ES2568072T5 - Secuencias para la detección e identificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Secuencias para la detección e identificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina

Antecedentes de la invención

Importancia clínica de Staphylococcus aureus

Está bien documentado que la especie Staphylococcus aureus positiva a coagulasa se trata de un patógeno oportunista humano. Las infecciones intrahospitalarias ocasionadas por S. aureus son una causa importante de morbilidad y mortalidad. Algunas de las infecciones más habituales ocasionadas por S. aureus afectan a la piel e incluyen forúnculos o diviesos, celulitis, impétigo e infecciones de heridas postoperatorias en varios sitios. Algunas de las infecciones más graves producidas por S. aureus son bacteremia, neumonía, osteomielitis, endocarditis aguda, miocarditis, pericarditis, cerebritis, meningitis, síndrome de la piel escaldada y diferentes abscesos. La intoxicación alimentaria mediada por enterotoxinas estafilocócicas es otro síndrome importante asociado con S. aureus. El síndrome del choque tóxico, una enfermedad adquirida fuera del hospital, también se ha atribuido a la infección o colonización por S. aureus toxigénico (Murray et al., Eds, 1999, Manual of Clinical Microbiology, 7a ed., ASM Press, Washington, D.C.).

En los años ochenta, S. aureus resistente a meticilina (SARM) surgió en los hospitales como un problema epidemiológico y clínico importante. El SARM es resistente a todos los p-lactámicos, entre los que se incluyen las penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos y monobactámicos, que son los antibióticos utilizados con más frecuencia para curar las infecciones por S. aureus. Las infecciones por SARM solo se pueden tratar con antibióticos más costosos y más tóxicos, que normalmente se utilizan como la última línea de defensa. Dado que los SARM pueden propagarse con facilidad de un paciente a otro a través del personal, los hospitales de todo el mundo se enfrentan con el problema de controlar el SARM. Por lo tanto, es necesario desarrollar pruebas sencillas y rápidas de diagnóstico y de exploración para detectar y/o identificar el SARM para reducir su diseminación y mejorar el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes infectados.

La resistencia a la meticilina en S. aureus es única porque se debe a la adquisición de ADN de otros estafilococos negativos a coagulasa (ENC), que codifica la proteína de unión a penicilina (PUP) supernumeraria resistente a los plactámicos, que se encarga de las funciones biosintéticas de las PUP normales cuando la célula está expuesta a los antibióticos p-lactámicos. S. aureus normalmente contiene cuatro PUP, de las cuales la PUP 1,2 y 3 son esenciales. La PUP de baja afinidad en el SARM, denominada PUP 2a (o PUP2'), está codificada por el gen cromosómico mecA y funciona como una transpeptidasa resistente a los p-lactámicos. El gen mecA está ausente en S. aureus sensible a meticilina, pero está ampliamente distribuido entre otras especies de estafilococos y está muy conservado (Ubukata et al., 1990, Antimicrob. Agents Chemother. 34:170-172).

Cuando se determinó la secuencia de nucleótidos de la región del ADN que rodea al gen mecA de la cepa N315 de S. aureus (aislada en Japón en 1982), Hiramatsu et al. descubrieron que un nuevo elemento genético, denominado casete cromosómico estafilocócico de mec (SCCmec, por su nombre en inglés), insertado en el cromosoma, llevaba el gen mecA. SCCmec es un elemento genético móvil caracterizado por la presencia de repeticiones directas e inversas terminales, un conjunto de genes de recombinasas específicas de sitio (ccrA y ccrB) y el complejo génico mecA (Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458; Katayama et al, 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:1549-1555). El elemento se escinde con precisión del cromosoma de la cepa N315 de S. aureus y se integra en un sitio cromosómico específico de S. aureus en la misma orientación mediante la función de un conjunto único de genes de recombinasas que comprenden ccrA y ccrB. Se descubrieron dos nuevos elementos genéticos de SCCmec que compartían características estructurales similares cuando se clonó y secuenció la región del ADN que rodeaba el gen mecA de las cepas de SARM NCTC 10442 (la primera cepa de SARM aislada en Inglaterra en 1961) y 85/2082 (una cepa de Nueva Zelanda aislada en 1985). Los tres SCCmec se han denominado tipo I (NCTC 10442), tipo II (N315) y tipo III (85/2082) basándose en el año del aislamiento de las cepas (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother.45:1323-1336) (figura 1). Hiramatsu et al. han descubierto que los ADN de SCCmec están integrados en un sitio específico en el cromosoma de S. aureus sensible a meticilina (SASM). Estos caracterizaron las secuencias de nucleótidos de las regiones alrededor de los extremos izquierdo y derecho del ADN de SCCmec (es decir, atíL y attR, respectivamente), así como las regiones alrededor del sitio de integración del ADN de SCCmec (es decir, attBscc, que es el sitio de conexión en el cromosoma bacteriano para el ADN de SCCmec). El sitio attBscc se localizaba en el extremo 3' de un nuevo marco de lectura abierto (ORF, open reading frame), orfX. El orfX posiblemente codifica un polipéptido de 159 aminoácidos que comparte identidad con algunos polipéptidos identificados anteriormente, pero de función desconocida (Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458). Recientemente, Hiramatsu et al. (Ma et al, 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152) y Oliveira et al. (Oliveira et al, 2001, Microb. Drug Resist. 7:349-360) han descrito un nuevo tipo de SCCmec (tipo IV). Las secuencias del extremo derecho del nuevo SCCmec de tipo IV de las cepas de S. aureus CA05 y 8/6-3P publicadas por Hiramatsu et al. (Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152) eran casi idénticas a lo largo de 2000 nucleótidos al SCCmec de tipo II de la cepa de S.aureus N315 (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemather.45:1323-1336). No se dispone de secuencias del extremo derecho del SCCmec de tipo IV en las cepas de S. aureus HDE288 y PL72 descritas por Oliveira et al. (Oliveira et al., 2001, Microb.Drug Resist. 7:349-360).

Los métodos anteriores utilizados para detectar e identificar SARM (Saito et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33:2498-2500; Ubukata et al., 1992, J. Clin. Microbiol. 30:1728-1733; Murakami et al., 1991, J. Clin. Microbiol. 29:2240-2244; Hiramatsu et al., 1992, Microbiol. Immunol. 36:445-453), que se basan en la detección del gen mecA y de secuencias cromosómicas específicas de S. aureus, encontraron dificultades a la hora de discriminar entre los SARM y los estafilococos negativos a coagulasa (ENC) resistentes a meticilina porque el gen mecA está ampliamente distribuido tanto en S. aureus como en especies de ENC (Suzuki et al., 1992, Antimicrob. Agents. Chemother. 36:429-434). Hiramatsu et al. (patente de EE.UU. 6.156.507) han descrito un ensayo de PCR específico para SARM que utiliza cebadores que son capaces de hibridarse específicamente al extremo derecho de los 3 tipos de ADN de SCCmec en combinación con un cebador específico para el cromosoma de S. aureus, que corresponde a la secuencia de nucleótidos a la derecha del sitio de integración de SCCmec. Dado que las secuencias de nucleótidos que rodean el sitio de integración de SCCmec en otras especies estafilocócicas (tales como S. epidermidis y S. haemolyticus) son diferentes a las encontradas en S. aureus, este ensayo de PCR era específico para la detección de SARm . Este ensayo de PCR también proporcionó información para la tipificación de MREP (por su nombre en inglés, que significa «polimorfismo del extremo derecho de mec) del ADN de SCCmec (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother.45:1323-1336; Hiramatsu et al., 1996, J. Infect. Chemother. 2:117-129). Este método de tipificación se aprovecha del polimorfismo del extremo derecho de los ADN de SCCmec adyacentes al sitio de integración entre los tres tipos de SCCmec. El tipo III tiene una secuencia de nucleótidos única, mientras que el tipo II tiene una inserción de 102 nucleótidos en el extremo derecho del SCCmec de tipo I. El método de tipificación de MREP descrito por Hiramatsu et al. (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336; Hiramatsu et al., 1996, J. Infect. Chemother. 2:117-129) define el SCCmec de tipo I como el MREP de tipo i, el SCCmec de tipo II como el MREP de tipo ii y el SCCmec de tipo III como el MREP de tipo iii. Debe observarse que el método de tipificación de MREP no puede diferenciar entre el SCCmec de tipo II y el nuevo SCCmec de tipo IV descrito por Hiramatsu et al. (Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152) porque estos dos tipos de SCCmec muestran la misma secuencia de nucleótidos en el extremo derecho.

En la presente invención se ha utilizado el conjunto de cebadores que Hiramatsu et al. describen como la combinación de cebadores óptima (SEQ ID NO.: 22, 24, 28 en la patente de Estados Unidos 6.156.507 que corresponde a las SEQ ID NO.: 56, 58 y 60, respectivamente, en la presente invención) para ensayar por PCR una serie de cepas de SARM y SASM (figura 1 y tabla 1). De las 39 cepas de SARM analizadas, 20 no se amplificaron con el ensayo de PCR múltiple de Hiramatsu et al. (Tablas 2 y 3). De hecho, el método de Hiramatsu fue satisfactorio al detectar menos de 50 % de las 39 cepas de SARM analizadas. Este hallazgo demuestra que algunas cepas de SARM tienen secuencias en el extremo derecho de la unión del extremo derecho del cromosoma SCCmec que son diferentes a las identificadas por Hiramatsu et al. Por consiguiente, el sistema desarrollado por Hiramatsu et al. no permite la detección de todos los SARM. La presente invención se refiere a la generación de datos de secuencias de la unión del extremo derecho del cromosoma SCCmec que se requieren para detectar más cepas de SARM para mejorar el ensayo de Hiramatsu et al. Es necesario desarrollar más cebadores y sondas ubicuos para detectar la mayor parte de las cepas de SARM en todo el mundo.

Compendio de la invención

La invención se refiere a las realizaciones definidas en las reivindicaciones.

La invención se refiere a los siguientes artículos:

Artículo 1. El ácido nucleico de SEQ ID NO: 165 o 166, o el complemento de dicho ácido nucleico.

Artículo 2. Un oligonucleótido del ácido nucleico del artículo 1 que es específico para MREJ (mec right extremity junction, unión en el extremo derecho de mec) de SARM de tipo vii, en donde dicho oligonucleótido es adecuado para detectar específicamente MREJ de SARM de tipo vii y en donde dicho oligonucleótido se hibrida con el extremo derecho del elemento de SCCmec del ácido nucleico del artículo 1.

Artículo 3. Un par de cebadores que se hibridan con el ácido nucleico del artículo 1, que comprende

(a) un primer cebador específico para la MREJ de tipo vii, en donde dicho primer cebador se hibrida con el extremo derecho del elemento de SCCmec de la secuencia de la MREJ de tipo vii del ácido nucleico del artículo 1, y

(b) un segundo cebador que se hibrida con una secuencia cromosómica de S. aureus adyacente a dicho extremo derecho del elemento SCCmec del ácido nucleico de MREJ de tipo vii del artículo 1. en donde dichos cebadores de a) y b) permiten la generación específica de un(unos) amplicón(amplicones) que comprende(n) secuencias tanto del extremo derecho del elemento de SCCmec como del ADN cromosómico adyacente a dicho extremo derecho de dichas cepas de MREJ de SARM de tipo vii,

y en donde dicho par de cebadores es adecuado para detectar específicamente MREJ de SARM de tipo vii.

Se proporciona un método específico, ubicuo y sensible utilizando sondas y/o cebadores de amplificación para determinar la presencia y/o la cantidad de ácidos nucleicos de todas las cepas de SARM.

La ubicuidad de al menos 50 % entre las cepas que representan las cepas de SARM de los tipos IV a X es un objetivo de la presente divulgación.

Por lo tanto, se proporciona un método para detectar la presencia de una cepa de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) en una muestra, siendo la cepa de SARM resistente debido a la presencia de un inserto SCCmec que contiene un gen mecA, insertándose dicho SCCmec en ácidos nucleicos bacterianos mediante lo cual se genera una unión en el extremo derecho polimórfico (MREJ), comprendiendo el método la etapa de emparejar los ácidos nucleicos de la muestra con una pluralidad de sondas y/o cebadores, caracterizado por:

(i) los cebadores y/o las sondas son específicos de cepas de SARM y pueden emparejarse con ácidos nucleicos MREJ polimórficos, comprendiendo los MREJ polimórficos los MREJ tipo i a x; y

(ii) los cebadores y/o las sondas en su conjunto pueden emparejarse con al menos cuatro tipos de MREJ seleccionados de los tipos i a x de MREJ.

En una realización específica, todos los cebadores y/o las sondas, se seleccionan para emparejarse en condiciones de emparejamiento habituales, e incluso más específicamente, se colocan conjuntamente en el mismo recinto físico.

Se ha desarrollado un método específico utilizando cebadores y/o sondas que tienen al menos 10 nucleótidos de longitud y que pueden emparejarse con los tipos i a iii de MREJ, definidos en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 41, 199; 2, 17, 18, 19, 26, 40, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 185, 186, 197; 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 104, 184, 198 y con uno o más tipos iv a ix de MREJ, que tienen las SEQ ID nO: 42, 43, 44, 45, 46, 51; 47, 48, 49, 50; 171; 165, 166; 167; 168. Para ser perfectamente ubicuos con todas las MREJ secuenciadas, los cebadores y/o las sondas en conjunto pueden emparejarse con dichas SEQ ID NO de MREJ de los tipos i a ix.

Se han diseñado los siguientes cebadores y/o sondas específicos que tienen las siguientes secuencias:

66, 100, 101, 105, 52, 53, 54, 55, para la detección de MREJ de tipo i

56, 57, 64, 71, 72, 73, 74, 75, 76,

70, 103, 130, 132, 158, 159, 59,

62, 126, 127, 128, 129, 131, 200,

201,60, 61, 63

32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164

85, 86, 87, 88, 89

66, 97, 99, 100, 101, 106, 117, para la detección de MREJ de tipo ii

118, 124, 125, 52, 53, 54, 55, 56, 57

64, 71,72, 73, 74, 75, 76, 70,

103, 30, 32, 158, 159

59, 62

126, 127

128, 129, 131, 200, 201

60, 61,63

32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164

85, 86, 87, 88, 89

67, 98, 102, 107, 108 para la detección de MREJ de tipo iii

64, 71,72, 73, 74, 75, 76, 70,

103, 130, 132, 158, 159

58,

59, 62

126, 127

128, 129, 131, 200, 201

60,61,63

32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164

85, 86, 87, 88, 89

, 77, 145, 147 para la detección de MREJ de tipo iv , 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70,

3, 130, 132, 158, 159

, 62

6, 127

8, 129, 131, 200, 201

, 61, 63

, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164

, 86, 87, 88, 89

, 80, 146, 154, 155 para la detección de MREJ de tipo v , 71,72, 73, 74, 75, 76,

, 103, 130, 132, 158, 159

, 62

6, 127

8, 129, 131, 200, 201

, 61,63

, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164

, 86, 87, 88, 89

2, 203, 204 para la detección de MREJ de tipo vi , 71,72, 73, 74, 75, 76, 70,

3, 130, 132, 158, 159

, 62

6, 127

8, 129, 131, 200, 201

, 61,63

, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164

, 86, 87, 88, 89

2, 113, 114, 119, 120, 121, 122 para la detección de MREJ de tipo vii 3, 150, 151, 153

, 71,72, 73, 74, 75, 76, 70, 103,

0, 132, 158, 159

, 62

6, 127

8, 129, 131, 200, 201

, 61,63

, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164

, 86, 87, 88, 89

5, 116, 187, 188, 207, 208 para la detección de MREJ de tipo viii , 71,72, 73, 74, 75, 76, 70,

3, 130, 132, 158, 159

, 62

6, 127

8, 129, 131, 200, 201

, 61,63

, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164

85, 86, 87, 88, 89

109, 148, 149, 205, 206 para la detección de MREJ de tipo ix

64, 71,72, 73, 74, 75, 76

70, 103, 130, 132, 158, 159

59, 62

126, 127

128, 129, 131, 200, 201

60, 61,63

32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164

85, 86, 87, 88, 89

Entre estas, se utilizan los siguientes pares de cebadores que tienen las siguientes secuencias:

64/66, 64/100, 64/101; 59/52, para la detección de MREJ de tipo i

59/53, 59/54, 59/55, 59/56, 59/57,

60/52, 60/53, 60/54, 60/55, 60/56

60/57, 61/52, 61/53, 61/54, 61/55

61/56, 61/57, 62/52, 62/53, 62/54

62/55, 62/56, 62/57, 63/52, 63/53

63/54, 63/55, 63/56, 63/57

64/66, 64/97, 64/99, 64/100, 64/101 para la detección de MREJ de tipo ii

59/52, 59/53, 59/54, 59/55, 59/56,

59/57, 60/52, 60/53, 60/54, 60/55,

60/56, 60/57, 61/52, 61/53, 61/54,

61/55, 61/56, 61/57, 62/52, 62/53,

62/54, 62/55, 62/56, 62/57, 63/52

63/53, 63/54, 63/55, 63/56, 63/57

64/67, 64/98, 64/102; 59/58, para la detección de MREJ de tipo iii

60/58, 61/58, 62/58, 63/58

64/79 para la detección de MREJ de tipo iv

64/80 para la detección de MREJ de tipo v

64/204 para la detección de MREJ de tipo vi

64/112, 64/113 para la detección de MREJ de tipo vii

64/115, 64/116 para la detección de MREJ de tipo viii

64/109 para la detección de MREJ de tipo ix

También, entre estas, se utilizan las siguientes sondas que tienen las siguientes secuencias:

SEQ ID NO: 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164 para la detección de MREJ de los tipos i a ix.

En el método de realización más preferido, se utilizaron en conjunto los siguientes cebadores y/o sondas que tenían las siguientes secuencias de nucleótidos. Las combinaciones preferidas hacen uso de:

i) las SEQ ID NO: 64, 66, 84, 163, 164 para la detección de MREJ de tipo i

ii) las SEQ ID NO: 64, 66, 84, 163, 164 para la detección de MREJ de tipo ii

iii) las SEQ ID NO: 64, 67, 84, 163, 164 para la detección de MREJ de tipo iii

iv) las SEQ ID NO: 64, 79, 84, 163, 164 para la detección de MREJ de tipo iv

v) las SEQ ID NO: 64, 80, 84, 163, 164 para la detección de MREJ de tipo v

vi) las SEQ ID NO: 64, 112, 84, 163, 164 para la detección de MREJ de tipo vii

Todas estas sondas y cebadores pueden incluso utilizarse conjuntamente en el mismo recinto físico.

Se proporciona un método para tipificar una MREJ de una cepa SARM, que comprende las etapas de: reproducir el método anterior con cebadores y/o sondas específicos para MREJ de tipo vii, y detectar una sonda o un cebador emparejado como un indicativo de la presencia de MREJ de tipo vii.

Se desvela un ácido nucleico seleccionado de:

i) las SEQ ID NO: 42, 43, 44, 45, 46, 51 para la secuencia de MREJ de tipo iv

ii) las SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50 para la secuencia de MREJ de tipo v;

iii) las SEQ ID NO: 171 para la secuencia de MREJ de tipo vi;

iv) las SEQ ID NO: 167 para la secuencia de MREJ de tipo viii;

v) las SEQ ID NO: 168 para la secuencia de MREJ de tipo ix.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un ácido nucleico seleccionado de las SEQ ID NO: 165 y 166 para la secuencia de MREJ de tipo vii.

También son objeto de la presente divulgación los oligonucleótidos de al menos 10 nucleótidos de longitud que se hibridan con MREJ de tipo vii. Entre estos, los pares de cebadores (o sondas) tienen las siguientes SEQ ID NO: 64/112, 64/113 para la detección de MREJ de tipo vii que también se encuentra dentro del ámbito de la presente invención.

También se desvelan las SEQ ID NO:

64/66, 64/100, 64/101; 59/52, para la detección de MREJ de tipo i

59/53, 59/54, 59/55, 59/56, 59/57,

60/52, 60/53, 60/54, 60/55, 60/56

60/57, 61/52, 61/53, 61/54, 61/55

61/56, 61/57, 62/52, 62/53, 62/54

62/55, 62/56, 62/57, 63/52, 63/53

63/54, 63/55, 63/56, 63/57

64/66, 64/97, 64/99, 64/100, 64/101 para la detección de MREJ de tipo ii

59/52, 59/53, 59/54, 59/55, 59/56,

59/57, 60/52, 60/53, 60/54, 60/55,

60/56, 60/57, 61/52, 61/53, 61/54,

61/55, 61/56, 61/57, 62/52, 62/53,

62/54, 62/55, 62/56, 62/57, 63/52

63/53, 63/54, 63/55, 63/56, 63/57

64/67, 64/98, 64/102; 59/58, para la detección de MREJ de tipo iii

60/58, 61/58, 62/58, 63/58

64/79 para la detección de MREJ de tipo iv

64/80 para la detección de MREJ de tipo v

64/204 para la detección de MREJ de tipo vi

64/115, 64/116 para la detección de MREJ de tipo viii

64/109 para la detección de MREJ de tipo ix

Además, sondas internas que tienen las secuencias de nucleótidos definidas mediante una cualquiera de las SEQ ID NO: 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164, también se encuentran divulgadas. Las composiciones de materia que comprenden los cebadores y/o las sondas que se emparejan o se hibridan con MREJ de tipo vii así como con cebadores y/o sondas, que se hibridan con MREJ de tipo i a iii, son también objeto de la presente divulgación. Las composiciones preferidas comprenderían los cebadores que tuviesen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO:

64/66, 64/100, 64/101; 59/52, para la detección de MREJ de tipo i

59/53, 59/54, 59/55, 59/56, 59/57,

60/52, 60/53, 60/54, 60/55, 60/56

60/57, 61/52, 61/53, 61/54, 61/55

61/56, 61/57, 62/52, 62/53, 62/54

62/55, 62/56, 62/57, 63/52, 63/53

63/54, 63/55, 63/56, 63/57

64/66, 64/97, 64/99, 64/100, 64/101 para la detección de MREJ de tipo ii

59/52, 59/53, 59/54, 59/55, 59/56,

59/57, 60/52, 60/53, 60/54, 60/55,

60/56, 60/57, 61/52, 61/53, 61/54,

61/55, 61/56, 61/57, 62/52, 62/53,

62/54, 62/55, 62/56, 62/57, 63/52

63/53, 63/54, 63/55, 63/56, 63/57

64/67, 64/98, 64/102; 59/58, para la detección de MREJ de tipo iii

60/58, 61/58, 62/58, 63/58

64/79 para la detección de MREJ de tipo iv

64/80 para la detección de MREJ de tipo v

64/204 para la detección de MREJ de tipo vi

64/112, 64/113 para la detección de MREJ de tipo vii

64/115, 64/116 para la detección de MREJ de tipo viii

64/109 para la detección de MREJ de tipo ix,

o sondas con las SEQ ID NO: 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164, o ambos.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se proporciona particularmente un método en el que cada uno de los ácidos nucleicos de SARM o una variante o una parte de los mismos comprende una región diana seleccionada que puede hibridarse con dichos cebadores o sondas desarrollados para ser ubicuos;

en el que cada uno de dichos ácidos nucleicos o una variante o una parte de los mismos comprende una región diana seleccionada que puede hibridarse con dichos cebadores o sondas;

comprendiendo dicho método las etapas de poner en contacto dicha muestra con dichas sondas o cebadores y detectar la presencia y/o la cantidad de sondas o productos amplificados hibridados como un indicativo de la presencia y/o cantidad de SARM.

En el método, las secuencias de los fragmentos de ADN de la unión del extremo derecho del cromosoma SCCmec, en lo sucesivo con el nombre de MREJ, que representa la « unión del extremo derecho de mec », incluyendo las secuencias del extremo derecho de SCCmec y el ADN cromosómico a la derecha del sitio de integración de SCCmec, se utilizan como secuencias parentales de las que provienen los cebadores y/o las sondas. Las secuencias MREJ incluyen las secuencias de la patente así como las secuencias obtenidas de las bases de datos públicas y de la patente de Estados Unidos 6.156.507 y se seleccionaron por su capacidad para detectar de una manera sensible, específica, ubicua y rápida los ácidos nucleicos de SARM objetivo.

También se describen fragmentos de ADN y oligonucleótidos propios (cebadores y sondas).

También se describen composiciones de materias que comprenden los cebadores o las sondas de amplificación para la detección de SARM.

En los métodos y kits anteriores, las sondas y los cebadores no están limitados a ácidos nucleicos y pueden incluir, pero sin limitación, análogos de nucleótidos. Los reactivos de diagnóstico constituidos por las sondas y los cebadores pueden estar presentes en cualquier forma adecuada (unidos a un soporte sólido, líquido, liofilizado, etc.). En los métodos y kits anteriores, las reacciones de amplificación pueden incluir, pero sin limitación: a) reacción en cadena de la polimerasa (PCR), b) reacción en cadena de la ligasa (LCR), c) amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA), d) replicación automantenida de secuencia (3SR), e) amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), f) amplificación de señal de ADN ramificado (bDNA), g) amplificación mediada por transcripción (TMA), h) tecnología de sonda cíclica (CPT), i) PCR anidada, j) PCR múltiple, k) amplificación en fase sólida (SPA), l) amplificación de señal dependiente de nucleasa (NDSA), m) tecnología de amplificación por círculo rodante (RCA), n) amplificación por desplazamiento de cadena anclada, o) amplificación por círculo rodante (inmovilizada) en fase sólida. En los métodos y kits anteriores, la detección de los ácidos nucleicos de los genes diana pueden incluir tecnologías de amplificación en tiempo real o en tiempo posterior. Estas tecnologías de detección pueden incluir, pero sin limitación, los métodos basados en transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) tales como hibridación de sondas adyacentes (incluyendo métodos de sonda-sonda y sonda-cebador), sondas TaqMan, sondas fluorescibles (molecularbeacon), sondas Scorpion, sondas de nanopartículas y sondas Amplifluor. Otros métodos de detección incluyen la detección de ácidos nucleicos de genes diana mediante métodos inmunológicos, métodos de hibridación en fase sólida en filtros, microplacas o cualquier otro soporte sólido. En estos sistemas, la hibridación puede motorizarse mediante fluorescencia, quimioluminiscencia, potenciometría, espectrometría de masas, resonancia de plasmón, polarimetría, colorimetría, citometría de flujo o escanometría. La secuenciación de nucleótidos, incluyendo secuenciación mediante la terminación didesoxi o secuenciación por hibridación (por ejemplo, secuenciación utilizando una microplaca de ADN) representa otro método para detectar y caracterizar los ácidos nucleicos de los genes diana.

En una realización preferida, se utiliza a un protocolo de PCR para la amplificación de ácido nucleico.

Un método de detección de una pluralidad de posibles cepas de SARM que tienen diferentes tipos de MREJ puede realizarse en reacciones distintas y en recintos físicos distintos, un tipo al mismo tiempo. Como alternativa, puede realizarse simultáneamente para diferentes tipos en recintos físicos distintos, o en el mismo recinto físico. En un último escenario, puede realizarse una reacción de PCR múltiple que requeriría que los oligonucleótidos pudiesen emparejarse con una región diana en condiciones habituales. Dado que muchas sondas o cebadores son específicos para un tipo de MREJ determinado, la tipificación de una cepa de SARM es una posible realización. Cuando una mezcla de oligonucleótidos se empareja entre sí con más de un tipo, se utiliza en un solo recinto físico o recipiente, para diferenciar un tipo de otro se utilizarían diferentes marcadores.

Se pretende desarrollar un ensayo o kit basado en ADN para detectar e identificar SARM. Aunque las secuencias de los genes orfX y de algunos fragmentos de ADN de SCCmec se encuentran disponibles en las bases de datos públicas y se han utilizado para desarrollar ensayos basados en ADN para la detección de SARM, nuevos datos de secuencias permiten mejorar la detección e identificación de SARM que son objeto de la presente divulgación que nunca se ha caracterizado anteriormente o no se conocían pero que no muestran estar localizados en el extremo derecho del SCCmec adyacente al sitio de integración (Tabla 4). Estas nuevas secuencias podrían no haberse previsto ni detectado mediante el ensayo de PCR específico de SARM desarrollado por Hiramatsu et al. (patente de Estados Unidos 6.156.507). Estas secuencias permitirán mejorar los ensayos actuales basados en ^a Dⁿ para el diagnóstico de SARM porque permiten diseñar cebadores y sondas ubicuos para la detección e identificación de más cepas de SARM incluyendo todos los clones epidémicos principales en todo el mundo.

Los kits, cebadores y sondas de diagnóstico mencionados anteriormente pueden utilizarse para detectar y/o identificar SARM, tanto si dichos kits, cebadores y sondas de diagnóstico se utilizan para aplicaciones in vitro como in situ. Dichas muestras pueden incluir, pero sin limitación: cualquier muestra clínica, cualquier muestra ambiental, cualquier cultivo microbiano, cualquier colonia microbiana, cualquier tejido y cualquier línea celular.

También es objeto de la presente invención que dichos cebadores y sondas puedan utilizarse en solitario o en combinación con cualquier otro ensayo adecuado para detectar y/o identificar microorganismos, incluyendo pero sin limitación: cualquier ensayo basado en la detección de ácidos nucleicos, cualquier inmunoensayo, cualquier ensayo enzimático, cualquier ensayo bioquímico, cualquier ensayo lisotípico, cualquier ensayo serológico, cualquier medio de cultivo diferencial, cualquier modo de cultivo de enriquecimiento, cualquier medio de cultivo selectivo, cualquier medio de cultivo específico, cualquier medio de cultivo de identificación, cualquier medio de cultivo de numeración, cualquier cepa celular, cualquier cultivo en líneas de células específicas y cualquier ensayo de infectividad en animales.

En los métodos y kits descritos a continuación en el presente documento, las sondas oligonucleotídicas y los cebadores de amplificación proceden de secuencias más largas (es decir, de fragmentos de ADN de al menos 100 pares de bases). Todas las secuencias de ADN se han obtenido bien a partir de secuencias de la patente o de datos de bases públicas (tablas 5, 6, 7, 8 y 9).

Está claro para el experto en la técnica que las secuencias de oligonucleótidos distintas de las descritas y que son apropiadas para la detección y/o identificación de SARM, también pueden proceder de las secuencias de fragmentos de la patente o seleccionarse de secuencias de bases de datos públicas. Por ejemplo, los cebadores o sondas oligonucleotídicos pueden ser más pequeños, aunque de una longitud de al menos 10 nucleótidos, o más largos que los seleccionados; también pueden seleccionarse de cualquier parte de los fragmentos de ADN de la patente o en las secuencias seleccionadas de bases de datos públicas; también pueden ser variantes del mismo oligonucleótido. Si el ADN diana o una variante del mismo se hibrida con un oligonucleótido determinado, o si el ADN diana o una variante del mismo puede amplificarse mediante un par de cebadores de PCR oligonucleotídicos, lo contrario es también cierto; un ADN diana determinado puede hibridarse con una sonda oligonucleotídica variante o amplificarse mediante un cebador de PCR oligonucleotídico variante. Como alternativa, los oligonucleótidos pueden diseñarse a partir de dichas secuencias de fragmentos de ADN para su uso en los métodos de amplificación distintos a la PCR. Por consiguiente, el centro de la presente divulgación es la detección y/o identificación de SARM dirigiéndose a secuencias de ADN genómicas que se utilizan como una fuente de sondas y/o cebadores de amplificación oligonucleotídicos específicos y ubicuos. Aunque la selección y evaluación de oligonucleótidos adecuados con fines de diagnóstico requiere gran esfuerzo, es muy posible que el experto en la técnica obtenga, a partir de los fragmentos de ADN seleccionados, oligonucleótidos que no sean los indicados en las tablas 5, 6, 7, 8 y 9 que sean adecuados con fines de diagnóstico. Cuando un fragmento de la patente o una secuencia de la base de datos pública se seleccionan por su especificidad y ubicuidad, esto aumenta la probabilidad de que sus subconjuntos también sean específicos y ubicuos.

Los fragmentos propios de ADN de la patente se han obtenido como un repertorio de secuencias creadas amplificando ácidos nucleicos de SARM con nuevos cebadores. Estos cebadores y el repertorio de ácidos nucleicos así como el repertorio de secuencias de nucleótidos son objetos adicionales de la presente divulgación (tablas 4, 5, 6, 7, 8 y 9).

Por lo tanto, las reivindicaciones son de acuerdo con la presente invención.

Secuencias para la detección e identificación de SARM

En la descripción de la presente invención, las expresiones «ácidos nucleicos» y «secuencias» deben utilizarse indistintamente. Sin embargo, los «ácidos nucleicos» son entidades químicas mientras que las «secuencias» son los trozos de información codificados por estos «ácidos nucleicos». Tanto los ácidos nucleicos como las secuencias son fuentes de información equivalentemente valiosas para la materia que pertenece a esta invención.

Diseño y síntesis de sondas y cebadores oligonucleotídicos

Como parte de las normas del diseño, todos los oligonucleótidos (sondas para la hibridación y cebadores para la amplificación de ADN por PCR) se evaluaron con respecto a su idoneidad para la hibridación o amplificación por PCR mediante análisis informáticos utilizando programas convencionales (es decir, los programas del paquete informático de Wisconsin GCG, el programa informático de análisis de cebadores Oligo™ 6 y MFOLD 3.0). La posible idoneidad de los pares de cebadores de PCR también se evaluó antes de su síntesis verificando la ausencia de características no deseadas tales como tramos largos de un nucleótido y una alta proporción de restos G o C en el extremo 3' (Persing et al., 1993, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.). Los cebadores de amplificación de oligonucleótidos se sintetizaron utilizando un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems). Los diseños molecular beacon se evaluaron utilizando criterios establecidos por Kramer et al. (http://www.molecular-beacons.org).

La secuencia oligonucleotídica de sondas y cebadores puede proceder de cualquier cadena del ADN bicatenario. Los cebadores o las sondas pueden consistir en las bases A, G, C o T o análogos y pueden estar degenerados en una o más posiciones de nucleótidos seleccionadas (Nichols et al., 1994, Nature 369:492-493). Los cebadores y las sondas también pueden consistir en análogos de nucleótidos tales como ácidos nucleicos bloqueados (LNA) (Koskin et al., 1998, Tetrahedron 54:3607-3630) y ácidos nucleicos peptídicos (PNA) (Egholm et al., 1993, Nature 365:566-568). Los cebadores o las sondas de la divulgación pueden tener cualquier longitud adecuada y pueden seleccionarse de cualquier parte dentro de las secuencias de ADN de los fragmentos de la patente, o de las secuencias de las bases de datos seleccionadas que sean adecuadas para la detección de SARM.

Las variantes para un gen microbiano diana determinado son de origen natural y atribuibles a la variación de secuencia dentro de ese gen durante la evolución (Watson et al., 1987, Molecular Biology of the Gene, 4a ed., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Menlo Park, CA; Lewin, 1989, Genes IV, John Wiley & Sons, Nueva York, NY). Por ejemplo, diferentes cepas de la misma especie microbiana pueden tener una sola variación o más variaciones de nucleótidos en el sitio de hibridación del oligonucleótido. El experto en la técnica conocerá la existencia de ácidos nucleicos y/o secuencias variantes para un gen específico y sabrá que la frecuencia de las variaciones de secuencia depende de la presión selectiva durante la evolución en un producto génico determinado. La detección de una secuencia variante para una región entre dos cebadores de PCR puede demostrarse secuenciando el producto de amplificación. Para mostrar la presencia de variaciones de secuencia en el sitio de hibridación con cebador, se tiene que amplificar una diana de ADN más grande con cebadores de PCR fuera de ese sitio de hibridación. La secuenciación de este fragmento más largo permitirá la detección de la variación de secuencia en este sitio de hibridación con cebador. Puede aplicarse una estrategia similar para mostrar variaciones en el sitio de hibridación de una sonda. Más allá de la divergencia de los ácidos nucleico diana y/o secuencias o una parte de los mismos que no afectan significativamente a la sensibilidad y/o especificidad y/o ubicuidad de los cebadores o sondas de amplificación, el ADN microbiano variante se encuentra en el ámbito de la presente divulgación.

Amplificación del ADN

Para la amplificación del ADN mediante el método de PCR generalmente utilizado, los pares de cebadores procedían de los fragmentos de ADN de la patente o de secuencias de bases de datos públicas.

Durante la amplificación del ADN por PCR, se utilizaron dos cebadores oligonucleotídicos que se unían respectivamente a cada cadena del ADN diana desnaturalizado con calor del genoma microbiano para amplificar exponencialmente in vitro el ADN diana mediante ciclos térmicos sucesivos lo que permitió la desnaturalización del ADN, el emparejamiento de los cebadores y la síntesis de nuevas dianas en cada ciclo (Persing et al, 1993, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.).

En resumen, los protocolos de la PCR en un termociclador convencional (PTC-200 de MJ Research Inc., Watertown, MA) fueron los siguientes: se amplificaron suspensiones bacterianas estandarizadas o ADN genómico preparados de cultivos bacterianos o de especímenes clínicos en una mezcla de reacción de PCR de 20 gl. Cada reacción de PCR contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), MgCh 2,5 mM, 0,4 gM de cada cebador, 200 gM de cada uno de los cuatro dNTP (Pharmacia Biotech), albúmina de suero bovino (BSA) 3,3 gg/gl (Sigma-Aldrich Canadá Ltd, Oakville, Ontario, Canadá) y 0,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Promega Corp., Madison, WI) combinada con el anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences, Palo Alto, CA). El anticuerpo TaqStart™, que es un anticuerpo monoclonal neutralizante contra la Taq ADN polimerasa, se añadió a todas las reacciones de PCR para potenciar la especificidad y la sensibilidad de las amplificaciones (Kellogg et al., 1994, Biotechniques 16:1134-1137). El tratamiento de los cultivos bacterianos o de los especímenes clínicos consistía en un protocolo rápido para lisar las células microbianas y eliminar o neutralizar los inhibidores de la PCR (descritos en la solicitud pendiente de trámite de Estados Unidos 60/306.163). Para la amplificación del ADN genómico purificado, se añadieron muestras directamente a la mezcla de amplificación por PCR. Se utilizó un control interno, procedente de secuencias no encontradas en las secuencias MREJ diana o en el genoma humano, para verificar la eficacia de la reacción de PCR y la ausencia de inhibición de PCR significativa.

El número de ciclos realizado para los ensayos de la PCR varía según el nivel de sensibilidad requerido. Por ejemplo, el nivel de sensibilidad requerido para la detección microbiana directamente de un especimen clínico es mayor que para la detección de un cultivo microbiano. Por consiguiente, los ensayos PCR más sensibles tienen más ciclos térmicos que los probablemente necesarios para la detección directa de especímenes clínicos.

El experto en la técnica de amplificación de ácido nucleico conoce la existencia de otros procedimientos de amplificación rápidos, tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), amplificación mediada por transcripción (TMA), replicación automantenida de secuencia (3SR), amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación de señal de ADN ramificado (bDNA), tecnología de sonda cíclica (CPT), amplificación en fase sólida (SPA), tecnología de amplificación por círculo rodante (RCA), amplificación por círculo rodante en fase sólida, SDA anclada y amplificación de señal dependiente de nucleasa (NDSA) (Lee et al., 1997, Nucleic Acid Amplification Technologies: Application to Disease Diagnosis, Eaton Publishing, Boston, MA; Persing et al., 1993, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.; Westin et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18:199-204). El alcance de la presente invención no está limitado al uso de la amplificación por PCR, sino que incluye el uso de cualquier método de amplificación de ácido nucleico o cualquier otro procedimiento que pueda utilizarse para aumentar la sensibilidad y/o la rapidez de los ensayos de diagnóstico basados en ácidos nucleicos. El alcance de la presente invención también incluye el uso cualquier tecnología de amplificación y detección de ácidos nucleicos, incluyendo tecnologías de detección en tiempo real o posterior a la amplificación, cualquier tecnología de amplificación combinada con detección, cualquier tecnología con microplaca de ácido nucleico de hibridación o de micromatriz, cualquier tecnología de microplaca o micromatriz de hibridación de ácidos nucleicos, cualquier tecnología de amplificación con microplaca o combinación de tecnologías de amplificación e hibridación con microplaca. La detección e identificación mediante cualquier método de secuenciación de nucleótidos también se encuentra bajo el alcance de la presente invención.

Cualquier oligonucleótido procedente de las secuencias de ADN de MREJ de S. aureus y utilizado con cualquier tecnología de amplificación y/o hibridación de ácido nucleico también se encuentra bajo el alcance de la presente divulgación.

Evaluación del método de detección de SARM desarrollado por Hiramatsu et al.

De acuerdo con Hiramatsu et al. (Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458; Katayama et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:1549-1555; Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336, Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152), se descubrieron cuatro tipos de ADN de SCCmec entre las cepas de SARM. Se descubrió que los ADN de SCCmec estaban integrados en un sitio específico del cromosoma de SASM (denominado orfX). Desarrollaron un ensayo de PCR múltiple específico de SARM incluyendo cebadores que podían hibridarse con el extremo derecho de SCCmec de los tipos I, II y III (SEQ ID NO.: 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 en la patente de Estados Unidos 6.156.507 correspondientes a las SEQ ID nO.: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, respectivamente, en la presente divulgación) así como cebadores específicos del cromosoma de S. aureus a la derecha del sitio de integración de SCCmec (SEQ ID NO.: 25, 28, 27, 26, 29 en la patente de Estados Unidos 6.156.507 correspondientes a las SEQ ID NO.: 59, 60, 61, 62, 63, respectivamente, en la presente divulgación) (tabla 1 y figura 1). En la presente divulgación se utilizó el conjunto de cebadores descrito por Hiramatsu et al., que es la combinación de cebadores óptima (SEQ ID NO.: 22, 24 y 28 en la Patente de Estados Unidos 6.156.507 correspondientes a las SEQ ID NO.: 56, 58 y 60 en la presente invención o divulgación) para analizar por PCR una serie de cepas de SARM, SASM, ENC resistentes a meticilina (ENCRM) y ENC sensibles a meticilina (ENCSM) (tabla 2). Para analizar la ubicuidad, la especificidad y la sensibilidad de estos cebadores, se realizó un ensayo de PCR utilizando un termociclador convencional (PTC-200 de MJ Research Inc.) utilizando el siguiente protocolo: un ml de una suspensión bacteriana estandarizada tratada o de una preparación de ADN genómico purificado de bacterias se amplificó en una mezcla de reacción de PCR de 20 ml. Cada reacción de PCR contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 a 0,1%, MgCl22,5 mM, 0,4 mM de cada uno de los cebadores específicos del cromosoma de SCCmec- y S. aureus (SEQ ID NO.: 22, 24 y 28 en la Patente de Estados Unidos 6.156.507 correspondientes a las SEQ ID NO.: 56, 58 y 60 en la presente invención o divulgación), 200 mM de cada uno de los cuatro de dNTP (Pharmacia Biotech), 3,3 mg/ml de BSA (Sigma) y 0,5 U de Taq polimerasa (Promega) combinada con el anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences).

Las reacciones de la PCR se sometieron después a ciclado térmico durante 3 minutos a 94 °C seguido de 40 ciclos de 60 segundos a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 60 segundos a 55 °C para la etapa de emparejamiento y 60 segundos a 72 °C para la etapa de extensión, seguido después de una extensión terminal de 7 minutos a 72 °C utilizando un termociclador convencional (PTC-200 de MJ Research Inc.). La detección de los productos de la PCR se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa (2 %) que contenían 0,25 pg/ml de bromuro de etidio. De las 39 cepas de SARM analizadas, 20 no se amplificaron con el ensayo de PCR múltiple desarrollado por Hiramatsu et al. (ejemplo 1, tablas 2 y 3).

Con la intención de establecer un análisis de diagnóstico rápido para los SARM, los autores de la presente invención desarrollaron nuevos conjuntos de cebadores específicos del extremo derecho de SCCmec de los tipos I y II (SEQ ID NO.: 66, 100 y 101) (anexo 1), de SCCmec de tipo II (SEQ ID NO.: 97 y 99), de SCCmec de tipo III (S^eQ ID NO.: 67, 98 y 102) y en el cromosoma de S. aureus a la derecha del sitio de integración de SCCmec (SEQ ID NO.: 64, 70, 71, 72, 73, 74, 75 y 76) (tabla 5). Estos cebadores, que amplifican amplicones cortos (de 171 a 278 pb), son compatibles para su uso en ensayos rápidos con PCR (tabla 7). El diseño de estos cebadores se basó en el análisis de alineamientos de secuencias múltiples de secuencias orfX y SCCmec descritas por Hiramatsu et al. (patente de Estados Unidos 6.156.507) o disponibles en el GenBank (tabla 10, anexo I). Estos conjuntos de cebadores diferentes se utilizaron para ensayar por PCR una serie de cepas de SARM, SASM, ENCRM y ENCSM. Se desarrollaron diversos cebadores de amplificación para detectar los tres tipos de SCCmec (SEQ ID NO.: 97 y 99 para SCCmec de tipo II, SEQ ID NO.: 66, 100 y 101 para SCCmec tipos I y II y SEQ ID NO.: 67, 98 y 102 para SCCmec de tipo III). Los cebadores se seleccionaron según su especificidad por las cepas de SARM, su sensibilidad analítica en la PCR y por la longitud del producto de la PCR. Se seleccionó un conjunto de dos cebadores para la región del extremo derecho de SCCmec (SEQ ID NO.: 66 específica para SCCmec tipos I y II; SEQ ID NO.: 67 específica para SCCmec de tipo III). De los 8 cebadores diferentes diseñados para emparejarse en el cromosoma de S. aureus a la derecha del sitio de integración de SCCmec (gen que se dirige a orfX) (SEQ ID NO.: 64, 70, 71, 72, 73, 74, 75 y 76), se descubrió que solo uno (SEQ ID.: 64) era específico para SARM basándose en el análisis con una serir de cepas de SARM, SASM, ENCRM y ENCSM (Tabla 12). Por consiguiente, se desarrolló un ensayo de PCR utilizando los conjuntos de cebadores óptimos (SEQ ID NO.: 64, 66 y 67) que podrían amplificar específicamente cepas de SARM que contenían SCCmec de los tipos I, II y III (Figura 2, anexo I). Aunque el ensayo de PCR desarrollado con este nuevo conjunto de cebadores era muy sensible (es decir, permitía la detección de 2 a 5 copias del genoma para los tres tipos de SCCmec) (tabla 11), tenía los mismos inconvenientes (es decir, ausencia de ubicuidad) que los del análisis desarrollado por Hiramatsu et al. Las 20 cepas SARM que no se amplificaron con los cebadores de Hiramatsu et al. tampoco se detectaron con el conjunto de cebadores que comprendía las SEQ ID NO.: 64, 66 y 67 (tablas 3 y 12). Claramente, se necesita una herramienta de diagnóstico para conseguir al menos una ubicuidad de 50 % entre las cepas analizadas.

Con la intención de establecer un método de detección e identificación más ubicuo (es decir, capacidad para detectar todas o la mayoría de las cepas de SARM) se determinó la secuencia de la MREJ presente en estas 20 cepas de SARM que no se amplificaron. Esta investigación condujo al descubrimiento y a la identificación de siete nuevas secuencias diana distintas de MREJ que podían utilizarse con fines de diagnóstico. Estas siete nuevas secuencias de MREJ que no podían haberse previsto ni detectado con el sistema descrito en la patente de Estados Unidos 6.156.507 por Hiramatsu et al. Concretamente, la presente divulgación representa un método mejorado para la detección e identificación de SARM porque proporciona un método de diagnóstico más ubicuo que permite la detección de los principales clones de SARM epidémicos en todo el mundo.

Secuenciación de secuencias de nucleótidos de MREJ de cepas de SARM no amplificables con cebadores específicos de SCCmec de los tipos I, II y III

Dado que el ADN de 20 cepas de SARM no se amplificó con los conjuntos de cebadores desarrollados por Hiramatsu et al. (SEQ ID NO.: 22, 24 y 28 en la Patente de Estados Unidos 6.156.507 correspondientes a las SEQ ID NO.: 56, 58 y 60 en la presente invención o divulgación) (tablas 2 y 3) ni con los conjuntos de cebadores desarrollados en la presente invención o divulgación basándose en los mismas secuencias de los tres tipos de SCCmec (I, II y III) (SEQ ID NO.: 64, 66 y 67) (tabla 12), se determinó la secuencia de nucleótidos de M^r E^j para dieciséis de estas veinte cepas de SARM.

La transposasa de IS437 se asocia frecuentemente con la inserción de genes de resistencia dentro del locus mec. El gen que codifica esta transposasa se ha descrito frecuentemente en una o más copias dentro del segmento derecho de SCCmec (Oliveira et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:1906-1910; Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-36). Por lo tanto, en un primer intento para secuenciar la nueva MREJ para 16 de las 20 cepas de SARM descritas en la tabla 3, se diseñó un cebador en la secuencia del gen que codificaba la transposasa de IS437 (SEQ ID NO.: 68) y se combinó con un cebador específico de orfX a la derecha del sitio de integración de SCCmec (SEQ ID NO.: 70) (tablas 5 y 8). En la figura 3 se ilustra la estrategia utilizada para seleccionar estos cebadores.

Los fragmentos de MREJ a secuenciar se amplificaron utilizando el siguiente protocolo de amplificación: un pl de suspensión celular tratada (o de una preparación de ADN genómica purificada) se transfirió directamente a 4 tubos que contenían 39 pl de una mezcla de reacción de PCR. Cada reacción de PCR contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 a 0,1 %, MgCl22,5 mM, 1 pM de cada uno de los 2 cebadores (SEQ ID NO.: 68 y 70), 200 pM de cada uno de los cuatro dNTP, 3,3 pg/pl de BSA (Sigma-Aldrich Canadá Ltd) y 0,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Promega) combinadas con el anticuerpo TaqStart™ (BD Bisociences). Las reacciones PCR se sometieron a ciclado utilizando un termociclador convencional (PTC-200 de MJ Research Inc.) de la siguiente manera: 3 min a 94 °C seguido de 40 ciclos de 5 segundos a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 30 segundos a 55 °C para la etapa de emparejamiento y 2 min a 72 °C para la etapa de extensión.

Posteriormente, las cuatro mezclas amplificadas por PCR se agruparon y 10 pl de la mezcla se resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa a 1,2 % que contenía 0,25 pg/ml de bromuro de etidio. Después, los amplicones se visualizaron con un generador de imágenes Alfa (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) exponiendo a la luz UV a 254 nm. El tamaño del amplicón se calculó comparando con un marcador de peso molecular de 1 kb (Life Technologies, Burlington, Ontario, Canadá). La mezcla restante amplificada por PCR (150 pl, total) también se resolvió por electroforesis en un gel de agarosa a 1,2 %. Después, los amplicones se visualizaron mediante tinción con azul de metileno (Flores et al., 1992, Biotechniques, 13:203-205). El tamaño del amplicón se calculó de nuevo por comparación con un marcador de peso molecular de 1 kb. De las dieciséis cepas seleccionadas de las veinte descritas en la tabla 3, seis (CCRI-178, CCRI-8895, CCRI-8903, CCRI-1324, CCRI-1331 y CCRI-9504) se amplificaron utilizando, como cebadores, las SEQ ID NO.: 68 y 70. Para estas seis cepas de SARM, se obtuvo un producto de amplificación de 1,2 kb. La banda correspondiente a este producto de amplificación específico se escindió del gel de agarosa y se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick™ (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA). El fragmento de ADN purificado con gel se utilizó después directamente en el protocolo de secuenciación. Ambas cadenas de los productos de amplificación de MREJ se secuenciaron mediante el método de secuenciación de terminación de cadena con didesoxinucleótidos utilizando un secuenciador de ADN automático de Applied Biosystems (modelo 377) con su Kit de Reacción Listo para Secuenciar Big Dye™ Terminator Cycle (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las reacciones de secuenciación se realizaron utilizando los mismos cebadores (SEQ ID NO.: 68 y 70) y 10 ng/100 pb por reacción de los amplicones purificados con gel. La secuenciación de MREJ de las seis cepas de SARM (CCRI-178, CCRI-8895, CCRI-8903, CCRI-1324, CCRI-1331 y CCRI-9504) descritas en la tabla 3 dio lugar a las SeQ ID NO.: 42, 43, 44, 45, 46 y 51, respectivamente (tabla 4).

Para garantizar que la secuencia determinada no contenía errores atribuibles a la secuenciación de artefactos de la PCR, se secuenciaron dos preparaciones de los productos de amplificación de MREJ purificados en gel originados de dos amplificaciones de PCR independientes. Para la mayoría de los fragmentos diana, las secuencias determinadas para ambas preparaciones de amplicones fueron idénticas. Además, las secuencias de ambas cadenas fueron 100 % complementarias por lo que se confirma la alta precisión de la secuencia determinada. Las secuencias de MREJ determinadas utilizando la estrategia anterior se describe en el Listado de Secuencias y en la tabla 4.

Para secuenciar la MREJ en cepas para las que no se había obtenido ningún amplicón utilizando la estrategia que incluye cebadores específicos para el gen de la transposasa de IS437 y orfX, se utilizó otra estrategia con cebadores que se dirigen a secuencias mecA y orfX para amplificar fragmentos genómicos más largos. Se utilizó un nuevo cebador de PCR que se dirige a mecA (SEQ ID NO.: 69) (tabla 8) en combinación con el mismo cebador en la secuencia orfX (SEQ ID NO.: 70). En la figura 3 se ilustra la estrategia utilizada para seleccionar estos cebadores.

Se utilizó el siguiente protocolo de amplificación: ADN genómico purificado (300 ng) se transfirió a un volumen final de 50 pl de una mezcla de reacción de PCR. Cada reacción de PCR contenía tampón 1XHerculase (Stratagene, La Jolla, C^a ), 0,8 pM de cada uno de los 2 cebadores (SEQ ID NO.: 69 y 70), 0,56 mM de cada uno de los cuatro dNTP y 5 unidades de Herculase (Stratagene). Las reacciones de PCR se sometieron a ciclado utilizando un ciclador térmico convencional (PTC-200 de MJ Research Inc.) de la siguiente manera: 2 min a 92 °C seguido de 35 o 40 ciclos de 10 segundos a 92 °C para la etapa de desnaturalización, 30 segundos a 55 °C para la etapa de emparejamiento y 30 min a 68 °C para la etapa de extensión.

Posteriormente, 10 pl de la mezcla amplificada por PCR se resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,7 % que contenía 0,25 pg/ml de bromuro de etidio. Después, los amplicones se visualizaron como se ha descrito anteriormente. El tamaño del amplicón se calculó por comparación con un marcador de peso molecular de 1 kb (Life Technologies). Después se realizó una reacción de reamplificación en 2 a 5 tubos utilizando el mismo protocolo con 3 pl de la primera reacción de PCR utilizada como muestra de ensayo para la segunda amplificación. Las mezclas reamplificadas por PCR se agruparon y también se resolvieron por electroforesis en un gel de agarosa al 0,7 %. Después los amplicones se visualizaron por tinción con azul de metileno como se ha descrito anteriormente. Se obtuvo un producto de amplificación de aproximadamente 12 kb utilizando esta estrategia de amplificación para todas las cepas ensayadas. La banda correspondiente al producto de amplificación específico se escindió del gel de agarosa y se purificó como se ha descrito anteriormente. El fragmento de ADN purificado en gel se utilizó después directamente en el protocolo de secuenciación que se ha descrito anteriormente. Las reacciones de secuenciación se realizaron utilizando los mismos cebadores de amplificación (SEQ ID NO.: 69 y 70) y 425-495 ng de los amplicones purificados en gel por reacción. Posteriormente, los cebadores de secuenciación internos (SEQ ID NO.: 65, 77 y 96) (tabla 8) se utilizaron para obtener datos de secuencia en ambas cadenas para una parte más larga del amplicón. Cinco de las 20 cepas de SARM (CCRI-1331, CCRI-1263, CCRI-1377, CCRI-1311 y CCRI-2025) descritas en la tabla 3 se secuenciaron utilizando esta estrategia, dando lugar a las SEQ ID NO.: 46, 47, 48, 49 y 50, respectivamente (tabla 4). La secuencia dentro del gen mecA también se obtuvo a partir de los amplicones generados dando lugar a las SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30 y 31 de las cepas CCRI-2025, CCRI-1263, CCRI-1311, CCRI-1331 y CCRI-1377, respectivamente (tabla 4). También se obtuvieron secuencias más largas dentro del gen mecA y a partir de regiones cadena abajo para las cepas CCRI-2025, CCRI-1331 y CCRI-1377 como se describe más adelante.

Para obtener secuencias más largas del gen or/X, se utilizaron otras dos estrategias con cebadores que se dirigen a las secuencias mecA y or/X (en el codón de inicio) para amplificar fragmentos más largos de cromosoma. Se diseñó un nuevo cebador de PCR en or/X (SEQ ID NO.: 132) para utilizar en combinación con el mismo cebador en el gen mecA (SEQ ID NO.: 69). En la figura 3 se ilustra la estrategia utilizada para seleccionar estos cebadores. Se amplificaron ocho cepas de S. aureus (CCRI-9860, CCRI-9208, CCRI-9504, CCRI-1331, CCRI-9583, CCRI-9681, CCRI-2025 y CCRI-1377) utilizando los cebadores de las SEQ ID NO.: 69 y 132. En la figura 3 se ilustra la estrategia utilizada para seleccionar estos cebadores.

Se utilizó el siguiente protocolo de amplificación: ADN genómico purificado (de 350 a 500 ng) se transfirió a una mezcla de reacción PCR de 50 pl. Cada reacción de PCR contenía tampón 1XHerculase (Stratagene, La Jolla, CA), 0,8 pM de cada uno de los conjuntos de los 2 cebadores (SEQ ID NO.: 69 y 132), 0,56 mM de cada uno de los cuatro dNTP y 7,5 unidades de Herculase (Stratagene) con MgCl21 mM. Las reacciones de la PCR se sometieron a termociclado como se ha descrito anteriormente.

Posteriormente, 5 pl de la mezcla amplificada por PCR se resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 % que contenía 0,25 pg/ml de bromuro de etidio. Después los amplicones se visualizaron como se ha descrito anteriormente. Para una cepa de S. aureus (CCRI-9583), se realizó después una reamplificación utilizando los cebadores de las SEQ ID NO.: 96 y 158 (figura 3) en 4 tubos, utilizando el mismo protocolo PCR, con 2 pl de la primera reacción de PCR como muestra de ensayo para la segunda amplificación. Las mezclas reamplificadas por PCR se agruparon y también se resolvieron por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 %. Después los amplicones se visualizaron por tinción con azul de metileno como se ha descrito anteriormente. Se obtuvo una banda de aproximadamente 12 a 20 kb utilizando esta estrategia de amplificación dependiendo de la cepa ensayada. La banda correspondiente al producto de amplificación específico se escindió del gel de agarosa y se purificó utilizando el kit de extracción en gel QIAquick™ o el kit de extracción en gel QIAEX II (QIAGEN Inc.). Dos cepas, CCRI-9583 y CCRI-9589, también se amplificaron con los cebadores de las SEQ ID NO.: 132 y 150, generando un producto de amplificación de 1,5 kb. Se secuenciaron amplicones largos (12-20 kb) utilizando de 0,6 a 1 pg por reacción, mientras que se secuenciaron amplicones cortos (1,5 kb) utilizando 150 ng por reacción. Las reacciones de secuenciación se realizaron utilizando conjuntos de cebadores diferentes para cada una de las cepas de S. aureus: 1) SEQ ID NO.: 68, 70, 132, 145, 146, 147, 156, 157 y 158 para la cepa CCRI-9504; 2) SEQ ID NO.: 70, 132, 154 y 155 para la cepa CCRI-2025; 3) SEQ ID NO.: 70, 132, 148, 149, 158 y 159 para la cepa CCRI-9681; 4) SEQ ID NO.: 70, 132, 187, y 188 para la cepa CCRI-9860; 5) SEQ ID NO.: 70, 132, 150 y 159 para la cepa CCRI-9589, 6) SEQ ID NO.: 114, 123, 132, 150 y 158 para la cepa CCRI-9583; 7) SEQ ID NO.: 70, 132, 154 y 155 para la cepa CCRI-1377, 8) SEQ ID NO.: 70, 132, 158 y 159 para la cepa CCRI-9208; 9) SEQ ID NO: 68, 70, 132, 145, 146, 147 y 158 para la cepa CCRI-1331; y 10) SEQ ID NO.: 126 y 127 para la cepa CCRI-9770.

En una cepa (CCRI-9770), se mostró que los genes or/X y or/SA0022 estaban total o parcialmente delecionados basándose en la amplificación utilizando cebadores específicos para estos genes (SEQ ID NO: 132 y 159 y SEQ ID NO.: 128 y 129, respectivamente) (tabla 8). Posteriormente, se diseñó un nuevo cebador de PCR en o r/ SA0021 (SEQ ID NO.: 126) para utilizar en combinación con el mismo cebador en el gen mecA (SEQ ID NO.: 69). Con este conjunto de cebadores se obtuvo un producto de amplificación de 4,5 kb. La amplificación, purificación y secuenciación de amplicones se realizó como se ha descrito anteriormente.

Para obtener la secuencia de la región del SSCmec que contiene mecA para diez de las 20 cepas de SARM descritas en la tabla 3 (CCRI-9504, CCRI-2025, CCRI-9208, CCRI-1331, CCRI-9681, CCRI-9860, CCRI-9770, CCRI-9589, CCRI-9583 y CCRI-1377), el cebador descrito anteriormente diseñado en mecA (SEQ ⁱD NO.: 69) se utilizó en combinación con un cebador diseñado en la región cadena abajo de mecA (SEQ ID NO.: 118) (tabla 8). Se obtuvo un producto de amplificación de 2 kb en todas las cepas ensayadas. Para una cepa, CCRI-9583, se realizó una reamplificación con los cebadores de las SEQ ID NO.: 96 y 118 con el amplicón generado con los cebadores de las SEQ ID NO.: 69 y 132 descritos anteriormente. Las reacciones de amplificación, reamplificación, purificación de amplicones y secuenciación se realizaron como se describe anteriormente. Las reacciones de secuenciación se realizaron con los amplicones generados con las SEQ ID NO.: 69 y 132 descritas anteriormente o con las SEQ ID NO.: 69 y 118. Se utilizaron diferentes conjuntos de cebadores de secuenciación para cada una de las cepas de S. aureus: 1) SEQ ID NO.: 69, 96, 117, 118, 120, 151, 152 para las cepas CCRI-9504, CCRI-2025, CCRI-1331, CCRI-9770 y CCRI-1377; 2) SEQ ID NO.: 69, 96, 118 y 120 para las cepas CCRI-9208, CCRI-9681 y CCRI-9589; 3) SEQ ID NO: 69, 96, 117, 118, 120 y 152 para las cepas CCRI-9860; y 4) SEQ ID NO.: 96, 117, 118, 119, 120, 151 y 152 para las cepas CCRI-9583.

Las secuencias obtenidas para las 16 de las 20 cepas no amplificables por el ensayo de Hiramatsu (tabla 4) se compararon después con las secuencias disponibles en las bases de datos públicas. En todos los casos, partes de la secuencia tenían una identidad caso del 100 % con las secuencias disponibles públicas para orfX (SEQ ID NO.: 42-51, 165-168 y 171) o mecA y la región cadena abajo (SEQ ID NO.: 27-31, 189-193, 195, 197-199 y 225). Sin embargo, aunque la parte orfX de los fragmentos (SEQ ID NO.: 42-51, 165-168 y 171) compartían una identidad casi de 100 % con el gen orfX de la cepa NCTC 8325 de SASM descrita por Hiramatsu et al. (SEQ ID NO.: 3), se observó que la secuencia de ADN dentro del extremo derecho del propio SCCmec era muy diferente a la de todos los tipos I, II, III y IV descritos por Hiramatsu et al. (tabla 13, figura 4). Se obtuvieron seis nuevos tipos de secuencias diferentes.

Debe observarse que Hiramatsu et al. demostraron que SCCmec de tipo I podía asociarse con el MREP (polimorfismo del extremo derecho de mec) de tipo i, que SCCmec de tipos II y IV se asociaban con el MREP de tipo ii y que SCCmec de tipo III se asociaba con el MREP de tipo iii. Nuestros datos de secuenciación de MREJ de varias cepas de SARM conducen al descubrimiento de 6 nuevos tipos de MREP denominados tipos iv, v vi, vii, viii e ix. La MREJ que comprende distintos tipos de MREP se denominaron de acuerdo con el esquema de numeración de MREP. Por tanto, el MREP de tipo i está comprendido dentro de la MREJ de tipo i, el MREP de tipo ii está comprendido dentro de la MREJ de tipo ii y así sucesivamente hasta el MREP de tipo ix.

Las secuencias dentro del extremo derecho de SCCmec obtenidas a partir de las cepas CCRI-178, CCRI-8895, CCRI-8903, CCRI-1324, CCRI-1331 y CCRI-9504 (SEQ ID NO.: 42, 43, 44, 45, 46 y 51) eran casi idénticas entre sí y mostraron una identidad casi de 100 % con IS437 (números de acceso al GenBank AF422691, AB037671, AF411934). Sin embargo, nuestros datos de secuencia revelaron por primera vez la localización de esta secuencia IS437 en el extremo derecho de SCCmec adyacente al sitio de integración. Por lo tanto, como las secuencias en el extremo derecho de SCCmec de estas 6 cepas de SARM eran diferentes de las de SCCmec de tipo I de la cepa NCTC 10442, SCCmec de tipo II de la cepa N315, SCCmec de tipo III de la cepa 85/2082 y SCCmec de tipo IV de las cepas CA05 y 8/6-3P descritas por Hiramatsu et al. (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336; Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152), estas nuevas secuencias se denominaron MREP de tipo iv (SEQ ID NO.: 42-46 y 51). Una búsqueda BLAST con la parte SCCmec de las secuencias de MREP de tipo iv produjeron alineamientos significativos con secuencias que codifican partes de una serie de transposasas conocidas. Por ejemplo, cuando se comparó con el número de acceso a Genbank. AB037671, el MREP de tipo iv de SEQ ID NO. 51 compartió una identidad de 98 % con la supuesta transposasa de IS437 y sus regiones cadena abajo; en la alineación también había dos huecos de 7 nucleótidos cada uno.

Las secuencias obtenidas para las cepas CCRI-1263, CCRI-1377, CCRI-1311 y CCRI-2025 (SEQ ID NO.: 47-50) eran casi idénticas entre sí y diferentes de los otros tres tipos de SCCmec y de MREP de tipo iv y, por consiguiente, se denominaron MREP de tipo v. Cuando se compararon con las secuencias del Genbank utilizando BLAST, las secuencias de MREP de tipo v no compartían ninguna homología significativa con ninguna secuencia publicada, excepto por los 28 primeros nucleótidos. Este corto tramo corresponde a los últimos 11 nucleótidos codificantes de orfX, seguido de los 17 nucleótidos cadena abajo, incluyendo la repetición invertida derecha (IR-R) de SCCmec.

La secuencia obtenida de la cepa CCRI-9208 también era diferente de los tres tipos de SCCmec y MREP de tipos iv y v y, por consiguiente, se denominó MREP de tipo vi (SEQ ID NO.: 171). Después de una búsqueda con BLAST, se mostró que el MREP de tipo vi era exclusivo, exhibiendo homología no significativa con cualquier secuencia publicada.

Las secuencias obtenidas de las cepas CCRI-9583 y CCRI-9589 también eran diferentes de las de los tres tipos de SCCmec y del MREP de tipos iv a vi y por lo tanto se denominaron MREP de tipo vii (SEQ ID NO.: 165 y 166). Después de una búsqueda con BLAST, también se mostró que el MREP de tipo vii también era exclusivo, exhibiendo homología no significativa con cualquier secuencia publicada.

La secuencia obtenida de la cepa CCRI-9860 también era diferente de la de los tres tipos de SCCmec y MREP de tipos iv a vii y, por consiguiente, se denominó MREP de tipo viii (SEQ ID NO.: 167).La secuencia obtenida de la cepa CCRI-9681 también era diferente de la de los tres tipos de SCCmec y del MREP de tipos iv a viii y, por consiguiente, se denominó MREP de tipo ix (SEQ ID NO.: 168). Las búsquedas con BLAST con la parte SCCmec de las secuencias de MREP de tipos viii y ix produjeron alineaciones significativas, pero solo para los primeros ~150 nucleótidos de cada tipo de MREP. Por ejemplo, el inicio de la secuencia de MREP de tipo viii tenía una identidad de 88 % con una parte del número de acceso Genbank AB063173, pero no se descubrió homología significativa con ninguna secuencia publicada para el resto de la secuencia. De la misma manera, los primeros ~ 150 nucleótidos de MREP de tipo ix tuvieron una identidad de 97 % con la misma parte de AB063173, siendo el resto de la secuencia exclusiva. La parte homóloga corta de MREP de tipos viii y ix corresponde en AB063173 a los últimos 14 nucleótidos codificantes de orfX, la IR-R de SCCmec, y una parte de or/CM009. Aunque compartiendo semejanzas, el MREP de los tipos viii y ix son muy diferentes entre sí; como se muestra en la tabla 13, teniendo solo una identidad de 55,2 % entre los dos tipos para los primeros 500 nucleótidos de la parte SCCmec.

Finalmente, no se obtuvo ninguna secuencia dentro del SSCmec de la cepa CCRI-9770. Sin embargo, como se describe en la sección " secuenciación de secuencias de nucleótidos de MREJ de cepas de SARM no amplificables con cebadores específicos de SCCmec de los tipos I, II y III", esta cepa tiene aparentemente una deleción parcial o total de los genes or/X y or/SA0022 en el ADN cromosómico a la derecha del sitio de integración de SCCmec y esto representaría una nueva unión en el extremo derecho. Por lo tanto a esta nueva secuencia se la denominó MREP de tipo x (SEQ ID NO.: 172). Secuenciaciones futuras revelarían si esta MREJ de tipo x contiene un nuevo MREP de tipo x o si la ausencia de simplificación está de hecho ocasionada por una variación en la parte cromosómica de la MREJ.

Las secuencias de la parte de los primeros 500 nucleótidos del extremo derecho de todos los SCCmec obtenidos en la presente invención se compararon con las de los SCCmec de tipos I, II y III utilizando los programas GCG Pileup y Gap. La tabla 13 presenta las identidades a nivel de nucleótidos entre los extremos derechos del SCCmec de las seis nuevas secuencias con los del SCCmec de tipos I, II y III utilizando el programa GCG gap. Aunque el SCCmec de tipos I y II mostró una identidad de casi 79,2 % (difiriendo solamente por una inserción de 102 pb presentes en el SCCmec de tipo II) (figuras 1, 2 y 4), los restantes tipos de MREP mostraron identidades que variaban de 40,9 a 57,1 %. Esto explica por qué los extremos derechos del nuevo MREP de tipos iv a ix desvelados en la presente divulgación no se han previsto ni detectado con el sistema descrito por Hiramatsu et al.

Cuatro cepas (CCRI-1312, CCRI-1325, CCRI-9773 y CCRI-9774) descritas en la tabla 3 no se secuenciaron sino que se caracterizaron utilizando cebadores de PCR. Se observó que las cepas CCRI-1312 y CCRI-1325 contenían MREP de tipo v utilizando los cebadores de amplificación específicos descritos en los ejemplos 4, 5 y 6 mientras que se observó que las cepas CCRI-9773 y CCRI-9774 contenían MREP de tipo vii utilizando los cebadores de amplificación específicos descritos en el ejemplo 7.

Para obtener la secuencia completa del SCCmec presente en las cepas de SARM descritas en la presente invención, se desarrollaron cebadores que se dirigían al cromosoma de S. aureus a la izquierda (cadena abajo del gen mecA) del sitio de integración de SCCmec. Basándose en las secuencias de bases de datos públicas, se diseñaron 5 cebadores diferentes (SEQ ID NO.: 85-89) (tabla 9). Estos cebadores pueden utilizarse en combinación con cebadores específicos del cromosoma de S. aureus para secuenciar todo el SCCmec o, como alternativa, utilizarse en combinación con un cebador específico de mecA (SEQ ID NO.: 81) para secuenciar la unión del extremo izquierdo del SCCmec. También se desarrollaron diversos cebadores específicos para secuencias de SCCmec conocidas dispersos a lo largo del locus para obtener la secuencia completa de SCCmec (tabla 9). Estos cebadores permitirán asignar, a las cepas de SARM descritas en el presente documento, un tipo de SCCmec.

Selección de cebadores de amplificación de secuencias de SCCmec/or/X

Las secuencias de MREJ determinadas por los autores de la invención o seleccionadas de las bases de datos públicas se utilizaron para seleccionar cebadores de PCR para la detección e identificación de SARM. La estrategia utilizada para seleccionar cebadores de PCR se basó en el análisis de alineamientos múltiples de secuencias de diversas secuencias de MREJ.

Después de analizar los datos de las secuencias de los seis nuevos tipos iv a ix de MREP descritos anteriormente, se diseñaron cebadores específicos para cada una de las secuencias de los nuevos tipos de MREP (SEQ ID NO.: 79, 80, 109, 112, 113, 115, 116 y 204) (figura 2, tabla 5, ejemplos 3, 4, 5, 6, 7 y 8). Los cebadores específicos de MREP de tipos iv, v y vii (SEQ ID NO.: 79, 80 y 112) se utilizaron en PCR múltiple con los tres cebadores para detectar SCCmec de tipos I, II y III (SEQ ID NO: 64, 66 y 67) y el cebador específico de or/X de S. aureus (SEQ ID NO. 64) (ejemplos 3, 4, 5, 6 y 7). Los cebadores específicos de MREP de tipos vi, viii y ix (SEQ ID NO.: 204, 115, 116 y 109) también se diseñaron y se ensayaron frente a su diana específica (ejemplo 8).

Detección de productos de amplificación

Clásicamente, la detección de los productos de amplificación por PCR se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa con tinción de bromuro de etidio convencional como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, está claro que pueden utilizarse tres métodos para detección de productos de amplificación específicos, que pueden ser más rápidos y más prácticos para el diagnóstico habitual. Los ejemplos de dichos métodos se describen en la solicitud de patente pendiente junto con la presente WO01/23604 A2.

La detección del amplicón también se realizó mediante hibridación en soporte sólido o líquido utilizando sondas de ADN internas específicas de especie que se hibridan a un producto de amplificación. Dichas sondas pueden generarse a partir de cualquier secuencia de nuestro repertorio y diseñarse para hibridarse específicamente con los productos de amplificación de ADN que son objeto de la presente divulgación. Como alternativa, los amplicones pueden caracterizarse por secuenciación. Para ejemplos de detección y métodos de secuenciación, véase la solicitud de patente pendiente junto con la presente WO01/23604 A2.

Para mejorar la eficiencia de la amplificación de los ácidos nucleicos, la composición de la mezcla de reacción puede modificarse (Chakrabarti y Schutt, 2002, Biotechniques, 32:866-874; Al-Soud y Radstrom, 2002, J. Clin. Microbiol., 38:4463-4470; AlSoud y Radstrom, 1998, Appl. Environ. Microbiol., 64:3748-3753; Wilson, 1997, Appl. Environ. Microbiol., 63:3741-3751). Dichas modificaciones de la mezcla de reacción de amplificación incluyen el uso de diversas polimerasa o la adición de facilitadores de amplificación de ácido nucleico tales como asbetaína, BSA, sulfóxidos, proteína gp32, detergentes, cationes, cloruro de tetrametilamonio y otros.

En una realización preferida, la detección en tiempo real de la amplificación por PCR se monitorizó utilizando sondas fluorescibles en un aparato SmartCycler® (Cepheid, Sunnyvale, CA). Se desarrolló un ensayo de PCR múltiple que contenía cebadores específicos para MREP de tipos i a v y para o rfX de S. aureus (SEQ ID NO.: 64, 66, 67, 79 y 80), una sonda fluorescible específica para la secuencia de orfX (SEQ ID NO. 84, véase el anexo II y la figura 2) y un control interno para monitorizar la inhibición de la PCR. El control interno contenía secuencias complementarias a MREP de tipo iv y cebadores específicos para orfx (SEQ ID NO. 79 y 64). El ensayo también contenía una sonda fluorescible marcada con tetracloro-6-carboxifluoresceína (TET) específica para la secuencia dentro de un fragmento de ADN generado durante la amplificación del control interno. Cada reacción de PCR contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 a 0,1 %, MgCl23,45 mM, 0.8 pM de cada uno de los cebadores específicos de MREP (SEQ ID NO.: 66 y 67) y el cebador específico de orfX (SEQ ID NO.: 64), 0,4 pM de cada uno de los cebadores específicos de MREP (SEQ ID NO.: 79 y 80), 80 copias del control interno, 0,2 pM de la sonda fluorescible marcada con TET específica para el control interno, 0,2 pM de la sonda fluorescible (SEQ ID NO.: 84) marcada con 6-carboxifluoresceína (FAM), 330 pM de cada uno de los cuatro de dNTP (Pharmacia Biotech), 3,45 pg/pl de BSA (Sigma) y 0,875 U de Taq polimerasa (Promega) combinada con el anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences). La amplificación por PCR en el Smart Cycler® se realizó de la siguiente manera: 3 min. a 95 °C durante desnaturalización inicial, después, 48 ciclos de tres etapas que consistían en 5 segundos a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 15 segundos a 60 °C para la etapa de emparejamiento y 15 segundos a 72 °C para la etapa de extensión. Los ensayos de sensibilidad realizados utilizando ADN genómico purificado de una cepa de SARM de cada tipo (i a v) de MREP mostraron un límite de detección de 2 a 10 copias de genoma (ejemplo 5). Ninguno de los 26 ENCRM o de los 10 ENCSM ensayados fue positivo con este ensayo múltiple. Las ocho cepas de SARM (CCRI-9208, CCRI-9770, CCRI-9681, CCRI-9860, CCRI-9583, CCRI-9773, CCRI-9774, CCRI-9589) que llevaban las secuencias de los nuevos tipos vi, viii, ix y x de MREP, descritos en el presente documento, quedaron sin poder detectarse (ejemplo 5).

En una realización preferida, se evaluó la detección de SARM utilizando el ensayo de PCR múltiple en tiempo real en el aparato Smart Cycler® (Cepheid, Sunnyvale, CA) directamente de especímenes clínicos. Se recogió un total de 142 torundas nasales durante un programa hospitalario de vigilancia de SARM, en el Hospital General de Montreal (Montreal, Quebec, Canadá). Las muestras de las torundas se analizaron en el Centre de Recherche en Infectiologie de l'Université Laval a las 24 horas de la recogida. Después de la recepción, las torundas se sembraron en placas con agar que contenían manitol y después el material nasal de la misma torunda se preparó con un protocolo de preparación de especimen sencillo y rápido descrito en la solicitud de patente pendiente junto con la presente US 60/306.163. La identificación clásica de SARM se realizó con métodos de cultivos convencionales.

El ensayo de PCR detectó 33 de las 34 muestras positivas para SARM basándose en el método de cultivo. En comparación con el cultivo, el ensayo de PCR detectó 8 especímenes adicionales positivos a SARM con una sensibilidad de 97,1 % y una especificidad de 92,6 % (ejemplo 6). Este ensayo de PCR múltiple representa un método rápido y poderoso para la detección específica de transportadores de SARM directamente desde especímenes nasales y puede utilizarse con cualquiera de los tipos de especímenes clínicos tales como heridas, sangre o cultivo de sangre, CSF, etc.

En el presente documento, se desarrolló un ensayo de PCR múltiple que contenía cebadores específicos para MREP de tipos i, ii, iii, iv, v y vi y orfX de S. aureus (SEQ ID NO.: 66, 67, 79, 80 y 112), y tres sondas fluorescibles específicas de la secuencia de orfX que permitió la detección de los dos polimorfismos de secuencia identificados en esta región de la secuencia de orfX. Cuatro de las cepas que no se detectaron con el ensayo múltiple para la detección de MREP de tipos i a v ahora se detectaron con este ensayo múltiple, mientras que cuatro cepas de SARM (CCRI-9208, CCRI-9770, CCRI-9681, CCRI-9860) que llevaban los tipos vi, viii, ix y x de MERP descritos en la presente divulgación quedaron sin poder detectarse (ejemplo 7). También se diseñaron cebadores específicos de MREP de tipos vi, viii y ix (SEQ ID NO.: 204, 115, 116 y 109) y se mostró que detectaban sus cepas específicas diana (ejemplo 8). Aunque los cebadores y las sondas procedentes de las enseñanzas de Hiramatsu et al., permitieron la detección solo del 48,7 % (19 cepas de 39) de las cepas de SARM de la tabla 2, los cebadores y las sondas procedentes de la presente invención permitieron la detección del 97,4 % de las cepas (38 cepas de 39) (véanse los ejemplos 7 y 8). Por lo tanto puede decirse que el ensayo de la presente invención tiene una ubicuidad superior a 50 % para las cepas de SARM indicadas en la tabla 2.

Ensayos de especificidad, ubicuidad y sensibilidad para sondas y cebadores oligonucleotídicos La especificidad de las sondas y de los cebadores oligonucleotídicos se ensayó por amplificación de ADN o por hibridación con especies estafilocócicas. Todas las especies estafilocócicas ensayadas eran probablemente patógenos asociados con infecciones o posibles contaminantes que podían aislarse de especímenes clínicos. Cada ADN diana podía liberarse de las células microbianas utilizando tratamientos químicos y/o físicos convencionales para efectuar la lisis de las células (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) o como alternativa, se utilizó ADN genómico purificado con el kit de ADN GNOME™ (Qbiogene, Carlsbad, CA). Posteriormente, el ADN se sometió a amplificación con el conjunto de cebadores. Los cebadores o las sondas específicos se hibridaron solo con el ADN diana.

Posteriormente, los cebadores oligonucleotídicos descubiertos que amplificaban específicamente el ADN de SARM diana se ensayaron con respecto a su ubicuidad por amplificación (es decir, cebadores ubicuos amplificados eficazmente de la mayoría o de todos los aislados de SARM). Finalmente, la sensibilidad analítica de los ensayos de PCR se determinó utilizando diluciones con factor 10 o 2 de ADN genómico purificado de los microorganismos diana. Para la mayoría de los ensayos, se obtuvieron niveles de sensibilidad en el intervalo de 2-10 copias genómicas. La especificidad, ubicuidad y sensibilidad analítica de los ensayos de PCR se analizó bien directamente con cultivos bacterianos o con ADN genómico bacteriano purificado.

Las sondas fluorescibles se analizaron utilizando la plataforma Smart Cycler® como se ha descrito anteriormente. Se consideraba que una sonda fluorescible era específica solo cuando se hibridaba exclusivamente con ADN amplificado de MREJ de S. aureus. Se descubrió que las sondas fluorescibles eran específicas cuando se ensayaban posteriormente con respecto a su ubicuidad (es decir, sondas ubicuas detectadas eficazmente en la mayoría o en todos los aislados de SARM) por hibridación con ADN bacterianos de diversas cepas de SARM.

Cepas bacterianas

Las cepas de referencia utilizadas para construir subrrepertorios de datos de secuencias de unión del extremo derecho del cromosoma SCCmec de la patente, así como para analizar los ensayos de amplificación e hibridación, se obtuvieron de (i) la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), (ii) el Laboratorio de Salud Pública de Quebec (LSPQ) (Ste-Anne de Bellevue, Quebec, Canadá), (iii) el Centro de Control y Prevención de Enfermedades (CDC) (Atlanta, GA), (iv) el Instituto Pasteur (Paris, Francia) y V) la Colección Harmony (Londres, Reino Unido) (tabla 14). En la presente invención también se utilizaron aislados clínicos de SARM, SASM, ENCRM y ENCSM de diversas áreas geográficas (tabla 15). La identidad de la cepas de SARM e la presente invención se confirmó mediante ensayo fenotípico y se reconfirmó por análisis PCR utilizando cebadores específicos de S. aureus y cebadores específicos de mecA (SEQ ID NO.: 69 y 81) (Martineau et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:231-238). Con el fin de aclarar, a continuación se indica una lista de ejemplos, tablas, figuras y anexos de la presente invención.

Descripción de los ejemplos

Ejemplo 1: Los cebadores desarrollados por Hiramatsu et al. solo pueden detectar cepas de SARM pertenecientes a MREP de tipos i, ii y iii aunque faltan los nuevos tipos de MREP prevalentes.

Ejemplo 2: Detección e identificación de SARM utilizando cebadores específicos de secuencias de MREP de tipos i, ii, iii desarrollados en la presente divulgación.

Ejemplo 3: Desarrollo de un ensayo de PCR múltiple en un termociclador convencional para la detención e identificación de SARM basado en secuencias MREP de tipos i, ii, iii, iv y v.

Ejemplo 4: Desarrollo de un ensayo de PCR múltiple en tiempo real en el Smart Cycler® para la detección e identificación de SARM basado en secuencias de MREP de tipos i, ii, iii, iv y v.

Ejemplo 5: Desarrollo de un ensayo de PCR múltiple en tiempo real en el Smart Cycler® para la detección e identificación de SARM basado en secuencias de MREP de tipos i, ii, iii, iv y v e incluyendo un control interno. Ejemplo 6: Detección de SARM utilizando el ensayo múltiple en tiempo real en el Smart Cycler ® basado en secuencias de MREP de tipos i, ii, iii, iv y v para la detección de SARM directamente de especímenes clínicos.

Ejemplo 7: Desarrollo de un ensayo de PCR múltiple en tiempo real en el Smart Cycler para la detección e identificación de SARM basado en secuencias de MREP de tipos i, ii, iii, iv, v, vi y vii.

Ejemplo 8: Desarrollo de ensayos de PCR en tiempo real en el Smart Cycler® para la detección e identificación de SARM basado en MREP de tipos vi, viii y ix.

Descripción de las tablas

La tabla 1 proporciona información sobre todos los cebadores de PCR desarrollados por Hiramatsu et al. en la patente de Estados Unidos 6.156.507.

La tabla 2 es una recopilación de resultados (ubicuidad y especificidad) para la detección de la unión del extremo derecho de SCCmec-orfX utilizando los cebadores descritos por Hiramatsu et al. en la patente de Estados Unidos 6.156.507 en un termociclador convencional.

La tabla 3 es un listado de cepas de SARM no amplificable utilizando cebadores que se dirigen a los tipos I, II y III de las secuencias de unión del extremo derecho de SCCmec-orfX.

La tabla 4 es un listado de secuencias de nucleótidos de MREJ de Staphylococcus aureus, incluyendo las de la invención.

La tabla 5 proporciona información sobre todos los cebadores desarrollados, incluyendo los de la invención.

La tabla 6 es un listado de sondas fluorescibles desarrollados en la presente divulgación.

La tabla 7 muestra tamaños de amplicones de los diferentes pares de cebadores descritos por Hiramatsu et al. en la patente de Estados Unidos 6.156.507 o desarrollados, incluyendo los de la invención.

La tabla 8 proporciona información sobre cebadores desarrollados para la secuencia de unión del extremo derecho del cromosoma SCCmec, incluyendo de los de la invención.

La tabla 9 proporciona información sobre cebadores desarrollados para obtener la secuencia completa del SCCmec. La tabla 10 es un listado de las secuencias disponibles de las bases de datos públicas (GenBank, proyecto genoma o patente de Estados Unidos 6.156.507) utilizado para diseñar cebadores y sondas.

La tabla 11 proporciona sensibilidad analítica del ensayo de PCR desarrollado en la presente divulgación utilizando los cebadores que se dirigen a los tipos I, II y III de las secuencias de unión del extremo derecho de SCCme-orfX y realizado utilizando un termociclador convencional.

La tabla 12 es un recopilación de resultados (ubicuidad y especificidad) para la detección de SARM utilizando los cebadores desarrollados en la presente invención que se dirigen a los tipos I, II y III de las secuencias de unión del extremo derecho de SCCmec-orfX y realizado utilizando un termociclador convencional.

La tabla 13 muestra una comparación de identidades de secuencia entre los 500 primeros nucleótidos de los extremos del lado derecho de SCCmec entre 9 tipos de MREP.

La tabla 14 proporciona información sobre las cepas de referencia de SARM, SASM, ENCRM y ENCSM utilizadas para validar los ensayos de PCR desarrollados en la presente invención.

La tabla 15 proporciona información sobre el origen de las cepas clínicas de SARM, SASM, ENCRM y ENCSM utilizadas para validar los ensayos de PCR descritos en la presente invención.

La tabla 16 representa la sensibilidad analítica del ensayo de PCR desarrollado en la presente divulgación utilizando cebadores que se dirigen a 5 tipos de secuencias de MREP y realizado en un termociclador convencional.

La tabla 17 es una recopilación de resultados (ubicuidad y especificidad) para el ensayo de PCR desarrollado en la presente divulgación utilizando cebadores que se dirigen a 5 tipos de secuencias de MREP y realizado en un termociclador convencional.

La tabla 18 representa la sensibilidad analítica del ensayo de PCR desarrollado en la presente divulgación utilizando la plataforma Smart Cycler® para la detección de 5 tipos de MREP.

La tabla 19 es una recopilación de resultados (ubicuidad y especificidad) para el ensayo de PCR desarrollado en la presente divulgación utilizando cebadores y una sonda fluorescible que se dirige a 5 tipos de secuencias de MREP y realizado en la plataforma Smart Cycler®.

La tabla 20 representa la sensibilidad analítica del ensayo de PCR desarrollado en la presente invención utilizando la plataforma Smart Cycler® para la detección de 6 tipos de MREP.

La tabla 21 es una recopilación de resultados (ubicuidad y especificidad) para el ensayo de PCR desarrollado en la presente invención utilizando cebadores y una sonda fluorescible que se dirige a 6 tipos de secuencias de MREP y realizado en la plataforma Smart Cycler®.

Descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama que ilustra la posición de los cebadores desarrollados por Hiramatsu et al. (patente de Estados Unidos 6.156.507) en la unión del extremo derecho del cromosoma SCCmec para la detección e identificación de SARM.

La figura 2 es un diagrama que ilustra la posición de los cebadores divulgados que incluyen aquellos seleccionados en la presente invención en la unión del extremo derecho de SCCmec-orfX para la detección e identificación de SARM. La figura 3 es un diagrama que ilustra la posición de los cebadores divulgados que incluyen aquellos seleccionados en la presente invención para secuenciar nuevos tipos de MREP.

La figura 4 ilustra un alineamiento de secuencias de nueve tipos de MREP.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Organización esquemática de las uniones del extremo derecho de SCCmecorfX de tipos I, II y III y localización de los cebadores (SEQ ID NO: 52-63) descrita por Hiramatsu et al. para la detección e identificación de SARM. En la tabla 7 se representan los tamaños de los amplicones.

Figura 2. Organización esquemática de MREP de tipos i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii y ix y localización de los cebadores y sondas fluorescibles que se dirigen a todos los tipos de MREP (s Eq ID NO. 20, 64, 66, 67, 79, 80, 84, 112, 115, 116, 84, 163 y 164) que se desarrollaron, incluyendo los de la invención. En la tabla 7 se representan los tamaños de los amplicones.

Figura 3. Organización esquemática de las uniones del extremo derecho del cromosoma SCCmec y localización de los cebadores (SEQ ID NO. 65, 68, 69, 70, 77, 96, 118, 126, 132, 150 y 158) desarrollados para la secuenciación de MREP de tipos iv, v, vi, vii, viii, ix y x.

Figura 4. Alineamiento de secuencias múltiple de representantes de nueve tipos de MREP (representados por partes de las SEQ ID NO.: 1, 2, 104, 51, 50, 171, 165, 167 y 168 para los tipos i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii y ix, respectivamente).

Descripción de los anexos

Los anexos muestran las estrategias utilizadas para la selección de cebadores y sondas internas:

El anexo I ilustra la estrategia para la selección de cebadores de secuencias de SCCmec y orfX específicos para los tipos I y II de SCCmec.

El anexo II ilustra la estrategia para la selección de sondas fluorescible específicas para la detección en tiempo real de uniones del extremo derecho de SCCmec-orfX.

Como se muestra en estos anexos, los cebadores de amplificación seleccionados pueden contener inosinas y/o ambigüedades de bases. La inosina es un análogo nucleotídico que puede unirse específicamente a cualquiera de los cuatro nucleótidos A, C, G o T. Como alternativa, se utilizaron oligonucleótidos degenerados que constaban de una mezcla de oligonucleótidos que tenía dos o más de los cuatro nucleótidos A, C, G o T en el sitio de discordancia. La inclusión de inosina y/o de degeneraciones en los cebadores de amplificación acepta tolerancia de discordancia permitiendo de este modo la amplificación de una serie más amplia de secuencias de nucleótidos diana (Dieffenbach y Dveksler, 1995, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Ejemplos

Ejemplo 1:

Los cebadores desarrollados por Hiramatsu et al. solo pueden detectar cepas de SARM que pertenecen a MREP de tipos i, ii y iii al mismo tiempo que no detectan nuevos tipos de MREP prevalentes.

Como se muestra en la figura 1, Hiramatsu et al. han desarrollado varios cebadores que pueden hibridarse específicamente los extremos de lado derecho de los ADN de SCCmec de tipos I, II y III. Combinaron estos cebadores con cebadores específicos de la región del cromosoma de S. aureus localizada a la derecha del sitio de integración de SCCmec para detectar los SARM. El conjunto de cebadores (SEQ ID NO.: 22, 24 y 28 en la Patente de Estados Unidos 6.156.507 correspondientes a las SEQ ID NO.: 56, 58 y 60 de la presente divulgación) demostrado por Hiramatsu et al. era el más específico y ubicuo para detectar SARM. Este conjunto de cebadores ofrece productos de amplificación de 1,5 kb para el SCCmec de tipo I, de 1,6 kb para el SCCmec de tipo II y de 1,0 kb para el SCCmec de tipo III (tabla 7). Se analizó la ubicuidad y la especificidad de este ensayo por PCR múltiple con 39 cepas de SARM, 41 cepas de SASM y 9 cepas de ENCRM y 11 cepas ENCSM (tabla 2). En una mezcla de reacción de PCR de 20 pl se amplificó un pl de una suspensión bacteriana estandarizada tratada o de una preparación de ADN genómico purificado de bacterias. Cada reacción PCR contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 a 0,1%, MgCl22,5 mM, 0,4 pM de cada uno de los cebadores específicos de SCCmec- y de orfX (s Eq ID NO.: 56, 58 y 60), 200 pM de cada uno de los cuatro de dNTP (Pharmacia Biotech), 3,3 pg/pl de BSA (Sigma) y 0,5 U de Taq polimerasa (Promega) combinado con el anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences).

Las reacciones de la PCR se sometieron después a termociclado: 3 minutos a 94 °C seguido de 40 ciclos de 60 segundos a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 60 segundos a 55 °C para la etapa de emparejamiento y 60 segundos a 72 °C para la etapa de extensión, seguido después de una extensión terminal de 7 minutos a 72 °C utilizando un termociclador convencional (PTC-200 de MJ Research Inc.). La detección de los productos de la PCR se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa (2 %) que contenían 0,25 pg/ml de bromuro de etidio. No se detectó ninguna de las cepas de ENCRM o ENCSM analizadas con el conjunto de cebadores que detectaba los SCCmec de tipos I, II y III. De las 39 cepas de SARM analizadas, veinte no se detectaron con este ensayo de PCR múltiple (tablas 2 y 3). Una de estas cepas de SARM no detectada correspondía al clon portugués de SARM muy epidémico (cepa CCRI-9504; De Lencastre et al., 1994. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13:64-73) y otra correspondía al clon canadiense de SARM muy epidémico CMRSA1 (cepa CCRI-9589; Simor et al. CCDR 1999, 25­ 12, 15 de junio). Estos datos demuestran que el conjunto de cebadores desarrollado por Hiramatsu et al. (SEQ ID NO.: 22, 24 y 28 en la Patente de Estados Unidos 6.156.507 correspondientes a las SEQ ID NO.: 56, 58 y 60 en la presente divulgación) no es ubicuo para detectar los SARM y sugiere que algunas cepas de SARM tienen secuencias en la unión del extremo derecho de SCCmec que son diferentes de las identificadas por Hiramatsu et al. En los SARM se encuentran secuencias de SCCmec de otros tipos y otras secuencias en el extremo derecho del SCCmec (tipo de MREP). Una limitación de este ensayo es la detección inespecífica de 13 cepas de SASM (tabla 2).

Ejemplo 2:

Detección e identificación de SARM utilizando cebadores específicos de las secuencias de los MREP de tipos i, ii y iii desarrollados en la presente divulgación.

Basándose en los análisis de los alineamientos múltiples de las secuencias de orfX y de SCCmec descritas por Hiramatsu et al. o disponibles en el GenBank, se diseñó un conjunto de cebadores (SEQ ID NO: 64, 66, 67) capaz de amplificar segmentos cortos de las uniones en el extremo derecho de SCCmec-orfX de los tipos I, II y III a partir de cepas de SARM y discriminarlos de los de ENCRM (anexo I y figura 2). El conjunto de cebadores seleccionado ofrece productos de amplificación de 176 pb para el SCCmec de tipo I, de 278 pb para el SCCmec de tipo II y de 223 pb para el SCCmec de tipo III, y permite una amplificación rápida por PCR. Estos cebadores se utilizaron en una PCR múltiple para analizar su ubicuidad y especificidad utilizando 208 cepas de SARM, 252 cepas de SASM, 41 cepas de ENCRM y 21 cepas de ENCRM (tabla 12). La amplificación y la detección por PCR se realizó tal y como se describe en el ejemplo 1. Las reacciones de PCR se sometieron después a termociclado (3 minutos a 94 °C seguido de 30 o 40 ciclos de 1 segundo a 95 °C para la etapa de desnaturalización y de 30 segundos a 60 °C para la etapa de emparejamiento-extensión y después seguido de una extensión terminal de 2 minutos a 72 C) en un termociclador convencional (PTC-200 de MJ Research Inc.). La detección de los productos de la PCR se realizó como se describe en el ejemplo 1.

Con este conjunto de cebadores (tabla 12) no se detectó ninguna de las cepas analizadas de ENCRM ni de ENCSM. Sin embargo, las veinte cepas de SARM que no se detectaron con el conjunto de cebadores desarrollado por Hiramatsu et al. (SEQ ID NO: 56, 58 y 60) tampoco se detectaron con los cebadores desarrollados en la presente divulgación (tablas 3 y 12). Estos datos también demuestran que algunas cepas de SARM tienen secuencias en la unión del extremo derecho del cromosoma SCCmec que son diferentes de las identificadas por Hiramatsu et al. De nuevo, como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se detectaron inespecíficamente 13 cepas de SASM (tabla 12). Queda por establecer la importancia clínica de este hallazgo dado que estas cepas aparentes de SASM podrían ser el resultado de una deleción reciente en el locus de mec (Deplano et al., 2000, J. Antimicrob. Chemotherapy, 46:617-619; Inglis et al., 1990, J. Gen. Microbiol., 136:2231-2239; Inglis et al., 1993, J. Infect. Dis., 167:323-328; Lawrence et al. 1996, J. Hosp. Infect., 33:49-53; Wada et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm., 176:1319-1326).

Ejemplo 3:

Desarrollo de un ensayo de PCR múltiple en un termociclador convencional para detectar e identificar SARM basándose en secuencias de MREP de tipos i, ii, iii, iv y v.

Tras el análisis de dos de los datos de secuencias de los nuevos MREP de tipos iv y v descritos en la presente divulgación, se diseñaron dos cebadores nuevos (SEQ ID NO.: 79 y 80) y se utilizaron en un ensayo múltiple con los tres cebadores SEQ ID NO.: 64, 66 y 67 descritos en el ejemplo 2. La amplificación por PCR y la detección de los productos de la PCR se realizó como se describe en el ejemplo 2. Los análisis de sensibilidad realizados con diluciones de factor 10 o de factor 2 de ADN genómico purificado de diferentes cepas de SARM de cada tipo de MREP, mostraron un límite de detección de 5 a 10 copias del genoma (tabla 16). Se realizaron análisis de especificidad con 0,1 ng de ADN genómico purificado o con 1 pl de una suspensión bacteriana estandarizada. Todas las cepas de ENCRM o de ENCRM analizadas dieron negativo con este ensayo múltiple (tabla 17). De las 20 cepas de SARM que no se detectaron con las PCR múltiples descritas en los ejemplos 1 y 2, ahora se detectaron doce con este ensayo múltiple. De nuevo, como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se detectaron inespecíficamente 13 cepas de ^sA^s M (tabla 12). Las ocho cepas de SARM (CCRI-9208, CCRI-9583, CCRI-9773, Cc Ri-9774, CCRI-9589, CCRI-9860, Cc RI-9681, CCRI-9770) y que llevaban las secuencias de Mr EP de los nuevos tipos vi, vii, viii, ix y x descritos en la presente invencióno divulgación quedaron sin poder detectarse.

Ejemplo 4:

Desarrollo de un ensayo de PCR múltiple en tiempo real en el Smart Cycler® para la detección e identificación de SARM basado en secuencias de MREP de tipos i, ii, iii, iv y v.

El ensayo de PCR múltiple descrito en el ejemplo 3 que contenía los cebadores (SEQ ID NO.: 64, 66, 67, 79 y 80) se adaptó a la plataforma SmartCycler® (Cepheid). Se desarrolló una sonda fluorescible específica de la secuencia de or/X (SEQ ID NO. 84, véase el anexo II). Cada reacción de PCR contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 a 0,1%, MgCl23,5 mM, 0,4 pM de cada uno de los cebadores específicos de SCCmec y de or/X (SEQ ID NO.: 64, 66, 67, 79 y 80), 0,2 pM de la sonda fluorescible marcada con FAM (SEQ ID NO.: 84), 200 pM de cada uno de los cuatro dNTP, 3,3 pg/pl de BSA y 0,5 U de Taq polimerasa combinada con el anticuerpo TaqStar™. La amplificación por PCR en el Smart Cycler® se realizó de la siguiente manera: 3 min. a 94 °C para la desnaturalización inicial, después cuarenta y cinco ciclos de tres etapas que consistían en 5 segundos a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 15 segundos a 59 °C para la etapa de emparejamiento y 10 segundos a 72 °C para la etapa de extensión. La detección de la fluorescencia se realizó al final de cada etapa de emparejamiento. Los análisis de sensibilidad realizados utilizando ADN genómico purificado de varias cepas SARM de cada tipo de MREP mostraron un límite de detección de 2 a 10 copias del genoma (tabla 18). Ninguno de los ENCRM ni de los ENCSM dieron positivo con este ensayo múltiple (Tabla 19). De nuevo, como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se detectaron inespecíficamente 13 cepas de SASM. De las 20 cepas de SARM que no se detectaron con la PCR múltiple descrita en los ejemplos 1 y 2, se detectaron 12 con este ensayo múltiple. Como se describe en el ejemplo 3, las ocho cepas de SARM que llevaban las secuencias de MREP de los nuevos tipos vi, vii, viii, ix y x, descritos en la presente invención o divulgación, quedaron sin poder detectarse.

Ejemplo 5:

Desarrollo de un ensayo de PCR múltiple en tiempo real en el Smart Cycler® para la detección e identificación de SARM basado en secuencias de MREP de tipos i, ii, iii, iv y v que incluye un control interno.

El ensayo de PCR múltiple descrito en el ejemplo 4 que contenía los cebadores específicos de los MREP de tipos i a v y de or/X de S. aureus (SEQ ID NO.: 64, 66, 67, 79 y 80) y una sonda fluorescible específica de la secuencia de or/X (SEQ ID NO. 84, véase el anexo II) se optimizó para incluir un control interno que monitorice la inhibición de la PCR. Este control interno contenía secuencias complementarias a cebadores específicos de MREP de tipo iv y de or/x (SEQ ID NO. 79 y 64). El ensayo también contenía una sonda fluorescible marcada con TET específica de una secuencia dentro del amplicón generado por amplificación del control interno. Cada reacción de PCR contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 a 0,1 %, MgCl23,45 mM, 0.8 pM de cada uno de los cebadores específicos de MREP (SeQ ID NO.: 66 y 67) y el cebador específico de or/X (SEQ ID NO.: 64), 0,4 pM de cada uno de los cebadores específicos de MREP (SEQ ID NO.: 79 y 80), 80 copias del control interno, 0,2 pM de la sonda fluorescible marcada con TET específica del control interno, 0,2 pM de la sonda fluorescible marcada con FAM (SEQ ID NO.: , 84 y ), 330 pM de cada uno de los cuatro de dNTP (Pharmacia Biotech), 3,45 pg/pl de BSA (Sigma) y 0,875 U de Taq polimerasa (Promega) combinada con el anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences). La amplificación por PCR en el Smart Cycler® se realizó de la siguiente manera: 3 min. a 95 °C para la desnaturalización inicial, después cuarenta y ocho ciclos de tres etapas que consistían en 5 segundos a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 15 segundos a 60 °C para la etapa de emparejamiento y 15 segundos a 72 °C para la etapa de extensión. Los análisis de sensibilidad realizados utilizando ADN genómico purificado de una cepa de SARM de cada tipo (i a v) de MREP mostraron un límite de detección de 2 a 10 copias del genoma. Ninguno de los 26 ENCRM ni de los 10 ENCSM dieron positivo con este ensayo múltiple. De nuevo, como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se detectaron inespecíficamente 13 cepas de SASM Como se describe en los ejemplos 3 y 4, las ocho cepas de SARM que llevaban las secuencias de MREP de los nuevos tipos vi a x, descritos en la presente divulgación, quedaron sin poder detectarse.

Ejemplo 6:

Detección de SARM utilizando el ensayo múltiple en tiempo real en el Smart Cycler® basado en secuencias de MREP de tipos i, ii, iii, iv y v, directamente de especímenes clínicos.

El ensayo descrito en el ejemplo 5 se adaptó para la detección directamente de especímenes clínicos. Se recogió un total de 142 torundas nasales durante un programa hospitalario de vigilancia de SARM, en el Hospital General de Montreal (Montreal, Quebec, Canadá). Las muestras de las torundas se analizaron en el Centre de Recherche en Infectiologie de l'Université Laval a las 24 horas de la recogida. Después de la recepción, las torundas se sembraron en placas con agar que contenían manitol y después el material nasal de la misma torunda se preparó con un protocolo de preparación de especimen sencillo y rápido descrito en la solicitud de patente pendiente junto con la presente US 60/306.163. La identificación clásica de SARM se realizó con métodos de cultivos convencionales. El ensayo de PCR descrito en el ejemplo 5 detectó 33 de las 34 muestras positivas para SARM basándose en el método de cultivo. En comparación con el cultivo, el ensayo por PCR detectó 8 especímenes adicionales positivos a SARM con una sensibilidad de 97,1 % y una especificidad de 92,6 %. Este ensayo de PCR múltiple representa un método rápido y poderoso para la detección específica de transportadores de SARM directamente de especímenes nasales y puede utilizarse con cualquiera de los tipos de especímenes clínicos tales como heridas, sangre o cultivo de sangre CSF, etc.

Ejemplo 7:

Desarrollo de un ensayo de PCR múltiple en tiempo real en el Smart Cycler® para la detección e identificación de SARM basado en secuencias de MREP de tipos i, ii, iii, iv, v y vii.

Tras el análisis de los datos de secuencias del nuevo MREP de tipo vii descrito en la presente invención (SEQ ID NO.:165 y 166), se diseñaron dos cebadores nuevos (SEQ ID NO.: 112 y 113) y se analizaron en ensayos múltiples con los tres cebadores SEQ ID NO.: 64, 66 y 67 descritos en el ejemplo 2. El cebador de SEQ ID NO.: 112 se seleccionó para su uso en el ensayo múltiple basándose en su sensibilidad. También se utilizaron en el ensayo múltiple tres sondas fluorescibles (SEQ ID NO.: 84, 163 y 164) específicas de la secuencia de orfX que permitieron la detección de dos polimorfismos de secuencia identificados en esta región de la secuencia de orfX, basándose en el análisis de las SEQ ID NO.: 173-186. Cada reacción de PCR contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 a 0,1 %, MgCl23,45 mM, 0,8 pM de cada uno de los cebadores específicos de SCCmec (SeQ ID NO.: 66 y 67) y el cebador específico de orfX (SEQ ID NO.: 64), 0,4 pM de cada uno de los cebadores específicos de SCCmec (SEQ ID ⁿO.: , 79, , y 80), 0,2 pM de la sonda fluorescible marcada con FAM (SEQ ID NO.: 84), 330 pM de cada uno de los cuatro de dNTP (Pharmacia Biotech), 3,45 pg/pl de BSA (Sigma) y 0,875 U de la Taq polimerasa (Promega) combinada con el anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences). La amplificación por PCR en el Smart Cycler® se realizó de la siguiente manera: 3 min. a 95 °C durante desnaturalización inicial, después 48 ciclos de tres etapas que consistían en 5 segundos a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 15 segundos a 60 °C para la etapa de emparejamiento y 15 segundos a 72 °C para la etapa de extensión. La detección de la fluorescencia se realizó al final de cada etapa de emparejamiento. Los análisis de sensibilidad realizados utilizando ADN genómico purificado de varias cepas de SARM de cada tipo de MREP mostraron un límite de detección de 2 copias del genoma (tabla 20). Ninguno de los 26 ENCRM ni de los 8 ENCSM dieron positivo con este ensayo múltiple. De nuevo, como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se detectaron inespecíficamente 13 cepas de SASM (tabla 21). Cuatro de las cepas que no se detectaron con el ensayo múltiple para la detección de MREP de tipos i a iv ahora se detectaron con este ensayo múltiple, mientras que las cuatro cepas de SARM (CCRI-9208, CCRI-9770, CCRI-9681, CCRI-9860) que llevaban los tipos vi, viii, ix y x de MERP descritos en la presente divulgación quedaron sin poder detectarse.

Ejemplo 8:

Desarrollo de ensayos por PCR en tiempo real en el Smart Cycler® para la detección e identificación de SARM basado en MREP de tipos vi, viii, ix.

Tras el análisis de los datos de secuencias de los nuevos MREP de tipos vi, viii y ix descritos en la presente divulgación, se diseñaron dos cebadores nuevos específicos de MREP de tipo vi (SE^q ID NO.: 201), un cebador específico de MREP de tipo viii (SEQ ID NO.: 115), un cebador específico de MREP de tipo ix (SEQ iD NO.: 109) y un cebador específico de MREP tanto de tipo viii como de tipo ix (SEQ ID NO.: 116). Cada cebador de la PCR se utilizó en combinación con el cebador específico de orfX (SEQ ID NO.: 64) y se analizó frente a su cepa diana específica. Cada reacción de PCR contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 a 0,1%, MgCl23,45 mM, 0,4 pM de cada uno de los cebadores específicos de SCCmec y de orfX, 200 pM de cada uno de los cuatro dNTP, 3,4 pg/pl de BSA y 0,875 U de Taq polimerasa combinada con el anticuerpo TaqStart™. La amplificación por PCR se realizó como se describe en el ejemplo 7. Los análisis de sensibilidad realizados con ADN genómico purificado de sus respectivas cepas diana de SARM demostraron que la mejor combinación de pares de cebadores era las SEQ ID NO.: 64 y 115 para la detección de los MREP de tipos viii y ix simultáneamente. Estos nuevos cebadores específicos de SCCmec pueden utilizarse en ensayos múltiples con cebadores específicos de MREP de los tipos i, ii, ii, iv, v y vii (SEQ ID NO.: 64, 66, 67, 79 y 80) descritos en los ejemplos anteriores para proporcionar un ensayo de SARM más ubicuo.

En conclusión, se ha mejorado la ubicuidad de la detección de las cepas de SARM. Se han identificado nuevos MREJ de tipos iv a x. Entre las cepas representativas de estos nuevos tipos, los cebadores y/o las sondas de Hiramatsu conseguían detectar menos de 50 % de los mismos. Por consiguiente, se ha traspasado ampliamente la barrera de una ubicuidad de al menos 50 %, porque los cebadores y las sondas de la presente invención se diseñaron para detectar el 100 % de las cepas analizadas como representantes de los MREJ de tipos iv a ix. Por consiguiente, aunque la ubicuidad depende del grupo de cepas y de representantes que están analizándose, ahora se sabe que, aproximarse a una ubicuidad de 100 % es un objetivo alcanzable, cuando se utilizan las secuencias de las uniones del extremo derecho (MREJ) para obtener sondas y cebadores que se ocupan del polimorfismo en esta región. Dependiendo de cuantos tipos desconocidos de MREJ existan, se tiene un margen de maniobra que va del 50 % (más alto que para los cebadores de Hiramatsu con las cepas analizadas) al 100 % si se secuencian todas las MREJ existentes para obtener de manera adecuada las herramientas y los métodos de diagnóstico presentes, siguiendo las enseñanzas anteriores.

Tabla 1. Cebadores para la amplificación por PCR publicados por Hiramatsu et al. en la patente de Estados Unidos 6.156.507 encontrados en el listado de secuencias

SEQ ID NO.: Diana Posiciónab SEQ ID NO.: (presente dodumento) (patente de Estados Unidos 6.156.507) 52 MREP tipos i e ii 480 18 53 MREP tipos i e ii 758 19 54 MREP tipos i e ii 927 20 55 MREP tipos i e ii 1154 21 56 MREP tipos i e ii 1755 22 57 MREP tipos i e ii 2302 23 58 MREP tipo iii 295c 24 59 orfX 1664 25 60 orfSA0022d 3267 28 61 orfSA0022d 3585 27 62 orfX 1389 26 63 orfSA0022d 2957 29 a La posición hace referencia a la posición del nucleótido del extremo 5' del cebador.

b La numeración para las SEQ ID NO.: 52-57 se refiere a la SEQ ID NO.: 2; la numeración para la SEQ ID NO.: 58 se refiere a la SEQ ID NO.: 4; la numeración para las SEQ ID NO.: 59-63 se refiere a la SEQ ID NO.: 3.

c El cebador es el complemento inverso de la secuencia diana.

d orfSA0022 hace referencia a la designación del marco de lectura abierto del número de acceso del GenBank AP003129 (SEQ ID NO.: 231).

Tabla 2. Análisis de especificidad y ubicuidad realizados en un termociclador convencional utilizando el conjunto de cebadores óptimos descrito por Hiramatsu et al. (SEQ ID NO. : 22, 24 y 28 en la patente de Estados Unidos 6.156.507 que corresponden a las SEQ ID NO.: 56, 58 y 60, respectivamente, en el presente documento) para la detección de SARM.

Cepas Resultados de la PCR para la unión en el extremo derecho de SCCmec - orfX Positivas (%) Negativas (%)

SARM - 39 cepas 19 (48,7) 20 (51,2)

SASM - 41 cepas 13 (31,7) 28 (68,3)

ENCRM - 9 cepas* 0 (0 %) 9 (100 %)

ENCSM - 11 cepas* 0 (0 %) 11 (100 %)

* Detalles referentes a cepas de Estafilococos Negativos a Coagulasa - ENC:

ENCRM (Estafilococos Negativos a Coagulasa Resistentes a Meticilina):

S. caprae (1)

S. cohni cohnii (1)

S. epidermidis (1)

S. haemolyticus (2)

S. hominis (1)

S. sciuri (1)

S. simulans (1)

S. warneri (1)

ENCSM (Estafilococos Negativos a Coagulasa Sensibles a Meticilina):

S. cohni cohnii (1)

S. epidermidis (1)

S. equorum (1)

S. gallinarum (1)

S. haemolyticus (1)

S. lentus (1)

S. lugdunensis (1)

S. saccharolyticus (1)

S. saprophyticus (2)

S. xylosus (1)

Tabla 3. Origen de cepas de SARM que no se amplifican utilizando los cebadores desarrollados por Hiramatsu et al. (SEQ ID NO.: 22, 24 y 28 en la patente de Estados Unidos 6.156.507 correspondientes a las SEQ ID NO.: 56, 58 y 60, respectivamente, en el presente documento) así como con los cebadores desarrollados en la presente invención o divulgación se se dirigen selectivamente a MREP de tipos i, ii y iii (SEQ ID NO.: 64, 66 y 67).

Denominación de la cepa de Staphylococcus aureus:

Original CCRIa Origen ATCC BAA-40b CCRI-9504 Portugal

ATCC 33592 CCRI-178 EE.UU

R991282 CCRI-2025 Quebec, Canadá

4508 CCRI-9208 Quebec, Canadá

19121 CCRI-8895 Dinamarca

Z109 CCRI-8903 Dinamarca

45302 CCRI-1263 Ontario, Canadá

R655 CCRI-1324 Quebec, Canadá

MA 50428 CCRI-1311 Quebec, Canadá

MA 50609 CCRI-1312 Quebec, Canadá

MA 51363 CCRI-1331 Quebec, Canadá

MA 51561 CCRI-1325 Quebec, Canadá

14A0116 CCRI-9681 Polonia 23 (CCUG 41787) CCRI-9860 Suecia

SE26-1 CCRI-9770 Ontario, Canadá

SE1-1 CCRI-9583 Ontario, Canadá

ID-61880c CCRI-9589 Ontario, Canadá

SE47-1 CCRI-9773 Ontario, Canadá

SE49-1 CCRI-9774 Ontario, Canadá

39795-2 CCRI-1377 Quebec, Canadá

a CCRI significa "Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie".

b Clon portugués.

c Clon canadiense EMRSA1.

Tabla 4. Secuencias de nucleótidos de MREJ de Staphylococcus aureus, incluyendo las de la invención

SEQ ID Denominación de la cepa de Staphylococcus Diana genética

NO.: aureus:

Original CCRIa

27 R991282 CCRI-2025 mecA

28 45302 CCRI-1263 mecA

29 MA 50428 CCRI-1311 mecA

30 MA 51363 CCRI-1331 mecA

31 39795-2 CCRI-1377 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo

42 ATCC 33592 CCRI-178 MREP de tipo iv

SEQ ID Denominación de la cepa de Staphylococcus Diana genética NO.: aureus:

Original CCRIa

43 19121 CCRI-8895 MREP de tipo iv

44 Z109 CCRI-8903 MREP de tipo iv

45 R655 CCRI--1324 MREP de tipo iv

46 MA 51363 CCRI-1331 MREP de tipo iv

47 45302 CCRI-1263 MREP de tipo v

48 39795-2 CCRI-1377 MREP de tipo v

49 MA 50428 CCRI-131 MREP de tipo v

50 R991282 CCRI-2025 MREP de tipo v

51 ATCC BAA-40 CCRI-9504 MREP de tipo iv

165 SE1-1 CCRI-9583 MREP de tipo vii

166 ID-61880 CCRI-9589 MREP de tipo vii

167 23 (CCUG 41787) CCRI-9860 MREP de tipo viii

168 14A016 CCRI-9681 MREP de tipo ix

171 4508 CCRI-9208 MREP de tipo vi

172 SE26-1 CCRI-9770 orfSA0021b y 75 pb de orfSA0022b

173 26 (98/10618) CCRI-9864 MREP de tipo ii

174 27 (98/26821) CCRI-9865 MREP de tipo ii

175 28 (24344) CCRI-9866 MREP de tipo ii

176 12 (62305) CCRI-9867 MREP de tipo ii

177 22 (90/14719) CCRI-9868 MREP de tipo ii

178 23 (98/14719) CCRI-9869 MREP de tipo ii

179 32 (97S99) CCRI-9871 MREP de tipo ii

180 33 (97S100) CCRI-9872 MREP de tipo ii

181 38 (825/96) CCRI-9873 MREP de tipo ii

182 39 (842/96) CCRI-9874 MREP de tipo ii

183 43 (N8-892/99) CCRI-9875 MREP de tipo ii

184 46 (9805-0137) CCRI-9876 MREP de tipo iii

185 1 CCRI-9882 MREP de tipo ii

186 29 CCRI-9885 MREP de tipo ii

189 SE1-1 CCRI-9583 mecA y 2,2 kb de la región cadena abajo, incluyendo IS431 mec

190 ATCC BAA-40 CCRI-9504 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo

191 4508 CCRI-9208 mecA y 0,9 kb de la región cadena abajo

192 ID-61880 CCRI-9589 mecA y 0,9 kb de la región cadena abajo

193 14A016 CCRI-9681 mecA y 0,9 kb de la región cadena abajo

195 SE26-1 CCRI-9770 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo, incluyendo IS431 mec

197 ATCC 43300 CCRI-175 MREP de tipo ii

198 R522 CCRI-1262 MREP de tipo iii

199 13370 CCRI-8894 MREP de tipo i

219 ATCC BAA-40 CCRI-9504 tetK

220 MA 51363 CCRI-1331 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo

221 39795-2 CCRI-1377 IS431mec y 0,6 kb de la región cadena arriba

222 R991282 CCRI-2025 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo

223 R991282 CCRI-2025 IS431mec y 0,6 kb de la región cadena arriba

224 23 (CCUG 41787) CCRI-9860 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo

SEQ ID Denominación de la cepa de Staphylococcus Diana genética NO.: aureus:

Original CCRIa

225 23 (CCUG 41787) CCRI-9860 IS431mec y 0,6 kb de la región cadena arriba

233 14A016 CCRI-9681 MREP de tipo ix

a CCRI significa "Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie".

b orfSA0021 y orfSA0022 hace referencia a la designación del marco de lectura abierto del número de acceso del GenBank AP003129 (SEQ ID NO.: 231).

Tabla 5. Cebadores para PCR desarrollados, incluyendo los de la invención

ADN de origen

SEQ ID NO. Diana Posicióna SEQ ID NO.

64 orfX 1720 3 70 orfX 1796 3 71 orfX 1712 3 72 orfX 1749 3 73 orfX 1758 3 74 orfX 1794 3 75 orfX 1797 3 76 orfX 1798 3 66 MREP tipos i y ii 2327 2 100 MREP tipos i y ii 2323 2 101 MREP tipos i y ii 2314 2 97 MREP tipo ii 2434 2 99 MREP tipo ii 2434 2 67 MREP tipo iii 207b 4 98 MREP tipo iii 147b 4 102 MREP tipo iii 251b 4 79 MREP tipo iv 74b 43 80 MREP tipo v 50b 47 109 MREP tipo ix 652b 168 204 MREP tipo vi 642b 171 112 MREP tipo vii 503b 165 113 MREP tipo vii 165 115 MREP tipo viii 514b 167 116 MREP tipo viii 601b 167 a La posición hace referencia a la posición del nucleótido del extremo 5' del cebador.

b El cebador es el complemento inverso de la secuencia diana.

Tabla 6. Sondas fluorescibles desarrolladas en la presente divulgación

SEQ ID NO. Diana Posición

32 orfX 86a

83 orfX 86a

84 orfX ^34a,b

160 orfX

161 orfX ^34a,b

162 orfX 114a

163 orfX 34ab

164 orfX 34ab

a Se refiere a la posición de nucleótidos del extremo 5' del bucle de la sonda fluorescible en la SEQ ID NO.: 3.

b La secuencia del bucle de la sonda fluorescible es el complemento inverso de la SEQ ID NO.: 3.

Tabla 7. Longitud de los amplicones obtenidos con los diferentes pares de cebadores, incluyendo los de la invención SEQ ID NO. Dianad Longitud del amplicóna 59/52b orfX/MREP de tipo i e ii 2079 (tipo i);2181 (tipo ii)

59/53b orfX/MREP de tipo i y ii 1801 (tipo i);1903 (tipo ii)

59/54b orfX/MREP de tipo i e ii 1632 (tipo i); 1734 (tipo ii)

59/55b orfX/MREP de tipo i e ii 1405 (tipo i);1507 (tipo ii)

59/56b orfX/MREP de tipo i e ii 804 (tipo i);906 (tipo ii)

59/57b orfX/MREP de tipo i e ii 257 (tipo i);359 (tipo ii)

60/52b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 2794 (tipo i);2896 (tipo ii)

60/53b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 2516 (tipo i);2618 (tipo ii)

60/54b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 2347 (tipo i);2449 (tipo ii)

60/55b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 2120 (tipo i);2222 (tipo ii)

60/56b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 1519 (tipo i);1621 (tipo ii)

60/57b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 972 (tipo i);1074 (tipo ii)

61/52b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 2476 (tipo i);2578 (tipo ii)

61/53b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 2198 (tipo i);2300 (tipo ii)

61/54b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 2029 (tipo i);2131 (tipo ii)

61/55b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 1802 (tipo i);1904 (tipo ii)

61/56b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 1201 (tipo i);1303 (tipo ii)

61/57b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 654 (tipo i);756 (tipo ii)

62/52b orfX/MREP de tipo i e ii 2354 (tipo i); 2456 (tipo ii)

62/53b orfX/MREP de tipo i e ii 2076 (tipo i);2178 (tipo ii)

62/54b orfX/MREP de tipo i e ii 1907 (tipo i);2009 (tipo ii)

62/55b orfX/MREP de tipo i e ii 1680 (tipo i);1782 (tipo ii)

62/56b orfX/MREP de tipo i e ii 1079 (tipo i);1181 (tipo ii)

62/57b orfX/MREP de tipo i e ii 532 (tipo i);634 (tipo ii)

63/52b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 3104 (tipo i);3206 (tipo ii)

63/53b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 2826 (tipo i);2928 (tipo ii)

63/54b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 2657 (tipo i);2759 (tipo ii)

63/55b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 2430 (tipo i);2532 (tipo ii)

63/56b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 1829 (tipo i);1931 (tipo ii)

63/57b orfSA0022/MREP de tipo i e ii 1282 (tipo i);1384 (tipo ii)

59/58b orfX/MREP de tipo iii 361

60/58b orfSA0022/MREP de tipo iii 1076

61/58b orfSA0022/MREP de tipo iii 758

62/58b orfX/MREP de tipo iii 656

63/58b orfSA0022/MREP de tipo iii 1386

70/66 orfX/MREP de tipo i e ii 100 (tipo i);202 (tipo ii)

70/67 orfX/MREP de tipo iii 147 (de tipo iii)

64/66c orfX/MREP de tipo i e ii 176 (de tipo i); 278 (de tipo ii)

64/67c orfX/MREP de tipo iii 223

64/79c orfX/MREP de tipo iv 215

SEQ ID NO. Dianad Longitud del amplicón3 69/80c orfXMIREP de tipo v 196

64/97c orfXMIREP de tipo ii 171

64/98c orfXMIREP de tipo iii 163

64/99c orfXMIREP de tipo iii 171

64/100c orfXMIREP de tipos i u ii 180 (tipo i); 282 (tipo ii)

64/101c orfXMIREP de tipos i u ii 189 (tipo i); 291 (tipo ii)

64/102c orfXMIREP de tipo iii 263

64/109c orfXMIREP de tipo ix 369

64/204c orfX/MREP de tipo vi 348

64/112c orfXMIREP de tipo vii 214

64/113c orfXMIREP de tipo vii 263

64/115c orfXMIREP de tipo viii 227

64/116c orfXMIREP de tipo viii 318

a La longitud del amplicón se da en pares de bases para los tipos de MREP amplificados por el conjunto de cebadores. b Conjunto de cebadores descritos por Hiramatsu et al. en la patente de Estados Unidos 6.156.507.

c Conjunto de cebadores desarrollados en la presente invención.

d orfSA0022 hace referencia a la designación del marco de lectura abierto del número de acceso del GenBank AP003129 (SEQ ID NO.: 231)

Tabla 8. Otros cebadores desarrollados, incluyendo los de la invención

ADN de origen

SEQ ID NO. Diana Posicióna SEQ ID NO.

77 MREP de tipo iv 993 43

65 MREP de tipo v 636 47

70 orfX 1796 3

68 IS431 626 92

69 mecA 1059 78

96 mecA 1949 78

81 mecA 1206 78

114 MREP de tipo vii 629b 165

117 MREP de tipo ii 856 194

118 MREP de tipo ii 974b 194

119 MREP de tipo vii 404 189

120 MREP de tipo vii 477b 189

123 MREP de tipo vii 551 165

124 MREP de tipo ii 584 170

125 MREP de tipo ii 689b 170

126 orfSA0021 336 231

127 ofSA0021 563 231

128 orfSA0022d 2993 231

129 orfSA0022d 3467b 231

132 orfX 3700 231

145 MREP de tipo iv 988 51

146 MREP de tipo v 1386 51

147 MREP de tipo iv 891b 51

148 MREP de tipo ix 664 168

ADN de origen

SEQ ID NO. Diana Posición3 SEQ ID NO.

149 MREP de tipo ix 849b 168 150 MREP de tipo vii 1117b 165 151 MREP de tipo vii 1473 189 152 IS431mec 1592b 189 154 MREP de tipo v 996b 50 155 MREP de tipo v 935 50 156 tetK del plásmido pT181 1169b 228 157 tetK del plásmido pT181 136 228 158 orfX 2714b 2 159 orfX 2539 2 187 MREP de tipo viii 967b 167 188 MREP de tipo viii 851 167 a La posición hace referencia a la posición del nucleótido del extremo 5' del cebador.

b El cebador es el complemento inverso de la secuencia diana.

Tabla 9. Cebadores de amplificación y/o secuenciación desarrollados

ADN de origen SEQ ID NO. Diana Posicióna SEQ ID NO.

85 Cromosoma de S. aureus 197b 35 86 Cromosoma de S. aureus 198b 37 87 Cromosoma de S. aureus 197b 38 88 Cromosoma de S. aureus 1265b 39 89 Cromosoma de S. aureus 1892 3 103 orfX 1386 3 105 MREP de tipo i 2335 2 106 MREP de tipo ii 2437 2 107 MREP de tipo iii 153b 4 108 MREP de tipo iii 153b 4 121 MREP de tipo vii 1150 165 122 MREP de tipo vii 1241b 165 130 orfX 4029b 231 131 región entre ofSA0022 y orfSA0023d 3588 231 133 merB del plásmido pI258 262 226 134 merB del plásmido pI258 539b 226 135 merR del plásmido pI258 564 226 136 merR del plásmido pI258 444 227 137 merR del plásmido pI258 529 227 138 merR del plásmido pI258 530b 227 139 rep del plásmido pUB110 796 230 140 rep del plásmido pUB110 761b 230 141 rep del plásmido pUB110 600 230 142 aadD del plásmido pUB110 1320b 229 143 aadD del plásmido pUB110 759 229 144 aadD del plásmido pUB110 646 229 153 MREP de tipo vii 1030 165 ADN de origen SEQ ID NO Diana Posición SEQ ID NO.

200 ofSA0022d 871c 231

201 ofSA0022d 1006 231

202 MREP de tipo vi 648 171

203 MREP de tipo vi 883b 171

205 MREP de tipo ix 1180 168

206 MREP de tipo ix 1311b 233

207 MREP de tipo viii 1337 167

208 MREP de tipo viii 1441b 167

209 ccrA 184 232

210 ccrA 385 232

211 ccrA 643b 232

212 ccrA 1282b 232

213 ccrB 1388 232

214 ccrB 1601 232

215 ccrB 2139b 232

216 ccrB 2199b 232

217 ccrB 2647b 232

218 ccrB 2946b 232 a La posición hace referencia a la posición del nucleótido del extremo 5' del cebador

b El cebador es el complemento inverso de la secuencia diana.

c El cebador contiene dos discordancias.

d orfSA0022 y ofSA0023 hacen referencia a la designación del marco de lectura abierto del número de acceso del GenBank AP003129 (SEQ ID NO.: 231).

Tabla 10. Origen de los ácidos nucle icos y/o de las secuencias d isponib les en las bases de datos públicas que se encuentran en el listado de secuencias

SEQ ID Cepa de Fuente Número de acceso Diana genéticaab

NO. Staphylococcus

19 MR108 Base de datos AB014404 MREJ de tipo 20 85/9302 Base de datos AB014430 MREJ de tipo 21 85/9580 Base de datos AB014431 MREJ de tipo 22 85/1940 Base de datos AB014432 MREJ de tipo 23 85/6219 Base de datos AB014433 MREJ de tipo

24 64/4176 Base de datos AB014434 MREJ de tipo I de SCCmec

25 64/3846 Base de datos AB014435 MREJ de tipo I de SCCmec

26 HUC19 Base de datos AF181950 MREJ de tipo II de SCCmec

33 G3 US 6.156.507 SEQ ID NO.: 15 MREJ de tipo II de SCCmec de S.

epidermidis

34 SH 518 US 6.156.507 SEQ ID NO.: 16 MREJ de tipo II de SCCmec de S.

haemolyticus

35 ATCC 25923 US 6.156.507 SEQ ID NO.: 9 Cromosoma de S. aureus

36 STP23 US 6.156.507 SEQ ID NO.: 10 Cromosoma de S. aureus

37 STP43 US 6.156.507 SEQ ID NO.: 12 Cromosoma de S. aureus

38 STP53 US 6.156.507 SEQ ID NO.: 13 Cromosoma de S. aureus

39 476 Proyecto genomac Cromosoma de S. aureus

40 252 Proyecto genomac MREJ de tipo II de SCCmec

41 COL Proyecto MREJ de tipo I de SCCmec

genomad

78 NCTC 8325 Base de datos X52593 mecA

82 NCTC 10442 Base de datos AB033763 mecA

90 N315 Base de datos D86934 mecA

91 85/2082 Base de datos AB037671 mecA

92 NCTC 10442 Base de datos AB033763 IS431

93 N315 Base de datos D86934 IS431

94 HUC19 Base de datos AF181950 IS431

95 NCTC 8325 Base de datos X53818 IS431

104 85/2082 Base de datos AB037671 MREJ de tipo III de SCCmec

226 desconocida Base de datos L29436 merB en el plásmido pI258

227 desconocida Base de datos L29436 merR en el plásmido pI258

228 desconocida Base de datos S67449 tetK en el plásmido pT181

229 HUC19 Base de datos AF181950 aadD en el plásmido pUB110

230 HUC19 Base de datos AF181950 rep en el plásmido pUB110

231 N315 Base de datos AP003129 ortSA0021, ofSA0022, ofSA0023

232 85/2082 Base de datos AB037671 ccrA/ccrB

a MREJ se refiere a la unión en el extremo derecho de mec e incluye secuencias del extremo derecho de SCCmec y del ADN cromosómico a la derecha del sitio de integración de SCCmec.

b A menos que se especifique de otra manera, todas las secuencias se obtuvieron de cepas de S. aureus.

c Proyecto genoma del Instituto Sanger (http://www.sanger.ac.uk).

d Proyecto genoma del TIGR (Institute of Genoma Research) (http:/lwww.tigr.org).

Tabla 11. Sensib ilidad analítica del ensayo de PCR específico de SARM que se dirige a los MREP de tipos i, ii e iii en un term ocic lador convencional utilizando el conjunto de cebadores desarro llado en la presente d ivulgación (SEQ ID NO.: 64, 66 y 67).

Denominación de la cepa: Límite de detección

Original CCRIa(tipo de MREP) (número de copias del genoma)

13370 CCRI-8894 (I) 5

ATCC 43300 CCRI-175 (II) 2

35290 CCRI-1262 (III) 2

a CCRI significa "Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie".

Tabla 12. Análisis de especific idad y ubicuidad realizados en un term ocic lador convencional utilizando el conjunto de cebadores que se dirigen a los MREP de tipos i, ii e iii desarro llados en la presente ^{d ivulgación (SEQ ID NO.: 64, 66 y 67) para la detección de} SArM

Cepas Resultados de la PCR para MREJ

Positivas (%) Negativas (%) SARM - 208 cepas 188 (90,4) 20 (9,6)

SASM - 252 cepas 13 (5,2) 239 (94,8) ENCRM - 41 cepas* 0 42 (100)

ENCSM - 21 cepas* 0 21 (100)

* Detalles referentes a las cepas de ENC:

ENCRM:

S. caprae (2)

S. cohni cohnii (3)

S. cohni urealyticum (4)

S. epidermidis (8)

S. haemolyticus (9)

S. hominis (4)

S. sciuri (4)

S. sciuri sciuri (1)

S. simulans (3)

S. warneri (3)

ENCSM:

S. cohni cohnii (1)

S. epidermidis (3)

S. equorum (2)

S. felis (1)

S. gallinarum (1)

S. haemolyticusnn (1

S. hominis (1)

S. lentus (1)

S. lugdunensis (1)

S. saccharolyticus (1)

S. saprophyticus (5)

S. simulans (1)

S. warneri (1)

S. xylosus (1)

Tabla 13. Porcentaje de identidad de secuencia para los primeros 500 nucleótidos del extremo derecho de SCCmec entre los 9 tipos de MREP (polimorfismo del extremo derecho de mec)ab

Tipo de MREP i ii iii iv v vi vii viii ix

i -- 79,2 42,8 42,8 41,2 44,4 44,6 42.3 42.1 ii 43,9 47,5 44,7 41,7 45,0 52,0 57,1 iii 46,8 44,5 42,9 45,0 42,8 45,2 iv 45,8 41,4 44,3 48,0 41,3 v 45,4 43,7 47,5 44,3 vi 45,1 41,1 47,2 vii 42,8 40,9 viii

55,2 ix --a Los "primeros 500 nucleótidos" hace referencia a los 500 nucleótidos dentro del extremo derecho de SCCmec, comenzando en el sitio de integración de SCCmec en el cromosoma de Staphylococcus aureus como se muestra en la figura 4.

b Las secuencias se extrajeron de las SEQ ID NO.: 1, 2, 104, 51, 50, 171, 165, 167 y 168 para los tipos i a ix, respectivamente.

Tabla 14. Cepas de referencia utilizadas para analizar la sensibilidad y/o especificidad y/o ubicuidad de los ensayos de PCR específicos de SARM que se dirigen a secuencias de MREJ

Especies de Staphylococcus Cepas Fuente8

33591 ATCC

33592 ATCC

33593 ATCC

BAA-38 ATCC

BAA-39 ATCC

BAA-40 ATCC

BAA-41 ATCC

BAA-42 ATCC

BAA-43 ATCC

BAA-44 ATCC

F182 CDC

23 (CCUG 41787) Colección HARMONY

ID-61880 (EMRSA1) LSPQ

MA 8628 LSPQ

MA 50558 LSPQ

MA 50428 LSPQ

MA 50609 LSPQ

MA 50884 LSPQ

MA 50892 LSPQ

MA 50934 LSPQ

MA 51015 LSPQ

MA 51056 LSPQ

SARM (n = 45) MA 51085 LSPQ

MA 51172 LSPQ

MA 51222 LSPQ

MA 51363 LSPQ

MA 51561 LSPQ

MA 52034 LSPQ

Especies de Staphylococcus Cepas Fuente8 MA 52306 LSPQ MA 51520 LSPQ MA 51363 LSPQ 98/10618 Colección HARMONY 98/26821 Colección HARMONY 24344 Colección HARMONY 62305 Colección HARMONY 90/10685 Colección HARMONY 98/14719 Colección HARMONY 97S99 Colección HARMONY 97S100 Colección HARMONY 825/96 Colección HARMONY 842/96 Colección HARMONY N8-890/99 Colección HARMONY 9805-01937 Colección HARMONY 1 Kreiswirth-1 29 Kreiswirth-1 29060 ATCC ENCRM (n=4) 35983 ATCC 35984 ATCC 2514 LSPQ MA 52263 LSPQ 6538 ATCC 13301 ATCC 25923 ATCC 27660 ATCC 29213 ATCC 29247 ATCC 29737 ATCC RN 11 CDC RN 3944 CDC RN 2442 CDC 7605060113 CDC BM 4611 Instituto Pasteur BM 3093 Instituto Pasteur SASM (n = 28) 3511 LSPQ MA 5091 LSPQ MA 8849 LSPQ MA 8871 LSPQ MA 50607 LSPQ MA 50612 LSPQ MA 50848 LSPQ MA 51237 LSPQ MA 51351 LSPQ MA 52303 LSPQ MA 51828 LSPQ MA 51891 LSPQ Especies de Staphylococcus Cepas Fuente8

MA 51504 LSPQ MA 52535 LSPQ MA 52783 LSPQ 12228 ATCC 14953 ATCC 14990 ATCC 15305 ATCC 27836 ATCC 27848 ATCC 29070 ATCC 29970 ATCC ENCSM (n = 17) 29974 ATCC 35539 ATCC 35552 ATCC 35844 ATCC 35982 ATCC 43809 ATCC 43867 ATCC 43958 ATCC 49168 ATCC a ATCC significa “Colección Americana de Cultivos Tipo” (American Type Culture Collection)

LSPQ significa “Laboratorio de Salud Pública du Quebec" (Laboratorie de Santé Publique du Quebec) CDC significa “Centro de Control y Prevención de Enfermedades” (Center for Disease Control and Prevention) Tabla 15. A islados clín icos utilizados para analizar sensib ilidad y/o especific idad y/o ubicuidad de los ensayos de PCR específicos de SARM que se dirigen a secuencias de MREJ

Especies de Staphylococcus Número de cepas Fuente 150 Canadá 10 China 10 Dinamarca SARM (n =177) 9 Argentina 1 Egipto 1 Suecia 1 Polonia 3 Japón 1 Francia 208 Canadá 10 China SASM (n = 224) 4 Japón

1 EE.UU 1 Argentina 32 Canadá 3 China ENCRM (n=38) 1 Francia 1 Argentina 1 EE.UU ENCSM (n = 17) 14 Reino Unido 3 Canadá

Tabla 16. Sensib ilidad analítica de los análisis realizados en un term ocic lador convencional utilizando el conjunto de cebadores que se dirigen a los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v (SEQ ID NO.: 64, 66, 67, 79 y 80) desarro llados en la presente invención para la detección e identificación de SARM

Denominación de la cepa de Staphylococcus aureus: Límite de detección

Original CCRIa (tipo de MREP) (número de copias del genoma)

13370 CCRI-8894 (i) 10

ATCC 43300 CCRI-175 (ii) 5

9191 CCRI-2086 (ii) 10

35290 CCRI-1262 (iii) 5

352 CCRI-1266 (iii) 10

19121 CCRI-8895 (iv) 5

ATCC 33592 CCRI-178 (iv) 5

MA 50428 CCRI-1311 (v) 5

R991282 CCRI-2025 (v) 5

a CCRI significa “Colección del Centro de Investigación en Enfermedades Infecciosas” (Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie)

Tabla 17. Análisis de especific idad y ubicuidad realizados en un term ocic lador convencional utilizando el conjunto de cebadores que se dirigen a MREP de tipos i, ii, iii, iv y v (SEQ ID NO.: 64, 66, 67, 79 y 80) desarro llados en la presente divulgación para la detección e identificación de SARM

Cepas Resultados de la PCR para la unión en el extremo derecho de SCCmec - orfX Positivas (%) Negativas (%)

SARM - 35 cepasa 27 (77,1) 8 (22,9)

SASM - 44 cepas 13 (29,5) 31 (70,5)

ENCRM - 9 cepas* 0 9 (100)

ENCSM - 10 cepas* 0 10 (100)

a Las cepas de SARM incluyen las 20 cepas recogidas en la tabla 3.

* Detalles referentes a las cepas de Estafilococos Negativos a Coagulasa (ENC):

ENCRM:

S. caprae (1)

S. cohni cohnii (1)

S. epidermidis (1)

S. haemolyticus (2)

S. hominis (1)

S. sciuri (1)

S. simulans (1)

S. warneri (1)

ENCSM:

S. cohni (1)

S. epidermidis (1)

S. equorum (1)

S. haemolyticus (1)

S. lentus (1)

S. lugdunensis (1)

S. saccharolyticus (1)

S. saprophyticus (2)

S. xylosus (1)

Tabla 18. Sensib ilidad analítica de análisis realizados en el term ocic lador Smart Cycler® utilizando el conjunto de cebadores que se dirigen a MREP de tipos i, ii, iii, iv y v (SEQ ID NO.: 64, 66, 67, 79 y 80) y la sonda fluorescib le (SEQ ID NO.: 84) desarro llados en la presente divulgación para la detección e identificación de SARM

Denominación de la cepa de Staphylococcus aureus: Límite de detección

Original CCRIa (tipo de MREP) (número de copias del genoma)

13370 CCRI-8894 (i) 2

ATCC 43300 CCRI-175 (ii) 2

9191 CCRI-2086 (ii) 10

35290 CCRI-1262 (iii) 2

352 CCRI-1266 (iii) 10

ATCC 33592 CCRI-178 (iv) 2

MA 51363 CCRI-1331 (iv) 5

19121 CCRI-8895 (iv) 10

Z109 CCRI-8903 (iv) 5

45302 CCRI-1263 (v) 10

MA 50428 CCRI-1311 (v) 5

MA 50609 CCRI-1312 (v) 5

MA 51651 CCRI-1325 (v) 10

39795-2 CCRI-1377 (v) 10

R991282 CCRI-2025 (v) 2

a CCRI significa “Colección del Centro de Investigación en Enfermedades Infecciosas” (Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie)

Tabla 19. Análisis de especificidad y ubicuidad realizados en el termociclador Smart Cycler® utilizando el conjunto de cebadores que se dirigen a MREP de tipos i, ii, iii, iv y v (SEQ ID NO.: 64, 66, 67, 79 y 80) y sonda fluorescible (SEQ ID NO. : 84) desarrollados en la presente divulgación para la detección de SARM

Cepas Resultados de la PCR para MREJ

Positivas (%) Negativas (%) SARM - 29 cepasa 21 (72,4) 8 (27,6)

SASM - 35 cepas 13 (37,1) 22 (62,9) ENCRM - 14 cepas 0 14 (100) ENCSM - 10 cepas 0 10 (100) a Las cepas de SARM incluyen las 20 cepas recogidas en la tabla 3.

Detalles referentes a las cepas de ENC:

ENCRM:

S. epidermidis (1)

S. haemolyticus (5)

S. simulans (5)

S. warneri (3)

ENCSM:

S. cohni cohnii (1)

S. epidermidis (1)

S. gallinarum (1)

S. haemolyticus (1)

S. lentus (1)

S. lugdunensis (1)

S. saccharolyticus (1)

S. saprophyticusO (2)

S. xylosus (1)

Tabla 20. Sensibilidad analítica de análisis realizados en el termociclador Smart Cycler® utilizando el conjunto de cebadores que se dirigen a MREP de tipos i, ii, iii; iv, v y vii (SEQ ID NO.: 64, 66, 67, 79 y 80) y la sonda fluorescible (SEQ ID NO.: 84) desarrollados en la presente invención para la detección e identificación de S^a R^m

Denominación de la cepa de Staphylococcus aureus: Límite de detección

Original CCRIa (tipo de MREP) (número de copias del genoma)

13370 CCRI-8894 (i) 2

ATCC 43300 CCRI-175 (ii) 2

35290 CCRI-1262 (iii) 2

ATCC 33592 CCRI-178 (iv) 2

R991282 CCRI-2025 (v) 2

SE-41-1 CCRI-9771 (vii) 2

a CCRI significa “Colección del Centro de Investigación en Enfermedades Infecciosas” (Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie)

Tabla 21. Análisis de especificidad y ubicuidad realizados en el termociclador Smart Cycler® utilizando el conjunto de cebadores que se dirigen a MREP de tipos i, ii, iii, iv, vi y vii (SEQ ID NO.: 64, 66, 67, 79 y 80) y la sonda fluorescible (SEQ ID NO.: 84) desarrollados en la presente invención para la detección e identificación de SARM

Cepas Resultados de la PCR para MREJ

Positivas (%) Negativas (%) SARM - 23 cepasa 19 (82,6) 4 (17,4) SASM - 25 cepas 13 (52) 12 (48) ENCRM - 26 cepas 0 26 (100) ENCSM - 8 cepas 0 8 (100) a Las cepas de SARM incluyen las 20 cepas recogidas en la tabla 3.

Detalles referentes a las cepas de ENC:

ENCRM:

S. capitis (2)

S. caprae (1)

S. cohnii (1)

S. epidermidis (9)

S. haemolyticus (5)

S. hominis (2)

S. saprophyticus (1)

S. sciuri (2)

S. simulans (1)

S. warneri (2)

ENCSM:

S. cohni cohnii (1)

S. epidermidis (1)

S. haemolyticus (1)

S. lugdunensis (1)

S. saccharolyticus (1)

S. saprophyticus (2)

S. xylosus (1)

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. El ácido nucleico de la SEQ ID NO: 165 o 166, o el com plem ento de dicho ácido nucleico.

2. Un o ligonucleótido del ácido nucleico de la reivindicación 1, que es específico para MREJ de SARM de tipo vii, en donde dicho oligonucleótido es adecuado para detectar específicam ente MREJ de SARM de tipo vii, y en donde dicho o ligonucleótido se hibrida con el extrem o derecho del e lem ento de SCCm ec del ácido nucleico de la reivindicación ¹ .

3. Un par de cebadores que se hibrodan con el ácido nucleico de la reivindicación 1, que com prenden

(a) un prim er cebador específico para MREJ de tipo vii, en donde dicho prim er cebador se hibrida con el extrem o derecho del e lem ento de SCCm ec de la secuencia de MREJ de tipo v ii del ácido nucleico de la reivindicación 1, y (b) un seguno cebador que se hibrida con una secuencia crom osóm ica de S. aureus contigua a dicho extrem o derecho del e lem ento de SC C m ec del ácido nucleico de MREJ de tipo vii de la reivindicaicón 1,

en donde dichos cebadores de a) y b) perm iten la generación específica de un(unos) am plicón(am plicones) que com prende(n) secuencias tanto del extrem o derecho del e lem ento de SC C m ec com o ADN crom osóm ico contiguo a dicho extrem o derecho de dichas cepas de MREJ de SARM de tipo vii,

y en donde dicho par de cebadores es adecuado para detecta respecíficam ente MREJ de SARM de tipo vii.