ES2549551T3 - Método para aumentar la tenacidad ósea y la rigidez y reducir las fracturas - Google Patents

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Abstract

PTH(1-34) humana para su uso en un metodo para la reducción de la incidencia y/o gravedad de fractura, en un hombre con riesgo de padecer o con osteoporosis, mediante la administración de PTH(1-34) por inyección subcutánea de una dosis de menos de 1 mg/kg/dia.

Description

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Metodo para aumentar la tenacidad osea y la rigidez y reducir las fracturas Descripcion
CAMPO DE LA TECNICA
La presente invencion se refiere a metodos para aumentar la tenacidad y/o rigidez del hueso y/o reducir la probabilidad y/o gravedad de la fractura osea administrando una hormona paratiroidea. Mas particularmente, la invencion se refiere a un metodo para aumentar la tenacidad o rigidez del hueso en un sitio de traumatismo potencial o real, tal como la cadera o la columna vertebral, de una persona en riesgo de sufrir osteoporosis. Mas particularmente, la invencion se refiere a un metodo para la reduccion de la incidencia de fracturas vertebrales, la reduccion de la incidencia de fracturas vertebrales multiples, la reduccion de la gravedad de fracturas vertebrales y/o la reduccion de la incidencia de fracturas no vertebrales.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Los agentes existentes, tales como estrogenos, bisfosfonatos, fluoruro o calcitonina, pueden prevenir la perdida osea e inducir un aumento de un 3-5 % de masa osea mediante rellenado del espacio de remodelacion, pero no se estimula significativamente la formacion osea neta. La retencion del hueso mediante la inhibicion del recambio oseo puede no ser suficiente proteccion frente al riesgo de fracturas para pacientes que tienen ya una perdida osea significativa. Los agentes anabolicos que aumentan la resistencia osea estimulando la formacion de hueso pueden proporcionar, preferentemente, una mejor proteccion frente a fracturas en pacientes con osteoporosis establecida.
La hormona paratiroidea (PTH) es un producto de 84 aminoacidos secretado por la glandula paratiroidea de mairnferos que controla los niveles sericos de calcio mediante su accion sobre diversos tejidos, incluyendo el oseo. Los 34 aminoacidos N-terminales de la PTH bovina y humana (PTH(1-34)) se consideran biologicamente equivalentes a la hormona de longitud completa. Se ha demostrado que otros fragmentos amino-terminales de la PTH (incluyendo 1-31 y 1-38 por ejemplo) o la PTHrP (peptido/protema relacionados con la PTH) o analogos de cualquiera o ambas, que activan el receptor de PTH/PTHrP (receptor PTH1) tienen efectos biologicos similares sobre la masa osea, aunque la magnitud de dichos efectos puede variar.
En los estudios en seres humanos con diversas formas de PTH se ha demostrado un efecto anabolico sobre el hueso y han suscitado un interes significativo sobre su uso para el tratamiento de la osteoporosis y trastornos oseos relacionados. Los efectos anabolicos significativos de la PTH sobre el hueso, incluyendo la estimulacion de la formacion de hueso que da como resultado una ganancia neta de masa y/o resistencia osea, se han demostrado en muchos modelos animales y en seres humanos.
Se cree habitualmente que la administracion de PTH a seres humanos y a modelos animales relevantes tiene un efecto negativo sobre el hueso cortical. De hecho, los aumentos de origen natural de la PTH endogena que aparecen en el trastorno de hiperparatiroidismo dan como resultado un adelgazamiento del hueso cortical acompanado de un aumento de la conectividad y la masa del hueso trabecular. En estudios anteriores se ha sugerido que cuando se remodela hueso cortical haversiano (encontrado en seres humanos y mai^eras superiores) bajo la influencia de la PTH, habra una redistribucion del hueso de tal modo que la masa y la resistencia del hueso cortical disminuyen, mientras que la masa y la resistencia del hueso trabecular aumentan. Por ejemplo, en estudios clmicos publicados de administracion de PTH, la masa osea cortical disminuyo despues del tratamiento con PTH exogena, y estos descubrimientos han planteado la preocupacion de que el tratamiento con PTH conducira a una masa y resistencia oseas corticales reducidas. Una preocupacion planteada por dichos estudios es que habna una perdida de masa osea esqueletica total debida a la perdida de hueso cortical. Esto es de alta relevancia clmica puesto que, en la osteoporosis, la mayor perdida de hueso trabecular en comparacion con la perdida de hueso cortical significa que la carga mecanica es soportada predominantemente por el hueso cortical restante. La perdida continuada de hueso cortical aumentana el riesgo de fracturas. Por lo tanto, es importante que un agente terapeutico para la osteoporosis mantenga o aumente el hueso cortical residual de un sujeto.
Los efectos de la PTH sobre el hueso cortical se han investigado en animales no humanos con remodelacion haversiana, tales como perros, hurones, ovejas y monos, pero los tamanos de muestra son tfpicamente demasiado pequenos para un analisis estadfstico fiable. El impacto de los cambios inducidos por el tratamiento con PTH sobre las propiedades mecanicas del hueso cortical en dichos animales sigue siendo desconocido. Los estudios publicados sobre roedores han mostrado un aumento de la masa cortical durante la administracion de PTH, pero una perdida de su beneficio despues de la retirada de la PTH. Sin embargo, el hueso cortical de roedor tiene una estructura claramente diferente del hueso cortical haversiano y se remodela mediante formacion y resorcion aposicional de superficie, en lugar de mediante remodelacion intracortical de osteonas. Ademas, las limitaciones tecnologicas del ensayo biomecanico sobre los huesos relativamente cortos de roedores dan lugar a artefactos de medida cuando un agente, tal como una PTH, altera la geometna del hueso para reforzar el hueso. Dichos artefactos hacen extrapolaciones de las respuestas de hueso cortical de rata a aquellos de seres humanos u otros animales con remodelacion de osteonas incierta. Por lo tanto, los datos existentes para animales, como los seres
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humanos, que experimentan remodelacion haversiana, indican que la PTH puede tener un impacto adverso sobre el hueso cortical, causando la perdida neta de masa osea mediante la merma del hueso cortical.
Como consecuencia, ha sido una creencia popular respecto a la accion de la PTH que los pacientes requieren el tratamiento simultaneo o posterior con un antirresortivo para minimizar la perdida de hueso inducida por la PTH. Por ejemplo, en tres estudios clmicos se ha utilizado PTH en mujeres posmenopausicas en tratamiento simultaneo con calcitonina o estrogeno (por ejemplo, Lindsay et al., 1997, The Lancet 350:550-5) o en mujeres premenopausicas que tomaban el agonista de GnRH Synarel para la endometriosis. Los efectos opuestos del estrogeno y la PTH sobre el recambio de hueso cortical hacen particularmente diffcil observar efectos de solo la PTH durante la terapia de combinacion con estos dos agentes.
Continua existiendo la necesidad de un metodo para emplear una PTH para aumentar la resistencia y la rigidez oseas en seres humanos y otros animales que exhiben remodelacion haversiana, y para reducir la incidencia de fracturas oseas en estos animales. Ademas, continua existiendo la necesidad de un metodo para aumentar la calidad y cantidad del hueso cortical.
SUMARIO DE LA INVENCION
La invencion proporciona PTH (1-34) humana para su uso en la prevencion o reduccion de la incidencia de fractura vertebral y no vertebral en un ser humano con o en riesgo de progresar a osteoporosis, en el que la PTH (134) se administra por inyeccion subcutanea a una dosis de 20 |jg/dfa, en la que el humano tambien recibe dosis eficaces de calcio y vitamina D. La PTH(1-34) se formula con un tampon y un excipiente, con agente de tampon capaz de mantener la solucion a un intervalo de pH de 3 a 7.
El ser humano puede ser una mujer, tal como una mujer posmenopausica.
Los aumentos de la tenacidad y/o la rigidez del hueso pueden persistir durante varios ciclos de remodelacion o hasta varios anos despues de la ultima administracion de la hormona paratiroidea.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Las figuras 1A y 1B muestran que la BMD (densidad mineral osea) y el BMC (contenido mineral oseo) en el eje femoral central (hueso cortical) (A) y en el femur proximal (hueso esponjoso + hueso cortical) (B) fueron significativamente mayores en animales tratados con PTH que en los controles a ambas dosis.
Las figuras 2A a 2D muestran los efectos de la PTH sobre la resistencia mecanica y el momento de inercia en seccion transversal (MIST) en el hueso cortical de la diafisis media del femur.
La figura 3 ilustra el cambio porcentual en las medidas de DXA del contenido mineral oseo entero en los grupos de control y de tratamiento.
Las figuras 4A-C ilustran el cambio porcentual en las medidas DXA de la columna vertebral para los grupos de control y de tratamiento en las vertebras lumbares 2-4 para la superficie osea (A), el contenido mineral oseo (B) y la densidad mineral osea (C).
Las figuras 5A y 5B ilustran el aumento de la masa osea (A) y la resistencia osea (B) en las vertebras lumbares de los primates tratados con una hormona paratiroidea.
Las figuras 6A y 6B ilustran el aumento de la fuerza del cuello del femur (A) y la resistencia constante de la diafisis media del humero (B) en primates tratados con una hormona paratiroidea.
La figura 7 ilustra la activacion de las tasas de formacion de hueso en las superficies endosteica y periostica de la diafisis media del humero.
La figura 8 ilustra el analisis de histograma del desplazamiento de las densidades de voxteles oseos en las vertebras lumbares, resultante del tratamiento con pTh comparado con el control. Observese el aumento de la densidad en el compartimento oseo cortical tras la retirada del tratamiento con PTH.
La figura 9 ilustra aumentos en la BMD de la columna lumbar a lo largo de 23 meses de tratamiento de pacientes con PTH, en comparacion con los controles tratados con placebo.
La figura 10 ilustra aumentos en la BMD del cuello del femur y la cadera a lo largo de 24 meses de tratamiento de pacientes con PTH, en comparacion con los controles tratados con placebo.
DESCRIPCION DETALLADA
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La reduccion de la incidencia de fractura generalmente incluye la reduccion de la probabilidad o la incidencia real de fractura para un sujeto en comparacion con una poblacion control no tratada.
Como se usa en el presente documento, fuerza de rotura designa la fuerza maxima que soporta un especimen oseo; rigidez se refiere a la pendiente de la porcion lineal de una curva de carga-deformacion; y esfuerzo de rotura se refiere el area bajo la curva de carga-deformacion antes de la rotura. Cada uno de estos puede medirse y calcularse mediante metodos estandar en la tecnica de estudio del hueso. Estos parametros son propiedades estructurales que dependen de las propiedades intrmsecas y la geometna del material, y pueden determinarse como se describe en Turner CH, Burr DB 1993 "Basic biomechanical measurements of bone: a tutorial." Bone 14:595-608, que se incorpora en el presente documento por referencia. La fuerza ultima, la rigidez y el esfuerzo de rotura pueden normalizarse para obtener propiedades intrmsecas del material, tales como tension de rotura, modulo elastico y tenacidad, que son independientes del tamano y la forma. Como se utilizan en el presente documento, tension de rotura se refiere a la tension maxima que puede soportar un especimen; modulo elastico se refiere a la rigidez intrmseca del material; y tenacidad se refiere a la resistencia a la fractura por unidad de volumen. Cada uno de estos puede determinarse mediante metodos conocidos en la tecnica, id. La resistencia osea femoral, como se designa en el presente documento, puede medirse en el cuello femoral o en la diafisis, utilizando tipicamente una flexion de tres o cuatro puntos en el ultimo sitio.
Traumatismo oseo
La invencion es beneficiosa para un sujeto que puede padecer o haber padecido traumatismos en uno o mas huesos. Un ser humano puede sufrir cualquiera de diversos traumatismos oseos debidos, por ejemplo, a un accidente, intervencion medica, enfermedad o trastorno. En los jovenes, el traumatismo oseo se debe, probablemente, a la fractura, la intervencion medica para reparar una fractura o la reparacion de articulaciones o tejido conjuntivo danado, por ejemplo, por el atletismo. Otros tipos de traumatismo oseo, tales como los producidos por osteoporosis, enfermedad degenerativa osea (tal como artritis u osteoartritis), reemplazo de cadera o afecciones secundarias asociadas con terapia para otras afecciones sistemicas (por ejemplo, osteoporosis por glucocorticoides, quemaduras o trasplante de organos) se encuentran mas a menudo en personas mayores.
Los sujetos son seres humanos, preferentemente una mujer, en riesgo de sufrir osteoporosis o que sufren la misma. Los factores de riesgo para la osteoporosis son conocidos en la materia e incluyen afecciones de hipogonadismo en varones y mujeres, independientemente de la edad, las afecciones, las enfermedades o los farmacos que inducen hipogonadismo, los factores nutricionales asociados con la osteoporosis (siendo los niveles bajos de calcio o de vitamina D mas frecuentes), tabaquismo, alcohol, farmacos asociados con la perdida osea (tales como glucocorticoides, tiroxina, heparina, litio, anticonvulsivos, etc.), perdida de vision que predispone a cafdas, viajes espaciales, inmovilizacion, hospitalizacion cronica o reposo en cama, y otras enfermedades sistemicas vinculadas a un mayor riesgo de osteoporosis. Las indicaciones de la presencia de osteoporosis son conocidas en la materia e incluyen signos radiologicos de al menos una fractura de compresion vertebral, masa osea baja (tfpicamente al menos 1 desviacion estandar por debajo de los valores normales en jovenes) y/o fracturas atraumaticas.
La osteoporosis puede conducir, por ejemplo, a fracturas vertebrales y/o no vertebrales. Entre los ejemplos de fracturas no vertebrales se incluyen fractura de cadera, fractura de antebrazo distal, fractura de humero proximal, fractura de muneca, fractura de radio, fractura de tobillo, fractura de humero, fractura de costilla, fractura de pie, fractura de pelvis o una combinacion de estas. La invencion puede utilizarse para reducir el riesgo de dichas fracturas o para tratar dichas fracturas. El riesgo de fractura esta reducido y la curacion de una fractura esta estimulada por el aumento de la resistencia y/o la rigidez del hueso, por ejemplo de la cadera, de la columna o de ambas. Una mujer tfpica con riesgo de osteoporosis es una mujer posmenopausica o una mujer premenopausica con hipogonadismo. Un sujeto preferido es una mujer posmenopausica y es independiente de la terapia de reemplazo hormonal concurrente (TRH), terapia con estrogenos o equivalentes, o terapia antirresortiva. La invencion puede beneficiar a un sujeto en cualquier estadio de la osteoporosis, pero especialmente en los estadios tempranos y avanzados.
La invencion es eficaz para prevenir o reducir la incidencia de fracturas vertebrales y no vertebrales en un sujeto con o en riesgo de progresar a osteoporosis. Por ejemplo, la presente invencion puede reducir la incidencia de fracturas vertebrales y/o no vertebrales, reducir la gravedad de las fracturas vertebrales, reducir la incidencia de fracturas vertebrales multiples, mejorar la calidad del hueso y similares. La invencion puede beneficiar a pacientes con masa osea baja o fractura previa que tienen el riesgo de futuras fracturas esqueleticas multiples, tales como pacientes en los que la osteoporosis de columna puede progresar rapidamente.
Tenacidad y rigidez oseas
Generalmente, la tenacidad o rigidez oseas son el resultado de la masa y la resistencia del hueso cortical, trabecular y esponjoso. La invencion puede proporcionar niveles de tenacidad, rigidez, masa y/o resistencia oseas
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dentro o por encima del intervalo de la poblacion normal. Preferentemente, la invencion proporciona niveles aumentados respecto de los niveles resultantes de traumatismo o que dan lugar a riesgo de traumatismo. Al aumentar la tenacidad, la rigidez o ambas, se reduce el riesgo o la probabilidad de fractura en comparacion con una poblacion de control no tratada.
Al aumentar ciertas caractensticas del hueso proporcionan una tenacidad y/o rigidez aumentadas. Dichas caractensticas incluyen la densidad mineral osea (BMD), el contenido mineral oseo (BMC), la frecuencia de activacion o la velocidad de formacion de hueso, el numero de trabeculas, el espesor de las trabeculas, la conectividad trabecular y otras, la formacion de hueso periostico y endocortical, la porosidad cortical, la superficie osea transversal y la masa osea, la resistencia a la carga y/o el esfuerzo de rotura. Un aumento en una o mas de estas caractensticas es un resultado preferido del metodo de la invencion.
Ciertas caractensticas del hueso, tales como el espacio medular y el modulo elastico, al reducirse proporcionan una
tenacidad y/o rigidez aumentada al hueso. El hueso mas joven (mas tenaz y ngido) tiene cristalitos que son, generalmente, menores que los cristalitos del hueso mas viejo. Por tanto, generalmente al reducir el tamano de los cristalitos oseos aumenta la tenacidad y la rigidez del hueso, y puede reducirse la incidencia de fracturas. Ademas, madurar los cristalitos de un hueso puede proporcionar caractensticas deseables adicionales al hueso, incluyendo una tenacidad y rigidez oseas aumentadas y/o pueden reducir la incidencia de fracturas. Una disminucion en una o mas de estas caractensticas puede ser un resultado preferido del metodo de la invencion.
La invencion es eficaz para aumentar la tenacidad y la rigidez de cualquiera de varios huesos. Por ejemplo, puede aumentar la tenacidad y/o la rigidez de los huesos, incluyendo un hueso de la cadera, tal como un ilion, un hueso de la pierna, tal como un femur, un hueso de la columna, tal como una vertebra, o un hueso del brazo, tal como un hueso del antebrazo distal o un humero proximal. Este aumento de la tenacidad y/o la rigidez puede encontrarse a lo largo del hueso o localizarse en ciertas porciones del hueso. Por ejemplo, la tenacidad y/o la rigidez de un femur pueden aumentarse al aumentar la tenacidad y/o la rigidez del cuello femoral o de un trocanter femoral. La tenacidad y/o la rigidez de una cadera pueden aumentarse aumentando la tenacidad y/o la rigidez de una cresta iliaca o espina iliaca. La tenacidad y/o la rigidez de una vertebra pueden aumentarse aumentando la tenacidad y/o la rigidez de un pedfculo, lamina o cuerpo. Ventajosamente, el efecto se produce sobre las vertebras en ciertas porciones de la columna, tales como vertebras cervicales, toracicas, lumbares, sacras y/o cocdgeas. Preferentemente, el efecto es sobre una o mas vertebras toracicas medias y/o lumbares superiores.
El aumento de la tenacidad y/o la rigidez puede encontrarse en cada uno de los tipos de hueso, o predominantemente en un tipo de hueso. Los tipos de hueso incluyen hueso esponjoso (esponjoso, trabecular o lamelar) y compacto (cortical o denso) y el callo de fractura. El metodo de la invencion aumenta, preferentemente, la tenacidad y la rigidez mediante sus efectos sobre el hueso esponjoso y cortical, o sobre hueso cortical solo. El hueso trabecular, hueso al que esta unido el tejido conjuntivo, puede endurecerse y/o fortalecerse mediante la presente invencion. Por ejemplo, resulta ventajoso proporcionar una tenacidad adicional a un sitio de union para un ligamento, un tendon y/o un musculo.
El aumento de la tenacidad o la rigidez puede reducir la incidencia de fracturas. En este aspecto, el aumento de la tenacidad o la rigidez puede incluir la reduccion de la incidencia de fracturas vertebrales, la reduccion de la incidencia de fracturas graves, la reduccion de la incidencia de fracturas moderadas, la reduccion de la incidencia de fracturas no vertebrales, la reduccion de la incidencia de fracturas multiples o una combinacion de las mismas.
Hormona paratiroidea
La hormona puede obtenerse mediante metodos recombinantes o sinteticos conocidos, tal como se describe en la patente de Estados Unidos n. ° 4.086.196.
La invencion utiliza PTH humana (1-34), tambien conocida como teriparatida. Se pueden usar soluciones estabilizadas de PTH (1-34) humana, tales como PTH (1-34) humana recombinante rhPTH (1-34), formas cristalinas de PTH(1-34) humana.
Administracion de la hormona paratiroidea
La hormona paratiroidea se administra por inyeccion subcutanea. Pueden emplearse ventajosamente formulaciones estabilizadas de PTH (1-34) humana. Una solucion estabilizada de una hormona paratiroidea puede incluir un agente estabilizante, un agente de tampon, un conservante y similares.
El agente estabilizante incorporado a la solucion o composicion incluye un poliol que incluye un sacarido, preferentemente un monosacarido o disacarido, por ejemplo glucosa, trehalosa, rafinosa o sacarosa; un alcohol de tipo azucar, tal como, por ejemplo, manitol, sorbitol o inositol, y un alcohol polihidroxflico tal como glicerina o propilenglicol o mezclas de los mismos. Un poliol preferido es manitol o propilenglicol. La concentracion de poliol puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 % en peso, preferentemente de 3 a
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aproximadamente 10 % en peso de la solucion total.
El agente tampon empleado en la solucion o la composicion de la presente invencion puede ser cualquier combinacion de acido o sal que sea farmaceuticamente aceptable y capaz de mantener la solucion acuosa en un intervalo de pH de 3 a 7, preferentemente de 3-6. Los sistemas tampon utiles son, por ejemplo, fuentes de acetato, tartrato o citrato. Los sistemas tampon preferidos son fuentes de acetato o tartrato, el mas preferido es una fuente de acetato. La concentracion de tampon puede estar en el intervalo de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 500 mM, preferentemente de aproximadamente 2 mM a 100 mM.
La solucion o composicion estabilizada de la presente invencion puede incluir tambien un conservante aceptable por via parenteral. Dichos conservantes incluyen, por ejemplo, cresoles, alcohol bendlico, fenol, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorobutanol, alcohol feniletflico, metilparaben, propilparaben, timerosal y nitrato y acetato fenilmercurico. Un conservante preferido es m-cresol o alcohol bendlico; el mas preferido es m-cresol. La cantidad de conservante empleada puede variar de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2% en peso, preferentemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 1,0 % en peso de la solucion total.
Por tanto, la solucion estabilizada de teriparatida puede contener manitol, acetato y m-cresol con una vida util de mas de 15 meses a 5 °C.
Las composiciones de hormona paratiroidea pueden proporcionarse, si se desea, en forma de un polvo que contiene no mas de un 2 % de agua en peso como resultado de la liofilizacion de una solucion acuosa esteril de la hormona preparada mezclando la hormona paratiroidea seleccionada, un agente tampon y un agente estabilizante como se han descrito anteriormente. Es especialmente util como agente tampon cuando se preparan polvos liofilizados una fuente de tartrato. Los agentes estabilizantes particularmente utiles incluyen glicina, sacarosa, trehalosa y rafinosa.
La hormona paratiroidea se formula con tampones y excipientes tfpicos empleados en la tecnica para estabilizar y solubilizar protemas para la administracion parenteral. Los vehfculos farmaceuticos reconocidos en la tecnica y sus formulaciones se describen en Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences," 15a Ed.; Mack Publishing Co., Easton (1975).
La hormona paratiroidea se formula para administrar una dosis eficaz para aumentar la tenacidad y/o la rigidez de uno o mas huesos de un sujeto y/o para reducir la probabilidad y/o la gravedad de una fractura osea. Preferentemente, una dosis eficaz proporciona una mejora de la estructura, masa y/o resistencia osea cortical. Preferentemente, una dosis eficaz reduce la incidencia de fracturas vertebrales, reduce la incidencia de fracturas vertebrales multiples, reduce la gravedad de fracturas vertebrales y/o reduce la incidencia de fracturas no vertebrales. Preferentemente, un sujeto que recibe hormona paratiroidea recibe tambien dosis eficaces de calcio y vitamina D, que pueden potenciar los efectos de la hormona.
Los beneficios de la administracion de una hormona paratiroidea persisten durante un periodo de administracion. Los beneficios de varios meses de administracion pueden persistir durante un ano o dos, o mas, sin administracion adicional.
Una composicion farmaceutica que incluye una formulacion de PTH humana (1-34) es adecuada para administracion parenteral. Por ejemplo, una formulacion lfquida o solida se puede fabricar de varias maneras, usando tecnicas convencionales. Puede prepararse una formulacion lfquida disolviendo PTH humana (1-34), en un disolvente adecuado, tal como agua, a un pH apropiado, incluyendo tampones u otros excipientes, por ejemplo para formar una de las soluciones estabilizadas descritas anteriormente en el presente documento.
Los ejemplos siguientes son ilustrativos de la invencion y no se pretende que sean limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo de referencia 1 - Resistencia y densidad oseas aumentadas tras la administracion de rhPTH(1-34) a conejos
Procedimientos experimentales
Se clasificaron conejos hembras blancos intactos New Zealand (HRP Inc. Denver, Pa.), uno de los animales mas pequenos que forman osteonas por remodelado intracortical, de aproximadamente 9 meses de edad y de 3,25-3,75 kg de peso por peso corporal medio en 3 grupos de 6 animales cada uno. Dos grupos experimentales recibieron PTH(1-34) biosintetica a dosis de 10 o 40 |jg/ml/kg/dfa. El grupo control recibio 1,0 ml/kg/dfa de solucion salina 0,9M acidificada que contema 2 % de suero de conejo inactivado por calor. Se inyecto PTH(1-34) o veldculo mediante inyecciones subcutaneas una vez al dfa 5 dfas a la semana durante 140 dfas. Se alimento a los conejos con comida de laboratorio para conejo que contema 0,5 % de Ca y 0,41 % de P, y se les dio agua ad limitum.
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La seleccion de dosis se baso en una serie de estudios preliminares en los que se demuestra que (1) despues de una sola inyeccion de PTH (1-34) a 100 pg/kg, el calcio serico aumento y no retorno a los valores basales en 24 horas, mientras que tras una sola dosis de 50 pg/kg, los valores sericos de calcio retornaron al valor basal en 24 horas. (2) inyecciones repetidas de 20 pg/kg de PTH (1-34) produjeron un aumento transitorio de los niveles sericos de calcio con retorno a los valores basales en 6-24 horas, y (3) pTh (1-34) a < 5 pg/kg no altero la histomorfometna de las superficies oseas.
Se administro un conjunto de marcadores dobles de alizarina (Sigma, St. Louis) i.m. a 20 mg/kg los dfas 55 y 63, y se administro un conjunto de marcadores dobles de calcema (Sigma, St. Louis) s.c. a 5 mg/kg los dfas 15 y 7, antes del sacrificio. Se anestesio a los conejos mediante CO2 en una secuencia de orden aleatorio, aproximadamente 3-6 horas despues de la ultima inyeccion, para obtener sangre mediante puncion cardiaca y despues se les sacrifico con pentobarbital sodico (100 mg/kg) i.p. Se extrajeron el humero derecho, ambos femures, las vertebras lumbares (L3-L5) y la tibia derecha.
Bioquimica sangumea
Se midieron los niveles sericos de calcio, fosfato, fosfatasa alcalina, creatinina y nitrogeno ureico mediante analisis de suero multicanal computarizado.
Histomorfometna
Se realizaron mediciones histomorfometricas en el hueso cortical de la diasifis tibial y en el hueso esponjoso de L3. Despues del sacrificio, se extrajeron estos huesos de cada animal y se fijaron en formol tamponado neutro al 10 % durante 24 horas. Los tejidos se deshidrataron en una serie graduada de alcoholes (70-100%, 2 cambios por grado, cada uno durante 4 horas al vado). Los espedmenes se colocaron despues en xileno y se infiltraron con metilmetacrilato al vado a 20 psi en un programa de infiltracion de 2 horas/etapa y 24 horas en un procesador automatico Shandon Hypercenter (Shandon Lipshaw, Pittsburgh, PA). Los espedmenes se incrustaron en DDK-plast al 2 % con 0,2 % de iniciador (Delaware Diamond Knives, Wilmington, DE). Se cortaron secciones transversales de tibia a 80 pm usando una sierra de alambre de diamante (Delaware Diamond Knives, Inc., DE) y se tineron con tricromico de Goldner. Se procesaron secciones transversales no tenidas de aproximadamente 80 pm de espesor para la histomorfometna dinamica de marcadores fluorocromaticos. Se cortaron secciones sagitales de L3 con un microtomo Reichert-Jung 2050 (Magee Scientific Inc., Dexter, MI) a pm y se tineron con tetracromico de McNeal o se dejaron sin manchar para la histomorfometna dinamica.
La histomorfometna se realizo con un aumento de 150x, utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon (Optiphot, Nikon, Tokio, Japon) y un sistema de digitalizacion semiautomatico (Bioquant IV, R & M Biometrics, Nashville, TN). La formacion y reabsorcion oseas en las envolturas periosticas, endocortical e intracortical se midieron en a lo largo de la totalidad de la superficie transversal de las secciones de la diafisis media de la tibia. Las mediciones en el hueso esponjoso se realizaron dentro de una superficie de 6 mm2 en el centro de la vertebra lumbar, a 0,5 mm del margen de la cubierta cortical circundante. La nomenclatura se efectuo de acuerdo con el Comite ASBMR sobre nomenclatura histomorfometrica (Parfitt AM, Drezner MK, Florieux FH, Kanis JA, Malluche H, Meunier PJ, Ott SM, Recker RR 1987 "Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee". J. Bone Miner. Res. 2:595-610.) Los parametros dinamicos se midieron basandose en el marcador calcema.
Mediciones de la masa osea
La diafisis del femur y la cuarta vertebra lumbar en 50 % de etanol/solucion salina se escanearon en seccion transversal mediante tomograffa computerizada cuantitativa (QCT o pQCT) usando un 960A pQCT y se analizaron con el software Dichte version 5.1 (Norland/Stratec, Ft. Atkinson, WI). Se midieron los parametros del tejido entero, incluyendo la densidad mineral osea volumetrica (BMDv, mg/cm3), la superficie de la seccion transversal (superficie X, mm2) y el contenido mineral oseo (BMC, mg), utilizando dimensiones de voxtel de 148 x 148 x 1200 pm. El volumen se puede calcular multiplicando la superficie X por el grosor de corte de 1,2 mm. Se escaneo el cuello femoral completo del femur extirpado en un bano de etanol al 50 %, solucion salina utilizando una absorciometna de energfa dual periferica (pDEXA, Norland/Stratec). Espedficamente, se midieron la densidad mineral osea aparente (BMDa, g/cm2), la superficie proyectada (cm2) y el contenido mineral oseo (BMC, g) usando etapas de barrido de 0,5 x 1,0 mm y umbral de 0,04.
Pruebas biomecanicas
Las propiedades mecanicas oseas se midieron en la diafisis del femur derecho y en el cuerpo de L5. Los huesos se resecaron, se limpiaron de tejido conjuntivo, se envolvieron en gasa empapada en solucion salina isotonica y se congelaron a -20 °C hasta la prueba. Antes de la prueba, los espedmenes se descongelaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Todos los espedmenes se analizaron hasta el fallo en un bano de agua circulante a 37 °C
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usando una maquina de ensayo servohidraulica MTS 810 (MTS Corp., Minneapolis, MN). Las curvas de deformacion de carga se registraron usando el sistema de representacion de medidas HP 7090A (Hewlett Packard, Camas, WA). Se midio la fuerza de rotura (fuerza maxima que soportan los espedmenes), la rigidez (la pendiente de la porcion lineal de la curva carga-deformacion) y el esfuerzo de rotura (area bajo la curva carga-deformacion antes del fallo) mediante un sistema de digitalizacion (Jandel Scientific, Corte Madera, CA). Estos parametros son propiedades estructurales que dependen de las propiedades intrmsecas y la geometna del material. Turner CH, Burr DB 1993 "Basic biomechanical measurements of bone: a tutorial." Bone 14:595-608. Los datos se normalizaron para obtener propiedades intrmsecas del material, tales como tension de rotura (tension maxima que soportan los espedmenes), modulo elastico (rigidez intnnseca del material) y tenacidad (resistencia a la fractura por unidad de volumen), que son independientes del tamano y la forma. ]d.
La resistencia osea femoral se midio en la diafisis utilizando una flexion de tres puntos. El femur se coloco sobre un aparato con el lado anterior orientado hacia el cargador. La carga se aplico en el punto medio entre dos soportes separados 54 mm. La celula de carga se desplazo a una velocidad de 1 mm/s hasta que se produjo el fallo. Para normalizar los datos obtenidos a partir de la curva carga-deformacion, la tension de rotura a la flexion se calculo a partir de la fuerza de rotura mediante
cr=FuLr/8I (1)
en la que Of es la tension de rotura por flexion, Fu es la fuerza de rotura, L es la longitud entre soportes, r es el radio en direccion antero-posterior el es el momento de inercia. ]d. Se calculo el valor para el momento de inercia, suponiendo que las secciones transversales femorales eran elfpticas.
El espesor cortical promedio se calculo a partir de las mediciones del espesor realizadas en cada uno de los cuatro cuadrantes de la seccion transversal femoral con un par de calibradores digitales, precisos a 0,01 mm con una precision de ± 0,005 mm (Mitutoyo, Japon).
El modulo elastico del femur (Ef) se calculo usando la siguiente ecuacion:
E^= (rigidez) *(L,V48I) (2)
La tenacidad del femur (Tenacidadf) tambien se calculo utilizando la siguiente ecuacion:
Tenacidad f=3* (esfuerzo de rotura) V/LI (3)
Para el ensayo mecanico de la quinta vertebra lumbar (L5), ambas placas terminales del cuerpo vertebral se cortaron en paralelo utilizando una sierra de velocidad lenta Buehler Isomet (Buehler LTD, Evanston, IL). Despues de la reseccion de los procesos posteriores, la resistencia mecanica de L5 se midio en compresion. La carga de compresion se aplico en control de carrera, con una velocidad de cruce de 1 mm/s a traves de un plato pivotante para corregir la alineacion no paralela de las caras del cuerpo vertebral Para normalizar los datos obtenidos a partir de la curva carga-deformacion y para evaluar las propiedades intrmsecas del material que son independientes de la geometna osea, se calculo la tension de rotura como la fuerza de rotura dividida por la superficie transversal bruta.
La superficie de corte transversal (CSA) se calculo mediante
CSA=7iab/4
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en la que a y b son la anchura en las direcciones antero-posterior y medial-lateral, respectivamente).
El modulo elastico de la vertebra (Ev) se calculo mediante
Ev= (rigidez)/(CSA/h) (5)
en la que h es la altura craneo-caudal del cuerpo vertebral.
La tenacidad de la vertebra (Tenacidadv) se calculo mediante
Tenacidad v= (esfuerzo de rotura)/(CSA*h) (6)
Microscopia acustica
Se cortaron secciones transversales de 500 pm de grosor a partir de la diafisis del humero derecho usando una sierra de alambre de diamante. El espesor preciso de cada especimen se midio usando un micrometro (Mitutoyo, Japon) con una resolucion de 1 pm. Las mediciones de la velocidad acustica se realizaron usando un microscopio acustico de barrido (UH3, Olympus, Japon) por el metodo descrito anteriormente por Hasegawa K, Turner Ch,
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Recker RR, Wu E, Burr DB 1995 "Elastic properties of osteoporotic bone measured by scanning acoustic microscopy". Bone 16:85-90. Mediante esta tecnica se pueden medir propiedades mecanicas intrmsecas detalladas en un punto focal seleccionado. Se uso un transductor de 50 MHz (V-390, Panametrics, Waltham, MA) para generar ondas acusticas en modo de eco de pulsos. La lente de 50 MHz produjo un haz acustico de aproximadamente 60 pm de diametro. Los espedmenes se fijaron en el fondo de una camara llena de agua a temperatura constante (22 °C). Se midio el tiempo de retardo entre las ondas acusticas reflejadas desde la parte superior de los espedmenes y los reflejados desde la parte inferior de los espedmenes usando un osciloscopio digital (TDS 620, Tekronix, Beaverton, OR). Los tiempos de retardo se midieron en cinco localizaciones diferentes, de modo que cada sitio estaba separado por mas de 300 pm en la corteza anterior del humero. La velocidad acustica se calculo como el doble del espesor de los espedmenes, dividido por el tiempo de retardo promedio. El peso en humedo (Ph) y el peso sumergido (Ps) en alcohol etilico al 100 % se midieron usando una bascula (AJ100, Mettler Instrument Corp., Heightstown, NJ). La densidad humeda (p) se calculo usando el principio de Arquimedes:
p= {Ph/{Ph-Ps)}* p ETOH (7)
en la que pETOH es la densidad de alcohol (0,789 g/cm3). Suponiendo que la via de la onda acustica en el hueso es homogenea, se calcula el coeficiente elastico (C) que representa la rigidez intrmseca de los espedmenes:
imagen1
en la que p es la densidad humeda y v es velocidad acustica. Analisis estadistico
Se uso analisis de Bartlett para verificar la homogeneidad de la varianza. Cuando la varianza era homogenea, se aplico un ANOVA unidireccional con pruebas de PLSD de Fisher para la comparacion post-hoc. Cuando la varianza no era homogenea, se aplico el analisis de la varianza no parametrico de Kruskal-Wallis, con analisis post-hoc utilizando las pruebas U de Mann-Whitney. La significacion estadfstica se atribuyo a p <0,05. Los resultados se presentan como la media ± SEM.
Resultados
Peso corporal y bioquimica
Los conejos tratados con PTH(1-34) vehfculo a 10 mg/kg/dfa presentaron incrementos menores en el peso corporal durante 140 dfas. Los conejos que recibieron PTH(1-34) a 40 pg/kg/dfa presentaron una pequena disminucion de 51 g del peso corporal, lo que representa una perdida de peso corporal de 1,4 ± 1,6 % durante el experimento (Tabla 1). Las medidas en suero estaban dentro de la respuesta fisiologica normal para conejos, aunque se observaron pequenos aumentos en el calcio serico y el nitrogeno ureico. La fosfatasa alcalina serica se duplico a la dosis mas alta de PTH(1-34) (Tabla 2).
Tabla 1 - Efectos de la PTH(1-34) sobre el peso corporal
Control PTH(1-34) 10 pg/kg/dfa PTH(1-34) 40 pg/kg/dfa
Peso (kg)
corporal inicial 3,43 ± 0,08 3,42 ± 0,08 3,42 ± 0,08
Peso (kg)
corporal final 3,70 ± 0,05 3,51 ± 0,05 3,37 ± 0,10
Ganancia de corporal (kg)
peso 0,26 ± 0,09 0,09 ± 0,05 -0,05 ± 0,05*
Los datos se expresan como la media ± SEM para 6 conejos por grupo. * P < 0,05 comparado con el control.
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____________Control PTH(1-34) 10 pg/kg/dia PTH(1-34) 40 pg/kg/dia
Calcio (mg/dl) 12,1 ± 0,3 12,6 ± 0,2
Fosfato (mg/dl) 4,7 ± 0,2 4,7 ± 0,2
Fosfatasa alcalina (ui/l) 24,7 ± 4,1 41,0 ± 8,1
Creatinina (mg/dl) 1,9 ± 0,1 1,6 ± 0,1
Nitrogeno ureico (mg/dl) 18,3 ± 0,3 18,1 ± 0,8
13,5 ± 0,3* 5,5 ± 0,3
49.8 ± 7,1* 1,8 ± 0,1
23.9 ± 1,9
Los datos se expresan como la media ± SEM para 6 conejos por grupo. * P < 0,05 comparado con el control.
Histomorfometria
La formacion osea en las superficies periosticas (Ps.MSBS) y endocortical (Ec.MSBS) de la diafisis de la tibia aumento en los grupos tratados con PTH(1-34) (Tabla 3). La Ps.MS/BS en el grupo de dosis mas alta fue significativamente mayor que en los otros 2 grupos (p <0,001) y la Ec.MS/SB en el grupo de dosis mas alta fue significativamente mayor que en el grupo de control (p <0,05). Compatible con el aumento de la fosfatasa alcalina serica, las tasas de formacion de hueso en cada superficie (Ps.bFr/BS y Ec.BFR/BS) fueron significativamente mayores en el grupo con dosis mas altas que en los otros 2 grupos (p <0,05). La tasa de aposicion mineral (TAM) no cambio en las cubiertas del periostio y endocortical.
Intracorticalmente, el numero de sitios de reabsorcion (Rs.N/Ct.Ar) en conejos que recibieron PTH(1-34) a 40 |jg/kg/dfa fue significativamente mayor, multiplicandose 7, que en los otros 2 grupos (p <0,05 ) (Tabla 4). El numero de osteonas marcadas (L.On.N/Ct.Ar) en conejos que recibieron PTH(1-34) a 40 jg/kg/dfa tambien aumento significativamente en comparacion con los otros 2 grupos (p <0,01 frente al grupo control, p <0,05 frente a 10 pg/kg/ dfa). La TAMf ue significativamente mayor en ambos grupos de tratamiento con respecto al grupo control (p <0,01), pero no hubo diferencias significativas entre los grupos tratados con PTH. La tasa de formacion osea (BFR/BV) y la frecuencia de activacion (Ac.F) aumentaron (p <0,05 y p <0,01, respectivamente) con ambas dosis.
Aunque la superficie osea (B.Ar) aumento en ambas dosis, solo se encontro una diferencia significativa entre el grupo con dosis mas alta y el grupo control (p <0,01). La superficie de la medula (Ma.Ar) disminuyo despues del tratamiento, pero no fue significativamente diferente entre los tres grupos. Sin embargo, la superficie cortical (Ct.Ar) en el grupo de dosis mas alta fue significativamente mayor que en los otros 2 grupos (p <0,0001 frente al grupo control, p <0,05 frente al grupo de dosis mas baja). La Ct.Ar en el grupo de dosis mas baja tambien fue significativamente mayor que la del grupo control (p <0,05). Se encontraron resultados similares en el % de la Ct.Ar.
La porosidad cortical (Ct.Po) en conejos que recibieron PTH(1-34) a 10 jg/kg/dfa fue el doble que en el grupo control (p <0,05), mientras que la Ct.Po en conejos que recibieron PTH(1-34) a 40 pg/kg/dfa fue 6 veces mayor que en el grupo control (p < 0,01). Sin embargo, las porosidades se encuentran en el compartimento endocortical y, en ese lugar, es poco probable que contribuyan a la fuerza biomecanica, ya que la PTH tambien aumento la superficie osea cortical, en consonancia con un aumento del momento de inercia de la seccion transversal.
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Parametros
Abreviatura Control PTH(1-34) 10 pg/kg/dfa PTH(1-34) 40 pg/kg^a
Superficie osteoide endocortical
Ec.OSBS ( %) 8,8 ± 6,0 13,7 ± 10,5 20,2 ± 5,8
Espesor osteoide endocortical
Ec.O.Th (pm) 7,4 ± 2,4 3,7 ± 2,3 8,1 ± 0,9
Tasa de aposicion mineral periostica
Ps.MAR (pm/dfa) 0,33 ± 0,17 0,38 ± 0,08 0,66 ± 0,14
Tasa de aposicion mineral endocortical
Ec.MAR (pm/dfa) 1,33 ± 0,22 0,79 ± 0,16 1,32 ± 0,15
Superficie de mineralizacion periostica
Ps.MSBS ( %) 3,8 ± 1,9 8,2 ± 2,1 22,3 ± 2,7**
Superficie de mineralizacion endocortical
Ec.MS/BS ( %) 26,4 ± 6,6 32,6 ± 8,2 57,7 ± 10,4*
Tasa de formacion osea periostica
Ps.BFR/BS (pm3/pm2/ano) 0,02 ± 0,02 0,03 ± 0,01 0,16 ± 0,05**
Tasa de formacion osea endocortical
Ec.BFR/BS (pm3/pm2/ano) 0,40 ± 0,10 0,31 ± 0,10 0,72 ± 0,12**
Los datos se expresan como la media ± SEM para 6 conejos por grupo. * P < 0,05 comparado con el control. *P <0,05 en comparacion con PTH(1-34) 10 pg/kg/dfa.
Tabla 4 - Efectos de la PTH(1-34) sobre la remodelacion oseo intracortical de la diafisis tibial
Parametros
Abreviatura Control PTH(1-34) 10 pg/kg/d^a PTH(1-34) 40 pg/kg/d^a
Numero de cavidad de resorcion
Rs.N/Ct.Ar (n.°/mm2) 0,014 ± 0,013 0,013 ± 0,004 0,097 ± 0,036**
Numero de osteonas marcadas
L.On.N/Ct.Ar (n.°/mm2) 0,011 ± 0,006 0,027 ± 0,006 0,215 ± 0,094**
Espesor osteoide
O.Th (pm) 4,92 ± 0,59 5,42 ± 0,30 5,16 ± 0,27
Tasa de aposicion mineral
MAR (pm/dfa) 1,19 ± 0,20 1,56 ± 0,13* 1,60 ± 0,12*
Tasa de formacion osea
BFR/BV ( %/ano) 0,5 ± 0,3 8,5 ± 2,9* 21,4 ± 3,8*
Frecuencia de activacion
Ac.F (n.°/mm2/ano) 1,8 ± 1,0 15,1 ± 5,0* 43,8 ± 10,5**
Superficie osea
B.Ar (mm2) 29,1 ± 1,3 33,3 ± 1,9 37,8 ± 2,7*
Superficie de la medula
Ma.Ar (mm2) 12,7 ± 0,7 11,9 ± 1,0 10,7 ± 1,0
Superficie cortical
Ct.Ar (mm2) 16,4 ± 0,9 21,3 ± 1,2* 27,1 ± 2,0**
% de la superficie cortical
%Ct.Ar (%) 56,4 ± 1,5 64,2 ± 1,6* 71,6 ± 1,5**
Los datos se expresan como la media ± SEM para 6 conejos por grupo. * P < 0,05 comparado con el control. *P <0,05 en comparacion con PTH(1-34) 10 pg/kg^a.
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Parametros
Abreviatura Control PTH(1-34) 10 pg/kg/dfa hPTH(1-34) 40 pg/kg/dfa
Volumen del hueso
BV/TV ( %) 27,5 ± 1,4 30,5 ± 3,4 27,9 ± 3,2
Espesor trabecular
Tb.Th (pm) 124,8 ± 7,3 147,4 ± 12,7 126,4 ± 13,7
Superficie erosionada
ESBS ( %) 0,5 ± 0,3 1,4 ± 0,3 2,6 ± 0,7*
Superficie de osteoclastos
Oc.SBS ( %) 0,4 ± 0,2 0,9 ± 0,3 1,3 ± 0,3
Superficie osteoide
OSBS ( %) 5,2 ± 1,3 7,2 ± 1,2 27,7 ± 3,8**
Superficie osteoblastica
Ob.SBS ( %) 1,4 ± 0,6 1,3 ± 0,6 15,3 ±5,6**
Espesor osteoide
O.Th (pm) 5,2 ± 0,5 5,3 ± 0,5 4,4 ± 0,2
Volumen del osteoide
OV/TV ( %) 0,10 ± 0,02 0,13 ± 0,03 0,46 ± 0,07**
Tasa de aposicion mineral
MAR (pm/dfa) 1,3 ± 0,2 1,5 ± 0,1 1,7 ± 0,1
Superficie de mineralizacion
MSBS ( %) 4,4 ± 1,4 7,4 ± 1,9 24,2 ± 1,5**
Tasa de formacion osea
BFR/BS (pm3/pm2/ano) 19,7 ± 5,3 38,5 ± 8,9 153,0 ± 15,6**
Los datos se expresan como la media ± SEM para 6 conejos por grupo. * P < 0,05 comparado con el control. *P <0,05 en comparacion con PTH(1-34) 10 jg/kg^a.
En el hueso esponjoso, la mayona de los parametros de formacion (OSBS, Ob.SBS, OV/TV y MSBS) aumentaron con el tratamiento con PTH(1-34) (Tabla 5). Los de los conejos que recibieron PTH(1-34) a 40 jg/kgMa fueron significativamente mayores que en los otros 2 grupos (p <0,01 frente al grupo control y 10 jg/kg^a en todos los parametros). La tasa de formacion de hueso (BFR/BS) tambien aumento significativamente en conejos que recibieron PTH(1-34) a 40 jg/kgMa en comparacion con los otros 2 grupos (p <0,0001 frente a los grupos control y 10 jg/kgMa). Aunque la resorcion (ESBS y Oc.S/BS) aumento en ambos grupos tratados con PTH (1-34), solo la superficie erosionada (ESBS) en el grupo de dosis mas alta fue significativamente mayor que el grupo de control (p <0,001). No hubo diferencias en el espesor osteoide (O.Th) entre los tres grupos. A pesar de la evidencia de un recambio oseo acelerado, el volumen fraccional de hueso (BV/TV) no cambio despues del tratamiento con PTH (134). No se observo reabsorcion en tunel y fibrosis peritrabecular en ninguno de los grupos.
Mediciones de la masa osea
La vBMD y el BMC en la diafisis del femur evaluados mediante pQCT en el grupo tratado con 40 jg/kg/dfa fueron significativamente mayores que en los otros 2 grupos (p <0,001 en la vBMD y p <0,0001 en el BMC frente al grupo de control, p <0,05 en la vBMD y p <0,01 en el BMC frente al grupo de dosis mas baja) (figura 1A). La vBMD y el BMC en el grupo tratado con 10 j g/kg/dfa tambien fueron significativamente mayores que en el grupo de control (p <0,05 tanto en la vBMD como el BMC). Aunque la superficie osea de la diafisis del femur tambien aumento de forma dependiente de la dosis, solo aumento significativamente en el grupo tratado con 40 jg/kg/dfa (p <0,05).
La aBMD y el BMC en el femur proximal, medidos mediante absorciometna dual de rayos X (DXA o pDXA), aumento de forma dependiente de la dosis. Hubo diferencias significativas tanto en la aBMD como en el BMC entre el grupo control y el grupo tratado con 10 jg/kg/dfa (p <0.05), asf como entre el grupo control y el grupo tratado con 40 jg/kg/dfa (p <0.001) (figura 1B). No se encontraron diferencias significativas en la superficie osea entre los tres grupos.
En general, la figura 1 muestran que la BMD (densidad mineral osea) y el BMC (contenido mineral oseo) en el eje femoral central (hueso cortical) (A) y en el femur proximal (hueso esponjoso + hueso cortical) (B) fueron significativamente mayores en animales tratados con PTH que en los controles a ambas dosis. La superficie osea cortical en la diafisis femoral en conejos tratados con la dosis mas alta fue significativamente mayor que los controles. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos en la superficie osea del femur proximal. Los datos se expresan como la media +/- SEM. * P < 0,05 comparado con el control. *P <0,05 en comparacion con PTH 10 jg/kg/dfa.
No hubo diferencias significativas en la vBMD, el BMC o la superficie osea de la vertebra lumbar (L4) evaluados mediante pQCT, entre los tres grupos.
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Pruebas biomecanicas
Las propiedades estructurales de la diafisis del femur, tales como la fuerza de rotura, la rigidez y el esfuerzo de rotura aumentaron de forma dependiente de la dosis (figura 2). La figura 2 muestran los efectos de la PTH sobre la resistencia mecanica y el momento de inercia en seccion transversal (MIST) en el hueso cortical de la diafisis media del femur. Las propiedades mecanicas estructurales (barras abiertas) y CSMI aumentaron significativamente en el grupo de dosis mas alta, mientras que la rigidez tambien aumento significativamente en el grupo de dosis mas baja. De las propiedades intrmsecas del material (barras oscuras), solo el modulo elastico aumento significativamente en el grupo de dosis mas baja en comparacion con los controles. El modulo elastico en el grupo de dosis mas alta disminuyo significativamente cuando se comparo con el grupo de dosis mas baja. En la figura 2: los datos se expresan como la media ± SEM; * indica P <0,05 en comparacion con el control; y * indica P <0,05 en comparacion con 10 |jg/kg/dfa.
En este estudio y los resultados mostrados en la figura 2, todos los parametros fueron significativamente mayores en conejos que recibieron PTH(1-34) a 40 jg/kg/dfa que en el grupo control (p <0,01 para la fuerza de rotura y el esfuerzo de rotura, p <0,05 para rigidez). La rigidez en el grupo de dosis mas baja tambien fue significativamente mayor que la del grupo control (p <0,05). De las propiedades intrmsecas del material, el modulo elastico fue significativamente menor en conejos que recibieron 40 jg/kg/dfa que los que recibieron 10 jg/kg/dfa (p <0,01).
En el cuerpo vertebral lumbar, no se encontraron diferencias significativas en las propiedades mecanicas entre los tres grupos.
Microscopia acustica
No hubo diferencias significativas en la velocidad acustica o el coeficiente elastico entre los tres grupos. Discusion
La respuesta esqueletica del hueso cortical a la PTH(1-34) biosintetica implico tanto una regulacion directa de las propiedades del material como una regulacion compensatoria de las propiedades biomecanicas en los huesos largos de conejos hembra maduros intactos. La PTH(1-34) aumento el recambio oseo y la porosidad cortical y, a la dosis de 40 jg/kg, redujo el modulo elastico material del hueso cortical. Sin embargo, el modulo elastico disminuido fue mas que compensado por el aumento de la aposicion osea en las superficies periosticas y endocorticales, lo que dio como resultado una mejora significativa en la resistencia estructural, la rigidez y el esfuerzo de rotura del hueso cortical en conejos.
En este estudio utilizando conejos intactos, el volumen del hueso esponjoso de la vertebra lumbar no cambio despues del tratamiento con PTH (1-34), a pesar de la evidencia de aumento del recambio oseo. El uso previo como modelo osteopenico, la presencia de remodelacion intracortical y el corto periodo de remodelacion, junto con el rapido crecimiento del conejo y la maduracion esqueletica precoz (6-9 meses), sentaron la base para la seleccion del conejo como modelo en el cual probar los efectos de la PTH(1-34). Administrada de forma intermitente.
Los conejos pueden presentar una amplia variacion en los niveles sericos de calcio (10-16 mg/dl), pero estos niveles no estan directamente influenciados por la cantidad de calcio en la dieta, otra ventaja del modelo. Aunque se registraron aumentos transitorios significativos de aproximadamente 1 mg/ml en conejos tratados con PTH (1-34) a 40 jg/kg, los valores reales estaban siempre dentro del intervalo fisiologico conocido.
En el presente estudio, la hPTH(1-34) for biosintetica durante 140 dfas aumento la tasa de formacion osea intracorticalmente, asf como en las superficies periosticas y endocorticales. El Ac.F intracortical aumento en el grupo de dosis mas baja por 8 veces y en el grupo de dosis mas alta 20 veces. Esto condujo a un aumento de 2 veces en la porosidad cortical en la tibia en el grupo de dosis mas baja y un aumento de 6 veces en el grupo de dosis mas alta. Los datos de la microscopia acustica muestran que las propiedades elasticas del propio material oseo en el humero no se vieron afectadas, lo que indica que la calidad intrmseca del hueso cortical es normal. Por lo tanto, la mayor porosidad debe explicar la ligera reduccion del modulo elastico, una medida de las propiedades del material que incluye los espacios en la corteza.
Sin embargo, el aumento de la porosidad cortical fue mas que compensado por el aumento significativo de MS/BS y BFR/BS en ambas superficies periostica y endocortical en la diafisis de la tibia en el grupo de dosis mas alta, lo que dio como resultado un aumento significativo de la superficie osea. Esto aumentana el momento de inercia de la seccion transversal, que es proporcional a la rigidez a la flexion del hueso, como en la diafisis femoral (figura 2). La consecuencia de estos cambios en la forma y las propiedades del material fue la mejora de la resistencia mecanica y la rigidez de la diafisis femoral en comparacion con los controles, compensando asf los efectos mecanicos potencialmente perjudiciales del aumento de la porosidad cortical.
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Conclusion
En conclusion, los incrementos en el recambio oseo y la porosidad cortical despues del tratamiento con PTH(1- 34) se acompanaron de por aumentos simultaneos en el hueso en las superficies periostica y endocortical. La combinacion de estos fenomenos dio lugar a una mejora de la tenacidad, la tension de rotura y el esfuerzo de rotura del femur.
Ejemplo de referencia 2 - Resistencia y densidad oseas aumentadas tras la administracion de rhPTH(1-34) a monos
Procedimientos experimentales
Aspectos generales
La fase in vivo del estudio utilizo primates cynomolgus (Macaca fascicularis) salvajes adultos (con placas de crecimiento cerradas) de 2,77 ± 0,03 kg de peso (media ± error tfpico de la media [SEM)]. Los monos se mantuvieron en cuarentena durante 3 meses, despues se empezo una dieta que contema un 0,3 % de calcio, un 0,3 % de fosfato y 250 UI de vitamina D3/100 g de dieta, y se les administro agua fluorada (1 ppm de fluoruro) a demanda. El contenido de calcio correspondfa a 1734 mg de calcio/2000 calonas. Despues de 1 mes de dieta, se clasifico a los animales en grupos de 21 o 22, fueron operados de forma simulada o fueron ovariectomizados. Se iniciaron inyecciones subcutaneas de vetuculo una vez al dfa (controles simulados y ovariectomizados) o de rhPTH(1-34) a 1 pg/kg (PTH1) o 5 pg/kg (PTH5) 24 horas despues de la ovariectoirna. Se trato a los animales durante 18 meses (PTH1 y PtH5) o durante 12 meses, seguidos de la retirada del tratamiento (PTH1-W y PTH5-W).
Los grupos de estudio se dividieron como se muestra en la Tabla 6.
Tabla 6 - Grupos de estudio para el estudio de primates
Grupo
Abreviatura Monos de partida (n=128) Monos en el analisis final (n = 121)
Ovariectomizados de forma simulada, 18 meses con vetuculo
Simulado 21 21
Ovariectomizados, 18 meses con vehfculo
OVX 22 20
Ovariectomizados, 18 meses con 1 pg de rhPTH(1- 34)/kg/dfa
PTH1 21 19
Ovariectomizados, 12 meses con 1 pg de rhPTH(1- 34/kg/dfa 6 meses con vehfculo
PTH1-W 21 20
Ovariectomizados, 18 meses con 5 pg de rhPTH(1- 34)/kg/dfa
PTH5 22 21
Ovariectomizados, 12 meses con 5 pg de rhPTH(1- 34)/kg/dfa 6 meses con vehfculo
PTH5-W 21 20
Se tomaron muestras de suero y orina 24 horas despues de la inyeccion de vetuculo o rhPTH(1-34) en intervalos de 3 meses. Se utilizo un diseno de toma de muestras disperso de 5 monos en cada grupo tratado con rhPTH(1-34) para la farmacocinetica, con toma de muestras (que abarca de 0 a 240 minutos cada vez) en el momento basal, a 7, 11 y 17 meses. A tiempo 0 y en intervalos de 6 meses, se evaluo la masa osea esqueletica total y de la columna (L-2 a L-4) mediante absorciometna de rayos X de energfa dual (DXA); se utilizo tomograffa de rayos X computerizada cuantitativa periferica (pQCT) para evaluar la masa osea en los radios de la diafisis y distal, y la tibia proximal. Se realizaron biopsias iliacas a los 6 y 15 meses para histomorfometna. Se sacrifico a todos los animales despues de 18 meses.
Las pruebas biomecanicas se realizaron en las vertebras lumbares L-3 a L-4, el cuello femoral, la diafisis del humero y en un especimen de hueso cortical obtenido a partir de la diafisis femoral (medidas definidas en la tabla 7). Se realizo histomorfometna estatica y dinamica convencional (medidas descritas en la tabla 1) en la diafisis del humero, la vertebra lumbar L-2, el cuello femoral, la diafisis del femur, la diafisis del radio y el radio distal. Los analisis estadfsticos iniciales compararon todos los grupos con los controles ovariectomizados tratados con vetuculo. Los datos son adecuados para analisis exploratorios adicionales para examinar la dependencia de la dosis, los efectos de la retirada, las interacciones entre resultados y los cambios con el tiempo mediante metodos conocidos por los expertos en la materia. Todos los ensayos se realizaron y determinaron mediante metodos conocidos en la materia.
Para ciertos sujetos experimentales, el hueso cortical del humero se examino mediante histomorfometna y
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mediante microscopia de infrarrojos polarizada de transformada de Fourier. La microscopia de infrarrojos de transformada de Fourier se realizo mediante una adaptacion de metodos conocidos para dicha microscopia.
Estudios de modelacion de elementos finitos tridimensionales
Estos estudios determinaron los datos de modelacion de elementos finitos tridimensionales en vertebras de los monos del estudio dosificados con PTH durante 18 meses. La vertebra L-5 extrafda con 50% de etanol/solucion salina de los grupos de animales ovariectomizados (n= 7) y PTH (n= 7) se barrieron en serie en etapas de 500 pm mediante tomograffa computerizada cuantitativa (QCT, Norland, Ft Atkinson, WI), utilizando pfxeles de 70x70 pm. En cada una de las secciones transversales de 500 pm se analizo la densidad mineral osea volumetrica (BMD, mg/cm3), el contenido mineral oseo (BMC, mg), la superficie transversal (superficie X), el volumen de hueso esponjoso (BV/TV), el espesor trabecular (Tb.Th) y la conectividad (densidad nodal, analisis de soportes). Los pfxeles en cada barrido en serie se promediaron para crear voxteles de 490 x 490 x 500 pm. Los barridos en serie se apilaron despues y se genero una malla de superficie triangular para cada hueso utilizando el algoritmo de los "cubos contiguos" (vease, por ejemplo, Lorensen y Cline 1987 "Marching cubes, a high resolution 3D surface construction algorithm." Computer Graphics 21, 163-169). Una version suavizada de cada malla de superficie se utilizo despues para generar una trama tetraedrica para modelacion de elementos finitos tridimensionales.
El modulo de Young para cada elemento tetraedrico se derivo de las densidades en voxtel originales y de las propiedades del material a partir de un haz de hueso cortical laminado de la diafisis femoral de los monos. Cada malla tetraedrica se roto de modo que la superficie inferior de cada vertebra se alineara con un plano. A continuacion, se realizo el analisis de tension elastica lineal para cada modelo de L-5 en los que se aplico una carga distribuida de 100 N a la superficie superior del centro, perpendicular al plano inferior, mientras la superficie inferior se fijaba en la direccion de la carga. Se evaluaron los contornos de la tension axial resultante, asf como las distribuciones de la BMD, y se compararon entre los animales tratados con PTH y ovariectomizados. A esta resolucion, la densidad de cada voxtel depende de la extension en que cada voxtel se ha llenado con hueso en oposicion a tejido blando.
Resultados
Los informes de las diferencias en el texto son estadfsticamente significativas, p < 0,05. Todos los animales ganaron de 4 % a 9 % de peso corporal inicial durante el estudio independientemente del tratamiento.
Medidas de suero y orina
Los niveles sericos de estradiol a los 3 y 18 meses eran menores que 5 pg/ml en todos los monos ovariectomizados- Cuando se compararon las medidas de homeostasis del calcio con los controles simulados, los controles ovariectomizados teman niveles sericos menores de calcio y fosfato y de 1,25-dihidroxivitamina D, pero no difenan en cuando a PTH endogena, adenosm monofosfato dclico (AMPc) urinario, calcio urinario, creatinina urinaria o nitrogeno ureico serico medidos 24 horas despues de la ultima inyeccion. Los animales tratados con rhPTH(1-34) teman niveles menores de fosfato serico, menos PTH endogena y mas 1,25-dihidroxivitamina D y AMPc urinario en comparacion con los animales ovariectomizados. Los ensayos de marcadores sericos de formacion de hueso mostraron que los monos ovariectomizados teman niveles bajos de fosfatasa alcalina (ALP) total y de osteocalcina en comparacion con los simulados y se restauraron los niveles de rhPTH(1-34) de nuevo a los valores de los simulados. La excrecion del C-telopeptido urinario (CrossLaps), utilizado como marcador bioqmmico de la resorcion osea, no estaba alterada por la rhPTH(1-34) en comparacion con los controles ovariectomizados.
Masa osea
La masa osea esqueletica total, expresada como el BMC corporal total, aumento significativamente por la PTH(1- 34) (Fig. 3). La densidad mineral osea (BMD) de columna vertebral permanecio estable en los controles ovariectomizados durante 18 meses, mientras que los controles simulados ganaron aproximadamente un 5% por encima del valor basal (figuras 4A-4C y 5A). La rhPTH(1-34) aumento la BMD de la columna vertebral en un 7 % a un 14 % y el contenido mineral oseo (BMC, figura 3) de todo el cuerpo hasta un 6 % en comparacion con el valor basal (figuras 4A-4C y 5A). El contenido mineral oseo de la columna vertebral aumento tambien (Fig. 5A). En primates tratados con rhPTH(1-34), la magnitud de estos aumentos era significativamente mayor que la de los controles ovariectomizados e igualaba (PTH1) o superaba (PTH5) la de los simulados. La rhPTH(1-34) no altero la BMD de la diafisis o el radio distal. La superficie transversal de la diafisis aumento en un 7 % en el grupo de PTH5. El la tibia proximal, no hubo aumento de la superficie transversal, pero la rhPTH(1-34) aumento el BMC y la BMD en comparacion con los controles ovariectomizados. Seis meses despues de la retirada del tratamiento, la BMD y el BMC en la columna vertebral y el cuello femoral permanecieron mayores que en los controles ovariectomizados, sin cambios en la diafisis cortical del humero.
Resistencia osea
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La rhPTH(1-34) aumento la resistencia (Fy) en las vertebras hasta un 43% (Tablas 7 y 8, figura 5B). La rhPTH(1-34) mejoro la resistencia del cuello femoral (fu) hasta un 12 % (Tablas 7 y 9, figura 6A). La rhPTH(1-34) no altero las medidas de la diafisis cortical del humero medio (Tablas 7 y 10) ni las propiedades materiales de los espedmenes de haz maquinados de la diafisis femoral (Tablas 7 y 9, Fig. 6B) en comparacion con los controles ovariectomizados. En animales tratados con rhPTH(1-34) durante 12 meses y despues retirados del tratamiento durante 6 meses, las medidas de resistencia osea permanecieron significativamente mayores que en los controles ovariectomizados (Tablas 7-10, figuras 5B y 6A).
Tabla 7 Variables indicadas para espedmenes de la tercera y cuarta vertebras lumbares (L-3 y L-4), diafisis del
humero, cuello femoral proximal y haz femoral
Variable
Unidades Descripcion
Vertebras lumbares, L-3 y L-4
A
mm2 Superficie transversal
Fv
N La fuerza de fluencia es la fuerza para un alargamiento del 0,2 %
S
N/mm Pendiente de la porcion lineal de la curva de fuerza- desplazamiento (rigidez)
ay
Mpa Lfmite elastico
E
Mpa Modulo de Young
Diafisis del humero
t
mm Espesor cortical promedio
Fu
N La fuerza de rotura es la fuerza maxima que puede soportar el especimen
S
N/mm Pendiente de la porcion lineal de la curva de fuerza- desplazamiento (rigidez), aqu es rigidez
mJ/U
N-mm Area bajo la curva de carga-desplazamiento (U= esfuerzo de rotura)
Cuello femoral proximal
Fu
N La fuerza de rotura es la fuerza maxima que puede soportar el especimen
Espedmenes del haz de la diafisis del femur
au
Mpa Tension de rotura
E
Gpa Modulo de Young
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J/m3 Tenacidad
£u
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Tabla 8 Medidas biomecanicas de la resistencia de la columna vertebral (vertebras lumbares L-3 y L-4 _____________ combinadas) de primates^ ovariectomizados a los 18 meses________________
Variable (unidades)a
Simulado Control OVX PTH1 PTH1-W PTH5 PTH5-W
A (mm2)
90,5 ± 2,1b 86,7 ± 2,3 88,3 ± 2,0 90,9 ± 2,3 87,3 ± 2,7 82,8 ± 2,1
Fv(N)
1738 ± 52 1499 ± 945 1915±105° 1899 ± 73° 2113 ± 77s° 1792 ± 59°
S (N/mm)
7312± 319 5805 ± 4765 7701 ± 474° 7401 ± 452° 8012 ± 367° 7074± 314°
Oy (Mpsa)
19,4 ± 0,6 17,3 ± 1,0 21,9 ± 1,3° 21,1 ± 0,8° 24,6 ± 1,1s° 21,9 ± 0,9°
E(Mpa)
650 ± 32 546 ± 49 717 ± 48° 659 ± 42 759 ± 36° 698 ± 41°
Abreviaturas: OVX=ovariectomizado; PTH1: rhPTH(1-34) 1 pg/kg durante 18 meses; PTH1-W= retirada durante 6 meses despues del tratamiento con rhPTH(1-34) 1 m pg/kg durante 12 meses; PTH5= rhPTH(1- 34) 5 pg/kg durante 18 meses; PTH5-W= retirada durante 6 meses despues del tratamiento con rhPTH(1- 34) 5 pg/kg durante 12 meses. aVease la tabla 4.1 para la descripcion de las variables bDatos expresados como media ± error tfpico de la media (SEM) por grupo. °°Estadfsticamente significativo en comparacion con los controles OVX (p < 0,05). °sEstadfsticamente significativo en comparacion con los controles simulados (p < 0,05).
Tabla 9 Medidas biomecanicas de las propiedades del material de espedmenes de haz de tamano equivalente de diafisis femoral y medida biomecanica de la resistencia del cuello femoral de primates
ovariectomizados a los 18 meses
Variable (unidades)a
Simulado Control OVX PTH1 PTH1-W PTH5 PTH5-W
Ob (Mpa)
222 ± 5b 216 ± 5 222 ± 4 214 ± 6 206 ± 6 208 ± 6
E(Gpa)
17,2 ± 0,6 16,4 ± 0,4 17,1 ± 0,4 16,6 ± 0,6 15,4 ± 0,6s 15,3 ± 0,6s
u (mJ/m3)
5,9 ± 0,3 5,8 ± 0,4 6,1 ± 0,4 5,5 ± 0,4 5,4 ± 0,4 6,1 ± 0,4
£b
0,035 ± 0,001 0,035 ± 0,002 0,036 ± 0,002 0,034 ± 0,002 0,034 ± 0,002 0,038 ± 0,002
Cuello femoral proximal
Fu
1288 ± 41 1105 ± 53s 1235 ± 45° 1258 = 52° 1362 ± 30° 1213 ± 42
Abreviaturas: OVX=ovariectomizado; PTH1: rhPTH(1-34) 1 pg/kg durante 18 meses; PTH1-W= retirada durante 6 meses despues del tratamiento con rhPTH(1-34) 1 m pg/kg durante 12 meses; PTH5= rhPTH(1- 34) 5 pg/kg durante 18 meses; PTH5-W= retirada durante 6 meses despues del tratamiento con rhPTH(1- 34) 5 pg/kg durante 12 meses. aVease la tabla 4.1 para la descripcion de las variables bDatos expresados como media ± error tfpico de la media (SEM) por grupo. ^Estadfsticamente significativo en comparacion con los controles OVX (p < 0,05). °sEstadfsticamente significativo en comparacion con los controles simulados (p < 0,05).
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Tabla 10 Medidas biomecanicas del hueso cortical de la diafisis del humero de primates ovariectomizados a
los 18 meses
Variable (unidades)a
Simulado Control OVX PTH1 PTH1-W PTH5 PTH5-W
t(mm)
1,74 ± 0,04b 1,63 ± 0,03s 1,68 ±0,03 1,66 ± 0,04 1,80 ± 0,04° 1,72 ± 0,05
Fu(N)
725 ± 26 636 ± 26 654 ± 23 689 ± 23 680 ± 15s 707 ± 24
S(N/mm)
601 ± 23 520 ± 26 544 ± 23 573 ± 20 548 ± 18 573 ± 24
U(mJ)
1797 ± 85 1542 ± 92 1641±137 1751 ± 84 1804 ± 99 1775±113
Abreviaturas: OVX=ovariectomizado; PTH1: rhPTH(1-34) 1 pg/kg durante 18 meses; PTH1-W= retirada durante 6 meses despues del tratamiento con rhPTH(1-34) 1 m pg/kg durante 12 meses; PTH5= rhPTH(1-34) 5 pg/kg durante 18 meses; PTH5-W= retirada durante 6 meses despues del tratamiento con rhPTH(1-34) 5 pg/kg durante 12 meses. aVease la tabla 4.1 para la descripcion de las variables bDatos expresados como media ± error tfpico de la media (SEM). °°Estadfsticamente significativo en comparacion con los controles OVX (p < 0,05). °sEstadfsticamente significativo en comparacion con los controles simulados (p < 0,05).
Histomorfometria osea
Aunque las velocidades de recambio eran mayores en los controles ovariectomizados que en los simulados, no hubo una perdida significativa de volumen oseo en la cresta iliaca. Ya que el marcaje de tetraciclina administrado a los 6 meses no era detectable en muchos animales, se midieron solo parametros estaticos en ese momento. Los datos histomorfometricos estaticos y dinamicos a los 15 meses mostraron que el tratamiento con rhPTH(1-34) aumentaba la superficie de hueso esponjoso en comparacion con los ovariectomizados, y aumentaba la formacion de hueso sin aumentar las medias de resorcion por encima de las medidas en los controles ovariectomizados. La velocidad de formacion de hueso aumento progresivamente por dosis mayores de rhPTH(1-34). Aunque el hueso esponjoso permanecio aumentado en comparacion con los controles ovariectomizados despues de la retirada de la rhpTH(1-34) despues de 12 meses de tratamiento, la formacion y resorcion oseas revirtieron a las observadas en controles ovariectomizados, y el recambio oseo permanecio mayor que en los controles simulados. La rhPTH(1-34) no afecto la mineralizacion, la frecuencia de activacion ni los periodos de remodelacion. No hubo diferentes en el equilibrio oseo basado en la unidad multicelular osea individual (BMU) entre la resorcion y la formacion. En resumen, la rhPTH(1-34) aumento el hueso esponjoso mediante la estimulacion selectiva de la formacion de hueso.
En el hueso cortical del humero, en que la rhPTH(1-34) no modifico significativamente la BMD ni las medidas de resistencia osea, la rhPTH(1-34) estimulo cambios en los compartimientos periostico, endostico e intracortical (Tablas 11 y 12). Aunque no hubo diferencias en la superficie total o superficie medular entre grupos, la rhPTH(1-34) aumento la superficie cortical, y los grupos PTH5 y PTH5-W tuvieron significativamente mas hueso cortical, lo que sugiere un momento de inercia transversal aumentado, una medida de la resistencia. El aumento de la superficie podna atribuirse a un aumento de la formacion tanto de superficies periostica como endostica (figura 7).
Los controles simulados y los grupos tratados con PTH5-W teman superficies de mineralizacion periostica reducidas en comparacion con los controles ovariectomizados y los demas grupos tratados con rhPTH(1-34). Las superficies de mineralizacion endocorticales eran significativamente mayores en controles ovariectomizados en comparacion con los simulados y la rhPTH(1-34) no aumento por encima de los valores de los controles ovariectomizados. En la remodelacion intracortical, hubo mas espacios de resorcion en los animales ovariectomizados y la frecuencia de activacion fue mayor en los grupos ovariectomizado, PTH1 y PTH5 que en los controles simulados o en cualquiera de los grupos de retirada. Hubo significativamente mas osteonas marcadas por unidad de superficie en los ovariectomizados en comparacion con los controles simulados y la rhPTH(1-34) no aumento estas significativamente por encima de los valores de los controles ovariectomizados.
La porosidad intracortical fue mayor en los animales ovariectomizados en comparacion con los simulados, pero no diferente entre los controles ovariectomizados y los tratados con PTH1. PTH5 y PTH5-W aumentaron la porosidad por encima de la observada en controles ovariectomizados. Los datos de estudios de conejos sugenan la hipotesis de que el aumento de porosidad, acompanado del aumento de hueso cortical, puede ser una respuesta estructural para mantener las propiedades biomecanicas del hueso tratado con rhPTH(1-34). No hubo diferencias entre los grupos ovariectomizado y los otros grupos en el periodo de formacion, anchura del osteoide, anchura de la pared o maduracion del osteoide a los 18 meses.
En resumen, no hubo diferencias en las velocidades de recambio entre los controles ovariectomizados y cualquier dosis de rhPTH(1-34). Los controles simulados tuvieron una velocidad de recambio menor que cualquiera de los controles ovariectomizados o animales tratados con rhPTH(1-34). Cuando se retiro la rhPTH(1-34) durante 6 meses, las velocidades de recambio se redujeron significativamente, pero las medidas de BMD y resistencia biomecanica permanecieron mayores que en los controles ovariectomizados. Los valores normales para anchura del osteoide y tiempo de maduracion intracortical para todos los grupos indican que el tratamiento no causo ningun
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defecto en la cadencia del proceso de mineralizacion. Los valores normales de anchura de pared indican que el tratamiento no altero el equilibrio normal entre resorcion y formacion al nivel de la BMU individual.
Tabla 11 Variables histomorfometricas para las medidas de hueso cortical del humero
Variable3
Unidades Descripcion
Ac.F
Ciclos/ano Frecuencia de activacion
BFR/BS.Ec
|jm/dfa Velocidad de formacion osea, referente de la superficie endocortical
BFR/BS.Ps
jm^a Velocidad de formacion osea, referente de la superficie periostica
BFR/BV
%/ano Velocidad de formacion osea, referente del volumen oseo
FP
d^as Periodo de formacion
L.On.N/CtA
#/mm2 Numero de osteonas marcadas con fluorocromo por unidad de superficie cortical
MAR
jm^a Tasa de aposicion mineral, intracortical
MAR.Ec
jm^a Tasa de aposicion mineral, superficie endocortical
MAR.Ps
jm/dfa Tasa de aposicion mineral, superficie periostica
MS/BS.Ec
% Superficie de mineralizacion endocortical normalizada con respecto a la superficie endocortical total
MS/BS.Ps
% Superficie de mineralizacion periostica normalizada con respecto a la superficie periostica total
O.Wi
jm Anchura del osteoide
Rs.N/Ct.A
n.°/mm2 Numero de espacios de resorcion por unidad de superficie cortical
W.Wi
jm Anchura de la pared osteonal
omt
dfas Tiempo de maduracion del osteoide
Po
% Porosidad, porcentaje de la superficie osea ocupado por espacios
B.Ar
mm2 Superficie osea, la superficie total dentro de la superficie periostica
Ct. Ar
mm2 Superficie cortical, superficie de hueso dentro de la superficie periostica (incluye porosidades)
Mc.Ar
mm2 Superficie de la cavidad medular
aNomenclatura recomendada por el Journal of Bone and Mineral Research, 1987.
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Variableb
Simulado OVX PTH1 PTH1-W PTH5 PTH5-W
Ac.F
1,85 ± 1,87ac 6,06 ± 3,31 7,69 ± 4,96 3,05 ± 2,15a 8,70 ± 3,97 2,05 ± 1,46a
BFR/BS.Ec
7,08 ± 3,80 20,93 ± 19,23 18,14 ± 13,95 14,89 ± 10,32 34,04 ± 19,01 12,73± 16,33a
BFR/BS.Ps
3,79 ± 3,07 9,12 ± 7,58 8,53 ± 10,54 3,60 ± 3,84a 8,99 ± 5,81 5,79 ± 4,05
BFR/BV
2,13 ± 2,06a 9,16 ±5,37 9,23 ± 5,93 4,39 ± 3,48a 12,93 ± 5,94a 2,21 ± 1,73a
FP
82,73 ± 41,06 65,94 ± 19,79 63,44 ± 10,02 64,94 ± 11,99 81,97 ± 95,63 88,63 ± 52,90
L.On.N/Ct.A
0,28 ± 0,27a 1,03 ± 0,52 1,26 ± 0,71 0,50 ± 0,36a 1,45 ± 0,47a 0,38 ± 0,26a
MAR
0,91 ± 0,33a 1,07 ± 0,19 0,98 ± 0,12a 1,06 ± 0,27 1,03 ± 0,23 0,85 ± 0,28a
MAR.Ec
0,48 ± 0,19a 0,75 ± 0,25 0,66 ± 0,15 0,66 ± 0,16 0,75 ± 0,14 0,63 ± 0,17
MAR.Ps
0,62 ± 0,24 0,69 ± 0,23 0,89 ± 0,95 0,54 ± 0,152a 0,66 ± 0,17 0,82 ± 0,15
MSBS.Ec
3,09 ± 6,49a 20,99 ± 18,04 25,19 ± 17,14 11,74 ± 14,41a 40,47 ± 24,68a 8,93 ± 15,39a
MSBS.Ps
1,81 ± 3,59a 10,03 ± 10,49 8,59 ± 5,73 3,86 ± 4,83a 11,00 ± 9,63 2,30 ± 3,76a
O.Wi
3,77 ± 0,92 4,04 ± 0,91 3,66 ± 0,67 3,96 ± 0,83 3,94 ± 1,13 3,76 ± 0,83
Rs.N/Ct.A
0,12 ± 0,17a 0,21 ± 0,13 0,28 ± 0,18 0,12 ± 0,07a 0,43 ± 0,26a 0,19 ± 0,18
W.Wi
63,23 ± 13,61 68,63 ± 15,09 61,36 ± 7,79 63,12 ± 17,35 65,28 ± 9,43 63,82 ± 8,31
omt
4,58 ± 1,26 3,87 ± 1,04 3,76 ± 0,70 3,86 ± 0,74 6,45 ± 13,85 5,07 ± 2,65
Po
1,32 ± 0,60a 2,61 ± 1,40 4,65 ± 4,78 2,23 ± 1,60 6,78 ± 4,23a 6,40 ± 4,22a
B.Ar
53,12 ± 5,50 52..82 ± 7,09 54,22 ± 5,97 54,94 ± 6,55 55,81 ± 6,24 58,16 ± 8,79a
Ct.Ar
37,40 ± 3,75 35,35 ± 5,04 37,61 ± 3,86 38-10 ± 4,83 40,96 ± 4,30a 40,83 ± 5,80a
Me.Ar
15,72 ± 4,07 17,47 ± 4,22 16,61 ± 3,77 16,84 ± 3,74 14,85 ± 4,72a 17,34 ± 6,05
Abreviaturas: OVX=ovariectomizado; PTH1: rhPTH(1-34) 1 pg/kg durante 18 meses; PTH1-W= retirada durante 6 meses despues del tratamiento con rhPTH(1-34) 1 m pg/kg durante 12 meses; PTH5= rhPTH(1-34) 5 pg/kg durante 18 meses; PTH5-W= retirada durante 6 meses despues del tratamiento con rhPTH(1-34) 5 pg/kg durante 12 meses. a°Estadfsticamente significativo en comparacion con los controles OVX (p < 0,05). bVease la tabla 4.2 para la descripcion de las variables
cDatos expresados como media ± error tipico de la media (SEM).__________________________________________
Los analisis mediante histomorfometna y microscopia de infrarrojos polarizada de transformada de Fourier revelaron que la administracion de PTH mejoraba la calidad osea al reemplazar el hueso viejo (cristalitos grandes) con hueso joven (intervalo de tamano de cristalitos con tendencia a un tamano menor). Ademas, tras la retirada de la PTH de monos administrados a dosis bajas, existe un beneficio adicional, ya que la matriz se mineraliza optimamente y los cristalitos maduran. Los datos derivados de histomorfometna y microscopia infrarroja de transformada de Fourier muestran un inesperado beneficio sobre la calidad osea del hueso cortical, ya que al aparecer la mineralizacion optima, la fase mineral madura.
Estudios de modelacion de elementos finitos tridimensionales
El examen de la lamina media de 500 pm de L-5 mostro un aumento de un 21 % de la BMD para PTH en comparacion con ovariectomizados que era debido a un aumento del 27 % del BMC sin cambios en la superficie transversal. El analisis del centro de los grupos de PTH mostro un aumento de un 73 % de BV/TV que era debido a una aumento de un 30 % de Tb.Th y un Tb.N un 37 % mayor en comparacion con los animales ovariectomizados. Los analisis de conectividad para esta region mostraron una densidad nodal mayor que un 140% (volumen de nodo/tejido) y un 286 % mas de soportes nodo a nodo para las vertebras del grupo de PTH.
El analisis de distribucion de histograma de las densidades de voxtel oseo para PTH mostro una reduccion de la proporcion de densidades bajas (0-355 mg/cm3), un aumento de las densidades medias (356-880 mg/cm3), con poco efecto sobre los voxteles de densidad alta (887-1200 mg/cm3) en comparacion con los animales ovariectomizados (Fig. 8). Lo mas notable fue el desplazamiento a una mayor densidad de voxtel oseo en el compartimiento de hueso cortical despues de la retirada del tratamiento durante 6 meses (figura 8).
Se calculo la proporcion de elementos oseos vertebrales (voxteles) que entraba dentro de un cierto intervalo de valores de BMD. Los intervalos de BMD elegidos fueron los siguientes: BMD baja, 0-300 mg/cm3; BMD media, 300-
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700 mg/cm3; BMD alta, 700-1000 mg/cm3; y BMD cortical > 1000 mg/cm3 (Tabla 13). En comparacion con los controles ovariectomizados, el tratamiento con PTH redujo significativamente el volumen oseo de BMD baja y aumento el volumen oseo de la BMD media. Despues de la retirada de la PTH, hubo una reduccion del hueso de BMD media y un aumento del hueso de BMD alta, indicando que el hueso de BMD media se hizo mas denso.
Tabla 13. Porcentajes de volumen vertebral de L5 agrupados por valores de BMD (media ± SEM)
Tratamiento
BMD baja (%) BMD media (%) BMD alta (%) BMD cortical (%)
ovariectomizados
30,4±2,2 48,7±1,6 19,9±1,2 0,9±0,3
PTH
17,7±1,6* 58,9±1,9* 22,8±2,7 0,6±0,3
PTH-W
22,4±1,3* 49,7±1,2 27,0±1,6* 0,8±0,2
Tabla 14. BMC al nivel medio de la vertebra L5 y tension eficaz de la vertebra
Tratamiento
BMC (mg) Tension eficaz (sin tension)
ovariectomizados
37,2±1,6 701±64
PTH
47,4±1,5* 447±36*
PTH-W
44,2±1,2* 539±34*
*Estadfsticamente diferente (p < 0,05 mediante la prueba PLSD de Fisher).
Los datos resumidos en la figura 8 muestran que la vertebra L5 de monos cynomolgus tratados durante 18 meses con PTH responden con aumentos significativos de la masa osea, el espesor trabecular y la conectividad trabecular, con efectos marginales sobre las dimensiones externas (superficie X) de la vertebra. El analisis de la distribucion de los elementos oseos en L5 mostro que las regiones oseas fuertemente mineralizadas cambian mmimamente sin evidencia de esclerosis osea. En su lugar es el hueso trabecular poroso el que mas respondfa a la PTH. El desplazamiento de la BMD condujo a una reduccion sustancial de la deformacion axial, indicando una mejora mecanica. Como se muestra claramente en los histogramas de PTH y BMD de ovariectoirna, la PTH convirtio los voxteles oseos de densidad baja en voxteles oseos de densidad media sin efecto significativo sobre los voxteles de densidad alta.
Los datos resumidos en la tabla 2 muestran que el BMC en la parte central de las vertebras aumento significativamente con el tratamiento con PTH y un efecto beneficioso de PTH permanecio a los 6 meses de la retirada. La tension mecanica promedio en la vertebra se redujo un 36 % mediante el tratamiento con PTH y se mantuvo un 23 % por debajo de los OVX despues de la retirada de PTH. Este estudio indica que el retiro del tratamiento con PTH durante 6 meses no condujo a la reabsorcion del hueso recien formado, sino que en cambio hubo una redistribucion beneficiosa del hueso de densidad media en hueso de densidad mas baja y mas alta. Esta redistribucion condujo a una reduccion continuada de la deformacion en las vertebras y, por tanto, a una funcion mecanica mejorada.
Discusion
Este estudio en primates indica que la PTH, administrada en ausencia de otros medicamentos que podnan afectar al hueso, beneficia tanto al hueso cortical como trabecular aumentando la masa osea esqueletica total. Ademas, la retirada de la PTH no dio como resultado una perdida significativa de los beneficios asociados al tratamiento con PTH durante un periodo de al menos 2 ciclos de remodelacion.
Se han utilizado marcadores sustitutos en los demas ensayos para indicar la actividad en hueso, y se supone que los cambios de valor reflejan cambios en la masa osea. Aunque existen publicados datos de seres humanos y primates que muestran que aumentan tanto los marcadores de formacion como de resorcion consistentemente con la activacion del recambio oseo, por ejemplo durante el inicio de la menopausia o en estados patologicos activos, el recambio alto es considerado indicativo de perdida osea. En la adolescencia, se ha estudiado menos un recambio alto durante la maduracion del esqueleto humano, pero esta acompanado por una ganancia anabolica de masa osea. Dicho fenomeno sena totalmente inesperado en la terapia con farmacos de la osteoporosis, segun la tecnica actual. Por tanto, el aumento de los marcadores de recambio oseo es inconsistente con el efecto anabolico conocido de la PTH de aumentar la masa y resistencia oseas, como muestran los datos en el presente estudio.
Los datos de este estudio de 18 meses en monos cynomolgus apoyan los siguientes inesperados descubrimientos:
• Aumento significativo general de la masa esqueletica total
• Aumento significativo de la masa y la resistencia oseas en el cuello femoral.
• Ninguna evidencia de "robo" de hueso cortical para aumentar el hueso trabecular. El aumento de la masa y la
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resistencia oseas fue estadfsticamente significativo en los sitios enriquecidos por hueso cortical (cuello femoral) o hueso trabecular (vertebras lumbares). En los sitios de hueso puramente cortical (diafisis media femoral), hubo una tendencia de la PTH a estabilizar o aumentar ligeramente la masa y resistencia oseas, en comparacion con los controles ovariectomizados.
• Los cambios en los marcadores oseos en monos ovariectomizados (y seres humanos) no reflejan los efectos anabolicos beneficiosos de la PTH sobre el esqueleto. uso de fluidos corporales de primates en el presente estudio permite el desarrollo de nuevos y mas validos marcadores sustitutos.
• La retencion de la ganancia de masa y resistencia oseas durante al menos 2 ciclos de remodelacion despues de la retirada del tratamiento.
Este estudio de PTH en primates difiere de los estudios publicados sobre monos Rhesus y cynomolgus en que se utiliza un gran tamano de muestra para proporcionar una apropiada potencia estadfstica para detectar diferencias que pueden no haber sido evidentes en estudios mucho menores anteriores; los controles inclman tanto primates ovariectomizados (utilizados en estudios publicados) como primates operados simuladamente, pero intactos. El ultimo grupo de control no se ha resenado anteriormente en este tipo de estudio, de modo que algunos de los beneficios de la PTH y el restablecimiento de ciertas medidas a los niveles del control simulado, en comparacion con los valores para animales ovariectomizados, se evaluaron por primera vez.
Conclusiones
Este estudio de 18 meses en monos Cynomolgus maduros silvestres ovariectomizados (OVX), Macaca fascicularis, aseguro la eficacia y seguridad en el hueso despues del tratamiento con rhPTH(1-34) durante 12 meses seguidos de retirada del tratamiento durante 6 meses, o tratamiento durante 18 meses. La rhPTH(1-34) aumento significativamente la masa y resistencia oseas de la columna y el cuello femoral por encima de los controles ovariectomizados hasta niveles equivalentes o mayores a los de los controles simulado. En monos ovariectomizados tratados con rhPTH(1-34), las medidas de homeostasis de calcio (calcio, fosfato y 1,25-dihidroxivitamina D sericos) se restablecieron a las de los controles simulados. Las medidas de suero, orina e histomorfometna utilizadas para evaluar el recambio oseo mostraron que la rhPTH(1-34) mantema velocidades de formacion equivalentes o mayores a las de los controles ovariectomizados, mientras que los marcadores bioqmmicos de la resorcion osea permanedan equivalentes a los de los controles simulados. En todos los animales tratados con rhPTH(1-34) durante hasta 18 meses, las medidas farmacocineticas no cambiaron con el tiempo, y no hubo acumulacion de rhPTH(1-34). No hubo evidencia de hipercalcemia sostenida ni patologfa renal despues de 18 meses de tratamiento. No hubo cambios en los periodos de mineralizacion o remodelacion. La ganancia neta de contenido mineral oseo esqueletico observada con rhPTH(1-34) puede explicarse por el aumento de la velocidad de formacion de hueso y la superficie de formacion de hueso con poco o ningun efecto sobre la resorcion osea. Hubo aumentos significativos del contenido mineral oseo, la densidad mineral osea y las medidas biomecanicas de resistencia, incluyendo tenacidad y rigidez, en sitios clmicamente relevantes tales como la columna, el cuello femoral y la tibia proximal.
La rhPTH(1-34) aumento la velocidad de recambio en el hueso cortical del humero y del radio medios, pero no altero significativamente la masa osea ni las medidas biomecanicas de resistencia en comparacion con los controles ovariectomizados o simulados. Sin embargo, el aumento de la anchura cortical y/o superficie osea cortical es consistente con un aumento del momento de inercia transversal, una medida de resistencia y rigidez. La rhPTH(1- 34) no tuvo efectos significativos sobre las propiedades intrmsecas del material de hueso cortical. La formacion de hueso endocortical se estimulo, aumentando asf la anchura cortical y la porosidad intracortical. Parece que estos cambios de porosidad son responsables del mantenimiento de la elasticidad del hueso.
En monos, los 12 meses de tratamiento con rhPTH(1-34) seguidos de retirada durante 6 meses estuvieron asociados a ganancias de masa y resistencias oseas menores, pero todavfa significativas, en la columna y cuello femoral. Despues de la retirada, no se observaron efectos significativos sobre la diafisis de hueso cortical del humero y radio. Los marcadores oseos y la histomorfometna mostraron tendencias a volver a los valores de recambio medidos en los controles simulados.
Los estudios mecamsticos in vivo en roedores mostraron que los genes asociados a los resultados anabolicos de la rhPTH(1-34) estan estimulados a las 1 a 6 horas, y el aumento de las superficies de formacion de hueso puede detectarse a las 24 horas despues de la primera dosis en ausencia de efectos detectables sobre la resorcion. La rhPTH(1-34) parece agrupar osteoprogenitores en fase S, y estimular su diferenciacion en osteoblastos, aumentando asf rapidamente el porcentaje de superficies de formacion de hueso. Pueden administrarse inyecciones unicas o multiples de rhPTH(1-34) en un periodo de 1 hora para inducir el efecto anabolico en el hueso. Sin embargo, cuando se administra la dosis equivalente a ratas jovenes en forma de inyecciones multiples durante 6 u 8 horas, el efecto anabolico se anulo, sugiriendo que es necesaria una exposicion breve limitada a rhPTH(1-34) para inducir el efecto anabolico.
En resumen, la rhPTH(1-34) es anabolica en el hueso de monos y conejos, aumentando la masa osea y las medidas de resistencia biomecanica en sitios clmicamente relevantes tales como la columna lumbar y el cuello femoral mediante la estimulacion selectiva de la formacion de hueso. Los aumentos del recambio oseo, la formacion
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de superficie endocortical y la porosidad, detectados mediante histomorfometna en los sitios corticales, no altero la masa osea ni las medidas biomecanicas de resistencia osea, pero aumento el momento de inercia transversal al aumentar la superficie y/o la anchura osea cortical.
Estos estudios demuestran que la administracion de activadores de receptor de hormona paratiroidea, tales como PTH(1-34) recombinante humana, mejora la calidad osea tanto durante como despues del tratamiento. De hecho, la administracion de PTH una vez al dfa durante 18 meses, o a las mismas dosis durante 12 meses seguidos de una fase de retirada de 6 meses, mostro una notable mejora de la calidad del hueso cortical del humero analizado mediante histomorfometna y microscopia de infrarrojos polarizada de transformada de Fourier (FTIR). Este analisis revelo que la administracion de PTH mejoraba la calidad osea al reemplazar el hueso viejo (cristalitos grandes) con hueso joven (intervalo de tamano de cristalitos con tendencia a un tamano menor). Por tanto, la administracion de PTH puede aumentar la calidad osea cortical, mejorar la mineralizacion y acelerar la mineralizacion y el reemplazo de hueso viejo con hueso nuevo.
Ademas, tras la retirada de la PTH de monos administrados a dosis bajas, existe un beneficio adicional, ya que la matriz se mineraliza mas optimamente y los cristalitos maduran. Es decir, a dosis bajas la PTH puede tener beneficios adicionales durante la fase de retirada del tratamiento potenciando la mineralizacion. Estos datos indican los beneficios de un regimen finito de tratamiento con PTH seguido de un periodo de retirada para conseguir el beneficio potenciado. Las definiciones actuales de calidad osea no incluyen estos aspectos de la mineralizacion mejorada.
En los estudios iniciales de una fase de tratamiento con PTH seguida de una fase de no tratamiento, la fase de tratamiento era de menos de 1 mes. La fase de tratamiento prolongado pero finito de 18-24 meses seguida por un periodo de al menos 2 ciclos de remodelacion no se ha explorado previamente. El beneficio continuado en primates despues de la retirada del tratamiento esta en marcado contraste con los resultados conseguidos en roedores tras dosificacion con PTH. Los estudios en ratas han mostrado uniformemente que el hueso se pierde rapidamente despues de la retirada del tratamiento. Gunness-Hey, M. y Hock, J. M. (1989) Bone 10: 447-452; Shen, V. et al. (1993) J. Clin Invest 91: 2479-2487; Shen, V. et al. (1992) Calcif. Tissue Int. 50: 214-220; and Mosekilde, L. et al. (1997) Bone 20: 429-437.
Dicho procedimiento de potenciar la mineralizacion osea no se ha observado anteriormente y es inesperado, revelando un nuevo procedimiento mediante el cual la PTH refuerza y endurece el hueso y puede prevenir fracturas. Este nuevo procedimiento incluye potenciar y regular la mineralizacion para proporcionar hueso mas tenaz, mas ngido y mas resistente a la fractura. Dichos efectos beneficiosos requieren mas que una nueva formacion de matriz. Estos descubrimientos indican que la PTH tiene beneficios en pacientes con huesos o esqueletos inmovilizados o en esqueletos deficientes en mineral, con la condicion de que exista tambien un suplemento adecuado de calcio y vitamina D.
Ejemplo 3 - Resistencia y densidad osea aumentadas y fracturas reducidas tras la administracion de rhPTH(1-34) a seres humanos
Numero de sujetos
Criterios de diagnostico e inclusion: Dosificacion y administracion:
rhPTH(1-34): 1093 inscritos, 848 terminaron.
Placebo: 544 inscritos, 447 terminaron.
Mujeres de 30 a 85 anos de edad, posmenopausicas durante un mmimo de 5 anos, con un mmimo de una fractura vertebral traumatica moderada o dos leves.
Producto de analisis (ciego)
rhPTH(1-34): 20 |jgMa, administrado por via subcutanea rhPTH(1-34): 40 |jgMa, administrado por via subcutanea Terapia de referencia (ciego)
Material de estudio placebo para inyeccion
Duracion del rhPTH(1-34): 17-23 meses (excluyendo la fase de preinclusion de 6 meses) tratamiento:
Placebo: 17-23 meses (excluyendo la fase de preinclusion de 6 meses)
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Criterios de Rayos X de la columna; marcadores biologicos sericos (calcio, fosfatasa alcalina espedfica de
evaluacion: hueso, propeptido carboxi-terminal de procolageno I); marcadores de orina (calcio, N-
telopeptido, desoxipiridinolina libre); 1,25-dihidroxivitamina D; densidad mineral osea: columna, cadera, muneca y cuerpo entero; altura; farmacocinetica de la poblacion; biopsia osea (sitios de estudio seleccionados).
Caracteristicas de los pacientes
Placebo (N=544) PTH-20(N=541) PTH-40(N=552) Valor p
Caucasicos
98,9 % 98,9 % 98,4% 0,672
Edad
69,0±7,0 69,5±7,1 69,9±6,8 0,099
Anos en menopausia
20,9±8,5 21,5±8,7 21,8±8,2 0,273
Histerectomizadas
23,8 % 23,1 % 21,6 % 0,682
Utero + 0 o 1 ovario
57 51 58
Utero + 2 ovarios
61 57 51
Desconocido
11 17 10
Uso previo de farmacos para la
14,9 % 15,5 % 13,0 % 0,479
osteoporosis BMD basal de la columna
0,82±0,17 0,82±0,17 0,82±0,17 >0,990
N.° basal de fc. vertebral 0
54 (10,4%) 45 (8,8%) 54 (10,1 %) >0,990
1
144 (27,8 %) 159 (31,1 %) 169 (31,6 %)
2
128 (24,7 %) 128 (25,0 %) 125 (23,4 %)
3
75 (14,5%) 67 (13,1 %) 81 (15,1 %)
4
59 (11,4%) 49 (9,6 %) 45 (8,4 %)
5
28 (5,4 %) 31 (6,1 %) 21 (3,9%)
6
13 (2,5%) 20 (3,9%) 25 (4,7%)
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6 (1,2 %) 7 (1,4 %) 10 (1,9%)
8
9 (1,7 %) 5 (1,0 %) 3 (0,6 %)
9
1 (0,2 %) 0 2 (0,4 %)
10
1 (0,2 %) 1 (0,2 %) 0
Sin especificar
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Resultados
Los datos de este ensayo clmico se indican en las tablas 15-19.
La Tabla 15 ilustra datos que muestran la reduccion tras el tratamiento con PTH del numero y la gravedad de fracturas vertebrales. Comparando todos los pacientes tratados con PTH con el placebo, la reduccion total en el numero de pacientes con fracturas vertebrales fue del 67 % (p < 0,001), con una reduccion del 65 % (p < 0,001) con PTH 20 m g/dfa en comparacion con el placebo y una reduccion del 69 % con PTH 40 m g/dfa en comparacion con el placebo (Tabla 15). Comparando todos los pacientes tratados con PTH con el placebo, la reduccion total en el numero de pacientes con fracturas vertebrales multiples fue del 81 % (p < 0,001), con una reduccion del 77 % (p < 0,001) con PTH 20 m g/dfa en comparacion con el placebo y una reduccion del 86 % con PTH 40 m g/dfa en comparacion con el placebo. Comparando todos los pacientes tratados con PTH con el placebo, la reduccion total en el numero de pacientes con fracturas vertebrales moderadas o graves fue del 84 % (p < 0,001), con una reduccion del 90 % (p < 0,001) con PTH 20 m g/dfa en comparacion con el placebo y una reduccion del 78 % con PTH 40 m g/dfa en comparacion con el placebo (Tabla 15).
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Tabla 15. Efecto del tratamiento con PTH sobre el numero y la gravedad de las fracturas vertebrales.
Placebo (n*=448) 20 jgMa de PTH (n=444) 40 jg/dfa de PTH (n=434)
Numero y porcentaje de pacientes con fracturas vertebrales nuevas
64 22 19
(14,3 %)
(5,0%) (4,4 %)
Numero y porcentaje de pacientes con 2 o mas fracturas vertebrales nuevas
22 5 3
(4,9%)
(1,1 %) (0,7%)
Numero y porcentaje de pacientes con fracturas moderadas o graves**
42 4 9
(9,4 %)
(0,9%) (2,1 %)
*n = numero de pacientes con radiograffas basales y de punto final
**La fractura moderada da como resultado una perdida de mas del 25 % de la altura vertebral (o una medida equivalente). La fractura grave da como resultado una perdida de mas del 40 % de la altura vertebral (o una medida equivalente). Las fracturas son como definen Genant et al. (1993) Vertebral fracture assessment using a semiquantitative technique; J. Bone & Min Res 81137-1148.______________________
La tabla 16 ilustra el efecto del tratamiento con PTH sobre el numero de fracturas en diversos huesos no vertebrales en todo el cuerpo. El numero de fracturas se reduce aparentemente en cada uno de los sitios de cadera, radio, tobillo humero, costillas, pie, pelvis y otros (Tabla 16). La reduccion es estadfsticamente significativa cuando se observa como la reduccion del numero total de fracturas entre los pacientes tratados con PTH en comparacion con los pacientes tratados con placebo. La reduccion es aun mas significativa cuando se considera como la reduccion del numero total de fracturas de cadera, radio, tobillo, humero, costillas, pie y pelvis entre los pacientes tratados con PTH en comparacion con los pacientes tratados con placebo (Tabla 16).
Tabla 16. Efecto del tratamiento con PTH sobre el numero de fracturas no vertebrales.
Valores p
Placebo (N=544) PTH-20(N=541) PTH-40(N=552) Global PTH-pbo* 20-pbo 40-pbo
Cadera
4 2 3 0,718 0,474 0,417 0,690
Radio
13 7 10 0,404 0,236 0,180 0,504
Tobillo
4 2 2 0,601 0,313 0,417 0,403
Humero
5 4 3 0,767 0,534 0,744 0,465
Costillas
10 5 5 0,277 0,109 0,197 0,184
Pie
4 1 4 0,374 0,474 0,181 0,983
Pelvis
3 1 0 0,171 0,076 0,319 0,081
Otros
16 14 9 0,338 0,296 0,723 0,146
Total
53 34 32 0,024 0,007 0,036 0,015
Total sin "Otras"
41 21 24 0,013 0,003 0,010 0,025
*Placebo (pbo)
El efecto de la PTH sobre el contenido mineral (BMC), la densidad mineral osea (BMD) y la superficie osea se determinaron mediante absorciometna de energfa dual (DEXA), y los resultados se indican en la Tablas 17-19. La administracion de PTH causo aumentos aparentes del BMC en la columna, el femur, la cadera y la muneca del paciente y en el cuerpo entero del paciente (Tabla 17). El tratamiento con PTH causo aumentos significativos de la BMD del paciente en la columna, el femur y la cadera (Tabla 18). Los aumentos en la columna, el femur y la cadera eran estadfsticamente significativos, con p < 0,001 (Tabla 18). La superficie osea aumento aparentemente tras el tratamiento con PTH para la columna, el femur y la cadera del paciente (Tabla 19). Los aumentos fueron significativamente estadfsticos para la columna lumbar y el cuello de la cadera (Tabla 19).
El efecto de la PTH sobre el cuerpo entero, la medida de la cantidad y calidad osea BMC, es particularmente significativo. Este efecto sobre el cuerpo entero indica que la cantidad de hueso en el cuerpo del paciente esta aumentando. La PTH no da como resultado unicamente el movimiento de masa osea de una parte del cuerpo a otra. En su lugar, el tratamiento con PTH aumenta la cantidad y calidad de hueso en el cuerpo del paciente.
Las figuras 9 y 10 ilustran los aumentos con el tiempo de la BMD de la columna lumbar y la BMD del cuello
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femoral/de cadera, respectivamente, para pacientes tratados con PTH y pacientes control tratados con placebo. La BMD de columna lumbar del paciente aumenta continuadamente durante al menos 18 meses, sin aumento o menos significativo durante los meses posteriores. La BMD del femur/cadera del paciente aumenta aparente-mente durante al menos 18 meses, y puede aumentar tras la duracion adicional del tratamiento con PTH.
Tabla 17. Efecto de la PTH sobre el contenido mineral oseo expresado como % de cambio en el punto final (SD) ______________________________con respecto al valor basal_______________________________
Placebo PTH-20 PTH-40 Valor p
Columna lumbar
1,60 (6,92) 11,85 (8,83) 16,62 (11,1) < 0,001
Femur/Cadera
Total
-0,38 (5,18) 3,50 (6,26) 4,78 (6,70) < 0,001
Cuello
-0,51 (7,06) 2,99 (7,26) 5,80 (8,71) < 0,001
Trocanter
0,98 (14,97) 5,68 (15,58) 6,53 (15,33) < 0,001
Intertrocanter
-0,23 (6,28) 3,59 (7,32) 4,99 (7,79) < 0,001
Triangulo de Ward
0,01 (14,75) 5,36 (14,78) 8,86 (17,02) < 0,001
Muneca
Ultradistal
-1,67 (7,44) -0,25 (6,53) -1,88 (7,97) 0,184
1/3 radio
-1,19 (6,12) -1,37 (4,51) -3,04 (6,09) 0,025
Cuerpo entero
-0,74 (4,76) 1,30 (4,48) 2,28 (5,44) < 0,001
Tabla 18. Efecto de la PTH sobre la densidad mineral osea expresado como % de cambio en el punto final (SD)
con respecto al valor basal
Placebo PTH-20 PTH-40 Valor p
Columna lumbar
1,13 (5,47) 9,70 (7,41) 13,7 (9,69) < 0,001
Femur/Cadera
Total
-1,01 (4,25) 2,58 (4,88) 3,60 (5,42) < 0,001
Cuello
-0,69 (5,39) 2,79 (5,72) 5,06 (6,73) < 0,001
Trocanter
-0,21 (6,30) 3,50 (6,81) 4,40 (7,45) < 0,001
Intertrocanter
-1,29 (4,53) 2,62 (5,52) 3,98 (5,96) < 0,001
Triangulo de Ward
-0,80 (11,73) 4,19 (11,93) 7,85 (13,24) < 0,001
Muneca
Ultradistal
-1,89 (7,98) -0,05 (7,14) -1,76 (7,20) 0,108
1/3 radio
-1,22 (3,37) -1,94 (4,07) -3,17 (4,62) 0,001
Tabla 19. Efecto de la PTH sobre la superficie osea expresado como % de cambio en el punto final (SD) con _______________________________respecto al valor basal_________________________________
Placebo PTH-20 PTH-40 Valor p
Columna lumbar
0,46 (2,97) 2,52(3,52) 3,34 (3,72) < 0,001
Femur/Cadera
Total
0,54 (3,02) 0,84(3,16) 1,05 (2,98) 0,144
Cuello
0,04 (4,60) 0,27(4,91) 0,81 (5,56) 0,035
Trocanter
0,95 (12,75) 1,99 (12,16) 1,92 (11,30) 0,197
Intertrocanter
1,01 (5,17) 1,01 (4,99) 1,01 (4,89) 0,964
Triangulo de Ward
0,44 (7,60) 1,13(7,34) 0,99 (8,06) 0,309
Muneca
Ultradistal
0,25 (6,40) -0,25 (6,00) -0,39 (4,80) 0,653
1/3 radio
-0,02 (5,73) 0,52(3,40) 0,01 (4,42) 0,586
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En resumen, los datos presentados anteriormente indican que los pacientes tratados con PTH tienen fracturas reducidas. Espedficamente, el tratamiento con PTH redujo en mas de un 66 % el numero de pacientes con fracturas vertebrales anteriores que padecio nuevas fracturas vertebrales. El tratamiento con PTH redujo tambien en mas de un 78 % el numero de pacientes con fractura vertebrales anteriores que padecio nuevas fracturas vertebrales multiples. Ademas, la PTH redujo la gravedad de las fracturas vertebrales, con una significativa reduccion del 78 % del numero de pacientes con fracturas moderadas o graves. Los pacientes que recibieron PTH se beneficiaron de una significativa reduccion de todas las fracturas no vertebrales (incluyendo fracturas de cadera, radio, muneca, pelvis, pie, humero, costillas o tobillo) con una significacion al nivel de p < 0,007. La calidad osea aumenta tambien. Los pacientes con fractura anterior se beneficiaron de un aumento significativo del contenido mineral oseo de la cadera, la columna y el cuerpo entero. Este aumento indica que la reduccion de fracturas en estos sitios puede aparecer tan temprano como despues de 12 meses de terapia.
Discusion
Estos datos sobre fracturas son los primeros datos sobre reduccion de fracturas por PTH en seres humanos. Estos descubrimientos demuestran una mejora de la calidad osea y la resistencia osea, como los datos preclmicos resenados anteriormente en el presente documento. Estos resultados muestran tambien los beneficios en la calidad y resistencia oseas en sitios no vertebrales. Los descubrimientos de una reduccion del numero de fracturas sostenida durante el periodo de 18-23 meses de tratamiento no se ha observado anteriormente en estudios clmicos o preclmicos.
La cuestion de si la PTH sola aumenta la tenacidad y resistencia del hueso para mejorar la resistencia a la fractura no se ha ensayado anteriormente en seres humanos. La bibliograffa publicada ha sugerido consistentemente que la PTH debe administrarse en combinacion con un antirresortivo o estrogeno. Los ensayos clmicos publicados anteriormente inclman poblaciones de pacientes demasiado pequenas para determinar una reduccion significativa de las fracturas. En un estudio, los beneficios de la PTH no pudieron evaluarse porque no habfa controles de placebo. En un segundo estudio, empleando la definicion habitualmente aceptada de fractura, no se observo reduccion de las fracturas.
Los descubrimientos de una reduccion de las fracturas en sitios no vertebrales combinados es particularmente inesperada a la vista de la creencia comun de que la PTH tiene efectos negativos en estos sitios. El dogma comun sostiene que la PTH aumentara la porosidad cortical y, por lo tanto, debilitara el hueso, especialmente al inicio de la terapia. Ademas, este dogma afirma que los sitios de hueso cortical son de alto riesgo de fractura y que la PTH no ofrecera beneficios en la reduccion de fracturas en sitios no vertebrales. El dogma sostiene tambien que la PTH sola es improbable que sea eficaz, y que requerira terapia antirresortiva simultanea para bloquear los efectos negativos sobre el hueso cortical. Los presentes datos demuestran los beneficios anteriormente no observados de la PTH administrada a pacientes que reciben suplementos de vitamina D y calcio. Inesperadamente, la PTH refuerza el hueso reduciendo el numero de nuevas fracturas en un paciente con riesgo de fracturas multiples de la columna, con riesgo de fracturas no vertebrales adicionales o con riesgo de fracturas moderadas a graves de la columna o similares.
Este estudio clmico en mujeres posmenopausicas mostro los beneficios particulares de tratar pacientes con dosis bajas (20 jgMa), puesto que se redujo la dosis de PTH (que a dosis altas podna mostrar efectos secundarios en algunos pacientes), pero se retuvo una prevencion y reduccion de fracturas similares a las observadas a la dosis alta (40 jg/dfa). Los datos FT-IR de monos proporcionan una posible explicacion mecamstica, pero no limitante. El estudio en monos muestra que la PTH en dosis bajas aumento la formacion de cristales y acelero la mineralizacion en el hueso cortical. Ademas, los monos con dosis bajas mostraron beneficios adicionales despues de la retirada, ya que la PTH potencio el contenido mineral oseo. Los presentes datos demuestran el nuevo descubrimiento de que la PTH administrada a dosis bajas a pacientes que reciben suplementos de vitamina D y calcio es eficaz en la prevencion tanto de fracturas vertebrales como no vertebrales. Al contrario que la creencia popular, la PTH refuerza el hueso en los sitios no vertebrales previniendo nuevas fracturas o reduciendo la gravedad de las fracturas, aparentemente mejorando la mineralizacion y el contenido mineral oseo.

Claims (13)

  1. 5
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    15
    20
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    Reivindicaciones
    1. PTH(1-34) humana para su uso en la prevencion o reduccion de la incidencia de fractura vertebral y no vertebral en un ser humano con o en riesgo de progresar a osteoporosis, en el que la PTH(1-34) se administra por inyeccion subcutanea a una dosis de 20 pg/dfa, en la que el ser humano tambien recibe dosis eficaces de calcio y vitamina D; y la PTH(1-34) se formula con un tampon y un excipiente, con un agente tampon capaz de mantener la solucion a un intervalo de pH de 3 a 7.
  2. 2. PTH(1-34) humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el agente tampon es capaz de mantener la solucion a un intervalo de pH de 3 a 6.
  3. 3. PTH(1-34) humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que el agente tampon es acetato, tartrato o citrato.
  4. 4. PTH(1-34) humana para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que la concentracion del tampon esta en el intervalo de 2 mM a 500 mM.
  5. 5. PTH(1-34) humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que la concentracion del tampon esta en el intervalo de 2 mM a 100 mM.
  6. 6. PTH(1-34) humana para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que la PTH(1-34) se formula en una solucion estabilizada que incluye un agente estabilizante, un agente tampon, y un conservante.
  7. 7. PTH(1-34) humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que el conservante se selecciona de cresoles, alcohol bendlico, fenol, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorobutanol, alcohol feniletflico, metilparabeno, propilparabeno, timerosal y nitrato fenilmercurico y acetato.
  8. 8. PTH(1-34) humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que el conservante es m-cresol o alcohol bendlico.
  9. 9. PTH(1-34) humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que el conservante es m-cresol.
  10. 10. PTH(1-34) humana para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que la cantidad de conservante vana de 0,1 a 2 de % en peso de la solucion total.
  11. 11. PTH(1-34) humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que la cantidad de conservante vana de 0,3 a 1,0 de % en peso de la solucion total.
  12. 12. PTH(1-34) humana para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que el humano es una mujer.
  13. 13. PTH(1-34) humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que la mujer es una mujer posmenopausica.
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