ES2536887T3 - Métodos y secuencias para la detección e identificación de cepas de Staphylococcus aureus MREJ tipo v resistentes a meticilina - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar la presencia de cepas de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) con MREJ de tipos i, ii, iii y v, que comprende: a) poner en contacto una muestra en la que hay que analizar la presencia de dichas cepas de SARM con MREJ de tipo i, ii, iii y v, en donde dichas cepas de SARM incluyen un elemento del casete cromosómico estafilocócico de mec (SCCmec) que contiene un gen mecA insertado en el ADN cromosómico, mediante lo cual se genera una secuencia de unión en el extremo derecho (MREJ, por su nombre en inglés) polimórfica de tipos i, ii, iii o v que comprende secuencias procedentes tanto del extremo derecho del elemento SCCmec como del ADN cromosómico adjunto al extremo derecho del elemento SCCmec con un primer y un segundo cebador para cada dicho MREJ de tipos i, ii, iii y v, en donde dicho primer cebador se hibrida con dicho extremo derecho del elemento SCCmec de una secuencia de MREJ de tipo i, ii, iii o v seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID n.º 1, 20 a 25, 41 y 199, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo i, las SEQ ID n.º 2, 17 a 19, 26, 40, 173 a 183, 185, 186 y 197, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo ii, las SEQ ID n.º 4 a 16, 104, 184 y 198, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo iii, y la SEQ ID n.º 47 a 50, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo v; y en donde cada dicho segundo cebador se hibrida con una secuencia cromosómica de S. aureus para generar específicamente uno o varios amplicones si tal cepa de SARM con MREJ de tipo i, ii, iii o v está presente en dicha muestra; y b) detectar la presencia de dicho uno o varios amplicones.
Description
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El número de ciclos realizados para los ensayos de PCR varía de acuerdo con el nivel de sensibilidad requerido. Por ejemplo, el nivel de sensibilidad requerido para la detección microbiana directa en un espécimen clínico es más alto que para la detección en un cultivo microbiano. Por consiguiente, para la detección directa en especímenes clínicos se requerirán probablemente ensayos de PCR más sensibles que tengan más ciclos térmicos.
5 El experto en la técnica de amplificación de ácidos nucleicos conoce la existencia de otros procedimientos de amplificación rápidos tal como la reacción de la cadena de la ligasa (LCR), PCR tras la transcriptasa inversa (RT-PCR), la amplificación mediada por la transcripción (TMA), la replicación de secuencias automantenida (3SR), la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), ADN ramificado (bDNA), la tecnología de ciclación de sondas (CPT), la amplificación en fase sólida (SPA), la
10 tecnología de amplificación con círculo rodante (RCA), la RCA en fase sólida, la SDA anclada y la amplificación de la señal dependiente de nucleasa (NDSA) (Lee et al., 1997, Nucleic Acid Amplification Technologies: Application to Disease Diagnosis, Eaton Publishing, Boston, MA; Persing et al., 1993, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.; Westin et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18: 199204). El alcance de esta invención no se limita al uso de la amplificación por PCR, sino que más bien incluye el uso
15 de cualquier método de amplificación de ácidos nucleicos o cualquier otro procedimiento que se puede utilizar para incrementar la sensibilidad y/o la rapidez de los ensayos diagnósticos que usan ácidos nucleicos. El alcance de la presente invención también cubre el uso de cualquier amplificación de ácidos nucleicos y la tecnología de detección, que incluye las tecnologías de detección en tiempo real o postamplificación, una tecnología de amplificación combinada con la detección, una tecnología de matrices o chips de ácidos nucleicos para hibridación, un chip para
20 amplificación, o combinación de tecnologías de amplificación e hibridación de chips. La detección y la identificación mediante cualquier método de secuenciación de nucleótidos también está bajo el alcance de la presente invención.
También está bajo el alcance de esta invención cualquier oligonucleótido procedente de las secuencias de ADN de MREJ de S. aureus y utilizable en cualquier tecnología de hibridación y/o amplificación de ácidos nucleicos.
Evaluación del método de detección de SARM desarrollado por Hiramatsu et al.
25 De acuerdo con Hiramatsu et al., (Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43: 1449-1458; Katayama et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44: 1549-1555; Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1323-1336; Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1147-1152), entre las cepas de SARM se encuentran cuatro tipos de ADN de SCCmec. Hallaron que los ADN de SSCmec están integrados en un sitio específico del cromosoma de los SASM (denominado orfX). Desarrollaron un ensayo de PCR múltiplex específico para SARM que incluye
30 cebadores que pueden hibridarse en el extremo derecho de los SCCmec de tipos I, II y III (SEQ ID n.º 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 en la patente de los EE.UU. n.º 6 156 507 que corresponden a las SEQ ID n.º 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, respectivamente, en la presente invención) así como cebadores específicos del cromosoma de S. aureus a la derecha del sitio de integración de SCCmec (SEQ ID n.º 25, 28, 27, 26, 29 en la patente de los EE.UU. n.º 6 156 507 que corresponden a las SEQ ID n.º 59, 60, 61, 62, 63, respectivamente, en la presente invención) (tabla 1 y figura 1).
35 El conjunto de cebadores que Hiramatsu et al. han descrito como la combinación de cebadores óptima (SEQ ID n.º 22, 24 y 28 de la patente de los EE.UU. n.º 6 156 507 corresponden a las SEQ ID n.º 56, 58 y 60 en la presente invención) se utilizó en la presente invención para analizar por PCR una serie de cepas de SARM, SASM, SCN resistente a la meticilina (SCNRM) y SCN sensible a la meticilina (SCNSM) (tabla 2). Para comprobar la ubicuidad, la especificidad y la sensibilidad de estos cebadores, se utilizó un ensayo de PCR que se llevó a cabo en un
40 termociclador estándar (PTC-200 de MJ Research Inc.) mediante el protocolo siguiente: 1 µl de una suspensión bacteriana estandarizada tratada o de una preparación de ADN genómico purificada de bacterias se amplificaron en una mezcla de reacción de PCR de 20 µl. Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 a 2,5 mM, 0,4 µM de cada uno de los cebadores específicos del cromosoma de S. aureus y del SCCmec (SEQ ID n.º 22, 24 y 28 de la patente de los EE.UU. n.º 6 156 507 que corresponden a las
45 SEQ ID n.º 56, 58 y 60 de la presente invención), 200 µM de cada uno de los cuatro dNTP (Pharmacia Biotech), SAB a 3,3 µg/µl (Sigma) y 0,5 U de polimerasa Taq (Promega) unida al anticuerpo TaqStartTM (BD Biosciences).
A continuación, las reacciones de PCR se sometieron a un termociclado de 3 min a 94 ºC seguido de 40 ciclos de 60 s a 95 ºC para la etapa de desnaturalización, 60 s a 55 ºC para la etapa de hibridación y 60 s a 72 ºC para la etapa de extensión, y después viene una extensión final de 7 minutos a 72 ºC en un termociclador estándar (PTC-200 de
50 MJ Research Inc.). La detección de los productos de PCR se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa (2%) que contenía 0,25 µg/ml de bromuro de etidio. De las 39 cepas de SARM analizadas, 20 no se amplificaron con el ensayo de PCR desarrollado por Hiramatsu et al., (ejemplo 1, tablas 2 y 3).
Con vistas a establecer un ensayo diagnóstico rápido para los SARM, los presentes inventores desarrollaron nuevos conjuntos de cebadores específicos del extremo derecho de SCCmec de los tipos I y II (SEQ ID n.º 66, 100 y 101) 55 (Anexo 1), SCCmec de tipo II (SEQ ID n.º 97 y 99), SCCmec de tipo III (SEQ ID n.º 67, 98 y 102) y en el cromosoma de S. aureus a la derecha del sitio de integración de SCCmec (SEQ ID n.º 64, 70, 71, 72, 73, 74, 75 y 76) (tabla 5). Estos cebadores, que amplifican amplicones cortos (de 171 a 278 pb), son compatibles para el uso en ensayos de PCR rápidos (tabla 7). El diseño de estos cebadores se basó en el análisis de varios alineamientos de secuencias de las secuencias de orfX y SCCmec descrito por Hiramatsu et al. (patente de los EE.UU. n.º 6 156 507) o 60 disponibles en GenBank (tabla 10, anexo 1). Estos diferentes conjuntos de cebadores se utilizaron para analizar por PCR una serie de cepas de SARM, SASM, SCNRM y SCNSM. Se desarrollaron varios cebadores de amplificación
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Chassworth, CA). Después se aplicó directamente el protocolo de secuenciación al fragmento de ADN purificado del gel. Ambas hebras de los productos de amplificación de la MREJ se secuenciaron mediante el método de secuenciación de terminación de cadenas con didesoxinucleótidos en un secuenciador automático de ADN de Applied Biosystems (modelo 377) con su kit de reacción Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready (Applied
5 Biosystems, Foster City, CA). Las reacciones de secuenciación se realizaron con los mismos cebadores (SEQ ID n.º 68 y 70) y 10 ng/100 pb por reacción de los amplicones purificados en gel. La secuenciación de MREJ de las seis cepas de SARM (CCRI-178, CCRI-8895, CCRI-8903, CCRI-1324, CCRI-1331 y CCRI-9504) descritas en la tabla 3 produjo las SEQ ID n.º 42, 43, 44, 45, 46 y 51, respectivamente (tabla 4).
Para estar seguros de que la secuencia determinada no contenía errores atribuibles a la secuenciación de los
10 artefactos de la PCR, hemos secuenciado dos preparaciones de los productos de amplificación de MREJ purificados de gel que se originaron de dos amplificaciones de PCR independientes. Para la mayor parte de los fragmentos diana, las secuencias determinadas para ambas preparaciones de amplicones eran idénticas. Además, las secuencias de ambas hebras eran complementarias al 100%, lo que confirma la alta precisión de la secuencia determinada. Las secuencias de MREJ determinadas con la estrategia anterior se describen en la lista de
15 secuencias y en la tabla 4.
Para secuenciar la MREJ en las cepas para las que no se había obtenido ningún amplicón con la estrategia que incluye cebadores específicos del gen de la transposasa de IS431 y del gen orfX, se utilizó otra estrategia que utiliza cebadores que están dirigidos selectivamente a las secuencias de mecA y orfX para amplificar fragmentos genómicos más largos. Se utilizó un nuevo cebador para PCR que está dirigido selectivamente a mecA (SEQ ID n.º
20 69) (tabla 8) en combinación con el mismo cebador en la secuencia de orfX (SEQ ID n.º 70). La estrategia utilizada para seleccionar estos cebadores se ilustra en la figura 3.
Se utilizó el protocolo de amplificación siguiente: se transfirió el ADN genómico purificado (300 ng) a un volumen final de 50 µl de una mezcla de reacción de PCR. Cada reacción de PCR contenía el tampón Herculase a 1X (Strategene, La Jolla, CA), 0,8 µM de cada uno de los 2 cebadores (SEQ ID n.º 69 y 70), 0,56 mM de cada uno de
25 los cuatro dNTP y 5 U de Herculase (Stratagene). Las reacciones de PCR se ciclaron en un termociclador estándar (PTC-200 de MJ Research Inc.) como sigue: 2 min a 92 ºC seguidos de 35 o 40 ciclos de 10 s a 92 ºC para la etapa de desnaturalización, 30 s a 55 ºC para la etapa de hibridación y 30 min a 68 ºC para la etapa de extensión.
Posteriormente, 10 µl de la mezcla amplificada por PCR se resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,7% que contenía 0,25 µg/ml de bromuro de etidio. A continuación se visualizaron los amplicones como se 30 describe más arriba. Se estimó el tamaño de los amplicones por comparación con una escalera de masas moleculares de 1 kb (Life Technologies). Después se llevó a cabo una reacción de reamplificación en 2 a 5 tubos con el mismo protocolo con 3 µl de la primera reacción de PCR utilizada como muestra problema para la segunda amplificación. Las mezclas reamplificadas por PCR se agruparon y también se resolvieron por electroforesis en un gel de agarosa al 0,7%. Entonces se visualizaron los amplicones mediante tinción con azul de metileno como se 35 describe más arriba. Se obtuvo un producto de amplificación de unas 12 kb con esta estrategia de amplificación con todas las cepas analizadas. La banda que corresponde al producto de amplificación específico se cortó de gel de agarosa y se purificó como se describe más arriba. El fragmento de ADN purificado de gel se utilizó directamente luego en el protocolo de secuenciación tal y como se describe más arriba. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo con los mismos cebadores para amplificación (SEQ ID n.º 69 y 70) y 425-495 ng de los amplicones 40 purificados en gel en cada reacción. Posteriormente, los cebadores de secuenciación internos (SEQ ID n.º 65, 77 y 96) (tabla 8) se utilizaron para obtener los datos de las secuencias en ambas hebras procedentes de un trozo más grande del amplicón. De las 20 cepas de SARM descritas en la tabla 3, 5 (CCRI-1331, CCRI-1263, CCRI-1377, CCRI-1311 y CCRI-2025) se secuenciaron con esta estrategia, lo que produjo las SEQ ID n.º 46, 47, 48, 49 y 50, respectivamente (tabla 4). La secuencia dentro del gen mecA también se obtuvo a partir de los amplicones
45 generados que produjeron las SEQ ID n.º 27, 28, 29, 30 y 31 a partir de las cepas CCRI-2025, CCRI-1263, CCRI1311, CCRI-1331 y CCRI-1377, respectivamente (tabla 4). También se obtuvieron secuencias más largas dentro del gen mecA y de las regiones cadena abajo para las cepas CCRI-2025, CCRI-1331 y CCRI-1377, tal y como se describe más adelante.
Para obtener secuencias más largas del gen orfX, se utilizaron otras dos estrategias que utilizan cebadores que
50 están dirigidos selectivamente a las secuencias de mecA y de orfX (en el codón de inicio) para amplificar fragmentos cromosómicos más largos. Se diseñó un nuevo cebador para PCR en orfX (SEQ ID n.º 132) a utilizar en combinación con el mismo cebador en el gen mecA (SEQ ID n.º 69). La estrategia utilizada para seleccionar estos cebadores se ilustra en la figura 3. Con los cebadores SEQ ID n.º 69 y 132 se amplificaron ocho cepas de S. aureus (CCRI-9860, CCRI-9208, CCRI-9504, CCRI-1331, CCRI-9583, CCRI-9681, CCRI-2025 y CCRI-1377). La estrategia
55 utilizada para seleccionar estos cebadores se ilustra en la figura 3.
Se utilizó el protocolo de amplificación siguiente: se transfirió ADN genómico purificado (350 a 500 ng) a una mezcla de reacción de PCR de 50 µl. Cada reacción de PCR contenía el tampón Herculase a 1X (Stratagene), 0,8 µM de cada uno de los cebadores de la pareja (SEQ ID n.º 69 y 132), 0,56 mM de cada uno de los cuatro dNTP y 7,5 U de Herculase (Stratagene) con MgCl2 a 1 mM. Las reacciones de PCR se sometieron al termociclado que se describe
60 más arriba.
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Posteriormente, 5 µl de la mezcla amplificada por PCR se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% con 0,25 µg/ml de bromuro de etidio. Luego se visualizaron los amplicones tal y como se describe más arriba. Para una cepa de S. aureus (CCRI-9583), se tuvo que volver a amplificar con los cebadores SEQ ID n.º 96 y 158 (figura 3) en 4 tubos, mediante el mismo protocolo de PCR, con 2 µl de la primera reacción de PCR como muestra 5 problema para la segunda amplificación. Las mezclas reamplificadas mediante PCR se agruparon y también se resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. Después se visualizaron los amplicones mediante tinción con azul de metileno tal y como se describe más arriba. Se obtuvo una banda de aproximadamente 12 a 20 kb con esta estrategia de amplificación según las cepas analizadas. La banda que corresponde al producto de amplificación específico se cortó del gel de agarosa y se purificó con el kit de extracción de gel QIAquickTM o el kit de extracción de gel QIAEX II (QIAGEN Inc.). Dos cepas, CCRI-9583 y CCRI-9589, también se amplificaron con los cebadores SEQ ID n.º 132 y 150, lo que generó un producto de amplificación de 1,5 kb. Los amplicones largos (1220 kb) se secuenciaron utilizando de 0,6 a 1 µg por reacción, mientras que los amplicones cortos (1,5 kb) se secuenciaron con 150 ng por reacción. Las reacciones de secuenciación se realizaron con diferentes conjuntos de cebadores para cada cepa de S. aureus: 1) SEQ ID n.º 68, 70, 132, 145, 146, 147, 156, 157 y 158 para la cepa
15 CCRI-9504; 2) SEQ ID n.º 70, 132, 154 y 155 para la cepa CCRI-2025; 3) SEQ ID n.º 70, 132, 148, 149, 158 y 159 para la cepa CCRI-9681; 4) SEQ ID n.º 70, 132, 187 y 188 para la cepa CCRI-9860; 5) SEQ ID n.º 70, 132, 150 y 159 para la cepa CCRI-9589, 6) SEQ ID n.º 114, 123, 132, 150 y 158 para la cepa CCRI-9583; 7) SEQ ID n.º 70, 132, 154 y 155 para la cepa CCRI-1377, 8) SEQ ID n.º 70, 132, 158 y 159 para la cepa CCRI-9208; 9) SEQ ID n.º 68, 70, 132, 145, 146, 147 y 158 para la cepa CCRI-1331; y 10) SEQ ID n.º 126 y 127 para la cepa CCRI-9770.
En una cepa (CCRI-9770), los genes orfX y orfSA0022 resultaron estar total o parcialmente delecionados basándose en la amplificación con cebadores específicos para estos genes (SEQ ID n.º 132 y 159 y SEQ ID n.º 128 y 129, respectivamente) (tabla 8). Posteriormente se diseñó un nuevo cebador para PCR en orfSA0021 (SEQ ID n.º 126) para utilizarlo en combinación con el mismo cebador en el gen mecA (SEQ ID n.º 69). Se obtuvo un producto de amplificación de 4,5 kb con este conjunto de cebadores. La amplificación, purificación y secuenciación de los
25 amplicones se llevó a cabo tal y como se describe más arriba.
Para obtener la secuencia de la región de SSCmec que contiene mecA para diez de las 20 cepas de SARM descritas en la tabla 3 (CCRI-9504, CCRI-2025, CCRI-9208, CCRI-1331, CCRI-9681, CCRI-9860, CCRI-9770, CCRI-9589, CCRI-9583 y CCRI-1377), el cebador descrito más arriba diseñado en mecA (SEQ ID n.º 69) se utilizó en combinación con un cebador diseñado en la región cadena abajo de mecA (SEQ ID n.º 118) (tabla 8). Se obtuvo un producto de amplificación de 2 kb para todas las cepas analizadas. Una cepa, la CCRI-9583, se volvió a amplificar con los cebadores SEQ ID n.º 96 y 118 a partir del amplicón generado con cebadores SEQ ID n.º 69 y 132 descritos más arriba. La amplificación, reamplificación y purificación de amplicones, y las reacciones de secuenciación, se realizaron tal y como se describe más arriba. Las reacciones de secuenciación se realizaron con los amplicones generados con las SEQ ID n.º 69 y 132 descritas más arriba o las SEQ ID n.º 69 y 118. Se utilizaron
35 diferentes conjuntos de cebadores para secuenciación para cada cepa de S. aureus: 1) SEQ ID n.º 69, 96, 117, 118, 120, 151, 152 para las cepas CCRI-9504, CCRI-2025, CCRI-1331, CCRI-9770 y CCRI-1377; 2) SEQ ID n.º 69, 96, 118 y 120 para las cepas CCRI-9208, CCRI-9681 y CCRI-9589; 3) SEQ ID n.º 69, 96, 117, 118, 120 y 152 para la cepa CCRI-9860; y 4) SEQ ID n.º 96, 117, 118, 119, 120, 151 y 152 para la cepa CCRI-9583.
A continuación, las secuencias obtenidas para 16 de las 20 cepas no amplificables por el ensayo de Hiramatsu (tabla 4) se compararon con las secuencias disponibles de las bases de datos públicas. En todos los casos, los trozos de la secuencia tenían una identidad cercana al 100% con las secuencias públicamente disponibles para orfX (SEQ ID n.º 42-51, 165-168 y 171) o mecA y la región secuencia abajo (SEQ ID n.º 27-31, 189-193, 195, 197-199 y 225). Sin embargo, mientras que el trozo de orfX de los fragmentos (SEQ ID n.º 42-51, 165-168 y 171) compartía una identidad de casi el 100% con el gen orfX de la cepa de SASM NCTC 8325 descrita por Hiramatsu et al. (SEQ
45 ID n.º 3), se demostró que la secuencia del ADN dentro del extremo derecho del propio SCCmec era muy diferente de la de los tipos I, II, III y IV descritas por Hiramatsu et al. (tabla 13, figura 4). Se obtuvieron seis nuevos tipos de secuencias diferentes.
Se debe advertir que Hiramatsu et al. demostraron que el SCCmec de tipo I se podía asociar al MREP de tipo i, los SCCmec de tipos II y IV se asocian al MREP de tipo ii, y el SCCmec de tipo III se asocia al MREP de tipo iii. Nuestros datos de secuenciación de MREJ de las diferentes cepas de SARM condujeron a descubrir 6 nuevos tipos de MREP denominados tipos iv, v, vi, vii, v y ix. Las MREJ que comprenden diferentes tipos de MREP se denominaron según el esquema de numeración de MREP. Por lo tanto, el MREP de tipo i está comprendido dentro de la MREJ de tipo i, el MREP de tipo ii está comprendido dentro de la MREJ de tipo ii, etc., hasta llegar al MREP de tipo ix.
55 Las secuencias que están en el extremo derecho de SCCmec obtenidas de las cepas CCRI-178, CCRI-8895, CCRI8903, CCRI-1324, CCRI-1331 y CCRI-9504 (SEQ ID n.º 42, 43, 44, 45, 46 y 51) eran casi idénticas unas a otras y mostraban una identidad de casi el 100% con IS431 (n.º de acceso de GenBank AF422691, ABO37671, AF411934). Sin embargo, nuestros datos de secuencias revelaron por primera vez la localización de esta secuencia de IS431 en el extremo derecho de SCCmec adyacente al sitio de integración. Por lo tanto, como las secuencias del extremo derecho de SCCmec de estas 6 cepas de SARM eran diferentes de las de SCCmec de tipo I de la cepa NCTC 10442, SCCmec de tipo II de la cepa N315, SCCmec de tipo III de la cepa 85/2082 y SCCmec de tipo IV de las cepas CA05 y 8/6-3P descritas por Hiramatsu et al. (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1323-1336;
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Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1147-1152), estas nuevas secuencias se denominaron MREP de tipo iv (SEQ ID n.º 42-46 y 51). Una búsqueda con BLAST con el trozo de SCCmec de las secuencias de MREP de tipo iv produjo alineamientos significativos con secuencias que codifican trozos de muy diversas transposasas conocidas. Por ejemplo, cuando se compara con el n.º de acceso de Genbank AB037671, el MREP de tipo iv de la
5 SEQ ID n.º 51 compartió una identidad del 98% con la posible transposasa de IS431 y su región cadena abajo; también estaban presentes en el alineamiento dos huecos de 7 nucleótidos cada uno.
Las secuencias obtenidas de las cepas CCRI-1263, CCRI-1377, CCRI-1311 y CCRI-2025 (SEQ ID n.º 47-50) eran casi idénticas entre sí y diferentes de los tres tipos de SCCmec y del MREP de tipo iv y, por consiguiente, se denominaron MREP de tipo v. Cuando se compara con las secuencias de GenBank mediante BLAST, las
10 secuencias de MREP de tipo v no compartían ninguna homología significativa con ninguna secuencia publicada, excepto en los primeros 28 nucleótidos. Este tramo corto correspondía a los últimos 11 nucleótidos codificantes de orfX, seguido de 17 nucleótidos cadena abajo que incluyen la repetición inversa derecha (IR-R, por su nombre en inglés) de SCCmec.
La secuencia obtenida de la cepa CCRI-9208 también era diferente de los tres tipos de SCCmec y de los MREP de
15 los tipos iv y v y, por consiguiente, se denominó MREP de tipo vi (SEQ ID n.º 171). Tras una búsqueda con BLAST, se demostró que el MREP de tipo vi era único, y que no mostraba ninguna homología significativa con ninguna secuencia publicada.
Las secuencias obtenidas de las cepas CCRI-9583 y CCRI-9589 también eran diferentes de los tres tipos de SCCmec y de los MREP de tipos iv a vi y, por lo tanto, se denominaron MREP de tipo vii (SEQ ID n.º 165 y 166).
20 Tras una búsqueda con BLAST, también se demostró que el tipo vii de MREP era único, y que no mostraba ninguna homología significativa con ninguna secuencia publicada.
La secuencia obtenida de la cepa CCRI-9860 también era diferente de los tres tipos de SCCmec y de los MREP de tipos iv a vii y, por lo tanto, se denominó MREP de tipo v (SEQ ID n.º 47 a 50). La secuencia obtenida de la cepa CCRI-9681 también era diferente de los tres tipos de SCCmec y de los MREP de tipos iv a v y, por lo tanto, se 25 denominó MREP de tipo ix (SEQ ID n.º 168). Las búsquedas con BLAST con el trozo de SSCmec de las secuencias de los MREP de tipos v y ix devolvió alineamientos significativos, pero sólo para los primeros ~150 nucleótidos de cada tipo de MREP. Por ejemplo, el comienzo de la secuencia del MREP de tipo v tenía una identidad del 88% con un trozo del n.º de acceso a GenBank AB063173, pero no se encontró ninguna homología significativa con ninguna secuencia publicada para el resto de la secuencia. De la misma manera, los primeros ~150 nucleótidos del MREP de
30 tipo ix tenían una identidad del 97% con la misma porción de AB063173, y el resto de la secuencia era única. El pequeño trozo homólogo de los MREP de tipos v y ix corresponde en la AB063173 a los últimos 14 nucleótidos codificantes de orfX, la IR-R de SCCmec y un trozo de orfCM009. Aunque compartan cierto parecido, los MREP de tipos v y ix son muy diferentes entre sí; tal y como se muestra en la tabla 13, sólo hay una identidad del 55,2% entre ambos tipos para los primeros 500 nucleótidos del trozo de SCCmec.
35 Finalmente, no obtuvimos ninguna secuencia dentro de SSCmec de la cepa CCRI-9770. Sin embargo, tal y como se describe en el apartado «Secuenciación de las secuencias nucleotídicas de MREJ a partir de cepas de SARM no amplificables con los cebadores específicos de los SCCmec de tipos I, II y III», esta cepa tiene aparentemente una deleción total o parcial de los genes orfX y orfSA0022 en el ADN cromosómico a la derecha del sitio de integración de SCCmec, y esto representaría una nueva unión en el extremo derecho. Por lo tanto, esta nueva secuencia la
40 denominamos MREP de tipo x (SEQ ID n.º 172). La secuenciación futura debería revelar si esta denominada MREJ de tipo x contiene un nuevo MREP de tipo x o si la ausencia de amplificación está ocasionada realmente por variaciones en la parte cromosómica de la MREJ.
Las secuencias del primer trozo de 500 nucleótidos del extremo derecho de todos los SCCmec obtenidos en la presente invención se compararon con las de los SCCmec de los tipos I, II y III con los programas de GCG Pileup y 45 Gap. La tabla 13 describe la identidad a nivel de nucleótido entre el extremo derecho de los SCCmec de las seis secuencias nuevas y las de los SCCmec de tipos I, II y III con el programa Gap de GCG. Mientras que los SCCmec de tipos I y II mostraron una identidad de casi el 79,2% (al diferir sólo por una inserción de 102 pb presente en el SCCmec de tipo II) (figuras 1, 2 y 4), todos los otros tipos de MREP mostraron identidades que variaban del 40,9% al 57,1%. Esto explica porqué el extremo derecho de los nuevos MREP de tipos iv a ix descritos en la presente
50 invención no se pudieron predecir ni detectar con el sistema descrito por Hiramatsu et al.
No se secuenciaron cuatro cepas (CCRI-1312, CCRI-1325, CCRI-9773 y CCRI-9774) descritas en la tabla 3. sino que en su lugar se caracterizaron con los cebadores para PCR. Con cebadores para amplificación específicos descritos en los ejemplos 4, 5 y 6 se demostró que las cepas CCRI-1312 y CCRI-1325 contenían MREP de tipo v, mientras que con los cebadores para amplificación específicos descritos en el ejemplo 7 se demostró que las cepas
55 CCRI-9773 y CCRI-9774 contenían MREP de tipo vii.
Para obtener la secuencia completa del SCCmec presente en las cepas de SARM descritas en la presente invención se desarrollaron cebadores específicos para el cromosoma de S. aureus a la izquierda (cadena arriba del gen mecA) del sitio de integración de SCCmec. Basándose en las secuencias de las bases de datos públicas disponibles, se diseñaron 5 cebadores diferentes (SEQ ID n.º 85-89) (tabla 9). Estos cebadores se pueden utilizar en combinación
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En aras de la claridad, a continuación se encuentra una lista con los ejemplos, tablas, figuras y anexos de esta invención. DESCRIPCIÓN DE LOS EJEMPLOS Ejemplo 1: los cebadores desarrollados por Hiramatsu et al. sólo pueden detectar las cepas de SARM que
5 pertenecen a los MREP de tipos i, ii y iii, mientras que no detectan los tipos de MREP nuevos prevalentes. Ejemplo 2: detección e identificación de SARM con cebadores específicos de las secuencias de MREP de tipos i, ii y iii desarrolladas en la presente invención.
Ejemplo 3: desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en un termociclador estándar para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v. 10 Ejemplo 4: desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar
SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v. Ejemplo 5: desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v, y que incluye un control interno.
Ejemplo 6: detección de SARM mediante el ensayo múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® basándose en las
15 secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v para detectar SARM directamente en los especímenes clínicos. Ejemplo 7: desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv, v, vi y vii.
Ejemplo 8: desarrollo de los ensayos de PCR en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en los MREP de tipos vi, v y ix.
20 DESCRIPCIÓN DE LAS TABLAS La tabla 1 da a conocer información sobre todos los cebadores para PCR desarrollados por Hiramatsu et al. en la patente de los EE.UU. n.º 6 156 507.
La tabla 2 es una recopilación de los resultados (ubicuidad y especificidad) para la detección de la unión en el extremo derecho de SCCmec-orfX con los cebadores descritos por Hiramatsu et al. en la patente de los EE.UU. n.º
25 6 156 507 en un termociclador estándar. La tabla 3 es una lista de cepas de SARM no amplificables con los cebadores que están dirigidos selectivamente a los tipos I, II y III de las secuencias de la unión del extremo derecho del SCCmec-orfX.
La tabla 4 es una lista de las secuencias nucleotídicas de las MREJ de Staphylococcus aureus. La tabla 5 da a conocer información sobre todos los cebadores desarrollados. 30 La tabla 6 es una lista de las sondas fluorescibles desarrolladas.
La tabla 7 muestra el tamaño de los amplicones de las diferentes parejas de cebadores descritas por Hiramatsu et al. en la patente de los EE.UU. n.º 6 156 507 o descritos en la presente memoria. La tabla 8 da a conocer información sobre los cebadores para secuenciar la unión en el extremo derecho de
SCCmec-cromosoma. 35 La tabla 9 da a conocer información sobre los cebadores para obtener la secuencia completa de SCCmec.
La tabla 10 es una lista de las secuencias disponibles en las bases de datos públicas (GenBank, proyectos genómicos o patente de los EE.UU. n.º 6 156 507) utilizadas para diseñar cebadores y sondas. La tabla 11 ofrece la sensibilidad analítica del ensayo de PCR desarrollado en la presente invención con los
cebadores que están dirigidos selectivamente a los tipos I, II y III de las secuencias de la unión en el extremo
40 derecho de SCCmec-orfX y realizado en un termociclador estándar. La tabla 12 es una recopilación de los resultados (ubicuidad y especificidad) para la detección de SARM con los cebadores desarrollados en la presente invención que están dirigidos selectivamente a los tipos I, II y III de las secuencias de unión en el extremo derecho de SCCmec-orfX y realizados en un termociclador estándar.
La tabla 13 muestra una comparación de la identidad de las secuencias entre los primeros 500 nucleótidos del 45 extremo derecho de los SCCmec entre 9 tipos de MREP. La tabla 14 da a conocer información sobre las cepas de referencia de SARM, SASM, SCNRM y SCNSM utilizadas
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para validar los ensayos de PCR desarrollados en la presente invención.
La tabla 15 da a conocer información sobre el origen de las cepas clínicas de SARM, SASM, SCNRM y SCNSM utilizadas para validar los ensayos de PCR descritos en la presente invención.
La tabla 16 describe la sensibilidad analítica del ensayo de PCR desarrollado en la presente invención que utiliza 5 cebadores que están dirigidos selectivamente a 5 tipos de secuencias de MREP y realizado en un termociclador estándar.
La tabla 17 es una recopilación de los resultados (ubicuidad y especificidad) para el ensayo de PCR desarrollado en la presente invención que usa los cebadores que están dirigidos selectivamente a 5 tipos de secuencias de MREP y realizado en un termociclador estándar.
10 La tabla 18 describe la sensibilidad analítica del ensayo de PCR desarrollado en la presente invención que usa la plataforma Smart Cycler® para la detección de 5 tipos de MREP.
La tabla 19 es una recopilación de los resultados (ubicuidad y especificidad) para el ensayo de PCR desarrollado en la presente invención que utiliza cebadores y una sonda fluorescible que está dirigida selectivamente a 5 tipos de secuencias de MREP y realizado en la plataforma Smart Cycler®.
15 La tabla 20 describe la sensibilidad analítica del ensayo de PCR desarrollado en la presente invención que usa la plataforma Smart Cycler® para la detección de 6 tipos de MREP.
La tabla 21 es una recopilación de los resultados (ubicuidad y especificidad) para el ensayo de PCR desarrollado en la presente invención que usa cebadores y una sonda fluorescible que está dirigida selectivamente a 6 tipos de secuencias de MPREP y realizado en la plataforma Smart Cycler®.
La figura 1 es un diagrama que ilustra la posición de los cebadores desarrollados por Hiramatsu et al. (patente de los EE.UU. n.º 6 156 507) en la unión del extremo derecho de SCCmec-cromosoma para detectar e identificar SARM.
La figura 2 es un diagrama que ilustra la posición de los cebadores seleccionados en la presente invención en la unión del extremo derecho de SCCmec-orfX para detectar e identificar SARM.
25 La figura 3 es un diagrama que ilustra la posición de los cebadores seleccionados en la presente invención para secuenciar los nuevos tipos de MREP.
La figura 4 ilustra un alineamiento de secuencias de nueve tipos de MREP.
Figura 1. Organización esquemática de los tipos I, II y III de las uniones en el extremo derecho de SCCmec-orfX, y 30 localización de los cebadores (SEQ ID n.º 52-63) descritos por Hiramatsu et al. para detectar e identificar SARM. El tamaño de los amplicones se describe en la tabla 7.
Figura 2. Organización esquemática de los MREP de tipos i, ii, iii, iv, v, vi, vii, v y ix, y localización de los cebadores y la sonda fluorescible que están dirigidos selectivamente a todos los tipos de MREP (SEQ ID n.º 20, 64, 66, 67, 79, 80, 84, 112, 115, 116, 84, 163 y 164) que se desarrollaron en la presente invención. El tamaño de los amplicones se
35 describe en la tabla 7.
Figura 3. Organización esquemática de las uniones en el extremo derecho de SCCmec-cromosoma, y localización de los cebadores (SEQ ID n.º 65, 68, 69, 70, 77, 96, 118, 126, 132, 150 y 158) desarrollados en la presente invención para secuenciar los MREP de tipos iv, v, vi, vii, v, ix y x.
Figura 4. Alineamiento múltiple de secuencias de representantes de nueve tipos de MREP (representados por trozos 40 de las SEQ ID n.º 1, 2, 104, 51, 50, 171, 165, 167 y 168 para los tipos i, ii, iii, iv, v, vi, vii, v y ix, respectivamente).
Los anexos muestran las estrategias utilizadas para seleccionar cebadores y sondas internos:
El anexo I ilustra la estrategia para seleccionar los cebadores a partir de las secuencias de SCCmec y de orfX específicas de los SCCmec de los tipos I y II.
45 El anexo II ilustra la estrategia para seleccionar las sondas fluorescibles específicas para detectar en tiempo real las uniones en el extremo derecho de SCCmec-orfX.
Tal y como se muestra en estos anexos, los cebadores para amplificación seleccionados pueden contener inosinas y/o bases ambiguas. La inosina es un análogo de nucleótido capaz de unirse específicamente a cualquiera de los
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cuatro nucleótidos A, C, G o T. Otra posibilidad es que se utilicen oligonucleótidos degenerados que consisten en una mezcla de oligonucleótidos que tienen dos o más de los cuatro nucleótidos A, C, G o T en el sitio de las discordancias. La inclusión de la inosina y/o de degeneraciones en los cebadores para amplificación proporciona cierta tolerancia a los apareamientos erróneos, con lo que se permite la amplificación de un abanico más amplio de
5 secuencias nucleotídicas diana (Dieffenbach y Dveksler, 1995, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York).
Ejemplos
EJEMPLO 1:
Los cebadores desarrollados por Hiramatsu et al. sólo pueden detectar las cepas de SARM que pertenecen a 10 los MREP de tipos i, ii y iii, mientras que no detectan nuevos tipos de MREP prevalentes.
Tal y como se muestra en la figura 1, Hiramatsu et al. han desarrollado varios cebadores que pueden hibridarse específicamente al extremo derecho de los ADN de SCCmec de tipos I, II y III. Combinaron estos cebadores con cebadores específicos de la región del cromosoma de S. aureus localizada a la derecha del sitio de integración de SCCmec para detectar los SARM. Hiramatsu et al. demostraron que el conjunto de cebadores (SEQ ID n.º 22, 24 y 15 28 en la patente de los EE.UU. n.º 6 156 507 que corresponde a las SEQ ID n.º 56, 58 y 60 en la presente invención) eran los más específicos y ubicuos para detectar SARM. Este conjunto de cebadores ofrece productos de amplificación de 1,5 kb para el SCCmec del tipo I, de 1,6 kb para el SCCmec del tipo II y de 1,0 kb para el SCCmec de tipo III (tabla 7). Se ensayó la ubicuidad y la especificidad de este ensayo de PCR múltiplex con 39 cepas de SARM, 41 cepas de SASM, 9 cepas de SCNRM y 11 cepas de SCNSM (tabla 2). En una mezcla de reacción de
20 PCR de 20 µl se amplificó 1 µl de una suspensión bacteriana estandarizada tratada o de una preparación de ADN genómico bacteriano purificado de bacterias. Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 a 2,5 mM, 0,4 µM de cada uno de los cebadores específicos de SCCmec y de orfX (SEQ ID n.º 56, 58 y 60), 200 µM de cada uno de los cuatro dNTP (Pharmacia Biotech), 3,3 µg/µl de SAB (Sigma) y 0,5 U de la polimerasa Taq (Promega) unida al anticuerpo TaqStartTM (BD Biosciences).
25 Las reacciones de la PCR se sometieron a continuación al termociclado: 3 min a 94 ºC seguidos de 40 ciclos de 60 s a 95 ºC para la etapa de desnaturalización, 60 s a 55 ºC para la etapa de hibridación y 60 s a 72 ºC para la etapa de extensión, y luego se realizó la última extensión de 7 minutos a 72 ºC en un termociclador estándar (PTC-200 de MJ Research Inc.). La detección de los productos de PCR se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa (2%) que contienen 0,25 µg/ml de bromuro de etidio.
30 Ninguna de las cepas de SCNRM o SCNSM analizadas fue detectada con el conjunto de cebadores que detectan los SCCmec de tipos I, II y III. De las 39 cepas de SARM analizadas, 20 no se detectaron con este ensayo de PCR múltiplex (tablas 2 y 3). Una de estas cepas de SARM sin detectadar corresponde al clon portugués de SARM muy epidémico (cepa CCRI-9504; De Lencastre et al., 1994, Eur, J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13: 64-73) y otra corresponde al clon canadiense de SARM muy epidémico CMRSA1 (cepa CCRI-9589; Simor et al., CCDR 1999, 25
35 12, 15 de junio). Estos datos demuestran que el conjunto de cebadores desarrollado por Hiramatsu et al. (SEQ ID n.º 22, 24 y 28 en la patente de los EE.UU. 6 156 507 que corresponden a las SEQ ID n.º 56, 58 y 60 en la presente invención) no es ubicuo para detectar los SARM y sugiere que algunas cepas de SARM tienen secuencias en la unión del extremo derecho de SCCmec que son diferentes de las identificadas por Hiramatsu et al. En los SARM se encuentran secuencias de SCCmec de otros tipos y otras secuencias en el extremo derecho del SCCmec (tipo de
40 MREP). Una limitación de este ensayo es la detección inespecífica de 13 cepas de SASM (tabla 2).
EJEMPLO 2:
Detección e identificación de SARM con cebadores específicos de las secuencias de los MREP de tipos i, ii yiii desarrolladas en la presente invención. Según el análisis de los alineamientos múltiples de secuencias de las secuencias de orfX y de SCCmec descritas por Hiramatsu et al. o disponibles en GenBank, se diseñó un conjunto de 45 cebadores (SEQ ID n.º 64, 66, 67) capaces de amplificar segmentos cortos de las uniones en el extremo derecho de SCCmec-orfX de los tipos I, II y III a partir de cepas de SARM y de discriminarlas de los SCNSM (anexo I y figura 2). El conjunto de cebadores elegido ofrece productos de amplificación de 176 pb para el SCCmec de tipo I, de 278 pb para el SCCmec de tipo II y de 223 pb para el SCCmec de tipo III, y permite la amplificación rápida por PCR. Estos cebadores se utilizaron en PCR múltiplex para comprobar su ubicuidad y especificidad con 208 cepas de SARM, 252 50 cepas de SASM, 41 cepas de SCNRM y 21 cepas de SCNSM (tabla 12). La amplificación y la detección por PCR se realizó tal y como se describe en el ejemplo 1. Las reacciones de PCR se sometieron a continuación a un termociclado (3 minutos a 94 ºC seguidos de 30 o 40 ciclos de 1 s a 95 ºC para la etapa de desnaturalización y de 30 s a 60 ºC para la etapa de hibridación-extensión y luego va seguida por una última extensión de 2 minutos a 72 ºC) en un termociclador estándar (PTC-200 de MJ Research Inc.). La detección de los productos de PCR se realizó
55 como se describe en el ejemplo 1.
Con este conjunto de cebadores (tabla 12) no se detectó ninguna de las cepas analizadas de SCNRM ni de SCNSM. Sin embargo, las 20 cepas de SARM que no se detectaron con el conjunto de cebadores desarrollado por Hiramatsu et al. (SEQ ID n.º 56, 58 y 60) tampoco se detectaron con los cebadores desarrollados en la presente invención
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(tablas 3 y 12). Estos datos también demuestran que algunas cepas de SARM tienen secuencias en la unión del extremo derecho del SCCmec-cromosoma que son diferentes a las identificadas por Hiramatsu et al. De nuevo, como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se detectaron inespecíficamente 13 cepas de SASM (tabla 12). Queda por establecer la importancia clínica de este hallazgo porque estas cepas que parecen SASM 5 podrían ser el resultado de una deleción reciente del locus mec (Deplano et al., 2000, J. Antimicrob. Chemotherapy,
46: 617-619; Inglis et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 2231-2239; Inglis et al, 1993, J. Infect. Dis. 167: 323-328; Lawrence et al, 1996, J. Hosp. Infect., 33: 49-53; Wada et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm. 176: 13191326).
EJEMPLO 3:
10 Desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en un termociclador estándar para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v. Tras el análisis de dos de los datos de secuencias de los nuevos MREP de tipos iv y v descritos en la presente invención, se diseñaron y usaron dos nuevos cebadores (SEQ ID n.º 79 y 80) en las múltiplex con los tres cebadores SEQ ID n.º 64, 66 y 67 descritos en el ejemplo 2. La amplificación por PCR y detección de los productos de PCR se realizó tal y como se describe en el
15 ejemplo 2. Los análisis de sensibilidad realizados con diluciones decimales o a la mitad del ADN genómico purificado de diferentes cepas de SARM de cada tipo de MREP mostraron un límite de detección de 5 a 10 copias del genoma (tabla 16). Se realizaron pruebas de especificidad con 0,1 ng de ADN genómico purificado o 1 µl de una suspensión bacteriana estandarizada. Todas las cepas de SCNRM o de SCNSM analizadas dieron negativo con este ensayo múltiplex (tabla 17). De las 20 cepas de SARM que no se detectaron con la PCR múltiplex descritas en los ejemplos
20 1 y 2, ahora se detectaron 12 con este ensayo múltiplex. De nuevo, tal y como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se detectaron inespecíficamente las 13 cepas de SASM (tabla 12). Las ocho cepas de SARM (CCRI-9208, CCRI-9583, CCRI-9773, CCRI-9774, CCRI-9589, CCRI-9860, CCRI-9681, CCRI-9770) y que albergan las secuencias de MREP de los nuevos tipos vi, vii, v, ix y x descritas en la presente invención permanecieron indetectables.
Desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v. El ensayo de PCR múltiplex descrito en el ejemplo 3 que contiene los cebadores (SEQ ID n.º 64, 66, 67, 79 y 80) se adaptó a la plataforma Smart Cycler® (Cepheid). Se desarrolló una sonda fluorescible específica de la secuencia de orfX (SEQ ID n.º 84, véase el anexo 30 II). Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 a 3,5 mM, 0,4 µM de cada uno de los cebadores específicos de SCCmec y de orfX (SEQ ID n.º 64, 66, 67, 79 y 80), 0,2 µM de la sonda fluorescible marcada con FAM (SEQ ID n.º 84), 200 µM de cada uno de los cuatro dNTP, 3,3 µg/µl de SAB y 0,5 U de la polimerasa Taq unida al anticuerpo TaqStartTM. La amplificación por PCR en el Smart Cycler® se realizó como sigue: 3 min a 94 ºC para la desnaturalización inicial, luego 45 ciclos de tres etapas que consisten en 5 35 s a 95 ºC para la etapa de desnaturalización, 15 s a 59 ºC para la etapa de hibridación y 10 s a 72 ºC para la etapa de extensión. La detección de la fluorescencia se realizó al final de cada etapa de hibridación. Los análisis de sensibilidad realizados con ADN genómico purificado de varias cepas de SARM de cada tipo de MREP mostraron un límite de detección de 2 a 10 copias del genoma (tabla 18). Ninguna de las SCNRM ni SCNSM dieron positivo con este ensayo múltiplex (tabla 19). De nuevo, como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se
40 detectaron inespecíficamente 13 cepas de SASM. De las 20 cepas de SARM que no se detectaron con la PCR múltiplex descritas en los ejemplos 1 y 2, 12 sí se detectaron con este ensayo múltiplex. Tal y como se describe en el ejemplo 3, las ocho cepas de SARM que albergan las secuencias de MREP de los nuevos tipos vi, vii, v, ix y x descritas en la presente invención permanecieron indetectables.
EJEMPLO 5:
45 Desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v que incluye un control interno. El ensayo de PCR múltiplex descrito en el ejemplo 4 que contiene los cebadores específicos para los MREP de tipos i a v y para el orfX de S. aureus (SEQ ID n.º 64, 66, 67, 79 y 80) y una sonda fluorescible específica de la secuencia de orfX (SEQ ID n.º 84, véase el anexo II) se optimizó para incluir un control interno que monitorice la inhibición de la
50 PCR. Este control interno contiene secuencias complementarias a los cebadores específicos de orfX y del MREP de tipo iv (SEQ ID n.º 79 y 64). El ensayo también contiene una sonda fluorescible marcada con TET específica de una secuencia interna del amplicón generado por amplificación del control interno. Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 a 3,45 mM, 0,8 µM de cada uno de los cebadores específicos de MREP (SEQ ID n.º 66 y 67) y del cebador específico de orfX (SEQ ID n.º 64), 0,4 µM de cada uno de
55 los cebadores específicos de MREP (SEQ ID n.º 79 y 80), 80 copias del control interno, 0,2 µM de la sonda fluorescible marcada con TET específica del control interno, 0,2 µM de la sonda fluorescible marcada con FAM (SEQ ID n.º 84), 330 µM de cada uno de los cuatro dNTP (Pharmacia Biotech), 3,45 µg/µl de SAB (Sigma) y 0,875 U de la polimerasa Taq (Promega) unida al anticuerpo TaqStartTM (BD Biosciences). La amplificación por PCR en el Smart Cycler® se realizó como sigue: 3 min a 95 ºC para la desnaturalización inicial, luego 48 ciclos de tres etapas que
60 consisten en 5 s a 95 ºC para la etapa de desnaturalización, 15 s a 60 ºC para la etapa de hibridación y 15 s a 72 ºC para la etapa de extensión. Los análisis de sensibilidad realizados con ADN genómico purificado de una cepa de
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SCNRM: S. caprae (1)
S. cohni cohnii (1)
S. epidermidis (1)
S. haemolyticus (2) 5 S. hominis (1)
S. sciuri (1)
S. simulans (1)
S. warneri (1)
SCNSM: S. cohni cohnii (1) 10 S. epidermidis (1)
S. equorum (1)
S. gallinarum (1)
S. haemolyticus (1)
S. lentus (1) 15 S. lugdunensis (1)
S. sachharolyticus (1)
S. saprophyticus (2)
S. xylosus (1)
Tabla 3. Origen de cepas de SARM que no se amplifican con los cebadores desarrollados por Hiramatsu et
Denominación de la cepa de Staphylococcus aureus: OrigenOriginal CCRIa ATCC BAA-40b CCRI-9504 Portugal ATCC 33592 CCRI-178 EE.UU. R991282 CCRI-2025 Quebec, Canadá 4508 CCRI-9208 Quebec, Canadá 19121 CCRI-8895 Dinamarca Z109 CCRI-8903 Dinamarca 45302 CCRI-1263 Ontario, Canadá R655 CCRI-1324 Quebec, Canadá MA 50428 CCRI-1311 Quebec, Canadá MA 50609 CCRI-1312 Quebec, Canadá MA 51363 CCRI-1331 Quebec, Canadá MA 51561 CCRI-1325 Quebec, Canadá 14A0116 CCRI-9681 Polonia 23 (CCUG 41787) CCRI-9860 Suecia SE26-1 CCRI-9770 Ontario, Canadá SE1-1 CCRI-9583 Ontario, Canadá
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182 39 (842/96) CCRI-9874 MREP de tipo ii 183 43 (N8-892/99) CCRI-9875 MREP de tipo ii 184 46 (9805-0137) CCRI-9876 MREP de tipo iii 185 1 CCRI-9882 MREP de tipo ii 186 29 CCRI-9885 MREP de tipo ii 189 SE1-1 CCRI-9583 mecA y 2,2 kb de la región cadena
abajo, que incluye IS431mec 190 ATCC BAA-40 CCRI-9504 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo 191 4508 CCRI-9208 mecA y 0,9 kb de la región cadena abajo 192 ID-61880 CCRI-9589 mecA y 0,9 kb de la región cadena abajo 193 14A016 CCRI-9681 mecA y 0,9 kb de la región cadena abajo 195 SE26-1 CCRI-9770 mecA y 1,5 kb de la región cadena
abajo, que incluye IS431mec 197 ATCC 43300 CCRI-175 MREP de tipo ii 198 R522 CCRI-1262 MREP de tipo iii 199 13370 CCRI-8894 MREP de tipo i 219 ATCC BAA-40 CCRI-9504 tetK 220 MA 51363 CCRI-1331 mecA y 1,5 kb de la región cadena
abajo 221 39795-2 CCRI-1377 IS431mec y 0,6 kb de la región cadena arriba 222 R991282 CCRI-2025 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo 223 R991282 CCRI-2025 IS431mec y 0,6 kb de la región cadena arriba 224 23 (CCUG 41787) CCRI-9860 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo 225 23 (CCUG 41787) CCRI-9860 IS431mec y 0,6 kb de región cadena arriba 233 14A016 CCRI-9681 MREP de tipo ix
a CCRI significa «Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie».
b orfS0021 y orfSA0022 hacen referencia a la designación del marco abierto de lectura del número de acceso de GenBank AP003129 (SEQ ID n.º 231).
5 Tabla 5. Cebadores para PCR desarrollados
ADN de origen SEQ ID n.º Diana Posicióna SEQ ID n.º 64 orfX 1720 3 70 orfX 1796 3 71 orfX 1712 3 72 orfX 1749 3 73 orfX 1758 3 74 orfX 1794 3
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- 75
- orfX 1797 3
- 76
- orfX 1798 3
- 66
- MREP de tipos i y ii 2327 2
- 100
- MREP de tipos i y ii 2323 2
- 101
- MREP de tipos i y ii 2314 2
- 97
- MREP de tipo ii 2434 2
- 99
- MREP de tipo ii 2434 2
- 67
- MREP de tipo iii 207b 4
- 98
- MREP de tipo iii 147b 4
- 102
- MREP de tipo iii 251b 4
- 79
- MREP de tipo iv 74b 43
- 80
- MREP de tipo v 50b 47
- 109
- MREP de tipo ix 652b 168
- 204
- MREP de tipo vi 642b 171
- 112
- MREP de tipo vii 503b 165
- 113
- MREP de tipo vii 551b 165
- 115
- MREP de tipo v y ix 514b 167
- 116
- MREP de tipo v 601b 167
a Posición usa de referencia la posición del nucleótido del extremo 5' del cebador.
b El cebador es el complemento inverso de la secuencia diana.
SEQ ID n.º Diana Posición 32 orfX 86a
83 orfX 86a 34a,b
84 orfX 55a,b
160 orfX 34a,b
161 orfX
162 orfX 114a 34a,b
163 orfX 34a,b
164 orfX
a Posición usa de referencia la posición del nucleótido del extremo 5' del bucle de la sonda fluorescible en la SEQ ID n.º 3.
b La secuencia del bucle de la sonda fluorescible es el complemento inverso de la SEQ ID n.º 3.
Tabla 7. Longitud de los amplicones obtenidos con las diferentes parejas de cebadores.
SEQ ID n.º Dianaa Longitud del amplicóna 59/52b orfX/MREP de tipos i y ii 2079 (tipo i); 2181 (tipo ii) 59/53b orfX/MREP de tipos i y ii 1801 (tipo i); 1903 (tipo ii) 59/54b orfX/MREP de tipos i y ii 1632 (tipo i); 1734 (tipo ii) 59/55b orfX/MREP de tipos i y ii 1405 (tipo i); 1507 (tipo ii) 59/56b orfX/MREP de tipos i y ii 804 (tipo i); 906 (tipo ii)
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59/57b orfX/MREP de tipos i y ii 257 (tipo i); 359 (tipo ii) 60/52b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2794 (tipo i); 2896 (tipo ii) 60/53b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2516 (tipo i); 2618 (tipo ii) 60/54b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2347 (tipo i); 2449 (tipo ii) 60/55b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2120 (tipo i); 2222 (tipo ii) 60/56b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 1519 (tipo i); 1621 (tipo ii) 60/57b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 972 (tipo i); 1074 (tipo ii) 61/52b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2476 (tipo i); 2578 (tipo ii) 61/53b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2198 (tipo i); 2300 (tipo ii) 61/54b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2029 (tipo i); 2131 (tipo ii) 61/55b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 1802 (tipo i); 1904 (tipo ii) 61/56b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 1201 (tipo i); 1302 (tipo ii) 61/57b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 654 (tipo i); 756 (tipo ii) 62/52b orfX/MREP de tipos i y ii 2354 (tipo i); 2456 (tipo ii) 62/53b orfX/MREP de tipos i y ii 2076 (tipo i); 2178 (tipo ii) 62/54b orfX/MREP de tipos i y ii 1907 (tipo i); 2009 (tipo ii) 62/55b orfX/MREP del tipos i y ii 1680 (tipo i); 1782 (tipo ii) 62/56b orfX/MREP de tipos i y ii 1079 (tipo i); 1181 (tipo ii) 62/57b orfX/MREP de tipos i y ii 532 (tipo i); 634 (tipo ii) 63/52b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 3104 (tipo i); 3206 (tipo ii) 63/53b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2826 (de tipo i); 2928 (tipo ii) 63/54b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2657 (tipo i); 2759 (tipo ii) 63/55b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2430 (tipo i); 2532 (tipo ii) 63/56b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 1829 (tipo i); 1931 (tipo ii) 63/57b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 1282 (tipo i); 1384 (tipo ii) 59/58b orfX/MREP de tipo iii 361 60/58b orfSA0022/MREP de tipo iii 1076 61/58b orfSA0022/MREP de tipo iii 758 62/58b orfX/MREP de tipo iii 656 63/58b orfSA0022/MREP de tipo iii 1386 70/66 orfX/MREP de tipos i y ii 100 (tipo i); 202 (tipo ii) 70/67 orfX/MREP de tipo iii 147 (tipo iii) 64/66c orfX/MREP de tipos i y ii 176 (tipo i), 278 (tipo ii) 64/67c orfX/MREP de tipo iii 223 64/79c orfX/MREP de tipo iv 215 64/80c orfX/MREP de tipo v 196 64/97c orfX/MREP de tipo ii 171 64/98c orfX/MREP de tipo iii 163 64/99c orfX/MREP de tipo ii 171 64/100c orfX/MREP de tipos i y ii 180 (tipo i); 282 (tipo ii) 64/101c orfX/MREP de tipos i y ii 189 (tipo i); 291 (tipo ii) 64/102c orfX/MREP de tipo iii 263 64/109c orfX/MREP de tipo ix 369
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64/204c orfX/MREP de tipo vi 348 64/112c orfX/MREP de tipo vii 214 64/113c orfX/MREP de tipo vii 263 64/115c orfX/MREP de tipo v 227 64/116c orfX/MREP de tipo v 318
a La longitud del amplicón se da en pares de bases para los tipos de MREP amplificados por el conjunto de cebadores.
b Conjunto de cebadores descritos por Hiramatsu et al. en la patente de los EE.UU. n.º 6 156 507.
5 c Conjunto de cebadores desarrollados en la presente memoria.
d orfSA0022 hace referencia a la designación del marco abierto de lectura del número de acceso de GenBank AP003129 (SEQ ID n.º 231).
ADN de origen SEQ ID n.º Diana Posicióna SEQ ID n.º 77 MREP de tipo iv 993 43 65 MREP de tipo v 636 47 70 orfX 1796 3 68 IS431 626 92 69 mecA 1059 78 96 mecA 1949 78 81 mecA 1206 78 114 MREP de tipo vii 629b 165 117 MREP de tipo ii 856 194 118 MREP de tipo ii 974b 194 119 MREP de tipo vii 404 189 120 MREP de tipo vii 477b 189 123 MREP de tipo vii 551 165 124 MREP de tipo ii 584 170 125 MREP de tipo ii 689b 170 126 orfSA0021 336 231 127 orfSA0021 563 231 128 orfSA0022d 2993 231 129 orfSA0022d 3467b 231 132 orfX 3700 231 145 MREP de tipo iv 988 51 146 MREP de tipo v 1386 51 147 MREP de tipo iv 891b 51 148 MREP de tipo ix 664 168 149 MREP de tipo ix 849b 168 150 MREP de tipo vii 1117b 165 151 MREP de tipo vii 1473 189
30
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