KR100998804B1 - 중추 및 말초 신경계 장애의 치료를 위한 방법 및 조성물,및 그에 유용한 신규 화합물 - Google Patents

중추 및 말초 신경계 장애의 치료를 위한 방법 및 조성물,및 그에 유용한 신규 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 스피로 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 말초 및 중추 신경계의 기능부전을 비롯한 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 유용한 제약 조성물, 상기 제약 조성물의 제조에 사용되는 화합물, 상기 방법의 수행에 유용한 화합물의 제조 방법 및 일부 신규 화합물 자체를 제공한다.
스피로 화합물, 말초 및 중추 신경계의 기능부전

Description

중추 및 말초 신경계 장애의 치료를 위한 방법 및 조성물, 및 그에 유용한 신규 화합물{Methods and Compositions for Treatment of Central and Peripheral Nervous System Disordors and Novel Compounds Useful Therefor}
본 발명은 다양한 중추 및 말초 신경계 장애를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 그 내용이 본원에 참고로 포함되는 하기 문헌들이 관련된 것으로 여겨진다.
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<발명의 요약>
본 발명의 실시양태에 따라서 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 기하 이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염이 제공된다.
Figure 112004050635939-pct00001
상기 식 중,
C는 고리 A 및 a, b, d 및 e를 함유하는 고리에 의해 공유되는 스피로 탄소 원자를 나타내고;
A는
Figure 112004050635939-pct00002
로 이루어진 군으로부터 선택되는데,
여기서, R은 H, C1-C8 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 -CH2-P(=O)(OH)2 로부터 선택되고;
a는 -O- 또는 -S-이고;
b는 -CR1R2- 또는 -C(R1)=이고;
d는 =N-, -C(=O)-, -C(=S)- 및 =N(R3)=O로 이루어진 군으로부터 선택되고;
e는 -CH2-, -CHR4-, -NH-, -NR5-, -N(SO2R6)- 및 -N(C(=O)R6)-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R, R1, R2, R3, R4는 각각 독립적으로 H, 및 1 내지 3개의 페닐로 임의 치환되는 C1-6 알콕시, C2-6 히드록시알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐 및 C1-6 알킬로부터 선택되고;
R5는 독립적으로 H, 1, 2 또는 3개의 페닐로 임의 치환되는 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 히드록시알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 치환된 페닐 및 헤테로아릴로부터 선택되고;
R6은 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 알킬티오, C2-6 히드록시알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐 및 C3-7 시클로알킬로부터 선택되는데, 이들 각각은 1 내지 6개의 할로겐 원자; 히드록시-C1-6-알킬; 할로겐, 니트로, 아미노, 히드록실 또는 CF3 기로 치환되는 아릴; 1, 2 또는 3개의 아릴기, C1-6 알킬 인돌, 이소인돌릴, 3-피리디닐, 3-피페리디닐, 벤즈이미다졸릴, 티에닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 피라지닐, 벤조푸라닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 벤조티에닐, 이소벤조푸릴, 피라졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 퓨리닐, 카르바졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 이소옥사졸릴, 피롤릴, 피라졸릴, 퀴나졸리닐, 피리다지닐, 피라지닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴녹살리닐, 크산티닐, 하이포크산티닐 및 프테리디닐로 치환되는 C1-6 알킬로부터 선택되나,
단, A가
Figure 112004050635939-pct00003
이고, R이 -CH3이고, a가 S이고, b가 -CH(CHCH3)-이고, d가 -C(=O)-인 경우, e는 -NH-가 아니고 (AF267 또는 그의 거울상이성질체),
추가로, A가
Figure 112004050635939-pct00004
이고, R이 -CH3이고, a가 S이고, b가 -C(CH3)=이고, d가 =N-인 경우, e는 -CH2-가 아니다 (AF150(S)).
본 발명의 실시양태에서, R5가 인돌, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 푸릴, 피리딜, 피리미딜, 티에닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 피라지닐, 벤조푸라닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 벤조티에닐, 이소벤조푸릴, 피라졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 퓨리닐, 카르바졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 이소옥사졸릴, 피롤릴, 피라졸릴, 퀴나졸리닐, 피리다지닐, 피라지닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴녹살리닐, 크산티닐, 하이포크산티닐, 프테리디닐, 5-아자시티디닐, 5-아자우라실릴, 트리아졸로피리디닐, 이미다졸로피리디닐, 피롤로피리미디닐 및 피라졸로피리미디닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로아릴이다.
본 발명의 실시양태에서, 상기 화합물은 e가 -NR5-이고, 화학식 (I)의 2개의 잔기가 -(CH2)n- 및 -(CH2O)n-로 이루어진 군으로부터 선택되는 공통 기 R5를 공유하며, 여기서 n이 1 내지 6인 화학식 (I)의 화합물의 이량체 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염이다.
본 발명의 실시양태에서, 상기 화합물은 N-[(2,8-디메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-3-일리덴)-아민]-N-옥시드; N-[(2-에틸-8-메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-3-일리덴)-아민-N-옥시드; N-[(2-메틸-8-페닐-1-옥사-8-아자-스피로 [4.5]데스-3-일리덴)-아민]-N-옥시드; 티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온; 4-(2,4-디메톡시벤질)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF286); 8-메틸-4-피롤리딘-1-일메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF287); 2-(1-히드록시-에틸)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF298); (S)-2-에틸-8-메틸-8-옥시-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF299); 4-(2,4-디메톡시-벤질)-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF288), (S)-2-에틸-8-메틸-1-옥소-1λ4-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF300); 2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-티온 (AF510); (S)-2-에틸-4-(4-플루오로-벤젠술포닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF700); 2-에틸-4-[2-(1H-인돌-3-일)-에틸]-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF703); 2-에틸-4-(3-1H-인돌-3-일-프로피오닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF704); (S)-에틸-4-(3-1H-인돌-3-일-프로피오닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF704B); (R)-에틸-4-(3-1H-인돌-3-일-프로피오닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF704A); 및 2-메틸-8-메틸-d3-1-티아-3,8-디아자-스피로[4.5]데스-2-엔 (AF402), 또는 이들의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 기하 이성질체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시양태에서, 상기 화합물은 AF292 또는 그의 제약상 허용가능한 염이다.
본 발명의 실시양태에서, 상기 화합물은 A가
Figure 112004050635939-pct00005
이고, R이 H이고, a가 -S-이고, b가 -CH(CH2CH3)-이고, d가 -(C=O)-이고, e가 -NH-인 화합물, 즉, 2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF504), 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염이다.
본 발명의 실시양태에서, 상기 화합물은 (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292) 또는 그의 HCl 염이다.
본 발명의 실시양태에서, 상기 화합물은 (R)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF291)이다
본 발명의 실시양태에서, 상기 화합물은 A가
Figure 112004050635939-pct00006
이고, R이 -CH3이고, a가 -O-이고, d가 =N(R3) =O인 화합물, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 기하 이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염이다. 본 발명의 실시양태에서, b는 -CH(CH3)-이고, R3은 -CH3이다 (즉, N-[(2,8-디메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-3-일리덴)-메틸-아민]-N-옥시드 (AF600)). 본 발명의 실시양태에서, b는 -CH(CH3)-이고, R3은 벤질이다 (즉, N-[(2,8-디메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-3-일리덴)-벤질-아민]-N-옥시드 (AF604)). 본 발명의 실시양태에서, b는 -CH(CH3)-이고, R3은 이소프로필이다 (즉, N-[(2,8-디메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-3-일리덴)-이소프로필-아민]-N-옥시드 (AF605)). 본 발명의 실시양태에서, b는 -CH(CH2CH3)-이고, R3은 -CH3이다 (즉, N-[(2-에틸-8-메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-3-일리덴)-메틸-아민]-N-옥시드 (AF601)). 본 발명의 실시양태에서, b는 -CH(CH3)-이고, R3은 페닐이다 (즉, N-[(2-메틸-8-페닐-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-3-일리덴)-메틸-아민]-N-옥시드 (AF602)).
본 발명의 실시양태에서, 상기 화합물은 A가
Figure 112004050635939-pct00007
이고, R이 -CH3이고, a가 -O-이고, d가 =N(R3)=O인 화합물, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 기하 이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염이다. 본 발명의 실시양태에서, b는 -CH(CH3)-이고, R3은 메틸이다 (즉, 디히드로-5'-메틸스피로[1-아자비시클로[2.2.2]옥탄-3,5'-(4'H)-3'-일리덴-메틸아민]-N-옥시드 (AF603)).
본 발명의 실시양태에서, A는
Figure 112004050635939-pct00008
이고, R은 메틸이고, a는 -S-이고, b가 -CH(CH2CH3)-이고, d는 -C(=O)-이고, e는 -NR5-이며, 여기서 R5 는 -(CH2)3-인돌릴 및 -C(=O)-(CH2)3-인돌릴로부터 선택된다 (즉, 2-에틸-4-[2-(1H-인돌-3-일)-에틸]-8-메틸-1-티아-4,8-디아자스피로[4.5]데칸-3-온 (AF703) 또는 2-에틸-4-(3-1H-인돌-3-일-프로피오닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자스피로[4.5]데칸-3-온 (AF704), 또는 이들의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염). 본 발명의 실시양태에서, 상기 화합물은 (S)-에틸-4-(3-1H-인돌-3-일-프로피오닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF704B)이다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 기하 이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의, 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 화합물은 AF292 또는 AF292의 프로드럭, 또는 AF292 또는 AF292의 프로드럭의 제약상 허용가능한 염이다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 프로드럭은 AF267B 또는 그의 제약상 허용가능한 염이다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 하나 이상의 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 기하 이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염, 및 이들을 위한 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 화합물은 AF292 또는 AF292의 프로드럭, 또는 이들의 제약상 허용가능한 염이다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 프로드럭은 AF267B 또는 그의 제약상 허용가능한 염이다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267 및 AF150(S), 또는 이들의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 기하 이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, M1 무스카린성 수용체를 자극하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 화합물은 AF292 또는 AF292의 프로드럭, 또는 이들의 제약상 허용가능한 염이다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 프로드럭은 AF267B 또는 그의 제약상 허용가능한 염이다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 M1 무스카린성 수용체를 자극하고 상기 M1 무스카린성 수용체 부근에서의 산화를 지연하기 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 A가
Figure 112004050635939-pct00009
이고, R이 -CH3이고, a가 -O-이고, d가 =N(R3)=O인 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 기하 이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 A가
Figure 112004050635939-pct00010
이고, R이 -CH3이고, a가 -O-이고, d가 =N(R3)=O인 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 거울상이성질체, 부분 입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 기하 이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의 M1 무스카린성 수용체에 대한 아고니스트량, 및 이를 위한 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 A가
Figure 112004050635939-pct00011
이고, R이 -CH3이고, a가 -O-이고, d가 =N(R3)=O인 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 기하 이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 M1 무스카린성 수용체를 자극하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에서는 또한 화합물 (S)-2-에틸-4-(4-플루오로-벤젠술포닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF700)을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 AF700, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의, M1 무스카린성 수용체를 자극하고 α 세크레타제를 활성화하기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 AF700, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의 M1 무스카린성 수용체 자극 및 α-세크레타제 활성화에 대한 유효량, 및 이를 위한 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 AF700, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, M1 무스카린성 수용체를 자극하고 α 세크레타제를 활성화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 AF700, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의, M1 무스카린성 수용체를 자극하고 β 세크레타제를 길항하기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 AF700, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의 M1 무스카린성 수용체에 대한 아고니스트성 유효량 및 β-세크레타제에 대한 길항제성 유효량, 및 이들을 위한 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 AF700, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 이량체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, M1 무스카린성 수용체를 자극하고 β-세크레타제를 길항하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 AF700, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의, M1 무스카린성 수용체를 자극하고 γ-세크레타제를 길항하기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 AF700, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 대사물질 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 M1 무스카린성 수용체에 대한 아고니스트성 유효량 및 γ-세크레타제에 대한 길항제성 유효량, 및 이들을 위한 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 AF700, 또는 그의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 호변이성질체, 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, M1 무스카린성 수용체를 자극하고 γ-세크레타제를 길항하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292), 또는 그의 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의, M1 무스카린성 수용체를 자극하고 M3 무스카린성 수용체를 길항하기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292), 또는 그의 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염의 M1 무스카린성 수용체에 대한 아고니스트성 유효량 및 M3 무스카린성 수용체에 대 한 길항제성 유효량, 및 이를 위한 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292), 또는 그의 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염을 함유하는 인간 또는 동물의 혈액을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 혈액은 인체 또는 동물체에 위치한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 혈액은 인체 또는 동물체에 위치하지 않는다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292), 또는 그의 대사물질 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 함유하는 인간 또는 동물의 혈장을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 혈액은 인체 또는 동물체에 위치한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 혈액은 인체 또는 동물체에 위치하지 않는다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 인체 또는 동물체 어디에나 위치하는 화합물 (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292), 또는 그의 대사물질 또는 제약상 허용가능한 염을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292)의 프로드럭으로서 사용하기 위한 화합물 (S)-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF267B)을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292)의 프로드럭으로서 화합물 (S)-2-에틸-8-메틸-1-티아 -4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF267B)의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 (S)-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF267B)과 (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292)의 배합물의, M1 무스카린성 수용체를 자극하고 M3 무스카린성 수용체를 길항하기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 AF267B과 AF292의 배합물의 M1 무스카린성 수용체에 대한 아고니스트량 및 M3 무스카린성 수용체에 대한 길항제량, 및 이를 위한 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화합물 AF267B과 AF292의 배합물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 M1 무스카린성 수용체를 자극하고 M3 무스카린성 수용체를 길항하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에서, AF267B 및 AF292는 함께 투여된다. 본 발명의 실시양태에서, AF267B 및 AF292는 별도로 투여된다. 본 발명의 실시양태에서, AF267B 및 AF292는 상이한 시간에 투여된다. 본 발명의 실시양태에서, AF267B 및 AF292는 동일한 시간에 투여된다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 제1 화합물 (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292)과, 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 및 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체, 기하 이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 화합물과의 배합물의, 다른 mAChR 아형의 자극으로 인한 역부작용을 최소화하면서 M1 무스카린성 수용체를 자극하기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 제1 화합물 AF292와, 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 및 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 화합물과의 배합물의 M1 무스카린성 수용체에 대한 아고니스트량, 및 이를 위한 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 제1 화합물 AF292와, 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 및 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체, 기하 이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 화합물과의 배합물의 M1 무스카린성 수용체에 대한 아고니스트량, 및 이를 위한 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 제1 화합물 AF292와, 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 및 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체, 기하 이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 화합물과의 배합물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 다른 mAChR 아형의 자극으로 인한 역부작용을 최소화하면서 M1 무스카린성 수용체를 자극하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서, 제1 화합물 및 제2 화합물을 함께 투여한다. 본 발명의 실시양태에서, 제1 화합물 및 제2 화합물을 별도로 투여한다. 본 발명의 실시양태에서, 제1 화합물 및 제2 화합물을 상이한 시간에 투여한다. 본 발명의 실시양태에서, 제1 화합물 및 제2 화합물을 동일한 시간에 투여한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 AF267B의 유효량을 환자에게 투여하여 생체내에서 AF267B과 AF292의 혼합물의 유효량을 형성하여 M1 무스카린성 수용체를 자극하는 것을 포함하는, AF267B 및 AF292로 동시에 환자의 M1 무스카린성 수용체를 자극하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 AF267B, AF292 및 인돌-3-프로피온산의 군 중 하나 이상의 프로드럭으로서 사용하기 위한 라세미 형태 (AF704)의 또는 그의 S-거울상이성질체 (AF704B)로서의 2-에틸-4-(3-1H-인돌-3-일-프로피오닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 라세미 형태 (AF704)의 또는 그의 S-거울상이성질체 (AF704B)로서의 2-에틸-4-(3-1H-인돌-3-일-프로피오닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온의, M1 무스카린성 수용체 자극, M1 무스카린성 수용체 부근에서의 산화 지연 및 신경보호제 활성 제공을 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 라세미 형태 (AF704)의 또는 그의 S-거울상이성질체 (AF704B)로서의 화합물 2-에틸-4-(3-1H-인돌-3-일-프로피오닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온의 M1 무스카린성 수용체 자극, 산화- 지연 및 신경보호제 활성에 대한 유효량, 및 이를 위한 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 4-에틸 피페리돈을 2-머캅토부티르산 및 암모니아와 반응시키는 것을 포함하는, 2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF267)의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 방법은 거울상이성질체 AF267A (R-거울상이성질체) 및 AF267B (S-거울상이성질체)를 키랄 분리에 의해 얻는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 AF267A를 라세미화하고 AF267B를 라세미 혼합물로부터 단리하는 것을 포함하는, AF267B의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 단리는 AF267B를 라세미 혼합물로부터 키랄 분리에 의해 분리하는 것을 포함한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 (R)-2-머캅토부티르산을 암모늄 아세테이트 및 1-메틸-4-피페리돈과 접촉시키는 것을 포함하는 AF267B의 합성 방법을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서, (R)-2-벤조일티오부티르산을 수산화암모늄과 접촉시켜 (R)-2-머캅토부티르산을 얻는다. 본 발명의 실시양태에서, (R)-2-브로모부티르산을 세슘 티오벤조에이트와 접촉시켜 (R)-2-벤조일티오부티르산을 얻는다. 본 발명의 실시양태에서, R 배열의 2-아미노부티르산을 아질산나트륨, 브롬화칼륨 및 브롬화수소산과 접촉시켜 (R)-2-브로모부티르산을 얻는다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 AF287을 14C-표지된 에틸 브로마이드와 반응시키고, AF287의 4-위치에서 질소 원자를 탈보호하고, 14C-표지된 AF267B를 키랄 크로마토그래피로 단리하는 것을 포함하는, 14C-표지된 AF267B의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 AF267를 탈메틸화제와 반응시키는 것을 포함하는, (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292)과 (R)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF291)의 혼합물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 P212121 (No 16) a=10.394 (10) (α=90°), b=20.133 (2) (β=90°), c=5.856 (4) (γ=90°) Å, T=110K의 데이타를 특징으로 하는 (S)-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF267B)의 결정질 형태를 제공한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 결정질 형태는 부피 = 1224.2 (9) Å3, Z = 4, Fw = 202.32, 계산된 밀도, Dc = 1.092 Mg/m3, 흡수 계수 μ = 0.232 mm-1의 데이타를 추가 특징으로 한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 실시예 2의 구조 1에 나타낸 배열을 갖는 AF267B의 결정질 형태를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 1-메틸-4-N-티오아세틸아미노-1,2,3,6-테트라-히드로피리딘을 고리화하는 것을 포함하는, 2,8-디메틸-1-티아-3,8-디아자-스피로[4.5]데스-2-엔[AF150(S)]의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 실시양태에 서, 상기 고리화는 인산의 존재하에 수행된다. 본 발명의 실시양태에서, 수소화붕소나트륨을 사용하여 1-메틸-4-N-티오아세틸아미노메틸 피리디늄을 환원시킴으로써 1-메틸-4-N-티오아세틸아미노-1,2,3,6-테트라히드로피리딘을 얻는다. 본 발명의 실시양태에서, 4-(아세트아미노메틸)-1-메틸-피리디늄 요오다이드를 라우슨(Lawesson) 시약과 반응시킴으로써 1-메틸-4-N-티오아세틸아미노메틸 피리디늄을 얻는다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 파라핀 오일 중 AF150(S)를 포함하는 제약 제제를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 베타-아밀로이드 펩티드 (Aβ)의 세포 방출 또는 합성을 억제하는데 효과적인 양으로 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 포유 동물 세포, 조직 또는 유기체에서 Aβ 펩티드의 방출 또는 합성을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물의, 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 베타-아밀로이드 펩티드 (Aβ)의 방출 또는 합성을 억제하기 위한 제약 조성물 제조에 있어 서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 비-아밀로이드원성 아밀로이드 전구 단백질 (α-APP) 분비형이 수준을 상승시키는데 효과적인 양으로 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 비-아밀로이드원성 아밀로이드 전구 단백질 (α-APP) 분비형의 수준을 상승시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물의, 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 비-아밀로이드원성 아밀로이드 전구 단백질 (α-APP) 분비형의 수준을 상승시키기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 뇌에서 Aβ 펩티드의 수준이 상승된 포유동물에서 Aβ 펩티드 수준을 감소시키는데 효과적인 양으로 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 뇌에서 Aβ 펩티드의 수준이 상승된 포유동물에서 Aβ 펩티드 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서 뇌에서 상승된 Aβ 펩티드의 수준은 고콜레스테롤혈증의 결과이다. 본 발명의 실시양태에서 뇌에서 상승된 Aβ 펩티드의 수준은 콜린성 기능저하의 결과이다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물의, 뇌에서 Aβ 펩티드의 수준이 상승된 포유동물의 뇌에서 Aβ 펩티드의 수준을 감소시키기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 아포지단백질 (ApoE)의 방출 또는 합성을 억제하는데 효과적인 양으로 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 ApoE의 합성 또는 방출을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물의, 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 ApoE 방출 또는 합성을 억제하기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다. 본 발명의 실시양태에서 ApoE는 ApoE4이다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 기하 이성질체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 아포지단백질 (ApoE) 수준을 감소시키는데 효과적인 양으로 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 ApoE 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물의, 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 ApoE 수준을 감소시키기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다. 본 발명의 실시양태에서 ApoE는 ApoE4이다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 tau 과인산화를 억제하는데 효과적으로 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 세포, 조직 또는 유 기체에서 tau 과인산화를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서 tau 과인산화는 Aβ-유도성 tau 과인산화이다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물의, 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 과인산화를 감소시키기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 tau 과인산화를 억제하는데 효과적으로 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 쌍을 이룬 나선 형태를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267 및 AF150(S), 또는 이들의 거울상이성질체, 라세미체, 부분입체이성질체, 호변이성질체, 기하 이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물의, 포유동물 세포에서 쌍을 이룬 나선 형태를 감소시키기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 거울상이성질체, 라세미체, 부분입체이성질체, 호변이성질 체, 기하 이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 Wnt 이상을 억제하는데 효과적으로 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 Wnt 신호 전달경로의 활성화 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체, 기하 이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물의, 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 Wnt 신호 전달경로를 활성화하기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체, 기하 이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 GSK3β-매개 효과를 억제하는데 효과적으로 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에서 GSK3β-매개 효과의 억제 방법을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서 GSK3β-매개 효과는 tau 과인산화, 아폽토시스, β-카테닌 분해 및 Wnt 표적 유전자의 감소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체, 기하 이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화 합물 또는 화합물들의 혼합물의, 포유동물에서 GSK3β-매개 효과를 억제하기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 방법은 Aβ 펩티드 유도성 상해 또는 Wnt 신호에 대한 산화 스트레스 고갈, 아폽토시스, 또는 세포 생존력에 대한 반응에서 사용된다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 단독으로 신경영양제로서 효과적인 양으로 및 세포내 내인성 성장 인자, 즉 뉴로트로핀과 상승작용적으로 작용하는 양으로 포유동물 세포, 조직 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 상기 뉴트로핀의 활성을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 단독으로 신경영양제로서 효과적이고 내인성 성장 인자, 즉 뉴로트로핀과 상승작용적으로 작용하는 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체, 기하 이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물의, 뉴로트로핀 활성의 증진을 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화 합물 또는 화합물들의 혼합물, 및 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 베타-아밀로이드 펩티드 (Aβ)의 방출 또는 합성의 억제, 비-아밀로이드원성 아밀로이드 전구 단백질 (α-APP) 분비형 수준의 상승, 뇌에서 Aβ 펩티드 수준이 상승된 포유동물의 뇌에서 Aβ 펩티드 수준의 감소, ApoE 방출 또는 합성의 억제, ApoE 수준의 감소, tau 과인산화의 감소, 쌍을 이룬 나선 형태의 감소, Wnt 신호 전달경로의 활성화, 베타-카테닌의 증가, GSK3β-매개 효과의 억제 또는 뉴로트로핀 활성의 증진을 위한 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 따른 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물; 및 콜린에스테라제 억제제, 니코틴성 아고니스트, 콜린성 전구체 및 콜린성 증진제, 뇌보약, 말초 항무스카린제, M2 무스카린성 길항제, M4 길항제, 벤조디아핀 역아고니스트, 항우울제, 파킨슨병 (PD) 또는 우울증 치료용 트리시클릭 항우울제 또는 항무스카린제, 항정신병제 및 항정신분열제, 글루타메이트 길항제 및 조절자, NMDA 길항제, AMPA 아고니스트, 아세틸-L-카르니틴, MAO-B 억제제, 펩티드 및 성장 인자, 콜레스테롤-저하제, 항산화제, GSK-3 β 억제제, Wnt-리간드, β- 또는 γ-세크레타제 억제제, 베타-아밀로이드 분해제, 베타-아밀로이드 항응집제, 킬레이트제, 베타-아밀로이드에 대한 면역치료용 화합물, 아밀로이드에 결합하는 화합물, 시클로옥시게나제 (COX)-2 억제제, 비-스테로이드성 항염증제, 에스트로겐제, 에스트로겐성 수용체 조절자, 스테로이드성 신경보호제 및 스핀 포착(spin trapping) 제약으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 약리학상 활성 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에서 상기 화합물은 AF292 또는 AF292의 프로드럭, 또는 이들의 제약상 허용가능한 염이다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 (a) AF267B, AF292, 및 AF704B로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물, 이들의 제약상 허용가능한 염, 또는 이러한 화합물 또는 염의 혼합물의 유효량, 및 (b) 베타-아밀로이드에 대한 면역치료용 화합물 및 아밀로이드에 결합하는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 대뇌 아밀로이드 혈관병증의 치료 또는 감소 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 (a) AF267B, AF292, 및 AF704B로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물, 이들의 제약상 허용가능한 염, 또는 이러한 화합물 또는 염의 혼합물의 유효량, 및 (b) 베타-아밀로이드에 대한 면역치료용 화합물 및 아밀로이드에 결합하는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 유효량, 및 이들을 위한 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 (a) AF267B, AF292, 및 AF704B로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물, 이들의 제약상 허용가능한 염, 또는 이러한 화합물 또는 염의 혼합물과, (b) 베타-아밀로이드에 대한 면역치료용 화합물 및 아밀로이드에 결합하는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물과의 배합물의, 대뇌 아밀로이드 혈관병증의 치료 또는 감소를 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을, 알쯔하이머 유형의 노인성 치매; 알쯔하이머병 (AD); 루이(Lewy) 소체 치매; 알쯔하이머병과 파킨슨병의 혼합 질환; 다발경색성 치매 (MID); 전측두엽 치매; 혈관성 치매; 졸중/허혈, 졸중/허혈/두부 손상과 조합된 MID; MID와 AD의 조합; 인간 두부 손상; 연령-연관성 기억 손상; 경증 인지 손상 (MCI); MCI가 원인이 되는 AD; (건망증, 급성 착란 장애, 주의력-결핍 장애, 초점 및 집중 장애를 비롯한) 인지 기능부전; 환각-편집 상태; 감정 및 주의력 장애; 수면 장애; 수술 후 섬망; 트리시클릭 항우울제의 역효과; 정신분열증 및 파킨슨병의 치료에 사용된 특정 약물의 역효과; 구강건조증, 건망성 실어증, 기억 상실 및(또는) 착란; 정신병; 정신분열증, AD와 조합된 정신분열증, 후기 발병 정신분열증, 망상분열증, 정신분열형 장애; 불안증; 양극성 장애; 조증; 기분 안정; 특정 신경교종 제거 후의 인지 손상; 지연 운동이상; 산소 요법시 산화 스트레스; 언어상실증; 뇌염후 기억상실 증후군; AIDS 치매; 루푸스, 다발성 경화증, 쉐그렌(Sjogren) 증후군, 만성 피로 증후군 및 섬유근육통을 비롯한 자가면역 질환에서의 기억 손상; 비정형 우울증 또는 정신분열증에서의 기억 손상; 동통, 류마티스, 관절염 및 말기 질병; 안구건조증, 질 건조증, 피부 건조증; 면역 기능부전; 신경분비 장애, 및 대식증 및 거식증 을 비롯한 음식 섭취 조절장애; 비만; 선천적 오르니틴 트랜스카르브아밀라제 결핍증; 올리브교소뇌 위축증; 알콜 금단 징후; 금단 징후를 비롯한 물질 남용 및 대체 요법; 헌팅톤(Huntington) 무도병; 진행성 상핵 마비; 픽(Pick)병; 프리드릭(Friedrick) 운동실조증; 질 드 라 뚜렛(Gilles de la Tourette) 질환; 다운 증후군; 녹내장; 노안; 위장관 운동 및 기능의 기능부전, 예를 들어 염증성 대장 질환, 과민성 대장 증후군, 설사, 변비, 위산 분비 및 궤양을 비롯한 자율신경계 장애; 급박성 요실금, 천식, COPD로 이루어진 군으로부터, 손상된 콜린성 기능과 연관된 질환 또는 콜린성 기능의 불균형이 존재하는 질환, 또는 아세틸콜린 수용체의 활성이 손상된 질환 중 하나를 치료하는데 효과적인 양으로 상기 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환에 걸린 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서 상기 화합물은 AF292 또는 AF292의 프로드럭, 또는 이들의 제약상 허용가능한 염이다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용가능한 염을, 뇌 아밀로이드-매개 장애; 글리코겐 신타제 키나제 (GSKβ)-매개 장애; tau 단백질 과인산화-매개 상해, 기능부전 또는 질환; CNS 및 PNS 고콜레스테롤혈증- 및(또는) 고지혈증-매개 상해, 기능부전 또는 질환; Wnt-매개 신호 이상; 신경가소성의 손상; 고혈당증; 당뇨병; 내인성 성장 인자-매개 질환, 또는 추가 위험 인자의 조합; 또는 아포지단백질 E를 포함하는 질환 상태; 또는 알쯔하이머 유형의 노인성 치매, 알쯔하이머병 (AD), AD 발생에 대한 위험에 있 는 환자에서 AD 징후의 발병 지연, 루이 소체 치매, 대뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 대뇌 아밀로이드증, 전측두엽 치매, 혈관성 치매, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 다발경색성 치매 (MID), 졸중 허혈, 졸중/허혈/두부 손상과 조합된 MID, MID와 알쯔하이머병의 조합, 인간 두부 손상, 연령-연관성 기억 손상, 경증 인지 손상 (MCI), MCI가 원인이 되는 AD, 양극성 장애, 조증, 정신분열증, 비정동성 정신분열증, 망상분열증, 면역 기능부전, 신경분비 장애, 및 대식증 및 거식증을 비롯한 음식 섭취 조절장애, 체중 조절, 비만, 염증을 비롯한, 콜린성 기능부전이 관련된 교란을 포함하는, 뇌, 신경계, 심혈관계, 면역계, 신경분비계, 위장관계 또는 내분비샘과 외분비샘, 눈, 각막, 폐, 전립선, 또는 콜린성 기능이 무스카린성 수용체 아형에 의해 매개되는 기타 기관 중 하나 이상에서의 기능부전으로 인한 중추 또는 말초 신경계 질환 상태 중 하나 이상을 치료하는데 효과적인 양으로 상기 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서 상기 화합물은 AF292 또는 AF292의 프로드럭, 또는 이들의 제약상 허용가능한 염이다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 화학식 (I)의 화합물, AF267B 및 AF150(S), 또는 이들의 거울상이성질체, 라세미체, 부분입체이성질체, 호변이성질체, 기하 이성질체 및 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물의 유효량을 AD, MCI, 루이 소체 치매, 전측두엽 치매, 혈관성 치매, 두부 손상에서의 기억 손상, AIDS 치매에 걸린 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 증상이 추가 악화되는 것의 억제하여 상기 환자들 을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에서 상기 화합물은 AF292 또는 AF292의 프로드럭, 또는 이들의 제약상 허용가능한 염이다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 AF267B, AF292, 이들의 제약상 허용가능한 염, 및 AF267B, AF292 또는 이들의 염의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 정신분열증을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 AF267B, AF292, 이들의 제약상 허용가능한 염, 또는 AF267B, AF292 또는 이들의 제약상 허용가능한 염의 혼합물의, 정신분열증 치료를 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 AF267B, AF292, 이들의 제약상 허용가능한 염, 또는 AF267B, AF292 또는 이들의 제약상 허용가능한 염의 혼합물, 및 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 정신분열증 치료용 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 AF267B, AF292, 이들의 제약상 허용가능한 염, 및 AF267B, AF292 또는 이들의 제약상 허용가능한 염의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 정신분열증 징후를 경감시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 AF267B, AF292, 이들의 제약상 허용가능한 염, 또는 AF267B, AF292 또는 이들의 제약상 허용가능한 염의 혼합물의, 정신 분열증 징후를 경감시키기 위한 제약 조성물 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태에 따라서는 또한 AF267B, AF292, 이들의 제약상 허용가능한 염, 및 AF267B, AF292 또는 이들의 제약상 허용가능한 염의 혼합물로부터 선택되는 화합물 및 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 정신분열증 징후를 경감시키기 위한 제약 조성물을 제공한다.
본 특허 출원에서, "알킬"은 1 내지 8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 분지쇄, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 등을 의미한다.
"알콕시"는 -O-알킬, 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시 등을 의미한다.
"알케닐"은 쇄에 하나 이상의 C-C 이중 결합을 보유하는 2 내지 8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 분지쇄를 의미한다.
"알키닐"은 쇄에 하나 이상의 C-C 삼중 결합을 보유하는 2 내지 8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 분지쇄를 의미한다.
"알킬티오"는 -S-알킬, 예를 들어 메틸티오, 에틸티오, 프로필티오, 이소프로필티오 등을 의미한다.
"시클로알킬"은 3 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 모노- 및 비시클릭 고리 구조를 의미한다. 시클로알킬의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 데칼리닐 및 노르보닐이다.
"아릴"은 5 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 모노- 또는 비시클릭 방향족 고리 구조를 의미한다. 아릴의 예는 페닐, 나프틸 및 벤질이다.
"헤테로시클릭"은 4 내지 12개의 탄소 원자 및 하나 이상의 질소, 산소 또는 황 원자를 함유하는 모노- 및 비시클릭 고리 구조를 의미한다.
"헤테로아릴"은 4 내지 12개의 탄소 원자 및 하나 이상의 질소, 산소 또는 황 원자를 함유하는 모노- 또는 비시클릭 방향족 고리 구조를 의미한다. 헤테로시클릭 및 헤테로아릴의 예는 인돌릴, 이소인돌릴, 3-피리디닐, 3-피페리디닐, 벤즈이미다졸릴, 티에닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 피라지닐, 벤조푸라닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 벤조티에닐, 이소벤조푸릴, 피라졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 퓨리닐, 카르바졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 이소옥사졸릴, 피롤릴, 피라졸릴, 퀴나졸리닐, 피리다지닐, 피라지닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴녹살리닐, 크산티닐, 하이포크산티닐, 및 프테리디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 푸릴, 피리딜, 피리미딜, 5-아자시티디닐, 5-아자우라실릴, 트리아졸로피리디닐, 이미다졸로피리디닐, 피롤로피리미디닐, 및 피라졸로-피리미디닐이다.
"할로겐 원자"는 불소, 염소, 브롬 및 요오드 중 하나일 수 있다.
달리 언급하지 않는다면, 하기 약어가 사용된다:
Aβ β-아밀로이드
AA 아라키돈산
AAMI 연령 연관성 기억 손상
ACh 아세틸콜린
AchE-Is 아세틸콜린스테라제 억제제
AD 알쯔하이머병
AGP 인간 α-당단백질
AGP α-당단백질
ApoE 아포지단백질
APP 아밀로이드 전구 단백질
AUC 곡선 하 면적
BDNF 뇌 유도성 성장 인자
bFGF 염기성 섬유아세포 성장 인자
CAA 대뇌 아밀로이드 혈관병증
CCh 카르바콜
CDX 메틸-β-시클로덱스트린
CE 충돌 에너지
CHI 폐쇄성 뇌 손상
CNS 중추 신경계
CSF 뇌척수액
DAPI 4,6-디아미디노-2-페닐인돌
DCC 디시클로헥실카르보디이미드
DDW 이차 증류수
DMF N,N-디메틸 포름아미드
DMAP 4-디메틸아미노피리딘
DMPU N,N'-디메틸-N,N'-프로필렌 우레아
ECG 심전도
EGF 상피 성장 인자
FACS 형광 활성 세포 분류기
FCS 소 태아 혈청
GC 기체 크로마토그래피
GSK3β 글리코겐 신타제 키나제
HERG 인간 에테르-아-고-고(ether-a-go-go) 관련 유전자
HPLC 고성능 액체 크로마토그래프
HS 말 혈청
HSA 인간 혈청 알부민
i.c.v., icv 뇌실내
i.p., ip 복강내
i.v., iv 정맥내
LBD 루이 소체 병
LC 액체 크로마토그래프
LDA 디-이소프로필아민
Li 리튬
M1 mAChR 1 무스카린성 수용체
mAChR 무스카린성 수용체
mCPBA m-클로로퍼벤조산
MCI 경증 인지 장애
MID 다발경색성 치매
MRSA 무스카린성 수용체 선택적 아고니스트 및 강력한 항산화제
MS 질량 분광계
MTBE 메틸-t-부틸 에테르
MTT 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리 움 브로마이드
MWM 모리스 물 미로
nbm 핵 기저 거대세포(nuclear basalis magnocellularis)
NFT 신경섬유 덩어리
NGF 신경 성장 인자
NMDA N-메틸-D-아스파테이트
NMR 핵 자기 공명
NOAEL 역효과 없는 수준
NSS 신경학상 심각성 수치
OXO-M 옥소트레모린-M
PA 수동 회피(passive avoidance)
PBS 인산염-완충화된 식염수
PD 파킨슨병
PHF 쌍을 이룬 나선 필라멘트
PI 포스포이노시티드
PKC 단백질 키나제 C
PMSF 페닐메틸술포닐플루오라이드
PNS 말초 신경계
po 경구로
PS-1 프레세닐린-1
PZ 피렌제핀
QNB 퀴누클리디닐 벤질레이트
REL 탈출 소요시간(escape latency)의 비율
RID 조사 지속의 비율
ROS 반응성 산화 물질
RPL 탈출 경로 거리의 비율
RSA 수용체 선택적 항산화제
s.c., sc 피하로
SDAT 알쯔하이머 유형의 노인성 치매
SDS-PAGE 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동
SMB 유사 유동층
TBI 외상성 뇌 손상
Tg 트랜스제닉
THF 테트라히드로푸란
투넬(TUNEL) 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라 제 (TdT) 매개된 dUTP 닉 엔드 표지화
A1 (인간); A2A (인간); A3 (인간) 아데노신 수용체 아형
AT1 (인간 재조합) 안지오텐신
BZD (중추) 벤조디아제핀
B2 (인간 재조합) 브래디키닌
CCKA (인간 재조합) (CCK1) 콜레시스토키닌
Dl (인간 재조합); D2S (인간 재조합) 도파민 수용체 아형
ETA (인간 재조합) 엔도텔린
GABA (비선택적) 감마-아미노부티르산
GAL2 (h) 갈라닌
IL-8B (인간 재조합) (CXCR2) 케모킨 수용체 아형
CCR1 (인간 재조합) 케모킨 수용체 아형
H1 (중추); H2 히스타민 수용체 아형
MC4 (인간 재조합) 멜라노코르틴
ML1 멜라토닌
NK2 (인간 재조합); NK3 (인간 재조합) 타키키닌
Y1 (인간); 뉴로펩티드, Y2 (인간) 뉴로펩티드
NTI (인간 재조합) (NTS1) 뉴로텐신
delta 2 (인간 재조합); (DOP); kapp 아편제 수용체 아형
(KOP); 아편제, mu (인간 재조합) (MOP)
ORL1 (인간 재조합) (NOP) 오르파닌
5-HT1A (인간 재조합); 5-HTIB; 세로토닌 아형
5-HT2A (인간 재조합); 5-HT3 (인간
재조합); 5-HT5A (인간 재조합) (5-ht5A);
5-HT6 (인간 재조합); 5-HT7 (인간)
sst (비선택적) 소마토스타틴
VIP1 (인간) (VPAC1) 혈관활성 장 펩티드
V1a (인간 재조합) 바소프레신
NE 수송자 (인간) 노르에피네프린
용어 "기하 이성질체"는 이중 결합을 통한 이성질체, 예를 들어 시스/트랜스 이성질체 및 E/Z 이성질체 뿐만 아니라 형상 이성질체, 예를 들어 신/안티 이성질체를 의미한다.
용어 "제약상 허용가능한 부가 염"은 제약 실습에 허용가능한 당업계에 공지 된 염, 예를 들면 염산 염, 말레산 염 및 시트르산 염과 같은 산 부가 염을 의미한다. 제약상 허용가능한 산 부가 염으로는 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등과 같은 무기산으로부터 유도된 염 뿐만 아니라 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 알칸디오산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등과 같은 유기산으로부터 유도된 염이 포함된다. 따라서, 이러한 염으로는 술페이트, 피로술페이트, 비술페이트, 술파이트, 비술파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모도히드로겐포스페이트, 디히드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 카프릴레이트, 이소부티레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 만델레이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 프탈레이트, 벤젠술포네이트, 톨루엔술포네이트, 페닐아세테이트, 시트레이트, 락테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 메탄술포네이트 등이 포함된다. 또한, 아르기네이트, 글루코네이트, 갈락투로네이트 등과 같은 아미노산의 염도 고려되며; 예를 들면, 문헌 [Berge et al., "Pharmaceutical Salts," J. of Pharmaceutical Science, 1977; 66: 1-19]를 참조한다.
염기성 화합물의 산 부가 염은 통상적인 방식으로 염을 제조하기 위해서 유리 염기 형태를 충분한 양의 원하는 산과 접촉시킴으로써 제조한다. 유리 염기 형태는 염 형태를 염기와 접촉시키고 통상적인 방식으로 유리 염기를 단리함으로써 재생시킬 수 있다. 유리 염기 형태는 극성 용매에서의 용해도와 같은 특정한 물성 면에서 그들 각각의 염 형태와 다소 상이하나, 이와는 달리, 본 발명의 목적상 염은 그들 각각의 유리 염기와 동일하다.
제약상 허용가능한 염기 부가 염은 금속 또는 아민, 예를 들어 알칼리 및 알칼리성 토금속 수산화물 또는 유기 아민과 형성된다. 양이온으로서 사용되는 금속의 예는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등이다. 적합한 아민의 예는 N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민 및 프로카인이고, 예를 들면, 문헌 [Berge et al., 상기 문헌, 1977]을 참조한다.
산성 화합물의 염기 부가 염은 통상적인 방식으로 염을 제조하기 위해서 유리 산 형태를 충분한 양의 원하는 염기와 접촉시킴으로써 제조한다. 유리 산 형태는 염 형태를 산과 접촉시키고 통상적인 방식으로 유리 산을 단리함으로써 재생시킬 수 있다. 유리 산 형태는 극성 용매에서의 용해도와 같은 특정한 물성 면에서 그들 각각의 염 형태와 다소 상이하나, 이와는 달리, 본 발명의 목적상 염은 그들 각각의 유리 산과 동일하다.
용어 "대사물질"은 화합물의 투여된 형태에서의 신체의 작용에 의해 인간 또는 동물 신체에서 수득되는 화합물의 형태를 의미하며, 예를 들면 메틸화된 화합물의 투여 후 메틸화된 화합물에 대한 신체의 작용의 결과 신체에서 수득되는 메틸기를 보유하는 화합물의 탈메틸화된 유사체를 의미한다. 대사물질은 그 자체로 생물학적 활성을 가질 수 있다.
용어 "프로드럭"은 인간 또는 동물 신체에 투여된 후 이들 신체내에서 생물 학적 활성을 갖는 상이한 화합물로 화학적으로 또는 생화학적으로 전환되는 화합물의 형태를 의미한다. 화합물의 프로드럭 형태는 그 자체로 생물학적 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 실시양태의 신규 화합물 및 본 발명의 실시양태에 따라 사용될 수 있는 화합물은 하나 이상의 키랄 중심을 가질 수 있고, 따라서 거울상이성질체 또는 거울상이성질체의 혼합물 (예컨대, 라세미 혼합물)로서 존재할 수 있다. 화합물이 2개 이상의 키랄 중심을 보유하는 경우, 이들은 또한 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서는, 제약 조성물 및 제약 조성물의 제조에서의 특정 화합물의 용도를 제공한다. 이러한 조성물은 경구로 적합한 형태 (예를 들어 캡슐제, 정제, 과립제, 산제 또는 비드의 형태), 직장, 비경구, 정맥내, 피내, 피하, 경피 또는 국소 투여에 적합한 형태 또는 취입 또는 비측 분무에 의한 투여, 이온영동법, 협측 또는 설하 설측 투여에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 단위 투여 형태일 수 있다. AF267B 또는 AF150(S)를 사용할 수 있는 상기 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 단위 투여량 내에 약 0.5 내지 약 100 mg 범위의 양으로 존재할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 화합물은 약 5 내지 약 100 mg의 양으로 존재한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 화합물은 약 10 내지 약 50 mg의 양으로 존재한다. 상기 양은 단일 용량 또는 1일 2 내지 4회 투여하기 위한 2 내지 4개의 개별 용량의 총량을 나타낼 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 지속 방출형이다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 어떤 화합물들은 비용매화 형태 뿐 아니라 수화 형태를 비롯한 용매화 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 수화 형태를 비롯한 용매화 형태는 비용매화 형태와 동등하며, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
화합물 AF150(S) 및 AF267B는 U.S. 5852029호에 기재되어 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 화합물은 항산화 활성을 갖는다. 이러한 항산화 활성은 N-옥시드가 있는 화합물, 예를 들어 AF600으로 인한 것일 수 있거나, 4-위치 질소에서 연결된 항산화 잔기를 갖는 화합물로 인한 것일 수 있다.
당업자는 많은 인자들, 예를 들어 의도된 목적을 위한 유효성, 안전성, 가능한 부작용 및 치료적 인덱스가 임상 요법에 적용하기 위한 임의의 화합물의 선별에 영향을 줌을 인식할 것이다. 따라서, 당업자는 3급 질소 원자를 갖는 본 발명의 화합물로부터 구조적으로 유도된 "제약상 허용가능한 4급 화합물"이란 표현 (이 표현은 본 명세서 및 청구항에서 사용됨)을 해석하는 방법을 인식할 것이다.
본 발명의 실시양태에 사용된 화합물은 광범위한 경구 및 비경구 투여 형태로 제조하고 투여할 수 있다. 따라서, 사용된 화합물은 주사로, 즉, 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 십이지장내 또는 복강내로 투여할 수 있다. 또한, 화합물은 흡입으로, 예를 들어 비강내로 투여할 수 있다. 추가로, 화합물은 경피로 투여할 수 있다. 당업자는 하기 투여 형태가 본 발명의 실시양태에 따라 임의로는 또한 AF267B 또는 AF150(S)와 함께 존재하는 화학식 (I)의 화합물 또는 화학식 (I)의 화합물의 상응하는 제약상 허용가능한 염을 활성 성분로서 포함할 수 있음을 인식할 것이다.
임의로 또한 AF267B 또는 AF150(S)를 비롯한 화학식 (I)의 화합물로부터 제약 조성물을 제조하기 위해, 제약상 허용가능한 담체가 고체 또는 액체 중 하나일 수 있다. 고체형 제제로는 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 카세제, 좌제, 및 분산가능한 과립제가 포함된다. 고체 담체는 희석제, 향미제, 결합제, 보존제, 정제 붕해제, 또는 캡슐화 물질로서 작용할 수도 있는 하나 이상의 재료일 수 있다.
산제에서, 담체는 미분된 활성 성분과의 혼합물로 존재하는 미분된 고체이다. 정제에서, 활성 성분 또는 성분들은 필요한 결합성을 갖는 담체와 적합한 비율로 혼합되어, 원하는 형태 및 크기로 압착된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 산제 및 정제는 활성 화합물 5 또는 10 내지 약 70％를 함유한다. 적합한 담체로는 탄산마그네슘, 스테아르산마그네슘, 탈크, 당, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 저융점 왁스, 코코아 버터 등이 포함된다. 용어 "제제"는 다른 담체와 함께 또는 다른 담체 없이 활성 성분이 담체로 둘러싸여져서, 담체와 회합된 캡슐제를 제공하며, 담체로서 캡슐화 물질과 활성 화합물의 배합물을 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 카세제 및 로젠지제가 포함된다. 정제, 산제, 캡슐제, 환제, 카세제 및 로젠지제는 경구 투여에 적합한 고체 투여 형태로서 사용할 수 있다.
좌제를 제조하기 위해, 지방산 글리세리드 또는 코코아 버터의 혼합물과 같은 저융점 왁스를 먼저 용융시키고, 활성 성분을 교반 등으로 균질하게 여기에 분 산시킨다. 이어서, 용융된 균질 혼합물을 통상적 크기의 주형에 붓고, 냉각시킴으로써 고체화한다.
액체형 제제로는 용액제, 현탁제 및 에멀젼제, 예를 들어 물 또는 물 프로필렌 글리콜 용액이 포함된다. 비경구 주사를 위해, 액체 제제는 수성 폴리에틸렌 글리콜 용액 중의 용액으로 제형화될 수 있다.
원하는 바에 따라, 활성 성분을 물에 용해시키고 적합한 색소, 향료, 안정화제 및 증점제를 첨가함으로써 경구로 사용하기에 적합한 수용액을 제조할 수 있다.
미분된 활성 성분을 점성 물질, 예를 들어 천연 또는 합성 검, 수지, 메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및 기타 공지된 현탁화제와 함께 물에 현탁시킴으로써, 경구로 사용하기에 적합한 수성 현탁액을 제조할 수 있다.
또한, 사용 직전에 경구 투여용 액체형 제제로 전환되도록 의도되는 고체형 제제도 포함된다. 이러한 액체 형태로는 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다. 상기 제제는 활성 성분 이외에, 색소, 향료, 안정화제, 완충제, 인공 및 천연 감미료, 분산제, 증점제, 가용화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 제제는 단위 투여 형태이다. 이러한 형태에서, 제제는 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 용량으로 하위분할된다. 단위 투여 형태는 포장된 제제, 분리된 양의 제제를 함유하는 포장물, 예를 들어 패킷화된 정제, 캡슐제, 및 바이알 또는 앰플 내의 산제일 수 있다. 또한, 단위 투여 형태는 캡슐제, 정제, 카세제, 또는 로젠지제 자체일 수 있거나, 포장된 형태 내의 이들 중 임의의 적절한 수일 수 있다.
단위 용량 제제 중의 활성 성분의 양은 상기 언급한 바와 같이, 특별한 적용 및 활성 성분의 강도에 따라 변화되거나 조정될 수 있다. 원한다면, 조성물은 다른 상용성 치료제를 함유할 수도 있다.
치료 용도에 있어서, 본 발명의 실시양태에 따라 사용되는 화합물은 1일 약 0.01 mg 내지 약 100 mg/kg의 초기 투여량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 약 0.01 mg 내지 약 10 mg/kg 범위의 1일 용량이 사용된다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 10 내지 50 mg/kg 범위의 1일 용량이 사용된다. 그러나, 상기 투여량은 환자의 요구사항, 치료할 상태의 중증도 및 사용할 화합물 또는 화합물들에 따라 달라질 수 있다. 특별한 상황에 대한 적절한 투여량의 결정은 당업계의 기술 내에 있다. 일반적으로, 화합물의 최적 용량 미만인 소량의 투여량으로 치료를 시작한다. 그 후, 그 상황 하의 최적 효과에 도달할 때까지 투여량을 조금씩 증가시킨다. 편리함을 위해, 원한다면 1일 총 투여량을 분할하여 하루동안 조금씩 투여할 수 있다.
본 발명의 화합물을 제조하기 위해 사용되는 방법으로는 5-원 고리의 형성, 고리-치환, 고리 포화/불포화의 정도 변화, 염 및 염기의 상호전환, 4급 염 형성 등에 대해 유기 화학자에게 본질적으로 공지된 방법들이 포함된다. 상기 합성 방법에서, 출발 물질은 키랄 중심을 함유할 수 있고, 라세미 출발 물질을 사용하는 경우, 생성된 생성물은 R, S 거울상이성질체의 혼합물이다. 별법으로, 출발 물질의 키랄 이성질체를 사용할 수 있고, 사용된 반응 프로토콜이 상기 출발 물질을 라세미화하지 않는다면, 키랄 생성물이 수득된다. 이러한 반응 프로토콜은 합성 중 키랄 중심의 역전을 포함할 수 있다. 선택된 화학식 (I)의 화합물은 E 및 Z (니트론에서) 및 거울상이성질체와 같은 기하 이성질체를 비롯한 다수의 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 상기 입체이성질체 형태 각각, 및 (라세미체를 비롯한) 이들의 혼합물을 포함한다. 상이한 입체이성질체 형태는 통상의 방법으로 서로 분리할 수 있거나, 입체특이적 또는 비대칭적 합성으로 임의의 주어진 이성질체를 수득할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 특정 화합물의 예시적인 제조 방법을 기재할 것이지만, 당업자에 의해 공지될 것과 같은 다른 방법도 또한 화합물을 제조하기 위해 사용할 수 있음을 인식할 것이다.
예를 들면, 5-원 고리가 티아졸리딘-3'-온 고리인 경우, 화합물은 상응하는 N-헤테로시클릭 케톤을 2-머캅토 카르복실산 [R1CH(SH)C02H] 및 암모니아와 반응시킴으로써 상기 고리를 형성하여 제조할 수 있고, 생성물에서의 4-N 원자는 공지된 방식으로 치환시킬 수 있다. 상기 반응은 하기 반응식 1에서와 같이 예시될 수 있고, 여기서 N-헤테로시클릭 케톤은 예를 들어 1-메틸피페리딘-4-온이다.
Figure 112004050635939-pct00012
"R5-(이탈기)"에서의 이탈기는 예를 들어 브로마이드 또는 클로라이드일 수 있다. 구조 (B)를 수득하기 위한 상기 치환 반응은 본질적으로 공지된 조건하에서, 예를 들어 리튬 디-이소프로필아민 (LDA)과 같은 알칼리의 존재하에 (A)를 반응시키고 테트라히드로푸란 (THF)과 같은 용매를 사용하여 수행할 수 있다.
화합물 구조 (A) 또는 화합물 구조 (B)는 키랄 HPLC로 2개의 거울상이성질체로 분리할 수 있고, 예를 들면 AF267 (R1=Et, R5=H)의 키랄 예비 액체 크로마토그래프 (LC) 분리로 AF267A [R1=(R)Et, R5=H] 및 활성 거울상이성질체 AF267B [R1=(S)Et, R5=H]를 수득하였다. 대규모 비용-효과적 방법이 개발되었고, 각 거울상이성질체의 최대 50％ 수율을 얻을 수 있었다 (각 거울상이성질체의 수율 > 97％, ee > 99％ 및 HPLC 순도 > 99％).
상기 방법은 마쪼티(Mazzoti) 등에 의해 규정된 바와 같은 (Proceedings of Chiral Europe 96 Symp, Spring Innovations, Stockport UK, p 103, 1996) 키랄 분리를 위한 유사 유동층 (SMB) 기술을 이용하여, 당업자를 위한 훨씬 더욱 실제적인 분리를 위해 추가로 확장될 수 있다.
AF267B는 또한 화학 수단, 예를 들어 염기-촉매반응, 또는 효소-촉매반응 이후의 키랄 HPLC 또는 SMB 분리에 의한 AF267A의 라세미화로 제조할 수 있다.
구조 (B)는 상응하는 N-헤테로시클릭 케톤을 2-머캅토 산 [R1CH(SH)CO2H] 및 1급 아민과 반응시켜 제조할 수 있다. 상기 반응은 하기 반응식 2에서와 같이 예시될 수 있고, 여기서 N-헤테로시클릭 케톤은 예를 들어 1-메틸피페리딘-4-온이다:
Figure 112004050635939-pct00013
구조 (B)는 또한 하기 반응식 3에 기재된 바와 같이, 아미드 결합을 수득하기 위한 조건 하에서 (A)를 반응시켜 수득할 수 있고, 여기서 반응하는 산은 예를 들어 3-인돌프로피온산이다:
Figure 112004050635939-pct00014
구조 (A) 또는 구조 (B)에서의 R1기는 표준 조건하에서 2-비치환된 화합물 (A) 또는 (B)를 알킬 할라이드 또는 알킬 알데히드와 반응시켜 수득하여, 2-위치에서의 치환에 영향을 줄 수 있다. 상기 반응은 하기 반응식 4에서와 같이 예시될 수 있다:
Figure 112004050635939-pct00015
상기 방법은 AF267의 14C-표지화에 적용할 수 있다. 쉽게 이용가능한 N-보호된 AF277 (AF287)을 14C-표지된 에틸 브로마이드로 알킬화하여 에틸 잔기를 도입하고, 그 이후 보호기를 제거하여 AF267의 14C-표지물을 수득한다. 13C가 풍부한 AF267을 제조하기 위해 유사하게 사용할 수 있는 합성 경로를 하기 반응식 5에 기재한다:
Figure 112004050635939-pct00016
구조 (A) 및 구조 (B)에서의 1-메틸기는 반응식 6에 나타낸 바와 같이, m-클로로퍼벤조산/FeCl2 또는 페닐클로로포르메이트와 같은 탈메틸화제와의 반응으로 제거할 수 있다:
Figure 112004050635939-pct00017
AF504 또는 AF292는 또한 상응하는 N-헤테로시클릭 케톤을 2-머캅토카르복실산 [R1CH(SH)CO2H] 및 1급 아민과 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 상기 반응은 반응식 7에서와 같이 예시될 수 있고, 여기서 N-헤테로시클릭 케톤은 N-BOC-피페리딘 -4-온 (BOC = tert-부톡시카르보닐)이다:
Figure 112004050635939-pct00018
또한, 구조 (A) 또는 (B)의 입체특이적 합성은 상응하는 N-헤테로시클릭 케톤을 적절한 2-머캅토카르복실산과 반응시켜 얻을 수 있고, 예를 들면, 반응식 8에 나타낸 바와 같이 1-메틸피페리딘-4-온을 (S)-2-머캅토부티르산 및 NH3과 반응시키는 경우, AF267B가 수득된다 [(S) 형상은 AF267B의 x-선 결정학을 기준으로 함]:
Figure 112004050635939-pct00019
(S)-2-머캅토부티르산은 시판되거나, (R)-브로모부티르산으로부터 제조된다. 상기 반응은 하기 반응식 9에서와 같이 예시될 수 있다:
Figure 112004050635939-pct00020
화합물 (A)를 과산화수소 또는 m-클로로퍼벤조산과 같은 산화제와 반응시킨 경우, 구조 (D) 또는 구조 (E)를 반응식 10에 나타낸 바와 같이 수득한다:
Figure 112004050635939-pct00021
구조 (A) 또는 (B)의 티오 유사체는 예를 들면 반응식 11에 나타낸 바와 같이, 일반적으로 구조 (A)에서의 상응하는 티아졸리디논 고리를 라우슨 시약으로 반응시켜 수득할 수 있다:
Figure 112004050635939-pct00022
동일한 분자 내에 본질적으로 2개의 리간드를 함유하는 2가 화합물은 동일한 조건 하에서 상응하는 화합물 구조 (A)를 스페이서와 반응시킴으로써 수득하여, 상기 기재한 바와 같은 화합물 구조 (B)를 수득할 수 있다. 스페이서-(이탈기)는 예를 들어 알칸디할라이드, 알칸디올, 알칸디산, 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 상기 반응은 하기 반응식 12에서와 같이 예시될 수 있다:
Figure 112004050635939-pct00023
N-포스포노옥시메틸 프로드럭은 문헌 [Krise et al, J Med. Chem. 42: 3094-3100 (1999)]에 보고되었다. 하기 나타낸 바와 같이, N-포스포노옥시메틸의 이러한 잔기는 또한 3급 아민-함유 화합물 (B)의 수용성을 개선시키기 위한 프로드럭 (H)의 합성에 사용할 수 있다. 화합물 구조 (B)에서의 3급 아민은 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트와 친핵 치환 반응하여 4급 암모늄 포스페이트로 보호된 프로드럭을 형성한다. 반응식 13에 나타낸 바와 같이, 3급 부틸기의 제거 후에 프로 드럭의 유리 산 형태를 수득한다:
Figure 112004050635939-pct00024
유형 (I) 및 (J)의 화합물인 니트론은 스피로-케톤을 알킬 히드록실 아민 또는 아릴 히드록실 아민과 반응시켜 제조할 수 있다. 상기 반응은 하기 반응식 14A 및 14B에서와 같이 예시될 수 있다:
Figure 112004050635939-pct00025
Figure 112004050635939-pct00026
별법으로, 구조 (I)은 5-원 고리 카르보닐을 알킬 히드록실 아민 또는 아릴 히드록실 아민과 반응시켜 제조할 수 있다. 생성된 니트론을 고리화하여 스피로 구조를 형성한다.
AF150(S)로 지칭되는 화학식
Figure 112004050635939-pct00027
의 화합물은 미국 특허 제5,407,938호에 기재되어 있다. 그러나, 상기 화합물의 합성은 본 발명에 이르러 개선되었다. 개선된 합성법을 하기 반응식 15에 기재한다:
Figure 112004050635939-pct00028
AF150(S)는 4-피콜릴아민을 아세트산 무수물/메틸 요오다이드와 반응시킨 후, 라우슨 시약과 반응시켜 수득하였다. 수득한 티오피리디늄 요오다이드를 환원시켜 티오아세틸아미노-테트라히드로피리딘을 수득하고, 이를 고리화하여 AF150(S)를 형성하였다.
유리 염기로서 제조하는 경우, AF150(S)는 무색의 액체이다. 유리 염기는 진공 건조하에 암소에서 벌크 물질로서 차갑게 (-20 내지 0℃) 저장할 수 있다. AF150(S)는 염으로서 수득할 수도 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 시트르산을 사용하여 궁극적으로 대규모 생산에 사용할 수 있는 안정한 염을 수득한다. 2-프 로판올 및 테트라히드로푸란 용액 중에서 AF150(S) 유리 염기를 시트르산과 혼합함으로써 AF150(S)의 백색 결정질 시트르산 염을 제조하였다. 유리 염기에 비해, 염은 (a) 고온에서조차 발색이 없고 (가속화된 안정성 시험), (b) 벌크를 무수 조건하에 유지하는 경우 고온에서도 높은 안정성을 나타낸다 (가속화된 안정성 시험).
본 발명의 다른 실시양태에서, AF150(S)는 제약상 허용가능한 파라핀 오일로 제공된다. 파라핀 오일 중 10％ w/w AF150(S)의 안정성은 40℃에서, 대기 또는 질소 분위기하에서 및 토코페롤의 존재 또는 부재하에서 검사하였다. 0.1％ 이상의 분해 생성물은 검출되지 않았다. 토코페롤을 함유하지 않는 샘플에서 미황색이 관찰되었으나, AF150(S) 내에 0.5％ w/w 토코페롤을 함유하는 샘플에서는 발색되지 않았다.
반응식 16에 나타낸 바와 같이, AF150(S)에서의 N-메틸기는 m-클로로퍼벤조산/FeCl2와 반응시켜 제거할 수 있음을 알 수 있다:
Figure 112004050635939-pct00029
AF150(S)를 m-클로로퍼벤조산과 같은 산화제와 반응시키는 경우, 하기 AF406이 수득된다:
Figure 112004050635939-pct00030
.
AF150(S)의 합성 반응식에 따라, 합성의 제1 단계에서 요오도메탄 대신에 d3-요오도메탄을 사용하여 AF150(S), AF402의 14C-표지화에 대한 냉각 모의실험물을 수득하였다. AF402의 합성을 하기 반응식 17에 기재한다:
Figure 112004050635939-pct00031
상기 설명과 반대로, 본 발명의 예시적 화합물은 피페리딘 및 퀴누클리딘 고리를 나타내고, 그러므로 도시된 스피로 5-원 고리와의 스피로-형상에 적합한 다른 임의의 질소-함유 헤테로시클릭 고리는 치환될 수 있음을 이해해야 한다. 3- 또는 4-피페리돈의 사용과 유사하게, 상응하는 케톤을 이용하여 이러한 화합물을 제조하여 상기 나타낸 화합물을 수득할 수 있다. 유사한 의견이 실제적인 실시예에 적용되며, 본 실시예는 단지 예시적일 뿐, 제한적이지 않다.
이제 본 발명을 하기 비제한적인 실시예로 예시할 것이다.
실시예 1
(S)-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온의 합성
Figure 112004050635939-pct00032
단계 1: 2-머캅토부티르산의 합성
2-브로모부티르산 (3.2 kg, 19.16 mol)을 냉각된 (빙수 조) 플라스크에 도입시켰다. 이를 교반하고, 온도를 30 내지 40℃에서 유지시키면서 수성 수산화칼륨 (18.2 mol)을 점차적으로 첨가하였다 (0.5시간). 냉각을 중단하고, 온도가 50℃를 초과하지 않도록, 칼륨 O-에틸디티오카르보네이트 (3.48 kg, 21.7 mol)를 조금씩 첨가하였다 (0.5시간). 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반한 후, 15 내지 20℃로 냉각하였다 (빙수 조). 온도를 45 내지 55℃에서 유지시키면서 (외부 냉각), 에틸렌디아민 (2.6 L, ~39 mol)을 20분의 기간 동안 첨가하였다. 생성된 현탁액을 50℃에서 2시간 동안 교반하고, 20℃로 냉각시키고 여과하고, 고체를 2 x 1.5 L 온수 (40 내지 50℃)로 세척하였다. 수성 여액 및 세척물을 합하고, 20℃ 미만으로 냉각시키고 (빙수 조), 온도를 45 내지 55℃에서 유지시키면서 수성 황산 [5.2 L, 50％ (w/w)]을 서서히 첨가하였다 (0.5시간, pH = 2까지). 용액을 30℃로 냉각시키고, 기계 교반기가 장착된 25 L 들이 용기로 옮겼다. 메틸-t-부틸 에테르 (MTBE, 3 L)를 첨가하고, 혼합물을 교반하고 밤새 실온에서 방치하였다. 상부 오일상을 분리하고, 하부 수성상을 감압하에 여과하여 형성된 침전물을 제거하였다. 수성상을 MTBE로 추출하고, 추출물을 합하고, MTBE를 제거하였다. 오일성 잔류물을 시클로헥산 (5 L)에 용해시키고, 밤새 냉장고에 두었다. 하부 상이 형성되었다. 이를 분리하고, 시클로헥산으로 추출하였다. 시클로헥산 추출물을 상부 상과 합하고, 시클로헥산을 제거하고, 2-머캅토부티르산 (조물질)을 진공중에 (54℃/2 mmHg) 건조하여 2-머캅토부티르산 (2.18 kg, 18.16 mol)을 수득하였다.
단계 2: AF267 (라세미체)의 합성
2-머캅토부티르산 (705 g, 5.88 mol) 및 시클로헥산/tert-부틸 알콜의 혼합물 (1:3.5 (w/w), 4.3 L)을 플라스크에 도입시켰다. 수득된 용액을 교반하고 40 내지 60℃로 가열하였다. 2-머캅토부티르산의 전부 또는 대부분이 그의 암모늄 염으로 전환될 때까지, 기체 암모니아를 용액을 통해 버블링하였다. 암모니아의 버블링을 중단하고, 반응 혼합물을 환류 가열하고, 시클로헥산/tert-부틸 알콜 혼합물 (500 ml) 중 1-메틸-4-피페리돈 (496 g, 4.39 mol)의 용액을 첨가하였다. 1시간 후, 용액은 투명하게 되고, 암모니아의 버블링을 다시 시작하고, 13시간 후에 (피페리돈의 첨가 및 반응 시간 후에) 반응 혼합물을 냉각시키고 밤새 실온에서 방치하였다. 농축된 수성 산 (1 부피)을 물 (2 부피) (960 ml)로 희석하여 제조한 염산 용액을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 수득된 용액 (pH ~2 내지 3)을 25℃로 냉각시키고, 하부 수성상을 분리하고, 수성 수산화칼륨으로 염기성으로 만든 후 (pH ~8.5 내지 9), 밤새 실온에서 방치하였다. 침전된 생성물을 여 과하고 냉수 (100 ml)로 세척하여 습윤한 분말을 수득하였다. 여액을 pH 9로 염기성화하고, 밤새 5℃에서 방치하고, 여과하고, 냉수 50 ml로 세척하여 분말 72 g을 수득하였다. 동일한 절차를 반복하여 AF267의 제2 배치를 합성하였다 (1.2의 인자를 곱함). 단체들을 합하여 습윤한 생성물 1.6 kg을 수득하였다. 합한 조 생성물을 열수 (95℃) 4.5 L에 용해시키고 여과하고, 투명한 용액을 실온에서 10시간 동안 방치하고, 여과하고 24시간 동안 건조하여 (50℃, 1 mmHg) AF267 (1.048 kg, 50.7％ 수율)을 수득하였다. 여액을 농축하고, 밤새 5℃에서 냉각시키고 여과하고 세척하고 (100 ml 냉수) 건조하여 AF267 (215 g, 10.4％ 수율)을 수득하였다. AF267 총 수율: 61％.
Figure 112004050635939-pct00033
단계 3: AF267B 및 AF267A의 키랄 분리
프로콤(Prochom) LC 110 고성능 예비 액체 크로마토그래프
컬럼: 키랄팍(CHIRALPAK) (등록상표) ASV (로트 번호 JG 001)
펌프 유속: 500 ml/분
압력: 12.7 bar
컬럼 온도 26℃
이동상: 아세토니트릴/EtOH 85:15
농도: 37 gr/L
UV 검출: 240/230 nm
용출 후, 용출액을 건조물로 증발시켰다.
첫번째 용출된 거울상이성질체 (AF267A): ee: 99.7 (687.1 gr; 순도 99.3％; 수율: 97％)
두번째 용출된 거울상이성질체 (AF267B): ee: 99.8 (694.9 gr; 99.9％; 수율: 98％).
에탄올을 추가로 첨가하고 건조물로 증발시켜 잔류 용매 (예를 들어, 아세토니트릴)를 제거하였다.
유사한 합성법으로, AF292 및 기타 관련 화합물을 제조하였다.
실시예 2:
(S)-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4,5]데칸-3-온 (AF267B)의 x-선 단일 결정 구조 분석
결정 데이타: C10H18N2OS + H2O (일수화물), 투명, 밝은 황색, 프리즘, 결정 크기 0.2 x 0.2 x 0.4 mm3; 결정 시스템, 직방정계, 공간 군: P212121 (No 16) a = 10.394 (10) (α= 90°), b = 20.133 (2) (β= 90°), c = 5.856 (4) (γ= 90°), Å, 25 반사로부터, T = 11O K, 부피 = 1224.2 (9) Å3, Z = 4, Fw = 202.32, 계산된 밀도, Dc = 1.092 Mg/m3, 흡광 계수, μ= 0.232 mm-1.
데이타 수집 및 처리: 리가쿠(Rigaku) AFC5R 4-서클 회절분석기, MoKα, 흑연 단색화장치 (λ= 0.71073 Å), 11461 반사를 수집함, 데이타 수집에 대한 쎄타 범위: 2.82°≤θ≤27.53°; 인덱스 범위: -13 ≤h ≤13, -26 ≤k ≤26, 0 ≤l ≤7, ω스캔 방법, 스캔 폭 = 1.2°, 스캔 속도 2°/분, 전형적인 반-높이 피크 폭 = 0.45°, 강도의 3％ 변화가 있는 각각 62회 수집된 3 표준; 수집된 반사: 6272 측정, 2833 독립적 반사 [R (int) = 0.0604, 비욥(Bijvoet) 반사가 분리되어 유지됨].
해석 및 정련(refinement): 직접적 방법 (SHELXS-97)으로 해석된 구조. F2를 기준으로 전체-매트릭스 최소-자승 정련 (SHELXL-97). 이상적인 수소를 놓고, 라이딩(riding) 방식으로 정련하고, 차이점으로부터 물 수소를 발견하였다, 포리어(Fourier) 맵, 148 파라미터; 최종 R 인덱스: I > 2 시그마 (I)인 데이타에 대해 R1 = 0.0671 (F2를 기준으로) wR2 = 0.1484 및 모든 데이타에 대해 R1 = 0.0747, wR2 = 0.1553, F2에서의 적합도(goodness-of-fit) = 1.13, S 원자 주위에서 최대 전자 밀도 = 0.745 e/-3.
절대적 형상: 플래크(Flack) 파라미터 접근법 및 거울상이성질체 쌍둥이 성분의 별법의 정련을 이용하여 분자의 절대적 형상을 결정하였다. 두 방법 모두 상기 대등물이 올바른 절대적 형상 (S 거울상이성질체)을 갖는다는 것을 명백하게 보여준다. 상기 화합물의 결정은 톨루엔/석유 에테르/메탄올에서의 결정화로부터 제 조하였다.
Figure 112010040036020-pct00088
실시예 3:
(R)-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF267A)의 키랄 합성
Figure 112004050635939-pct00035
AF267의 합성에서 광학 활성 2-머캅토부티르산을 이용함으로써 S 거울상이성질체의 합성을 설계하기 위하여 AF267A의 비대칭 합성을 수행하였다. S 형상을 갖는 L-(+)-2-아미노부티르산 (I)으로부터 출발하여 광학 활성 2-머캅토부티르산을 합성하였다. 아미노산을 아질산나트륨, 브롬화칼륨 및 브롬화수소산으로 처리함으로써 형상을 보유한 (S)-2-브로모부티르산 (II)으로 전환시켰다. 수득된 브롬화물 의 거울상이성질체적 순도를 (R)-(+)-N-벤질-α-메틸-벤질아민의 존재하에 측정된 양성자 NMR로 점검하고, 동일한 조건에서 측정된 라세미체 브롬화물의 스펙트럼과 비교하였다. 상기 방법으로 오직 하나의 거울상이성질체의 존재가 검출되었다. DMF 중의 세슘 티오벤조에이트로 처리하여 브롬화물을 (R)-2-벤조일티오부티르산 (III) (형상 역전)으로 전환시켰다. 아미노분해 (실온에서 1 N 수산화암모늄)에 의해 라세미화 없이 (III)의 탈벤조일화를 달성하였다.
수득된 (R)-2-머캅토부티르산을 증류로 정제한 후, 끓는 시클로헥산 중에서 아세트산암모늄 및 1-메틸-4-피페리돈과 반응시켰다. 조 반응 혼합물을 키랄 컬럼상에서 GC로 분석하여, 소량의 (2 내지 3％) AF267B를 동반하는 AF267A를 함유한다는 것을 밝혀내었다.
실시예 4:
(S)-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 AF267B의 키랄 합성
사용된 출발 물질이 (R)-2-브로모부티르산인 것을 제외하고, 실시예 3에서와 같이 상기 화합물을 수득하였다.
실시예 5:
(S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온, AF292의 합성
Figure 112004050635939-pct00036
디클로로메탄 (60 ml) 중 AF267B (6.1 gr, 0.028 mol)의 냉각된 (빙염 조) 교반 용액에 m-클로로퍼벤조산 (mCPBA) (70％, 7.02 gr, 0.028 mol 총량)을 조금씩 15분의 기간에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반한 후, 염화철 (II) (물 중 1M 용액 2.14 ml)로 처리하였다. 교반 및 냉각 (-10℃)을 1시간 동안 계속한 후, 실온에서 2시간 동안 교반을 계속하였다. 에틸렌 디아민 (1.9 ml, 0.285 mol), 수산화나트륨 (2N 수용액 30.5 ml), 및 석유 에테르 40 내지 60℃ (60 ml)를 첨가하였다. 격렬히 진탕한 후, 층을 분리하고, 수성층을 디클로로메탄/석유 에테르 1:1의 혼합물 (600 ml), 이어서 디클로로메탄 (처음에 600 ml, 이어서 300 ml)으로 추출하였다. 합한 추출물을 건조하고 (Na2SO4), 여과하고, 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카-겔 60, 230-400 메쉬, 머크 1.09385, 메탄올/클로로포름/수산화암모늄 10:89:1 v/v로 용출시킴)하여 AF292를 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00037
화합물의 순도는 HPLC, GC에 의해 99.9％초과이었다.
HCl (메탄올 중 4M)의 첨가 및 메탄올-디에틸 에테르로부터의 재결정화에 의해 AF292의 염화수소 염을 형성시켜 백색 침전물을 수득하고, 이를 여과하고 건조하였다.
Figure 112004050635939-pct00038
실시예 6:
[ 14 C]-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온: R 및 S 이성질체의 제조를 위한 반응
Figure 112004050635939-pct00039
자성 막대 및 질소 유입구가 장착된 격막-캡핑된 건조 플라스크 (10 ml)에서, 건조 THF (1.4 ml) 중 디이소프로필아민 (0.078 ml, 0.56 mmol)의 용액을 시린지로 도입시키고 0℃로 냉각시켰다. n-BuLi (헥산 중 0.9 M, 0.62 ml, 0.56 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반한 후, -78℃로 냉각시켰다. 건조 THF (0.4 ml) 및 건조 N,N'-디메틸-N,N'-프로필렌 우레아 (DMPU) (0.6 ml) 중 AF287 (0.1375 gr, 0.51 mmol)의 용액을 적가하고 (30분), 반응 혼합물을 -78℃에서 20분 동안 교반하였다. 1-탄소에서 14C로 표지된 에틸 브로마이드 (0.043 ml, 0.56 mmol)를 한번에 첨가하고, 온도를 실온으로 상승시키고, 반응 혼합물을 추가 의 4시간 동안 교반하였다. 처음에 25℃에서 20분 동안 물 펌프를 이용한 후, 이어서 ~60℃에서 ~30분 동안 오일 펌프 (~4 mmHg)를 이용하여 용매를 감압하에 제거하였다 (용매를 더 빨리 제거하기 위해 대기 스트림을 도입시키는 니들을 이용함). 잔류물의 플래쉬 크로마토그래피로 라세미체 AF267 (95 mg, ~86％ 수율)을 수득하였다. 예비 키랄 HPLC를 사용하여 거울상이성질체를 분리할 수 있었다. 표지되지 않은 에틸 브로마이드를 이용하는 상기 절차에 따라, 플래쉬 크로마토그래피 후 수득된 라세미체 60 mg의 예비 HPLC로 동위원소로 표지되지 않은 AF267B (17.6 mg)를 수득하였다.
실시예 7:
(S)-2-에틸-8-메틸-8-옥시-1-티아-4,8-디아자-스피로[4,5]데칸-3-온, AF299의 합성
Figure 112004050635939-pct00040
디클로로메탄 (40 ml) 중 mCPBA (70％, 2.62 gr, 10.64 mmol)의 용액을 디클로로메탄 (40 ml) 중 AF267B (2.07 gr, 9.67 mmol)의 냉각된 (0℃) 교반 용액에 서서히 (0.5시간) 첨가하였다. 냉각 조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (메탄올/클로로포름/수산화암모늄 10:89:1 v/v)하고 메탄올-아세토니트릴로부터 생 성물을 고체로서 침전시켜 N-옥시드, AF299를 수득하였다;
Figure 112004050635939-pct00041
실시예 8:
(S)-2-에틸-8-메틸-1-옥소-1λ 4 -티아-4,8-디아자-스피로[4,5]데칸-3-온, AF300의 합성
Figure 112004050635939-pct00042
물 (2.5 ml) 중 AF267B (1.72 gr, 0.008 mol)의 용액을 냉각시키고 (빙수 조), 트리플루오로아세트산 (3.5 ml)을 첨가하였다. 수득된 냉각 교반 혼합물에 과산화수소 (30％, 0.57 ml, 0.008 mol)를 첨가하고, 냉조를 제거하고 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 아황산나트륨을 첨가하고, 탄산나트륨 포화 용액으로 용액의 pH를 9로 조정하였다. 수성상을 디클로로메탄 (2 x 100 ml), 이어서 에틸 아세테이트 (1 x 50 ml)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 건조시키고 (MgS04), 용매를 증발시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (실리카-겔 60, 230-400 메쉬, 머크 1.09385, 메탄올/클로로포름/수산화암모늄 10:89:1 v/v로 용출)로 AF300을 수득하 였다.
Figure 112004050635939-pct00043
실시예 9:
2-(1-히드록시-에틸)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF298)의 합성
Figure 112004050635939-pct00044
아르곤 분위기하에서 건조 THF (12 ml) 중 디이소프로필아민 (0.28 ml, 0.002 mol)의 냉각 (0℃) 용액에 n-부틸리튬의 용액 (헥산 중 1.4 M, 1.4 ml, 0.002 mol)을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 교반한 후, -78℃로 냉각시켰다. THF (3 ml) 중 AF287 (0.41 g, 0.0015 mol)의 용액을 적가하고 (10분), 생성된 혼합물을 -78℃에서 추가의 10분 동안 교반하였다. 아세트알데히드 (0.85 ml, 0.015 mol)를 한번에 첨가하고, -78℃에서 10분 후 아세트산 (O.11 ml, 0.002 mol)을 한번에 첨가하고, 온도를 실온으로 상승시켰다. 반응 혼합물을 클로로포름 (200 ml)에 첨가하고, 유기상을 물 (2 x 20 ml)로 세척하고 분리하고 건조하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물의 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, CHCl3/MeOET/NH40H 80/20/1) 로 AF298 (0.132 g)을 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00045
실시예 10:
(S)-2-에틸-4-(4-플루오로-벤젠술포닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온, AF700의 합성
Figure 112004050635939-pct00046
아르곤 분위기하에서 리튬 헥사메틸디실라잔 (8 ml, THF 중 1 M)의 냉각 (0℃, 빙수 조) 용액에 AF267B (1.5 g, 0.007 mol)를 15분의 기간에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 냉각 조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 40분 동안 교반하였다. 4-플루오로벤질술포닐 클로라이드 (1.37 g, 0.007 mol)를 첨가하고 (첨가 온도를 20℃ 미만으로 유지하는 동안, 냉각 조), 반응 혼합물을 아르곤 분위기하에 실온에서 밤새 방치하였다. 디클로로메탄 (100 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 물 (20 ml)로 세척하고, 유기상을 분리하고 건조시키고 (MgS04) 증발시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 에틸 아세테이트/메탄올/수성 암모니아 10/2/0.1)로 AF700 (0.46 gr, 0.0015 mol)을 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00047
실시예 11:
8-메틸-4-피롤리딘-1-일메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온, AF287의 합성
Figure 112004050635939-pct00048
에탄올 (2.3 ml) 중 8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF277 5.13 g, 0.0275 mol), 포름알데히드 (37％ 용액, 2.75 ml) 및 피롤리딘 (2.3 ml, 0.0275 mol)의 용액을 4시간 동안 환류시킨 후, 밤새 실온에서 방치하였다. 톨루엔 (10 ml)을 첨가하고, 용매를 증발시켰다. 끓는 펜탄 (100 ml)을 잔류물에 첨가하고, 용액을 따라내었다. 뜨거운 펜탄으로의 연화처리를 4회 반복하고, 펜탄 층을 합하고 0℃로 냉각시키고, 침전물을 수집하고, AF287 (4.6 gr, 63％ 수율)로서 확인하였다.
Figure 112004050635939-pct00049
실시예 12:
2-에틸-4-(3-1H-인돌-3-일-프로피오닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4. 5]데칸-3-온, AF704의 합성
Figure 112004050635939-pct00050
디클로로메탄 (120 ml) 중 AF267 (1.2 gr, 0.0056 mol), 3-인돌프로피온산 (1.37 gr, 0.0072 mol), 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) (1.57 gr, 0.0076 mol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) (0.93 gr, 0.0076 mol)의 용액을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (2 x 40 ml)로 세척하고, 유기상을 건조시키고 증발시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, CHCl3/MeOH/NH40H 90/10/1)로 표제 화합물을 수득하고, 이를 아세톤 중에서 연화처리하였다. 용액을 여과하여 불순물을 제거한 후, 아세톤을 증발시키고, 수득된 진한 오일을 에테르 중에서 연화처리하였다. 수득된 고체 (AF704) 400 mg을 여과하고 건조시켰다.
Figure 112004050635939-pct00051
출발 물질이 AF267B인 경우, 거울상이성질체 AF704B가 수득되었다.
실시예 13:
2-에틸-4-[2-(1H-인돌-3-일)-에틸]-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데 칸-3-온, AF703의 합성
Figure 112004050635939-pct00052
자성 교반기 및 딘-스타크(Dean-Stark) 및 적하 깔대기가 장착된 삼목 플라스크에서, t-부탄올/시클로헥산의 혼합물 (30/104 gr/gr, 86 ml) 중 2-머캅토부티르산 (7.38 gr, 0.065 mol)의 용액을 40℃로 가열하였다. 트립타민 (10.8 gr, 0.068 mol)을 4번에 걸쳐 첨가하고 (20분), 반응 혼합물을 추가의 45분 동안 교반한 후, 환류 가열하였다. t-부탄올/시클로헥산 (30/104 gr/gr, 10 ml) 중 1-메틸-4-피페리돈 (6.18 ml, 0.049 mol)의 용액을 40분 동안 적가하고, 환류를 5시간 동안 계속하였다 (물 1 ml가 수집됨). pH가 2 내지 3일 때까지 HCl/물의 혼합물 (2:2 v/v)을 첨가하고, 수성상을 분리하고, 수산화칼륨 용액으로 pH 10으로 염기성화하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기상을 분리하고 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 잔류물의 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, CHCl3/MeOH/NH4OH 90/10/1)로 표제 화합물을 수득하였다. 끓는 헥산으로부터의 재결정화로 순수한 AF703을 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00053
실시예 14:
2,8-디메틸-1-티아-3,8-디아자-스피로[4.5]데스-2-엔, AF150(S)의 합성
Figure 112004050635939-pct00054
단계 1: 4-(아세트아미노메틸)-1-메틸-피리디늄 요오다이드의 합성
메탄올 (3 L) 중 4-피콜릴아민 (1070 gr, 9.9 mol)의 냉각 (빙수 조) 용액에 아세트산 무수물 (1400 gr, 13.7 mol)을 적가하였다. 첨가 반응 동안 온도를 10 내지 30℃로 유지하였다. 시약 첨가를 완료했을 때, 반응 혼합물을 밤새 실온에 방치하였다. 요오도메탄 (800 ml, 24.8 mol)을 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 질소 분위기하에서 수조로 냉각시켰다. 첨가 반응 동안 온도를 25℃ 미만으로 유지하였다. 첨가를 완료했을 때, 반응 혼합물을 빛으로부터 보호하고, 실온에서 밤새 방치하였다. 과량의 요오도메탄을 증발시키고, 결정화를 유도하고, 반응 혼합물을 냉각시키고 (빙조) 이소프로판올 (1.5 L)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 -30℃에서 밤새 방치하고, 침전물을 여과해 내고, 이소프로판올로 세척하고 건조시켰다. 4-(아세트아미노메틸)-1-메틸-피리디늄 요오다이드 (2043 gr, 7 mol)를 황색 분말 (71％ 수율)로서 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00055
단계 2: 1-메틸-4-N-티오아세틸아미노메틸피리디늄 요오다이드의 합성
아세토니트릴 (6 L) 중 4-(아세트아미노메틸)-1-메틸-피리디늄 요오다이드 (1.92 kg, 6.5 mol) 및 라우슨 시약 (1.87 kg, 4.6 mol)의 교반 용액을 17시간 동안 80℃로 가온하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 추가의 4시간 동안 교반하였다. 조 티오아미드를 여과해 내고 아세토니트릴 (2.8 L)로 세척하였다. 수득된 티오아미드에 에틸 아세테이트 (10 L)를 첨가하고, 현탁액을 1시간 동안 환류시켰다. 72 내지 73℃에서 유해한 기체를 증발시키고, NaOH 용액으로 트랩핑하였다. 현탁액을 60℃로 냉각시켰다. 티오아세트아미드를 여과해 내고, 에틸 아세테이트 (2 L)로 세척하고 건조시켰다 (45℃). 티오아미드 2 kg을 수득하였다.
단계 3: 1-메틸-4-N-티오아세틸아미노-1,2,3,6-테트라히드로피리딘의 합성
물 (6.2 L) 중 1-메틸-4-N-티오아세틸아미노메틸피리디늄 요오다이드 (2.07 kg, 6.7 mol)의 현탁액을 25 L 플라스크에서 제조하고, 실온에서 교반하였다. 온도를 32℃ 미만으로 유지하도록, 물 (1.2 L) 중 수소화붕소나트륨 (383 gr, 10.1 mol)의 용액을 3.5시간의 기간에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하고, 에탄올 (600 ml)을 첨가하고, 30분 동안 교반을 계속하였다. 탄산나트륨 (780 g)을 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 디클로로메탄 (4 L)을 첨가하고, 45분 동안 교반을 계속하였다. 용액을 여과하여 고체를 제거하고, 이를 클로로포름 (1 L) 및 물 (0.5 L)로 세척하였다. 여액을 따라내고, 수성상을 클로로포름 (2.5 L)으로 추출하였다. 유기상을 합하고 10％ 티오황산나트륨 용액 (2.2 L)으로 세척하였다. 수성상을 클로로포름 (1 L)으로 추출하고, 유기상을 합하고 황산마그네슘상에서 건조시키고, 여과하고 농축하였다. 아세톤 (1.5 L)을 첨 가하고, 현탁액을 실온에서 30분 동안 및 0℃에서 45분 동안 교반하였다. 티오아세트아미드를 여과해 내고, 아세톤 (1.5 L)으로 세척하고 건조하였다 (50℃). 티오아세트아미드 860 gr을 수득하였다. mp. 140℃
Figure 112004050635939-pct00056
단계 4: 2,8-디메틸-1-티아-3,8-디아자-스피로[4.5]데스-2-엔, AF150(S)의 합성
기계 교반기가 장착된 삼목 둥근바닥 플라스크 (5 L)에서, 폴리인산 (2.1 kg)을 교반하고 100℃로 가열하였다. 티오아세트아미드 (840 gr)를 조금씩 첨가하였다. 첨가의 마지막에 온도를 170℃로 상승시키고, 상기 온도를 2 내지 3시간 동안 유지하였다. 뜨거운 반응 혼합물을 탄산나트륨의 교반된 냉각 수용액 (25％, 10 L)에 서서히 부었다. 수성 수산화나트륨 용액 (50％, 350 ml)을 첨가하여 염기성도를 상승시켰다. 반응 혼합물을 클로로포름 (2 x 3 L)으로 추출하고, 유기상을 합하고 건조시키고 (Na2S04) 증발시켰다. 잔류물을 석유 에테르 (3.5 L)에 용해시켜 용액 및 소량의 불용성 물질을 수득하였다. 석유 에테르 용액을 증발시켜 조 AF150(S)를 수득하였다. 기재된 절차를 반복하고, 합한 배치로부터의 조 AF150(S)를 활성탄으로 처리하고 감압하에 (0.5 mmHg, 61℃) 2회 증류하여 AF150(S) (> 1.2 Kg, 전체 수율 40％)를 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00057
실시예 15:
2,8-디메틸-1-티아-3,8-디아자-스피로[4.5]데스-2-엔 8-옥시드, AF406의 합성
Figure 112004050635939-pct00058
디클로로메탄 (30 ml) 중 m-클로로퍼벤조산 (mCPBA) (1.40 gr, 8.11 mmol)의 용액을 디클로로메탄 (10 ml) 중 AF150(S) (1.45 gr, 7.88 mmol)의 용액에 점차적으로 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 천연 산화알루미늄의 컬럼 (머크) (메탄올:클로로포름 1/49)에서 반응 혼합물을 크로마토그래피하여 AF406 (0.75 gr)을 결정질 고체로서 수득하였다. 샘플을 에틸아세테이트로부터 결정화하였다. 매우 흡습성인 고체를 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00059
실시예 16:
2-메틸-1-티아-3,8-디아자-스피로[4.5]데스-2-엔, AF400의 합성
Figure 112004050635939-pct00060
클로로포름 (10 ml) 중 AF406 (2 gr, 0.01 mol)의 용액을 빙염조에서 -10℃ 내지 -5℃로 냉각시켰다. FeCl2 용액 (1 M, 0.7 ml)을 첨가하고, 2 상 반응 혼합물을 4.5시간 동안 교반하였다. 시간이 흐르면 반응 혼합물의 색이 암녹색에서 어두운 오렌지-갈색으로 변하였다. 냉각된 반응 혼합물에 석유-에테르 (10 ml), 에틸렌 디아민 (600 mg, 0.01 mol) 및 2 N 수산화나트륨 (10 ml, 0.02 mol)의 혼합물을 조심스럽게 첨가하였다. 수상의 pH는 13이었다. 유기물을 분리하고 수성상을 클로로포름으로 추출하고, 5 N HCl로 pH = 9로 산성화하고, 클로로포름으로 다시 추출하였다. 모든 유기 분획을 합하고, 탄산칼륨상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물의 크로마토그래피 [실리카-겔 (리델 데 핸(RIEDEL DE Haen) 31607), CHCl3:MeOH:NH40 90/9/1]로 AF400을 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00061
실시예 17:
2-메틸-8-메틸-d 3 -1-티아-3,8-디아자-스피로[4.5]데스-2-엔, AF402의 합성
Figure 112004050635939-pct00062
메탄올 (200 ml) 중 4-피콜리아민 (50 g, 0.462 mol)의 교반된 냉각 (빙수 조) 용액에 아세트산 무수물 (75 g, 0.735 mol)을 서서히 (1시간) 첨가하였다. 첨가 중에 온도를 10 내지 15℃에서 유지하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 방치하였다. TLC [실리카, 클로로포름/메탄올/암모니아 (33％) 90:10:1 (v/v)]는 Rf ~0.4에서의 한 지점을 나타내었다. 생성물인 N-피리딘-4-일메틸-아세트아미드를 단리하지 않고 다음 단계로 진행시켰다.
반응 혼합물의 일부 (43 ml)를 증발시켰다. 아세트아미드 염을 황색 오일 (14.5 g)로서 수득하였다. 오일의 일부 (1.9 g, ≤0.06 mol)를 메탄올 (40 ml)에 용해시키고, 질소 분위기하에서 교반하고 빛으로부터 보호하였다. 반응 혼합물의 온도를 15 내지 25℃에서 유지하면서, 요오도메탄-d3 (10 g, 0.07 mol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 방치한 후, 에테르 (2 x 200 ml)로 2회 연화처리하였다. 4-(아세트아미도-메틸)-1-메틸-d3-피리디늄 요오다이드를 황색 고체 (TLC [실리카, 클로로포름/메탄올/암모니아 (33％) 90:10:1 (v/v)]는 Rf ~0.05에서의 한 지점을 나타냄])로서 수득하고, 추가의 정제 없이 다음 단계에서 환원시켰 다.
질소 분위기하에서 메탄올 (40 ml) 중 피리디늄 요오다이드 염의 냉각 (빙수 조) 용액에 수소화붕소나트륨 (3.9 gr, 0.2 mol)을 점차적으로 첨가하여 (2시간) 온도를 15 내지 30℃에서 유지하고, 반응 혼합물을 추가의 2시간 동안 실온에서 교반하고, 밤새 교반하지 않고 방치하였다. 용매를 증발시켰다. N-(1-메틸-d3-1,2,3,6,-테트라히드로피리딘-4-일메틸)-아세트아미드를 진한 황색빛의 오일 (8.5 g)로서 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00063
최상부에 염화칼슘 튜브가 장착되고 첨가 깔대기 및 응축기가 장착된 삼목 둥근 바닥 플라스크 (250 ml)에, 건조 아세토니트릴 (70 ml) 중 테트라히드로피리딘 아세트아미드 (8.5 gr)의 용액을 첨가하였다. 교반 용액에, 오황화인 (6.7 gr, 0.03 mol)을 첨가하고, 이어서 트리에틸아민 (12 gr, 0.12 mol)을 10 내지 15분 동안 첨가 깔대기로부터 첨가하였다. 수득된 용액을 5시간 동안 환류 가열한 후, 15℃에서 3일 동안 방치하였다. 용액을 증발시키고, 10％ 수성 탄산칼륨으로 염기성화한 후, 클로로포름으로 추출하였다. 유기상을 건조시키고 증발시켰다. 조 흑색 N-(1-메틸-d3-1,2,3,6-테트라히드로피리딘-4-일메틸)-티오아세트아미드 (6.62 gr, 0.036 mol)를 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00064
플라스크 (150 ml)에서, 폴리인산 (30 g)을 조 티오아세트아미드 (6.5gr)에 첨가하였다. 반응물을 교반하고, 3.5시간 동안 170℃로 가열하였다. 뜨거운 반응 혼합물을 교반된 25％ 수성 탄산나트륨 (150 ml)에 서서히 부었다. 반응 플라스크에서 25％ 수성 탄산나트륨 (50 ml)을 잔류물에 첨가하고 두 용액을 합하였다. 50％ 수성 수산화나트륨 (6 ml)을 첨가하여 염기성도를 상승시키고, 반응 혼합물을 클로로포름으로 추출하였다. 유기상을 분리하고 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 석유 에테르 (100 ml)에 용해시켜 -20℃에서 12시간 후에 용액 및 소량의 불용성 물질을 수득하였다. 석유 에테르 용액을 증발시키고, 수득된 오일 (5 g)을 감압하에 (b.p. 50 내지 53℃, 0.2 mmHg) 증류하여 AF402 (2.15 g, 0.012 mol)를 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00065
실시예 18:
N-[(2,8-디메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-3-일리덴)-메틸-아민]-N-옥시드, AF600의 합성
Figure 112004050635939-pct00066
에탄올 (13.5 ml) 중 N-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (0.85 gr, 0.01 mol)의 용액에 아세트산나트륨 (0.84 gr, 0.01 mol)을 첨가하였다. 백색 침전물을 수득하였다. 에탄올 (7 ml) 중 2,8-디메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (1.62 gr, 0.0088 mol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4.5시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 디클로로메탄 (675 ml)을 첨가하고, 수득된 용액을 20％ 수성 탄산나트륨으로 세척하였다. 유기상을 건조시키고, 용매를 증발시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, CHCl3/MeOH/NH40H 90/10/1)로 AF600 (1.5 gr)을 두 이성질체의 혼합물 [덜 극성인 이성질체 (A)/더 극성인 이성질체 (B) 1:4]로서 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00067
실시예 19:
N-[(2,8-디메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-3-일리덴)-벤질-아민]-N-옥시드, AF604의 합성
Figure 112004050635939-pct00068
에탄올 (6 ml) 중 N-벤질히드록실아민 히드로클로라이드 (1.27 gr, 0.008 mol)의 용액에 아세트산나트륨 (0.65 gr, 0.008 mol)을 첨가하였다. 백색 침전물 을 수득하였다. 에탄올 (3.5 ml) 중 2,8-디메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (1.3 gr, 0.0072 mol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 디클로로메탄 (450 ml)을 첨가하고, 수득된 용액을 20％ 수성 탄산나트륨으로 세척하였다. 유기상을 건조시키고, 용매를 증발시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, CHCl3/ MeOH/NH4OH 90/10/1)로 AF604 (1.81 gr)를 두 이성질체의 혼합물 [덜 극성인 이성질체 (A)/더 극성인 이성질체 (B) 1:8]로서 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00069
실시예 20:
N-[(2,8-디메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-3-일리덴)-이소프로필-아민]-N-옥시드, AF605의 합성
Figure 112004050635939-pct00070
에탄올 (7 ml) 중 n-이소프로필히드록실아민 히드로클로라이드 (1.84 gr, 0.01 mol)의 용액에 아세트산나트륨 (0.91 gr, O.O11 mol)을 첨가하였다. 백색 침전물을 수득하였다. 에탄올 (4 ml) 중 2,8-디메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (1.84 gr, O.O1 mol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4.5시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 디클로로메탄 (500 ml)을 첨가하고 수득된 용액을 20％ 수성 탄산나트륨으로 세척하였다. 유기상을 건조시키고, 용매를 증발시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/10/1)로 AF605 (1.5 gr)를 두 이성질체의 혼합물 [덜 극성인 이성질체 (A)/더 극성인 이성질체 (B) 1:4]로서 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00071
실시예 21:
N-[(2-에틸-8-메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-3-일리덴)-메틸-아민]-N-옥시드, AF601의 합성
Figure 112004050635939-pct00072
에탄올 (14.3 ml) 중 N-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (0.95 gr, 0.011 mol)의 용액에 아세트산나트륨 (0.94 gr, 0.O11 mol)을 첨가하였다. 백색 침전물을 수득하였다. 에탄올 (7.4 ml) 중 2-에틸-8-메틸-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (2.1 g, 0.01 mol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5.5시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 디클로로메탄 (770 ml)을 첨가하고, 수득된 용액을 20％ 수성 탄산나트륨으로 세척하였다. 유기상을 건조시키고, 용매를 증발시키 고 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, CHCl3/MeOH/NH4OH 90/10/1)로 AF601 (2.4 gr)을 두 이성질체의 혼합물 [덜 극성인 이성질체 (A)/더 극성인 이성질체 (B)]로서 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00073
실시예 22:
N-[(2-메틸-8-페닐-1-옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-3-일리덴)-메틸-아민]-N-옥시드의 합성
Figure 112004050635939-pct00074
에탄올 (5.4 ml) 중 N-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (0.33 gr, 0.004 mol)의 용액에 아세트산나트륨 (0.32 gr, 0.004 mol)을 첨가하였다. 백색 침전물을 수득하였다. 에탄올 (3 ml) 중 8-메틸-2-페닐-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (0.85 gr, 0.004 mol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4.5시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 디클로로메탄 (250 ml)을 첨가하고, 수득된 용액을 20％ 수성 탄산나트륨으로 세척하였다. 유기상을 건조시키고, 용매를 증발시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, CHCl3/MeOH/NH40H 90/10/1)로 AF602 (130 mg)를 두 이성질체의 혼합물 [덜 극성인 이성질체 (A)/더 극성인 이성질체 (B) 1:3]로서 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00075
실시예 23
디히드로-5'-메틸스피로[1-아자비시클로[2.2.2]옥탄-3,5'-(4'H)-3'-일리덴-메틸아민-N-옥시드, AF603의 합성
Figure 112004050635939-pct00076
에탄올 (15 ml) 중 N-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (1.17 gr, 0.014 mol)의 용액에 아세트산나트륨 (1.15 gr, 0.014 mol)을 첨가하였다. 백색 침전물을 수득하였다. 에탄올 (7.4 ml) 중 디히드로-5'-메틸스피로[1-아자비시클로[2.2.2]옥탄-3,5'-(4'H)-3'-온 (2.1 gr, 0.01 mol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4.5시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 디클로로메탄 (770 ml)을 첨가하고, 수득된 용액을 20％ 수성 탄산나트륨으로 세척하였다. 유기상을 건조시키고, 용매를 증발시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, CHCl3/MeOH/NH4OH 90/10/1)로 AF601 (0.45 gr)을 두 이성질체의 혼합물 [덜 극성인 이성질체 (A)/더 극성인 이성질체 (B)]로서 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00077
실시예 24:
2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-티온, AF510의 합성
Figure 112004050635939-pct00078
아세토니트릴 (5 ml) 중 AF267 (214 mg, 1 mmol) 및 라우슨 시약 (280 mg, 0.692 mmol)의 혼합물을 17시간 동안 환류 가열하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 농축 수성 탄산나트륨 (0.5 ml)에 용해시킨 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 잔류물 (250 mg)을 먼저 톨루엔으로부터, 이어서 아세토니트릴로부터 재결정하여 순수한 AF510을 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00079
실시예 25:
4-벤질-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온, AF282의 합성
Figure 112004050635939-pct00080
자성 교반기 및 딘-스타크 및 2개의 적하 깔대기가 장착된 삼목 플라스크에서, 벤젠 (75 ml) 중 머캅토아세트산 (8 ml, 0.242 mol)의 용액을 환류 가열하였다. 벤질 브로마이드 (13 ml, 0.242 mol) 및 1-메틸-4-피페리돈 (9.3 ml, 0.08 mol)을 동시에 적가하고 (45분), 반응 혼합물을 추가의 1.5시간 동안 환류하였다 (물 2 ml가 수집됨). 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (30 ml)을 첨가하고, 유기상을 분리하고 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 잔류물의 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 클로로포름 중 10％ 메탄올)로 AF282 (3.8 g)를 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00081
실시예 26:
4-(2,4-디메톡시벤질)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온, AF286의 합성
Figure 112004050635939-pct00082
자성 교반기 및 딘-스타크가 장착된 삼목 플라스크에서, 벤젠 (5 ml) 중 1-메틸-4-피페리돈 (0.27 ml, 2.4 mmol), 2,4-디메톡시벤질아민 히드로클로라이드 (0.72 gr, 3.5 mmol) 및 머캅토아세트산 (0.24 ml, 3.5 mmol)의 용액을 3시간 동안 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (10 ml)을 첨가하고, 유기상을 분리하였다. 2.5 N 수성 수산화나트륨 용액으로 수성상의 pH를 10으로 조정한 후, 수성상을 클로로포름으로 추출하였다. 유기상을 합하고 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 잔류물의 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 클로로포름 중 10％ 메탄올)로 AF286 (140 mg, 15％ 수율)을 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00083
실시예 27:
4-(tert-부틸옥시카르보닐)-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4,5]데칸-3-온, AF284의 합성
Figure 112004050635939-pct00084
디클로로메탄 (60 ml) 중 AF277 (2.60 gr, 13.97 mmol)의 용액에, 트리에틸아민 (1.95 ml, 13.99 mmol), 디-tert-부틸 디카르보네이트 (3.85 ml, 16.76 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (1.71 gr, 13.99 mmol)을 첨가하였다. 수득된 용액을 밤새 실온에서 교반한 후, 용매를 증발시켰다. 잔류물의 플래쉬 크로마토그래피 (실 리카, CHCl3/MeOH/NH4OH 80/20/1)로 AF284 (4 gr, > 95％ 수율)를 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00085
실시예 28:
파라핀 오일 중의 AF150(S) 제조 + 안정성 연구
제약상 허용가능한 파라핀 오일 (파라핀 오일 유럽 피에이치(Paraffin oil Eur. Ph)) 중 10％ w/w AF150(S)의 안정성을 40℃에서 대기 또는 질소 분위기하에서, 토코페롤의 존재 또는 부재하에 검사하였다. 2개월의 저장 후에 샘플을 분석하였다. TLC, HPLC 및 GC를 사용하여 가능한 분해 생성물(들)의 양을 검출 및 결정하였다. 동일한 조건 하에서 토코페롤이 있거나 없는 파라핀 오일과 비교하여 색 변화를 결정하였다. AF150(S)는 파라핀 오일 배합물에서 안정하였다. AF150(S)의 가수분해로 수득된 분해 생성물인 티올아미드 유도체 (M+ 202) (상기 0.1％)는 시험된 어떠한 샘플에서도 검출되지 않았다. 토코페롤이 없는 샘플에서 미황색 색상이 관찰되었으나, AF150(S) 중에 0.5％ w/w 토코페롤을 함유하는 샘플에서는 발색되지 않았다.
실시예 29:
AF150 (S) 시트레이트 염 + 안정성 연구
2-프로판올 (60 ml) 및 테트라히드로푸란 (100 ml) 중 AF150(S) (30.13 gr, 163.8 mmol)의 용액에 2-프로판올 (200 ml) 중 무수 시트르산 (29.51 gr, 153.5 mmol)의 용액을 45분에 걸쳐 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 아르곤 분위 기하에서 추가의 2시간 동안 교반한 후, 생성된 백색 침전물을 여과하고 아르곤 분위기하에서 헥산으로 세척하였다. 백색 고체를 P205를 함유하는 건조 피스톨에 도입시키고, 건조 피스톨을 비운 후 (0.2 mmHg), 55 내지 60℃의 온도에서 6시간 동안 가열하였다. AF150(S) 시트레이트 (53.8 g, 87.6％ 수율)를 수득하였다.
Figure 112004050635939-pct00086
다양한 조건 (60℃에서 3개월 동안; 대기중에 실온에서 3개월 동안)하에서 저장된 상기 염의 샘플의 HPLC 분석은 무수 조건하에서 저장된 참고 표준물과 비교할 때, 상기 염이 매우 안정하다는 것을 나타내었다.
실시예 30:
화합물의 뇌 침투
1) AF267B의 pKa: 화합물 AF267B의 유리 염기 (이온화되지 않은) 형태를 뇌 혈액 장벽으로 횡단시켰다. AF267B의 pKa가 7.8이므로, 하기 나타낸 바와 같이 계산하여 뇌척수액 (CSF)의 pH = 7.35에서는 화합물의 26.2％가 유리 염기 형태이었다. 이는 유리 염기가 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 물질이므로 AF267B가 뇌로 매우 침투성임을 나타낸다. 비교하자면, 예를 들어 염기가 퀴누클리디닐인 몇몇 다른 공지된 제약적 CNS 활성 화합물은 pKa가 9 이상이다 (여기서, 3급 아민은 매우 염기성임). 이러한 화합물의 경우, 7.35의 관련 pH에서 오직 2.2％만이 비이온성 형태이다. 이는 이러한 화합물에 비해 AF267B가 뇌에 대한 더욱 높은 선호도를 가짐 을 나타낸다. 상기 계산은 하기를 기준으로 하였다:
BH+ → B + H+
％B = 100 - ％BH+ = 100 - 100/[1 + 10(pH-pKa)]
pKa (AF267B) = 7.8
pH (CSF) = 7.35
％B = 100 - 100 / 1 + 10-0.45]
％B = 26.2％
pKa = 9.0인 염기 B'의 경우
％B' = 100 - 100 / 1 + 10-1.65]
％B' = 2.2％
2) 래트를 AF267B (2 mg/kg, po)로 처리하고, 약물의 혈장 대 뇌 수준을 GC로 분석하였다. AF267B는 혈장에 비해 뇌에 대해 선호도를 가짐을 발견하였다:
a) 전체 뇌 (ng/gr)*hr 대 혈장 (ng/ml)*hr 모두에서, iv (1 mg/kg) 및 po (2 mg/kg) 모두, 무한 시간까지 외삽된 곡선하 면적 (AUC)을 각각 비교함으로써, AUC 뇌/AUC 혈장의 비율이 수컷의 경우 1.79 (iv) 및 2.43 (po)이고, 암컷의 경우 1.32 (iv) 및 1.25 (po)임을 발견하였다. 이로써, 혈장에서보다 뇌에서 더 많은 양의 화합물을 발견하였다;
b) Cmax 뇌 (ng/g) / Cmax 혈장 (ng/ml) (po)의 비를 비교함으로써, 수컷에서 는 화합물의 25％가 암컷에서는 16％가 뇌에서 발견됨을 발견하였다. 상기 계산은 뇌 중량 (2 gr) 대 총 혈장 부피 (14 ml)를 기준으로 하였다. 이는 또한 뇌에서의 화합물의 높은 퍼센트를 나타낸다.
3) 마우스 뇌 조직에서 AF150(S) 및 AF267B (100 μmole/kg, po)의 생체외 연구 (뇌 조직으로 첨가된 AF150(S) 또는 AF267B 대 표준 화합물 (AF261)의 GC 분석 또는 뇌 조직으로부터 삼중수소화된-옥소트레모린-M과 같은 방사능 무스카린성 화합물의 전치)는 또한 혈장에 비해 명백히 높은 뇌 침투를 보여준다 (GC 및 결합 연구). AF150(S): Tmax = 1 내지 10분; T1/2 = 21 및 53분 (2개의 상), iv; MRT (평균 체류 시간) = 50분, iv, po. AF150(S)는 신속한 뇌 침투 (1분 iv)를 갖는다; Cmax = 40.7 μmole/kg (po 투여된 양으로부터 뇌에서 40.7％); AF267B: 투여 후 2 내지 240분 사이에 뇌에서 검출됨, 20 내지 30분에서 피크, MRT = 128분; Cmax = 36.4 μmole/kg (po 투여된 양으로부터 뇌에서 36.4％).
실시예 31
비글 개에게의 AF267B 투여 후 AF292의 검출
상기 연구의 목적은 방법 (하기를 참조)에 따른 AF267B의 13주 아만성 1일 단일 투여 (1.5, 3 및 6 mg/kg, 수컷 및 암컷 개에게 po) 후, 개 혈장에서 AF267B 및 AF292 (AF267B의 대사물질)의 수준을 측정하는 것이다.
내부 표준 (AF261): 2-메틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온; MW 200. 분석 혈장 샘플은 상기 연구의 생애 내(in-life) 부분으로부터 유래 하였다. AF267B 및 AF292의 농도를 하기로 측정하였다:
컬럼: 퓨로스퍼 스타 (Purospher STAR) RP18e (4 x 50 mm, 3 ㎛)
이동상: 용매 A: 1 g/L (HN4)2C03 (H20)
용매 B: 메탄올
루프/주사 부피: 50 ㎕/10 ㎕
이온화 모드: 대기압 화학 이온화 (APCI); 양 이온
덮개(Sheath) 기체 압력: 질소: 70 psi
모세관 온도: 250℃
분무 전압: ~3.6 kV
검출 모드: SRM (선택된 반응 모니터링)
AF292: m/z: 201.0 [CE (CE = 충돌 에너지) 3O V] →m/z: 70.0 (0.0 - 5.2분)]
AF261: m/z: 201.0 (CE 35 V) →m/z: 70.0 (5.2 - 6.2분); 내부 표준
AF267B: m/z: 215.0 (CE 30 V) →m/z: 70.0 (6.2 - 10.0분)
충돌 기체 (CID): 2.5 mTorr/아르곤
결과:
반복되는 1일 투여의 13주 후, AF267B의 혈장 반감기는 1 내지 2시간이고, Tmax = 1.5 내지 3시간, Cmax (ng/ml) = 162 내지 1352 (직선으로 용량-의존성) 및 AUC(0-t) (ng*h/ml) = 712 내지 3947 (직선으로 용량-의존성)이었다. AF292의 혈장 수명 (~ 9 내지 20시간)은 대략 10배 더 길었고, Tmax = 3시간, Cmax (ng/ml) = 136 내지 555 및 AUC(0-t) (ng*h/ml) = 616 내지 2451 (직선으로 용량-의존성)이었다. AF267B와 비교하여, AF292의 약동학적 프로파일을 하기와 같이 요약할 수 있다: AF292의 혈장에서의 T1/2은 AF267B보다 약 3 내지 5배 더 길었다 (예를 들면, 암컷에서 AF292 T1/2 = 10.6시간이고, 암컷에서 T1/2 = AF267B). AF292의 Cmax는 AF267B의 Cmax에 비해 50 내지 90％이었다. AF292는 Cmax가 AF267B의 Cmax에 비해 우측으로 명백히 이동하였음을 보여준다 (AF267B에 비해 AF292의 혈장에서의 출현이 지연되므로). 상기 관찰을 근거로, AF267B 및 AF292는 함께, 둘 중 하나의 화합물 단독으로보다 더욱 긴 혈장 T1/2을 갖는 제약 배합물을 형성할 수 있음을 인식할 것이다. 이로써, 이러한 배합물을 투여할 수 있다.
실시예 32
M1 mAChR로 안정하게 형질감염된 세포 배양물 및 래트의 초대 해마 및 피질 신경세포 배양물 중 α-APP의 분비에서의 시험된 화합물의 효과
세포를 6-웰 배양 플레이트에 플레이팅하고, 플레이팅 후 3 내지 5일의 연령으로 사용하였다. 세포를 무혈청 배지에서 2회 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 AF150(S) 및 AF267B 또는 AF292와 함께 인큐베이션하였다. 세포 배양물을 상기 시험된 화합물의 다양한 농도 (10-6 내지 10-3 M)에 및 카르바콜 (10-4 M)에 1시간 동안 노출시켰다. 매질에 단독으로 노출된 세포를 대조군으로 간주하였다. 카르바콜, 리바스티그민 및 데프레닐을 참고 화합물로서 사용하였다.
세포 상등액을 프로테아제 억제제의 칵테일 (5 단위/ml 아프로티닌, 5 mg/ml 펩스타틴 A, 5 mg/ml 류펩틴 및 10-4 M 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF, 프로테아제 억제제); 시그마(Sigma), 미국)을 함유하는 에펜도르프(Eppendorff) 튜브에 수집하였다. 수집된 매질을 센트리콘(Centricon) 튜브 (아미콘(Amicon), 미국 메사추세츠주 비벌리)로 농축시키고, α-APP 분비 측정을 위해 동결 유지하였다. 동일 양의 단백질 (50 내지 100 ㎍)을 로딩하고, 10％ 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 분리하였다. 그 후, 니트로셀룰로스 막에 웨스턴 블럿팅하고, 무지방 우유로 블로킹하고, 24시간 동안 4℃에서 항-알쯔하이머 전구체 단백질, A4 모노클로날 항체 22C11 (0.25 ㎍/ml; 뵈링거(Boehringer), 독일 만하임)로 프로빙하였다. 니트로셀룰로스 막을 세척하고, 퍼옥시다제-연결된 염소 항-마우스 IgG 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch), 미국)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 대규모로 세척해 내고, 향상된 화학발광 검출 시스템 (아머샴(Amersham))으로 염색하였다. 비디오-화상 밀도계측기 (겔-보조(Gel-aid) 소프트웨어; 갈라이 캄파니(Galai Co.), 이스라엘)로, 노출된 필름상에서 면역반응 밴드의 정량 평가를 수행하였다. APP 수준을 기저 수준보다 x-배 증가로서 표현하였다. M1 mAChR로 안정하게 형질감염된 세포 배양물에서, α-APP-유도된 분비를 또한 10-4 M 카르바콜에 대한 최대 반응의 ％로서 계산하였다.
M1 mAChR을 발현하는 세포에서의 α-APP 분비는 아고니스트 자극에 따라 용 량-의존적으로 증가하였다. 10-4 M AF267B에서 최대 증가를 수득하였고 (대조군보다 약 6-배 증가), 이는 카르바콜에 의해 유발된 최대 증가와 동일하였다. 무스카린성 길항제인 아트로핀의 10-5 M 첨가는 AF267B로 유도된 APP의 분비를 완벽히 억제하여, AF267B의 효과가 M1 mAChR를 통해 매개됨을 나타내었다. 몇몇 실험에서, AF267B의 활성을 AF150(S)의 활성과 비교하였다. 결과는 AF150(S)보다 AF267B가 더욱 효능있고 강력함을 보여준다 (AF150(S)의 경우 카르바콜의 최대 반응의 50％인 반면, AF267B의 경우 카르바콜의 최대 반응과 동일함). 추가로 AF267B는 α-APP 분비에서 그의 라세미체 (AF267) 또는 AF102B (카르바콜의 최대 반응의 50％)보다 더욱 효능있고 더욱 강력한 반면, 덜 강력한 거울상이성질체 AF267A는 AF102B와 효력면에서 유사하였다.
AF292는 APP의 상승을 활성화함에 있어서 AF267B (EC50 = 3 μM) 및 카르바콜만큼 효과적이었던 반면, 리바스티그민 및 데프레닐은 APP 수준을 상승시킴에 있어서 효과적이지 않았다. 아트로핀 (10 μM)의 첨가는 카르바콜, AF267B 및 AF292로 유도된 APP의 분비를 억제하였고, 이는 이들 아고니스트의 효과가 M1 mAChR을 통해 매개됨을 나타내었다.
또한, 상기 결과는 AF267B가 선택적 M1 무스카린성 아고니스트, 및 그 자체로 선택적 M1 무스카린성 아고니스트 및 약한 M3 무스카린성 길항제인 AF292에 대한 "약물-프로드럭"임을 나타낸다. AF267B 및 AF292는 함께 둘 중 하나의 화합물 단독으로보다 더욱 긴 혈장 반감기 및 더욱 긴 무스카린성 활성을 갖는 제약 배합 물을 형성한다.
또한, 상기 시험을 이용하여, 이 제제 중의 AF700 및 AF704가 APP 수준 증가에도 효과적임을 발견하였다 (100 μM에서 카르바콜의 최대 효과의 50％를 발휘함).
다양한 무스카린성 아고니스트가 분비된 APP의 수준에 미치는 영향은 해마, 대뇌 피질 (둘다 주로 M1 mAChR을 함유함) 및 척수 (M2 수용체를 함유함)로부터 제조된 래트 초대 세포 배양물을 사용하여 추진하였다. 본 연구에서, 카르바콜 (비-선택적 무스카린성 아고니스트), 옥소트레모린 (> M2 선택적 무스카린성 아고니스트), 피소스티그민 (콜린스테라제 억제제) 및 AF102B, AF150(S) 및 AF267B (M1 선택적 무스카린성 아고니스트)이 APP 분비에 미치는 영향을 시험하였다.
초대 세포 배양물은 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트의 배아로부터 제조하였다. 해마, 대뇌 피질 및 척수의 배양물을 사용한 실험은 문헌 ["Guide for Care and Use of Laboratory animals", National Research Council, Washington, DC 1996]의 지침에 따라 수행하였다.
뇌 조직, 해마, 대뇌 피질 및 척수는 각각 13 내지 14일 또는 18 내지 19일 연령의 래트 태아로부터 프리-핸드 절개로 꺼내고, 6 mg/ml 글루코스를 함유하는 냉각된 게이스 밸런스드(Gey's Balanced) 염 용액 (깁코, 비알엘)에 옮겼다. 뇌수막을 제거한 후, 절개된 조직을 파스퇴르(Pasteur) 파이펫으로 기계적으로 해리시킨 후에 트립신-DNAase 용액으로 처리하여 세포 현탁액을 수득하였다. 해리된 세포를 6 mg/㎖ 글루코스, 2 mM L-글루타민, 1000 IU/㎖ 페니실린을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (바이올로지칼 인더스트리스(Biological Ind.), 이스라엘 베이트-해메크)로 옮겼다. 세포 현탁액을 폴리-L-리신 (1 mg/ml)으로 미리 코팅된 12-웰 조직 배양 플레이트에 4 ×105개 세포/웰 (해마 세포) 및 6 ×105개 세포/웰 (피질 세포)의 밀도로 플레이팅하였다. 세포 배양물을 약 2주 동안 37℃ 인큐베이터 (95％ 공기 및 5％ CO2)에 유지시켰다. 시험관내 제11일 내지 제14일에 세포를 철저하게 세척한 후, 하기에 상술한 바와 같은 여러가지 처리를 수행하였다. 해마 및 피질 세포를 100 μM 농도의 시험 리간드와 함께, 154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 3.6 mM NaHC03, 1.3 mM CaCl2, 5.6 mM 글루코스 및 10 mM HEPES, pH 7.4로 이루어지고 0.02％ BSA를 함유하는, 마그네슘이 없는 록케(Locke)-HEPES 완충액 중에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 연구에서, 무스카린성 아고니스트를 길항제인 피렌제핀 (10 μM)과 함께 공동-인큐베이션하였다. 완충액에만 노출시킨 세포는 대조군으로 지칭하였다. 인큐베이션 기간의 마지막에, 조건화된 배지를 꺼내어 프로테아제 억제제 칵테일 (상기 명시한 바와 같음)을 함유하는 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 상등액을 센트리콘-30 농축기 (아미콘, 인크., 미국 메사추세츠)를 사용한 원심분리 (4℃에서 45분 동안 2,500 ×g)로 농축하고, APP 수준 측정시까지 -70℃에서 동결시켰다.
샘플 중의 단백질 함량은 바이오-라드(Bio-Rad) 검정에 따라 마이크로플레이트에서 측정하였다. 각 샘플의 동량의 단백질 (약 40 ㎍/레인)을 10％ SDS-PAGE에 로딩하였다. 전기영동 완료시에 겔을 무지방 우유로 블록킹된 니트로셀룰로스 막 에 블럿팅하고, APP 밴드를 항-알쯔하이머 전구체 단백질 A4 (모노클로날 22C11, 뵈링거 만하임) 및 2차 프로브 퍼옥시다제-연결된 토끼 항-마우스 IgG (잭슨 이뮤노리서치, 피)를 사용하여 프로빙하였다. 철저히 세척해 낸 후, 밴드를 TMB (단일 용액, 자임드 랩.(Zymed Lab.), 캘리포니아)로 염색하거나, 르네상스 화학발광 시약 (듀폰, NEN)으로 현상한 후, 자가방사기록용 필름 (하이퍼필름(Hyperfilm)-ECL, 아머샴)에 노출시켰다. 비디오-화상 밀도계측기 (겔-보조 소프트웨어, 갈라이 캄파니, 이스라엘)로 전체 APP 밴드의 정량 측정을 수행하였다. APP에 대해 수득한 데이타를 대조군에 비해 증가된 배수 (여기서, 대조군은 록케 완충액과만 인큐베이션한 세포임)로 표현하였다.
초대 래트 피질 및 해마의 배양 세포 배양물을 비-선택적 아고니스트 카르바콜 (CCh) 및 옥소트레모린 (> M2 선택적)에, M1 무스카린성 아고니스트, AF150(S) 및 AF267B에, 및 콜린스테라제 억제제, 피소스티그민에 모두 100 μM로 노출시켰다. M1 아고니스트는 대조군 세포 배양물에서 측정된 수준에 비해, 사용된 두 세포 시스템인 해마 및 피질 모두에서 APP 분비의 유의한 증가를 유도하였다. 피질 세포 배양물에서 APP 수준의 증가는 대조군의 2.5 내지 3.1배 증가의 범위였고, 해마 세포 배양물에서는 대조군의 1.8 내지 2.8배의 범위의 증가가 발견되었다. AF150(S) 및 AF267B는 CCh보다 더욱 강력하였다 (각각 대조군의 2.8배 및 1.5배). 옥소트레모린 및 피소스티그민은 비활성이었다. AF150(S), AF267B 및 CCh에 의한 APP-유도성 분비는 M1 선택적 길항제인 피렌제핀 (10 μM)에 의해 완벽히 차단되었다. 이들 신경세포는 M1 mAChR을 함유하지 않으므로, 이들 아고니스트는 척수 배 양물에서 APP 분비를 활성화시키지 못했다.
실시예 33
뉴로트로핀의 존재 또는 부재하의 무스카린성 아고니스트에 대한 신경돌기-생성 반응
문헌 [Gurwitz et al, NeuroReport 6, 485, 1995]에 기재된 바와 같이, M1 mAChR 세포로 형질감염된 래트 크롬친화성세포종 세포를 성장시켰다. 신경돌기 생성의 측정을 위해, 6-웰 플레이트에 플레이팅한 세포를 플레이팅 후 제3일 내지 제5일에 사용하였다. 플레이팅 후 제1일에 성장 인자를 첨가하고, 마지막 24시간 동안 무스카린성 아고니스트를 첨가하였다.
세포를 도립 현미경하에서 관찰하였다. 각 웰로부터 얻은 수백만개 세포의 3개의 랜덤한 장에서, 세포 직경보다 더 긴 신경돌기를 가진 세포의 백분율을 계수하였다. 결과를 신경돌기를 가진 세포의 백분율로서 표현하였다. 처리는 3벌의 세포에서 수행하였다. 플레이팅 후 제1일에 NGF (50 ng/ml) 및 EGF (1OO ng/ml)를 둘다 첨가하였다. 계수하기 24시간 전에 무스카린성 아고니스트를 첨가하였다.
AF102B, AF150(S) 및 AF267B 대 카르바콜 (CCh)의 뉴로트로핀-유사 효과 및 뉴로트로핀, 예를 들어 NGF, 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) 및 상피 성장 인자 (EGF)와 이들의 상호작용을 평가하였다. CCh에 대한 최대 반응은 AF267B의 경우 60％ 및 AF150(S)의 경우 30％인 것과 비교하여 80％이었다. M1 mAChR 세포로 형질감염된 래트 크롬친화성세포종 세포를 NGF로 예비처리하니, 시험한 모든 리간드에 대해 뉴로트로핀성 반응이 상승적으로 증대되었고, 시험한 아고니스트의 효능 이 증가하였다.
NGF 및 한편으로는 bFGF (분화를 유도함) 및 다른 한편으로는 상피 성장 인자인 EGF (증식을 유도함)에 대한 M1 mAChR 세포로 형질감염된 래트 크롬친화성세포종 세포의 세포 반응 사이에는 관찰가능한 차이점이 존재하였다. EGF는 무스카린성 아고니스트와 함께 가속화된 분화를 유도하므로, EGF의 증식 프로파일은 무스카린성 아고니스트의 존재하에 변화하였다.
또한, 상기 결과는 M1 선택적 아고니스트를 단독으로 사용하거나 내인성으로 또는 외인성으로 투여된 성장 인자와 함께 사용하여 AD와 같은 신경퇴행성 장애의 치료에 유리한 뉴로트로핀성 효과를 유도할 수 있음을 보여준다.
AF292, AF700 및 AF704는 또한 뉴로트로핀성인 것으로 밝혀졌고, 상기 효과는 아트로핀에 의해 완전히 차단되어 상기 효과의 무스카린 성질을 나타냈다.
실시예 34
시험관내 Aβ수준에 대한 효과
인간 APP695 또는 APP C99 또는 C111 중 하나로 코딩된 재조합 세믈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스로 감염된, 혼합된 초대 래트 피질 신경세포 (Fassbeder et al, PNAS, 98: 5856, 2001)를 시험 화합물 중 하나 (AF102B, AF150 또는 AF267B)로 각각 5 내지 8시간 동안 처리하였다. 이들 세포 배양물에서, APP는 γ- 및 β-세크레타제에 의해 절단되어 Aβ를 생산한 반면, α-세크레타제는 Aβ를 파괴하였다. 그러나, α-세크레타제는 세포내에 존재하지 않았다. 세포를 용균시키고, Aβ를 W02 (항 Aβ 항체)로 침전시켰다.
APP로부터 발생된 절단된 구조물인 C99 (및 C111)를 이용하여 Aβ 조절의 메카니즘을 시험하였다. APP와는 달리, C99/C111은 γ-세크레타제에 대한 직접적인 기질이었다. 두 구조물 모두에서, γ-세크레타제 활성에 대한 직접적인 분석이 가능한 반면, APP에서는 불가능하였다. 두 구조물 모두 -APP와 비교했을 때- α-세크레타제에 대한 비효율적 기질이었다. 또한, 혈장 막으로부터 콜레스테롤을 추출하는 작용제인 CDX (메틸-β-시클로덱스트린)로 상승 효과를 평가하였다. CDX도 또한 Aβ생성을 억제하였다. 각각의 무스카린성 아고니스트 이외에 CDX-처리된 세포를 5분 동안 처리하여 콜레스테롤 함량을 감소시켰다.
상기 시스템 중 세포 용균물 및 매질 모두에서 무스카린성 아고니스트로 처리시 Aβ 수준이 감소되었다. AF267B는 μM 범위의 활성일 때, Aβ 수준을 감소시킴에 있어 AF150(S)보다 5배 이상 더욱 강력하였다. 상기 시스템에서의 Aβ를 검출불가능한 Aβ 수준까지 감소시키는 그들의 효능 면에서, AF267B와 일반적 콜레스테롤 강하제인 CDX (5 mM) 사이의 상승 효과를 관찰하였다. 또한 상기 연구에서는, 존재하는 M1 아고니스트가 α-세크레타제를 활성화시키는 것 이외에 γ-세크레타제를 억제함을 관찰하였다. AF267B는 Aβ-유사 단편 (모든 단편은 3 내지 4 Kda임)의 방출을 대략 50％의 범위까지 감소시켰다. 이는 γ세크레타제 활성이 50％ 감소한 것과 동일하였다. 이는 또한 대조군에 비해 AF267B (1 mM)-처리된 세포에서 p3 단편 (γ-세크레타제 절단으로 인해 유발된 APP의 단편)이 완전히 손실되었다는 것으로 증명되었다. 다양한 세크레타제 (α-, β- 및 γ-)에서의 이러한 배합된 유리한 성질에 대해 어떠한 다른 화합물도 보고되어 있지 않다. 상기 결과는 M1 아고니스트와 스타틴과 같은 콜레스테롤 저하제의 배합이 M1 아고니스트의 투여량을 감소시킬 수 있고, 따라서 M1 아고니스트의 가능한 부작용을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 35
AF267B는 과콜레스테롤 토끼의 피질에서의 상승된 β-아밀로이드를 감소시킨다.
식이성 콜레스테롤은 토끼 뇌에서 알쯔하이머-유사 Aβ-면역반응성을 유도한다 [Sparks et al. Exp Neurol 1994; 126: 88-94; Sparks Nutr Metab Cardiovasc Dis 1997; 7: 255-266]. 뉴질랜드 백색 수컷 토끼에게 음식 및 물을 자유롭게(ad libiturn) 제공하였다. 동물에게 표준 사료(chow) 또는 2 중량％ 콜레스테롤 (퓨리나(Purina))이 보충된 사료를 10주 동안 공급하였다. 한 군의 동물에게 0.9％ 멸균 식염수를 s.c.로 1일 1회 주사하고, 콜레스테롤을 공급한 다른 군의 동물에게 약물 (AF267B; 1 mg/체중 1 kg, s.c.)을 투여하였다. 처리 10주 후, 동물을 희생시키고, 모든 단편을 동시에 염색시켜서 Aβ 면역조직화학에 대해 평가하였다.
사료를 공급한 토끼의 피질 및 문(hilus)에서 제한된 신경세포 Aβ가 관찰되었다. 식염수를 주사한 콜레스테롤-공급 동물 중에는, 확인가능한 Aβ가 함유된 풍부한 신경세포가 존재하였다. 이러한 신경세포는 대조군 동물에서 때때로 확인되는 것보다 명백히 더 작았다. Aβ 면역반응성을 발현하는 신경세포의 수는 AF267B를 투여한 동물에서 25 내지 30％ 감소되었고, 면역반응성의 강도는 대략 50％ 감소되었다. 또한, AF267B 처리 후 Aβ를 발현하는 신경세포는 대조군 뇌에서 확인된 것과 크기 면에서 유사하고, 그러므로 식염수를 주사한 콜레스테롤-공급 토끼 뇌에서 발견된 것보다 더욱 크다는 것을 주목하였다.
상기 결과는 AF267B가 고콜레스테롤혈증으로 인해 뇌에서 상승된 Aβ 면역반응성을 감소시키는 데 효과적이고, 상기 Aβ 펩티드를 함유하는 신경세포에 대한 신경보호 효과를 가진다는 것을 나타낸다.
실시예 36
AF267B는 저콜린성 토끼 (병소가 있는 토끼)의 피질에서 상승된 β-아밀로이드를 감소시킨다.
실험적으로 유도된 피질 콜린성 탈신경은 피질 Aβ 농도의 생화학적 상승 및 조직학적 Aβ 침착을 유발하고 [Beach et al, Neurosci Lett 283: 9-12,2000], 정상 동물에 무스카린성 M1-선택적 작용제를 투여하는 것은 CSF Aβ 농도를 감소시킨다는 것은 공지되어 있다 [Beach et al Brain Res. 905: 220-223, 2001]. 본 실시예에서, nbm 병소가 있는 동물을 M1-선택적 아고니스트인 AF267B로 처리하여, CSF 및 피질 Aβ에서의 병소-유도성 증가가 만성 M1 수용체 활성화로 예방되거나 감소될 수 있는지의 여부를 결정하였다.
각각 약 2.5 kg (어린 성체)인 28개의 암컷 뉴질랜드 백색 토끼를 사용하였다. 콜린성 핵 기저 거대세포 (nbm)의 21개의 병소를 수용하였다. 저-친화성 뉴로트로핀 수용체, p75에 대항하여 지시되는 모노클로날 항체 ME20.4와 접합된 리보솜 독소 사포린으로 이루어진 면역독소의 일방적인 i.c.v.주사로 병소를 발생시켰다. ME20.4 항체를 원숭이 p75에 대항하여 제조하고, 이를 또한 토끼 p75로 인정 하였다. 면역독소의 양은 12 ㎕ 중 32.4 ㎍이었고, 이를 정수리에서 측면 2 mm인 우측 뇌실로 전달하였다. 7마리 동물은 멸균 생리 식염수의 i.c.v. 주사를 수용하였다 (허위(sham) 병소). 면역독소를 수용한 동물들을 7마리씩 3군으로 분할하였다. 한 군은 1일 2회 AF267B의 s.c. 주사를 수용하였고, 각각의 용량은 2 mg/kg의 1일 총 용량에 대해 1 mg/kg이었다. 다른 군은 s.c. 삼투 펌프를 이용하여 3 mg/kg의 1일 용량으로 생리 식염수 중의 피소스티그민 헤미살리실레이트를 수용하였다. 세번째 군은 멸균 식염수 s.c. 주사를 1일 2회 수용하였다. 허위 병소를 수용한 동물에게 멸균 생리 식염수로 충전한 s.c. 삼투 펌프를 이식하였다. 수술 4주 후 동물을 안락사시켰다. AF267B 주사를 수용한 동물의 경우, 모든 동물은 희생되기 대략 2 내지 3시간 전에 최종 주사를 수용하였다. 4마리의 동물이 조급하게 사망하고 [(1마리의 대조군 동물 및 3마리의 피소스티그민-처리된 동물), 1마리는 수술후 출혈 때문에, 1마리는 비제어성 발작이 발전한 후 안락사시켰고, 1마리는 수술 전 마취제의 i.m. 주사로 유도된 뒷다리부유(hindlimb) 마비 때문에 안락사시켰고, 1마리는 부검시 사망 원인이 밝혀지지 않은 채 죽은 채로 발견되었음)], 이를 분석에서 배재시켰다. 희생시에 모든 동물의 대조(cisterna magna)로부터 뇌척수액을 취하고; 뇌를 제거하고, 0.5 cm 슬라이스로 관상적으로(coronally) 슬라이싱하였다. 시상하부의 수준인 1개의 슬라이스 (상기 슬라이스는 해마 뿐 아니라 피질을 보유함)를 4％ 파라포름알데히드에 고정시키고, Aβ에 대한 항체로 면역조직화학적 염색을 진행하였다. 다른 슬라이스를 드라이 아이스의 시트상에서 동결시켰다 (상기 다른 슬라이스는 대뇌, 뇌간 및 소뇌의 고정되지 않은 0.5 cm 관상 슬라이스임). 4개의 군의 2마리 (nbm 병소를 갖고 생리 식염수로 처리한 것 및 nbm 병소를 갖고 AF267B로 처리한 것)에서 얻은 CSF에서 Aβ 및 sAPPα에 대한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
CSF Aβ를 나타내는 4 kDa 밴드의 정량에서는, 대조군 동물에 비해 AF267B-처리된 동물에서 CSF Aβ의 현저한 감소가 나타났다 (p = 0.05, 짝없음, 2-꼬리 t-시험). sAPPα를 나타내는 밴드의 강도에서는 유의한 차이점이 없었다. 모든 동물에서, 동물의 동일한 2개의 군에서 얻은 부분을 Aβ 노출된 혈관 Aβ 침착 뿐만 아니라 혈관주위 확산 침착에 대해 면역조직화학적으로 염색하였다. 병소-및-처리 연구는 AF267B 및 피소스티그민 모두 조직학적 침착 및 Aβ의 생화학적 수준을 감소시킴을 보여준다. 조직학적 Aβ 침착은 피소스티그민 및 AF267B에 대해 각각 병소가 있는 비처리 군의 6.4％ 및 12％로 감소되었다. 변화를 분석함으로써, 2개의 처리 군은 Aβ 침착에 대해 유의하게 (p = .01) 상이하고 (Aβ 침착은 병소가 있고 AB267B로 처리된 동물에서는 낮은 것에 비해, 병소가 있고 비처리된 동물에서는 높았음), AF267B 및 피소스티그민-처리 군이 모두 Aβ 침착에 대해 병소가 있고 비처리된 군과는 유의하게 (p < .05, 피셔(Fisher's) LSD) 상이함을 발견하였다 (Aβ 침착은 병소가 있고 AB267B 또는 피소스티그민으로 처리한 동물에서는 낮은 것에 비해, 병소가 있고 비처리된 동물에서는 높았음).
상기 결과는 nbm 병소가 있는 동물을 AF267B로 치료하는 것이 병소에 의해 유도된 CSF Aβ 및 뇌 Aβ 침착의 증가를 감소시킴을 나타내고, AF267B와 같은 M1 무스카린성 아고니스트가 AD에 대한 예방 요법으로서 사용될 수 있음을 암시한다.
실시예 37
다양한 손상 (혈청에서 발견되는 성장 인자들 또는 성장 인자로부터의 손실, β-아밀로이드, 산화성 스트레스)으로 유도된 세포독성 및 프로그래밍된 세포 사멸 (아폽토시스)의 예방
M1 mAChR 배양물로 형질감염된 융합성 래트 크롬친화성세포종 세포를 트립신으로 분리시키고, 세척하고, 래트 꼬리 콜라겐 (시그마, 이스라엘)으로 예비코팅된 24-웰, 6-웰, 60-mm 또는 100-mm 플레이트에 플레이팅하였다. 혈청-비함유 매질에서 몇몇 실험을 수행하였다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드 (MTT) 검정을 위해, 세포 (1.5 x 104)를 다양한 약물들과 함께 또는 이들 없이 혈청-비함유 매질 중에서 96-웰 콜라겐-예비코팅된 플레이트에 24시간 동안 플레이팅하였다. 분화를 위해, 1％ FCS 및 1％ HS의 존재하에 50 ng/ml NGF를 첨가하여 7일 동안 세포를 성장시켜, 완벽한 분화를 유발시켰다. 콜라겐으로 예비코팅된 100-mm 플레이트 (플레이트 당 5 x 105개의 세포; MTT, 형광 활성 세포 분류기 (FACS) 활성) 또는 챔버-슬라이즈(Chamber-Slides) (1.5 x 104개의 세포; 투넬(TUNEL)) 또는 폴리-L-리신으로 예비처리된 13-mm 유리 커버슬립에서 24-웰 플레이트 (1 웰 당 7500개의 세포; DAPI)로 세포를 성장시켰다. 7일 후, 세포를 세척하고, 매질을 혈청-비함유 매질로 대체하거나, 세포를 분리하여 혈청-비함유 매질에 다시 플레이팅하였다. 혈청-비함유 매질 중의 세포를 이전에 "성숙시킨(aged)" A β 펩티드 또는 H202로 처리하였다. 달리 기술하지 않는다면, 지시된 시간 동안의 손상과 함께 시험 화합물을 첨가하였다.
세포 생존력 검정:
세포를 100 ㎕ 매질 중의 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다양한 처리물에 노출시킨 후, 인산염-완충화된 식염수 (PBS) 중 5 mg/ml MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드; 시그마, 이스라엘] 용액 10 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 염화수소 산-이소프로판올을 첨가하였다 (0.04 N HCl/이소프로판올 100 ㎕). 570 nm의 파장에서 ELISA 판독기를 이용하여 플레이트를 판독하였다.
DNA의 핵 염색:
세포를 성장시키고, 유리 커버슬립상에 처리하였다. 처리 후, 세포를 -20℃에서 5분 동안 냉각 메탄올 중에 고정시킨 후, 4℃에서 2분 동안 냉각 아세톤으로 처리하고, PBS 중에서 세척하였다. 세포 핵 중 염색질 농도의 가시화를 가능하게 하는 삽입제 DAPI (4,6-디아미디노-2-페닐인돌; 5 mg/ml, 시그마, 이스라엘)로 커버슬립을 실온에서 15분 동안 형광 염색하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 22 mM 1,4-디아자비시클로(2,2,2)옥탄 (시그마, 이스라엘)을 함유하는 글리세롤의 용액 중에 탑재시켜 페이딩을 예방하고, 형광 현미경으로 핵 염색질 형태에 대해 관찰하였다. 아폽토시스 세포 및 생존 세포를 계수하였다 (커버슬립 당 200개의 세포, 각 실험은 2벌로 수행함).
투넬 검정:
본 방법은 개별 아폽토시스 세포에서의 DNA 단편화를 나타내었다. 투넬 (말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 (TdT) 매개된 dUTP 닉 말단 표지화) 방법은 3'OH 말단의 DNA 단편을 형광-dUTP (뵈링거 만하임, 독일)로 효소적으로 표지화하였다 (DNA 가닥 파괴를 나타냄). 요약하자면, 하기와 같이 처리하였다; 챔버 슬라이즈에서 성장된 세포를 pH 7.4에서 30분 동안 실온에서 PBS 중 파라포름알데히드 용액 (4％)에 고정시켰다. PBS로 세척한 후, 0.1％ 트리톤 X-100, 0.1％ 시트르산나트륨 용액을 이용하여 2분 동안 얼음에서 (4℃) 세포에 침투시키고, PBS로 세척하고, 투넬 반응 혼합물 50 ㎕을 습윤 챔버 중에서 1시간 동안 37℃에서 각 샘플에 첨가하였다. 에반스 블루 시약 (PBS 중에 1:2000로 희석된 것)을 5분 동안 첨가하고, 슬라이스를 형광 현미경으로 관찰하였다.
형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석:
세포를 7일 동안 분화시키고, 트립신을 사용하여 플레이트로부터 떼어냈다. 106개 세포를 무혈청 배지 중에서 각종 처리를 하거나 하지 않은 상태로 콜라겐-코팅된 50 mm 플레이트에 다시 플레이팅했다. 200 g에서 원심분리한 펠렛을 프렙하여 PBS 300 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 차가운 메탄올 (-20℃) 4 ㎖을 각 시험관에 첨가하고, 15분 동안 -20℃에서 고정시켰다. 세포를 PBS 중에 세척하여 회전시키고, PBS 1 ㎖ 중에 재현탁했다. 요오드화프로피듐 스톡(stock) 용액 (시그마 제품; 10 mg/㎖) 5 ㎕ 및 20 mg/㎖ RNAse A 용액 5 ㎕을 5 내지 10분 동안 실온에서 첨가했 다. 개개의 핵의 형광을 488 nm 파장에서 여기시켜 575 ±21 nm BP 필터로 수집하는 형광 활성화 세포 분류법 (FACScan; 벡톤 딕킨슨 코포레이션(Becton Dickinson Corp.) 제품)을 이용하여 측정하였다. 데이타를 셀 퀘스트(Cell Quest) 소프트웨어 컴퓨터 시스템으로 분석하였다. 본 발명자들은 이 방법에 의해 세포의 DNA 함량을 측정할 수 있었다 (아폽토시스가 일어난 세포에서 DNA가 더 적음). 세포 주기의 G1기 세포들은 유사분열 이후의 것이었고, G2/M기 세포 (유사분열 이전의 세포 및 유사분열 동안의 세포)보다 DNA가 더 적었다. 아폽토시스가 일어난 세포는 전-G1(pre-G1)기인 것으로 확인되었다.
MTT 분석법은 세포 내 전자전달계의 통합성(integrity)을 반영하는 1차 초기 변화를 측정하고 세포의 산화환원 활성에 대한 판독치를 제공한다. 이 시험은 β-아밀로이드에 의해 매개된 세포 사멸 메카니즘의 특이적인 초기 지표로서, 신속한 억제 반응 검출에 이용될 수 있다. M1 mAChR 세포 단독으로 형질감염된, 기아 상태의 미분화 래트 크롬친화성세포종 세포에서는 세포 생존율이 10 내지 20％ 감소되었고, 이 효과는 신경독성 전장 β-아밀로이드 (β-A1-42) 펩티드 및 이의 단편 (β-A25-35)의 농도를 증가 (0.5 내지 20 μM)시킬 때 더욱 증대되었다 (최대 50 내지 60％ 억제). 이들 세포를 혈청-고갈시키고 무스카린성 아고니스트의 부재 또는 존재하에 β-아밀로이드로 처리했을 경우에 카르바콜 또는 AF292, AF150(S) 및 AF267B를 첨가하면, β-A25-35 (1 μM)에 의해 유도된 24시간 후의 세포 사멸이 유의하게 감쇠되었다.
M1 mAChR 세포로 형질감염된 세포를 H2O2에 의해 유도된 직접적인 산화적 스트레스로부터 보호하는데 있어서 카르바콜, AF150(S), AF267B 및 AF292의 잠재력을 시험하였다. 이들 아고니스트는 세포를 H2O2에 의해 유도된 독성으로부터 보호하는 것으로 관찰되었다.
놀랍게도, 무스카린성 아고니스트는 항산화 잔기가 부착된 무스카린성 약물작용발생단을 갖는 화합물에서 검출되었다. 이들로는 항산화 잔기가 연결되어 있는 선택적인 M1 아고니스트 잔기를 포함하는 구조의 AF604, AF700 및 AF704 등이 있다. 주목할 만한 것은 AF700, AF703 및 특히 AF704 및 AF704B가 β-A25-35 (10 및 20 μM)에 의해 유도된 세포독성에 대하여 카르바콜 및 AF267B보다 더욱 효과적이라는 점이다.
세포 핵 내의 염색질 응축을 가시화시킬 수 있는 인터칼레이팅제인 DAPI를 사용했을 때, Aβ 또는 H2O2 처리 후에는 아폽토시스로 인한 세포 사멸이 발생하는 것으로 나타났다. Aβ를 처리한 세포는 수축하여 기능을 잃게 된, 아폽토시스가 일어난 세포의 모양을 나타내었다. DAPI 염색에 의해, 아폽토시스 과정의 지표인 핵의 응축 및 단편화된 염색질이 나타났다. AF150(S) 및 AF267B는 이들 세포가 아폽토시스되지 않도록 보호한다는 것을 알아냈고 신경세포-유사 기능도 잘 관찰되었다.
M1 수용체로 형질감염된 세포를 24시간 동안 기아 상태로 둔 후에는 아폽토시스로 인한 세포 사멸이 2배 증가하는 것으로 관찰되었다 (형질감염되지 않은 세 포에서는 이러한 증가가 관찰되지 않음). AF150(S) 및 AF267B는 기아에 의해 유도된 아폽토시스로 인해 세포 사멸되는 것을 유의하게 보호하였다. 아트로핀 (비-선택적인 무스카린성 길항제) 및 피렌제핀 (M1 선택적 길항제)은 오직 M1 형질감염된 세포에서만 무스카린성 아고니스트의 보호 효과를 반전시켰다.
M1 mAChR로 형질감염된 세포에 β-A25-35 (25 μM) 또는 β-A1-42 (25 μM)를 처리하면, 아폽토시스로 인한 세포 사멸이 기아의 경우에 비해 1.5 내지 2배 더 증가하였다. 이들 2가지 펩티드 모두가 선택적 독성 효과를 나타냈으나, 역방향 펩티드 (β-A35-25)를 사용한 경우에는 아폽토시스를 유도하지 않는 것으로 나타났다. AF150(S) 및 AF267B는 Aβ에 의해 유도된 아폽토시스를 M1 형질감염된 세포에서만 방지하였으며, 무스카린성 길항제는 이러한 효과를 반전시켰다.
H2O2 (25 및 50 μM)에 의해 유도된 산화적 손상은 아폽토시스가 일어난 집단을 기아에 의한 경우보다 각각 1.5배 및 2.5배 증가시켰다. AF150(S) 및 AF267B는 H2O2에 의해 유도된 아폽토시스를 방지하였으며, 아트로핀이 이러한 효과를 반전시키는 것을 볼 때, 이들의 효과는 M1 mAChR 활성화에 선택적이었다.
TUNEL 방법 역시 아폽토시스가 일어난 개개의 세포에서 아폽토시스에 따라 발생하는 DNA 단편화를 나타낸다. 25 μM β-아밀로이드25-35를 처리한 후에는 TUNEL-양성으로 염색된 세포의 수가 증가하여 아폽토시스 과정을 지시한 반면, AF150(S) (100 μM)는 아폽토시스를 차단할 수 있어서 대부분의 세포가 TUNEL-음성 으로 염색되었다. 세포는 그의 기능을 유지했으며 오직 세포질만이 적색으로 염색되었다.
아폽토시스가 일어난 집단의 정량화는 각종 처리 후에 FACS 분석을 이용하여 세포의 DNA 함량을 측정하여 수행하였다. M1 형질감염된 세포 중에서 혈청-고갈된 신경세포 배양물로부터 얻은 DNA 히스토그램에 의해, 아폽토시스가 일어난 세포 집단에서는 분해된 (서브이배체(subdiploid)) DNA 함유물이 나타난다는 것이 밝혀졌다 (M1 = 전-G1기). 24시간 동안의 기아 후에는 전체 세포의 약 20％에서 아폽토시스에 의한 사멸이 발생했다. 카르바콜, AF150(S) 및 AF267B는 기아 동안에 세포가 아폽토시스에 의해 사멸되지 않도록 보호하였다. β-아밀로이드 25-35 또는 β-아밀로이드 1-42는 아폽토시스가 일어난 집단을 세포의 30 내지 35％로 증가시켰다. 카르바콜, AF150(S) 또는 AF267B의 동시 첨가는 아폽토시스가 일어난 집단을 기아 후에 관찰된 값에 유의할 정도로 훨씬 못 미치는 수준으로 저하시켰다. 무스카린성 아고니스트의 효과는 10 μM 아트로핀에 의해 차단되어, 생존 효과에 M1 mAChR의 활성화가 관여함을 지시하였다. 또한, 형질감염되지 않은 세포에서는 아고니스트가 기아 및 β-아밀로이드에 의해 유도된 아폽토시스에 비효과적이었다.
실시예 38
N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA)에 의해 유도된 세포 사멸에 대한 보호
18 내지 19일 된 배아 래트 (스프라그 돌리 래트)의 뇌를 기계적으로 해리시켜, 래트 뇌의 초대 세포 배양물을 프렙하였다. 뇌를 꺼내어 6 mg/㎖ 글루코스를 함유하는 차가운 게이스 밸런스드 염 용액 (GBSS, 깁코, 비알엘 (Gibco, BRL) 제 품)에 넣었다. 해마 및 피질을 분리하여 6 mg/㎖ 글루코스, 2 mM L-글루타민 (이스라엘 베트-해메크에 소재하는 바이올로지칼 인더스트리스 제품), 1000 I.U/㎖ 페니실린 G 나트륨 및 3％ 울트로세르 G (ultrosere G) (깁코, 비알엘 제품)를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, 이스라엘 베트-해메크에 소재하는 바이올로지칼 인더스트리스 제품)로 옮겼다. 가열 연마한 파스퇴르 파이펫으로 세포를 해리시킨 후에, 생성된 세포 현탁물을 붕산염 완충액 중의 1 mg/㎖ 폴리-L-리신 (30,000 내지 70,000 MW, 시그마 제품)으로 미리 코팅해 둔 조직 배양 플레이트에 플레이팅했다. 세포를 96웰 배양 플레이트에 80000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하거나, 또는 12웰 배양 플레이트에 400000개 세포/웰 (해마 세포) 및 600000개 세포/웰 (피질 세포)의 밀도로 플레이팅하였다. 세포 배양물을 37℃의 5％ CO2/95％ O2에서 약 2주 동안 세포 성장 배지 중에 유지했다. 배양 후 3 내지 4일이 지난 뒤에 5-플루오로-2'-데옥시유리딘/유리딘/시토신 아라비노시드 혼합물 (5 mM의 최종 농도)을 첨가함으로써 신경교 세포 증식이 정지되었다.
NMDA에의 노출을 평가하기 위해서, 96웰 배양 플레이트에 플레이팅한 배양 제10일의 피질 및 해마 세포 배양물을 100 또는 200 μM NMDA (미국에 소재하는 알비아이(RBI) 제품)에 노출시켰다. 화학식 (I)의 화합물들에 의한 신경보호 효능을 20 μM MK801 (비-경쟁적 NMDA 수용체 길항제)에 의해 유발된 효능과 비교하였다. 또한, 대조군으로서 세포 배양물을 배지 단독에 노출시키는 실험을 병행하였다. 신경세포를 광범위하게 손상시키기 위해서, 모든 노출은 신경세포의 세포 사멸 평 가 전의 20 내지 24시간 동안 수행하였다. 신경독성은, {2,3-비스[2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐]-2H-테트라졸륨-카르복스아닐리드 내염]}-기재의 분석법 ([Klausner, Biotechnol 5:779-786, 1987], [Lipman et al., Cytotechnol 8:129-176, 1992])을 이용하여 살아있는 세포에서의 미토콘드리아 활성도를 측정함으로써 정량적으로 평가하였다.
AF150(S) 및 AF267B는 세포 사멸의 방지에 효과적이었다. 100 μM NMDA에 의해 유도된 독성에 대한 이들 아고니스트 100 μM의 신경보호 효능은 20 μM MK801에 의해 유발된 효능과 유사하였으나, 200 μM NMDA에 대해서는 약간 낮았다.
실시예 39
1. tau 단백질 과인산화에 미치는 영향
초대 세포 배양물을 실시예 38에 기재한 바와 같이 성장시켰다. 세포 상등액을 제거하고, 세포를 배지 중에서 1회 세척한 후에 0.2 mM EDTA를 함유하는 차가운 인산염 완충 염수 pH = 7.4 (PBS) 용액을 첨가하였다. 세포를 고무 폴리스맨으로 긁어내어 에펜도르프 튜브로 옮기고 4℃에서 원심분리했다. 세포 펠렛을 프로테아제 억제제 (5 유닛/㎖ 아프로니틴, 5 mg/㎖ 펩스타틴, 5 mg/㎖ 류펩틴 및 O.1 mM PMSF, 시그마 제품)를 함유하는 용균 완충액 (5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1％ Triton, 150 mM NaCl) 중에 재현탁시켜 4℃에서 원심분리했다. 상등액을 에펜도르프 튜브로 옮겨서 분석시까지 -20℃에 보관했다. tau-1 면역반응성 (Ser199에서 인산화되지 않은 tau를 인식하는 항체)의 정도를 웨스턴 블럿팅으로 측정하였다.
AF150(S) 및 AF267B는 피질 및 해마 세포 배양물 모두에서 tau 면역반응성을 상승시키는데 있어서 1 내지 100 μM 범위에서 효과적이었다.
2. tau 인산화에 미치는 영향 및 Aβ에 의해 유도된 tau 인산화 효과의 길항작용
Ser199/202에서 인산화된 tau를 인식하는 항체인 AT8 항체를 사용한 면역블럿팅을 포함하는, 문헌 [Sadot et al., J. Neurochem. 66:877-880, 1996]에서 고안된 실험을 수행하여, AF267B, AF292, AF704 및 AF704B (100 μM)가 이들 세포 배양물에서 tau 단백질의 탈인산화를 대조군 수준으로 유도함을 알아냈다. M1 아고니스트를 항산화 잔기에 연결시키면 tau 인산화가 감소될 수 있으며, 이는 산화적 스트레스 및 tau 과인산화로 인한 손상이 조합되어 발생한 다양한 CNS 질환 상태에 대한 새로운 치료 전략을 제공하는 것이다.
실시예 40
래트의 제1형 성상세포 초대 배양물에서 ApoE의 합성 및 분비에 미치는 영향
제1형 성상세포의 초대 배양물은 스프라그 돌리 래트의 피질에서 유래한 것이었다. 시험할 화합물을 배양 배지 중에 용해시키고, 세포에 첨가하여 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간 동안 두었다. 이어서, 문헌 [Poirier et al., Neuroscience 55:81-90 (1993)]에 기재된 바와 같이, 배지를 취하여 ApoE 단백질 수준을 면역블럿팅 분석으로 평가할 때까지 동결 상태로 유지시켰다. 별법으로, 문헌 [Cedazo-Minuez et al., Neurosci 105:651-661, 2001]의 방법을 이용할 수도 있다. 제96시간에서 AF102B는 ApoE 대사 (합성 및 분비)에 비활성이었다. 화합물 AF267B 및 AF150(S) (더 적은 정도)는 시간 경과에 따라 ApoE 생성을 억제하였으며, 최대 효과는 제96시간에 나타났다. 관찰된 효과 (60 내지 80％ 억제)는 화합물의 농도가 0.1 nM로 매우 낮을 때 일어났다. 이러한 결과는 상기 화합물이 래트 성상세포에서의 ApoE4를 비롯한 apoE 생성을 억제하며, 따라서 ApoE 생성 억제가 요구되는 치료법에 사용될 수 있음을 지시한다.
실시예 41
무스카린성 수용체에 대한, 표지된 프로브로서의 아고니스트와의 경쟁적 결합 분석
옥소트레모린-M (OXO-M)은 모든 무스카린성 수용체 아형에 유사한 친화도로 결합하는 아고니스트이다. [3H]OXO-M 결합을 대체하는 시험 화합물의 능력은 수용체 아고니스트 결합 부위에 대한 시험 화합물의 친화도를 나타내는 척도이다. [3H]OXO-M 결합에 대한 AF292 및 그의 거울상이성질체인 AF291의 경쟁은 Ki값이 각각 0.27 및 6.56 μM였는데, 이는 완전 아고니스트인 카르바콜의 Ki값인 0.05 μM과 비교된다.
OXO-M은 모든 mAChR 아형에 비-선택적으로 결합하지만, 무스카린성 길항제인 피렌제핀 (PZ)은 M1 수용체에 우선적으로 결합한다. 이때, PZ의 Ki값에 대한 OXO-M의 Ki값의 비율은 시험 화합물의 선택도에 대한 지표가 될 수 있다. 이 비율이 적 을 수록, 시험 화합물이 더욱 M1 선택적이다. 래트 피질 막에의 [3H]PZ 결합에 대한 AF292 (Ki = 1.39 μM) 및 그의 거울상이성질체인 AF291 (Ki = 10.7 μM)의 경쟁에 의해, AF292가 활성 거울상이성질체인 것으로 나타났다. OXO-M/PZ 비율은 약 0.36으로서, M1 수용체에 대한 중간 정도로 높은 선택도를 나타낸다.
실시예 42
무스카린성 수용체 선택도
1. 인간 무스카린성 수용체 아형으로 형질감염된 세포 배양물에서의 기능 연구
1.1. AF292를 문헌 [Gurwitz et al., Eur. J. Pharmacol. 267, 21, 1993]의 방법에 따라 포스포이노시타이드 (PI)의 가수분해를 활성화시키는데 있어서 인간 M1 수용체에 대한 그의 아고니스트 또는 길항제 성질, 그의 효능 및 그의 선택도에 대해 시험하고, M3 수용체와 M5 수용체에 대한 값과 비교하였다. 상기 화합물의 효과는 PI 가수분해 활성화에 있어서 아트로핀-민감성이었고, 이는 이들의 무스카린성 특성을 입증하는 것이다. AF292 및 AF267B는 M1 수용체에 대한 부분적인 아고니스트로서, 본 패러다임에서 PI 턴오버(turnover)와 관련하여 측정한 카르바콜에 의한 활성에 비해 각각 약 35％ 및 약 66％ 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. AF292는 AF267B (M3에 대한 카르바콜 활성의 약 30％)과 비교할 때 M3 및 M5 수용체에 대하여는 활성을 전혀 나타내지 않았다. AF292는 M1 수용체에 대하여는 부분적인 아고니스트인 동시에 M3 수용체에 대하여는 약한 길항제 (pKb = 0.66 μM)였으 며, M2 또는 M5 mAChR에 대하여는 아고니스트 활성을 나타내지 않았다. M2 수용체에 대한 효과는 카르바콜에 의한 활성화 이후에 세포내 Ca 이온의 증가를 나타내는 변형된 세포 배양물로 측정하였다. 카르바콜이 M2 mAChR에 대하여 유도하는 활성은 8배 증가되었으나, AF292는 시험한 모든 농도 (10-9 내지 10-3 M)에서 아고니스트로서 비활성이었다.
1.2. AF292를 문헌 [Gurwitz et al., Eur. J. Pharmacol. 267, 21, 1993]의 방법에 따라 아라키돈산 (AA)의 가수분해를 활성화시키는데 있어서 인간 M1 수용체에 대한 그의 아고니스트 또는 길항제 성질, 그의 효능 및 그의 선택도에 대해 시험하고, M3 수용체와 M5 수용체에 대한 값과 비교하였다. AF292는 M1 mAChR에 의해 유도된 AA 방출에 대한 활성 (80％)이 PI 턴오버에 대한 활성 (35％)보다 더욱 강력하였으나, 역시 M3 및 M5 mAChR에 대한 아고니스트 (AA 방출)로서는 비활성이었다. 따라서, AF292는 PI (포스포리파제 C를 통해 매개됨)보다 M1 mAChR에 의해 매개된 AA 방출 (포스포리파제 A2를 통해 매개됨)에 대하여 더욱 효능있는 아고니스트이다. 요약하면, AF292는 M1 mAChR에 대한 아고니스트로서 고도로 선택적일 뿐만이 아니라 선택한 G-단백질의 차별적 활성화 (예를 들어, 모든 G-단백질이 AF292에 의해 동일한 정도로 활성화되는 것이 아니며, 이들 수용체 모두를 동일한 정도로 활성화시키는 비-선택적인 mAChR 아고니스트로서 작용하는 카르바콜과는 다름)까지 발휘한다.
2. 무스카린성 수용체 및 기타 시스템에 대한 결합 연구
2.1. mAChR 수용체에 대한 하기의 리간드를 사용한 경쟁적 결합 연구에서, AF267B는 M1 mAChR 아형에 대하여 고도로 선택적이며: QNB [래트 피질 (CTX) 막에서의 무스카린성 길항제] (Ki = 49.6±9 μM); QNB [래트 소뇌 막에서의 무스카린성 길항제] (Ki = 45.2 ±10.8 μM); 피렌제핀 (CTX에서의 M1 선택적 길항제) (Ki = 3.74 ±0.59 μM); 옥소트레모린-M (CTX에서의 무스카린성 아고니스트) (Ki = 1.62 ±0.34 μM]; 비교 - 세로토닌, 5HT3 104 M에서 51.3％ 억제; 아편양제제/아편제제, 104 M에서 52.5％의 비-선택적 억제;
또한 아드레날린성(A), α1A, 아드레날린성; α1B, 아드레날린성; α2A (인간 재조합); 아드레날린성, α2B; 아드레날린성, α2C (인간 재조합); 아드레날린성, β1; 아드레날린성, β2; 벤조디아제핀 (BZD), 말초; 클로자핀; 도파민, D1; 도파민, D2 (인간 재조합); 도파민, D3 (래트 재조합); GABA A, 아고니스트 부위; GABA A, 벤조디아제핀, 중추; 글루타메이트, AMPA 부위; 글루타메이트, 카이네이트 부위; 글루타메이트, NMDA 아고니스트 부위; 글루타메이트, NMDA, 글리신; 글리신, 스트리크닌-민감성; 히스타민, H1; 히스타민, H2; 히스타민, H3; 니코틴성; 신경절 부위; 니코틴성, 신경세포 부위; 세로토닌, 5HT1A (인간 재조합); 세로토닌, 5HT1B; 세로토닌, 5HT4: 세로토닌, 5HT6 (래트 재조합); 세로토닌, 5HT7 (래트 재조합); 콜린 아세틸트랜스퍼라제; 글루탐산 데카르복실라제; 모노아민 옥시다제 A, MAO-A; 모노아민 옥시다제 B, MAO-B에는 전혀 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다.
2.2. 결합 연구에서, AF292 (10 μM)는 mAChR 아형 {M1 (인간) (55％), M2 (인간) (61％), M3 (인간) (55％)}에 고도로 선택적이며, 아데노신 A1 (인간); A2A (인간); 아데노신 A3 (인간); 알파 1 아드레날린성 (비-선택적); 알파 2 (비-선택적); 베타 1 (인간); 안지오텐신, AT1 (인간 재조합); 벤조디아제핀 (BZD) (중추); 브라디키닌, B2 (인간 재조합); 콜레시스토키닌 (CCKA) (인간 재조합) (CCK1); 도파민 D1 (인간 재조합); D2S (인간 재조합); 엔도텔린, ETA (인간 재조합); GABA (비-선택적); 갈라닌, GAL2 (인간); 케모카인, IL-8B (인간 재조합) (CXCR2); 케모카인, CCR1 (인간 재조합); 히스타민, H1 (중추); 히스타민, H2; 멜라노코르틴, MC4 (인간 재조합); 멜라토닌, ML1; 타키키닌, NK2 (인간 재조합); NK3 (인간 재조합); 신경펩티드, Y1 (인간); 신경펩티드, Y2 (인간); 뉴로텐신, NT1 (인간 재조합) (NTS1); 아편제제, 델타 2 (인간 재조합) (DOP): 아편제제, 카파 (KOP); 아편제제 뮤 (인간 재조합) (MOP); 오르파닌, ORL1 (인간 재조합) (NOP); 세로토닌, 5-HT1A (인간 재조합); 세로토닌, 5-HT1B; 세로토닌, 5-HT2A (인간 재조합); 세로토닌, 5-HT3 (인간 재조합); 세로토닌, 5-HT5A (인간 재조합) (5-ht5A); 5-HT6 (인간 재조합); 5-HT7 (인간); 소마토스타틴, sst (비-선택적); 혈관활성 장 펩티드, VIP1 (인간) (VPAC1); 바소프레신 V1a (인간 재조합); Ca2+ 채널 (L, 베라파밀 부위); K+V 채널; SK+Ca 채널; Na+ 채널 (부위 2); Cl-채널; 노르에피네프린 NE 트랜스포터 (인 간)에는 전혀 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 43
노화된 마이크로시브(microcebe)에서의 효과
노화된 마이크로시브는 노인 및 AD 환자에서 관찰된 것과 유사한 인지 결핍 및 대뇌 병소를 나타낸다. 따라서, 이것은 AD의 3가지 주요 증거 {플라크 (Aβ), 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 (과인산화되고 응집된 τ) 및 인지 기능부전}를 모방하는, AD를 위한 우수한 동물 모델이다. 또한, 이 모델을 이용하여 MCI가 원인이 되는 AD를 모방할 수도 있다.
이 모델에서, AF150(S) [18개월 동안의 만성 처리]는 i) 인지 및 거동 장해를 개선시켰고, ii) 과인산화된 τ 단백질을 감소시키고, 응집된-τ 단백질 (예를 들어 병든 뇌의 지표)을 함유하는 신경세포의 수 및 쌍을 이룬 나선형 필라멘트의 수를 감소시켰으며, iii) 성상교세포증(astrogliosis) 및 염증을 감소시켰다. 이것은 AF150(S)가 AD를 치료하거나 AD의 영향을 변형시키기 위한 약물로서 사용될 수 있으며 오랜 기간의 치료 후에도 내성이 생기지 않는다는 것을 지시한다.
실시예 44
마우스에서의 폐쇄성 두부 손상후, M1 아고니스트에 의한 신경거동 장해의 저하
문헌 [Chen et al., J Neurotrauma, 15:231-237, 1998]에 기재된 바와 같이, 마우스에서 폐쇄성 두부 손상 (CHI)을 유도하였다. 10 파라미터 (10 = 최악의 결과, 0 = 정상적 기능)를 배터리(battery)로 하여 신경계 중증도 스코어 (NSS)를 평 가하였다. CHI 후 5분이 지난 뒤에 시험 화합물 (체중 1 kg 당 화합물 1 mg)을 i.p. 주사하고, 위약을 처리한 동물과 비교하였다. 이와 같이 처리한 마우스를 평가하여 제1시간에는 손상의 중증도를 측정하였고, 제24시간 및 제48시간에는 회복률을 측정하였다. NSS는 다음과 같았다: 1) 대조군 (N = 10마리): 7.80 +/- 0.25 (제1시간); 5.30 +/- 0.33 (제24시간); 4.20 +/- 0.47 (제48시간); 2) AF150(S) (N = 10마리): 8.00 +/- 0.21 (제1시간); 4.30+/-0.26** (제24시간); 2.90 +/- 0.23b (제48시간); 3) AF267B (N = 9마리): 7.89 +/- 0.26 (제1시간); 3.67 +/- 0.24* (제24시간); 2.89 +/- 0.26c (제48시간) [*p = 0.03; **p = 0.03; ap = 0.009; bp = 0.005; cp = 0.004].
시험한 모든 화합물은 운동 기능에 있어서 고도로 유의한 개선을 나타내었다. 2가지 균형(balance) 시험 (빔 워크(beam walk))에서는 AF267B를 처리한 동물에서 회복이 더욱 신속하였다 - [제24시간 - 대조군에서는 80％인데 비해 22％ (3 cm); 또는 제48시간 - 대조군에서는 80％인데 비해 33％ (2 cm)].
실시예 45
래트의 사회적 기억에 있어서의 AF150(S), AF267B
설치류에서의 사회적 후각 인식은 단기 기억에 관여하고 콜린성 약물에 민감한 것으로 밝혀진 바 있다 ([Dantzer et al., Psychopharmacol. 91:363-368, 1987], [Perio et al., Psychopharmacol. 97:262-268, 1989]). 본 실시예에서는 AF150(S) 및 AF267B가 정상(naive) 래트의 조사 거동에 미치는 영향을 시험하였다.
400 내지 530 g (4 내지 5개월령)의 수컷 위스타(Wistar) 래트 12마리를 사용하였다. 래트를 시험 14일 전에 따로 가두어 두었다. 40 내지 50 g (도착시)의 미성숙(juvenile) 위스타 래트를 6개 군으로 나누고, 이들을 성숙 래트를 위한 사회적 자극체로 이용하였다. 역전 명암 주기 (오후 2시 정각부터 오전 2시 정각까지는 불을 켜두었음)를 사용하면서 동물들을 21℃ ±1에 유지시켰다. 명암 주기 중 암기가 된지 7시간이 지난 후, 적색 조명하에 집어넣었다.
성숙 래트는 사회성 시험 시작 1.5시간 전에 희미한 조명의 실내에 넣어두었다. 모든 미성숙 래트를 실험 시작 30분 전에 케이지에 고립시켰다. 시험 시작시에, 성숙 래트를 키우는 케이지에 낯선 미성숙 래트를 5분 동안 넣어 두었다. 성숙 래트가 미성숙 래트를 조사하는데 소요된 시간을 기록하였다. 이어서, 성숙 래트에게 비히클 또는 시험 화합물을 즉시 (1 내지 2분) 처리하였다. 2시간 후에는 동일한 미성숙 래트를 동일한 성숙 래트와 5분 동안 더 대면시켰는데, 자극체인 미성숙 래트를 더이상 탐색하지 않는 일반적인 시간만큼 소요되었다 (즉, 성숙 래트는 미성숙 래트를 첫 대면 동안과 동일한 시간 동안 조사하였음). 따라서, 목적한 기억 증진 약물의 영향하에서는 동일 미성숙 래트 조사에 소요되는 시간이 저하될 것이라고 예측된다. 2일 후, 첫번째 노출에 사용한 래트와는 다른 미성숙 래트를 약물 또는 비히클 투여 후 2시간이 지난 성숙 래트와 대면시켰다. 이러한 다른 미성숙 래트에 대한 사회적 탐색에 어떠한 저하가 있다면, 이는 상기 약물의 효과가 비특이적임 (즉, 기억과 관련이 없음)을 반영하는 것으로 간주된다. 48시간의 기 간 동안에는 동일한 미성숙 자극체 동물로 2회 시험하지도 않았으며, 미성숙 동물을 1회 초과로 이용하지도 않았다.
미성숙 래트에게 첫번째로 노출시킨 직후의 성숙 래트에게 AF150(S) 또는 AF267B (0.5, 1 및 5 mg/kg, p.o.) 또는 비히클인 인산염 완충 염수 (PBS)를 투여하였다.
자극체인 미성숙 래트에 대한 사회적 조사에 소요된 시간을 측정 (초 단위)한 후에 각 동물에 대하여 두번째 노출:첫번째 노출의 비 (조사 기간의 비율 (RID; Ratio of Investigation Duration))로 표현하였다. 이와 같이 RID로 전환시킨 것은, 기본적인 수행능에 있어서의 개별차 및 일일 변동의 가능성을 최소로 하기 위한 것이었다 [Perio et al., Psychopharmacol. 97:262-268, 1989]. 따라서, 두번째 노출 동안에 조사 시간에 있어서의 임의의 저하는 RID가 1 미만이 되도록 할 것이며, 이는 상기 동물이 미성숙 래트를 기억한다는 것을 지시한다. 반복 측정치의 분석은 3원 ANOVA로 이루어졌으며, 이후의 비교는 주요 효과에 대한 간략한 대조 분석에 의해 이루어졌다.
AF150(S) 및 AF267B는 위약 군과 비교할 때 동일 미성숙 래트의 조사 시간을 투여량-의존 방식으로 감소시켰다. 다른 미성숙 래트를 두번째 노출에 이용한 경우에는 이러한 현상이 관찰되지 않기 때문에, 이러한 기억력 개선은 비특이적 효과에 의한 것은 아니다. 따라서, 2가지 화합물 모두가 정상 래트의 사회적 기억력을 용이하게 한다고 여겨진다.
상기 2가지 화합물의 전체 RID에는 유의한 차이가 없었지만, 유사한/다른 미 성숙 래트 및 2가지 약물 둘다의 투여량 사이의 상호관련성은 통계적으로 유의한 것으로 밝혀졌다 [F(3/33) = 14.9, p < O.0001]. 구체적으로, 2가지 화합물 모두가 시험한 모든 3가지 투여량에서 동일 미성숙 래트의 조사 시간을 위약의 경우에 비해 유의하게 단축시켰다 (p < 0.001). 추가로, 0.5 mg/kg 및 2가지 다른 투여량의 RID 사이에도 유의한 차이가 있음이 발견되었다 (p < 0.05). 1 및 5 mg/kg에 대해 관찰한 RID는 0.5 mg/kg의 경우에 대해 관찰한 값보다 유의하게 더 낮았다.
동일 미성숙 군 및 다른 미성숙 군의 RID 사이에서는 3가지 모든 투여량에서 유의한 차이가 발견되었다는 점을 명심해야 한다 (p < 0.1 내지 p < 0.001).
실시예 46
콜린독소 (AF64A)를 처리한 래트에서 AF267B 및 AF292가 수동적 회피 (PA)에 미치는 영향
수행한 일반적인 절차는 문헌 [Fisher et al., J. Pharmacol. Exptl. Therap., 257:392, 1991]에 기재되어 있다. AF64A (10 mM)는 아세틸에틸콜린 머스타드 HCl의 알칼리성 가수분해로 제조하였다. 에퀴테신 (0.3 ㎖/100 g, i.p.)으로 마취시킨 래트에게 AF64A (3 nmol/2 ㎕/측) 또는 염수 (2 ㎕)를 대뇌 측뇌실 (AP = -0.8, L = 정수리점으로부터 ±1.5 mm, DV = 두개골 표면으로부터 -4.8 mm)에 정위고정성 투여하여 양측에 주사하였다. 주입은 CMA 100 미세주사 펌프를 통해 30-게이지 주사 캐뉼라로 0.25 ㎕/분의 일정 속도로 이루어졌다. 캐뉼라를 주사하고 그 위치에 4분 동안 고정시켜, 상기 용액이 뇌실 내로 확산되도록 하였다. 쇼크 직후에는 화합물 또는 인산염-완충-염수 (PBS)를 1회 p.o. 투여했다. 훈련 후 72시간 이 지난 후에 정체(retention) 시험을 실시하였다.
AF64A를 주사한 모든 래트 (29.02 ±3.1초)와 염수를 주사한 모든 래트 (20.55 ±1.95초)의 초기 잠복시간(latency)에서 유의한 차이가 발견되었다 (F(1/72) = 5.13, p < 0.05). AF64A-주사와 약물 처리 사이에는 정체 잠복시간(retention latency)에 있어서 통계적으로 유의한 상호관련성이 발견되었다 (F(3/72) = 11.99, p < 0.001). AF64A를 주사하고 PBS를 처리한 래트에서의 정체 잠복시간 (67.1 ±18.9초)은 염수를 주사하고 PBS를 처리한 래트의 경우 (455.3 ±55.1)에 비해 유의하게 더 짧았다 (기억력이 더 불량함) (p < 0.001, 주요 효과에 대한 간략한 대조 분석에 의함).
AF64A를 주사한 래트에게 O.1 mg/kg AF267B를 처리했을 때의 정체 잠복시간 (440.7 ± 46.4초)과 1 mg/kg AF292를 처리했을 때의 정체 잠복시간 (447 ± 46.8초)은 AF64A를 주사한 래트에게 PBS를 처리한 경우보다 유의하게 더 길었다 (기억력이 더 양호함) (p < 0.001, 주요 효과에 대한 간략한 대조 분석에 의함). AF64A-래트에게 0.03 mg/kg AF267B를 처리했을 때의 정체 잠복시간 (105.7 ± 31.9초)과 AF64A-래트에게 PBS를 처리했을 때의 정체 잠복시간 사이에는 유의한 차이가 없었다. 염수를 주사한 군 중 어느 래트에서도 잠복시간 사이에 유의한 차이는 없었다.
AF64A를 주사한 래트에서는 PA 현상의 정체가 명백하게 방해된다는 것이 입증되었다. AF64A에 의해 유도된 정체 결핍의 감쇠에 있어서 AF267B의 최소 유효 p.o. 투여량은 0.1 mg/kg이었다. PA 연구에서, AF64A를 주사한 래트에게 PBS를 처 리했을 때보다 O.1 mg/kg AF267B 및 1 mg/kg AF292를 처리한 2가지 경우 둘다가 AF64A에 의해 유도된 정체 결핍을 개선시키는데 효능이 있었다. AF292의 최소 유효 p.o. 투여량은 1 mg/kg 미만일 수 있다.
실시예 47
래트에서 AF64A에 의해 유도된 인지 장해에 AF267B가 미치는 영향 - MWM 시험
AF64A 또는 염수를 주사한 스프라그 돌리 래트 (6개월령)를 모리스 수중 미로 (Morris Water Maze (MWM)) 작업으로 시험하였다. 사용한 패러다임은 관련 기억 요법에서의 공간 학습 능력을 평가하는 것이며, 훈련 (제1일 내지 제4일), 플랫폼 제거 시험(transfer test) (프로브 실험(Probe trial) - 제4일, 마지막 훈련 실험로부터 3분 후) 및 플랫폼 위치 반전 시험(reversal test) (제5일)을 수반하였다.
래트의 AF64A 처리 군 및 염수 처리 군 각각을 처치 4개월 후에 무작위로 4개의 처리 아군(subgroup) (n = 9마리)으로 나누었다: 제1 아군 내지 제3 아군에는 AF267B를 0.3, 1 및 3 mg/kg의 투여량으로 10 ㎖/kg 부피 중에 p.o. 처리하였고, 제4 아군 (대조군)에는 비히클인 10 mM 인산염 완충 염수 (PBS)를 동일 부피로 처리하였다. 약물 및 PBS는 거동 시험 시작 전에 5일 동안 1일 1회 투여하였고, 이후에는 5일간의 실험 기간 동안 시험 30분 전에 1일 1회 투여하였다.
탈출 소요시간, 탈출 경로 거리 및 헤엄친 속도의 세가지 측정치를 MANOVA로 분석한 후에 주요 효과에 대한 간략한 대조 분석을 수행하였다.
결과: AF64A를 주사한 래트는 탈출 소요시간이 염수를 주사한 래트에 비해 유의하게 더 긴 것으로 나타났다 (F (1/64) = 10.56, p < 0.005). 탈출 경로 거리에 있어서는 AF64A를 주사한 래트의 학습 곡선이 염수를 주사한 래트에 비해 유의하게 더 느린 것으로 나타났다 (F (3/192) = 4.01, p < 0.01). AF267B는 학습에 유의한 영향을 미치지는 않았으나, AF64A를 주사한 래트에게 1 mg/kg AF267B를 처리하면 오직 탈출 소요시간에 있어서만 개선되는 경향이 있는 것으로 나타난 반면에 3 mg/kg AF267B 처리는 이들 래트의 수행능을 방해시키는 경향이 있었다. 인지 측정치 (탈출 소요시간 및 탈출 경로 거리)와 비특이적인 운동 측정치 (헤엄친 속도) 사이에는 상관관계가 없는 것으로 나타났다.
염수를 주사한 모든 래트는 프로브 실험시에 탈출 소요시간 및 탈출 경로 거리라는 2가지 파라미터 모두에 대하여 공간 바이어스를 나타내었다 (각각 F (3/192) = 7.86, p < 0.001 및 F (3/192) = 7.44, p < 0.001). 한편, 이 시험에서 AF64A를 주사하고 PBS를 처리한 래트는 단지 부분적인 공간 바이어스만을 나타내었다. 그러나, AF64A를 주사하고 AF267B를 처리한 래트는 염수를 주사한 래트의 경우와 유사하게 완벽한 공간 바이어스를 나타내었다 (오직 탈출 소요시간으로만 제시됨) (F (9/192) = 2.3, p < 0.025). 기억에 대한 유익한 효과에 있어서 AF267B의 여러가지 투여량 사이에 유의한 차이점은 없었다.
플랫폼 위치 반전 시험에서 시험한 임의의 군 사이에 유의한 차이점은 없었다. 그러나, AF64A 주사는 2가지 측정치 모두에서 인지 수행능을 악화시키는 경향이 있었다. 추가로, 이 시험에서 AF64A를 주사하고 1 mg/kg AF267B를 처리한 래트 에서는 개선되는 경향이 있는 것으로 나타난 반면, AF64A를 주사하고 3 mg/kg AF267B를 처리한 래트에서는 손상되는 경향이 있는 것으로 나타났다.
실시예 48
C57BL/10SnJ 마우스의 MWM 수행능에 AF150(S), AF267B, 리바스티그민 및 니코틴이 미치는 영향을 C57BL6J 마우스에서의 영향과 비교함
C57BL/10SnJ (B10) 마우스는 이들의 해마가 작고 해마의 추체 신경세포 수가 적어서 선택한 것이었다 - 세포 손실은 공간 학습 불량과 관련이 있다고 여겨진다. 이들 동물에서 관찰된 공간 기억력의 결핍은 콜린성 조작 (스코폴라민)에 반응한 것이라고 보고되어 있으며 [Simons et al., Life Sci., 42, 375-383, 1988], AChE 억제제 (피소스티그민)와 무스카린성 아고니스트 (AF102B, PD151832) 둘다가 이 모델을 MWM에 이용할 때 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타난 바 있다 ([Simons et al., 1988], [Vincent et al., Brain Res., 597, 264-268, 1992], [Schwarz et al., Drug Dev. Res., 40, 133-143, 1997]).
각 군의 마우스를 7개 처리 군 (n = 12 내지 14마리/군)으로 무작위로 나누었다. 제1군 및 제2군에는 AF150(S)를 0.5 및 1 mg/kg의 투여량으로 10 ㎖/kg 부피 중에 i.p. 처리하였고, 제3군 및 제4군에는 AF267B를 동일 투여량 및 동일 부피로 처리하였고, 제5군 및 제6군에는 각각 리바스티그민 및 니코틴을 1 mg/kg씩의 투여량으로 i.p. 처리하였으며, 제7군에는 용매인 0.9％ 염수를 처리하였다. 시험한 모든 화합물 및 염수는 거동 시험 시작 전에 4일 동안 1일 1회 투여하였고, 이후에는 5일간의 실험 기간 동안 시험 30분 전에 1일 1회 투여하였다.
훈련: 각 마우스를 연속 4일 동안 훈련시켰으며 1일 4회씩 실험 (1 블록)하였는데, 플랫폼 위치는 변화시키지 않고 풀의 남동쪽 사분면의 중앙에 두었다. 4회씩 실험한 각 블록에서, 각 마우스를 각각의 출발 위치에서 출발시키되 위치 순서는 무작위로 선택하였다. 1회 실험은, 풀의 주변부를 따라 4곳의 출발 위치인 북쪽, 남쪽, 동쪽 또는 서쪽 중 하나에서 풀의 벽과 맞닿은 물에 마우스를 위치시켜 이루어졌다. 탈출 소요시간 (플랫폼 발견 시간), 탈출 경로 거리 (마우스의 이동 거리) 및 속력 (마우스가 헤엄친 속도)을 모니터링 시스템으로 각 실험에 대해 기록하였다.
각 마우스에 대하여, 4일간의 훈련일 각각에서 4회 실험시의 탈출 경로 거리, 탈출 소요시간 및 헤엄친 속도를 블록으로 (매일마다 1 블록) 분류했다. 모든 3가지 측정치의 스코어는, 반복되는 1가지 변수 (일(日)) 및 반복되지 않는 2가지 변수 (마우스 종 [C57BL/10SnJ 또는 C57BL6J] 및 처리량 [AF150(S) 및 AF267B (각각 2가지 투여량); 리바스티그민, 니코틴 (각각 1가지 투여량) 및 염수])를 사용하여 3원 MANOVA (2 ×7 ×4)로 분석하였다. 주요 효과에 대한 간략한 대조 분석을 통해 구체적인 비교를 수행하였는데, 이것은 유의한 상호관련성을 시험하는데 특히 적절한 것이었다.
탈출 소요시간: 해마가 작은 마우스는 탈출 소요시간이 정상 해마 래트보다 유의하게 더 긴 것으로 나타났다 (RM 수행능이 더욱 불량함을 지시함). AF150(S)와 AF267B 및 리바스티그민은 해마가 작은 마우스의 훈련 수행능에 긍정적인 영향을 미쳤다 (F (6/161) = 6.39, p < 0.0001). 구체적으로, 각각의 무스카린성 화합 물은 2가지 투여량 둘다에서 해마가 작은 마우스의 탈출 소요시간을 대조군에 비해 개선시켰다 (p < 0.01 내지 p < 0.001). 추가로, AF267B는 수행능에 대한 영향에 있어서 투여량-반응 곡선을 나타낸 반면 (p < 0.02), AF150(S)은 2가지 투여량 모두가 수행능에 동등한 영향을 미쳤다. AF150(S) 및 AF267B는 리바스티그민보다 수행능에 더욱 효과적으로 영향을 미쳤다 (각각 p < 0.05 내지 p < 0.001). AF150(S)는 2가지 투여량 모두에서 정상 해마 마우스의 탈출 소요시간을 증가시킨 반면 (p < 0.05 내지 p < 0.01), AF267B는 훈련 동안 이들 마우스의 탈출 소요시간에 유의한 영향을 미치지 않았다. 니코틴은 해마가 작은 마우스에서 나타나는 기억 결핍을 개선시키는 효과는 없었고, 정상 해마 마우스의 경우에는 그의 수행능을 방해하였다 (p < 0.02). 또한, 이러한 결과는 훈련의 일반적 효과가 유의함을 지시하는 것이기도 했다 (F (3/483) = 90.49, p < 0.0001). 모든 군의 탈출 소요시간은 4일간의 훈련일 동안 선형으로 감소하였다 (p < 0.0001, 다각적 대조법(polynomial contrast)에 의함).
탈출 경로 거리: 해마가 작은 마우스의 탈출 경로 거리는 정상 해마 래트의 경우보다 유의하게 더 긴 것으로 나타났다 (F (6,161) = 2.35, p < 0.033). AF150(S) (2가지 투여량 모두), AF267B (더 높은 투여량) 및 리바스티그민은 해마가 작은 마우스의 상기 수행능에 긍정적인 영향을 미쳤다 (p < 0.05 내지 p < 0.01). AF150(S) (오직 더 높은 투여량만)는 정상 해마 마우스의 탈출 경로 거리를 유의하게 단축시킨 반면 (p < 0.05), AF267B 또는 리바스티그민은 어느 것도 이들 마우스의 탈출 경로 거리에 아무런 영향도 미치지 않았다. 니코틴은 시험한 마 우스 종 어느 것의 수행능에도 유의한 영향을 미치지 않았다. 또한, 이러한 결과는 훈련의 일반적 효과를 지시하는 것이기도 했다 (F (3/483) = 86.98, p < 0.0001). 모든 군의 탈출 경로 거리는 4일간의 훈련일 동안 선형으로 감소하였다 (p < 0.0001, 다각적 대조법에 의함).
헤엄친 속도. 운동 활성 차이를 염수로 처리한 두 종의 마우스 사이에서 관찰하였다: 해마가 작은 마우스의 헤엄친 속도는 정상 해마 마우스의 헤엄친 속도보다 유의하게 낮았음 (F (6/161)=14.32, p < 0.0001). 또한, 두 무스카린성 약물 모두는 해마가 작은 마우스의 헤엄친 속도를 증가시켰다. 구체적으로, AF150(S)의 헤엄친 속도의 증진 효과는 두가지 투여량 모두에서 동일하였으나 (p < 0.001), AF267B는 투여량에 의존하는 방식으로 헤엄친 속도를 증진시켰다 (대조군에 비해 p < 0.001; 투여량 사이에서 p < 0.02). 또한, AF267B-1 mg/kg이 AF150(S)-1 mg/kg 보다 더욱 강력하게 헤엄친 속도를 유의하게 증진시켰다 (p < 0.001). 리바스티그민 및 니코틴 모두가 해마가 작은 마우스의 헤엄친 속도에 어떠한 유의한 효과가 없었다. AF150(S)는 정상 해마 마우스의 헤엄친 속도를 유의하게 단축시켰으나 (p < 0.01 내지 p < 0.001), 한편 AF267B는 이러한 효과가 없었다. 마찬가지로, 리바스티그민 (p < 0.01) 및 니코틴 (p < 0.001)은 이들 마우스의 헤엄친 속도를 유의하게 감소시켰다. 결과는 또한 훈련의 유의한 일반적인 효과를 나타낸다 (F (3/483)=15.34, p < 0.0001); 모든 군의 헤엄친 속도는 4일간의 훈련일 동안 다각적 대조법에 의해 선형으로 상승됨.
플랫폼 제거 시험: 제4일의 제17 실험 동안, 플랫폼을 풀에서 완전히 제거하 였다 (프로브 실험). 이 실험에서, 마우스를 제한된 기간 (30초) 동안 물 속에 위치시키고, 공간 바이어스를 풀의 4개 사분면에 걸쳐 탈출 소요시간 및 탈출 경로 거리의 상대적 분포를 기록함으로써 측정하였다. 플랫폼 제거 실험 (제17 실험)에 대한 탈출 경로 거리 및 탈출 소요시간을, 반복되는 1가지 변수 (풀 중 사분면) 및 반복되지 않는 2가지 변수 [마우스 종-C57BL/1OSnJ 또는 C57BL6J 및 처리-AF150(S) 및 AF267B 각 2가지 투여량, 리바스티그민 및 니코틴 (각 1가지 투여량) 및 염수]를 갖는 3원 MANOVA (2 ×7 ×4)로 분석하였다.
탈출 경로 거리 측정에 대한 상호 작용성이 유의함에 근접한 것에 비해 (F (18/483)=1.5, p < 0.08), 탈출 소요시간 측정을 위한 3원 상호 작용성이 통계적으로 유의한 것으로 밝혀졌다 (F (18/483)=1.62, p < 0.05). 염수로 처리한 정상 해마 마우스는 플랫폼 제거 시험에서 완벽한 공간 바이어스를 보였다. 이들은 풀의 다른 세 사분면에 비해 훈련 사분면에서 더 많은 시간을 유의하게 소비하였다 (p < 0.001). 한편, 염수로 처리한 해마가 작은 마우스는 이 시험에서 단지 부분적인 공간 바이어스를 보였다; 제2 사분면에 비해서는 아니었으나, 제3 (p < 0.001) 및 제4 사분면 (p < 0.05)에 비해서 제1 사분면에서 더 많은 시간을 유의하게 소비하였음. 그러나, AF150(S) 또는 AF267B (2가지 투여량으로), 또는 리바스티그민으로 처리한 해마가 작은 마우스는 정상 해마 마우스와 같이 완벽한 공간 바이어스를 보였다. 반면에 니코틴으로 처리한 해마가 작은 마우스는 염수로 처리한 해마가 작은 마우스와 같이 단지 부분적인 공간 바이어스를 보였다. 다른 약물로 처리한 모든 다른 정상 해마 마우스가 이 시험에서 완벽한 공간 바이어스를 보였던 반면, AF150(S)-1 mg/kg로 처리한 정상 해마 마우스는 이 플랫폼 제거 시험에서 단지 부분적인 공간 바이어스를 보였다. 탈출 경로 거리 측정의 결과는 탈출 소요시간 측정의 결과와 매우 유사하였다.
플랫폼 위치 반전 시험: 제5일의 제18 내지 제21 실험 동안, 플랫폼의 위치를 훈련 사분면의 반대편인 북서 사분면으로 바꾸었다. 따라서, 반전 학습 동안, 플랫폼 위치는 방 안의 물체의 형태에 대해 이동시키지만, 풀은 전체 실험을 통해 방 내에 같은 장소에 채웠다. 래트의 시험 및 측정은 훈련과 동일하게 수행하였다.
각 마우스에 대해, 플랫폼 위치 반전 시험 (실험 제18 내지 제21)의 탈출 소요시간, 탈출 경로 거리 및 헤엄친 속도를 하나의 블록으로 분류하였다. 세가지 측정 모두를 2개의 변수 (마우스 종- C57BL/1OSnJ 또는 C57BL6J 및 처리- AF150(S) 및 AF267B 각 2가지 투여량, 리바스티그민, 니코틴 (각 1가지 투여량) 및 염수)를 갖는 2원 MANOVA (2 ×7)로 분석하였다.
탈출 소요시간: 해마가 작은 마우스는 정상 해마 마우스보다 반전 학습 동안 유의하게 더 긴 탈출 소요시간을 보였다 (F (6/161)=3.26, p < 0.005). 두 무스카린성 약물, AF150(S) 및 AF267B (2가지 투여량)는 해마가 작은 마우스의 탈출 소요시간을 유의하게 개선하였으나 (p < 0.05 내지 p < 0.01), 한편 AF150(S)-0.5 mg/kg은 정상 해마 마우스의 탈출 소요시간을 유의하게 단축시켰다 (p < 0.05). 리바스티그민 및 니코틴 모두는 C57BL/10SnJ 또는 C57BL6J 마우스 모두에 유의한 효과가 없었다.
탈출 경로 거리: 이 측정에서 보여진 유의한 효과 (p < 0.05)는 단지 정상 해마 마우스에서 AF150(S)-1 mg/kg에 의한 반전 학습의 장해였다 (2원 상호 작용성에 대해 F (6/161)=2.85, p < 0.011).
헤엄친 속도. 염수 처리된 두 종의 마우스 사이에서 운동 활성의 유의한 차이가 얻어지지 않았다. 그러나, 2가지 투여량으로의 두 무스카린성 약물이 해마가 작은 마우스의 헤엄친 속도를 유의하게 상승시켰다 (p < 0.01-0.001) (F (6/161)=8.71, p < 0.0001). 정상 해마 마우스의 헤엄친 속도는 AF150(S)-0.5 mg/kg (p < 0.02), AF267B-1 mg/kg (p < 0.05), 리바스티그민 (p < 0.01) 및 니코틴 (p < 0.05)에 의해 유의하게 감소되었다.
AF150(S), AF267B, 및 AChE 억제제, 리바스티그민은 해마가 작은 마우스에서 이들 장해를 유의하게 감쇠시켰다. 유사한 개선이 반전 학습 중 무스카린성 화합물 모두에 의해 나타났으나, 인지 기능의 개선이 습득 및 정체 동안 더욱 현저하였다. 반면에, 니코틴은 해마가 작은 마우스의 인지 수행능에 유리한 효과가 없었다. AF267B의 투여량-반응 효과가 탈출 소요시간 측정에서 나타난 인지 결핍의 상이한 개선으로 습득 중에 입증되었다. 1 mg/kg의 투여량의 유리한 효과가 0.5 mg/kg의 투여량의 유리한 효과보다 유의하게 더욱 강하였다. 플랫폼 제거 실험 동안, 처리되지 않은 해마가 작은 마우스는 플랫폼 위치에 관한 단지 부분적인 기억 결핍을 보였다. 이들 결핍의 유의한 개선이 니코틴을 제외하고, 시험된 2가지 투여량에서의 무스카린성 약물 모두에 의해 뿐만 아니라 리바스티그민에 의해 동등하게 잘 입증되었다. AF267B 및 AF150(S)의 학습 및 기억 기능의 개선에의 기 여는 두개의 발견: 습득 중 AF267B에 의해 보여진 투여량-반응 효과 및 프로브 (플랫폼 제거) 실험 중 입증된 두 약물의 유리한 효과로 강조된다. 이러한 점에서, 프로브 실험은 본래의 학습의 강도 및 정확성을 정량하는 측정을 제공하는 MWM 태스크(task) 중 으뜸가는 절차라는 것을 유념해야 한다.
실시예 49
AF150(S)는 허혈 래트에서 인지 장해의 회복에 효과적이다.
래트에서 일시적인 허혈을 허혈 모델의 변형에 의해 유도하였다 (문헌 [Voll et al., Stroke, 20: 1700-1706, 1989) 참고). 이는 나트륨 니트로프루시드에 의해 유도된 혈압 저하와 함께 스프라그-돌리 래트: (42 마리 수컷, 3 개월령, 체중 270 내지 340 g)에서 양측 목동맥 폐쇄로 수행되었다. 허혈을 21 마리의 래트에서 유도시키고, 다른 21 마리의 래트는 허위 대조군으로써 제공되었다. 펜토바르비탈 마취 (30 mg/kg, i.p.)하에, 나트륨 니트로프루시드 (4.8 mg/kg/hr)를 25분 동안 꼬리 정맥에 이식한 캐뉼라를 통해 주입하였다. 평균 혈압이 30 내지 60 mmHg (처음 수치는 약 110 mmHg임)로 유지되는, 주입을 시작한 후 5 분에 두 목동맥을 20 분 동안 클램핑(clamp)하였다. 상기 직 후에, 전신 산성증을 최소화하기 위해 중탄산나트륨 용액 1.8 밀리당량을 i.p. 투여하였다. 허위 수술된 래트를 허혈 래트와 같이 마취시키고 염수를 주입하였다. 이들의 목동맥을 노출시켰으나, 목정맥 클램핑을 수행하지는 않았다. 허혈을 앓는 래트에서, 수술 후 24 시간 내에 약 30%의 사망률을 기록하였다. 동물을 거동 시험 전에 3 주 동안 회복시켰다. 래트를 무작위로 4군 (AF150(S) (0.5 mg/kg, p.o.)로 처리되는 허혈 및 허위-수술된 래 트 및 2차 증류수 (DDW) (1O ㎖/kg, p.o.)로 처리되는 허혈 및 허위-수술된 래트) 중 하나에 지정하였다. 각 군은 10 내지 11 마리의 래트로 이루어졌다. AF150(S)를 수술 직 후, 거동 시험을 시작하기 몇 주 전에 1일 1회 (6일/주), 그 다음 3 주 실험 기간 동안, 시험 전 60 분 동안 투여하였다. 동물의 평가는 MWM 중 작업-기억 시료 맞추기 (working-memory matching-to-sample) 패러다임을 사용하여 수행하였다.
탈출 소요시간의 비율 (REL) 및 탈출 경로 거리의 비율 (RPL)을 각 파라미터에 대한 제2 블록/제1 블록의 비율로 계산하였다. REL 및 RPL은 제1 실험 내지 제2 실험의 수행능에 있어서, 상대적인 단축을 반영한다. REL 및 RPL은 반복되는 1가지 변수 (주) 및 반복되지 않는 2가지 변수 (수술- 허혈/허위-수술 및 처리- AF150(S)/DDW)를 갖는 3원 ANOVA (2 ×2 ×3)에 의해 분석하였다.
REL 및 RPL 모두에 대해, 수술 × 처리 사이의 상호 작용성이 통계적으로 유의한 것으로 밝혀졌다 (각 REL 및 RPL에 대해 F (1/32)=8.08; p < 0.01 및 F (1/32)=6.75; p < 0.025). 주요 효과에 대한 간략한 대조 분석은 DDW로 처리한 허혈 래트의 REL 및 RPL 모두가 DDW로 처리한 대조군 래트의 REL 및 RPL보다 높다는 것을 나타내었다 (REL 및 RPL 각각에 대해 p < 0.01 및 P < 0.02). 이 결과는 대조군 래트에 비해 허혈 래트의 작업 기억 기능이 결핍된다는 것을 나타낸다.
AF150(S)는 DDW-처리한 것과 비교하여 허혈 래트의 작업 기억 수행능을 유의하게 개선시켰다; AF150(S)로 처리한 허혈 래트의 REL 및 RPL 모두는 DDW로 처리한 허혈 래트의 REL 및 RPL보다 유의하게 낮았음 (p < 0.05). AF150(S)로 처리한 대 조군 래트는 수행능에 있어서 어떠한 유의한 변화도 보이지 않았다. 어떠한 시험 군에서도 헤엄친 속도의 차이가 발견되지 않았다. 결론적으로, AF150(S) (0.5 mg/kg, p.o.)의 장기간 투여는 (3 내지 6 주의 약물 투여에 이어) 시험의 3 주 동안 허혈 래트에서 작업 기억 수행능의 분명한 개선을 보였다. 모리스 수중 미로 실험에서 래트의 헤엄 능력에 유의한 효과가 입증되지 않았기 때문에, 비특이적 운동 공동작용 효과는 허혈 래트의 거동 효과 및 AF150(S)의 개선 효과 모두를 설명할 수 없었다.
실시예 50
트리헥시페니딜 처리된 래트에 있어서의 AF150(S), AF267B, AF292, AF704의 효과
트리헥시페니딜은 혈뇌장벽을 가로지르고 기억 및 학습 장해를 유도하는 선택적인 M1 무스카린성 길항제이다 (문헌 [(Bymaster et al., J Pharmacol Exp Ther 267: 16-24, 1993. Roldan et al., Neurosci. Lett. 230: 93-96, 1997; Kimura et al., Brain Res. 834: 6-12, 1999)] 참고).
정상 위스타 래트를 하기 실험에서 사용하였다. 수동적 회피 (PA) 태스크는 훈련 (습득) 단계 및 정체 단계로 구성된다. 훈련 과정에서, 각 래트를 개별적으로 작은 조명장치된 구획에 위치시키고, 60초의 친숙화/적응 후, 큰 구획으로의 문을 열고, 들어가는데 걸리는 소요시간을 측정하였다 (초기 소요시간). 어두운 구획에 들어간 직 후, 문을 닫고, 피할수 없는 발 쇼크 (3초 동안 0.6 mA)을 그리드(grid) 바닥을 통해 전달하였다. 초기 소요시간을 위해 180초의 차단 시점 을 사용하였다. 180초 내에 들어가는 것 (진입)에 실패한 동물을 실험으로부터 제외하였다. 습득 실험 후, 래트를 그의 원래 키우던 케이지로 되돌려 놓았다. 수동적 회피 태스크의 정체를 24 시간 후에, 밝은 구획에 래트를 다시 위치시키고, 60초의 적응 기간 후, 문을 열고 어두운 구획으로 다시 들어가는데 걸리는 소요시간을 측정함으로써 측정하였다. 정체 소요시간을 위해 300초의 차단 시점을 사용하였다. 300초 내에 진입에 실패한 동물을 기구로부터 제거하고, 이들에게 300초 소요시간을 기록하였다.
시험한 화합물은 AF150(S) (0.5, 1 및 5 mg/kg, p.o.), AF267B (0.5, 1 및 5 mg/kg, p.o.), AF102B (1 mg/kg, p.o.)를 포함한다. AF150(S)-5 mg/kg (222 ± 25.6), AF267B-0.5 mg/kg (181.1 ± 35.4), AF267B-1 mg/kg (290.1 ± 8.5) 및 AF102B-1 mg/kg (234.4 ± 35.3)으로 처리한 트리헥시페니딜 래트의 정체 소요시간이 2차 증류수 (DDW) (82.9 ± 19.55)로 처리한 트리헥시페니딜 래트의 정체 소요시간보다 유의하게 더 길었다 (p < 0.01 내지 0.001). 또한, AF267B-1 mg/kg로 처리한 트리헥시페니딜 래트의 정체 소요시간이 AF267B-0.5 mg/kg (p < 0.01)으로 처리한 트리헥시페니딜 래트 또는 AF150(S)-5 mg/kg (p < 0.05)으로 처리한 트리헥시페니딜 래트의 정체 소요시간보다 유의하게 더 길었다. 다양한 약물 또는 DDW로 처리한 대조군 사이의 정체 소요시간에는 차이가 발견되지 않았다. AF704는 또한 이 시험에 유의적으로 효과적이었다. 따라서, DDW (116.25 ± 36.36)로 처리한 트리헥시페니딜 래트의 정체 소요시간이 DDW (300 ±0)로 처리한 대조군 (DDW) 래트의 정체 소요시간보다 유의하게 짧았다 (p < 0.001). 그러나 AF704-0.1 mg/kg, p.o. (214.70 ± 36.63), 0.5 mg/kg, p.o. (283.50 ± 17.39) 및 1 mg/kg, p.o. (274.44 ±26.97)로 처리한 트리헥시페니딜 래트의 정체 소요시간이 DDW로 처리한 트리헥시페니딜 래트의 정체 소요시간보다 유의하게 길었다 (p < 0.01-0.001).
AF292는 시험한 아고니스트 중에서 가장 강력한 화합물이었다. AF292는 0.1 내지 0.05 mg/kg, p.o.의 투여량에서 유의하게 효과적이었다. 가장 적은 투여량, AF292 0.03 mg/kg, p.o.를 24 및 72시간 후에 시험하였을 때, 72시간 지체만이 정체 소요시간에서 PA에 유의한 효과를 보였다 (DDW로 처리한 트리헥시페니딜 래트와 비교하여 225.9 ± 36 대 DDW - 93.1 ± 29.0; p < 0.01). 초기 소요시간에는 효과가 발견되지 않았다. 이러한 결과는 피렌제핀에 대한 결합 연구에서 AF150(S)의 효능이 더 높음에도 불구하고 (높은 친화도 & 낮은 친화도), AF292가 고도로 강력한 아고니스트임을 보여준다 (예를 들어, AF150(S)보다 102 배 더 강력함). AF292의 이러한 효과는 AF150(S)에 반해 래트에서 단지 AF292의 더 높은 생체이용률 (49% 대 31%)에 기여할 수 없다.
실시예 51
노화된 래트에서 인지 기능에 대한 AF267B, AF292의 효과
늙은 (22 내지 24 개월령) 및 어린 (3 개월령) 스프라그-돌리 래트를 MWM으로 시험하였다. 늙은 래트는 어린 래트보다 유의하게 느린 학습 곡선을 보였다 (탈출 소요시간 및 탈출 경로 거리 각각에 대해 F (3/267)=6.74, p < 0.0001 및 F (3/267)=4.66, p < 0.003). 학습에 대한 어떠한 시험 화합물의 유의한 효과도 발 견되지 않았으나, AF267B-1 mg/kg로 처리된 노화된 래트는 개선되는 경향을 보였다. 모든 어린 래트는 프로브 실험에서 두 파라미터 모두에서 늙은 래트에 비해 공간 바이어스를 보였다 (탈출 소요시간 및 탈출 경로 거리 각각에 대해 F (3/267)=34.91, p < 0.0001 및 F (3/267)=9.06, p < 0.0001). 기억에 대한 어떠한 시험 화합물의 유의한 효과도 발견되지 않았으나, AF292를 두가지 투여량으로 처리한 노화된 래트는 DDW로 처리한 늙은 래트에 비해 이 시험에서 부분적인 공간 바이어스 경향을 보였다.
늙은 래트는 반전 학습 동안 어린 래트보다 불량한 수행능을 유의하게 나타내었다. AF267B-1 mg/kg은 노화된 래트의 반전 학습을 유의하게 개선시켰다 (탈출 소요시간 및 탈출 경로 거리 각각에 대해 F (4/88)=2.62, p < 0.04 및 F (4/88)=2.58, p < 0.04). AF267B가 이들 래트의 헤엄 능력에 대한 유의한 효과를 갖는 않으므로, 늙은 래트의 반전 학습에 대한 AF267B의 유리한 효과는 비특이적 운동 공동작용 효과에 기여할 수 없었다. AF292는 노화된 래트의 반전 학습에서 유의함에 도달하지 않았으나, 곡선의 형태로부터 시험된 두가지 투여량인 1 및 0.5 mg/kg, p.o.에서 개선되는 경향이 있었다.
실시예 52
AF292의 CNS 안전성 프로파일 (표 1)
AF292를 설치류에서의 일반적인 거동 및 기타 CNS에 관련한 약리학적 효과에 대한 가능한 효과에 대해 평가하였다. 경구로 AF292를 1, 10, 30, 60, 또는 100 mg/kg 투여한 래트에서 비히클 대조군과 비교하여 유의한 물리적인 또는 거동적인 징후가 관찰되지 않았다. 거동적인 또는 물리적인 징후가 투여한 후 24 시간 동안 관찰되지 않았다. 14일 동안 모든 래트를 유지시키고, 이 정체 기간 동안 모든 래트는 정상으로 보였다. 이에 비해, 화합물 AF267B는 투여 후 최초 1 시간 동안 이미 일부 효과 (약 40 mg/kg p.o.에서 침분비 및 눈물분비)를 보이기 시작했다.
실시예 53
AF292의 심혈관 안전성
1. 아스테미졸 (인간 에테르-아-고-고 (ether-a-go-go) 관련 유전자 (HERG) 채널) 결합 분석. AF292는 hERG-코딩된 채널에 [3H]-아스테미졸이 결합하는 것을 억제하는데 실패하여 이 결합 분석에서 비활성이였다.
2. 단리한 기니아 피그 우심방 (Guinea Pig Right Atrinm) (심방 세동). AF292는 수축력에는 유의한 효과를 갖지 않았으나, 비히클 군에서 보여진 것에 비해 수축률이 미미하게 저하되는 경향이 있었다.
3. 기계설치된 자각하는 개에서의 심장 전기생리학, 심장-혈류역학에 대한 AF292 (경구 투여량 5 mg/kg)의 효과. 다양한 연령 및 9.4 내지 12 kg 범위의 체중인 건강하고, 훈련되어 있으며, 장기간 기계장착된 암컷 비글 개를 이용하여 심혈관 파라미터: 심박률, 확장 및 수축 혈압, 심근 산소 소비량 (pressure rate product), LV dp/dt 최대값, LV dp/dt 최대값/pd, LV dp/dt 최소값, 심박출량, 일회박출량, 전신 혈관 내성 및 ECG 파라미터 (PQ-, QRS-, QT-, QTc바제트- (QTcBazett-) (QTcB), QTc프리데리시아- (QTcFridericia-) (QTcF) 및 QTc반 드 워 터- (QTcVan de Water-) (QTcVdW) 간격 기간 및 QT-분산을 기록하였다. 실험 전 마지막 18 시간 동안, 개에게 음식을 제공하지 않았다. 물을 자유롭게 먹게하는 방식 (ad libitnm)으로 제공하였다. 각 실험의 시작에서, 다양한 파라미터의 대조군 값을 30분 이상 동안 기록하였다. 그 후에, AF292 5 mg/kg (n=4) 또는 용매의 상응하는 부피 (n=4)를 급식으로 경구 투여하였다. 다양한 혈류역학 파라미터를 그 후 4 시간 동안 연속적으로 기록하였다.
5 mg/kg의 투여량으로 경구 투여한 AF292는 혈류역학 또는 ECG 파라미터, 예를 들어, 혈압, 심장수축성 (LV dp/dt 최대값; LV dp/dt 최대값/pd) 및 이완성 (LV dp/dt 최소값), 일회박출량, 전신 혈관 내성, PQ-, QRS-, QT-, QTcB-, QTcF- 및 QTcVdW-간격 기간, QT-분산 및 ECG-형태학에 대해 통계적으로 유의하고 의미있는 효과가 없었다.
실시예 54
시토크롬 P450 이성체 억제에 대한 AF292의 효과
시토크롬 P450 활성은 잠재적인 약물-약물 상호작용에 대한 지표가 될 수 있다. AF292를 P450 억제에 대해 미세적정 플레이트 분석으로 평가하였다. 최대 10 μM 농도에서, AF292는 약물 대사 및 관련된 약물-약물 상호작용을 담당하는 5개의 주요한 인간 P450 효소인 CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4 및 CPY2D6 이성체의 유의한 억제를 유도하지 않았다.
실시예 55
AF292의 시험관내 대사
AF292의 대사 안정성을 래트, 개, 원숭이 및 인간의 간 미세소체와 인큐베이션하는 동안 AF292의 소실을 모니터링하여 평가하였다. 테스토스테론 및 프로프라놀롤을 분석 대조군으로서 수행하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
실시예 56
AF292의 인간 결장 샘암종 (카코(Caco)-2) 세포 투과성 연구
이 시험은 시험되는 화합물의 장 투과성을 측정하는데 사용한다. 카코-2 세포를 반투과성 필터 상에서 성장시켰을 때, 카코-2 세포는 배양물 중에서 자발적으로 분화하여 소장 상피와 구조적으로 및 기능적으로 유사한 전면 단층을 형성한다. 이러한 특성 때문에, 이들은 장 점막에서 흡수하는 동안의 약물 흡수 및 대사의 연구를 위한 시험관내 모델로서 유용하다. 카코-2 단층을 12개 웰 플레이트에서 콜라겐-코팅된 미세다공 폴리카르보네이트 막 상에 전면 성장시키고, 시험 물질의 투과성을 측정하였다. AF292의 평균 투과성 계수 (Papp)는 17.4 ×106 cm/초로서 높은 흡수 잠재성을 갖는 것으로 분류되었다 (양방향성 분석을 수행함).
실시예 57
단백질 결합
단백질 결합 연구를 인간 혈장, α1-당단백질, 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 둘베코 인산염 완충 염수 (PBS)에서 수행하였다. AF292를 최종 농도 10 μM로 첨가하였다. PBS 완충액 투여량 농도 (μM) 및 인간 a-당단백질 (AGP)에서 0% 단백질 결합의 결과를 나타내었다 (표 1 참고).
실시예 58
래트 및 개에서 AF292의 약동학 프로파일
래트 및 비글 개 (밤새 단식시키고; 약물을 수용액으로 투여; 급식)에서 AF292의 PK 프로파일의 결과를 표 1에서 나열하였다.
실시예 59
AF267B의 독성학 프로파일
AF267B를 위스타 래트 및 비글 개에서 최대 13 주 동안 만성 독성 연구로 광범위하게 시험하였다. 개에서는, 비-역효과-수치 (NOAEL)가 p.o.로 6 내지 9 mg/kg/day 범위인 것으로 고려하였다. 개 ( > 9 mg/kg) 및 래트 ( > 40 mg/kg)에서 보이는 효과는 독성 심혈관 효과를 제외하고, 무스카린성 아고니스트로서 AF267B의 프로파일과 일치하였다 (자각된 개에서 시험하였음). AF267B는 통상적으로 시험 제제의 투여 전 후를 기록하는 경구 독성 연구 및 심전도 (EGG)로 최대 13 주 동안 비글 개에서 광범위하게 평가하였다. 심박률, P 파 기간 & 증폭, P-Q, QRS 및 QT 간격을 측정하였으며, 시험 제제의 투여와 관련한 것으로 고려되는 ECG의 변화는 없음을 관찰하였다.
실시예 60
생존 및 아폽토시스: GSK-3 활성: β-카테닌; 사이클린 D1 발현의 세포질 및 핵 안정화에 의한 바와 같은 Aβ 원섬유에 노출된 래트 해마의 신경세포에 대한 AF267B의 효과
이 연구를 문헌 [Garrido JL et al., (FASEB J 2002; 16:1982)]에 기재된 방 법을 이용하여 래트 해마의 1차 세포 배양물 중에서 수행하였다.
AF267B는 0.5 내지 50 μM의 농도에서 해마의 신경세포의 생존 및 형태에 영향을 미치지 않는다. 그러나, AF267B (10 μM)는 단독으로 생존 및 형태에 45% 감소를 일으키는 Aβ1-40 (5 μM)으로부터 해마의 신경세포를 90% 초과로 보호한다. AF267B의 이러한 보호 효과는 이들이 피렌제핀 (10 nM) 및 M1 길항제에 의해 차단되기 때문에 M1 무스카린성 수용체에 의해 매개된다. AF267B (100 μM)는 래트 해마의 신경세포의 배양물에서 GSK-3β 활성을 60%로 감소시켰다. 상기 제제에서, Aβ 원섬유 10 μM은 대조군 (100%)에 비해 GSK-3β 활성을 370%로 증가시켰다. 또한, AF267B (10 μM)는 GSK-3β 활성을 대조군에 비해 150%로 감소시켜 Aβ 원섬유 (10 μM)의 효과를 길항하였다. AF267B (10 μM)는 Aβ1-40 (5 μM)-유도된 아폽토시스를 대조군 수준으로 방지하였다. 배양한 해마 신경세포가 Aβ1-40 (5 μM)에 노출되었을 때, 용해성 β-카테닌은 분해되고, 이러한 분해는 AF267B (100 μM)에 의해 방지되었다. 사실, AF267B는 용해성 β-카테닌 수치를 농도 의존성 방식 [예를 들어, 1 μM (100%), 10 μM (300%), 100 μM (350%)]으로 대조군 이상으로 증가시켰다. Aβ1-40 (5 μM)은 핵 β-카테닌을 감소시켰으며 (60%), 효과는 AF267B (1 μM)에 의해 차단되었다 (대조군에 비해 140%). 이러한 AF267B의 보호 효과는 피렌제핀 (10 nM)에 의해 차단되기 때문에, M1 mAChR에 의해 매개된다. 래트 해마의 신경세포에서 Aβ1-40 (5 μM)의 탈안정화 효과는 면역형광 염색에 의해 검출된 가지 돌기 축소로 나타내었다. 핵의 위치는 c-준 (c-jun) 항체로 나타내었다. 상기 M1 아고니스트로 처리될 때, AF267B는 신경세포를 보호하고, 세포는 건강한 신경돌기를 갖는다. AF267B의 효과는 피렌제핀 (10 nM)으로 차단되기 때문에 M1 mAChR에 의해 매개된다. 결국, AF267B는, Wnt 경로의 표적 유전자인 사이클린 D1의 감소 (대조군에 비해 40%)로 유도된 Aβ1-40-40 (5 ㎛)에 대해 보호 효과를 갖는다 (대조군에 비해 50% 증가). 또한, AF267B의 이러한 효과는 피렌제핀 (10 nM)에 의해 차단된다.
여기서 보여지는 결과는 AF267B가 MTT 저하, 신경미세섬유의 면역형광 및 아폽토시스 분석에 의해 평가된 바와 같이 신경 세포를 보호한다는 것을 나타낸다.
상기 보여진 바와 같이, 본 발명의 실시양태에 사용된 화합물은 혈뇌장벽을 가로지를 수 있는 저분자량 화합물이다. 다수의 이러한 화합물은 특히, AD 및 우수한 안전 한계를 갖는 기타 관련 장애의 다양한 면이 닮은 다양한 동물 모델에서 기억 및 학습의 개선을 비롯한 추가의 유리한 효과를 갖는다.
표 1은 AF292 및 AF267B에 대한 시험 결과의 일부를 비교하였다.
효과 AF292 AF267B
트리헥시페니딜-래트의
수동적 회피		 0.03, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5 mg/kg, p.o.
긍적적인 효과 MED </ 0.03 mg/kg, p.o.
장기간 작용		 0.5, 1, 5 긍정적인 효과
MED 0.1 내지 0.5 mg/kg, p.o.
CNS (래트)
일반적인 관찰		 IRWIN 시험@
1, 10, 30, 60,100 mg/kg, p.o.
하기의 영향 없음
운동 활성 {개방 필드; 수직 & 수평 차폐; 로타로드(rotarod); 운동 실조; 자세 & 긴장성; 떨림; 경련; 마비; 강직}
반사 {정향; 각막; 귀바퀴반사 (pinnal); 신전; 사지 긴장; 움추림반사; 놀람}
흥분 또는 진정{간헐 경련/긴장; 활모양강직; 발성; C-꼬리; 스트라웁(Straub) 꼬리; 빙글빙글 돌기; 상동증; 진정; 최면 (수면)}
눈 상태 {눈꺼풀 처짐; 눈물분비; 색소눈물흘림; 안구침몰; 안구돌출}
피부 상태 {피부 형성성, 털세움, 창백 (귀); 충혈, 청색증}
다양한 효과 {침분비; 설사; 이뇨; 조작에 대한 반응; 복부 협착; 직장 온도; 사멸}		 동공확대: 25 mg/kg, p.o.
침분비: 40 mg/kg, p.o.
눈물분비: 50 mg/kg, p.o.
체온저하: 50 mg/kg, p.o.
선통; 50 mg/kg, p.o.
경련: 50 mg/kg, p.o.
진정: 100 mg/kg, p.o.
색소눈물흘림: 100 mg/kg, p.o.

IRWIN 시험: 1, 10, 100 mg/kg. p.o.
1 & 10
총체적인 거동 & 생리적인 상태에 영향 없음.
100 mg/kg: 운반의 비정상, 무감각, 각막 반사의 감소, 설사, 치장 저하, 배뇨 증가, 침분비, 눈물분비 & 색소눈물흘림, 운동 활성 저하, 수동성, 호흡 저하, 놀람 반응 저하 (시작: 0.5 hr; 기간 3-6 hrs.).
[3PZ]; 래트 피질; Ki, μM 1.64±0.13 3.74±0.59
[3OXO-M]; 래트 피질, Ki, μM 0.57±0.15 1.62±0.34
래트 M1 mAChR로 형질감염된 세포 배양물에서의 α-APP 분비 (최대 CCh의 %) PI에 대해서는 효능이 덜 했으나, AF267B & 카르바콜(CCh)과 100% 효력이 동등함. EC50=3 μM 100%

래트 M1 mAChR로 형질감염된 세포 배양물에서 Aβ 25-35 & H2O2에 대한 MTT 분석법 PI에 대해서는 효능이 덜 했으나, 100 μM에서 AF267B & CCh와 효력이 동등함. 100%
인간 mAChR 아형으로 형질감염된 세포 배양물에서 CCh대 PI의 턴오버 (100% 로서) PI, AA: M1 mAChR: 35%, > 88%
PI., AA: M3 mAChR: 아고니스트로서 활성없음
An M3 길항제 (pKb=660 nM)
M2 mAChR-아고니스트로서 효과 없음
PI, AA: M5 mAChR-아고니스트로서 효과 없음
PI, 래트 M1 mAChR; 50%		 PI, AA: M1 mAChR: 66%, 100%
PI: M3 mAChR: 30%
PI, 래트 M1 mAChR: 75%
대사 안정성 래트 간 미세소체: T1/2=92분
개 간 미세소체: T1/2 > 100분
원숭이 간 미세소체: T1/2=74분
인간 간 미세소체: T1/2 > 100분
{AF267B보다 우수함}		 간 미세소체: T1/2=88분
개 간 미세소체: T1/2 > 100분
원숭이 간 미세소체: T1/2=27분
인간 간 미세소체: T1/2 > 100분
단백질 결합 PBS=0%
인간 α-당단백질 (AGP)=0%
인간 혈청 알부민 (HSA)=22%
인간 혈장=35%		 PBS=0%
AGP=5.7%
HSA=32%
인간 혈장=25%
약동학적 연구^

T1/2, hr
T최대, hr
MRT, hr
C최대, ng/㎖
AUC(o-inf), (ng*hr/
㎖)

생체이용률 (%F)		 래트, 10 mg/kg,
p.o.
0.99
0.5
1.5
1906
2146

49		 개, 5 mg/kg,
p.o.
2.04
0.8
4.85
1193
4648

70		 래트, 5 mg/kg,
p.o.

0.64
0.25
1
852, 1704**
773, 1546**

30*** 		개, 1 mg/kg,
p.o.

1.33
0.58 내지 0.75
1.96
257, 1085#
552, 2760#


53

독성동역학적 연구
13w*
AUC(o-inf), ng*hr/
㎖
MRT (면적), [h]

제거 반감기 [h]
 F (1x): 특이값, 3901 내지 4840; M (1x): 1142 내지 10932
F (13w): 1866 내지 12723; M (13w): 1609 내지 4170
F (1x): 특이값, 8.7 내지 18.7; M (1x): 5 내지 27.3
F (13w): 5.1 내지 33.7; M (13w): 5 내지 7.8
평균 T1/2 (M)= 6.3±5.9;
평균 T1/2 (F)= 10.6±7.6		 F (1x): 985 내지 3179; M (1x): 800 내지 3691
F (13w): 1033 내지 4164; M (13w): 1041 내지 4471
F (1x): 4.7 내지 5.3; M (1x): 3.8 내지 5
F (13w): 3.6 내지 5.2; M (13w): 3.0 내지 4.2
평균 T1/2 (M)= 2.1±0.6
평균 T1/2 (F)=3.3±1.5
*개: AF267B {1.5, 3, 6 mg/kg, p.o.; 단일= 1x & 13 주 동안= 13w}; (AF292는 생체내에서 AF267B로부터 수득함); 먹이 공급 후 1/2 시간 급식으로 처리; 캡슐 중 고체 약물. 약물의 혈장 수치를 LC-MS로 다양한 시점에서 분석하였음;**1O mg/kg에 대해서는 외삽법으로 추정하였음;***2 mg/kg, p.o.에 대해서는 계산하였음; #(5 mg/kg에 대해서는 외삽법으로 추정하였음). 농도 대 시간 곡선 (AUC) 하의 경구 및 정맥내 면적을 생체이용률 (%F)를 하기 화학식에 의해 결정하기 위해 비교하였다: 투여량 (IV) × AUC (경구)/투여량 (경구) ×AUC (IV). 30% 초과의 %F를 일반적으로 우수한 생체이용률로 제안한다. C최대 수치는 목적하는 약리학적 효과를 발생시키는 것에 이르는데 충분한 혈장 수치인지를 결정하기 위해 동등하게 중요하며, 1 μM 초과의 값이 일반적으로 충분하다. AUMC는 AUC의 1차 통계학적 모멘트이고, 화합물이 동물 중에 있는 평균 시간인 평균 잔존 시간 (MRT=AUMC/AUC)을 계산하는데 사용된다. C최대는 관찰된 최대 농도를 나타내며, T최대는 최대 농도에 도달하는데 걸리는 시간이며, T1/2는 혈장 중에 화합물의 계산된 반감기이다 (In2 ×MRT). 일소량 (Clearance)은 단위 시간 당 완전히 제거되는 화합물로부터의 유체의 부피 (화합물 포함)이다. ^래트 및 개는 정맥내 (i.v.) 및 경구 급식으로 투여된다. 약물의 혈장내 수치를 LC-MS-MS로 다양한 시점에서 분석하였다. @Iwin, S. PSYCHOPHARM 13: 222-257, 1968.

표 1에 나타낸 결과는 AF267B 및 AF292가 mAChR 아형에 대해서 동일한 친화도를 가지나, 상이한 효능을 갖는 것을 나타낸다.
당업자는 본 발명을 특히 상기 나타내고 기재된 것으로 제한하지 않는다는 것을 인지할 것이다. 오히려, 본 발명의 범주는 본원에 기재한 특징들의 조합 및 하위조합 뿐만 아니라, 당업자가 상기 명세서를 읽으면서 발생할 수 있는 사전 기술에 속하지 않는 변형 및 변화를 포함한다.

Claims (173)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292)인 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
  4. 제3항에 있어서, AF292의 HCl 염인 화합물.
  5. 삭제
  6. (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292) 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 및 이를 위한 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는,
    포유류에서 알쯔하이머 유형의 노인성 치매; 알쯔하이머병 (AD); 루이(Lewy) 소체 치매; 알쯔하이머병과 파킨슨병의 혼합 질환; 다발경색성 치매 (MID); 전측두엽 치매; 혈관성 치매; 졸중/허혈, 졸중/허혈/두부 손상과 조합된 MID; MID와 AD의 조합; 인간 두부 손상; 연령-연관성 기억 손상; 경증 인지 손상 (MCI); MCI가 원인이 되는 AD; (건망증, 급성 착란 장애, 주의력-결핍 장애, 초점 및 집중 장애를 비롯한) 인지 기능부전; 환각-편집 상태; 감정 및 주의력 장애; 수면 장애; 수술 후 섬망; 트리시클릭 항우울제의 역효과; 정신분열증 및 파킨슨병의 치료에 사용된 특정 약물의 역효과; 구강건조증, 건망성 실어증, 기억 상실 및(또는) 착란; 정신병; 정신분열증, AD와 조합된 정신분열증, 후기 발병 정신분열증, 망상분열증, 정신분열형 장애; 불안증; 양극성 장애; 조증; 기분 안정; 특정 신경교종 제거 후의 인지 손상; 지연 운동이상; 산소 요법시 산화 스트레스; 언어상실증; 뇌염후 기억상실 증후군; AIDS 치매; 루푸스, 다발성 경화증, 쉐그렌(Sjogren) 증후군, 만성 피로 증후군 및 섬유근육통을 비롯한 자가면역 질환에서의 기억 손상; 비정형 우울증 또는 정신분열증에서의 기억 손상; 동통, 류마티스, 관절염 및 말기 질병; 안구건조증, 질 건조증, 피부 건조증; 면역 기능부전; 신경분비 장애, 및 대식증 및 거식증을 비롯한 음식 섭취 조절장애; 비만; 선천적 오르니틴 트랜스카르브아밀라제 결핍증; 올리브교소뇌 위축증; 알콜 금단 징후; 금단 징후를 비롯한 물질 남용 및 대체 요법; 헌팅톤(Huntington) 무도병; 진행성 상핵 마비; 픽(Pick)병; 프리드릭(Friedrick) 운동실조증; 질 드 라 뚜렛(Gilles de la Tourette) 질환; 다운 증후군; 녹내장; 노안; 위장관 운동 및 기능의 기능부전을 포함하는 자율신경계 장애; 급박성 요실금, 천식, COPD로 이루어진 군으로부터의, 손상된 콜린성 기능과 연관된 질환 또는 콜린성 기능의 불균형이 존재하는 질환, 또는 아세틸콜린 수용체의 활성이 손상된 질환의 치료; 또는
    뇌 아밀로이드-매개 장애; 글리코겐 신타제 키나제 (GSK3β)-매개 장애; tau 단백질 과인산화-매개 상해, 기능부전 또는 질환; CNS 및 PNS 고콜레스테롤혈증- 및(또는) 고지혈증-매개 상해, 기능부전 또는 질환; Wnt-매개 신호전달 이상; 신경가소성의 손상; 고혈당증; 당뇨병; 내인성 성장 인자-매개 질환, 또는 추가 위험 인자의 조합; 또는 아포지단백질 E를 포함하는 질환 상태; 또는 알쯔하이머 유형의 노인성 치매, 알쯔하이머병 (AD), AD 발생에 대한 위험에 있는 환자에서 AD 징후의 발병 지연, 루이 소체 치매, 대뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 대뇌 아밀로이드증, 전측두엽 치매, 혈관성 치매, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 다발경색성 치매 (MID), 졸중 허혈, 졸중/허혈/두부 손상과 조합된 MID, MID와 알쯔하이머병의 조합, 인간 두부 손상, 연령-연관성 기억 손상, 경증 인지 손상 (MCI), MCI가 원인이 되는 AD, 양극성 장애, 조증, 정신분열증, 비정동성 정신분열증, 망상분열증, 면역 기능부전, 신경분비 장애, 및 대식증 및 거식증을 비롯한 음식 섭취 조절장애, 체중 조절, 비만, 염증을 비롯한, 콜린성 기능부전이 관련된 교란을 포함하는, 뇌, 신경계, 심혈관계, 면역계, 신경분비계, 위장관계 또는 내분비샘과 외분비샘, 눈, 각막, 폐, 전립선, 또는 콜린성 기능이 무스카린성 수용체 아형에 의해 매개되는 기타 기관 중 하나 이상에서의 기능부전으로 인한 중추 또는 말초 신경계 질환 상태의 예방 또는 치료
    를 위한 제약 조성물.
  7. 제6항에 있어서, (S)-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF267B) 및 2,8-디메틸-1-티아-3,8-디아자-스피로[4.5]데스-2-엔 (AF150(S)), 또는 이들의 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 화합물을 추가로 포함하는 제약 조성물.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서, 상기 추가 화합물이 (S)-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF267B) 또는 그의 제약상 허용가능한 염인 제약 조성물.
  10. 삭제
  11. 제7항에 있어서, 상기 추가 화합물이 2,8-디메틸-1-티아-3,8-디아자-스피로[4.5]데스-2-엔 (AF150(S)) 또는 그의 제약상 허용가능한 염인 제약 조성물.
  12. 제6항에 있어서, 단위 투여 형태인 제약 조성물.
  13. 제6항에 있어서, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 카세제, 좌약제, 분산가능한 다수개의 과립제, 용액제, 현탁액제 또는 에멀젼제인 제약 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 단위 투여 형태 당 0.5 내지 100 mg의 (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292) 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함하는 제약 조성물.
  15. N-보호된 4-피페리돈을 암모니아 또는 암모늄염 및 (S)-2-머캅토부티르산과 반응시킨 후에 고리 질소 원자를 탈보호하는 것을 포함하는 (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292)의 제조 방법
  16. 제15항에 있어서, AF292를 산 또는 염기와 반응시켜 그의 제약상 허용가능한 염을 형성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 피페리돈 질소 원자가 카르바메이트로 보호된 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, N-보호기가 알콕시카르보닐인 방법.
  19. 제18항에 있어서, N-보호기가 t-부톡시카르보닐인 방법.
  20. (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292) 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함하는, 정신분열증의 치료 또는 정신분열증 징후의 경감을 위한 제약 조성물.
  21. 제20항에 있어서, (S)-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF267B)을 추가로 포함하는 제약 조성물.
  22. 제3항에 있어서, 단리된 형태인 화합물 AF292 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
  23. 제3항에 있어서, 순도가 99.9% 이상이거나 거울상이성질체 과량이 99.8%이거나 순도가 99.9% 이상이고 거울상이성질체 과량이 99.8%인 화합물 AF292 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
  24. 제3항에 있어서, 고체 형태인 화합물 AF292 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
  25. (S)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF292) 또는 그의 제약상 허용가능한 염과, (S)-2-에틸-8-메틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF267B) 또는 그의 제약상 허용가능한 염 및 (R)-2-에틸-1-티아-4,8-디아자-스피로[4.5]데칸-3-온 (AF291) 또는 그의 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다른 화합물과의 혼합물.
  26. 제25항에 있어서, 라세미 혼합물인 혼합물.
  27. 제25항에 있어서, 라세미 혼합물이 아닌 혼합물.
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