi birini içeren bir antikor hafif zincirini içeren bir antikor hafif zincirini kodlayan nükleik asit moleküllerini de içerir.

Belirli uygulamalarda, nükleik asit hem bir agir hem de hafif zinciri ya da bölümlerini kodlar.

Bulus ayni zamanda burada tarif edilen nükleik asit moleküllerinin herhangi birini içeren rekombinant vektörleri içerir. Vektör sadece bir antikor zincirini ya da bir bölümünü (örnegin agir ya da hafif zinciri) kodlayan bir nükleik asidi ya da her iki antikor zincirini ya da kismini kodlayan bir nükleik asidi içerebilir. Örnek vektörler arasinda, plazmitler, fajemitler, kozmitler, virüsler ve faj nükleik asitleri ya da bir prokaryotik ya da ökaryotik konakta çogalabilen diger nükleik asit moleküllerini içerir. Vektörler tipik olarak ampisilin ya da neomisin gibi antibiyotiklere direnç saglanmasi gibi dönüstürülen konaklarin seçilmesi için bir fenotipik niteligi saglamak için bir markörü içerir.

Vektör bir ekspresyon vektörü olabilir, burada antikoru kodlayan nükleik asit faal olarak bir ekspresyon kontrol sekansina baglanir. Tipik ekspresyon vektörleri transkripsiyon ve translasyon sonlandiricilarini, baslatma sekanslarini ve bulusun nükleik asit moleküllerinin ekspresyonunun düzenlenmesi için yararli promotörleri içerir. Vektörler ayni zamanda bir bagimsiz sonlandirma sekansini için genetik ekspresyon kasetlerini de içerebilir, burada sekanslar hem ökaryotlarda hem de prokaryotlarda vektörün yani hem prokaryotik hem de ökaryotik sistemler için karsilikli vektörlerin ve seçim markörlerinin replikasyonuna izin verir. Vektörler hem bir agir hem de hafif zinciri ya da kisimlarini kodlayan nükleik asitleri içerdigi zaman, agir zinciri kodlayan nükleik asit ayni ya da ayri bir promotör altinda olabilir. Ayri promotörler özdes olabilir ya da farkli promotör tipleri olabilir.

Uygun promotörler arasinda yapitasi promotörler ve indüklenebilir promotörler vardir.

Temsili ekspresyon kontrol sekanslari/promotörleri arasinda /ac sistemi, trp sistemi, tac sistemi, trc sistemi, Iambda fajinin ana operatör ve promotör bölgeleri, fd kaplama proteininin kontrol bölgesi, glikolitik maya promotörleri, örnegin 3-fosfogliserat kinaz için promotör, maya asit fosfatazinin promotörleri, örnegin, Ph05, maya alfa eslestirme faktörlerinin promotörleri, insan sitomegalovirüsünden türetilen promotörler, metalotiyonin promotörü, mürin memeli tümörü virüs promotörü, Rous sarkoma virüs promotörü, polihedrin promotörü ve poliyomadan, adenovirüstan, retrovirüsten ve maymun virüsünden türetilen promotörler, örnegin 8V40'in erken ve geç promotörleri yer alir.

Bulus ayni zamanda bulusun bir nükleik asit molekülünü ya da bir vektörünü içeren hücreler ya da organizmalar gibi insan disi konaklari da içerir. “Konak” terimi ile anlatilmak istenen bir insan disi tek hücreli ya da çok hücreli organizmadir ya da bir bir hücreye ya da hücre popülasyonuna atif eder. “Bir konak hücre popülasyonu” içine bulusun bir nükleik asit molekülünün ya da vektörünün uygulanabildigi ve eksprese edilebildigi bir kültürlenmis hücre grubuna atif eder. Konak tek bir zinciri ya da porsiyonunu (örnegin agir ya da hafif zinciri) kodlayan bir nükleik asidi ya da vektörü içerir; ya da ayni ya da ayri nükleik asitleri ve/veya vektörleri olmak üzere her iki zinciri ya da porsiyonunu kodlayan bir nükleik asidi ya da vektörü içerebilir.

Mevcut bulusun bir konagi prokaryotik ya da ökaryotik olabilir. Uygun prokaryotik E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI ve E. coli MRC1, Pseudomonas, BaciI/us, yani Baci'l/us subtilis ve Streptomyces yer alir. Uygun ökaryotik hücreler arasinda maya ve diger mantarlar, böcek hücreleri, bitki hücreleri, insan hücreleri ve hayvan hücreleri yani memeli hücreleri yani hibridom çizgileri, COS hücreleri, N80 hücreleri ve CHO hücreleri yer alir.

Bulus ayni zamanda mevcut bulusun bir antikorunu üretmek için yöntemleri içerir, bu yöntemler mevcut bulusun bir antikorunu kodlayan bir ya da daha fazla nükleik asit sekansini eksprese eden bir konak hücrenin kültürlenmesini ve kültür vasatindan antikorun geri kazanilmasini içerir. Belirli uygulamalarda antikor kültür vasatindan ayristirilarak saflastirilir. Bir zincirden fazlasini içeren antikorlar her bir zincirin ayni konakta birlikte eksprese edilmesiyle; ya da kültür vasatindan geri kazanma öncesinde ya da sonrasinda monte edilen ayri zincirler olarak üretilebilir.

Diger TGFß antagonistlerini yapma yöntemleri yukarida tarif edildigi gibi teknikte çok iyi bilinmektedir.

Kapesitabin genel olarak ABD Pat. No. 4,966,891'de tarif edilmistir ve spesifik olarak ABD Pat. No. 5,472,949'da tarif edilmistir. Farmasötik bilesimlerde Roche Laboratories saglayan çesitli sentetik prosesler teknikte bilinmektedir örnegin kapesitabin yapma yöntemleri buraya tamamen referans yoluyla eklenen ABD Patent basvurusu Yayini Iksabepilon yapma yöntemleri de teknikte çok iyi bilinmektedir. Örnegin iksabepilon içeren enterik kapli boncuk ve bunun preparasyonu ve tatbiki buraya tamamen referans Baska bir uygulamada burada bir süjedeki meme kanserini tedavi etmek için bir farmasötik bilesim tedarik edilmis olup: bir TGFß antagonistinin, kapesitabinin ve/veya iksabepilonun bir terapötik olarak etkili miktarini içerir, burada adi geçen TGFß antagonisti, adi geçen meme kanserini tedavi etmek için kapesitabinin ve/veya iksabepilonun etkililigini arttirmak için etkili bir miktarda mevcuttur. Bazi uygulamalarda, bir birinci farmasötik bilesim bir TGFß antagonistini içerir, bir ikinci farmasötik bilesim kapesitabini içerir ve bir üçüncü farmasötik bilesim iksabepilonu içerir. Bu tek tek ve ayri bilesimler bagimsiz olarak ya da birlikte tatbik edilebilir.

Bulus ayni zamanda bu bulusun antikorunu, nükleik asidini, vektörünü, konak hücresini ya da kemoterapi ajanlarini ve bir ya da daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilari içeren bir farmasötik bilesimi saglar. “Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar” kullanilan dozajlarda ve konsantrasyonlarda bunlara maruz kalan hücre ya da memeli için zehirsiz olan herhangi bir eksipiyani içerir. Farmasötik bilesim bir ya da daha fazla ilave terapötik ajani içerebilir.

Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar arasinda çözücüler. dispersiyon vasati. tamponlar, kaplamalar, antibakteriyel ve antifungal ajanlar, islatma ajanlari, koruyucular, karistiricilar, selatlama ajanlari, antioksidanlar, izotonik ajanlar ve absorpsiyonu geciktirici ajanlar yer alir.

Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar arasinda su; tuzlu su; fosfat tamponlu tuzlu su; dekstroz; gliserol; alkoller yani etanol ve izopropanol; fosfat, sitrat ve diger organik asitler; askorbik asit; düsük moleküler agirlikli (yaklasik 10 kalintidan az) polipeptitler; proteinler yani serum albümin, jelatin ya da immünoglobülinler; hidrofilik polimerler yani polivinilpirolidon; amino asitler yani glisin, glutamin, asparagin, arginin ya da Iisin; monosakkaritler, disakkaritler ve glikoz, mannoz ya da dekstrinleri içeren diger karbonhidratlar; EDTA; tuz Olusturucu ters yükünler yani sodyum; ve/veya non-iyonik sürfaktanlar yani TWEEN, polietilen glikol (PEG) ve PLURONICS; izotonik ajanlar yani sekerler, polialkoller yani manitol ve sorbitol ve sodyum klorür; ve ayrica bunlarin kombinasyonlari yer alir. Antibakteriyel ve antifungal ajanlar arasinda parabenler, klorobütanol, fenol, askorbik asit ve timerosal yer alir.

Bulusun farmasötik bilesimleri sivi çözeltiler (örnegin enjekte edilebilir ya da zerk edilebilir çözeltiler), dispersiyonlar ya da süspansiyonlar, tabletler, haplar, tozlar, yollarda formüle edilebilir. Bazi uygulamalarda bilesimler enjekte edilebilir ya da zerk edilebilir çözeltiler formundadir. Bilesim oral, intravenöz, intra-arteriyel, intramuskular, subkütanöz, parenteral, transmukozal, transdermal ya da topikal tatbik için uygun bir formdadir. Bilesim bir ani, kontrollü, uzatilmis ya da geciktirilmis salimli bilesim olarak formüle edilebilir.

Parenteral tatbik için preparasyonlar arasinda steril sulu ya da susuz çözeltiler, süspansiyonlar ve emülsiyonlar yer alir. Susuz çözücü örnekleri arasinda propilen glikol, polietilen glikol, zeytinyagi gibi bitkisel yaglar ve etil oleat gibi enjekte edilebilir organik esterler yer alir. 8qu tasiyicilar arasinda su, alkollü/sulu çözeltiler, emülsiyonlar ya da süspansiyonlar yani tuzlu su ve tamponlu vasat yer alir. Mevcut bulusta farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar 0.01-01M ve tercihen 0.05M fosfat tamponunu ya da %0.8 tuzlu suyu bunlarla sinirli olmaksizin içerir. Diger yaygin parenteral vehiküller arasinda sodyum fosfat çözeltileri, Ringer'in dekstrozu, dekstroz ve sodyum klorür, Laktatli Ringer ya da uçmaz yaglar yer alir. intravenöz vehiküller arasinda sivi ve besleyici tazeleyiciler, elektrolit tazeleyiciler yani Ringer dekstrozuna dayananlar ve benzerleri yer alir. Örnegin antimikrobiyaller, antioksidanlar, selatlama ajanlari ve soy gazlar ve benzerleri gibi koruyucular ve diger katki maddeleri de ayni zamanda mevcut olabilir.

Daha özellikle enjekte edilebilir kullanim için uygun farmasötik bilesimler arasinda steril sulu çözeltiler (burada suda çözülebilir) ya da steril enjekte edilebilir çözeltilerin ya da dispersiyonlarin ekstemporanöz preparasyonu için dispersiyonlar ve steril tozlar yer alir. Bu durumlarda bilesim steril olmalidir ve kolay siringalanabilmenin mevcut oldugu derecede akiskan olmalidir. Üretim ve saklama kosullari altinda stabil olmalidir ve tercihen bakteriler ve mantarlar gibi mikro organizmalarin kirletici etkisine karsi korunacaktir. Tasiyici örnegin su, etanol, poliyol (örnegin gliserol, propilen glikol ve sivi polietilen glikol ve benzerleri) ve bunlara ait uygun karisimlari içeren bir çözücü ya da dispersiyon vasati olabilir. Düzgün akiskanlik Örnegin Iesitin gibi bir kaplamanin kullanilmasi, dispersiyon durumunda gereken parçacik büyüklügünün muhafaza edilmesi ve sürfaktanlarin kullanilmasi yoluyla muhafaza edilebilir. Burada açiklanan terapötik yöntemlerde kullanim için uygun formülasyonlar Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16th ed. (1980)'de tarif edilir.

Bazi uygulamalarda bilesim izotonik ajanlari örnegin sekerleri, polialkolleri yani manitolü, sorbitolü ya da sodyum klorürü içerir. Enjekte edilebilir bilesimlerin süresi uzatilmis absorpsiyonu, bilesimin içine örnegin alüminyum monostearat ve jelatin gibi absorpsiyonu geciktiren bir ajanin eklenmesiyle gerçeklestirilebilir.

Steril enjekte edilebilir çözeltiler, burada siralanan bir ya da daha fazla içerik kombinasyonu ile uygun bir çözücü içinde gereken miktarda molekülün kendisinin ya da baska aktif ajanlarla kombinasyonlu olarak eklenmesiyle ve ardindan gerektigi gibi sterilizasyonla filtrelenmesiyle hazirlanabilir. Genel olarak dispersiyonlar aktif bilesigin bir steril vehikül içine eklenmesiyle hazirlanir, bu vehikül bir bazik dispersiyon vasatini ve yukarida numaralandirilanlarin arasindan gereken diger içerikleri içerir. Steril enjekte edilebilir çözeltilerin preparasyonu için steril toz durumunda bir preparasyon yöntemi de vakumla kurutma ve dondurarak kurutma olup, bir aktif içerigin bir tozunu arti bunun önceden steril olarak filtrelenmis bir çözeltisinden herhangi bir Ilave istenen içerigi verir. Enjeksiyon preparasyonlari islenir, ampuller, torbalar, siseler, siringalar ya da viyaller gibi kaplara doldurulur ve teknikte bilinen yöntemlere uygun olarak aseptik kosullar altinda sizdirmaz hale getirilir. Ayrica preparasyonlar buraya tamamen gibi bir kit formunda ambalajlanabilir ve satilabilir. Bu tip üretim maddeleri tercihen otoimmün ya da neoplastik rahatsizliklardan muzdarip olan ya da yatkinlasan bir süjenin tedavi edilmesi için yararlidir.

Burada tarif edildigini gibi rahatsizliklarin ya da hastaliklarin tedavi edilmesi için mevcut bulusun bilesimlerinin etkili dozlari tatbik yollari, hedef alan, hastanin fizyolojik durumu, hastanin insan ya da bir hayvan olmasi, tatbik edilen diger ilaçlar ve tedavinin profilaktik ya da terapötik olup olmamasi gibi birçok farkli faktöre dayanarak degisir.

Genellikle hasta bir insandir ancak transgenik memelileri içeren insan disi memeliler de tedavi edilebilir. Tedavi dozajlari, güvenliligi ve etkililigi optimize etmek için teknikte uzman kisilerce bilinen rutin yöntemler kullanilarak titratlanabilir.

Bulusun farmasötik bilesimleri bir “terapötik olarak etkili miktari" içerebilir. Bir “terapötik olarak etkili miktar” istenen terapötik sonucu basarmak için etkili bir miktara, dozajlara ve sürelere atif eder. Bir molekülün terapötik olarak etkili bir miktari, hastaligin durumu, yas, cinsiyet ve bireyin agirligi ve molekülün bireye istenen bir yaniti saglama kabiliyeti gibi faktörlere göre degisebilir. Terapötik olarak etkili bir miktar ayni zamanda içinde molekülün herhangi bir toksik ya da zararli etkisinin terapötik olarak yararli etkilerin gerisinde kaldigi bir miktardir.

Bulus ayrica bir TGFß antagonistinin, kapesitabinin, iksabepilonun ya da bunlarin kombinasyonunun terapötik olarak etkili bir miktarini içeren bir kiti saglar.

Bulus ayrica bir TGFß antagonistinin, kapesitabinin, iksabepilonun ya da bunlarin kombinasyonunun terapötik olarak etkili bir miktarinin ihtiyaci olan bir memeliye tatbik edilmesini içeren bir hastaligin ya da rahatsizligin tedavi edilmesi için yöntemleri Burada kullanildigi gibi “tedavi etmek” ve “tedavi” terimleri, profilaktik ya da koruyucu önlemleri içeren terapötik tedaviye atif eder, burada amaç bir hastalik ya da rahatsizlikla iliskili bir istenmeyen fizyolojik degisikligi önlemektir ya da yavaslatmaktir (azaltmaktir). Yararli ya da tercih edilen klinik sonuçlarin arasinda semptomlarin hafifletilmesi, bir hastaligin ya da rahatsizligin derecesinin azaltilmasi, bir hastaligin ya da rahatsizligin stabilizasyonu (yani bir hastaligin ya da rahatsizligin kötülesmemesi), bir hastaligin ya da rahatsizligin ilerlemesinin gecikmesi ya da yavaslamasi, hastaligin ya da rahatsizligin iyilesmesi ya da palyasyonu ve saptanabilir olsun ya da olmasin bir hastaligin ya da rahatsizligin (kismen ya da tamamen) hafiflemesi yer alir. “Tedavi” ayni zamanda tedavi alinmamasi halinde beklenen sag kalima kiyasla sag kalimin uzatilmasi anlamina da gelebilir. Tedaviye ihtiyaç duyanlar arasinda halihazirda hastaligi ya da rahatsizligi bulunanlarin yani sira hastaligi ya da rahatsizligi geçirme yatkinligi olanlar ya da bir hastaligi ya da rahatsizligi önlenmesi gerekenler yer alir.

Bulus tarafindan tedavi edilebilen kanserler/tümörler herhangi bir kanseri ya da tümör içerir. Tedavi edilebilen kanserlerin/tümörlerin örnekleri arasinda meme kanseri (HER2+ ve metastatik dahil), kapesitabin, iksabepilon ya da her ikisiyle tedavi edilen bir kanser ya da TGFß aracili sinyallesme ile iliskili bir kanser bunlarla sinirli olmaksizin yer alir.

Kanseri tedavi etme yöntemleri arasinda örnegin tümör içindeki anjiyojenezin inhibe edilmesi, tümör büyümesinin inhibe edilmesi, tümör migrasyonunun inhibe edilmesi, proliferasyonun inhibe edilmesi ya da tümör hücrelerinin bir alani isgal etmesinin inhibe edilmesi bunlarla sinirli olmaksizin yer alir.

TGFß'yi eksprese ya da asiri eksprese eden kanserler ya da bunun eksprese ya da asiri eksprese edilmesi ile iliskili kanserler, bulus ile tedavi edilebilir. Bununla birlikte buradaki kombinasyonlu terapi ile tedavi edilecek kanser sadece TGFß'yi eksprese ya da asiri eksprese edenler degil, herhangi bir kanser olabilir.

Tedavi edilecek kanserler arasinda birincil tümörler ve ikincil ya da metastatik tümörler (akcigerden, memeden ya da prostattan metastaz yapanlar dahil) ve ayrica nükseden ya da refraktör tümörler yer alir. Nükseden tümörler bu tip ajanlarla tedavi yoluyla inhibe edilmis gibi görünen ancak tedavinin birakilmasindan sonra bes yila kadar, bazen on yila kadar ya da daha uzun süre sonra nükseden tümörleri içerir. Refraktör tümörler, belirli tümör türü için bir ya da daha fazla konvansiyonel terapi ile tedaviye cevap vermeyen ya da dirençli olan tümörlerdir. Refraktör tümörler arasinda hormon- refraktörü olanlar (örnegin androjenden bagimsiz prostat kanseri; ya da hormon- refraktörü meme kanseri yani tamoksifene refraktör meme kanseri); bir ya da daha fazla kemoterapötik ajan ile tedaviye refraktör olanlar; radyasyona refraktör olanlar; ve kemoterapinin ve radyasyonun, kemoterapi ve hormon tedavisinin ya da hormon tedavisinin ve radyasyonun kombinasyonlarina refraktör olanlar yer alir.

Tedavi “birinci seri” yani önceden kanser önleyici hiçbir tedavi almamis hastalarda tek basina ya da baska tedavilerle kombinasyonlu olarak bir baslangiç tedavisi olabilir; ya da önceden bir kanser önleyici tedavi rejimi geçirmis olan hastalarda tek basina ya da baska tedavilerle kombinasyonlu olarak “ikinci seri”; ya da tek basina ya da baska tedavilerle kombinasyonlu olarak “üçüncü seri”, “dördüncü seri” ve benzeri tedaviler olabilir.

Tedavi ayni zamanda kismen basarili olmus ancak belirli tedaviye toleransli olmayan önceden tedavi geçirmis hastalara da verilebilir. Tedavi ayni zamanda, örnegin günümüzde saptanabilir hastaligi bulunmayan hastalarda ya da tümörün ameliyatla alinmasindan sonra kanserin yeniden nüksetmesini önlemek için bir adjuvan tedavi olarak verilebilir.

Tedavi edilebilen kanserler arasinda vaskülarize edilmeyen ya da henüz büyük oranda vaskülarize edilmeyen tümörler ve ayrica vaskülarize edilen tümörler yer alir. Kanserler kati olmayan tümörlerden (yani Iösemiden ve lenfomadan) meydana gelebilir ya da kati tümörler olabilir. Bulusun antikorlari ile tedavi edilecek kanser türleri arasinda karsinomu, blastom ve sarkoma ve belirli lösemi ya da Ienfoit maligniteleri, iyi huylu ve kötü huylu tümörler ve maligniteler örnegin sarkomalar, karsinomlari ve melanomlar bunlarla sinirli olmaksizin yer alir. Yetiskin tümörleri/kanserleri ve pediatrik tümörler/kanserler dahildir.

Ayni bilesime eklenmis olarak ya da ayri bilesimler halinde tatbik edilmis olarak birden fazla TGFß antagonisti tatbik edilebilir.

TGFß antagonisti tek basina ya da bir ya da daha fazla terapötik olarak etkili ajan (örnegin kapesitabin, iksabepilon ya da her ikisi) ya da tedaviler ile kombinasyonlu olarak tatbik edilebilir. Diger terapötik olarak etkili ajanlar TGFß antagonistine konjuge edilebilir, TGFß antagonisti ile ayni bilesime eklenebilir ya da ayri bir bilesim olarak tatbik edilebilir. Diger terapötik olarak etkili ajan ya da tedavi TGFß antagonistinin tatbikinden önce, tatbiki süresince ve/veya tatbikinden sonra tatbik edilebilir.

Bir uygulamada, TGFß antagonisti kapesitabin, iksabepilon ya da bunlarin bir kombinasyonu ile birlikte tatbik edilir. Baska bir uygulamada TGFß antagonisti kapesitabin, iksabepilon ya da bunlarin bir kombinasyonundan bagimsiz olarak tatbik edilir. Bir uygulamada TGFß antagonisti kapesitabin, iksabepilon ya da bunlarin bir kombinasyonunun ardindan ilk olarak tatbik edilir. Baska bir uygulamada kapesitabin, iksabepilon ya da bunlarin bir kombinasyon TGFß antagonistinin tatbik edilmesinden sonra ilk olarak tatbik edilir.

Diger terapötik olarak etkili ajanlar / tedaviler arasinda ameliyat, anti-neoplastikler (yani kemoterapötik ajanlar ve radyasyon), anti-anjiyojenez ajanlari, diger hedeflerin antikorlari, küçük moleküller, fotodinamik terapi, immünoterapi, sitotoksik ajanlar, sitokinler, kemokinler, büyüme önleyici ajanlar, anti-hormonal ajanlar, kinaz inhibitörleri, kardiyo koruyucular, immünostimülatör ajanlar, imünosupresif ajanlar, hematolojik hücrelerin çogalmasini destekleyen ajanlar ve protein tirozin kinaz (PTK) inhibitörleri yer alir.

Bir kemoterapötik ajan bir ön ilaç olarak tatbik edilebilir. “Ön ilaç” terimi ana ilaca kiyasla tümör hücrelerine daha az sitotoksik olan ve daha aktif ana forma enzimatik olarak aktive edilebilen ya da dönüstürülebilen farmasötik olarak aktif bir maddenin bir prekursörüne ya da türevine atif eder. Burada saglanan bilesimlerle ve yöntemlerle kullanilabilen ön ilaçlar arasinda fosfat içeren ön ilaçlar, tiyofosfat içeren ön ilaçlar, sülfat içeren ön ilaçlar, peptit içeren ön ilaçlar, D-amino asit modifiyeli ön ilaçlar, Glikosilatlanmis ön ilaçlar, beta-laktam içeren ön Ilaçlar, opsiyonel olarak ikame edilmis fenoksiasetamit içeren ön ilaçlar ya da opsiyonel olarak ikame edilmis fenilasetamit içeren ön ilaçlar, 5-florsitozin ve daha aktif sitotoksik olmayan ilaca dönüstürülebilen diger 5-florüridin ön ilaçlari bunlarla sinirli olmaksizin yer alir. Burada tedarik edilen bilesimlerin ve yöntemlerin antikorlari ve F0 füzyonlari ile kullanim için bir ön ilaç formuna türetilebilen sitotoksik ilaçlarin örnekleri arasinda yukarida belirtilen kemoterapötik ajanlarin herhangi biri bunlarla sinirli olmaksizin yer alir.

TGFß antagonistinin baska ajanlarla (örn., kapesitabin, iksabepilon ya da her ikisiyle) tatbiki ve/veya tedaviler es zamanli ya da ayri olarak ayni ya da farkli yoldan ayni ya da farkli zamanlarda meydana gelebilir. Optimum istenen yaniti (örnegin bir terapötik ya da profilaktik yaniti) saglamak için dozaj rejimleri ayarlanabilir.

Bir örnekte tek bir bolus tatbik edilebilir. Baska bir örnekte birçok bölünmüs doz zaman içinde tatbik edilebilir. Yine baska bir örnekte, terapötik durumun zorunluluklari tarafindan gösterildigi gibi bir doz orantili olarak azaltilabilir ya da arttirilabilir. Burada kullanildigi gibi dozaj birim formu memeli süjeleri tedavi etmek için üniter dozajlar olarak uygun fiziksel olarak ayri birimlere atif eder. Her bir birim bir istenen terapötik etkiyi üretmek için hesaplanan aktif bilesigi önceden belirlenmis bir miktarini içerebilir.

Bazi uygulamalarda bulusun dozaj birim formlari aktif bilesigi benzersiz karakteristikler ya da basarilmasi gereken belirli terapötik ya da profilaktik etki tarafindan dikte edilir ve dogrudan bunlara baglidir.

Bulusun bilesimi sadece bir kez tatbik edilebilir ya da birçok kez tatbik edilebilir. Çok dozajlar için bilesim örnegin günde üç kez, günde iki kez, günde bir kez, iki günde bir, haftada iki kez, haftalik olarak, iki haftada bir ya da aylik olarak tatbik edilebilir.

Dozaj degerlerinin hafifletilecek rahatsizligin türüne ve siddetine bagli olarak degisebilecegi not edilmelidir. Ayrica herhangi bir belirli süje için spesifik dozaj rejimlerinin bireysel ihtiyaca göre ve bilesimleri tatbik eden ya da tatbikini yöneten kisinin profesyonel takdirine göre zaman içinde ayarlanabilecegi ve burada ifade edilen dozaj araliklarinin sadece örnek amaçli oldugunu ve koruma talep edilen bilesimin kapsamini ya da uygulamasini sinirlamasinin amaçlanmadigi anlasilmalidir.

Bir sujeye “tatbik" herhangi bir belirli tedarik sistemi ile sinirli degildir ve sinirlamasiz olarak parenteral (yani subkütanöz, intravenöz, intramedüler, intra-artiküler, intramuskular ya da intraperitoneal enjeksiyon dahil) rektal, topikal, transdermal ya da oral (örnegin kapsülleri, süspansiyonlari ya da tabletleri) içerebilir. Bir konaga tatbik tek bir doz halinde ya da tekrarlanan tatbikler halinde ve çok çesitli fizyolojik olarak kabul edilebilir tuz formlarinin herhangi birinde ve/veya bir kabul edilebilir farmasötik tasiyici ile ve/veya (önceden tarih edilen) bir farmasötik bilesimin parçasi olarak meydana gelebilir. Bir kez daha fizyolojik olarak kabul edilebilir tuz formlari ve standart farmasötik formülasyon teknikleri teknikte uzman kisiler tarafindan çok iyi bilinmektedir (bakiniz örnegin Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.).

Bulusun bilesimi (örn., TGFß antagonisti) parenteral (örn., intravenöz, subkütanöz, intraperitoneal, intramuskular) olarak tatbik edilebilir. Ayrica bulusun bilesimi intravenöz infüzyon ya da enjeksiyon ile tatbik edilebilir. Bulusun bilesimi intramuskular ya da subkütanöz enjeksiyon ile tatbik edilebilir. Bazi uygulamalarda bulusun bilesimi örn., kapesitabin ve/veya iksabepilon) oral olarak tatbik edilebilir. Burada kullanildigi gibi bir iksabepilonun ya da bunlarin bir kombinasyonunun) bir farmasötik olarak etkili miktarini içeren herhangi bir bilesime atif eder.

Burada tarif edilen bulusun yöntemleri maymunlar ve insanlar gibi primatlari, atlari, inekleri, kedileri, köpekleri ve siçanlar ve fareler gibi kemirgenleri içeren herhangi bir uygun memeliyi tedavi etmek için kullanilabilir. Bir uygulamada tedavi edilecek memeli insandir.

Mevcut tarifnamede atfedilen bütün patentler ve literatür referanslari buraya bütünüyle referans yoluyla eklenmistir. ÖRNEKLER A_rastirme_i 1: Sir sineriik üçlü-nega_tif meme kanseri modelinde (4T1) birincil t_ümör büyümesinin ve metasta_zlarin ü_zerinde 1_D11,in, iksalgpilonimi k_apesita_binin ve li: teragtiklerin kombinasyonlarinin et_kileri.

Klinik olarak iksabepilon ve kapesitabin kemoterapötiklerinin kombinasyonunun taksanlara dirençli olarak metastatik ya da lokal olarak ilerlemis üçlü negatif meme kanserinin (TNBC) tedavisinde etkili oldugu gösterilmistir. Bu ön-klinik arastirma: (1) 1D11'in, iksabepilonun ve kapesitabinin tekli ajanlar olarak subkütanöz 4T1 tümörlerinin büyümesi ve akcigerlerdeki müteakip metastazlar üzerindeki etkilerinin belirlenmesi, (2) bu ajanlarla kombinatoryal terapilerin bireysel ajanlarin etkililigi üzerinde ilave ya da sinerjik etkiler ile sonuçlanip sonuçlanmadiginin belirlenmesi ve (3) bu kombinatoryal terapilerle potansiyel güvenlilik/toksisite konularina isik tutulmasi amaçlidir.

Deney Yöntemleri: Tablo 1: Arastirmanin Genel Hatlari Grup # Tedavi Gruplari Her bir grup için hayvanlar, 1 Antikor Vehikülü 10 2 13C410mg/kg 10 3 1D11 10mg/kg 10 4 Antikor Vehikülü + 10 noktalari: Tedavi Gruplari Kapesitabin 13C4 + Kapesitabin 1D11 + Kapesitabin Antikor Iksabepilon Vehikülü 1304 Iksabepilon 1D11 + Iksabepilon Antikor Vehikülü Kapesitabin + Iksabepilon 1304 + kapesitabin Iksabepilon 1D11 + Kapesitabin Iksabepilon Her bir grup için hayvanlar, Arastirmacilar sag bögüre 50,000 4T1 hücre + matrigel'i subkütanöz olarak enjekte eder Arastirmacilar 2-3X/haftalik tümör ölçümlerine DCM Personeli IP 3X/hasta antikor dozlamasina baslar DCM Personeli IV Q4Dx3 iksabepilon dozlamasina baslar DCM Personeli oral gavaj QDx14 ile kapesitabin dozlamasina baslar Birincil tümörler 2000mm3'lük bir hacme ulastigi zaman arastirmanin temizlenmesinden Önce hayvanlarin moribund kosullari (timarlanma eksikligi, yorucu olmayan nefes alma, kaseksi, anoreksi ya da Ietarji) göstermesi halinde hayvanlar kesilerek öldürülmüstür. Kesimin ardindan Grup # Tedavi Gruplari Her bir grup için hayvanlar, birincil tümör ikiye bölünmüstür ve bir yarisi OCT içine gömülmüstür ve diger yarisi çinko tamponlu formalin içine yerlestirilmistir. Akcigerler ve metastaz yapan herhangi baska doku akciger metastazlarinin ve IHC'nin siralanmasi için hasat edilmistir ve çinko tamponlu formalin içinde saklanmistir.

Dokular: OCT ve çinko tamponlu formalin içindeki birincil tümörler, metastazin ve müteakip IHC'nin degerlendirilmesi için çinko tamponlu formalin içinde hasat edilen akcigerler.

O.Günde 150 adet on iki haftalik disi BALB/c farelerinin her birine sag bögürden Matrigel içinde 50,000 4T1 hücreleri subkütanöz olarak enjekte edilmistir. Tümör tasiyan fareler rutin olarak takip edilmistir ve &Günden baslanarak 2-3X/haftalik düzenli tümör ölçümleri yürütülmüstür. Tümör hacmi asagidaki formül kullanilarak belirlenmistir: Tümör Hacmi = Uzunluk x Genislik2 x 0.52 Tümör hücresi enjeksiyonundan alti gün sonra, tümör hacimlerinin ortalamasi 80mm3 oldugu zaman hayvanlar büyüklüge göre eslestirilmistir ve her bir onar fareden olusan on iki tedavi grubuna ayrilmistir. Ortalamadan büyük olan ya da elle dokunulamayan (Omm3) birincil tümörlere sahip otuz fare arastirmadan çikarilmistir. Bu noktada arastirmacilar tedavi grubu tanimlarina körlestirilmistir ve terapötik tatbik baslatilmistir.

Bütün farelere 10mg/kg'lik 1D11, 13C4 ya da vehikül almistir ve bunlar haftada üç kez 100ul IP miktarinda tatbik edilmistir (Tablo 1). Farelerin spesifik kohortlari iksabepilon (, kapesitabin (100ul içinde 360mg/kg oral gavaj yoluyla QDx14) ya da her ikisinin ilave tedavilerini almistir.

Fareler birincil tümör hacimleri 2000mm3'e ya da daha fazlasina ulastigi zaman ya da tümörler tümörün yüzey alaninin >%20'sinden fazlasi ülserlendigi zaman ya da hayvanlarda moribund kosullari (timarlanma eksikligi, yorucu olmayan nefes alma, kaseksi, anoreksi ya da Ietarji) görüldügü zaman kesilerek öldürülmüstür. Kesilmeden sonra brüt nekropsiler gerçeklestirilmistir ve metastaz tasiyan tümörler. akcigerler ve diger dokular hasat edilmistir. Birincil tümörün bir bölümü immünomarkörlerin IHC'si için OCT içinde dondurulmustur ve geriye kalan tümör ve metastazli diger dokular parafine gömülmek üzere çinko-formalin içinde sabitlenmistir.

Sonuçlar: yedi ardisik hafta boyunca haftada üç kez verilmistir. Iksabepilonun, kapesitabinin ya da antikor terapötiklerinin dozlanmasinda, bu arastirmada muhtemelen Charles River'dan BALB/c farelerinin kullanilmasi nedeniyle hiçbir zorluk görülmemistir.

Tablo 2. Arastirmadaki tedavi ile ilgili bariz advers vakalar.

Grup# Durum Vehikül + __ __ Vehikül + ..

Vehikül + __ __ Vehikül + .. 13C4 + ____ 1304 +B1765 ölü Arastirma Gözlemler dokunabilir birincil tümör yok.

Kemoterapötigin verilmesinden sonraki aksam ölü bulundu.

Zayiflama ve kamburlasma. Spazmodik kas segirmesi gösterdi. Moribund durum dokunabilir birincil tümör yok.

Zayiflama ve kamburlasma. Spazmodik kas segirmesi gösterdi. Arka bacaklarini kullanamadi. Moribund durum nedeniyle kesilerek öldürüldü. dokunabilir birincil tümör yok.

Fare Arastirma Grup # Durum Gözlemler lD”si# günü Cape + bulundu dokunabilir küçük birincil tümör var. Doku 1304 + _. i" Zayiflama ve kamburlasma. Elle Cape + 81787 18 dokunabilir küçük birincil tümör var. Doku lxa alinmadi. 13C4 + __i k Zayiflama ve kamburlasma. Arka Cape + 81804 __ 17 bacaklarini kullanamadi. Moribund durum 1D11 + ölü dokunabilir birincil tümör yok. aksam ölü bulundu. 1D11 + ..i.. Zayiflama ve kamburlasma. Elle Caps + 81808 18 dokunabilir birincil tümör yok. Doku Bu arastirmada kapesitabin+iksabepilon kohortundaki fareler ya ölü bulundur ya da moribund kosullari göstermeleri sebebiyle kesilerek öldürüldü. Bu tedavi ile ilgili toksisiteler Tablo 1'de açiklanmistir. Ötenazi gereken fareler zayiflamis, hirpalanmis, kamburlasmis ve nefes almada zorluk çeker durumdaydi. Iksabepilon ile tedavi edilen gruplardaki bazi fareler bazi periferal nöropatiler sergiledi; fareler kendi arka bacaklari üzerinde yürümekte zorluk çekti. Ancak bu modelde iksabepilonu test eden önceki arastirmalarda gözlemlendigi gibi nöropatik kemoterapötiklerin son dozunun ardindan iyilesmistir. 1D11'in kemoterapöiklere eklenmesi bu toksisitelerin meydana gelme sikligini arttirmadi ya da azaltmadi.

Tedarik edilen tedaviye bagli olarak tümör büyümesi üzerinde farkli etkiler görülmüstür (Sekil 1). Tek bir ajan olarak 1D11, SQ 4T1 tümörlerinin büyümesi üzerinde hiçbir önemli etkiye sahip degildir (Sekil 2A). Bir monoterapi olarak iksabepilon, kapesitabin de tümör büyümesini inhibe etmemesine ragmen antikor terapisine ya da kapesitabine kiyasla 4T1 tümör büyümesinin inhibe edimesinde en etkili yoldur. Kapesitabin tedavisine 1D11'in eklenmesi tek basina ya da 1304 ile birlikte kapesitabin üzerinde iyilestirilmis etkililigi ile sonuçlanmistir (Sekil 28) ancak 1D11 tek basina iksabepilonun etkililigini etkilememistir (Sekil 2C).

Tümör büyümesinin en güçlü inhibisyonu tek basina ya da 13C4 ile kapesitabin+iksabepilon üzerinde iyilestirilmis etkililige sahip olan 1D11+kapesitabin+iksabepilon'un kombinatoryal tedavisini alan farelerde gözlemlenmistir (Sekil 3A). Kapesitabinin ve iksabepilonun kombinasyonu tek basina kapesitabinden daha etkili olmustur (Sekil SB) ancak bu kombinasyon iksabepilon terapisinden (Sekil 30) daha etkili olmamistir. 1D11, 1D11+kapesitabin+iksabepil0n içeren terapilere odaklanmak 1D11+iksabepil0ndan daha etkili olmustur, 1D11+kapesitabinden daha etkili olmustur ve tek bir ajan olarak 1D111den daha etkili olmustur (Sekil 4).

Farkli tedavi rejimleri sagkalim üzerinde degisen etkilere sahip olmustur. Antikor terapileri ve tek basina kapesitabin ile tedavi edilen fareler benzer sagkalim egrilerine sahiptir (Sekil 5). Tek basina ya da kapesitabin ile kombinasyonlu olarak iksabepilon ile tedavi edilen farelerde benzer sagkalim görülmüs olup antikor ya da kapesitabin kohortlarindan daha büyük olmustur. Tek bir ajan olarak 1D11 sag kalimi arttirmamistir ancak 1D11+kapesitabin tek basina kapesitabin üzerinde iyilestirilmis sag kalima sahip olmustur. 1D11 ayni zamanda tek basina iksabepilonun sagkalim yararini arttirmamistir ancak en büyük ortalama sagkalim 1D11+kapesitabin+iksabepilon tedavi grubunda gözlemlenmistir. Sagkalim egrileri ayni zamanda yukarida tarif edilen kemoterapötik rejimlere bagli olarak toksisiteden de etkilenmistir. 1D11 tek bir ajan olarak 2000mm3'ün büyüklük uç noktasina erismek için gereken zamani arttirmamistir ve iksabepilon ile tedavi edilen hayvanlarda uç noktasina kadar geçen zamani arttirmamistir (Sekil 6). Bununla birlikte 1D11 kapesitabin kohortundaki uç noktasina kadar geçen zamani arttirmistir ve arastirmada uç noktasina kadar geçen en uzun süre 1D11+kapesitabin+iksabepilon grubunda gözlemlenmistir. 1D11 ile tedavi her bir kohort içindeki akcigerlere metastazdaki bir artisa yol açmistir (Sekil 7). 1011 tekli ajan grubunda vehikül ile tedavi edilen gruba ya da 1304 ile tedavi edilen gruba kiyasla akciger metastazlarinin sayisinda önemli artis görülmüstür ve 1D11 tedavisi sebebiyle benzer artislar kapesitabin, iksabepilon ve kapesitabin+iksabepilon kohortlarinda gözlemlenmistir (Sekil 8). Akciger metastazlarinin sayisi bir hayvanin arastirmada oldugu sürenin bir fonksiyonu olarak arttirilmistir ve bu etki tedavi grubundan bagimsizdir (Sekli 9).

Klinikte iksabepilonun ve kapesitabinin kombinasyonlu tedavisinin taksana dirençli üçlü negatif meme kanserinde (TNBC) tek basina kapesitabinden daha etkili oldugu rapor edilmistir. 4T1 mürin memeli karsinomu modeli rutin olarak insan TNBC'si için ve TNBCye karsi terapötiklerin ön klinik testi için iyi bir tasiyici olarak kullanilir.

Arastirmanin amaci 1D11'in kapesitabinin, iksabepilonun ya da iki kemoterapötigin kombinasyonunun birincil tümör büyümesine ve/veya TNBC'nin sinerjik 4T1 modelindeki müteakip metastaza karsi etkililiginin artip artmayacagini saptamaktir.

Bu modelin geçmis arastirmalarinda gözlemlendigi gibi tek bir ajan olarak 1D11 birincil SQ 4T1 tümörlerinin büyümesini önemli oranda inhibe etmemistir. Ancak 1D11 birincil tümörlere karsi kapesitabinin ve kapesitabin+iksabepilonun kombinatoryal terapisinin etkililigini arttirmistir. Aslinda 1D11+kapesitabin+iksabepilon üçlü kombinasyonu 4T1 birincil tümör büyümesinin inhibe edilmesinde en çok etkiye sahip olmustur ve ayni zamanda en büyük sagkalim yararini saglamistir ve uç noktasina kadar en uzun süreyi Üretmistir. Birlikte alindiginda bu veri, bir TGFß nötralizasyon stratejisinin kapesitabin+iksabepil0n terapisi ile birlestirilmesinin tek basina kapesitabin+iksabepilon ile tedavi üzerinde bir terapötik etki saglayabilecegini gösterir.

Bu veriler SQ 4T1 tümor modelinde bir kemoterapötigin etkililiginin birinci arttirimini temsil eder. Önceden bu modelde 1D11 paklitaksel, cisplatin ya da karboplatin ile birlestirilmistir ve bu arastirmalarin her birinde 1D11 test edilen kemoterapötigin etkililigini iyilestirmemistir.

Bu arastirmada 1D11`In kapesitabin ile birlestirilmesi tek basina kapesitabin ile gözlemlenen etkililigi arttirmistir ve bu da kapesitabin+iksabepilon grubuna kiyasla 1D11 + kapesitabin + iksabepilon grubundaki artmis etkililigin kapesitabinin tümör büyümesi üzerindeki etkilerinin arttirilmasina bagli olabilecegini göstermistir.

Kapesitabin, 5-florourasile çevrilen ve bir pirimidin taklidi olarak islev görerek DNA sentezini bloke eden bir oral ön ilaçtir. Anti-tümör mekanizmasi gemsitabininkine benzerdir. Ilginç bir sekilde 1D11 pankreatik kanser modellerinde gemsitabinin etkililigini arttirmamistir ve bu da bu çalismada gözlemlenen iyilestirmenin spesifik ilaca, tümör modeline ya da her ikisine bagli oldugunu gösterir.

Sasirtici bir sekilde 1D11 ile tedavi her bir kemoterapötigin etkisinin arttirilmasi yerine her bir kohortta arttirilmis metastaz ile sonuçlanmistir.

Bu çalismada kilo kaybi, bir hirpalanmis ve kambur görünüs ve nefes alma güçlügü gibi tedavi ile ilgili toksisiteler kemo-kombo tedaviler alan farelerde gözlemlenmistir.

Iksabepilon alan fareler tedavi terapisi tamamlandigi zaman çözülen arka ayak hareketsizligi formunda periferal nöropati göstermistir. 1D11 bu toksisitelerin meydana gelme sikliginda ya da siddetinde hiçbir etkiye sahip degildir.

Arastirma 2: Bir sineriik üçlü-negatif meme kanseri modelinde (4T1) birincil tümör büyümesinin ve metastazlarin üzerinde 1D11'in, iksabepilonun, kapesitabinin ve bu terapötiklerin kombinasyonlarinin etkileri.

Deney Yöntemleri: Tedavi gruplari zaman noktalari ve dokular yukarida tarif edilen arastirmaya benzerdir.

O.Günde 150 adet on iki haftalik disi BALB/c farelerinin her birine sag bögürden Matrigel içinde 50,000 4T1 hücreleri subkütanöz olarak enjekte edilmistir. Tümör tasiyan fareler rutin olarak takip edilmistir ve &Günden baslanarak 2-3X/haftalik düzenli tümör ölçümleri yürütülmüstür. Tümör hacmi asagidaki formül kullanilarak belirlenmistir: Tümör Hacmi = Uzunluk X Genislik2 x 0.52 Tümör hücresi enjeksiyonundan alti gün sonra, tümör hacimlerinin ortalamasi ~70mm3 oldugu zaman hayvanlar büyüklüge göre eslestirilmistir ve her biri onar fareden olusan on iki tedavi grubuna ayrilmistir. Ortalamadan büyük olan ya da elle dokunulamayan (0mm3) birincil tümörlere sahip otuz fare arastirmadan çikarilmistir. Bu noktada arastirmacilar tedavi grubu tanimlarina körlestirilmistir ve terapötik tatbik baslatilmistir.

Bütün farelere 10mg/kg'lik 1D11, 13C4 ya da vehikül almistir ve bunlar haftada üç kez 100uI IP miktarinda tatbik edilmistir (Sekil 10). Farelerin spesifik kohortlari iksabepilon yoluyla QDx14) ya da her ikisinin ilave tedavilerini almistir.

Fareler asiri ülserlesme ya da moribund kosullarinin (timarlanma eksikligi, yorucu olmayan nefes alma, kaseksi, anoreksi ya da Ietarji) görülmesi bakimindan izlenmistir.

Metastazin düzgün analizi için fareler arastirmanin 23.Gününde kesilerek öldürülmüstür. Kesilmeden sonra brüt nekropsiler gerçeklestirilmistir ve metastaz tasiyan tümörler, akcigerler ve diger dokular hasat edilmistir. Birincil tümör ikiye kesilmistir ve bir bölümü OCT içinde dondurulmustur ve diger bölümü qPCR analizi için RNA Later'de saklanmistir. Akcigerler pulmoner metastazlasin siralanmasi ve müteakip IHC analizi için çinko tamponlu formalin içinde sabitlenmistir.

Sonuçlar: Arastirmanin 23.gününe kadar fareler antikor vehikülünün, 1304'ün ya da 1D11'in sekiz adet tedavisini almistir. Bu arastirmada iksabepilonun, kapesitabinin ya da antikor terapötiklerinin dozlanmasi esnasinda hiçbir toksisite sorunu gözlemlenmemistir. Tümör ülserlendigi için temizleme öncesinde kesilerek öldürülen bir fare haricinde bütün hayvanlar Arastirmanin 23.Gününde temizlenmistir.

Bu arastirmadaki tümörler önceki çalismalardan biraz daha yavas büyümüstür ve sonuç olarak arastirma, Arastirmanin 23. Gününde sonlandirildigi zaman nispeten küçük olmustur.

Bu arastirmadaki tümörlerin büyüklügü azaltilmasina ragmen tedavi gruplari arasindaki ortalama tümör hacimleri arasinda açik farklar gözlemlenmistir (Sekiller 10 ve 11).

Arastirmanin 20. ve 22.Gününde tek bir ajan olarak 1D11 ile dozlanan hayvanlari tek basina 13C4 alanlarla kiyaslarken fark edilebilir sekilde tümör hacminde önemli bir azalma görülmüstür ancak 1D11 tedavisi, vehikül ile tedavi edilen hayvanlara kiyasla 1D11'e bagli olarak istatistiki olarak önemli inhibisyon trendi ile sonuçlanmistir (Sekil 11A). Kapesitabin ile tedavi birincil tümörlerin inhibe edilmis büyümesine dogru bir trend ile sonuçlanmistir ve iksabepilon ile tedavi üzerine tümör hacminde önemli bir azalma görülmüstür. 1D11'in kapesitabin terapisine eklenmesi tek basina kapesitabine göre artmis etkililige dogru istatistiki olarak önemli bir trend ile sonuçlanmistir (Sekil 11 B). 1D11'in iksabepilon ile birlestirilmesi tek basina iksabepilona kiyasla artmis etkililikle sonuçlanmistir ancak 13C4+iksabepilon (Sekil 11C) ile de kiyaslanmistir.

Arastirma OSB-3493'te gözlemlenen iksabepilonun ve kapesitabinin tek basina herhangi bir kemoterapötik üzerinde birlestirilmesinin ilave edilen yarari bu arastirmada teyit edilmistir (Sekil 12A). Kapesitabinin ve iksabepilonun kombinatoryal terapisi, SQ 4T1 tümör büyümesinin önlenmesinden kapesitabinden önemli oranda daha etkilidir (Sekil 128) ve tek basina iksabepilon üzerinde hafif bir yarar vardir (Sekil 120). Tümör büyümesinin en güçlü inhibisyonu, Arastirma 09-3493'ten alinan verileri teyit edecek sekilde tek basina ya da 13C4 ile birlikte (Sekil 12A) kapesitabin+iksabepilona göre arttirilmis etkililige sahip olan 1D11+kapesitabin+iksabepilon kombinasyonlu tedavisini alan farelerde gözlemlenmistir. 1D11 içeren terapilere odaklanarak, 1D11+kapesitabin+iksabepil0n tedavisi 1D11+iksabepilondan daha etkili olmustur ve bu da tek bir ajan olarak 1d11'den daha etkili olan 1D11+kapesitabinden daha etkili olmustur (Sekil 13). 1D11 ile tedavi tek bir ajan olarak pulmoner metastazlarin sayisini inhibe etmemistir (Sekil 14). Metastaz kombinatoryal terapileri alan kohortlarda önemli oranda azalmistir ve bu kohortlarin her birindeki metastazlarin ortalama sayisi 10'dan daha düsük olmustur. Hem 1D11+iksabepilon hem de 13C4+iksabepil0n, kapesitabine kiyasla metastazlarin sayisini azaltmistir ancak kapesitabinde ya da kapesitabin+iksabepilon kohortlarindaki tedavi gruplarinin arasinda hiçbirfark yoktur.

Bu arastirma birinci tümör büyümesinin inhibe edilmesi ve akciger metastazinin önlenmesi için iksabepilon ve kapesitabin kemoterapötiklerinin kombinasyonuna 1d11”in eklenmesinin etkisini belirlemek için ikinci çalismadir. Birinci çalisma 09-3493'e benzer sekilde 1D11 tek bir ajan olarak birincil tümör büyümesi üzerinde fazla bir etkiye sahip olmamistir. 1304 ile tedavi edilen gruba kiyasla 1D11 grubunda inhibisyona dogru bir trend vardir ancak vehikül ile tedavi edilen grupla kiyaslandiginda bu önem kaybedilmistir. Ayni zamanda 1D11`in kapesitabinin ve iksabepilonun etkililigini arttirdigini gösteren trendler de vardir ancak ikinci bahsedilen durumda iksabepilonun etkililiginin iyilestirilmesi 13C4'ünküne benzerdir. Bununla birlikte bu çalismada 09- 3493`te oldugu gibi 4T1 tümör büyümesinin önemli oranda inhibisyonu 1D11+kapesitabin+iksabepilon ile tedavi edilen farelerde gözlemlenmistir. Tedavi gruplari arasindaki ayrim yeni meydana gelmeye basladigi yerdeki bir zaman noktasinda hayvanlar temizlenmis olsa dahi etkililigin iyilestirilmesi bariz olmustur.

Birlikte alindiginda bu iki arastirmadan elde edilen veriler bir TGFß nötralizasyon stratejisinin kapesitabin+iksabepilon terapisi ile birlestirilmesinin tek basina kapesitabin+iksabepilon ile tedavi üzerinde bir terapötik yarar saglayabilecegini açikça göstermektedir.

Birlikte alindigi zaman bu iki çalismadan elde edilen veriler, SQ 4T1 tümör modelinde bir kemoterapötigin etkililiginin birinci iyilestirilmesini temsil eder. Önceden bu modelde 1D11 paklitaksel, cisplatin ya da karboplatin ile birlestirilmistir ve bu çalismalarin her birinde 1D11 test edilen kemoterapötigin etkililigini iyilestirmemistir.

Arastirma 09-3493'te, kapesitabin+iksabepilon etkililiginin iyilestirilmesi muhtemelen kapesitabinin etkililigine atfedilebilir çünkü 1D11, iksabepilonun degil kapesitabinin etkililigini tek basina arttirmistir. Bu arastirmada kapesitabin kohortunda 1D11 ile etkililigin iyilestirilmesi yönünde bir trend vardir ancak bu istatistiki olarak önemli degildir. 1D11'in iksabepilonun etkililigini arttirdigi görülmüstür ancak iksabepilon 1304 ile birlestirildigi zaman benzer bir sonuç gözlemlenmistir. Arastirma daha uzun süre yürütülmüs olsaydi her bir kohorttaki tedavi gruplarini daha iyi bir sekilde ayiklanacakti.

Kapesitabin+iksabepilonuri etkililiginin 1D11 ile iyilestirilmesinin kapesitabinin, iksabepilonun aktivitesinin Iyilestirilmesine bagli olup olmadiginin ya da sadece 1D11'In her iki terapötik ile birlestirildigi zamandaki bir islev olup olmadiginin tespit edilmesi amaciyla bu durumun gelecek çalismalarda ele alinmasi gerekecektir.

Arastirma 09-3493'te, 6mg/kg iksabepilon alan hayvanlar tipik olarak periferal nöropati göstermistir ve iksabepilon+kapesitabin kohortundakilerin birçogu terapiye bagli olarak ölmeye yüz tutmustur ve öldürülmeleri gerekmistir. Bu çalismada iksabepilon dozu 6mg/kg'den 3mg/kg`ye düsürülmüstür; bu doz, Pharm/Tox içinden MTD çalismasindaki 4T1 tümör büyümesine karsi etkililik gösteren bir dozdur. Iksabepilonun bu azaltilmis dozuyla arastirmadaki hiçbir hayvan arastirma boyunca herhangi bir noktada hiçbir toksisite belirtisi göstermemistir. ilaveten 3 mg/kg'lik dozun birinci tümör büyümesine ve/veya bu çalismada metastatik meydana gelme sikligina karsi etkili oldugu kanitlanmistir. Bunun gibi bu daha düsük dozun kullanilmasi azaltilmis toksisite nedeniyle gelecek çalismalarda avantajli olma ihtimaline sahip olacaktir.

Birinci tümör büyümesindeki etkilerin gözlemlenebilmesine ek olarak bu çalisma, tek bir ajan olarak ya da kemoterapötiklerle kombinasyonlu olarak 1D11'in SQ 4T1 birincil tümöründen akcigerlere metastaz üzerindeki etkilerinin de fark edilebilecegi sekilde tasarlanmistir. Daha fazla metastaza yol açan tümör büyümesinin daha uzun bir süresinin olasiligini elimine etmek amaciyla (Arastirma 09-3493'te oldugu gibi) her bir bireysel tümör 2000mm3'e ulastigi zamanda temizlenmek yerine 23.Günde hayvanlarin tümü temizlenmistir. Sasirtici bir sekilde 1D11 deneysel metastazin 4T1 intrakardiyak modelini içeren diger tümör modellerinde gözlemlenmis oldugu gibi bu arastirmadaki metastazi inhibe etmemistir. Bununla birlikte tek ajanli antikor kohortundaki akciger metastazlarinin sayisinin her bir tedavi grubunda düsük oldugu ve özellikle de kemo- kombo kohortlarinda düsük oldugu not edilmelidir, bu da muhtemelen bu hayvanlarin olmasi gerekenden daha erken temizlendigini gösterir. Arastirma temizligi esnasinda tümörlerin ortalama büyüklügü antikor kohortunda ~1000mm3 olmustur, kapesitabin kohortunda ~700mm3 olmustur ve iksabepilon ve iksabepilon+kapesitabin kohortlarinda 500mm3 ya da altinda olmustur. Mevcut metastazlarin büyük çogunlugu tüm kohortlar arasinda büyüklük olarak 1mm`den daha düsük olmustur. Geçmis arastirmalarda metastazlarin güvenilir sayilari (akcigerlerin seti basina 50-100) birincil tümörler ~1500mm3'e ulasana kadar mevcut olmamistir.

Arastirma 3: Bir sinerjik üçlü-negatif meme kanseri modelinde (4T1) birincil tümör büyümesinin ve metastazlarin üzerinde 1D11'in, iksabepilonun, kapesitabinin ve bu terapötiklerin kombinasyonlarinin etkileri.

Deney Yöntemleri: O.Günde 150 adet on iki haftalik disi BALB/c farelerinin her birine sag bögürden Matrigel içinde 50,000 4T1 hücreleri subkütanöz olarak enjekte edilmistir. Tümör tasiyan fareler rutin olarak takip edilmistir ve &Günden baslanarak 2-3X/haftalik düzenli tümör ölçümleri yürütülmüstür. Tümör hacmi asagidaki formül kullanilarak belirlenmistir: Tümör Hacmi = Uzunluk x Genislik2 x 0.52 Tümör hücresi enjeksiyonundan alti gün sonra, hayvanlar büyüklüge göre eslestirilmistir ve her biri onar fareden olusan on iki tedavi grubuna ayrilmistir. Geri kalan 30 hayvan bu arastirmaya eslik eden bir deneye alinmistir ve makrofaj ikmalinin ve aktivitesinin üzerinde 1D11'in etkileri arastirilmistir. Bu noktada arastirmacilar tedavi grubu tanimlarina körlestirilmistir ve terapötik tatbik baslatilmistir. Bütün fare gruplarina herhangi bir antikor vehikülünün, 1D11'in ya da 13C4'ün tedavileri verilmistir ve bunlar haftada üç kez 100pl IP miktarinda tatbik edilmistir. Farelerin spesifik kohortlari pl içinde 3mg/kg, üç tedavi için dört günde bir) ya da her ikisinin ilave tedavilerini almistir.

Farelerin bütün bir kohortu tek bir grup için ortalama tümör hacmi 1500mm3'e ya da daha fazlasina ulastigi zaman kesilerek öldürülmüstür. Tümörler ülserlendigi zaman ya da hayvanlarda moribund kosullari (timarlanma eksikligi, yorucu olmayan nefes alma, kaseksi, anoreksi ya da letarji) görüldügü zaman büyüklük uç noktasindan önce tek tek fareler öldürülmüstür. Kesilmeden sonra brüt nekropsiler gerçeklestirilmistir ve metastaz tasiyan tümörler, akcigerler ve diger dokular hasat edilmistir. Birincil tümörün bir bölümü immünomarkörlerin IHC'si için OCT içinde dondurulmustur ve geriye kalan tümör ve metastazli diger dokular parafine gömülmek üzere çinko-formalin içinde sabitlenmistir.

Tablo 3: Arginaz deneyleri için arastirma taslagi Grup # Tedavi Gruplari Grup basina hayvan 13 Antikor vehikülü 10 1D11 10mg/kg 10 Zaman noktalari: Gün 0: Arastirmacilar sag bögürden 50,000 4T1 hücreleri + matrigeli subkütanöz olarak enjekte etmistir.

Gün 3: Arastirmacilar 2-3X/hafta tümör ölçümlerine baslamistir.

Gün 6: DCM Personeli antikor dozlamasina IP (SX/hafta baslamistir; toplam yedi tedavi yapilmistir Grup # Tedavi Gruplari Grup basina hayvan Gün 21: Grup 13-15 fareleri kesilerek öldürülmüstür ve birincil tümörler hasat edilmistir Dokular Islak buz üzerinde muhafaza edilen RPMI 1640 + %10 FBS'deki birincil tümörler.

Bu arastirmanin kemo-kombo kisminin üzerine yerlestirilmeyen otuz fare büyüklüge göre eslestirilmistir ve birincil tümör alaninda M2 makrofajlarinin varligini degerlendirmek için antikor vehikülü, 13C4 ya da 1D11 ile tedavi edilen üç ilave gruba bölünmüstür (Tablo 3). Birincil tümörler 21.arastirma gününde bu farelerden toplanmistir. Tümörler, 50ug/ml kolajenazini I, 50ug/ml kolajenazini IV, 25ug/ml hiyalüronidazini, 10ug/ml DNase I'i ve 0.2U/ml tripsin inhibitörünü içeren 5ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) içinde enzimatik olarak dijeste edilmistir. Dokular sürekli karistirilarak 37°C'de 20 dakika boyunca enzim çözeltisi içinde iki kez enkübe edilmistir ve gentleMACS doku ayristirici kullanilarak bir hücre süspansiyonu olusturulmustur. Ayristirilmis hücreler ve geriye kalan doku 100pm”luk bir süzgeçten, ardindan 40pm”luk süzgeçten ve 50 ml'lik santrifüj tüplerinden geçirilmistir. Hücreler HBSS ile iki kez yikanmistir ve canli hücreler sayilmistir. CD11b+ hücrelerinin zenginlestirilmesi için %05 endotoksinsiz BSA'yi ve 2mM EDTA'yi içeren gazi giderilmis her bir 90ul'lik PBS basina 1.0x107 hücreye ayrilmistir ve anti-CD11b manyetik mikro kürelerle enkübe edilmistir. CD11b+ hücreleri AutoMacs Pro Separator kullanilarak pozitif olarak seçilmistir. Tekli CD11b+ hücre süspansiyonlarinin hücreleri arginazi ekstrakte etmek için Iizizlenmistir.

Hücresel arginaz miktar tayini için zenginlestirilmis hücreler PBS ile yikanmistir ve her bir dokudan 1.0x105'lik hücreler 0.5ml mikro santrifüj tüplerinin ayrilmasi için ilave edilmistir. Hücreler, 1000 g'da PBS ile 4°C'de yikanmistir ve peletlere ayrilmis hücreler dakika boyunca Iizizlenmistir. Lizatlar 14,0009'da santrifüjlenmistir ve süpernatantlar miktar tayininin tarihine kadar -80°C'de saklanmistir. Argininin, bir üre standart egrisine karsi ornitine ve üreye dönüstürülmesinin ölçülmesiyle belirlendigi gibi arginaz seviyeleri için, Quantichrome Arginase Kit (BioAssay System) kullanilarak miktar tayini yapilmistir.

Hücre immünofenotiplemesi için her bir dokudan alinan 1.0x106 hücre, miyeloit türevli hücreler (CD11b), makrofajlar (F için antikorlarla boyamadan önce 30 dakika boyunca 10ug/ml Fc Blok (anti-CD16/32) ile bloke edilmistir. Canli/Ölü Sabitlenebilir Ölü Hücre Boyamasi (Invitrogen) kullanilarak hücre canliligi belirlenmistir. Hücreler 15 dakika boyunca %1 paraformaldehit içinde sabitlenmistir ve vakalar bir BD LSR II akis sitometresi üzerinde edinilmistir. Veri analizi Flow Jo yazilimi (Sekil 15) kullanilarak gerçeklestirilmistir.

Tek basina antikor terapisi ile tedavi edilen farelerde gözlemlenen en hizli tümör büyümesi ve antikor + kapesitabin + iksabepilon ile tedavi edilen farelerdeki en yavas büyüme ile tedarik edilen tedaviye dayanarak tümör büyümesi üzerinde farkli etkiler meydana gelmistir (Sekil 16). Bu çalismada hayvanlarin bütün bir kohortu, ilgili kohorttaki ortalama tümör hacminin 1500mm3'lük bir büyüklük uç noktasina ulastigi gün kesilerek öldürülmüstür. Tek basina antikor terapisi kohortundaki fareler arastirmanin 23.9ününe kadar ~1500mm3'lük bir ortalama tümör hacmine ulasmistir.

Kapesitabin ve iksabepilon kohortlari sirasiyla 27.günde ve 29.günde çalismanin uç noktasina ulasan gecikmis tümör büyümesi göstermistir ancak kapesitabinin ve iksabepilonun kombinasyonu bu kohort 30 günde uç noktasina ulastigi için en uzun gecikmeyi yasamistir.

Tek bir ajan olarak 1011, SQ 4T1 tümörlerinin büyümesi üzerinde hiçbir önemli etkiye sahip degildir (Sekil 17A). Kapesitabin ile tedavi, en ilimli tümör büyümesi inhibisyonu ile sonuçlanmistir ve iksabepilon bir monoterapi olarak 4T1 tümör büyümesinin inhibe edilmesi için en etkili olandir. 1D11'in eklenmesi kapesitabinin (Sekil 178) ya da iksabepilonun (Sekil 17C) etkililigini arttirmamistir.

Tümör büyümesinin en güçlü inhibisyonu, Arastirma 09-3493'ten alinan verileri teyit edecek sekilde tek basina ya da 1304 ile birlikte (Sekil 18A) kapesitabin+iksabepilona göre arttirilmis etkililige sahip olan 1D11+kapesitabin+iksabepilon kombinasyonlu tedavisini alan farelerde gözlemlenmistir. Çok çarpici olan bir durum da 1D11, kapesitabin ve iksabepilonun kombinasyonunun, vehiküle (1689.06mm3) ve bu tümör hacmi 1174.50mm3 ile sonuçlanmasidir. Kapesitabinin ve iksabepilonun kombinasyonu tek basina kapesitabinden daha etkili olmustur (Sekil 188) ancak bu kombinasyon iksabepilon terapisinden (Sekil 18C) çok az miktarda daha etkili olmustur. 1D11 içeren terapilere odaklanarak, 1D11+kapesitabin+iksabepil0n tedavisi 1D11+iksabepilondan daha etkili olmustur ve bu da tek bir ajan olarak 1d11”den daha etkili olan 1D11+kapesitabinden daha etkili olmustur (Sekil 19). 1D11, SQ birincil 4T1 tümörlerini tasiyan farelerin akcigerlerinde gelisen metastazlarin sayisi üzerinde hiçbir etkiye sahip degildir. Kapesitabin + iksabepilon ile tedavi, metastazi inhibe eder ve bu kombinasyonlu terapinin etkililigi 1D11 ile büyük oranda arttirilmistir (Sekil 20).

Tablo 4: 4T1 birincil tümörlerinden izole edilen CD11b+ hücrelerinden alinan toplam MDSC ve makrofajlarin yüzdesi Antikor 10mglkg 10mglkg vehikülü 13C4 1D11 4T1 birincil tümörler (toplam makrofajlar) CD11b+ hücrelerinin toplam %,si %94 %94 %90 M2 makrofajlarinin (CD11b*,F immünofenotiplemesi birincil 4T1 tümörlerinden izole edilen CD11b“Ierin çogunlugunun MDSC (Tablo 1) oldugunu göstermistir. TAM'Ierde küçük bir azalma ve kontrollere kiyasla 1D11 ile tedavi edilen birincil tümörlerden MDSC'lerin sayisinda bir azalma var gibi görünmektedir. Toplam makrofajlarin, M1 makrofajlarinin ve M2 makrofajlarinin kantitatif ölçümü her bir bireysel fareden toplanan birincil tümörlerden izole edilen hücrelerin toplam sayisina geri yönlü hesaplama yoluyla yapilmistir (Sekil 21). Bu analiz yoluyla tedavi gruplari arasindaki makrofajlarin sayisi üzerinde hiçbir önemli fark olmamistir. Bununla birlikte 1D11 tedavili farelerin birincil tümörlerinden (Sekil 21) CD206-M1 makrofajlarinda bir artis trendi vardir. 1D11 ile tedavi tümörlerle iliskili M2 makrofajlarinin sayisini azaltmamasina ragmen 1D11, TAM'lar tarafindan arginaz üretimi üzerinde bir inhibitör etkiye sahip gibi görünmektedir. Arginaz seviyeleri kontrollere kiyasla 1D11 ile tedavi edilen farelerden alinan CD11b+ hücre Iizatlarindan önemli oranda azaltilmistir (Sekil 22. p <0.001 tek yollu ANOVA analizi, Tukey çoklu kiyaslama testi).

Klinikte iksabepilonun ve kapesitabinin kombinasyonlu tedavisinin taksana dirençli üçlü negatif meme kanserinde (TNBC) tek basina kapesitabinden daha etkili oldugu rapor edilmistir. 4T1 mürin memeli karsinomu modeli rutin olarak insan TNBC`si için ve TNBC'ye karsi terapötiklerin ön klinik testi için iyi bir tasiyici olarak kullanilir. Önceki arastirmanin amaci 1D11'in kapesitabinin, iksabepilonun ya da iki kemoterapötigin kombinasyonunun birincil tümör büyümesine ve/veya TNBC”nin sinerjik 4T1 modelindeki müteakip metastaza karsi etkililiginin artip artmayacagini saptamaktir.

Bu arastirma 1D11'in 4T1 birincil tümör büyümesini ve birincil tümörden akcigerlere metastazi inhibe etmek için kapesitabin ve iksabepilon kemoterapötiklerinin etkisini arttirabilip arttiramayacaginin tespit edilmesi için tasarlanmistir. En güçlü tümör büyümesi inhibisyonu 1D11 arti kapesitabin ve iksabepilon tedavi grubunda gözlemlenmistir. Kapesitabinin ve iksabepilonun kombinasyonu da akciger metastazini inhibe etmistir ve bu etki 1D11 kombinasyon terapisine eklendigi zaman daha da arttirilmistir. Bu modeli içeren geçmis çalismalarda gözlemlendigi gibi tek bir ajan olarak 1D11 birincil tümör büyümesi üzerinde hiçbir etkiye sahip degildir, metastazi inhibe etmemistir ve bunlar mono terapiler olarak tatbik edildigi zaman kapesitabinin ya da iksabepilonun etkililigini önemli oranda arttirmamistir. çalismalardan elde edilen sonuçlari teyit eder yani 1D11, kapesitabinin ve iksabepilonun 4T1 birincil tümör büyümesine karsi kombinatoryal terapisinin etkililigini önemli oranda arttirabilir ve bu çalisma 1D11*in ayni zamanda kapesitabin + iksabepilon ile metastazin inhibisyonunu arttirildigini gösteren ilk çalismadir. Bu veriler, SQ 4T1 tümör modelinde bir kemoterapötigin etkililiginin birinci iyilestirilmesini temsil eder. Önceden bu modelde 1D11 paklitaksel, cisplatin ya da karboplatin ile birlestirilmistir ve bu çalismalarin her birinde 1D11 test edilen kemoterapötigin etkililigini iyilestirmemistir.

Tek bir ajan olarak 1D11, birincil tümör büyümesi ya da metastaz üzerinde hiçbir etkiye sahip olmadigi için, 1D11'in kapesitabin + iksabepilona eklenmesi bir sinerjik etki ile sonuçlanir. Bu sinerjinin sebebi henüz bilinmemektedir. 1D11 sadece kapesitabin ve iksabepilonun kombinasyonunun etkililigini arttirir ve 1D11, bu kemoterapötikler bireysel olarak tatbik edildigi zaman kapesitabinin ya da iksabepilonun etkililigini sürekli olarak arttirmamistir. 5-florourasile dönüstürülen bir ön ilaç olan kapesitabinin antitümör aktivitesi, bunun bir pirimidin antagonisti olarak islev kabiliyetine baglidir ve iksabepilon bir mikrotübül sabitleyicidir. Klinikte kapesitabin ve iksabepilon kombinasyonu bu ajanlarin üçlü negatif meme kanserine karsi tek basina olmalarindan daha etkilidir. 4T1 tümör modelinde, kombinasyon terapisinin etkililigi tek basina kapasitabinden daha güçlü olmustur ve tek basina iksabepilon ile gözlemlenenden sadece marjinal olarak daha iyidir. TGFß'nin 1D11 ile hedeflenmesi tümör ve stroma-türevli TGFß'nin imünosupresif etkilerini nötralize ederek antitümör immünitesini arttirmasi için düsünülmüstür. Bu sekilde bir agresif tümör modelindeki bu potansiyel ustaca etkilerin, tümörlere çoklu yollari hedefleyen çoklu terapötikler saldirdigi zaman sadece kemoterapötik etkililigi arttirabilmesi mümkündür. 09-3493 çalismasinda, kapesitabin ve iksabepilon kombinasyonu ile tedavi edilen tümör tasiyan hayvanlarda önemli toksisite gözlemlenmistir. Her bir terapötigin dozlari sirasiyla 360mg/kg ve 6mg/kg olmustur. Nöropatiye yol açabilen iksabepilon dozu bu serideki 09-3494 nolu ikinci arastirmada 3mg/kgiye indirgenmistir. Bu da toksisitede ve nöropatide önemli bir azalma ile sonuçlanmistir ve bu nedenle bu doz mevcut çalismada kullanilmistir. Antikor/kemoterapötik tedavi alan hastalarda kilo kaybi gözlemlenmesine ragmen, arka bacak felci ve Arastirma OSB-3493'te gözlemlenen ölüm gibi ciddi advers vakalarda önemli bir azalma görülmüstür. Kilo kaybi kombinasyonlu terapinin en yaygin yan etkisi olmustur ancak 1D11'in eklenmesi bu toksisitenin meydana gelme sikligini arttirmamistir ya da azaltmamistir.

Birlikte alindiginda bu verileri bir TGFß nötralizasyon stratejisinin kapesitabin+iksabepilon terapisi ile birlestirilmesinin klinikte tek basina kapesitabin+iksabepilon ile yapilan tedavi üzerinde bir terapötik yarari saglayacagini gösterir.

Diger tümör modellerindeki metastaza karsi 1D11 ile gördügümüz etkililik ve bu arastirma serisinde kapesitabin + iksabepilonun ilerlemesi göz önüne alindiginda, 1D11'in etki mekanizmasini arastiran birçok çalisma yürütülmüstür. Sitotoksik T pedi tümör modelindeki metastazi inhibe etme kabiliyeti için kritik oldugu tespit edilmistir. 09-4255 arastirmasinda ana etkililik arastirmasinin bir eslik eden deneyi yürütülerek TGFß'nin 1D11 ile nötralizasyonunun TAM'larin dahil edilmesini, fenotipini ve/veya aktivitesini etkileyip etkilemedigini tespit etmek için yürütülmüstür.

Ayni zamanda M1 makrofajlari olarak bilinen klasik olarak aktive edilen TAM`Iar NO sentaz indüklenebilir (iNOS) olmasina ragmen kismen tümörisidaldir. Tam aksine alternatif olarak aktive edilen TAM`Iar ya da M2 makrofajlari tümör yayilmasini, metastazi ve anjiyojenezi destekleyerek tümörün ilerlemesi ile iliskilendirilmistir.

Literatürde M2 makrofajlarinin arginaz salgiladigi ve arginaz yolu içinden tümör hücresi proliferasyonunu destekleyebildigi rapor edilmistir. Baska bir hücre tipi olan MDSC'Ier bir imünosupresif rol oynadiklari birincil tümörlerin alanina dahil edilmistir. MDSC'Ier ve makrofajlar da TGFßlnin büyük üreticileri olup, tümör ilerlemesinin desteklenmesine yardimci olur.

CD68/CD206 ko-lokalizasyonunun immünofloresani M2 makrofajlarinin tedavi edilmemis, tümör tasiyan farelerin 4T1 birincil tümörlerinde mevcut oldugunu göstermistir. Mevcut arastirmada, 1D11 ile tedavi edilen farelerin hem birincil tümörlerinde hem de akcigerlerinde tümörlü M1 makrofajlarinin sayisinda bir artisa dogru bir trend gözlemlenmistir. 1D11 ile tedavi birincil tümörlerle iliskili M2 makrofajlari ve MDSC olmak üzere iki hücre türünde önemli bir azalmaya yol açmamistir. 1D1 ile tedavi tümör destekleyici M2 makrofajlarinin ya da MSDSC'Ierin sayisinda bir azalmaya yol açmamasina ragmen, her iki 4T1 birincil tümöründen izole edilen CD11b+ hücrelerinden intrasellüler arginazin önemli bir azalmasi mevcuttur. Bu da modelde 1D11'in farmakodinamik aktivitesini gösterir çünkü TGFß'nin M2 makrofajlari tarafindan üretilen arginaz sentezini yukari düzenlemesi ve iNOS'un sentezini asagi düzenlemesi gösterilmis olup, bu da antitümorijenik M1 makrofajlari tarafindan üretilmistir. Arginazin tümör hücresi proliferasyonunu destekledigi gösterilmistir bu yüzden TGFß”nin nötralize edilmesiyle arginaz üretiminin inhibe edilmesi tümör proliferasyonu ve büyümesi üzerinde zararli etkilere sahip olabilir.

Pan-Nötralize Edici TGFß Antikoru ID11 ile TGFß'nin Nötralizasyonu Ön Klinik Emör Modelleringe KemoteraMklerin E_tkililigini Arttirir Mürin monoklonal antikor 1D11 kullanilarak TGF-ß nötralizasyonunun kombinasyonu ve seçilmis kemoterapötikler meme kanserinin, pankreatik kanserin, melanomun ve böbrek hücresi karsinomunun mürin modellerinde test edilmistir. Test edilen kombinasyonlar arasindan sadece 1D11'in kapesitabin + iksabepilonun kombinasyonlu terapisine eklenmesi tek basina kemoterapötik rejim üzerinde arttirilmis etkililik ile sonuçlanmistir. 1D11, kapesitabin+iksabepilonun birincil tümör büyümesine karsi etkililigini rutin olarak arttirmistir ve sinerjik 4T1 subkütanöz (SQ) tümör modelinde metastazi inhibe etmistir ve 1D11 birçok kanser çalismasinda kemoterapötiklerle birlestirildigi zaman katki etkilerinin birinci göstergesidir. meme kanseri modelinde hem de singenetik 4T1 meme kanseri modelinde paklitaksel ile birlestirilmistir. Bu çalismalarda 1D11 birincil tümörlerin paklitaksel ile inhibisyonunu arttirmamistir ve 4T1 çalismalarinda 1D11 ayni zamanda birincil tümörlerden akcigerlere kadar spontane metastazlari inhibe etme kabiliyetini arttirmamistir. 1D11'in ve siklofosfamidin kombinasyonu ayni zamanda MDA-MB-231 ksenogreft modelinde test edilmistir ve yine 1D11 birincil tümör büyümesine karsi siklosfamidin etkililigini arttirmamistir. MDA-MB-231 ve 4T1 modelleri de 1D11 ve platin bilesikler cisplatin ya da karboplatin ile kombinasyonlu terapileri test etmek için kullanilmistir. 4T1 SQ modellerinde, 1D11 birincil tümör büyümesine karsi karboplatinin etkililigini arttirmamistir. Deneysel metastazin bir 4T1 modelinde, ki burada tümör hücreleri kalbin sol kapakçigina enjekte edilir ve sonuçta kemiklerin, adrenal bezlerin, böbreklerin ve akcigerlerin metastatik tohumlamasi meydana gelir, hem 1D11 hem de cisplatin özellikle kemige metastazi inhibe edebilmistir ancak iki terapötik birlestirildigi zaman hiçbir arttirilmis etkililik gözlemlenmemistir.

Pankreatik kanser ya da melanom modellerinde standart bakim kemoterapötikleri ile 1D11 birlestirildigi zaman hiçbir etkililik artisi gözlemlenmemistir. Gemisitabin pankreas kanseri için ilk siradaki kemoterapötiktir ve 1D11'in ve gemsitabinin kombinasyonu bir SQ ksenogreft modelinde (Pano-1), bir SQ singenetik modelinde (Pan02) ve Kras/mutant p53-tahrikli pankreatik duktal adenokarsinomun (PDAC) genetik olarak yapilandirilmis fare modelinde (GEMM) test edilmistir. Pano-1 çalismalarinda 1D11 gemsitabinin SQ birincil tümörlerine karsi etkililigi üzerinde hiçbir etki sahibi degildir ve PDAC GEMM ile benzer bir etki gözlemlenmistir. Ancak Pan02 modelinde 1011 ile gemsitabinin birlestirilmesi fiili olarak gemsitabinin birincil tümör büyümesine karsi etkililigini azaltmistir ve sonuçta kontrollere kiyasla tümör büyümesi hizlanmistir.

B16-F1O mürin melanom modeli, 1D11'in, melanomda ilk siradaki tedavi olarak kullanilan kemoterapötik olan dakarbazin ile birlestirilmesinin etkilerini degerlendirmek için kullanilmistir. Bir SQ B16-F10 modelinde, 1D11 dakarbazinin birincil tümör büyümesine karsi etkililigini arttirmamistir. 1D11'in ve dakarbazinin kemo-kombosu da B16-F1O mürin melanomunun bir spontane metastaz modelinde test edilmistir. Bu modelde tümör hücreleri farelerin plantar bölgesine subkütanöz olarak enjekte edilmistir burada bir birincil tümör gelisir ve bölgesel popliteal lenf noduna spontane olarak metastaz yapar. SQ modelinde oldugu gibi 1011 dakarbazinin birincil tümörlere karsi etkililigini arttirmaz ve ilaveten dakarbazinin akan lenf noduna karsi metastazinin etkililigini arttirmaz.

Son olarak 1D11, siklofosfamit ve paklitaksel ile kombinasyonlu olarak bir Caki-1 böbrek hücresi karsinomu ksenogreft modelinde test edilmistir ve bu çalismada 1D11`in bu kemoterapötiklerin her birinin etkililigini azalttigi görülmüstür. Özetle, veriler TGFß'nin 1D11 ile nötralizasyonunun sadece spesifik kemoterapötiklerin etkililigini arttirdigini gösterir. 1D11 meme kanserinin bir ön klinik modelinde kapesitabin ve iksabepilon kombinasyonunun etkililigini arttirmistir ancak ilgili tümör modellerinde paklitakselin, siklofosfamidin, cisplatinin, karboplatinin, gemsitabinin ya da dakarbazinin etkililigini arttirmamistir.

Ana basvurunun orijinal Istemlerde tanimlandigi gibi bulus, asagidaki paragraflarda ifade edilmistir: 1. Bir süjede bir meme kanserinin tedavi edilmesi için bir yöntem olup, yöntem asagidaki adimlari içerir: adi geçen süjeye kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak bir Dönüstürücü Büyüme Faktörü beta (TGFß) antagonistinin terapötik olarak etkili bir miktarinin tatbik edilmesi, burada adi geçen TGFß antagonistinin tatbik edilmesi kapesitabin ve iksabepilonun adi geçen meme kanserini tedavi etme etkililigini arttirir. Önceki paragraf 1'e göre yöntem olup, burada adi geçen TGFß antagonisti bir TGFß proteininin reseptörüne baglanmasini önleyen bir ajandir. Önceki paragraf Z'ye göre yöntem olup, burada adi geçen ajan bir proteindir. Önceki paragraf Sie göre yöntem olup, burada adi geçen ajan bir anti-TGFß antikorudur. Önceki paragraf 4le göre yöntem olup, burada adi geçen antikor bir pan nötralize edici anti-TGFß antikorudur. Önceki paragraf 4le göre yöntem olup, burada adi geçen antikor bir anti-TGFß monoklonal antikorudur. Önceki paragraf 6'ya göre yöntem olup, burada adi geçen antikor 1D1 1 'in bir ya da daha fazla CDR'sini içeren bir insancillastirilmis antikordur. Önceki paragraf ?ye göre yöntem olup, burada adi geçen TGFß proteini TGFß- 1, -2, -3 ya da bunlarin bir kombinasyonudur. Önceki paragraf 1'e göre yöntem olup, burada adi geçen TGFß antagonistin bir TGFß`nin aktivitesini azaltabilen bir moleküldür. Önceki paragraf 1'e göre yöntem olup, burada adi geçen TGFß antagonisti kapesitabin ve iksabepilon ile birlikte tatbik edilir. Önceki paragraf 1'e göre yöntem olup, burada adi geçen TGFß antagonisti kapesitabin ve iksabepilonun tatbikinden bagimsiz olarak tatbik edilir. Önceki paragraf 1'e göre yöntem olup, burada kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak adi geçen TGFß antagonistinin tatbiki birincil tümörün büyümesini inhibe eder. Önceki paragraf 1`e göre yöntem olup, burada kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak adi geçen TGFß antagonistinin tatbiki metastazi inhibe Istem 1'e göre yöntem olup, burada kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak adi geçen TGFß antagonistinin tatbiki birincil tümörden akcigere metastazi önler.

Bir süjede bir meme kanseri ile iliskili tümör büyümesinin inhibe edilmesi için bir yöntem olup, yöntem asagidaki adimi içerir: adi geçen süjeye kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak bir Dönüstürücü Büyüme Faktörü beta (TGFß) antagonistinin terapötik olarak etkili bir miktarinin tatbik edilmesi, burada adi geçen TGFß antagonistinin tatbik edilmesi kapesitabin ve iksabepilonun adi geçen meme kanseri ile iliskili tümör büyümesini tedavi etme etkililigini arttirir. Önceki paragraf 15'e göre yöntem olup, burada adi geçen TGFß antagonisti bir TGFß proteininin reseptörüne baglanmasini önleyen bir ajandir Önceki paragraf 16'ya göre yöntem olup, burada adi geçen ajan bir proteindir. Önceki paragraf 17'ye göre yöntem olup, burada adi geçen ajan bir anti-TGFß antikorudur. Önceki paragraf 18'e göre yöntem olup, burada adi geçen antikor bir pan nötralize edici anti-TGFß antikorudur. Önceki paragraf 18'e göre yöntem olup, burada adi geçen antikor bir anti-TGFß monoklonal antikorudur. Önceki paragraf 20'ye göre yöntem olup, burada adi geçen antikor 1D11'in bir ya da daha fazla CDRisini içeren bir insancillastirilmis antikordur. Önceki paragraf 16'ya göre yöntem olup, burada adi geçen TGFß proteini TGFß-1, -2, -3 ya da bunlarin bir kombinasyonudur. Önceki paragraf 15`e göre yöntem olup, burada adi geçen TGFß antagonistin bir TGFß'nin aktivitesini azaltabilen bir moleküldür. Önceki paragraf 15'e göre yöntem olup, burada adi geçen TGFß antagonisti kapesitabin ve iksabepilon ile birlikte tatbik edilir. Önceki paragraf 15'e göre yöntem olup, burada adi geçen TGFß antagonisti kapesitabin ve iksabepilonun tatbikinden bagimsiz olarak tatbik edilir. Önceki paragraf 15'e göre yöntem olup, burada kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak adi geçen TGFß antagonistinin tatbiki birincil tümörün büyümesini inhibe eder. Önceki paragraf 15'e göre yöntem olup, burada kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak adi geçen TGFß antagonistinin tatbiki metastazi inhibe Istem 15'e göre yöntem olup, burada kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyonlu olarak adi geçen TGFß antagonistinin tatbiki birincil tümörden akcigere metastazi önler.

Tümör Hacmi (mm3) Vehikul ~--- Vehikül +0309 › ~-1Dî'+Cape mâ?” Vehikul +Ixa * 'SCArxa -i-Vehikul +Ixa+Cape ...4... 13i34+-)cascape -ii- ' Dî1+\xa-Cape A 2500- K. &x Vehikül E 2000' «1D11 g 1500" 8 î; &VehiküIJrCape 6` *' î304+Cape E 2000- -v 1D11+Cape E 1000- ” C ;a Vehikul+lxa ”A 1500' 1304+ixa T: 1000- A 6" 2000- -I- Vehikül +Ixa+Cê1pe E mßm 13C4+lxa+Cape E 1500_ +1Dî1+lxa+Cape cu 1000- E 500- B 2000. \ Vehikül G; w&“Vehküß+Cape g 1500. ~ 13C4+Cape .g “Kâr“ 1 D1 `I+Cape g 1000. + Vehikül +lxa+Cape .5 m0..” 13C4+Ixa+Cape g 500- +1D11+lxa+Cape --\\ Vehikül +lxa wéw 1 D11+Ixa -i- Vehikül +lxa+Cape +1D11+lxa+Cape Tümör Hacmi (mma) SEKl3 s asi ~ r \\ 1 D11+Cape --â-m1D11+lxa +1D11+lxa+Cape Tümör Hacmi (mma) Sagkalim %'si 20 30 40 5° çalisma Günleri Vehikül Veh+Capecitabine - 13C4+Capecitabine 1D11+Capecitabine Veh+lxabepilone »w1D11+|xabepilone -i- Veh+lxa+Cape --6- 1304+|xa+Cape +1D11+|xa+Cape .mamo+mg+FFop iwamo+mx_+cm> .9.150 w ißxîvoî .mamo+e0nr 3:50 :39_ .::820: w: EE FA _umumwuos_ 5098:.` Arastirmadaki Günlere göre Tx'e göre Metastazlarin Ortalama Sayisi Metastazlarin ortalama sayisi Arastirma Günleri » &1334 0 Exa › Cape 9 D Vehikul - Ixe; «- Çapi.' D I 3! ' + Cape 51315 i Sxe D 13534 0 Exa D 13:34 El Vehikul /22 1400- 1300- 1200- 1100' 1000- Tümör Hacmi (mm3) /22 Vehikül - 1D11 Vehikül + Kapesitabin. 1304 + Kapesitabin 1 D11 + Kapesitabin 13C4 + Iksabepilon W1D11 + Iksabepilon -i- Vehikül + lxa + Cape -W'M13C4 + Ixa + Cape +1011+lxa+ Cape 11/22 1500- Tümör Hacmi (mma) Tümör Hacmi (mms) Tümör Hacmi (m 11/22 »55 1304 N:5~: 1 D1 1 1200- 1100- 1000- VehiKÜI + Kapesitabin 1304 + Kapesitabin 1 DH + Kapesitabin »55» Vehikül »55 Vehikül + Iksabepilon -1304 + Iksabepilon 12/22 12/22 E 800- W1304+lxa+Cape T: Ö -ii- 101 1+lxa+Cape g 600- ._ 400- E 200- B1 200- ›:< Veh i kül ”E 1 SC4+Cape g 400_ W13C4+lxa+Cape E 200- 1200- \ VehIkÜI " 1000- \\ \\Vehikül +lxa g 8 -- î3C4+Ixa g 600- -i-VehmuLHxa+Cape E 400_ W13C4+lxa+Cape E 200- 13/22 Tümör Hacmi (mms) 13/22 --x 1D11+Cape mâ“ 1D1 1 +lxa 14/22 14/22 /22 /22 16/22 16/22 Vehikul 2500' 13C4 l3-. 101 1 E 2000' Vehikül › Kapesilabin E_ 1704 + Ka `t b' - 71011 + Kapesitabin 13C4 + Iksabepilon +Vehikül + Cape + x& +1Dî1 +Cape+1xa SEKIL 16 17/22 17/22 A 2000- \ \\ Vehikül 6; 5" NNN î 304 E 1000- B 2000- A N Vehikül +Cape ”E 1500. "N ~- 1304+Cape g, 1D1 1+Cape g 1000_ NNN Vehikul 2000- C A Vehikül +Ixa g Mam- îD11+lxa 1000_ NN Vehikül SEKIL 17 18/22 18/22 e - Vehikul +Vehikül +Cape+lxa ~4~1384oCapeolxa +1D1î+Cap8+îxa Tümör Hacmi (mms) 2000- 2 B ..: Vehikül ”E Vehikui+Cape E 1500" ' `1:3(34pîlaoe 3 1000- -i-Vehikül +Capei xa C2000- «:2 Vehikul ...A 25%› Vehikül +ixa E 1500- 13C4+lxa g +1011+ixa E 1000- +Vehikül+Cape+ xa 2 -~0--- 1SC4+CaDe+Ixa 500“ -i-îD'hCaoeHxa 19/22 19/22 2000- <\ Veh I kül E 1500. 1D11 g \ 1 D1 1+Cape g 1000- W1011+lxa g 500. +1D11+Cape+lxa SEKIL 19 /22 /22 21/22 21/22 4 3 2 ..I 22/22 22/22 5520› A±3VEDasaato

Claims (14)

ISTEMLER

1. Bir öznede meme kanseri ile iliskili tümör büyümesini inhibe etmeye yönelik bir yöntemde kullanima yönelik bir TGFß antagonisti olup, özelligi yöntemin kapasitabin ve iksabepilon ile kombinasyon halinde TGFB antagonistinin terapötik olarak etkili bir miktarinin söz konusu özneye uygulanmasini içermesidir, burada söz konusu TGFB antagonistinin uygulanmasi, söz konusu meme kanseri ile iliskili tümör büyümesini inhibe etmek üzere kapesitabin ve iksabepilonun etkinligini gelistirir.

2. Istem 1'e göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu TGFß antagonistinin bir TGFß proteininin bunun reseptörüne baglanmasini bloke eden bir ajan olmasidir.

3. Istem 2'ye göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu ajanin bir protein olmasidir.

4. Istem 3'e göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu ajanin bir anti- TGFß antakoru olmasidir.

5. Istem 4'e göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu antikorun bir pan nötralize edici anti-TGFß antikoru olmasidir.

6. Istem 4'e göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu antikorun bir anti-TGFß monoklonal antikor olmasidir.

7. Istem 6*ya göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu antikorun 1D11'in bir veya daha fazla CDR'sini içeren bir insanlastirilmis antikor olmasidir.

8. Istem 2'ye göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu TGFß proteininin TGFß-t, -2, -3 veya bunlarin bir kombinasyonu olmasidir.

9. istem 1'e göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu TGFß antagonistinin, bir TGFß'nin aktivitesini azaltabilen bir molekül olmasidir.

10.Istem 1”e göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu TGFB antagonistinin kapesitabin ve iksabepilon ile birlikte uygulanmasidir.

11.Istem 1'e göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu TGFß antagonistinin, kapesitabin ve iksabepilonun uygulanmasindan bagimsiz olarak uygulanmasidir.

12.Istem 1'e göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu TGFß antagonistinin kapesitabin ve ixabepilon ile kombinasyon halinde uygulanmasinin primer tümörün büyümesini inhibe etmesidir.

13.Istem 1'e göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu TGFß antagonistinin kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyon halinde uygulanmasinin metastazi inhibe etmesidir.

14.Istem 1'e göre kullanima yönelik TGFß antagonisti olup, özelligi söz konusu TGFß antagonistinin kapesitabin ve iksabepilon ile kombinasyon halinde uygulanmasinin primer tümörden cigere metastazi inhibe etmesidir.