MXPA04010921A - Metodos y composiciones para el tratamietno de trastornos del sistema nervioso central y periferico y compuestos novedosos utiles para los mismos. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan metodos para el tratamiento de enfermedades que implican disfunciones del sistema nervioso central y periferico que comprende administrar uno o mas compuestos espiro. Tambien se proporcionan composiciones farmaceuticas utiles en tales metodos, los compuestos para uso en la preparacion de tales composiciones farmaceuticas, procesos para preparar compuestos utiles en la practica de tales metodos, y algunos nuevos de tales compuestos per se.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL Y PERIFÉRICO Y COMPUESTOS NOVEDOSOS ÚTILES PARA LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a métodos para tratar varios trastornos del sistema nervioso central y periférico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los siguientes documentos, los contenidos de los cuales se incorporan en la presente para referencia, se cree que son relevantes: Fisher and Barak. Drug News & Perspectives 7: 453-64, 1994; Review: Fisher. Jap J Pharmacol 84: 101-112, 2000; Wolozin '' CA, USA, 2001 ; Refolo et al. Neurobiol Dis 8: 890-899, 2001 ; Review: Cedazo-Minguez and Cowburn. J Cell Mol Med 5:254-266. 2001 ; Bales et al. PNAS 96: 15233, 1999; Buttini et al. Neurosci 97: 207, 2000; Hartmann et al, Exp Neurol 170: 326, 2001 ; Mudher and Lovestone. Trends Neurosci 25:22-6, 2002; Mudher et al. J Neurosci 21 :4987-95, 2001 ; Zhang et al. Nature 395: 698-702, 1998; De Ferrari et al. Brain Res Brain Res Rev 33:1-12, 2000; Garrido et al. FASEB J 16:1982-4, 2002; Eldar-Finkelman. Trends Molec ed. 8:126-32. 2002: Bhat et al. Neurosignals 11:251-61. 2002; Gent!eman et ai. NeuroReport 8: 1519-1522. 1997; Roberts et al. J Neurol Neurosurg Psychiat. 57: 419-425. 1994: Havlik et al. Neurobiol Aging S140, 587, 1998: Mayeux et al. Neurol, 45: 5 556-557, 1995; Nico!l et al. Ann N Y Acad Sci, 777: 271 -275. 1996; Capruso and Levin. Neurol Clin 10: 879-893, 1992; Dixon et. al. Behav Brain Res 70:125-131, 1995; Pike and Hamm. Exptl Neurol. 147: 55-65, 1997; Pike and Hamm. Pharmacol Biochem Behav, 57: 785-791, 1997; Pike and Hamm. J Neurotrauma, 14: 897-905, 0 1997; U.S. Patents Nos. 4,855,290, 4,981,858, 4,900,830. 4,876,260, 5,053,412, 5,407.938, 6,277,874. 6,274,603; Irwin, S. PSYCHOPHARM 13:222-257, 1968; Beach et al, Neurosci Lett 283: 9-12, 2000; Beach et al., Brain Res 905: 220-223, 2001; Pfeifer et al., Science 2002 298:1379; Nicoll et al, 5 Nature Medicine, March 2003, Sparks et al. Neurosci Lett 1995; - Minguez et al, Neurosci, 105: 651-661, 2001; Sparks et al. Neurosci Lett 1995; 187:142-144; Dean et al, Mol Psychiatry 1996; 0 1:54-8; Dean et al, Mol Psychiatry 2002; 7: 1083-91; Raedler et al, Am J. Psychiatry 160: 118, 2003; Borda et al J Immunol 2002; 168:3667-74; Felder et al, Life Sci 2001 8:2605-13; Bymaster et al, Current Drug Targets- CNS & Neurological Disorders 2002; 1:147- 164; Sullivan et al, Br J Psychiatry 2000; 177:177-8; Gould and 5 Manji. Neuroscientist 2002: 8:497-511; Cotter et al, NeuroReport 9: 1379. 1998; Casanova MF et al Acta Neuropathol (Berl) 2002 103: 313-20; Auld et al Prog Neurobiol 2002, 68:209-45; Poeggeler et al, Brain Res 815: 382-388, 1999; Chyan et al, J Biolog Chem 274: 21937-21942, 1999; Bons et al., Alzheimer's Res (1995) 1:83- 87; Mazzoti et al (Proceedings of the Chiral Europe 96 Symp, Spring Innovations, Stockport UK, p 103, 1996; Krise et al, J Med. Chem. 42: 3094-3100 (1999); Fassbeder et al, PNAS.98: 5856, 2001; Sparks et al. Exp Neurol 1994; 126:88-94; Sparks Nutr Metab Cardiovasc Dis 1997: 7:255-266; Beach et al, Neurosci Lett 283: 9-12, 2000; Beach et al Brain Res. 905: 220-223, 2001; Klausner, Biotechnol 5:779-786, 1987; Lipman et al, Cytotech.no! 8:129-176, 1992; Rappoport and Ferreira J. Neurochem. 74:125-133 (2000); Ekinci et al J. Biol. Chem. 274: 30322-30327 (1999); Sadot et al J. Neurochem. 66:877-880, 1996; Poirier et al Neuroscience 55: 81- Neural Transm Suppl 62: 189, 2002; Chen et al, J Neurotrauma, 15: 231-237, 1998; Dantzer et al. Psychopharmacol. 91:363-368, 1987; Perio et al Psychopharmacol. 97: 262-268. 1989; Perio et al Psychopharmacol. 97: 262-268. 1989; Fisher et al, J. Pharmacol. Exptl. Therap., 257: 392, 1991; Simons et al Life Sci., 42, 375- 383, 1988; Simons et al., 1988; Vincent et al Brain Res., 597, 264- 268, 1992; Schwarz et al Drug Dev. Res., 40, 133-143, 1997; Voll et et al, Stroke, 20: 1700-1706, 1989; Bymaster et al. J Pharmacol Exp Ther 267: 16-24. 1993; Roldan et al Neurosa. Lett. 230:93-96. 1997; Kimura et al Bram Res. 834: 6-12. 1999; Garrido JL. et aL (FASEB J 2002; 16: 1982.

ARTE PREVIO Se proporciona de acuerdo con una modalidad de la invención un compuesto de la fórmula (I): en donde: C significa un átomo de carbono espiro compartido por el anillo a y el anillo que contiene a, b, d y e; A se selecciona del grupo que consiste de: en donde R se selecciona de H, alquilo de cadena lineal o ramificada de C,-C3, o -CH2-P( = 0)(OH)2; a es -O- o -S-; b es -CR 'R2- o -C(R,) = : d se selecciona del grupo que consiste de = N - , - C ( = O ) - . -C( = S)- y = N(R3) = 0; e se selecciona del grupo que consiste de -C ~-. -CHR4-. -NH-, -NR 5- , -N(S02R6)- y -N(C = 0)R6)-; R, R1 , R , R ° , R4 se seleccionan cada Lino independientemente de H, alquilo de C |_6 opción al mente sustituido por uno, dos o tres fenilos. alcoxi de C|_6, hidroxialquilo de C2-s. alquenilo de C?-6 y alquinilo de C2-6; R5 se selecciona independientemente de H, alquilo de C1-6 opcionalmente sustituido por uno, dos o tres fenilos, alcoxi de Ci-6, hidroxialquilo de C2-6 , alquenilo de C2-6, alquinlo de C2.6, fenilo sustituido y heteroarilo; y Rs se selecciona de alquilo de Ci_6, alcoxi de Ci-e, alquiltio de d-6, hidroxialquilo de C2_6, alquenilo de C2-6, alquinilo < e-G 2 - 6— y~c i.c Ipa q u i l.o_ d e _C 3.7 , cada uno opcionalmente sustituido por 1 -6 átbmos~de-'halógeno . hidroxialquilo de C 1 - ß , arilo sustituido" con un grupo halógeno, nitro, amino, hidroxilo o CF3, y al uilo de d_6 sustituido por uno, dos o tres grupos arilo, alquilindol de Ci.s isoindolilo, 3-piridinilo, 3-piperidinilo. benzimidazoiilo, tiendo, isotiazolilo, imidazolilo, pirazinilo, benzofuranilo, quinolilo, isoquinolilo. benzotienilo, isobenzofurilo, pirazolilo, indolilo. isoindolilo. benzimidazoiilo, purinilo, carbazoilo, oxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, 1 ,2.5-tiadiazolilo, isooxazolilo. pirrolilo, pirazolilo, quinazolilo, piridazinilo, pirazinilo, cinolinilo, ftalazinilo. q Li i n o x a I i n i I o . x a n t i n ¡ I o . h ¡ p o x a n t i n i I o y pteridinilo: o un e n a ntióme ro . diastereómero, racemato, tautómero. isómero geométrico, dímero. metabolito o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, / \ RN c con la condición de que cuando A sea x- . R sea -CH3, a sea S, b sea -CH(CH2CH3)- y d sea -C( = 0)-, entonces e no sea -NH- (AF267 o un enantiómero del mismo), y con la condición adicional de que cuando A sea \_ / R sea -CH3, a sea S, b sea -C(CH3)= y d sea =N, entonces e no sea -CH2- (AF150(S)). En una modalidad de la invención, R5 es heteroarilo seleccionado del grupo que consiste de indol, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, furilo. piridilo, pirimidilo, tienilo, isotiazolilo , ¡midazolilo, pirazinilo, benzofuranilo, quinolilo, -i s o q u i n o I i I o — be n z ot i e ni I o ^ i so b e nzofurilo, pirazolilo, i n d o i i I o , isoindolilo, be nzi midazolilo-;-" purinilo, .car-bazo I i. lo, _ oxazoüTo. tiazolilo, isotiazolilo, 1 , 2 , 5-tiadiazolilo, isooxazolilo, pirrolilo, pirazolilo, quinazolin ¡lo, piridazinilo, pirazinilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinoxalinilo, xantinilo, hipoxantinilo, pteridinilo, 5-azacitidinilo, 5-azauracililo, triazolopiridinilo, imidazolpiridinilo, pirrolpirimidinilo y pirazolpirimidinilo. En una modalidad de la invención, el compuesto es un dímero de un compuesto de la fórmula 1 , en donde e es -NR5- y las dos porciones de la fórmula 1 comparten un grupo común R5 / que se selecciona de¡ grupo que consiste de -(CH ),r y -(CH^O),,-. en donde n es 1 a 6, o un enantiómero. diastereómero. racemato, tautómero, metabolito o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En una modalidad de la invención, el compuesto se selecciona del grupo que consiste de: N-[(2,8-dimetil-1-oxa-8-aza-espiro,[4.5]dec-3-il¡den)-amina]-N-óxido; N-[(2-etil-8-metil-1-oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-amina]-N-óxido; N-[(2-Metil-8-fenil-1-oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-amina]-N-óxido; Tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona; 4-(2,4-D¡metoxi-bencil)-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF286); 8-Metil-4-pirrolidin-1 -ilmetil-1 - tia-4.8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF287); 2-(1 -Hidroxi-etil)-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF298); (S)-2-Etil-8-metil-8-oxi-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF299); 4-(2 ,4-Dimetoxi-bencil)-2-etil-8-metil-1 -tia-4,8-d'i a z a - e s p i r-o [4.5]d e can ^?,? i a. _ JA F 288 ) ; (_S ) - 2- E t i I - 8 - m e t i I - 1 - o x o -1 ;.4-tia-4,8-diaza-espiro'[4.5]decan-3-ona (AF300).; 2 E t ¡ I - 8 - m e t i I - T-tia-4,8-diaza-esp¡ro[4.5]decan-3-tiona (AF510); (S)-2-Et¡l-4-(4-fluorobencensulfonil)-8-metil-1-tia-4,8-diaza-esp¡ro[4.5]decan-3-ona (AF700); 2-Eti l-4-[2-( 1 H -i ndol-3-il)-etil]-8-metil- 1 -tia-4, 8 -d iaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF703); 2-Eti l-4-( 3- 1 H -indol-3-i l-p ropio n )-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF704); (S)-Etil-4-(3 -1H - indo t-3-ii-prop ion i f ) -8 - me t i I - 1 - tia-4, 8-diaza-esp iro[4.5]decan-3-ona (AF704B); (R)-Etil-4-(3-1H-indol-3-il-propionil)-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]d can-3-ona (AF704A); y 2-Metil-8-metil-d3-1- tia-3.8-d¡aza-espiro[4.5]dec-2-eno (AF402), o un enantiómero, d i as te reo me ro . racemato, tautómero. isómero geométrico, metabolito o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En una modalidad de la in ención, el compuesto es AF292 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una modalidad de la invención, el compuesto es un / \ RN c compuesto en donde A es \ / R es H, a es -S-; b es -CH(CH2CH3)-; d es -(C = 0)-: y e es -NH-, es decir 2 -et i I - 1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF504), o un enantiómero, diastereómero, isómero geométrico, racemato, tautómero, dímero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En una modalidad de la invención, el compuesto es (S)-2 - ?? t i I - 1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292) o su sal de En~ una modalidad1 de la invención, el compuesto es~(R'')-~ 2-Etil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF291). En una modalidad de la invención, el compuesto es un RN compuesto en donde A es \ / R es -CH3, a es -O-, d es = N(R3) = 0, o un enantiómero, diastereómero, racemato, tautómero, isómero geométrico, dímero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En una modalidad de la invención b es -CH(CH3)- y R3 es -CH3, es decir, N-[(2,8-Dimetil-1 -oxa-8-aza- espiro[4.5]dec-3-¡liden)-metil-amina].-N-óx¡cio (AF600). En una modalidad de la in ención, b es - C H ( C H 3 ) - y "' es bencilo, es decir, N-[(2,8-Dimetil-1-oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-bencil- amina]-N-óxido (AF604). En una modalidad de la invención, b es -CH(CH3)- y R3 es isopropilo, es decir, N -[(2 , 8 - D im et i I- 1 -o xa -8 - aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-isopropil-amina]-N-óxido (AF605). En una modalidad de la invención, b es -CH(CH2CH3)- y R3 es -CH3, es decir, N-[(2-Etil-8-metil-1-oxa-8-aza-espiro[4 5]dec-3-iliden)- metil-amina]-N-óxido ( A F 601 ) . En una modalidad de la invención, b es -CH(CH3)- y R3 es fenilo, es decir N-[(2-Metil-8-fenil-1 -oxa-8- aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-metil-amina]-N-óxido (AF602) En una modalidad de la invención, el compuesto es un i ¡ \ y-^ x. compuesto en donde A es ? " R es CH3, a es -O-, d es =N(R3) = 0, o un enantiómero. diastereómero, racemato, tautómero, -CH(CH3)- y R3 es metilo, es decir, Dihidro-5'-metilespiro[1 - azabiciclo[2.2.2]octan-3,5'-{4'H)-3'-iliden-metilamina]-N-óxido (AF603). En una modalidad de la invención, el compuesto es un compuesto en donde A es \ / R es metilo, a es -S-, b es -CH(CH2CH3)-; d es -C( = 0)-; e es -NR5- en donde R5 se selecciona de -(CH2)3-indolilo y -C( = 0)-(CH2)3-indol¡lo, es decir, 2- Etil-4-[2-(1H-indol-3-il)-etil]-8-metil-1-t¡a-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF703) o 2 - E t i I -4 - ( 3 - 1 H-indol-3-??-propionil)-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF704), o un enantiómero. diastereómero. isómero geométrico, racemato. tautómero, dímero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En una modalidad de la invención, es (S)-Etil-4-(3-1H-indol-3-il-propionil)-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF704B). Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso de un compuesto de la fórmula (I) o un enantiómero,. diastereómero, racemato, tautómero, isómero geométrico, dímero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la preparación de una composición farmacéutica. En una modalidad de la invención, el compuesto es AF292 o un pro-fármaco de AF292 o una sal farmacéuticamente a epta le--de-:-ya-se_a_^ de AF292. En una modalidad de la Invención, el pro-fármaco es - AF267B ,_o una sal, farmacéuticamente aceptable del mismo. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de la fórmula (I), o un enantiómero, diastereómero, racemato, tautómero, isómero geométrico, dímero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de ios mismos, y un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o un excipiente de los mismos. En una modalidad de la invención, el compuesto es AF292 o un pro-fármaco de AF292 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una modalidad de la in ención, el p r o - fármaco es AF267B o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 5 Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la in ención un método para estimular el receptor muscarinico M 1 , que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267 y 10 AF150(S), o un enantiómero, d iastereómero, racemato, tautómero, isómero geométrico, dímero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En una modalidad de la invención, el compuesto es AF292 o un pro-fármaco de AF292 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una modalidad de la 15 invención, el pro-fármaco es AF267B o una sal farmacéuticamente cep.ía b.|e-..d.e LmJ.splQ,. ~ Se proporciona también de acuerdo. ,con_ una modalidad' de la invención un compuesto de la fórmula (I) en donde A es 20 , R es -CH3, a es -O-, d es = N(R3) = 0, o un enantiómero, diastereómero, racemato, tautómero, isómero geométrico, dímero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos en la preparación de una composición farmacéutica que estimula el receptor muscarinico M 1 y retarda la oxidación en 25 la cercanía del receptor muscarinico M 1. 1 Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención LI n a composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva agonística del receptor muscarínico M1 de un / \ R C 5 compuesto de la fórmula (I) en donde A es '' . R es -CH3. a es -O-, d es = N(RJ) = 0, o un enantiómero, d iastereómero, racemato, tautómero, isómero geométrico, dímero, metabolito o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, y al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable 0 del mismo. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para estimular el receptor muscarínico M1, que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula (I) en RN c ¦ =srrdonjie^A._es_^ _/_. R e_s _-CH 3, a es -O-, d es =N(R") = 0, o un "enantiómero, diastereómero; racemato,. tautómero, isómero geométrico, dímero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. 0 Se proporciona también en una modalidad de la invención el compuesto (S)-2-Etil-4-(4-Fluoro-bencensulfonil)-8- metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF700): Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso del compuesto AF700, o un enantiómero. 5 diastereómero. racemato, tautómero, metabolito o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la preparación de na com osición farmacéutica que estimula el receptor muscarínico M1 y activar» secretasa. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención una composición farmacéutica que comprende un receptor muscarínico M1 que estimula y una cantidad efectiva que activa u secretasa del compuesto AF700, o un enantiómero, diastereómero, racemato, tautómero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, y al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable de los mismos. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para estimular el receptor muscarínico M1 y activar « secretasa, que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva del compuesto-.AF.700., . _o ...un. ^enantióme o, diastereómero, racemato, tautómero, " metabolito ?· sal- 'farmacéuticamente., aceptable de jos mismos. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso del compuesto AF700, o un enantiómero, diastereómero, racemato, tautómero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la preparación de una composición farmacéutica que estimula el receptor muscarínico M1 y antagonisa \ secretasa. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención una composición farmacéutica que comprende un receptor muscarínico M 1 agonístico y una cantidad efectiva antagonista de |> secretasa del compuesto AF700. o un enantiómero, diastereómero, isómero geométrico. racemato, tautómero, dimero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, y al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable de los mismos. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para estimular el receptor muscarínico M1 y antagonizar (5-secretasa, que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva del compuesto AF700, o un enantiómero. diastereómero, isómero geométrico, racemato, tautómero, dimero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad F700, o un enantiómero, diastereórrféro, racemato, - tautómero,- metabolito , o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la preparación de una composición farmacéutica que estimula el receptor muscarínico M1 y antagoniza y-secretasa. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención una composición farmacéutica que comprende un receptor muscarínico M1 agonístico y cantidad efectiva antagonista y-secretasa del compuesto AF700, o un enantiómero. diastereómero, racemato, tautómero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, y al menos un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente de los mismos. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para estimular el receptor muscarínico M 1 y antagonizar y-secretasa, que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva del compuesto AF700, o un enantiómero, diastereómero, racemato, tau.tómero, metabolíto o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso del compuesto (S)-2-Etil-1 -tia-4,8-diaza- espiro[4.5]decan-3-ona (AF292), o un metabolito o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la preparación de una composición farmacéutica para estimular el receptor 1.y aji ag ji iza r el receptor muscarínico M3. Se' proporciona también de- acuerdo . con una modalidad de la invención una composición farmacéutica que comprende un receptor muscarínico M1 agonista y una cantidad efectiva antagonista del receptor muscarínico M3 del compuesto (S)-2-Etil- 1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292), o un metabolito o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable del mismo. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención sangre humana o animal que contiene el compuesto (S)-2-Etil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292) o un metaboito o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una modalidad de la invención, la sangre se ubica en 5 un cuerpo humano o animal. En una modalidad de la invención, la sangre no se ubica en un cuerpo humano o animal. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención plasma en sangre humana o animal que contiene el compuesto (S)-2-Etil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona 10 (AF292), o un metabolito o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una modalidad de la invención, la sangre se ubica en un cuerpo humano o animal. En una modalidad de la invención, la sangre no se ubica en un cuerpo humano o animal. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad 15 de la invención el compuesto (S)-2-Et¡l-1 -tia-4,8-diaza- ·<¦ -re s p i no [A.5J.d e^a n^^.na^^Af^^ ) _d e acuerdo a la reivindicación 1, o un metabolito o - sa l' -farmacéuticamente ..¿.aceptabje _del. mismo, siempre que se ubique en un cuerpo humano o animal. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad 20 de la invención el compuesto (S)-2-etil-8-metil- 1 -tia-4,8-diaza- espiro[4.5]decan-3-ona (AF267B), para uso como un pro-fármaco del compuesto (S)-2-Etil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292). Se proporciona también de acuerdo con una modalidad 25 de la invención el uso del compuesto (S)-2-etil-8-metil-1 -tia-4 ,8- diaza-espi o(4.5]decan-3-ona (AF26/B) como un pro-fármaco del compuesto (S)-2-Et¡l-1-t¡a-4.8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292). Se proporciona también de acuerdo con una modalidad 5 de la invención el uso de una combinación de los compuestos (S)- 2-etil-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF267B) y (S)-2-Etil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292) en la preparación de una composición farmacéuticamente para estimular el receptor muscarinico M 1 y antagonizar el receptor muscarinico 10 M.3. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención una composición farmacéutica que comprende un receptor muscarinico M1 agonista y una cantidad antagonista del receptor muscarinico M3 de una combinación de los compuestos 15 AF267B y AF292 y ai menos un portador, diluyente o excipiente =r_- -~f a r.m acé utj c a mente g ce p_t a ¡ bll e__d e I o_s mismos. " ~ ' Se proporciona- también de. acuerdo con una modalidad de la invención un método para estimular el receptor muscarinico M 1 y antagonizar el receptor muscarinico M3 en un paciente, que 20 comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de una combinación de los compuestos AF267B y AF292. En una modalidad de la invención AF267B y AF292 se administran juntos. En una modalidad de la invención, AF267B y AF292 se administran separadamente. En una modalidad de la 25 invención, AF267B y AF292 se administran en diferentes ocasiones. En una modalidad de la invención AF267B y AF292 se administran al mismo tiempo. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso de Lina combinación de un primer compuesto 5 que es ( S ) - 2 - E t i M -t ¡a -4.8 -d ia za-es p i ro[4.5 ]deca n - 3 -o n a (AF292) y un segundo compuesto seleccionado del grupo que consiste del compuesto de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), incluyendo racematos, enantiómero, d lastereómeros, tautómeros, isómeros geométricos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, 10 en la preparación de una composición farmacéutica para estimular el receptor muscarinico M1 mientras se disminuyen los efectos secundarios adversos debidos a la estimulación de otros subtipos de mAChR. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad 15 de la invención una composición farmacéutica que comprende una ¦r-:- -cantidad.._ _ a g o n ÍsJ i.c a d e I receptor muscarinico M 1 de una combinación de un primer compuesto que es AF292 y un segundo compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), incluyendo racematos, 20 enantiómeros, diastereómeros, isómeros geométricos, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable de los mismos. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad 25 de la invención un método para estimular el receptor muscarinico M 1 mientras que dismin yen los efectos secundarios adversos debidos a la estimulación de otros subtipos mAChR en un paciente, que comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de una combinación de un primer compuesto que es AF292 y un segundo compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), incluyendo racematos, enantiómeros, diastereómeros. tautómeros, isómeros geométricos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En una modalidad de la invención, el primer compuesto y el segundo compuesto se administran juntos. En una modalidad de la invención, el primer compuesto y el segundo compuesto se administran de manera separada. En una modalidad de la invención, el primer compuesto y el segundo compuesto se administran en diferentes ocasiones. En una modalidad de la invención, el primer compuesto y el segundo compuesto se --a d mi n:i s t r.ari_a Ljm ismp_t jejnpo . Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para estimular el receptor muscarínico M1 en un paciente simultáneamente con AF267B y AF292. que comprende administrar a un paciente una cantidad de AF267B efectiva para formar in vivo una cantidad de una mezcla de AF267B y AF292 efectiva para estimular el receptor muscarínico M . Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención 2 - Et i I -4 - ( 3 - 1 H-indol-3-il-propionil)-8-metil-1 -tia- 4.8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona en una forma racémica (AF704) o como el S-enantiómero de la misma (AF704B) para uso como un pro-fármaco de al menos uno del grupo de AF267B. AF292 y ácido indol-3-propiónico. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso de 2-Etii-4-(3-1 H-indol-3-il-propionil)-8- metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona en forma racémica (AF704) o como el S-ena ntjómero de la misma (AF704B), en la preparación de una composición farmacéutica para estimular el receptor muscarinico M 1 , retardando la oxidación en la cercanía del receptor muscarinico M1 , y proporcionando actividad neuroprotectora. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de actividad neuroprotectora y que retarda la espiro[4.5]decan-3-ona en forma racémica (AF704) o como el S- enantiómero de la misma (AF704B), y. un portador, diiuyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable de la misma. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un proceso para la preparación de 2-etil-8-metil-1 - tia-4, 8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF267), que comprende hacer reaccionar 4-etilpiperidona con ácido 2-mercaptobutírico y amoniaco. En una modalidad de la invención, el proceso comprende además obtener los enantiómeros AF267A (R-enantiómero) y AF267B (S-enantiómero) por separación quiral. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un proceso para la preparación de AF267B, que comprende racemizar AF267A y aislar AF267B a partir de la mezcla racé mica. En una modalidad de la invención, el aislamiento comprende separar el AF267B a partir de la mezcla racémica por separación quiral. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un proceso para la síntesis de AF267B que comprende poner en contacto ácido (R)-2-mercaptobutírico con acetato de amoniaco y 1 -metil-4-piperidona. En una modalidad de la invención el (R)-2-mercaptobutírico se obtiene poniendo en contacto ácido (R)-2-benzoiltiobutírico con hidróxido de amonio. En una modalidad de la invención, el ácido (R)-2-benzo¡ltiob utírico se~pbJ;iene_.poi2j_eiid_o en _c o n_t a c t o ácido (R)-2-bromobutírico con tiobenzoato de cesio.- En una modalidad .de. la invención el ácido (R)-2-bromobutírico se obtiene poniendo en contacto ácido 2-aminobutírico que tiene la configuración R con nitrito de sodio. bromuro de potasio y ácido bromhídrico. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un proceso para la preparación de AF267B ,4C marcado, que comprende hacer reaccionar AF287 con bromuro de etilo 14C-marcado, desprotegiendo el átomo de nitrógeno en la posición 4 de AF287, y aislando AF267B C marcado por c r o m a t o g r a f i a q Li i r a I . Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un proceso para la preparación de una mezcla de (S)-2-Etil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292) y (R)-2-Etil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona ( A F 291 ) que comprende hacer reaccionar AF267 con un agente de desmetilación. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención una forma cristalina de (S)-2-etil-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF267B), caracterizada por los siguientes datos: P212121 (No. 16) a = 10.394 ((10) (a = 90°), b = 20.133 (2)(p = 90°), c =5.856 (4) (y = go°), Á, T=110K. En una modalidad de la invención, la forma cristalina se caracteriza además por los siguientes datos: Volumen =1224.2 (9) Á3, Z = 4, Fw = 202.32, Densidad calculada, Dc=1.092 Mg/m3, Coeficiente de absorción, µ = 0.232 mm"1. :-. J3e_pjioporci na Jambién de acuerdo con una modalidad de la" invención una" forma -cristalina de. (AF267B) que tiene la configuración mostrada en la Estructura 1 en el Ejemplo 2. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un proceso para la preparación de 2 , 8-Dimeti I- 1 -tia-3,8-diaza-espiro[4.5]dec-2-eno [AF150(S)] que comprende ciclizar 1-metil-4-N-tioacetilamino-1,2,3,6-tetra-hidropiridina. En una modalidad de la invención la ciclización se conduce en la presencia de ácido fosfórico. En una modalidad de la invención, la 1 -metil-4-N-tioacetilamino-1 ,2,3,6-tetrahidropiridina se obtiene por reducción de reducción de 1 -metil-4-N-tioacetilaminometilpiridinio con borohidruro de sodio. En una modalidad de la invención el 1- m e t i I - 4 - N - 1 i o a c e t i I a m i n o m e t i I p i r i d i n i o se obtiene haciendo reaccionar yoduro de 4- ( acetam i nometi I ) - 1 -metil-p i rid i n io con 5 reactivo Lawesson. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención una formulación farmacéutica que comprende AF150(S) en aceite de parafina. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad 10 de la invención un método para inhibir la liberación o síntesis de péptido beta-amiloide (?ß) en una célula, tejido u organismo de mamífero que comprende administrar a una célula, tejido u organismo de mamífero una cantidad de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de 15 compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), o racematos, -=·---- — ~~ ---enantiómeros ,t-js.ó.mer s. gje nLé.txico^djastereómeros, tautómeros, os efectivas para inhibir la liberación o síntesis celular de ?ß. Se proporciona también" de acuerdo con una modalidad 20 de la invención el uso de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados de! grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, d iastereómeros, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la preparación de 25 una composición farmacéutica para inhibir la liberación o síntesis de péptido beta-amiioide (A|>) en una célula, tejido u organismo de m a m i f e ro . Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para elevar el nivel de forma secretada de la proteína (c/.-APPs) del precursor amiloide no amiloidogénico en una célula, tejido u organismo de mamífero que comprende administrar a una célula, tejido u organismo de mamífero una cantidad de un compuesto de una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de un compuesto de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, d iastereómeros , tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos efectivas para elevar el nivel de la forma secretada de la proteína (oc-APPs) precursora amiloide no amiloidogénica. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de-~la^in vencióm_-el_ _us _de__un _ cp_mp_u_esto o una mezcla de compuestos "seieccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, díastereómeros, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la preparación de una composición farmacéutica para elevar el nivel de forma secretada de la proteína (a-APPs) precursora amiloide no amiloidogénica en una célula, tejido u organismo de mamífero. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para disminuir el nivel de péptido AB en el cerebro de un mamífero que tiene un nivel elevado de A|i en el cerebro, que comprende administrar a un mamífero que tiene un nivel elevado de A|> en el cerebro una cantidad de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S) o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, diastereómeros, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos efectiva para disminuir el nivel de ?ß en el cerebro del mamífero. En una modalidad de la invención, el nivel elevado de A f¾ en el cerebro es un resultado de h ipercolesterolem la. En una modalidad de la invención, el nivel elevado de A|5 en el cerebro es un resultado de hipofunción colinérgica. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste del compuesto ™.d e=l a=f.órm u I a~(J .)·,·_ A E2.67 B_y_AF 15,0. (.S.L _o_ r a ce m at_os, enantjó mero s , isóTneros g 'dniétri'c'os, diastereómeros,- tautómeros- y — sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en la preparación de una composición farmacéutica para disminuir el nivel de péptido ?ß en el cerebro de un mamífero que tiene un nivel elevado de ?ß en el cerebro. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para inhibir la síntesis o liberación de apolipoproteína (ApoE) en una célula, tejido u organismo de mamífero que comprende administrar a una célula, tejido u organismo de mamífero una cantidad de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste del compuesto de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), o racematos. enantiómeros, isómeros geométricos, diastereómeros, tautómeros 5 y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos efectivos para inhibir la liberación o síntesis de ApoE en la célula, tejido u organismo de mamífero. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso de un compuesto o una mezcla de 10 compuestos seleccionados del grupo que consiste del compuesto de la fórmula (I), AF267 y AF150(S), o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, diastereómeros, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la liberación o síntesis 15 de ApoE en una célula, tejido u organismo de mamífero. En una - .·-— -^modalidad-de^a Jn.v.ención ta .ApoE^es^ApoE^, 'Se "proporción a'" también desacuerdo con una modalidad -¦ de la invención un método para disminuir los niveles de apolipoproteína (ApoE) en una célula, tejido u organismo de 20 mamífero que comprende administrar a una célula, tejido u organismo de mamífero una cantidad de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de un compuesto de la fórmula (I), AF267B y AF150(S) o racematos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereómeros, tautómeros 25 y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos efectivas para disminuir los niveles de ApoE en la célula, tejido u organismo del mamífero. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso de un compuesto de una mezcla de 5 compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, d iastereómeros . tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en la preparación de una composición farmacéutica para disminuir niveles de ApoE en 10 una célula, tejido u organismo de mamífero. En una modalidad de la invención la ApoE es ApoE4. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para disminuir hiperfosforilación tau en una célula, tejido u organismo de mamífero, que comprende 15 administrar a una célula, tejido u organismo de mamífero un ~=~-co m p.u esto-._,o-u n a¾mezc I a .de_.c o m p.u.e.st o s, ,s,e l.e.c ci.o.o d P s_d.e]_ g.n¿ p_o_ que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S) - o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, diastereómeros, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables 20 de los mismos efectivas para inhibir hiperfosforilación tau. En una modalidad de la invención la hiperfosforilación tau es hiperfosforilación tau inducida por ?ß. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención, el uso de un compuesto o una mezcla de 25 compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), o racematos, ena ntiómeros, isómeros geométricos, diastereómeros, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en la preparación de una composición farmacéutica para disminuir hiperfosforilación tau en una célula, tejido u organismo de mamífero. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para disminuir la formación helicoidal apareada en una célula, tejido u organismo de mamífero que comprende administrar a una célula, tejido u organismo de mamífero un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S) o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, diastereómeros, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos efectivas para inhibir hiperfosforilación tau. .-.-Se-^ no p o rci o n a, .tam bJé n -d e-.ac.t¿e rd q_.co.n_u na mod andad de la inveTiciÓn "el" uso "de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267 y AF150(S), o racematos, enantiómeros, diastereómeros, tautómeros, isómeros geométricos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en la preparación de una composición farmacéutica para disminuir la formación helicoidal apareada en una célula de mamífero. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para activar la trayectoria de señalización Wnt en una célula, tejido u organismo de mamífero que comprende administrar a una célula, tejido u organismo de mamífero un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula 5 (I), AF267B y AF150(S), o racematos, enantiómeros. diastereómeros, tautómeros, isómeros geométricos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos efectivas para inhibir anormalidades Wnt. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad 10 de la invención el uso de un compuesto o una mezcla de compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267 y AF150(S), o racematos, enantiómeros, diastereómeros, tautómeros, isómeros geométricos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en la preparación de 15 una composición farmacéutica para activar la trayectoria de —-*·- =se ña I i z a c i ó rir. Wn t-e n-u na.-cé.j.u,ja,,. te j i.d .j.^j.gan i sino de mamífero. Se "proporciona también desacuerdo con -una modalidad de la invención un método para inhibir efectos mediados por GSK3[5 en una célula, tejido u organismo de mamífero que 20 comprende administrar a una célula, tejido u organismo de mamífero un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S) o racematos, enantiómeros, diastereómeros, tautómeros, isómeros geométricos y sales 25 farmacéuticamente aceptables de los mismos efectivas para inhibir efectos mediados por GSK3(!. En una modalidad de la invención, los efectos mediados por GSK3|'. se seleccionan del grupo que consiste de hiperfosforilación tau. apoptosis, degradación de |¡- c a t e n i n a . y disminución en genes objeti o W n t - 5 Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267 y AF150(S), o racematos, enantiómeros. d iastereómeros, tautómeros, isómeros geométricos y sales 10 farmacéuticamente aceptables de los mismos en la preparación de una composición farmacéutica para inhibir efectos mediados por GSK3|3 en un mamífero. En una modalidad de la invención, el método se utiliza en respuesta para agravios inducidos por péptidos A (3 o inanición de tensión oxidativa para señalización 15 Wnt, apoptosis, o viabilidad celular. =-_^ e¾p rop,o c i o a^ta mjp i en. de a cu erd o con una modalidad efe la invención un" método para" mejorar- la actividad de factores de crecimiento endógenos, es decir, neutrófinos, en una célula, que comprende administrar a una célula, tejido u organismo de 20 mamífero una cantidad de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S) o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, diastereómeros, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos el cual solo es 25 efectivo como un agente neurotrófico y que actúa sinergistica mente con los neu ro trotino s . Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos 5 de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), o racernatos. enantiómeros. diastereómeros, tautómeros, isómeros geométricos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que solo es efectivo como un agente neurotrófico y que actúa sinerg ¡sticamente con factores de crecimiento endógeno, es decir, neurotrofinos, en la 10 preparación de una composición farmacéutica para mejorar la actividad de neurotrofinos. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención una composición farmacéutica para inhibir la liberación o síntesis de péptido beta-amiloide (A|í) para elevar el 15 nivel de forma secretada de la proteína ( -APPs) precursora --3e-~-:.-r-ain iloíd Af> en el" cerebro dé 'un mamífero que tiene un nivel elevado de..A(3 en el cerebro, para inhibir la liberación o síntesis de ApoE, para disminuir niveles de ApoE, para disminuir hiperfosforilación tau. 20 para disminuir la formación helicoidal apareada, para activar la trayectoria de señalización Wnt, para incrementar beta-catenina, para inhibir los efectos mediados por GSK3[3, o para mejorar la actividad de neurotrofinas, que comprende un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados a partir del grupo que 25 consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S) o racematos, enantiómeros. isómeros geométricos, d iastereómeros. tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. 5 Se proporciona también de acuerdo con Lina modalidad de la invención una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, diastereómeros, tautómeros 10 y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y al menos un compuesto farmacéuticamente activo adicional seleccionado del grupo que consiste de: inhibidores de colinesterasa, agonistas nicotínicos, precursores colinérgicos y mejoradores colinérgicos, nootrópicos, fármacos antimuscarinicos periféricos, antagonistas 15 muscarínicos M2, antagonistas M4, agonistas inversos de enfermedad de Parkinson (PD) o de depresión, agentes antipsicóticos y antiesquizofrénicos, antagonistas y moduladores 20 de glutamato, antagonistas de NMDA, agonistas de AMPA, acetil- L-carnitina, inhibidores de MAO-B, péptidos y factores de crecimiento, agentes que disminuyen el colesteról, antioxidantes, inhibidores de GSK-3p\ ligandos Wnt, o inhibidores de y-secretasa , agentes que degradan beta-am iloide, agentes anti-agregación 25 beta-amiloide, agentes quelantes, compuestos inmunoterapéuticos contra beta-amiloides. compuestos que unen a amiloides. inhibidores de ciclooxigenasa (COX)-2-, fármacos antiinflamatorios no esteroidales, agentes estrogénicos, moduladores del receptor estrogénico. neuroprotectores esteroidales y farmacéuticos de captura prolongada. En una modalidad de la invención el compuesto es AF292 o pro-fármaco de AF292 o una sai farmacéuticamente aceptable del mismo. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para tratar o reducir angiopatia amiloide cerebral que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo (a) una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de sales farmacéuticamente aceptables de AF267B, AF292 y AF704B de los mismos o mezclas de tales compuestos y sales y (b) una cantidad efectiva de un c o m p u es to_r_s eje c c i o n a_d o d_e jj_n compuesto inmunoterapéutico contra beta-amiloides y compuestos que .se unen a amiloides. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención una composición farmacéutica que comprende (a) una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de sales farmacéuticamente aceptables de AF267B, AF292, y AF704B de los mismos o mezclas de tales compuestos o sales, y (b) una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado de un compuesto inmunoterapéutico contra beta-amiloides y compuestos que se unen a amiloides, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable de los mismos. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso de una combinación de (a) un compuesto seleccionado del grupo que consiste de sales farmacéuticamente aceptables AF267B, AF292 y AF704B de los mismos o mezclas de tales compuestos o sales, y (b) un compuesto seleccionado de un compuesto ¡nmunoterapéutico contra beta-a miloides y compuestos que se unen a amiloides. en la preparación de una composición farmacéutica para tratar o reducir angiopatia amiloide cerebral. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para tratar una enfermedad en un mamífero asociada con función colinérgica afectada o enfermedades en donde existe un desequilibrio en la función colinérgica, o enfermedades con actividad afectada de receptores de acetilcolina a partir del grupo que consiste de: demencia senil demencia multiifract; demencia fronto-temporal; demencia vascular; apoplejía/isquemia; MID combinado con daño por apoplejía/isquemia/cabeza; MID y AD combinados; y daño de cabeza humana; deterioros de memoria asociadas con la edad; deterioros cognitivos ligeros (MCI); MCI conductivo a AD; disfunción cognitiva (incluyendo amnesia, trastornos de confusión aguda, trastornos de falta de atención, trastornos de enfoque y concentración); estados alucinantes-de paranoia; trastornos de atención y emocionales; trastornos del sueño; deli io pos- operativo; efectos adversos de antidepresivos tricíclicos; efectos adversos de ciertos fármacos utilizados en el tratamiento de esquizofrenia y enfermedad de Parkinson; xerostomia, anomia. 5 pérdida de memoria y lo confusión; psicosis; esquizofrenia, esquizofrenia comorbit con AD, principio de esquizofrenia tardía, parafrenia. trastornos esquizofreniformes. ansiedad; trastornos bipolares; manía; estabilización del humor; deterioros cognitivos después de la remoción de ciertos gliomas; disquinesia tardía; 10 tensión oxidativa durante terapia de oxígeno; afasia; síndrome amnésíco pos-encefalítico; demencia por SIDA; deterioros de memoria en enfermedad autoinmune incluyendo lupus, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, síndrome de fatiga crónica, y .fíbromialgía; deterioros de memoria en depresión o esquizofrenia 15 atípica; dolor, rumatismo, artritis y enfermedades terminales; alimenticio; incluyendo bulimia y anorexía; obesidad; deficiencia de ornitina transcarbamilasa congenital; atrofia olivopontocerebral, 20 síntomas de abstinencia de alcohol; abuso de sustancias incluyendo síntomas de abstinencia y terapia de sustitución; corea de Huntington; parálisis supranuclear progresiva; enfermedad de Pick, ataxia Friedrick; .enfermedad de Gilíes de la Tourette; síndrome de Down; glaucoma; presbiopia; trastornos autonómicos 25 incluyendo disfunción de motilidad y función gastrointestinal tal como enfermedad del intestino inflamado, síndrome del intestino irritable, diarrea, constipación, secreción de ácido gástrico y úlceras; incontinencia por urgencia urinaria, asma, COPD; que comprenden administrar a un mamífero con necesidad de tal 5 tratamiento un compuesto, una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), o racematos, enantiómeros, diasteró meros, ta u torneros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en una cantidad efectiva total de tales 10 enfermedades. En una modalidad de la invención, el compuesto es AF292 o un pro-fármaco de AF292 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para evitar o tratar estados de 15 enfermedad del sistema nervioso central o periférico debidos a la ~ . =r --,<-(.,· s, u.n G i Ó n --e.n _.u n o o más de los siguientes: cerebro, sistema nervioso, sistema - cardiovascular, sistema inmune, sistema neurócrino, sistema gastrointestinal, o glándulas endocrinas y exóc riñas, ojo, córnea, pulmones, próstata u otros órganos en 20 donde la función colinérgica se media por los subtipos del receptor muscarínico, en donde la disfunción implica; trastornos mediados por amiloide de cerebro; trastornos mediados por glicogen sintasa cinasa (GSK3(í), daños, disfunciones o enfermedades mediados por hiperfosforilación de proteína fat/, disfunciones o trastornos: 25 daños, disfunciones o enfermedades mediados por hipercolesterolemia y/o hiperlipidemia del CNS y PNS. anormalidades de señalización mediadas por Wnt, dete ioro de neuroplasticidad ; hiperglicemia; diabetes; enfermedades mediadas por factores de crecimiento endógenos, o combinación de factores 5 de riesgo adicionales; o estados de enfermedad que implica apolipoproteína E; o disturbios en donde una disfunción colinérgica ha sido implicada, incluyendo: demencia senil del tipo Alzheimer, enfermedad de Alzheimer (AD), retraso del comienzo de síntomas de AD en un paciente con riesgo de desarrollar AD, 0 demencia corporal Lewy, angiopatia amiloide cerebral (CAA), amiloidosis cerebral, demencia fronto-temporaL demencia vascular, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, demencia multiifract ( ID), isquemia por choque, ID combinada con daño por apoplej i a/isquemia/cabeza, MID combinada y enfermedad de 5 Alzheimer, daño de cabeza humana, deterioros de memoria -^.,a s o c i a d_as_ c o_n la__ edad, deterioro cognitivo ligero (MCI), MCI " conducente" a - AD, - trastorno bipolar, *" alfu ¾~,~-~e s'qu i-z o fr-e n i at,-.- esquizofrenia no afectiva, parafrenia, disfunciones inmunes, trastornos neurocrinos y desregulación de consumo alimenticio, 0 incluyendo buljmia y anorexia, control de peso, obesidad, inflamación; que comprenden administrar a un mamífero con necesidad de tal tratamiento un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), o racematos. enantiómeros, 5 diastereómeros, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en una cantidad efectiva para tratar al menos una de tales enfermedades En una modalidad de la invención, el compuesto es AF292 o un pro-fármaco de AF292 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 5 Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para tratar un paciente con AD, MCI, Demencia Corporal Lewy. demencia fronto-temporal. demencia vascular, deterioro de memoria en dolor de cabeza, demencia por SIDA para inhibir el deterioro adicional en la condición del 10 paciente que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I), AF267B y AF150(S), o racematos, enantiómeros, d iastereómeros , tautómeros, isómeros geométricos y sales 15 farmacéuticamente aceptables. 2 e Se proporciona también de acuerdo con una modalidad 20 de la invención un método para tratar esquizofrenia, que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de AF267B, AF292, sales farmacéuticamente aceptables del mismo y mezclas de AF267B, AF292 o sales de las mismas. 25 Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso de AF267B. AF292. sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, o una mezcla de AF267B, AF292 o sales farmacéuticamente aceptable de los mismos en la preparación de una composición para el tratamiento de esquizofrenia Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención una composición farmacéutica para el tratamiento de esquizofrenia, que comprende AF267B, AF292, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, o una mezcla de AF267B, AF292 o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención un método para disminuir síntomas de esquizofrenia, que comprende administrar a un paciente con neaesjdad_del mismo una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste les. farmacéuticamente aceptables del mismo y mezclas de AF267B," AF292 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo. Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención el uso de AF267B, AF292, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos o mezclas de AF267B, AF292 o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en la preparación de una composición farmacéutica para disminuir los síntomas de esquizofrenia.

Se proporciona también de acuerdo con una modalidad de la invención una composición farmacé tica para disminuir síntomas de esquizofrenia, que comprende un compuesto seleccionado a partir de AF267B, AF292, sales farmacéuticamente aceptables del mismo y mezclas de AF267B, AF292 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo y al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En esta solicitud de patente, "alquilo" significa una cadena lineal o ramificada de 1-8 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, etc. "alcoxi" significa -O-alquilo, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, etc. "alquenilo" significa una cadena lineal o ramificada de 2-8 átomos de carbono que tiene al menos una doble unión C-C en l a cadena .__ . " a I q u i n i I o -s i g n i fie a. una c a d en a I i n e al o "7 a mi f i c a d a~ a" é -2 -8 átomos de carbono que tiene al menos una triple unión C-C en la cadena. "alquiltio" significa -S-alquilo, por ejemplo, metilito, etiltio, propiltio, isopropiltio etc. "cicloalquilo" se refiere a estructuras del anillo mono- y biciclico que contienen 3-12 átomos de carbono. Ejemplos de cicloalquilo son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, decalinilo y norbornilo. "arilo" se refiere a una estructura del anillo aromático mono- o biciclico que contiene 5-12 átomos de carbono. Ejemplos de arilo son fenilo, naftilo y bencilo. "heterocíclico" se refiere a estructuras del anillo mono- 5 y biciclico que contienen 4-12 átomos de carbono y al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre. "heteroarilo" se refiere a una estructura del anillo aromático mono- o biciclico que contiene 4-12 átomos de carbono y al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre. Ejemplos de 10 heterocíclico y heterarilo son indolilo, isoindolilo, 3-piridinilo, 3- piperidinilo, benzimidazolilo, tienilo, isotiazolilo, imidazolilo, pirazinilo, benzofuranilo, quinolilo, isoquinolilo, benzotienilo, isobenzofurilo, pirazolilo, indolilo, isoindolilo, benzimidazolilo, purinilo, carbazolilo, oxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, 1,2,5- 15 tiadiazolilo, isoxazolilo, pirrolilo, pirazolilo, quinazolinilo, -.. -^ ir.idajzm.il ., p r_azinilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinoxalinilo, xantinilo, -hipoxantinilo. y _ p.terid inilo, pirrolid'i ilb," ^p"i peYid i ? ilo~ piperazinilo, furilo, piridilo, pirimidilo, 5-azacitidinilo, 5- azauracililo, triazolopiridinilo, imidazolopiridinilo, 20 pirrolopirimidinilo y pirazolo-pirimidinilo. El "átomo de halógeno" puede ser uno de flúor, cloro, bromo y yodo. A menos que se observe de otra manera, se utilizan las siguientes abreviaturas. 25 ?ß- [3-amiloide AA ácido araqu ido n ico AAMI deterioro de memoria asociado con la edad ACh acetilcolina AchE-ls inhibidores de acetilcolinesterasa AD enfermedad de Alzheimer AGP u-glicopro teína humana AGP |1-glicoproina ApoE apoliproteína APP proteína precursora amiloide AUC área bajo la curva BDNF factor de crecimiento derivado de cerebro bFGF factor de crecimiento , de fibroblasto básico CAA angiopatía amiloide cerebral CCh carbacol CDX met¡l-|3-c¡clodextrina CE._ energía de colisión " ~OHF - - ¦-- - lesión de obstrucción de \a~ ^ab'eYsT^'' '~ ~~ 3 CNS ' sistema nervioso central CSF fluido cerebroespinal DAPI 4,6-diamidino-2-fenil¡ndol DCC diciclohexilcarbodiimida DDW agua doble destilada DMF N,N-dimetilformamida DMAP 4-d imetilaminopiridina DMPU N,N'-dimetil-N,N'-propenilurea ECG electrocardiograma EGF factor de crecimiento epidérmico FACS clasificador celular activado con fluorescencia FCS suero de bovino fetal 5 GC cromatografía de gas G S K 31 i giicogen sintasa cinasa HERG gen relacionado con éter a-go-go humano HPLC cromatografía liquida de rendimiento elevado HS suero de caballo 10 HSA albúmina de suero humano Lev., icv intracerebroventricular i.p., ip intraperitonealmente i.v., iv intravenosa LBD enfermedad Corporal Lewy 15 LC cromatografía liquida M1 mAChR receptor muscarínico 1 mAChR receptor muscarínico 20 mCPBA ácido m-cloroperbenzoico MCI deterioro cognitivo mínimo MID demencia multiifract MRSA agonistas selectivos del receptor muscarínico y antioxidantes potentes 25 MS espectrometría de masa MTBE Metil-í-butil-éter MTT bromuro de 3-(4.5-dimetiltiazol-2-il)-2. difenil-tetrazol MWM laberinto de agua de Morris 5 n b m núcleo basal magnocelular NFT nudos neurofibrilares NGF Factor de Crecimiento Nervioso NMDA N-metil-D-Aspartato NMR resonancia magnética nuclear 0 NOAEL nivel de efecto no adverso NSS clasificaciones de severidad nerurológ OXO-M oxotremorina-M PA evitación pasiva PBS solución salina regulada con fosfato 5 PD enfermedad de Parkinson -_P_H.F__ filamentos helicoidales apareados - P I - f s f o i n ó s i t i ilar ~~^~-~-- tt^=-~ -- . — . _ _ PKC pro teína ciñas a C PMSF fe nilmetilsulfonil fluoruro 0 PNS sistema nervioso periférico po per os, oral PS-1 presenilina-1 PZ pirencepina QNB bencilato de quinuclidinilo 5 REL relación de latencia de escape RID Relación de Duración de Investigación ROS especies de oxígeno reactivas RPL relación de longitud de trayectoria RSA Antioxidantes Selectivos Receptores 5 s . c.. sc subcutáneamente SDAT demencia senil de tipo Alzheimer SDS-PAGE electroforesis de dodecil sulfato de sodio-gel de poliacrilamida SMB Lecho de Traslado Simulado 10 TBI daño cerebral traumático Tg transgénico THF tetrahidrofurano TUNEL desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) mediada por muesca de etiquetado final dUTP 15 A1 (humano); Tr~=. ^ 2 A^ ( h ujriaji o ) ; A 3 (humano subtipos. del rece~ptor"de ¾'éli "sina~^^-— AT1 (Recombinante Humana) ang iotensina 20 BZD (Central) benzodiacepina B2 (Recombinante Humana) b r a d i q u i n i n a CCKA (Recombinante 25 Humana (CCK1) colecistoquinina D (Recom binan te Humana); D2S ( R e c o m b i n a n t e Humana) Subtipos del receptor de dopamina ETA (Recom binante Humana) endotelina GABA (no selectivo) ácido gamma-aminobutirico GAL2 (h) galanina IL-8B (recombinante humano) (CXCR2) subtipo del receptor de quemoquina CC R 1 (Recombinante -_Hu_niano2_ subtipo del receptor de quemoquina H1 (central): H2 subtipos del re c e p t o r dé- tíTst a mi n a -MC4 (Recombinante Humana) melanocortina ML1 melatonina NK2 (Recombinante Humana); NK3 ( R e c o m b i n a n t e Humana) T a q u i k i n i n a Y 1 (humana); neuropéptido. Y2 (humana) neuropétido N T 1 (Humana Recombin ante); (NTS1) neurotensina Delta 2 (Recombinante Humano) ; (DOP); subtipos del receptor opiato Kapp (KOP); opiato, mu (Recombinante Humano) (MOP) QRL 1 _ (Recombinante . . - ^ . ~ Humana (NOP) o rf a nina 5-HT,A (Humana Recombinante); 5-HT1B; subtipos de serotonina 5-HT2A (Humana Recombinante): 5-HT3 (Recombinante Humana); 5-HT5A ( R e c o m b i n a n t e Humana); 5-??5? (Recombinante Humana) (5-ht5A); 5-HT6 (Recombinante Humana); 5 - H T - ( h u m a n a ) s s t (no selectiva) somatostatina VI P1 (humano) (VPAC1) péptido intestinal vasoactivo V 1 a (Recombinante Humana) va sop resina Transportador NE (humana) norepinefrina El término "isómeros geométricos" se refiere a isomerismo a través e lo e isomerismo syn/anti. El término "sales de adición farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales conocidas en la técnica por ser farmacéuticamente aceptables en la práctica farmacéutica, por ejemplo, sales de adición de ácido tales como sales de ácido clorhídrico, sales del ácido 'm ale ico y sales del ácido cítrico. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen sales derivadas de ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhidrico. fosforoso, y similares, así como las sales derivadas de ácidos orgánicos, tales como ácidos mono- y d icarboxilicos alifáticos. ácidos alcanoico fenil sustituidos, ácidos hidroxi alcanoicos, 5 ácidos a lea ndio icos , ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, etc. Tales sales incluyen así sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, nitrato. fosfato, monohid rogenfosfato, dihidrogenfosfato, metafosfato, pirofosfato, cloruro, bromuro, yoduro, acetato, porpionato, caprilato, 10 isobutirato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, mandelato, benzoato, cloroben zoato , metilbenzoato, dinitrobenzoato, ftalato, bencensulfonato, toluensulfonato, fen i lacetato , citrato, lactato, maleato, tartrato, metansulfonato y similares. También contempladas son las sales 15 de aminoácidos tales como arginato, gluconato, galacturonato y Las sales de adición de ácido de los compuestos básicos se preparan poniendo en contacto la forma de base libre 20 con una cantidad suficiente del ácido deseado para producir la sal en la manera convencional. La forma de base libre puede regenerarse poniendo en contacto la forma de sal con una base y aislando la base libre en la manera convencional. Las formas de base libre difieren a partir de sus formas de sal respectivas un 25 poco en ciertas propiedades físicas tales como solubilidad en solventes polares, pero de otra manera las sales son equivalentes a su base libre respectiva para propósitos de la presente in ención. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables se forman con metales o aminas, tales como hidróxidos de metal álcali o alcalinotérreo, o de aminas orgánicas. Ejemplos de metales utilizados como cationes son sodio, potasio, magnesio, calcio y similares. Ejemplos de aminas adecuadas son ?,?'- dibenciletilendiamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina. etilend iam ¡na, N-metilglucamina, y procaína; véase por ejemplo, Berge et al., supra., 1977. Las sales de adición de base de los compuestos acidicos se preparan poniendo en contacto la forma de ácido libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal en la manera convencional. La forma de ácido libre puede ciertas propiedades físicas tales como solubilidad en solventes polares, pero de otra manera las sales son equivalentes a su ácido libre respectivo para propósitos de la presente invención. El término "metabolito" se refiere a una forma de un compuesto obtenido en un cuerpo humano o animal por acción del cuerpo en la forma administrada del compuesto, por ejemplo un análogo desmetilado de un compuesto que soporta un grupo metilo que se obtiene en el cuerpo después de la administración del compuesto metilado como un resultado de acción por el cuerpo en el compuesto metilado. Los metabolitos pueden por sí mismos tener actividad biológica. 5 El término "pro-fármaco" se refiere a una forma de un compuesto que después de la administración a un cuerpo humano o animal se convierte química o biológicamente a un compuesto diferente en el cuerpo que tiene actividad biológica. Una forma de pro-fármaco de un compuesto puede por sí misma tener actividad 10 biológica. Los compuestos novedosos de las modalidades de la presente invención y compuestos que pueden utilizarse de acuerdo con las modalidades de la presente invención pueden tener al menos un centro quiral, y pueden por consiguiente existir como 15 enantiómeros o como mezclas de enantiómeros (por ejemplo, ^..-^_mezcl.as_ ajcéjTTjcas). Cuando los compuestos poseen dos o más diastereoísómeros. En algunas modalidades de la presente invención, se 20 proporcionan composiciones farmacéuticas y el uso de ciertos compuestos en la fabricación de composiciones farmacéuticas. Tales composiciones pueden estar en una forma adecuada para administración oral (por ejemplo, en la forma de cápsulas, tabletas, gránulos, polvos o perlas), rectal, parenteral, 25 intravenosa, intradérm ica . subcutánea, transdérmica, o tópica, o para administración, o por administración insuflación o aspersión nasal, yontoforética , bucal o sublingal. lingual. Tales composiciones pueden estar en forma de unidad de dosis. El compuesto de la fórmula (I), o, en aquellas modalidades en donde AF267B o AF150(S) pueden emplearse, pueden presentarse en la unidad de dosis en una cantidad en el rango de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 100 mg. En una modlaidad de la invención, el compuesto se presenta en una cantidad de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg. En una modalidad de la invención el compuesto se presenta en una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg. Estas cantidades pueden representar una sola dosis o la dosis total de 2-4 individuos para la administración de 2 a 4 veces por día. En una modalidad de la invención, la composición farmacéutica está en forma de liberación sostenida. Ciertos de los compuestos en algunas modalidades de la_ presente invención pueden existir en formas no solvatadas así como .formas general, las formas solvatadas, incluyendo formas hidratadas, son equivalentes a formas no solvatadas y se pretenden para abarcarse dentro del alcance de la presente invención. Los compuestos AF150(S) y AF267B han sido descritos en U.S. 5852029. En algunas modalidades de la invención, los compuestos tienen actividad antioxidante. Tal actividad antioxidante puede ser el resultado de tales compuestos que son N-óxidos. tales como AF600. o puede ser el resultado de tales compuestos que tienen una porción anti-oxidante unida al nitrógeno en la posición El técnico experimentado apreciará que muchos factores influencian la selección de cualquier compuesto para la aplicación de terapia clínica, por ejemplo, efectividad para el propósito pretendido, seguridad, posibles efectos secundarios e índice terapéutico. El técnico experimentado apreciará de este modo cómo interpretar la expresión "compuestos cuaternarios farmacéuticamente aceptables" que se derivan estructuralmente de los compuestos inventivos que tienen un átomo de nitrógeno terciario, ya que esta expresión se utiliza en la presente especificación y reivindicaciones. Los compuestos utilizados en las modalidades de la presente invención pueden prepararse y administrarse en una subcutánea, intraduodena o intraperitonealmente. También, los compuestos pueden administrarse por inhalación, por ejemplo, intranasalmente. Adicionalmente, los compuestos pueden administrarse transdérmicamente. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que las siguientes formas de dosis pueden comprender como el componente activo, cualquier compuesto de la Fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable correspondiente de un compuesto de la Fórmula (I), de acuerdo con las modalidades de la invención opcional mente con AF267B o AF150(S) presentes también. Para preparar composiciones farmacéuticas a partir de 5 compuestos de la fórmula (I), incluyendo también opcionalmente AF267B o AF150(S), portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser ya sea sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, tabletas, pildoras, cápsulas, sellos, supositorios y gránulos dispersables. Un portador sólido puede ser 10 una o más sustancias que pueden también actuar como diluyentes, agentes saborizantes, aglutinantes, conservadores, agentes de desintegración de tableta, o un material de encapsulación. En polvos, el portador es un sólido finamente dividido que está en una mezcla con el componente activo finamente 15 dividido. En tabletas, el componente o componentes activos se En una modalidad de la invención, los polvos y tabletas 20 contienen de cinco o diez a aproximadamente setenta por ciento del compuesto activo. Los portadores adecuados incluyen carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelu losa de sodio, una cera de fusión 25 baja, manteca de cacao, y similares. El término "preparación" se pretende para incluir la formulación del compuesto activo con material de encapsulación como un portador proporcionando una cápsula en la cual el componente activo con o sin otros portadores, se rodea por un portador, que está así en asociación con éste. De manera similar, los sellos y pastillas se incluyen. Las Tabletas, polvos, cápsulas, pildoras, sellos y pastillas pueden utilizarse como formas de dosis sólidas adecuadas para administración oral. Para preparar supositorios, una cera de fusión baja, tal como una mezcla de glicéridos de ácido graso o manteca de cacao, se funde primero y el componente activo se dispersa homogéneamente en la presente, como por agitación. La mezcla homogénea fundida se vierte entonces en moldes de tamaño conveniente, permite enfriar, y consecuentemente solidificar. Las preparaciones en forma líquida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, por ejemplo, soluciones acuosas o de propilenglicol acuoso. PaTa— prepara.c ones_líquidas de inyección parenteral pueden formularse en solución en. una solución " de~ polietilenglicol acuoso. Las soluciones acuosas adecuadas para uso oral pueden prepararse disolviendo el compuesto activo en agua y agregando colorantes adecuados, sabores, agentes estabilizantes y espesantes como se desee. Las suspensiones acuosas adecuadas para uso oral pueden hacerse dispersando el componente activo finamente dividido en agua con material viscoso, tal como gomas naturales o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y otros agentes de suspensión bien conocidos. También incluidos son preparaciones en forma sólida 5 que se pretenden para convertirse a corto plazo antes del uso, a preparaciones en forma líquida para administración oral. Tales formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Estas preparaciones pueden contener, además del componente activo, colorantes, sabores, estabilizadores, reguladores, 10 edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares. En una modalidad de la invención la preparación farmacéutica en una forma de unidad de dosis. En tal forma, la preparación se subdivide en unidad de dosis que contienen 15 cantidades apropiadas del componente activo. La forma de unidad — -,-__ d_e_ dosis puede ser una preparación empacada, el empaque forma de unidad de dosis puede ser una cápsula, tableta, sello o 20 pastilla misma, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estos en forma empacada. La cantidad del componente activo en una preparación de unidad de dosis puede variarse o ajustarse como se relató anteriormente, de acuerdo con la aplicación particular y la 25 potencia del componente activo. La composición puede, si se desea, contener también otros agentes terapéuticos compatibles. En uso terapéutico, los compuestos utilizados de acuerdo con las modalidades de esta invención pueden administrarse en la dosis inicial de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 100 mg/kg diariamente. En una modalidad de la invención, un rango de dosis diaria de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 10 mg/kg se utiliza. En otra modalidad de la invención, un rango de dosis diaria de 10 a 50 mg/kg se utiliza. Las dosis, sin embargo, pueden variarse dependiendo de los requerimientos del paciente, la severidad de la condición que se trata, y el compuesto o compuestos que se emplean. La determinación de la dosis apropiada para una situación particular está dentro de la experiencia de la técnica. Generalmente, el tratamiento se inicia con pequeñas dosis que son menores que la dosis óptima del compuesto. Más adelante, la dosis se incrementa pA__p_equeños incrementos hasta que el efecto óptimo bajo las circunstancLas se la dosis diaria total puede dividirse y administrarse en "porc ones durante el ~diaT~srse-desea . Los métodos utilizados para preparar compuestos de la invención incluyen métodos que son esencialmente conocidos por químicos orgánicos para la formación de anillos de cinco miembros, sustitución de anillo, cambiando el grado de saturación/in satu ración de anillo, ¡ntercon versión de sales y bases, formación de sal cuaternaria y asi por el estilo. En estos métodos sintéticos, los materiales de partida pueden contener un centro quiral y, cuando un material de partida racémico se emplea, el producto resultante es una mezcla de enantiómeros R, S. Alternativamente, un isómero quiral del material de partida puede 5 emplearse y, si el protocolo de reacción empleado no racemiza este material de partida, se obtiene un producto quiral. Tales protocolos de reacción pueden implicar la inversión del centro quiral durante la síntesis. Los compuestos selectos de la fórmula (I) son capaces de existir en un número de formas 10 esteroisoméricas incluyendo isómeros geométricos tales como E y Z (en los nitrones) y enantiómeros). La invención incluye cada una de estas formas estereoisoméricas y a mezclas de las mismas (incluyendo racematos). Las diferentes formas estereoisoméricas pueden separarse una de ia otra por los métodos usuales, o 15 cualquier isómero dado puede obtenerse por síntesis ---r^ r^^tereoes-pecífica o asimétrica. Se . apreciará , por lo tanto que preparar los compuestos, como se sabrá por la persona experta. 20 Cuando el anillo de cinco miembros es el anillo tiazolidin-3'-ona, por ejemplo, los compuestos pueden prepararse formando este anillo haciendo reaccionar la cetona N-heterocícl ica correspondiente con ácido 2-mercaptocarboxílico [R1CH(SH)C02H] y amoniaco, y el átomo 4-N en el producto puede sustituirse en 25 una manera conocida. Estas reacciones pueden ilustrarse como sigue en el Esquema 1. en donde la cetona N-heterociclica es 1 metilpiperidina-4-ona ejem larmente.

(B) [(A) .e. AF267: R'=Et, R5 H;AF277; R¡=H, R¡=H); (B)p.e. AF700: /?'=£ , R5 = J-fluorobemensulfonilo; AF~03: R'=E¡, R5 = 2-(lH-mdol-3- ilj-eüi] ESQUEMA 1 El grupo saliente en "R5-(grupo saliente)" puede ser por ejemplo, bromuro o cloruro. Esta reacción de sustitución para y utilizando un solvente tal como tetrahidrofurano (THF). La estructura del compuesto (A) o estructura del compuesto (B) pueden separarse en dos enantiómeros por HPLC quiral, por ejemplo, separación de cromatografía líquida preparativa quiral (LC) de AF267 ( R 1 = Et , R5 = H) dio AF267A [R1 = (R)Et, R5=H] y el enantiómero activo AF267B [R1 = (S)Et, R5 = H]. Un método de costo efectivo a gran escala se desarrolló y un máximo de 50% de rendimiento de cada enantiómero puede obtenerse (rendimiento >97% de cada enantiómero, con ee >99% y pureza de HPLC >99%). El método puede además expandirse por una separación aún más práctica para aquellos expertos en la técnica utilizando tecnología de Lecho de Traslado Simulado (SMB) para separación quiral como se define por Mazzoti et al (Proceedings of the Chiral Europe 96 Symp, Spring Innovations, Stockport UK, p 103, 1996). AF267B puede también producirse por racemización del AF267A por medios químicos, por ejemplo, catálisis base, o por catalización de enzima seguida por HPLC quiral o separación SMB. La Estructura (B) puede prepararse haciendo reaccionar la cetona N-heterocíclica correspondiente con ácido 2-mercapto [R1CH(SH)C02H] y amina primaria. Esta reacción puede ilustrarse co_mo__sigue en el Esquema 2, en donde la cetona N-heterocíclica (B) AF282: AF2S8: ,4-dimetoxibencil; AF2S5: R1 *=Et, R5=bencil) ESQUEMA 2 La Estructura (B) puede también obtenerse haciendo reaccionar (A) bajo condiciones para obtener amida unida como se describe después en el Esquema 3, en donde el ácido reactivo es ácido 3-indolp ropión ico ejemplarmente: (A) p.e. AF267 R1=Et R5-{grupo sal¡ente) = AF704 R1=Et ácido 3-lndolpropionico R5=3-1 H-¡ndoí-3-il-prcpioni¡ ESQUEMA 3 El grupo R1 en estructura (A) o en estructura (B) puede obtenerse por la reacción del compuesto (A) o (B) 2-no sustituido con un alquilhaluro o alquilaldehído bajo condiciones estándares para efectuar la sustitución en la posición 2. Estas reacciones pueden ilustrarse como sigue en el Esquema 4: p.e. AF298 R1=CH(OH)CH3r Rs-H AF277 R5-H AF285 R=Et, R5=bencil ESQUEMA 4 Este método puede aplicarse a 14C-etiquetado de AF267. La introducción de la porción etilo por alquilación de la AF277 N-protegida fácilmente disponible (AF287) con bromuro de etilo 14C-marcado seguido por la remoción del grupo de protección produjo l4C-etiquetado de AF267. La trayectoria sintética, que puede utilizarse de manera análoga para preparar AF267 enriquecida con l3C, se describe después en e! Esquema 5: El grupo 1-metilo en la estructura (A) y en la estructura (B) puede removerse por la reacción con ácido m- cloroperbenzo¡co/FeCI2 con agente de desmetilación tal como fen i lelo rof orm i ato como se muestra en el Esquema 6: (C) p.g. AF5G.I R'=Et, R'=H; AF292~[(S)-,lF504] ESQUEMA 6 AF504 y AF292 pueden también prepararse haciendo reaccionar la cetona N-heterocíclica correspondiente con ácido 2- mercaptocarboxílico [R1CH(SH)CC>2H] y amina primaria. Esta reacción puede ilustrarse como sigue en el Esquema 7, en donde la cetona N- heterocílica es N-BOC-piperidin-4-ona (BOC=ter-Butoxicarbonilo): Separación quiral HPLC AF291 AF292 ESQUEMA 7 La síntesis estereoespecífica de la estructura (A) o (B] puede también obtenerse haciendo reaccionar la cetona N- heterocíclica correspondiente con ei ácido 2-mercaptocarboxiüco apropiado por ejemplo, cuando 1 -metilpiperidina-4-ona se hace reaccionar con ácido (S)-2-mercaptobutirico y NH3, AF267B se obtiene, como se muestra en el Esquema 8 [la configuración (S) se basa en la cristalografía de rayos x de AF267B]: ácido (S)-2-inercaptobutir¡co XF267Í ESQUEMA 8 El ácido (S)-2-Mercaptobutí rico está comercialmente disponible o se prepara de ácido (R)-bromobutírico. Esta reacción puede ilustrarse como sigue en el Esquema 9: — - ácido ..R-(+);2-aminobu tinco ácido R-2-bromobui'rico ácido S-2-benzoiltiobutirico ácido S-2-mercaptabutírico (a)NaN03,K6r,HBr (b)PhCO-SCs÷ (c)NH4OH ESQUEMA 9 Cuando el compuesto (A) se hace reaccionar con el agente de oxidación tal como peróxido ácido o ácido m- cloroperbenzoico , la estructura (D) o estructura (E) se obtiene como se muestra en el Esquema 10: (D) (E) AF299 R!=(S)'Et] [p.e. AF300 R =(S)-Et] ESQUEMA 10 El análogo tio de la estructura (A) o (B) puede en general obtenerse haciendo reaccionar el anillo tiazolidininona correspondiente en la estructura (A) con reactivo de Lawesson, por ejemplo como se muestra en el Esquema 11 ESQUEMA 11 Los compuestos bivalentes que contienen esencialmente dos ligandos dentro de la misma molécula pueden obtenerse haciendo reaccionar la estructura (A) del compuesto correspondiente con un espaciador bajo las mismas condiciones para obtener la estructura (B) del compuesto como se describe anteriormente El espaciador (grupo saliente) es ejemplarmente alcandihaluro, alcandiol, alcandiácido, poli(etilenglicol). Esta reacción puede ilustrarse como sigue en el Esquema 12: p.e. espaciador = (CH2)„ , (CH,CK20)n , n = 1-12 grupo saliente = Br, C(0}CI, C(0)OH 10 ESQUEMA 12 Se reportaron pro-fármacos N -f osf onoximeti lo en Krise et al, J Med. Chem. 42: 3094-3100 (1999). Tales porciones de N- fosfonoximetilo pueden utilizarse también para síntesis de pro-15 fármaco (H) para mejorar la solubilidad acuosa de compuestos (B) ------ -q.ue__contienen amina terciaria como se muestra posteriormente. La d i-íer-butilo que resulta en la formación del pro-fármaco protegido 20 con fosfato de amonio cuaternario. La forma de ácido libre del profármaco se obtiene después de la remoción de los grupos butilo terciarios como se muestra en el Esquema 13: 25 ESQUEMA 13 Los nitrones, compuestos del tipo (I) y (J), pueden prepararse haciendo reaccionar la espiro-cetona con alquilhidroxilamina o arilhidroxilamina. Estas reacciones pueden ¡lustrarse como sigue en los Esquemas 14A y 14B: (p.e. AF603A=O, R¡=Me, R5=Me) ESQUEMA 14B Alternativamente, la estructura (I) puede prepararse haciendo reaccionar un anillo carbón ¡lo de cinco miembros con alquil hidroxil amina o aril hidroxil amina. La nitrona resultante se cicliza para formar la estructura espiro.

El compuesto de la fórmula designado AF150(S) se describe en la patente Norteamericana 5,407,938. Sin embargo, la síntesis de este compuesto ha sido mejorada ahora. La síntesis mejorada se describe en el siguiente esquema 15: ESQUEMA 15 AF150(S) se obtuvo por la reacción de 4-picolilamina con anhídrido acético/yoduro de metilo, seguido por la reacción con reactivo Lawesson. El yoduro tiopiridinio obtenido se redujo para dar tioacetilamino-tetrahidropiridina que se ciclizó para formar AF150(S).

Cuando se prepara como una base libre, AF150(S) es un líquido incoloro. La base libre puede almacenarse en frío (-20-0°C) corno un material a granel en almacenamiento oscuro bajo vacio seco. AF150(S) puede obtenerse también como una sal. En una modalidad de la invención, el ácido cítrico se utiliza para obtener na sal estable que puede utilizarse eventual mente en una producción a gran escala. Una sal de ácido cítrico cristalino de AF150(S) se preparó mezclando AF150(S) de base libre con ácido cítrico en solución de 2-propanol y tetrahidrofurano. En comparación con la base libre, la sal: (a) carece de desarrollo de color aún a temperatura elevada (prueba de estabilidad acelerada) y (b) muestra alta estabilidad si el volumen se mantiene bajo condiciones anhidras aún a temperatura elevada (prueba de estabilidad acelerada). En otra modalidad de la invención, AF150(S) se proporciona un aceite de parafina farmacéutico aceptable. La estabilidad...de 10% ""p/'p^ l e^AF 1:50 ( S-)--e n,..;aceite _de pjarafina se examinó a 40°C, bajo aire o atmósfera" de" nitrógeno y . en la presencia o ausencia de tocoferol. No se detectaron productos de degradación arriba de 0.1%. Se observó un color amarillo claro en muestras sin tocoferol pero el color no se desarrolló en muestras que contienen 0.5% p/p de tocoferol en AF150(S). Puede observarse que el grupo N-metilo en AF150(S) puede removerse por la reacción con ácido m-cloroperbenzoico/FeCÍ2 como se muestra en el Esquema 16: AF150(S) AF400 ESQUEMA 16 Cuando AF150(S) se hace reaccionar con el agente oxidación tal como ácido m-cloroperbenzoico, se obtiene AF406.

AF406 La simulación en frío a 14C-etiquetado de AF150(S), AF402, se obtuvo utilizando d3-yodometano en lugar de yodometano en la primera etapa de la síntesis, de acuerdo al esquema de la síntesis de AF150(S). La síntesis de AF402 se describe en el Esquema 17 siguiente: AF402 ESQUEMA 17 Se entenderá que aunque en la descripción anterior, los compuestos ilustrativos de la invención han mostrado anillos de piperidina y quinuclidina, otros anillos heterocícl icos que contienen cualquier nitrógeno adecuados para configuración espiro con el anillo de cinco miembros espiro descrito puede sustituirse por lo tanto. Tales compuestos pueden hacerse utilizando la cetona correspondiente, en analogía al uso de 3- o 4-piperidona para obtener compuestos mostrados anteriormente. Una observación similar aplica a los EJEMPLOS prácticos, que son únicamente ilustrativos y no limitativos. La invención se ¡lustrará ahora por los siguientes EJEMPLOS no limitantes. EJEMPLO 1 Síntesis de (S)-2-Etil-8-metil- 1 -tia-4.8-diaza-espiro[4.51decan-3- ona AF267B Etapa 1: Síntesis de ácido 2-mercaptobutírico Se introdujo ácido 2-bromobutírico (3.2 kg, 19.16 moles) en un matraz helado (baño de agua helada). Se agitó y se agregó gradualmente hidróxido de potasio acuoso (18.2 moles) (0.5 h) mientras la temperatura se mantuvo a 30-40°C. Se detuvo el enfriamiento y se agregó en porciones O-etilditiocarbonato de potasio (3.48 kg, 21.7 moles) de manera que la temperatura no 5 excedió 50°C (0.5 h). La mezcla de reacción se agitó a 50°C durante 1 hora, luego se enfrió a 15-20°C (baño de agua helada). Se agregó etilendiamina (2.6 I, ~ 39 moles) durante un periodo de 20 minutos mientras la temperatura se mantuvo a 45-55°C (enfriamiento externo). La suspensión resultante se agitó a 50°C 10 durante dos horas, se enfrió a 20°C, se filtró y el sólido se lavó con .2 x 1.5 litros de agua caliente (40-50°C). El filtrado acuoso y los lavados se combinaron, se enfriaron bajo 20°C (baño de agua helada) y ácido sulfúrico acuoso [5.2 I, 50% (p/p)] se agregó lentamente mientras se mantiene la temperatura a 45-55°C (0.5 15 horas a pH = 2). La solución se enfrió a 30°C y se transfirió a un se separó y la fase acuosa inferior se ltr a o pres n re uc a 20 para remover un precipitado el cual se formó. La fase acuosa se extrajo con MTBE, los extractos se combinaron y el MTBE se removió. El residuo oleoso se disolvió en ciclohexano (5 I) y se mantuvo en un refrigerador durante la noche. Se formó una fase inferior. Ésta se separó y se extrajo con ciclohexano. Los 25 extractos de ciclohexano se combinaron con la fase superior, se removió ciclohexano y el ácido 2-mercaptobutírico (sin purificar) se secó al vacío (54°C/2 mmHg) para producir ácido 2- mercaptobutírico (2.18 kg, 18.16 moles). 5 Etapa 2: Síntesis de AF267 (racemato) Se introdujeron en un matraz ácido 2-mercaptobutírico (705 g, 5.88 mmoles) y una mezcla de ciclohexano/alcohol ter- butílico (1;3.5 (p/p), 4.3 I). La solución obtenida se agitó y se calentó a 40-60°C. Se burbujeó amoniaco gaseoso a través de la 10 solución hasta que todo o la mayoría del ácido 2-mercaptobutírico se convirtió a su sal de amonio. Se detuvo el burbujeo del amoniaco, se calentó la mezcla de reacción a reflujo y se agregó una solución de 1 -metil-4-piperidona (496 g, 3.49 moles) en una mezcla de ciclohexano/alcohol íer-butílico (500 mi). Después de 1 15 hora, la solución llegó a ser clara y el burbujeo de amoniaco se '~'~~~^r-ert.q ó_ y después de 13 horas (adición de piperidona y tiempo de clorhídrico preparada diluyendo ácido concentrado acuoso (un 20 volumen) con agua (dos volúmenes) (960 mi) se agregó y la mezcla se agitó durante 1 hora. La solución obtenida (pH ~ 2-3) se enfrió a 25°C y la fase acuosa inferior se separó e hizo básica con hidróxido de potasio acuoso (pH ~ 8.5-9) luego se dejó durante la noche a temperatura ambiente. El producto el cual se precipitó se 25 filtró y se lavó con agua fría (100ml) para dar el polvo húmedo. El filtrado se basificó a pH 9 y se dejó durante la noche a 5°C, se filtró y se lavó con 50 mi de agua fría para dar 72 g de polvo. El mismo procedimiento se repitió para sintetizar un segundo lote de AF267 (multiplicado por un factor de 1.2). Los cuerpos se 5 combinaron para dar 1.6 kg del producto húmedo. El producto combinado sin purificar se disolvió en 4.5 litros de agua caliente (95°C), se filtró y la solución transparente se dejó a temperatura ambiente durante 10 horas, se filtró y se secó durante 24 horas (50°C, 1 mmHg) para dar AF267 (1.048 kg, 50.7% de rendimiento). 10 El filtrado se concentró, se enfrió durante la noche a 5°C, se filtró, lavó (100 mi de agua fría) y secó para dar AF267 (215 g, 10.4% de rendimiento). Rendimiento Total AF267: 61% p.f. 142-144°C; 1H NMR (CDCI3) d 1.02 (t, y = 7.3Hz, CH3CH2), 1.7-1.8 (m, CH3CHH), 1.96-2.07 (m), 2.30 (s, NCH3), 2.3-2.36 (m, 2H), 2.6-2.7 (bs, 2H), 15 3.80 (dd, j = 8.7, 3.9Hz, 1H, SCH) ppm. EM m/e 214(M + ), 181(M + - S Etapa 3: Separación quiral de AF267B y AF267A 20 Cromatografía Líquida Preparativa de Rendimiento Elevado Prochom LC 100 Columna: CHIRALPAK®ASV (número de lote JG 001) Velocidad de flujo de bomba: 500 ml/minutos Presión: 12.7 bares 25 Temperatura de Columna 26°C Fase Móvil: Acetonitrilo/EtOH 85:15 Concentración: 37 g/l Detección UV: 240/230 nm Después de la elusión el eluyente se evaporó hasta sequedad. Primera elusión del enantiómero (AF267A): ee: 99.7 (687.1 g; pureza 99.3%; Rendimiento: 97%). Segunda elusión del enantiómero (AF267B): ee. 99.8 (694.9 g: 99.9%; Rendimiento: 98%). Solvente residual (por ejemplo, aceto n itri lo ) se removió por adición adicional de etanol y evaporación hasta sequedad. Pueden prepararse por síntesis análoga, AF292 y otros compuestos relacionados.

EJEMPLO 2 Análisis estructural de cristal único de rayos X de (S)-2-Etil-8- amarillo claro, prismas, tamaño de cristal 0.2 x 0.2 x 0.4 mm3; sistema de cristal, ortorómbico, grupo de espacio: P212121 (No. 16) a = 10.394 (10) (a = 90°), b = 20.133 (2) (ß = 90°), c = 5.856 (4) (y = 90°) Á, de reflexión 25, T=110K, Volumen =1224.2 (9) Á3, Z = 4, Fw = 202.32. Densidad calculada, Dc=1.092 Mg/m3, Coeficiente de absorción, µ = 0.232 m m " 1. Colección y tratamiento de Datos: Dif ractómetro de cuatro círculos AFC5R Rigaku, MoKcx, monocromator de grafito (? = 0.71073 Á), 11461 reflexiones recolectadas, rango Teta para recolección de datos: 2.82° < T < 27.53°; Rangos de ¡ndice: -13 < h < 13, -26 k < 26, 0 < 1 < 7, o) método de exploración, ancho de exploración 5 1.2°, velocidad de exploración 2°/minutos, ancho de pico de altura medio típico = 0.45°, 3 estándares recolectados 62 veces cada uno, con un cambio de 3% de intensidad; Reflexiones recolectadas: 6727 mediciones, 2833 reflexiones independientes [R (int) = 0.0604, las reflexiones Bijvoet se mantienen separadas]. 10 Soluciones y refinamiento: la estructura resuelta por los métodos directos (SHELXS-97). El refinamiento de cuadrados mínimos de la matriz completa basado* en F2 (SHELXL-97). Se colocaron hidrógenos idealizados y se refinaron en un modo de montar, los hidrógenos acuosos se encontraron a partir de la diferencia del 15 mapa Fourier, 148 parámetros; índices R finales: R^ 0.0671 con I > 2 sigma (I) wR2 = 0.1484 y todos -los .datos, bondad del ajuste en F 2 = 1.13 , densidad de electrón más grande = 0.745...e/"3 alrededor"" del átomo S. 20 Configuración absoluta: La configuración absoluta de la molécula se determinó utilizando parámetro de Flack y el refinamiento alternativo del componente juntado enantiomérico. Ambos métodos muestran inequívocamente que los coordinados presentes pertenecen a la configuración correcta absoluta (enantiómero S). 25 Los cristales de este compuesto se prepararon a partir de la cristalización en tolueno/éter de petróleo/metanol.

Estructura 1 : Estructura ORTEP de Cl0H,9NOS+ ¾0 EJEMPLO 3: Síntesis a?Gp??" ' :~ ~dé~~~ ~— — (R.)-2.-Etil-8-me il- 1 -ti a -4 , 8-d iaza-espirof4.51decan-3-ona. AF267A AF267A síntesis asimétrica de AF267A se realizó para modelar la síntesis del enantiómero S utilizando ácido 2-mercaptobutírico ópticamente activo en la síntesis de AF267. El ácido 2-mercaptobutírico ópticamente activo se sintetizó partiendo del ácido L-( + )-2-aminobutírico (I) que tiene la configuración S. Se convirtió el aminoácido a ácido (S)-2-bromobutírico (II) con retención de la configuración por el tratamiento con nitrito de sodio, bromuro de potasio y ácido bromhídrico. La pureza enantiomérica del bromuro obtenido se verificó por NMR de protón medida en la presencia de (R)-( + )-N-bencil-a-metil-bencilamina y se comparó con el espectro del bromuro racémico medido en las mismas condiciones. La presencia de únicamente un enantiómero se detectó por este método. Se convirtió bromuro a ácido (R)-2-benzoiltiobutírico (III) (con inversión de la configuración) por tratamiento con tiobenzoato de cesio en D F. Se logró la desbenzoilacion de (III) sin racemización por aminólisis (hidróxido de_amonio 1N a temperatura ambiente). metil-4-piperidona ebullendo ciclohexano. La mezcla de reacción sin purificar se analizó por GC en una columna quiral y encontró que contiene AF267A acompañada por una pequeña cantidad de AF267B (2-3%).

EJEMPLO 4: Síntesis quiral de (S)-2-Etil-8-metil-1 -tia-4.8-diaza-espiroí4.51- decan-3-ona AF267B Este compuesto se obtiene como en el EJEMPLO 3 excepto que el material de partida utilizado es ácido (R)-2- bromobutírico.

EJEMPLO 5: Síntesis de ( S ) -2-Eti I- 1 -tia -4.8-d iaza-espi rof4.5]deca n -3-ona AF292 AF 92 15 A una solución agitada enfriada (baño de sal con hielo) de AF267B mezcla se agitó durante 1 hora y luego se trató con cloruro de 20 hierro (II) (2.14 mi de solución 1 M en agua). Se continuaron la agitación y el enfriamiento (-10°C) durante 1 hora y luego se continuó la agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. Se agregaron etilendiamina (1.9 mi, 0.285 mol), hidróxido de sodio (30.5 mi de solución acuosa 2N), y éter de petróleo 40-60°C (60 25 mi). Después de agitación vigorosa las capas se separaron, la capa acuosa se extrajo con mezcla de diclorometano/éter de petróleo 1:1 (600 ml) seguido por diclorometano (primero 600 ml, luego 300 ml). Los extractos combinados se secaron (Na2S04), se filtraron y los solventes se removieron bajo presión reducida. La cromatografía instantánea (gel de sílice 60, malla 230-400, Merck 1.09385, elusión con metanol/cloforomo/hidróxido de amonio 10:89:1 v/v) del residuo dio AF292. *H NMR (CDCI3) d 1.02 (t,y = 7Hz, 3H), 1.76 1.92 y 2.07 (3xm, 6H), 2.84 (m, 2H), 3.04 (m, 2H), 3.83 (dd, j =8.8, 4Hz, 1H), 7.66 (NH) ppm; 1 C NMR (CDCI3) S 11.50, 27.24, 42.87, 43.95, 44.10, 48.80, 64.22, 175.22 ppm: EM m/e 200(M + ). El compuesto fue >99.9%, pureza por HPLC, GC. La sal clorhidrato de AF292 se formó por la adición de HCI (4M en metanol) y se recristalizó a partir de metanol-éter dietílico para dar un precipitado blanco que se filtró y se secó. 1H NMR (D20) d 0.78 (t, j =7.3Hz, 3H), 1.58 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 2.05 (m, 4H), 3.07 (m, 2H), 3.30 (m, 2H), 3.92 (dd, j = 7.9, 4.0Hz, 1H) ppm.

EJEMPLO 6: * - "^"^ Reacciones para la preparación de f 14C1-2-Etil-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro 4.51decan-3-ona: isómeros R y S [1*C]-AF267B P»C]-AF267A En un matraz seco cubierto con septo (10 mi) equipado con una barra magnética y entrada de nitrógeno, se introdujo una solución de diisopropilamina (0.078 mi, 0.56 mmol) en THF seco (1.4 mi) por una jeringa y se enfrió a 0°C. Se agrega n-Bul_i (0.9 M en hexano, 0.62 mi, 0.56 mmol), la mezcla de reacción se agita a 0°C durante 20 minutas y luego se enfría a -78°C. Una solución de AF287 (0.1375 g, 0.51 mmol) en THF seco (0.4 mi) y N , N'-dimetil- ?,?'-propilenurea seca (DMPU) (0.6 mi) se agrega en gotas (30 minutos) y la mezcla de reacción se agita durante 20 minutos a - 78°C. El bromuro de etilo (0.043 mi, 0.56 mmol) marcado en el carbono 1 con MC se agrega en una porción, la temperatura se permite elevar a temperatura ambiente y la mezcla de reacción se agita durante 4 horas adicionales. Los solventes se remueven bajo presión reducida, utilizando primero una bomba acuosa a 25°C durante 20 minutos y luego una bomba oleosa (-4 mm de Hg) _a -60°C durante -30 minutos (utilizando una aguja la cual ntroduce una comeTTte~~de~- ai r:e.---P.a ra_ remover el solvente más rápido). La cromatografía instantánea del residuo da~" ??26-7 racémica (95 mg, -86% de rendimiento). La HPLC quiral preparativa puede utilizarse para separar los enantiómeros. Se sigue el procedimiento anterior utilizando bromuro de etilo el cual no se etiquetó, la HPLC preparativa de 60 mg del racemato obtenido después de la cromatografía instantánea no produjo AF267B etiquetada isotópicamente (17.6 mg).

EJEMPLO 7: Síntesis de (S)-2-Etil-8-metil-8-oxi- 1 - tia-4,8-diaza-espiro[4.51- decan-3-ona AF299 Se agregó lentamente (0.5 horas) una solución de mCPBA (70%, 2.62 g, 10.64 mmoles) en diclorometano (40 mi) a una solución enfriada (0°C) y agitada de AF267B (2.07 g, 9.67 mmoles) en diclorometano (40 mi). El baño de enfriamiento se removió y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y luego el solvente se removió bajo presión reducida. La cromatografía instantánea -(mejaj^o|/cloroformo/hidróxido de amonio 10:89:1 v/v) del residuo y 7.3 Hz, CH3CH2), 1.74 y 2.09 (2m, CH3CH2), 1.82 (m, 2H), 3.9 (m, 2H), 3.36 (s, CH3N + ), 3.33-3.45 (m, 4?), 3.78 (br NH), 3.83 (dd, j = 3.74, 8.84 Hz, CH3CH2CH) ppm; EM m/e 230 (M + ).

EJEMPLO 8: Síntesis de (S)-2-Etil-8-metil-1-oxo-1 Á4-tia-4,8-d¡aza-espiro[4.51- decan-3-ona. AF300 Se enfrió (baño de agua con hielo) una solución de AF267B (1.72 g. 0.008 mol) en agua (2.5 mi) y se agregó ácido trifluoroacético (3.5 mi). A la mezcla obtenida agitada en frío se agregó peróxido ácido (30%, 0.57 mi, 0.008 mol), el baño de enfriamiento se removió y la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente durante la noche. Se agregó sulfito de sodio y el pH de la solución se ajustó a 9 con una solución saturada de carbonato de sodio. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 100 mi) y luego con acetato de etilo (1 x 50 mi). Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron (MgS04) y los solventes se evaporaron. La cromatografía instantánea (gel de sílice 60, malla 230-400, e r"cíT~ "09385. - el u s ¡ó n_.c .oruriet anol/cloroformo/hidróxido de amonio 10:89:1 v/v) dio"AF300. JH NMR. (Cü'c"í3) < " lO~(t:7 = 7.3Hz, 3H, CH3), 1.85-2.0 (m, 5H), 2.17 (m, 1H), 2.27 (m, 1H), 2.34 (s, 3H, NCH3), 2.6 (m, 2H), 3.30 (dd, j = 3.56, 11.13 Hz, CH3CH2CH), 6.37 (br NH) ppm; EM (El) m/e 230 (M + ).

EJEMPLO 9: Síntesis de 2-(1-Hidroxi-et¡l)-8-metil-1-t¡a-4.8-diaza-espiro[4.5l-decan-3-ona (AF298) AF298 A una solución fría (0°C) de diisopropilamina (0.28 mi, 0.002 mol) en THF seco (12 mi) bajo atmósfera de argón se agregó una solución de n-butil-litio (1.4M en hexano, 1.4 mi, 0.002 mol), la mezcla se agitó durante 20 minutos y luego se enfrió a -78°C. Una solución de AF287 (0.41 g, 0.0015 mol) en THF (3 mi) se agregó en gotas (10 minutos) y la mezcla resultante se agitó a -78°C durante 10 minutos adicionales. Se agregó acetaldehído (0.84 mi, 0.015 mol) en una porción y después diez minutos a -78°C de ácido acético (0.11 mi, 0.002 mol) se agregó en una porción y la temperatura se permitió elevar a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agregó a cloroformo (200 mi) y la.fase o rg á ?? ta" - "s e=*l a v ó -=c o n .-_a gju.a_( 2 x 2_0 mi), se separó y se secó. El solvente se evaporó y la: cromatografía instantánea (sílice, CHCI3/MeOH/NH4OH 80/20/1) del residuo dio AF298 (0.132 g). 1 H-N M R (CDCI3) d 1.24 (d, y=6.05 Hz, 3H, CH3), 1.7-2.2 (m, CH2), 2.31 (s, 3H, NCH3), 2.60-2.80 (m, CH2), 3.71 (d, j = 9.41Hz, 1H, SCH), 3.94-4.04 (m, 1H, CHO), 4.75-4.9 (br OH), 7.1-7.2 (br NH) ppm. EM m/e 230 M( + ).

EJEMPLO 10: Síntesis de (S)-2-Etil-4-(4-fluoro-bencens lfonil)-8-metil-1 - 1 i a - 4 , 8 - diaza-espiro[4.51decan-3-ona. AF700 AF700 En una solución fría ( 0 ° C , baño de agua con hielo) de hexametildisilazano de litio (8 mi, 1 M en THF) se agregó AF267B (1.5 g, 0.007 mol) en pequeñas porciones durante un periodo de 15 minutos bajo atmósfera de argón. El baño de enfriamiento se removió y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. Se agregó cloruro de 4-fluorobencilsulfonilo (1.37 g, 0.007 mol) (durante la adición la temperatura se mantuvo bajo 20°C, baño de enfriamiento) y la mezcla de reacción se dejó a ^temperatura ambiente bajo atmósfera de argón durante la noche. evaporó. La cromatografía instantánea (sílice, acetato de etilo/metanol/amoniaco acuoso 10/2/0.1) dio AF700 (0.46g, 0.0015moí). ?-N R (CDCI3, 300 MHz) d 0.94 (t, j = 7.14 Hz. 3H, CH3), 1.64-1.77 (m, 3H, CHH + CH2), 1.88-2.00 (m, 3H, CHH + CH2). 2.15-2.29 (br, 2H, CH2), 2.29 (s, 3H, NCH3), 2.51-2.60 (br, 2H, CH2), 4.24(dd. j = 7.99, 3.72 Hz, 1H, SCH), 7.21(app. t, /= 8.53 Hz, 2H, Ar), 8.07-8.12 (m, 2H, Ar).

EJEMPLO 11 : Síntesis de 8-Metil-4-p i rrol id in-1 -ilmetil- 1 -tia-4, 8-d iaza- espiro[4.5ldecan-3-ona, AF287 AF287 Una solución de 8-metil-1 -tia-4, 8-d iaza- 0 espiro[4.5]decan-3-ona (AF277 5.13 g, 0.0275 mol), formaldeh ido (solución al 37%, 2.75 mi), y pirrolidina (2.3 mi, 0.0275 mol) en etanol (2.3 mi) se llevó a reflujo durante 4 horas, luego se dejó a temperatura ambiente durante la noche. Se agregó tolueno (10 mi) y el solvente se evaporó. Se agregó pentano en ebullición (100 mi) 5 al residuo y la solución se decantó. La trituración con pentano _ caliente se repitió cuatro veces, las capas de pentano se - -combinaron, ^sé ^TFfriaron— a_--0 C__ y_ el precipitado se recolectó e identificó como AF287 (4Í6 gramos, 63%.-de ,rendimiento)r¾"1:HrNMR (CDCI3) d 1.69-1.77 (m, 5H), 2.20-2.29(s y m, 5H, CH3 y CH2), 0 2.43-2.58 (m, 6H), 2.82-2.86 (m, 2H), 3.50 (s, 2H, SCH2), 4.14 (s, 2H, NCH2N) ppm. EM (El) m/e 269(M + ); 198; 84; 70.

EJEMPLO 12: Síntesis de 2-Etil-4-(3-1 /-/-indol-3-il- ropionil)-8-metil-1 -ti a -4.8- 5 diaza-espiro[4.51decan-3-ona. AF704 AF704 Se agitó a temperatura ambiente durante 3 días una solución de AF267 (1.2 g, 0.0056 mol), ácido 3-indolpropiónico (1.37 g. 0.0072 mol), diciclohexilcarbodümida (DCC) (1.57 g, 0.0076 mol) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0.93 g, 0.0076 mol) en dicloro metano (120 mi). La mezcla de reacción se lavó con agua (2x40 mi), la fase orgánica se secó y se evaporó. La cromatografía instantánea (sílice, CHCI3/MeOH/NH4OH 90/10/1) dio el compuesto del título el cual se trituró en acetona. La solución se filtró para remover las impurezas, luego la acetona se evaporó y el aceite espeso obtenido se trituró en éter. El sólido obtenido (AF704), 400 mg, se filtró y se secó. P.f.122.5-124.5°C; ?-NMR (CDCI3) 1.01 (t, j = J^.4H z 73Hrc7vjC'HT) 0-(HO,, J.yj.,._1J5_9J__m , 1H), 1.61-1.73 (m, 1H, CH3CHH), 2.1-2.15 (m. 1 H. CH3CHH),- 2.18.(dt, j ~='~ 12 4." 2~4? / . · 1H), 2.29 (s, 3H, NCH3), 2.33 (m, 1H), 2.83 (m, 2H), 2.99 (dt, j = 12.55, 4.39 Hz, 1H), 3.01 (t, j = 7.42Hz, 2H, CH2), 3.16 (dt, j = 12.7, 4.39Hz, 1H), 3.28 (m, 2H), 3.67 (dd, j = 8.9, 4.18Hz, 1H, SCH), 7.04 (br s, C = CH), 7.11 (t, j = 7.8Hz, ArH), 7.18 (t, j = 7.1Hz, ArH), 7.34 (d, j = 8.08Hz, ArH), 7.64 (d, j = 7.58Hz, ArH), 8.01 (br NH) ppm; EM (El) m/e 385 M( + ), 214, 181, 171,143, 130 (100%).

Cuando el material de partida es AF267B, se obtiene el enantiómero AF704B.

EJEMPLO 13: Síntesis de 2-Et¡l-4-f2-(1 H-indol-3-il)-etill-8-metil- 1 -tia-4.8-diaza- espiror4.51decan-3-ona. AF703 En un matraz de tres cuellos equipado con un agitador magnético y Dean-Stark y embudo de destilamiento una solución de ácido 2-mercaptobutírico (7.38 g, 0.065 mol) en una mezcla de a c ona es, y uego se ca ent a re u o. na so uc n e -me - 4-piperidona (6.18 mi, 0.049 mol) en t-butanol/ciclohexano (30/104 g/g, 10 mi) se agregó en gotas durante 40 minutos y el reflujo continuó durante 5 horas (1 mi de agua se recolectó). La mezcla de HCI/agua (2:2 v/v) se agregó hasta el pH 2-3, la fase acuosa se separó, se basificó a pH 10 con solución de hidróxido de potasio y se extrajo con diclorometano. La fase orgánica se separó, secó y el solvente se evaporó. La cromatografía instantánea (sílice. CHCI3/MeOH/NH4OH 90/10/1 ) del residuo dio el compuesto del título. La recristalización a partir del hexano en ebullición dio AF703 puro. 1 H -N M R (CDCI3) 1.04 (t, j= 7.35Hz, 3H, CH3), 1.65-1.68 (m, 2H), 1.71-1.80 (m, 1H, CH3CHH), 2.13-2.34 (m, 5H), 2.31 (s. 3H, NCH), 2.86 (m, 2H). 3.05-3.10 (m, 2H), 3.41-3 49 (m, 1H), 3.51-3.65 (m, 1H), 3.80 (dd. j = 8.8, 3.9Hz, 1 H, SCM), 7.02 (d, j = 2.32Hz, 1H, ArH ) , 7.14 (ddd, j = 7.35, 7.35, 1.17Hz, 1H, ArH), 7.20 (ddd, j = 7.45, 7.45, .39Hz, 1H, ArH), 7.35 (d, j = 7.4Hz, 1H, ArH), 7.77 (d, j = 7.42Hz, 1H, ArH), 8.03 (brNH) ppm.

EJEMPLO 14: Síntesis de 2.8-Dimetil-1 -tía-3.8-diaza-espiror4.51dec-2-eno A F 150 ( S ) AF150(S) Etapa 1 : Síntesis de yoduro de 4-(acetaminometil)-1 -metil-piridinio A una solución fría (baño de agua con hielo) de 4-picolilamina (1070 g, 9.9 moles) en metanol (3 I) se agregó en gotas anhídrido acético (1400 g, 13.7 moles). Durante la adición la temperatura de reacción se mantuvo entre 10 y 30°C. Cuando la adición del reactivo se completó, la mezcla de reacción se dejó durante la noche a temperatura ambiente. Se agregó yodometanol (800 mi, 24.8 moles) a la mezcla de reacción la cual se enfrió con un baño de agua, bajo atmósfera de nitrógeno. Durante la adición la temperatura de reacción se mantuvo bajo 25°C. Cuando la adición se completó, la mezcla de reacción se protegió de la luz y se dejó a temperatura ambiente durante la noche. Se evaporó el yodometano en exceso, la cristalización se indujo, la mezcla de reacción se enfrió (baño con hielo) y se agregó isopropanol (1.5 I). La mezcla de reacción se dejó a -30°C durante la noche, el precipitado se extrajo por filtración, se lavó con isopropanol y se secó. Se obtuvo yoduro de 4-(Acetamidometil)-1 -metil-piridinio (2043 g, 7 moles) como un polvo amarillo (71% de rendimiento). 1 H-NMR (D20) d 2.10 (s, CH3CO), 4.32 (s, CH3N + ), 4.63 (s, tilpiridinio Se calentó a 80°C durante 17 horas una solución agitada de yoduro de 4-(Acetaminometil)-1 -metil-piridinio (1.92 kg, 6.5 moles) y reactivo Lawesson (1.87 kg, 4.6 moles) en acetonitrilo (6 I). Luego, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se agitó durante 4 horas adicionales. La tioamida sin purificar se extrajo por filtración y se lavó con acetonitrilo (2.8 I).

Se agregó a la tioamida obtenida acetato de etilo (10 I) y la suspensión se llevó a reflujo du ante 1 hora. A 72-73 "C un gas nocivo se desarrolló y atrapó con solución de NaOH. La suspensión se enfrió a 60°C. Se extrajo por filtración tioacetamida, se lavó con acetato de etilo (2 I) y se secó (45°C). Se obtuvo 2 kg de tioamida.

Etapa 3: Síntesis de 1 -metil-4-N-tioacetilamino-1.2.3.6- tetrahidropiridina. Se preparó una suspensión de yoduro de 1-metil-4N- tioacetilaminometilpiridínio (2.07 kg, 6.7 moles) en agua (6.2 I) en matraz de 25 I y se agitó a temperatura ambiente. Una solución de borohidruro de sodio (383g, 10.1 moles) en agua (1.2 I) se agregó en gotas durante un periodo de 3.5 horas de manera que la temperatura se mantuvo bajo 32°C. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente, se agregó etanol (600 mi) durante la noche. Se agregó d iclorometa no (4 I), y la agitación se continuó durante 45 minutos. La solución se filtró para remover el sólido el cual se lavó con cloroformo (1 I) y agua (0.5 I). El filtrado se decantó, y la fase acuosa se extrajo con cloroformo (2.5 I). Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron con 10% de solución de tiosulfato de sodio (2.2 I). La fase acuosa se extrajo con cloroformo (1 I), las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y concentraron. Se agregó acetona (1.5 I), la suspensión se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y durante 45 minutos a 0°C. La tioacetamida se extrajo por filtración, se lavó con acetona (1.5 I) y se secó (50°C). Se obtuvo 860 g de tioacetamida. P.f. 140°C; 1H NMR (CDCI3) d 2.21 (m, 2H), 2.36 (s, CH3N), 2.56 (s, CH3CS), 2.57 (t, 2H), 2.95 (m, 2H), 4.23 (d, CH2NH), 5.65 (m, CH = C), 7.41 (bs, NH) ppm. EM m/e 184 (M + ), 151, 150, 149, 141, 140, 126, 114, 109 (100%), 109, 96, 94, 82, 70.

Etapa 4: Síntesis de 2,8-dimetíl-1 -tia-3,8-diaza-espiro[4.51dec-2- eno AF150(S) En un matraz de fondo redondo de tres cuellos (5 I) equipado con un agitador mecánico, se agitó y se calentó a 100°C ácido polifosfórico (2.1 kg). Se agregó tioacetamida (840 g) en una acuosa agitada en frío de carbonato de sodio (25%, 10 I). La alcalinidad se elevó por la adición de solución de hidróxido de sodio acuoso (50%, 30 mi). La mezcla de reacción se extrajo con cloroformo (2x3 I), las fases orgánicas se combinaron, secaron (Na2S04) y se evaporaron. El residuo se disolvió en éter de petróleo (3.5 I) para dar una solución y una pequeña cantidad de material insoluble. La evaporación de la solución de éter de petróleo dio AF150(S) sin purificar. El procedimiento descrito se repitió y el AF1.50(S) sin purificar a partir de los lotes combinados con carbono activado y se destiló dos veces bajo presión reducida (0.5 mmHg, 61°C) para dar AF150(S) (>1.2 kg, rendimiento global de 40%) ? NMR (CDCI3) o 1.8-2.0 (m. 4H), 2.18 (t, 3H, CH3C), 2.28 (s, 3H, CH3N), 3.9 (m, 2H, CH2) ppm; IR (C = 0) 1636 cm"'; E . M/e 184 (M + ).

EJEMPLO 15: Síntesis de 2.8-Dimetil-1 -tia-3.8-diaza-espiro[4.51dec-2-eno-8- óxido AF406 diclorometano (10 mi). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La cromatografía de la mezcla de reacción estuvo en una columna de óxido de aluminio natural (Merck) (metanohcloroformo 1/49) dio AF406 (0.75 g) como un sólido cristalino. Una muestra se recristalizó a partir de acetilaceto. Se obtuvo un sólido muy higroscópico. P.f. 130-132°C (145-159°C dec.) 1H NMR (300MHz, CDCI3) d 1.89 (m, 2H), 2.2 (t, j = 1.5Hz, CH3C = N), 2.82 (m, 2H), 3.24 (m, 2H), 3.25 (s, CH3N + 0~), 3.35 (m, 2H), 4.03 (q, ; = 1.5 Hz, CH2N = C) ppm; IR(CHCI3) 2947, 1636, 1448, 1153, 931 , 664 cm"1; EM(EI) 200 (M + ), 184, 182, 149, 141 , 140, 126, 110, 109, 108, 96, 82, 70.

EJEMPLO 16: Síntesis de 2-MetM-1 -tia-3,8-diaza-espiror4.51dec-2-eno. AF400 AF400 Se enfrió a -10°C - -5°C en un baño de sal con hielo una solución de AF406 (2 g, 0.01 mol) en cloroformo (10 mi). Se agregó una solucibñ~devFeGI-2«(-1 M ,^0_.7 rnj) V se agi ó la mezcla de reacción de dos fases durante" 4.5 horas. -El color de ¡a rfTézcla^de" reacción cambia con el tiempo de verde oscuro a anaranjado-café oscuro. A la mezcla de reacción enfriada se agregó cuidadosamente una mezcla de éter de petróleo (10 mi), etilendiamina (600 mg, 0.01 mol) e hidróxido de sodio 2N (10 mi 0.02 mol). El pH de la fase acuosa fue 13. Los materiales orgánicos se separaron y la fase acuosa se extrajo con cloroformo, se acidificó con 5N HCI 1 pH = 9 y se extrajo nuevamente con cloroformo. Tocias las fracciones orgánicas se combinaron, se secaron en carbonato de potasio, se filtraron y se evaporaron. La cromatografía [gel de sílice (RIEDEL DE Haen 31607), CHCI3:MeOH:NH40 90/9/1] del residuo dio AF400, p.f. 40°C; ? NMR (CDCI3) 1.74(m, 2H), 1.92 (m, 2H), 2.19 (tj - 1.8Hz, 3H), 2.71 (m, 2H), 3.05 (m, 2H), 3.92 (q,y = 1.8Hz, 2H) ppm; EM m/e 171 (M + + 1), 170 (M + ).

EJEMPLO 17: Síntesis de 2-Metil-8-metil-d;y-1-tia-3,8-d¡aza-espiror4.51dec-2-eno. AF402 ¦ AF402 .. A una "solución agitada en frío (baño de agua con hielo) de 4-picoliamina (50 g, 0.462 mol) e lentamente anhídrido acético (75 g, 0.735 mol) (1 hora). La temperatura se mantuvo a 10-15°C durante la adición. La mezcla de reacción se dejó durante la noche a temperatura ambiente. TLC [sílice, cloroformo/metanol/amoniaco (33%) 90:10:1 (v/v)] mostró una mancha de Rf - 0.4. El producto, N-pirid in-4-ilmetil -acetamida no se aisló y se procesó a la siguiente etapa. Parte de la mezcla de reacción (43 mi) se evaporó. La sal acetamida se obtuvo como un aceite amarillo (14.5 g). Parte del aceite (1.9 g, < 0.06 mol) se disolvió en metanol (40 mi), se agitó bajo atmósfera de nitrógeno y se protegió de la luz. Se agregó yodometano-d3 (10 g, 0.07 mol), manteniendo la temperatura de la mezcla de reacción a 15-25°C. La mezcla de reacción se dejó durante la noche a temperatura ambiente, luego se trituró dos veces con éter (2x200 mi). Se obtuvo yoduro de 4- (Acetamido-metil)-l -metil-d3-piridinio como sólido amarillo TLC [sílice, cloroformo/metanol/amoniaco (33%) 90:10:1 (v/v)] mostró una mancha en Rf -0.05] y se redujo en la siguiente etapa sin purificación adicional. A una solución enfriada (baño de agua con hielo) de la sal de yoduro de piridinio en metanol (40 mi) bajo atmósfera de nitrógeno, se agregó gradualmente borohidruro de sodio (3.9 g, 0.2 mol) (2 horas) de manera que la temperatura se mantuvo a 15- - tetrahidropiridin-4-ilmetil)-acetamida como aceite amarillento pegajoso (8.5 g). 1 H-NMR (CDCI3) d 1.98 (s, 3H, CH3CN), 2.12 (m, 2H), 2.52 (t, 2H), 2.91 (m, 2H), 3.76 (d, CH2NHCO), 5.52 (m, CH = C), 6.66 (br. s, NH) ppm. EM m/e 172(M + ). En un matraz de fondo redondo de tres cuellos (250 mi) equipado con un embudo de adición y condensador con un tubo de cloruro de calcio en su punta, una solución de la tetrahid ropiridin acetamida* (8.5 g) en acetonitrilo seco (70 mi) se agregó. A la solución agitada, se agregó pentasulfuro fosforoso (6.7 g. 0.03 mol) seguido por trietilamina (12 g, 0.12 mol) que se agregó a partir del embudo adicional durante 10-15 minutos. La solución 5 obtenida se calentó bajo reflujo durante 5 horas y luego se dejó a 15°C durante tres días. La solución se evaporó, basificó con 10% de carbonato de potasio acuoso, luego se extrajo con cloroformo. La fase orgánica s.e secó y se evaporó. Se obtuvo N-(1 -metil-d3- 1 ,2,3,6-tetrahidropiridin-4-ilmetil)-tioacetamida (6.62 g, 0.036 mol) 10 negro sin purificar. 1 H-N M R (CDCI3) ¿ 2.21(m, 2H), 2.56(s, CH3CS), 2.58(t, j = 4.4Hz, 2H), 2.97(m, 2H), 4.23(d, j = 4.4Hz, CH2NH), 5.65(m, CH = C), 7.41(br s, NH) ppm. EM m/e 187(M + ). En un matraz (150 mi), se agregó ácido polifosfórico (30 g) a la tioacemida sin purificar (6.5 g). La reacción se agitó y se 15 calentó a 170°C durante 3.5 horas. La mezcla de reacción caliente n carbonato de sodio acuoso al 25% ato- de~s djo_acuoso al 25% (50 mi) se agregó al residuo en el matraz de reacción y las dos solüc7o?fes~se- combinaron. La alcalinidad se elevó por la adición de un 50% de 20 hidróxido de sodio acuoso (6 mi) y la mezcla de reacción se extrajo con cloroformo. La fase orgánica se separó, se secó y se evaporó. El residuo se disolvió en éter de petróleo (100 mi) para dar después de 12 horas a -20°C una solución y una pequeña cantidad de material insoluble. La solución de éter de petróleo se 25 evaporó y el aceite obtenido (5 g) se destiló a presión reducida (p.e. 50-53°C, 0.2 mmHg) para dar AF402 (2.15 g 0.012 mol). ?- NMR (CDCI3) d 1.87(m, 2H), 1.94(m, 2H), 2.1(m, 2H), 2.2(tj = 1.7Hz, 3H), 2.76(m, 2H), 3.92(m, 2H) ppm. EM m/e 187(M + ). 5 EJEMPLO 18: Síntesis de N-f(2,8-Dimetil-1 -oxa-8-aza-espiro[4.51dec-3-iliden )- metil-aminal-N-óxido, AF600 AF600 5 A una solución de clorhidrato de N-metilhid roxilamina g, 0.0088 mol) en etanol (7 mi) y la mezcla se agitó a temperatura 0 ambiente durante 4.5 horas. El solvente se evaporó, se agregó diclorometano (675 mi) y la solución obtenida se lavó con 20% de carbonato de sodio acuoso. La fase orgánica se secó, el solvente se evaporó y la cromatografía instantánea (sílice, CHCI3/MeOH/NH4OH 90/10/1) dio AF600 (1.5 g) como una mezcla 5 de dos isómeros [isómero (A) menos polar/isómero (B) más polar 1:4]. ?-NMR (CDCI3) ? 1.45 [d. j = 6.37Hz. CH3 ( A ) ] . 1.54 [d, j = 6.48Hz. CH3 (B)] , 1.7-1.9 (m), 2.29 [S. NCH3 (A)]. 2.31 [s. NCH3 (B)]. 2.32-2.5 (m, 3H), 2.62 (s, CH2). 3.63 [s, CH3NO (A)]. 3.68 [s, CH3NO (B)], 4.78 [br CH ( A ) ] , 4.85 [br CH (B)] ppm. EM m/e 212 (M + ), 196, 169, 126, 110, 96. 70.

EJEMPLO 19: Síntesis de N-f(2,8-Dimetil-1-oxa-8-aza-espiro[4.5 dec-3-iliden)-bencil-amina|-N-óxido. AF604 AF604 . A (1.27 g, 0.0 (0.65 g, 0.008 mol). Se obtuvo un precipitado blanco. Una solución de' 2,8-dimetil-1 -oxa-8-aza-espiro[4.5]decan-3-ona (1.3 g, 0.0072 mol) en etanol (3.5 mi) se agregó y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El solvente se evaporó, se agregó díclorometano (450 mi) y la solución obtenida se lavó con 20% de carbonato de sodio acuoso. La fase orgánica se secó, el solvente se evaporó y la cromatografía instantánea (sílice, CHCI3/MeOH/NH4OH 90/10/1) dio AF604 (1.81 g) como una mezcla de dos isómeros [isómero (A) menos polar/isómero (B) más polar 1:8]. 1 H-N M R (CDCI3) d 1.42 [d, j = 6.35Hz, CH3 (A)], 1 53 [d, j = 6.45Hz, CH3 (B)], 1.7-1.9 (m), 2.29 (S, NCH3), 2.32-2.55 (m), 2.62 (m, CH2), 4.85(br CH), 4.91[s, CH3NO (A)], 4.97 [s, CH3NO (B)] ppm. EM m/e 288 (M + ), 272, 254, 197, 153, 91(100%).

EJEMPLO 20: Síntesis de N-[(2,8-Dimetil-1-oxa-8-aza-espirof4.5ldec-3-ilidenl- isopropil-aminal-N-óxido, AF605 agregó acetato de sodio (0.91 g, 0.011 mol). Se obtuvo un precipitado blanco. Se agregó una solución de 2,8-dimetil-1 -oxa-8- aza-espiro[4.5]decan-3-ona (1.84 g, 0.01 mol) en etanol (4 mi) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4.5 horas. Se evaporó el solvente, se agregó d iclorometano (500 mi) y la solución obtenida se lavó con 20% de carbonato de sodio acuoso. La fase orgánica se secó, el solvente se evaporó y la cromatografía instantánea (sílice. CH2CI2/MeOH/NH4OH 90/10/1) dio AF605 (1.5 g) como una mezcla de dos isómeros [isómero (A) menos polar/isómero (B) más polar 1:4] ?-NMR (CDCI3) 6 1.40 (d, j = 6.6Hz, CH3CH2), 1.42 [d . j = 6.2Hz, CH3 (A)], 1.6-1.8 (m), 2.29 [s, CH3 (A)], 2.31 [s, CH3 (B)], 2.35-2.57 (m. 3H), 2.63-2.71 (m, 2H, CH2), 4.05 [m, CHNO (A)], 4.18 [m, CHNO (B)], 4.83 (m, 1H, OCH) ppm.

EJEMPLO 21 : Síntesis de N-f(2-Etil-8-metil-1-oxa-8-aza-espirof4.51dec-3-iliden)-metil-amina]-N-óx¡do, AF601 A una solución de clorhidrato de N-metilhidroxilamina (0.95 g, 0.011 mol) en etanol (14.3 mi) se agregó acetato de sodio (0.94 g, 0.011 mol). Se obtuvo un precipitado blanco, se agregó una solución de 2-etil-8-metil-1 -oxa-8-aza-espiro[4.5]decan-3-ona (2.1 g, 0.01 mol) en etanol (7.4 mi) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5.5 horas. El solvente se evaporó, se agregó diclorometano (770 mi) y la solución obtenida se lavó con 20% de carbonato de sodio acuoso. La fase orgánica se secó, el solvente se evaporó y la cromatografía instantánea (sílice, CHCI3/MeOH/NH4OH 90/10/1) dio AF601 (2.4 g) como una mezcla de dos isómeros [isómero (A) menos polar e isómero (B) más polar]. 1 H-N M R (CDCI3) 0.94 [X: ,j = 7.4Hz, CH3CH2 (B)], 0.99 [t, j = 7.4Hz, CH3CH2 (A)], 1.59 (m, 1 H), 1.74-1.86 (m), 1.98-2.05 (m, 2H), 2.29 [s, NCH3 (A)], 2.30 [s, NCH3 (B)], 2.45-2.60 (m, 5H), 3.63 [s, CH2 (A)], 3.69 [s, CH2 (B)], 4.66 [br OCH (A)], 4.78 [br OCH (B)] ppm. EM m/e 226 (M + ), 209, 197, 181, 169, 152, 138, 126, 110, 96, 70.

EJEMPLO 22: Síntesis de N-r(2-metil-8-fenil-1 -oxa-8-aza-espi ro[4.51dec-3- ¡liden)-metil-amina1-N-óxido, AF602.

AF602 A una solución de clorhidrato de N-metilh idroxilamina (0.33 g, 0.004 mol) en etanol (5.4 mol) se agregó acetato de sodio (0.32 g, 0.004 mol). Se obtuvo un precipitado blanco. Se agregó una solución de 8-metil-2-fenil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3- ona (0.85 g, 0.004 mol) en etanol (3 mi) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4.5 horas. El solvente se evaporó, se agregó dicloro metano (250 mi) y la solución obtenida se lavó con 20% de carbonato de sodio acuoso. La fase orgánica se secó, el solvente se evaporó y la cromatografía instantánea (sílice, CHCI3/MeOH/NH4OH 90/10/1 ) dio AF602 (130 mg) como una mezcla de dos isómeros [isómero (A) menos polar/isómero (B) más polar 1:3]. 1 H-N R (CDCI3) o 1.24 (m, CH2), 1 7-1.97 (m), 2.29 [s, NCH3 (A)], 2.31 [s, NCH3 (B)], 2.32-2.5 (m), 2.72 (m, CH2), 3.30(m), 3.67 [s, CH3NO (B)], 3.71 [s, CH3NO (A)], 5.49 [br CH (A)], 4.74[br CH (B)], 7.28-7.56(m, ArH) ppm. EM m/e 274 (M + ), 257(100%), 245, 168, 112, 96, 70.

EJEMPLO 23 Síntesis de D¡hidro-5'-met espiroM - azabiciclof2.2.21octan-3,5'- (4'H)-3,-¡liden-metilam¡na-N-óxido. AF603 A una solución de clorhidrato de N-metílhidroxilamina (1.17 g, 0.014 mol) en etanol (15 mi) se agregó acetato de sodio (1.15 g, 0.014 mol). Se obtuvo un precipitado blanco, se agregó una solución de díhidro-5'-metilespiro[1-azabiciclo[2.2.2]octan- 3,5'-(4'H)-3'-ona (2.1 g, 0.01 mol) en etanol (7.4 mi) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4.5 horas. El solvente se evaporó, se agregó diclorometano (770 mi) y la solución obtenida se lavó con 20% de carbonato de sodio acuoso. La fase orgánica se secó, el solvente se evaporó y la cromatografía instantánea (sílice, CHCI3/MeOH/NH4OH 90/10/1) dio AF601 (0.45 g) como una mezcla de dos isómeros [isómero (A) menos polar/isómero (B) más polar]. ?-N R (D20) d 1.22 [t, j = 7.09Hz, CH (B)], 1.46 [tj = 7.0Hz, CH (A)], 1.35 [d,j= 6.5Hz, (CH3)2CH], 1.41-1.58 (m), 1.57- 1.9 (m), 2.59 (m), 2.67-3.01 (m), 3.01-3.26 (m), 3.47 [s, N(0)CH3 (A)], 3.49 (m), 3.52 [s, N(0)CH3 (B)] ppm. EM m/e 224 (M + ), 207, 195, 178, 138, 124, 96, 83 (100%).

EJEMPLO 24: Síntesis de 2-Etil-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiror4.5ldecan-3-tiona.

AF510 Una mezcla de AF267 (214 mg, 1 mmol) y Reactivo Lawesson (280 mg, 0.692 mmol) en acetonitrilo (5 mi) se calentó bajo reflujo durante 17 horas. El solvente se removió y el residuo se disolvió en carbonato de sodio acuoso concentrado (0.5 mi) y luego se extrajo con acetato de etilo. El extracto se secó y el solvente se evaporó. El residuo (250 mg) recristalizado primero a partir de tolueno y luego a partir de acetonitrilo dio AF510 sin purificar. 1 H-NMR (CDCI3) d 1.03 (t, CH3CH2), 1.83 (m), 1.93-2.44 (m), 2.30 (s, CH3N), 2.80 (m, 2H), 4.21 (dd, SCM), 8.66 (br, NH) ppm. EM m/e 230 (IvT), 197 (M + -SH), 156, 128, 96 (100%).

EJEMPLO 25: Síntesis de 4-Bencil-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espirof4.51decan-3- ona. AF282 En un matraz de tres cuellos equipado con un agitador magnético y Dean-Stark y dos embudos de destilamiento se calentó a reflujo una solución de ácido mercaptoacético (8 mi, " *0~.242 mol) en benceno r(75" mi)— Se- agrega ron simultáneamente en gotas (45 minutos) bromuro de bencilo (13 mi,. 0.242 ^rTolp ~1r- metil-4-piperidona (9.3 mi, 0.08 mol) y la mezcla de reacción se llevó a reflujo durante 1.5 horas adicionales (2 mi de agua se recolectaron). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se agregó agua (30 mi) y la fase orgánica se separó, se secó y el solvente se separó. La cromatografía instantánea (sílice, 10% de metanol en cloroformo) del residuo dio AF282 (3.8 g). H- NMR (CDCI3) d 1.65 (m, 2H), 219 (m. 4H), 2.27 (s, 3H, NCH3), 2.78 (m, 2H), 3.64 (s, 2H, SCH2), 4.78 (s, 2H, NCH2), 7.25 (5H, Ar) ppm.

EJEMPLO 26: 5 Síntesis de 4-(2,4-Dimetoxibencil)-8-metil-1-tia-4,8-diaza- AF286 En un matraz de tres cuellos equipado con un agitador magnético y Dean-Stark una solución de 1 -metil-4-piperidona (0.27 15 mi, 2.4 mmoles), clorhidrato de 2,4-dimetoxibencilamina (0.72 g, y la fase orgánica se separó. El pH de la fase acuosa se ajustó a 20 pH 10 con solución de hidróxido de sodio acuoso 2.5 N y luego la fase acuosa se extrajo con cloroformo. Las fases orgánicas se combinaron, se secaron y el solvente se evaporó. La cromatografía instantánea (sílice, 10% de metanol en cloroformo) del residuo dio AF286 (140 mg, 15% de rendimiento). 1 H-NMR (CDCI3) ó 1.66 (m, 2H), 2.21 (m, 4H), 2.27 (s, 3H, NCH3), 2.77 (m, 2H), 3.64 (s, 2H SCH2). 3.78 (s. 3H. OCH3), 3 80 (s, 3H. OCH3). 4.52 (s. 2H. NCH2).

EJEMPLO 27: Síntesis de 4-(fer-butiloxicarbonil)-8-metil-1-tia-4,8-diaza- espiro[4.51decan-3-ona. AF284 AF284 A una solución de AF277 (2.60 g, 13.97 minóles) en diclorometano (60 mi), se agregaron trietilamina (1.95 mi, 13 99 mmoles), dicarbonato de di-fer-butilo (3.85 mi, 16.76 mmoles) y 4- La solución obtenida ambiente, luego el ¡nstan áne'a ~~(sílice--. CHCI3/MeOH/NH4OH 80/20/1) del residuo dio AF284 (4 g, >95% de' rendimiento). 1 H - N M R (CDCI3) 6 1.55 (s, 9H, OC(CH3)3), 1.70-1.82 (m, 2H), 2.26 (m, 2H), 2.28 (s, 3H, NCH3), 2.83-2.87 (m, 4H), 3.53 (s, 2H, SCH2) ppm.

EJEMPLO 28: Formulación de AF150(S) en aceite de parafina + estudios de estabilidad La estabilidad del 10% p/p de AF150(S) en aceite de parafina farmacéutico aceptable (Paraffin oil Eur. Ph) se examinó a 40°C bajo aire o atmósfera de nitrógeno, en la presencia o ausencia de tocoferol. Las muestras se analizaron después de dos meses de almacenamiento. Se utilizaron TLC, HPLC y GC para detectar y determinar la cantidad de posibles productos de degradación. Los cambios de color se determinaron en comparación con el aceite de parafina con o sin tocoferol bajo las mismas condiciones. El AF150(S) fue estable en la formulación de aceite de parafina. Los productos de degradación, el derivado tiolamida (M+ 202) obtenido por hidrólisis de AF150(S), sobre 0.1% no se detectó en ninguna muestra probada. Se observó un color amarillo claro en muestras sin tocoferol, pero el color no se desarrolló en muestras que contienen 0.5% p/p de tocoferol en A 50JS).

EJEMPLO 29: AF150(S) sal citrato + estudios de estabilidad Se agregó en gotas a una solución de AF150(S) (30.13 g, 163.8 mmoles) en 2-propanol (60 mi) y tetrah id rofurano (100 mi) durante 45 minutos una solución de ácido cítrico anhidro (29.51 g, 153.5 mmoles) en 2-propanol (200 mi). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón durante 2 horas adicionales, luego el precipitado blanco resultante se filtró y se lavó con hexano bajo atmósfera de argón. El sólido blanco se introdujo en Lina pistola de secado que contiene P205, la pistola de secado se evacuó la temperatura (0.2 mmH) y luego se calentó a 55-60°C durante 6 horas. Citrato AF150(S) (53.8 g. 87.6% de rendimiento) se obtuvo. TLC (2% de NH40H en metanol) Rf 0.57, p.f. 146.5- 147.5 °C ; ? NMR (300MHz. D20-Na2C03, pH 12) ó 1.80(m, 4H), 2.08 (s. 3H, CH3C = N) 2.17(s y m, 5H, CH2 + CH3N + ), 2.46 (ABq, j= 15.2Hz. 4H, 2C/-/2C02H), 2.73(m, 2H), 3.81(s, 2H, CH2N = C) ppm. ,3C NMR (300MHz. D20- Na2C03, pH 12) 19.77, 36.17, 44.16, 45.64, 53.08, 72.71 , 75.03, 170.91 , 179.19 y 181.86 Hz. El análisis de HPLC de muestras de esta sal almacenado bajo varias condiciones (a 60°C durante tres meses; en aire a temperatura ambiente durante tres meses) comparado a ^--un-e.s.táji dar.__.de _refe_rencia almacenado bajo condiciones anhidras mostró la sal para-ser altamente estable". " — ~~ ~ - EJEMPLO 30: Penetración cerebral de compuestos 1. pKa de AF267B. La forma de base libre (no ionizada) del compuesto AF267B cruza la barrera de sangre cerebral. Ya que AF267B tiene un pKa de 7.8, en el pH = 7.35 del fluido • cerebroespinal (CSF), 26.2% del compuesto están en una forma de base libre, calculado como se muestra posteriormente. Esto indica que AF267B es altamente penetrable en el cerebro ya que la base libre es la especie que cruza la barrera cerebral sanguínea. En comparación, algunos otros compuestos activos del CNS farmacéuticos conocidos, por ejemplo en donde la base es quinuclidinilo, tienen un pKa > 9 (en donde la amina terciaria es 5 altamente básica). Para tales compuestos en el pH relevante de 7.35, únicamente 2.2% están en forma no ionizada. Esto indica una preferencia más elevada para el cerebro para AF267B contra tales compuestos. Estos cálculos se basan en lo siguiente: BH+ ? B + H + 10 % B = 100-% BH+ =100-100/[1+10(pH pK3)] pKa(AF267B) = 7.8 pH(CSF) = 7.35 % B = 100-100/1 + 10"° 5] % B = 26.2% - — -^15- - ana^una^ase_B'_que_ tiene un p Ka = 9.0 "* % B ' = 100 - 100 / 1 + 10 " 6 ] . . ~ -=^-^·.^ ~" % B' = 2.2% 2) Se trataron a las ratas con AF267B (2 mg/kg, po) y plasma 20 contra niveles cerebrales del fármaco se analizaron por GC. Se encontró que AF267B tiene una preferencia para el cerebro contra plasma: a) comparando el área bajo la curva extrapolada a tiempo infinito (AUC) ambos en el cerebro completo (ng/gr)*hora contra plasma 25 (ng/ml)*hora ambos iv (1mg/kg) y po (2 mg/kg), respectivamente, se encontró que la relación de cerebro AUC/plasma AUC es: para machos 1.79 (iv) y 2.43 (po) y para hembras 1.32 ( i v ) y 1.25 (po). De este modo la mayor cantidad del compuesto se encuentra en el cerebro que en el plasma; 5 b) comparando la relación de cerebro Cmax (ng/g )/plasmá Cmax (ng/ml) (po) se encontró que 25% del compuesto en machos y 16% en hebras se encuentra en el cerebro. Este cálculo se basó en el peso del cerebro (2 g) contra el volumen de plasma total (14 mi). Esto también indica un porcentaje elevado del compuesto en el 10 cerebro. 3) estudio ex vivo de AF150(S) y AF267B (100 pmoles/kg, po) en tejido de cerebro de ratón (análisis GC de AF150(S) o AF267B contra un compuesto estándar (AF261) agregado al tejido cerebral, o por desplazamiento de un compuesto muscarínico radioactivo tal J5_ c_o_m.o_oxotnemorina-M tritiada a partir del tejido cerebral) también * muestra claramente ^una .penetración "c'e'r e b r a f "el evada "~c o n t r a --- plasma (GC y estudios de unión). AF150(S): Tmax =1-10 minutos; T1 2 = 21 y 53 minutos (dos fases), iv; MRT (tiempo de retención promedio) = 50 minutos, iv, po. AF150(S) tiene una penetración 20 cerebral rápida (1 minuto iv); Cmax = 40.7 pmoles/kg (40.7% en cerebro a partir de la cantidad administrada po); AF267B; detectada en el cerebro entre 2-240 minutos después de la dosis, un pico en 20-30 minutos, MRT=128 minutos; Cmax = 36.4 pmoles/kg (36.4 % en el cerebro a partir de la cantidad administrada po). 25 EJEMPLO 31 Detección de AF292 después de la administración de AF267B a perros Beaqle. El propósito de este estudio fue determinar los niveles 5 de AF267B y AF292 (a metabolito de AF267B) en plasma de perro después de 13 semanas de administración diaria individualmente subcrónica de AF267B (1.5, 3 y 6 mg/kg po a perros hembra y macho) de acuerdo al método (véase posteriormente). Estándar Interno (AF261): 2-Metil-8-metil-1 -tia-4,8- 10 diaza-espir[4.5]decan-3-ona; MW 200. Las muestras de plasma analítico se originan de la parte, en la vida del estudio. Las concentraciones de AF267B y AF292 se determinaron por: Columna: Purospher STAR RP18e (4 x 50 mm, 3 pm) Fases Móviles: Solvente A: 1 g/l (HN4)2C03 (H20) - -15.· ÷=_.-_.-.. __. - Sojvente B: Metanol Volumen de Lazo/Inyección 50 jjg/10 µ? — - Modo de Ionización: Ionización Química de Presión Atmosférica (APCI); iones positivos Presión de Gas de Funda: Nitrógeno: 70 psi 20 Temperatura Capilar: 250°C Voltaje de Rocío: -3.6 kV Modo de Detección: SRM (verificación de reacción seleccionada) AF292: m/z: 201.0 [CE(CE = energía de colisión 30V)] ? m/z: 70 0 (0.0-5.2 minutos)] 25 AF261: m/z: 201.0 (CE 35V) ? m/z: 70.0 (5.2-6.2 minutos): Estándar interno AF267B: m/z: 215.0 (CE 30V) ? m/z: 70.0 (6.2-10.0 minutos) Gas de Colisión (CID): 2.5 mTorr/Argón Resultados : Después de 13 semanas de dosificación diaria repetida AF267B tiene una vida media de plasma de 1-2 horas con Tmax = 1.5-3 horas, Cmai( (ng/ml) = 162-1352 (linearmente dependiente de dosis) y AUC(o-t) (ng*h/ml) - 712-3947 (linearmente dependiente de dosis). AF292 tiene una vida de plasma más larga de aproximadamente diez veces (-9-20 horas) con Tmax = 3 horas, Cma* (ng/ml) = 136.555 y AUC(0-t) (ng*h/ml) = 616-2451 (linealmente dependiente de dosis). En comparación a AF267B. el perfil farmacocinético de AF292 puede resumirze como sigue: _ hembras, contra T1 2 = AF267B en hembras). El Cmax de AF292 es 50-90% contra el Cmax de AF267B. AF292 muestra un cambio aparente a la derecha de Cmax contra Cmax de AF267B (debido a un retraso en la apariencia en plasma de AF292 contra AF267B). En la base de esta observación, se apreciará que AF267B y AF292 pueden juntos formar una combinación farmacéutica con un plasma más largo T1 2 que cualquier compuesto solo. Tal combinación puede administrarse como tal.

EJEMPLO 32 Efectos de los compuestos probados en secreción de g-APP. en cultivos celulares establemente transfectados con el MI mAChR y en hipocampo principal de ratas y cultivos neuronales corticales. 5 Se colocaron en placas células en placas de cultivo de 6 pozos y se utilizaron a la edad de 3-5 días después de colocarse en placas. Las células se lavaron dos veces en un medio libre de suero e incubaron durante 1 hora a 37°C con AF150(S) y AF267B o AF292. Los cultivos celulares se expusieron durante 1 hora a 10 varias concentraciones de estos compuestos de prueba (10~6 - 103 M) y a carbacol (10'4 M). Las céluluas expuestas al medio solo se se refieren como controles. Carbacol, rivastigmina y deprenilo se utilizaron como compuestos de referencia. Se recolectaron sobrenadantes celulares en tubos ~— -- 5 d o r.f f .co ? teniendo un cóctel de inhibidores de proteasa (5 'unidádes/ml de aprotinina, 5 mg/ml de pep'stati ' ^A^-S- mg/ml~de leupeptina y 10"4 M de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF, un inhibidor de proteasa); Sigma, USA). Los medios recolectados se concentraron con tubos Centricon (Amicron, Beverly, MA, USA) y 20 se mantuvieron congelados para determinación de secreción a- APPS. Cantidades ¡guales de proteina (50-100 pg) se cargaron y se separaron en 10% de dodecilsulfato de sodio-electroforesis de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Seguido por transferencia western en nitrocelulosa, membrana, bloqueada por leche libre de grasa, y 25 examinada durante 24 horas a 4°C, con proteína precursora anti- A I z h e i m e r . el anticuerpo m o n o c I o n a I A 4 22 C 11 (0.25 µ g / m I : B o e h r i n g e r M a n n h e i m . Alemania). Las memb anas de n i t r o c e I u I o s a se lavaron e incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con anticuerpos IgG anti-ratón de cabra unidos con peroxidasa 5 (Jackson Immunoresearch, USA), seguidas por deslave extenso y tinción con sistema de detección quimioluminiscente mejorado (Amersham). La evaluación cuantitativa de las bandas inmunoreactivas, en las películas expuestas, se realizó por densitometría de formación de imágenes por video (Gel-aid 0 software; Galai Co., Israel). Los niveles APPS se expresaron como incremento x veces sobre los niveles básales. En los cultivos celulares establemente transfectados con M 1 mAChR, la secreción inducida por a-APPs se calculó también como % de respuesta máxima a carbacol 10"4M. 5____. _ La secreción de r/.-APPs en células que expresan el M1 ¦ - mAChR incrementó .la dosis depéndient¥mente"~después-^der:^La_- estimulación agonista. El incremento máximo se obtuvo a 10"4 "M AF267B (aproximadamente 6 veces el incremento sobre el control) y fue igual al incremento máximo producido por carbacol. La 0 adición del antagonista muscarínico, atropina a 10"5 M, inhibió completamente la secreción de APPS inducida por AF267B. indicando que el efecto de AF267B se media a través de M 1 mAChR. En varios experimentos, la actividad de AF267B se comparó a la actividad de AF150(S). Los resultados muestran que 5 AF267B es más efectiva y potente que AF150(S) (50% de respuesta máxima de carbacol para AF150(S) contra igual a la máxima respuesta de carbacol para AF267B). Adicionalmente, AF267B es más efectiva y más potente que su racemato (AF267) o AF102B (50% de respuesta máxima de carbacol) en secreción de a-APPs, mientras que el enantiómero AF267A menos potente es similar en potencia a AF102B. AF292 fue tan efectivo como AF267B (EC50 = 3 µ?) y el carbacol en activar la elevación de APPS, mientras rivastigmina y deprenilo no fueron efectivos en elevar niveles de APPS. La adición de atropina (10 µ?) inhibió la secreción de APPS inducida por carbacol, AF267B y AF292, indicando que el efecto de estos agonistas se media por mAChR. Tomados juntos, estos resultados muestran que AF267B es un agonista muscarínico M1 selectivo y un "fármaco-pro- ar maco" para AF292, que el mismo es un agonista muscarínico M1 de plasma más prolongada y actividad muscarínica más prolongada que cualquier compuesto solo. Utilizar las pruebas anteriores, AF700 y AF704 se encontró también que son efectivos para incrementar niveles de APP en esta preparación (a 100 µ? 50% de efecto máximo de carbacol). El efecto de varios agonistas muscarínicos en los niveles de APPS secretados se siguió de utilizar cultivos celulares primarios de rata preparados a partir de! hipocampo, corteza cerebral (ambos de los cuales contienen principalmente M1 mAChR) y médula espinal (que contiene receptores M2). En este estudio los efectos de carbacol (un agonista muscarinico no 5 selectivo) oxotremorina (> agonista muscarinico selectivo M2), fisoestigmina (un inhibidor de colinesteras) y AF102B, AF150(S) y AF267B (agonistas muscarínicos selectivos M1) en secreción de APPS se probaron]. Se prepararon cultivos celulares primarios a partir de 10 embriones de ratas Sprague-Dawley. Los experimentos se realizaron con cultivos de hipocampo, corteza cerebral y médula espinal siguiendo las guías principales "Guide for Care and Use of Laboratory animáis", National Research Council, Washington, DC 1996. --—15 Los tejidos cerebrales, hipocampo, corteza cerebral y médula espinal: se removieron de _fetos™dé ra t a s~d e~ 13 - 1 '4 o "-18-19- - días, respectivamente, por disección de mano libre y transfirieron en Solución salina Equilibrada de Gey fría (Gibco, BRL) conteniendo 6 mg/ml de glucosa. Después de la remoción de las 20 meninges, el tejido examinado se disoció mecánicamente utilizando pipetas Pasteur después de solución de tripsina-ADNasa para obtener suspensión celular. Las células disociadas se transfirieron a un Medio Eagle Modificado con Dulbeco (Biological Ind. Beit-Haemek, Israel) conteniendo: 6 mg/ml de glucosa; 2 mM 25 de L-glutamato. 1000 lU/ml de penicilina. La suspensión celular se colocó en placas, en placas de tejido de cultivo de 12 pozos pre-recubiertas de poli-L-lisina (1 mg/ml) en una densidad de 4 x 105 y 6x105 células/pozo para células de hipocampo y corticales, respectivamente. Los cultivos celulares se mantuvieron durante aproximadamente 2 semanas en incubador a 37°C (95% de aire y 5% de C02). Las células a 11-14 días in vitro se lavaron extensamente y luego se sometieron a varios tratamientos como se detalla posteriormente. Las células de hipocampo y corticales se incubaron con ligandos probados en una concentración de 100 µ? durante 1 hora en un regulador HEPES Locke libre de magnesio que consiste de: 154 mM de NaCI, 5 6 mM de KCI, 3.6 mM de NaHC03, 1.3 mM de CaCI2, 5.6 mM de glucosa y 10 mM de HEPES, pH 7.4, conteniendo 0.02% de BSA. En los estudios de bloqueo los agonistas muscarinicos se co-incubaron con el antagonista, pir.enz^p.ina_J1^_pJVIj_ Las células expuestas a regulador solo se refirieron- corno control. En. el final del periodo" dé~Tncub TcibTTr~elr medio condicionado se removió y se transfirió a tubos Eppendorff, que contienen un coctel de inhibidores de proteasa (como se especifica anteriormente). Los sobrenadantes se concentraron por centrifugación (2,500 Xg durante 45 minutos a 4°C) utilizando concentradores Centricon-30 (Amicon, Inc., MA USA) y se congelaron a -70°C hasta que los niveles de APP se determinaron. El contenido de proteína en las muestras se determinó en microplacas de acuerdo al ensayo Bio-Rad. Las cantidades de proteína iguales de cada muestra (~ 40 pg/senda) se cargaron en 10% de SDS-PAGE. Cuando se completó ¡a electroforesis. los geles se tiñeron en membranas de nitrocel ulosa , se bloquearon por leche libre de grasa y las bandas de APP se examinaron utilizando la proteína A4 precursora anti-Alzheimer (monoclonal 22 C 11 , Boehringer Mannheim) y la sonda secundaria de IgG anti ratón de conejo unida con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, P). Después del deslave extenso las bandas se tiñeron con TMB (solución única, Zymed Lab., California) o se desarrollaron con el Reactivo de Quimioluminiscencia Renaissance (DuPont, NEN) seguido por la exposición a una película de autoradiograf ía (Hyperfilm-ECL, Amersham), La determinación cuantitativa de las bandas de APP totales se realizó por densitometría de formación de imágenes por video (Gel-aid software, Galai Co. Israel). Los datos obtenidos para APPS se expresaron como veces de donde el control fueron células incubadas con regulador Loe ke sol o. "* Se expusieron cultivos celulares de cultivos de hipocampo y corticales primarios al carbacol agonista no selectivo (CCh) y oxotremorina (>M2 selectivo) a los agonistas muscarinicos M1 , AF150(S) y AF267B y al inhibidor de colinesterasa, fisostigmina, todos a 100 µ?. Los agonistas M1 indujeron un incremento significativo en secreción de APPS en ambos sistemas celulares utilizados, hipocampo y corteza cuando se compara a niveles determinados en cultivos celulares control. En los cultivos celulares corticales el incremento en los niveles de APPS vario de 2.5 a 3.1 veces el incremento sobre el control y un incremento en el rango de 1.8-2.8 veces sobre el control se encontró en cultivos celulares de hipocampo. AF150(S) y AF267B fueron más potentes que CCh (2.8 veces y 1.5 veces sobre control, respectivamente). Oxotremorina y fisostigmina fueron inactivas. La secreción inducida por APPS por AF150(S), AF267B y CCh se bloqueo completamente por el antagonista selectivo M1, pirencepina (10 µ'?). Estos agonistas no activaron la secreción de APPS en los cultivos de médula espinal, ya que estas neuronas no contienen M1 mAChR.

EJEMPLO 33 Respuesta de Consecuencia de Neurita a agonistas muscarínicos en la ausencia o presencia de neurotrófinos Las células de feocromocitoma de rata transfectadas con células M.1 mAChR se. cultivaron como se describe en Gurwitz et al, (NeuroReport 6, 485, 1995). Para determinación de consecuencia de neurita, las células se colocaron en placas, en placas de seis pozos y se utilizaron 3-5 días después de colocarse en placas. Los factores de crecimiento se agregaron 1 día después de colocarse en placas y se agregaron agonistas muscarínicos por las últimas 24 horas. Se observaron las células bajo un microscopio invertido. El porcentaje de células con neurita más largas que el diámetro celular se clasificaron en tres campos aleatorios de varios cientos de células a partir de cada pozo. Los resultados se expresaron como un porcentaje de células con neuritas. Los tratamientos se realizaron en células por triplicado. Tanto NGF (50 ng/ml) como EGF (100 ng/ml) se agregaron 1 día después de colocarse en placas. Se agregaron agonistas muscarinicos 24 horas antes del resultado. Los efectos como neu rotróficos de AF102B, AF150(S) y AF267B contra carbacol (CCh) y su interacción con neurotrofinos tales como NGF, el factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) y factor de crecimiento epidérmico (EGF) se evaluaron. La respuesta máxima a CCh fue 80% comparado al 60% para AF267B y 30% para AF150(S). El pre-tratamiento de células de feocromocitoma de rata tra nsfectaron con células M1 mAChR con aumentos sinerg ísticamente NGF la respuesta neurotrófica a todos los ligados probados y la eficacia de los agonistas probados se incrementó.. ¦ . . . _ Existe una diferencia observable entre . la respuesta celular de células de feocromocitoma de rata transfectadas con células M1 mAChR a NGF y bFGF por un lado (induce diferenciación) y a factor de crecimiento epidérmico, EGF por otro lado (induce proliferación). El perfil de proliferación de EGF cambió en la presencia de agonistas muscarinicos como EGF junto con agonistas muscarinicos inducidos una diferenciación acelerada. Tomados juntos, los resultados anteriores muestran que agonistas selectivos M 1 , solos o en combinación con cualquier endógeno o factores de crecimiento exógenamente administrados, pueden utilizarse para inducir efectos neurotróficos benéficos en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, tales como AD. 5 AF292, AF700 y AF704 se encontró también que son neurotróficos, y este efecto se bloqueo totalmente por atropina, indicando la naturaleza muscarínica del efecto.

EJEMPLO 34 10 Efectos en niveles A(3 in vitro Las nuronas corticales de rata mezcladas primarias infectadas con virus Semliki Forest recombinante que codifica ya sea APP695 o APP C99 humano o C111 (Fassbeder et al, PNAS, 98; 5856, 2001) se trataron con uno de los compuestos probados ?5.¾ AF102B¡ AFJ50_o AF267B, respectivamente durante 5-8 horas. En estos cultivos celulares. APP. se desdobla por ?- y ß-secretasa para producir ?ß, mientras a-secretasa destruye ?ß. Sin embargo, a- secretasa no se presenta ¡ntracelularmente. Las células se lisaron y ?ß precipitaron con W02 (anticuerpo anti ?ß). 20 Se probó el mecanismo de modulación ?ß utilizando C99 (y C 11 ) que son construcciones truncadas generadas a partir - de APP. A menos que APP, C99/C111 sean sustratos directos para ?-secretasa. Con ambas construcciones es posible evaluar directamente para actividad de ?-secretasa, mientras con APP esto 25 no es posible. Ambas construcciones son - cuando se compara con APP- sustratos ineficientes para -secretasa . Los efectos sinergísticos se evaluaron también con CDX (metil-¡>- ciclodextrina), un agente que extrae colesterol a partir de la membrana de plasma. CDX inhibe también producción A|>. Las células tratadas con CDX se trataron además al agonista muscarínico respectivo durante 5 minutos para reducir el contenido de colesterol. Los niveles A[> se redujeron hasta el tratamiento con los agonistas muscarínicos ambos en el lisato celular y medio en este sistema. AF267B fue al menos 5 veces más potente que AF150(S) para disminuir niveles ?ß, que son activos en el rango µ? Un efecto sinergístico entre AF267B y el agente que disminuye el colesterol general, CDX (5 mM) en su eficacia para disminuir A|> en este sistema a niveles ?ß indetectables, se observó. Se gb servó también en estos estudios que los presentes agonista M 1 , activan además a-secretasa, e inhiben _y-secreta_sa. AF267B reduce la liberación de fragmentos de similares rangos ?ß (todos los fragmentos están en 3-4 Kda) por aproximadamente 50%. Esto es equivalente a una reducción de actividad de y secretasa de 50%. Esto se evidenció también por una pérdida completa del fragmento p3 (un fragmento de APP resultando de desdoblamiento de y-secretasa) en AF267B células tratadas con AF267B (1mM) contra el control. Ningún otro compuesto han sido reportado con tal propiedad benéfica combinada en las diversas secretasas (</.-. ß- y y-). Los resultados indican que la combinación de un agonista M 1 con un agente que disminuye el colesterol, tal como estatina, permite la disminución de la dosis del agonista 1 y de este modo la reducción de posibles efectos secundarios del agonista M1.

EJEMPLO 35 AF267B disminuye ß-amiloides elevados en corteza en conejos hipercolesterolémicos El colesterol dietético induce ?ß-inmunoreactividad como Alzheimer en cerebro de conejo (Spark et al. Exp Neurol 1994; 126:88-94; Sparks Nutr Metab Cardiovasc Dis 1997; 7:255- 266). Se permitieron alimentar conejos machos blancos de Nueva Zelanda y agua ad libitum. Los animales se alimentaron ya sea por comida estándar o comida suplementada con 2% de colesterol por peso (Purina) durante 10 semanas. Un grupo de animales se inyectaron s.c. una vez al día con 0.9% de solución salina estéril y - el otr:o grupo de animales alimentados en colesterol se administraron con fármaco (AF267B; 1 mg/kg, s.c. peso corporal). Después de 10 semanas de tratamiento, los animales se sacrificaron y se evaluaron por ?ß inmunohistoquímico, cuando todas las secciones se tiñeron simultáneamente. Se observó ?ß neuronal limitado en corteza y pelo de conejos alimentados con comida. Entre los animales alimentados con colesterol inyectados con solución salina existen abundantes neuronas que contuvieron las ?ß identificables. Tales neuronas fueron observablemente más pequeñas que aquellas ocasionalmente encontradas en un animal control. El número de neuronas que expresan inmunoreactividad A[l se redujo 25-30% en los animales administrados AF267B, y la intensidad de- la inmunoreactividad se redujo aproximadamente 50%. Se observó también que las neuronas que expresan A|> después de tratamiento con AF267B fueron similares en tamaño en aquellas encontradas en cerebro control y por lo tanto más grandes que aquellas encontradas en cerebro de conejo inyectado con solución salina alimentada con colesterol. Estos resultados muestran que AF267B es efectivo para disminuir inmunorreactividad A|3 elevada en el cerebro después de hipercolesterolemia, y tiene un efecto neuroprotector en las neuronas que contienen estos péptidos A|3.

EJEMPLOJ36_ - AF267B disminuye ß -a mi lo i des elevados en corteza en conejos hipocolinérqicos (conejos lesionados) Se sabe que la denervación colinérgica cortical inducida experimentalmente resulta en elevaciones bioquímicas de concentraciones ?ß corticales y en deposición ?ß histológica (Beach et al, Neurosci Lett 283: 9-12, 2000) y esa administración de agentes selectivos M1 muscarínicos a animales normales disminuye concentraciones de CSF ?ß {Beach et al Brain Res. 905:220-223, 2001}. En el presente ejemplo, los animales con lesiones nbm se trataron con AF267B, un agonista selectivo de M 1 , para determinar si los incrementos que inducen lesión en CSF y A(í cortical podrían evitarse o reducirse por activación del receptor M1 crónico. Veintiocho conejos blancos de Nueva Zelanda hembras, de aproximadamente 2.5 kg cada una (adultos jóvenes) se utilizaron. Veintiuna lesiones recibidas del nucleus basalis magnocellularis (nbm) colinérgico. La lesión se logró con inyecciones i.c.v. unilaterales de una inmunotoxina que consiste de saporina de toxina ribosomal conjugada al anticuerpo monoclonal ME20.4 que se dirige contra el receptor de neurotrofina de afinidad baja, p75. El anticuerpo ME20.4 se hace contra mono p75 y también reconoce al conejo p75. La dosis de inmunotoxina fue 32.4 pg en 12 pl; esto se suministró al ventrículo lateral derecho 2 mm lateral a la vértice. Siete animales recibieron inyecciones i.c.v. de solución salina normal estéril (lesión falsa). Los animales . que reciben .. la . inmunotoxina se dividieron en 3 grupos de 7. Un grupo recibió dos veces diariamente inyecciones s.c. de AF267B; cada dosis fue 1 mg/kg durante una dosis diaria total de 2 mg/kg. Otro grupo recibió hemisalicilato de fisoestigmina en solución salina por bomba osmótica s.c. en una dosis diaria de 3 mg/kg. El tercer grupo recibió dos veces diariamente inyecciones s.c. de solución salina estéril. Los animales que recibieron una lesión falsa se implantaron con bombas osmóticas s.c. llenas con solución salina normal estéril. Los animales se sacrificaron 4 semanas después de la cirugía. En el caso de animales que 1 reciben inyecciones AF267B. todos los animales recibieron una inyección final aproximadamente 2-3 horas antes del sacrificio. Cuatro animales murieron prematuramente [(1 animal control y 3 animales tratados con fisoestigmina) , 1 a hemorragia post-op. 1 se sacrificó después de desarrollar ataques incontrolables, 1 se sacrificó debido a parálisis de extremidad trasera inducida por inyección i.m. de agentes anestésicos antes de la cirugía y 1 se encontró muerto sin causa de muerte encontrada en autopsia)] y se excluyeron a partir del análisis. El fluido cerebroespinal se tomó a partir de la cisterna magna de todos los animales al tiempo de sacrificio; el cerebro se removió y se cortó coronalmente en 0.5 cm de cortes. Un corte, en el nivel del hipotálamo (este corte tiene hipocampo, así como una corteza), se fijó en 4% de paraformaldeh ido y se procesó para tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo a A(3. Los otros cortes se. congelaron en hojas de hielo seco (los otros cortes son los cortes coronales de 0 5 cm no fijos de cerebro, tronco cerebral y cerebelo). El análisis de transferencia western para A (3 y SAPPa se realizó en el CSF a partir de 2 de los 4 grupos, aquellos con lesión nbm y tratamiento de solución salina normal y aquellos con lesión nbm y AF267B. La cuantificación de la banda de 4 kDa que representa CSF ?ß mostró una disminución notable en CSF ?ß en los animales tratados con AF267B contra los animales control (p = 0.05, no emparejados, prueba t de dos colas). No hubo diferencia significativa en la intensidad de las bandas que representan sAPPa. Las secciones de los mismos 2 grupos de animales teñidos ¡nmunohistoquímicamente para ?ß revelaron deposición A [5 vascular así como depósitos difusos perivascu lares en todos los animales. El estudio de lesión y tratamiento mostró que ambos AF267B y la fisoestigmina redujeron deposición histológica y niveles bioquímicos de ?ß. La deposición ?ß histológica se redujo a 6.4% y 12% del grupo lesionado, no tratado para fisoestigmina y AF267B, respectivamente. El análisis de varianza encontró que los dos grupos de tratamiento diferenciados significativamente (p = .01) con respecto a la deposición ?ß (deposición ?ß fue elevada en los animales lesionados no tratados contra baja en los animales que se lesionaron y trataron con AB267B) y que tanto AF267B y grupos tratados con fisoestigmina diferenciados significativamente a partir de grupo no tratado, lesionado (p < .05, Fisher's LSD) con respecto a deposición ?ß (deposición ?ß fue elevada de los anjmales lesionados no tratados contra baja en . los animales lesionados tratados con AB267B o fisoestigmina). Los resultados muestran que el tratamiento AF267B de animales con lesiones nbm reducen los incrementos en CSF ?ß y deposición ?ß de cerebro que se inducen por la lesión, e indican que los agonistas muscarínicos M1 tales como AF267B pueden utilizarse como terapia preventiva para AD.

EJEMPLO 37 Prevención de cite-toxicidad y muerte celular programada (apoptosis) inducida por varios agravios (privación a partir de factores de crecimiento o factor de crecimiento" encontrado en suero, fí-amiloides, tensión oxidativa) Las células feocromocitoma de rata confluente transfectadas con los cultivos M1 inAChR se despredieron con tripsina, se lavaron y se colocaron en placas, en placas de 24 pozos, 6 pozos, 60 mm o 100 mm que se pre-recubrieron con colágeno de cola de rata (Sigma, Israel). Varios experimentos se realizaron en un medio libre de suero. Para ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio (MTT), las células (1.5x104) se colocaron en placas, en placas pre-recubiertas con colágeno de 96 pozos, en un medio libre de suero, con o sin varios fármacos durante 24 horas. Para diferenciación, las células se cultivaron en la presencia de .1 % de FCS y 1 % .de HS. con adición de 50 ng/ml de NGF durante 7 días, para provocar diferenciación completa. Las células se cultivaron ya sea en placas de 100 mm (5x105 células por placa; MTT, actividades clasificadoras activadas con fluorescencia (FACS), o en Chamber-Slides (1.5x104 célula; TUNEL) que se pre-recubrieron con colágeno, en una cubierta de vidrio de 13 mm pre-tratadas con Poli-L-Lisina en placas de 24 pozos (7500 células por pozo; DAPI). Después de 7 días, las células se lavaron y el medio se reemplazó ya sea libre de suero, o las células se desprendieron y se recubrieron en un medio libre de suero. Las células en un medio libre de suero se trataron ya sea con péptido ?ß que se "añejaron" previamente o con H2Ü2. Los compuestos probados se agregaron junto con los agravios para el tiempo indicado, a menos que se establezca de otra manera.

Ensayo de viabilidad celular: Se colocaron en placas en placas de 96 pozos en un medio de 100 pl. Después de la exposición a varios tratamientos, se agregó a cada pozo 10 µ? de 5 mg/ml de solución MTT bromuro de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio¡ Sigma, Israel] en solución salina regulada con fosfato (PBS). Las placas se incubaron durante 2 horas a 37°C seguidas por adición de ácido clorhidrico-isopropanol (100 µ? de 0.04N de HCI/isopropanol). Las placas se leyeron utilizando un lector ELISA a una longitud de onda de, 570 -nm .... .· ¦ „ .. .. _ .

Tinción nuclear de ADN: Se cultivaron las células y se trataron en cubiertas de vidrio. Después los tratamientos, las células se fijaron en metanol frío durante 5 minutos a -20°C seguidas por tratamiento con acetona fría a 4°C durante 2 minutos y lavando en PBS. Las cubiertas de vidrio se tiñeron fluorescentemente con DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol; 5 mg/ml, Sigma, Israel) en agente de intercalación que permite la visualización de condensación de y cromatina en el núcleo celular, durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces con PBS, montadas en una solución de giicerol que contiene 22 mM de 1,4- diazabiciclo(2,2,2)octano (Sigma, Israel) para evitar desvanecimiento, y vista para morfología de cromatina nuclear con un microscopio fluorescente. Las células apoptóticas y viables se contaron (200 células por cubierta de vidrio, cada experimento se realizó en duplicados).

Ensayo de TUNEL: Este método revela fragmentación de ADN en células apoptóticas individuales. El método TUNEL (etiquetado final de muesca dUTP mediada por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT)) marca enzimáticamente de fragmentos de ADN en los extremos 3?? (representando rompimientos de hebra ADN) con fluoresceína-dIJTP Boehringer Mannheim, Alemania), Brevemente, después del tratamiento, las células cultivadas en transparencias de cámara se fijaron con solución de paraformaldehído (4%) en PBS, pH 7.4, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, las células se permeabilizaron utilizando 0.1% de Tritón X-100, 0.1% de solución de citrato de sodio, durante 2 minutos en hielo (4°C), se lavaron con PBS y se agregó 50 µ? de la mezcla de reacción TUNEL en cada muestra durante 1 hora a 37°C, en una cámara humidificada. El reactivo Evans Blue (diluido 1:2000 en PBS) se agregó durante 5 minutos y las transparencias se observaron con microscopio de fluorescencia.

Análisis del Clasificador Celular Activado con Fluorescencia (FACS): Se diferenciaron células durante 7 días y desprendieron a partir de placas con Tripsina. Se volvieron a colocar en placas 106 células en placas recubiertas con colágeno de 50 mm en medio libre de suero en presencia o ausencia de varios tratamientos, los gránulos centrifugados de 200 g se prepararon y se resuspendieron en 300 µ? de PBS, 4 mi de metanol frío (-20°C) se agregaron a cada tubo de prueba y la fijación se llevó a cabo durante .15 minutos a -20°C. Las células se lavaron en PBS, se giraron y se resuspendieron en 1 m! de PBS. Cinco microlitros de yoduro de solución clásica de yoduro de propidio (Sigma; 10 mg/ml) y 5 µ? de 20 mg/ml de solución de ARNasa A se agregaron durante 5-10 minutos a temperatura, ambiente. La fluorescencia de núcleo individual se midió utilizando Clasificador Celular Activado con Fluorescencia (FACScan; Becton Dickinson Corp.) estimulado a 488 nm de longitud de onda y recolectado a través de filtro BP 575 ± 21. Los datos se analizaron por sistema de cómputo Cell Quest. Por este método fueron capaces de medir el contenido de ADN de las células (células apoptóticas que tienen menos ADN). Las células en fase G1 del ciclo celular son después mitosis y tienen menos ADN que las células en fase G2/M (antes y durante la mitosis). Las células apoptóticas se identificaron como 1 la fase pre-G . El ensayo TT mide los cambios anteriores primarios dentro de las células, reflejando la integridad de la cadena de transporte de electrón' y proporciona una lectura de actividad redox celular. Esta prueba es un indicador previo, específico del mecanismo de muerte celular mediada por ß-amiloide y puede utilizarse para detectar respuesta inhibidora rápida. Las células de feocromocitoma de rata no diferenciadas, muertas por inanición transfectadas con células mAChR M 1 redujeron solo la viabilidad celular por 10-20% y este efecto se aumentó adicionalmente (hasta 50-60% de inhibición) incrementando concentraciones del pétpido ß-amiloide de longitud completa neurotóxico (ß-??-42) y su fragmento, ((J-A25-35) (0.5-20 µ?). Cuando tales células se despojan por suero y se tratan con ß-amiloides, en la ausencia o presencia de agonistas muscarínicos, la muerte celular inducida por ..P-A25-35. (1 -^µ. ) después de_ .24. horas , se atenuó significativamente por la adición de carbacol o AF292, AF150(S) y AF267B. El potencial de carbacol, AF150(S), AF267B y AF292 para proteger células transfectadas con células M1 mAChR a partir de tensión oxidativa directa inducida por H202 se probó. Estos agonistas se observaron para proteger las células a partir de toxicidad inducida por H202- Sorprendentemente, los agonistas muscarínicos se detectaron en compuestos que tienen un farmacóforo muscarínico al cual una porción antioxidante se une. Estos incluyen AF604, AF700 y AF704, las estructuras de las cuales incluyen una porción agonista M1 selectiva unida a una porción antioxidante. Notablemente, AF700, AF703, y en particular AF704 y AF704B son más efectivas que el carbacol y AF267B contra citotoxicidad inducida por ß-?25-35 ( 10 y 20 µ?). Utilizar DAPI, un agente intercalante que permite la visualización de condensación de cromatina en el núcleo celular, se siguió muerte celular apoptótica después del tratamiento con ?·.ß o H202. Las células tratadas con ?ß mostraron la morfología de células apoptóticas que se contraen y pierde sus procesos La tinción DAPI reveló condensación nuclear y cromatina fragmentada que es indicativa de procesos apoptóticos. AF150(S) y AF267B se encontraron para proteger estas células a partir de apoptosis y los procesos comparables a neuríticos son bien observados. Un incremento de dos veces en_ la muerte celular apoptótica se observó después de la inanición durante 24 horas de las células transfectadas con el receptor 1 (pero no en las células no transfectadas). AF150(S) y AF267B protegen significativamente la muerte celular apoptótica inducida por inanición. La atropina (un antagonista muscarínico no selectivo) y pirencepina (un antagonista selectivo M1), invirtió el efecto de protección de los agonistas muscarinicos únicamente en las células transfectadas M1. El tratamiento de células transfectadas con M1 mAChr con G>-?25-35 (25 PM) ° )-?,.42 (25 µ?) además incrementado por 1.5-2 veces la muerte celular apoptótica sobre la inanición. El efecto tóxico selectivo de ambos péptidos se mostró utilizando el péptido invertido (|">-A35-25) qué no indujo apoptosis. La apoptosis que induce A|l se evitó por AF150(S) y AF267B únicamente en las células transfectadas M1, mientras los antagonistas muscarínicos invierten estos efectos. El agravio oxidativo inducido por H202 (25 y 50 µ?) incrementó la población apoptótica por 1.5 y 2.5 veces sobre la inanición, respectivamente, AF150(S) y AF267B evitó apoptosis inducida por H202 y su efecto fue selectivo a activación M1 mAChR, ya que la atropina invirtió el efecto. El método TUNEL también revela la fragmentación de ADN que ocurre después de la apoptosis en células apoptóticas individuales. El número de células teñidas positivas TUNEL n c r é rñ éñ t "ad as "d é~s~p u é s de tj a t a m i e n t o de 25 - 35 ß - a m i [o i d e d e -25 µ? se indica en proceso apoptótico, mientras AF150(S) (100 µ?) fue capaz de bloquear la apoptosis de manera que la mayoría de las células fueron teñidas TUNEL negativas. Las células retuvieron sus procesos, y únicamente el citoplasma se tiñó de rojo. La cuantificación de población apoptótica se realizó por la medición de contenido de ADN celular, después de varios tratamientos utilizando análisis FACS. Los histogramas de ADN obtenidos a partir de cultivos neuronales despojados de suero en las células transfectadas M1 revelaron la apariencia de población celular apoptótica con contenido de ADN degradado (subdiploide) (M1 = fase pre-G1). Aproximadamente 20% de las células totales experimentaron muerte apoptótica después de la inanición durante 24 horas. Carbacol, AFI150(S) y AF267B, las células protegidas de la muerte apoptótica durante la inanición, ß-amiloide 25-35 o (3-amiloide 1-42 incrementaron la población apoptótica a 30-35% de las células. La co-adicíón de carbacol, AF150(S) o AF267B redujo la población apoptótica significativamente, aún debajo de los valores observados después de la inanición. El efecto de los agonistas muscarínicos se bloqueo por 10 µ? de atropina indicando el envolvimiento de activación de M1 mAChR en los efectos de supervivencia. Además, en células no transfectadas, los agonistas fueron inefectivos en inanición y apoptosis inducida por ß-amiloide.

EJEMPLO 38 Protección contra muerte celular inducida por N-metil-D-Aspartato (NMDA) Los cultivos celulares de cerebro de rata primarios derivados de cerebros de rata embriónica de 18-19 días (ratas Sprague Dawly) se prepararon por mecano-disociación. Los cerebros se removieron en solución salina Equilibrada Gey fría (GBSS, Gibco, BRL) conteniendo 6 mg/ml de glucosa. El hipocampo y la corteza se separaron y se transfirieron a Medio Eagle Modificado con Dulbecco (DMEM, Biological Industries, Bet- Haemek, Israel), que contiene 6 mg/ml de glucosa, 2 mM de L- glutamina (Biological Industries Bet-Haemek, Israel), 1000 I.U/ml de Penicilina G de sodio y 3% de ultrosere G (Gibco, BRL). Después de la disociación celular utilizando una pipeta Pasteur pulida con fuego, la suspensión celular resultante se colocó en placas en cultivos de tejido pre-recu biertos con poli-L-lisina (30,000-70,000 PM, Sigma) 1 mg/ml en regulador de borato Las células se colocaron en placas a una densidad de 80000 células/pozo en una placa de cultivo de 96 pozos, o a 40000 células/pozo (células del hipocampo) y 60000 células/pozo (células corticales) en placas de cultivo de 12 pozos. Los cultivos celulares se mantuvieron en un medio de cultivo de crecimiento a 37°C 5% de C02/95% de 02 durante aproximadamente 2 semanas. La proliferación celular Glial se detuvo después de 3-4 días en cultivo" "por la adición de mezcla de J5-fluoro-2'-desoxiuridina/uridina/citosina arabinosida (concentración final de 5 mM). Para evaluar la exposición a NMDA, el cultivo celular cortical y de hipocampo en 10 días en cultivo colocado en placas de cultivo de 96 pozos se expusieron a 100 ó 200 µ? de NMDA (RBI, USA). La potencia neuroprotectora de compuestos a partir de la fórmula I se comparó a aquella producida por 20 µ? de MK801 (un antagonista receptor de NMDa no competitivo). Los cultivos celulares se expusieron también en paralelo a medio único y se refirieron como controles. Para producir lesión neuronal dispersa, todas las exposiciones se llevaron a cabo durante 20-24 horas antes de la evaluación anterior de muerte celular neuronal. La neurotoxicidad se evaluó cuantitativamente midiendo la extensión de actividad mitocondrial en células vivas utilizando ensayo basado en {2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazolio- sal interior de carboxanilida]} (Kalusner, Biotechnol 5:770-786, 1987; Lipman et al, Cytotechnol 8:129-176, 1992). AF150(S) y AF267B fueron efectivos en la prevención de muerte celular. La potencia neuroprotectora de 100 µ? de estos agonistas contra 100 µ? de toxicidad inducida por NM DA fue similar a aquella producida por 20 µ? de MK801, pero ligeramente menor contra 200 µ? de NMDA.

EJEMPLO 39 1. Efectos en hiperfosforilación de proteína tau: _ - , Se cosecharon cultivos celulares primarios como se describe en el EJEMPLO 38. Los sobrenadantes celulares se removieron y las células se lavaron una vez en un medio antes de la adición de solución salina regulada con fosfato frío pH = 7.4 (PBS) que contiene 0.2 mM de EDTA. Las células se rasparon utilizando un rubber policeman (manguito de goma de caucho), transferido a tubos Eppendorf, y se centrifugaron a 4°C. Los gránulos celulares se resuspendieron en regulador de lisis (EDTA 5 mM, Tris 50 mM, Tritón 1%, NaCI 150 mM) conteniendo inhibidores de proteasa (5 unidades/ml de apronitina, 5 mg/ml de pepestatina, 5 mg/ml de leupeptina y 0.1 mM de PMSF, Sigma) y se sometieron a centrifugación a 4°C. Los sobrenadantes se transfirieron en tubos Eppendorf y SE mantuvieron a -20°C hasta que se analizaron. La extensión de inmunoreactividad tau-1 (un anticuerpo que reconoce un tau no fosforilado en Ser199) se determinó por transferencias western. AF150(S) y AF267B fueron efectivos para elevar inmunoreactividad tau tanto en cultivos celulares corticales e del hipocampo en un rango de dosis de 1-100 µ?. 2. Efectos en fosforilación y antagonismo tau de efectos inducidos por A [3 en fosforilación tau. Después del diseño experimental de Sadot et al., J . Neurochem. 66:877-880, 1996, incluyendo inmunotinción con ¾nticue"rpo ÁT8, un anticuerpo que reconoce tau fosforilajdo-, en Seri 99/202 se encontró que AF267B, AF292, AF704 y AF704B (100 pm) indujo desfosforilación de proteínas tau en estos cultivos celulares al nivel control. Al unir un agonista M1 a una porción antioxidante la fosforilación tau puede disminuirse, proporcionando una nueva estrategia terapéutica en una variedad de estados de enfermedad del CNS debidos a daño combinado debido a tensión oxidativa e hiperfosforilación tau.

EJEMPLO 40 Efectos en síntesis ApoE y secreción en cultivos de astrosito del tipo 1 primarios de rata Los cultivos primarios de astrositos del tipo 1 se derivaron de la corteza de ratas Sprague Dawley. Los compuestos probados se disolvieron en medios de cultivo y se agregaron a células durante 24, 48, 72 y 96 horas. Los medios se removieron entonces y se mantuvieron congelados hasta que los niveles de proteína ApoE se evaluaron por análisis de inmunotinción como se describe en Poirier et al Neuroscience 55: 81-90 (1993). Alternativamente, los métodos de Cedazo-Minuez et al [neurosci 105: 651-661, 2001} pueden emplearse. AF102B a 96 horas se inactivo hacia el metabolismo ApoE (síntesis y secreción). El compuesto AF267B y a AF150(S) de menos extensión, inhibe la producción de ApoE con el tiempo con un efecto máximo en 96 horas. Los efectos observados (60-80%. de jnhjbición) ocurrieron a _ 0.1 nM, a una concentración muy baja del compuesto. Estos resultados indican que este compuesto inhibe producción de ApoE, incluyendo ApoE4 en astrositos de rata, y así pueden utilizarse en terapias en donde la inhibición de producción de ApoE se indica.

EJEMPLO 41 Competición de ensayo de unión para receptor muscarínico con un agonista como la sonda etiquetada. La oxotremorina-M (OXO-M) es un agonista que se une a tocios los subtipos del receptor muscarínico con afinidades similares. La capacidad de un compuesto probado para desplazar la unión [3H]OXO-M proporciona una medida para la afinidad del compuesto de prueba al receptor contra el sitio de unión. La competición de la unión de [3H]OXO- con AF292 y su enantiómero, AF291, tiene valores K, de 0.27 y 6.56 µ? respectivamente como se compara al carbacol agonista completo que muestra un K¡ de 0.05 µ?. La pirencepina (PZ), un antagonista muscarínico, se une preferencíalmente a los receptores 1 mientras OXO-M se une a todos los subtipos mAChR no selectivamente; la relación entre los valores K¡ para PZ contra aquel de OXO-M puede ser indicativo de la selectividad del compuesto probado. Entre más pequeña es la relación, más selectivo M1 es el compuesto de prueba La competición de unión de [3H]PZ a membranas corticales de rata con AF292 *(K¡ = 1.39 µ?)~ y su enan! ómero AF291 (K¡ = 10.7 µ?) muestra que AF292 es el enantiómero activo. La relación de OXO-M/PZ es -0.36 mostrando una selectividad moderadamente elevada para el receptor M1.

EJEMPLO 42 Selectividad del receptor muscarínico 1. Estudios funcionales en cultivos celulares tra nsfectados con subtipos del receptor muscarínico humano 1.1 AF292 se probó para sus propiedades agonísticas o antagonísticas, su potencia, y su selectividad hacia receptores M1 contra M3 y M5 humanos para activar hidrólisis de fosfoinositida (Pl) de acuerdo al método de Gurwitz et al Eur. J. Pharmacol. 267, 21, 1993. Los efectos de los compuestos fueron sensibles a la atropina para activar hidrólisis Pl demostraron su naturaleza muscarínica. AF292 y AF267B se encontraron ser agonistas parciales en el receptor M 1 mostrando -35% y -66% de actividad, respectivamente, contra carbacol con respecto a rendimiento Pl medido en este paradigma. No se observó actividad en el receptor M3 y M5 con AF292, como se compara con AF267B (-30% contra carbacol en M3). AF292 fue tanto un agonista parcial en el receptor M1 y un antagonista débil en el receptor M3 (pKb = 0.66 µ?), sin actividad agonística en M2 o M5 mAChR. Los efectos en el receptor M2 se midieron en cultivos celulares modificados que muestran un incremento en iones de Ca intracelulares después de la acíivación con carbacol Á pesar de uñ incremento 8 veces en actividad inducida por carbacol en M2 mAChR, AF292 fue inactivo como un agonista en todas las concentraciones probadas (10"9-10 3 M). 1.2 AF292 se probó para sus propiedades agonísticas o antagonísticas, su potencia y su selectividad hacia los receptores M1 contra M3 y M5 humanos activando hidrólisis del ácido araquidónico (AA) de acuerdo al método de Gurwitz et al. Eur. J. Pharmacol. 267, 21, 1993. AF292 fue más potente en liberación de AA inducida por M1 mAChR (80%) que en rendimiento Pl (35%), pero aún inactivo como un agonista (liberación AA) en M3 y M5 mAChR. De este modo AF202 es un agonista más efectivo en liberación de AA mediada por M 1 mAChR (mediada a través de fosfolipasa A2) que en Pl (mediada a través de fosfolipasa C). En resumen, no únicamente es AF292 altamente selectivo para M1 mAChR como un agonista, pero también exhibe distinta activación de proteínas G selectas (por ejemplo, no todas las proteínas G se activan en la misma extensión por AF292, diferente del carbacol, - que actúa como un agonista mAChR no selectivo que activa todos estos receptores en la misma extensión. 2. Estudios de unión a receptores muscarínicos y otros sistemas 2.1 En estudios de unión competitivos contra los siguientes ligandos para receptores mAChR, AF267B se encontró ser altamente selectivo por los siguientes subtipos M( mAChR: QNB [Antagonista Muscarinico en Membranas .Corticales de Rata (CTX)] (K¡ = 49.6 ± 9 pM); QNB [Antagonista Muscarinico en Membranas Cerebelares de Rata] (K¡ = 45.2 ± 10.8 µ?); Pirencepina (Antagonista selectivo , en CTX) (K, = 3.74 ± 0.59 pM); Oxotremorina-M (Agonista Muscarinico CTX) (K¡ = 1.62 ± 0.34 uM)]; contra Serotonina, 5HT3 51.3% de inhibición a 10~4 M; Opiodes/Opiato, 52.5% de inhibición No Selectiva a 10"4 M; sin unión en todo a Adrenérgico (A), a1A, Adrenérgico; a1B, Adrenérgico; 2A (Recombinante Humano); Adrenérgico, a2B, Adrenérgico, a2C (Recombinante Humano); Adrenérgico, ß1; Adrenérgico, ß2; Benzodiacepina (BZD), Periférica; Clozapina; Dopamina; D1; Dopamina, D2 (Recombinante Humano); Dopamina, D3 (Recombinante de Rata); GABA A, Sitio Agonista; GABA A, Benzodiacepina, Central; Glutamato, Sitio AMPA; Glutamato, Sitio Kainato; Glutamato, Sitio Agonista NMDA; Glutamato, NM DA, Glicina; Glicina, Sensible a Estricquinina; Histamina, H1; Histamina, H2; Histamina, H3; Nicotínico; sitio Gangliónico; Nicotínico, Sitio neuronal; Serotonina, 5HT1A (Recombinante Humano); Serotonina, 5HTIB; Serotonina, 5HT4: Serotonina, 5HT6 (Recombinante de Rata); Serotonina, 5HT7 (Recombinante de Rata); Colina Acetiltransferasa; Decarboxilasa del Ácido Glutámico; Óxidos de Monoamina A, MAO-A; Oxidasa de Monamina B, MAO-B. 2.2 En estudios de unión, AF292 (10 µ?) se encontró ser altamente selectivo para los subtipos de mAChR {M1 (humano) (55 % )7 lv2 ? h u ma n o) a: adenosina A1 (humana); A2A (humana), adenosina A3 (humana); alfa adrenérgico (no selectivo); alfa 2 (no selectivo); beta 1 (humano); angiotensina, AT1 (recombinante humano); benzodiacepina (BZD) (central); bradiquinina, B2 (recombinante humano); colecistoquinina (CCKA) (recombinante humano), (CCK1); dopamina D1 (recombinante humano); D2S (recombinante humano); endotelina, ETA (recombinante humano); GABA (no selectivo), galanina, GAL2 (humana); quemoquina, IL-8B (recombinante humano (CXCR2); quemoquina, CCR1 (recombinante humano); histamina, H1 (central), histamina. H2: melanocortina. MC4 (recom b ina nte humano); melatonina, ML1. taquinina, NK2 (recombinante humano); NK3 (recombinante humano); neu ropéptido, Y1 (humano); neuropéptido. Y2 (humano); neurotensina, NT1 (recombinante humano) (NTS1); opiato, delta 2 (recombinante humano) (DOP); opiato, kappa (KOP); opiato mu (recombinante humano) (MOP); orfanina, ORL1 (recombinante humano) (NOP), serotonina, 5-HT|A (recombinante humano); serotonina, 5-HTie; serotonina, 5-HT2A (recombinante humano); serotonina, 5-HT3 (recombinante humano); serotonina, 5-HT5A (recombinante humano), (5-ht5A); 5-HTe (recombinante humano); 5-HT7 (humano); somatostatina, sst (no selectiva); péptido intestinal vasoactivo; VIP1 (humano) (VPAC1); vasopresina V1a (recombinante humano); canal Ca2+ (L, sitio de verapamilo); canal K + V; canal SK + Ca; canal Na+ (sitio 2); canal Cl~; transportador de norepinefrina NÉ (humano).

EJEMPLO 43 Efectos en microcebes envejecidos Los microcebes envejecidos muestran déficits cognitivos similares y lesiones cerebrales a aquellos observados en seres humanos envejecidos y en pacientes AD. De este modo, esto es un buen modelo animal para AD, imitando los tres mayores sellos en AD (placas (?ß), filamentos helicoidales emparejados (t hiperfosforilado y agregado) y disfunción cognitiva). Este modelo puede también utilizarse para imitar MCI conductivo a AD. En este modelo AF150(S) [tratamiento crónico durante 18 meses]: i) mejoró los deterioros cognitivos y conductista ii) disminuyó proteínas t hiperfosforiladas y el número de neuronas que contiene la proteína t agregada (por ejemplo, indicativo de cerebros enfermos) y el número de filamentos helicoidales emparejados; e ¡ii) disminuyó astrogliosis e inflamación. Esto indica que AF150(S) puede utilizarse como un fármaco para tratar o modificar los efectos de AD pero no produce tolerancia después de tratamiento prolongado.

EJEMPLO 44: Agonistas M1 reduce deterioros neuroconductístas después de la lesión de cabeza cerrada en ratones Se indujo la lesión de cabeza cerrada (CHI) en ratones "¿o m ó" 'se de¾cfi bV~ C h en" ef a G. , ~J'.~'N'e u 'fot ra u m a , 15: 231-237. 1998. Se evaluaron resultados de severidad neurológica (NSS) utilizando una batería de 10 parámetros (10 = peor resultado, 0 = función normal). Los compuestos probados (1 mg del compuesto/kg de peso corporal) contra animales tratados con placebo se inyectaron ip 5 minutos después de CHI contra animales tratados con placebo. Los ratones tratados se evaluaron en 1 hora, para determinar la severidad de lesión, y en 24 y 48 horas para determinar la recuperación. La NSS fue como sigue: 1. Control (N = 10): 7.80+/-0.25 (1h); 5.30+/-0.33 (24h); 4.20 + /-0.47 14 (48h). 2. AF150(S) (N = 10): 8.00 + /-0.21 (1h); 4.3 O + /-0.26 * *(24 h ) : 2 90 + /-0 23b (48h); AF267B (N = 9): 7.89 + /-0.26 ( 1 h ) ; 3.67 + /-0.24* (24h); 2.89 + /- 0.26c (48h) [*p = 0.03; **p = 0.03; ap = 0.009: p = 0.005; cp = 0.004]. Todos los compuestos probados mostraron una mejora altamente significativa en las funciones motoras. La recuperación fue más rápida en animales tratados con AF267B en dos pruebas de equilibrio (rango asimilativo) - [22% contra 80% en control en 24 horas (3 cm) o 33% contra 80% en control en 48 horas (2 cm)].

EJEMPLO 45: AF150(S). AF267B en memoria social en ratas El reconocimiento olfatorio social en roedores ha sido mostrado para evaluar memoria a corto plazo y para ser sensible a fármacos colinérgicos (Dantzer et al. Psychopharmacol. 91:363-368," T9'8'7'f "P e r ilfefa I " P'sy c h o p h a rrñ a c ?? 97 : ~262 -268 ~ ~f 989 ) . Se probó en este ejemplo el efecto de AF150(S) y AF267B en comportamiento indagatorio de ratas simples. Se utilizaron 12 ratas macho Wistar, de 400-530 gr (4-5 meses de edad). Las ratas se alojaron individualmente 14 días antes de la prueba. Las ratas Wistar jóvenes de 40-50 gr (en la llegada) se mantuvieron en grupos de 6 y sirvieron como estímulo social para las ratas adulto. Los animales se mantuvieron a 21°C ± 1, con un ciclo de luz-oscuridad invertido (luz de 2:00 p.m. a 2:00 a.m.). Las sesiones se condujeron 7 horas en la parte oscura del ciclo luz/oscuridad, bajo iluminación roja. Se colocaron las ratas adulto en un cuarto de iluminación débil 1.5 horas antes del comienzo de la prueba social. Todos los jóvenes se aislaron en jaulas durante 30 minutos antes del inicio del experimento. En el comienzo de la prueba, se colocó una rata joven no familiar en la jaula de una rata adulto durante 5 minutos. Se registró el tiempo gastado por la rata adulto en investigar la rata joven. La rata adulto se trató inmediatamente entonces (1-2 minutos) con vehículo o compuesto de prueba. Dos horas después, el mismo joven se presentó a la misma rata adulto durante un periodo de otros 5 minutos, un tiempo cuando normalmente el estimulo joven no está bien definido (es decir, la rata adulto investiga al joven por la misma cantidad de tiempo como durante la primera presentación). De este modo, bajo la influencia de una memoria pretendida que mejora el fármaco, el tiempo- gástacio én i ~invésIig r~ármis"mo~jóveñ se espera" reducirse. Dos días después, un joven, diferente a uno utilizado para la primera exposición, se presentó a la rata adulto, 2 horas después de la administración del vehículo o fármaco. Cualquier reducción en exploración social de este joven diferente se considera así como reflejando un efecto no específico del fármaco (es decir, sin memoria relacionada). En ninguna ocasión fue un sujeto probado dos veces con el mismo animal de estímulo joven, ni fue un joven utilizado más de una vez en un periodo de 48 horas. Se administraron a las ratas adulto AF150(S) o AF267B (0.5, 1 y 5 mg/kg p.o.) o vehículo, solución salina regulada con fosfato (PBS) inmediatamente después de la primera exposición a la rata joven. El tiempo gastado en in estigación social de la rata 5 joven de estímulo se midió (en segundos) y luego se expresó para cada animal como la relación de la segunda exposición a la primera exposición (Relación de Duración de Investigación (RID)). Esta transformación de RIDs se utilizó para minimizar posibles individuos así como variaciones día a día en rendimiento de base 10 (Pe rio et al Psychopharmacol. 97: 262-268, 1989). Por lo tanto cualquier reducción en tiempo de investigación durante la segunda exposición conducirá a un RID que es menor de 1, indicando que el animal reconoce a la rata joven. El análisis para medición repetida se hizo por una ANOVA de 3 vías y comparaciones post 15 hoc se hicieron por análisis de contrastes de efectos principales ~ ~ si p é"s~~~~ — — - — - AF150(S) y AF267B disminuye el tiempo de investigación del mismo joven comparado ai grupo placebo en una manera dependiente de dosis. Esta mejora de memoria no puede 20 atribuirse a efectos no específicos, ya que no se observó cuando un joven diferente se utilizó para la segunda exposición. Ambos compuestos parecen de este modo facilitar la memoria social en ratas simples. No se encontró ninguna diferencia significativa entre las 25 RIDs totales de los dos compuestos, pero la interacción entre el joven similar/diferente x dosis de ambos fármacos se encontró estadísticamente significante, [F(3/33) = 14.9, p<0.0001]. Específicamente, ambos compuestos reducen significativamente el tiempo de investigación del mismo joven en todas las tres dosis probadas (p<0.001) en relación al placebo. Además, una diferencia significativa se encontró entre las RIDs de 0.5 mg/kg y las dos otras dosis (p<0.05). Las RIDs observadas para 1 y 5 mg/kg fueron significativamente inferiores que aquellas observadas para 0.5 mg/kg. Se debe observar que una diferencia significativa se encontró entre las RIDs del mismo grupo joven y un grupo joven diferente en todas las tres dosis (p<0.01-p<0.001 ).

EJEMPLO 46 Efectos de AF267B y AF292 en evidencia pasiva (PA) en ratas t rat ád a's" có 'ñTcol i rí t ox i ría '( A F 6 ? )".""" " ~ x El procedimiento general seguido se describe en Fisher et al, J. Pharmacol. Exptl. Therp., 257: 392, 1991. Se preparó AF64A (10 mM) por hidrólisis alcalina de ratas con mostaza. HCI. acetiletilcolína, anestesiadas con Equitesina (0.3 ml/100 g, IP) se inyectaron bilateralmente por aplicación estereotáxica de AF64A (3 nmoles/2 µ?/lado) o solución salina (2 µ?) en los ventrículos cerebrales laterales (AP = -0.8; L = ± 1.5 mm para bregma; y DV = -4.8 mm para superficie del cráneo). Se hicieron las infusiones a través de una bomba de microinyección CMA 100, a través de una cánula de inyección de calibre 30\ en una velocidad constante de 0 25 µ?/min. La cánula se dejó en el lugar durante 4 minutos después de la inyección para permitir la difusión de la solución en los ventrículos. Los compuestos de la solución salina regulada con fosfato (PBS) se administraron una vez p.o., inmediatamente después del choque. La retención se probó 72 horas después del entrenamiento. Se encontró una diferencia significativa en la latencia inicial entre todas las ratas inyectadas con AF64A (29.02±3.1s) y todas las ratas inyectadas con solución salina (20.55 ± 1.95s), F(1/72) = 5.13, p<0 05. Se encontró una interacción estadísticamente significativa entre el tratamiento con inyección de AF64A x fármaco, F(3/72)=11.99, p<0.001, en la latencia de retención. La latencia de retención de ratas inyectadas con AF64A tratadas con PBS (67.1±18.9s) fue significativamente más corta (merrioria'mas pobre) q~ue aquella de las_ ratas inyectadas con solución salina tratada con PBS (455.3±55.1) (p<0.001, por análisis de contrastes de efectos principales simples). Las latencias de retención de ratas inyectadas con AF64A tratadas con AF267B, 0.1 mg/kg (440.7±46.4s ) , y AF292, 1 mg/kg (447±46.8s), fueron significativamente más prolongadas (mejor memoria) que aquella de las ratas inyectadas con AF64A tratadas con PBS (p<0.001, por análisis de contrastes de efectos principales simples). No se encontró ninguna diferencia significativa entre la latencia de retención de ratas tratadas con AF64A con AF267B, 0.03 mg/kg (105.7 ± 31.9s), y aquella de ratas AF64A tratadas con PBS. No se encontraron diferencias significativas entre las latencias de cualquiera de los grupos inyectados con solución salina. Las ratas inyectadas con AF64A demostraron un claro deterioro en retención de la tarea PA. La dosis efectiva mínima de AF267B para atenuar deficiencias de retención que inducen AF64A en menos de 0 1 mg/kg, p.o. Ambas AF267B, 0.1 mg/kg y AF292, 1 mg/kg en la tarea PA, son efectivas para mejorar las deficiencias de retención inducida por AF64A, comparadas a ratas inyectadas con AF64A tratadas con PBS. La dosis mínima efectiva de AF292 es menor que 1 mg/kg, p.o.

EJEMPLO 47 Efectos de deterioros coqnitivos AF267B inducidos por AF64A en r ta""s"erria" prueba MWM.~ ~ ' " Se probaron ratas Sprague-Dawley inyectadas con AF64A o solución salina (6 meses de edad) en la tarea de Laberinto de Agua de Morris (MWM). El paradigma utilizado evalúa las capacidades de aprendizaje espacial en un régimen de memoria de referencia, e implica el entrenamiento (días 1-4), prueba de transferencia (prueba de Sonda - día 4, 3 minutos después de la última prueba de entrenamiento) y prueba de inversión (día 5). En 4 meses después de la operación, cada uno de los grupos de AF64A y solución salina de ratas se subdividió aleatoriamente en cuatro subgrupos de tratamiento (n-9): los subgrupos 1 - 3 se trataron con AF267B en dosis de 0.3, 1 y 3 mg/kg p.o., en un volumen de 10 ml/kg. mientras el subgrupo 4 (grupo control) se trató con el vehículo, solución salina regulada con fosfato. 10 mM (PBS) en el mismo volumen. Los fármacos y PBS se administraron una vez al día durante 5 días antes del inicio de la prueba conductista, y luego para la duración del experimento del día 5, 30 minutos antes de la prueba. Las tres medidas, latencia de escape, longitud de trayectoria y velocidad de nado se analizaron por MANOVA, seguido por análisis de contraste de efectos principales simples. Resultados: Las ratas inyectadas con AF64A mostraron una latencia de escape significativamente más larga que las ratas inyectadas con solución salina, F( 1 /64) = 10.56, p<0.005. En términos de la longitud de trayectoria, las ratas inyectadas con AF64A no tuvo efecto significativo en el aprendizaje; sin embargo, las ratas inyectadas con AF64A tratadas con AF267B-1 mg/kg mostraron una tendencia para la mejora, en latencia de escape únicamente, mientras AF267B-3 mg/kg tendió a deteriorar el rendimiento en estas ratas. No se encontró ninguna correlación entre las medidas cognitivas (latencia de escape y longitud de trayectoria) y la medida motora no específica (velocidad de nado). Todas las ratas inyectadas con solución salina mostraron una predisposición espacial en la prueba de sonda, en ambos parámetros, F(3/192) = 7.86, p<0.001, y F(3/192) = 7.44, p<0.001, para latencia de escape y longitud de trayectoria, respectivamente. Por otro lado, las ratas inyectadas con AF64A tratadas con PBS mostraron únicamente una predisposición espacial parcial en esta prueba. Sin embargo, las ratas inyectadas con AF64A tratadas con AF267B mostraron una predisposición espacial completa, similar a aquella de las ratas inyectadas con solución salina, como se presenta en la latencia de escape únicamente, F(9/192) = 2.3, p<0.025. No se encontraron diferencias significativas entre las diversas dosis de AF267B, en su efecto benéfico en la memoria No se encontraron diferencias significativas entre cualquiera de los grupos probados en la prueba de inversión. Sin embargo, la inyección AF64A tendió a deteriorar el rendimiento cognitivo, en ambas medidas. Adicionalmente, las ratas inyectadas ~ con AF64 \ "tratadas "co'rv AF267B- ~rñ~g7kg m o stVaV on dina tendencia para mejoramiento, mientras las ratas inyectadas con AF64A tratadas con AF267B-3 mg/kg mostraron una tendencia para el deterioro en su prueba.

EJEMPLO 48 Efectos de AF150(S), AF267B, rivastigmina y nicotina en rendimiento MWM de ratones C57BL/10SnJ contra C57BL6J Se seleccionaron ratones C57BL/10SnJ (B10) debido a su pequeño hipocampo y número disminuido de neuronas piramidales del hipocampo; la pérdida celular pareció asociarse con pobre aprendizaje espacial. Las deficiencias en las tareas de memoria espacial observadas en estos animales se reportaron ser responsables de manipulación colinérgica (escopolamina) (Simons et al Life Sci., 42, 375-383, 1988) y ambos inhibidores AchE (f isostigmina) y agonistas muscarinicos (AF102B, PD151832) (Simons et al. 1988; Vincent et al Brain Res., 597, 264-268, 1992; Schwartz et al Drug Dev. Res , 40, 133-143, 1997) han mostrado efectos positivos en este modelo, utilizando el MWM. Cada grupo de ratones se dividió aleatoriamente en 7 grupos de tratamiento (n = 12/14 /grupo). Los grupos 1-2 se trataron con AF150(S) en dosis de 0.5 y 1 mg/kg, i . p . , en un volumen de 1.0 ml/kg, los grupos 3-4 se trataron con AF267B en la misma dosis y volumen, los grupos 5-6 se trataron con rivastigmina y nicotina, respectivamente, en la dosis de 1 mg/kg, ip., y el grupo 7 se trató n salina al 0.9%. Todos los compuestos probados y la solución salina se administraron una vez al dia durante 4 días antes del inicio de la prueba conductista, y luego para la duración del experimento al día 5, 30 minutos antes de la prueba. Entrenamiento: Cada ratón se entrenó durante cuatro días consecutivos, cuatro pruebas (un bloque) por día, en donde la posición de la plataforma permaneció constante y se ubicó en el centro del cuadrante sudeste de la piscina. Dentro de cada bloque de cuatro pruebas, cada ratón inició en cada una de las ubicaciones de partida, pero la secuencia de las ubicaciones se seleccionó aleatoriamente. Una prueba consistió colocando un ratón por mano en el agua de frente a la pared de la piscina en uno a cuatro ubicaciones de partida, norte, sur, este u oeste, alrededor del perímetro de la piscina. La latencia de escape (el tiempo para encontrar la plataforma), longitud de trayectoria (la distancia viajada por el ratón) y velocidad (la velocidad de nado del ratón) se registraron en cada prueba por el sistema de observación. Para cada ratón, la longitud de trayectoria, latencia de escape, y velocidad de nado de las cuatro pruebas en cada uno de los 4 días de entrenamiento se agruparon en bloques (un bloque para cada día). Los resultados de todas las medidas se analizaron por MANOVA de tres vías (2 7 x 4) con una variable repetida (días) y dos sin variables repetidas [cepa de ratones - 57BL/10SnJ o C57BL6"J7~y t'rlaf miento ^dds dosis de cada uno, ÁFf5Ó(S) y_ AF267B, rivastigmina, nicotina (una dosis para cada uno) y solución salina]. Las comparaciones especificas se realizaron, utilizando el análisis de contrastes de efectos principales simples, que se sitúa específicamente para probar las interacciones significativas. Latencia de escape: Los ratones de hipocampo pequeño mostraron latencias de escape significativas más prolongadas (indicando un mal rendimiento RM) que las ratas de hipocampo normal. AF150(S) y AF267B, y rivastigmina, afectaron positivamente el rendimiento de entrenamiento de ratones de hipocampo pequeño. F(6/161 ) = 6.39. p<0.0001. Específicamente, ambas dosis de cada uno de los compuestos muscarínicos mejoraron las latencias de escape de ratones de hipocampo pequeño, comparadas al grupo control (p<0.01 -p<0.001 ) . Además, AF267B mostró una curva de respuesta de dosis en su efecto en rendimiento (p<0.02) mientras AF150(S) afectó el rendimiento igualmente para ambas dosis. Tanto AF150(S) y AF267B afectaron el rendimiento más efecti amente que rivastigmina (p<0.05, p<0.001, respectivamente). AF150(S) incrementó las latencias de escape de ratones de hipocampo normales, para ambas dosis (p<0.05, p<0.001) mientras AF267B no afectó significativamente las latencias de escape de estos ratones durante el entrenamiento. Mientras la nicotina no tuvo efecto de mejora de déficit de memoria mostrados por ratones de hipocampo pequeño, se degradó eí rendimiento de ratones de hipocampo normal (p<0.02).. Los resultados también indicaron un efecto general significativo de entrenamiento. F(3/483) = 90.49, p<0.0001; las latencias de escape de todos los grupos disminuidos linealmente durante los cuatro días de entrenamiento (p<0.0001, por un contraste polinómico). Longitud de trayectoria. Ratones de hipocampo pequeño mostraron longitudes de trayectoria significativamente más prolongadas que los ratones de hipocampo normal, F(6 , 161 ) = 2.35 , p<0.033. AF150(S) (ambas dosis), AF267B (la dosis más elevada) y rivastigmina positivamente afectaron el rendimiento de los ratones de hipocampo pequeño (p<0.05-p<0.01 ). AF150(S) (únicamente la dosis más elevada) deterioró significativamente ,y£, (p<0.05) la longitud de trayectoria de ratones de hipocampo normal mientras ningún AF267B ni rivastigmina tuvieron ningún efecto en la longitud de trayectoria de estos ratones. La nicotina no tuvo efecto significativo en el rendimiento de cualquiera de las cepas de ratones probadas. Los resultados también indicaron un efecto general significativo de entrenamiento, F(3/483) = 86.98, p<0.0001; las longitudes de trayectoria de todos los grupos disminuidos linealmente durante los cuatros días de entrenamiento (p<0.0001, por un contraste polinómico). Velocidad de nado: Las diferencias de actividad motora se observaron entre las dos cepas de ratones tratados con solución salina: La velocidad de nado de los ratones de hipocampo pequeño fue significativamente más lenta que aquella de los 'Tá on'eVd'e hi'pocám'po hoTrnalT F(67 6 ) = í 4.32* p< 0.0001. Además, ambos fármacos muscarínicos incrementaron significativamente la velocidad de nado de los ratones de hipocampo pequeño. Específicamente, AF267B mejoró la velocidad de nado en una manera dependiente de dosis (p<0.001, relativa al control; p<0.02, entre dosis) mientras el efecto de mejoramiento de AF150(S) fue igual en ambas dosis (p<0.001). Además, AF267B-1 mg/kg mejoró significativamente la velocidad de nado más fuertemente (p<0.001) que AF150(S)-1 mg/kg. Ninguna rivastigmina ni la nicotina tuvieron ningún efecto significativo en la velocidad de nado de ratones de hipocampo pequeño. AF150(S) deterioró significativamente (p<0.01-p<0.001 ) la velocidad de nado de ratones de hipocampo normal mientras AF267B no tuvo tal efecto. Así mismo, la rivastigmina (p<0.01) y nicotina (p<0 001) disminuyó significativamente la velocidad de nado de estos ratones. Los resultados también indicaron un efecto general significativo de entrenamiento. F(3/483) = 15.34, p<0.0001 ; las velocidades de nado de todos los grupos se incrementaron linealmente durante los cuatro días de entrenamiento (p<0.0001 ) por un contraste polinómico). Prueba de transferencia: Durante la prueba No. 17, en el cuarto día, la plataforma se removió completamente a partir de la piscina (una prueba de sonda). En esta prueba, el ratón se colocó en el agua durante un periodo limitado (30 s) y su predisposición espacial se midió registrando la distribución relativa~de~ latencia de escape y_ long¡tud_ de trayectoria sobre Jos cuatro cuadrantes de la piscina. La longitud de trayectoria y latencia de escape para la prueba de transferencia (prueba No. 17) se analizaron por MANOVA de 3 vías (2 x 7 x 4) con una variable repetida (cuadrante en la piscina) y dos variables no repetidas [cepa de ratones - C57BL/10SnJ o CS57BL6J, y tratamiento - dos dosis de cada uno AF150(S) y AF267B rivastigmina y nicotina (una dosis para cada uno) y solución salina]. La interacción de tres vías para la medida de latencia de escape se encontró estadísticamente significativa, F( 8/483) = 1.62, p<0.05, mientras la interacción para la medida de longitud de trayectoria fue cercana a la trascendencia. F(18/483) = 1.5, p<0.08. Los ratones de hipocampo normal tratados con solución salina mostraron una predisposición espacial completa en la prueba de transferencia. Gastan significativamente más tiempo en el cuadrante de entrenamiento (p<0.001) en relación a los otros tres cuadrantes de la piscina Por otro lado, los ratones de hipocampo pequeño tratados con solución salina mostraron únicamente una predisposición espacial parcial en esta prueba. Gastaron significativamente más tiempo en el cuadrante No. 1 en relación a los cuadrantes No. 3 (p<0.001) y 4 (p<0.05), pero no en relación al cuadrante No. 2. Sin embargo, los ratones de hipocampo pequeño tratados con AF150(S) o AF267B (por ambas dosis) o rivastigmina, mostraron una predisposición espacial' completa, " como los ratones de hipocampo normal. En contraste, los ratones de hipocampo pequeño tratados con nicotina mostraron únicamente una predisposición espacial parcial, similar a los ratones de hipocampo pequeño tratados con solución salina. Los ratones de hipocampo normal tratados con AF150(S)-1 mg/kg mostraron únicamente una predisposición espacial parcial en la prueba de transferencia mientras todos los otros ratones de hipocampo normal tratados con los otros fármacos mostraron una predisposición espacial completa en esta prueba. Los resultados de la medida de longitud de trayectoria fueron muy similares a aquellos de la medida de latencia de escape. Prueba de inversión: Durante las pruebas 18-21 , en el quinto día, la posición de plataforma se cambió al cuadrante de noreste, opuesto al cuadrante de entrenamiento. De este modo, durante el aprendizaje de inversión, la ubicación de la plataforma se movió en relación a la configuración de objetos dentro del cuarto, pero la piscina ocupó el mismo lugar dentro del cuarto a lo largo de todo el experimento completo. La prueba de las ratas y medidas tomadas fueron las mismas como en el entrenamiento. Para cada ratón, la latencia de escape, longitud de trayectoria y velocidad de nado de la prueba de inversión (pruebas No. 18-21 ) se agruparon en un bloque. Todas las tres medidas se analizaron por un MANOVA de dos vías (2 x 7) con dos variables ([cepa de ratones - C57BL/10SnJ o C57BL6J, y tratamiento - dos dosis de cada una, AF150(S) y AF267B, rivastigmina, nicotina (una d o s"\ s~p a r a "c a el a ' ~ ñoj "y"s o lli c i ó n ~s á I i ri a ] . Latencia de escape: Los ratones de hipocampo pequeño mostraron latencias de escape significativamente más prolongadas durante el aprendizaje de inversión que los ratones de hipocampo normales, F (6/ 161 ) = 3.26 , p<0.005. Ambos fármacos muscarínicos, AF150(S) y AF267B (por ambas dosis), significativamente mejoró (p<0.05-p<0.01 ) la latencia de escape de ratones de hipocampo pequeño mientras AF150(S)-0.5 mg/kg significativamente deterioro (p<0.06) la latencia de escape de los ratones de hipocampo normal. Tanto la rivastigmina y la nicotina no tuvieron efecto significativo en cyalesquier ratones C57BL/10SnJ o C57BL6J. Longitud de trayectoria. El único efecto significativo (p<0.05) mostrado en esta medida fue el deterioro de aprendizaje de inversión por AF150(S)-1 mg/kg en ratones de hipocampo normal [F(6/161 ) = 2.85, p<0.011, para la interacción de dos vías). Velocidad de nado. No se obtuvieron diferencias significativas entre las dos cepas de ratones tratadas con solución salina en actividad motora. Sin embargo, ambos fármacos muscarínicos, por ambas dosis, incrementaron significativamente (p<0.01 -0.001 ) las velocidades de nado de ratones de hipocampo pequeño, F(6/161 ) = 8.71 , p<0.0001. Las velocidades de nado de los ratones de hipocampo normal se disminuyeron significativamente por AF150(S)-0.5 mg/kg (p<0.02), AF267B 1mg/kg (p<0.05), rivastigmina (p<0.01) y nicotina (p<0.05). AF150(S), AF267B, y el inhibidor AchE, rivastigmina, atenuaron" ^ignificátiv^rñérvte "estos deterioros en ratones con hipocampo pequeño. La mejora del funcionamiento cognitivo fue más pronunciada durante la adquisición y retención, aunque una mejora similar se mostró por ambos compuestos muscarínicos en aprendizaje cognitivo. En contraste, la nicotina no tuvo efecto benéfico en el rendimiento cognitivo de ratones de hipocampo pequeño. Un efecto de respuesta de dosis de AF267B se demostró en adquisición, por la mejora diferencial del déficit cognitivo mostrados en la medida de latencia de escape. El efecto benéfico de la dosis de 1mg/kg fue significativamente más fuerte que aquella de 0.5 mg/kg de dosis. Durante la prueba de transferencia, los ratones de hipocampo pequeño no tratados, mostraron únicamente déficit de memoria parcial concernientes a la ubicación de plataforma. Una mejora significativa de estos déficits se 5 demostró igualmente bien por ambos fármacos muscarínicos, en las dos dosis probadas, así como por rivastigmina, pero no por nicotina. La contribución de AF267B y AF150(S) a la mejora de procesos de aprendizaje y memoria se enfatiza por dos hallazgos: el efecto de respuesta de dosis mostrado por AF267B en la 10 adquisición, y el efecto benéfico de ambos fármacos demostrados en la prueba de sonda (transferencia). En este aspecto, se debe observar que la prueba de sonda es el procedimiento principal en la tarea MWM, proporcionando medidas que cuantifican la resistencia y exactitud del aprendizaje original. 15 "^" E JE P C~0 49 "~ ~ f . AF150(S) es efectivo en restauración de deterioros coqnitivos en ratas isquémicas. La isquemia transitoria en ratas se indujo por una 20 modificación del modelo de isquemia (Voll et et al. Stroke, 20: 1700-1706, 1989). Esto se hizo por una oclusión de arteria de carótida bilateral en ratas Sprague Dawley (42 machos, 3 meses de edad, pesando 270-340 g) combinadas con reducción en presión sanguínea inducida por nitroprusida de sodio. La isquemia 25 se indujo en 21 ratas mientras que las otras 21 ratas sirvieron como controles falsos. Bajo anestesia de pentobarbital (30 mg/kg, ip), nitroprusida de sodio 4.8 mg/kg/hora) se implantaron a través de una cánula implantada en la vena posterior, durante un periodo de 25 minutos. Cinco minutos después de la iniciación de la infusión, al tiempo cuando la presión sanguínea principal se mantuvo a 30-60 mmHg (niveles iniciales ~ 110 mm Hg) ambas arterias de carótida se sujetaron durante 20 minutos. Inmediatamente después, 1.8 mEq de solución de bicarbonato de sodio se administró ip para minimizar la acidosis sistémica. Las ratas operadas en falso se anestesiaron como las ratas isquémicas y se implantaron con solución salina. Sus arterias de carótida se expusieron, pero no se sometieron a sujeción de carótida. En las ratas sujetas a isquemia, una mortalidad de aproximadamente 30% se registró dentro de 24 horas después de la cirugía. Los animales se permitieron recuperar por 3 semanas antes de la prueba cuatro grupos: ratas isquémicas y operadas en falso que se trataron con AF150(S) (0.5 mg/kg, po) y ratas control isquémicas, operadas en falso tratadas con doble agua destilada (DDW) (10 mg/kg, po). Cada grupo comprende, de 10-11 ratas. AF150(S) se administró inmediatamente después de la operación, una vez al día (6 días/semana) por semanas antes del inicio de la prueba conductistas, y luego para la duración del experimento de tres semanas, 60 minutos antes de la prueba. La evaluación de los animales se hizo utilizando el paradigma de emparejamiento a muestra de funcionamiento de memoria en el WM. La relación de latencia de escape (REL) y la relación de longitud de trayectoria (RPL) se calcularon por la relación de bloque no. 2/bloque no. 1 para cada parámetro. REL y RPL reflejan el ahorro relativo en rendimiento de la prueba no. 1 a la prueba no. 2. REL y RPL se analizaron por un ANOVA de 3 vías (2x2x3) con una variable repetida (semanas) y dos variables no repetidas. (Operación-isquemia/operada falsa y Tratamiento AF150(S)/DDW). Para REL y RPL la interacción entre la operación x tratamiento se encontró estadísticamente significativa [F(1/32) = 8.08; p<0.01 y F(1/32) = 6.75; p<0.025 para REL y RPL, respectivamente). El análisis de contrastes de efectos principales simples mostraron que REL y RPL de ratas isquémicas tratadas con DDW fueron más elevados que aquellos de ratas ~~^^-tratadas" "c o n~ DDW (p<0.01 y P<0.02 para REL y- RPL, respectivamente). Este resultado indica un déficit en los procesos de funcionamiento de memoria de ratas isquémicas comparadas a las ratas control. AF!50(S) mejoraron significativamente el. rendimiento de funcionamiento de memoria de ratas isquémicas, comparado con el tratamiento DDW; tanto REL y RPL de ratas isquémicas tratadas con AF150(S) fueron significativamente inferiores (p<0.05) que aquellos de ratas isquémicas tratadas con DDW. Las ratas control tratadas con AF150(S) no mostraron ningún cambio significativo en rendimiento. No se encontraron diferencias en la velocidad de nado en ninguno de los grupos probados. En conclusión, la administración crónica de AF150(S), 0.5 mg/kg, po, mostró una mejora clara de rendimiento de funcionamiento de memoria en ratas isquémicas durante las tres semanas del experimento (después de 3-6 semanas de la administración del fármaco). Los efectos de coordinación motora, no específicos no pudieron explicar los efectos conductivos de las ratas isquémicas, ni los efectos de mejoramiento de AF150(S) debido a que no se demostraron efectos significativos en la capacidad de nado de las ratas en la prueba de laberinto de agua de Morris.

EJEMPLO 50 Efectos en ratas tratadas con Trihexifenidilo - AF150(S). AF267B. AF297, AF704. Trihexifenidilo es un^ antagonista, muscarínico M1 selectivo que cruza la barrera cerebral sanguínea e induce deterioros de memoria y aprendizaje (Bymaster et al. J Pharmacol Exp Ther 267: 16-24, 1993, Roldan et al Neurosci. Lett. 230:93-96, 1997; Kimura et al Brain Res. 834: 6-12, 1999). Ratas Wistar simples se utilizaron en los experimentos siguientes. La tarea de evidencia pasiva (PA) comprende fase de entrenamiento (adquisición) y una fase de retención. En el procedimiento de entrenamiento cada rata se colocó individualmente en el pequeño compartimiento iluminado y después de 60 segundos de familiarización/adaptación , la puerta al compartimiento grande se abrió y la latencia para entrar se midió (Latencia Inicial). Inmediatamente después de entrar en el compartimiento oscuro, la puerta se cerró y el choque de pie inescapable (0.6 mA durante 3 segundos) se suministró a través del piso de la reja. Un punto de cortocircuito de 180 segundos se utilizó para latencia inicial. Los animales que fallaron al entrar (etapa directa) dentro de 180 segundos se excluyeron del experimento. Después de la prueba de adquisición, la rata se regresó a su jaula. La retención de la tarea de evidencia pasiva se midió 24 horas después, colocando nuevamente la rata en el compartimiento de luz y después a 60 segundos de intervalo de adaptación, la puerta se abrió y la latencia para volver a entrar al compartimiento oscuro se midió Un punto de corte de 300 segundos se utilizó para latencia de retención. Los animales < c\ue fallaron a la etapa directa dentro de 300 segundos se removieron del aparato y una latencia de 300 segundos se registró para ellos. Los compuestos probados incluyen: AF150(S) (0.5, 1 y 5 mg/kg p.o.), AF267B (0.5, 1 y 5 mg/kg, p o.), AF102B (1 mg/kg, p o.). La latencia de retención de ratas con trihexifenidilo tratadas con AF150(S)-5 mg/kg (222 ± 25.6), AF267B - 0.5 mg/kg (181.1 ± 35.4), AF267B - 1 mg/kg (290.1 ± 8.5) y AF102B - 1 mg/kg (234.4 ± 35.3) fue significativamente más prolongada que aquella de ratas trihexilfenidilo tratadas con doble agua destilada (DDW) (82.9 ± 19.55) (p<0.01-0.001 ). Además, la latencia de retención de las 1 ratas trihexilfenidilo tratadas con AF267B- 1 mg/kg fue significativamente más prolongada que aquella de ratas trihexilfenidilo tratadas con AF267B- 0.5 mg/kg (p<0.01) o ratas trihexilfenidilo tratadas con AF150(S)-5 mg/kg (p<0.06). No se 5 encontró diferencia en la latencia de retención entre grupos control tratados con varios fármacos o DDW. AF704 también fue significativamente efectivo en esta prueba. De este modo, la latencia de retención de ratas trihexifenid ilo tratadas con DDW (116.25 ± 36.36) fue significativamente más corta que aquella de ratas control (DDW) con DDW (300±0) (p<0.001). Sin embargo, la latencia de retención de ratas trihexilfenidilo tratadas con AF704.0.1 mg/kg po (214.70±36.63), 0.5 mg/kg, po (283.50±17.39) y 1 mg/kg, po (274.44±26.97) fue ^significativamente más prolongada que aquella de ratas trihexilfenidilo tratadas con DDW (p<0.01 -0.001). ~ ' AF292 fue el .compuesto -más. potente entre los agonistas. AF292 fue significativamente más efectivo en una dosis de 0.1-0.05 mg/kg po. Cuando la dosis más baja de AF292 0.03 mg/kg, po se probó después de 24 y 72 horas, únicamente 72 horas de retraso mostró un efecto significativo en PA en latencia de retención {225.9±36 contra DDW - 93.1 ± 29.0; p<0.01 comparada a ratas trihexilfenidilo tratadas con DDW). No se encontraron efectos en la latencia inicial. Estos resultados muestran a AF292 ser un agonista altamente potente (por ejemplo, más potente que AF150(S) por dos órdenes de magnitudes), a pesar de la potencia más elevada de AF150(S) en estudios de unión contra pirencepina (alta afinidad y baja afinidad). Este efecto de AF292 no puede atribuirse únicamente a la biodisponibilidad más elevada de AF292 contra AF150(S) en ratas (49% contra 31%).

EJEMPLO 51 Efectos de AF267B. AF292 en función coqnitiva en ratas maduras. Ratas Sp rague-Dawley viejas (22-24 meses) y jóvenes (tres meses de edad) habían sido probadas en MWM. Las ratas viejas mostraron una curva de aprendizaje significativamente más lenta que las ratas jóvenes, F(3/267) = 6.74, p<0.001, y F(3/267)=4.66, p<0.003, para latencia de escape y longitud de trayectoria, respectivamente. No se encontró ningún efecto significativo para cualquiera de los com puestos_d_e_ pj"J¿eb_a__eji__ aprendizaje; sin embargo.,-.] as .ratas maduras - tratadas con AF267B- -1 mg/kg mostraron una tendencia para mejoramiento. Todas las ratas jóvenes mostraron una predisposición espacial en la prueba de sonda, en ambos parámetros, en relación a ratas viejas, F(3/267) = 34.91 , p<0001, y F (3/267) = 9.06 , p<0.0001 para latencia de escape y longitud de trayectoria, respectivamente. No se encontró ningún efecto significativo para cualquiera de los compuestos de prueba en memoria; sin embargo, en relación a ratas viejas tratadas con DDW, ratas maduras tratadas con AF292 en ambas dosis, mostraron una tendencia para predisposición espacial parcial en esta prueba. Las ratas viejas mostraron significativamente peor rendimiento durante el aprendizaje de inversión que las ratas jóvenes. AF267B-1 mg/kg mejoró significativamente el aprendizaje de inversión de ratas maduras, F(4/88) = 2.62, p<0.04, y F(4/88) = 2.58, p<0.04, para latencia de escape y longitud de trayectoria, respectivamente. Los efectos benéficos de AF267B en aprendizaje de inversión y ratas viejas podrían no atribuirse a efectos de coordinación motora no específicos, ya que AF267B no tuvo efecto significativo en la capacidad de nado de estas ratas. AF292 no alcanzó trascendencia en el aprendizaje de inversión de ratas maduras, aún a partir de la forma de las curvas existe una tendencia de mejoramiento de ambas dosis probadas, 1 y 0.5 mg/kg, po. ^ ^ EJF_M~PLoY2~ 7*" ' - ¦ - - - ··-¦-- - ¦ Perfil de Seguridad del CNS de AF292 (Tabla 1i AF292 se evaluó en roedores para efectos posibles en comportamiento general y otros efectos farmacológicos relacionados con CNS. No se observaron signos conductistas y físicos significativos en ratas administradas AF292 en 1, 10, 30, 60 ó 100 mg/kg oralmente, como se compara al grupo control vehículo. No se observaron signos físicos o conductistas 24 horas después de la administración. Todas las ratas se retuvieron durante 14 días, y a través de todo este periodo de retención todas las ratas parecieron normales. En comparación, el compuesto AF267B comienza a mostrar los mismos efectos (salivación y lagrimeo a aproximadamente 40 mg/kg po) ya en la primera hora después de la administración.

EJEMPLO 53 Seguridad Cardiovascular de AF292 1. Astemizol (canal del gen relacionado con éter a- go-go humano) (HERG) Ensayo de Unión. AF292 se inactivo en este ensayo de unión ya que falló para inhibir la unión de [3H]-Astemizol al canal codificado de HERG. 2. Atrio Derecho de Cobayo Aislado (fibrilación atrial), AF292 no tuvo efecto significativo en fuerza contráctil, pero tendió a reducir ligeramente la velocidad contráctil más allá de lo que se ve en el grupo vehículo. 3. _ Los efectos de AF292 (dosis 5. mg/kg oralmente) en ' perros despiertos instrumentados, electrofisiológicos cardiacos, cardio-hemodinámicos. Los perros Beagle hembras instrumentados crónicamente y entrenados saludables de edad variable y variando en peso corporal de 9.4 a 12 kg, se utilizaron para registrar los parámetros cardiovasculares: frecuencia cardiaca, presión sanguínea distólica y sistólica, producto de velocidad de presión, LV dp/dt max, LV dp/dt max/pd, LV dp/dt min, producción cardiaca, volumen de choque, resistencia vascular sistémica y los parámetros ECG (PQ-, QRS-, QT-, QTcBazett (QTcB) , QtcFridericia - (QTcF) y duración de intervalo QtcVan de Water - (QTcVdW) y dispersión QT. Durante las últimas 18 horas previas a los experimentos, no han accedido a comer. El agua estuvo disponible ab Ubitum. En el inicio de cada experimento, los valores de control de varios parámetros se registraron durante los últimos 30 minutos. Después, 5 mg/kg de AF292 (n=4) o el volumen correspondiente del solvente (n=4) se administró oralmente por cebadura. Varios parámetros haemodinámicos se registraron continuamente durante 4 horas después. AF292 oralmente se administro en una dosis de 5 mg/kg no tuvo efecto estáticamente significante y relevante en parámetros hemod inám icos o ECG: por ejemplo, presión sanguínea, contractilidad cardiaca (LV dp/dt max; LV dp/dt max/pd) y relajación (LV dp/dt min), volumen de choque, resistencia vascular sistémica, duración de PQ-, QRS-, QT-, QTcB-, QTcF-, e intervalo QTcVdW,. dispersión QT - y una -morfología de ECG.

EJEMPLO 54 Efectos de AF292 en Inhibición de Isoforma de Citocromo P450 La actividad de critocromo P450 puede ser un indicador de interacciones de fármaco-fármaco potencial. AF292 se evaluó en un ensayo de placa microtituladora para inhibición P450 AF292, en una concentración de hasta 10 µ?, no indujo significativamente la inhibición de isoformas CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4 y CPY2D6, cinco enzimas P450 mayores humanas responsables para metabolismo de fármaco e interacciones de fármaco-fármaco asociadas .

EJEMPLO 55 Metabolismo in vitro de AF292 La estabilidad metabólica de AF292 se evaluó verificando su desaparición mientras se incubó con rata, perro, mono y microsomas hepáticos humanos. La testosteron a , y el propanol se activaron como controles ensayo. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

EJEMPLO 56 Estudios de permeabilidad de célula de adenocarcinoma de colon humano (Caco-2) de AF292. _ Esta prueba se util¡za_=para -determinar permeabilidad intestinal de compuestos probados. Las células Caco-2, cuando se cultivan en filtros semipermeables, diferenciados espontáneamente en cultivo para formar monocapas confluentes que se asemejan estructural y funcionalmente al epitelio intestinal pequeño Debido a esta propiedad, son útiles como un modelo in vitro para el estudio de absorción de fármaco y metabolismo durante la absorción de la mucosa intestinal. Las monocapas Caco-2 se cultivaron a confluencia en membranas de policarbonato, microporosas recubiertas con colágeno en placas de 12 pozos y la permeabilidad del material de prueba se determinó. El coeficiente de permeabilidad promedio (Papp) de AF292 fue 17.4x106 cm/seg variándolo ya que tiene un potencial de absorción elevado (ensayo bidireccional realizado).

JEMPLO 57 Unión de Proteína Se llevaron a cabo estudios de unión de proteína en plasma humano, ai-glicoproteína, albúmina de suero humano (iHSA), y Solución Salina Regulada con Fosfato de Dulbecco (PBS). AF292 se agregó a una concentración final de 10 µ?. Los resultados mostraron 0% de unión de proteína en concentración de dosis de regulador PBS (µ?) y en a-glicoproteína humana (AGP), (véase la Tabla 1). . - —=r ?????????'d " ..---^ . --=¦¦ -·-¦¦ - · - -Perfil farmacocinético de AF292 en ratas v perros Los resultados del perfil PK de AF292 en ratas y perros Beagle (ayuno durante la noche; fármaco administrado en solución acuosa; cebadura) se listan en la Tabla 1.

EJEMPLO 59 Perfil toxicológico de AF267B AF267B ha sido extensamente probado en estudios de toxicidad crónica por hasta 13 semanas en rata Wistar y perro Beagle. En el perro, el nivel de efecto no adverso (NOAEL) se considera estar en el rango de 6-9 mg/kg/día, po Los efectos vistos en el perro (>9 mg/kg) y la rata (> 40 mg/kg) son consistentes con el perfil de AF267B como un agonista muscarínico, sin efectos cardiovasculares tóxicos (probados en perros despiertos). AF267B se evaluó extensamente en perros beagle por hasta 13 semanas en estudios de toxicidad oral y electrocardiogramas (ECG) se registraron rutinariamente pre- y pos-administración del agente de prueba. La frecuencia cardiaca, duración y amplitud de onda P, intervalos P-Q, QRS y QT se midieron y no se observaron cambios en el ECG se consideraron para relacionarse a la administración del agente de prueba.

EJEMPLO 60 Efectos de AF267B en neuronas del hipocampo de rata expuetas a,. fibrilos ?ß como sigue por: supervivencia -y- apoptosis: actividad GSK-3I3, estabilización citoplásmica y nuclear de ß-catenina: expresión de ciclina D1. Este estudio se realizó en cultivos celulares primarios de hipocampo de rata utilizando los métodos descritos por Garrido JL et al. (FASEB J 2002; 16:1982). AF267B no afecta la supervivencia y morfología de neuronas del hipocampo en concentraciones de 0.5-50 µ?. Sin embargo, AF267B (10 µ?) protege >90% las neuronas del hipocampo a partir de ??1-40 (5 µ?) que solo provocó una disminución del 45% en supervivencia y en morfología. Estos efectos protectores de AF267B se miden por receptores muscarínicos M1 ya que estos se bloquean por pirencepina (10 mM), un antagonista M1, AF267B (100 µ?) disminuyó la 5 actividad de 05?-3ß por 60% en cultivos de neuronas del hipocampo de rata. En tal preparación, fibrilos de 10 µ? ?ß incrementó la actividad de GSK-3p a 370% contra control (100%). Además, AF267B (10 µ?) antagonizó los efectos de fibrilos ?ß (10 µ?) disminuyendo la actividad de GSK-3p al mismo de 150% 10 contra control. AF267B (10 µ?) evitó la apoptosis inducida por ?ß1-40 (5 µ?) al nivel control. Cuando las neuronas del hipocampo cultivadas se expusieron a ?ß1-40 (5 µ?), se degradó la ß-catenina soluble y está degradación se evitó por AF267B (100 µ?). De hecho, AF267B incrementó el nivel ß-catenina 15 soluble en una manera dependiente de _con cení :racjó n ,.--_,[ Bo r-r"= éjem p o? ? µ?~ (?? 0 %.). 10 µ M (300%), 100 µ (350 % ) ] ; A ß 1 -40 (5 µ?) disminuyó la ß-catenina nuclear (por 60%) un efecto bloqueado por AF267B (1 µ? (140% contra control). Estos efectos protectores de AF267B se miden por M1 mAChR ya que estos se 20 bloquean por pirencepina (10 nM). El efecto desestabilizante de ?ß1-40 (5 µ?) en neuronas del hipocampo de rata se mostró por encogimiento dendrítico detectado por tinción inmunofluorescente. La posición de los núcleos se mostró por anticuerpo c-jun, AF267B protegió las neuronas y las células tienen neuritos saludables 25 cuando se tratan con este agonista M1. El efecto de AF267B es M1 mAChR mediado ya que se bloquea por pirencepina (10 nM). Finalmente, AF267B tiene un efecto protector (50% de incremento contra control) contra ?|?-40 (5 µ?)- indujo disminución (40% contra control) de ciclina D1, un gen objetivo de la trayectoria Wnt. Nuevamente este efecto de AF267B se bloquea por pirencepina (10 nM). Los resultados mostrados aquí indican que AF267B protege las células neuronales como se evalúa por reducción MTT, inmunofluorescencia de neurofilamentos y análisis apoptótico. Como se muestra anteriormente, los compuestos utilizados en las modalidades de la presente invención, son compuestos moleculares bajos que son capaces de cruzar la barrera cerebral sanguínea. Muchos de estos compuestos tienen efectos benéficos adicionales que incluyen, inter alia, mejoramiento de memoria y ap endjzaje_ eji^.uji^^varie.dad,— de modelos animales .que .imitan.- varios -aspectos de A'D" y "otros trastornos relacionados con un margen de seguridad excelente.

La Tabla 1 compara algunos de los resultados de pruebas en AF292 y AF267B.

EFECTO AF292 AF267B Ratas trihexifenidilo-Evasión pasiva 0.03, 0.05, 0.1 , 0.3, 0.5 mg/kg, p.o. Efectos positivos 0.5, 1. 5 efectos positivos; MED </0.03 mg/kg p.o. MED 0 1 - 0 5 mg/kg, p.o. DURACIÓN PROLONGADA DE ACCIÓN CNS (rata). PRUEBA IRWIN<® Midriasis: 25 mg/kg, p.o. Observación General 1 , 10, 30, 60, 100 mg/kg, p.o. Salivación: 40 mg/kg, p.o. Sin efecto en: Lagrimeo: 50 mg/kg p.o. Actividad motora (campo abierto; tamiz Hipotermia: 50 mg/kg, p.o. vertical y horizontal; rotarod; ataxia Roedura: 50 mg/kg p.o. locomotora; postura y tono corporal; Convulsión: 50 mg/kg p.o. temblores; contracciones; parálisis; Sedación: 100 mg/kg, p.o. catalepsis} Cromodacriorrea: 100 mg/kg p.o. Reflejos (enderezamiento; córnea; piñal: PRUEBA IRWING: 1 10 100 mo/ko. extensión; tono de extremidad; retiro de músculo flexor; sobresalto) 1 y 10 sin efecto en comportamiento total Excitación o sedación (convulsión y estado fisiológico clónica/tónica; opistotono; vocalización; 100 mg/kg: anormalidades de acarreo, C-cola; cola Straub; giro; estereotipos; apatía, reflejo corneal disminuido, sedación; hipsosis (dormir) diarrea, aseo reducido, orinacíón Condición del oio: (otosis oaloebral: incrementada, salivación, lagrimeo y lagrimeo; cromodacriorrea; enoftalamo, cromodacriorrea, actividad locomotora exoftalamo) reducida, pasividad, respiración Condición de la piel (plasticidad de la disminuida, respuesta startle reducida piel, piloerección, blanqueo (oreja); (inicio: 0.5 horas, duración 3-6 horas) hiperemia, cianosis} Varios efectos (salivación, diarrea: diuresis; respuesta a manipulación; construcción abdominal; temperatura rectal, muerte} Í3PZ); corteza de rata; Ki, µ? 1.64+/-0.13 3.74+/-0.59 [3OXO-M], corteza de rata; Ki, µ?| 0.57+/-0.15 1 62+/-0.34 Secreción de -APPs en cultivos 100% Equipotente con AF267B y 100% celulares transfectados con rata 1 carbacol.(CCh), ??50=3µ?: Aün a mAChR (% de max CCh) través de menos eficacia en Pl Ensayo MTT contra ?ß 25-35 y ?2?2 en Equipotente _ con .. AF267B„y .- CCh -a ,100%= *:-= "·=--cultivos : celulares* tranfectados ~con Trata !100µ?; Aun a través de menos eficacia MI mAChR en Pl - . - · Rendimiento Pl contra CCh (como Pl, AA: MI mAChR: 35%, >68% Pl, AA: 1 mAChR; 66%. 100% 100%) en cultivos celulares Pl, AA: M3 mAChR: No activo como Pl: M3 mAChR: 30% transfectados con el subtipo mAChR agonista Pl, rata M1 mAChR: 75% humano Antagonista An M3 (pKb=660 nM) M2 mAChR - sin efectos como agonista Pl, AA: M5 mAChR - sin efectos como agonista Pl, rata M1 mAChR, 50% Estabilidad metabólica Microsomas de Hígado de Rata: T1/2 = Microsomas de Hígado: T1/2 = 88 92 minutos minutos Microsoma de Hígado de Perro: T1/2 Microsomas de Hígado de Perro: T1/2 100 minutos >100 minutos Microsoma de Hígado de Mono: T1//2 = Microsomas de Hígado de Mono: T1/2 = 74 minutos 27 minutos Microsomas de Hígado Humano: T1/2 Microsomas de Hígado Humano. T1/2 > 100 minutos 100 minutos (MEJOR QUE AF267B) *Perros: AF267B {1.5, 3, 6 mg/kg p.o.; única = 1 x y por semanas w}; (AF"92 obtenido a partir de AF267B, in vivo); tratamiento por cebadura ½ hora después de la alimentación; fármaco sólido en cápsula: _Nj_vel.es d.e__,pla_sma--d-el.--:fánmacO--S'e_ analizan en varios puntos de tiempo por LC-MS; ** extrapolan para 10 mg/kg; *** calculado para 2 mg/kg, po; # (extrapolado para 5 mg/kg). Área oral e intravenosa bajo la concentración contra la curva de tiempo (AUC) se compararon para determinar el % de biodisponiblidad (%F) siguiendo la fórmula: Dosis (IV)xAUC (oral)/Dosis (oral)xAUC(IV). Un % de F sobre 30% generalmente sugiere buena biodisponiblidad. Los niveles Cmax son igualmente importantes para determinar si suficientes niveles de plasma se logran para producir el efecto farmacológico deseado y un valor > 1 µ? es usualmente suficiente. AUMC es el primer momento estadístico del AUC y se utiliza para calcular el tiempo de residencia promedio (MRT = AUMC/AUC) que es el tiempo promedio del compuesto está en el animal. El Cmax representa la concentración máxima observada, el Tmax es el tiempo para alcanzar la concentración máxima y el T1/2 es la vida media calculada del compuesto en plasma (ln2xMRT). La aclaración es el volumen de fluido (conteniendo el compuesto) a partir del cual el compuesto se remueve completamente por unidad de tiempo. Ratas y perros se dosificaron intravenosamente (iv) y por cebadura oral. Los niveles de plasma del fármaco se analizan en varios puntos de tiempo por LC-MS-MS. @lrwin, S.PSYCHOPHARM 13:222-257, 1968. Los resultados mostrados en la Tabla 1 indican que AF267B y AF292 tienen la misma afinidad, pero diferente eficacia por subtipos MaChR. r«=a -~ Se .apreciará por expertos en "la técnica qué la presente invención no se limita por lo que se ha mostrado particularmente y descrito anteriormente. Más bien, el alcance de la presente invención incluye ambas combinaciones y subcombinaciones de las características descritas anteriormente así como modificaciones y variaciones de las mismas que ocurrirían a un experto en la técnica hasta la lectura de la descripción anterior y que no está en la técnica anterior.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de la fórmula (I): caracterizado porque: C denota un átomo de carbono espiro compartido por el anillo A y el anillo que contiene a, b, d y e; A se selecciona del grupo que consiste de: ramificada de d-Ce, o -CH2-P( = 0)(OH)2; a es -O- o -S-; b es -CR1R2- o -C(R1) = ; d se selecciona del grupo que consiste de =N-, -C( = 0)-, -C( = S)- y = N(R3) = 0; e se selecciona del grupo que consiste de -CH2-, -CHR4, -NH-, -N R5, -N(S02R6)- y -N(C( = 0)R6); R, R1, R2, R3, R4 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo de Ci-6 opcionalmente sustituido por uno, dos o tres fenilos, alcoxi de Ci-6, hidroxialquilo de C2-6, alquenilo de C2-6 y alquinilo de C2-6; R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alquilo de Ci-6 opcionalmente sustituido por uno, 5 dos o tres fenilos, alcoxi de Ci-6, hidroxialquilo de C2.6, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, fenilo opcionalmente sustituido, heteroarilo, y alquilo de Ci-6 sustituido opcionalmente por uno a tres fenilos; o, cuando el compuesto de la fórmula (I) es un dímero, en donde ambas mitades del dímero comparten un solo R5, 10 R5 se selecciona del grupo que consiste de -(CH2)n- y -(CH20)n- en donde n es 1 a 6; y R6 se selecciona a partir del grupo que consiste de alquilo de Ci-6, alcoxi de Ci-6, alquiltio de Ci-6, hidroxialquilo de C2-6, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-e y cicloalquilo de C3-7 con 15 un grupo halógeno, nitro, amino_,_h¡jdjox¡l ,,_q_C ''" susTífuldo opcionalmente por uno a tres grupos arilo, y Cm alquilo- X, en donde m = 0 a 6 y X se selecciona del grupo que consiste de indol, alquilindol de Ci-6, isoindolilo, 3-piridinilo, 3-piperidinilo, bencimidazolilo, tienilo, isotiazolilo, imidazolilo, pirazinilo, 20 benzofuranilo, quinolilo, isoquinolilo, benzotienilo, isobenzofurilo, pirazolilo, indolilo, isoindolilo, bencimidazolilo, purinilo, carbazoilo, oxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, 1 ,2,5-tiadiazolilo, isoxazolilo, pirrolilo, pirazolilo, quinazolilo, piridazin ilo, pirazinilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinoxalinilo, xantinilo, hipoxantinilo y 25 pteridinilo; o un enantiómero, días te re ó mero, race mato, tautómero, isómero geométrico, dimero, metabolito o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, con la condición de que cuando A , R sea -CH3, a sea S, b sea -CH(CH2CH3)- y d sea -C( = 0)-, entonces e no sea -NH- (AF267 o un enantiómero del mismo), y con la condición adicional de que cuando A sea, R sea -CH3, a sea S, b sea -C(CH3)= y d sea = N, entonces e no sea -CH2- (AF150(S)). . 2. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R5 es heteroarilp seleccionado del grupo que consiste de indol, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, furilo, piridilo, pirimidilo, tienilo, isotiazolilo, ¡midazolilo, pirazinilo, benzofuranilo, quinolilo, isoqu_inoljjp., _benzgtienilo, ^isobenzofurilo",'"' p i razo I i lo , indolilo, - isoindolilo béncimidazolilo, purinilo, carbazolilo, oxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, 1 ,2,5-tiadiazolilo, isooxazolilo, pirrolilo, pirazolilo, quinazolinilo, piridazinilo, pirazinilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinoxalinilo, xantinilo, hipoxantinilo, pteridinilo, 5-azacitidinilo, 5-azauracililo, triazololpirid i n i I o , imidazolopiridinilo, pirrolopirimidinilo y pirazolopirimidinilo. 3. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: N-[(2,8-dimetil-1-oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-amina]-N-óxido; N-[(2-etil-8-metil-1-oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-amina]-N- ó ido; N-[(2-Metil-8-fenil-1 -oxa-8-aza -espiro [4.5 ]dec-3-¡ lid en )-amina]-N-óxido; tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona ; 4-(2,4- Dimeto i-bencil)-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF286); 8-Metil-4-pirrolidin-1 -ilmetil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF287); 2-(1 -Hidroxi-etil)-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF298); (S)-2-Etil-8-metil-8-oxi- 1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF299); 4- (2, 4- Di meto xi -bencil)-2-etil-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF288); (S)-2-Etil-8-metil-1 -oxo-1 4-tia-4, 8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF300); 2-Etil-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-tiona (AF510); (S)-2-Etil-4-(4-fluoro-bencensulfonil)-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF700); 2-Etil-4-[2-(1H-indol-3-il)-etil]-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-o propionil)-8-metil - 1 -t (S)-Etil-4-(3-1 H-indol-3-il-propionil)-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF704B); (R)-Et¡l-4-(3-1 H-indol-3-il-propionil)-8-metil - 1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF704A); 2-Metil-8-metil-d3-1-tia-3,8-diaza-espiro[4.5]dec-2-eno (AF402), 2-Etil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF504), (S)-2-Etil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292), (R)-2-Etil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF291), N-[(2,8-Dimetil-1 -oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-metilamina]-N-óxido (AF600), N-[(2,8-Dimetil-1 -oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-bencilamina]-N-óxido (AF604), N-[(2,8-Dimetil-1-oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-isopropilamina]-N-óxido (AF605), N-[(2-Etil-8-metil-1-oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-metilamina]-N-óxido (AF601 ) , N-[(2- etil-8-fenil - 1 - oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-metilamina]-N-óx¡do (AF602) y d i h ¡d ro -5 '-meti lespi ro[ 1 -aza biciclo [2.2.2]octa n -3 , 5 '-(4'H)-3'-iliden-metilamina]-N-óxido (AF603), o un enantiómero, diastereómero, racemato, tautómero, isómero geométrico, metabolito o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. 4. Un compuesto de conformidad con la rei indicación 1, caracterizado porque A es es H, a es -S-; b es -CH(CH2CH3)-; d es -C( = 0); y e es -NH-(2-Etil-1 -tia-4, 8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona; AF504), o un enantiómero, diastereómero, isómero geométrico, racemato, tautómero, dímero, metabolito o sal farmacéuticamente acepta_ble^ del mismo....... .__ -~r -.· 5. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el compuesto es (S)-2-Etil-1 -tia-4 , 8-d iaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 6. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el compuesto es la sal HCI de AF292. 7. El compuesto (S )-2-Etil- 1 -tia-4 , 8-d iaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292) de conformidad a la reivindicación 1, o un metabolito o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. donde sea que se ubique en un cuerpo humano o animal. 8. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el compuesto es (R)-2-Etil-1 -tia-4, 8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF291) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 9. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende al menos un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un enantiómero, diastereómero, racemato, tautómero, isómero geométrico, dímero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable diluye o excipiente de ésta. 10. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende además al menos un compuesto adicional elegido del grupo que consiste de (S)-2-etil-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF267B) y 2,8-Dimetil-1-tia-3,8-dia z a -es [piro [4¿5Jdec - 2-e no.^ (A ?-? 50 ( S1)') ~o~ una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. " ~" 11. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque al menos un compuesto es (S)-2-Etil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292) o un profármaco de AF292 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 12. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el pro-fármaco es (S)-2-etil-8-metil- -tia-4, 8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF267B) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 13. Una composición farmacéutica de conformidad con la rei indicación 11, caracterizada porque (S)-2-Etil-1 -tia-4,8- diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292) o sal farmacéuticamente aceptable del mismo se presenta en un receptor muscarinico M1 agonístico y cantidad antgonistica del receptor muscarinico 3. 14. Una composición farmacéutica de conformidad con al reivindicación 11, caracterizada además porque comprende además al menos un compuesto adicional seleccionado del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 1, AF291, AF267B y AF150(S). 15. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque al menos un compuesto adicional es (S)-2-etil-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF267B) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 16. Una compjísj(^óji_faj n^ la r.ejyindicación 14, caracterizada porque' al menos uñ compuesto adicional es 2 , 8-Dimet¡ 1-1 -tia-3 ,8-d ¡aza-espiro[4.5]dec-2-eno (AF150(S)) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 17. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque al menos un compuesto adicional se selecciona del grupo que consiste de: N-[(2,8-dimetil-1-oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-amina]-N-óx¡do; N -[(2-eti I-8-metil-1-oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-amina]-N-óxido; N-[(2-Metil-8-fenil-1-oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-amina]-N-óxido, tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona; 4-(2,4-Dimeto i-bencil)-8- met¡l-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF286); 8-Metil-4-pirrolid in-1 - ilmetil - 1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF287); 2-(1 - Hidroxi-etil)-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF298); (S)-2-Etil-8-met¡l-8-ox¡-1-tia-418-d¡aza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF299); 4-(2,4-Dimetoxi-bencil)-2-et¡l-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4,5]decan-3-ona (AF288); (S)-2-Etil-8-met¡l-1 -oxo-1 4-tia-4,8-d¡aza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF300); 2-Et¡l-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-tiona (AF510); (S)-2-Etil-4-(4-fluoro-bencensulfon¡l)-8-metil-1-tia-4,8-diaza-esp¡ro[4.5]decan-3-ona (AF700); 2-Et¡l-4-[2-(1 H-indol-3-il)-etil]-8-met¡l-1 -tia-4,8-diaza-esp¡ro[4.5]decan-3-ona (AF703); 2-Etil-4-(3-1 H-indol-3-il-propion¡[)-8 -metí 1-1 -tia-4,8-diaza-esp¡ro[4.5]decan-3-ona (AF704); (S)-Etil-4-(3-1 H-¡ndol-3-¡l-propionil)-8-metil-1 -t¡a-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF704B); (R)-Etil-4-(3-1 H-indol-3-il-prop¡onil)-8-metil-1-tja-4J5 - d i az a HS.S p. ¡ r [A.5] de c a n - 3 - o n a - - - =^ (AF704A); - 2 = Metil-8-m-eUI-d3-1 -tia-3,8-diaza-esp¡ro[4.'5]deV-3-eno (AF402), 2-Etil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF504), (S)-2-Etil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292), (R)-2-Etil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF291), N-[(2,8-D¡metil-1-oxa-8-aza-esp¡ro[4.5]dec-3-iliden)-metilamina]-N-óxido (AF600), N-[(2,8-Dimetil-1-oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3-iliden)-bencilamina]-N-óxido (AF604), N-[(2,8-Dimet¡l-1 -oxa-8-aza-esp¡ro[4,5]dec-3-il¡den)-¡sopropilamina]-N-óx¡do (AF605), N-[(2-Etil-8-metil-1 -oxa-8-aza-esp¡ro[4.5]dec-3-il¡den)-metilamina]-N-óxido (AF601), N-[(2-Metil-8-fen¡l-1-oxa-8-aza-espiro[4.5]dec-3- iliden)-metilamina-N-óxido (AF602), y dihidro-5 -metilespiro |1-azabiciclo[2.2.2]octan-3,5'-(4'-H)-3'-iliden-metilamina]-N-óxido (AF603) o un enantiómero, diastereómero, racemato, tautómero, isómero geométrico, dímero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 18. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque comprende al menos un compuesto adicional seleccionado del grupo que consiste de 2-etil-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF267) y 2 , 8-D imetil-1 -tia-3, 8-d iaza-esp i ro[4.5]dec-2-e no (AF150(S)), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 19. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende: (a) una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste___d_e_ (S)r.2-etil-8.-metil-.1.-tia-478-diaza~ espiro[4.5]decan-3-ona (AF267B), (S)-2-EtM - 1 -ti -4, 8-cfiáza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292) y (S)-Et¡l-4-(3-1 H-indol-3-il-propionil)-8-metil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF704B), sales farmacéuticamente aceptables del mismo o mezclas de tales compuestos o sales, y (b) una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de un compuesto inmunoterapéutico contra beta-amilodes y compuestos que se unen a amiloides y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable de los mismos. 20. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 19, caracterizada porque la composición farmacéutica está en forma de unidad de dosis. 21. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, caracterizada porque la composición farmacéutica es un polvo, tableta, pildora, cápsula, sello, supositorio, una pluralidad de gránulos dispersables, una solución, una suspensión o una emulsión. ' ? 22. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende entre aproximadamente ' 0.5 a aproximadamente 100 mg de un compuesto de la fórmula (I) por forma de unidad de dosis. . 23. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, ;ajja ctejjzad a, porque-com prende alómenos- un~ compuesto o una mezcla de - compuestos"~selecciónados del grupo que consiste de: compuestos de la fórmula (I) en donde: R es -CH3, a es -O-, d es =N(R3) = 0; compuestos de la fórmula (I) en donde: R es -CH3, a es -O-, d es =N(R3) = 0; 2-Etil-4-[2-(1H-indol-3-¡l)-etil]-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF703); 2 - Etil-4- (3-1 H-indol-3-il-prop¡onil)-8-metil-1-t¡a-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF704); (S)-2-Etil-1 -tia-4,8-diaza-esp¡ro[4.5]decan-3-ona (AF292); AF267(B); AF150(S); o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, diastereómeros, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en una cantidad efectiva para elevar el nivel de forma secretada , -d.e__J.a~ -proteínas- precursora" ~ Jamiloi_e^"rTo: amiloidogénica (a-APPs), elevar los niveles de a-secretasa, disminuir el nivel de péptido ?ß en el cerebro de un mamífero que tiene un nivel elevado de ?ß en el cerebro, inhibir la liberación o síntesis de ApoE, disminuir los niveles de ApoE, disminuir la hiperfosforilación tau, disminuir formación helicoidal emparejada, activar la trayectoria de señalización Wnt, incrementar beta-catenina, inhibir efectos mediados por GSK3 o mejorar la actividad de neu rotrofinas. 24. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende: al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I) de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-8, AF267B y AF150(S) o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, diastereómeros, tautómeros, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y al menos un compuesto farmacológicamente activo, de crecimiento, agentes de disminución de colesterol, antioxidantes, inhibidores de GSK-3p, ligandos Wnt, inhibidores ß o ?-secretasa, agentes que degradan beta-amiloide, agentes anti-agregación beta-amiloide, agentes quelantes, compuestos inmunoterapéuticos contra compuestos beta-amiloides, que se unen a amiloides, inhibidores de ciclooxigenasa (COX)-2, fármacos antiinflamatorios no esteroidales, agentes estrogénicos, moduladores del receptor estrogénico, neuroprotectores esteroidales y farmacéuticos de captura de giro. 25. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque al menos un compuesto es AF292 o un profármaco de AF292 o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. 5 26. Una composición farmacéutica para tratar o reducir angiopatía amiloide cerebral, caracterizada porque comprende: (a) una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de AF267B, AF292 y AF704B, sales farmacéuticamente aceptables del mismo o mezclas de tales 0 compuestos o sales, y (b) una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de un compuesto inmunoterapéutico contra beta-amiloides y compuestos que se unen a amiloides, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. 5 27_._S a n g re -h u m a n ar o-a n i m a q u e^co n t ie n e-e I compuesto -¦ (S)-2-Etil-1-tiá-478-diaza-esp'i'ro[4.5]déc"an-3-óna (AF292), o un metabolito o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 28. Un proceso para la preparación de 2-et¡l-8-metil-1 - tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF267), caracterizado porque comprende hacer reaccionar 4-metil piperidona con ácido 2-mercaptobutírico y amoniaco. 29. Un proceso de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque comprende obtener los enantiómeros AF267A (enantiómero R) y AF267B (enantiómero S) por separación 5 quiral. 30. Un proceso para la preparación de AF267B, caracterizado porque comprende racemizar AF267A y aislar AF267B a partir de la mezcla racémica. 31. Un proceso de conformidad con la reivindicación 30, 5 caracterizado porque el aislamiento comprende separar el AF267B a partir de la mezcla racémica por separación quiral. 32. Un proceso para la síntesis de AF267B, caracterizado porque comprende poner en contacto ácido (R)-2- mercaptobutírico con acetato de amonio y 1 -metil-4-piperidona. 10 33. Un proceso para la preparación de AF267B isotópicamente etiquetado con 13C o 14C, caracterizado porque comprende hacer reaccionar AF287 con bromuro de etilo etiquetado 13C o 14C, desprotegiendo el átomo de nitrógeno en la posición 4 de AF287, y aislando AF267B etiquetado 13C o 14C por (S)-2-Etil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292) y (R)-2- Etil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF291 ), caracterizado porque comprende hacer reaccionar AF267 con un agente de 20 desmetilación . 35. Una forma cristalina de (S)-2-etil-8-metil-1 -tia-4,8- diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF267B) caracterizado por los siguientes datos: P212121 (No. 16) a=10.394 ((10) (a = 90°), b = 20.133 (2) (ß = 90°), c = 5.856 (4) (? = 90°) A, T=110K. 25 36. Una forma cristalina de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada por los siguientes datos. Volumen = 1224.2 (9) Á3, Z = 4, Fw = 202.32, Densidad calculada. De = 1.092 Mg/m3, coeficiente de absorción, µ = 0.232 mm. 37. Una forma cristalina de (S)-2-etil-8-met¡l-1 -tia-4,8-d iaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF267B) caracterizada porque tiene la configuración mostrada en la Estructura 1 en el Ejemplo 2. 38. Uso de un compuesto (S)-2-etil-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF267B) como un pro-fármaco del compuesto (S)-2-Etil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292). 39. Uso de 2-Etil-4-(3-1 H-indol-3-il-propionil)-8-metil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona en forma racémica (AF704) o como el enantiómero S del mismo (AF704B) como un pro-fármaco de al menos uno de AF267B, AF292 y ácido indol-3-propiónico. ACL SJ.s o_d e .un . compuesto-de conformidad"con~cualquier de las reivindicaciones ? a 8;~o un" enantiómero, diastereómero, racemato, tautómero, isómero geométrico, dímero, metabolito o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la preparación de una composición farmacéutica. 41. Uso de conformidad con la reivindicación 40, en donde el compuesto es AF292 o un pro-fármaco de AF292 o una sal farmacéuticamente aceptable de ya sea AF292 o un profármaco de AF292. 42. Uso de conformidad con la reivindicación 41, en donde el pro-fármaco es AF267B o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 43 Uso del compuesto (S)-2-Etil-1 -tia-4,8-diaza-espiro[4.5Jdecan-3-ona (AF292), o un metabolito o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la preparación de una composición farmacéutica para ambos que estimula el receptor muscarínico M1 y antagoniza el receptor muscarínico M3. 44. Uso de conformidad con la reivindicación 43, la composición además comprende (S)-2-etil-8-metil-Í -tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF267B). 45. Uso de una combinación de un primer compuesto, que comprende (S)-2-Etil-1-tia-4,8-diaza-espiro[4.5]decan-3-ona (AF292) y un segundo compuesto seleccionado del grupo que consiste de AF267B, AF150(S) y compuestos de conformidad con la reivindicación 1, diferentes de AF292, incluyendo racematos, e n a nt i ó me ro s,_ d jas t e re ó m e ros, -t a u t ó m e r o s i sómeros"ge'ó métricos" y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la preparación de una composición farmacéuticamente aceptable para estimular el receptor muscarínico M1 mientras se minimizan los efectos adversos debidos a la estimulación de otros subtipos mAChR. 46. Uso de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de conformidad con la reivindicación 1, AF267B y AF150(S), o racematos, enantiómeros, isómeros geométricos, diastereómeros, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en la preparación de una composición farmacéutica para: inhibir la liberación de síntesis de péptido beta-am iloide (A(3) en una célula, tejido u organismo de mamífero; estimular el receptor muscarínico M1 y retardar la 5 oxidación en la cercanía del receptor muscarínico M1; elevar el nivel de forma secretada de la proteína de precursor amiloide (a-PPs) en una célula, tejido u organismo de mam ífero ; elevar los niveles de a-secretasa, 10 disminuir el nivel de péptido ?ß en el cerebro de un mamífero que tiene un nivel elevado de ?ß en el cerebro inhibir la liberación o síntesis de ApoE en una célula, tejido u organismo de mamífero; disminuir los niveles de ApoE en una célula, tejido u _15_ rganisj o _jde majm|f ro;~ —— ^ . -» t ^rr - ^,— * «c^^^^-" ¾?? disminuir hiperfosforiíacióh tau en una célula, tejido u organismo de mamífero; disminuir la formación helicoidal emparejada en una célula de mamífero; 20 activar la trayectoria de señalización Wnt en una célula, tejido u organismo de mamífero; inhibir efectos mediados por GSK3 en un mamífero; mejorar la actividad de neurotrofinos; tratar en un mamífero, enfermedades asociadas con 25 función colinérgica deteriorada o enfermedades en donde existe un desequilibrio en la función colinérgica, o enfermedades con actividad deteriorada de receptores de acetilcolina a partir del grupo que consiste de: demencia senil por tipo Alzheimer; enfermedad de Alzheimer (AD), demencia de cuerpo Lewy; enfermedad de Alzheimer y Parkinson combinadas, demencia multiifract (MID); demencia fronto-temporal; demencia vascular; apoplejía/isquemia, control MID con apoplejía/isquemia/lesión cerebral, MID y AD combinados; lesión de cabeza humana; deterioros de memoria asociados con la edad; deterioro cognitivo ligero (MCI); MCI conductivo a AD; disfunción cognitiva (incluyendo amnesia, trastornos de confusión aguda, trastornos de falta de atención, trastornos de enfocamiento y concentración), estados alucinatorios-paranoia; trastornos emocionales y de atención; trastornos del sueño; delirio pos-operativo; efectos _ a d_v_e s o s_d e^a ntjdepresi o s^t r i c i c I i c o s t~ef e ct o s¾a d e r s o s " d e"c i e rt o s fármacos utilizados en el tratamiento de esquizofrenia y enfermedad de Parkinson; xerostomia, anomia, pérdida de memoria y/o confusión; psicosis; esquizofrenia, esquizofrenia comorbit con AD, esquizofrenia de inicio tardío, parafrenia, trastornos esqu izofren ¡formes, ansiedad; trastornos bipolares; manía; estabilización del humor; deterioros cognitivos después de la remoción de ciertos gliomas; disquinesia tardía; tensión oxidativa durante terapia de oxigeno; afasia; síndrome amnésico pos-encefalítico ; demencia por SIDA; deterioros de memoria en enfermedades autoinmunes incluyendo lupus, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, síndrome de fatiga crónica, y fibromialgia; deterioros de memoria en depresión atípica o esquizofrenia; dolor, reumatismo, artritis y enfermedades terminales; xeroftalmia; sequedad vaginal, sequedad de la piel; disfunciones inmunes; trastornos neurócrinos y desregulación de consumo alimenticio, incluyendo bulimia y anorexia, obesidad; deficiencia de ornitina transcarbamílasa congenital; atrofia olivopontocerebral; síntomas de abstinencia de alcohol; abuso de sustancias incluyendo síntomas de abstinencia y terapia de sustitución; corea de Huntington; parálisis supranuclear progresiva; enfermedad de Pick, ataxia Friedrick; enfermedad de Gilíes de la Tourette; síndrome de Down; glaucoma; presbiopia; trastornos autonómicos incluyendo disfunción de motilidad y función gastrointestinal tal como enfermedad del intestino inflamado, síndrome del intestino ir r i ta b I e., di a rrea , _c n s t i p a c i ó n ^-s e c r e c i ó n~ d e~á c i d o~ga tTiccF t? úlceras; incontinencia por urgencia urinaria, asma, COPD; y/o evitar o tratar enfermedades del sistema nervioso central o periférico debidos a la disfunción en uno o más de los siguientes: cerebro, sistema nervioso, sistema cardiovascular, sistema inmune, sistema neurócríno, sistema gastrointestinal, o glándulas endocrinas y exócrinas, ojo, córnea, pulmones, próstata u otros órganos en donde la función colinérgica se media por los subtipos del receptor muscarínico, en donde la disfunción implica; trastornos mediados por amíloide de cerebro; trastornos mediados por glicogen sintasa cinasa (GSK3P), daños, disfunciones o enfermedades mediados por hiperfosforilación de proteína tau, disfunciones o trastornos; daños, disfunciones o enfermedades mediados por hipercolesterolemia y/o hiperlipidemia del CNS y PNS, anormalidades de señalización mediadas por Wnt, deterioro 5 de neuroplasticidad ; hiperglicemia; diabetes; enfermedades mediadas por factores de crecimiento endógenos, o combinación de factores de riesgo adicionales; o estados de enfermedad que implica apolipoproteína E; o disturbios en donde una disfunción colinérgica ha sido implicada, incluyendo: demencia senil del tipo 10 Alzheimer, enfermedad de Alzheimer (AD), retraso del comienzo de síntomas de AD en un paciente con riesgo de desarrollar AD, demencia corporal Lewy, angiopatía amiloide cerebral (CAA), amiloidosis cerebral, demencia Pronto-temporal, demencia vascular, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, demencia multiifract 15 _ ( M I D ) , jsg uejrn a^P, i.uc h o q.u e , ~-M I D-r Comb i n a d a~-co n- ~d a ñ o po r~ _ - apoplejía/isquemia/cabeza," MID "combinada y enfermedad de Alzheimer, daño de cabeza humana, deterioros de memoria asociados con la edad, deterioro cognitivo ligero (MCI), MCI conducente a AD, trastorno bipolar, manía, esquizofrenia, 20 esquizofrenia no afectiva, parafrenia, disfunciones inmunes, trastornos neurocrinos y desregulación de consumo alimenticio, incluyendo bulímia y anorexia, control de peso, obesidad, inflamación. 47. Uso de una combinación de: 25 (a) un compuesto seleccionado del grupo que consiste de AF267B, AF292 y AF704B, sales farmacéuticamente aceptables del mismo o mezclas de tales compuestos o sales, y (b) un compuesto seleccionado del grupo que consiste de un compuesto inmunoterapéutico contra beta-amiloides y 5 compuestos que se unen a amiloides, en la preparación de una composición farmacéutica para tratar o reducir angiopatía amiloide cerebral. 48. Uso de AF267B, AF296, sales farmacéuticamente aceptables del mismo o una mezcla de AF267B, AF292 o sales 10 farmacéuticamente aceptables de la misma en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de esquizofrenia o para la mejora de síntomas de esquizofrenia. 49. El compuesto AF292 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de conformidad con la reivindicación 5, en J5 for gp a_a i si a.d a„o_su s t a n c ia I m e n te=p u ra^ ~ ·"" 50. El compuesto AF292 o uña sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de conformidad con la reivindicación 5, en una pureza de al menos 99.9% y/o un exceso enantiomérico de 99.8%. 20 51. El compuesto AF292 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de conformidad con la reivindicación 5, en forma sólida. 52. Una mezcla de AF292 o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y al menos otro compuesto seleccionado 25 del grupo que consiste de AF267B o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y AF291 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 53. Una mezcla de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la mezcla es una mezcla racémica. 54. Una mezcla de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la mezcla no es una mezcla racémica. 55. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque comprende una cantidad de AF292 o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, o una mezcla de AF292 o sal farmacéuticamente aceptable de la misma y al menos otro compuesto o sal farmacéuticamente aceptable de la misma seleccionada del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 1, AF267B y AF150(S), en una cantidad efectiva para: _,_^ h i b i r_l a -I i b e ra c i ó n-rce I u I a r=o=s í n t e si s-d e-Ap-;35^'^""'^"'-'"'1' elevar el nivel de forma secretada de la proteína de precursor amiloide no-amiloidogénica (a-PPs); elevar los niveles de a-secretasa, disminuir el nivel de ?ß en el cerebro del mamífero; inhibir la liberación o síntesis de ApoE en el mamífero; disminuir los niveles de ApoE en el mamífero; inhibir hiperfosforilación tau; inhibir anormalidades Wnt; inhibir efectos mediados por GSK3 ; actuar sinergisticamente con neurotrofinas; tratar en un mamífero, enfermedades asociadas con función coiinérgica deteriorada o enfermedades en donde existe un desequilibrio en la función coiinérgica, o enfermedades con actividad deteriorada de receptores de acetilcolina a partir del 5 grupo que consiste de: demencia senil por tipo Alzheimer; enfermedad de Alzheimer (AD), demencia de cuerpo Lewy; enfermedad de Alzheimer y Parkinson combinadas, demencia multiifract (MID); demencia fronto-temporal; demencia vascular; apoplejía/isquemia, MID combinado con apoplejía/isquemia/lesión 10 cerebral; MID y AD combinados; lesión de cabeza humana; deterioros de memoria asociados con la edad; deterioro cognitivo ligero (MCI); MCI conductivo a AD; disfunción cognitiva (incluyendo amnesia, trastornos de confusión aguda, trastornos de falta de atención, trastornos de enfocamiento y concentración), 5- r e s t a d o s— a I u c i n a t o rio s - par a n o i a ; ---t r a s t o r n o s~ ~e m o c i ó n a I e's^y" ? e; atención; trastornos del sueño; delirio pos-operativo; efectos adversos de antidepresivos triciclicos; efectos adversos de ciertos fármacos utilizados en el tratamiento de esquizofrenia y enfermedad de Parkinson; xerostomia, anomia, pérdida de 20 memoria y/o confusión; psicosis; esquizofrenia, esquizofrenia comorbit con AD, esquizofrenia de inicio tardío, parafrenia, trastornos esquízofreniformes, ansiedad; trastornos bipolares; manía; estabilización del humor; deterioros cognitivos después de la remoción de ciertos gliomas; disquinesia tardía; tensión 25 oxidativa durante terapia de oxígeno; afasia; síndrome amnésico pos-encefal ítico; demencia por SIDA; deterioros de memoria en enfermedades autoinmunes incluyendo lupus, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, síndrome de fatiga crónica, y fibromialgia; deterioros de memoria en depresión atípica o esquizofrenia; dolor, reumatismo, artritis y enfermedades terminales; xeroftalmia; sequedad vaginal, sequedad de la piel; disfunciones inmunes; trastornos neurócrinos y desregulación de consumo alimenticio, incluyendo bulimia y anorexia, obesidad; deficiencia de ornitina transcarbamilasa congenital; atrofia olivopontocerebral; síntomas de abstinencia de alcohol; abuso de sustancias incluyendo síntomas de abstinencia y terapia de sustitución; corea de Huntington; parálisis supranuclear progresiva; enfermedad de Pick, ataxia Friedrick; enfermedad de Gilíes de la Tourette; síndrome de Down; glaucoma; presbiopia; trastornos autonómicos _ i n c I u y e n d o — d i s f u n c i ó n - d e — m o t i I i d a d y -función *- g astroin't es t i rTa G ~t a I ; ' como enfermedad del intestino inflamado, síndrome del intestino irritable, diarrea, constipación, secreción de ácido gástrico y úlceras; incontinencia por urgencia urinaria, asma, COPD; y/o evitar o tratar enfermedades del sistema nervioso central o periférico debidos a la disfunción en uno o más de los siguientes: cerebro, sistema nervioso, sistema cardiovascular, sistema inmune, sistema neurócrino, sistema gastrointestinal, o glándulas endocrinas y exócrinas, ojo, córnea, pulmones, próstata u otros órganos en donde la función colinérgica se media por los subtipos del receptor muscarínico, en donde la disfunción implica; trastornos mediados por amiloide de cerebro; trastornos mediados por glicogen sintasa cinasa (GSK3f3), daños, disfunciones o enfermedades mediados por hiperfosforilación de proteina tau, disfunciones o trastornos; daños, disfunciones o enfermedades mediados por hipercolesterolemia y/o hiperlipidemia del CNS y PNS, anormalidades de señalización mediadas por Wnt, deterioro de neuroplasticidad; hiperglicemia; diabetes; enfermedades mediadas por factores de crecimiento endógenos, o combinación de factores de riesgo adicionales; o estados de enfermedad que implica apolipoproteína E; o disturbios en donde una disfunción colinérgica ha sido implicada, incluyendo: demencia senil del tipo Alzheimer, enfermedad de Alzheimer (AD), retraso del comienzo de síntomas de AD en un paciente con riesgo de desarrollar AD, demencia corporal Lewy, angiopatía amiloide cerebral (CAA), a m i I o i d o s i s r- =r c e r e b r a I ; — -demenci a ~- - f r o n t o - 1 e m p o rá'l ~d e'meici'a™ vascular, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, demencia multiifract (MID), isquemia por choque, MID combinada con daño por apoplejía/isquemia/cabeza, MID combinada y enfermedad de Alzheimer, daño de cabeza humana, deterioros de memoria asociados con la edad, deterioro cognitivo ligero (MCI), MCI conducente a AD, trastorno bipolar, manía, esquizofrenia, esquizofrenia no afectiva, parafrenia, disfunciones inmunes, trastornos neurocrinos y desregulación de consumo alimenticio, incluyendo bulimia y anorexia, control de peso, obesidad, inflamación. 56. Un proceso para la preparación de AF292, caracterizado porque comprende hacer reaccionar opcionalmente 4-piperidona N-protegida con amoniaco o una sal de amonio de ácido (S)-2-mercaptobutírico y luego desproteger opcionalmente el átomo de nitrógeno en el anillo. 57. El proceso de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque comprende hacer reaccionar AF292 con un ácido o base para formar una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 58. Un método para tratar en un mamífero enfermedades asociadas con función colinérgica deteriorada o enfermedades en donde existe un desequilibrio en la función colinérgica, o enfermedades con actividad deteriorada de receptores de acetilcolina a partir del grupo que consiste de: demencia senil por - = i p o ^A I z h e i m e r ; "d e m e n c i a " s e n i l~ p o r t i pcT A I z ríe i meTT é" n f er me dad d e Alzheimer (AD), demencia de cuerpo Lewy; enfermedad de Alzheimer y Parkinson combinadas, demencia multiifract (MID); demencia fronto-temporal; demencia vascular; apoplejía/isquemia, MID combinado con apoplejía/isquemia/lesión cerebral; MID y AD combinados; lesión de cabeza humana; deterioros de memoria asociados con la edad; deterioro cognitivo ligero (MCI); MCI conductivo a AD; disfunción cognitiva (incluyendo amnesia, trastornos de confusión aguda, trastornos de falta de atención, trastornos de enfocamiento y concentración), estados alucinatoríos-paranoia; trastornos emocionales y de atención; trastornos del sueño; delirio pos-operativo; efectos adversos de antidepresivos triciclicos; efectos adversos de ciertos fármacos utilizados en el tratamiento de esquizofrenia y enfermedad de Parkinson; xerostomia, anomia, pérdida de memoria y/o confusión; psicosis; esquizofrenia, esquizofrenia comorbit con AD, esquizofrenia de inicio tardío, parafrenia, trastornos esquizofreniformes, ansiedad; trastornos bipolares; manía; estabilización del humor; deterioros cognitivos después de la remoción de ciertos g liornas; disquinesia tardía; tensión ox ¡dativa durante terapia de oxígeno; afasia; síndrome amnésico pos-encefalítico; demencia por SIDA; deterioros de memoria en enfermedades autoinmunes incluyendo lupus, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, síndrome de fatiga crónica, y fibromialgia; deterioros de memoria en depresión atípica o esquizofrenia; dolor, réljmiffism'o', ::"~artri tí s~~ ' e íf errfíe'd a'd é sT~ termina les ; " xeTdfta I m i á~' sequedad vaginal, sequedad de la piel; disfunciones inmunes; trastornos neurócrinos y desregulación de consumo alimenticio, incluyendo bulimia y anorexia, obesidad; deficiencia de ornitina transcarbamilasa congenital; atrofia olivopontocerebral; síntomas de abstinencia de alcohol; abuso de sustancias incluyendo síntomas de abstinencia y terapia de sustitución; corea de Huntington; parálisis supranuclear progresiva; enfermedad de Pick, ataxia Friedrick; enfermedad de Gilíes de la Tourette; síndrome de Down; glaucoma; presbiopia; trastornos autonómicos incluyendo disfunción de motilidad y función gastrointestinal tal como enfermedad del intestino inflamado, síndrome del intestino irritable, diarrea, constipación, secreción de ácido gástrico y úlceras; incontinencia por urgencia urinaria, asma, COPD; o para evitar o tratar enfermedades del sistema nervioso central o periférico debidos a la disfunción en uno o más de los siguientes: cerebro, sistema nervioso, sistema cardiovascular, sistema inmune, sistema neurócrino, sistema gastrointestinal, o glándulas endocrinas y exócrinas, ojo, córnea, pulmones, próstata u otros órganos en donde la función colinérgica se media por los subtipos del receptor muscarínico, en donde la disfunción implica; trastornos mediados por amiloide de cerebro; trastornos mediados por glicogen sintasa cinasa (GSK3P), daños, disfunciones o enfermedades mediados por hiperfosforilación de proteína tau, disfunciones o trastornos; daños, disfunciones o enfermedades rnediados^por "hipercolesterolemia* /0^hiperlipide7ni PÑS, anormalidades de señalización mediadas por Wnt, deterioro de neuroplasticidad ; hiperglicemia; diabetes; enfermedades mediadas por factores de crecimiento endógenos, o combinación de factores de riesgo adicionales; o estados de enfermedad que implica apolipoproteína E; o disturbios en donde una dísfunción colinérgica ha sido implicada, incluyendo: demencia senil del tipo Alzheimer, enfermedad de Alzheimer (AD), retraso del comienzo de síntomas de AD en un paciente con riesgo de desarrollar AD, demencia corporal Lewy, angiopatía amiloide cerebral (CAA), amiloidosis cerebral, demencia fronto-temporal, demencia vascular, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, demencia multüfract (MID), isquemia por choque, MID combinada con daño por apoplejía/isquemia/cabeza, MID combinada y enfermedad de Alzheimer, daño de cabeza humana, deterioros de memoria asociados con la edad, deterioro cognitivo ligero (MCI), MCI conducente a AD, trastorno bipolar, manía, esquizofrenia, esquizofrenia no afectiva, parafrenia, disfunciones inmunes, trastornos neurocrinos y desregulación de consumo alimenticio, incluyendo bulimia y anorexia, control de peso, obesidad, inflamación; que comprende administrar a un sujeto con necesidad del mismo una cantidad efectiva de un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I) de conformidad a cualquiera 'de las reivindicaciones 1, 2 y 4-9, AF267B y AF150(S) o racematos, enanttómeros, diastereómeros, tautómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.