ES2575914T3 - Derivados condensados de aminodihidrotiazina como inhibidores de BACE - Google Patents

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Abstract

Un compuesto de fórmula (I):**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que X es hidrógeno o flúor; A es CH o N; Y es metilo, etilo, monofluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, difluoroetilo, metoxi, etoxi, metoximetilo o -C≡N.

Description

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N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-amino-5-(trifluorometil)-4a,5,7,7a-tetrahidro-4H-furo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il)-4fluorofenil)-5-etoxipirazin-2-carboxamida:
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N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-amino-5-(trifluorometil)-4a,5,7,7a-tetrahidro-4H-furo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il)-4fluorofenil)-5-(1,1-difluoroetil)pirazin-2-carboxamida:
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N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-amino-5-(trifluorometil)-4a,5,7,7a-tetrahidro-4H-furo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il)-4fluorofenil)-5-(trifluorometil)pirazin-2-carboxamida:
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N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-amino-5-(trifluorometil)-4a,5,7,7a-tetrahidro-4H-furo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il)-4fluorofenil)-5-(metoximetil)pirazin-2-carboxamida:
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N-{3-[(4aS,5S,7aS)-2-amino-5-(trifluorometil)-4a,5-dihidro-4H-furo[3,4-d][1,3]tiazin-7a(7H)-il]-4-fluorofenil}-5[(2H3)metiloxi]pirazin-2-carboxamida:
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y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
En una realización, la presente invención proporciona un compuesto que es N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-amino-5(trifluorometil)-4a,5,7,7a-tetrahidro-4H-furo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il)-4-fluorofenil)-5-metoxipirazin-2-carboxamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización, la presente invención proporciona un compuesto que es N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-amino-5(trifluorometil)-4a,5,7,7a-tetrahidro-4H-furo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il)-4-fluorofenil)-5-(fluorometil)pirazin-2-carboxamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los compuestos específicos dentro del alcance de esta invención incluyen aquellos nombrados en los Ejemplos siguientes y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Como se usa aquí, el término “difluoroetilo” se refiere a un grupo alquilo que tiene dos átomos de carbono y está sustituido con dos átomos de flúor. Los ejemplos del grupo son CH3-CF2-, CH2F-CHF-y CHF2-CH2-. En la presente invención, el grupo es preferiblemente CH3-CF2-.
El compuesto de fórmula (I) no se limita a un isómero especifico, e incluye todos los isómeros posibles (tal como un isómero de ceto-enol, un isómero de imina-enamina y un rotámero) y mezclas de los mismos. Por ejemplo, el compuesto de fórmula (I) incluye los siguientes tautómeros:
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Los compuestos de la presente invención contienen tres centros quirales ubicados en el anillo de tetrahidrofurotiazinilo dentro de la fórmula (I). La configuración estereoquímica en cada uno de estos centros quirales es preferiblemente S, es decir, son estereoisómeros (4aS,5S,7aS). Para evitar dudas, los estereoisómeros (4aS,5S,7aS) de la presente invención pueden estar presentes como una mezcla con uno o más de los otros estereoisómeros posibles, por ejemplo, en una mezcla racémica.
En una realización, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) que es estereoquímicamente puro en los centros quirales (4aS,5S,7aS). En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión estereoquímicamente puro denota un compuesto que tiene 80% o más en peso del estereoisómero (4aS,5S,7aS) y 20% o menos en peso de otros estereoisómeros. En una realización adicional, el compuesto de fórmula (I) tiene 90%
o más en peso del estereoisómero (4aS,5S,7aS) y 10% o menos en peso de otros estereoisómeros. En una realización todavía adicional, el compuesto de fórmula (I) tiene 95% o más en peso del estereoisómero (4aS,5S,7aS) y 5% o menos en peso de otros estereoisómeros. En una realización aún más adicional, el compuesto de fórmula (I) tiene 97% o más en peso del estereoisómero (4aS,5S,7aS) y 3% o menos en peso de otros estereoisómeros.
En la presente memoria descriptiva, aunque puedan estar presentes polimorfos cristalinos del compuesto, el compuesto de modo similar no está limitado a ello y puede estar presente como una forma cristalina única o una mezcla de formas cristalinas únicas. El compuesto puede ser un anhídrido o un hidrato. Cualquiera de estas formas se incluye en las reivindicaciones de la presente memoria descriptiva.
La presente invención también incluye compuestos marcados isotópicamente, que son idénticos a los compuestos de fórmula (I), excepto que uno o más átomos se reemplaza por un átomo que tiene un número másico o masa atómica diferente del número másico o masa atómica usualmente encontrado en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que se pueden incorporar en los compuestos de la invención incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, flúor, fósforo, cloro, tecnecio y yodo, tales como 2H, 3H, 11C, 14C, 13N, 15O, 18F, 32P, 99mTc, 123I y
131I.
Los compuestos de la presente invención y derivados farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, sales) de dichos compuestos que contienen los isótopos mencionados anteriormente y/u otros isótopos de otros átomos están dentro del alcance de la presente invención. Los compuestos marcados isotópicamente de la presente invención, por ejemplo aquellos en los que se incorporan isótopos radiactivos tales como 3H y/o 14C, son útiles en ensayos de distribución de tejidos de sustratos y/o fármacos. 3H y 14C se consideran útiles debido a su facilidad de preparación y detección. Los isótopos 11C, 15O y 18F se consideran útiles en PET (tomografia de emisión de positrones), y los isótopos 99mTc, 123I y 131I se consideran útiles en SPECT (tomografia computarizada de emisión de fotón único),
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ser sometido al eflujo de gp-P, es decir, llevando a cabo un ensayo in vitro de gp-P. Los expertos en la técnica apreciarán que se puede usar un número de líneas de células, y que estas líneas de células pueden afectar o no a los resultados del ensayo. A continuación se describe un ensayo de este tipo (Cyprotex UK).
Se utilizó el siguiente ensayo de MDR-1 MDCK para evaluar el eflujo de gp-P. El ensayo se llevó a cabo en Cyprotex Discovery Ltd. 15 Beech Lane, Macclesfield, Cheshire, Reino Unido, SK10 2DR.
Permeabilidad de MDR1-MDCK (Bi-direccional; pH 7,4/pH 7,4)
Resumen del protocolo
Las células MDCK son una línea de células epiteliales de origen renal canino. Estas células se pueden transfectar para expresar de forma estable glicoproteína P activa (MDR1-MDCK), y son ideales para el estudio del eflujo de fármacos. El compuesto de ensayo se añadió al lado apical o basolateral de una monocapa confluente de células MDR1-MDCK, y la permeabilidad se midió monitorizando la aparición del compuesto de ensayo en el lado opuesto de la membrana usando LC-MS/MS. A partir de esto, se midió/calculó una relación de un coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) y eflujo.
Objetivo
Para medir la permeabilidad del compuesto de ensayo en la dirección apical a basolateral (A-B) y basolateral a apical (B-A) a través de las células MDR1-MDCK, se calculó una relación de permeabilidades B-A y A-B (relación de eflujo) para demostrar si el compuesto sufre eflujo de glicoproteína P.
Los compuestos se proporcionaron como una disolución de 200 l de compuesto de ensayo 10 mM en DMSO.
Procedimiento experimental
Se usaron células MDR1-MDCK obtenidas del NIH (Rockville, MD, USA). Después del cultivo hasta la confluencia, las monocapas se prepararon enjuagando las dos superficies basolateral y apical dos veces con un amortiguador de pH 7,4 a 37ºC. Las células se incubaron a continuación con un amortiguador de pH 7,4 en los dos compartimentos apical y basolateral durante 40 minutos para estabilizar los parámetros fisiológicos.
El amortiguador a pH 7,4 se retiró entonces del compartimento apical y se reemplazó con disoluciones de dosificación del compuesto de ensayo. Las disoluciones se prepararon diluyendo 10 mM del compuesto de ensayo en DMSO con el amortiguador para dar una concentración final del compuesto de ensayo de 10 M (concentración final de DMSO ajustada al 1%). El marcador de integridad fluorescente amarillo Lucifer también se incluyó en la disolución de dosificación. Las inserciones de compartimentos apicales se colocaron a continuación en placas de “compañía” que contienen amortiguador reciente a pH 7,4. Los patrones analíticos se obtuvieron a partir de las disoluciones de dosificación.
Para los experimentos basolateral a apical (B-A), el experimento se inició reemplazando el amortiguador en los insertos, colocándolos a continuación en placas de compañía que contienen disoluciones de dosificación. Las incubaciones se llevaron a cabo en una atmósfera de 5% de CO2 con una humedad relativa de 95% a 37ºC durante 60 minutos.
Después del periodo de incubación, se retiró la placa de compañía y las muestras apical y basolateral se diluyeron para el análisis por LC-MS/MS. La permeabilidad del compuesto de ensayo se evaluó por duplicado. En cada placa, los compuestos de características de permeabilidad conocidas se usaron como controles.
Los compuestos de ensayo y de control se cuantificaron por análisis de casete de LC-MS/MS usando una calibración de 5 puntos con la dilución apropiada de las muestras Se usaron condiciones analíticas genéricas de Cyprotex. La concentración de partida (C0) se determinó a partir de la disolución de dosificación, y la recuperación experimental se calculó a partir de C0 y las concentraciones de compartimentos tanto apical como basolateral.
La integridad de las monocapas durante todo el experimento se comprobó monitorizando la permeación de amarillo Lucifer usando un análisis fluorimétrico. La permeación de amarillo Lucifer es baja si las monocapas no han sido dañadas. Si un valor de Papp de amarillo Lucifer estaba por encima de los límites de control de calidad (QC) en un pocillo de compuesto de ensayo individual, entonces se informó de un resultado n=1. Si los valores de Papp de amarillo Lucifer estaban por encima de los límites de control de calidad en los dos pocillos duplicados para un compuesto de ensayo, el compuesto se volvía a probar. Si en la repetición se observó una alta permeación de amarillo Lucifer en ambos pocillos, entonces se supuso la toxicidad o la fluorescencia inherente del compuesto de ensayo. No se llevaron a cabo experimentos adicionales en este caso.
Análisis de datos
El coeficiente de permeabilidad para cada compuesto (Papp) se calculó a partir de la siguiente ecuación:
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en la que dQ/dt es la velocidad de permeación del fármaco a través de las células, C0 es la concentración de compartimiento donante a tiempo cero y A es el área de la monocapa de células. C0 se obtuvo del análisis de la disolución de dosificación al inicio del experimento.
Además, se calculó una relación de eflujo (ER) partir de datos de la media AB y BA. Esto se deriva de:
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Se cribaron dos compuestos de control junto con los compuestos de ensayo, propranolol (altamente permeable) y prazosina (un sustrato para glicoproteína P).
Sorprendentemente, se encontró que los compuestos de la presente invención muestran una relación de eflujo de
10 gp-P más baja que los compuestos ejemplificados en el documento WO2009/091016, indicando que tienen el potencial para mostrar mayor penetración en el SNC. Los datos para los ejemplos seleccionados se muestran a continuación en la Tabla 1.
Tabla. 1: datos del ensayo de gp-P para MDR-1 MDCK
Ejemplo
ER de gp-P
Ejemplo Comparativo 1
26,2
Ejemplo Comparativo 2
16,6
Ejemplo Comparativo 3
24,0
Ejemplo Comparativo 4
20,7
2
1,7
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0,7
Ejemplo Comparativo 5
4,7
Ejemplo Comparativo 6
4,5
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administración de GSK188909) se observó una reducción del 68% en los niveles de A40 en el cerebro con respecto a los ratones tratados con vehículo.
Otra publicación ha informado de un efecto similar con tres inhibidores de BACE-1 de Bristol-Myers Squibb (Meredith et al., J. Pharm. Expt. Ther. 2008, 326, 502-513). Se encontró que los tres compuestos dados a conocer eran sustratos de la gp-P in vitro. Cuando se dosificaron a ratones, los tres compuestos mostraron baja penetración en el SNC, y no disminuyeron los niveles de amiloide en el cerebro pero fueron capaces de reducir los niveles de amiloide en el plasma. Cuando los mismos tres compuestos se administraron a ratones genosuprimidos (KO) para gp-P, el nivel de penetración en el SNC aumentó, y los compuestos fueron capaces de reducir los niveles de amiloide en el cerebro.
Los investigadores de Schering-Plough también han publicado artículos (Iserloh et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 418) para mostrar que los inhibidores de BACE-1 de su serie (por ejemplo, el ejemplo 11 de la referencia mencionada anteriormente), están sometidos a eflujo de gp-P, como resultado de lo cual se encontró que el compuesto muestra un bajo Br:Pl (<0,1) en la rata.
La bibliografía citada anteriormente pone énfasis en las dificultades de identificar inhibidores de BACE-1 que no están sometidos a eflujo de gp-P. Los inhibidores serían muy deseables, y muchos grupos de investigación han intentado descubrir tales compuestos sin éxito. De este modo, serían deseables inhibidores de BACE-1 que no sean sustratos de la gp-P y por lo tanto puedan penetrar fácilmente el SNC y reducir amiloide en el cerebro.
Más recientemente, los investigadores de Wyeth han informado de un extenso trabajo para superar el eflujo de gp-P en una serie de inhibidores de acilguanidina cíclicos de BACE-1 (Malamas et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 6597). Se descubrió que los compuestos eran sustratos débiles de la gp-P y con Br:Pl acercándose a 1:1. Sin embargo, dos ejemplos principales con eflujo de gp-P reducido (84 y 89 de la referencia mencionada anteriormente) no disminuyeron A40 en el cerebro de ratones Tg2576 8 horas después de una dosis oral de 30 mg/kg. La falta de eficacia se atribuyó al hecho de que los compuestos mostraron una unión elevada al tejido cerebral. De este modo, es importante descubrir inhibidores de BACE-1 que no sean sustratos de la gp-P pero que todavía tengan una fracción no unida razonable en el tejido cerebral y sean capaces de reducir amiloide en el cerebro.
También se ha mostrado que los inhibidores de BACE que no son sustratos de la gp-P in vitro pueden penetrar el SNC (por ejemplo, TC-1 de Merck), y pueden reducir los niveles de A40 en el cerebro de ratones APP-YAC y monos (Sankaranarayanan et al., J. Pharmacol. Expt. Ther. 2009, 328, 131-140). De este modo, ensayos in vitro de gp-P mostraron que TC-1 no es un sustrato de la gp-P, y cuando TC-1 se dosificó a los ratones APP-YAC (100 mg/kg i.p.) fue capaz de penetrar modestamente el SNC como se muestra por las concentraciones cerebrales y la relación cerebro:plasma, y esta capacidad dio como resultado la reducción moderada de amiloide cerebral.
Tiempo
Conc. plasmática (M) Conc. cerebral (M) Br:Pl Reducción de A40 cerebral (%)
2h
25 1,6 0,06 26
4h
13 1,8 0,14 29
Concentración plasmática y cerebral de TC-1 tras una dosis de 100 mg/kg i.p., y efectos correspondientes sobre los niveles de Ab40 cerebral en ratones APP-YAC.
En experimentos separados se demostró que TC-1 podría penetrar en el LCR de monos cuando se coadministra con un inhibidor de CYP3A4 (ritonavir). En estos experimentos, se encontró que la concentración plasmática media de TC-1 fue 2,7 uM, mientras que se encontró que la concentración de LCR fue 0,025 uM. Sin embargo, puesto que TC-1 está ~ 99% enlazado a proteínas plasmáticas, se calculó que la concentración plasmática libre es ~ 0,027 nM. Se encontró que los niveles de A40 del LCR mostraron una disminución del 42% con respecto a un grupo de control tratado con vehículo. De este modo, se esperaría que un inhibidor de BACE que pueda penetrar libremente en el SNC sea capaz de reducir los niveles de amiloide en el SNC. Sería beneficioso no tener que ser co-dosificado con un inhibidor de CYP3A4.
Los compuestos de la presente invención han demostrado reducir la producción de A en ensayos celulares, lo que se correlaciona con su capacidad para disminuir la producción de A en animales. De este modo, los compuestos de la presente invención tendrán utilidad reduciendo la producción de A en seres humanos y de este modo serán útiles en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer.
Penetración in vivo en el SNC de rata
Se adquirieron ratas macho Sprague Dawley de Charles River UK Ltd. (Margate, Reino Unido) y se alojaron de acuerdo con las directrices del Ministerio del Interior del Reino Unido. Los fármacos se obtuvieron hasta las
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Extracción de muestras de LCR, patrones y blancos
Cada muestra de LCR, patrón y blanco (50 l) se extrajo con una alícuota (150 l) de acetonitrilo (que contiene ácido fórmico al 0,1% y 100 ng/ml de un patrón interno apropiado). Los blancos dobles se extrajeron con una alícuota (150 l) de acetonitrilo que contiene ácido fórmico al 0,1%. Todas las muestras se mezclaron después en vórtice, y entonces se diluyó adicionalmente una alícuota (50 l) de cada una en 150 l de acetonitrilo:agua (50/50 v/v) en un bloque de 2 ml de 96 pocillos profundos listo para el análisis de LC-MS/MS.
Todas las muestras se analizaron entonces usando una UPLC Waters Acquity acoplada a un espectrómetro de masas Waters Xevo TQ.
Condiciones de LC:
Columna: Acquity UPLC BEH C18, 1,7 um, 2,1 x 50 mm, mantenida a 40ºC. Fase móvil: A = 95% de agua: 5% de MeOH que contiene 0,01 M de acetato de amonio; B = 5% de agua: 95% de MeOH que contiende 0,01 M de acetato de amonio
Gradiente:
Tiempo (min)
B (%)
0
5
1,2
95
1,5
95
1,7
5
2,0
5
Caudal: 0,6 ml/min; volumen de inyección 5 l; temperatura del automuestreador 6ºC El flujo de LC se desvió para perder los primeros 0,3 min de cada inyección Las transiciones MS/MS se optimizaron automáticamente mediante el software Waters QuanOptimise.
Detección de amiloide
Extracción mediante DEA/NaCl de péptidos A de cerebro de rata:
Se prepararon recientemente 100 ml de dietilamina (DEA) al 0,2% enfriada en 50 mM de NaCl (pH 10), y se añadió 1 ml/25 mg de tejido cerebral a cada hemisferio (es decir, 40x el volumen del cerebro). Los cerebros se homogeneizaron inmediatamente usando un Polytron PT 1200 durante 1,5 minutos, y las muestras se dejaron incubar en hielo durante una hora tras la homogeneización. Se transfirieron 3 ml del homogeneizado a un tubo de polialómero (Beckman nº 362333), y se centrifugaron a 133.000 x g (55.000 rpm) durante 45 min a 4ºC. El sobrenadante se neutralizó después hasta un pH de 8 -8,3 añadiendo 1/10 volumen de 0,5 M Tris/HCl, pH 6,8. Las muestras se pueden usar recientes o congeladas instantáneamente en hielo seco, y almacenaron a -80ºC hasta que se requieran para el análisis.
ELISA (kit de Wako) de amiloide (40) humano/rata
El kit de ELISA de A40 de Wako (nº de código 294-62501) usa el anticuerpo monoclonal BNT77, generado contra el epítopo A(11-28) y el anticuerpo monoclonal BA27, que detecta específicamente la porción C-terminal de A40. Este kit se usa para la determinación cuantitativa de A(1-40) humano o de rata, y también especies de A40 truncadas N-terminalmente (A(x-40)) en matrices biológicas tales como medio de cultivo tisular, tejido homogeneizado, LCR y plasma.
Para el análisis, muestras de plasma y cerebro se diluyen 1:1 con el diluyente patrón contenido en el kit, y las muestras de LCR se diluyen 1:8 con el diluyente patrón contenido en el kit. El ensayo se lleva a cabo según las instrucciones del fabricante, y las muestras se analizan por duplicado. Los datos se analizan usando Microsoft Excel 2003, y el análisis estadístico se lleva a cabo usando Genstat 9ª edición.
De este modo, cuando el Ejemplo Comparativo 4 se administró en una dosis de 10 mg/kg p.o. y las muestras de plasma, cerebro y LCR se recogieron 2, 4, 6 y 8 horas después de la dosis, se midieron las siguientes concentraciones (Tabla 2):
Tabla 2: Datos para el Ejemplo Comparativo 4
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