ES2903172T3

ES2903172T3 - Compuesto pentacíclico

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Publication number: ES2903172T3
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Authority: ES
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Abstract

Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: 3-fluoro-6,11-dimetil-6,7,10,11,12,13-hexahidrobenzo[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina- 5,14-diona: **(Ver fórmula)** 5,10-dimetil-5,6,9,10,11,12-hexahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[2,3-f][1,4]diazepina-4,13- diona: **(Ver fórmula)** 5,10-dimetil-5,6,9,10,11,12-hexahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[3,2-f][1,4]diazepina-4,13- diona: **(Ver fórmula)** (3aS,14aR)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2- a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona: **(Ver fórmula)** (3aR,14aR)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2- a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona: **(Ver fórmula)** y (3aS,14aS)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2- a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Compuesto pentacíclico

Campo técnico

La presente invención se refiere a un compuesto pentacíclico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que tiene un efecto de activación de neuronas colinérgicas y/o neuroprotector, y a su uso farmacéutico. La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto anterior como principio activo.

Antecedentes

Las neuronas colinérgicas que liberan acetilcolina como transmisor se proyectan ampliamente en el prosencéfalo desde el núcleo basal de Meynert y el núcleo septal del prosencéfalo basal hasta el hipocampo, la amígdala y la corteza cerebral, y están involucradas en la modulación de la memoria, el aprendizaje, la cognición y la atención (literatura no relacionada con patentes 1). Además, las neuronas colinérgicas del núcleo tegmental pedunculopontino y el núcleo tegmental laterodorsal del tallo cerebral se proyectan en el cuerpo estriado, el núcleo accumbens, la sustancia negra y el tálamo, y se considera que están involucradas en el control de la motivación y la vigilancia (literatura no relacionada con patentes 2 a 4).

En particular, el papel de las neuronas colinérgicas en el prosencéfalo basal se ha aclarado mediante análisis utilizando muchos modelos animales, tales como el modelo de lesión. Especialmente, la correlación entre un trastorno funcional de las neuronas colinérgicas y la disminución de la memoria y el aprendizaje se ha demostrado en los modelos animales (literatura no relacionada con patentes 5 a 7), y se ha demostrado que el rendimiento cognitivo se mejora aumentando la cantidad de acetilcolina mediante el uso de un inhibidor de la colinesterasa, y potenciando la función de las neuronas colinérgicas (literatura no relacionada con patentes 8 a 12).

Se ha notificado que el factor de crecimiento nervioso (NGF) muestra el efecto neuroprotector sobre las neuronas colinérgicas en el modelo animal que indica la pérdida de neuronas colinérgicas. (Literatura no relacionada con patentes 13 a 15).

Particularmente para la enfermedad de Alzheimer (AD), la pérdida de neuronas colinérgicas se encuentra desde la etapa temprana de la AD y es una de las características patológicas de la AD. La acumulación de placas seniles por depósitos de beta-amiloide y ovillos neurofibrilares por agregación de la proteína tau son también características patológicas de la AD, y en particular, se sabe que los ovillos neurofibrilares aumentan con el progreso del estado patológico y acarrean la muerte neuronal. Los ovillos neurofibrilares se encuentran en el núcleo basal de Meynert y la corteza entorrinal desde la etapa temprana de AD. Entre las mismas, se informa que la pérdida de neuronas colinérgicas en el núcleo basal de Meynert por agregación de la proteína tau se encuentra en una etapa más temprana y que existe una correlación entre la pérdida y una disminución en la puntuación de la función cognitiva (literatura no relacionada con patentes 16 y 17). De forma similar a la AD, se encuentra hiperfosforilación y acumulación anormal de proteína tau en ratones modificados genéticamente que tienen una mutación P301S que se ha encontrado en demencia frontotemporal familiar (ratones transgénicos P301S con tau humana). En consecuencia, se forman ovillos neurofibrilares, una característica patológica de la AD (literatura no relacionada con patentes 18), que acarrea disfunción cognitiva por deterioro sináptico, neurodegeneración y pérdida de neuronas. Basándose en estos hallazgos, los ratones transgénicos P301S con tau humana se utilizan ampliamente como modelos animales similares a la AD (literatura no relacionada con patentes 19-22), y se puede esperar una mejora del deterioro cognitivo y la supresión del progreso del estado patológico en la enfermedad de Alzheimer mediante la supresión de cambios patológicos de tipo AD en ratones transgénicos P301S con tau humana.

Además, múltiples análisis que utilizan ratones modificados genéticamente y modelos animales de trastornos sugieren que el déficit de transporte axonal es una de las causas de la pérdida de neuronas colinérgicas (literatura no relacionada con patentes 23-25). Entre las mismas, el axón de las neuronas colinérgicas que se proyecta desde el área septal al hipocampo está deteriorado en un modelo de lesión de fimbria-fórnix y el deterioro del transporte retrógrado de moléculas involucradas en la supervivencia y la función acarrea la pérdida de neuronas (literatura no relacionada con patentes 26-28). El deterioro del transporte retrógrado también se encuentra en ratones modificados genéticamente (literatura no relacionada con patentes 23 y 24) y la pérdida de neuronas colinérgicas por lesión de fimbria-fórnix refleja un aspecto del estado patológico. En consecuencia, se puede esperar una mejora del deterioro cognitivo y la supresión del progreso del estado patológico en la enfermedad de Alzheimer mediante la supresión o la mejora de la pérdida de neuronas colinérgicas en este modelo del trastorno.

La demencia con cuerpos de Lewy (DCL) y la enfermedad de Parkinson (EP) son trastornos neurodegenerativos progresivos en los que aparecen cuerpos de inclusión anormales (cuerpos de Lewy) compuestos principalmente por alfa sinucleína en las neuronas y acarrean degeneración y pérdida de neuronas. La disfunción cognitiva se desarrolla si los cuerpos de Lewy se distribuyen principalmente en la corteza cerebral y el parkinsonismo se desarrolla si los cuerpos de Lewy se distribuyen principalmente en el tronco encefálico. Además de esto, también se desarrollan síntomas psiquiátricos tales como alucinaciones visuales, alucinaciones y delirios, trastornos del sueño y síntomas autonómicos. El diagnóstico es demencia con cuerpos de Lewy si la demencia aparece antes o dentro de un periodo de un año desde el inicio del parkinsonismo y el diagnóstico es enfermedad de Parkinson con demencia (PDD) si el parkinsonismo ha aparecido antes de un año o más desde el inicio de la demencia. La demencia con cuerpos de Lewy, la enfermedad de Parkinson con demencia y la enfermedad de Parkinson son patológicamente las mismas enfermedades y se denominan, en general, enfermedad con cuerpos de Lewy (LBD), aunque son diferentes en la disfunción cognitiva, el orden de aparición y el grado de parkinsonismo. En la demencia con cuerpos de Lewy y la enfermedad de Parkinson con demencia, de forma similar a la enfermedad de Alzheimer, las neuronas del núcleo basal de Meynert, núcleo de origen del nervio colinérgico, se degeneran y se pierden y se informa que aparece un trastorno neuronal colinérgico grave en el hipocampo y la corteza (literatura no relacionada con patentes 29-31). Además, existe una correlación entre el progreso del trastorno de neuronas colinérgicas y la disfunción cognitiva (literatura no relacionada con patentes 29), y se ha demostrado que los inhibidores de la colinesterasa mejoran la función cognitiva. Basándose en estos hallazgos, la función cognitiva mejora al mejorar la función de las neuronas colinérgicas y, de forma similar a la enfermedad de Alzheimer, se puede esperar una mejora del deterioro cognitivo y la supresión del progreso del estado patológico en la demencia con cuerpos de Lewy y la enfermedad de Parkinson con demencia por supresión o mejora de pérdida de neuronas colinérgicas en varios modelos del trastorno.

Por lo tanto, basándose en estos hallazgos, se puede esperar una mejora en el rendimiento cognitivo reducido provocada por la disfunción de las neuronas colinérgicas al lograr una activación funcional y/o un efecto neuroprotector sobre las neuronas colinérgicas en la práctica clínica.

Además de las enfermedades anteriores, los ejemplos de enfermedades para las que se ha informado de la asociación entre la disminución de la función cognitiva y la disfunción de las neuronas colinérgicas incluyen corea de Huntington, síndrome de Down, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), depresión mayor, esquizofrenia y similares.

Listado de citas

Literatura no relacionada con patentes

[Literatura no relacionada con patentes 1] Everitt BJ et al. "Central cholinergic systems and cognition". Annu. Rev. Psychol. 48 (1997) 649-684.

[Literatura no relacionada con patentes 2] Gulledge AT. et al. "Cholinergic inhibition of neocortical pyramidal neurons". J. Neurosci. 25 (2005) 10308-20.

[Literatura no relacionada con patentes 3] Daniel Dautan D. et al. "A major external source of cholinergic innervation of the striatum and nucleus accumbens originates in the brainstem". J. Neurosci. 34 (2014) 4509-18.

[Literatura no relacionada con patentes 4] M Steriade M. et al. "Neuronal activities in brain-stem cholinergic nuclei related to tonic activation processes in thalamocortical systems". J. Neurosci. 10 (1990) 2541-59.

[Literatura no relacionada con patentes 5] Fischer W. et al. "Progressive decline in spatial learning and integrity of forebrain cholinergic neurons in rats during aging". Neurobiol. Aging 13 (1992) 9-23.

[Literatura no relacionada con patentes 6] Leanza G. et al. "Selective lesioning of the basal forebrain cholinergic system by intraventricular 192 IgG-saporin: behavioural, biochemical and stereological studies in the rat". Eur. J. Neurosci. 7 (1995) 329-43.

[Literatura no relacionada con patentes 7] Leanza G. et al. "Selective immunolesioning of the basal forebrain cholinergic system disrupts short-term memory in rats". Eur. J. Neurosci. 8 (1996) 1535-44.

[Literatura no relacionada con patentes 8] Ogura H. et al. "Donepezil, a centrally acting acetylcholinesterase inhibitor, alleviates learning deficits in hypocholinergic models in rats". Methods Find Exp Clin Pharmacol. 22 (2000) 89-95.

[Literatura no relacionada con patentes 9] Spowart-Manning L. et al. "Spatial discrimination deficits by excitotoxic lesions in the Morris water escape task". Behav Brain Res. 156 (2005) 269-76.

[Literatura no relacionada con patentes 10] Bruce AP. et al. "Choline acetyltransferase activity and cognitive domain score of Alzheimer's patients". Neurobiol. Aging. 21 (2000) 11-17

[Literatura no relacionada con patentes 11] Rogers SL. et al. "The efficacy and safety of donepezil in patients with Alzheimer's disease: results of a US Multicentre, Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial. The Donepezil Study Group". Dementia. 7 (1996) 293-303

[Literatura no relacionada con patentes 12] Mori E. et al. "Donepezil for dementia with Lewy bodies: a randomized, placebo-controlled trial". Ann Neurol. 72 (2012) 41-52

[Literatura no relacionada con patentes 13] Mufson EJ. et al. "Human cholinergic basal forebrain: chemoanatomy and neurologic dysfunction". J. Chem. Neuroanat. 26 (2003) 233-242

[Literatura no relacionada con patentes 14] Mufson EJ. et al. "Cholinergic system during the progression of Alzheimer's disease: therapeutic implication". Expert. Rev. Neurother. 8 (2008) 1703-1718

[Literatura no relacionada con patentes 15] Schliebs R. et al. "The significance of the cholinergic system in the brain during aging and in Alzheimer's disease". J. Neural. Transm 113 (2006) 1625-1644

[Literatura no relacionada con patentes 16] Vana L et al. "Progression of tau pathology in cholinergic Basal forebrain neurons in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease". Am J Pathol. 179 (2011) 2533-2550.

[Literatura no relacionada con patentes 17] Gómez-Isla T et al. "Neuronal loss correlates with but exceeds neurofibrillary tangles in Alzheimer's disease." Ann Neurol. 41 (1997) 17-24.

[Literatura no relacionada con patentes 18] Lee VM et al. "Neurodegenerative tauopathies". Annu. Rev. Neurosci.

24 (2001) 1121-1159.

[Literatura no relacionada con patentes 19] Allen B et al. "Abundant tau filaments and nonapoptotic neurodegeneration in transgenic mice expressing human P301S tau protein". J. Neurosci. 22 (2002) 9340-9351.

[Literatura no relacionada con patentes 20] Xu H et al. "Memory deficits correlate with tau and spine pathology in P301S MAPT transgenic mice". Neuropathol. Appl. Neurobiol. 40 (2014) 833-43.

[Literatura no relacionada con patentes 21] Yoshiyama Y et al. "Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model". Neuron. 53 (2007) 337-351.

[Literatura no relacionada con patentes 22] Hoffmann NA et al. "Impaired plasticity of cortical dendritic spines in P301S tau transgenic mice". Acta Neuropathol Commun. 1 (2013) 82.

[Literatura no relacionada con patentes 23] Salehi A et al. "Increased App Expression in a Mouse Model of Down's Syndrome Disrupts NGF Transport and Causes Cholinergic Neuron Degeneration" Neuron 51 (2006) 29-42.

[Literatura no relacionada con patentes 24] Onishi T et al. "Early-onset cognitive deficits and axonal transport dysfunction inP301S mutant tau transgenic mice" Neuroscience Research 80 (2014) 76-85.

[Literatura no relacionada con patentes 25] Xu W et al. "Amyloid precursor protein-mediated endocytic pathway disruption induces axonal dysfunction and neurodegeneration" J. Clin. Invest. 126 (2016) 1815-33.

[Literatura no relacionada con patentes 26] Lapchak PA et al. "Effect of recombinant human nerve growth factor on presynaptic cholinergic function in rat hippocampal slices following partial septohippocampal lesions: measures of [3H]acetylcholine synthesis, [3H]acetylcholine release and choline acetyltransferase activity" Neuroscience 42 (1991) 639-49.

[Literatura no relacionada con patentes 27] Gilmor ML et al. "Coordinate expression of the vesicular acetylcholine transporter and choline acetyltransferase following septohippocampal pathway lesions" J. Neurochem. 71 (1998) 2411-20.

[Literatura no relacionada con patentes 28] Gu H et al. "Recombinant human NGF-loaded microspheres promote survival of basal forebrain cholinergic neurons and improve memory impairments of spatial learning in the rat model of Alzheimer's disease with fimbria-fornix lesion" Neurosci. Lett. 453 (2009) 204-9.

[Literatura no relacionada con patentes 29] Shimada, H. et al., "Mapping of brain acetylcholinesterase alterations in Lewy body disease by PET" Neurology, vol. 73, páginas 273-278, 2009.

[Literatura no relacionada con patentes 30] Tiraboschi, P. et al., "Cholinergic dysfunction in diseases with Lewy bodies" Neurology 54 (2000) 407-411.

[Literatura no relacionada con patentes 31] Perry, E. K. et. al., "Neocortical cholinergic activities differentiate Lewy body dementia from classical Alzheimer's disease", NeuroReport, vol. 5, pp.747-749 (1994).

Sumario de la invención

Problema técnico

Un objeto de la presente invención es proporcionar un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que tenga un efecto de activación de neuronas colinérgicas y/o neuroprotector y que tenga el uso potencial de un agente terapéutico contra la enfermedad de Alzheimer, la demencia con cuerpos de Lewy y la enfermedad de Parkinson con demencia.

Solución al problema

Como resultado de amplios estudios para resolver los problemas anteriores, los presentes inventores encontraron que un compuesto pentacíclico o sales farmacéuticamente aceptables del mismo tienen un efecto de activación de neuronas colinérgicas y/o neuroprotector.

Es decir, la presente invención se refiere a los puntos <1> a <26> siguientes.

<1>Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

3-fluoro-6,11 -dimetil-6,7,10,11,12,13-hexahidrobenzo[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-5,14-diona:

5,10-dimetil-5,6,9,10,11,12-hexahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[2,3-f][1,4]diazepina-4,13-diona:

5,10-dimetil-5,6,9,10,11,12-hexahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[3,2-f][1,4]diazepina-4,13-diona:

(3aS,14aR)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1 H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona:

(3aR,14aR)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1 H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona:

y

(3aS,14aS)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1 H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

<2>3-Fluoro-6,11 -dimetil-6,7,10,11,12,13-hexahidrobenzo[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-5,14-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma:

<3>5,10-Dimetil-5,6,9,10,11,12-hexahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[2,3-f][1,4]diazepina-4,13-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma:

<4>5,10-Dimetil-5,6,9,10,11,12-hexahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[3,2-f][1,4]diazepina-4,13-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma:

<5>(3aS,14aR)-5,10-Dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma:

<6>(3aR,14aR)-5,10-Dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1 H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma:

<7>(3aS,14aS)-5,10-Dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1 H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma:

<8>Una composición farmacéutica que comprende el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según uno cualquiera de <1> a <7> y uno o más aditivos farmacéuticamente aceptables.

<9>Un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según uno cualquiera de <1> a <7>.

<10>El compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según uno cualquiera de <1> a <7> para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

<11>Un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de la demencia con cuerpos de Lewy que comprende el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según uno cualquiera de <1> a <7>.

<12>El compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según uno cualquiera de <1> a <7> para su uso en el tratamiento de la demencia con cuerpos de Lewy.

<13>Un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson con demencia que comprende el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según uno cualquiera de <1> a <7>.

<14>El compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según uno cualquiera de <1> a <7> para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson con demencia.

Efectos ventajosos de la invención

Los compuestos pentacíclicos representados por las fórmulas (I) a (VI) (en lo sucesivo denominados "los compuestos (I) a (VI)") o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos según la presente invención tienen un efecto de activación neuronal y/o neuroprotector, tal como se muestra en los datos de actividad en los ejemplos de ensayos farmacológicos que se proporcionan más adelante. Los compuestos (I) a (VI) de la presente invención dan lugar a una mejora del rendimiento cognitivo debido a su efecto de activación neuronal y/o neuroprotector, por lo que tienen un uso potencial como agentes terapéuticos contra la enfermedad de Alzheimer, la demencia con cuerpos de Lewy y la enfermedad de Parkinson con demencia.

Descripción de formas de realización

A continuación, se describirá en detalle el contenido de la presente invención.

En la presente memoria descriptiva, las fórmulas estructurales de los compuestos pueden representar isómeros específicos por conveniencia; sin embargo, la presente invención puede incluir isómeros rotacionales y tautómeros, así como mezclas de isómeros, no está limitada a las fórmulas descritas por conveniencia, y puede ser cualquiera de los isómeros o una mezcla que contenga los isómeros en cualquier proporción.

Además, también pueden existir cristales polimórficos; sin embargo, la presente invención tampoco se limita a ninguno de los mismos y puede ser una forma cristalina individual o una mezcla de las mismas. Además, la presente invención también incluye formas amorfas, y los compuestos según la presente invención incluyen anhidratos y solvatos (particularmente hidratos).

La presente invención también incluye compuestos marcados con isótopos de los compuestos (I) a (VI). Los compuestos marcados con isótopos son los mismos que los compuestos (I) a (VI), excepto que uno o más átomos están reemplazados por uno o más átomos que tienen una masa atómica o un número másico diferente de los que se encuentran generalmente en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que se pueden incorporar a los compuestos de la presente invención incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, flúor, fósforo, azufre, yodo y cloro, y específicamente incluyen 2H, 3H, 11C, 14C, 15N, 18O, 18F, 32P, 35S, 123I, 125I y similares.

Los compuestos marcados con isótopos anteriores, por ejemplo, compuestos en los que están incorporados isótopos radiactivos, tales como 3H y/o 14C, son útiles para el ensayo de distribución tisular de medicamentos y/o sustratos. 3H y 14C se consideran útiles debido a la facilidad de preparación y detección de los mismos. Los isótopos 11C y 18F se consideran útiles para PET (tomografía por emisión de positrones), el isótopo 125I se considera útil para SPECT (tomografía computarizada por emisión de fotón único), y todos ellos son útiles para la toma de imágenes del cerebro. El reemplazo por isótopos más pesados, tal como 2H, proporciona algunos tipos de ventajas terapéuticas, incluido un aumento en la semivida in vivo o una reducción en la dosis requerida debido a una mayor estabilidad metabólica, y por lo tanto se considera útil en determinadas situaciones. Los compuestos marcados con isótopos anteriores se pueden preparar de forma similar llevando a cabo los procedimientos descritos en los Ejemplos siguientes utilizando reactivos fácilmente utilizables marcados con isótopos en lugar de reactivos no marcados con isótopos.

Las "sales farmacéuticamente aceptables" en la presente memoria descriptiva no están particularmente limitadas siempre que sean sales formadas con los compuestos según la presente invención, y los ejemplos específicos incluyen sales de adición de ácidos, tales como sales de ácidos inorgánicos, sales de ácidos orgánicos y sales de aminoácidos ácidos.

La "sal farmacéuticamente aceptable" en la presente memoria descriptiva es cualquier sal formada en una proporción adecuada a menos que exista una descripción especialmente limitante, y el número de moléculas de ácido por molécula del compuesto en la sal formada no está particularmente limitado; sin embargo, se prefiere que el número de moléculas de ácido por molécula del compuesto sea de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2, y se prefiere aún más que el número de moléculas de ácido por molécula del compuesto sea de aproximadamente 0,5, de aproximadamente 1 o de aproximadamente 2.

Los ejemplos preferidos de sales de ácidos inorgánicos incluyen clorhidrato, bromhidrato, sulfato, nitrato y fosfato; y los ejemplos preferidos de sales de ácidos orgánicos incluyen acetato, succinato, fumarato, maleato, tartrato, citrato, lactato, estearato, benzoato, metanosulfonato, p-toluenosulfonato y bencenosulfonato.

Los ejemplos preferidos de sales de aminoácidos ácidos incluyen aspartato y glutamato.

Cuando los compuestos (I) a (VI) según la presente invención se obtienen en forma libre, se pueden convertir en sales que pueden estar formadas por los compuestos (I) a (VI) o hidratos de los mismos según un procedimiento convencional.

Cuando los compuestos (I) a (VI) según la presente invención se obtienen como sales de los compuestos (I) a (VI) o hidratos de los compuestos (I) a (VI), pueden convertirse en formas libres de los compuestos (I) a (VI) según un procedimiento convencional.

Además, varios isómeros (por ejemplo, isómeros ópticos, isómeros rotacionales, estereoisómeros, etc.) obtenidos a partir de los compuestos (I) a (VI) según la presente invención pueden purificarse y aislarse mediante medios de separación generales, tales como recristalización, procedimiento de sal diastereomérica, procedimiento de resolución enzimática y diversas técnicas cromatográficas (por ejemplo, cromatografía en capa fina, cromatografía en columna, cromatografía de gases, etc.).

[Preparación farmacéutica]

La composición farmacéutica según la presente invención se puede producir mezclando aditivos farmacéuticamente aceptables con un compuesto seleccionado del grupo de compuestos (I) a (VI) o sus sales farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica según la presente invención se puede producir mediante un procedimiento conocido, por ejemplo, el procedimiento descrito en la Reglas generales para preparaciones de la Farmacopea japonesa, decimoséptima edición.

La composición farmacéutica según la presente invención puede administrarse apropiadamente a un paciente dependiendo de la forma de dosificación de la misma.

La dosis de los compuestos (I) a (VI) según la presente invención o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos varía dependiendo de la gravedad de los síntomas, la edad, el sexo, el peso corporal, la forma de dosificación, el tipo de sal, el tipo específico de enfermedad y otras condiciones; sin embargo, en general, la dosis diaria para un adulto por administración oral es de aproximadamente 30 gg a 10 g, preferentemente de 100 gg a 5 g y de forma más preferida de 100 gg a 1 g; la dosis diaria para un adulto por administración inyectable es de aproximadamente 30 gg a 1 g, preferentemente de 100 gg a 500 mg, y de forma más preferida de 100 gg a 300 mg; y la dosis anterior se administra una o varias veces.

Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse como sondas químicas para capturar las proteínas diana de compuestos bioactivos de bajo peso molecular. Es decir, los compuestos de la presente invención se pueden convertir en sondas de cromatografía de afinidad, sondas de fotoafinidad, etc., mediante la introducción de grupos marcadores, enlazadores o similares en un resto diferente de un resto estructural esencial para el desarrollo de la actividad de los compuestos utilizando un procedimiento descrito, por ejemplo, en J. Mass Spectrum. Soc. Jpn. Vol.

51, N° 5, 2003, páginas 492-498, documento WO2007/139149, o similar.

Los ejemplos de grupos marcadores, enlazadores, etc., usados en sondas químicas incluyen grupos que se muestran en el grupo que consiste en los puntos (1) a (5) siguientes:

(1) grupos marcadores de proteínas, tales como grupos marcadores de fotoafinidad (por ejemplo, un grupo benzoílo, un grupo benzofenona, un grupo azida, un grupo carbonilazida, un grupo diaziridina, un grupo enona, un grupo diazo, un grupo nitro, etc.) y grupos de afinidad química (por ejemplo, un grupo cetona en el que el átomo de carbono alfa está reemplazado por un átomo de halógeno, un grupo carbamoílo, un grupo éster, un grupo alquiltio, un aceptor de Michael tal como cetona o éster a,p-insaturados, y un grupo oxirano);

(2) enlazadores escindibles, tales como -S-S-, -O-Si-O-, monosacáridos (un grupo glucosa, un grupo galactosa, etc.) o disacáridos (lactosa, etc.); y enlazadores de oligopéptidos que se pueden escindir mediante reacción enzimática; (3) grupos de etiquetas de captura, tales como biotina y un grupo 3-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4H-3a,4a-diaza-4-boras-indacen-3-il)propionilo;

(4) grupos marcadores radiactivos, tales como 125I, 32P, 3H y 14C; grupos marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferona, 7-nitrofurazanilo y un grupo 3-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4H-3a,4adiaza-4-bora-s-indacen-3-il)propionilo; grupos quimioluminiscentes, tales como luciferina y luminol; y marcadores capaces de detectar iones de metales pesados, tales como iones de metales lantánidos e iones radio; o

(5) grupos que se unirán a vehículos sólidos, tales como perlas de vidrio, lechos de vidrio, placas de microvaloración, perlas de agarosa, lechos de agarosa, perlas de poliestireno, lechos de poliestireno, perlas de nailon y lechos de nailon.

Las sondas preparadas mediante la introducción de grupos marcadores, etc., seleccionados del grupo que consiste en los (1) a (5) anteriores en los compuestos de la presente invención mediante los procedimientos descritos en los documentos anteriores o similares, pueden usarse como sondas químicas para identificar proteínas marcadas útiles para buscar nuevas dianas de diseño de fármacos, etc.

Ejemplos

Los compuestos (I) a (VI) de la presente invención se pueden producir mediante, por ejemplo, los procedimientos descritos en los Ejemplos siguientes, y los efectos de los compuestos se pueden confirmar mediante los procedimientos descritos en los Ejemplos de ensayo siguientes. Sin embargo, estos son solo ejemplos, y la presente invención no se limita a los ejemplos específicos siguientes en ningún caso y puede modificarse dentro de un rango que no se aparte del alcance de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Los compuestos descritos con nombres de documentos, etc., indican que los compuestos se produjeron según los documentos, etc.

Además, las abreviaturas utilizadas en la presente memoria descriptiva son bien conocidas y comunes para un experto en la técnica. En la presente memoria descriptiva, se utilizan las abreviaturas siguientes.

DCE: 1,2-dicloroetano

DCM: diclorometano

DIPEA: N,N-diisopropiletilamina

DMT-MM: cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio

DMSO: dimetilsulfóxido

EDC: clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida

HATU: hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotiazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio

HOBT: 1-hidroxibenzotriazol

n-: normal

NMM: N-metilmorfolina

t-: terciario

TBD: 1,3,4,6,7,8-hexahidro-2H-pirimido[1,2-a]pirimidina

TBME: terc-butil metil éter

TEA: trietilamina

THF: tetrahidrofurano

RMN de 1H: espectrometría de resonancia magnética nuclear de protón

EM: espectrometría de masas

HPLC: cromatografía líquida de alta resolución

El término "temperatura ambiente" en los Ejemplos y Ejemplos de producción siguientes generalmente se refiere a de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 35 °C. % se refiere al porcentaje en peso a menos que se especifique lo contrario.

Los desplazamientos químicos de los espectros de resonancia magnética nuclear de protón se indican en unidades 5 (ppm) con respecto al tetrametilsilano, y las constantes de acoplamiento se registran en hercios (Hz). Los patrones se designan como s: singlete, d: doblete, t: triplete, c: cuarteto, m: multiplete, a: ancho, s a: singlete ancho.

Para la resolución óptica del compuesto, se utiliza Parallex Flex (TM) producido por Biotage (columna: una de CHIRALPAK (R) AD-H, IA, IB e IC producidas por DAICEL; y CHIRALCEL (R) OD-H y OJ- H producidas por DAICEL). En las reacciones que utilizan un reactor de microondas en los Ejemplos de producción, Ejemplos de referencia y Ejemplos, se utilizó Initiator(TM) o Initiator+(TM) producidos por Biotage.

Con respecto a la cromatografía, como gel de sílice se utilizó Silica Gel60 producido por Merck (malla 70-230 o malla 230-400 ASTM) o PSQ60B producido por Fuji Silysia Chemical Ltd., o se utilizó una columna preempaquetada {columna: Hi-Flash (TM) Column (Silicagel) producida por YAMAZEN, tamaño: uno de S (16 x 60 mm), M (20 x 75 ^{mm), L (26 x 100 mm),}2l ^{(26 x 150 mm) y 3L (46 x 130 mm); o Biotage™ SNAP Ultra Silica Cartridge producido por}Biotage, tamaño: uno de 10 g, 25 g y 50 g}.

Como gel de sílice NH, se utilizó CHROMATOREX NH-DM2035 producido por Fuji Silysia Chemical Ltd., o se utilizó una columna preempaquetada {columna: Hi-Flash (TM) Column (Amino) producida YAMAZEN, tamaño: uno de S (16 x 60 mm), M (20 x 75 mm), L (26 x 100 mm), 2L (26 x 150 mm) y 3L (46 x 130 mm); o Presep (TM) (Luer Lock) NH2 (HC) producida por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., tamaño: uno de tipo M (14 g/25 mL), tipo L (34 g/70 mL), tipo 2L ( 50 g/100 mL) y tipo 3L (110 g/200 mL)}.

Como nombres de los compuestos que se muestran a continuación, a excepción de los reactivos de uso general, se utilizaron los que se muestran en la versión 12 del "E-Notebook" (PerkinElmer).

Ejemplo de producción 1

Síntesis de 2-amino-6-metil-4,5,67-tetrahidrotieno[2,3-c]piridina-3-carboxilato de etilo

Se añadió TEA (61,6 ml, 442 mmol) a temperatura ambiente a una mezcla de 1 -metil-4-piperidona (N° CAS 1445-73 4) (51,5 ml, 442 mmol), cianoacetato de etilo (N° CAS 105-56-6) (47,2 ml, 442 mmol), azufre (N° CAS 7704-34-9) (14,2 g, 442 mmol) y etanol (800 ml). La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 15 horas y después se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice NH, acetato de etilo). El residuo concentrado obtenido se trituró con acetato de etilo. Los precipitados se recogieron por filtración, se lavaron con acetato de etilo y se secaron a presión reducida para producir el compuesto del título (58,4 g).

1H-RMN (400 MHz, CDCh) 5 (ppm): 1,33 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 2,44 (s, 3H), 2,62-2,70 (m, 2H), 2,79-2,88 (m, 2H), 3,37 (t, J = 2,0 Hz, 2H), 4,26 (c, J = 7,3 Hz, 2H), 5,97 (s a, 2H).

MS (ESI) m/z: 241 [M+H]+

Ejemplo de producción 2

Síntesis de 7-fluoro-4-metil-3,4-dihidro-1 H-benzo[e][1,4]diazepina-2,5-diona

Se añadió sarcosina (N° CAS 107-97-1) (5,16 g, 58,0 mmol) a temperatura ambiente a una solución de 6-fluoro-1 H-benzo[d][1,3]oxazina-2,4-diona (N° CAS 321 -69-7) (10,0 g, 55,2 mmol) en piridina (100 ml) y la mezcla de reacción se agitó a 100 °C durante 8 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente. Los precipitados se recogieron por filtración y se lavaron con dietil éter. El sólido obtenido se secó a presión reducida para producir el compuesto del título (5,34 g).

1H-RMN (400 MHz, CDCL) 5 (ppm): 3,30 (s, 3H), 3,90 (s, 2H), 6,97 (dd, J = 8,8, 4,5 Hz, 1 H), 7,20 (ddd, J = 8,6, 7,6,2,9 Hz, 1 H), 7,67 (dd, J = 9,0, 3,1 Hz, 1 H), 7,99 (s a, 1 H).

MS (ESI) m/z: 209 [M+H]+

Ejemplo de producción 3

Síntesis de 4-metil-3,4-dihidro-1 H-tieno[3,2-e][1,4]diazepina-2,5-diona

Una mezcla de 1H,2H,4H-tieno[3,2-d][1,3]oxazina-2,4-diona (N° CAS 78756-28-2) (300 mg, 1,77 mmol), sarcosina (395 mg, 4,43 mmol) y agua (10 ml) se calentó a reflujo durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió a 0 °C. Los precipitados se recogieron por filtración y se lavaron secuencialmente con agua y dietil éter. El sólido obtenido se secó a presión reducida para producir el compuesto del título (165 mg).

1H-RMN (400 MHz, CDCL) 5 (ppm): 3,24 (s, 3H), 4,00 (s, 2H), 6,72 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 5,3 Hz, 1 H), 7,96 (s a, 1 H).

MS (ESI) m/z: 197 [M+H]+

Ejemplo de producción 4

Síntesis de 4-metil-3,4-dihidro-1 H-tieno[2,3-e][1,4]diazepina-2,5-diona

Se añadió 1 H,2H,4H-tieno[2,3-d][1,3]oxazina-2,4-diona (N° CAS 103979-54-0) (600 mg, 3,55 mmol) a una solución de sarcosina (790 mg, 8,87 mmol) en agua (12 ml). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió cloroformo a la mezcla de reacción y se separó la capa orgánica. La capa acuosa se extrajo con cloroformo (dos veces) y acetato de etilo (3 veces). La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El sólido obtenido se secó para producir el compuesto del título (430 mg).

1H-RMN (400 MHz, CDCh) 5 (ppm): 3,23 (s, 3H), 3,99 (s, 2H), 6,90 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 5,7 Hz, 1 H), 8,39 (s a, 1 H).

MS (ESI) m/z: 197 [M+H]+

Ejemplo de producción 5

Síntesis de (5aS,8aR)-4-metiloctahidrociclopenta[e][1,4]diazepina-2,5-diona

(1) Síntesis de 2-((1S2R)-2-((t-butoxicarbonil)amino)-N-metilciclopentanocarboxamida)acetato de metilo

Se añadieron secuencialmente TEA (22,2 ml, 159 mmol), HOBT/monohidrato (11,7 g, 76,3 mmol) y EDC (14,6 g, 76,3 mmol) con enfriamiento con hielo a una mezcla de ácido (1 S,2R)-2-((t-butoxicarbonil)amino)ciclopentano-1 -carboxílico (N° CAS 137170-89-9) (14,6 g, 63,6 mmol), clorhidrato de éster metílico de sarcosina (N° CAS 13515-93-0) (10,7 g, 76,3 mmol) y THF (150 ml). Después de que la mezcla de reacción se agitara a temperatura ambiente durante 15 horas, se añadieron acetato de etilo y agua y se separó la capa orgánica. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se lavó secuencialmente con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio y una solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo obtenido se purificó dos veces mediante cromatografía en columna (gel de sílice, acetato de etilo al 25-30%/n-heptano) para producir el compuesto del título (16,1 g).

MS (ESI) m/z: 337 [M+Na]+

(2) Síntesis de (5aS,8aR)-4-metiloctahidrociclopenta[e][1,4]diazepina-2,5-diona

Se añadió una solución 4 N de cloruro de hidrógeno/1,4-dioxano (160 ml, 640 mmol) con enfriamiento con hielo a 2-((1S,2R)-2-((t-butoxicarbonil)amino)-N-metilciclopentanocarboxamida)acetato de metilo (16,1 g, 51,3 mmol). La mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura durante 30 minutos, después se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos y se concentró a presión reducida. Se añadió TBD (8,57 g, 61,6 mmol) con enfriamiento con agua a una solución del residuo en metanol (130 ml). La mezcla de reacción se agitó con enfriamiento con agua durante 3 horas y después se enfrió a 0 °C. El sólido resultante se recogió por filtración, se lavó 3 veces con metanol enfriado con hielo y se secó a presión reducida para producir el compuesto del título (5,22 g).

1H-RMN (400 MHz, CDCb) 5 (ppm): 1,41-1,59 (m, 2H), 1,78-1,98 (m, 2H), 2,00-2,15 (m, 1 H), 2,36-2,53 (m, 1 H), 3,08 (s, 3H), 3,18-3,32 (m, 1 H), 3,49 (dd, J = 15,5, 1,7 Hz, 1 H), 3,91 -4,04 (m, 1 H), 4,51 (d, J = 15,4 Hz, 1 H), 5,54 (s a, 1 H).

MS (ESI) m/z: 183 [M+H]+

Ejemplo de producción 6

Síntesis de (5aR,8aR)-4-metiloctahidrociclopenta[e][1,4]diazepina-2,5-diona 1

(1) Síntesis de 2-((1 R,2R)-2-((t-butoxicarbonil)amino)-N-metilciclopentanocarboxamida)acetato de t-butilo

Se añadieron secuencialmente DIPEA (1,81 ml, 10,5 mmol) y HATU (1,99 g, 5,23 mmol) a temperatura ambiente a una mezcla de ácido (1R,2R)-t-butoxicarbonil-2-aminociclopentanocarboxílico (N° CAS 245115-25-7) (1,00 g, 4,36 mmol), clorhidrato de éster t-butílico de sarcosina (N° CAS 136088-69-2) (872 mg, 4,80 mmol) y d Cm (10 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se purificó directamente mediante cromatografía en columna (gel de sílice, acetato de etilo al 30-50%/n-heptano) para producir el compuesto del título (1,61 g).

MS (ESI) m/z: 357 [M+H]+

(2) Síntesis de (5aR,8aR)-4-metiloctahidrociclopenta[e][1,4]diazepina-2,5-diona

Se añadió una solución 4 N de cloruro de hidrógeno/1,4-dioxano (16 ml, 64 mmol) a temperatura ambiente a 2-((1R,2R)-2-((t-butoxicarbonil)amino)-N-metilciclopentanocarboxamida)acetato de t-butilo (1,61 g, 4,52 mmol) y la mezcla se agitó durante 20 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. Se añadieron secuencialmente al residuo bicarbonato de sodio (0,911 g, 10,8 mmol), metanol (24 ml), NMM (0,099 ml, 0,90 mmol) y DMT-MM (12,3% de H²O, 1,80 g, 5,70 mmol) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 20 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo se lavó con DCM. El líquido de lavado se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice, metanol al 5-20%/acetato de etilo) para producir el compuesto del título (745 mg).

1H-RMN (400 MHz, CDCb) 5 (ppm): 1,56-1,88 (m, 3H), 1,91 -2,02 (m, 1 H), 2,13-2,23 (m, 1 H), 2,26-2,39 (m, 1 H), 3,07 (s, 3H), 3,08-3,16 (m, 1 H), 3,51 -3,62 (m, 1 H), 3,79 (d, J = 18,0 Hz, 1 H), 4,58 (d, J = 18,0 Hz, 1 H), 6,76 (s a, 1 H).

MS (ESI) m/z: 183 [M+H]+

Ejemplo de producción 7

Síntesis de (5aS,8aS)-4-metiloctahidrociclopenta[e][1,4]diazepina-2,5-diona

(1) Síntesis de 2-((1S,2S)-2-((t-butoacarbonil)amino)-N-metilciclopentanocarboxamida)acetato de t-butilo

Se añadió HATU (1,99 g 5,23 mmol) a temperatura ambiente a una mezcla de ácido (1S,2S)-t-butoxicarbonil-2-aminociclopentanocarboxílico (N° CAS 143679-80-5) (1,00 g, 4,36 mmol), clorhidrato de éster t-butílico de sarcosina (872 mg, 4,80 mmol), DIPEA (1,81 ml, 10,5 mmol) y DCM (10 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y después se purificó directamente mediante cromatografía en columna (gel de sílice, acetato de etilo al 30-50%/n-heptano) para producir el compuesto del título (1,55 g).

MS (ESI) m/z: 357 [M+H]+

(2) Síntesis de (5aS,8aS)-4-metiloctahidrociclopenta[e][1,4]diazepina-2,5-diona

Se añadió una solución 4 N de cloruro de hidrógeno/1,4-dioxano (16 ml, 64 mmol) a temperatura ambiente a 2-((1S,2S)-2-((t-butoxicarbonil)amino)-N-metilciclopentanocarboxamida)acetato de t-butilo (1,55 g, 4,35 mmol) y la mezcla se agitó durante 16 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. Se añadieron secuencialmente bicarbonato de sodio (0,877 g, 10,4 mmol), metanol (24 ml), NMM (0,096 ml, 0,87 mmol) y DMT-MM (12,3% de H²O, 1,73 g, 5,48 mmol) al residuo a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 3 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo se lavó con DCM. El líquido de lavado se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice, metanol al 0-20%/acetato de etilo) para producir el compuesto del título (753 mg).

1H-RMN (400 MHz, CDCh) 5 (ppm): 1,55-1,88 (m, 3H), 1,91 -2,02 (m, 1 H), 2,11 -2,22 (m, 1 H), 2,25-2,40 (m, 1 H), 3,07 (s, 3H), 3,07-3,16 (m, 1 H), 3,51 -3,62 (m, 1 H), 3,78 (d, J = 18,0 Hz, 1 H), 4,57 (d, J = 18,0 Hz, 1 H), 6,54 (s a, 1 H).

MS (ESI) m/z: 183 [M+H]+

Ejemplo 1

Síntesis de 3-fluoro-6,11 -dimetil-6,7,10,11,12,13-hexahidrobenzo[f]pirido[4"3":4',5]tieno[2'3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-5,14-diona

Se añadió oxicloruro de fósforo (4,65 ml, 49,9 mmol) a temperatura ambiente a una mezcla de 2-amino-6-metil-4,5,6,7-tetrahidrotieno[2,3-c]piridina-3-carboxilato de etilo (6,00 g, 25,0 mmol) obtenido en el Ejemplo de producción 1, 7-fluoro-4-metil-3,4-dihidro-1H-benzo[e][1,4]diazepina-2,5-diona (5,20 g, 25,0 mmol) obtenido en el Ejemplo de producción 2 y DCE (300 ml). La mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 20 horas. Mientras se agitaba con enfriamiento con hielo, se añadió etóxido de sodio (una solución al 20% en etanol, 80 ml, 207 mmol) a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio y acetato de etilo a la mezcla de reacción y se separó la capa orgánica. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de magnesio y se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó secuencialmente mediante cromatografía en columna (gel de sílice NH, acetato de etilo al 50-100%/n-heptano) y cromatografía en columna (gel de sílice, metanol/acetato de etilo al 0-50%). El sólido obtenido se trituró con TBME y los precipitados se recogieron por filtración. El sólido obtenido se lavó con TBME y se secó a presión reducida para producir el compuesto del título (4,56 g).

1H-RMN (400 MHz, CDCh) 5 (ppm): 2,51 (s, 3H), 2,66-2,76 (m, 1H), 2,77-2,88 (m, 1H), 3,04-3,18 (m, 2H), 3,25 (s, 3H), 3,57-3,75 (m, 2H), 4,09 (d, J = 15,2 Hz, 1 H), 4,47 (d, J = 14,8 Hz, 1 H), 7,25-7,31 (m, 1 H), 7,60-7,64 (m, 1 H), 7,67 (dd, J = 9,0, 4,7 Hz, 1H).

MS (ESI) m/z: 385 [M+H]+

Ejemplo 2

Síntesis de 5,10-dimetil-5,6,9,10,11,12-hexahidropirido[4",3":4',5']tieno[2'3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[2,3-f][1,4]diazepina-4,13-diona

Se añadió oxicloruro de fósforo (0,157 ml, 1,68 mmol) a temperatura ambiente a una mezcla de 2-amino-6-metil-4,5,6,7-tetrahidrotieno[2,3-c]piridina-3-carboxilato de etilo (303 mg, 1,26 mmol) obtenido en el Ejemplo de producción 1, 4-metil-3,4-dihidro-1H-tieno[3,2-e][1,4]diazepina-2,5-diona (165 mg, 0,841 mmol) obtenida en el Ejemplo de producción 3 y 1,4-dioxano (10 ml). La mezcla de reacción se agitó a 70 °C durante 2 horas y después se agitó a 90 °C durante 5 horas. Se añadió etóxido de sodio (una solución al 20% en etanol, 2,60 ml, 6,73 mmol) a la mezcla de reacción enfriada a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. Se añadieron acetato de etilo y una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio a la mezcla de reacción y se separó la capa orgánica. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice, metanol al 50%/acetato de etilo) para producir el compuesto del título (90,0 mg).

[1H-RMN (400 MHz, CDCh) 5 (ppm): 2,51 (s, 3H), 2,66-2,87 (m, 2H), 3,07-3,20 (m, 2H), 3,26 (s, 3H), 3,56-3,74 (m, 2H), 4,21 (d, J = 15,0 Hz, 1 H), 4,56 (d, J = 15,0 Hz, 1 H), 7,54 (d, J = 5,3 Hz, 1 H), 7,59 (d, J = 5,3 Hz, 1 H).

MS (ESI) m/z: 373 [M+H]+

Ejemplo 3

Síntesis de 5,10-dimetil-5,6,9,10,11,12-hexahidropirido[4"3":4',5']tieno[2'3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[3,2-f][1,4]diazepina-4,13-diona

Se añadió oxicloruro de fósforo (1,43 ml, 15,3 mmol) a temperatura ambiente a una mezcla de 4-metil-3,4-dihidro-1 H-tieno[2,3-e][1,4]diazepina-2,5-diona (1,00 g, 5,10 mmol) obtenida en el Ejemplo de producción 4, 2-amino-6-metil-4,5,6,7-tetrahidrotieno[2,3-c]piridina-3-carboxilato de etilo (1,84 g, 7,64 mmol) obtenido en el Ejemplo de producción 1 y 1,4-dioxano (30 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se agitó a 90 °C durante 2 horas. Se añadió etóxido de sodio (una solución al 20% en etanol, 21,7 ml, 56,1 mmol) durante 5 minutos a la mezcla de reacción enfriada a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Se añadieron secuencialmente acetato de etilo, una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio y agua a la mezcla de reacción y se separó la capa orgánica. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice, metanol al 20%-50%/acetato de etilo). El sólido obtenido se trituró con etanol y los precipitados se recogieron por filtración. El sólido obtenido se lavó con etanol y se secó a presión reducida para producir el compuesto del título (712 mg).

1H-RMN (400 MHz, CDCh) 5 (ppm): 2,52 (s, 3H), 2,71-2,87 (m, 2H), 3,05-3,30 (m, 5H), 3,59-3,75 (m, 2H), 4,23 (d, J = 14,8 Hz, 1 H), 4,57 (d, J = 14,8 Hz, 1 H), 7,35 (d, J = 6,2 Hz, 1 H), 7,39 (d, J = 5,9 Hz, 1H).

MS (ESI) m/z: 373 [M+H]+

Ejemplo 4

Síntesis de (3aS,14aR)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1 H-ciclopenta[f]pirido[4'',3'':4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona

Se añadió oxicloruro de fósforo (7,93 ml, 85,1 mmol) a temperatura ambiente a una mezcla de (5aS,8aR)-4-metiloctahidrociclopenta[e][1,4]diazepina-2,5-diona (3,10 g, 17,0 mmol) obtenida en el Ejemplo de producción 5-(2), 2-amino-6-metil-4,5,6,7-tetrahidrotieno[2,3-c]piridina-3-carboxilato de etilo (8,18 g, 34,0 mmol) obtenido en el Ejemplo de producción 1 y DCE (300 ml). La mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 14,5 horas. Se añadió una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio a la mezcla de reacción a 0 °C, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3,5 horas y después se separó la capa orgánica. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se lavó secuencialmente con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio y una solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice NH, acetato de etilo al 30-60%/n-heptano). El residuo concentrado obtenido se trituró con TBME y los precipitados se recogieron por filtración. El sólido obtenido se lavó 3 veces con TBME y se secó a presión reducida para producir el compuesto del título (3,70 g).

1H-RMN (400 MHz, CDCb) 5 (ppm): 1,51 -1,73 (m, 2H), 1,94-2,18 (m, 2H), 2,30-2,41 (m, 1 H), 2,44-2,59 (m, 4H), 2,71 -2,82 (m, 2H), 3,04-3,19 (m, 5H), 3,42-3,54 (m, 1 H), 3,64 (s, 2H), 4,17 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 4,75 (d, J = 15,6 Hz, 1 H), 5,69-5,82 (m, 1H).

MS (ESI) m/z: 359 [M+H]+

Rotación específica: [a]D20 -146,0 (c 0,50, CHCh)

Análisis por HPLC:

(Condiciones de análisis) Columna: CHIRALPAK IB (producida por Daicel Chemical Industries, Ltd.) (0,46 cm $ x 15 cm), 40 °C, eluyente: etanol/hexano = 20/80 (v/v), caudal: 1 ml/min., detección: UV (254 nm).

(Resultados del análisis) Cuando se analizó el compuesto del título en las condiciones de análisis anteriores, el tiempo de retención fue de 10,38 minutos, la pureza óptica fue > 98% de ee y la rotación óptica fue (-). El tiempo de retención del enantiómero se confirmó mediante el producto sintetizado de forma similar utilizando una mezcla racémica como material de partida.

Ejemplo 5

Síntesis de (3aR,14aR)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1 H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona

Se añadió oxicloruro de fósforo (0,793 ml, 8,51 mmol) a temperatura ambiente a una mezcla de (5aR,8aR)-4-metiloctahidrociclopenta[e][1,4]diazepina-2,5-diona (310 mg, 1,70 mmol) obtenida en el Ejemplo de producción 6-(2), 2-amino-6-metil-4,5,6,7-tetrahidrotieno[2,3-c]piridina-3-carboxilato de etilo (613 mg, 2,55 mmol) obtenido en el Ejemplo de producción 1 y DCE (16 ml). La mezcla de reacción se agitó a 70 °C durante 2,5 horas y después se retornó a la temperatura ambiente, y se añadieron acetato de etilo (15 ml) y una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio (30 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 días, se añadió acetato de etilo y se separó la capa orgánica. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice NH, acetato de etilo al 50-70%/n-heptano). El producto obtenido se lavó 3 veces con dietil éter, después se lavó con TBME y se secó a presión reducida para producir el compuesto del título (143 mg).

1H-RMN (400 MHz, CDCI³) 5 (ppm): 1,29-1,49 (m, 1 H), 1,68-1,83 (m, 1 H), 1,82-2,21 (m, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,76 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 2,98-3,23 (m, 6H), 3,40-3,54 (m, 1 H), 3,57-3,68 (m, 2H), 4,17-4,34 (m, 2H), 5,30 (d, J = 17,4 Hz, 1 H). MS (ESI) m/z: 359 [M+H]+

Análisis por HPLC:

(Condiciones de análisis) Columna: CHIRALPAK IC (producida por Daicel Chemical Industries, Ltd.) (0,46 cm f x 15 cm), 40 °C, eluyente: etanol, caudal: 1 ml/min., Detección: UV (254 nm)

(Resultados del análisis) El tiempo de retención del compuesto del título fue de 6,64 minutos, la pureza óptica fue > 99% de ee y la rotación óptica fue (-).

Ejemplo 6

Síntesis de (3aS,4aS)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1 H-ciclopenta[f]pirido[4"3":4',5']tieno[2'3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona

Se añadió oxicloruro de fósforo (0,859 ml, 9,22 mmol) a temperatura ambiente a una mezcla de (5aS,8aS)-4-metiloctahidrociclopenta[e][1,4]diazepina-2,5-diona (336 mg, 1,84 mmol) obtenida en el Ejemplo de producción 7-(2), 2-amino-6-metil-4,5,6,7-tetrahidrotieno[2,3-c]piridina-3-carboxilato de etilo (665 mg, 2,77 mmol) obtenido en el Ejemplo de producción 1 y DCE (17 ml). La mezcla de reacción se agitó a 60 °C durante 3,5 horas y después se retornó a la temperatura ambiente. Se añadieron acetato de etilo (15 ml) y una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio (30 ml) a la mezcla de reacción. Después de agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 5 días, se añadió acetato de etilo y se separó la capa orgánica. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice NH, acetato de etilo al 40-80%/n-heptano). El producto obtenido se lavó 3 veces con dietil éter y se secó a presión reducida para producir el compuesto del título (1⁶⁶mg).

1H-RMN (400 MHz, CDCh) 5 (ppm): 1,31 -1,50 (m, 1 H), 1,69-1,83 (m, 1 H), 1,84-1,97 (m, 1 H), 1,97-2,20 (m, 2H), 2,50 (s, 3H), 2,73-2,80 (m, 2H), 3,02-3,23 (m, 6H), 3,41-3,55 (m, 1H), 3,57-3,69 (m, 2H), 4,19-4,34 (m, 2H), 5,30 (d, J = 17,2 Hz, 1 H).

MS (ESI) m/z: 359 [M+H]+

(Condiciones de análisis) Columna: CHIRALPAK IC (producida por Daicel Chemical Industries, Ltd.) (0,46 cm f x 15 cm), 40 °C, eluyente: etanol, caudal: 1 ml/min., Detección: UV (254 nm )

(Resultados del análisis) El tiempo de retención del compuesto del título fue de 8,34 minutos, la pureza óptica fue > 99% de ee y la rotación óptica fue (+).

Ejemplos de ensayos farmacológicos

Se llevaron a cabo los ensayos farmacológicos siguientes utilizando los compuestos de los Ejemplos 1 a 6.

Medición de la liberación de acetilcolina (ACh) en el sistema de cultivo de neuronas septales primarias de rata en presencia de NGF

(1) Cultivo de neuronas septales primarias de rata

Se aisló el área septal de ratas Sprague-Dawley (SD) (Charles River Laboratories Japan, Inc.) con una edad fetal de 18 días y se cultivó. Específicamente, se extrajeron los fetos asépticamente de ratas preñadas con anestesia con isoflurano. Se extrajo el cerebro de cada feto y se sumergió en medio L-15 enfriado con hielo (11415-064, Thermo Fisher Scientific). El área septal se diseccionó del cerebro extraído con un microscopio estereoscópico. El área septal diseccionada se sometió a tratamiento enzimático en una solución enzimática que contenía el 0,25% de tripsina (15050-065, Thermo Fisher Scientific) y el 0,01% de DNasa (D5025-150KU, Sigma) a 37 °C durante 30 minutos, dispersando así las células. En este caso, la reacción enzimática se finalizó añadiendo suero de caballo inactivado (26050-088, Thermo Fisher Scientific). La solución tratada con enzima se centrifugó a 1000 rpm durante 3 minutos y se retiró el sobrenadante. Se añadió un medio en una cantidad de 10 ml a la masa celular obtenida. El medio utilizado fue medio Eagle modificado por Dulbecco (044-29765, WAKO) suplementado con suplemento de N2 (17502-048, Thermo Fisher Scientific), piruvato de sodio 1 mM (11360-070, Thermo Fisher Scientific) y penicilina-estreptomicina (15140-1221, Thermo Fisher Scientific). Las células de la masa celular a la que se añadió el medio se redispersaron mediante un pipeteo suave y después se centrifugaron de nuevo a 1000 rpm durante 3 minutos y se retiró el sobrenadante. Se añadió el medio en una cantidad de 10 ml a la masa celular obtenida y la dispersión celular se filtró a través de una malla de nailon de 40 pm (Cell Strainer) para retirar la masa celular, obteniendo así una suspensión de células neuronales. La suspensión de células neuronales se diluyó con el medio y se añadieron suero bovino inactivado al 10% (26140-079, Thermo Fisher Scientific) y suero de caballo inactivado al 10%. A continuación, se sembraron 100 pl/pocillo de la suspensión en una placa de 96 pocillos (354461, CORNING) revestida previamente con poli-D-lisina de modo que la densidad de cultivo inicial fuera de 1,4 x 105 células/cm2. Después de cultivar las células sembradas en una atmósfera con el 5% de CO2-95% de aire en una incubadora a 37 °C durante 2 días, todo el medio se reemplazó por 120 pl de medio nuevo y las células se cultivaron posteriormente durante 5 días.

(2) Adición del compuesto

El séptimo día de cultivo se añadió el compuesto de la forma siguiente. Se diluyó una solución del compuesto de ensayo en DMSO con el medio de modo que la concentración fuera 10 veces superior a la concentración final. Se preparó NGF (450-01, PEPRO TECH, INC.) a 0,3 ng/ml. Estas dos soluciones se añadieron cada una en una cantidad de 15 pl/pocillo y la mezcla se mezcló bien. La concentración final de DMSO fue del 0,1% o inferior. Además, solo se añadieron DMSO y NGF al grupo de control.

(3) Medición de liberación de ACh

Un día después de la adición del compuesto, se midió la cantidad de liberación de ACh mediante HPLC de la forma siguiente. Se añadieron 100 pl/pocillo de un tampón calentado al pocillo después de eliminar el medio, y el tampón se retiró inmediatamente. A continuación, se añadieron 120 pl/pocillo de un tampón al que se añadieron colina 10 pM, fisostigmina 10 pM y KCl 6 mM. El tampón se preparó añadiendo NaCl 125 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico 25 mM, KH²PO⁴1,2 mM, MgSO4 1,2 mM, CaCl²(²H²O) 2,2 mM y glucosa 10 mM a agua esterilizada, y el pH final de la solución se fijó en 7,4. Después de incubar la placa de 96 pocillos a la que se añadió el tampón en una atmósfera con el 5% de CO2-95% de aire en una incubadora a 37 °C durante 40 minutos, se recogieron 80 pl de tampón. Se añadió una solución de patrón interno de IPHC (5 x 10-7 M) en una cantidad de 6 pl al tampón recogido, y el tampón se transfirió a un tubo para la medición por HPLC y se sometió a la medición por HPLC. Los resultados están representados por el efecto de cada compuesto como el porcentaje (% de control) de la concentración de ACh en el tampón del grupo de control, y las concentraciones de compuesto que muestran un aumento del 20% con respecto a la concentración de ACh en el tampón del grupo de control se muestran en la tabla 1 siguiente.

[Tabla 1]

Medición de los niveles de expresión de ARNm de colina acetiltransferasa (ChAT) en el área septal de ratas

(1) Administración del compuesto

En este estudio, se utilizaron ratas SD macho (Charles River Laboratories Japan, Inc.) con un peso corporal de aproximadamente 250 a 350 g. El compuesto se disolvió en ácido clorhídrico 0,01 mol/l y se administró por vía oral.

(2) Muestreo

24 horas después de la administración del compuesto, se recogió todo el tejido cerebral con anestesia con pentobarbital. Se aisló el septo medio a partir de todo el cerebro en hielo y se congeló con nitrógeno líquido y después se almacenó a -80 °C.

(3) Medición de los niveles de expresión de ARNm de ChAT

Para la purificación del ARN, en este estudio se usó el kit RNeasy Plus Mini Kit (N° de cat. 74136: QIAGEN). La purificación de ARN se realizó mediante el procedimiento descrito en el kit. Después de la purificación de ARN, se midió la concentración de ARN total utilizando el Instrumento QIAxpert (QIAGEN). El ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc SuperScript® VILO™ (N° de cat. 11754: Thermo Fisher Scientific). La síntesis de ADNc se realizó mediante el procedimiento descrito en el kit. El ADNc sintetizado se diluyó 4 veces con agua desprovista de RNasa y la solución de ADNc diluida se utilizó como muestra. Se mezclaron la mezcla maestra Taqman Universal PCR Master Mix (N° de cat. 4304437: Thermo Fisher Scientific), ensayos de expresión génica inventariados Taqman® Gene Expression Assays, INVENTORIED (N° de cat. 4331182: Thermo Fisher Scientific), agua desprovista de ARNasa y la solución de ADNc en cantidades de 10 gl, 1 gl, 4 gl y 5 gl, respectivamente, y la mezcla resultante se utilizó como solución de muestra de medición. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) se llevó a cabo utilizando ABI PRISM® 7900HT (Thermo Fisher Scientific) mediante un procedimiento de sonda de fluorescencia. El análisis se realizó mediante SDS 2.4 (Thermo Fisher Scientific). Los resultados se calcularon mediante el aumento en porcentaje de la cantidad de niveles de expresión de ARNm de ChAT en el grupo de administración del compuesto con respecto a la cantidad de niveles de expresión de ARNm de ChAT en el grupo de administración de vehículo. Los resultados se muestran en la tabla 2 siguiente.

[Tabla 2]

Medición de acetilcolina (ACh) en líquido cefalorraquídeo (LCR) de rata

(1) Antecedentes

La correlación entre el aumento y la disminución de los neurotransmisores intracerebrales y los del líquido cefalorraquídeo (LCR) se reveló mediante estudios en roedores y la correlación también se observó en humanos (Lowe S et al. Psychopharmacology 219 (2012) 959-970). Por lo tanto, se midieron los cambios en acetilcolina en LCR con el fin de determinar los cambios en acetilcolina intracerebral por los compuestos de ensayo.

(2) Administración de compuestos

En este estudio, se utilizaron ratas Fischer344 macho (Charles River Laboratories Japan, Inc.) con un peso corporal de aproximadamente 150 a 250 g. Los compuestos de ensayo se administraron por vía oral a las ratas una vez al día a 10 mg/kg durante tres días. El vehículo utilizado fue ácido clorhídrico a 0,01 mol/l.

(3) Muestreo

24 horas después de la administración del vehículo y los compuestos de ensayo, se recogió el LCR de la cisterna magna en un tubo que contenía inhibidores de AchE con anestesia con pentobarbital. El LCR recogido se centrifugó a 3500 x g a 4 °C durante 10 minutos y se recogió el sobrenadante. El sobrenadante recogido se congeló con nitrógeno líquido y después se almacenó a -80 °C.

(4) Medición de Ach por CL-EM

A 10 gl del CSF se añadieron 50 gl de cloruro de acetilcolina-d9 (ACh-d9) a una concentración final de 0,34 nmol/l como patrón interno. La mezcla se pipeteó y se centrifugó a 1500 x g a 4 °C durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió y se sometió a CL/EM (NexeraX2 (MS), TSQ Altis (HPLC)), y se detectó Ach como ion precursor en m/z 146,050 y como ion de producto en m/z 87,071 y ACh-d9 como patrón interno se detectó como ion precursor en m/z 155,088 y como ion de producto en m/z 87,000. Los resultados se mostraron como cálculos de un porcentaje de aumento en la concentración de ACh en el LCR en el grupo de administración del compuesto de ensayo con respecto al grupo de administración del vehículo (% de control). Los resultados se muestran en la tabla 3.

[Tabla 3]

Evaluación en ratón transgénico P301S con tau humana

(1) Administración de compuesto

En este estudio, los compuestos de ensayo se administraron por vía oral a ratones transgénicos P301S con tau humana una vez al día durante tres meses desde los cuatro hasta los siete meses de edad. El vehículo utilizado fue ácido clorhídrico a 0,01 mol/l.

(2) Muestreo

El día inicial de la administración (cuatro meses de edad) y al día siguiente de la administración final, los ratones del grupo de administración de vehículo y del grupo de administración del compuesto de ensayo se anestesiaron con pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) y se perfundieron con PBS. Después de la perfusión, se recogió el prosencéfalo, incluida el área septal media, y se fijó con paraformaldehído al 4%.

(3) Preparación de la sección coronal de cerebro congelada

El prosencéfalo recogido, incluida el área septal media, se sumergió y se agitó durante la noche en paraformaldehído al 4%. La solución de inmersión se reemplazó por una solución de sacarosa al 7,5%. Se sumergió y se agitó durante la noche en una solución de sacarosa al 7,5%, y la solución de inmersión se reemplazó por una solución de sacarosa al 15% y se sumergió y se agitó durante la noche. La solución de inmersión se reemplazó por una solución de sacarosa al 30% y se sumergió y se agitó durante la noche. Se prepararon secciones coronales de cerebro congeladas con un espesor de 30 |um a partir del prosencéfalo que incluye el área septal media utilizando un micrótomo (Leica, SM2000R).

(4) Inmunohistoquímica de células positivas de colina acetiltransferasa (ChAT)

Las secciones coronales de cerebro congeladas preparadas se tiñeron con DAB (DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT (Vector, SK-4100)) usando un anticuerpo de ChAT (Santa Cruz, SC-20672) como anticuerpo primario. La imagen de la sección que incluye el área septal media tal como se muestra en "The mouse Brain in stereotaxic coordinates" (TERCERA EDICIÓN COMPACTA, Keith B.J. Franklin y George Paxinos) se tomó con un microscopio de fluorescencia todo en uno (KEYENCE, BZ-X710) y las células positivas a ChAT alrededor del eje principal del área septal media se contaron mediante el programa informático de análisis BZ (KEYENCE). Los resultados se mostraron como un porcentaje del número de células positivas a ChAT en el grupo de administración de vehículo y el grupo de administración del compuesto de ensayo con respecto al número de células positivas a ChAT en el momento de la administración inicial (cuatro meses de edad). Los datos se expresan como la media ± SEM. Las diferencias entre el grupo en el momento de la administración inicial y el grupo tratado con vehículo (significativas: *) se analizaron mediante una prueba t no apareada, y también las diferencias entre el grupo tratado con vehículo y el grupo tratado con compuesto (significativas: #) se analizaron mediante una prueba t no apareada. Un valor de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 7.02. Los resultados se muestran en la tabla 4.

[Tabla 4]

Efecto neuroprotector y restaurador sobre las neuronas colinérgicas utilizando un modelo de rata con lesión de fimbriafórnix

(1) Preparación del modelo de rata con lesión de fimbria-fórnix

En este estudio, se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley (Charles River Laboratories Japan, Inc.) con un peso corporal de aproximadamente 250 a 350 g. La rata se anestesió con la combinación de tres fármacos: midazolam (2 mg/kg sc), clorhidrato de medetomidina (0,15 mg/kg sc) y tartrato de butorfanol (2,5 mg/kg sc) y se fijó con un aparato de estereotaxis cerebral (Narishige Co., Ltd.). Se expuso el cráneo y se perforó un orificio de 5 mm de ancho en el cráneo desde la línea media 2 mm posterior al bregma. Se introdujo una cuchilla de 4 mm de ancho en el bregma con una profundidad de 5,5 mm para cortar el fimbria-fórnix. Después de la hemostasia, se suturó el cuero cabelludo. Después de la operación, la rata se devolvió a la jaula y se recuperó de la anestesia. En el grupo de operación simulada, se perforó un orificio de 5 mm de anchura en el cráneo desde la línea media 2 mm posterior al bregma, pero no se introdujo ninguna cuchilla.

(2) Administración de compuesto

Los compuestos de ensayo se administraron por vía oral a las ratas una vez al día de cinco días a nueve días después de la operación (ejemplo 1:10 mg/kg) o de siete días a catorce días después de la operación (ejemplo 3: 3 mg/kg). El vehículo utilizado fue ácido clorhídrico 0,01 mol/l. En el grupo operado de forma simulada, el vehículo se administró por vía oral una vez al día de forma similar al grupo de administración del compuesto de ensayo.

(3) Muestreo

Las ratas se anestesiaron con pentobarbital y se perfundieron por vía transcardiaca con PBS helado. Después de la perfusión, se recogió el prosencéfalo que incluía el área septal media, se sumergió y se agitó durante la noche con paraformaldehído al 4%. La solución de inmersión se reemplazó por una solución de sacarosa al 7,5%. Se sumergió y se agitó durante la noche en una solución de sacarosa al 7,5%, y la solución de inmersión se reemplazó por una solución de sacarosa al 15% y se sumergió y se agitó durante la noche. La solución de inmersión se reemplazó por una solución de sacarosa al 30% y se sumergió y se agitó durante la noche. Se prepararon secciones coronales de cerebro congeladas con un espesor de 30 gm a partir del prosencéfalo que incluye el área septal media utilizando un micrótomo (Leica, SM2000R).

(4) Inmunohistoquímica de células positivas a colina acetiltransferasa (ChAT) y transportador vesicular de acetilcolina (VAChT)

Las secciones coronales de cerebro congeladas preparadas se tiñeron con DAB (DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT (Vector, SK-4100)) usando un anticuerpo ChAT (Santa Cruz, SC-20672) o un anticuerpo VAChT (Merck Millipore, ABN100) como anticuerpo primario. La imagen de la sección que incluye el área septal media o el hipocampo, tal como se muestra en "The mouse Brain in stereotaxic coordinates" (TERCERA EDICIÓN COMPACTA, Keith B.J. Franklin y George Paxinos) se tomó con un microscopio de fluorescencia todo en uno (KEYENCE, BZ-X710) y las células positivas a ChAT del área septal media o la densidad óptica (DO) de VAChT en el hipocampo se midieron mediante el programa informático de análisis BZ (KEYENCE). Los resultados se mostraron como un porcentaje del número de células positivas a ChAT del área septal media o DO de VAChT en el hipocampo en el grupo de administración del vehículo y el grupo de administración del compuesto de ensayo con respecto al número de células positivas a ChAT del área septal media o DO de VAChT en el hipocampo en el grupo operado de forma simulada. Los datos se expresan como media ± SEM. Las diferencias entre el grupo tratado con vehículo y el grupo tratado con compuesto (significativas: #) se analizaron mediante la prueba t no apareada. Un valor de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 7.02. Los resultados se muestran en las tablas 5 y 6.

[Tabla 5]

[Tabla 6]

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

y

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. 3-Fluoro-6,11 -dimetil-6,7,10,11,12,13-hexahidrobenzo[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-5,14-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma según la reivindicación 1:

3. 5,10-Dimetil-5,6,9,10,11,12-hexahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[2,3-f][1,4]diazepina-4,13-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma según la reivindicación 1:

4. 5,10-Dimetil-5,6,9,10,11,12-hexahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[3,2-f][1,4]diazepina-4,13-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma según la reivindicación 1:

5. (3aS,14aR)-5,10-Dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1 H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma según la reivindicación 1:

6. (3aR,14aR)-5,10-Dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1 H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma según la reivindicación 1:

7. (3aS,14aS)-5,10-Dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-octahidro-1 H-ciclopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepina-4,13(2H,14aH)-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma según la reivindicación 1:

8. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y uno o más aditivos farmacéuticamente aceptables.

9. Un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. El compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

11. Un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de la demencia con cuerpos de Lewy que comprende el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. El compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento de la demencia con cuerpos de Lewy.

13. Un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson con demencia que comprende el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

14. El compuesto o sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson con demencia.