ES2526517T5 - Métodos y secuencias para la detección e identificación de cepas de Staphylococcus aureus MREJ tipo vi resistentes a meticilina - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y secuencias para la detección e identificación de cepas de Staphylococcus aureus MREJ tipo vi resistentes a meticilina

Antecedentes de la invención

Importancia clínica del Staphylococcus aureus

La especie Staphylococcus aureus que contiene coagulasa está bien descrito que se trata de un patógeno oportunista humano. Las infecciones intrahospitalarias ocasionadas por S. aureus son una causa importante de morbimortalidad. Algunas de las infecciones más habituales ocasionadas por S. aureus afectan a la piel e incluyen forúnculos o diviesos, celulitis, impétigo e infecciones de heridas posoperatorias en diferentes sitios. Algunas de las infecciones más graves producidas por S. aureus son bacteriemia, neumonía, osteomielitis, endocarditis aguda, miocarditis, pericarditis, cerebritis, meningitis, dermatitis exfoliativa neonatal y diferentes abscesos. La intoxicación alimentaria mediada por enterotoxinas estafilocócicas es otro síndrome importante relacionado con S. aureus. El síndrome del choque tóxico, una enfermedad adquirida fuera del hospital, también se ha atribuido a la infección o colonización por S. aureus toxigénico (Murray et al., Eds., 1999, Manual of Clinical Microbiology, 7.a ed., ASM Press, Washington, D. C.).

En los años ochenta surgió en los hospitales el problema epidemiológico y clínico importante de S. aureus resistentes a la meticilina (SARM). Los sAr M son resistentes a todos los p-lactámicos, entre ellos las penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos y monobactámicos, que son los antibióticos utilizados con más frecuencia para curar las infecciones por S. aureus. Las infecciones por SARM sólo se pueden tratar con antibióticos más costosos y más tóxicos, que normalmente se utilizan como la última línea de defensa. Dado que los SARM consiguen extenderse con facilidad de un paciente a otro a través del personal, los hospitales de todo el mundo se enfrentan con el problema de controlar los SARM. Por lo tanto, es necesario desarrollar pruebas sencillas y rápidas de diagnóstico y de detección para detectar y/o identificar los SARM con el objetivo de reducir su diseminación y mejorar el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes infectados.

La resistencia a la meticilina en S. aureus es única porque se debe a la adquisición del ADN de otros Staphylococcus sin coagulasa (o coagulasa-negativos, SCN) que codifica la proteína supernumeraria de unión a la penicilina resistente a los p-lactámicos (PBP, por su nombre en inglés), que se encarga de las funciones biosintéticas de las PBP normales cuando la célula está expuesta a los antibióticos p-lactámicos. S. aureus normalmente contiene cuatro PBP, de las cuales las PBP 1, 2 y 3 son esenciales. La PBP de baja afinidad en los SARM, denominada PBP 2a (o PBP2'), está codificada por el gen cromosómico mecA y funciona como una transpeptidasa resistente a los p-lactámicos. El gen mecA está ausente en los S. aureus sensibles a la meticilina, pero está ampliamente distribuido entre otras especies de estafilococos y está muy conservado (Ubukata et al., 1990, Antimicrob. Agents Chemother. 34: 170-172).

Cuando se determinó la secuencia nucleotídica de la región del ADN que rodea al gen mecA de la cepa N315 de S. aureus (aislada en Japón en 1982), Hiramatsu et al. hallaron que el gen mecA se alberga en un nuevo elemento genético, denominado casete cromosómico estafilocócico de mec (SCCmec, por su nombre en inglés), insertado en el cromosoma. SCCmec es un elemento genético móvil caracterizado por la presencia de repeticiones directas e inversas terminales, un conjunto de genes de recombinasas específicas de sitio (ccrA y ccrB) y el complejo génico mecA (Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents. Chemother. 43: 1449-1458; Katayama et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44: 1549-1555). El elemento se escinde con precisión del cromosoma de la cepa N315 de S. aureus y se integra en un sitio cromosómico específico de S. aureus en la misma orientación mediante la función de un conjunto único de genes de recombinasas que comprenden ccrA y ccrB. Se encontraron dos nuevos elementos genéticos de SSCmec que compartían características estructurales similares cuando se clonó y secuenció la región del ADN que rodeaba el gen mecA de las cepas de SARM NCTC 10442 (la primera cepa de SARM aislada en Inglaterra en 1961) y 85/2082 (una cepa de Nueva Zelanda aislada en 1985). Los tres SCCmec se han denominado tipo I (NCTC 10442), tipo II (N315) y tipo III (85/2082) basándose en el año de aislamiento de las cepas (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents. Chemother. 45: 1323-1336) (figura 1). Hiramatsu et al. han encontrado que los ADN de SSCmec están integrados en un sitio específico del cromosoma de S. aureus sensible a la meticilina (SASM). Caracterizaron las secuencias nucleotídicas de las regiones que flanqueaban los extremos izquierdo y derecho del ADN de SCCmec (a saber, attL y attR, respectivamente), así como las regiones alrededor del sitio de integración del ADN de SCCmec (a saber, attBscc, que es el sitio de integración en el cromosoma bacteriano para el ADN de SCCmec). El sitio attBscc se localizaba en el extremo 3' de un nuevo marco de lectura abierto (ORF, por su nombre en inglés), orfX. El gen orfX posiblemente codifica un polipéptido de 159 aminoácidos que comparte identidad con algunos polipéptidos identificados previamente, pero de función desconocida (Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43: 1449-1458). Recientemente, Hiramatsu et al. (Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1147-1152) y Oliveira et al., (Oliveira et al., 2001, Microb. Drug Resist. 7: 349-360) han descrito un nuevo tipo de SCCmec (tipo IV). Las secuencias del extremo derecho del nuevo SCCmec de tipo IV de las cepas de S. aureus CA05 y 8/6-3P publicadas por Hiramatsu et al. (Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1147-1152) eran casi idénticas a lo largo de 2000 nucleótidos al SCCmec de tipo II de la cepa de S. aureus N315 (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents. Chemother,. 45: 1323-1336). No se dispone de secuencias del extremo derecho del SCCmec de tipo IV en las cepas de S. aureus HDE288 y PL72 descritas por Oliveira et al. (Oliveira et al., 2001, Microb. Drug Resist. 7: 349-360).

Los métodos que se han usado antes para detectar e identificar los SARM (Saito et al., 1995, J. Clin. Microbio!. 33: 2498-2500; Ubukata et al., 1992, J. Clin. Microbio!. 30: 1728-1733; Murakami et al., 1991, J. Clin. Microbio!. 29: 2240-2244; Hiramatsu et al., 1992, Microbio!. Immunol. 36: 445-453), que se basan en la detección del gen mecA y de secuencias cromosómicas específicas de S. aureus, encontraron dificultades a la hora de discriminar entre los SARM y los estafilococos sin coagulasa (SCN) resistentes a la meticilina porque el gen mecA está ampliamente distribuido tanto en S. aureus como en los SCN (Suzuki et al., 1992, Antimicrob. Agents. Chemother. 36: 429-434). Hiramatsu et al. (patente de los EE.UU. n.° 6156507) han descrito un ensayo de PCR específico de los SARM que utiliza cebadores que son capaces de hibridarse específicamente al extremo derecho de los 3 tipos de ADN de SCCmec en combinación con un cebador específico para el cromosoma de S. aureus, que corresponde a la secuencia nucleotídica a la derecha del sitio de integración de SCCmec. Dado que las secuencias nucleotídicas que rodean el sitio de integración de SCCmec en otras especies estafilocócicas (tales como S. epidermidis y S. haemolyticus) son diferentes a las encontradas en S. aureus, este ensayo de PCR era específico para la detectar los SARM. Este ensayo de PCR también suministró información para la tipificación de MREP (por su nombre en inglés, que significa «polimorfismo del extremo derecho de mec») del ADN de SCCmec (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1323-1336; Hiramatsu et al., 1996, J. Infect. Chemother. 2: 117-129). Este método de tipificación se aprovecha del polimorfismo del extremo derecho de los ADN de SCCmec adyacentes al sitio de integración entre los tres tipos de SCCmec. El tipo III tiene una secuencia nucleotídica única, mientras que el tipo II tiene una inserción de 102 nucleótidos en el extremo derecho del SCCmec de tipo I. El método de tipificación de MREP descrito por Hiramatsu et al., (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1323-1336; Hiramatsu et al., 1996, J. Infect. Chemother. 2: 117-129) define el SCCmec de tipo I como el MREP de tipo i, el SCCmec de tipo II como el MREP de tipo ii y el SCCmec de tipo III como el MREP de tipo iii. Se debe observar que el método de tipificación de MREP no consigue diferenciar entre el SCCmec de tipo II y el nuevo SCCmec de tipo IV descrito por Hiramatsu et al. (Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents. Chemother. 46: 1147-1152) porque estos dos tipos de SCCmec muestran la misma secuencia nucleotídica en el extremo derecho.

El conjunto de cebadores que Hiramatsu et al. describen como la combinación de cebadores óptima (SEQ ID n.° 22, 24, 28 en la patente de los EE.UU. n.° 6156507 que corresponde a las SEQ ID n.° 56, 58 y 60, respectivamente, en la presente invención) se ha utilizado en la presente invención para analizar por PCR una serie de cepas de SARM y SASM (figura 1 y tabla 1). De las 39 cepas de SARM analizadas, 20 no se amplificaron mediante el ensayo de PCR múltiplex de Hiramatsu et al. (tablas 2 y 3). De hecho, el método de Hiramatsu resultó satisfactorio a la hora de detectar menos del 50% de las 39 cepas de SARM analizadas.

Este hallazgo demuestra que algunas cepas de SARM tienen secuencias en el extremo derecho de la unión del extremo derecho de SCCmec-cromosoma que son diferentes de las identificadas por Hiramatsu et al. Por consiguiente, el sistema desarrollado por Hiramatsu et al. no permite la detección de todos los SARM. La presente invención se refiere a la generación de datos de secuencia de la unión entre el extremo derecho de SCCmec-cromosoma que se necesitan para detectar más cepas de SARM para mejorar el ensayo de Hiramatsu et al. Es necesario desarrollar más cebadores y sondas ubicuos para detectar la mayor parte de las cepas de SARM en todo el mundo.

Compendio de la invención

La invención se refiere a las realizaciones como se define en las reivindicaciones.

La invención se refiere a un método para detectar la presencia de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (SARM) de MREJ de los tipos i, ii, iii y vi, que comprende:

a) poner en contacto una muestra en la que hay que analizar la presencia de dichas cepas de SARM con MREJ de los tipos i, ii, iii y vi, en donde dichas cepas de SARM incluyen un elemento de casete cromosómico estafilocócico de mec (SCCmec) que contiene un gen mecA insertado en el ADN cromosómico, por lo que genera un polimorfismo de secuencia en la unión del extremo derecho (MREJ, por su nombre en inglés) de tipo i, ii, iii o vi que comprende secuencias del extremo derecho del elemento SCCmec y del ADN cromosómico que está unido a dicho extremo derecho del elemento SCCmec, con un primer cebador y un segundo cebador para cada uno de dichos MREJ de tipos i, ii, iii y vi,

en donde cada dicho primer cebador es específico para una MREJ de tipo i, ii, iii o vi, y

en donde cada dicho primer cebador se hibrida con dicho extremo derecho del elemento SCCmec de una secuencia de una MREJ de tipo i, ii, iii o vi seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID n.° 1, 20 a 25, 41 y 199 y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo i, SEQ ID n.° 2, 17 a 19, 26, 40, 173 a 183, 185, 186 y 197 y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo ii, SEQ ID n.° 4 a 16, 104, 184 y 198 y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo iii y SEQ ID n.° 171 y el complemento de la misma, para la MREj de tipo vi; y

en donde cada dicho segundo cebador se hibrida con dicha secuencia cromosómica de S. aureus seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 1, 20 a 25, 41 y 199, y los complementos de las mismas, para la MREJ de tipo i, SEQ ID NOs: 2, 17 a 19, 26, 40, 173 a 183, 185, 186 y 197, y los complementos de las mismas, para la MREJ de tipo ii, SEQ ID NOs: 4 a 16, 104, 184 y 198, y los copmlementos de las mismas, para la MREJ de tipo iii, y SEQ ID

NO: 171, y el complemento de las mismas, para la MREJ de tipo vi para generar específicamente uno o vari amplicones si tal cepa de SARM de MREJ de tipos i, ii, iii o vi está presente en dicha muestra; y

b) detectar la presencia de dicho o dichos amplicones.

La invención se refiere a un kit para detectar la presencia de cepas de SARM de MREJ de tipos i, ii, iii y vi en una muestra que comprende:

a) un primer conjunto de cebadores con un primer cebador para cada de dicho MREJ de tipo i, ii, iii y vi, en

donde cada dicho primer cebador es específico para la MREJ de tipo i, ii, iii o vi, en donde cada dicho primer cebador se hibrida con el extremo derecho del elemento SCCmec de una secuencia de MREJ de tipo i, ii, iii o vi seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 1, 20 a 25, 41 y 199, y los complementos de las mismas,

para la MREJ de tipo i, SeQ ID NOs: 2, 17 a 19, 26, 40, 173 a 183, 185, 186 y 197, y los complementos de las mismas, para la MREJ de tipo ii, SEQ ID NOs: 4 a 16, 104, 184 y 198, y los complementos de las mismas, para

la MREJ de tipo iii, y SEQ ID NO:171, y el complemento de las mismas, para la MREJ de tipo vi; y

b) un segundo cebador que se hibrida con una secuencia cromosómica de S. aureus adjuntando dichas secuencias del extremo derecho del elemento SCCmec de MREJ de tipos i, ii, iii y vi seleccionadas del grupo

que consiste en: SEQ ID n.° 1, 20 a 25, 41 y 199, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo i, SEQ

ID n.° 2, 17 a 19, 26, 40, 173 a 183, 185, 186 y 197, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo ii,

SEQ ID n.° 4 a 16, 104, 184 y 198 y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo iii, y SEQ ID n.° 171 y

el complemento de la misma para la MREJ de tipo vi; y

en donde dichos cebadores de a) y b) permiten generar selectivamente uno o varios amplicones que comprende secuencias del extremo derecho del elemento SCCmec y del ADN cromosómico que une a dicho extremo derecho de dichas cepas de SARM de MREJ de tipos i, ii, ii y vi.

Un objeto de la presente invención es dar a conocer un método específico, ubicuo y sensible que utiliza sondas y/o cebadores de amplificación para determinar la presencia y/o cantidad de ácidos nucleicos de todas las cepas de SARM.

La ubicuidad de al menos el 50% entre las cepas que representan las cepas de SARM de los tipos iv a x es un

objeto de esta invención.

Por consiguiente, se da a conocer un método para detectar la presencia de una cepa de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) en una muestra, en donde la cepa de SARM es resistente debido a la presencia de

un inserto de SCCmec que contiene un gen mecA, en donde dicho SCCmec está insertado en ácidos nucleicos bacterianos, con lo que se genera una unión en el extremo derecho polimórfico (MREJ), en donde el método comprende la etapa de hibridar los ácidos nucleicos de la muestra con una serie de sondas y/o cebadores, caracterizados por que:

(i) los cebadores y/o sondas son específicos de las cepas de SARM y capaces de hibridarse con ácidos nucleicos de MREJ polimórficas, en donde la MREJ polimórfica comprende MREJ de tipos i a x; y

(ii) los cebadores y/o sondas juntos son capaces de hibridarse con al menos cuatro tipos de MREJ seleccionados de MREJ de tipos i a x.

En una realización específica, los cebadores y/o sondas se escogen que se hibriden en las condiciones de hibridación corrientes e incluso más específicamente, se colocan juntos en el mismo confinamiento físico.

Se ha desarrollado un método específico que utiliza cebadores y/o sondas que tienen al menos 10 nucleótidos de

longitud y son capaces de alinearse con la MREJ de los tipos i a iii, definidas en cualquiera de las SEQ ID n.° 1, 20,

21, 22, 23, 24, 25, 41, 199; 2, 17, 18, 19, 26, 40, 173; 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 185, 186,

197; 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 104, 184, 198 y con una o más MREJ de tipos iv a ix, que tiene las

S^eQ ID n.° 42, 43, 44, 45, 46, 51; 47, 48, 49, 50; 171; 165, 166; 167, 168. Para ser perfectamente ubicuos con todas

las MREJ secuenciados, los cebadores y/o sondas juntos pueden alinearse con dichas SEQ ID n.° de MREJ de los

tipos i a ix.

Los siguientes cebadores y/o sondas específicos que tienen las secuencias siguientes se han denominado:

Entre ellas, se utilizan las siguientes parejas de cebadores que tienen las secuencias siguientes:

De igual modo, entre ellas, se utilizan las siguientes sondas que tienen las secuencias siguientes:

SEQ ID n.° 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164 para la detección de MREJ de los tipos i a ix.

En el método divulgado más preferido, se usan juntos los cebadores y/o sondas que tienen las secuencias nucleotídicas que vienen a continuación. Las combinaciones preferentes utilizan:

i) SEQ ID n.° 64, 66, 84, 163, 164 para la detección de MREJ de tipo i

ii) SEQ ID n.° 64, 66, 84, 163, 164 para la detección de MREJ de tipo ii

iii) SEQ ID n.° 64, 67, 84, 163, 164 para la detección de MREJ de tipo iii

iv) SEQ ID n.° 64. 79, 84, 163, 164 para la detección de MREJ de tipo iv

v) SEQ ID n.° 64, 80, 84, 163, 164 para la detección de MREJ de tipo v

vi) SEQ ID n.° 64, 112, 84, 163, 164 para la detección de MREJ de tipo vii.

Todas estas sondas y cebadores pueden incluso utilizarse juntos en el mismo confinamiento físico.

Se da a conocer un método para tipar una MREJ de una cepa de SARM, que comprende las etapas de: reproducir el método anterior con cebadores y/o sondas específicos para un tipo de MREJ determinada y detectar una sonda o cebador alineado como una indicación de la presencia de una MRE^j de tipo determinado.

Se da a conocer un ácido nucleico seleccionado de las SEQ ID n.°:

i) SEQ ID n.° 42, 43, 44, 45, 46, 51 para la secuencia de MREJ de tipo iv;

ii) SEQ ID n.° 47, 48, 49, 50 para la secuencia de MREJ de tipo v;

iii) SEQ ID n.° 171 para la secuencia de MREJ de tipo vi;

iv) SEQ ID n.° 165, 166 para la secuencia de MREJ de tipo vii;

v) SEQ ID n.° 167 para la secuencia de MREJ de tipo viii;

vi) SEQ ID n.° 168 para la secuencia de MREJ de tipo ix.

También son objeto de esta divulgación los oligonucleótidos de al menos 10 nucleótidos de longitud que se hibridan con cualquiera de estos ácidos nucleicos y que se hibridan con una o varias MREJ de los tipos seleccionados entre iv a ix. Entre ellos, las parejas de cebadores (o sondas) que tienen las siguientes SEQ ID n.°:

Además, también se encuentran dentro del alcance de esta divulgación las sondas internas que tienen las secuencias nucleotídicas definidas en cualquiera de las SEQ ID n.° 32, 83, 83, 160, 161, 162, 163, 164. También son otros objetos de esta divulgación las composiciones de interés que comprenden los cebadores y/o sondas que se renaturalizan o se hibridan con una o varias MREJ de los tipos seleccionados de iv a ix, así como con los ácidos nucleicos de más arriba, que comprenden o no cebadores y/o sondas, que se hibridan con una o varias MREJ de los tipos seleccionados de i a iii. Las composiciones preferidas comprenderían los cebadores que tienen las secuencias nucleotídicas definidas en las SEQ ID n.°:

o sondas, cuyas SEQ ID n.° son: 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164 o ambas.

Descripción detallada de la invención

En esta memoria se da a conocer en particular un método en donde cada uno de los ácidos nucleicos de SARM o una variante o parte de los mismos comprenden una región diana específica que se puede hibridar con dichos cebadores o sondas desarrollados para que sean ubicuos;

en donde cada uno de dichos ácidos nucleicos o una variante o parte de los mismos comprende una región diana específica que se puede hibridar con dichos cebadores o sondas;

en donde dicho método comprende las etapas de poner en contacto dicha muestra con dichas sondas o cebadores y detectar la presencia y/o cantidad de las sondas hibridadas o de los productos amplificados como una indicación de la presencia y/o cantidad de SARM.

En el método, las secuencias de fragmentos de ADN de la unión del extremo derecho de SCCmec-cromosoma, en adelante denominada MREJ que significa «unión en el extremo derecho de mec» que incluye secuencias procedentes del extremo derecho de SCCmec y del ADN cromosómico a la derecha del sitio de integración de SCCmec, se utilizan como secuencias originales a partir de las cuales se obtienen los cebadores y/o las sondas. Las secuencias de MREJ incluyen nuestras secuencias en propiedad así como las secuencias obtenidas de las bases de datos públicas y de la patente de los EE.UU. n.° 6156507, y se seleccionaron por su capacidad para detectar de manera sensible, específica, ubicua y rápida los ácidos nucleicos diana de los SARM.

Se divulgan fragmentos de ADN y oligonucleótidos (cebadores y sondas).

Los kits de diagnóstico que comprenden los cebadores para amplificación y las sondas para detección de los SARM también son objetos de la presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones.

En los métodos y los kits de más arriba, las sondas y los cebadores no se limitan a ácidos nucleicos y pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, análogos de nucleótidos. Los reactantes para diagnóstico formados por las sondas y los cebadores pueden estar presentes en cualquier forma adecuada (unidos a un soporte sólido, líquido, liofilizado, etc).

En los métodos y kits de más arriba, las reacciones de amplificación pueden incluir, pero sin limitarse a ellas: a) reacción en cadena de la polimerasa (PCR), b) reacción en cadena de la ligasa (LCR), c) amplificación de ácidos nucleicos basada en la secuencia (NASBA, por su nombre en inglés), d) amplificación de secuencias automantenida (3SR, por su nombre en inglés), e) amplificación por desplazamiento de cadena (SDA, por su nombre en inglés), f) amplificación de señal de ADN ramificado (bDNA, por su nombre en inglés), g) amplificación mediada por la transcripción (TMA, por su nombre en inglés), h) tecnología de ciclación de sondas (CPT, por su nombre en inglés), i) PCR anidada, j) PCR múltiplex, k) amplificación en fase sólida, l) amplificación de señal dependiente de nucleasa (NDSA, por su nombre en inglés), m) tecnología de amplificación con círculo rodante (RCA, por su nombre en inglés), n) amplificación por desplazamiento de hebras ancladas, o) amplificación con círculo rodante (inmovilizado) en fase sólida.

En los métodos y los kits de más arriba, la detección de los ácidos nucleicos de los genes diana puede incluir tecnologías en tiempo real o postamplificación. Estas tecnologías de detección pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, métodos basados en la transferencia de la energía de resonancia mediante fluorescencia (FRET, por su nombre en inglés) tales como la hibridación adyacente de sondas (entre ellos, métodos sonda-sonda y sondacebador), sonda TaqMan, sonda fluorescible, sonda Scorpion, sonda de nanopartículas y sonda Amplifluor. Otros métodos de detección incluyen la detección de los ácidos nucleicos del gen diana mediante métodos inmunológicos, métodos de hibridación en fase sólida sobre filtros, chips o cualquier otro soporte sólido. En estos sistemas, la hibridación se puede seguir mediante fluorescencia, quimioluminiscencia, potenciometría, espectrometría de masas, resonancia de plasmones, polarimetría, colorimetría, citometría de flujo o escanometría. La secuenciación de nucleótidos, que incluye la secuenciación mediante la terminación con didesoxinucleótidos o la secuenciación por hibridación (p. ej., secuenciación con un chip de ADN) representa otro método para detectar y caracterizar los ácidos nucleicos de los genes diana.

En una realización preferente se utiliza un protocolo de PCR para la amplificación del ácido nucleico.

Un método para detectar una gran variedad de posibles cepas de SARM que tienen diferentes tipos de MREJ se puede llevar a cabo en reacciones y confinamientos físicos independientes, un tipo cada vez. Otra alternativa es que se podría llevar a cabo simultáneamente para diferentes tipos en confinamientos físicos independientes, o en los mismos confinamientos físicos. En la última situación posible se podría llevar a cabo una reacción de PCR múltiplex que requeriría que los oligonucleótidos sean capaces de hibridarse con una región diana en las condiciones habituales. Dado que muchas sondas o cebadores son específicas para un determinado tipo de MREJ, la tipificación de una cepa de SARM es una realización posible. Cuando se utiliza una mezcla de oligonucleótidos que se hibriden al mismo tiempo con más de un tipo en un único confinamiento físico o contenedor, se utilizarán diferentes marcaciones para diferenciar un tipo de otro.

Perseguimos desarrollar una prueba o kit que use ADN para detectar e identificar los SARM. Aunque las secuencias de los genes orfXy algunos fragmentos del ADN de SCCmec están disponibles en las bases de datos públicas y se han utilizado para desarrollar pruebas de ADN para detectar los SARM, los nuevos datos de secuencias que permiten mejorar la detección e identificación de los SARM que son objeto de la presente invención nunca se habían caracterizado anteriormente, o se conocían pero no se había demostrado que estuvieran localizadas en el extremo derecho del SCCmec adyacente al sitio de integración (tabla 4). Estas nuevas secuencias no se podrían haber predicho ni detectado mediante el ensayo de PCR específico de SARM desarrollado por Hiramatsu et al. (patente de los EE.UU. n.° 6156507). Estas secuencias permitirán mejorar las pruebas actuales que usan ADN para el diagnóstico de los SARM porque permiten diseñar cebadores y sondas ubicuos para detectar e identificar más cepas de SARM, entre ellas, todos los principales clones epidémicos del planeta.

Los kits, cebadores y sondas de diagnóstico mencionados más arriba se pueden utilizar para detectar y/o identificar los SARM, incluso si dichos kits, cebadores y sondas de diagnóstico se utilizan para aplicaciones in vitro o in situ. Dichas muestras pueden incluir, pero sin limitarse a ellas: una muestra clínica, una muestra ambiental, un cultivo microbiano, una colonia microbiana, un tejido y una línea celular.

Dichos kits, cebadores y sondas de diagnóstico se puedan utilizar solos o en combinación con cualquier otra prueba adecuada para detectar y/o identificar microorganismos, entre ellas, pero sin limitarse a ellas: un ensayo basado en la detección de ácidos nucleicos, un inmunoensayo, un ensayo enzimático, un ensayo bioquímico, un ensayo lisotípico, un ensayo serológico, un medio de cultivo diferencial, un medio de cultivo de enriquecimiento, un medio de cultivo selectivo, un medio de ensayo específico, un medio de cultivo de identificación, un medio de cultivo de recuento, una tinción celular, un cultivo en líneas celulares específicas y un ensayo de infectividad con animales.

En los métodos y los kits que se describen más adelante en la presente memoria, las sondas oligonucleotídicas y los cebadores para amplificación se han deducido de secuencias más largas (a saber, fragmentos de ADN de al menos 100 pares de bases). Todas las secuencias de ADN se han obtenido bien de nuestras secuencias en propiedad o de bases de datos públicas (tablas 5, 6, 7, 8, y 9).

Para el experto en la técnica está claro que también se pueden deducir secuencias oligonucleotídicas diferentes a las descritas, y que son apropiadas para detectar y/o identificar los SARM a partir de los fragmentos de las secuencias en propiedad o de determinadas secuencias de las bases de datos públicas. Por ejemplo, los cebadores o sondas oligonucleotídicos pueden ser más cortos, pero de una longitud de al menos 10 nucleótidos o más que los elegidos; también se pueden seleccionar de cualquier parte de los fragmentos de ADN en propiedad o de las secuencias seleccionadas de las bases de datos públicas; también pueden ser variantes del mismo oligonucleótido. Si el ADN diana o una variante del mismo se hibrida a un oligonucleótido determinado, o si el ADN diana o una variante del mismo se puede amplificar mediante una pareja de cebadores oligonucleotídicos para PCR, lo contrario también es cierto; un ADN diana determinado puede hibridarse con una sonda oligonucleotídica variante o ser amplificado por una variante de cebador oligonucleotídico para PCR. Otra alternativa es que los oligonucleótidos se pueden diseñar a partir de dichas secuencias de fragmentos de ADN para utilizarlos en métodos de amplificación diferentes a la PCR. Por consiguiente, el núcleo de esta invención es la detección y/o identificación de los SARM dirigida selectivamente a las secuencias de ADN genómico que se utilizan como fuente de cebadores para amplificación y/o sondas oligonucleotídicas, específicos y ubicuos. Aunque la selección y la evaluación de los oligonucleótidos adecuados para los propósitos diagnósticos requieren mucho esfuerzo, es realmente posible que el experto en la técnica deduzca, a partir de los fragmentos de ADN seleccionados, oligonucleótidos diferentes a los recogidos en las tablas 5, 6, 7, 8 y 9 que sean adecuados para los propósitos diagnósticos. Cuando un fragmento en propiedad o una secuencia de las bases de datos públicas se selecciona por su especificidad y ubicuidad, incrementa la probabilidad de que los subconjuntos de los mismos sean también específicos y ubicuos.

Los fragmentos de ADN en propiedad se han obtenido como un repertorio de secuencias creadas por la amplificación de los ácidos nucleicos de SARM con nuevos cebadores. Estos cebadores y el repertorio de ácidos nucleicos, así como el repertorio de secuencias nucleotídicas, son otros objetos de esta divulgación (tablas 4, 5, 6, 7, 8 y 9).

Por lo tanto, las reivindicaciones están de acuerdo con la presente invención.

Secuencias para detectar e identificar los SARM

En la descripción de esta invención, la terminología «ácidos nucleicos» y «secuencias» podrían utilizarse indistintamente. Sin embargo, los «ácidos nucleicos» son entidades químicas, mientras que las «secuencias» son los trozos de información codificados por estos «ácidos nucleicos». Los ácidos nucleicos y las secuencias son fuentes de información igual de valiosas en el ámbito de esta invención.

Diseño y síntesis de cebadores y sondas oligonucleotídicos

Como parte de las reglas de diseño, a todos los oligonucleótidos (sondas para la hibridación y cebadores para la amplificación del ADN por PCR) se les evaluó su idoneidad para la hibridación o amplificación por PCR mediante análisis informático con programas estándares (a saber, los programas del paquete GCG de Wisconsin, el programa de análisis de cebadores Oligo™ 6 y MFOLD 3.0). También se evaluó la posible idoneidad de las parejas de cebadores para PCR antes de sintetizarlos con la verificación de la ausencia de rasgos indeseados tales como tramos largos de un nucleótido y una proporción elevada de restos G o C en el extremo 3' (Persing et al., 1993, Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.). Se sintetizaron cebadores oligonucleotídicos para amplificación con un sintetizador automático de ADN (Applied Biosystems). Se evaluaron los diseños de las sondas fluorescibles mediante los criterios establecidos por Kramer et al. (http://www.molecular-beacons.org).

La secuencia oligonucleotídica de los cebadores o de las sondas puede proceder de cualquier hebra del ADN bicatenario. Los cebadores o las sondas pueden consistir en las bases A, G, C o T o análogos, y pueden estar degenerados en una o más posiciones de nucleótidos escogidas (Nichols et al., 1994, Nature, 369: 492-493). Los cebadores y las sondas también pueden consistir en análogos de nucleótidos tal como los ácidos nucleicos bloqueados (LNA, por su nombre en inglés) (Koskin et al., 1998, Tetrahedron 54: 3607-3630), y los ácidos peptidonucleicos (PNA, por su nombre en inglés) (Egholm et al., 1993, Nature, 365: 566-568). Los cebadores o las sondas pueden tener cualquier longitud adecuada y se pueden seleccionar en cualquier parte dentro de las secuencias de ADN de los fragmentos en propiedad, o de las secuencias seleccionadas de las bases de datos que son adecuadas para la detección de los SARM.

Las variantes de un determinado gen microbiano de diana se producen de forma natural y se atribuyen a la variación de la secuencia de ese gen durante la evolución (Watson et al., 1987, Molecular Biology of the Gene, 4.a ed., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Menlo Park, CA; Lewin, 1989, Genes IV, John Wiley & Sons, Nueva York, NY). Por ejemplo, diferentes cepas de las mismas especies microbianas pueden tener una o mas variaciones de uno sólo o varios nucleótidos en el sitio de hibridación del oligonucleótido. La persona experta en la técnica es muy consciente de la existencia de ácidos nucleicos y/o secuencias variantes para un gen específico, y que la frecuencia de las variaciones de la secuencia depende de la presión selectiva sobre un producto génico determinado durante la evolución. La detección de una secuencia variante para una región entre dos cebadores para PCR se puede demostrar mediante la secuenciación del producto de amplificación. Para demostrar la presencia de variaciones de secuencia en el sitio de hibridación del cebador, se tiene que amplificar una diana de ADN más larga con cebadores para PCR localizados fuera de ese sitio de hibridación. La secuenciación de este fragmento más largo permitirá detectar la variación de la secuencia en este sitio de hibridación del cebador. Se puede aplicar una estrategia parecida para mostrar las variaciones en el sitio de hibridación de la sonda. En la medida en que la divergencia de los ácidos nucleicos y/o las secuencias de diana, o una parte de los mismos, no afecte significativamente a la sensibilidad y/o especificidad y/o ubicuidad de los cebadores o de las sondas para amplificación, el ADN microbiano variante está dentro del alcance de esta invención. También se pueden utilizar variantes de los cebadores o sondas seleccionados para amplificar o hibridarse a un ADN diana variante.

Amplificación del ADN

Para la amplificación del ADN mediante el método de PCR ampliamente utilizado, se obtuvieron parejas de cebadores de nuestros fragmentos de ADN en propiedad o de las secuencias de las bases de datos públicas.

Durante la amplificación del ADN por PCR se utilizan dos cebadores oligonucleotídicos que se fijan cada uno a una hebra del ADN diana del genoma microbiano desnaturalizado con calor para amplificar exponencialmente in vitro el ADN diana mediante ciclos térmicos sucesivos que permiten la desnaturalización del ADN, la hibridación de los cebadores y la síntesis de nuevas dianas en cada ciclo (Persing et al., 1993, Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.).

Brevemente, los protocolos de la PCR en un termociclador estándar (PTC-200 de MJ Research Inc., Watertown, MA) fueron los siguientes: en 20 pl de mezcla de reacción de PCR se amplificaron suspensiones bacterianas estandarizadas y tratadas o ADN genómico preparado de cultivos bacterianos o especímenes clínicos. Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), MgCh a 2,5 mM, 0,4 pM de cada cebador, 200 pM de cada uno de los cuatro dNTP (Pharmacia Biotech), seroalbúmina bovina (SAB) a 3,3 pg/pl (Sigma-Aldrich Canada Ltd, Oakville, Ontario, Canada) y 0,5 unidades de la ADN polimerasa Taq (Promega Corp., Madison, WI) combinada con el anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences, Palo Alto, CA). El anticuerpo TaqStart™, que es un anticuerpo monoclonal neutralizante de la ADN polimerasa Taq, se añadió a todas las reacciones de PCR para realzar la especificidad y la sensibilidad de las amplificaciones (Kellogg et al., 1994, BioTechniques 16: 1134-1137). El tratamiento de los cultivos bacterianos o de los especímenes clínicos consiste en un protocolo rápido para lisar las células microbianas y eliminar o neutralizar los inhibidores de la PCR (descrito en la solicitud de los EE.UU. en tramitación con la presente n.° 60/306163). Para la amplificación del ADN genómico purificado, las muestras se añadieron directamente a la mezcla de amplificación para PCR. Se utilizó un control interno, obtenido de secuencias que no se encuentran en las secuencias de MREJ diana ni en el genoma humano, para verificar la eficacia de la PCR y no había ninguna inhibición significativa de la PCR.

El número de ciclos realizados para los ensayos de PCR varía de acuerdo con el nivel de sensibilidad requerido. Por ejemplo, el nivel de sensibilidad requerido para la detección microbiana directa en un espécimen clínico es más alto que para la detección en un cultivo microbiano. Por consiguiente, para la detección directa en especímenes clínicos se requerirán probablemente ensayos de PCR más sensibles que tengan más ciclos térmicos.

El experto en la técnica de amplificación de ácidos nucleicos conoce la existencia de otros procedimientos de amplificación rápidos tal como la reacción de la cadena de la ligasa (LCR), PCR tras la transcriptasa inversa (RT-PCR), la amplificación mediada por la transcripción (TMA), la replicación de secuencias automantenida (3SR), la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), ADN ramificado (bDNA), la tecnología de ciclación de sondas (CPT), la amplificación en fase sólida (SPA), la tecnología de amplificación con círculo rodante (RCA), la RCA en fase sólida, la SDA anclada y la amplificación de la señal dependiente de nucleasa (NDSA) (Lee et al., 1997, Nucleic Acid Amplification Technologies: Application to Disease Diagnosis, Eaton Publishing, Boston, MA; Persing et al., 1993, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.; Westin et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18: 199­ 204). El alcance de esta invención no se limita al uso de la amplificación por PCR, sino que más bien incluye el uso de cualquier método de amplificación de ácidos nucleicos o cualquier otro procedimiento que se puede utilizar para incrementar la sensibilidad y/o la rapidez de los ensayos diagnósticos que usan ácidos nucleicos. El alcance de la presente invención también cubre el uso de cualquier amplificación de ácidos nucleicos y la tecnología de detección, que incluye las tecnologías de detección en tiempo real o postamplificación, una tecnología de amplificación combinada con la detección, una tecnología de matrices o chips de ácidos nucleicos para hibridación, un chip para amplificación, o combinación de tecnologías de amplificación e hibridación de chips. La detección y la identificación mediante cualquier método de secuenciación de nucleótidos también está bajo el alcance de la presente invención.

También está bajo el alcance de esta divulgación cualquier oligonucleótido procedente de las secuencias de ADN de MREJ de S. aureus y utilizable en cualquier tecnología de hibridación y/o amplificación de ácidos nucleicos.

Evaluación del método de detección de SARM desarrollado por Hiramatsu et al.

De acuerdo con Hiramatsu et al., (Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43: 1449-1458; Katayama et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44: 1549-1555; Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1323-1336; Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1147-1152), entre las cepas de SARM se encuentran cuatro tipos de ADN de SCCmec. Hallaron que los ADN de SSCmec están integrados en un sitio específico del cromosoma de los SASM (denominado orfX). Desarrollaron un ensayo de PCR múltiplex específico para SARM que incluye cebadores que pueden hibridarse en el extremo derecho de los SCCmec de tipos I, II y III (SEQ ID n.° 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 en la patente de los EE.UU. n.° 6156507 que corresponden a las SEQ ID n.° 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, respectivamente, en la presente invención) así como cebadores específicos del cromosoma de S. aureus a la derecha del sitio de integración de SCCmec (SEQ ID n.° 25, 28, 27, 26, 29 en la patente de los EE.UU. n.° 6156507 que corresponden a las SEQ ID n.° 59, 60, 61, 62, 63, respectivamente, en la presente invención) (tabla 1 y figura 1). El conjunto de cebadores que Hiramatsu et al. han descrito como la combinación de cebadores óptima (SEQ ID n.° 22, 24 y 28 de la patente de los EE.UU. n.° 6156507 corresponden a las SEQ ID n.° 56, 58 y 60 en la presente invención) se utilizó en la presente invención para analizar por PCR una serie de cepas de SARM, SASM, SCN resistente a la meticilina (SCNRM) y SCN sensible a la meticilina (SCNSM) (tabla 2). Para comprobar la ubicuidad, la especificidad y la sensibilidad de estos cebadores, se utilizó un ensayo de PCR que se llevó a cabo en un termociclador estándar (PTC-200 de MJ Research Inc.) mediante el protocolo siguiente: 1 pl de una suspensión bacteriana estandarizada tratada o de una preparación de ADN genómico purificada de bacterias se amplificaron en una mezcla de reacción de PCR de 20 pl. Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 a 2,5 mM, 0,4 pM de cada uno de los cebadores específicos del cromosoma de S. aureus y del SCCmec (SEQ ID n.° 22, 24 y 28 de la patente de los EE.UU. n.° 6156507 que corresponden a las SEQ ID n.° 56, 58 y 60 de la presente invención), 200 pM de cada uno de los cuatro dNTP (Pharmacia Biotech), SAB a 3,3 pg/pl (Sigma) y 0,5 U de polimerasa Taq (Promega) unida al anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences).

A continuación, las reacciones de PCR se sometieron a un termociclado de 3 min a 94 °C seguido de 40 ciclos de 60 s a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 60 s a 55 °C para la etapa de hibridación y 60 s a 72 °C para la etapa de extensión, y después viene una extensión final de 7 minutos a 72 °C en un termociclador estándar (PTC-200 de MJ Research Inc.). La detección de los productos de PCR se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa (2%) que contenía 0,25 pg/ml de bromuro de etidio. De las 39 cepas de SARM analizadas, 20 no se amplificaron con el ensayo de PCR desarrollado por Hiramatsu et al. (ejemplo 1, tablas 2 y 3).

Con vistas a establecer un ensayo diagnóstico rápido para los SARM, los presentes inventores desarrollaron nuevos conjuntos de cebadores específicos del extremo derecho de SCCmec de los tipos I y II (SEQ ID n.° 66, 100 y 101) (Anexo 1), SCCmec de tipo II (SEQ ID n.° 97 y 99), SCCmec de tipo III (SEQ ID n.° 67, 98 y 102) y en el cromosoma de S. aureus a la derecha del sitio de integración de SCCmec (^s E^q ID n.° 64, 70, 71, 72, 73, 74, 75 y 76) (tabla 5). Estos cebadores, que amplifican amplicones cortos (de 171 a 278 pb), son compatibles para el uso en ensayos de PCR rápidos (tabla 7). El diseño de estos cebadores se basó en el análisis de varios alineamientos de secuencias de las secuencias de orfX y SCCmec descrito por Hiramatsu et al. (patente de los EE.UU. n.° 6156507) o disponibles en GenBank (tabla 10, anexo 1). Estos diferentes conjuntos de cebadores se utilizaron para analizar por PCR una serie de cepas de SARM, SASM, SCNRM y SCNSM. Se desarrollaron varios cebadores de amplificación para detectar los tres tipos de SSCmec (SEQ ID n.° 97 y 99 para el SCCmec de tipo II, SEQ ID n.° 66, 100 y 101 para el SCCmec de los tipos I y II y SEQ ID n.° 67, 98 y 102 para el SCCmec de tipo III). Los cebadores se eligieron de acuerdo con su especificidad por las cepas de SARM, su sensibilidad analítica en la PCR y la longitud del producto de la PCR. Se eligió un conjunto de dos cebadores para la región del extremo derecho de SCCmec (SEQ ID n.° 66 específica de SCCmec de los tipos I y II; SEQ ID n.° 67 específica de SCCmec de tipo III). De los 8 cebadores diferentes diseñados para que se hibriden sobre el cromosoma de S. aureus a la derecha del sitio de integración de SCCmec (que se hibridarán selectivamente al gen orfX) (SEQ ID n.° 64, 70, 71, 72, 73, 74, 75 y 76), se encontró que sólo una (SEQ ID n.° 64) era específica de los SARM basándose en el análisis de diferentes cepas de SARM, ^sA^s M, SCNRM y SCNSM (tabla 12). Por consiguiente, se desarrolló un ensayo de PCR que utilizaba el conjunto óptimo de cebadores (SEQ ID n.° 64, 66 y 67) que podría amplificar específicamente las cepas de SARM que contenían SCCmec de los tipos I, II y III (figura 2, anexo 1). Aunque el ensayo de PCR desarrollado con este nuevo conjunto de cebadores era muy sensible (a saber, permitió la detección de 2 a 5 copias del genoma para los tres tipos de SCCmec) (tabla 11), presentó las mismas limitaciones (a saber, falta de ubicuidad) que el ensayo desarrollado por Hiramatsu et al. Las 20 cepas de SARM que no se amplificaron con los cebadores de Hiramatsu et al. tampoco se detectaron mediante el conjunto de cebadores que comprenden las SEQ ID n.° 64, 66 y 67 (tablas 3 y 12). Claramente, se necesitan herramientas de diagnóstico para conseguir una ubicuidad de al menos el 50% entre las cepas analizadas.

Con vistas a establecer un método de identificación y detección de los SARM más ubicuo (a saber, capacidad para detectar todas o la mayoría de las cepas de SARM), determinamos la secuencia de la MREJ presente en estas 20 cepas de SARM que no se amplificaron. Esta investigación ha conducido al descubrimiento e identificación de siete secuencias diana de MREJ nuevas y diferentes que se pueden utilizar para los propósitos diagnósticos. Estas siete nuevas secuencias de MREJ no se pudieron predecir ni detectar con el sistema descrito en la patente de los EE.UU. n.° 6156507 por Hiramatsu et al. A saber, la presente invención representa un método mejorado para detectar e identificar los SARM porque proporciona un método de diagnóstico más ubicuo que permite detectar los principales clones de SARM epidémicos en el mundo.

Secuenciación de secuencias nucleotídicas de MREJ a partir de cepas de SARM no amplificables con los cebadores específicos de SCCmec de los tipos I, II y III

Dado que el ADN de 20 cepas de SARM no se amplificó con el conjunto de cebadores desarrollado por Hiramatsu et al. (SEQ ID n.° 22, 24 y 28 de la patente de los EE.UU. n.° 6156507 que corresponden a las SEQ ID n.° 56, 58 y 60 en la presente invención) (tablas 2 y 3) ni con el conjunto de cebadores desarrollado en la presente invención basándose en las secuencias de los mismos tres tipos de SCCmec (I, II y III) (SEQ ID n.° 64, 66 y 67) (tabla 12), se determinó la secuencia nucleotídica de la MREJ para 16 de estas 20 cepas de SARM.

La transposasa de IS437 se relaciona a menudo con la inserción de los genes de resistencia dentro del locus mec. El gen que codifica esta transposasa se ha descrito que con frecuencia está en una o varias copias dentro del segmento derecho de SCCmec (Oliveira et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44: 1906-1910; Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1323-36). Por lo tanto, en un primer intento de secuenciar las nuevas MREJ de 16 de las 20 cepas de SARM descritas en la tabla 3, se diseñó un cebador en la secuencia del gen que codifica la transposasa de IS437 (SEQ ID n.° 68) y se combinó con un cebador específico de orfX a la derecha del sitio de integración de SCCmec (SEQ ID n.° 70) (tablas 5 y 8). La estrategia utilizada para seleccionar estos cebadores se ilustra en la figura 3.

Los fragmentos de MREJ a secuenciar se amplificaron con el protocolo de amplificación siguiente: 1 pl de la suspensión celular tratada (o de una preparación de ADN genómico purificado) se transfirió directamente a 4 tubos que contenían 39 pl de una mezcla de reacción de PCR. Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCh a 2,5 mM, 1 pM de cada uno de los 2 cebadores (SEQ ID n.° 68 y 70), 200 pM de cada uno de los cuatro dNTP, 3,3 pg/pl de SAB (Sigma-Aldrich Canada Ltd) y 0,5 U de la ADN polimerasa Taq (Promega) unida al anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences). Las reacciones de PCR se ciclaron en un termociclador estándar (PTC-200 de MJ Research Inc.) como sigue: 3 min a 94 °C seguido de 40 ciclos de 5 s a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 30 s a 55 °C para la etapa de hibridación y 2 min a 72 °C para la etapa de extensión.

Posteriormente se agruparon las cuatro mezclas amplificadas por PCR y se resolvieron 10 pl de la mezcla por electroforesis en un gel de agarosa al 1,2% que contenía 0,25 pg/ml de bromuro de etidio. A continuación se visualizaron los amplicones con un Alpha-Imager (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) al exponerlo a la luz UV a 254 nm. Se estimó el tamaño de los amplicones por comparación con una escalera de masas moleculares de 1 kb (Life Technologies, Burlington, Ontario, Canadá). Lo que quedó de mezcla amplificada por PCR (150 pl en total) también se resolvió mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,2%. Luego se visualizaron los amplicones por tinción con azul de metileno (Flores et al., 1992, Biotechniques, 13: 203-205). De nuevo se estimó el tamaño de los amplicones por comparación con una escalera de masas moleculares de 1 kb. De las 16 cepas seleccionadas entre las 20 descritas en la tabla 3, seis se amplificaron con las SEQ ID n.° 68 y 70 como cebadores (CCRI-178, CCRI-8895, CCRI-8903, CCRI-1324, CCRI-1331 y CCRI-9504). Para estas seis cepas de SARM se obtuvo un producto de amplificación de 1,2 kb. La banda que corresponde a este producto de amplificación específico se cortó del gel de agarosa y se purificó con el kit de extracción de gel QIAquick™ (QUIAGEN Inc., Chassworth, CA). Después se aplicó directamente el protocolo de secuenciación al fragmento de ADN purificado del gel. Ambas hebras de los productos de amplificación de la MREJ se secuenciaron mediante el método de secuenciación de terminación de cadenas con didesoxinucleótidos en un secuenciador automático de ADN de Applied Biosystems (modelo 377) con su kit de reacción Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las reacciones de secuenciación se realizaron con los mismos cebadores (SEQ ID n.° 68 y 70) y 10 ng/100 pb por reacción de los amplicones purificados en gel. La secuenciación de MREJ de las seis cepas de SARM (CCRI-178, CCRI-8895, CCRI-8903, CCRI-1324, CCRI-1331 y CCRI-9504) descritas en la tabla 3 produjo las SEQ ID n.° 42, 43, 44, 45, 46 y 51, respectivamente (tabla 4).

Para estar seguros de que la secuencia determinada no contenía errores atribuibles a la secuenciación de los artefactos de la PCR, hemos secuenciado dos preparaciones de los productos de amplificación de MREJ purificados de gel que se originaron de dos amplificaciones de PCR independientes. Para la mayor parte de los fragmentos diana, las secuencias determinadas para ambas preparaciones de amplicones eran idénticas. Además, las secuencias de ambas hebras eran complementarias al 100%, lo que confirma la alta precisión de la secuencia determinada. Las secuencias de MREJ determinadas con la estrategia anterior se describen en la lista de secuencias y en la tabla 4.

Para secuenciar la MREJ en las cepas para las que no se había obtenido ningún amplicón con la estrategia que incluye cebadores específicos del gen de la transposasa de IS437 y del gen orfX, se utilizó otra estrategia que utiliza cebadores que están dirigidos selectivamente a las secuencias de mecA y orfX para amplificar fragmentos genómicos más largos. Se utilizó un nuevo cebador para PCR que está dirigido selectivamente a mecA (SEQ ID n.° 69) (tabla 8) en combinación con el mismo cebador en la secuencia de orfX (SEQ ID n.° 70). La estrategia utilizada para seleccionar estos cebadores se ilustra en la figura 3.

Se utilizó el protocolo de amplificación siguiente: se transfirió el ADN genómico purificado (300 ng) a un volumen final de 50 pl de una mezcla de reacción de PCR. Cada reacción de PCR contenía el tampón Herculase a 1X (Strategene, La Jolla, CA), 0,8 pM de cada uno de los 2 cebadores (SEQ ID n.° 69 y 70), 0,56 mM de cada uno de los cuatro dNTP y 5 U de Herculase (Stratagene). Las reacciones de PCR se ciclaron en un termociclador estándar (PTC-200 de MJ Research Inc.) como sigue: 2 min a 92 °C seguidos de 35 o 40 ciclos de 10 s a 92 °C para la etapa de desnaturalización, 30 s a 55 °C para la etapa de hibridación y 30 min a 68 °C para la etapa de extensión.

Posteriormente, 10 pl de la mezcla amplificada por PCR se resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,7% que contenía 0,25 pg/ml de bromuro de etidio. A continuación se visualizaron los amplicones como se describe más arriba. Se estimó el tamaño de los amplicones por comparación con una escalera de masas moleculares de 1 kb (Life Technologies). Después se llevó a cabo una reacción de reamplificación en 2 a 5 tubos con el mismo protocolo con 3 pl de la primera reacción de PCR utilizada como muestra problema para la segunda amplificación. Las mezclas reamplificadas por PCR se agruparon y también se resolvieron por electroforesis en un gel de agarosa al 0,7%. Entonces se visualizaron los amplicones mediante tinción con azul de metileno como se describe más arriba. Se obtuvo un producto de amplificación de unas 12 kb con esta estrategia de amplificación con todas las cepas analizadas. La banda que corresponde al producto de amplificación específico se cortó de gel de agarosa y se purificó como se describe más arriba. El fragmento de ADN purificado de gel se utilizó directamente luego en el protocolo de secuenciación tal y como se describe más arriba. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo con los mismos cebadores para amplificación (SEQ ID n.° 69 y 70) y 425-495 ng de los amplicones purificados en gel en cada reacción. Posteriormente, los cebadores de secuenciación internos (SEQ ID n.° 65, 77 y 96) (tabla 8) se utilizaron para obtener los datos de las secuencias en ambas hebras procedentes de un trozo más grande del amplicón. De las 20 cepas de SARM descritas en la tabla 3, 5 (CCRI-1331, CCRI-1263, CCRI-1377, CCRI-1311 y CCRI-2025) se secuenciaron con esta estrategia, lo que produjo las SEQ ID n.° 46, 47, 48, 49 y 50, respectivamente (tabla 4). La secuencia dentro del gen mecA también se obtuvo a partir de los amplicones generados que produjeron las SEQ ID n.° 27, 28, 29, 30 y 31 a partir de las cepas CCRI-2025, CCRI-1263, CCRI-1311, CCRI-1331 y CCRI-1377, respectivamente (tabla 4). También se obtuvieron secuencias más largas dentro del gen mecA y de las regiones cadena abajo para las cepas CCRI-2025, CCRI-1331 y CCRI-1377, tal y como se describe más adelante.

Para obtener secuencias más largas del gen orfX, se utilizaron otras dos estrategias que utilizan cebadores que están dirigidos selectivamente a las secuencias de mecA y de orfX (en el codón de inicio) para amplificar fragmentos cromosómicos más largos. Se diseñó un nuevo cebador para PCR en orfX (SEQ ID n.° 132) a utilizar en combinación con el mismo cebador en el gen mecA (SEQ ID n.° 69). La estrategia utilizada para seleccionar estos cebadores se ilustra en la figura 3. Con los cebadores SEQ ID n.° 69 y 132 se amplificaron ocho cepas de S. aureus (CCRI-9860, CCRI-9208, CCRI-9504, CCRI-1331, CCRI-9583, CCRI-9681, CCRI-2025 y CCRI-1377). La estrategia utilizada para seleccionar estos cebadores se ilustra en la figura 3.

Se utilizó el protocolo de amplificación siguiente: se transfirió ADN genómico purificado (350 a 500 ng) a una mezcla de reacción de PCR de 50 pl. Cada reacción de PCR contenía el tampón Herculase a 1X (Stratagene), 0,8 pM de cada uno del conjuno de 2 cebadores de la pareja (SEQ ID n.° 69 y 132), 0,56 mM de cada uno de los cuatro dNTP y 7,5 U de Herculase (Stratagene) con MgCh a 1 mM. Las reacciones de PCR se sometieron al termociclado que se describe más arriba.

Posteriormente, 5 pl de la mezcla amplificada por PCR se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% con 0,25 pg/ml de bromuro de etidio. Luego se visualizaron los amplicones tal y como se describe más arriba. Para una cepa de S. aureus (CCRI-9583), se tuvo que volver a amplificar con los cebadores SEQ ID n.° 96 y 158 (figura 3) en 4 tubos, mediante el mismo protocolo de PCR, con 2 pl de la primera reacción de PCR como muestra problema para la segunda amplificación. Las mezclas reamplificadas mediante PCR se agruparon y también se resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. Después se visualizaron los amplicones mediante tinción con azul de metileno tal y como se describe más arriba. Se obtuvo una banda de aproximadamente 12 a 20 kb con esta estrategia de amplificación según las cepas analizadas. La banda que corresponde al producto de amplificación específico se cortó del gel de agarosa y se purificó con el kit de extracción de gel QIAquick™ o el kit de extracción de gel QIAEX II (QIAGEN Inc.). Dos cepas, CCRI-9583 y CCRI-9589, también se amplificaron con los cebadores SEQ ID n.° 132 y 150, lo que generó un producto de amplificación de 1,5 kb. Los amplicones largos (12­ 20 kb) se secuenciaron utilizando de 0,6 a 1 pg por reacción, mientras que los amplicones cortos (1,5 kb) se secuenciaron con 150 ng por reacción. Las reacciones de secuenciación se realizaron con diferentes conjuntos de cebadores para cada cepa de S. aureus: 1) SEQ ID n.° 68, 70, 132, 145, 146, 147, 156, 157 y 158 para la cepa CCRI-9504; 2) SEQ ID n.° 70, 132, 154 y 155 para la cepa CCRI-2025; 3) SEQ ID n.° 70, 132, 148, 149, 158 y 159 para la cepa CCRI-9681; 4) SEQ ID n.° 70, 132, 187 y 188 para la cepa CCRI-9860; 5) SEQ ID n.° 70, 132, 150 y 159 para la cepa CCRI-9589, 6) SEQ ID n.° 114, 123, 132, 150 y 158 para la cepa CCRI-9583; 7) SEQ ID n.° 70, 132, 154 y 155 para la cepa CCRI-1377, 8) SEQ ID n.° 70, 132, 158 y 159 para la cepa CCRI-9208; 9) SEQ ID n.° 68, 70, 132, 145, 146, 147 y 158 para la cepa CCRI-1331; y 10) SEQ ID n.° 126 y 127 para la cepa CCRI-9770.

En una cepa (CCRI-9770), los genes orfX y orfSA0022 resultaron estar total o parcialmente delecionados basándose en la amplificación con cebadores específicos para estos genes (SEQ ID n.° 132 y 159 y SEQ ID n.° 128 y 129, respectivamente) (tabla 8). Posteriormente se diseñó un nuevo cebador para PCR en orfSA0021 (SEQ ID n.° 126) para utilizarlo en combinación con el mismo cebador en el gen mecA (SEQ ID n.° 69). Se obtuvo un producto de amplificación de 4,5 kb con este conjunto de cebadores. La amplificación, purificación y secuenciación de los amplicones se llevó a cabo tal y como se describe más arriba.

Para obtener la secuencia de la región de SSCmec que contiene mecA para 10 de las 20 cepas de SARM descritas en la tabla 3 (CCRI-9504, CCRI-2025, CCRI-9208, CCRI-1331, CCRI-9681, CCRI-9860, CCRI-9770, CCRI-9589, CCRI-9583 y CCRI-1377), el cebador descrito más arriba diseñado en mecA (SEQ ID n.° 69) se utilizó en combinación con un cebador diseñado en la región cadena abajo de mecA (SEQ ID n.° 118) (tabla 8). Se obtuvo un producto de amplificación de 2 kb para todas las cepas analizadas. Una cepa, la CCRI-9583, se volvió a amplificar con los cebadores SEQ ID n.° 96 y 118 a partir del amplicón generado con cebadores SEQ ID n.° 69 y 132 descritos más arriba. La amplificación, reamplificación y purificación de amplicones, y las reacciones de secuenciación, se realizaron tal y como se describe más arriba. Las reacciones de secuenciación se realizaron con los amplicones generados con las SEQ ID n.° 69 y 132 descritas más arriba o las SEQ ID n.° 69 y 118. Se utilizaron diferentes conjuntos de cebadores para secuenciación para cada cepa de S. aureus: 1) SEQ ID n.° 69, 96, 117, 118, 120, 151, 152 para las cepas CCRI-9504, CCRI-2025, CCRI-1331, CCRI-9770 y CCRI-1377; 2) SEQ ID n.° 69, 96, 118 y 120 para las cepas CCRI-9208, CCRI-9681 y CCRI-9589; 3) SEQ ID n.° 69, 96, 117, 118, 120 y 152 para la cepa CCRI-9860; y 4) SEQ ID n.° 96, 117, 118, 119, 120, y 152 para la cepa CCRI-9583.

A continuación, las secuencias obtenidas para 16 de las 20 cepas no amplificables por el ensayo de Hiramatsu (tabla 4) se compararon con las secuencias disponibles de las bases de datos públicas. En todos los casos, los trozos de la secuencia tenían una identidad cercana al 100% con las secuencias públicamente disponibles para orfX (SEQ ID n.° 42-51, 165-168 y 171) o mecA y la región secuencia abajo (SEQ ID n.° 27-31, 189-193, 195, 197-199 y 225). Sin embargo, mientras que el trozo de orfX de los fragmentos (SEQ ID n.° 42-51, 165-168 y 171) compartía una identidad de casi el 100% con el gen orfX de la cepa de SASM NCTC 8325 descrita por Hiramatsu et al. (SEQ ID n.° 3), se demostró que la secuencia del ADN dentro del extremo derecho del propio SCCmec era muy diferente de la de los tipos I, II, iIi y IV descritas por Hiramatsu et al. (tabla 13, figura 4). Se obtuvieron seis nuevos tipos de secuencias diferentes.

Se debe advertir que Hiramatsu et al. demostraron que el SCCmec de tipo I se podía asociar al MREP de tipo i, los SCCmec de tipos Il y IV se asocian al MREP de tipo ii, y el SCCmec de tipo III se asocia al MREP de tipo iii. Nuestros datos de secuenciación de MREJ de las diferentes cepas de SARM condujeron a descubrir 6 nuevos tipos de MREP denominados tipos iv, v, vi, vii, viii y ix. Las MREJ que comprenden diferentes tipos de MREP se denominaron según el esquema de numeración de MREP. Por lo tanto, el MREP de tipo i está comprendido dentro de la MREJ de tipo i, el MREP de tipo ii está comprendido dentro de la MREJ de tipo ii, etc., hasta llegar al MREP de tipo ix.

Las secuencias que están en el extremo derecho de SCCmec obtenidas de las cepas CCRI-178, CCRI-8895, CCRI-8903, CCRI-1324, CCRI-1331 y CCRI-9504 (SEQ ID n.° 42, 43, 44, 45, 46 y 51) eran casi idénticas unas a otras y mostraban una identidad de casi el 100% con IS437 (n.° de acceso de GenBank AF422691, ABO37671, AF411934). Sin embargo, nuestros datos de secuencias revelaron por primera vez la localización de esta secuencia de IS437 en el extremo derecho de SCCmec adyacente al sitio de integración. Por lo tanto, como las secuencias del extremo derecho de SCCmec de estas 6 cepas de SARM eran diferentes de las de SCCmec de tipo I de la cepa NCTC 10442, SCCmec de tipo II de la cepa N315, SCCmec de tipo III de la cepa 85/2082 y SCCmec de tipo IV de las cepas CA05 y 8/6-3P descritas por Hiramatsu et al. (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1323-1336; Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1147-1152), estas nuevas secuencias se denominaron MREP de tipo iv (SEQ ID n.° 42-46 y 51). Una búsqueda con BLAST con el trozo de SCCmec de las secuencias de MREP de tipo iv produjo alineamientos significativos con secuencias que codifican trozos de muy diversas transposasas conocidas. Por ejemplo, cuando se compara con el n.° de acceso de Genbank AB037671, el MREP de tipo iv de la SEQ ID n.° 51 compartió una identidad del 98% con la posible transposasa de IS437 y su región cadena abajo; también estaban presentes en el alineamiento dos huecos de 7 nucleótidos cada uno.

Las secuencias obtenidas de las cepas CCRI-1263, CCRI-1377, CCRI-1311 y CCRI-2025 (SEQ ID n.° 47-50) eran casi idénticas entre sí y diferentes de los tres tipos de SCCmec y del MREP de tipo iv y, por consiguiente, se denominaron MREP de tipo v. Cuando se compara con las secuencias de GenBank mediante BLAST, las secuencias de MREP de tipo v no compartían ninguna homología significativa con ninguna secuencia publicada, excepto en los primeros 28 nucleótidos. Este tramo corto correspondía a los últimos 11 nucleótidos codificantes de orfX, seguido de 17 nucleótidos cadena abajo que incluyen la repetición inversa derecha (IR-R, por su nombre en inglés) de SCCmec.

La secuencia obtenida de la cepa CCRI-9208 también era diferente de los tres tipos de SCCmec y de los MREP de los tipos iv y v y, por consiguiente, se denominó MREP de tipo vi (SEQ ID n.° 171). Tras una búsqueda con BLAST, se demostró que el MREP de tipo vi era único, y que no mostraba ninguna homología significativa con ninguna secuencia publicada.

Las secuencias obtenidas de las cepas CCRI-9583 y CCRI-9589 también eran diferentes de los tres tipos de SCCmec y de los MREP de tipos iv a vi y, por lo tanto, se denominaron MREP de tipo vii (SEQ ID n.° 165 y 166).

Tras una búsqueda con BLAST, también se demostró que el tipo vii de MREP era único, y que no mostraba ninguna homología significativa con ninguna secuencia publicada.

La secuencia obtenida de la cepa CCRI-9860 también era diferente de los tres tipos de SCCmec y de los MREP de tipos iv a vii y, por lo tanto, se denominó MREP de tipo viii (SEQ ID n.° 167). La secuencia obtenida de la cepa CCRI-9681 también era diferente de los tres tipos de SCCmec y de los MREP de tipos iv a viii y, por lo tanto, se denominó MREP de tipo ix (SEQ ID n.° 168). Las búsquedas con BLAST con el trozo de SSCmec de las secuencias de los MREP de tipos viii y ix devolvió alineamientos significativos, pero sólo para los primeros —150 nucleótidos de cada tipo de MREP. Por ejemplo, el comienzo de la secuencia del MREP de tipo viii tenía una identidad del 88% con un trozo del n.° de acceso a GenBank AB063173, pero no se encontró ninguna homología significativa con ninguna secuencia publicada para el resto de la secuencia. De la misma manera, los primeros —150 nucleótidos del MREP de tipo ix tenían una identidad del 97% con la misma porción de AB063173, y el resto de la secuencia era única. El pequeño trozo homólogo de los MREP de tipos viii y ix corresponde en la AB063173 a los últimos 14 nucleótidos codificantes de orfX, la IR-R de SCCmec y un trozo de orfCM009. Aunque compartan cierto parecido, los MREP de tipos viii y ix son muy diferentes entre sí; tal y como se muestra en la tabla 13, sólo hay una identidad del 55,2% entre ambos tipos para los primeros 500 nucleótidos del trozo de SCCmec.

Finalmente, no obtuvimos ninguna secuencia dentro de SSCmec de la cepa CCRI-9770. Sin embargo, tal y como se describe en el apartado «Secuenciación de las secuencias nucleotídicas de MREJ a partir de cepas de SARM no amplificables con los cebadores específicos de los SCCmec de tipos I, II y III», esta cepa tiene aparentemente una deleción total o parcial de los genes orfX y orfSA0022 en el ADN cromosómico a la derecha del sitio de integración de SCCmec, y esto representaría una nueva unión en el extremo derecho. Por lo tanto, esta nueva secuencia la denominamos MREP de tipo x (SEQ ID n.° 172). La secuenciación futura debería revelar si esta denominada MREJ de tipo x contiene un nuevo MREP de tipo x o si la ausencia de amplificación está ocasionada realmente por variaciones en la parte cromosómica de la MREJ.

Las secuencias del primer trozo de 500 nucleótidos del extremo derecho de todos los SCCmec obtenidos en la presente invención se compararon con las de los SCCmec de los tipos I, II y III con los programas de GCG Pileup y Gap. La tabla 13 describe la identidad a nivel de nucleótido entre el extremo derecho de los SCCmec de las seis secuencias nuevas y las de los SCCmec de tipos I, II y III con el programa Gap de GCG. Mientras que los SCCmec de tipos I y II mostraron una identidad de casi el 79,2% (al diferir sólo por una inserción de 102 pb presente en el SCCmec de tipo II) (figuras 1, 2 y 4), todos los demás tipos de MREP mostraron identidades que variaban del 40,9% al 57,1%. Esto explica porqué el extremo derecho de los nuevos MREP de tipos iv a ix descritos en la presente invención no se pudieron predecir ni detectar con el sistema descrito por Hiramatsu et al.

No se secuenciaron cuatro cepas (CCRI-1312, CCRI-1325, CCRI-9773 y CCRI-9774) descritas en la tabla 3, sino que en su lugar se caracterizaron con los cebadores para PCR. Con cebadores para amplificación específicos descritos en los ejemplos 4, 5 y 6 se demostró que las cepas CCRI-1312 y CCRI-1325 contenían MREP de tipo v, mientras que con los cebadores para amplificación específicos descritos en el ejemplo 7 se demostró que las cepas CCRI-9773 y CCRI-9774 contenían MREP de tipo vii.

Para obtener la secuencia completa del SCCmec presente en las cepas de SARM descritas en la presente invención se desarrollaron cebadores específicos para el cromosoma de S. aureus a la izquierda (cadena arriba del gen mecA) del sitio de integración de SCCmec. Basándose en las secuencias de las bases de datos públicas disponibles, se diseñaron 5 cebadores diferentes (SEQ ID n.° 85-89) (tabla 9). Estos cebadores se pueden utilizar en combinación con cebadores específicos del cromosoma de S. aureus para secuenciar todo el SCCmec o, alternativamente, utilizarlos en combinación con un cebador específico de mecA (SEQ ID n.° 81) para secuenciar la unión en el extremo izquierdo del SCCmec. También desarrollamos varios cebadores específicos para que las secuencias de SCCmec conocidas que hay a lo largo del locus para obtener la secuencia completa de SCCmec (tabla 9). Estos cebadores permitirán asignar un tipo de SCCmec a las cepas de SARM descritas en la presente invención.

Selección de los cebadores para amplificación a partir de las secuencias de SCC meclorfX

Las secuencias de MREJ determinadas por los inventores o seleccionadas de las bases de datos públicas se utilizaron para seleccionar los cebadores para PCR para detectar e identificar los SARM. La estrategia utilizada para seleccionar estos cebadores para PCR se basó en el análisis de alineamientos múltiples de secuencias de diferentes secuencias de MREJ.

Tras el análisis de los datos de las seis secuencias nuevas de MREP de los tipos iv a ix descritas más arriba, se diseñaron los cebadores específicos para cada secuencia de los nuevos tipos de MREP (SEQ ID n.° 79, 80, 109, 112, 113, 115, 116 y 204) (figura 2, tabla 5, ejemplos 3, 4, 5, 6, 7 y 8). Los cebadores específicos para los M^r E^p de los tipos iv, v y vii (SEQ ID n.° 79, 80 y 112) se utilizaron en múltiplex con los tres cebadores para detectar los SCCmec de los tipos I, II y III (SEQ ID n.° 64, 66 y 67) y el cebador específico de orfX de S. aureus (SEQ ID n.° 64) (ejemplos 3, 4, 5, 6, y 7). Los cebadores específicos de los MREP de tipos vi, viii y ix (SEQ ID n.° 204, 115, 116 y 109) también se diseñaron y se comprobaron con su diana específica (ejemplo 8).

Detección de los productos de amplificación

Clásicamente, la detección de los productos de amplificación por PCR se realiza por electroforesis estándar en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, tal y como se describe más arriba. Sin embargo, está claro que se pueden utilizar otros métodos para detectar los productos de amplificación específicos, que pueden ser más rápidos y más prácticos para el diagnóstico convencional. Los ejemplos de tales métodos se describen en la solicitud de patente internacional en tramitación con la presente WO01/23604 A2.

La detección de los amplicones también se puede realizar mediante hibridación líquida o en soporte sólido con sondas de ADN internas específicas de especie que se hibridan a un producto de amplificación. Tales sondas se pueden generar a partir de cualquier secuencia de nuestro repertorio y diseñar para que se hibriden específicamente a productos de amplificación de ADN que son objeto de la presente invención. Otra posibilidad es que los amplicones se pueden caracterizar por secuenciación. Véase la solicitud de patente internacional en tramitación con la presente WO01/23604 A2 para los ejemplos de los métodos de detección y de secuenciación.

Para mejorar la eficacia de la amplificación de ácidos nucleicos, se puede modificar la composición de la mezcla de reacción (Chakrabarti y Schutt, 2002, Biotechniques, 32: 866-874; Al-Soud y Radstrom, 2002, J. Clin. Microbio!., 38: 4463-4470; Al-Soud y Radstrom, 1998, Appl. Environ. Microbio!. 64: 3748-3753; Wilson, 1997, Appl. Environ. Microbio!., 63: 3741-3751). Tales modificaciones de la mezcla de reacción de amplificación incluyen el uso de diferentes polimerasas o la adición de facilitadores de la amplificación de ácidos nucleicos, tales como asbetaína, SAB, sulfóxidos, proteína gp32, detergentes, cationes, cloruro de tetrametilamonio y otros.

En una realización preferente, la detección en tiempo real de la amplificación por PCR se monitorizó con sondas fluorescibles en un aparato Smart Cycler® (Cepheid, Sunnyvale, CA). Se desarrolló un ensayo de PCR múltiplex que contenía cebadores específicos para los MREP de tipos i a v y para el orfX de S. aureus (SEQ ID n.° 64, 66, 67, 79 y 80), una sonda fluorescible específica de la secuencia de orfX (SEQ ID n.° 84, véase anexo II y figura 2) y un control interno para monitorizar la inhibición de la PCR. El control interno contiene secuencias complementarias a los cebadores específicos de orfX y de los MREP de tipo iv (SEQ ID n.° 79 y 64). El ensayo también contiene una sonda fluorescible, marcada con tetracloro-6-carboxifluoresceína (TET), específica de una secuencia interna del fragmento de ADN generado durante la amplificación del control interno. Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCb a 3,45 mM, 0,8 pM de cada uno de los cebadores específicos del MREP (SEQ ⁱD n.° 66 y 67) y del cebador específico de orfX (SEQ ID n.° 64), 0,4 pM de cada uno de los cebadores específicos de MREP (SEQ ID n.° 79 y 80), 80 copias del control interno, 0,2 pM de la sonda fluorescible marcada con TET específica del control interno, 0,2 pM de la sonda fluorescible (SEQ ID n.° 84) marcada con 6-carboxifluoresceína (FAM), 330 pM de cada uno de los cuatro dNTP (Pharmacia Biotech), 3,45 pg/pl de SAB (Sigma), y 0,875 U de la polimerasa Taq (Promega) unida al anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences). La amplificación por PCR en el Smart Cycler® se realizó como sigue: 3 min a 95 °C para la desnaturalización inicial, luego 48 ciclos de tres etapas que consisten en 5 s a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 15 s a 60 °C para la etapa de hibridación y 15 s a 72 °C para la etapa de extensión. Las pruebas de sensibilidad realizadas con ADN genómico purificado a partir de una cepa de SARM de cada tipo de MREP (i a v) mostraron un límite de detección de 2 a 10 copias de genoma (ejemplo 5). Ninguna de las 26 SCNRM ni de las 10 SCNSM analizadas dieron positivo con este ensayo múltiplex. Las ocho cepas de SARM (CCRI-9208, CCRI-9770, CCRI-9681, CCRI-9860, CCRI-9583, CCRI-9773, CCRI-9774, CCRI-9589) que albergan las secuencias nuevas de MREP de los tipos vi, viii, ix y x descritas en la presente invención permanecieron indetectables (ejemplo 5).

En una realización preferente, se evaluó la detección de SARM con el ensayo de PCR múltiplex en tiempo real en el aparato Smart Cycler® (Cepheid, Sunnyvale, CA) directamente de los especímenes clínicos. Se recogieron 142 muestras nasales con torunda durante un programa de seguimiento hospitalario de SARM en el Hospital General de Montreal (Montreal, Quebec, Canadá). Las muestras de las torundas se analizaron en el Centre de Recherche en Infectiologie de la Universidad Laval antes de que pasaran 24 horas desde su recogida. Una vez recibidas, las torundas se sembraron en placas de agar con manitol y, luego, el material nasal de la misma torunda se preparó con un protocolo de preparación de especímenes simple y rápido descrito en la solicitud de patente de los ^e E.UU. en tramitación con la presente n° US 60/306163. La identificación clásica de SARM se realizó mediante los métodos de cultivo estándares.

De las 34 muestras, el ensayo de PCR detectó 33 positivos para SARM basándose en el método de cultivo. En comparación con el cultivo, el ensayo de PCR detectó 8 especímenes más que dieron positivo para el SARM con una sensibilidad del 97,1% y una especificidad del 92,6% (ejemplo 6). Este ensayo de PCR múltiplex representa un método rápido y poderoso de detección específica de vehículos de SARM directamente de especímenes nasales, y se puede utilizar con cualquier tipo de especímenes clínicos tales como heridas, sangre o cultivo de sangre, LCR, etc.

En una realización preferente, se desarrolló un ensayo de PCR múltiplex que contenía cebadores específicos de los MREP de tipos i, ii, iii, iv, v y vi, y del orfX de S. aureus (SEQ ID n.° 66, 67, 79, 80 y 112) y tres sondas fluorescibles específicas para la secuencia de orfX que permitieron detectar los dos polimorfismos de secuencia identificados en esta región de la secuencia de orfX. Cuatro de las cepas que no se detectaron con el ensayo múltiplex para detección de los MREP de tipos i a v se detectaron ahora con este ensayo múltiplex, mientras que las cuatro cepas de SARM (CCRI-9208, CCr I-9770, CCRI-9681, CCRI-9860) que albergan los MREP de tipos vi, viii, ix y x descritos en la presente invención permanecieron indetectables (ejemplo 7). También se diseñaron cebadores específicos para los MREP de tipos vi, viii y ix (SEQ ID n.° 204, 115, 116 y 109) y se demostró que detectaban sus cepas diana específicas (ejemplo 8). Mientras que los cebadores y las sondas procedentes de las enseñanzas de Hiramatsu et al. permitieron detectar sólo el 48,7% (19 cepas de 39) de las cepas de SARM de la tabla 2, los cebadores y las sondas diseñados en la presente invención permiten detectar el 97,4% de las cepas (38 cepas de 39) (véanse los ejemplos 7 y 8). Por lo tanto, se puede decir que nuestro ensayo tiene una ubicuidad superior al 50% para las cepas de SARM recogidas en la tabla 2.

Pruebas de especificidad, ubicuidad y sensibilidad para las sondas y cebadores oligonucleotídicos

Se analizó la especificidad de las sondas y cebadores oligonucleotídicos mediante la amplificación del ADN o mediante la hibridación con especies de estafilococos. Todas las especies estafilocócicas analizadas probablemente eran patógenos relacionados con infecciones o posibles contaminantes que se pueden aislar de especímenes clínicos. Cada ADN diana se puede liberar desde las células microbianas mediante tratamientos químicos y/o físicos estándares para lisar las células (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) o, alternativamente, se utilizó ADN genómico purificado con el kit de ADN GNOME™ (Qbiogene, Carlsbad, CA). Posteriormente, el ADN se amplificó con el conjunto de cebadores. Las sondas o cebadores específicos se hibridaron sólo con el ADN diana.

A los cebadores oligonucleotídicos que se encontró que amplificaban específicamente el ADN del SARM diana se les analizó posteriormente su ubicuidad por amplificación (a saber, los cebadores ubicuos que amplificaron con eficacia la mayor parte o todos los aislados de SARM). Finalmente, se determinó la sensibilidad analítica de los ensayos de PCR mediante diluciones de 10 veces o de 2 veces del ADN genómico purificado de los microorganismos diana. Para la mayoría de los ensayos se obtuvieron unos niveles de sensibilidad en el margen de 2 a 10 copias de genoma. La especificidad, la ubicuidad y la sensibilidad analítica de los ensayos por PCR se analizó bien directamente con cultivos bacterianos o bien con ADN genómico bacteriano purificado.

Las sondas fluorescibles se analizaron con la plataforma Smart Cycler® tal y como se describe más arriba. Se consideró que una sonda fluorescible era específica sólo cuando se hibridaba únicamente al ADN amplificado de la MREJ de S. aureus. A las sondas fluorescibles que se halló que eran específicas se les analizó posteriormente su ubicuidad (a saber, las sondas ubicuas que detectaban con eficacia la mayoría o todos los aislados de SARM) por hibridación a los ADN bacterianos de diferentes cepas de SARM.

Cepas bacterianas

Las cepas de referencia utilizadas para construir subrepertorios de datos de secuencias de unión del extremo derecho del SCCmec-cromosoma en propiedad, así como para comprobar los ensayos de hibridación y de amplificación, se obtuvieron de (i) la American Type Culture Collection (ATCC), (ii) el Laboratorio de Salud Pública de Québec (LSPQ) (Ste-Anne de Bellevue, Québec, Canadá), (iii) los centros para la prevención y el control de enfermedades (CDC, por su nombre en inglés) (Atlanta, GA), (iv) el Instituto Pasteur (París, Francia) y v) la colección Harmony (Londres, Reino Unido) (tabla 14). En esta invención también se utilizaron aislados clínicos de SARM, SASM, SCNRM y SCNSM de diferentes regiones geográficas (tabla 15). Se confirmó la identidad de nuestras cepas de SARM mediante pruebas fenotípicas y se volvió a confirmar mediante análisis por PCR con cebadores específicos de S. aureus y cebadores específicos para mecA (SEQ ID n.° 69 y 81) (Martineau et al., 2000, Antimicrob. Agents. Chemother. 44: 231-238).

En aras de la claridad, a continuación se encuentra una lista con los ejemplos, tablas, figuras y anexos de esta invención.

Descripción de los ejemplos

Ejemplo 1: los cebadores desarrollados por Hiramatsu et al. sólo pueden detectar las cepas de SARM que pertenecen a los MREP de tipos i, ii y iii, mientras que no detectan los tipos de MREP nuevos prevalentes.

Ejemplo 2: detección e identificación de SARM con cebadores específicos de las secuencias de MREP de tipos i, ii y iii desarrolladas en la presente invención.

Ejemplo 3: desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en un termociclador estándar para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v.

Ejemplo 4: desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v.

Ejemplo 5: desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v, y que incluye un control interno.

Ejemplo 6: detección de SARM mediante el ensayo múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v para detectar SARM directamente en los especímenes clínicos.

Ejemplo 7: desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv, v, vi y vii.

Ejemplo 8: desarrollo de ensayos de PCR en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en los MREP de tipos vi, viii y ix.

Descripción de las tablas

La tabla 1 da a conocer información sobre todos los cebadores para PCR desarrollados por Hiramatsu et al. en la patente de los EE.UU. n.° 6156507.

La tabla 2 es una recopilación de los resultados (ubicuidad y especificidad) para la detección de la unión en el extremo derecho de SCCmec-orfX con los cebadores descritos por Hiramatsu et al. en la patente de los EE.UU. n.° 6156507 en un termociclador estándar.

La tabla 3 es una lista de cepas de SARM no amplificables con los cebadores que están dirigidos selectivamente a los tipos I, II y III de las secuencias de la unión del extremo derecho del SCCmec-orfX.

La tabla 4 es una lista de las secuencias nucleotídicas de las MREJ de Staphylococcus aureus.

La tabla 5 da a conocer información sobre todos los cebadores desarrollados.

La tabla 6 es una lista de las sondas fluorescibles desarrolladas.

La tabla 7 muestra el tamaño de los amplicones de las diferentes parejas de cebadores descritas por Hiramatsu et al. en la patente de los EE.UU. n.° 6156507 o descritas en la presente memoria.

La tabla 8 da a conocer información sobre los cebadores desarrollados para secuenciar la unión en el extremo derecho de SCCmec-cromosoma.

La tabla 9 da a conocer información sobre los cebadores desarrollados para obtener la secuencia completa de SCCmec.

La tabla 10 es una lista de las secuencias disponibles en las bases de datos públicas (GenBank, proyectos genómicos o patente de los EE.UU. n.° 6156507) utilizadas para diseñar cebadores y sondas.

La tabla 11 ofrece la sensibilidad analítica del ensayo de PCR desarrollado en la presente invención con los cebadores que están dirigidos selectivamente a los tipos I, II y III de las secuencias de la unión en el extremo derecho de SCCmec-orfX y realizado en un termociclador estándar.

La tabla 12 es una recopilación de los resultados (ubicuidad y especificidad) para la detección de SARM con los cebadores desarrollados en la presente invención que están dirigidos selectivamente a los tipos I, II y III de las secuencias de unión en el extremo derecho de SCCmec-orfX y realizados en un termociclador estándar.

La tabla 13 muestra una comparación de la identidad de las secuencias entre los primeros 500 nucleótidos del extremo derecho de los SCCmec entre 9 tipos de MREP.

La tabla 14 da a conocer información sobre las cepas de referencia de SARM, SASM, SCNRM y SCNSM utilizadas para validar los ensayos de PCR desarrollados en la presente invención.

La tabla 15 da a conocer información sobre el origen de las cepas clínicas de SARM, SASM, SCNRM y SCNSM utilizadas para validar los ensayos de PCR descritos en la presente invención.

La tabla 16 describe la sensibilidad analítica del ensayo de PCR desarrollado en la presente invención que utiliza cebadores que están dirigidos selectivamente a 5 tipos de secuencias de MREP y realizado en un termociclador estándar.

La tabla 17 es una recopilación de los resultados (ubicuidad y especificidad) para el ensayo de PCR desarrollado en la presente invención que usa los cebadores que están dirigidos selectivamente a 5 tipos de secuencias de MREP y realizado en un termociclador estándar.

La tabla 18 describe la sensibilidad analítica del ensayo de PCR desarrollado en la presente invención que usa la plataforma Smart Cycler® para la detección de 5 tipos de MREP.

La tabla 19 es una recopilación de los resultados (ubicuidad y especificidad) para el ensayo de PCR desarrollado en la presente invención que utiliza cebadores y una sonda fluorescible que está dirigida selectivamente a 5 tipos de secuencias de MREP y realizado en la plataforma Smart Cycler®.

La tabla 20 describe la sensibilidad analítica del ensayo de PCR desarrollado en la presente invención que usa la plataforma Smart Cycler® para la detección de 6 tipos de MREP.

La tabla 21 es una recopilación de los resultados (ubicuidad y especificidad) para el ensayo de PCR desarrollado en la presente invención que usa cebadores y una sonda fluorescible que está dirigida selectivamente a 6 tipos de secuencias de MPREP y realizado en la plataforma Smart Cycler®.

Descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama que ilustra la posición de los cebadores desarrollados por Hiramatsu et al. (patente de los EE.UU. n.° 6156507) en la unión del extremo derecho de SCCmec-cromosoma para detectar e identificar SARM. La figura 2 es un diagrama que ilustra la posición de los cebadores seleccionados en la presente invención en la unión del extremo derecho de SCCmec-orfX para detectar e identificar SARM.

La figura 3 es un diagrama que ilustra la posición de los cebadores seleccionados en la presente invención para secuenciar los nuevos tipos de MREP.

La figura 4 ilustra un alineamiento de secuencias de nueve tipos de MREP.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Organización esquemática de los tipos I, II y III de las uniones en el extremo derecho de SCCmec-orfX, y localización de los cebadores (SEQ ID n.° 52-63) descritos por Hiramatsu et al. para detectar e identificar SARM. El tamaño de los amplicones se describe en la tabla 7.

Figura 2. Organización esquemática de los MREP de tipos i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii y ix, y localización de los cebadores y la sonda fluorescible que están dirigidos selectivamente a todos los tipos de MREP (SEQ ID n.° 20, 64, 66, 67, 79, 80, 84, 112, 115, 116, 84, 163 y 164) que se desarrollaron en la presente invención. El tamaño de los amplicones se describe en la tabla 7.

Figura 3. Organización esquemática de las uniones en el extremo derecho de SCCmec-cromosoma, y localización de los cebadores (SEQ ⁱD n.° 65, 68, 69, 70, 77, 96, 118, 126, 132, 150 y 158) desarrollados en la presente invención para secuenciar los MREP de tipos iv, v, vi, vii, viii, ix y x.

Figura 4. Alineamiento múltiple de secuencias de representantes de nueve tipos de MREP (representados por trozos de las SEQ ID n.° 1, 2, 104, 51, 50, 171, 165, 167 y 168 para los tipos i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii y ix, respectivamente). Descripción de los anexos

Los anexos muestran las estrategias utilizadas para seleccionar cebadores y sondas internos:

El anexo I ilustra la estrategia para seleccionar los cebadores a partir de las secuencias de SCCmec y de orfX específicas de los SCCmec de los tipos I y II.

El anexo II ilustra la estrategia para seleccionar las sondas fluorescibles específicas para detectar en tiempo real las uniones en el extremo derecho de SCCmec-orfX.

Tal y como se muestra en estos anexos, los cebadores para amplificación seleccionados pueden contener inosinas y/o bases ambiguas. La inosina es un análogo de nucleótido capaz de unirse específicamente a cualquiera de los cuatro nucleótidos A, C, G o T. Otra posibilidad es que se utilicen oligonucleótidos degenerados que consisten en una mezcla de oligonucleótidos que tienen dos o más de los cuatro nucleótidos A, C, G o T en el sitio de las discordancias. La inclusión de la inosina y/o de degeneraciones en los cebadores para amplificación proporciona cierta tolerancia a los apareamientos erróneos, con lo que se permite la amplificación de un abanico más amplio de secuencias nucleotídicas diana (Dieffenbach y Dveksler, 1995, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York).

Ejemplos

Ejemplo 1:

Los cebadores desarrollados por Hiramatsu et al. sólo pueden detectar las cepas de SARM que pertenecen a los MREP de tipos i, ii y iii, mientras que no detectan nuevos tipos de MREP prevalentes.

Tal y como se muestra en la figura 1, Hiramatsu et al. han desarrollado varios cebadores que pueden hibridarse específicamente al extremo derecho de los ADN de SCCmec de tipos I, II y III. Combinaron estos cebadores con cebadores específicos de la región del cromosoma de S. aureus localizada a la derecha del sitio de integración de SCCmec para detectar los SARM. Hiramatsu et al. demostraron que el conjunto de cebadores (SEQ ID n.° 22, 24 y 28 en la patente de los EE.UU. n.° 6156507 que corresponde a las SEQ ID n.° 56, 58 y 60 en la presente invención) eran los más específicos y ubicuos para detectar SARM. Este conjunto de cebadores ofrece productos de amplificación de 1,5 kb para el SCCmec del tipo I, de 1,6 kb para el SCCmec del tipo II y de 1,0 kb para el SCCmec de tipo III (tabla 7). Se ensayó la ubicuidad y la especificidad de este ensayo de PCR múltiplex con 39 cepas de SARM, 41 cepas de SASM, 9 cepas de SCNRM y 11 cepas de SCNSM (tabla 2). En una mezcla de reacción de PCR de 20 pl se amplificó 1 pl de una suspensión bacteriana estandarizada tratada o de una preparación de ADN genómico bacteriano purificado de bacterias. Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCb a 2,5 mM, 0,4 pM de cada uno de los cebadores específicos de SCCmec y de orfX (SEQ ID n.° 56, 58 y 60), 200 pM de cada uno de los cuatro dNTP (Pharmacia Biotech), 3,3 pg/pl de SAB (Sigma) y 0,5 U de la polimerasa Taq (Promega) unida al anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences).

Las reacciones de la PCR se sometieron a continuación al termociclado: 3 min a 94 °C seguidos de 40 ciclos de 60 s a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 60 s a 55 °C para la etapa de hibridación y 60 s a 72 °C para la etapa de extensión, y luego se realizó la última extensión de 7 minutos a 72 °C en un termociclador estándar (PTC-200 de MJ Research Inc.). La detección de los productos de PCR se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa (2%) que contienen 0,25 pg/ml de bromuro de etidio.

Ninguna de las cepas de SCNRM o SCNSM analizadas fue detectada con el conjunto de cebadores que detectan los SCCmec de tipos I, II y III. De las 39 cepas de SARM analizadas, 20 no se detectaron con este ensayo de PCR múltiplex (tablas 2 y 3). Una de estas cepas de SARM sin detectar corresponde al clon portugués de SARM muy epidémico (cepa CCRI-9504; De Lencastre et al., 1994, Eur, J. Clin. Microbio!. Infect. Dis. 13: 64-73) y otra corresponde al clon canadiense de SARM muy epidémico CMRSA1 (cepa CCRI-9589; Simor et al., CCDR 1999, 25­ 12, 15 de junio). Estos datos demuestran que el conjunto de cebadores desarrollado por Hiramatsu et al. (SEQ ID n.° 22, 24 y 28 en la patente de los EE.UU. 6156507 que corresponden a las SEQ ID n.° 56, 58 y 60 en la presente invención) no es ubicuo para detectar los SARM y sugiere que algunas cepas de SARM tienen secuencias en la unión del extremo derecho de SCCmec que son diferentes de las identificadas por Hiramatsu et al. En los SARM se encuentran secuencias de SCCmec de otros tipos u otras secuencias en el extremo derecho del SCCmec (tipo de MREP). Una limitación de este ensayo es la detección inespecífica de 13 cepas de SASM (tabla 2).

Ejemplo 2:

Detección e identificación de SARM con cebadores específicos de las secuencias de los MREP de tipos i, ii y iii desarrolladas en la presente invención. Según el análisis de los alineamientos múltiples de secuencias de las secuencias de orfX y de SCCmec descritas por Hiramatsu et al. o disponibles en GenBank, se diseñó un conjunto de cebadores (SEQ ID n.° 64, 66, 67) capaces de amplificar segmentos cortos de las uniones en el extremo derecho de SCCmec-orfX de los tipos I, II y III a partir de cepas de SARM y de discriminarlas de los SCNSM (anexo I y figura 2). El conjunto de cebadores elegido ofrece productos de amplificación de 176 pb para el SCCmec de tipo I, de 278 pb para el SCCmec de tipo II y de 223 pb para el SCCmec de tipo III, y permite la amplificación rápida por PCR. Estos cebadores se utilizaron en PCR múltiplex para comprobar su ubicuidad y especificidad con 208 cepas de SARM, 252 cepas de SASM, 41 cepas de SCNRM y 21 cepas de SCNSM (tabla 12). La amplificación y la detección por PCR se realizó tal y como se describe en el ejemplo 1. Las reacciones de PCR se sometieron a continuación a un termociclado (3 minutos a 94 °C seguidos de 30 o 40 ciclos de 1 s a 95 °C para la etapa de desnaturalización y de 30 s a 60 °C para la etapa de hibridación-extensión y luego va seguida por una última extensión de 2 minutos a 72 °C) en un termociclador estándar (PTC-200 de MJ Research Inc.). La detección de los productos de PCR se realizó como se describe en el ejemplo 1.

Con este conjunto de cebadores (tabla 12) no se detectó ninguna de las cepas analizadas de SCNRM ni de SCNSM. Sin embargo, las 20 cepas de SARM que no se detectaron con el conjunto de cebadores desarrollado por Hiramatsu et al. (SEQ ID n.° 56, 58 y 60) tampoco se detectaron con los cebadores desarrollados en la presente invención (tablas 3 y 12). Estos datos también demuestran que algunas cepas de SARM tienen secuencias en la unión del extremo derecho del SCCmec-cromosoma que son diferentes a las identificadas por Hiramatsu et al. De nuevo, como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se detectaron inespecíficamente 13 cepas de SASM (tabla 12). Queda por establecer la importancia clínica de este hallazgo porque estas cepas que parecen SASM podrían ser el resultado de una deleción reciente del locus mec (Deplano et al., 2000, J. Antimicrob. Chemotherapy, 46: 617­ 619; Inglis et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 2231-2239; Inglis et al, 1993, J. Infect. Dis. 167: 323-328; Lawrence et al, 1996, J. Hosp. Infect., 33: 49-53; Wada et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm. 176: 1319-1326).

Ejemplo 3:

Desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en un termociclador estándar para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v. Tras el análisis de dos de los datos de secuencias de los nuevos MREP de tipos iv y v descritos en la presente invención, se diseñaron y usaron dos nuevos cebadores (SEQ ID n.° 79 y 80) en las múltiplex con los tres cebadores SEQ ID n.° 64, 66 y 67 descritos en el ejemplo 2. La amplificación por PCR y detección de los productos de PCR se realizó tal y como se describe en el ejemplo 2. Los análisis de sensibilidad realizados con diluciones decimales o a la mitad del ADN genómico purificado de diferentes cepas de SARM de cada tipo de MREP mostraron un límite de detección de 5 a 10 copias del genoma (tabla 16). Se realizaron pruebas de especificidad con 0,1 ng de ADN genómico purificado o 1 pl de una suspensión bacteriana estandarizada. Todas las cepas de SCNRM o de SCNSM analizadas dieron negativo con este ensayo múltiplex (tabla 17). De las 20 cepas de SARM que no se detectaron con la PCR múltiplex descritas en los ejemplos 1 y 2, ahora se detectaron 12 con este ensayo múltiplex. De nuevo, tal y como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se detectaron inespecíficamente las 13 cepas de SASM (tabla 12). Las ocho cepas de SARM (CCRI-9208, CCRI-9583, CCRI-9773, CCRI-9774, CCRI-9589, CCRI-9860, CCRI-9681, CCRI-9770) y que albergan las secuencias de MREP de los nuevos tipos vi, vii, viii, ix y x descritas en la presente invención permanecieron indetectables.

Ejemplo 4:

Desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v. El ensayo de PCR múltiplex descrito en el ejemplo 3 que contiene los cebadores (SEQ ID n.° 64, 66, 67, 79 y 80) se adaptó a la plataforma Smart Cycler® (Cepheid). Se desarrolló una sonda fluorescible específica de la secuencia de orfX (SEQ ID n.° 84, véase el anexo II). Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCh a 3,5 mM, 0,4 pM de cada uno de los cebadores específicos de SCCmec y de orfX (SEQ ID n.° 64, 66, 67, 79 y 80), 0,2 pM de la sonda fluorescible marcada con FAM (SEQ ID n.° 84), 200 pM de cada uno de los cuatro dNTP, 3,3 pg/pl de SAB y 0,5 U de la polimerasa Taq unida al anticuerpo TaqStart™. La amplificación por PCR en el Smart Cycler® se realizó como sigue: 3 min a 94 °C para la desnaturalización inicial, luego 45 ciclos de tres etapas que consisten en 5 s a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 15 s a 59 °C para la etapa de hibridación y 10 s a 72 °C para la etapa de extensión. La detección de la fluorescencia se realizó al final de cada etapa de hibridación. Los análisis de sensibilidad realizados con ADN genómico purificado de varias cepas de SARM de cada tipo de MREP mostraron un límite de detección de 2 a 10 copias del genoma (tabla 18). Ninguna de las SCNRM ni SCNSM dieron positivo con este ensayo múltiplex (tabla 19). De nuevo, como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se detectaron inespecíficamente 13 cepas de SASM. De las 20 cepas de SARM que no se detectaron con la PCR múltiplex descritas en los ejemplos 1 y 2, 12 sí se detectaron con este ensayo múltiplex. Tal y como se describe en el ejemplo 3, las ocho cepas de SARM que albergan las secuencias de MREP de los nuevos tipos vi, vii, viii, ix y x descritas en la presente invención permanecieron indetectables.

Ejemplo 5:

Desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v que incluye un control interno. El ensayo de PCR múltiplex descrito en el ejemplo 4 que contiene los cebadores específicos para los MREP de tipos i a v y para el orfX de S. aureus (SEQ ID n.° 64, 66, 67, 79 y 80) y una sonda fluorescible específica de la secuencia de orfX (SEQ ID n.° 84, véase el anexo II) se optimizó para incluir un control interno que monitorice la inhibición de la PCR. Este control interno contiene secuencias complementarias a los cebadores específicos de orfX y del MREP de tipo iv (SEQ ID n.° 79 y 64). El ensayo también contiene una sonda fluorescible marcada con TET específica de una secuencia interna del amplicón generado por amplificación del control interno. Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCh a 3,45 mM, 0,8 pM de cada uno de los cebadores específicos de MREP (SEQ ID n.° 66 y 67) y del cebador específico de orfX (s Eq ID n.° 64), 0,4 pM de cada uno de los cebadores específicos de MREP (SEQ ID n.° 79 y 80), 80 copias del control interno, 0,2 pM de la sonda fluorescible marcada con TET específica del control interno, 0,2 pM de la sonda fluorescible marcada con FAM (SEQ ID n.° 84), 330 pM de cada uno de los cuatro dNTP (Pharmacia Biotech), 3,45 pg/pl de SAB (Sigma) y 0,875 U de la polimerasa Taq (Promega) unida al anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences). La amplificación por pCr en el Smart Cycler® se realizó como sigue: 3 min a 95 °C para la desnaturalización inicial, luego 48 ciclos de tres etapas que consisten en 5 s a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 15 s a 60 °C para la etapa de hibridación y 15 s a 72 °C para la etapa de extensión. Los análisis de sensibilidad realizados con ADN genómico purificado de una cepa de SARM para cada tipo de MREP (i a v) mostraron un límite de detección de 2 a 10 copias del genoma. Ninguna de las 26 SCNRM ni de las 10 SCNSM dieron positivo con este ensayo múltiplex. De nuevo, como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se detectaron inespecíficamente 13 cepas de SASM. Como se describe en los ejemplos 3 y 4, las ocho cepas de SARM que albergan las secuencias de MREP de los nuevos tipos vi a x descritas en la presente invención permanecieron indetectables.

Ejemplo 6:

Detección de SARM mediante el ensayo múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v, directamente en los especímenes clínicos. El ensayo descrito en el ejemplo 5 se adaptó para la detección directa en los especímenes clínicos. Se analizaron en total 142 muestras nasales recogidas con torunda durante un programa de seguimiento hospitalario de SARM en el Hospital General de Montreal (Montreal, Quebec, Canadá). Las muestras de las torundas se analizaron en el Centre de Recherche en Infectiologie de la Universidad Laval en menos de 24 horas desde su recogida. Tras su recepción, las torundas se sembraron en placas de agar con manitol, y luego se preparó el material nasal de la misma torunda con un protocolo de preparación de especímenes simple y rápido descrito en la solicitud de patente de los EE.UU en tramitación con la presente n° US 60/306163. La identificación clásica de los SARM se realizó mediante métodos de cultivo estándares.

El ensayo de PCR descrito en el ejemplo 5 detectó 33 de las 34 muestras positivas para SARM basándose en el método de cultivo. En comparación con el cultivo, el ensayo de PCR detectó 8 especímenes positivos más de SARM para una sensibilidad de 97,1% y una especificidad del 92,6%. Este ensayo de PCR múltiplex representa un método rápido y poderoso para la detección específica de portadores de SARM directamente de especímenes nasales y se puede utilizar con cualquier tipo de especímenes clínicos tales como heridas, sangre o cultivo de sangre, LCR, etc.

Ejemplo 7:

Desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en las secuencias de los MREP de tipos i, ii, iii, iv, v y vii. Tras el análisis de los datos de la secuencia del nuevo MREP de tipo vii descrito en la presente invención (SEQ ID n.° 165 y 166), se diseñaron dos nuevos cebadores (SEQ ID n.° 112 y 113) y se ensayaron en múltiplex con los tres cebadores SEQ ID n.° 64, 66, y 67 descritos en el ejemplo 2. Se seleccionó el cebador SEQ ID n.° 112 para uso en el múltiplex sobre la base de su sensibilidad. También se utilizaron en el múltiplex tres sondas fluorescibles (SEQ ID n.° 84, 163 y 164) específicas de la secuencia de orfX que permitieron detectar dos polimorfismos de secuencia identificados en esta región de la secuencia de orfX, basándose en el análisis de las s Eq ID n.° 173-186. Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCb a 3,45 mM, 0,8 pM de cada uno de los cebadores específicos de SCCmec (SEQ iD n.° 66 y 67) y del cebador específico de orfX (SEQ ID n.° 64), 0,4 pM de cada uno de los cebadores específicos de SCCmec (SEQ ID n.° 79 y 80), 0,2 pM de la sonda fluorescible marcada con FAM (SEQ ID n.° 84), 330 pM de cada uno de los cuatro dNTP (Pharmacia Biotech), 3,45 pg/pl de SAB (Sigma) y 0,875 U de la polimerasa Taq (Promega) unida al anticuerpo TaqStart™ (BD Biosciences). La amplificación por PCR en el Smart Cycler® se realizó como sigue: 3 min a 95 °C para la desnaturalización inicial, luego 48 ciclos de tres etapas que consisten en 5 s a 95 °C para la etapa de desnaturalización, 15 s a 60 °C para la etapa de hibridación y 15 s a 72 °C para la etapa de extensión. La detección de la fluorescencia se realizó al final de cada etapa de hibridación. Las pruebas de sensibilidad realizadas con ADN genómico purificado de varias cepas de SARM de cada tipo de MREP mostraron un límite de detección de 2 copias del genoma (tabla 20). Ninguna de las 26 SCNRM ni de las 8 SCNSM dieron positivo con este ensayo múltiplex. De nuevo, como se observó con los cebadores de Hiramatsu, también se detectaron 13 cepas de SASM inespecíficamente (tabla 21). Cuatro de las cepas que no se detectaron con el ensayo múltiplex para la detección de MREP de los tipos i a v se detectaron ahora con este ensayo múltiplex, mientras que permanecieron indetectables las cuatro cepas de SARM (CCRI-9208, CCRI-9770, CCRI-9681, CCRI-9860) que albergan MREP de los tipos vi, viii, ix y x descritos en la presente invención.

Ejemplo 8:

Desarrollo de los ensayos de PCR en tiempo real en el Smart Cycler® para detectar e identificar SARM basándose en los MREP de tipos vi, viii, ix. Tras el análisis de los datos de secuencia de los nuevos MREP de tipos vi, viii y ix descritos en la presente invención, se diseñó un nuevo cebador específico del MREP de tipo vi (SEQ iD n.° 201), un cebador específico del MREP de tipo viii (SEQ ID n.° 115), un cebador específico del MREP de tipo ix (SEQ ID n.° 109) y un cebador específico de los MREP de tipos viii y ix (SEQ ID n.° 116). Cada cebador para PCR se utilizó en combinación con el cebador específico de orfX (SEQ ID n.° 64) y se analizó frente a su cepa diana específica. Cada reacción de PCR contenía KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCb a 3,45 mM, 0,4 mM de cada uno de los cebadores específicos de SCCmec y de orfX, 200 mM de cada uno de los cuatro dNTP, 3,4 mg/pl de SAB, y 0,875 U de la polimerasa Taq unida al anticuerpo TaqSart™. La amplificación por PCR se realizó como se describe en el ejemplo 7. Los análisis de sensibilidad realizados con ADN genómico purificado de sus respectivas cepas diana de SARM demostraron que la mejor combinación de parejas de cebadores eran SEQ iD n.° 64 y 115 para la detección de los MREP de tipos viii y ix simultáneamente. Estos nuevos cebadores específicos de SCCmec se pueden utilizar en múltiplex con cebadores específicos de MREP de los tipos i, ii, iii, iv, v y vii (SEQ ID n.° 64, 66, 67, 79 y 80) descritos en los ejemplos anteriores para proporcionar un ensayo de SARM más ubicuo.

En conclusión, hemos mejorado la ubicuidad de la detección de las cepas de SARM. Se han identificado nuevos MREJ de tipos iv a x. Entre las cepas representativas de estos nuevos tipos, los cebadores y/o sondas de Hiramitsu conseguían detectar menos del 50% de los mismos. Por consiguiente, hemos pasado ampliamente la barra de una ubicuidad de al menos el 50%, porque nuestros cebadores y sondas se diseñaron para detectar el 100% de las cepas analizadas como representantes de los MREJ de tipos iv a ix. Por consiguiente, aunque la ubicuidad depende del grupo de cepas y representantes que están analizándose, ahora sabemos que acercarse a una ubicuidad del 100% es un objetivo alcanzable, cuando se utilizan las secuencias de las uniones en el extremo derecho (MREJ) para diseñar sondas y cebadores que se ocupen del polimorfismo en esta región. Según cuántos tipos desconocidos de MREJ existan, tenemos un margen de maniobra que va del 50% (más alto que para los cebadores de Hiramatsu con las cepas analizadas) al 100% si secuenciamos todas las MREJ existentes para diseñar de manera adecuada las herramientas y métodos diagnósticos presentes, siguiendo las enseñanzas anteriores.

Tabla 1. Cebadores para amplificación por PCR descritos por Hiramatsu et al. en la patente de los EE.UU. n.° 6 156507 encontrados en el listado de secuencias.

SEQ ID n.° (presente Diana Posicióna,b SEQ ID n.° (patente de los EE.UU.

invención) n.° 6156507) 52 MREP de los tipos i y ii 480 18

53 MREP de los tipos i y ii 758 19

54 MREP de los tipos i y ii 927 20

55 MREP de los tipos i y ii 1154 21

56 MREP de los tipos i y ii 1755 22

57 MREP de los tipos i y ii 2302 23

58 MREP del tipo iii 295c 24

59 orfX 1664 25

60 orfSA0022d 3267 28

61 orfSA0022d 3585 27

62 orfX 1389 26

63 orfSA0022d 2957 29

a Posición hace referencia a la posición del nucleótido del extremo 5' del cebador.

La numeración para las SEQ ID n.° 52-57 usa de referencia la SEQ ID n.° 2; la numeración para la SEQ ID n.° 58 usa de referencia la SEQ ID n.° 4; la numeración para las SEQ ID n.° 59-63 usa de referencia la SEQ ID n.° 3.

c El cebador es el complemento inverso de la secuencia diana.

orfSA0022 hace referencia a la designación del marco abierto de lectura del número de acceso de GenBank AP003129 (SEQ ID n.° 231).

Tabla 2. Análisis de especificidad y ubicuidad realizados en un termociclador estándar con el conjunto óptimo de cebadores descritos por Hiramatsu et al. (SEQ ID n.° 22, 24 y 28 en la patente de los EE.^u U. n.° 6 156507 que corresponden a las SEQ ID n.° 56, 58 y 60, respectivamente, en la presente invención) para la detección de SARM.

Cepas Resultados de la PCR para la unión en el extremo derecho de SCCmec-orfX Positivas (%) Negativas (%) SARM - 39 cepas 19 (48,7) 20 (51,2)

SASM - 41 cepas 13 (31,7) 28 (68,3)

SCNRM - 9 cepas* 0 (0%) 9 (100%)

SCNSM - 11 cepas* 0 (0%) 11 (100%)

* Detalles referentes a las cepas de SCN:

SCNRM: S. caprae (1)

S. cohni cohnii (1)

S. epidermidis (1)

S. haemolyticus (2)

S. hominis (1)

S. sciuri (1)

S. simulans (1)

S. warneri (1)

SCNSM: S. cohni cohnii (1)

S. epidermidis (1)

S. equorum (1)

S. gallinarum (1)

S. haemolyticus (1)

S. lentus (1)

S. lugdunensis (1)

S. sachharolyticus (1)

S. saprophyticus (2)

S. xylosus (1)

Tabla 3. Origen de cepas de SARM que no se amplifican con los cebadores desarrollados por Hiramatsu et al. (SEQ ID n.° 22, 24 y 28 en la patente de los EE.UU. n.° 6156507 que corresponden a las SEQ ID n.° 56, 58 y 60, respectivamente, en la presente invención) así como con los cebadores desarrollados en la presente invención que están dirigidos selectivamente a los MREP de tipos i, ii y iii (SEQ ID n.° 64, 66 y 67).

Denominación de la cepa de Staphylococcus aureus:

Origen

Original CCRIa

ATCC BAA-40b CCRI-9504 Portugal

ATCC 33592 CCRI-178 EE.UU.

R991282 CCRI-2025 Quebec, Canadá

4508 CCRI-9208 Quebec, Canadá 19121 CCRI-8895 Dinamarca Z109 CCRI-8903 Dinamarca 45302 CCRI-1263 Ontario, Canadá

R655 CCRI-1324 Quebec, Canadá

MA 50428 CCRI-1311 Quebec, Canadá MA 50609 CCRI-1312 Quebec, Canadá MA 51363 CCRI-1331 Quebec, Canadá MA 51561 CCRI-1325 Quebec, Canadá 14A0116 CCRI-9681 Polonia 23 (CCUG 41787) CCRI-9860 Suecia

SE26-1 CCRI-9770 Ontario, Canadá

SE1-1 CCRI-9583 Ontario, Canadá

ID-61880c CCRI-9589 Ontario, Canadá SE47-1 CCRI-9773 Ontario, Canadá

SE49-1 CCRI-9774 Ontario, Canadá 39795-2 CCRI-1377 Quebec, Canadá a CCRI significa «Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie».

b Clon portugués.

c Clon canadiense EMRSA1.

Tabla 4. Secuencias nucleotídicas de MREJ de Staphylococcus aureus.

SEQ ID n.° Denominación de la cepa de Staphylococcus aureus: Diana genética Original CCRIa

27 R991282 CCRI-2025 mecA

28 45302 CCRI-1263 mecA

29 MA 50428 CCRI-1311 mecA

30 MA 51363 CCRI-1331 mecA

31 39795-2 CCRI-1377 mecA y 1,5 kb de la región secuencia abajo

42 ATCC 33592 CCRI-178 MREP de tipo iv

43 19121 CCRI-8895 MREP de tipo iv

44 Z109 CCRI-8903 MREP de tipo iv

45 R655 CCRI-1324 MREP de tipo iv

46 MA 51363 CCRI-1331 MREP de tipo iv

47 45302 CCRI-1263 MREP de tipo v

48 39795-2 CCRI-1377 MREP de tipo v

49 MA 50428 CCRI-1311 MREP de tipo v

50 R991282 CCRI-2025 MREP de tipo v 51 ATCC BAA-40 CCRI-9504 MREP de tipo iv

165 SE1-1 CCRI-9583 MREP de tipo vii 166 ID-61880 CCRI-9589 MREP de tipo vii 167 23 (CCUG 41787) CCRI-9860 MREP de tipo viii 168 14A016 CCRI-9681 MREP de tipo ix

171 4508 CCRI-9208 MREP de tipo vi 172 SE26-1 CCRI-9770 orfSA0021b y 75 pb de orfSA0022b 173 26 (98/10618) CCRI-9864 MREP de tipo ii

174 27 (98/26821) CCRI-9865 MREP de tipo ii

175 28 (24344) CCRI-9866 MREP de tipo ii

176 12 (62305) CCRI-9867 MREP de tipo ii

177 22 (90/14719) CCRI-9868 MREP de tipo ii

178 23 (98/14719) CCRI-9869 MREP de tipo ii

179 32 (97S99) CCRI-9871 MREP de tipo ii

180 33 (97S100) CCRI-9872 MREP de tipo ii

181 38 (825/96) CCRI-9873 MREP de tipo ii

182 39 (842/96) CCRI-9874 MREP de tipo ii

183 43 (N8-892/99) CCRI-9875 MREP de tipo ii

184 46 (9805-0137) CCRI-9876 MREP de tipo iii 185 1 CCRI-9882 MREP de tipo ii

186 29 CCRI-9885 MREP de tipo ii

189 SE1-1 CCRI-9583 mecA y 2,2 kb de la región cadena abajo, que incluye IS431mec 190 ATCC BAA-40 CCRI-9504 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo 191 4508 CCRI-9208 mecA y 0,9 kb de la región cadena abajo 192 ID-61880 CCRI-9589 mecA y 0,9 kb de la región cadena abajo 193 14A016 CCRI-9681 mecA y 0,9 kb de la región cadena abajo 195 SE26-1 CCRI-9770 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo, que incluye IS431mec 197 ATCC 43300 CCRI-175 MREP de tipo ii

198 R522 CCRI-1262 MREP de tipo iii 199 13370 CCRI-8894 MREP de tipo i

219 ATCC BAA-40 CCRI-9504 tetK

220 MA 51363 CCRI-1331 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo 221 39795-2 CCRI-1377 IS431mec y 0,6 kb de la región cadena arriba

222 R991282 CCRI-2025 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo 223 R991282 CCRI-2025 IS431mec y 0,6 kb de la región cadena arriba

224 23 (CCUG 41787) CCRI-9860 mecA y 1,5 kb de la región cadena abajo 225 23 (CCUG 41787) CCRI-9860 IS431mec y 0,6 kb de región cadena arriba

233 14A016 CCRI-9681 MREP de tipo ix a CCRI significa «Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie».

b orfSA0021 y orfSA0022 hacen referencia a la designación del marco abierto de lectura del número de acceso de GenBank AP003129 (SEQ ID n.° 231).

Tabla 5. Cebadores para PCR desarrollados

ADN de origen

SEQ ID n.° Diana Posicióna SEQ ID n 64 orfX 1720 3 70 orfX 1796 3 71 orfX 1712 3 72 orfX 1749 3 73 orfX 1758 3 74 orfX 1794 3 75 orfX 1797 3 76 orfX 1798 3 66 MREP de tipos i y ii 2327 2 100 MREP de tipos i y ii 2323 2 101 MREP de tipos i y ii 2314 2 97 MREP de tipo ii 2434 2 99 MREP de tipo ii 2434 2 67 MREP de tipo iii 207b 4 98 MREP de tipo iii 147b 4 102 MREP de tipo iii 251b 4 79 MREP de tipo iv ^74b 43 80 MREP de tipo v 50b 47 109 MREP de tipo ix 652b 168 204 MREP de tipo vi 642b 171 112 MREP de tipo vii 503b 165 113 MREP de tipo vii 551b 165 115 MREP de tipo viii y ix 514b 167 116 MREP de tipo viii 601b 167 a Posición usa de referencia la posición del nucleótido del extremo 5' del cebador.

b El cebador es el complemento inverso de la secuencia diana.

Tabla 6. Sondas fluorescibles desarrolladas

SEQ ID n.° Diana Posición 32 orfX

83 orfX 86a

84 orfX 34ab 160 orfX

161 orfX 34ab 162 orfX 114a 163 orfX 34ab 164 orfX 34ab a Posición usa de referencia la posición del nucleótido del extremo 5' del bucle de la sonda fluorescible en la SEQ ID n.° 3. b La secuencia del bucle de la sonda fluorescible es el complemento inverso de la SEQ ID n.° 3.

Tabla 7. Longitud de los amplicones obtenidos con las diferentes parejas de cebadores.

SEQ ID n.° Diana3 Longitud del

59/52b orfX/MREP de tipos i y ii 2079 (tipo i); 2181 (tipo ii) 59/53b orfX/MREP de tipos i y ii 1801 (tipo i); 1903 (tipo ii) 59/54b orfX/MREP de tipos i y ii 1632 (tipo i); 1734 (tipo ii) 59/55b orfX/MREP de tipos i y ii 1405 (tipo i); 1507 (tipo ii) 59/56b orfX/MREP de tipos i y ii 804 (tipo i); 906 (tipo ii) 59/57b orfX/MREP de tipos i y ii 257 (tipo i); 359 (tipo ii) 60/52b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2794 (tipo i); 2896 (tipo ii) 60/53b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2516 (tipo i); 2618 (tipo ii) 60/54b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2347 (tipo i); 2449 (tipo ii) 60/55b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2120 (tipo i); 2222 (tipo ii) 60/56b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 1519 (tipo i); 1621 (tipo ii) 60/57b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 972 (tipo i); 1074 (tipo ii) 61/52b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2476 (tipo i); 2578 (tipo ii) 61/53b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2198 (tipo i); 2300 (tipo ii) 61/54b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2029 (tipo i); 2131 (tipo ii) 61/55b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 1802 (tipo i); 1904 (tipo ii) 61/56b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 1201 (tipo i); 1302 (tipo ii) 61/57b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 654 (tipo i); 756 (tipo ii) 62/52b orfX/MREP de tipos i y ii 2354 (tipo i); 2456 (tipo ii) 62/53b orfX/MREP de tipos i y ii 2076 (tipo i); 2178 (tipo ii) 62/54b orfX/MREP de tipos i y ii 1907 (tipo i); 2009 (tipo ii) 62/55b orfX/MREP del tipos i y ii 1680 (tipo i); 1782 (tipo ii) 62/56b orfX/MREP de tipos i y ii 1079 (tipo i); 1181 (tipo ii) 62/57b orfX/MREP de tipos i y ii 532 (tipo i); 634 (tipo ii) 63/52b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 3104 (tipo i); 3206 (tipo ii) 63/53b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2826 (de tipo i); 2928 (tipo 63/54b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2657 (tipo i); 2759 (tipo ii) 63/55b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 2430 (tipo i); 2532 (tipo ii) 63/56b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 1829 (tipo i); 1931 (tipo ii) 63/57b orfSA0022/MREP de tipos i y ii 1282 (tipo i); 1384 (tipo ii) 59/58b orfX/MREP de tipo iii 361

60/58b orfSA0022/MREP de tipo iii 1076

61/58b orfSA0022/MREP de tipo iii 758

62/58b orfX/MREP de tipo iii 656

63/58b orfSA0022/MREP de tipo iii 1386

70/66 orfX/MREP de tipos i y ii 100 (tipo i); 202 (tipo ii)

70/67 orfX/MREP de tipo iii 147 (tipo iii)

64/66c orfX/MREP de tipos i y ii 176 (tipo i), 278 (tipo ii) 64/67c orfX/MREP de tipo iii 223

64/79c orfX/MREP de tipo iv 215

64/80c orfX/MREP de tipo v 196

64/97c orfX/MREP de tipo ii 171

64/98c orfX/MREP de tipo iii 163

64/99c orfX/MREP de tipo ii 171

64/100c orfX/MREP de tipos i y ii 180 (tipo i); 282 (tipo

64/101c orfX/MREP de tipos i y ii 189 (tipo i); 291 (tipo

64/102c orfX/MREP de tipo iii 263

64/109c orfX/MREP de tipo ix 369

64/204c orfX/MREP de tipo vi 348

64/112c orfX/MREP de tipo vii 214

64/113c orfX/MREP de tipo vii 263

64/115c orfX/MREP de tipo viii 227

64/116c orfX/MREP de tipo viii 318

a La longitud del amplicón se da en pares de bases para los tipos de MREP amplificados por el conjunto de cebadores.

b Conjunto de cebadores descritos por Hiramatsu et al. en la patente de los EE.UU. n.° 6156507.

c Conjunto de cebadores desarrollados en la presente memoria.

d orfSA0022 hace referencia a la designación del marco abierto de lectura del número de acceso de GenBank AP003129 (SEQ ID n.° 231).

Tabla 8. Otros cebadores desarrollados

ADN de origen

SEQ ID n.° Diana Posición3 SEQ ID n.° 77 MREP de tipo iv 993 43

65 MREP de tipo v 636 47

70 orfX 1796 3

68 IS431 626 92

69 mecA 1059 78

96 mecA 1949 78

81 mecA 1206 78

114 MREP de tipo vii 629b 165

117 MREP de tipo ii 856 194

118 MREP de tipo ii 974b 194

119 MREP de tipo vii 404 189

120 MREP de tipo vii 477b 189

123 MREP de tipo vii 551 165

124 MREP de tipo ii 584 170

125 MREP de tipo ii 689b 170

126 orfSA0021 336 231

127 orfSA0021 563 231

128 orfSA0022d 2993 231

129 orfSA0022d 3967b 231

132 orfX 3700 231

145 MREP de tipo iv 988 51

146 MREP de tipo v 1386 51

147 MREP de tipo iv 51

148 MREP de tipo ix 664 168

149 MREP de tipo ix 849b 168

150 MREP de tipo vii 1117b 165

151 MREP de tipo vii 1473 189

152 IS431mec 1592b 189

154 MREP de tipo v 996b 50

155 MREP de tipo v 935 50

156 tetK del plásmido pT181 1169b 228

157 tetK del plásmido pT181 136 228

158 orfX 2714b 2

159 orfX 2539 2

187 MREP de tipo viii 967b 167

188 MREP de tipo viii 851 167 a Posición usa de referencia la posición del nucleótido del extremo 5' del cebador.

b El cebador es el complemento inverso de la secuencia diana.

Tabla 9. Cebadores para amplificación y/o secuenciación desarrollados

ADN de origen SEQ ID n.° Diana Posicióna SEQ IDn 85 Cromosoma de S. aureus 197b 35 86 Cromosoma de S. aureus 198b 37 87 Cromosoma de S. aureus 197b 38 88 Cromosoma de S. aureus 1265b 39 89 Cromosoma de S. aureus 1892 3

103 orfX 1386 3

105 MREP de tipo i 2335 2

106 MREP de tipo ii 2437 2

107 MREP de tipo iii 153b 4

108 MREP de tipo iii 153b 4

121 MREP de tipo vii 1150 165 122 MREP de tipo vii 1241b 165 130 orfX 4029b 231 131 Región entre orfSA0022 y orfSA0023d 3588 231 133 merB del plásmido pI258 262 226 134 merB del plásmido pI258 539b 226 135 merR del plásmido pI258 564 226 136 merR del plásmido pI258 444 227 137 merR del plásmido pI258 529 227 138 merR del plásmido pI258 530b 227 139 rep del plásmido pUB110 796 230 140 rep del plásmido pUB110 761b 230 141 rep del plásmido pUB110 600 230 142 aaaD del plásmido pUB110 1320b 229 143 aaaD del plásmido pUB110 759 229 144 aaaD del plásmido pUB110 646 229 153 MREP de tipo vii 1030 165 200 orfSA0022d 231 201 orfSA0022d 1006 231 202 MREP de tipo vi 648 171 203 MREP de tipo vi 883b 171 205 MREP de tipo ix 1180 168 206 MREP de tipo ix 1311b 233 207 MREP de tipo viii 1337 167 208 MREP de tipo viii 1441b 167 209 ccrA 184 232 210 ccrA 385 232

211 ccrA 643b 232

212 ccrA 12826 232

213 ccrB 1388 232

214 ccrB 1601 232

215 ccrB 2139b 232

216 ccrB 2199b 232

217 ccrB 2847b 232

218 ccrB 2946b 232

a Posición usa de referencia la posición del nucleótido del extremo 5' de cebador.

b El cebador es el complemento inverso de la secuencia diana.

c El cebador contiene dos discordancias.

d orfSA0022 y orfSA0023 hacen referencia a la designación del marco abierto de lectura del número de acceso de GenBank AP003129 (SEQ ID n.° 231).

Tabla 10. Origen de los ácidos nucleicos y/o las secuencias disponibles en las bases de datos públicas que se encuentran en el listado de secuencias

SEQ ID n.° Cepa de Fuente Número de Diana genética3,11

Staphylococcus acceso

1 NCTC 10442 Base de datos AB033763 MREJ de tipo I de SCCmec

2 N315 Base de datos D86934 MREJ de tipo II de SCCmec

3 NCTC 8325 Base de datos AB014440 Cromosoma de SASM

4 86/560 Base de datos AB013471 MREJ de tipo III de SCCmec

5 86/961 Base de datos AB013472 MREJ de tipo III de SCCmec

6 85/3907 Base de datos AB013473 MREJ de tipo III de SCCmec

7 86/2652 Base de datos AB013474 MREJ de tipo III de SCCmec

8 86/1340 Base de datos AB013475 MREJ de tipo III de SCCmec

9 86/1762 Base de datos AB013476 MREJ de tipo III de SCCmec

10 86/2082 Base de datos AB013477 MREJ de tipo III de SCCmec

11 85/2111 Base de datos AB013478 MREJ de tipo III de SCCmec

12 85/5495 Base de datos AB013479 MREJ de tipo III de SCCmec

13 85/1836 Base de datos AB013480 MREJ de tipo III de SCCmec

14 85/2147 Base de datos AB013481 MREJ de tipo III de SCCmec

15 85/3619 Base de datos AB013482 MREJ de tipo III de SCCmec

16 85/3566 Base de datos AB013483 MREJ de tipo III de SCCmec

17 85/2232 Base de datos AB014402 MREJ de tipo II de SCCmec

18 85/2235 Base de datos AB014403 MREJ de tipo II de SCCmec

19 MR108 Base de datos AB014404 MREJ de tipo II de SCCmec

20 85/9302 Base de datos AB014430 MREJ de tipo I de SCCmec

21 85/9580 Base de datos AB014431 MREJ de tipo I de SCCmec

22 85/1940 Base de datos AB014432 MREJ de tipo I de SCCmec

23 85/6219 Base de datos AB014433 MREJ de tipo I de SCCmec

24 64/4176 Base de datos AB014434 MREJ de tipo I de SCCmec

25 64/3846 Base de datos AB014435 MREJ de tipo I de SCCmec

26 HUC19 Base de datos AF181950 MREJ de tipo II de SCCmec

33 G3 Patente de los EE.UU n.° SEQ ID n.° 15 MREJ de tipo II de SCCmec de S. epidermidis 6 156507

34 SH 518 Patente de los EE.UU. n.° SEQ ID n.° 16 MREJ de tipo II de SCCmec de S.

6 156507 haemolyticus

35 ATCC 25923 Patente de los EE.UU. n.° SEQ ID n.° 9 Cromosoma de S. aureus

6 156507

36 STP23 Patente de los EE.UU. n.° SEQ ID n.° 10 Cromosoma de S. aureus

6 156507

37 STP43 Patente de los EE.UU. n.° SEQ ID n.° 12 Cromosoma de S. aureus

6 156507

38 STP53 Patente de los EE.UU. n.° SEQ ID n.° ° 13 Cromosoma de S. aureus

6 156507

39 476 Proyecto Genomac Cromosoma de S. aureus

40 252 Proyecto Genomac MREJ de tipo II de SCCmec

41 COL Proyecto Genomad MREJ de tipo I de SCCmec

78 NCTC8325 Base de datos X52593 mecA

82 NCTC 10442 Base de datos AB033763 mecA

90 N315 Base de datos D86934 mecA

91 85/2082 Base de datos AB037671 mecA

92 NCTC 10442 Base de datos AB033763 IS431

93 N315 Base de datos D86934 IS431

94 HUC19 Base de datos AF181950 IS431

95 NCTC 8325 Base de datos X53818 IS431

104 85/2082 Base de datos AB037671 MREJ de tipo III de SCCmec

226 Desconocido Base de datos L29436 merB en el plásmido pI258

227 Desconocido Base de datos L29436 merR en el plásmido pI258

228 Desconocido Base de datos S67449 tetK en el plásmido pT181

229 HUC19 Base de datos AF181950 aadD en el plásmido pUB110

230 HUC19 Base de datos AF181950 rep en el plásmido pUB110

231 N315 Base de datos AP003129 orfSA0021, orfSA0022, orfSA0023

232 85/2082 Base de datos AB037671 ccrA/ccrB

a MREJ se refiere a la unión en el extremo derecho de mec e incluye secuencias del extremo derecho de SSCmec y del ADN cromosómico a la derecha del sitio de integración de SCCmec.

b A menos que se especifique de otra manera, todas las secuencias se obtuvieron de cepas de S. aureus.

c Proyecto Genoma del Instituto Sanger (http://www.sanger.ac.uk).

d Proyecto Genoma del TIGR (http://www.tigr.org).

Tabla 11. Sensibilidad analítica del ensayo de PCR específico de SARM que está dirigido selectivamente a los MREP de tipos i, ii y iii en un termociclador estándar con el conjunto de cebadores desarrollado en la presente invención (SEQ ID n.° 64, 66 y 67).

Denominación de la cepa: Límite de detección _Origi ._nal , _C .._C.._R.._I._a.. ₍._t._i._p.._o... _d._e... _M.._R.._EP) (número de copias del genoma) 13370 CCRI-8894 (I) 5

ATCC 43300 CCRI-175 (II) 2

35290 CCRI-1262 (III) 2

a CCRI hace referencia a «Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie».

Tabla 12. Pruebas de especificidad y ubicuidad realizadas en un termociclador estándar con el conjunto de cebadores que están dirigidos selectivamente a los MREP de tipos i, ii y iii desarrollados en la presente invención (SEQ ID n.° 64, 66 y 67) para la detección de SARM

Cepas Resultados de la PCR para MREJ

Positivo (%) Negativo (%) SARM - 208 cepas 188 (90,4) 20 (9,6)

SASM - 252 cepas 13 (5,2) 239 (94,8) SCNRM - 41 cepas* 0 42 (100)

SCNSM - 21 cepas* 0 21 (100) *Detalles referentes a las cepas de SCN:

SCNRM: S. caprae (2)

S. cohni cohnii (3)

S. cohni urealyticum (4)

S. epidermidis (8)

S. haemolyticus (9)

S. hominis (4)

S. sciuri (4)

S. sciuri sciuri (1)

S. simulans (3)

S. warneri (3)

SCNSM: S. cohni cohnii (1)

S. epidermidis (3)

S. equorum (2)

S. felis (1)

S. gallinarum (1)

S. haemolyticus (1)

S. hominis (1)

S. lentus (1)

S. lugdunensis (1)

S. sachharolyticus (1)

S. saprophyticus (5)

S. simulans (1)

S. warneri (1)

S. xylosus (1)

Tabla 13. Porcentaje de la identidad de secuencia para los primeros 500 nucleótidos del extremo derecho de los SCCmec entre los 9 tipos de MREPa b

Tipo de i ii iii iv v vi vii viii ix MREP

i - 79,2 42,8 42,8 41,2 44,4 44,6 42,3 42,1 ii 43,9 47,5 44,7 41,7 45,0 52,0 57,1 iii 46,8 44,5 42,9 45,0 42,8 45,2 iv 45,8 41,4 44,3 48,0 41,3 v 45,4 43,7 47,5 44,3 vi 45,1 41,1 47,2 vii 42,8 40,9 viii 55,2 ix -a «Primeros 500 nucleótidos» hace referencia a los 500 nucleótidos dentro del extremo derecho de SCCmec, y que comienzan en el sitio de integración de SCCmec en el cromosoma de Staphylococcus aureus tal y como se muestra en la figura 4.

b Las secuencias se extrajeron de las SEQ ID n.° 1,2, 104, 51,50, 171, 165, 167 y 168 para los tipos i a ix, respectivamente. Tabla 14. Cepas de referencia utilizadas para analizar la sensibilidad y/o especificidad y/o ubicuidad de los ensayos de PCR específicos de SARM que están dirigidos selectivamente a secuencias de MREJ

Especie de Staphylococcus Cepas Fuente1 a

33591 ATCC

33592 ATCC

33593 ATCC

BAA-38 ATCC

BAA-39 ATCC

SASM (n = 45)

BAA-40 ATCC

BAA-41 ATCC

BAA-42 ATCC

BAA-43 ATCC

BAA-44 ATCC

F182 CDC

23 (CCUG 41787) Colección HARMONY

ID-61880 (EMRSA1) LSPQ

MA 8628 LSPQ

MA 50558 LSPQ

MA 50428 LSPQ

MA 50609 LSPQ

MA 50884 LSPQ

MA 50892 LSPQ

MA 50934 LSPQ

MA 51015 LSPQ

MA 51056 LSPQ

MA 51085 LSPQ

MA 51172 LSPQ

MA 51222 LSPQ

MA 51363 LSPQ

MA 51561 LSPQ

MA 52034 LSPQ

MA 52306 LSPQ

MA 51520 LSPQ

MA 51363 LSPQ

98/10618 Colección HARMONY 98/26821 Colección HARMONY 24344 Colección HARMONY 62305 Colección HARMONY 90/10685 Colección HARMONY 98/14719 Colección HARMONY 97S99 Colección HARMONY 97S100 Colección HARMONY 825/96 Colección HARMONY 842/96 Colección HARMONY N8-890/99 Colección HARMONY 9805-01937 Colección HARMONY 1 Kreiswirth-1 29 Kreiswirth-1

29060 ATCC

35983 ATCC

SCNRM (n = 4)

35984 ATCC

2514 LSPQ

MA 52263 LSPQ

6538 ATCC

13301 ATCC

SASM (n = 28) 25923 ATCC

27660 ATCC

29213 ATCC

29247 ATCC

29737 ATCC

RN 11 CDC

RN 3944 CDC

RN 2442 CDC

7605060113 CDC

BM 4611 Instituto Pasteur

BM 3093 Instituto Pasteur

3511 LSPQ

MA 5091 LSPQ

MA 8849 LSPQ

MA 8871 LSPQ

MA 50607 LSPQ

MA 50612 LSPQ

MA 50848 LSPQ

MA 51237 LSPQ

MA 51351 LSPQ

MA 52303 LSPQ

MA 51828 LSPQ

MA 51891 LSPQ

MA 51504 LSPQ

MA 52535 LSPQ

MA 52783 LSPQ

12228 ATCC

14953 ATCC

14990 ATCC

15305 ATCC

27836 ATCC

27848 ATCC

29070 ATCC

29970 ATCC

SCNSM (n = 17) 29974 ATCC

35539 ATCC

35552 ATCC

35844 ATCC

35982 ATCC

43809 ATCC

43867 ATCC

43958 ATCC

49168 ATCC

a ATCC hace referencia a «American Type Culture Collection».

LSPQ hace referencia a «Laboratorio de Salud Pública de Quebec».

CDC hace referencia a «Centros para la Prevención y el Control de Enfermedades» (por su nombre en inglés) Tabla 15. Aislados clínicos utilizados para analizar la sensibilidad y/o especificidad y/o ubicuidad de los ensayos de PCR específicos de SARM que están dirigidos selectivamente a las secuencias de MREJ.

Especie de Staphylococcus Número de cepas Fuente

150 Canadá

10 China

10 Dinamarca

9 Argentina

SARM (n = 177) ^{1 Egipto}

1 Suecia

1 Polonia

3 Japón

1 Francia

208 Canadá

10 China

SASM (n = 224) ^{4 Japón}

1 EE.UU.

1 Argentina

32 Canadá

3 China

SCNRM (n = 38) 1 Francia

1 Argentina

1 EE.UU.

14 Reino Unido

SCNSM (n = 17)

3 Canadá

Tabla 16. Sensibilidad analítica de las pruebas realizadas en un termociclador estándar con el conjunto de cebadores que están dirigidos selectivamente a los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v (SEQ ID n.° 64, 66, 67, 79 y 80) desarrollados en la presente invención para la detección y la identificación de SARM.

Denominación de la cepa de Staphylococcus aureus: Límite de detección (número de copias del genoma) Original CCRIa (tipo de MREP)

13370 CCRI-8894 (i) 10

ATCC 43300 CCRI-175 (ii) 5

9191 CCRI-2086 (ii) 10

35290 CCRI-1262 (iii) 5

352 CCRI-1266 (iii) 10

19121 CCRI-8895 (iv) 5

ATCC 33592 CCRI-178 (iv) 5

MA 50428 CCRI-1311 (v) 5

R991282 CCRI-2025 (v) 5

a CCRI hace referencia a «Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie».

Tabla 17. Pruebas de especificidad y ubicuidad realizadas en un termociclador estándar con el conjunto de cebadores que se dirigen selectivamente a los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v (SEQ ID n.° 64, 66, 67, 79 y 80) desarrollados en la presente invención para la detección e identificación de SARM.

Cepas Resultados de la PCR para la unión en el extremo derecho de SCCmec-orfX Positivo (%) Negativo (%)

SARM - 35 cepasa 27 (77,1) 8 (22,9)

SASM - 44 cepas 13 (29,5) 31 (70,5)

SCNRM - 9 cepas* 0 9 (100)

SCNSM - 10 cepas* 0 10 (100)

a Las cepas de SARM incluyen las 20 cepas recogidas en la tabla 3.

*Detalles referentes a las cepas de SCN:

SCNRM: S. caprae (1)

S. cohni cohnii (1)

S. epidermidis (1)

S. haemolyticus (2)

S. hominis (1)

S. sciuri (1)

S. simulans (1)

S. warneri (1)

SCNSM: S. cohni (1)

S. epidermidis (1)

S. equorum (1)

S. haemolyticus (1)

S. lentus (1)

S. lugdunensis (1)

S. sachharolyticus (1)

S. saprophyticus (2)

S. xylosus (1)

Tabla 18. Sensibilidad analítica de los análisis realizados en el termociclador Smart Cycler® con el conjunto de cebadores que están dirigidos selectivamente a los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v (SEQ ID n.° 64, 66, 67, 79 y 80) y la sonda fluorescible (SEQ ID n.° 84) desarrollados en la presente invención para la detección e identificación de SARM.

Denominación de la cepa de Staphylococcus aureus: Límite de detección (número de copias del genoma) Original CCRIa (tipo de MREP)

13370 CCRI-8894 (i) 2

ATCC 43300 CCRI-175 (ii) 2

9191 CCRI-2086 (ii) 10

35290 CCRI-1262 (iii) 2

352 CCRI-1266 (iii) 10

ATCC 33592 CCRI-178 (iv) 2

MA 51363 CCRI-1331 (iv) 5

19121 CCRI-8895 (iv) 10

Z109 CCRI-8903 (iv) 5

45302 CCRI-1263 (v) 10

MA 50428 CCRI-1311 (v) 5

MA 50609 CCRI-1312 (v) 5

MA 51651 CCRI-1325 (v) 10

39795-2 CCRI-1377 (v) 10

R991282 CCRI-2025 (v) 2

a CCRI hace referencia a «Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie».

Tabla 19. Pruebas de especificidad y ubicuidad realizadas en el termociclador Smart Cycler® con el conjunto de cebadores que están dirigidos selectivamente a los MREP de tipos i, ii, iii, iv y v (^s E^q ID n.° 64, 66, 67, 79 y 80) y sonda fluorescible (SEQ ID n.° 84) desarrollados en la presente invención para la detección de SARM.

Cepas Resultados de PCR para MREJ

Positivos (%) Negativos (%) SARM - 29 cepasa 21 (72,4) 8 (27,6)

SASM - 35 cepas 13 (37,1) 22 (62,9)

SCNRM - 14 cepas 0 14 (100)

SCNSM - 10 cepas 0 10 (100)

a Las cepas de SARM incluyen las 20 cepas recogidas en la tabla 3.

Detalles referentes a las cepas de SCN:

SCNRM: S. epidermidis (1)

S. haemolyticus (5)

S. simulans (5)

S. warner (3)

SCNSM: S. cohni cohnii (1)

S. epidermidis (1)

S. gallinarum (1)

S. haemolyticus (1)

S. lentus (1)

S. lugdunensis (1)

S. saccharolyticus (1)

S. saprophyticus (2)

S. xylosus (1)

Tabla 20. Sensibilidad analítica de las pruebas realizadas en el termociclador Smart Cycler® con el conjunto de cebadores que se dirigen selectivamente a los MREP de tipos i, ii, iii, iv, v y vii (SEQ ID n.° 64, 66, 67, 79 y 80) y la sonda fluorescible (SEQ ID n.° 84) desarrollados en la presente invención para detectar e identificar SARM.

Denominación de la cepa de Staphylococcus aureus: Límite de detección (número de copias del genoma) Original CCRIa (tipo de MREP)

13370 CCRI-8894 (i) 2

ATCC 43300 CCRI-175 (ii) 2

35290 CCRI-1262 (iii) 2

ATCC 33592 CCRI-178 (iv) 2

R991282 CCRI-2025 (v) 2

SE-41-1 CCRI-9771 (vii) 2

a CCRI hace referencia a «Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie».

Tabla 21. Pruebas de especificidad y ubicuidad realizadas en el termociclador Smart Cycler® con el conjunto de cebadores que se dirigen selectivamente a los MREP de tipos i, ii, iii, iv, vi y vii (SEQ ID n.° 64, 66, 67, 79 y 80) y la sonda fluorescible (SEQ ID n.° 84) desarrollados en la presente invención para la detección e identificación de SARM.

Cepas Resultados de PCR para MREJ

Positivos (%) Negativos (%) SARM - 23 cepasa 19 (82,6) 4 (17,4)

SASM - 25 cepas 13 (52) 12 (48)

SCNRM - 26 cepas 0 26 (100)

SCNSM - 8 cepas 0 8 (100)

a Las cepas de SARM incluyen las 20 cepas recogidas en la tabla 3.

Detalles referentes a las cepas de SCN:

SCNRM: S. capitis (2)

S. caprae (1)

S. cohnii (1)

S. epidermidis (9)

S. haemolyticus (5)

S. hominis (2)

S. saprophyticus (1)

S. sciuri (2)

S. simulans (1)

S. warneri (2)

SCNSM: S. cohni cohnii (1)

S. epidermidis (1)

S. haemolyticus (1)

S. lugdunensis (1)

S. saccharolyticus (1)

S. saprophyticus (2)

S. xylosus (1)

Anexo I: Estrategia para la selección de cebadores para amplificación específicos para los MREP de tipos i y ii.

MREP de tipos i y i orfX

^{ID NO.: 2324 2358 2583 2607}

²

_T ^T _A ^AT _T ^G _G ^T _T ^C _C ^A _A ^A _A ^A _A ^A _A ^A _A ^T _T ^C _C ^A _A ^T _T ^G _G ^A _A ^A _A ^C _C ^C

_C ^T

_T ^C

_C ^A

_A ^T

_TT ^T

_A ^A

_C ^CT

_T ^T

_T ^A

_A ^T

_T ^G

_G ^A

_{A T} ^T

_A ^A

_. ^{. ..CCT TGTGCAGGCC} GTTTGATCCGCC

_{1 .-CCT TGTGCAGGCC gtttgatccg cc}

17* . TATGTCAAAAATCATGAACCTCATTACTTATGATA...CCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGCC

_{IB* TAT GTCAAAAATC ATGAACCTCA TTACTTATGA TA...CCT TGTGCAGGCC GTTTGATCCG cc}

19* TATGTCAAAAATCATGAACCTCATTACTTATGATA...CCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGcc

^C

₂ ²

₁ ^0*

_{* T} ^T

_A ^AT _T ^G _G ^T _T ^C _C ^A _A ^A _A ^A _A ^A _A ^A _A ^T _T ^{C ATGAACCT} _{C ATGAACCTCA} ^{A T}

_T ^T

_T ^A

_AC ^C

_T ^T

_T ^T

_A ^A

_T ^T

_G ^G

_A ^A

_T ^T

_A ^A

_. ^{. .}

_. ^.

_. ^C

_C ^C _C ^{T TGTGCAGGCC} _{T TGTGCAGGCC} ^G

_g ^T

_tt ^T

_t ^T

_g ^G

_a ^A

_t ^T

_c ^C

_c ^C

_g ^{G c}

_c ^c

_c

22* TATGTCAAAAATCATGAACCTCATTACTTATGATA...CCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGcc

23* TATGTCAAAAATCATGAACCTCATTACTTATGATA...CCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGcc

24* TATGTCAAAAATCATGAACCTCATTACTTATGATA...CCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGcc

25* TATGTCAAAAATCATGAACCTCATTACTTATGATA...CCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGcc

26 TATGTCAAAAATCATGAACCTCATTACTTATGATA...CCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCG cc

33c CtT gGTGtAaaCCaTTgGAgCCa cc

34* CCTcaTGCAatCCaTTTGATC

Secuencia seleccionada para el cebador de los MREP de tipos i y ii

(SEQ ID n066) gtcaaaaatcatgaacctca ttacttaig

Secuencia seleccionada para el cebador de orfX

(SEQ ID n.° 64) TGTGCAGGCCGTTTGATCC

Las posiciones de las secuencias usan la referencia de la SEQ ID n.° 2.

Los nucleótidos en mayúscula son idénticos a los de las secuencias seleccionadas o coinciden con tales secuencias.

Las discordancias están indicadas por letras minúsculas. Los puntos indican huecos en las secuencias mostradas.

a Estas secuencias son los complementos inversos de las SEQ ID n.° 17-25.

b Esta secuencia es el complemento inverso del cebador seleccionado.

c Las SEQ ID n.° 33 y 34 se obtuvieron de especies de SCN.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Método para detectar la presencia de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (SARM) con MREJ de tipos i, ii, iii y vi, que comprende:

a) poner en contacto una muestra en la que hay que analizar la presencia de dichas cepas de SARM con MREJ de tipos i, ii, iii y vi, en donde cada una de dichas cepas de SARM incluyen un elemento de casete cromosómico estafilocócico de mec (SCCmec) que contiene un gen mecA insertado en el ADN cromosómico, mediante lo cual se genera una unión en el extremo derecho (MREJ, por su nombre en inglés) polimórfica de tipos i, ii, iii o vi que comprende secuencias procedentes del extremo derecho del elemento SCCmec y del ADN cromosómico adjunto a dicho extremo derecho del elemento SCCmec, con un primer y un segundo cebador para cada una de dichas MREJ de tipos i, ii, iii y vi,

en donde cada dicho primer cebador es específico para una MREJ de tipo i, ii, iii o vi, y

en donde dicho primer cebador se hibrida con dicho extremo derecho del elemento SCCmec de una secuencia de MREJ de tipos i, ii, iii o vi seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID n.° 1, 20 a 25, 41 y 199, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo i, SEQ ID n.° 2, 17 a 19, 26, 40, 173 a 183, 185, 186 y 197, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo ii, SEQ ID n.° 4 a 16, 104, 184 y 198, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo iii, y SEQ ID n.° 171, y el complemento de la misma, para la MREJ de tipo vi; y

en donde cada dicho segundo cebador se hibrida con dicha secuencia cromosómica de S. aureus seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 1, 20 a 25, 41 y 199, y los complementos de las mismas, para la MREJ de tipo i, SEQ ID NOs: 2, 17 a 19, 26, 40, 173 a 183, 185, 186 y 197, y los complementos de las mismas, para la MREJ de tipo ii, SEQ ID NOs: 4 a 16, 104, 184 y 198, y los copmlementos de las mismas, para la MREJ de tipo iii, y SEQ ID NO: 171, y el complemento de las mismas, para la MREJ de tipo vi para generar específicamente uno o varios amplicones si tal cepa de SARM de MREJ de tipos i, ii, iii o vi está presente en dicha muestra, y

b) detectar la presencia de dicho uno o varios amplicones.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha secuencia cromosómica de S. aureus es orfX.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho método comprende el uso de al menos un cebador y/o sonda seleccionado entre las siguientes SEQ ID n.° 202, 203, 204, 64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201,60, 61, 63, 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163 y 164, para la detección de MREJ de tipo vi.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende el uso de una pareja de cebadores que consiste en las SEQ ID n.° 64 y 204.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, que además comprende el uso de al menos una sonda que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID n.° 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163 y 164.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dichos cebadores y sondas tienen las siguientes secuencias nucleotídicas: SEQ ID n.° 64, 204, 84, 163, 164 para detectar la MREJ de tipo vi.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se utilizan juntos varios cebadores y/o sondas en el mismo confinamiento físico.

8. Un kit para detectar la presencia de las cepas de SARM con MREJ de tipos i, ii, iii y vi en una muestra, que comprende:

a) un primer conjunto de cebadores con un primer ebador para cada dicho MREJ de tipo i, ii, iii y vi, en donde cada dicho primer cebador es específico para MREJ de tipo i, ii, iii o vi, en donde cada dicho primer cebador se hidroda con el extremo derecho del elemento SCCmec de las secuencias de una MREJ de tipos i, ii, iii o vi seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID n.° 1, 20 a 25, 41 y 199, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo i, SEQ ID n.° 2, 17 a 19, 26, 40, 173 a 183, 185, 186 y 197, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo ii, SEQ ID n.° 4 a 16, 104, 184 y 198, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo iii, y SEQ ID n.° 171, y el complemento de la misma, para la MREJ de tipo vi; y

b) un segundo cebador que se hibrida con una secuencia cromosómica de S. aureus adjuntando dichas secuencias del extremo derecho del elemento SCCmec de MREJ de tipos i, ii, iii y vi seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID n.° 1, 20 a 25, 41 y 199, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo i, SEQ ID n.° 2, 17 a 19, 26, 40, 173 a 183, 185, 186 y 197, y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo ii, SEQ ID n.° 4 a 16, 104, 184 y 198 y complementos de las mismas, para la MREJ de tipo iii, y SEQ ID n.° 171 y el complemento de la misma para la MREJ de tipo vi;

en donde dichos cebadores de a) y b) permiten generar selectivamente uno o varios amplicones que comprende secuencias del extremo derecho del elemento SCCmec y del ADN cromosómico adjunto a dicho extremo derecho de dichas cepas de SARM con MREJ de tipos i, ii, iii y vi.

9. El kit de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha secuencia específica del ADN cromosómico de S. aureus es orfX.

10. Kit de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, que comprende una pareja de cebadores que consiste en las SEQ ID n.° 64 y 204.

11. El kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 10, que además comprende al menos una sonda seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID n. 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163 y 164.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde dicho segundo cebador tiene una secuencia como la presentada en la SEQ ID n.° 64.

13. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, que comprende cebadores y sondas que tienen las secuencias que se presentan en las SEQ ID n.° 64. 204, 84, 163 y 164.