ME02464B - Kombinovana terapija za lečenje raka dojke - Google Patents

Description

KOMBINOVANA TERAPIJA ZA LEČENJE RAKA DOJKE

REFERENCE NA SRODNE PRIJAVE

[0001] Ova prijava poziva se na prioritet Privremene prijave patenta br. 61/313,515 u SAD, zavedene 12. marta 2010. godine.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Ovaj pronalazak odnosi se na kompozicije i metode za lečenje raka dojke. Konkretno, pronalazak se odnosi na primenu antagonista transformišućeg faktora rasta beta (TGFß) u kombinaciji s jednim ili više hemioterapijskih agenasa radi lečenja raka dojke.

POZADINA PRONALASKA

[0003] Superfamilija transformišućeg faktora rasta beta (TGF-beta ili TGFß) sadrži mnoge proteine koji imaju zajedničke elemente sekvenci i strukturne motive. Za ove proteine zna se da pokreću širok spektar bioloških odgovora u raznim tipovima ćelija. Ćelijsko signaliziranje koje pokreću članovi superfamilije TGFß obuhvata kooperativno vezivanje liganda i za TGFß tip II i za tip III komponente transmembranskih receptora, što indukuje izgradnju aktivnog receptorskog kompleksa serin/treonin kinaze sa receptorom TGFß tipa I. Ovaj receptorski kompleks pokreće put prenosa signala fosforilacijom citoplazmatskih Smad proteina, koji se zatim translociraju u jedro i deluju tako što suprimiraju ili aktiviraju transkripciju ciljnih gena.

[0004] Mnogi proteini TGFß superfamilije imaju važne funkcije tokom embrionalnog razvoja u stvaranju obrazaca i specifikaciji tkiva. Signalizacija indukovana proteinima iz TGFß superfamilije reguliše različite procese diferencijacije, uključujući adipogenezu, miogenezu, hondrogenezu, hematopoezu i diferencijaciju epitelnih ćelija (za pregled videti Massague, 1987, Cell 49:437; Siegel et al., 2003, Nature Review Cancer, 8:807-20). U tkivima odraslih proteini TGFß superfamilije takođe su uključeni u procese poput rasta i metastaziranja tumora, zarastanja rana, reparacije kosti te remodelovanja kosti. Tumor-supresivni efekti TGFß proteina prikazani su u ranijim studijama. Videti Derynck et al., 2001, Nat Genet, 29:117-129.

[0005] Molekuli TGFß antagonista regulišu signalizaciju posredovanu TGFß proteinima. Primeri ovakvih antagonista obuhvataju monoklonalna i poliklonalna antitela usmerena protiv jedne ili više izoformi TGFß (američki patentU.S. Pat. No. 5,571,714 i PCT patentna prijava WO 97/13844).

[0006] Za molekule antagonista TGFß otkriveno je da inhibišu tumorogenosti ćelija raka dojke i da povećavaju aktivnost ćelija prirodnih ubica u slezini miševa. Videti Arteaga et al., 1993, J. Clin. Invest., 92:6.

[0007] Postoji potreba za kombinovanim terapijskim modalitetima za lečenje raka.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

[0008] Pronalazak obezbeđuje kombinovani terapijski metod za lečenje raka dojke kod ispitanika. Metod uključuje korake primene terapijski efikasne količine antagonista transformišućeg faktora rasta beta (TGFß) kod ispitanika u kombinaciji s kapecitabinom, iksabepilonom ili oba. Primena (TGFß) antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom povećava efikasnost kombinacije kapecitabina i iksabepilona u lečenju raka dojke.

[0009] U jednom otelotvorenju, TGFß antagonist je molekul koji blokira vezivanje TGFß proteina za njegov receptor. U drugom otelotvorenju, TGFß antagonist je molekul koji je sposoban da smanji aktivnost TGFß. U jednom konkretnom otelotvorenju, TGFß antagonist je anti-TGFß monoklonalno antitelo koje se vezuje za ili neutrališe jednu ili više izoformi TGFß (npr. pan-specifično anti-TGFß antitelo).

[0010] U nekim otelotvorenjima, TGFß antagonist se primenjuje zajedno s kombinacijom kapecitabina i iksabepilona. U drugim otelotvorenjima, TGFß antagonist se primenjuje nezavisno od primene kombinacije kapecitabina i iksabepilona.

[0011] Kombinovana terapija pronalaska inhibiše rast primarnog tumora i dalje inhibiše metastaziranje primarnog tumora u pluća.

[0012] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapijski efikasnu količinu TGFß antagonista, naznačenu time što je TGFß antagonist prisutan u količini delotvornoj da poveća efikasnost kombinacije kapecitabina i iksabepilona u lečenju raka dojke.

[0013] Pronalazak dalje obezbeđuje komplet koji sadrži terapijski efikasnu količinu TGFß antagonista, naznačenu time što je TGFß antagonist prisutan u količini delotvornoj da poveća efikasnost kombinacije kapecitabina i iksabepilona u lečenju raka dojke.

[0014] Druge osobine i prednosti predmetnog pronalaska postaće jasne iz sledećih primera i slika s detaljnim opisima. Međutim, treba imati u vidu da su detaljni opis i specifični primeri, iako ukazuju na poželjna otelotvorenja pronalaska, dati samo kao ilustracija, budući da će različite izmene i modifikacije unutar ideje i okvira pronalaska iz ovog detaljnog opisa postati jasne onima upućenim u predmetnu oblast.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0015]

Slika 1 prikazuje srednje vrednosti zapremine primarnih tumora. Inhibicija rasta tumora zabeležena je u kohortama s kapecitabinom, iksabepilonom i kapecitabinom+iksabepilonom, u poređenju s kohortom samo sa antitelom.

Slika 2 prikazuje da 1D11 kao samostalni agens nije imao relativno nikakvog efekta na rast 4T1 tumora (A). 1D11 je povećavao efikasnost kapecitabina (B), ali ne i efikasnost iksabepilona (C).

Slika 3 prikazuje da je dodavanjem 1D11 povećana efikasnost kombinovane terapije kapecitabin + iksabepilon u inhibiciji rasta 4T1 tumora (A). Kapecitabin je inhibirao rast 4T1 tumora, ali nije bio podjednako efikasan kao iksabepilon, iako je 1D11 povećavao efikasnost kapecitabina, što je rezultovalo inhibicijom rasta 4T1 tumora slično onoj kod primene samo iksabepilona (B). Nije bilo značajne prednosti kombinovane terapije kapecitabin+iksabepilon nad primenom samo iksabepilona, osim ako u kombinovanu terapiju nije bio uključen i 1D11 (C).

Slika 4 prikazuje pregled efekata antitela 1D11 kao samostalnog agensa, odnosno u kombinaciji s kapecitabinom i/ili iksabepilonom na rast 4T1 tumora. Najefikasnija terapija je trojna kombinacija 1D11+kapecitabin+iksabepilon.

Slika 5 prikazuje krivu preživljavanja kod životinja. Najduže preživljavanje (medijana) zabeleženo je kod životinja koje su lečene kombinacijom 1D11 + kapecitabin + iksabepilon.

Slika 6 prikazuje da je vreme potrebno da se dostigne krajnja tačka, zapremina primarnog tumora ≥2000 mm3, značajno različito (p<0,0001) između terapijskih grupa. 1D11 je produžavao vreme do krajnje tačke kod terapije kapecitabinom, a najduže vreme do krajnje tačke postignuto je u grupi 1D11+kapecitabin+iksabepilon.

Slika 7 prikazuje ukupan broj metastaza u plućima u svim terapijskim grupama (A) i ukupan broj metastaza u plućima veličine >1 mm u svim terapijskim grupama (B). Najveći broj metastaza u plućima u svakoj kohorti bio je u terapijskoj grupi s najdužim vremenom do krajnje tačke; u svim slučajevima to je bila 1D11 terapijska grupa.

Slika 8 prikazuje broj metastaza u plućima u kohorti s jednim agensom (A), kohorti s kapecitabinom (B), kohorti sa iksabepilonom (C) i kohorti s kapecitabinom+iksabepilonom (D). U svakoj kohorti, najveći broj metastaza u plućima zabeležen je u 1D11 terapijskoj grupi, verovatno stoga što su ove terapijske grupe duže bile u studiji nego njihove odgovarajuće kontrole unutar svake kohorte.

Slika 9 prikazuje da je postojala korelacija između broja metastaza u plućima i vremena provedenog u studiji, bez obzira na terapiju.

Slika 10 prikazuje srednje vrednosti zapremine primarnih tumora. Inhibicija rasta tumora zabeležena je u kohortama s kapecitabinom, iksabepilonom i kapecitabinom+iksabepilonom, u poređenju s kohortom samo sa antitelom.

Slika 11 prikazuje da je terapija antitelom 1D11 imala blag efekat kada je ono primenjeno kao samostalni agens, odnosno u kombinaciji ili s kapecitabinom ili sa iksabepilonom. A. Terapija antitelom 1D11 kao samostalnim agensom rezultovala je značajnim smanjenjem veličine primarnog tumora. B. 1D11, primenjen u kombinaciji s kapecitabinom, rezultovao je povećanom efikasnošću, većom od one kod primene samo kapecitabina. C. 1D11 nije povećavao efikasnost iksabepilona na statistički značajan način. (A: * = p<0,05, Takijev test višestrukih poređenja) (B: * = p<0,05, ** = p<0,01, T-Test).

Slika 12 prikazuje da je terapija antitelom 1D11 značajno povećala efikasnost kombinacije iksabepilon/kapecitabin na zapreminu primarnog tumora. A. 1D11 je povećavao efikasnost iksabepilona i kapecitabina u poređenju sa 13C4 kombinovanim sa iksabepilonom i kapecitabinom. B. Iksabepilon je značajno povećavao efikasnost 1D11 i kapecitabina kada su se dozirali zajedno. C. Trojna kombinacija 1D11, kapecitabina i iksabepilona bila je efikasnija nego 1D11 + iksabepilon. (A: * = p<0,05, T-Test) (B: *** = p<0,001, jednosmerna Anova) (C: * = p<0,05, T-Test)

Slika 13 prikazuje pregled efekata 1D11 kao samostalnog agensa, odnosno u kombinaciji s kapecitabinom i/ili iksabepilonom na rast 4T1 tumora. Najefikasnija terapija je trojna kombinacija 1D11+kapecitabin+iksabepilon.

Slika 14 prikazuje ukupne metastaze u plućima. 1D11 nije smanjivao broj metastaza u plućima niti je povećavao efikasnost hemioterapeutika.

Slika 15 prikazuje shemu gejtinga CD11b+ ćelija izolovanih iz 4T1 primarnih tumora. (A) FSC hi gejting zasnovan na veličini i rasipanju. (B) Live gate (tamne, 52%) vijabilnih ćelija kroz FSC hi gejt. (C) Gejting MDSC ćelija (Gr-1 PE svetle CD11b PerCP Cy5.5 svetle, 74,1%) i makrofaga (Gr-1 PE tamni i CD11b PerCP Cy5.5 svetli, 15,4%) u okviru gejta živih ćelija (D) Gejting M1 makrofaga (F4/80 svetli i CD206 Alexa 488 tamni, 83%) i M2 makrofaga (F4/80 svetli i CD206 Alexa 488 svetli, 15,7%) u okviru gejta za makrofage (E) Potvrda CD206 negativnog/niskog statusa MDC kroz gejt Gr-1+CD11b+.

Slika 16 prikazuje srednje vrednosti zapremine primarnih tumora. Inhibicija rasta tumora zabeležena je u kohortama s kapecitabinom, iksabepilonom i kapecitabinom+iksabepilonom, u poređenju s kohortom samo sa antitelom.

Slika 17 prikazuje da 1D11 kao samostalni agens nije imao nikakvog efekta na rast 4T1 tumora (A). 1D11 takođe nije značajno povećavao efikasnost kapecitabina (B) niti iksabepilona (C).

Slika 18 prikazuje da je 1D11 povećavao efikasnost kombinovane terapije kapecitabin + iksabepilon u inhibiciji rasta 4T1 tumora (A). Kapecitabin je blago inhibirao rast 4T1 tumora, ali je bio efikasniji u kombinaciji sa iksabepilonom (B). Po pitanju inhibicije rasta tumora, iksabepilon i kombinovana terapija kapecitabin+iksabepilon bili su slični, osim ako u kombinovanu terapiju nije bio uključen i 1D11 (C).

Slika 19 prikazuje pregled efekata 1D11 kao samostalnog agensa, odnosno u kombinaciji s kapecitabinom i/ili iksabepilonom na rast 4T1 tumora. Najefikasnija terapija je trojna kombinacija 1D11+kapecitabin+iksabepilon.

Slika 20 prikazuje da su metastaze u plućima kod miševa sa SQ 4T1 tumorima bile smanjene kombinovanom terapijom kapecitabin + iksabepilon te da je efikasnost ove terapije značajno povećana dodavanjem 1D11.

Slika 21 prikazuje da je, na osnovu imunofenotipizacije ukupnih makrofaga (F4/80+), M1 makrofaga (F480+CD206-) i M2 makrofaga (F4/80+CD206+) izolovanih iz 4T1 primarnih tumora u studiji 09-4255, 1D11 imao neznatan efekat na broj makrofaga u primarnim tumorima. Crni stubac predstavlja nosač; crveni stubac predstavlja 13C4 (kontrolu); a plavi stubac predstavlja 1D11.

Slika 22 prikazuje da je arginaza iz CD11b+ ćelija izolovanih iz 4T1 primarnih tumora miševa lečenih antitelom 1D11 značajno snižena u poređenju s kontrolnim miševima.

[0016] Ovde opisan 1D11 predstavlja anti-TGFß monoklonsko antitelo.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0017] Ovaj pronalazak odnosi se na kompozicije i metode za lečenje raka dojke. Konkretno, pronalazak se odnosi na primenu TGFß antagonista u kombinaciji s jednim ili više hemioterapijskih agenasa radi lečenja raka dojke. Upotreba TGFß antagonista u kombinaciji s jednim ili više hemioterapijskih agenasa povećava efikasnost tog jednog ili više hemioterapijskih agenasa u lečenju raka dojke.

[0018] Hemioterapijski agensi iz ovog pronalaska obuhvataju, ali nisu ograničeni na kapecitabin, iksabepilon ili njihovu kombinaciju.

[0019] U jednom otelotvorenju, ovde je predstavljena metoda za povećanje efikasnosti određene hemioterapije za lečenje raka dojke kod ispitanika, a metoda obuhvata: primenu kod pomenutog ispitanika terapijski efikasne količine TGFß antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom, naznačeno time što primena pomenutog TGFß antagonista povećava efikasnost kapecitabina i iksabepilona u lečenju pomenutog raka dojke.

[0020] U drugom otelotvorenju, ovde je predstavljena metoda za inhibiciju rasta tumora povezanog s rakom dojke kod ispitanika, a metoda obuhvata: primenu kod pomenutog ispitanika terapijski efikasne količine TGFß antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom, naznačeno time što primena pomenutog TGFß antagonista povećava efikasnost kapecitabina i iksabepilona u inhibiciji pomenutog rasta tumora povezanog s rakom dojke.

[0021] Pronalazači aktuelne aplikacije iznenađujuće i neočekivano su otkrili da neutralizacija TGFß u kombinaciji s jednim ili više hemioterapijskih agenasa povećava efikasnost jednog ili više hemioterapijskih agenasa u lečenju raka dojke. Na primer, primena TGFß antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom iznenađujuće i neočekivano povećava efikasnost kapecitabina i iksabepilona u lečenju raka dojke.

[0022] Kako se ovde koristi, „TGFß“ odnosi se na sve izoforme TGFß. Trenutno postoji 5 poznatih izoformi TGFB (1-5), od kojih su sve homologe (60-80% istovetnosti) i od kojih sve grade homodimere od oko 25 kD, a deluju na zajedničke TGFß ćelijske receptore (tipovi I, II i III). Genetika i molekularna biologija TGFß dobro su poznate u struci (videti, na primer, Roberts, 1998, Miner. Electrolyte and Metab., 24(2-3):111-119; Wrana, 1998, Miner. Electrolyte and Metab., 24(2-3):120-130.)

[0023] Kako se ovde koristi, „TGFß antagonist“ je bilo koji molekul koji je sposoban da smanji količinu ili aktivnost TGFß, bilo u ćeliji ili u fiziološkom sistemu. Poželjno, TGFß antagonist deluje tako što smanjuje količinu ili aktivnost TGFß 1, 2 ili 3. Na primer, TGFß antagonist može biti molekul koji inhibira ekspresiju TGFß na nivou transkripcije, translacije, obrade ili transporta; može uticati na stabilnost TGFß ili na konverziju prekursorskog molekula u aktivan, zreli oblik; može uticati na neutralizaciju TGFß ili na sposobnost TGFß da se vezuje za jedan ili više ćelijskih receptora (npr. tip I, II ili III); ili može uticati na signalizaciju putem TGFß.

[0024] Niz TGFß antagonista i metoda za njihovu proizvodnju poznati su u struci, a mnogi drugi se trenutno razvijaju (videti, na primer, američki patent Dennis et al., U.S. Pat. No. 5,821,227). Upotreba specifičnog TGFß antagonista nije ograničavajući faktor; bilo koji efikasan TGFß antagonist kako je ovde definisan može da se koristi u metodama i kompozicijama iz ovog pronalaska. U jednom otelotvorenju, TGFß antagonist je TGFß-1, TGFß-2 ili TGFß-3 antagonist. U jednom konkretnom otelotvorenju, TGFß antagonist je pan-specifično anti-TGFß antitelo koje se vezuje za ili neutrališe jednu ili više izoformi TGFß.

[0025] Efekti TGFß posredovani su vezivanjem aktivnog TGFß za specifične receptore prisutne na ćelijama, što je praćeno prenosom signala na te ćelije. TGFß antagonisti definisani su kao agensi koji inhibiraju prenos signala putem TGFß, uključujući TGFß antagoniste koji su poznati u struci. Na primer, agensi koji vezuju TGFß i sprečavaju TGFß da se veže za TGFß receptor delovaće kao TGFß antagonisti.

[0026] Drugi neograničavajući primeri uključuju blokirajuća (neutrališuća) antitela specifična za humani TGFß (NAbs) poput onih koje su opisali Dasch et al. (J. Immunol. (1989) 142:1536) i Lucas et al. (J. Immunol. (1990) 145:1415), rastvorljive TGFß receptore, TGFß receptore vezane za membranu, inhibitore proteaze koji inaktivišu proteazu odgovornu za aktivaciju prekursora TGFß u zreli TGFß, antitela specifična za TGFß receptore (tipove I, II ili III), a koja sprečavaju vezivanje TGFß za receptor, te njihove kombinacije.

[0027] Iskusni u struci poznaju različite načine na koje se antitelo dobijeno od jedne vrste, na primer miša, može obraditi tako da bude terapijski primenljivo na drugu vrstu, na primer čoveka. Neke od ovih tehnika ukratko su prikazane u radu Harris and Emery, TIBTECH 11:42-44, 1993.

[0028] TGFß se generalno luči kao latentni prekursor koji se sastoji od TGFß nekovalentno vezanog za protein koji se označava kao protein povezan s latencom (latency-associated protein, LAP; pregled u radu Harpel et al. (1992) Prog. Growth Factor Res. 4: 321). DNK koja enkodira peptid od 278 aminokiselina koji odgovara pre-pro-TGFß, prekidajući proces tik pred zreli oblik TGFß, i koji sadrži supstituciju Cys33 u Ser33, eksprimirana je (Derynck et al. (1985) Nature 316: 701), i utvrđeno je da vezuje TGFß i čini ga latentnim.

[0029] Rastvorljivi oblici TGFß receptora takođe će vezivati TGFß i sprečiti vezivanje za TGFß receptore vezane za membranu. TGFß receptore opisali su Wang et al. (Cell (1991) 67: 797) i Lin et al. (Cell (1992) 68: 775). Rastvorljivi oblici TGFß receptora mogu se pripremiti metodama poznatim u struci. Na primer, mogu se pripremiti deletirani mutanti kojima nedostaje transmembranski domen TGFß receptora, što će eksprimirati rastvorljiv TGFß-vezujući protein. Miyazono et al. (Adv. Immunol. (1994) 55: 181) dali su pregled TGFß receptora

[0030] Druge vrste TGFß antagonista takođe su poznate u struci. Na primer, Yamaguchi et al. (Nature (1990) 346: 281) raspravljaju o dekorinu, malom hondroitin-dermatan sulfat proteoglikanu koji vezuje TGFß i modulira aktivnost ovog faktora rasta. Ohtsuki i Massague (Mol. Cell. Biol. 12:261-265, 1992) otkrivaju inhibitore protein-kinaze koji blokiraju određene biološke aktivnosti TGFß. T. cruzi proizvodi cistein-proteazu (kruzain ili kruzipain; Eakin et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 7411) koja konvertuje neaktivni TGFß prekursor u aktivni, zreli TGFß. Dizajn i upotreba inhibitora proteaze kao lekova dobro su poznati u struci (Design of Enzyme Inhibitors as Drugs; Sandier and Smith, eds; 1989, Oxford University Press; Proteinase Inhibitors Medical and Biological Aspects; Katunuma, Umezawa and Holzer, eds., 1983, Springer-Verlag); stoga; inhibitori kruzaina mogu se pripremiti i biće korisni kao TGFß antagonisti.

[0031] I drugi TGFß antagonisti i metode za njihovu proizvodnju poznati su u struci, a mnogi drugi se trenutno razvijaju. Upotreba specifičnog TGFß antagonista nije ograničavajući faktor, budući da bilo koji efikasan TGFß antagonist može da se koristi u metodama iz ovog pronalaska. Primeri ovakvih antagonista obuhvataju monoklonalna i poliklonalna antitela usmerena protiv jedne ili više izoformi TGFß (američki patent U.S. Pat. No. 5,571,714), TGFß receptore, njihove fragmente, njihove derivate i antitela usmerena protiv TGFß receptora (američki patenti U.S. Pat. Nos. 5,693,607, 6,008,011, 6,001,969 i 6,010,872); peptid povezan s latencom (WO 91/08291), veliki latentni TGFß (WO 94/09812), fetuin (američki patent U.S. Pat. No. 5,821,227), dekorin i druge proteoglikane kao što su biglikan, fibromodulin, lumikan i endoglin (američki patenti U.S. Pat. Nos. 5,583,103, 5,654,270, 5,705,609, 5,726,149, 5,824,655, 5,830,847, i 6,015,693).

[0032] Dalji primeri ovakvih antagonista uključuju somatostatin (PCT patenta prijava WO 98/08529), manoza-6-fosfat ili manoza-1-fosfat (američki patent U.S. Pat. No. 5,520,926), prolaktin (PCT patentna prijava WO 97/40848), insulinu sličan faktor rasta II (PCT patentna prijava WO 98/17304), IP-10 (PCT patentna prijava WO97/00691), peptide koji sadrže arg-gly-asp (američki patent U.S. Pat. No. 5,958,411 i PCT patentna prijava WO 93/10808), ekstrakte biljaka, gljiva i bakterija (evropska patentna prijava 813875, japanska patentna prijava 8119984 i američki patent U.S. Pat. No. 5,693,610), antisens oligonukleotide (američki patenti U.S. Pat. Nos. 5,683,988, 5,772,995, 5,821,234 i 5,869,462 te PCT patentna prijava WO 94/25588), zatim mnoštvo drugih proteina uključenih u TGFß signalizaciju, uključujući SMAD i MAD (američki patenti U.S. Pat. Nos. 5,834,248, 5,807,708 i 5,948,639) te Ski i Sno (G. Vogel, Science, 286:665 (1999) i Stroschein et al., Science, 286:771-74 (1999)), kao i fragmente i derivate bilo kojih od gore navedenih molekula koji zadržavaju sposobnost da inhibišu aktivnost TGFß.

[0033] TGFß receptori i TGFß-vezujući fragmenti TGFß receptora, naročito rastvorljivi fragmenti, korisni su TGFß antagonisti u metodama predmetnog pronalaska. TGFß receptori i nukleinske kiseline koje ih kodiraju dobro su poznate u struci. Sekvenca ljudske nukleinske kiseline koja kodira TGFß tip 1 receptor objavljena je, na primer, u GenBank, pristupni broj L15436, i u američkom patentu U.S. Pat. No. 5,538,892 autora Donahoe et al. Sekvenca ljudske nukleinske kiseline za TGFß tip 2 receptor javno je dostupna, na primer, pod GenBank pristupnim brojevima AW236001; AI35790; AI279872; AI074706; i AA808255. Sekvenca ljudske nukleinske kiseline za TGFß tip 3 receptor takođe je javno dostupna, na primer, pod GenBank pristupnim brojevima NM 003243; AI887852; AI817295; i AI681599.

[0034] U poželjnom otelotvorenju, TGFß antagonist je antitelo koje blokira vezivanje TGFß za receptor, ili njegovi fragmenti poput Fab, Fab‘, F(ab‘)2 fragmenata, Fv fragmenti, jednolančana antitela i drugi oblici „antitela“ koji zadržavaju sposobnost da se vezuju za TGFß. U jednom otelotvorenju, antitelo je pan-specifično anti-TGFß antitelo. U jednom primeru, pan-specifično anti-TGFß antitelo vezuje se za jednu ili više izoformi TGFß i neutrališe ih. U drugom primeru, pan-specifično anti-TGFß antitelo blokira ili inhibira vezivanje proteina za jednu ili više izoformi TGFß.

[0035] U jednom otelotvorenju, antitelo je monoklonalno antitelo. U drugom otelotvorenju, antitelo je humano antitelo. U sledećem otelotvorenju, antitelo je humanizovano antitelo. U sledećem otelotvorenju, antitelo je himerično antitelo. U jednom konkretnom otelotvorenju, antitelo je humanizovan oblik mišjeg monoklonalnog antitela 1D11, deponovan pod ATCC brojem [...............]. U drugom konkretnom otelotvorenju, antitelo je anti-TGFß antitelo opisano u američkoj patentnoj prijaviU.S. 11/350,906, zavedenoj 8. februara 2006. (U.S. 2006/0251658), koja je ovde uključena referencom u celosti. U sledećem konkretnom otelotvorenju, antitelo obuhvata jedan ili više regiona sa 1D11 koji određuju komplementarnost (CDR), opisanih u američkoj patentnoj prijavi U.S. 11/350,906.

[0036] Kako se ovde koristi, pojam „antitelo“ obuhvata intaktne molekule imunoglobulina koji sadrže 4 polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, međusobno povezane disulfudnim vezama. Svaki teški lanac sastoji se od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćenog kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćenog kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Laki lanci antitela bilo koje vrste kičmenjaka mogu se svrstati u jedan od dva jasno odvojena tipa, zvana kapa (K) i lambda (λ), zavisno od sekvenci aminokiselina u njihovim konstantnim domenima. Varijabilni regioni kapa lakih lanaca ovde su označeni kao VK. Izraz VL, kako se ovde koristi, služi da obuhvati i varijabilne regione lakih lanaca kapa tipa (VK) i lakih lanaca lambda tipa. Konstantni region lakih lanaca sastoji se od jednog domena, CL. VH i VL regioni obuhvataju regione hipervarijabilnosti, zvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), izmešane s regionima koji su stalniji, zvanim okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL građen je od tri CDR i četiri FR, poređanih od amino-kraja do karboksi-kraja sledećim redom: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. „CDRH1“ odnosi se na prvi CDR region u teškom lancu antitela, „CDRH2“ odnosi se na drugi CDR region u teškom lancu antitela, a „CDRH3“ odnosi se na treći CDR region u teškom lancu antitela. „CDRL1“ odnosi se na prvi CDR region u lakom lancu antitela, „CDRL2“ odnosi se na drugi CDR region u lakom lancu antitela, a „CDRL3“ odnosi se na treći CDR region u lakom lancu antitela.

[0037] Zavisno od sekvence aminokiselina u konstantnom domenu teških lanaca, antitela se mogu svrstati u različite klase. Postoji 5 velikih klasa intaktnih antitela: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM. Neke od njih mogu se dalje podeliti u potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Konstantni domeni teških lanaca koji odgovaraju navedenim različitim klasama antitela nazivaju se, redom, alfa (α), delta (Δ), epsilon (ε), gama (γ) i mi (µ). Strukture subjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina dobro su poznate. Predmetni pronalazak obuhvata antitela bilo koje od gorepomenutih klasa ili potklasa (izotipova).

[0038] Pojam „antitelo“, kako se ovde koristi, takođe je predviđen da obuhvati intaktna antitela, funkcionalne fragmente koji vezuju antigene, te njihove varijante koje vezuju antigene, uključujući mimetike antitela ili obuhvatajući delove antitela koji imitiraju strukturu i/ili funkciju antitela, odnosno njegovog definisanog fragmenta ili dela; sve navedeno sadrži bar po jedan CDR. Antitela iz pronalaska uključuju fragmente ili varijante antitela koji sadrže jedan, dva, tri, četiri, pet, šest ili više CDR regiona.

[0039] Fragmenti antitela obuhvaćeni predmetnim pronalaskom uključuju Fab (npr. digestijom papainom), Fab', F(ab')2, facb (npr. digestijom plazminom), pFc' (npr. digestijom pepsinom ili plazminom), Fd (npr. digestijom pepsinom, parcijalnom redukcijom i reagregacijom), sVds, i Fv ili scFv (npr. tehnikama molekularne biologije). Predviđeno je i da fragmenti antitela obuhvataju antitela sa izbrisanim domenom, antitela po tipu diabodies i triabodies, linearna antitela, jednolančane molekule antitela (uključujući kamelizovana antitela) i multispecifična antitela stvorena od fragmenata antitela.

[0040] Pojam „antitelo“, kako se ovde koristi, takođe uključuje „himerična“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lan(a)ca identičan ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od druge vrste (npr. miša ili pacova) ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok ispoljavaju željenu biološku aktivnost. Stoga predmetni pronalazak obuhvata, na primer, himerična antitela koja sadrže himeričan težak lanac i/ili himeričan lak lanac. Himeričan težak lanac može da sadrži bilo koji od varijabilnih regiona teškog lanca (VH) opisanih ovde ili njihove mutante ili varijante spojene s konstantnim regionom teškog lanca nehumanog antitela. Himeričan lak lanac može da sadrži bilo koji od varijabilnih regiona lakog lanca (VL) opisanih ovde ili njihove mutante ili varijante spojene s konstantnim regionom lakog lanca nehumanog antitela.

[0041] Antitela iz pronalaska takođe obuhvataju „humanizovana antitela“, što su molekuli antitela s jednim ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) iz nehumane vrste i okvirnim regionima iz humanog molekula imunoglobulina. Često se rezidue okvirnih regiona u humanim okvirnim regionima supstituišu odgovarajućom reziduom iz antitela donora CDR kako bi se izmenilo ili poboljšalo vezivanje antigena. Ove supstitucije okvirnih regiona identifikuju se standardnim tehnikama poput modeliranja interakcija CDR i rezidua okvirnih regiona kako bi se identifikovale rezidue okvirnih regiona važne za vezivanje antigena i poređenja sekvenci kako bi se identifikovale neuobičajene rezidue okvirnih regiona na određenim pozicijama. Antitela se mogu humanizovati pomoću različitih tehnika, uključujući CDR-grafting, veneering ili resurfacing te izmenu lanaca (chain shuffling).

[0042] Pojam „humano antitelo“, kako se ovde koristi, uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione koji odgovaraju sekvencama humanih imunoglobulina germinativne linije. Humana antitela iz pronalaska mogu uključivati rezidue aminokiselina koje nisu kodirane sekvencama humanih imunoglobulina germinativne linije (npr. mutacije nastale nasumičnom ili mesto-specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR. Humano antitelo može imati bar jednu poziciju zamenjenu reziduom aminokiseline, npr. reziduom aminokiseline koja povećava aktivnost, a koja nije kodirana sekvencom humanog imunoglobulina germinativne linije. Međutim, pojam „humano antitelo“, kako se ovde koristi, nije predviđen da uključuje antitela u kojima su CDR sekvence dobijene od germinativnih linija drugih vrsta sisara, poput miša, graftovane na humane okvirne sekvence.

[0043] Fraza „rekombinantno humano antitelo“ obuhvata humana antitela koja su pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana rekombinantnim metodama, kao što su antitela eksprimirana pomoću rekombinantnog ekspresionog vektora transficiranog u ćeliju domaćina, antitela izolovana iz biblioteke rekombinantnih, kombinatornih humanih antitela, antitela izolovana iz životinje koja je transgena za gene humanih imunoglobulina, odnosno antitela pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana bilo kojom drugom metodom koja uključuje splajsovanje genskih sekvenci humanih imunoglobulina u druge DNK sekvence. Ovakva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione dobijene iz sekvenci humanih imunoglobulina germinativne linije.

[0044] Pojam „monoklonalno antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije uglavnom homogenih antitela, npr. pojedinačna antitela koja čine populaciju uglavnom su identična, s izuzetkom mogućih prirodno nastalih mutacija ili manjih posttranslacionih varijacija koje mogu biti prisutne. Monoklonalna antitela su visoko specifična, usmerena protiv jednog antigenog mesta (poznatog i kao determinanta ili epitop). Dalje, u suprotnosti s preparacijama konvencionalnih (poliklonalnih) antitela koje obično sadrže različita antitela usmerena protiv različitih determinanti, svako monoklonalno antitelo usmereno je protiv jedne jedine determinante na antigenu. Modifikator „monoklonalno“ ukazuje na karakter antitela u smislu da je dobijeno iz uglavnom homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao da iziskuje proizvodnju antitela bilo kojom konkretnom metodom.

[0045] Antitela takođe obuhvataju polipeptide sa sekvencama aminokiselina uglavnom sličnim sekvencama aminokiselina varijabilnih ili hipervarijabilnih regiona teških i/ili lakih lanaca. Uglavnom ista sekvenca aminokiselina ovde je definisana kao sekvenca s bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identičnosti s poređenom sekvencom aminokiselina, kako je određeno pretraživačkom metodom FASTA u skladu s Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988).

[0046] Antitela iz pronalaska uključuju ona koja su identična ovde opisanim, s izuzetkom jedne ili više konzervativnih supstitucija aminokiseline. Konzervativna supstitucija aminokiseline definiše se kao izmena u kompoziciji aminokiselina tako što su zamenjene jedna ili dve aminokiseline u peptidu, polipeptidu ili proteinu, odnosu u njihovom fragmentu. Supstitucija se vrši aminokiselinama sa suštinski sličnim osobinama (npr. kiselost, baznost, aromatičnost, veličina, pozitivno ili negativno naelektrisanje, polarnost, nepolarnost) tako da supstitucija suštinski ne menja osobine (npr. naboj, izoelektrična tačka, afinitet, aviditet, konformacija, rastvorljivost) ili aktivnost peptida, polipeptida ili proteina. Tipične supstitucije koje se mogu vršiti kod ovakvih konzervativnih supstitucija aminokiselina mogu biti među sledećim grupama aminokiselina: glicin (G), alanin (A), valin (V), leucin (L) i izoleucin (I); asparaginska kiselina (D) i glutaminska kiselina (E); alanin (A), serin (S) i treonin (T); histidin (H), lizin (K) i arginin (R); asparagin (N) i glutamin (Q); fenilalanin (F), tirozin (Y) i triptofan (W).

[0047] Konzervativne supstitucije aminokiselina mogu se vršiti u CDR ili okvirnim regionima, npr. regionima tik uz hipervarijabilne regione, koji su prvenstveno odgovorni za osobinu selektivnog i/ili specifičnog vezivanja molekula, kao i u drugim delovima molekula, npr. varijabilnoj kaseti teškog lanca.

[0048] Antitela iz predmetnog pronalaska obuhvataju i one čiji je afinitet povećan ili izmenjen direktnom mutacijom, maturacijom afiniteta, ispoljavanjem na fagima (phage display) ili izmenom lanaca. Afinitet i specifičnost mogu se menjati ili poboljšati mutiranjem CDR i/ili rezidua okvirnih regiona te skriningom za mesta vezivanja antigena koja imaju željene karakteristike. Jedan od načina jeste da se randomizuju pojedinačne rezidue ili kombinacije rezidua tako da se, u populaciji inače identičnih mesta vezivanja antigena, podsetovi od dve do dvadeset aminokiselina nađu na određenim pozicijama. Ili, mutacije se mogu indukovati na nizu rezidua greškom pomoću PCR metoda. U drugom primeru, vektori za phage display koji sadrže varijabilne regione teških i lakih lanaca mogu se umnožavati u mutiranim sojevima E. coli.

[0049] Antitela dobijena izmenom lanaca obuhvataju ona gde su teški ili laki lanci nasumično spareni s drugim ovde opisanim teškim ili lakim lancima. Stoga antitela iz pronalaska obuhvataju bilo koju kombinaciju teških i lakih lanaca (bilo celih, bilo njihovih delova).

[0050] Antitela iz predmetnog pronalaska specifična su za TGFß. Specifičnost antitela odnosi se na selektivno prepoznavanje određenog epitopa na antigenu od strane antitela. Antitela mogu pokazivati selektivnost kako za vrstu tako i za molekul ili mogu biti selektivna samo za molekul i vezivati se za TGFß više od jedne vrste. Antitela iz pronalaska mogu se vezivati za humani, mišji, pacovski, pseći i/ili zečji TGFß. U jednom otelotvorenju, antitelo se vezuje za humani TGFß. Da li se neko antitelo specifično vezuje za neki TGFß može se odrediti npr. esejom vezivanja kao što je ELISA, koristeći panel antigena.

[0051] Specifičnost antitela može se odrediti na osnovu afiniteta i/ili aviditeta. Afinitet, predstavljen ravnotežnom konstantom disocijacije antigena sa antitelom (Kd), meri jačinu vezivanja između antigenske determinante i vezujućeg mesta antitela. Aviditet je mera jačine vezivanja antitela sa svojim antigenom. Aviditet je povezan kako sa afinitetom između epitopa i njegovog antigen-vezujućeg mesta na antitelu, tako i sa valencom antitela, koja se odnosi na broj antigen-vezujućih mesta za određeni epitop. Antitela se tipično vezuju s konstantom disocijacije (Kd) od oko 10-5 do oko 10-11 l/mol (npr. KD <100 nM). Uopšte uzev, za svaku Kd manju od oko 10-4 l/mol smatra se da ukazuje na nespecifično vezivanje. Što je vrednost Kd manja, to je jačina vezivanja između antigenske determinante i vezujućeg mesta antitela veća.

[0052] Antitela iz pronalaska vezuju se za TGFß sa Kd poželjno oko 1 x 10-8 M-1 ili manje, poželjnije oko 1 x 10-9 M-1 ili manje, poželjnije oko 1 x 10-10 M-1 ili manje, a najpoželjnije oko 1 x 10-11 M-1 ili manje.

[0053] Antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti monospecifična, bispecifična ili multispecifična. Monospecifična antitela vezuju se samo za jedan antigen. Bispecifična antitela (BsAbs) su antitela koja imaju dva različita antigen-vezujuća specificiteta ili mesta. Multispecifična antitela imaju više od dva različita antigen-vezujuća specificiteta ili mesta. Kada antitelo ima više od jednog specificiteta, prepoznati epitopi mogu biti povezani s jednim antigenom ili s više antigena.

[0054] U drugom aspektu pronalaska, antitelo je konjugovano s drugim hemijskim jedinjenjem, bilo direktno ili indirektno. Ova konjugacija može biti hemijska ili biosintetska. Druga jedinjenja koja mogu biti konjugovana sa antitelom obuhvataju toksine, antitumorske agense, detektabilne obeleživače, target jedinjenja i reporter jedinjenja. Pogodni toksini ovde su opisani.

[0055] U jednom otelotvorenju, jedan ili više hemioterapijskih agenasa iz pronalaska funkcionalno su povezani sa antitelom. Na primer, kapecitabin, iksabepilon ili oba mogu biti konjugovani sa anti-TGFß antitelom.

[0056] Antitela koja su konjugovana s detektabilnim obeleživačima mogu se, na primer, koristiti za dijagnozu bolesti, kao pomoć u prognozi i za lokalizaciju tumorskih ćelija, in vivo ili in vitro. Detektabilni obeleživač proizvodi merljiv signal koji je detektabilan eksternim metodama. Detektabilni obeleživači obuhvataju enzim, hromoforu, radioizotop ili supstancu koja emituje svetlost fluorescencijom, fosforescencijom ili hemiluminiscencijom. Pogodni enzimi obuhvataju peroksidazu iz rena, alkalnu fosfatazu, ß-galaktozidazu i acetilholinesterazu. Hromofore obuhvataju boje koje apsorbuju svetlost ultraljubičastog ili vidljivog spektra, a mogu biti supstrati ili degradacioni produkti enzimski katalizovanih reakcija. Pogodni fluorescentni materijali obuhvataju umbeliferon, fluorescein, fluorescein-izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin-fluorescein, danzil-hlorid ili fikoeritrin. Pogodni hemiluminiscentni materijali obuhvataju luminol, luciferazu, luciferin i ekvorin. Pogodni radioaktivni materijali obuhvataju 125I, 131I, 35S i 3H.

[0057] Ciljna jedinjenja su prvi članovi vezujućih parova. Antitumorski agensi, na primer, mogu se konjugovati s drugim članovima ovakvih parova, pa su stoga usmereni ka mestu gde se vezuje antigen-vezujući protein. Čest primer ovakvog vezujućeg para su avidin i biotin. Biotin se može konjugovati sa antitelom iz pronalaska, postajući tako meta za antitumorski agens ili drugo jedinjenje konjugovano sa avidinom ili streptavidinom. Ili, biotin ili drugo slično jedinjenje se veže za antigen-vezujući protein iz pronalaska i koristi kao reporter, na primer, detektabilni obeleživač se konjuguje sa avidinom ili streptavidinom.

[0058] Predmetni pronalazak obuhvata i molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju anti-TGFß antitelo ili njegov deo. Nukleinske kiseline mogu da kodiraju težak lanac antitela, koji sadrži bilo koji od VH regiona ili njegov deo, odnosno bilo koji od VH CDR, uključujući njihove bilo koje varijante, kako je ovde izloženo. Pronalazak obuhvata i nukleinske kiseline koje kodiraju lak lanac antitela, koji sadrži bilo koji od VL regiona ili njegov deo, odnosno bilo koji od VL CDR, uključujući njihove bilo kakve varijante, kako je ovde izloženo. U određenim otelotvorenjima, nukleinska kiselina enkodira i težak i lak lanac, odnosno njihove delove.

[0059] Pronalazak obuhvata i rekombinantne vektore koji sadrže bilo koji od ovde opisanih molekula nukleinskih kiselina. Vektor može da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira samo jedan lanac antitela ili njegov deo (npr. težak ili lak lanac), odnosno nukleinsku kiselinu koja kodira oba lanca antitela ili njihove delove.

[0060] Primeri vektora obuhvataju plazmide, fagemide, kozmide, viruse i fagne nukleinske kiseline, odnosno druge molekule nukleinskih kiselina sposobne da se replikuju u prokariotskom ili eukariotskom domaćinu. Vektori tipično sadrže marker kako bi obezbedili fenotipsku osobinu radi selekcije transformisanih domaćina, poput prenosa rezistencije na antibiotike kao što su ampicilin ili neomicin.

[0061] Vektor može biti ekspresioni vektor, naznačen time što je nukleinska kiselina koja kodira antitelo operabilno povezana sa sekvencom koja kontroliše ekspresiju. Tipični ekspresioni vektori sadrže terminatore transkripcije i translacije, inicijalne sekvence i promotore korisne za regulaciju ekspresije molekula nukleinskih kiselina iz pronalaska. Vektori takođe mogu da sadrže genske ekspresione kasete koje sadrže nezavisnu terminator sekvencu, sekvence koje dozoljavaju replikaciju vektora i u eukariotama i u prokariotama, npr. šatl vektore i selekcione markere i za prokariotske i za eukariotske sisteme. Kada vektor sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju i težak i lak lanac ili njihove delove, nukleinska kiselina koja kodira težak lanac može biti pod istim ili pod odvojenim promotorom. Odvojeni promotori mogu biti identični ili mogu biti različiti tipovi promotora.

[0062] Pogodni promotori obuhvataju konstitutivne promotore i inducibilne promotore. Reprezentativne kontrolne sekvence/promotori ekspresije uključuju lac sistem, trp sistem, tac sistem, trc sistem, glavne operator i promotor regione faga lambda, kontrolni region fd proteina omotača, promotore glikolize u kvascu, npr. promotor za 3-fosfoglicerat kinazu, promotore kisele fosfataze kvasca, npr. Pho5, promotore alfa faktora parenja kvasca, promotore dobijene iz humanog citomegalovirusa, promotore metalotioneina, promotor virusa mišjeg tumora dojke, promotor Rous sarkoma virusa, promotor polihedrina i promotore dobijene od polioma, adenovirusa, retrovirusa i majmunskog virusa, npr. rane i kasne promotore SV40.

[0063] Pronalazak takođe obuhvata nehumane domaćine poput ćelija ili organizama koji sadrže molekul nukleinske kiseline ili vektor iz pronalaska. Pod pojmom „domaćin“ podrazumeva se nehumani jednoćelijski ili višećelijski organizam ili „ćelija domaćin“, što se odnosi na ćeliju ili populaciju ćelija u koju je unet molekul nukleinske kiseline ili vektor iz pronalaska. „Populacija ćelija domaćina“ odnosi se na grupu kultivisanih ćelija u koje se molekul nukleinske kiseline ili vektor iz predmetnog pronalaska može uneti i eksprimirati. Domaćin sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor koji kodiraju samo jedan lanac ili njegov deo (npr. težak ili lak lanac); ili može da sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor koji kodiraju oba lanca ili njihove delove, bilo na istoj ili na odvojenim nukleinskim kiselinama i/ili vektorima.

[0064] Domaćin iz predmetnog pronalaska može biti prokariotski ili eukariotski. Pogodni prokariotski domaćini obuhvataju, na primer, E. coli, poput E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI, i E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, kao što je Bacillus subtilis, i Streptomyces. Pogodne eukariotske ćelije obuhvataju kvasce i druge gljive, ćelije insekata, ćelije biljaka, humane ćelije i životinjske ćelije, uključujući ćelije sisara, poput linija hibridoma, COS ćelija, NS0 ćelija i CHO ćelija.

[0065] Pronalazak takođe sadrži metode za proizvodnju antitela iz predmetnog pronalaska, što podrazumeva kultivisanje ćelije domaćina koja eksprimira jednu ili više sekvenci nukleinskih kiselina koje enkodiraju antitelo iz predmetnog pronalaska, te dobijanje antitela iz medijuma kulture. U neki otelotvorenjima, antitelo se prečišćava odvajanjem od kulture medijuma. Antitela koja sadrže više od jednog lanca mogu se proizvoditi ekspresijom svih pojedinačnih lanaca zajedno u istom domaćinu; ili odvojenih lanaca, koji se sastavljaju pre ili posle dobijanja iz medijuma kulture.

[0066] Metode za proizvodnju drugih TGFß antagonista dobro su poznate u struci, kako je opisano gore.

[0067] Kapecitabin je uopšte uzev izložen u američkom patentu U.S. Pat. No. 4,966,891 a posebno izložen u američkom patentu U.S. Pat. No. 5,472,949. U farmaceutskim kompozicijama na tržištu je pod zaštićenim imenom XELODA (proizvođač Roche Laboratories Inc.) (SAD). Različiti procesi sinteze kojima se dobija kapecitabin poznati su u dosadašnjem stanju tehnike, na primer, metode za dobijanje kapecitabina opisane su u objavi američke patentne prijave U.S. Patent Application Publication 20080300399, koja je ovde uključena referencom u celosti.

[0068] Metode za dobijanje iksabepilona takođe su dobro poznate u struci. Na primer, enterički obložena kapsula sa iksabepilonom te njena priprema i primena opisane su u objavi američke patentne prijave U.S. Patent Application Publication 20060153917, koja je ovde uključena referencom u celosti.

[0069] U drugom otelotvorenju, ovde je prikazana farmaceutska kompozicija za lečenje raka dojke kod ispitanika koja sadrži: terapijski efikasnu količinu TGFß antagonista, kapecitabina i/ili iksabepilona, naznačenu time što je pomenuti TGFß antagonist prisutan u količini delotvornoj da poveća efikasnost kapecitabina i/ili iksabepilona u lečenju pomenutog raka dojke. U pojedinim otelotvorenjima, prva farmaceutska kompozicija sadrži TGFß antagonist, druga farmaceutska kompozicija sadrži kapecitabin, a treća farmaceutska kompozicija sadrži iksabepilon. Ove pojedinačne i odvojene kompozicije mogu se primenjivati nezavisno ili zajedno.

[0070] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo, nukleinsku kiselinu, vektor, ćeliju domaćina ili hemioterapijske agense iz ovog pronalaska te jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. „Farmaceutski prihvatljivi nosači“ obuhvataju sve ekscipijente koji su netoksični za njima izloženu ćeliju ili sisara u primenjenim dozama i koncentracijama. Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže jedan ili dodatne terapijske agense.

[0071] Farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju rastvarače, disperzione medijume, pufere, omotače, antibakterijske i antigljivične agense, ovlaživače, konzervanse, helirajuće agense, antioksidanse, izotoničke agense i agense koji odlažu apsorpciju.

[0072] Farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju vodu; fiziološki rastvor; fiziološki rastvor s fosfatnim puferom; dekstrozu; glicerol; alkohole poput etanola i izopropanola; fosfate, citrate i druge organske kiseline; askorbinsku kiselinu; polipeptide male molekulske mase (manje od desetak rezidua); proteine, poput serumskih albumina, želatina ili imunoglobulina; hidrofilne polimere poput polivinilpirolidona; aminokiseline poput glicina, glutamina, asparagina, arginina ili lizina; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; EDTA; kontrajone koji grade soli, poput natrijuma; i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN, polietilen-glikol (PEG) i PLURONICS; izotoničke agense poput šećera, polialkohola kao što su manitol i sorbitol, i natrijum-hlorida; kao i njihove kombinacije. Antibakterijski i antigljivični agensi uključuju parabene, hlorobutanol, fenol, askorbinsku kiselinu i timerosal.

[0073] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu biti formulisane na razne načine, uključujući na primer, tečne, polučvrste i čvrste oblike doziranja, poput tečnih rastvora (npr. injekcionih i infuzionih rastvora), disperzija ili suspenzija, tableta, pilula, praška, lipozoma i supozitorija. U pojedinim otelotvorenjima, kompozicije su u obliku injekcionih ili infuzionih rastvora. Kompozicija je u obliku pogodnom za oralnu, intravensku, intraarterijsku, intramuskularnu, supkutanu, parenteralnu, transmukoznu, transdermalnu ili topičku primenu. Kompozicija može biti formulisana kao kompozicija sa trenutnim, kontrolisanim, produženim ili odloženim oslobađanjem.

[0074] Preparacije za parenteralnu primenu obuhvataju sterilne vodene ili nevodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri nevodenih rastvarača su propilen-glikol, polietilen-glikol, biljna ulja poput maslinovog, i injektabilni organski estri poput etil-oleata. Vodeni nosači obuhvataju vodu, vodeno-alkoholne rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferovane medijume. U predmetnom pronalasku, farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju, ali nisu ograničeni na 0,01-01M i poželjno 0,05M fosfatni pufer ili 0,8% fiziološki rastvor. Drugi uobičajeni parenteralni nosači obuhvataju rastvore natrijum-fosfata, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum-hlorid, Ringer-laktat ili fiksirana ulja. Intravenski nosači obuhvataju sredstva za nadoknadu tečnosti i hranljivih materija, sredstva za nadoknadu elektrolita, poput onih zasnovanih na Ringerovoj dekstrozi, i slično. Konzervansi i drugi aditivi takođe mogu biti prisutni, na primer, antimikrobici, antioksidansi, helirajući agensi te inertni gasovi i slično.

[0075] Konkretnije, farmaceutske kompozicije pogodne za injekcionu primenu obuhvataju sterilne vodene rastvore (kada je supstanca rastvorljiva u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporalnu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. U ovakvim slučajevima, kompozicija mora da bude sterilna i treba da bude tečna do te mere da se lako ubrizgava. Treba da bude stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja i po mogućstvu zaštićena od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, poput bakterija i gljiva. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr. glicerol, propilen-glikol, tečni polietilen-glikol i slično) i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost može se sačuvati, na primer, upotrebom omotača poput lecitina, očuvanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Pogodne formulacije za primenu u ovde izloženim terapijskim metodama opisane su u radu Remington‘s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16th ed. (1980).

[0076] U pojedinim otelotvorenjima, kompozicija sadrži izotoničke agense, na primer, šećere, polialkohole, poput manitola, sorbitola, ili natrijum-hlorid. Produžena apsorpcija injekcionih kompozicija može se postići dodavanjem agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum-monostearata i želatina, u kompoziciju.

[0077] Sterilni injekcioni rastvori mogu se pripremiti dodavanjem molekula, samog ili u kombinaciji s drugim aktivnim agensima, u potrebnu količinu odgovarajućeg rastvarača s jednim ili kombinacijom ovde nabrojanih sastojaka, po potrebi, praćenim sterilizacijom filtriranjem. Uopšte uzev, disperzije se pripremaju dodavanjem aktivnog jedinjenja u sterilan nosač, koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke u okviru gore pobrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, jedna od metoda pripreme je sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem, čime se dobija prašak sa aktivnim sastojkom zajedno s bilo kojim dodatnim željenim sastojkom iz njihovog prethodno sterilno filtriranog rastvora. Preparacije za injekcije se obrade, sipaju u ambalaže poput ampula, vrećica, bočica, brizgalica ili fiola te zapečate u aseptičnim uslovima u skladu s metodama poznatim u struci. Dalje, preparacije mogu da se pakuju i prodaju u vidu kompleta, poput onih opisanih u objavi američke patentne prijave US App. Publ. No. 2002/0102208 A1, koja je ovde uključena referencom u celosti. Ovakvi proizvodi poželjno sadrže deklaraciju ili uputstvo koji navode da su sadržane kompozicije korisne za lečenje ispitanika obolelog od autoimunih ili neoplastičnih bolesti, odnosno predisponiranog za njih.

[0078] Efikasne doze kompozicija iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja ili bolesti kako je ovde opisano menjaju se zavisno od mnogih različitih faktora, uključujući načine primene, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, druge primenjene lekove te da li je primena profilaktička ili terapijska. Uobičajeno, pacijent je čovek, ali mogu se lečiti i nehumani sisari, uključujući transgene sisare. Doze za primenu mogu se titrirati rutinskim metodama poznatim onima upućenim u struku radi optimizacije bezbednosti i efikasnosti.

[0079] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu sadržati „terapijski efikasnu količinu“. „Terapijski efikasna količina“ odnosi se na količinu efikasnu u neophodnim dozama i vremenskim periodima da bi se postigao željeni terapijski rezultat. Terapijski efikasna količina molekula može da se razlikuje zavisno od faktora poput stanja bolesti, uzrasta, pola i težine pojedinca, te sposobnosti molekula da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapijski efikasna količina takođe je ona čiji terapijski povoljni efekti imaju prevagu nad bilo kojim toksičnim ili štetnim efektima molekula.

[0080] Pronalazak dalje obezbeđuje komplet koji sadrži terapijski efikasnu količinu TGFß antagonista, kapecitabina, iksabepilona ili njihovu kombinaciju.

[0081] Pronalazak dalje obezbeđuje metode za lečenje bolesti ili poremećaja koje obuhvataju primenu terapijski efikasne količine TGFß antagonista, kapecitabina, iksabepilona ili njihove kombinacije na sisaru kome je ona potrebna.

[0082] Kako se ovde koriste, pojmovi „lečiti“ i „terapija“ odnose se na terapijsko lečenje, uključujući profilaktičke ili preventivne mere, naznačene time što je cilj sprečiti ili usporiti (oslabiti) neželjenu fiziološku promenu u vezi s bolešću ili poremećajem. Povoljni ili željeni klinički ishodi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje simptoma, smanjene proširenosti bolesti ili poremećaja, stabilizaciju bolesti ili poremećaja (tj. kada se bolest ili poremećaj ne pogoršavaju), odlaganje ili usporavanje progresije bolesti ili poremećaja, poboljšanje ili palijaciju bolesti ili poremećaja, te remisiju (bilo parcijalnu ili potpunu) bolesti ili poremećaja, bilo detektabilnu ili nedetektabilnu. „Terapija“ može da znači i produženje preživljavanja kada bi se uporedilo sa očekivanim preživljavanjem bez lečenja. Osobe kojima je lečenje neophodno obuhvataju osobe koje već imaju bolest ili poremećaj, kao i osobe sklone dobijanju bolesti ili poremećaja, odnosno osobe kod kojih bolest ili poremećaj treba sprečiti.

[0083] Kanceri/tumori koji se mogu lečiti pronalaskom obuhvataju bilo koji kancer ili tumor. Primeri kancera/tumora koji se mogu lečiti obuhvataju, ali nisu ograničeni na rak dojke (uključujući HER2+ i metastatski), rak lečen kapecitabinom, iksabepilonom ili pomoću oba leka, te rak povezan sa signalizacijom posredovanom preko TGFß.

[0084] Metode lečenja raka obuhvataju, ali nisu ograničene na, npr. inhibiciju angiogeneze u tumoru, inhibiciju rasta tumora, inhibiciju migracije tumora, inhibiciju proliferacije ili inhibiciju invazije tumorskih ćelija.

[0085] Kanceri koji eksprimiraju ili previše eksprimiraju TGFß ili su povezani sa ekspresijom ili prevelikom ekspresijom TGFß mogu se lečiti pronalaskom. Međutim, kancer koji se može lečiti ovom kombinovanom terapijom može biti bilo koji kancer, ne samo oni koji eksprimiraju ili previše eksprimiraju TGFß.

[0086] Kanceri koji se mogu lečiti obuhvataju primarne tumore i sekundarne ili metastatske tumore (uključujući one koji su metastazirali iz pluća, dojke ili prostate), kao i rekurentne ili refraktorne tumore. Rekurentni tumori obuhvataju tumore koji su naizgled inhibisani lečenjem ovakvim agensima, ali se ponovo jave unutar pet godina, ponekad čak unutar deset ili više godina nakon obustave terapije. Refraktorni tumori su tumori koji nisu reagovali ili su otporni na lečenje jednom ili pomoću više konvencionalnih terapija za taj konkretan tip tumora. Refraktorni tumori obuhvataju one koji su hormon-refraktorni (npr. androgen-nezavisni karcinom prostate; ili hormon-refraktorni karcinom dojke, poput karcinoma dojke refraktornog na tamoksifen); one koji su refraktorni na lečenje jednim ili pomoću više hemioterapijskih agenasa; one koji su refraktorni na zračenje; i one koji su refraktorni na kombinacije hemioterapije i zračenja, hemioterapije i hormonske terapije, ili hormonske terapije i zračenja.

[0087] Terapija može biti „prvog izbora“, tj. kao inicijalna terapija kod pacijenata koji nisu ranije imali nikakvu antikancersku terapiju, bilo samostalna, bilo u kombinaciji s drugim terapijama; ili „drugog izbora“, kao terapija kod pacijenata koji su imali jedan prethodni antikancerski terapijski režim, bilo samostalna, bilo u kombinaciji s drugim terapijama; odnosno „trećeg izbora“, „četvrtog izbora“ itd, bilo samostalna ili u kombinaciji s drugi terapijama.

[0088] Terapija se može davati i pacijentima koji su imali prethodne terapije koje su bile delimično uspešne, ali su intolerantni na konkretnu terapiju. Terapija se može davati i kao adjuvantna terapija, tj. za prevenciju ponovnog javljanja kancera kod pacijenata koji u tom trenutku nemaju detektabilnu bolest ili nakon hirurškog uklanjanja tumora.

[0089] Kanceri koji se mogu lečiti obuhvataju tumore koji nisu vaskularizovani, ili još nisu značajno vaskularizovani, kao i vaskularizovane tumore. Kanceri mogu obuhvatati nesolidne tumore (poput leukemija i limfoma) ili solidne tumore. Tipovi kancera koji se mogu lečiti antitelima iz pronalaska obuhvataju, ali nisu ograničeni na karcinome, blastome i sarkome, te određene leukemije ili limfoidne malignitete, benigne i maligne tumore, te malignitete, npr. sarkome, karcinome i melanome. Obuhvaćeni su adultni tumori/kanceri i pedijatrijski tumori/kanceri.

[0090] Može se primenjivati više od jednog TGFß antagonista, bilo u sastavu iste kompozicije ili u odvojenim kompozicijama.

[0091] TGFß antagonist može se davati samostalno ili u kombinaciji s jednim ili više terapijski efikasnih agenasa (npr. kapecitabinom, iksabepilonom ili oba) ili terapija. Drugi terapijski efikasan agens može se konjugovati sa TGFß antagonistom, ugraditi u istu kompoziciju kao i TGFß antagonist ili se može primeniti kao zasebna kompozicija. Drugi terapijski agens ili terapija može se primeniti pre, tokom i/ili posle primene TGFß antagonista.

[0092] U jednom otelotvorenju, TGFß antagonist se primenjuje zajedno s kapecitabinom, iksabepilonom ili njihovom kombinacijom. U drugom otelotvorenju, TGFß antagonist se primenjuje nezavisno od primene kapecitabina, iksabepilona ili njihove kombinacije. U jednom otelotvorenju, TGFß antagonist se primenjuje prvi, a zatim se primenjuju kapecitabin, iksabepilon ili njihova kombinacija. U drugom otelotvorenju, kapecitabin, iksabepilon ili njihova kombinacija se primenjuju prvi, a zatim se primenjuje TGFß antagonist.

[0093] Drugi terapijski efikasni agensi/terapije obuhvataju hirurgiju, antineoplastike (uključujući hemioterapijske agense i zračenje), antiangiogene agense, antitela na druge ciljne antigene, male molekule, fotodinamsku terapiju, imunoterapiju, citotoksične agense, citokine, hemokine, agense koji inhibišu rast, antihormonske agense, inhibitore kinaze, kardioprotektivne agense, imunostimulatorne agense, imunosupresivne agense, agense koji podstiču proliferaciju hematopoeznih ćelija i inhibitore protein-tirozin-kinaze (PTK).

[0094] Hemioterapijski agens može se primeniti kao prolek. Pojam „prolek“ odnosi se na prekursor ili derivat farmaceutski aktivne supstance koji je manje citotoksičan za tumorske ćelije u poređenju s lekom roditeljem i koji je sposoban da se enzimski aktivira ili konvertuje u aktivniji roditeljski oblik. Prolekovi koji se mogu upotrebiti u ovde prikazanim kompozicijama i metodama obuhvataju, ali nisu ograničeni na prolekove koji sadrže fosfate, prolekove koji sadrže tiofosfate, prolekove koji sadrže sulfate, prolekove koji sadrže peptide, D-aminokiselinski modifikovane prolekove, glikozilirane prolekove, prolekove koji sadrže beta-laktam, opcionalno supstituisane prolekove koji sadrže fenoksiacetamid ili opcionalno supstituisane prolekove koji sadrže fenilacetamid, 5-fluorocitozin i druge 5-fluorouridinske prolekove koji se mogu konvertovati u aktivniji citotoksični slobodan lek. Primeri citotoksičnih lekova od kojih se derivacijom može dobiti prolek za upotrebu sa antitelima i Fc fuzijama iz kompozicije i metoda kako su ovde navedene obuhvataju, ali nisu ograničeni na bilo koji od gorenavedenih hemioterapijskih agenasa.

[0095] Primena TGFß antagonista s drugim agensima (npr. kapecitabinom, iksabepilonom ili oba) i/ili terapijama može biti simultana ili odvojena, istim ili različitim putem, u isto ili različito vreme. Režimi doziranja mogu se prilagoditi kako bi se postigao optimalan željeni odgovor (npr. terapijski ili profilaktički odgovor).

[0096] U jednom primeru, može se dati jedan jedini bolus. U drugom primeru, tokom vremena može da se da više podeljenih doza. U sledećem primeru, doza može proporcionalno da se smanji ili poveća zavisno od potreba terapijske situacije. Oblik jedinice doziranja, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne za pojedinačne doze za lečenje ispitanika sisara. Svaka jedinica može sadržati prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu tako da postigne željeni terapijski efekat. U nekim otelotvorenjima, oblici jedinice doziranja iz pronalaska određeni su i direktno zavisni od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i konkretnog terapijskog ili profilaktičkog efekta koji treba postići.

[0097] Kompozicija iz pronalaska može se primeniti samo jednom ili se može primenjivati više puta. Kod multiplih doza, kompozicija se, na primer, može davati triput dnevno, dvaput dnevno, jednom dnevno, svakog drugog dana, dvaput nedeljno, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje ili jednom mesečno.

[0098] Treba imati na umu da se veličina doze može menjati zavisno od vrste i težine poremećaja koji treba ublažiti. Dalje treba razumeti da za svakog pojedinačnog ispitanika specifične režime doziranja treba prilagođavati tokom vremena zavisno od individualnih potreba i profesionalne ocene osobe koja daje kompozicije ili nadgleda njihovo davanje, te da su ovde nadalje navedeni opsezi doza dati samo kao primer i ne treba da ograniče obuhvat i delovanje kompozicija iz prijave.

[0099] „Primena“ na ispitaniku nije ograničena ni na jedan određen put davanja leka i može obuhvatati, bez ograničenja, parenteralni (uključujući supkutanu, intravensku, intramedularnu, intraartikularnu, intramuskularnu ili intraperitonealnu injekciju), rektalni, topički, transdermalni ili oralni (na primer, u kapsulama, suspenzijama ili tabletama). Primena na domaćinu može biti u pojedinačnoj dozi ili ponavljana, u bilo kom od brojnih fiziološki prihvatljivih oblika soli, i/ili s prihvatljivim farmakološkim nosačem i/ili aditivom kao deo farmaceutske kompozicije (opisano ranije). Još jednom, fiziološki prihvatljivi oblici soli i standardne tehnike farmaceutskih formulacija dobro su poznati osobama iskusnim u struci (videti, na primer, Remington‘s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.).

[0100] Kompozicija iz pronalaska (npr. TGFß antagonist) može se davati parenteralno (npr. intravenski, supkutano, intraperitonealno, intramuskularno). Dalje, kompozicija iz pronalaska može se davati putem intravenske infuzije ili injekcije. Kompozicija iz pronalaska može se davati putem intramuskularne ili supkutane injekcije. U pojedinim otelotvorenjima, kompozicija iz pronalaska (npr. kapecitabin i/ili iksabepilon) može se davati oralno. Kako se ovde koristi, „kompozicija“ se odnosi na bilo koju kompoziciju koja sadrži farmaceutski efikasnu količinu jednog ili više aktivnih sastojaka (npr. TGFß antagonist, kapecitabin, iksabepilon ili njihovu kombinaciju).

[0101] Ovde opisane metode lečenja mogu se koristiti za lečenje bilo kog pogodnog sisara, uključujući primate, poput majmuna i čoveka, konje, krave, mačke, pse, zečeve i glodare, poput pacova i miševa. U jednom otelotvorenju, sisar koji se leči je čovek.

[0102] Svi patenti i reference iz literature navedene u predmetnoj specifikaciji uključene su referencom u celosti.

PRIMERI

PRIMER 1

Studija 1: Efekti 1D11, iksabepilona, kapecitabina i kombinacija ovih terapeutika na rast primarnog tumora i metastaze u singenom modelu tripl-negativnog karcinoma dojke (4T1)

[0103] Klinički, za kombinaciju hemioterapeutika iksabepilona i kapecitabina dokazano je da je efikasna u lečenju metastatskog ili lokalno uznapredovalog tripl-negativnog karcinoma dojke (TNBC) rezistentnog na taksane. Pretklinička studija sprovedena je da bi se: (1) odredili efekti 1D11, iksabepilona i kapecitabina kao pojedinačnih agenasa na rast supkutanih 4T1 tumora i posledične metastaze u pluća, (2) odredilo da li kombinovane terapije ovim agensima imaju aditivne ili sinergističke efekte na efikasnost pojedinačnih agenasa i (3) stekao uvid u potencijalne probleme s bezbednošću/toksičnošću ovih kombinovanih terapija.

Eksperimentalne metode:

[0104]

Tabela 1: Nacrt studije

Grupa br.

Grupe lečenja

Životinje po grupi

1

Nosač antitela

10

2

13C4 10mg/kg

10

3

1D11 10mg/kg

10

4

Nosač antitela + kapecitabin

10

5

13C4 + kapecitabin

10

6

1D11 + kapecitabin

10

7

Nosač antitela + iksabepilon

10

8

13C4 iksabepilon

10

9

1D11 + iksabepilon

10

10

Nosač antitela + kapecitabin + iksabepilon

10

11

13C4 + kapecitabin + iksabepilon

10

12

1D11 + kapecitabin + iksabepilon

10

Vremenske tačke:

Dan 0:

Istraživači ubrizgaju 50 000 4T1 ćelija + matrigel supkutano u desni bok

Dan 3:

Istraživači započinju merenje tumora 2-3X/nedeljno

Dan 6:

DCM osoblje započinje doziranje antitela i.p. 3X/nedeljno

DCM osoblje započinje doziranje iksabepilona i.v., triput u intervalima od četiri dana

DCM osoblje započinje doziranje kapecitabina oralno, jednom dnevno, 14 dana

Životinje su žrtvovane kada je primarni tumor dostigao zapreminu 2000 mm3 ili pre završetka studije ukoliko su ispoljavali samrtnička stanja (izostanak čišćenja, teško disanje, kaheksija, anoreksija ili letargija). Nakon žrtvovanja, primarni tumor je prepolovljen, pa je jedna polovina uronjena u OCT, a druga stavljena u formalin puferovan cinkom. Pluća i bilo koja druga tkiva s metastazama prikupljena su i stavljena u cinkom puferovani formalin radi prebrojavanja plućnih metastaza i za imunohistohemiju.

Tkiva:

Primarni tumori u OCT i cinkom puferovanom formalinu, pluća prikupljena u cinkom puferovanom formalinu za ocenu metastaza i naknadnu imunohistohemiju.

[0105] Na dan 0, svaka od 150 ženki BALB/c miševa starih 12 nedelja dobila je supkutane injekcije 50 000 4T1 ćelija u matrigelu u desni bok. Miševi nosači tumora rutinski su posmatrani, a redovna merenja tumora 2-3X/nedeljno započeta su 6. dana. Zapremina tumora određivana je sledećom formulom:

Zapremina tumora = Dužina x Širina2 x 0.52

[0106] Šest dana nakon injekcije tumorskih ćelija, kada je prosečna zapremina tumora dostigla 80 mm3, životinje su mečovane po veličini i podeljene u dvanaest terapijskih grupa od po deset miševa. Trideset miševa s primarnim tumorima koji su bili ili značajno veći od proseka ili nepalpabilni (0 mm3) isključeno je iz studije. Od tog trenutka istraživači nisu imali uvid u to koja je koja terapijska grupa i započeta je terapijska primena. Svi miševi dobili su 10 mg/kg ili 1D11 ili 13C4 ili nosača antitela, u dozama od po 100 µl i.p. triput nedeljno (tabela 1). Specifične kohorte miševa dobijale su dodatne terapije iksabepilonom (6 mg/kg u 200 µl i.v. triput u intervalima od četiri dana), kapecitabinom (360 mg/kg u 100 µl oralno, jednom dnevno tokom 14 dana) ili obe.

[0107] Miševi su žrtvovani kad bi primarni tumor dostigao zapreminu 2000 mm3 ili veću ili ako bi se više od 20% površine tumora ulcerisalo ili ako bi životinje ispoljavale samrtnička stanja (izostanak čišćenja, teško disanje, kaheksija, anoreksija ili letargija). Po žrtvovanju, izvršene su makroskopske nekropsije i prikupljeni tumori, pluća i druga tkiva s metastazama. Deo primarnog tumora je zamrznut u OCT za imunohistohemiju na imunomarkere, a preostali tumor i druga tkiva s metastazama fiksirani su u cink-formalinu za uklapanje u parafin.

Rezultati:

[0108] Studijski miševi iz studije 09-3493 dobijali su kao terapiju nosač antitela, 13C4 ili 1D11 triput nedeljno tokom sedam uzastopnih nedelja. Nije bilo poteškoća u doziranju iksabepilona, kapecitabina niti terapeutika sa antitelom; verovatno zbog korišćenja BALB/c miševa proizvođača Charles River u ovoj studiji.

Tabela 2. Vidljiva neželjena dejstva u studiji u vezi s terapijom.

Grupa br.

Identifikacioni broj miša

Status

Studijski dan

Primedbe

Nosač + Kape + Iksa

B7171

nađen mrtav

14

Izrazito mršav i pogrbljen. Bez palpabilnog primarnog tumora. Nađen mrtav uveče nakon hemioterapeutika.

Nosač + Kape + Iksa

B1741

na samrti

20

Izrazito mršav i pogrbljen. Imao trzaje mišića. Žrtvovan zbog samrtničkog stanja.

Nosač + Kape + Iksa

B1793

nađen mrtav

17

Izrazito mršav i pogrbljen. Bez palpabilnog primarnog tumora.

Nosač + Kape + Iksa

B1835

na samrti

20

Izrazito mršav i pogrbljen. Imao trzaje mišića. Nemogućnost korišćenja zadnjih nogu. Žrtvovan zbog samrtničkog stanja.

13C4 + Kape + Iksa

B1718

nađen mrtav

16

Izrazito mršav i pogrbljen. Bez palpabilnog primarnog tumora.

13C4 + Kape + Iksa

B1765

nađen mrtav

18

Izrazito mršav i pogrbljen. Mali palpabilni primarni tumor. Nisu uzeta tkiva.

13C4 + Kape + Iksa

B1787

nađen mrtav

18

Izrazito mršav i pogrbljen. Mali palpabilni primarni tumor. Nisu uzeta tkiva.

13C4 + Kape + Iksa

B1804

na samrti

17

Izrazito mršav i pogrbljen. Nemogućnost korišćenja zadnjih nogu. Žrtvovan zbog samrtničkog stanja.

1D11 + Kape + Iksa

B1800

nađen mrtav

14

Izrazito mršav i pogrbljen. Bez palpabilnog primarnog tumora. Nađen mrtav uveče nakon hemioterapeutika.

1D11 + Kaps + Iksa

B1808

nađen mrtav

18

Izrazito mršav i pogrbljen. Bez palpabilnog primarnog tumora. Nisu uzeta tkiva.

[0109] Nekoliko miševa u ovoj studiji u kohorti kapecitabin+iksabepilon ili je pronađeno mrtvo ili je moralo biti žrtvovano zbog ispoljavanja samrtničkog stanja. Ove toksičnosti u vezi s terapijom opisane su u tabeli 1. Miševi kojima je bila neophodna eutanazija bili su izrazito mršavi, zapušteni, pogrbljeni i teško su disali. Neki miševi u grupama koje su dobijale iksabepilon pokazivali su znake periferne neuropatije; imali su teškoće u korišćenju zadnjih ekstremiteta. Međutim, kao što je primećeno u prethodnim studijama kojima se ispitivao iksabepilon na ovom modelu, neuropatija se povukla nakon poslednje doze hemioterapeutika. Dodatak 1D11 hemioterapeuticima nije povećao niti smanjio učestalost ovih toksičnosti.

[0110] Efekti na rast tumora bili su različiti zavisno od primenjene terapije (sl. 1). Kao samostalni agens, 1D11 nije imao značajan efekat na rast SQ 4T1 tumora (sl. 2A). Kao monoterapija, iksabepilon je bio najefikasniji u inhibiciji rasta 4T1 tumora u poređenju bilo s terapijom antitelom ili s kapecitabinom, premda je kapecitabin takođe inhibisao rast tumora. Dodatak antitela 1D11 terapiji kapecitabinom rezultirao je povećanom efikasnošću u odnosu na kapecitabin davan sam ili sa 13C4 (sl. 2B), međutim 1D11 nije povećavao efikasnost samostalno davanog iksabepilona (sl. 2C).

[0111] Najjača inhibicija rasta tumora zabeležena je kod miševa koji su primali kombinovanu terapiju 1D11+kapecitabin+iksabepilon, koja je pokazivala povećanu efikasnost u odnosu na kapecitabin+iksabepilon, same ili sa 13C4 (sl. 3A). Kombinacija kapecitabina i iksabepilona bila je efikasnija nego sam kapecitabin (sl. 3B), međutim ova kombinacija nije bila efikasnija od terapije iksabepilonom (sl. 3C). Što se tiče terapija sa 1D11, 1D11+kapecitabin+iksabepilon je bila efikasnija nego 1D11+iksabepilon, koja je bila efikasnija nego 1D11+kapecitabin, koja je bila efikasnija nego 1D11 kao samostalni agens (sl. 4).

[0112] Različiti terapijski režimi imali su različite efekte na preživljavanje. Miševi lečeni antitelom ili samo kapecitabinom imali su slične krive preživljavanja (sl. 5). Miševi lečeni samo iksabepilonom ili u kombinaciji s kapecitabinom imali su slično preživljavanje, koje je bilo veće nego u kohorti sa antitelom i kohorti s kapecitabinom. 1D11 kao samostalni agens nije povećavao preživljavanje, ali je terapija 1D11+kapecitabin imala povećano preživljavanje u odnosu na samostalni kapecitabin. Antitelo 1D11 nije povećavalo ni preživljavanje kod samostalnog iksabepilona, ali je najveća medijana preživljavanja zabeležena u terapijskoj grupi 1D11+kapecitabin+iksabepilon. Na krive preživljavanja uticala je i toksičnost hemioterapijskih režima kako je gore opisano.

[0113] Antitelo 1D11 kao samostalan agens nije produžavalo vreme potrebno da se dostigne krajnja tačka veličine od 2000 mm3 niti je produžavalo vreme do krajnje tačke kod životinja lečenih iksabepilonom (sl. 6). Međutim, antitelo 1D11 je produžavalo vreme do krajnje tačke u kohorti s kapecitabinom, a najduže vreme do krajnje tačke u studiji zabeleženo je u grupi 1D11+kapecitabin+iksabepilon.

[0114] Terapija antitelom 1D11 dovela je do povećanja broja metastaza u plućima u svim kohortama (sl. 7). U grupi sa 1D11 kao samostalnim agensom značajno je povećan broj metastaza u plućima u poređenju s grupom lečenom nosačem ili lekom 13C4, a slična povećanja usled terapije antitelom 1D11 zabeležena su u kohortama s kapecitabinom, iksabepilonom i kapecitabinom+iksabepilonom (sl. 8). Broj metastaza u plućima rastao je u funkciji vremena koje je životinja provela u studiji i taj efekat bio je nezavisan od terapijske grupe (sl. 9).

[0115] U klinici, objavljeno je da je kombinovana terapija iksabepilonom i kapecitabinom efikasnija od samostalnog kapecitabina kod taksan-rezistentnog tripl-negativnog karcinoma dojke (TNBC). Mišji 4T1 model karcinoma dojke rutinski se koristi kao dobar surogat za humani TNBC i za pretklinička ispitivanja terapijskih agenasa protiv TNBC. Svrha studije bila je da se odredi da li bi 1D11 povećao efikasnost kapecitabina, iksabepilona ili kombinacije ova dva hemioterapeutika protiv rasta primarnog tumora i/ili sledstvenih metastaza u singenom 4T1 modelu TNBC.

[0116] Kako je zabeleženo u prethodnim studijama sa ovim modelom, 1D11 kao samostalni agens nije značajno inhibisao rast primarnih, SQ 4T1 tumora. Međutim, 1D11 jeste povećavao efikasnost kapecitabina i kombinovane terapije kapecitabin+iksabepilon protiv primarnih tumora. Zapravo, trojna kombinacija 1D11+kapecitabin+iksabepilon bila je najefikasnija u inhibiciji rasta 4T1 primarnih tumora, a takođe je pokazala najveći povoljan efekat na preživljavanje i omogućila najduže vreme do krajnje tačke. Zajedno gledano, ovi podaci sugerišu da kombinovanje strategije neutralizacije TGFß s terapijom kapecitabin+iksabepilon može imati povoljniji terapijski učinak u odnosu na terapiju samo kapecitabinom+iksabepilonom.

[0117] Ovi podaci predstavljaju prvo povećanje efikasnosti nekog hemioterapeutika na modelu SQ 4T1 tumora. Prethodno je na ovom modelu 1D11 kombinovan s paklitakselom, cisplatinom ili karboplatinom i ni u jednoj od ovih studija 1D11 nije povećavao efikasnost ispitivanih hemioterapeutika.

[0118] U ovoj studiji, kombinovanjem antitela 1D11 s kapecitabinom povećana je efikasnost zabeležena kod samostalnog kapecitabina, što sugeriše da povećana efikasnost u grupi 1D11 + kapecitabin + iksabepilon u odnosu na grupu kapecitabin+iksabepilon može biti usled pojačanja efekta kapecitabina na rast tumora. Kapecitabin je oralni prolek koji se konvertuje u 5-fluorouracil, koji blokira sintezu DNK tako što imitira pirimidin. Antitumorski mehanizam sličan je onom kod gemcitabina. Interesantno je da 1D11 nije povećavao efikasnost gemcitabina na modelima karcinoma pankreasa, što sugeriše da povećanje zabeleženo u ovoj studiji zavisi od specifičnog leka, tumorskog modela ili oba.

[0119] Iznenađujuće, terapija antitelom 1D11 rezultirala je povećanim brojem metastaza u svim kohortama, a ne pojačanim efektom svakog hemioterapeutika.

[0120] U ovoj studiji, toksičnosti u vezi s terapijom, poput gubitka u težini, zapuštenog, pogrbljenog izgleda i otežanog disanja, zabeležene su kod miševa koji su primali hemio-kombo terapije. Miševi koji su primali iksabepilon imali su perifernu neuropatiju u vidu nepokretnosti zadnjih ekstremiteta, koja je prošla po završetku terapije. 1D11 nije imao efekta na učestalost niti na težinu ovih toksičnosti.

PRIMER 2

Studija 2: Efekti 1D11, iksabepilona, kapecitabina i kombinacija ovih terapeutika na rast primarnog tumora i metastaze u singenom modelu tripl-negativnog karcinoma dojke (4T1).

Eksperimentalne metode:

[0121] Terapijske grupe, vremenske tačke i tkiva bili su slični kao u gore opisanoj studiji. Na dan 0, svaka od 150 ženki BALB/c miševa starih 12 nedelja dobila je supkutane injekcije 50 000 4T1 ćelija u matrigelu u desni bok. Miševi nosači tumora rutinski su posmatrani, a redovna merenja tumora vršena su 2-3X/nedeljno počev od 6. dana. Zapremina tumora određivana je sledećom formulom:

Zapremina tumora = dužina x širina2 x 0,52

[0122] Šest dana nakon injekcije tumorskih ćelija, kada je prosečna zapremina tumora iznosila ∼70 mm3, životinje su mečovane po veličini i podeljene u dvanaest terapijskih grupa od po deset miševa. Trideset miševa s primarnim tumorima koji su bili ili značajno veći od proseka ili nepalpabilni (0 mm3) isključeno je iz studije. Od tog trenutka istraživači nisu imali uvid u to koja je koja terapijska grupa i započeta je terapijska primena. Svi miševi dobili su 10 mg/kg ili 1D11 ili 13C4 ili nosača antitela, u dozama od po 100 µl i.p. triput nedeljno (sl. 10). Specifične kohorte miševa dobijale su dodatne terapije iksabepilonom (3 mg/kg u 200 µl i.v. triput u intervalima od četiri dana), kapecitabinom (360 mg/kg u 100 µl oralno, jednom dnevno tokom 14 dana) ili obe.

[0123] Miševi su praćeni na pojavu izraženih ulceracija ili samrtničkih stanja (izostanak čišćenja, teško disanje, kaheksija, anoreksija ili letargija). Radi ispravne analize metastaza, svi miševi su žrtvovani 23. studijskog dana. Po žrtvovanju, izvršene su makroskopske nekropsije i prikupljeni tumori, pluća i druga tkiva s metastazama. Primarni tumor je podeljen napola, jedna polovina je zamrznuta u OCT, a druga sačuvana u reagensu RNAlater radi qPCR analize. Pluća su fiksirana u cink-puferovanom formalinu radi prebrojavanja plućnih metastaza i dalje imunohistohemijske analize.

Rezultati:

[0124] Do 23. studijskog dana, miševi su primili osam terapija nosača antitela, 13C4 ili 1D11. U ovoj studiji nisu zabeleženi problemi s toksičnošću ni tokom doziranja iksabepilona, ni kapecitabina, ni terapeutika sa antitelom. Sve životinje su žrtvovane 23. studijskog dana izuzev jednog miša koji je žrtvovan pre završetka studije jer je tumor ulcerisao.

[0125] Tumori u ovoj studiji rasli su nešto sporije nego u prethodnim studijama, pa su posledično bili relativno manji kada je studija završena 23. studijskog dana.

[0126] Uprkos smanjenoj veličini tumora u ovoj studiji, zabeležene su jasne razlike između srednjih zapremina tumora među terapijskim grupama (sl. 10 i 11). Treba istaći značajno smanjenje zapremine tumora registrovano 20. i 22. studijskog dana poređenjem životinja lečenih antitelom 1D11 kao samostalnim agensom sa onima koje su dobijale samo 13C4, iako je terapija antitelom 1D11 rezultirala statistički neznačajnim trendom inhibicije rasta antitelom 1D11 u poređenju sa životinjama lečenim nosačem (sl. 11A). Terapija kapecitabinom rezultirala je trendom ka inhibiciji rasta primarnih tumora, a nakon terapije iksabepilonom zabeleženo je značajno smanjenje zapremine tumora. Dodatak antitela 1D11 terapiji kapecitabinom rezultirao je statistički neznačajnim trendom ka povećanoj efikasnosti u odnosu na samostalan kapecitabin (sl. 11B). Kombinovanje 1D11 sa iksabepilonom rezultiralo je povećanom efikasnošću u poređenju sa samostalnim iksabepilonom, ali u poređenju sa 13C4+iksabepilonom (sl. 11C).

[0127] Dodatna korist od kombinovanja iksabepilona i kapecitabina nad bilo kojim hemioterapeutikom pojedinačno, zabeležena u studiji 09-3493, potvrđena je u ovoj studiji (sl. 12A). Kombinovana terapija kapecitabinom i iksabepilonom bila je značajno efikasnija u inhibiciji rasta SQ 4T1 tumora nego kapecitabin (sl. 12B), a zabeležena je i blaga korist u odnosu na samostalan iksabepilon (sl. 12C). Najjača inhibicija rasta tumora zabeležena je kod miševa koji su primali kombinovanu terapiju 1D11+kapecitabin+iksabepilon, koja je pokazivala povećanu efikasnost u odnosu na kapecitabin+iksabepilon, same ili sa 13C4 (sl. 12A), što je potvrdilo podatke iz studije 09-3493. Što se tiče terapija sa 1D11, 1D11+kapecitabin+iksabepilon je bila efikasnija nego 1D11+iksabepilon, koja je bila efikasnija nego 1D11+kapecitabin, koja je bila efikasnija nego 1D11 kao samostalni agens (sl. 13).

[0128] Terapija antitelom 1D11 nije inhibirala broj plućnih metastaza kao samostalni agens (sl. 14). Metastaze su značajno smanjene u kohorti koja je dobijala kombinovane terapije, a prosečan broj metastaza u svakoj od ovih kohorti bio je manji od 10. I 1D11+iksabepilon i 13C4+iksabepilon smanjivali su broj metastaza u poređenju s kapecitabinom, ali nije bilo razlika između terapijskih grupa u kohortama s kapecitabinom ili kapecitabinom+iksabepilonom.

[0129] Ova studija je druga po redu koja određuje efekat dodavanja 1D11 u kombinaciju hemioterapeutika iksabepilona i kapecitabina na inhibiciju rasta primarnog tumora i prevenciju metastaza u plućima. Slično kao u prvoj studiji, 09-3493, antitelo 1D11 nije imalo bitan efekat na rast primarnog tumora kao samostalni agens. Postojao je trend ka inhibiciji u grupi sa 1D11 u poređenju s grupom lečenom lekom 13C4, ali ovaj značaj je nestao kada je poređen s grupom lečenom nosačem. Takođe su postojali trendovi koji pokazuju da je 1D11 pojačavao efikasnost kapecitabina i iksabepilona, iako je u drugom slučaju povećanje efikasnosti iksabepilona bilo slično onom kod 13C4. Međutim, u ovoj studiji, kao i u 09-3493, najznačajnija inhibicija rasta 4T1 tumora zabeležena je kod miševa lečenih kombinacijom 1D11+kapecitabin+iksabepilon. Povećanje efikasnosti bilo je očigledno iako su životinje žrtvovane u vremenskoj tački kada je razdvajanje među terapijskim grupama tek počelo da se odvija. Zajedno gledano, podaci iz ove dve studije jasno pokazuju da kombinovanje strategije neutralizacije TGFß s terapijom kapecitabin+iksabepilon može imati povoljniji terapijski učinak u odnosu na terapiju samo kapecitabinom+iksabepilonom.

[0130] Zajedno gledano, podaci iz ove dve studije predstavljaju prvo povećanje efikasnosti nekog hemioterapeutika na modelu SQ 4T1 tumora. Prethodno je na ovom modelu 1D11 kombinovan s paklitakselom, cisplatinom ili karboplatinom i ni u jednoj od ovih studija 1D11 nije povećavao efikasnost ispitivanih hemioterapeutika.

[0131] U studiji 09-3493, povećanje efikasnosti kapecitabina+iksabepilona moglo je biti pripisano povećanju efikasnosti kapecitabina, budući da je 1D11 povećavao efikasnost samostalnog kapecitabina, ali ne i iksabepilona. U ovoj studiji postojao je trend ka povećanju efikasnosti antitelom 1D11 u kohorti s kapecitabinom, ali nije bio statistički značajan. Izgledalo je da 1D11 povećava efikasnost iksabepilona, ali je sličan rezultat zabeležen kada je iksabepilon kombinovan sa 13C4. Verovatno je da bi razdvajanje između terapijskih grupa u svakoj kohorti bilo bolje da je studija trajala duže. Time bi se trebalo pozabaviti u narednim studijama kako bi se odredilo da li je povećanje efikasnosti kapecitabina+iksabepilona antitelom 1D11 bilo zbog povećanja aktivnosti kapecitabina, iksabepilona ili je samo slučaj kada se 1D11 kombinuje sa oba terapeutika.

[0132] U studiji 09-3493, životinje koje su dobijale 6 mg/kg iksabepilona tipično su ispoljavale perifernu neuropatiju, a mnoge u kohorti sa iksabepilonom+kapecitabinom bile su na samrti zbog terapije i morale su biti žrtvovane. U ovoj studiji, doza iksabepilona smanjena je sa 6 mg/kg na 3 mg/kg; to je doza koja je bila efikasna protiv rasta 4T1 tumora u MTD studiji koju je sproveo Pharm/Tox. Sa ovako smanjenom dozom iksabepilona, nijedna životinja u studiji nije pokazivala znake intoksiciranosti ni u jednoj tački tokom studije. Pored toga, dokazano je da je doza od 3 mg/kg bila efikasna protiv rasta primarnog tumora i/ili učestalosti metastaza u ovoj studiji. Kao takva, primena ove manje doze verovatno bi imala prednost u budućim studijama zbog smanjene toksičnosti.

[0133] Osim što je mogla da registruje efekte na rast primarnog tumora, ova studija bila je dizajnirana na takav način da je mogla da prepozna i efekte antitela 1D11 kao samostalnog agensa ili u kombinaciji s hemioterapeuticima na metastaze SQ 4T1 primarnog tumora u pluća. Sve životinje su žrtvovane 23. dana, a ne kada bi svaki pojedinačni tumor dostigao 2000 mm3 (kao u studiji 09-3493), kako bi se eliminisala mogućnost da više vremena za rast tumora dovede do više metastaza. Iznenađujuće, 1D11 nije inhibisao metastaze u ovoj studiji kao što je bilo zabeleženo na drugim tumorskim modelima, uključujući 4T1 intrakardijalni model eksperimentalnih metastaza. Međutim, treba napomenuti da je broj plućnih metastaza u kohorti sa antitelom kao samostalnim agensom bio nizak u svim terapijskim grupama, a naročito nizak u hemio-kombo kohortama, što ukazuje na to da su ove životinje možda žrtvovane ranije nego što je trebalo. Prosečna veličina tumora u vreme završetka studije bila je ∼1000 mm3 u kohorti sa antitelom, ∼700 mm3 u kohorti s kapecitabinom, a 500 mm3 ili manja u kohortama sa iksabepilonom i iksabepilonom+kapecitabinom. Velika većina zabeleženih metastaza bila je manja od 1 mm među svim kohortama. U prethodnim studijama, pouzdan broj metastaza (50-100 po plućima) nije bio prisutan sve dok primarni tumori nisu dostigli ∼1500 mm3.

PRIMER 3

Studija 3: Efekti 1D11, iksabepilona, kapecitabina i kombinacija ovih terapeutika na rast primarnog tumora i metastaze u singenom modelu tripl-negativnog karcinoma dojke (4T1).

Eksperimentalne metode:

Zapremina tumora = dužina x širina2 x 0,52

[0135] Šest dana nakon injekcije tumorskih ćelija životinje su mečovane po veličini i podeljene u dvanaest terapijskih grupa od po deset miševa. Preostalih 30 životinja uključeno je u prateći eksperiment pri ovoj studiji, radi traženja efekata antitela 1D11 na regrutovanje i aktivnost makrofaga (videti dole). Od tog trenutka istraživači nisu imali uvid u to koja je koja terapijska grupa i započeta je terapijska primena. Sve grupe miševa dobile su kao terapiju ili nosač antitela ili 1D11 ili 13C4, primenjene u dozama od po 100 µl i.p. triput nedeljno. Specifične kohorte miševa dobijale su dodatne terapije kapecitabinom (360 mg/kg u 100 µl oralno, jednom dnevno tokom 14 uzastopnih dana), iksabepilonom (3 mg/kg u 200 µl i.v. triput u intervalima od četiri dana) ili obe.

[0136] Čitava kohorta miševa žrtvovana je kada je prosečna zapremina tumora u jednoj grupi unutar te kohorte dostigla 1500 mm3 ili više. Pojedinačni miševi žrtvovani su pre ove krajnje tačke u veličini ako su tumori ulcerisali ili ako bi životinje ispoljavale samrtnička stanja (izostanak čišćenja, teško disanje, kaheksija, anoreksija ili letargija). Po žrtvovanju, izvršene su makroskopske nekropsije i prikupljeni tumori, pluća i druga tkiva s metastazama. Deo primarnog tumora je zamrznut u OCT za imunohistohemiju na imunomarkere, a preostali tumor i druga tkiva s metastazama fiksirani su u cink-formalinu za uklapanje u parafin.

Tabela 3: Nacrt studije za eksperimente sa arginazom

Grupa br.

Grupe lečenja

Životinje po grupi

13

Nosač antitela

10

14

13C4 10 mg/kg

10

15

1D11 10 mg/kg

10

Vremenske tačke:

Dan 0:

Istraživači treba da ubrizgaju 50 000 4T1 ćelija + matrigel supkutano u desni bok

Dan 3:

Istraživači treba da započnu merenje tumora 2-3X/nedeljno

Dan 6:

DCM osoblje treba da počne doziranje antitela i.p. 3X/nedeljno; sedam celih terapija

Dan 21:

Grupa 13-15 miševa žrtvovana i prikupljeni primarni tumori

Tkiva

Primarni tumori u RPMI 1640 + 10% FBS čuvani na mokrom ledu.

[0137] Trideset miševa koji nisu uključeni u hemio-kombo deo ove studije mečovano je po veličini i podeljeno u tri dodatne grupe lečene nosačem antitela, lekom 13C4 ili antitelom 1D11 kako bi se evaluiralo prisustvo M2 makrofaga na mestu primarnog tumora (tabela 3). Primarni tumori prikupljeni su sa ovih miševa 21. studijskog dana. Tumori su enzimski svareni u 5 ml Hankovog balansiranog rastvora soli (HBSS) koji sadrži 50 µg/ml kolagenaze I, 50 µg/ml kolagenaze IV, 25 µg/ml hijaluronidaze, 10 µg/ml DNaze I i 0,2 U/ml inhibitora tripsina. Tkiva su dvaput inkubirana u rastvoru enzima 20 minuta na 37°C uz konstantno mućkanje, a suspenzija ćelija napravljena je pomoću disocijatora tkiva gentleMACS. Razdvojene ćelije i preostalo tkivo propušteni su kroz cediljku od 100 µm, a zatim kroz cediljku od 40 µm u epruvete za centrifugu od 50 ml. Ćelije su dvaput oprane u HBSS, pa su izbrojane žive ćelije. Radi obogaćenja CD11b+ ćelijama, žive ćelije su podešene na 1,0x107 ćelija po 90 µl degasiranog PBS koji sadrži 0,5% BSA bez endotoksina i 2 mM EDTA, pa su inkubirane sa anti-CD11b magnetnim mikrosferama. CD11b+ ćelije su pozitivno selektovane pomoću AutoMacs Pro Separatora. Porcije pojedinačnih CD11b+ ćelijskih suspenzija obojene su na CD11b, F4/80, CD206 i Gr-1. Preostale CD11b+ ćelije su lizirane da bi se ekstrahovala arginaza.

[0138] Za esej ćelijske arginaze, obogaćene ćelije oprane su u PBS, pa je 1,0x106 ćelija iz svakog tkiva dodato u odvojene epruvete za mikrocentrifugu od 0,5 ml. Ćelije su oprane u PBS na 1000 g na 4°C, pa su peletirane ćelije lizirane 10 minuta u 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) koja sadrži 0,4% Triton X-100 i inhibitor proteaze. Lizati su centrifugirani na 14 000 g, pa su supernatanti skladišteni na -80°C do dana eseja. Nivoi arginaze, određeni merenjem konverzije arginina u ornitin i ureu prema standardnoj krivoj za ureu, kvantifikovani su pomoću kompleta Quantichrome Arginase Kit (BioAssay System).

[0139] Za imunofenotipizaciju ćelija, 1,0x106 ćelija iz svakog tkiva blokirano je sa 10 µg/ml Fc Block (anti-CD16/32) 30 minuta pre bojenja antitelima na ćelije mijeloidnog porekla (CD11b), makrofage (F4/80), M2 makrofage (CD206) i MDSC ćelije (Gr-1). Vijabilnost ćelija određena je pomoću boje Live/Dead Fixable Dead Cell Stain (Invitrogen). Ćelije su fiksirane 15 minuta u 1% paraformaldehidu, a rezultati su dobijeni na protočnom citometru BD LSR II. Analiza podataka izvršena je pomoću softvera Flow Jo (sl. 15).

Rezultati:

[0140] Efekti na rast tumora bili su različiti zavisno od dodeljene terapije, tako da je najbrži rast tumora zabeležen kod miševa lečenih samo antitelima, a najsporiji rast kod miševa lečenih antitelom + kapecitabinom + iksabepilonom (sl. 16). U ovoj studiji, cela kohorta životinja žrtvovana je na dan kada je prosečna zapremina tumora u toj kohorti dostigla krajnju tačku veličine od 1500 mm3. Miševi u kohorti samo sa antitelom dostigli su srednju zapreminu tumora od ∼1500mm3 23. studijskog dana. Kohorte s kapecitabinom i sa iksabepilonom pokazivale su usporen rast tumora, sa dostizanjem krajnje tačke 27. dana, odnosno 29. dana, tim redom, dok je kombinacija kapecitabina i iksabepilona imala najsporiji rast, budući da je ova kohorta dostigla krajnju tačku 30. dana.

[0141] Kao samostalni agens, 1D11 nije imao značajan efekat na rast SQ 4T1 tumora (sl. 17A). Terapija kapecitabinom rezultirala je vrlo skromnom inhibicijom rasta tumora, a iksabepilon je bio najefikasniji u inhibiciji rasta 4T1 tumora kao monoterapija. Dodavanjem 1D11 nije povećana efikasnost ni kapecitabina (sl. 17B) ni iksabepilona (sl. 17C).

[0142] Najjača inhibicija rasta tumora zabeležena je kod miševa koji su primali kombinovanu terapiju 1D11+kapecitabin+iksabepilon, koja je pokazivala povećanu efikasnost u odnosu na kapecitabin+iksabepilon, same ili sa 13C4 (sl. 18A). Vrlo je upečatljivo da je kombinacija 1D11, kapecitabina i iksabepilona rezultirala najmanjom srednjom zapreminom tumora, 1174,50 mm3 u vreme žrtvovanja u poređenju s grupama s kombinovanom terapijom s nosačem (1689,06 mm3) i s lekom 13C4 (1651,24 mm3) u toj kohorti. Kombinacija kapecitabina i iksabepilona bila je efikasnija nego sam kapecitabin (sl. 18B), međutim ova kombinacija je bila tek malo efikasnija od terapije iksabepilonom (sl. 18C). Što se tiče terapija sa 1D11, 1D11+kapecitabin+iksabepilon je bila efikasnija nego 1D11+iksabepilon, koja je bila efikasnija nego 1D11+kapecitabin, koja je bila efikasnija nego 1D11 kao samostalni agens (sl. 19).

[0143] Antitelo 1D11 nije imalo efekta na broj metastaza koje su se razvile u plućima miševa sa SQ primarnim 4T1 tumorima. Terapija kapecitabinom + iksabepilonom inhibirala je metastaze, a efikasnost ove kombinovane terapije značajno je povećana antitelom 1D11 (sl. 20).

Tabela 4: Procenat ukupnih MDSC ćelija i makrofaga iz CD11b+ ćelija izolovanih iz 4T1 primarnih tumora.

Nosač antitela

10mg/kg 13C4

10mg/kg 1D11

4T1 primarni tumori (ukupni makrofagi)

22%

23%

26%

4T1 primarni tumori (MDSC)

72%

71%

64%

Ukupan % CD11b+ ćelija

94%

94%

90%

[0144] Imunofenotipizacija ukupnih makrofaga (CD11b+,F4/80+) M1 makrofaga (CD11b+,F4/80+,CD206-), M2 makrofaga (CD11b+,F4/80+CD206+) i MDSC ćelija (CD11b+,Gr-1+) otkrila je da su većina CD11b+ izolovanih iz primarnih 4T1 tumora MDSC ćelije (tabela 1). Izgleda da postoji blago povećanje broja TAM makrofaga i smanjenje broja MDSC ćelija u primarnim tumorima lečenim antitelom 1D11 u poređenju s kontrolama. Kvantitativno merenje ukupnih makrofaga, M1 makrofaga i M2 makrofaga izvršeno je računanjem unazad do ukupnog broja ćelija izolovanih iz primarnih tumora prikupljenih od svakog pojedinačnog miša (sl. 21). Prema ovoj analizi, nije bilo značajne razlike u broju makrofaga između terapijskih grupa. Međutim, postoji trend porasta CD206- M1 makrofaga iz primarnih tumora (sl. 21) miševa lečenih antitelom 1D11.

[0145] Iako terapija antitelom 1D11 nije smanjila broj M2 makrofaga povezanih s tumorima, izgleda da 1D11 ima inhibitorni efekat na proizvodnju arginaze od strane TAM ćelija. Nivoi arginaze bili su značajno smanjeni iz lizata CD11b+ ćelija miševa lečenih antitelom 1D11 u poređenju s kontrolama (sl. 22, p <0,001 jednosmernom ANOVA analizom i Takijevim testom višestrukih poređenja)

[0146] U klinici, objavljeno je da je kombinovana terapija iksabepilonom i kapecitabinom efikasnija od samostalnog kapecitabina kod taksan-rezistentnog tripl-negativnog karcinoma dojke (TNBC). Mišji 4T1 model karcinoma dojke rutinski se koristi kao dobar surogat za humani TNBC i za pretklinička ispitivanja terapijskih agenasa protiv TNBC. Svrha ranije studije bila je da se odredi da li bi 1D11 povećao efikasnost kapecitabina, iksabepilona ili kombinacije ova dva hemioterapeutika protiv rasta primarnog tumora i/ili sledstvenih metastaza u singenom 4T1 modelu TNBC.

[0147] Ova studija je dizajnirana da odredi da li bi 1D11 mogao da poveća efekat hemioterapeutika kapecitabina i iksabepilona na inhibiciju rasta primarnih 4T1 tumora i metastaze primarnog tumora u pluća. Najjača inhibicija rasta tumora zabeležena je u terapijskoj grupi 1D11 plus kapecitabin i iksabepilon. Kombinacija kapecitabina i iksabepilona takođe je inhibirala metastaze u pluća, a ovaj efekat dodatno je povećan kada je 1D11 dodat kombinovanoj terapiji. Kako je zabeleženo u prethodnim studijama sa ovim modelom, 1D11 kao samostalni agens nije imao efekta na rast primarnog tumora, nije inhibirao metastaze i nije značajno povećavao efikasnost ni kapecitabina ni iksabepilona kada su se primenjivali kao monoterapije.

[0148] Rezultati studije 09-4255 potvrđuju rezultate prethodne dve studije, 09-3493 i 09-3494, da 1D11 može značajno da poveća efikasnost kombinovane terapije kapecitabinom i iksabepilonom protiv rasta 4T1 primarnih tumora, a ova studija bila je prva koja je pokazala da 1D11 može i da poveća inhibiciju metastaza od strane kapecitabina + iksabepilona. Ovi podaci predstavljaju prvo povećanje efikasnosti nekog hemioterapeutika na modelu SQ 4T1 tumora. Prethodno je na ovom modelu 1D11 kombinovan s paklitakselom, cisplatinom ili karboplatinom i ni u jednoj od ovih studija 1D11 nije povećavao efikasnost ispitivanih hemioterapeutika.

[0149] Budući da 1D11 kao samostalni agens nema efekta ni na rast primarnog tumora ni na metastaze, dodatak antitela 1D11 u kapecitabin+ iksabepilon rezultira sinergističkim efektom. Razlog za ovu sinergiju još nije poznat. Antitelo 1D11 jedino povećava efikasnost kombinacije kapecitabina i iksabepilona, odnosno 1D11 nije konzistentno povećavao efikasnost ni kapecitabina ni iksabepilona kada su se ovi hemioterapeutici primenjivali pojedinačno. Antitumorska aktivnost kapecitabina, proleka koji se konvertuje u 5-fluorouracil, posledica je njegove sposobnosti da funkcioniše kao antagonist pirimidina, a iksabepilon je stabilizator mikrotubula. U klinici, kombinacija kapecitabina i iksabepilona bila je efikasnija od oba pojedinačna agensa protiv tripl-negativnog karcinoma dojke. Na modelu 4T1 tumora, efikasnost kombinovane terapije bila je jača nego kod samostalnog kapecitabina, odnosno samo neznatno bolja od one zabeležene kod samostalnog iksabepilona. Pretpostavlja se da targetiranje TGFß antitelom 1D11 povećava antitumorsku imunost neutralisanjem imunosupresivnih efekata TGFß poreklom iz tumora i strome. Moguće je da bi ovi potencijalno suptilni efekti na modelu ovako agresivnog tumora mogli jedino da povećaju efikasnost hemioterapeutika kada bi se tumori napadali multiplim terapeuticima koji ciljano deluju na multiple puteve.

[0150] U studiji 09-3493, zabeležena je značajna toksičnost kod životinja nosača tumora lečenih kombinacijom kapecitabina i iksabepilona. Doze ova dva terapeutika bile su 360 mg/kg i 6 mg/kg, tim redom. Doza iksabepilona koja može da uzrokuje neuropatiju smanjena je na 3 mg/kg u drugoj studiji u ovoj seriji, 09-3494. To je rezultiralo značajnim smanjenjem toksičnosti i neuropatije, pa je stoga ova doza korišćena u aktuelnoj studiji. Iako je kod miševa koji su primali terapiju antitelo/hemioterapeutik zabeležen gubitak u težini, postojalo je značajno smanjenje teških neželjenih dejstava poput paralize zadnjih udova i smrti, koja su zabeležena u studiji 09-3493. Gubitak u težini bio je najčešće neželjeno dejstvo kombinovane terapije, međutim, dodatak antitela 1D11 nije ni povećao ni smanjio učestalost ove toksičnosti.

[0151] Zajedno gledano, ovi podaci pokazuju da će kombinovanje strategije neutralizacije TGFß s terapijom kapecitabin+iksabepilon imati povoljniji terapijski učinak u odnosu na terapiju samo kapecitabinom+iksabepilonom u klinici.

[0152] S obzirom na efikasnost koju 1D11 ima protiv metastaza na drugim tumorskim modelima i povećanje dejstva kapecitabina + iksabepilona u ovoj seriji studija, sprovedeno je nekoliko studija za ispitivanje mehanizma dejstva antitela 1D11. Utvrđeno je da su citotoksični T limfociti (CTL) ključni za sposobnost antitela 1D11 da inhibiše metastaze na modelu spontanih metastaza tumora jastučića na šapama B16-F10. U studiji 09-4255, sproveden je prateći eksperiment pri glavnoj studiji efikasnosti kako bi se odredilo da li neutralizacija faktora TGFß antitelom 1D11 utiče na regrutovanje, fenotip i/ili aktivnost TAM makrofaga.

[0153] Klasično aktivirani TAM makrofagi, poznati i kao M1 makrofagi, delom su tumoricidni zahvaljujući inducibilnoj NO sintazi. (iNOS). Obrnuto, alternativno aktivirani TAM makrofagi, ili M2 makrofagi, povezivani su s progresijom tumora putem pospešivanja tumorske invazije, metastaza i angiogeneze. Zabeleženo je u literaturi da M2 makrofagi luče arginazu i da su sposobni da pospešuju proliferaciju tumorskih ćelija preko arginaznog puta. Drugi ćelijski tip, MDSC ćelije, regrutuju se na mesto primarnog tumora, gde imaju imunosupresivnu ulogu. MDSC ćelije i makrofagi su i veliki proizvođači TGFß, koji pomaže u pospešivanju progresije tumora.

[0154] Immunofluorescencija CD68/CD206 kolokalizacijom pokazala je da su M2 makrofagi prisutni u primarnim 4T1 tumorima nelečenih miševa nosača tumora. U ovoj studiji, zabeležen je trend ka povećanom broju tumoricidnih M1 makrofaga i u primarnim tumorima i u plućima miševa lečenih antitelom 1D11. Terapija antitelom 1D11 nije dovela do značajnog smanjenja broja dva ćelijska tipa, M2 makrofaga i MDSC ćelija, povezanih s primarnim tumorima. Premda terapija antitelom 1D11 nije dovela do smanjenja broja tumor-pospešujućih M2 makrofaga niti MDSC ćelija, postoji značajno smanjenje intraćelijske arginaze porekla CD11b+ ćelija izolovanih iz oba 4T1 primarna tumora. Ovo demonstrira farmakodinamsku aktivnost 1D11 na modelu jer je pokazano da TGFß vrši ushodnu regulaciju sinteze arginaze, koju proizvode pro-tumorigeni M2 makrofagi, i nishodnu regulaciju sinteze enzima iNOS, koju luče anti-tumorigeni M1 makrofagi. Pokazano je da arginaza pospešuje proliferaciju tumorskih ćelija, tako da bi inhibicija proizvodnje arginaze neutralizacijom TGFß mogla imati štetan efekat na proliferaciju i rast tumora.

PRIMER 4

Neutralizacija TGFß pan-neutrališućim TGFß antitelom, 1D11, selektivno povećava efikasnost hemioterapeutika na pretkliničkom tumorskom modelu

[0155] Kombinacija TGF-ß neutralizacije upotrebom mišjeg monoklonskog antitela 1D11 i odabranih hemioterapeutika testirana je na mišjem modelu raka dojke, raka pankreasa, melanoma i karcinoma bubrežnih ćelija. Od testiranih kombinacija, jedino je dodatak antitela 1D11 kombinovanoj terapiji kapecitabin + iksabepilon konzistentno rezultirao povećanom efikasnošću nad režimom samo sa hemioterapeutikom. Antitelo 1D11 rutinski je povećavalo efikasnost kapecitabina+iksabepilona protiv rasta primarnog tumora i inhibisalo metastaze u singenom 4T1 supkutanom (SQ) tumorskom modelu i prva je demonstracija aditivnog efekta kada se 1D11 kombinuje s hemioterapeuticima u nekoliko studija raka.

[0156] Antitelo 1D11 kombinovano je s paklitakselom i na ksenograft (MDA-MB-231) modelu raka dojke i na singenom 4T1 modelu raka dojke. U ovim studijama, 1D11 nije povećavao inhibiciju primarnih tumora paklitakselom, a u 4T1 studijama 1D11 takođe nije povećavao sposobnost paklitaksela da inhibiše spontane metastaze primarnih tumora u pluća. Kombinacija antitela 1D11 i ciklofosfamida takođe je testirana na ksenograft MDA-MB-231 modelu i ni u ovom slučaju 1D11 nije povećavao efikasnost ciklofosfamida protiv rasta primarnog tumora. MDA-MB-231 i 4T1 modeli takođe su korišćeni za testiranje kombinovanih terapija antitelom 1D11 i jedinjenjima platine cisplatinom ili karboplatinom. Na 4T1 SQ modelima, 1D11 nije povećavao efikasnost karboplatina protiv rasta primarnog tumora. Na 4T1 modelu eksperimentalnih metastaza, gde su tumorske ćelije ubrizgavane u levu srčanu komoru što je rezultiralo metastatskim rasejanjem u kosti, nadbubrežne žlezde, bubrege i pluća, i 1D11 i cisplatin bili su sposobni da inhibišu metastaze, naročito u kosti, ali nije zabeležena povećana efikasnost kada su se ova dva terapeutika kombinovala.

[0157] Nije zabeleženo povećanje efikasnosti kada je 1D11 kombinovan sa standardnim hemioterapeuticima na modelima raka pankreasa ili melanoma. Gemcitabin je hemioterapeutik prve linije za rak pankreasa, a kombinacija antitela 1D11 i gemcitabina testirana je na SQ ksenograft modelu (Panc-1), SQ singenom modelu (Pan02) i na genetski-inženjeriranom mišjem modelu (GEMM) Kras/mutantni p53-indukovanog duktalnog adenokarcinoma pankreasa (PDAC). U Panc-1 studijama, 1D11 nije imao efekta na efikasnost gemcitabina protiv SQ primarnih tumora, a sličan efekat zabeležen je i u PDAC GEMM. Međutim, na Pan02 modelu, kombinovanje 1D11 sa gemcitabinom zapravo je smanjilo efikasnost gemcitabina protiv rasta primarnih tumora, što je rezultovalo ubrzanim rastom tumora u poređenju s kontrolama.

[0158] Mišji B16-F10 model melanoma korišćen je da se procene efekti kombinovanja antitela 1D11 sa dakarbazinom, hemioterapeutikom koji se koristi kao prva linija terapije melanoma. Na SQ B16-F10 modelu, 1D11 nije povećavao efikasnost dakarbazina protiv rasta primarnog tumora. Hemio-kombo terapija antitelom 1D11 i dakarbazinom takođe je testirana na modelu spontanih metastaza B16-F10 mišjeg melanoma. Na ovom modelu, tumorske ćelije ubrizgavane su supkutano u plantarni region miševa, gde se razvio primarni tumor koji je spontano metastazirao u regionalni poplitealni limfni čvor. Kao i na SQ modelu, 1D11 nije povećavao efikasnost dakarbazina protiv primarnih tumora, a nije ni povećavao efikasnost dakarbazina protiv metastaza u drenirajući limfni čvor

[0159] Na kraju, 1D11 je testiran na Caki-1 ksenograft modelu karcinoma bubrežnih ćelija u kombinaciji sa ciklofosfamidom i paklitakselom i u toj studiji izgledalo je da 1D11 smanjuje efikasnost oba ova hemioterapeutika.

[0160] Ukratko, podaci jasno pokazuju da neutralizacija TGFß antitelom 1D11 jedino povećava efikasnost određenih hemioterapeutika. 1D11 je povećavao efikasnost kombinacije kapecitabina i iksabepilona na pretkliničkom modelu raka dojke, ali nije povećavao efikasnost paklitaksela, ciklofosfamida, cisplatina, karboplatina, gemcitabina niti dakarbazina na relevantnim tumorskim modelima.

[0161] Iskusni u struci prepoznaće da se otelotvorenja opisana gore mogu menjati, a da se ne odstupi od njihovog šireg pronalazačkog koncepta. Stoga je razumljivo da ovaj pronalazak nije ograničen na konkretna izložena otelotvorenja, već je namenjen da obuhvati modifikacije koje su u opsegu pronalaska, kako je definisano priloženim patentnim zahtevima.

[0162] Specifične karakteristike pronalaska, definisane u originalnim patentnim zahtevima matične prijave, izložene su u narednim pasusima:

1. Metoda za lečenje raka dojke kod ispitanika, pri čemu metoda obuhvata:

primenu kod pomenutog ispitanika terapijski efikasne količine antagonista transformišućeg faktora rasta (TGFß) u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom, naznačeno time što primena pomenutog TGFß antagonista povećava efikasnost kapecitabina i iksabepilona u lečenju pomenutog raka dojke.

2. Metoda iz prethodnog pasusa 1, naznačena time što je pomenuti antagonist TGFß agens koji blokira vezivanje TGFß proteina za odgovarajući receptor.

3. Metoda iz prethodnog pasusa 2, naznačena time što je pomenuti agens protein.

4. Metoda iz prethodnog pasusa 3, naznačena time što je pomenuti agens anti-TGFß antitelo.

5. Metoda iz prethodnog pasusa 4, naznačena time što je pomenuto antitelo pan-neutrališuće anti-TGFß antitelo.

6. Metoda iz prethodnog pasusa 4, naznačena time što je pomenuto antitelo anti-TGFß monoklonsko antitelo.

7. Metoda iz prethodnog pasusa 6, naznačena time što je pomenuto antitelo humanizovano antitelo koje sadrži jedan ili više CDR regiona antitela 1D11.

8. Metoda iz prethodnog pasusa 2, naznačena time što je pomenuti TGFß protein TGFß-1, -2, -3 ili njihova kombinacija.

9. Metoda iz prethodnog pasusa 1, naznačena time što je pomenuti TGFß antagonist molekul koji je sposoban da smanji aktivnost TGFß.

10. Metoda iz prethodnog pasusa 1, pomenuti TGFß antagonist se primenjuje zajedno s kapecitabinom i iksabepilonom.

11. Metoda iz prethodnog pasusa 1, pomenuti TGFß antagonist se primenjuje nezavisno od primene kapecitabina i iksabepilona.

12. Metoda iz prethodnog pasusa 1, naznačena time što primena pomenutog TGFß antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom inhibiše rast primarnog tumora.

13. Metoda iz prethodnog pasusa 1, naznačena time što primena pomenutog TGFß antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom inhibiše metastaze.

14. Metoda iz patentnog zahteva 1, naznačena time što primena pomenutog TGFß antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom inhibiše metastaze primarnog tumora u pluća.

15. Metoda za inhibiciju rasta tumora povezanog s rakom dojke kod ispitanika, pri čemu metoda obuhvata: primenu kod pomenutog ispitanika terapijski efikasne količine antagonista transformišućeg faktora rasta beta (TGFß) u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom, naznačeno time što primena pomenutog TGFß antagonista povećava efikasnost kapecitabina i iksabepilona u inhibiciji pomenutog rasta tumora povezanog s rakom dojke.

16. Metoda iz prethodnog pasusa 15, naznačena time što je pomenuti TGFß antagonist agens koji blokira vezivanje TGFß proteina za odgovarajući receptor.

17. Metoda iz prethodnog pasusa 16, naznačena time što je pomenuti agens protein.

18. Metoda iz prethodnog pasusa 17, naznačena time što je pomenuti agens anti-TGFß antitelo.

19. Metoda iz prethodnog pasusa 18, naznačena time što je pomenuto antitelo pan-neutrališuće anti-TGFß antitelo.

20. Metoda iz prethodnog pasusa 18, naznačena time što je pomenuto antitelo anti-TGFß monoklonsko antitelo.

21. Metoda iz prethodnog pasusa 20, naznačena time što je pomenuto antitelo humanizovano antitelo koje sadrži jedan ili više CDR regiona antitela 1D11.

22. Metoda iz prethodnog pasusa 16, naznačena time što je pomenuti TGFß protein TGFß-1, -2, -3 ili njihova kombinacija.

23. Metoda iz prethodnog pasusa 15, naznačena time što je pomenuti TGFß antagonist molekul koji je sposoban da smanji aktivnost TGFß.

24. Metoda iz prethodnog pasusa 15, pomenuti TGFß antagonist se primenjuje zajedno s kapecitabinom i iksabepilonom.

25. Metoda iz prethodnog pasusa 15, pomenuti TGFß antagonist se primenjuje nezavisno od primene kapecitabina i iksabepilona.

26. Metoda iz prethodnog pasusa 15, naznačena time što primena pomenutog TGFß antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom inhibiše rast primarnog tumora.

27. Metoda iz prethodnog pasusa 15, naznačena time što primena pomenutog TGFß antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom inhibiše metastaze.

28. Metoda iz prethodnog pasusa 15, naznačena time što primena pomenutog TGFß antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom inhibiše metastaze primarnog tumora u pluća.

Claims (16)

1. Farmaceutska kompozicija za lečenje raka dojke kod ispitanika koja sadrži: terapijski efikasnu količinu antagonista transformišućeg faktora rasta beta (TGFß), kapecitabina i iksabepilona, naznačena time što je pomenuti TGFß antagonist prisutan u količini delotvornoj da poveća efikasnost kapecitabina i iksabepilona u lečenju pomenutog raka dojke.

2. Kompozicija prema zahtevu 1, naznačena time što je pomenuti TGFß antagonist agens koji blokira vezivanje TGFß proteina za odgovarajući receptor.

3. Kompozicija prema zahtevu 2, naznačena time što je pomenuti agens protein.

4. Kompozicija prema zahtevu 3, naznačena time što je pomenuti agens anti-TGFß antitelo.

5. Kompozicija prema zahtevu 4, naznačena time što je pomenuto antitelo pan-neutrališuće anti-TGFß antitelo.

6. Kompozicija prema zahtevu 4, naznačena time što je pomenuto antitelo anti-TGFß monoklonsko antitelo.

7. Kompozicija prema zahtevu 6, naznačena time što je pomenuto antitelo humanizovano antitelo koje sadrži jedan ili više CDR regiona antitela 1D11.

8. Kompozicija prema zahtevu 2, naznačena time što je pomenuti TGFß protein TGFß-1, -2, -3 ili njihova kombinacija.

9. Komplet za lečenje raka dojke kod ispitanika koji sadrži: terapijski efikasnu količinu antagonista transformišućeg faktora rasta beta (TGFß), kapecitabina i iksabepilona, naznačen time što je pomenuti TGFß antagonist prisutan u količini delotvornoj da poveća efikasnost kapecitabina i iksabepilona u lečenju pomenutog raka dojke.

10. Komplet prema zahtevu 9, naznačen time što je pomenuti antagonist TGFß agens koji blokira vezivanje TGFß proteina za odgovarajući receptor.

11. Komplet prema zahtevu 10, naznačen time što je pomenuti agens protein.

12. Komplet prema zahtevu 11, naznačen time što je pomenuti agens anti-TGFß antitelo.

13. Komplet prema zahtevu 12, naznačen time što je pomenuto antitelo pan-neutrališuće anti-TGFß antitelo.

14. Komplet prema zahtevu 13, naznačen time što je pomenuto antitelo anti-TGFß monoklonsko antitelo.

15. Komplet prema zahtevu 14, naznačen time što je pomenuto antitelo humanizovano antitelo koje sadrži jedan ili više CDR regiona antitela 1D11.

16. Komplet prema zahtevu 10, naznačen time što je pomenuti TGFß protein TGFß-1, -2, -3 ili njihova kombinacija.