NO323984B1 - Anvendelse av paratyroidhormon for fremstilling av et preparat for a redusere benfraktur - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av paratyroidhormon for fremstilling av et preparat for å redusere benfraktur. Mer spesielt angår foreliggende oppfinnelse anvendelse for å øke hardheten eller stivheten til et ben på et sete med potensiell eller virkelig traume, slik som hofte eller ryggrad til en person med risiko for å få osteoporose. Mer spesielt angår foreliggende oppfinnelse anvendelse for å redusere tilfeller av ryggvirvelfraktur, redusere sannsynligheten for multiple ryggvirvelrfakturer, redusere alvorligheten av ryggvirvelfrakturer, og/eller redusere forekomsten av ikke-ryggvirvelfrakturer.

The Lancet, vol. 350,23. aug. 1997, s. 550-555, R. Lindsay et al, beskriver anvendelse av PTH eller hPTH (1-34) i terapeutiske preparater for osteoporose.

JP-A-08073376 beskriver anvendelse av hPTH (1-34) i farmasøytiske preparater til post-menopausale kvinner med osteoporose.

Fra WO-A1-98/144778 er det kjent å anvende PTH, særlig hPTH (1-34) for å fremme bendannelse hos post-menopausale kvinner som har osteoporose.

Eksisterende midler slik som østrogen, bifosfonater, fluorid eller kalsitonin kan hindre bentap og gi en 3-5 % økning av benmasse med å etterfylle ombyggingsområdet, men netto bendannelse ble ikke signifikant stimulert. Retensjonen av ben ved inhibering av benturnover trenger ikke å være tilstrekkelig beskyttelse overfor frakturrisiko for pasienter som allerede har hatt signifikant bentap. Anabole midler som øker benstyrken ved å stimulere bendannelse kan foretrukket gi bedre beskyttelse mot frakturer hos pasienter med etablert osteoporose.

Paratyroidhormon (PTH) er et utskilt 84 aminosyreprodukt av pattedyrs paratyroid-kjertel som kontrollerer serumkalsiumnivåer gjennom dens virkning på forskjellige vev, som inkluderer ben. De N-terminale 84 aminosyrene til bovin og humant PTH (PTH(1-34)) anses biologisk ekvivalent med fullengdehormonet. Andre aminoterminale fragmenter av PTH (som inkluderer 1-31 og 1-38 for eksempel) eller PTHrP (PTH-relatert peptid/protein) eller analoger av den enkelte eller begge, som aktiverer PTH/PTHrP reseptoren (PTH1 reseptor) har vist lignende biologiske aktiviteter på benmasse, selv om rekkevidden av slike effekter kan variere.

Studier på mennesker med forskjellige former for PTH har vist en anabolsk effekt på ben, og har foranlediget signifikant interesse for dets anvendelse for behandling av osteoporose og relaterte benforstyrrelser. Signifikante anabole effekter av PTH på ben, som inkluderer stimulering av bendannelse som resulterer i en netto gevinst når det gjelder benmasse og/eller styrke, er blitt demonstrert i mange dyremodeller og hos mennesker.

Det er vanlig å anta at PTH administrasjon til mennesker og i relevante dyremodeller har en negativ effekt på kortikalt ben. Faktum er at naturlige forekommende økninger i endogent PTH, som finner sted i sykdommen hyperparatyroidisme, resulterer i fortynning av kortikalt ben ledsagende med en økning i bindeevnen og massen til trabekulært ben. Tidligere studier antar at haversk kortikalt ben (funnet hos mennesker og høyere pattedyr) remodelleres under påvirkning av PTH, det vil skje en omfordeling av ben slik at kortikal benmasse og styrke reduseres, mens trabekulært .ben øker i masse og styrke. For eksempel, i publiserte kliniske studier av administrering av PTH, har disse oppdagelsene om at kortikal benmassereduksjon etter behandling med eksogen PTH vakt bekymring om at PTH vil føre til redusert kortikal benmasse og styrke. En bekymring som slike studier bringer er at det vil være et tap av totalt skjelettbenmasse på grunn av tap av kortikalt ben. Dette er av høy klinisk relevans da, ved osteoporose, større tap av trabekulært ben sammenlignet med tap av kortikalt ben betyr at den mekaniske lasten først og fremst bæres av det resterende kortikale benet. Fortsatt tap av kortikalt ben vil øke frakturrisikoen. Derfor er det viktig at et terapeutisk middel for osteoporose opprettholder eller øker et subjekt kortikale benrester.

Effektene av PTH på kortikalt ben er blitt undersøkt blant ikke-humane pattedyr med haversk remodellering, slik som hunder, ildere, sauer og aper, men prøvestørrelsene er typisk for små for pålitelige statistiske analyser. Følgende åv forandringer indusert ved PTH behandling på mekaniske egenskaper til kortikalt ben hos slike dyr er fremdeles ukjent. Publiserte studier av gnagere har vist noe øket kortikal benmasse i løpet av administrasjon av PTH, men et tap av denne fordelen etter fjerning av PTH. Imidlertid har gnagerkortikalt ben en distinkt forskjellig struktor til forskjell fra haversk kortikalt ben og remodellerer ved overflatetilleggsdannelse og resorpsjon, isteden for intrakortikal remodellering av osteoner. Videre gir tekniske begrensinger i biomekanisk testing på de relativt korte benene til gnagere opphav til kunstige målinger når et middel, slik som et PTH, forandrer bengeometrien ved å gjøre benet tykkere. Disse kunstige målingene gjør ekstrapolering av rottekortikale benresponser til de som gjelder for mennesker eller andre dyr med osteonal remodellering upålitelig. Derfor indikerer eksisterende data for dyr, som mennesker, som gjennomgår haversk remodellering at PTH kan ha en uhelding påvirkning på kortikalt ben, som forårsaker netto benmassetap ved reduksjon av kortikalt ben.

Som en konsekvens av dette har det vært et populært syn med hensyn til PTH virkningen at pasienter krever samtidig eller etterfølgende behandling med et antiresorptiv for å minimalisere bentapet indusert ved PTH. I virkeligheten har denne modellen vært basis for flere kliniske studier hos kvinner. For eksempel har tre kliniske studier som anvender PTH hos postmenopausale kvinner og samtidig behandling med kalsitonin eller østrogen, eller i menopausale kvinner som tar GnRH agonist, Synarel, for endometriose. Det motsatte effektene av østrogen og PTH på kortikal benturnover gjør det særlig vanskelig å observere effekter av akkurat PTH i løpet av kombinasjons-terapi med disse to midlene.

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av et pararyroidhormon bestående av aminosyresekvens 1-34 til humant paratyroidhormon for fremstilling av et medikament for samtidig å redusere risiko for både vertebral og ikke-vertebral benfraktur hos en post-menopausal kvinne som har eller med risiko for å oppnå osteoporose, hvori nevnte medikament administreres ved subkutan injeksjon til nevnte kvinne uten samtidig administrasjon av et antiresorptivt middel forskjellig fra vitamin D eller kalsium, i en daglig dose på 20 ug i minst ca. 12 måneder opp til 3 år.

Anvendelsen kan øke hardhet eller stivhet på et sete for potensielt traume, slik som en hofte eller ryggraden til en person med osteoporose, eller et annet sete som har abnormalt lav benmasse eller dårlig benstruktur. Anvendelsen kan også øke benhardhet eller stivhet på et sete med et virkelig traume, slik som en fraktur, f.eks i en hofte eller vertebra. Et foretrukket subjekt for anvendelsen er en kvinne eller mann med risiko for å få osteoporose, foretrukket en postmenopausal kvinne, og er uavhengig av ledsagende hormonerstatningsterapi (HRT), østrogen eller lignende terapi, eller antiresorptiv terapi. I en utførelsesform mottar pasienten også tillegg av kalsium og/eller vitamin D.

Et paratyroidhormon, slik som de N-terminale aminosyrene 1-34 av rekombinant humant paratyroidhormon, kan administreres enten cyklisk eller periodisk. Foretrukket inkluderer cyklisk administrasjon administreringen av PTH i to eller flere remodelleirngscykler og fjerning av PTH i en eller flere remodelleringscykler. Videre kan økning i hardhet og/eller stivhet av et ben vare i flere remodelleirngscykler, eller opptil flere år, etter den siste administrasjonen av et paratyroidhormon.

Figurene IA og IB viser at BMD (benmineraltetthet) og BMC (benmineralinnhold) i lårmidtskaftet (kortikalben) (A) og i det proksimale lårbenet (cancellusben + kortikalben) (B) er signifikant høyere hos PTH behandlede dyr enn kontroll i begge doser. Figurene 2 A til og med 2D viser effekten av PTH på mekanisk styrke og tverrsnitts-treghetsmoment (CSMI) i kortikalt ben på lårmidtskaftet. Figur 3 illustrerer prosent forandring i DXA målinger av hele benmineralinnholdet hos kontroll og behandlingsgrupper. Figurene 4A-C illustrerer prosent forandring i DXA målinger av ryggraden for kontroll og behandlingsgrupper i den lumbare vertebra 2-4 for benareal (A), benmineralinnhold

(B) og benmineraltetthet (C).

Figurene 5A og 5B illustrerer økning i benmasse (A) og benstyrke (B) i lumbar vertebra

av primater behandlet med et paratyroidhormon.

Figurene 6A og 6B illustrerer økning i styrke av lårbennakke (A) og konstant styrke av humerus midt-diafyse (B) hos primater behandlet med et paratyroidhormon. Figur 7 illustrerer aktivering av bendannelseshastigheter på endosteale og periosteale overflater av midtskafthumerusen. Figur 8 illustrerer histogramanalyse av forandring i benvokaltetthet i lumbar vertrebra, som resultat av PTH behandling sammenlignet med kontroll. Bemerk økning i tetthet i kortikal benavdeling etter fjerning av PTH behandling. Figur 9 illustrerer økning i lumbar ryggrad BMD ved 23 måneders behandling av pasienter med enten 20 ug/dag PTH eller 40 ug/dag PTH, sammenlignet med placebobehandlede kontroller. Figur 10 illustrerer økning i lårben og hoftehals BMD i løpet av 24 måneders behandling av pasienter med enten 20 ug/dag PTH eller 40 ug/dag PTH, sammenlignet med placebobehandlede kontroller.

Slik det anvendes heri refererer endelig kraft til den maksimale kraften som en benprøve motstår; stivhet refererer til stigningen til en lineær del av en belastning-deformasjons-kurve; og arbeid til brudd refererer til området under belastnings-deformasjonskurven før brudd. Hver av disse kan måles og beregnes ved fremgangsmåter som er standard i benlitteratur. Disse parametrene er strukturelle egenskaper som avhenger av iboende materielle egenskaper og geometri, og kan bestemmes som beskrevet i Turner CH, Burr DB 1993 "Basic biomechanical measurements of bone: a tutorial." Bone 14:595-608. Endelig kraft, stivhet og arbeid til brudd kan normaliseres for å oppnå iboende materielle egenskaper slik som endelig stress, elastisk modulus og hardhet, som er uavhengig av størrelse og forni. Slik det anvendes heri refererer endelig stress til maksimalt stress som en prøve kan motstå; elastisk modulus refererer til materialets iboende stivhet og hardhet refererer til motstand mot fraktur per enhetsvolum. Hver av disse kan bestemmes ved fremgangsmåter kjent i litteraturen. Id. Lårbenstyrke, som referert til heri, kan måles ved lårhalsen, eller ved midtskaftet som typisk anvender trepunkts eller firepunktsbøying ved sistnevnte sete.

Anvendelsen ifølge oppfinnelsen er fordelaktig for et subjekt som lider av eller har lidd av traume for ett eller flere ben. Anvendelsen gjelder fordelaktig pattedyrsubjekter, slike som mennesker, hester, hunder og katter, særlig mennesker. Bentraume kan være et problem for veddeløpshester og hunder, også for kjeledyr. Et menneske kan lide av en hvilken som helst av de mange bentraumene f.eks på grunn av ulykke, medisinsk intervensjon, sykdom eller forstyrrelser. For unge er bentraume vanlig på grunn av fraktur, medisinsk intervensjon på grunn av reparasjon av en fraktur, eller reparasjon av ledd eller bindévevskade, f.eks på grunn av idrett. Andre typer bentraume, slik som de fra osteoporose, degenerativ bensykdom (slik som arteritt eller osteoartritt), hofteerstatning, eller sekundære tilstander tilknyttet behandling for andre systemiske tilstander (f.eks glukokortikoid osteoporose, brannskader eller organtransplantasjon) finnes vanligvis hos eldre mennesker.

Foretrukne subjekter inkluderer et menneske, foretrukket en kvinne, med risiko for å lide av osteoporose. Risikofaktorer for osteoporose er kjent i litteraturen og inkluderer hypogonadole tilstander hos menn og kvinner, uavhengig av alder, tilstander, sykdommer eller legemidler som induserer hypogonadisme, næringsmiddelfaktorer tilknyttet osteoporose (lavt kalsium eller vitamin D som det mest vanlige), røking, alkohol, legemidler tilknyttet bentap (slik glukokortikoider, tyroksin, heparin, litium, antikonvulsanter etc), tap av syn som forhåndsdisponerer til å svekkes. Romreise, immobilisering, kronisk hospitalisering eller sengeleie, eller andre systemiske sykdommer som er blitt tilknyttet øket risiko for osteoporose. Indikasjoner for tilstedeværelsen av osteoporose er kjent i litteraturen og inkluderer radiologiske bevis av minst en vertebral kompresjonsfraktur, lav benmasse (typisk minst 1 standardavvik under gjennomsnittlig normalverdier for ungdom), og/eller atraumiske frakturer.

Osteoporose kan for eksempel føre til vertebral og/eller ikke-vertebrale frakturer. Eksempler på ikke-vertebrale frakturer inkluderer hoftefraktur, en fraktur av en fjerntliggende underarm, en fraktur av en proksimal humurus, en fraktur av en vrist, en fraktur av en radius, en fraktur av en ankel, en fraktur av en numerus, en fraktur av et ribben, en fraktur av en fot, en fraktur av et bekken, eller en kombinasjon av disse. Anvendelsen ifølge oppfinnelsen kan brukes for å redusere risikoen for slike frakturer eller behandle slike frakturer. Risikoen for frakturer reduseres og behandlingen av frakturen gjøres ved å øke styrken og/eller stivheten til benet, f.eks i hoften, ryggraden eller begge. En typisk kvinne med risiko for osteoporose er en postmendpausal kvinne eller en premenopausal, hypogonadal kvinne. Et foretrukket subjekt er en postmenopausal kvinne, og er uavhengig av samtidig hormonerstatningsterapi (HRT), østrogen eller ekvivalent terapi, eller antiresorptiv terapi. Anvendelsen ifølge oppfinnelsen kan fordelaktig anvendes på et subjekt i et hvilket som helst stadie av osteoporose, men særlig i tidlige og fremskredne stadier.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en anvendelse som er særlig effektiv overfor forekomster av frakturer hos et subjekt med eller som har risiko for å utvikle osteoporose. For eksempel kan den foreliggende oppfinnelsen redusere forekomsten av vertebral og/eller ikke-vertebrale frakturer, redusere alvorligheten til vertebrale frakturer, redusere forekomsten av multiple vertebrale frakturer; forbedre benkvalitet og lignende. I en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen være fordelaktig for pasienter med lav benmasse eller tidlig fraktur som har risiko for å utvikle fremtidige multiple skjelettfrakturer, slik som pasienter hvori ryggradsosteoporose kan fremskride raskt. Andre subjekter kan også ha risiko for eller lide av bentraume og kan ha fordeler av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan ét bredt spekter av subjekter med risiko for en eller flere av frakturene definert ovenfor forvente kirurgi som resulterer i bentraume, eller kan gjennomgå en ortopedisk prosedyre som manipulerer et ben ved et skjelettsete med abnormalt lav benmasse eller dårlig benstruktur, eller underskudd av mineral. For eksempel, å få igjen funksjonen etter et kirurgisk inngrep, slik som ledderstatning (for eksempel kne eller hofte) eller ryggstøtte, eller andre prosedyrer som immobiliserer et ben eller skjellett kan bli bedre på grunn av oppfinnelsen. Oppfinnelsen kan også hjelpe til med å komme seg fra ortopediske prosedyrer som manipulerer et ben ved et sete med abnormalt lav benmasse eller dårlig benstruktur, som inkluderer kirurgisk deling av ben, som inkluderer osteomi, ledderstatning hvor tap av benstruktur krever restrukturering med acetabulum hofteskål og lindring av protesedrift, for eksempel. Andre egnede subjekter for å utføre den foreliggende oppfinnelsen inkluderer de som lider av hypoparatoridisme eller kyfosi, som kan gjennomgå traumer relatert til, eller forårsaket av, hypoparatyroidisme eller progresjon av kyfose.

Anvendelsen ifølge oppfinnelsen reduserer risikoen for traume eller hjelper til med å komme seg fra traume ved å øke benhardhet, stivhet, eller begge. Generelt kommer hardheten eller stivheten til benet fra masse og styrke til kortikal, trabekulær og cancellusben. Anvendelsen ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringe nivåer av benhardhet, stivhet, masse og/eller styrke innenfor eller over området for normal populasjon. Foretrukket tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen økte nivåer relativt til nivåer som kommer av traume eller gir opphav til risiko for traume. Økt hardhet, stivhet eller begge reduserer risikoen eller sannsynligheten for frakturer sammenlignet med ubehandlet kontrollpopulasj on.

Visse karakteristikker av ben når de øker tilveiebringer økt benhardhet og/eller stivhet. Slike karakteristikker inkluderer benmineraltetthet (BMD), benmineralinnhold (BMC), aktiveringsfrekvens eller bendannelseshastighet, trabekulærtall, trabekulærtykkelse, trabekulær eller annet bindemateriale, periosteal og endokortikalbendannelse, kortikal porøsitet, tverrsnittsbenområde og benmasse, motstand mot belastning og/eller arbeid ved brudd. En økning i en eller flere av disse karakteirstikkene er et foretrukket utkomme av anvendelsen ifølge oppfinnelsen.

Visse karakteristikker av ben, slik som margmellomrom og elastisk modulus, tilveiebringer økt hardhet og/eller stivhet av benet når de reduseres. Yngre (hardere og stivere) ben har krystalitter som generelt er mindre enn krystallittene til eldre ben. Således vil generelt reduksjon av benkrystallittstørrelsene øke hardheten og stivheten til benet og kan redusere forekomsten av frakturer. I tillegg kan modning av krystallittene til et ben tilveiebringe ytterligere ønskelige karakteristikker til benet, inkludert økt hardhet og stivhet av benet og/eller kan redusere forekomst av frakturer. Å redusere en eller flere av disse karakteirstikkene kan være et foretrukket utkomme av anvendelsen ifølge oppfinnelsen.

Anvendelsen ifølge oppfinnelsen er effektiv til å øke hardheten og/eller stivheten til et hvilket som helst av flere bentyper. For eksempel kan anvendelsen øke hardheten og/eller stivheten til ben som inkluderer et hofteben, slik som ilium, et leggben, slik som lårbenet, et ben fra ryggraden, slik som en vertebra, et ben fra en arm, slik som en fjern underarm eller en proksimal hemerus. Denne økningen i hardhet og/eller stivhet kan finnes i benet, eller lokalisert til visse deler av benet. For eksempel kan hardhet og/eller stivhet av et lårben økes ved å øke hardheten og/eller stivheten til en lårbenhals eller en lårbentrochantera. Hardhet og/eller stivhet av en hofte kan økes ved å øke hardheten og/eller stivheten til en hoftekam eller hofteryggmarg. Hardheten og/eller stivheten til en vertebra kan økes ved å øke hardheten og/eller stivheten til en pedikkel, lamina eller begge. Fordelaktig er effekten på vertebra i visse deler av ryggmargen, slik som cervical, torak, lumbar, sakral og/eller cyccygel vertebra. Fordelaktig er effekten på en eller flere midttorak og/eller øvre lubar vertebra.

Økningen i hardhet og/eller stivhet kan finnes i hver av typene av ben, eller foretrukket i en type ben. Typer av ben inkluderer porøst (cancellus, trabekulær eller lamellær) ben og kompakt (kortikal eller tett) ben og frakturkallusen. Anvendelsen ifølge oppfinnelsen øker foretrukket hardheten og/eller stivheten ved dens effekter på cancellus eller kortikalt ben, eller på kortikalt ben alene. Trabeuklært ben, ben til hvilket bindevev er festet kan også bli hardere og/eller stivere. For eksempel er det fordelaktig å tilveiebringe ytterligere hardhet til et festesete for et bånd, sene og/eller en muskel.

I en foretrukket utførelse angår oppfinnelsen en anvendelse hvori den daglige dosen administreres i minst ca. 24 måneder.

I en ytterligere utførelsesform angår oppfinnelsen anvendelsen ifølge oppfinnelsen hvori nevnte medikament er innbefattet i et pakningsmateriale, nevnte pakningsmateriale innbefatter trykt materiale som indikerer at nevnte medikament er effektivt for Samtidig å redusere risiko for både ryggrad og ikke-ryggrad benfraktur hos én post-menopausal kvinne med risiko for å oppnå osteoporose når det administreres til nevnte kvinne slik at nevnte paratyroidhormon administreres uten samtidig administrasjon av et antiresorptivt middel forskjellig fra vitamin D eller kalsium, i en daglig dose på 20 ug i minst 12 måneder og opp til 3 år..

Som aktiv ingrediens kan sammensetningen eller løsningen innbefatte fullengde 84 aminosyreformen av paratyroidhormon, særlig den humane formen, hPTH (1-84) oppnådd enten rekombinant, ved peptidsynte eller ved ekstraksjon fra humant fluid. Se f.eks US patent nr 5.208.041. Aminosyresekvensen for hPTH (1-84) er rapportert av Kimura et al i Biochem. Biophys. Res. Comm., 114(2):493.

Sammensetningen eller løsningen kan også innbefatte som aktiv ingrediens fragmenter eller varianter av fragmenter av humant PTH eller av rotte, svin eller bovine PTH som har human PTH aktivitet som bestemmes i den ovariestomiserte rottemodellen til osteoporose rapportert av Kimmel et al, Endocrinology, 1993, 32(4): 1577.

Paratyroidhormonfragmentene innbefatter ønskelig minst de første 28 N-terminale restene, slik som PTH(l-28), PTH(1-31), PTH(l-34), PTH(l-37), PTH(l-38) og PTH(1-41). Alternativer i form av PTH varianter innbefatter fra 1 til 5 aminosyre-substitusjoner som forbedrer PTH stabilitet og halveringstid, slik som erstatning av metioninrester i posisjonene 8 og/eller 18 med leucin eller andre hydrofobe aminosyrer som forbedrer PTH stabilitet overfor oksydasjon og erstatning av aminosyrer i 25-27 regionen med trypsininsensitive aminosyrer slike som histidin eller annen aminosyre som forbedrer PTH stabiliteten overfor protease. Andre egnede former av PTH inkluderer PTHrP, PTHrP(l-34), PTHrP(l-36) og analoger av PTH eller PTHrP som aktiverer PTH1 reseptoren. Disse formene av PTH er omfattet åv begrepet "paratyroid hormon" som anvendes generisk heri. Hormonene kan oppnås ved kjente rekombinante eller syntetiske fremgangsmåter, slik som beskrevet i US patent nr 4.086.196 og 5.556.940.

De foretrukne hormonene er humant PTH(l-34), også kjent som teriparatid. Stabiliserte løsninger av humant PTH(l-34) slik som rekombinant humant PTH(l-34) (rhPTH(l-34), som kan anvendes i den foreliggende fremgangsmåten er beskrevet i US patent-søknad serienummer 60/069.075, innbefattet heri som referanse. Krystallinske former av human PTH(l-34) som kan anvendes ifølge foreliggende fremgangsmåte er beskrevet i US patentsøknad serienummer 60/069.875.

Et paratyroidhormon kan typisk administreres parenteralt,. foretrukket ved subkutan injeksjon, ved fremgangsmåter og i formuleringer godt kjent i litteraturen. Stabiliserte formuleringer av humant PTH(l-34) som fordelaktig kan anvendes ifølge oppfinnelsen er beskrevet i US patent serienummer 60/069.075. Denne patentsøknaden beskriver også flere andre formuleringer for lagring og administrering av paratyroidhormon. En stabilisert løsning av et paratyroidhormon kan inkludere et stabiliseringsmiddel, en buffer, et konserveirngsmiddel og lignende.

Stabiliseirngsmidlet innbefattet i løsningen eller sammensetningen inkluderer et polyol som inkluderer sakkarid, foretrukket et monosakkarid eller disakkarid, f.eks glukose, trehalose, raffinose eller sukrose; en sukkeralkohol slik som f.eks mannitol, sorbitol eller inositol, og en polyhydrisk alkohol slik som glyserin eller propylenglykol eller blandinger derav. Et foretrukket polyol er mannitol eller propylenglykol. Konsentrasjonen av polyol kan variere fra ca 1 til ca 20 vekt-%, foretrukket ca 3 til 10 vekt-% av den totale løsningen.

Buffermidlet som anvendes i løsningene eller sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan være hvilken som helst syre eller saltkombinasjon som er farmasøytisk akseptabel og holder den vandige løsningen i et pH området på 3 til 7, foretrukket 3 til 6. Anvendelige buffersystemer er f.eks acetat, tartrat eller citratkilder. Foretrukne buffersystemer er acetat eller tartratkilder, mest foretrukket er en acetatkilde. Konsentrasjonen av bufferen kan være i området fra 2 mM til ca 500 mM, foretrukket ca 2 mM til 100 mM.

Den stabiliserte løsningen eller sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan også inkludere et parenteralt akseptabel konserveringsmiddel. Slike konserveringsmidler inkluderer f.eks kresoler, benzylalkohol, fenyl, benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid, klorbutanol, fenyletylalkohol, metylparaben, propylparaben, timerosal og fenylkvikk-sølvnitrat og acetat. Et foretrukket konserveirngsmiddel er m-kresol eller benzylalkohol; mest foretrukket er m-kresol. Mengden av konserveirngsmiddel som anvendes kan variere fra ca 0,1 til ca 2 vekt-%, foretrukket ca 0,3 til ca 1*0 vekt-% av den totale løsningen.

Således kan den stabiliserte teriparatidløsningCn inneholde mannitol, acetat og m-kresol med en forventet halveringstid over 15 måneder ved 5°C.

Paratyroidhormonsammensetningene kan, hvis ønskelig, bli tilveiebragt i pulverform

som inneholder mer enn 2 vekt-% vann, som resultat av frysetørring av en steril vandig hormonløsning fremstilt ved å blande det utvalgte paratyroidhormonet, et buffermiddel og et stabiliseirngsmiddel som beskrevet ovenfor. Særlig anvendelig som en buffer ved fremstilling av lyoflliserte pulvere er en tartratkilde. Særlig anvendelige stabiliserings-midler inkluderer glysin, sukrose, trehalose og raffinose.

I tillegg kan paratyroidhormonet formuleres med typiske buffere og eksipienter som anvendes i litteraturen for å stabilisere og løse proteiner for parenteral administrasjon.

Anvendte farmasøytiske bærere og deres formuleringer ifølge litteraturen er beskrevet i Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Ed.; Mack Publishing Co, Easton

(1975). Et paratyroidhormon kan også leveres via lunger, munn, nese, ved stikkpille eller ved orale formuleringer.

Paratyroidhormonet formuleres for administrering av en dose effektiv til å øke hardhet og/eller stivhet til ett eller flere av et subjekts ben og/eller for å redusere sannsynligheten og/eller alvorligheten av benfraktur. Foretrukket tilveiebringer en effektiv dose en forbedring i kortikal benstruktur, masse og/eller styrke. Foretrukket reduserer en effektiv dose forekomsten av vertebral fraktur, reduserer forekomsten av multiple vertebrale frakturer, reduserer alvorligheten av vertebral fraktur og/eller reduserer forekomsten av ikke-vertebrale frakturer. Foretrukket mottar et subjekt som mottar paratyroidhormon også effektive doser av kalsium og vitamin D, som kan øke effektene til hormonet. En effektiv dose av paratyroidhormon er typisk større enn ca 5 ug/kg/dag selv om, særlig hos mennesker, den kan være så stor som ca 10 til ca 40 ug/kg/dag, eller større som er effektiv for å oppnå økt hardhet eller stivhet, særlig i kortikalt ben, eller for å redusere forekomsten av fraktur. Et subjekt som lider av hypoparatyroidisme kan kreve ytterligere eller høyere doser av et paratyroidhormon; slik som et subjekt som også krever erstatningsterapi med hormonet. Doser som kreves for erstatningsterapi i hypoparatyroidisme er kjent i litteraturen. I visse tilfeller kan relevante effekter av PTH observeres ved doser lavere enn ca 5 ug/kg/dag til og med mindre enn ca 1 ug/kg/dag.

Hormonet kan administreres regulært (f.eks en eller flere ganger daglig eller ukentlig), periodisk (f.eks uregelmessig i løpet av en dag eller uke) eller cyklisk (f.eks regulært i en periode på dager eller uker fulgt av en periode uten administrasjon). Foretrukket blir PTH administrert en ganger daglig 1-7 dager i en periode som varierer fra 3 måneder opptil 3 år hos osteoporosepasienter. Foretrukket inkluderer cyklisk administrasjon administrering av et paratyroidhormon i minst 2 remodellerende cykler og fjerning av paratyroidhormon i minst en remodellerende cykel. Et annet foretrukket regime for cyklisk administrasjon inkluderer administrering av paratyroidhormonet i minst ca 12 til ca 24 måneder og fjerning av paratyroidhormonet i minst 6 måneder. Typisk består fordelene ved administrasjon av et paratyroidhormon etter en administrasjonsperiode. Fordelene ved flere måneders administrasjon kan bestå i så lenge som et år eller to, eller mer, uten ytterligere administrasjon.

Eksemplene som følger her er illustrative for oppfinnelsen og er ikke ment å være begrensende.

EKSEMPLER

Eksempel 1 - Økt benstyrke og tetthet etter administrasjon av rhPTH(l-34) til kaniner

Intakte New Zealand hvite kaniner av hunnkjønn (HRP Inc. Denver, Pa), et av de minste dyrene som danner osteoner ved intrakortikal remodellering, ca 9 måneder gamle som veide 3,25-3,75 kg, ble sortert i forhold til kroppsvekt i tre grupper av 6 dyr. To eksperimentgrupper mottok biosyntetisk PTH(l-34) ved doser på 10 eller 40 ug/ml/kg/dag. Kontrollgruppen ble gitt 1,0 ml/kg/dag av surgjort 0,9 M saltløsning som inneholdt 2 % varmeinaktivert kaninsera. PTH(l-34) eller vehikkel ble injisert ved daglig subkutante injeksjoner 5 dager i uken i 140 dager. Kaninene ble gitt kaninlabmat som inneholdt 0,5 % Ca og 0,41 % P og gitt vann ad libitum.

Seleksjonen av dose ble basert på en serie av forhåndsstudier som viste at (1) etter en enkelt injeksjon av PTH(l-34) ble 100 ug/kg økte serumkalsium og gikk ikke tilbake til grunnlinjen i løpet av 24 timer, mens etter en enkeltdose på 50 ug/kg returnerte serum-kalsiumet til grunnlinjen i løpet av 24 timer, (2) gjentatte injeksjoner av 20 ug/kg PTH(l-34) resulterte i transient heving i serumkalsium med returnering til grunnlinje-verdiene i løpet av 6-24 timer, og (3) PTH(l-34) ved < 5 ug/kg forandret ikke histo-morfometrien til benoverflatene.

Et sett av doble alizarinmerker (Sigma, St. Louis) ble gitt i.m. ved 20 mg/kg på dag 55 og 63, og et sett av doble kalseinmerker (Sigma, St. Louis) ble gitt s.c. ved 5 mg/kg på dagene 15 og 7, før avlivning. Kaninene ble anestesibehandlet med CO2 i en tilfeldig rekkefølge, ca 3-6 timer etter siste injeksjon, for å oppnå blod ved hjertepunktur og deretter avlivet med natriumpentobarbital (100 mg/kg), injisert i.p. Det høyre overarms-benet, begge lårbena, lumbar vertebra (L3-L5) og det høyre tibia ble fjernet.

Serumkalsium, fosfat, alkalisk fosfatase, kretinin og ureanitrogen ble målt med multi-kanal serumanalyse behandlet med datamaskin.

Histomorfometriske målinger ble gjort på kortikalt ben av tibial midtskaft og et porøst ben av L3. Etter avlivning ble disse benene fjernet fra hvert dyr og fiksert i 10 % nøytralt buffret formalin i 24 timer. Vevene ble dehydrert i en gradert serie av alkohol-løsninger (70-100 %, 2 variasjoner per gradering,, hver i 4 timer under vakuum). Prøvene ble deretter plassert i xylen og infiltrert med metylmetakrylat under vakuum ved 20 psi i 2 timer/trinn og 4 timers infiltreringstabell i en Shandon Hypercenter automatisk prosessor (Shandon Lipshaw, Pittsburgh, PA). Prøvene ble nedsenket i 2 % DDK-plast med 0,2 % initiator (Delaware Diamond Knives, Wilmington, DE). Tverrsnitt av tibia ble kuttet ved 80 nm ved anvendelse av en diamantsag (Delaware Diamond Knives, Inc., DE) og beiset med Goldner's trikrom. Dcke-beisede tverrsnitt ca 80 nm tykke ble behandlet for dynamisk histomorfometri med fluorkrommerker. Pilformede utsnitt av L3 ble kuttet på Reichert-Jung 2050 mikrotom (Magee Scientific Inc., Dexter, MI) ved 5 um og beiset med McNeal's tetrakrom eller ikke-beiset for dynamisk histomorfometri.

Histomorfometri ble gjort ved 150x førstørrelse, ved anvendelse av et Nikon fluorescens mikroskop (Optiphot, Nikon, Tokyo, Japan) og et halvautomatisk digitalisert system (Bioquant IV, R&M Biometrics, Nashville, TN). Benformasjon og resporsjon i pereostil, endokortikal og intrakortikale konvolutter ble målt over hele tverrsnittsarealet og midtdiafysialseksjonene til tibia. Målingene av porøst ben ble gjort innenfor et 6 mm<2> område i sentret av lumbar vertebra, 0,5 mm fra margen til det omkringliggende kortikale skjellet. Nomenklaturen var i henhold til ASBMR Committe on histomorphometric nomenclature (Parfitt AM, Drezner MK, Florieux FH, Kanis JA, Malluche H, Meunier PJ, Ott SM, Recker RR 1987 "Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee". J. Bone Miner. Res. 2:595-610). Dynamiske parametre ble målt basert på kalseinmerket.

Midtskaftet til lårbenet og den fjerde lumbar vertebra i 50 % etanol/saltvann ble scannet i tverrsnitt ved kvantifisert datatomografi (QCT eller pQCT) ved anvendelse av en 960A pQCT og analysert ved anvendelse av Dichte software versjon 5.1 (NorlandV Stratec, Ft. Atkinson, WI). Hele vevsparametre ble målt som inkluderer volumetrisk benmineraltetthet (vBMD, mg/cm<3>), tverrsnittsarealet (X-Area, mm<2>), benmineralinnholdet (BMC, mg), ved anvendelse av vokseldimensjoner på 148 x 148 x 1200 um. Volumet kan beregnes ved å multiplisere X-området med skivetykkelsen på 1,2 mm. Hele lårbenhalsen til utskåret lårben i et bad på 50 % etanol, salvann ble scannet ved anvendelse av periferal dobbelenergi absorptiometri (pDEXA, Norland/Stratec). Spesifikt ble gjeldende benmineraltetthet (aBMD, g/cm<2>), projisert areal (cm<2>) og benmineralinnhold (BMC, g) målt ved anvendelse av scanningtrinn på 0,5 x 1,0 mm og terskel på 0,04.

Benmekaniske egenskaper ble målt i det høyre lårbensmidtskaftet og kroppen til L5. Benene ble operert bort, vasket for bindevev, pakket i gasbind fuktet i isotonisk saltvann og frosset ved -20°C. Før testing ble prøver tint i 1-2 timer ved romtemperatur. Alle prøvene ble testet for feil i et sirkulasjonsvannbad ved 37°C ved dannelse av MTS 810 servohydraulisk testemaskin (MTS Corp., Minneapolis, MN). Belastningsdeformasjons-kurver ble avlest ved anvendelse av HP 7090A måleplottesystemet (Hewlett Packard Camas, WA). Maks styrke (maksimal styrke som prøvene utsto), stivhet (hellingen til den lineære delen av belastning-deformasjonskurven) og arbeid til brudd (området under belastning-deformasjonskurven før feil) ble målt ved anvendelse av et digitalisert system (Jandel Scientific, Corte Madera, CA). Disse parametrene er strukturelle egenskaper som avhenger av iboende materialegenskaper og geometri. Turner CH, Burr DB 1993 "Basic biomechanical measurements of bone: a tutorial" Bone 14:595-608. Dataene ble normalisert for å oppnå iboende materialegenskaper slik som maksimal belastning (maksimal belastning som prøvene utsto) elastisk modulus (material iboende stivhet) og hardhet (motstand mot fraktur per enhetsvolum) som er uavhengig av størrelse og form. Id.

Lårbenstyrke ble målt ved midtskaftet ved anvendelse av trepunkts bøying. Lårbenet ble posisjonert på en fikstur med anteroidsiden vendende mot belastningen. Belastningen ble pålagt midtpunktet mellom to støtter som var 54 mm fra hverandre. Belastnings-cellen ble flyttet i en hastighet på 1 mm/sek til brudd fant sted. For å normalisere data oppnådd fra belastning/deformasjonskurven ble bøyingsmaksimal belastning beregnet fra bøyningskraften ved

arFuLr/81 (1)

hvor Gr er bøyingsfrakturbelastning, Fu er den maksimale kraften, L er lengden mellom støttene, r er radien i anterior-posterior retning, og I er momentet til inertia. Id. Verdien for momentet av inertia ble beregnet, med antakelse om at lårbentverrsnittene var elliptiske.

Gjennomsnittlig kortikal tykkelse ble beregnet fra tykkelsesmålinger gjort i hvert av fire kvadranter av lårbenstverrsnittet med et par digitale kalipere, innstilt til 0,01 mm med en presisjon på ± 0,005 mm (Mitutoyo, Japan).

Elastisk modulus til lårbenet (Ef) ble beregnet ved anvendelse av følgende ligning:

Ef=(stivhet)<*>(L<3>/48I) (2)

Hardhet til lårbenet (hardhetf) ble også beregnet ved anvendelse av følgende ligning:

Hardhetf=3*(arbeidtilbrudd)*r2/LI (3)

For den mekaniske testingen av femte lumbar vertebra (L5) ble begge endeplatene til vertebralkroppen kuttet parallelt ved anvendelse av en Buehler Isomet langsom hastighetssag (Buehler LTD, Evanston, IL). Etter reseksjon av de bakre prosessene ble mekanisk styrke av L5 målt i kompresjon. Kompresjonsbelastning ble anvendt i slag-kontroll, med en tverrhodehastighet på 1 mm/sek gjennom en vippeplate for å korrigere for ikke-parallell innstilling av forsidene til den vertebrale kroppen. For å normalisere dataene oppnådd fra belastnings/deformasjonskurven, og for å evaluere iboende materialegenskaper som er uavhengig av bengeometri ble maksimal belastning beregnet som maksimal kraft dividert med det totale tverrsnittsarealet.

Tverrsnittsareal (CSA) ble beregnet ved

CSA=7iab/4 (4)

hvor a og b er bredden i anterior-posterior og medial-lateral retninger, respektivt.

Elastisk modulus av vertebra (Ev) ble beregnet ved

Ev=(stivhet)/(CSA/h) (5)

hvor h er kranio-kaudalvekten til vertebralkroppen.

Hardhet til vertebra (hardhetv) ble beregnet ved

Hardhetv=(arbeid til brudd)/(CSA<*>h) (6)

500 um tykke tverrsnitt ble kuttet fra midtdiafysen til høyre humerus ved anvendelse av en diamantsag. Presis tykkelse av hver prøve ble målt ved anvendelse av et mikrometer (Mitutoyo, Japan) ved en oppløsning på 1 um. Akustiske hastighetsmålinger gjort ved anvendelse av et scanningakustisk mikroskop (UH3, Olympus, Japan) ved fremgangsmåten beskrevet tidligere av Hasegawa K, Turner CH, Recker RR, Wu E, Burr DB

1995 "Elastic properties of osteoporotic bone measured by scanning acoustic microscopy" Bone 16:85-90. Ved anvendelse av denne teknikken kan detaljerte iboende mekaniske egenskaper ved et utvalgt fokalpunkt bli målt. En 50 MHz signalomformer (V-390, Panametrics, Waltham, MA) ble anvendt for å generere akustiske bølger i puls-ekkoinnstilling. 50 MHz linsen produserte en akustisk stråle, ca 60 um i diameter. Prøver ble fiksert til bunnen av et kammer fylt med vann ved konstant temperatur (22°C). Forsinkelsestid mellom akustiske bølger reflektert fra toppen av prøven og de som ble reflektert fra bunnen av prøvene ble målt ved anvendelse av et digitalt oscilloskop (TDS 620, Tekronix, Beaverton, OR). Forsinkelsestidene ble målt ved fem forskjellige steder slik at hvert sete var mer enn 300 nm fra hverandre i den tidligere korteks til humerus. Akustisk hastighet ble beregnet som to ganger tykkelsen til prøvene, dividert med gjennomsnitlig forsinkelsestid. Våtvekt (Ww) og neddykket vekt (Ws) i 100 % etylalkohol ble niålt ved anvendelse av en balanse (AJ 100, Mettler Instrument Corp., Heightstown, NJ). Våt tetthet (p) ble beregnet ved anvendelse av Archimedes prinsipp:

p={Ww/(Ww-Ws)}<*>pETOH (7)

hvor pETOH er tettheten til alkohol (0,789 g/cm<3>). Ved antakelse om at den akustiske bølgeveien i benet er homogen ble den elastiske koeffisienten (C) som representerer den iboende stivheten til prøven beregnet:

C=p<*>v<2> (8)

hvor p er våt tetthet og v er akustisk hastighet.

Bartlett-analyse ble anvendt for å sjekke varianshomogeniteten. Når variansen var homogen ble enveis ANOVA med Fishers PLSD tester for post-hoc sammenligning anvendt. Når variansen ikke var homogen ble Kruskal-Wallis ikke-parametrisk varians-analyse anvendt, med post-hoc analyse ved anvendelse av Mann-Whitney's U-tester. Statistisk signifikans ble beskrevet som p<0,05. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM.

Resultater

Kaniner behandlet med vehikkel PTH(l-34) ved 10 mg/kg/dag fremviste små økninger i kroppsvekt i løpet av 140 dager. Kaniner gitt PTH(l-34) ved 40 ug/kg/dag fremviste en liten reduksjon på 51 g i kroppsvekt, som representerer en 1,4 ± 1,6 % tap i kroppsvekt i løpet av eksperimentet (tabell 1). Serummålinger var innenfor den normale fyisologiske responsen for kaniner, selv om små økninger i serumkalsium og ureanitrogen ble observert. Serumalkalisk fosfatase økte med 2 ganger ved høyere PTH(l-34) dose (tabell 2). Bendannelse på periosteal (Ps.MS/BS) og endokortikal (Ec.MS/BS) overflater av tibial-midtskaftet økte i PTH(l-34) behandlede grupper (tabell 3). Ps.MS/BS i høyere dosegruppen var signifikant større enn i de andre to gruppene (p<0,001) og Ec.MS/BS i den høyere dosegruppen var signifikant større enn i kontrollgruppen (p<0,05). I samsvar med økningen i serumalkalisk fosfatase var bendannelseshastigheten for hver overflate (Ps.BFR/BS og Ec.BFR/BS) signifikant større enn i høydosegruppen enn de to andre gruppene (p<0,05). Mineraløkningshastigheten (MAR) forandret seg ikke på verken periosteale eller endokortikale konvolutter.

Intrakortikal var antallet resorpsjonsseter (Rs.N/Ct.Ar) hos kaniner gitt PTH(l-34) ved 50 ug/kg/dag signifkant større med 7 ganger, enn i de andre to gruppene (p<0,05)

(tabell 4). Antallet merkede osteoner (L.On.N/Ct.Ar) hos kaniner gitt PTH(l-34) ved 40 ug/kg/dag økte også signifikant sammenlignet med de andre to gruppene (p<0,01 vs kontrollgruppen, p<0,05 vs 10 ug/kg/dag gruppen). MAR var signifikant større i begge behandlingsgruppene enn i kontrollgruppen (p<0,01), men det var ingen signifikant forskjell med de PTH behandlede gruppene. Bendannelseshastighet (BFR/BV) og aktiveringsfrekvens (Ac.F) økte (p<0,05 og p<0,01, respektivt) ved begge dosene.

Selv om benarealet (B.Ar) økte ved begge doser ble det kun funnet en signifikant forskjell mellom den høyere dosegruppen og kontrollgruppen (p<0,01). Marrow areal (Ma.Ar) ble redusert etter behandling, men var ikke signifikant forskjellig blant de tre gruppene. Imidlertid var det kortikale areal (Ct.Ar) i høyere dose gruppen signifikant større enn i de to andre gruppene (p<0,001 vs kontrollgruppen, p<0,05 vs den lavere dose gruppen). Ct.Ar i lavere dose gruppen var også signifikant høyere enn i kontrollgruppen (p<0,05). Tilsvarende resultater ble funnet i % Ct.Ar.

Kortikal porøsitet (Ct.Po) hos kaniner gitt PTH(l-34) ved 10 ug/kg/dag var doble i forhold til den i kontrollgruppen (p<0,05), mens Ct.Po hos kaniner gitt PTH(l-34) ved 40 ug/kg/dag var 6x høyere enn kontrollgruppen (p<0,01). Imidlertid lå porøsitetene i den endokortikale avdelingen og, inne i denne lokaliteten, er det uvanlig å bidra til biomekanisk styrke idet PTH også øker kortikalt benareal, i overensstemmelse med det økte tverrsnittsmomentet til intertia. I porøst ben økte de fleste formasjonsparametrene (OS/BS, Ob.S/BS, OV/TV og MS/BS) med PTH(l-34) behandling (tabell 5). De kaninene som ble gitt PTH(l-34) ved 40 um/kg/dag var signifikant større enn i de andre to gruppene (p<0,01 vs både kontrollgruppe og 10 ug/kg/dag gruppe i alle parametre). Bendannelseshastighet (BFR/BS) økte også signifikant hos kaniner gitt PTH(l-34) ved 40 ug/kg/dag sammenlignet med de andre to gruppene (p<0,001 vs både kontroll og 10 ug/kg/dag gruppene). Selv om resorpsjon (ES/BS og Oc.S/BS) økte i begge PTH(l-34) behandlede grupper var bare erodert overflate (ES/BS) i høyeredosegruppen signifikant større enn kontrollgruppen (pz0,01). Det var ingen forskjeller i osteoidtykkelse (O.Th) blant de tre gruppene. Til tross for bevis for aksellerert benturnover forandret fraksjonelt benvolum (BV/TV) seg ikke etter PTH(l-34) behandling. Tunellresorpsjon og peritrabekulær fibroser ble ikke observert i noen av gruppene.

vBMD og BMC i midtskaftet til lårbenet bestemt ved pQCT i 40 ug/kg/dag gruppen var signifikant høyere enn i de to andre gruppene (p<0,001 i vBMD og p<0,0001 i BMC vs kontrollgruppen, p<0,05 i vBMD og p<0,01 i BMC vs laveredosegruppen) (figur IA). vBMD og BMC i 10 ug/kg/dag gruppen var også siginifkant høyere enn i kontrollgruppen (p<0,05 i både vBMD og BMC). Selv om benarealet til midtskaftet til lårbenet også økte doseavhengig økte det bare signifikant i 40 ug/kg/dag gruppen (p<0,05).

aBMD og BMC i proksimallårbenet, målt ved dobbel røntgenabsorpsjonsmåling (DXA eller pDXA) økte doseavhengig. Signifikante forskjeller var tilstede både i aBMD og BMC mellom kontrollgruppen og 10 ug/kg/dag gruppen (p<0,05) så vel som mellom kontrollgruppen og 40 ug/kg/dag gruppen (p<0,001) (figur IB). Ingen signifikante forskjeller ble funnet i benareal blant de tre gruppene.

Totalt viser figur 1 at BMD (benmaterialtetthet) og BMC (benmaterialinnhold) i lårben-midtskaftet (kortikalben) (A) og i proksimallårbenet (porøst ben + kortikalt ben) (B) var signifikant større hos PTH behandlede dyr i forhold til kontroller med begge doser. Kortikalt benareal ved lårbenmidtskaft hos kaniner behandlet ved høyere dose var signifikant større enn kontroller. Ingen signifikante forskjeller ble funnet mellom gruppene i benareal og det proksimale lårbenet. Data ble uttrykt som gjennomsnitt SEM. <*>P<0,05 sammenlignet med kontroll. <!>P<0,05 sammenlignet med PTH 10 ug/kg/dag.

Det var ingen signifikante forskjeller i vBMD, BMC eller benareal av lumbar vertebra (L4) målt ved pQCT, blant disse gruppene.

Strukturelle egenskaper i midtskaftet til lårbenet, slik som maksimal kraft, stivhet og arbeid til brudd økte doseavhengig (figur 2). Figur 2 viser effekten av PTH på mekanisk styrke og tverrsnittsmoment av interia (CSMI) i det kortikale benet av lårbenmidt-skaftet. Strukturelle mekaniske egenskaper (åpen søyle) og CSMI økte signifikant i høyeredosegruppen, mens stivheten også økte signifikant i laveredosegruppen. Av de iboende materialegenskapene (mørke søyler) økte bare elastisk modulus signifikant i laveredosegruppen sammenlignet med kontroller. Elastisk modulus i høyeredose-gruppen ble signifikant redusert sammenlignet med laveredosegruppen. I figur 2: data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM; <*>indikerer P<0,05 sammenlignet med kontroll; og! indikerer P>0,05 sammenlignet med 10 ug/kg/dag.

I denne studien og resultatene vist i figur 2 var alle parametre signifikant høyere hos kaniner gitt PTH(l-34) ved 40 ug/kg/dag i forhold til kontrollgruppe (p<0,01 for maksimal kraft og arbeid til brudd, p<0,05 for stivhet. Stivhet i laveredosegruppen var også signifikant høyere enn i kontrollgruppen (p<0,05). Av de iboende materialegenskapene var elastisk modulus signifikant mindre hos kaniner gitt 40 ug/kg/dag enn de som ble gitt 10 ug/kg/dag (p<0,01).

I den lumbare vertebrale kroppen ble ingen signifikante forskjeller funnet i mekaniske egenskaper blant de tre gruppene.

Det var ingen signifikante forskjeller i akustisk hastighet eller elastisk koeffisient blant de tre gruppene.

Skjelettrespons av kortikalt ben overfor biosyntetisk hPTH(l-34) omfattet både én retningsregulering av materialegenskaper og en kompensasjonsregulering av biomekaniske egenskaper i de lange benene til intakte, voksne hunnkaniner. PTH(l-34) økte benturnover og kortikal porøsitet og, ved 40 ug/kg dose, reduserte måterialeelastisk modulus til kortikalt ben. Imidlertid ble den reduserte elastiske modulusen mer enn kompensert ved økt benøkning på periosteal og endokortikale overflater, som resulterer i signifikant forbedring i strukturstyrke, stivhet og arbeid til brudd av kortikalt ben hos kaniner.

I denne studien ved anvendelse av intakte kaniner, forandret porøst benvolum av lumbar vertebra ikke etter PTH(l-34) behandling til tross for belegg for økt benturnover. Tidligere anvendelse som en ostepenisk modell, tilstedeværelsen av intrakortikal remodellering og kortremodelleringsperiode - sammen med kaniners raske vekst og tidlig skjelettmaturasjon (ved 6-9 måneder) danner basis for skjelett til kanin som en modell hvor man kan teste effektene av intermitterende administrering av PTH(l-34).

Kaniner kan fremvise et bredt spekter i serumkalsiumnivåer (10-16 mg/dl), men disse nivåene er ikke direkte påvirket av mengden av kalsium gjennom diett, en annen fordel med modellen. Selv om transiente signifikante økninger av ca 1 mg/ml ble avlest hos kaniner behandlet med PTH(l-34) ved 40 ug/kg var de virkelige verdiene alltid innenfor det kjente fysiologiske området.

I den foreliggende studien økte biosyntetisk hPTH(l-34) i 140 dager benformasjonshastigheten intrakortikalt så vel som på periosteale og endokortikale overflater. Intrakortikal Ac.F økte i den lavere doseringsgruppen med 8X og i den høyere doseringsgruppen med 20X. Dette fører til en 2 ganger økning i kortikal porøsitet i tibia i laveredosegruppen og 6 gangers økning i høyeredosegruppen. Data fra akustisk mikroskopi viser at elastiske egenskaper av benmaterialet i seg selv i numerusen ikke ble påvirket, som indikerer at iboende kortikal benkvalitet er normalt. Derfor må økt porøsitet være en bidragsyter til den lille reduksjonen i elastisk modulus, en materialegenskapmåling som inkluderer mellomrom i korteks.

Økt kortikal porøsitet ble mer enn kompensert, imidlertid, med signifikant økt MS/BS og BFR/BS på både periosteal og endokortikale overflater i midtskaftet til tibia i høyeredosegruppen, som resulterer i signifikant økt benareal. Dette vil øke tverrsnittsmomentet til inertia, som er propsjonalt med benets bøyningsstivhet, som det gjorde i lårbensmidtskaftet (figur 2). Konsekvensene av disse forandringer i form og materialegenskaper var for å forbedre den mekaniske styrken og stivheten til lårbensdiafysis sammenlignet med kontroll, og således tilsidesette de potensielt skadelige mekaniske effektene av økt kortikal porøsitet.

Som konklusjon ble økning i benturnover og kortikal porøsitet.etter PTH(l-34) behandling ledsaget av økning i benet ved periosteal og endokortikale overflater. Kombinasjonen av disse fenomenene resulterer i en økning av maksimal belastning, stivhet og arbeid til brudd av lårbenet: Eksempel 2 - Øket benstyrke og tetthet etter administrering av rhPTH(l-34) til aper

Levendefasen av studien anvendte ville, voksne (lukkede vekstplater) cynomolgus primater (Macaca fascicularis), som veier 2,77 ± 0,03 kg (gjennomsnitt ± standardavvik av. middelverdi [SEM]). Apene ble holdt i karantene i 3 måneder, og startet på en diett som inneholdt 0,3 % kalsium, 0,3 % fosfat og 250 IU vitamin D3/100 g diett og gitt fluorholdig vann (1 ppm fluor) ad libitum. Kalsiuminnholdet korresponderer til 1734 mg kalsium/2000 kalorierer. Etter 1 måned på dietten ble dyrene sortert i grupper på 21 eller 22, innbilt operert eller ovarietomisert. En daglig subkutan injeksjon av vehikkel (innbilt og ovariestomiserte kontroller) eller rhPTH(l-34) ved 1 ug/kg (PTH1) eller 5 Hg/kg (PTH5) ble startet 25 timer etter ovariestomi. Dyrene ble behandlet enten i 18 måneder (PTH1 og PTH5) eller i 12 måneder fulgt av fjerning av behandling (PTH1-W ogPTH5-W).

De studerte gruppene ble oppdelt som vist i tabell 6.

Serum og urinprøver ble tatt 24 timer etter vehikkel eller rhPTH(l-34) injeksjon ved 3 måneders intervaller. Et sparsomt prøvetakningsdesign av 5 aper i hver rhPTH(l-34)

behandlet gruppe ble anvendt for farmakokinetikker, med prøvetakning (spennende fra 0 til 240 minutter hver gang) ved grunnlinjen, 7,11 og 17 måneder. Ved 0 tid og ved 6 måneders intervaller ble total skjelett og ryggrads (L-2 til L-4) benmasse undersøkt ved dualenergirøntgenabsorpsjonsmåling (DXA); periferisk kvantitativ databehandlet røntgentomograf (pQCT) ble anvendt for å undersøke benmassen i midtskaftet og distal

radius, og proksimal tibia. Iliac biopsier ble tatt ved 6 og 15 måneder for histomorfometri. Alle dyrene ble eutanisert etter 18 måneder..

Biomekaniske tester ble gjort på lubar vertebraer L-3 til L-4, lårbenhalsen, humerus midtskaft og på en kortikal benprøve bearbeidet fra lårbendiafysen (mål definert i tabell 7). Vanlig statisk og dynamisk histomorfometri ble gjort (mål beskrevet i tabell 11) på humurus midtskaft, lumbar vertebra L-2, lårbenshals, lårmidtskaft, radiusmidtskaft og distal radius. Begynnende statistisk analyse sammenlignet alle grupper med vehikkel-behandlet ovariestomiserte kontroller. Data er egnet for ytterligere forklarende analyse for å undersøke doseavhengighet (effekter av fjerning, interaksjoner mellom utkom, og forandring over tid ved fremgangsmåter kjente for fagmannen. Alle undersøkelser ble utført og bestemt ved fremgangsmåter kjent i litteraturen.

For visse eksperimentsubj ekter ble kortikalben av humerus undersøkt med histomorfometri og med polarisert Fourier-trahsforminfrarødt mikroskopi. Fourier-transforminfra-rød mikroskopi ble utført på en adapsjon av kjente fremgangsmåter for slik mikroskopi.

3D endelig modelleringsstudier

Disse studiene bestemmer 3D endelig elementmodelleringsdata på vertebra fra aper i studien dosert med PTH i 18 måneder. Fjernet L-5 vertebra i 50 % etanol/saltvann fra ovariestomisert (n=7) og PTH (n=7) grupper ble seriescannet i 500 um trinn med kvantitativ computerbehandlet tomografi (QCT, Norland, Ft. Atkinson, WI) ved anvendelse av 70 x70 um pikseller. Hver av de 500 um tverrsnittene ble analysert for volumetrisk benmineraltetthet (BMD, mg/cc), benmineralinnhold (BMC, mg), tverrsnittsareal (X-areal), porøst benvolum (BV/TV), trabekulær tykkelse (Tb.Th) og binde-evnende (nodetetthet, struanalyse). Pikseller i hvert seriescan ble gjort gjennomsnittlig for å danne 490 x 490 x 500 nm vokseller. Seriescanningene ble deretter stablet og et triangulært overflatenett generert for hvert ben ved anvendelse av "marsjerende kuber" algoritme (se f.eks Lorensen and Cline 1987 "Marching cubes, a high resolution 3D surface construction algorithm" Computer Graphics 21,163-169). En avrundet versjon av hvert overflatenett ble deretter anvendt for å generere et tetrahedralt nett for 3D endelig elementmodellering.

Youngs modulus for hvert tetrahedrale element ble avledet fra opprinnelige voksel-densiteter og materialegenskaper fra en stråle av kortikalt ben malt fra lårbendiafysen til apene. Hvert tetrahedrale nett ble rotert slik at bunnplaten til hvert lårben ble rettet inn med et plan. Linjaer elastisitetsbelastningsanalyse ble deretter utført for hver L-5 modell hvori en fordelt belastning på 100 N ble pålagt toppflaten til sentrum, perpendikulært på bunnplanet mens bunnoverflaten ble fiksert i belastningsretningen. De resulterende aksiale belastningskonturene ble evaluert, på samme måte som BMD fordelingen og sammenligning mellom PTH og ovariestomisert. Ved denne oppløsningen er tettheten til hver voksel avhengig av omfanget som hver voksel er fylt med ben i motsetning til mykt vev.

Rapportering av forskjeller i teksten er statistisk signifikant, p>0,05. Alle dyrene økte

4 % til 9 % i forhold til opprinnelig kroppsvekt i løpet av studien uavhengig av behandling.

Serumestradiolnivåer ved 3 og 18 måneder var under 5 pg/ml i alle ovariestomiserte aper. Når målinger av kalsiumhomeostatis ble sammenlignet med shamkontroller hadde ovariestomiserte kontroller lavere serumkalsium og fosfat og en 1,25-dihydroksyvitamin D nivåer men var ikke forskjellige når det gjaldt endogent PTH, urincyklisk adenosinmonofosfat (cAMP), urinkalsium, urinkreatinin eller serumureanitrogen målt 24 timer etter siste injeksjon. Dyr behandlet med rhPTH(l-34) hadde lavere serum-fosfat, lavere endogent PHT og høyere 1,25-dihydroksyvitamin D og urin cAMP sammenlignet med ovariestomisert. Serumbendannelsesmarkør-undersøkelser viste at ovariestomiserte aper hadde lav serumtotal alkalisk fosfatase (ALP) og osteokalsin sammenlignet med shams, rhPTH(l-34) gjenetablerte nivåene tilbake til shamverdier. Urin C-telopeptid (Kryss Laps) ekskresjon, anvendt som en biokjemisk markør for benresorpsjon, ble ikke forandret ved rhPTH(l-34) sammenlignet med ovariestomiserte kontroller.

Total skjelettbenmasse, uttrykt som total kropps BMC, ble økt signifikant med PTH(1-34) (figur 3). Ryggmargsbenmaterialtetthet (BMD) holdt seg stabil i ovariestomiserte kontroller i 18 måneder, mens shamkontroller økte ca 5 % over grunnlinjen (figurene 4A-4C og 5 A). rhPTH(l-34) økte ryggmargs BMD med 7 % til 14 % og hele kropps-benmineralinnholdet (BMC, figur 3) med 86 % sammenlignet med grunnlinjen (figurene 4A-4C og 5A). Ryggradbenmaterialinnholdet økte også (figur 5A). I rhPTH(l-34) behandlede primater var størrelsen på disse økningene signifikant høyere enn den for ovariestomiserte kontroller, og matchet (PTH1) eller overskred (PTH5) den til shams. rhPTH(l-34) forandret ikke BMD til midskaftet eller den distale radiusen. Tverrsnittsarealet til midtskaftet økte med 7 % i PTH5 gruppen. I den proksimale tibia var det ingen økning i tverrsnittsarealet, men rhPTH(l-34) økte BMC og BMD sammenlignet med overiestomiserte kontroller. Seks måneder etter at behandlingen var avsluttet holdt BMD og BMC i ryggraden og lårbenshalsen seg høyere enn ovariektomiserte kontroller, med ingen forandring i det kortikale midtskaftet til humerus.

rhPTH(l-34) økte styrken (Fy) i vertebra med opptil 43 % (tabellene 7 og 8, figur 5B). rhPTH(l-34) forbedret styrken i lårbenshalsen (fu) med opptil 12 % (tabeller 7 og 9, figur 6A). rhPHT(l-34) forandret ikke målene i den kortikale diafysen til humerus-midtskaftet (tabeller 7 dg 10), eller materialegenskapene til stråleprøvene fremstilt fra lårbensdiafysen (tabeller 7 og 9, figur 6B), sammenlignet med ovariektomiserte kontroller. Hos dyr behandlet med rhPTH(l-34) i 12 måneder og deretter fjernet fra behandlingen i 6 måneder holdt benstyrkemålingene seg signifikant høyere enn ovariektomiserte kontroller (tabell 7-10 figurene 5B og 6A).

Forkortelser: OXV = ovariektomisert; PTH1 = rhPTH(l-34) 1 mg/kg i 18 måneder; PTH-W = fjerning i 6 måneder eetter behandling med rhPTH(l-34) 1 ug/kg i 12 måneder; PTH5 = rhPTH(l-34) 5 ug/kg i 18 måneder; PTH5-W = fjerning i 16 måneder etter behandling med rhPTH(l-34) 5 ug/kg i 12 måneder.

a Se tabell 4.1 for beskrivelse av variable

b Data uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av middelverdi (SEM) per gruppe.

<0> Statistisk signifikant sammenlignet med OVX kontroller (p<0,05).

s Statistisk signifikant sammenlignet med sham kontroller (p>0,05).

Forkortelser: OXV = ovariektomisert; PTH1 = rhPTH(l-34) lmg/kg i 18 måneder; PTH-W = fjerning i 6 måneder eetter behandling med rhPTH(l-34) 1 ug/kg i 12 måneder; PTH5 = rhPTH(l-34) 5 ug/kg i 18 måneder; PTH5-W = fjerning i 16 måneder etter behandling med rhPTH(l-34) 5 fig/kg i 12 måneder.

a Se tabell 4.1 for beskrivelse av variable

b Data uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av middelverdi (SEM) per gruppe.

<0> Statistisk signifikant sammenlignet med OVX kontroller (p<0,05).

s Statistisk signifikant sammenlignet med sham kontroller (p>0,05).

Forkortelser: OXV = ovariektomisert; PTH1 = rhPTH(l-34) lmg/kg i 18 måneder; PTH-W = fjerning i 6 måneder eetter behandling med rhPTH(l-34) 1 ug/kg i 12 måneder; PTH5 = rhPTH(l-34) 5 ug/kg i 18 måneder; PTH5-W = fjerning i 16 måneder etter behandling med rhPTH(l-34) 5 ug/kg i 12 måneder.

a Se tabell 4.1 for beskrivelse av variable

b Data uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av middelverdi (SEM) per gruppe. Statistisk signifikant sammenlignet med OVX kontroller (p<0,05).

s Statistisk signifikant sammenlignet med sham kontroller (p>0,05).

Selv om turnoverhastigheter var større hos ovariektomiserte enn sham kontroller var det ingen signifikant benvolumtap i iliakskålen. Idet tetracyklinmerket ikke var detekterbart etter 6 måneder hos noen av dyrene ble kun statistiske parametre målt på dette tids-punktet. Statiske og dynamiske histomorfometridata ved 15 måneder viste at behandling med rhPTH(l-34) økte porøst benareal sammenlignet med ovareiktomisert, og økte bendannelse uten å øke resorpsjonsmålene over de som ble målt i ovariektomiserte kontroller. Benformasjonshastigheten ble økt progressivt ved høyere doser av rhPTH(l-34). Selv om porøst ben holdt seg økende sammenlignet med ovariektomiserte kontroller etter fj erhing av rhPTH( 1 -34) fulgt av 12 måneders behandling gikk bendannelsen og resporsjonen tilbake til hva som ble observert i ovariestomiserte kontroller, og benturonver holdt seg høyere enn i shamkontroller. rhPTH(l-34) påvirket ikke mineraliseringen, aktiveringsfrekvensen eller remodelleringsperiodene. Det var ingen forskjeller i enkeltbenmulticellulær enhet (BMU)-basert benbalanse mellom resorpsjon og formasjon. I sum økte rhPTH(l-34) porøst ben ved selektiv stimulering av benformasjon.

I det kortikale benet av humerus, hvor rhPTH(l-34) ikke signifikant modifiserer BMD eller benstyrkemålinger stimulerer rhPTH(l-34) forandringer i periosteal, endosteal og intrakortikale avdelinger (tabell 11 og 12). Selv om det ikke var noen forskjeller i totalt areal eller medullært areal mellom gruppene økte rhPTH(l-34) kortikalt areal og PTH5 og PTH5-W gruppene hadde signifikant mer kortikalt ben, som antar et økt tverrsnittsmoment av interia, et mål for styrke. Økningen i arealet kan bidra til å øke dannelsen av både periosteal og endosteale overflater (figur 7).

Shamkontroller og PTH5-W grupper hadde reduserte periosteale mineraliserende overflater sammenlignet med ovariektomiserte kontroller og de andre rhPTH(l-34) behandlede gruppene. Endokortikale mineraliseringsoverflater var signifikant større i ovariektomiserte kontroller sammenlignet med sham og rhPTH(l-34) økte ikke over de ovariektomiserte kontrollverdiene. I intrakortikal remodellering var det mer resorpsjons-mellomrom i ovariektomiserte dyr og aktiveringsforbindelsen var større hos ovariektomiserte, PTH1 og PTH5 grupper enn i shamkontroller eller hver av de fjernede gruppene. Det var signifikant flere merkede osteoner per enhetsareal i ovariektomisert sammenlignet med shamkontroller, og rhPTH(l-34) økte ikke disse signifikant over ovariektomiserte kontroll verdi er.

Intrakortikal porøsitet var større i ovariektomiserte sammenlignet med sham, men ingen forskjell mellom ovariektomiserte kontroller og PTH1. PTH5 og PTH5-W økte porøsiteten over det som ble observert i ovariektomiserte kontroller. Data fra kanin-studier antar hypotesen om at økning i porøsitet, ledsaget av økt kortikalt ben, kan være en strukturell respons for å opprettholde de biomekaniske egenskapene til rhPTH(l-34) behandlet ben. Det var ingen forskjell mellom ovariektomisert og de andre gruppene i

dannelsesperioden, osteoidbredde, veggtykkelse eller osteoid modning ved 18 måneder.

I sum var det ingen forskjeller i turnoverhastigheter mellom ovariektomiserte kontroller og begge dosene av rhPTH(l-34). Shamkontroller hadde en lavere turnoverhastighet enn begge ovariektomiserte kontroller eller rhPTH(l-34) behandlede dyr. Når rhPTH (1-34) ble fjernet i 6 måneder ble turnoverhastighetene redusert signifikant, men BMD og biomekanisk styrkemålinger målte høyere enn ovariektomiserte kontroller. Normalverdier for osteoidbredde og modningstid intrakortikalt for alle grupper indikerer at behandlingen ikke forårsaket noen defekt i normal timing av mineraliséringsprosessen. Normalverdier for veggbreddé indikerer at behandlingen ikke forandret den normale balansen mellom resporsjon og dannelse ved nivået for individuell BMU. Analysene av histomorfometri og polarisert Fourier transform infrarød mikroskopi viste at administrasjon av PTH forbedret benkvaliteten ved å ersatte gammelt ben (store krystalitter) med nytt ben (krystallitter med variabel størrelse, som tenderer til mindre størrelser). Videre, etter fjerning av PTH fra aper gitt låve doser, er det en ytterligere fordel idet matriksen blir optimalt mineralisert og krystallittene modnes.

Undersøkelse av middel 500 um skive av L-5 viste en 21 % økning i BMD for PTH sammenlignet med ovariektomiserte som var på grunn av en 27 % økning i BMC uten forandring i tverrsnittsarealet. Analyse av senter fra PTH viste en 73 % økning i BV/TV som var på grunn av en 30 % økning i Tb.Th og 37 % større Tb.N, sammenlignet med ovariektomisert. Bindingsanalyser for dette området viste en 140 % større nodetetthet (node/vevsvolum) og 286 % større node til node avstivere for PTH vertebra.

Histogramfordelingsanalyse av benvokseltettheter for PTH viste en reduksjon i andel lavtetthet (0-355 mg/cc), en økning i middeldensitetene (356-880 mg/cc), med liten effekt på høytetthetsvokslene (887-1200 mg/cc) sammenlignet med ovariektomiserte (figur 8). Mest slående var skiftet til en større benvokseltetthet i den kortikale benavdelingen etterfølgende fjerning av behandling i 6 måneder (figur 8).

Andelen vertebrale benelementer (voksler) som faller innenfor et visst område av BMD verdier ble beregnet. BMD områdene valgt var som følger: lav BMD, 0-300 mg/cc; middels BMD, 300-700 mg/cc; høy BMD 700-1000 mg/cc og kortikal BMD, > 1000 mg/cc (tabell 13). Sammenlignet med ovariektomiserte kontroller reduserte PTH behandling signifikant volumet av lav BMD ben og økte volumet av middels BMD ben. Etter fjerning av PTH var det en reduksjon i middels BMD ben og en økning i høy BMD ben, som indikerer at medium BMD ben får høyere tetthet.

Data summerti figur 8 viser at L5 vertebra fra cynomolgus aper behandlet i 18 måneder med PTH responderer med signifikant økning i benmasse; trabekulær tykkelse og trabekulær binding, med marginale effekter på ytre dimensjoner (X-areal) av vertebra. Analyse av fordelingen av benelementer i L5 viser at sterkt mineraliserte benområder forandrer den minste uten tegn til bensklerose. Isteden er det det porøse trabekulære benet som responderer mest på PTH. Skiftet i BMD fører til en substensiell reduksjon i aksial belastning, som indikerer mekanisk forbedring. Som det klart fremgår i histo-grammene av PTH og ovariektomi BMD omdanner PTH lavtetthetsbenvoksler til middels tetthet voksler uten signifikant effekt på høytetthetsvoksler.

Data summert i tabell 2 viser at BMC gjennom midten av vertebra ble signifikant økt ved PTH behandling og en fordelaktig effekt av PTH holdt seg etter 6 måneder etter fjerning. Gjennomsnittlig mekanisk belastning i vertebra ble redusert 36 % ved PTH behandling og holdt seg 23 % under OVX etter fjerning av PTH. Denne studien indikerer at fjerning av PTH behandling i 6 måneder ikke fører til resorpsjon av nylig dannet ben, men isteden ble det en fordelaktig redistribusjon av middels tetthet ben til lavere og høyere tetthetsben. Redistribusjonen fører til fortsatt belastningsreduksjon i vertebra og således forbedret mekanisk funksjon.

Denne primatstudien indikerer at PTH, gitt under fravær av andre medisiner som kan påvirke benet, har fordeler ovenfor både kortikal og trabekulært ben og øker total skjelettbenmasse. Videre resulterer ikke fjerning av PTH i signifikant tap av fordeler tilknyttet PTH behandling i løpet av en periode på minst 2 remodellerende cykler.

Surrogatmarkører er blitt anvendt i andre forsøk for å indikere aktiviteten i ben og de antar at forandringer i verdi reflekterer forandring i benmasse. Selv om det ikke er publisert data på mennesker og primater for å vise at både dannelse og resorpsjons-markører øker, i samsvar med aktivering av benturnover, f.eks, i løpet av tidlig meno-pause eller i aktive sykdomstilstander, antas den høye turnoveren å være indikativ på bentap. Blant ungdom har høy turnover i løpet av modning av det humane skjelettet blitt mindre studert, men er ledsaget av en anabolisk gevinst i benmasse. Et slikt fenomen vil være totalt uventet ved legemiddelbehandling av osteoporose, ifølge litteraturens stand. Således er økning i benturnovermarkører ikke i samsvar med den kjente anabolske effekten av PTH for å øke benmasse og styrke, som vist ved data ifølge foreliggende studie.

Dataene fra denne 18 måneders studien av cynomolgus. aper støtter følgende uventede oppdagalese.

Total signifikant økning i total skjelettmasse

Signifikant økning i" benmasse og styrke av lårbenhalsen.

Ingen bevis på "heling" fra kortikal ben til økt trabekulærben. Økning i benmasse og styrke var statistisk signifikant ved seter anriket av enten kortikalt ben (lårbenhalsen) eller trabekulært ben (lumbar vertebra). På rene kortikalbenseter (lårbenmidtdiafyse), var det en trend for PTH til å stabilisere eller forsiktig øke benmassen og styrken, sammenlignet med ovariektomiserte kontroller.

Forandring i benmarkører i ovariektomiserte aper (og mennesker) reflekterer ikke de fordelaktige anabolske effektene av PTH på skjelettet. Anvendelse av kroppsfluider fra primater ifølge foreliggende studie muliggjør utvikling av nye og mer valide surrogatmarkører.

Retensjon av gevinsten i benmasse og styrken i minst to remodelleringscykler etter fjerning av behandling.

Denne PTH primatstudien er forskjellig fra publiserte studier på rhesus og cynomolgus aper i at den anvender en stor prøvestørrelse for å tilveiebringe tilfredsstillende statistisk signifikans til å oppdage forskjeller som ikke har gått klart frem av forskjellige tidligere mindre studier; kontroller inkluderer både ovariektomiserte primater (anvendt i publiserte studier) og shamoperert, men intakte primater. Den sistnevnte kontrollgruppen har ikke tidligere blitt rapportert i denne type studie, slik at noe av fordelen av PTH og restituering av visse tiltak ovenfor shamkontrollnivåer, sammenlignet med verider for ovariektomiserte dyr, ble bestemt for første gang.

Denne 18 måneders studien av voksne, ville, ovariektomiserte (OVX) cynomolgusaper, Macaca fascicularis, bekreftet effektivitet og sikkerhet i benet etterfølgende behandling med rhPTH(l-34) for både 12 måneder etterfølgende fjerning av behandling i 6 måneder eller behandling i 18 måneder. rhPTH(l-34) økte signifikant benmassen og styrken på ryggraden og lårbenshalsen over ovariektomiserte kontroller til nivåer ekvivalent med eller større enn de med shamkontroller. Hos ovariektomiserte rotter behandlet med rhPTH(l-34) ble målene.for kalsiumhomeostatis (serumkalsium, fosfat og 1,25-dihydroksyvitamin D) reetablert til den for shamkontroller. Serum, urin og histomorfometermålinger anvendt for å bestemme benturnover viste at rhPTH(l-34) opprettholdt dannelseshastigheter ekvivalent med eller høyere enn de for ovariektomiserte kontroller, mens biokjemiske markører av benresporsjon holdt seg ekvivalent med de for shamkontroller. Hos alle dyrene behandlet med rhPTH(l-34) i opptil 18 måneder forandret ikke de farmakokinetiske målene seg over tid og det var ingen akkumulering av rhPTH(l-34). Det var ingen tegn til vedvarende hyperkalsemi eller nyrepatologi etter 18 måneders behandling. Det var ingen forandringer i mineralisering eller remodelleringsperioder. Netto tilvekst i skjelettbenmaterialinnhold observert med rhPTH(l-34) kan bli forklart ved økt bendannelseshastighet og bendanningsoverflate med liten eller ingen effekt på benresorpsjon. Det var ingen signifikant økning i benmineralinnhold, benmineraltetthet og biomekaniske mål av styrke, som inkluderer hardhet og stivhet, ved klinisk relevante seter slik som ryggraden, lårbenshalsen og proksimal tibia.

rhPTH(l-34) økte hastigheten for turnover i kortikalt ben til midtskaftet av humerus og radius, men forandret ikke signifikant benmassen eller biomekaniske mål for styrke sammenlignet med verken ovariektomisert eller shamkontroller. Imidlertid er økning i kortikal bredde og/eller kortikal benareal i samsvar med økning i tverrsnittsmoment av inertia, et mål for styrke og stivhet. rhPTH(l-34) hadde ingen signifikante effekter på iboende materialegenskaper på kortikalt ben. Endokortikal bendannelse ble stimulert, som således øker kortikal bredde og intrakortikal porøsitet. Det synes som om disse forandringene i porøsitet er ansvarlig for opprettholdelsen av benets elastisitet.

Hos aper ble 12 måneders behandling med rhPTH(l-34) fulgt av fjerning i 6 måneder tilknyttet mindre, men fremdeles signifikant, økning i benmasse og styrke i ryggrad og lårbenshals. Etterfølgende fjerning ble ingen signifikante effekter notert på kortikalben-midtskaft av humerus og radius. Benmarkører og histomorfometri viste trender til å returnere til lave turnoververdier målt i shamkontroller.

In vivo mekaniske studier hos gnagere viste at gener tilknyttet anabolsk utkom av rhPTH(l-34) er upregulert i løpet av 1 til 6 timer og økningen i bendannende overflater kan detekteres i løpet av 24 timer etter første dose under fravær av detekterbare effekter på resorpsjon. rhPTH(l-34) synes å rekrutere osteoprogenitorer i S-fase og stimulerer deres differensiering til osteoblaster, og dermed raskt øke prosent bendannende overflater. Enkle eller multiple injeksjoner av rhPTH(l-34) kan gis i løpet av en 1 times periode for å indusere den anabolske effekten i benet. Imidlertid når ekvivalent dose er gitt til unge rotter som multiple injeksjoner i løpet av 6 timer eller 8 timer ble den anabolske effekten opphevet, antakelig på grunn av at forsiktig, begrenset eksponering for rhPTH(l-34) er påkrevet for å indusere den anabolske effekten.

I sum er rhPTH(l -34) anabolsk på benet hos aper og kaniner, som øker benmassen og de biokjemiske styrkemålene ved klinisk relevante seter slik som lumbar ryggraden og lårbenshalsen ved selektiv stimulering av bendannelsen. Økningene i benturnover, endokortikal overflate dannelse og porøsitet, detektert med histomorfometri ved kortikale seter, forandret ikke benmassen eller de biomedisinske målene og benstyrke, men økte tverrsnittsmomentet av inertia ved å øke det kortikalé benarealet og/eller bredden.

Disse studiene viser at administrasjon av paratyroidhormonreseptoraktivatorer, slik som rekombinant human PTH(l-34) forbedrer benkvaliteten både i løpet av og etterfølgende behandling. I virkeligheten viste administrering av PTH en gang daglig i 18 måneder eller med samme dose i 12 måneder etterfølgende en 6 måneders fjerningsfase, markert forbedring av kvaliteten av kortikalt ben av humerus som ble analysert med histomorfometri og polarisert Fourier-transformasjon infrarødt (FTIR) mikroskopi. Denne analysen avdekket at administrasjon av PTH forbedret benkvaliteten ved å erstatte gammelt ben (store krystallitter) med ungt ben (forskjellig størrelse på krystallittene, tenderer til mindre størrelse). Således kan administrasjon av PTH øke kortikal benkvalitet, forbedre mineralisering og aksellerere mineralisering og erstatning av gammelt ben med nytt ben.

Videre, etter fjerning av PTH fra aper gitt lave doser, er den en ytterligere effekt i det matriksen blir mer valgfritt mineralisert og krystallittene modnes. Det vil si at lave doser PTH kan ha ytterligere fordeler i løpet av fjerningsfasen av behandling ved økt mineralisering. Disse data indikerer fordeler av et endelig regime for behandling med PTH fulgt av fjerningsperiode for å oppnå økt fordel. Foreliggende definisjoner av benkvalitet inkluderer ikke disse aspektene med forbedret mineralisering.

I tidligere studier av behandlingsfase av PTH fulgt av en fase uten behandling var behandlingsfasen mindre ertn 1 måned. Den forlengede men endelige behandlingsfasen på 18-24 måneder fulgt av en periode på minst 2 remodelleirngscykler har ikke tidligere blitt utforsket. Den vedvarende fordelen hos primater etter fjerning av behandlingen er en markert kontrast til resultater oppnådd på gnagere etter dosering med PTH. Studier av rotter har enhetlig vist at ben blir raskt mistet etterfølgende fjerning av behandling. Gunness-Hey, M. and Hock, J.M. (1989) Bone 10: 447-452; Shen, V. et al (1993) J. Clin. Invest 91:2479-2487; Shen, V. et al (1992) Calvif. Tissue Int. 50: 214-220; and Mosekilde, L. et al (1997) Bone 20: 429-437.

En slik fremgangsmåte for å øke benmineralisering har ikke tidligere blitt observert og er uventet, som avdekker en ny fremgangsmåte hvor PTH styrker benet og gjør benet hardere og kan hindre frakturer. Denne nye fremgangsmåten inkluderer økning og regulering av mineraliseringen, for å tilveiebringe harde, stivere og mer frakturresistent ben. Slike fordelaktige effekter krever mer enn ny matriksdannelse. Disse oppdagelsene indikerer at PTH har fordeler hos pasienter med immobiliserte ben eller skjelett, eller ved skjelettsvakhet i mineralet, forutsatt at det også er adekvat kalsium og vitamin D supplementering.

Eksempel 3 - Økt benstyrke og tetthet, og reduserte frakturer etter administrasjon

av rhPTH(l-34) til mennesker

Antall subjekter: rhPTH(l-34): 1093 påmeldt, ,848 avsluttet.

Placebo: 544 påmeldt, 447 avsluttet.

Diagnose og inklusjons- Kvinner fra 30 til 85 år, postmenopausale i minst 5 år, kriterium: med minimum en moderat eller to milde atraumatiske

vertebrale frakturer.

Dosering og administrasjon: Testprodukt ( blindet)

rhPTH(l-34): 20 ug/dag, gitt subkutant rhPTH(l-34): 40 ug/dag, gitt subkutant

Referanseterapi ( blindet)

Placebostudiemateriale for injeksjon

Varighet for behandling: rhPTH(l-34): 17-23 måneder (ekskluderer 6 måneder kjøring i fase)

Placebo: 17-23 måneder (ekskluderer 6 måneder kjøring i fase)

Kriterier for evaluering: Ryggradrøntgen; serumbiologiske markører (kalsium,

benspesifikk alkalisk fosfatase, prokollagen I karboksy-terminal propeptid); urinmarkører (kalsium, N-telopeptid, fri deoksypyirdinolin); 1,25-dihydroksyvitamin D; benmineraltetthet; ryggrad, hofte, vrist og total kropp; høyde;

populasjon farmakokinetikker; benbiopsi (utvalgte studie-seter).

Pasientkarakteristikker

Data fra denne kliniske undersøkelsen inkluderer totalt 1637 kvinner behandlet med rekombinant humant paratyroidhormon(l-34), rhPTH(l-34), 0,20 eller 40 ug/dag og supplementert med vitamin D og kalsium, i 18-24 måneder, som viser resultater rapportert i tabellene 15-19.

Tabell 15 illustrerer data som viser reduksjon etter behandling med PTH og antallet og alvorligheten til vertebrale frakturer. Ved å sammenligne alle PTH behandlede pasienter med placebo var den totale reduksjonen i antall pasienter med vertebrale frakturer 67 %

(p<0,001), med en 65 % reduksjon (p>0,001) ved 20 ug/dag PTH sammenlignet med placebo, og en 69 % reduksjon ved 40 ug/dag PTH sammenlignet med placebo (tabell 15). Sammenligne alle PTH behandlede pasienter med placebo er den totale reduksjon i antall pasienter med multiple vertebrale frakturer 81 % (p>0,001), med en 77 % reduksjon (p>0,001) ved 20 ug/dag PTH sammenlignet med placebo, og 86 % reduksjon ved 40 ug/dag PTH sammenlignet med placebo. Sammenligning av alle PTH behandlede pasienter med placebo er den totale reduksjon i antall pasienter med moderat til alvorlig vertebrale frakturer 84 % (p>0,001), med en 90 % reduksjon (p>0,001) med 20 ug/dag PTH sammenlignet med placebo og en 78 % reduksjon ved 40 ug/dag PTH sammenlignet med placebo (tabell 15).

<**> Moderate frakturer resulterer i mer enn 25 % tap av vertebral høyde (eller et ekvivalent mål). Alvorlige frakturer resulterer i mer enn 40 % av vertebral høyde (eller et ekvivalent mål). Frakturer er som definert av Genant et al (1993) Vertebra fraktur-beregning ved anvendelse av en semikvantitativ teknikk; J. Bone & Min Res 81137-1148. Tabell 16 illustrer effekten av behandling med PTH på antallet frakturer med forskjellige ikke-vertebrale ben i kroppen. Antallet frakturer viser reduksjon ved hver av hofte, radius, ankel, humerus, ribben, fot, pelvis og andre seter (tabell 16). Reduksjonen er statistisk signifikant når den sees på som reduksjon i totalantallet frakturer blant PTH behandlede pasienter sammenlignet med placebobehandlede pasienter. Reduksjonen er enda mer signifikant når den sees på som reduksjon i totalt antall frakturer av hofte, radius, ankel, humerus, ribben, fot og pevis blant PTH behandlede pasienter sammenlignet med placebobehandlede pasienter (tabell 16).

Effekten av PTH på benmineralinnhold (BMC), benmineraltetthet (BMD) og benareal ble bestemt ved dobbel energiabsorpsjonsmåling (DEXA) og resultatene rapportert i

tabellene 17-19. PTH administrasjon forårsaket tilsynelatende økning i BMC ved pasientens lumbarryggrad, lårben og hofte, vrist og gjennom hele pasientens kropp

(tabell 17). Behandling med PTH forårsaket signifikant økning i pasientens BMD ved lumbarryggrad, lårben og hofte (tabell 18). Økningen ved lumbarryggraden, lårben og hofte var statistisk signifikant med p<0,001 (tabell 18). Benarealet økte tilsynelatende etter PTH behandling for pasientens lumbarryggrad, lårben og hofte (tabell 19). Økningen var statistisk signifikant for lumbarryggrad og hoftehals (tabell 19).

Effekten av PTH på hele kroppen er målet for benkvantitet og benkvalitet, BMC, særlig signifikant. Denne hele kroppen effekten indikerer at mengden av ben i pasientens kropp øker. PTH resulterer ikke bare i bevegelse av masse fra en del til pasientens kropp til en annen. Isteden øker behandling med PTH mengden og kvaliteten av ben i pasientens kropp.

Figur 9 og 10 illustrerer økningene over tid i lumbarryggrad BMD og lårben/hoftehals BMD, respektivt for PTH behandlede og placebokontrollpasienter. Pasientens lumbarryggrad BMD øker hele tiden i minst ca 12 måneder, uten eller med mindre signifikant økning over de etterfølgende måneder. Pasientens lårben/hofteben BMD synes å øke i minst 18 måneder, og kan øke etter ytterligere varighet på PTH behandlingen.

I sum indikerer dataene presentert ovenfor at pasienter behandlet med PTH har reduserte frakturer. Særlig reduserer PTH behandling med mer enn 66 % når det gjelder antallet pasienter med tidligere vertebrale frakturer som lider av nye vertebrale frakturer. PTH behandling reduserer også mer enn 78 % når det gjelder antallet pasienter med tidligere vertebrale frakturer som lider av nye multiple vertebrale frakturer. I tillegg reduserer PTH alvorligheten av vertebrale frakturer, med en signifikant reduksjon på 78 % når det gjelder antallet pasienter med moderate eller alvorlige frakturer. Pasienter som mottar PTH har fordel av en signifikant reduksjon i alle ikke-vertebrale frakturer (som inkluderer frakturer i hofte, radius, vrist, pelvis, fot, humerus, ribben eller ankel) med signifikans og et nivå på p<0,007. Benkvaliteten øker i tillegg. Pasienter med tidligere fraktur har fordel av en signifikant økning i benmineralinnhold i hofte, ryggrad og hele kroppen. Denne økningen indikerer at frakturreduksjon på disse setene kan finne sted så tidlig som etter 12 måneders behandling.

Disse data vedrørende frakturer er de første data på frakturreduksjon ved PTH hos mennesker. Disse oppdagelsene demonstrerer en forbedring i benkvalitet og benstyrke, som de prekliniske data rapportert ovenfor. Disse resultatene viser også forbedringer i benkvalitet og styrke på ikke-vertebrale seter. Oppdagelsene av en reduksjon i antallet frakturer som holdt seg i løpet av den 18-23 måneders behandlingsperioden har tidligere ikke blitt observert i kliniske eller prekliniske studier.

Spørsmålet vedrørende om PTH alene øker hardhet og styrke av ben for å forbedre resistens mot fraktur har tidligere ikke blitt testet på mennesker. Den publiserte litteraturen har hele tiden antatt at PTH må bli gitt i kombinasjon med et antiresorptiv eller østrogen. Tidligere publiserte kliniske forsøk inkluderte for små pasient-populasjoner for å bestemme en signifikant reduksjon av fraktur. I en studie kunne fordelene ved PTH alene ikke bli bestemt fordi det ikke var noen placebokontroller. I en andre studie, ved anvendelse av den vanlig aksepterte definisjonen av fraktur, ble ingen reduksjon i fraktur observert.

Oppdagelsene av en reduksjon av frakturer ved kombinerte ikke-vertebrale seter er særlig uventet i lys av den vanlige oppfatningen om at PTH har negative effekter på slike seter. Vanlige dogmer fremholder at PTH vil øke kortikal porøsitet og derfor svekke benet, særlig tidlig i terapi. Videre angir dette dogmet at kortikale benseter har høy risiko for fraktur og PTH vil ikke gi noen fordel i frakturreduksjon ved ikke-vertebrale seter. Dogmet fastholder også at PTH alene lite trolig vil være effektivt og vil kreve samtidig antiresorptiv terapi for å blokkere negative effekter på kortikalt ben. Foreliggende data viser de tidligere ikke observerte fordelene ved PTH gitt til pasienter som mottar vitamin D og kalsiumsupplementer. Uventet styrker PTH benet for å redusere antallet nye frakturer hos en pasient med risiko for multiple frakturer i ryggraden, med risiko for ytterligere ikke-vertebrale frakturer, med risiko for moderat til alvorlige ytterligere frakturer av ryggraden, og lignende.

Denne kliniske studien av post-menopausale kvinner viser særlig fordeler ved behandling av pasienter med lav dose (20 ug/dag) siden dosen av PTH (som høye doser kan vise bivirkninger hos noen pasienter) ble redusert, men frakturhindring og frakturreduksjon ble bibeholdt og på samme måte med de som ble observert ved høy dose (40 ug/dag). FT-IR apedata ga en mulig, men ikke begrensende, mekanismeforklaring. Apestudien viser at lavdose PTH øker krystallformasjon og aksellererer mineralisering i kortikalt ben. I tillegg viste lavdoseaper ytterligere fordeler etter fjerning, idet PTH økte mineralinnholdet i benet. De foreliggende data viser den nye oppdagelsen om at PTH gitt med lave doser til pasienter som mottar vitamin D og kalsiumsupplementer er effektiv til å hindre både vertebrale og ikke-vertebrale frakturer. I motsetning til den vanlige antakelsen styrker PTH ben ved ikke-vertebrale seter for å hindre nye frakturer eller redusere alvorligheten til frakturene, tilsynelatende ved å forbedre mineraliseringen og mineralinnholdet til benet.

Foreliggende oppfinnelse har blitt beskrevet med referanse til forskjellige spesifikke og foretrukne utførelsesformer og teknikker. Imidlertid er det å forstå at mange variasjoner og modifikasjoner kan gjøres samtidig som man holder seg innenfor ånden og omfanget av oppfinnelsen. Alle publikasjoner og patentsøknader i denne beskrivelsen er indikative for nivået til en fagmann som foreliggende oppfinnelse angår.

Claims (3)

1. Anvendelse av et pararyroidhormon bestående av aminosyresekvens 1-34 til humant paratyroidhormon for fremstilling av et medikament for samtidig å redusere risiko for både vertebral og ikke-vertebral benfraktur hos en post-menopausal kvinne som har eller med risiko for å oppnå osteoporose, hvori nevnte medikament administreres ved subkutan injeksjon til nevnte kvinne uten samtidig administrasjon av et antiresorptivt middel forskjellig fra vitamin D eller kalsium, i en daglig dose på 20 ug i minst ca. 12 måneder opp til 3 år.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori nevnte daglige dose som administreres skjer i løpet av minst ca. 24 måneder.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvori nevnte medikament er innbefattet i et pakningsmateriale, nevnte pakningsmateriale innbefatter trykt materiale som indikerer at nevnte medikament er effektivt for samtidig å redusere risiko for både ryggrad og ikke-ryggrad benfraktur hos en post-menopausal kvinne med risiko for å oppnå osteoporose når det administreres til nevnte kvinne slik at nevnte paratyroidhormon administreres uten samtidig administrasjon av et antiresorptivt middel forskjellig fra vitamin D eller kalsium, i en daglig dose på 20 ug i minst 12 måneder og opp til 3 år.