PT2907522T - Método para aumentar a dureza e rigidez óssea e para reduzir fraturas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA AUMENTAR A RESISTÊNCIA E RIGIDEZ ÓSSEA E PARA REDUZIR FRATURAS"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção refere-se a métodos para aumentar a resistência e/ou rigidez óssea e/ou reduzir a probabilidade e/ou gravidade da fratura óssea por administração de uma hormona paratiroideia. Mais particularmente, a invenção refere-se a um método para aumentar a resistência ou rigidez óssea num local de um traumatismo potencial ou real, tal como a anca ou a coluna vertebral de uma pessoa em risco de osteoporose ou que sofra de osteoporose. Mais particularmente, a invenção refere-se a um método para reduzir a incidência de fratura vertebral, reduzir a incidência de múltiplas fraturas vertebrais, reduzir a gravidade da fratura vertebral e/ou reduzir a incidência de fratura não-vertebral.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Agentes existentes tais como estrogénio, bisfosfonatos, fluoreto ou calcitonina podem prevenir a perda óssea e induzir um aumento de 3 - 5% de massa óssea por reenchimento do espaço de remodelação, mas a formação óssea global não é estimulada significativamente. A retenção de osso por inibição da renovação óssea pode não ser proteção suficiente contra o risco de fratura para doentes que já têm perda óssea significativa. Os agentes anabólicos que aumentam a resistência óssea por estimulação da formação de osso podem preferencialmente proporcionar melhor proteção contra fratura em doentes com osteoporose estabelecida. A hormona paratiroideia (PTH) é um produto de 84 aminoácidos segregado a partir da glândula paratiroide de mamífero que controla os níveis séricos de cálcio através da sua ação em vários tecidos, incluindo osso. Os 34 aminoácidos do N-terminal da PTH (PTH(1-34)) bovina e humana são considerados biologicamente equivalentes à hormona de tamanho total. Outros fragmentos amino-terminais de PTH (incluindo 1-31 e 1-38, por exemplo), ou PTHrP (péptido/proteína relacionado com PTH) ou análogos de qualquer um ou de ambos, que ativam o recetor de PTH/PTHrP (recetor PTH1), mostraram efeitos biológicos semelhantes na massa óssea, embora a magnitude de tais efeitos possa variar.

Estudos em seres humanos com várias formas de PTH demonstraram um efeito anabólico no osso, e despoletaram um interesse significativo na sua utilização para o tratamento da osteoporose e de distúrbios relacionados com ossos. Os efeitos anabólicos significativos da PTH no osso, incluindo a estimulação da formação óssea que resulta num ganho global de massa e/ou resistência óssea, foram demonstrados em muitos modelos animais e em seres humanos.

Crê-se habitualmente que a administração de PTH em seres humanos e em modelos animais relevantes tem um efeito negativo no osso cortical. De facto, aumentos naturais em PTH endógena, que ocorrem no distúrbio de hiperparatiroidismo, resultam no adelgaçamento do osso cortical acompanhado de um aumento na conectividade e massa do osso trabecular. Estudos no passado sugerem que quando o osso cortical Haversiano (encontrado em seres humanos e em mamíferos superiores) remodela sob a influência de PTH, haverá uma redistribuição óssea de modo que a massa óssea cortical e a resistência diminua, enquanto o osso

trabecular aumenta em massa e resistência. Por exemplo, em estudos clínicos publicados de administração de PTH, a massa óssea cortical diminuiu após tratamento com PTH exógena e estes resultados levantaram preocupações de que o tratamento de PTH conduziria a massa óssea cortical e resistência reduzidas. Uma preocupação suscitada por tais estudos é que haveria uma perda de massa óssea esquelética total devido à perda de osso cortical. Isto tem elevada importância clínica uma vez que na osteoporose, uma maior perda de osso trabecular comparativamente à perda de osso cortical, significa que a carga mecânica é predominante suportada pelo osso cortical restante. A perda continuada de osso cortical aumentaria o risco de fratura. Consequentemente, é importante que um agente terapêutico para a osteoporose mantenha ou aumente o osso cortical residual de um indivíduo.

Os efeitos de PTH no osso cortical foram investigados em animais não humanos através de remodelação Haversiana, tais como cães, doninhas, ovelhas e macacos, mas os tamanhos de amostra são tipicamente demasiados pequenos para análise estatística fiável. 0 impacto das alterações induzidas pelo tratamento de PTH nas propriedades mecânicas de osso cortical em tais animais permanece desconhecido. Os estudos publicados em roedores mostraram uma massa óssea cortical aumentada durante a administração de PTH, mas uma perda deste benefício após a retirada da PTH. Contudo, o osso cortical de roedor tem uma estrutura distintamente diferente do osso cortical Haversiano, e remodela-se por formação aposicional superficial e reabsorção, em vez de remodelação intracortical de osteões. Além disso, as limitações tecnológicas no teste biomecânico nos ossos relativamente curtos de roedores origina artifícios de medição quando um agente, tal como PTH, altera a geometria óssea para engrossar o osso. Tais artifícios fazem a extrapolação das respostas do osso cortical de rato para àquelas dos seres humanos ou de outros animais com remodelação osteonal não fiável. Consequentemente, a data existente para animais, como os seres humanos, para se submeterem a remodelação Haversiana indica que a PTH pode ter um impacto adverso no osso cortical, causando perda global da massa óssea através da depleção de osso cortical.

Consequentemente, tem sido uma ideia muito divulgada, em relação à ação da PTH, que os doentes requerem tratamento simultâneo ou subsequente com um anti-reabsortivo para minimizar a perda de osso induzida por PTH. Por exemplo, três ensaios clinicos usaram PTH em mulheres pós-menopáusicas em terapia simultânea com calcitonina ou estrogénio (por exemplo, Lindsay et ai., 1997, The Lancet 350:550-5), ou em mulheres pré-menopáusicas que tomam o agonista de GnRH, Synarel, para a endometriose. Os efeitos opostos do estrogénio e da PTH na renovação do osso cortical tornam particularmente dificeis de observar os efeitos de apenas PTH durante a terapia de combinação com estes dois agentes.

Permanece a necessidade para um método para empregar uma PTH para aumentar a resistência e a rigidez óssea em seres humanos e noutros animais que apresentam remodelação Haversiana, e para reduzir a incidência de fratura óssea nestes animais. Além disso, permanece a necessidade para um método para aumentar a qualidade e a quantidade de osso cortical.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona PTH(1-34) humana para utilização na prevenção ou redução da incidência de fratura vertebral e não-vertebral num ser humano com osteoporose ou em risco de progressão para osteoporose, em que a PTH(1-34) é administrada por injeção subcutânea a uma dose de 20 yg/dia, em que o ser humano também recebe doses eficazes de cálcio e de vitamina D. A PTH(l-34) é formulada com um tampão e um excipiente, com um agente de tamponamento capaz de manter a solução numa gama de pH de 3 a 7, 0 ser humano pode ser uma mulher, tal como uma mulher pós-menopáusica.

Os aumentos na resistência e/ou rigidez óssea podem persistir durante diversos ciclos de remodelação, ou até diversos anos, após a última administração da hormona paratiroideia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras IA e 1B mostram que a BMD (densidade mineral óssea) e o BMC (teor mineral ósseo) na diáfise femoral (osso cortical) (A) e no fémur proximal (osso esponjoso + osso cortical) (B) foram significativamente maiores em animais tratados com PTH do que controlos em ambas as doses.

As Figuras 2A a 2D mostram os efeitos de PTH na resistência mecânica e no momento de inércia de seção transversal (CSMI) no osso cortical da diáfise femoral. A Figura 3 ilustra a variação percentual em medidas de DXA do teor mineral de osso inteiro em grupos de controlo e de tratamento.

As Figuras 4A-C ilustram a variação percentual em medidas de DXA da coluna vertebral para grupos de controlo e de tratamento nas vértebras lombares 2-4 para área óssea (A) , teor mineral ósseo (B) e densidade mineral óssea (C) .

As Figuras 5A e 5B ilustram o aumento em massa óssea (A) e resistência óssea (B) em vértebras lombares de primatas tratados com uma hormona paratiroideia.

As Figuras 6A e 6B ilustram o aumento na resistência do colo do fémur (A) e na resistência constante da diáfise média do úmero (B) em primatas tratados com uma hormona paratiroideia. A Figura 7 ilustra a ativação das taxas de formação óssea em superficies endostal e periostal da diáfise do úmero. A Figura 8 ilustra a análise de histograma do desvio em densidades ósseas voxel em vértebras lombares, resultantes do tratamento de PTH comparativamente ao controlo. Note o aumento na densidade no compartimento do osso cortical após retirada do tratamento de PTH. A Figura 9 ilustra aumentos em BMD da coluna vertebral lombar ao longo de 23 meses de tratamento de doentes com PTH, comparativamente a controlos tratados com placebo. A Figura 10 ilustra aumentos em BMD do colo do fémur e anca ao longo de 24 meses de tratamento de doentes com PTH, comparativamente a controlos tratados com placebo.

DESCRIÇÃO DETALHADA A redução da incidência de fratura inclui geralmente a diminuição da probabilidade ou da incidência real de fratura para um indivíduo comparativamente a uma população de controlo não tratada.

Como aqui usado, força última refere-se à força máxima que um espécime de osso suporta; a rigidez refere-se ao declive da porção linear de uma curva de carga-deformação; e o trabalho até rutura refere-se à área sob a curva de carga-deformação antes da rutura. Cada uma destas pode ser medida e calculada por métodos convencionais na técnica de estudo dos ossos. Estes parâmetros são propriedades estruturais que dependem das propriedades materiais intrínsecas e da geometria, e podem ser determinados como descrito em Turner CH, Burr DB 1993 "Basic biomechanical measurements of bone: a tutorial." Bone h4:595-608, que é aqui incorporado por referência. A força última, rigidez e trabalho até rutura podem ser normalizados para se obterem propriedades materiais intrínsecas, tais como força última, módulo elástico e resistência, que são independentes do tamanho e da forma. Como aqui usada, a força última refere-se à tensão máxima que um espécime pode suportar; o módulo elástico refere-se a rigidez intrínseca do material; e a resistência refere-se à resistência para fraturar por unidade de volume. Cada um destes pode ser determinado por métodos conhecidos na técnica. I_d. A resistência do osso femoral, como aqui referida, pode ser medida no colo do fémur, ou na diáfise, usando tipicamente flexão de três pontos ou quatro pontos no último local.

Traumatismo ósseo A invenção tem beneficio para um indivíduo que possa sofrer ou ter sofrido de traumatismo em um ou mais ossos. Um ser humano pode sofrer qualquer um de uma variedade de traumatismos ósseos devidos, por exemplo, a acidente, intervenção médica, doença ou distúrbio. Nos jovens, o traumatismo ósseo é provavelmente devido a fratura, intervenção médica para reparar uma fratura, ou a reparação de articulações ou tecido conjuntivo lesado, por exemplo, através de atletismo. Outros tipos de traumatismo ósseo, tais como aqueles da osteoporose, doença degenerativa óssea (tal como artrite ou osteodistrofia), substituição da anca, ou estados secundários associados com terapia para outros estados sistémicos (por exemplo, osteoporose glucocorticoide, queimaduras ou transplantação de órgãos) são encontrados mais frequentemente em pessoas mais idosas.

Os indivíduos são humanos, preferencialmente, uma mulher, em risco de sofrer osteoporose ou que sofra de osteoporose. Os fatores de risco para a osteoporose são conhecidos na técnica e incluem estados hipogonadais em homens e mulheres, independentemente da idade, estados, doenças ou fármacos que induzem hipogonadismo, fatores nutricionais associados com a osteoporose (sendo mais comum baixo cálcio ou vitamina D) , tabagismo, álcool, fármacos associados com a perda óssea (tais como glucocorticoides, tiroxina, heparina, lítio, anticonvulsivos etc.), perda de visão que predispõe às quedas, viagens no espaço, imobilização, hospitalização crónica ou em estado acamado, e outras doenças sistémicas que foram associadas a risco aumentado de osteoporose. As indicações da presença de osteoporose são conhecidas na técnica e incluem evidência radiológica de pelo menos uma fratura de compressão vertebral, baixa massa óssea (tipicamente pelo menos 1 desvio padrão abaixo dos valores normais médios para jovens) e/ou fraturas atraumáticas. A osteoporose pode conduzir, por exemplo, a fraturas vertebrais e/ou não-vertebrais. Os exemplos de fraturas não-vertebrais incluem uma fratura da anca, uma fratura de um antebraço distai, uma fratura de um úmero proximal, uma fratura de um pulso, uma fratura de um rádio, uma fratura de um tornozelo, uma fratura de um úmero, uma fratura de uma costela, uma fratura de um pé, uma fratura de uma bacia, ou uma combinação destas. 0 método da invenção pode ser usado para diminuir o risco de tais fraturas ou para tratar tais fraturas. 0 risco de fratura é diminuído e a cura de uma fratura é auxiliada por aumento da resistência e/ou rigidez óssea, por exemplo, na anca, na coluna vertebral ou em ambos. Uma mulher típica em risco de osteoporose é uma mulher pós-menopáusica ou uma mulher pré-menopáusica, hipogonadal. Um indivíduo preferido é uma mulher pós-menopáusica e é independente de terapêutica simultânea de substituição hormonal (HRT), estrogénio ou terapia equivalente, ou terapia anti-reabsortiva. A invenção pode beneficiar um indivíduo em qualquer fase da osteoporose, mas especialmente nas fases precoces e avançadas. A invenção é eficaz para prevenir ou reduzir a incidência de fraturas vertebrais e não-vertebrais num indivíduo com osteoporose ou em risco de progressão para osteoporose. Por exemplo, a presente invenção pode reduzir a incidência de fratura vertebral e não-vertebral, reduzir a gravidade da fratura vertebral, reduzir a incidência de fratura vertebral múltipla, melhorar a qualidade óssea e semelhantes. A invenção pode beneficiar doentes com baixa massa óssea ou fratura prévia que estão em risco de múltiplas fraturas esqueléticas futuras, tais como doentes em que a osteoporose espinal pode progredir rapidamente.

Resistência e rigidez óssea

Geralmente a resistência ou rigidez do osso resulta da massa e da resistência do osso cortical, trabecular e esponjoso. A invenção pode proporcionar níveis de resistência, rigidez, massa, e/ou solidez óssea dentro ou acima da gama da população normal. Preferencialmente, a invenção proporciona niveis aumentados relativos aos niveis que resultam de traumatismo ou que originam risco de traumatismo. Resistência crescente, rigidez crescente, ou ambas, diminuem o risco ou a probabilidade de fratura comparativamente a uma população de controlo não tratada.

Determinadas caracteristicas do osso quando aumentadas proporcionam resistência e/ou rigidez óssea aumentada. Tais caracteristicas incluem densidade mineral óssea (BMD), teor mineral ósseo (BMC), frequência de ativação ou taxa de formação óssea, número trabecular, espessura trabecular, trabecular e outra conectividade, formação óssea periostal e endocortical, porosidade cortical, massa óssea e área óssea de seção transversal, resistência à carga e/ou trabalho até rutura. Um aumento em uma ou mais destas caracteristicas é um resultado preferido do método da invenção.

Determinadas caracteristicas do osso, tais como espaço medular e módulo elástico, quando diminuídas proporcionam resistência e/ou rigidez óssea aumentada. Um osso mais novo (mais resistente e mais rijo) tem cristalitos que são geralmente menores do que cristalitos de um osso mais velho. Assim, geralmente a redução do tamanho de cristalitos ósseos aumenta a resistência e a rigidez óssea, e pode reduzir a incidência de fratura. Além disso, a maturação de cristalitos de um osso pode proporcionar características desejáveis adicionais ao osso, incluindo resistência e rigidez óssea aumentadas e/ou pode reduzir a incidência de fratura. Uma diminuição em uma ou mais destas caracteristicas pode ser um resultado preferido do método da invenção. A invenção é eficaz para aumentar a resistência e/ou rigidez de alguns de vários ossos. Por exemplo, pode aumentar a resistência e/ou rigidez de ossos que incluem um osso da anca, tal como um iliaco, um osso da perna, tal como um fémur, um osso da coluna vertebral, tal como uma vértebra, ou um osso de um braço, tal como um osso do antebraço distai ou um úmero proximal. Este aumento na resistência e/ou na rigidez pode ser encontrado ao longo do osso, ou estar localizado a determinadas porções do osso. Por exemplo, a resistência e/ou rigidez de um fémur pode ser aumentada por aumento da resistência e/ou rigidez de um colo do fémur ou de um trocânter do fémur. A resistência e/ou rigidez de um anca pode ser aumentada por aumento da resistência e/ou rigidez de uma crista iliaca ou de uma espinha iliaca. A resistência e/ou rigidez de uma vértebra pode ser aumentada por aumento da resistência e/ou rigidez de um pediculo, lâmina ou corpo. Vantajosamente, o efeito é em vértebras em determinadas porções da coluna vertebral, tais como vértebras cervicais, torácicas, lombares, sacras e/ou cóccix. Preferencialmente, o efeito é em uma ou mais vértebras mid-torácicas e/ou lombares superiores. 0 aumento na resistência e/ou na rigidez pode ser encontrado em cada um dos tipos de ossos, ou predominantemente em um tipo de osso. Os tipos de ossos incluem osso esponjoso (esponjoso, trabecular ou lamelar) e osso compacto (cortical ou denso) e calo de fratura. 0 método da invenção aumenta, preferencialmente, a resistência e/ou rigidez com os seus efeitos em osso esponjoso e cortical, ou apenas em osso cortical. 0 osso trabecular, o osso a que o tecido conjuntivo se liga, pode também aumentar a resistência e/ou rigidez pelo presente método. Por exemplo, é vantajoso proporcionar resistência adicional a um local de ligação a um ligamento, tendão e/ou músculo. 0 aumento da resistência ou rigidez pode reduzir a incidência de fratura. Neste aspeto, o aumento de resistência ou rigidez podem incluir a redução da incidência de fratura vertebral, redução da incidência de fratura grave, redução da incidência de fratura moderada, redução da incidência de fratura não-vertebral, redução da incidência de fratura múltipla, ou uma combinação das mesmas.

Hormona paratiroideia A hormona pode ser obtida por métodos recombinantes ou sintéticos conhecidos, tal como descritos na PAT. U.S. N° 4,086,196. A invenção usa PTH(l-34) humana, também conhecida como teriparatida. Soluções estabilizadas de PTH(l-34) humana, tal como PTH(l-34) humana recombinante (rhPTH(l-34)). Podem ser utilizadas formas cristalinas de PTH(l-34) humana.

Administração de hormona paratiroideia A hormona paratiroideia é administrada por injeção subcutânea. Podem ser vantajosamente utilizadas formulações estabilizadas de PTH(l-34) humana. Uma solução estabilizada de uma hormona paratiroideia pode incluir um agente estabilizador, um agente de tamponamento, um conservante e semelhantes. 0 agente estabilizador incorporado na solução ou na composição inclui um poliol que inclui um sacárido, preferencialmente, um monossacárido ou um dissacárido, por exemplo, glicose, trealose, rafinose, ou sacarose; um álcool de açúcar, tal como, por exemplo, manitol, sorbitol ou inositol, e um álcool poli-hídrico, tal como glicerina ou propilenoglicol ou suas misturas. Um poliol preferido é manitol ou propilenoglicol. A concentração de poliol pode variar de cerca de 1 a cerca de 20% em peso, preferencialmente, cerca de 3 a 10% em peso da solução total. O agente de tamponamento utilizado na solução ou na composição da presente invenção pode ser qualquer combinação de ácido ou sal que seja farmaceuticamente aceitável e capaz de manter a solução aquosa numa gama de pH de 3 a 7, preferencialmente, 3-6. Os sistemas de tamponamento úteis são, por exemplo, fontes de acetato, tartarato ou citrato. Os sistemas de tampão preferidos são fontes de acetato ou tartarato, sendo muito preferida uma fonte de acetato. A concentração do tampão pode ser cerca de 2 mM a cerca de 500 mM, preferencialmente, cerca de 2 mM a 100 mM. A solução ou composição estabilizada da presente invenção podem também incluir um conservante parentericamente aceitável. Tais conservantes incluem, por exemplo, cresóis, álcool benzilico, fenol, cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio, clorobutanol, álcool feniletilico, metilparabeno, propilparabeno, timerosal e nitrato e acetato de fenilmercúrio. Um conservante preferido é m-cresol ou álcool benzilico; é muito preferido m-cresol. A quantidade de conservante utilizado pode variar de cerca de 0,1 a cerca de 2% em peso, preferencialmente, cerca de 0,3 a cerca de 1,0% em peso da solução total.

Assim, a solução estabilizada de teriparatida pode conter manitol, acetato e m-cresol com uma estabilidade em armazenamento prevista de mais de 15 meses a 5°C.

As composições de hormona paratiroideia podem, se desejado, ser proporcionadas numa forma de pó contendo não mais de 2% em peso de água, que resulta da liofilização de uma solução de hormona aquosa estéril preparada por mistura da hormona paratiroideia selecionada, um agente de tamponamento e um agente estabilizador como descrito acima. Especialmente útil como um agente de tamponamento quando se preparam pós liofilizados é uma fonte de tartarato. Agentes estabilizadores particularmente úteis incluem glicina, sacarose, trealose e rafinose. A hormona paratiroideia é formulada com tampões e excipientes típicos utilizados na técnica para estabilizar e solubilizar proteínas para administração parentérica. Os veículos farmacêuticos reconhecidos na técnica e as suas formulações são descritos em Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences," 15a Ed.; Mack Publishing Co., Easton (197 5) . A hormona paratiroideia é formulada por administração de uma dose eficaz para aumentar a resistência e/ou rigidez de um ou mais dos ossos de um indivíduo e/ou para reduzir a probabilidade e/ou a gravidade da fratura óssea. Preferencialmente, uma dose eficaz proporciona uma melhoria na estrutura do osso cortical, massa e/ou resistência. Preferencialmente, uma dose eficaz reduz a incidência de fratura vertebral, reduz a incidência de múltiplas fraturas vertebrais, reduz a gravidade da fratura vertebral e/ou reduz a incidência de fratura não-vertebral. Preferencialmente, um indivíduo que recebe a hormona paratiroideia também recebe doses eficazes de cálcio e vitamina D, que podem aumentar os efeitos da hormona .

Os benefícios da administração de uma hormona paratiroideia persistem após um período de administração. Os benefícios de diversos meses de administração podem persistir durante tanto quanto um ano ou dois, ou mais, sem administração adicional.

Uma composição farmacêutica que inclui uma formulação de PTH(l-34) humana é apropriada para administração parentérica. Por exemplo, uma formulação líquida ou sólida pode ser fabricada de diversos modos, usando técnicas convencionais. Uma formulação líquida pode ser fabricada por dissolução de PTH(l-34) humana, num solvente apropriado, tal como água, num pH apropriado, incluindo tampões ou outros excipientes, por exemplo para formar uma das soluções estabilizadas descritas acima.

Os exemplos que seguem são ilustrativos da invenção e não pretendem limitar a mesma.

EXEMPLOS

Exemplo de referência 1 - Resistência e densidade óssea aumentada após administração de rhPTH(l-34) a coelhos

Procedimentos experimentais

Coelhos brancos Nova Zelândia intactos fêmeas (HRP Inc. Denver, Pa.), um dos animais mais pequenos que formam osteões por remodelação intracortical, de aproximadamente 9 meses de idade e pesando 3,25-3,75 kg, foram divididos por peso corporal médio de grupo em 3 grupos de 6 animais cada. Dois grupos experimentais receberam PTH(l-34) biossintético em doses de 10 ou 40 yg/mL/kg/dia. Ao grupo de controlo foi dado 1,0 mL/kg/dia de soro fisiológico 0,9M acidificado contendo 2% de soros de coelho termo-inativados. PTH(l-34) ou veiculo foi injetado por injeções subcutâneas uma vez por dia, em 5 dias por semana durante 140 dias. Os coelhos foram alimentados com ração de coelho de laboratório contendo 0,5% de Ca e 0,41% de P, e dada água ad libitum. A seleção das doses foi baseada numa série de estudos preliminares que mostram que (1) após uma única injeção de PTH(l-34) a 100 yg/kg, o cálcio sérico aumentou e não foi capaz de retornar à linha de base em 24 horas, enquanto após uma única dose de 50 yg/kg, o cálcio sérico retornou à linha de base dentro de 24 horas, (2) injeções repetidas de 20 yg/kg PTH(l-34) resultaram num subida transiente no cálcio sérico com retorno aos valores da linha de base em 6-24 horas, e (3) PTH(l-34) a ã 5 yg/kg não alterou a histomorfometria das superficies ósseas.

Um grupo de marcadores duplos de alizarina (Sigma, St Louis) foi dado i.m. a 20 mg/kg nos dias 55 e 63, e um grupo de marcadores duplos de calceina (Sigma, St Louis) foi dado s.c. a 5 mg/kg nos dias 15 e 7, antes do sacrifício. Os coelhos foram anestesiados com CO2 numa sequência de ordem aleatória, aproximadamente 3-6 horas após a última injeção, para se obter sangue por punção cardíaca e depois mortos com pentobarbital de sódio (100 mg/kg), injetados i.p. O úmero direito, ambos os fémures, as vértebras lombares (L3-L5) e a tíbia direita foram removidos.

Composição sanguínea

Foram medidos o cálcio, fosfato, fosfatase alcalina, creatinina e azoto de ureia séricos por análise sérica multicanal automatizada.

Histornorfornetria

As medidas histomorfométricas foram feitas em osso cortical da diáfise tibial e em osso esponjoso de L3. Após o sacrifício, estes ossos foram removidos de cada animal e fixados em 10% de formalina tamponada à neutralidade durante 24 horas. Os tecidos foram desidratados numa série graduada de álcoois (70-100%, 2 mudanças por grau, cada durante 4 horas sob vácuo). Os espécimes foram depois colocados em xileno, e infiltrados com metilmetacrilato sob vácuo a 20 psi a 2 horas/passo e 24 horas de um plano de infiltração num processador automático Shandon Hypercenter (Shandon Lipshaw, Pittsburgh, PA) . Os espécimes foram impregnados em 2% de DDK-plast com 0,2% de iniciador (Delaware Diamond Knives,

Wilmington, DE). As seções transversais de tibia foram cortadas a 80 ym usando uma serra de fio de diamante (Delaware Diamond Knives, Inc., DE) e coradas com tricrómico de Goldner. Seções transversais não coradas de cerca de 80 ym de espessura foram processadas para histomorfometria dinâmica de marcadores de fluorocromo. As seções sagitais de L3 foram cortadas no micrótomo Reichert-Jung 2050 (Magee Scientific Inc., Dexter, MI) a 5 ym e coradas com tetracrómico de McNeal, ou deixadas sem coloração para histomorfometria dinâmica. A histomorfometria foi feita com uma ampliação de 150x, usando um microscópio de fluorescência Nikon (Optiphot, Nikon, Tóquio, Japão) e um sistema digitalizador semiautomático (Bioquant IV, R&M Biometrics, Nashville, TN). A formação e a reabsorção óssea nos envelopes periostal, endocortical e intracortical foram medidas ao longo de toda a área da seção transversal das seções de diáfises de tibia. As medidas em osso esponjoso foram feitas dentro de uma área de 6 mm2 no centro da vértebra lombar, 0,5 mm da margem da camada cortical circundante. A nomenclatura foi de acordo com o Comité ASBMR sobre nomenclatura histomorfométrica (Parfitt AM, Drezner MK, Florieux FH, Kanis JA, Malluche H, Meunier PJ, Ott SM, Recker RR 1987 "Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee". J. Bone Miner. Res. 2:595-610). Os parâmetros dinâmicos foram medidos com base na marcação de calceina.

Medidas de massa óssea A diáfise de fémures e a quarta vértebra lombar em 50% de etanol/soro fisiológico foram submetidas a varrimento na seção transversal por tomografia computacional quantitativa (QCT ou pQCT) utilizando um pQCT 960A e analisadas usando o software Dichte versão 5.1 (Norland/Stratec, Ft. Atkinson, WI). Os parâmetros de tecido completo foram medidos incluindo densidade mineral óssea volumétrica (vBMD, mg/cm3), área de seção transversal (Área-X, mm2) e teor mineral ósseo (BMC, mg) , usando dimensões voxel de 148 x 148 x 1200 ym. O volume pode ser calculado multiplicando a Área-X pela espessura do corte de 1,2 mm. O colo femoral completo dos fémures excisados num banho de 50% de etanol, soro fisiológico foi submetido a varrimento usando absorciometria de energia dupla periférica (pDEXA, Norland/Stratec). Especificamente, a densidade mineral óssea aparente (aBMD, g/cm2), área projetada (cm2) e teor mineral ósseo (BMC, g) foram medidos usando passos de varrimento de 0,5 x 1,0 mm e limite de 0,04 .

Teste biomecânico

As propriedades mecânicas do osso foram medidas na diáfise femoral direita e no corpo de L5. Os ossos foram removidos, limpos do tecido conjuntivo, envolvidos em gaze embebida em soro fisiológico isotónico e congelados a -20°C até ao teste. Antes do teste, os espécimes foram descongelados durante 1-2 horas à temperatura ambiente. Todos os espécimes foram testados até à rutura num banho de água com circulação a 37 °C usando uma máquina de teste servo-hidráulica MTS 810 (MTS Corp., Minneapolis, MN) . As curvas de carga-deformação foram registadas usando o sistema de representação de medida HP 7090A (Hewlett-Packard, Camas, WA) . A força última (força máxima que os espécimes suportam), a rigidez (o declive da porção linear da curva de carga-deformação) e o trabalho até rutura (área sob a curva de carga-deformação antes da rutura) foram medidos usando um sistema digitalizador (Jandel Scientific, Corte Madera, CA) . Estes parâmetros são propriedades estruturais que dependem das propriedades materiais intrínsecas e da geometria. Turner CH, Burr DB 1993 "Basic biomechanical measurements of bone: a tutorial." Bone 14:595-608. Os dados foram normalizados para se obterem propriedades materiais intrínsecas, tais como força última (tensão máxima que os espécimes suportam), módulo elástico (rigidez intrínseca do material) e resistência (resistência à fratura por unidade de volume) que são independentes do tamanho e da forma. Id. A resistência do osso femoral foi medida na diáfise usando flexão de três pontos. O fémur foi posicionado num dispositivo de fixação com o lado anterior de frente para o carregador. A carga foi aplicada no ponto médio entre dois apoios que estavam separados por 54 mm. A célula de carga foi deslocada a uma taxa de 1 mm/seg até ocorrer rutura. Para normalizar os dados obtidos da curva de carga-deformação, a tensão última de flexão foi calculada a partir da força última por

(1) em que Of é a tensão de fratura de flexão, Fu é a força última, Léo comprimento entre apoios, r é o raio no sentido anterior-posterior, e I é o momento de inércia. Id. 0 valor para o momento de inércia foi calculado, assumindo que as seções transversais femorais eram elípticas. A espessura cortical média foi calculada a partir das medidas de espessura feitas em cada de quatro quadrantes da seção transversal femoral com um par de paquímetros digitais, precisos até 0,01 mm com uma precisão de ± 0,005 mm (Mitutoyo, Japão). O módulo elástico do fémur (Ef) foi calculado usando a seguinte equação:

(2) A resistência do fémur (Resistênciaf) foi também calculada usando a seguinte equação:

Resistênciaf=3*(trabalho até rutura)*r2/LI (3)

Para o teste mecânico da quinta vértebra lombar (L5) , ambas as placas terminais do corpo vertebral foram cortadas paralelas usando uma serra de baixa velocidade Buehler Isomet (Buehler LTD, Evanston, IL) . Após remoção dos processos posteriores, a resistência mecânica de L5 foi medida em compressão. A carga compressiva foi aplicada em controlo de batida, com uma velocidade de quebra bruta de lmm/seg através de uma placa de rotação para corrigir para o alinhamento não paralelo das faces do corpo vertebral. Para normalizar os dados obtidos da curva de carga-deformação, e avaliar as propriedades materiais intrínsecas que são independentes da geometria óssea, a tensão última foi calculada como a força última dividida pela área da seção transversal bruta. A área de seção transversal (CSA) foi calculada por

(4) em que a e b são a largura nos sentidos anterior-posterior e medial-laterais, respetivamente). 0 módulo elástico da vértebra (Ev) foi calculado por

(5) em que h é a altura crânio-caudal do corpo vertebral. A resistência da vértebra (Resistênciav) foi calculada por

Resistênciav=(trabalho até rutura)/)(CSA*h) (6)

Microscopia acústica

Seções transversais de 500 ym de espessura foram cortadas da diáfise média do úmero direito usando uma serra de fio de diamante. A espessura precisa de cada espécime foi medida usando um micrómetro (Mitutoyo, Japão) a uma resolução de 1 ym. As medidas de velocidade acústica foram feitas usando um microscópio acústico de varrimento (UH3, Olympus, Japão) através do método descrito previamente por Hasegawa K, Turner CH, Recker RR, Wu E, Burr DB 1995 "Elastic properties of osteoporotic bone measured by scanning acoustic microscopy". Bone J__6:8 5 — 90. Usando esta técnica, podem ser medidas as propriedades mecânicas intrínsecas detalhadas num ponto focal selecionado. Um transdutor de 50 MHz (V-390, Panametrics, Waltham, MA) foi usado para gerar ondas acústicas em modo pulso-eco. A lente de 50 MHz produziu um feixe acústico, de aproximadamente 60 ym de diâmetro. Os espécimes foram fixados ao fundo de uma câmara cheia com água a temperatura constante (22°C). O tempo de atraso entre as ondas acústicas refletidas do topo dos espécimes e aquelas refletidas do fundo dos espécimes foi medido usando um osciloscópio digital (TDS 620,

Tekronix, Beaverton, OR). Os tempos de atraso foram medidos em cinco locais diferentes de modo que cada local era mais de 300 ym uns dos outros no córtex anterior do úmero. A velocidade acústica foi calculada como o dobro da espessura dos espécimes, dividida pelo tempo de atraso médio. O peso húmido (Ww) e o peso submerso (Ws) em 100% de álcool etilico foram medidos usando uma balança (AJ100, Mettler

Instrument Corp., Heightstown, NJ) . A densidade húmida (p) foi calculada usando o principio de Arquimedes: (7)

em que pETOH

é a densidade do álcool (0,789 g/cm3) . Assumindo o percurso da onda acústica no osso como homogéneo, o coeficiente elástico (C) que representa a rigidez intrínseca dos espécimes é calculada:

(8) em que p é a densidade húmida e v é a velocidade acústica.

Análise estatística A análise de Bartlett foi usada para verificar a homogeneidade da variância. Quando a variância era homogénea, foi aplicada ANOVA unidirecional com testes de PLSD de Fisher para comparação post-hoc. Quando a variância não era homogénea, foi aplicada a análise não-paramétrica de Kruskal-Wallis da variância, com análise post-hoc usando testes U de Mann-Whitney. O significância estatística foi atribuída a p<0,05. Os resultados são apresentados como média ± SEM.

Resultados

Peso corporal e bioquímica

Coelhos tratados com veículo de PTH(l-34) a 10 mg/kg/dia apresentaram incrementos mínimos no peso corporal durante 140 dias. Os coelhos que receberam PTH(l-34) a 40 yg/kg/dia apresentaram um pequeno decréscimo de 51 g no peso corporal, representando uma perda de 1,4 ± 1,6% em peso corporal durante a experiência (Tabela 1). As medições séricas estavam dentro da resposta fisiológica normal para coelhos, embora tenham sido observados pequenos aumentos no cálcio e azoto de ureia séricos. A fosfatase alcalina sérica aumentou em duas vezes na dose mais alta de PTH(1-34) (Tabela 2).

Tabela 1 - Efeitos de PTH(l-34) no peso corporal

Os dados são expressos como média ± SEM para 6 coelhos por grupo. *P<0,05 comparativamente ao controlo.

Tabela 2 - Efeitos de PTH(l-34) na composição sérica

Os dados são expressos como média ± SEM para 6 coelhos por grupo. *P<0,05 comparativamente ao controlo.

Histornorfornetria A formação óssea nas superficies periostal (Ps.MS/BS) e endocortical (Ec.MS/BS) da diáfise tibial aumentou em grupos tratados com PTH(l-34) (Tabela 3).

Ps.MS/BS no grupo de dose mais alta era significativamente maior do gue nos outros 2 grupos (p<0,001) e Ec.MS/BS no grupo de dose mais alta era significativamente maior do gue no grupo de controlo (p<0,05). Consistente com o aumento na fosfatase alcalina sérica, as taxas da formação óssea em cada superfície (Ps.BFR/BS e Ec.BFR/BS) eram significativamente maiores no grupo de dose mais alta do gue nos outros 2 grupos (p<0,05) . A taxa de aposição mineral (MAR) não mudou nos envelopes periostal ou endocortical.

Intracorticalmente, o número de locais de reabsorção (Rs.N/Ct.Ar) em coelhos gue receberam PTH(l-34) a 40 yg/kg/dia foi significativamente maior em 7 vezes, do que nos outros 2 grupos (p<0,05) (Tabela 4) . O número de osteões marcados (L. On.N/Ct.Ar) em coelhos que receberam PTH(l-34) a 40 yg/kg/dia aumentou também significativamente comparativamente aos outros 2 grupos (p<0,01 versus o grupo de controlo, p<0,05 versus o grupo de 10 yg/kg/dia). MAR foi significativamente maior em ambos os grupos de tratamento do que no grupo de controlo (p<0,01), mas não havia nenhuma diferença significativa entre os grupos tratados com PTH. A taxa de formação óssea (BFR/BV) e a frequência da ativação (Ac.F) aumentaram (p<0,05 e p<0,01, respetivamente) em ambas as doses.

Embora a área óssea (B.Ar) tenha aumentado em ambas as doses, uma diferença significativa foi apenas encontrada entre o grupo de dose mais alta e o grupo de controlo (p<0,01). A área medular (Ma.Ar) diminuiu após o tratamento, mas não foi significativamente diferente entre os três grupos. Contudo, a área cortical (Ct.Ar) no grupo de dose mais alta foi significativamente maior do que nos outros 2 grupos (p<0,0001 versus o grupo de controlo, p<0,05 versus o grupo de dose mais baixa). A Ct.Ar no grupo de dose mais baixa foi também significativamente mais alta do que o controlo (p<0,05). Resultados semelhantes foram encontrados na %Ct.Ar. A porosidade cortical (Ct.Po) em coelhos que receberam PTH(l-34) a 10 yg/kg/dia foi o dobro daquela no grupo de controlo (p<0,05), enquanto a Ct.Po em coelhos que receberam PTH(1-34) a 40 yg/kg/dia foi 6X mais alta do que o grupo de controlo (p<0,01). Contudo, as porosidades encontradas dentro do compartimento endocortical e, dentro desse local, são improváveis de contribuir para a resistência biomecânica uma vez que a PTH também aumentou a área do osso cortical, consistente com um aumento no momento de inércia da seção transversal.

Tabela 3 - Efeitos de PTH(1-34) na remodelação do osso periostal e endocortical da diáfise tibial.

Os dados são expressos como média ± SEM para 6 coelhos por grupo. *P<0,05 comparativamente ao controlo. ΦΡ<0,05 comparado com PTH(l-34) 10 yg/kg/dia.

Tabela 4 - Efeitos de PTH(l-34) na remodelação de osso intracortical da diáfise tibial.

Os dados são expressos como média ± SEM para 6 coelhos por grupo. *P<0,05 comparativamente ao controlo. ΦΡ<0,05 comparado com PTH(l-34) 10 yg/kg/dia.

Tabela 5 - Efeitos de PTH(l-34) na remodelação de osso esponjoso da terceira vértebra lombar.

Os dados são expressos como média ± SEM para 6 coelhos por grupo. *P<0,05 comparativamente ao controlo. ΦΡ<0,05 comparado com PTH(l-34) 10 yg/kg/dia.

No osso esponjoso, a maioria dos parâmetros de formação (OSBS, Ob.S/BS, OV/TV, e MS/BS) aumentaram com tratamento de PTH(l-34) (Tabela 5) . Aqueles em coelhos que receberam PTH(l-34) a 40 yg/kg/dia foram significativamente maiores do que nos outros 2 grupos (p<0,01 versus o grupo de controlo e o grupo de 10 yg/kg/dia em todos os parâmetros). A taxa da formação óssea (BFR/BS) aumentou também significativamente em coelhos que receberam PTH(ΙΟΙ) a 40 yg/kg/dia comparativamente aos outros 2 grupos (p<0,0001 contra o controlo e grupos de 10 yg/kg/dia). Embora a reabsorção (ES/BS e Oc.S/BS) tenha aumentado em ambos os grupos tratados com PTH(1-34), apenas a superfície erodida (ES/BS) no grupo de dose mais alta foi significativamente maior do que o grupo de controlo (p<0,001). Não havia nenhuma diferença na espessura osteoide (O.Th) entre os três grupos. Apesar da evidência para renovação óssea acelerada, o volume ósseo fracionário (BV/TV) não mudou após o tratamento de PTH(1-34). A reabsorção de túnel e a fibrose peritrabecular não foram observadas em alguns dos grupos.

Medições de massa óssea vBMD e BMC na diáfise do fémur avaliados por pQCT no grupo de 40 yg/kg/dia foram significativamente mais altos do que nos outros 2 grupos (p<0,001 em vBMD e p<0,0001 em BMC versus o grupo de controlo, p<0,05 em vBMD e p<0, 01 em BMC versus o grupo de dose mais baixa) (Fig. IA) . vBMD e BMC no grupo de 10 yg/kg/dia foram também significativamente mais altos do que no grupo de controlo (p<0,05 em vBMD e BMC). Embora a área óssea da diáfise do fémur também aumentasse de modo dependente da dose, esta aumentou significativamente apenas no grupo de 40 yg/kg/dia (p<0,05) . aBMD e BMC no fémur proximal, medidos por absorciometria de raio X duplo (DXA ou pDXA), aumentaram de modo dependente da dose. Verificaram-se diferenças significativas na aBMD e no BMC entre o grupo de controlo e o grupo de 10 yg/kg/dia (p<0,05), assim como entre o grupo de controlo e o grupo de 40 yg/kg/dia (p<0,001) (Fig. 1B). Nenhuma diferença significativa foi encontrada na área óssea entre os três grupos.

Globalmente, a Figura 1 mostra que a BMD (densidade mineral óssea) e o BMC (teor mineral ósseo) na diáfise femoral (osso cortical) (A) e no fémur proximal (osso esponjoso + osso cortical) (B) foram significativamente maiores em animais tratados com PTH do que em controlos a ambas as doses. A área de osso cortical na diáfise femoral em coelhos tratados na dose mais alta foi significativamente maior do que em controlos. Não foram encontradas diferenças significativas entre grupos na área óssea do fémur proximal. Os dados são expressos como média ± SEM. *P<0,05 comparativamente ao controlo. Φ P<0,05 comparativamente a PTH 10 yg/kg/dia. Não havia diferença significativa na vBMD, BMC ou área óssea da vértebra lombar (L4) avaliada por pQCT, entre os três grupos.

Teste biomecânico

As propriedades estruturais da diáfise do fémur, tais como força última, rigidez e trabalho até rutura aumentaram de modo dependente da dose (Fig. 2). A Figura 2 mostra os efeitos de PTH na resistência mecânica e no momento de inércia da seção transversal (CSMI) no osso cortical da diáfise femoral. As propriedades mecânicas estruturais (barras sem preenchimento) e CSMI aumentaram significativamente no grupo de dose mais alta, enquanto a rigidez também aumentou significativamente no grupo de dose mais baixa. Das propriedades materiais intrínsecas (barras preenchidas), apenas o módulo elástico aumentou significativamente no grupo de dose mais baixa quando comparado aos controlos. O módulo elástico no grupo de dose mais alta foi reduzido significativamente quando comparado ao grupo de dose mais baixa. Na Figura 2: os dados são expressos como média ± SEM; * indica P<0,05 comparativamente ao controlo; e Φ indica P<0,05 comparativamente a 10 yg/kg/dia.

Neste estudo e nos resultados mostrados na Figura 2, todos os parâmetros foram significativamente mais altos em coelhos que receberam PTH(l-34) a 40 yg/kg/dia do que no grupo de controlo (p<0,01 para a força última e trabalho até rutura, p<0,05 para a rigidez) . A rigidez no grupo de dose mais baixa foi também significativamente mais alta do que no grupo de controlo (p<0,05). Das propriedades materiais intrínsecas, o módulo elástico foi significativamente menor em coelhos que receberam 40 yg/kg/dia do que naqueles que receberam 10 yg/kg/dia (P<0,01) .

No corpo vertebral lombar, nenhuma diferença significativa foi encontrada em propriedades mecânicas entre os três grupos.

Microscopia acústica Não se verificaram diferenças significativas na velocidade acústica ou no coeficiente elástico entre os três grupos.

Discussão A resposta esquelética de osso cortical à hPTH(l-34) biossintética envolveu uma regulação direta de propriedades materiais e uma regulação compensatória de propriedades biomecânicas nos ossos longos de coelhos fêmeas intactos, maduros. PTH(l-34) aumentou a renovação óssea e a porosidade cortical e, na dose de 40 yg/kg, reduziu o módulo elástico material do osso cortical. Contudo, o módulo elástico reduzido foi mars do que compensado por aposição óssea aumentada nas superfícies periostal e endocortical, resultando numa melhoria significativa na resistência estrutural, rigidez e no trabalho até rutura de osso cortical em coelhos.

Neste estudo usando coelhos intactos, o volume do osso esponjoso da vértebra lombar não mudou após o tratamento de PTH(l-34), apesar da evidência para renovação óssea aumentada. A utilização anterior como um modelo osteopénico, a presença de remodelação intracortical, e de período de remodelação curto - juntamente com o crescimento rápido e maturação esquelética precoce do coelho (em 6-9 meses) , formou a base para a seleção do coelho como um modelo em que se pode testar os efeitos de PTH(l-34) administrada intermitentemente.

Os coelhos podem apresentar uma vasta variação nos níveis de cálcio sérico (10-16 mg/dL), mas estes níveis não são diretamente influenciados pela quantidade de cálcio dietético, uma outra vantagem do modelo. Embora aumentos transientes significativos de cerca de 1 mg/mL fossem registados em coelhos tratados com PTH(l-34) a 40 yg/kg, os valores reais estavam sempre dentro da gama fisiológica conhecida.

No presente estudo, a hPTH(l-34) biossintética durante 140 dias aumentou a taxa de formação óssea intracorticalmente, assim como nas superficies periostal e endocortical. A Ac.F intracortical aumentou no grupo de dose mais baixa em 8X e no grupo de dose mais alta em 20X. Isto conduziu a um aumento de 2 vezes na porosidade cortical na tibia no grupo de dose mais baixa e a um aumento de 6 vezes no grupo de dose mais alta. Os dados de microscopia acústica mostram que as propriedades elásticas do próprio material ósseo no úmero não foram afetadas, indicando que a qualidade intrínseca do osso cortical é normal. Consequentemente, a porosidade aumentada deve justificar a leve redução no módulo elástico, uma medição das propriedades materiais que inclui os espaços no córtex. A porosidade cortical aumentada foi mais do que compensada, contudo, por MS/BS e BFR/BS significativamente aumentados nas superficies periostal e endocortical na diáfise da tibia no grupo de dose mais alta, resultando em área óssea significativamente aumentada. Isto aumentaria o momento de inércia da seção transversal, que é proporcional à rigidez de flexão do osso, como fez na diáfise femoral (Fig.2). A consequência destas variações nas propriedades de forma e materiais foi de melhorar a resistência e rigidez mecânicas da diáfise femoral quando comparadas aos controlos, compensando assim os efeitos mecânicos potencialmente prejudiciais da porosidade cortical aumentada.

Conclusão

Em conclusão, os aumentos na renovação óssea e na porosidade cortical após tratamento de PTH(l-34) foram acompanhados de aumentos simultâneos em osso nas superficies periostal e endocortical. A combinação destes fenómenos resultou num aumento da resistência, tensão última, rigidez e trabalho até rutura do fémur.

Exemplo de referência 2 - Resistência e densidade óssea aumentadas após administração de rhPTH(l-34) a macacos

Procedimentos experimentais

Geral A fase viva do estudo usou primatas cinomolgos selvagens adultos (placas de crescimento fechadas) (Macaca fascicularis), pesando 2,7710,03 kg (média ± erro padrão da média [SEM]). Os macacos foram mantidos em quarentena durante 3 meses, depois começaram uma dieta contendo 0,3% de cálcio, 0,3% de fosfato e 250 IU de vitamina D3/100 g de dieta, e foi dada água com fluor (1 ppm de fluoreto) ad libitum. 0 teor de cálcio correspondeu a 1734 mg de cálcio/2000 calorias. Após 1 mês em dieta, os animais foram divididos em grupos de 21 ou 22, ficticiamente operados ou ovariectomizados. Injeções subcutâneas uma vez por dia de veiculo (controlos dos fictícios e dos ovariectomizados) ou rhPTH(l-34), a 1 yg/kg (PTH1) ou 5 yg/kg (PTH5, foram iniciadas 24 horas após a ovariectomia. Os animais foram tratados durante 18 meses (PTH1 e PTH5), ou durante 12 meses após a retirada do tratamento (PTH1-W e PTH5-W).

Os grupos de estudo foram divididos como mostrado na Tabela 6.

Tabela 6 - Grupos de estudo para o estudo de primatas

As amostras de soro e urina foram recolhidas 24 horas após a injeção de veiculo ou de rhPTH(l-34) em intervalos de 3 meses. Uma conceção de amostragem reduzida de 5 macacos em cada grupo tratado com rhPTH(l-34) foi usada para a farmacocinética, com a amostragem (variando de 0 a 240 minutos de cada vez) na linha de base, 7, 11 e 17 meses. No tempo 0 e em intervalos de 6 meses, a massa óssea total do esqueleto e da coluna vertebral (L-2 a L-4) foi avaliada por absorciometria de raio X de dupla energia (DXA); foi usada tomografia de raio X computacional quantitativa periférica (pQCT) para avaliar a massa óssea na diáfise do rádio e no rádio distal, e na tibia proximal. As biópsias iliacas foram recolhidas aos 6 e 15 meses para histomorfometria. Todos os animais foram eutanasiados após 18 meses.

Os testes biomecânicos foram feitos em vértebras lombares L-3 a L-4, colo do fémur, diáfise do úmero e num espécime de osso cortical preparado à máquina a partir da diáfise do fémur (medições definidas na Tabela 7) . Histomorfometria convencional estática e dinâmica foram feitas (medições descritas na Tabela 11) na diáfise do úmero, vértebra lombar L-2, colo femoral, diáfise do fémur, diáfise do rádio e rádio distal. As análises estatísticas iniciais compararam todos os grupos a controlos ovariectomizados tratados com veiculo. Os dados são apropriados para análises exploratórias adicionais para examinar dependência de dose, efeitos de retirada, interações entre resultados e variações no tempo, por métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Todos os ensaios foram conduzidos e determinados por métodos conhecidos na técnica.

Para determinados indivíduos experimentais, o osso cortical do úmero foi examinado por histomorfometria e por microscopia de infravermelhos com transformada de Fourier polarizada. A microscopia de infravermelhos com transformada de Fourier foi conduzida por uma adaptação de métodos conhecidos para tal microscopia.

Estudos de modelação de elemento finito 3D

Estes estudos determinaram dados de modelação de elemento finito 3D nas vértebras de macacos do estudo dosados com PTH durante 18 meses. Vértebras L-5 excisadas em 50% de etanol/soro fisiológico de grupos ovariectomizados (n=7) e PTH (n=7) foram submetidas a varrimento em série em passos de 500 ym por tomografia computacional quantitativa (QCT, Norland, Ft. Atkinson, WI), usando pixéis de 70x70 ym. Cada uma das seções transversais de 500 ym foi analisada para densidade mineral óssea volumétrica (BMD, mg/cc), teor mineral ósseo (BMC, mg) , área de seção transversal (Área-X), volume de osso esponjoso (BV/TV), espessura trabecular (Tb.Th) e conectividade (densidade nodular, análise estrutural). Foi calculada a média dos pixéis em cada varrimento em série para criar voxels de 490x490x500 ym. Os varrimentos em série foram depois empilhados e foi gerada uma malha de superfície triangular para cada osso usando o algoritmo "marching cubes" (ver, por exemplo, Lorensen e Cline 1987 "Marching cubes, a high resolution 3D surface construction algorithm." Computer Graphics 21, 163-169). Uma versão suavizada de cada malha de superfície foi depois usada para gerar uma malha tetraédrica para a modelação de elemento finito 3D. O módulo de Young para cada elemento tetraédrico foi derivado a partir das densidades de voxel originais e das propriedades materiais a partir de um feixe de osso cortical mordo da diáfise femoral dos macacos. Cada malha tetraédrica foi rodada de modo que a superfície inferior de cada vértebra fosse alinhada com um plano. A análise de tensão elástica linear foi depois realizada para cada modelo L-5, em que uma carga distribuída de 100 N foi aplicada à superfície superior do centro, perpendicular ao plano inferior enquanto a superfície inferior foi fixada no sentido da carga. Os contornos de tensão axial resultantes foram avaliados, assim como foram as distribuições da BMD, e comparados entre PTH e ovariectomizados. A esta resolução, a densidade de cada voxel é dependente da extensão a que cada voxel é cheio com osso em oposição a tecido mole.

Resultados

Os relatos de diferenças no texto são estatisticamente significativos, p<0,05. Todos os animais ganharam 4% a 9% do peso corporal inicial durante o estudo, independentemente do tratamento.

Medições séricas e de urina

Os níveis de estradiol sérico aos 3 e 18 meses estavam abaixo de 5 pg/mL em todos os macacos ovariectomizados. Quando as medições de homeostasia do cálcio foram comparadas com os controlos fictícios, os controlos ovariectomizados apresentaram níveis séricos mais baixos de cálcio e fosfato e 1,25-di-hidroxivitamina D, mas não diferiram na PTH endógena, monofosfato de adenosina cíclica (cAMP) urinário, cálcio urinário, creatinina urinária ou azoto de ureia sérico medidos 24 horas após a última injeção. Os animais tratados com rhPTH(l-34) apresentaram fosfato sérico mais baixo, PTH endógena mais baixa, e 1,25-di-hidroxivitamina D e cAMP urinário mais altos comparativamente a ovariectomizados. Os ensaios de marcadores séricos de formação óssea mostraram que os macacos ovariectomizados tinham fosfatase alcalina total sérica (ALP) e osteocalcina baixas comparativamente aos ficticios, e niveis restaurados de rhPTH(l-34) de volta aos valores ficticios. A excreção urinária de C-telopéptido (CrossLaps), usado como um marcador bioquimico da reabsorção óssea, não foi alterada por rhPTH(l-34) comparativamente aos controlos ovariectomizados.

Massa óssea A massa óssea esquelética total, expressa como BMC corporal total, foi significativamente aumentada por PTH(1-34) (Fig. 3). A densidade mineral óssea da coluna vertebral (BMD) permaneceu estável em controlos ovariectomizados durante 18 meses, enquanto os controlos ficticios ganharam cerca de 5% acima da linha de base (Figs. 4A-4C e 5A) . A rhPTH(l-34) aumentou a BMD da coluna vertebral em 7% a 14% e o teor mineral ósseo do corpo inteiro (BMC, Figura 3) em até 6%, comparativamente à linha de base (Figs. 4A-4C e 5A) . 0 teor mineral ósseo da coluna vertebral também aumentou (Fig. 5A) . Em primatas tratados com rhPTH(l-34), a magnitude destes aumentos foi significativamente maior do que aquela de controlos ovariectomizados, e igualou (PTH1) ou excedeu (PTH5) aquela dos fictícios. A rhPTH(l-34) não alterou a BMD da diáfise do rádio ou do rádio distal. A área da seção transversal da diáfise aumentou em 7% no grupo PTH5. Na tíbia proximal, não houve nenhum aumento na área da seção transversal, mas a rhPTH(l-34) aumentou o BMC e a BMD comparativamente aos controlos ovariectomizados. Seis meses após o tratamento ser retirado, a BMD e o BMC na coluna vertebral e no colo do fémur permaneceram superiores aos controlos ovariectomizados, sem variação na diáfise cortical do úmero.

Resistência óssea A rhPTH(l-34) aumentou a resistência (Fy) nas vértebras em até 43% (Tabelas 7 e 8, Fig. 5B) . A rhPTH(l-34) melhorou a resistência no colo do fémur (fu) em até 12% (Tabelas 7 e 9, Fig. 6A) . A rhPTH(l-34) não alterou as medições na diáfise cortical da diáfise do úmero (Tabelas 7 e 10), ou as propriedades materiais dos espécimes de feixe feitos à máquina da diáfise femoral (Tabelas 7 e 9, Fig. 6B) quando comparadas aos controlos ovariectomizados. Nos animais tratados com rhPTH(l-34) durante 12 meses e depois retirados do tratamento durante 6 meses, as medições de resistência óssea permaneceram significativamente mais altas do que os controlos ovariectomizados (Tabelas 7-10, figos. 5B e 6A) .

Tabela 7 - Variáveis reportadas para as terceiras e quartas vértebras lombares (L-3 e L-4), diáfise do úmero, colo femoral proximal e espécimes de feixe femoral

Tabela 8 - Medidas biomecânicas da resistência na coluna vertebral (vértebras lombares, L-3 e L-4 combinadas) de primatas Ovariectomizados aos 18 meses

Abreviaturas: OVX=ovariectomizados; PTHl=rhPTH(1-34) 1 yg/kg durante 18 meses; PTH1-W= retirada durante 6 meses após tratamento com rhPTH(l-34) 1 yg/kg durante 12 meses; PTH5=rhPTH(1-34) 5 yg/kg durante 18 meses; PTH5-W=retirada durante 6 meses após tratamento com rhPTH(l-34) 5 yg/kg durante 12 meses. aVer Tabela 4.1 para descrição de variáveis bDados expressos como média ± erro padrão da média (SEM) por grupo. °Estatisticamente significativo comparativamente a controlos OVX (p<0,05). sEstatisticamente significativo comparativamente a controlos fictícios (p<0,05) .

Tabela 9 - Medidas biomecânicas de propriedades materiais de espécimes de feixe de tamanho equivalente de diáfise de fémur, e medida biomecânica da resistência do colo do fémur de primatas Ovariectomizados aos 18 meses

Abreviaturas: OVX=ovariectomizados; PTHl=rhPTH(1-34) 1 pg/kg durante 18 meses; PTH1-W= retirada após tratamento com rhPTH(l-34) 1 pg/kg durante 12 meses; PTH5=rhPTH(1-34) 5 pg/kg durante 18 meses; PTH5-W=retirada após tratamento com rhPTH(l-34) 5 pg/kg durante 12 meses. aVer Tabela 4.1 para descrição de variáveis bDados expressos como média ± erro padrão da média (SEM) por grupo. °Estatisticamente significativo comparativamente a controlos OVX (p<0,05). sEstatisticamente significativo comparativamente a controlos fictícios (p<0,05) .

Tabela 10 - Medidas biomecânicas de osso cortical da Diáfise do úmero de primatas Ovariectomizados aos 18 meses

Abreviaturas: OVX=ovariectomizados; PTHl=rhPTH(1-34) 1 yg/Kg durante 18 meses; PTH1-W= retirada após tratamento com rhPTH(l-34) 1 yg/kg durante 12 meses; PTH5=rhPTH(1-34) 5 yg/kg durante 18 meses; PTH5-W=retirada após tratamento com rhPTH(l-34) 5 yg/kg durante 12 meses. aVer Tabela 4.1 para descrição de variáveis bDados expressos como média ± erro padrão da média (SEM). °Estatisticamente significativo comparativamente a controlos OVX (p<0,05). sEstatisticamente significativo comparativamente a controlos fictícios (p<0,05) .

Histomorfometria óssea

Embora as taxas de renovação fossem maiores em ovariectomizados do que em controlos fictícios, não havia qualquer perda significativa de volume ósseo na crista ilíaca. Uma vez que a marcação de tetraciclina dada aos 6 meses não era detetável em muitos animais, apenas os parâmetros estáticos foram medidos para este ponto de tempo. Os dados de histomorfometria estática e dinâmica aos 15 meses mostraram que o tratamento com rhPTH(l-34) aumentou a área de osso esponjoso comparativamente a ovariectomizados, e aumentou a formação óssea sem aumentar as medições de reabsorção acima daquelas medidas em controlos ovariectomizados. A taxa de formação óssea foi aumentada progressivamente por doses mais altas de rhPTH(l-34) . Embora o osso esponjoso permanecesse aumentado comparativamente aos controlos ovariectomizados após a retirada de rhPTH(l-34) depois de 12 meses de tratamento, a formação e a reabsorção óssea reverteram para aquela observada em controlos ovariectomizados, e a renovação óssea permaneceu mais alta do que em controlos fictícios. A rhPTH(l-34) não afetou a mineralização, a frequência de ativação ou os períodos de remodelação. Não se verificaram diferenças no equilíbrio ósseo à base de unidade multicellular óssea (BMU) individual entre a reabsorção e a formação. Em resumo, a rhPTH(l-34) aumentou o osso esponjoso por estimulação seletiva da formação óssea.

No osso cortical do úmero, em que a rhPTH(l-34) não alterou significativamente a BMD ou as medições de resistência óssea, a rhPTH(l-34) estimulou variações nos compartimentos periostal, endostal e intracortical (Tabelas 11 e 12) . Embora não houvesse nenhuma diferença na área total ou na área medular entre grupos, a rhPTH(l-34) aumentou a área cortical, e os grupos PTH5 e PTH5-W tinham significativamente mais osso cortical, o que sugere momento de inércia da seção transversal aumentado, uma medida da resistência. 0 aumento na área pode ser atribuído à formação aumentada nas superficies periostal e endostal (Fig. 7) .

Os grupos de controlos fictícios e PTH5-W tinham superficies de mineralização periostal reduzidas comparativamente aos controlos ovariectomizados e aos outros grupos tratados com rhPTH(l-34) . As superficies de mineralização endocortical foram significativamente maiores em controlos ovariectomizados comparativamente aos fictícios e a rhPTH(l-34) não aumentou acima dos valores do controlo ovariectomizado. Na remodelação intracortical, havia mais espaços de reabsorção em animais ovariectomizados, e a frequência de ativação era maior em grupos ovariectomizados, PTH1 e PTH5 do que em controlos fictícios ou em quaisquer dos grupos de retirada. Havia significativamente mais osteões marcados por unidade de área em ovariectomizados comparativamente aos controlos fictícios, e a rhPTH(l-34) não aumentou estes significativamente acima dos valores de controlo ovariectomizado. A porosidade intracortical foi maior em ovariectomizados comparativamente aos fictícios, mas não foi diferente entre controlos ovariectomizados e PTHl. PTH5 e PTH5-W aumentaram a porosidade acima daquela observada em controlos ovariectomizados. Os dados dos estudos com coelhos sugeriram a hipótese de que o aumento na porosidade, acompanhada por osso cortical aumentado, pode ser uma resposta estrutural para manter as propriedades biomecânicas de osso tratado com rhPTH(l-34). Não havia nenhuma diferença entre ovariectomizados e os outros grupos no período de formação, largura osteoide, largura da parede ou maturação osteoide aos 18 meses.

Em resumo, não havia qualquer diferença nas taxas de renovação entre controlos ovariectomizados e quaisquer das doses de rhPTH(l-34) . Os controlos fictícios tiveram uma taxa de renovação mais baixa do que quaisquer dos controlos ovariectomizados ou animais tratados com rhPTH(l-34). Quando a rhPTH(l-34) foi retirada durante 6 meses, as taxas de renovação diminuíram significativamente, mas a BMD e as medições de resistência biomecânica permaneceram mais altas do que os controlos ovariectomizados. Os valores normais para a largura osteoide e o tempo de maturação intracorticalmente para todos os grupos indicam que o tratamento não causou nenhum defeito no tempo normal do processo de mineralização. Os valores normais para a largura da parede indicam que o tratamento não alterou o equilíbrio normal entre a reabsorção e a formação ao nivel da BMU individual.

Tabela 11 - Variáveis histomorfométricas para medições de osso cortical do úmero

a A nomenclatura é aquela recomendada no Journal of Bone and Mineral Research, 1987.

Tabela 12 - Histomorfometria cortical da diáfise do úmero de primatas ovariectomizados aos 18 meses (n=121)

Abreviaturas: OVX=ovariectomizados; PTHl=rhPTH(1-34) 1 yg/kg durante 18 meses; PTH1-W= retirada após tratamento com rhPTH(l-34) 1 yg/kg durante 12 meses; PTH5=rhPTH(1-34) 5 yg/kg durante 18 meses; PTH5-W=retirada após tratamento com rhPTH(l-34) 5 yg/kg durante 12 meses. aEstatisticamente significativo comparativamente a controlos OVX (p<0,05). bVer tabela 4.2 para descrição de variáveis. c0s dados são expressos como média ± erro padrão da média (SEM). A análise por histomorfometria e microscopia de infravermelhos com transformada de Fourier polarizada revelou que a administração de PTH melhorou a qualidade óssea por substituição do osso velho (grandes cristalitos) com osso novo (gama de cristalitos de vários tamanhos, tendendo para menor tamanho). Além disso, após retirada da PTH de macacos que receberam doses baixas, existe um beneficio adicional uma vez que a matriz se torna otimamente mineralizada, e os cristalitos maturam. Os dados derivados de histomorfometria e de microscopia de infravermelhos com transformada de Fourier mostram um beneficio inesperado na qualidade óssea do osso cortical, uma vez que à medida que ocorre mineralização ótima a fase mineral matura.

Estudos de modelação de elemento finito 3D 0 exame do corte de 500 ym médio de L-5 mostrou um aumento de 21% na BMD para PTH comparativamente aos ovariectomizados que foi devido a um aumento de 27% no BMC sem variação na área de seção transversal. A análise do centro a partir da PTH mostrou um aumento de 73% em BV/TV que foi devido a um aumento de 30% em Tb.Th e 37% maior que

Tb.N, comparativamente a ovariectomizados. A análise de conectividade para esta região mostrou uma densidade nodular maior que 140% (nó/volume de tecido) e estrutura nó-a-nó maior que 286% para as vértebras de PTH. A análise de distribuição de histograma de densidades ósseas de voxel para PTH mostrou uma diminuição na proporção das baixas densidades (0-355 mg/cc), um aumento nas densidades médias (356-880 mg/cc), com pouco efeito nos voxels de alta densidade (887-1200 mg/cc), comparativamente aos ovariectomizados (Fig. 8). Mais impressionante foi o desvio para uma maior densidade óssea de voxel no compartimento ósseo cortical após retirada do tratamento durante 6 meses (Fig. 8).

Foi calculada a proporção de elementos ósseos vertebrais (voxels) que se enquadraram dentro de uma determinada gama de valores de BMD. As gamas de BMD escolhidas foram as seguintes: BMD baixa, 0-300 mg/cc; BMD média, 300-700 mg/cc; BMD alta, 700-1000 mg/cc; e BMD cortical, >1000 mg/cc (Tabela 13). Comparativamente aos controlos ovariectomizados, o tratamento de PTH diminuiu significativamente o volume ósseo de BMD baixa e aumentou o volume ósseo de BMD média. Após a retirada de PTH, verificou-se uma diminuição no osso de BMD média e um aumento no osso de BMD alta, indicando que o osso de BMD média se tornou mais denso.

Tabela 13 - Percentagens de volume vertebral L5 agrupadas por valores de BMD (médialSEM)

Tabela 14 - BMC no nível médio da vértebra L5 e esforço eficaz vertebral

*estatisticamente diferente (p<0,05 pelo teste de PLSD de Fisher)

Os dados resumidos na Figura 8 mostram que a vértebra L-5 de macacos cinomolgos tratados durante 18 meses com PTH responde com aumentos significativos na massa óssea, espessura trabecular e conectividade trabecular, com efeitos marginais nas dimensões externas (Área-X) da vértebra. A análise da distribuição de elementos ósseos em L-5 mostrou que as regiões ósseas muito mineralizadas variam o mínimo sem evidência de esclerose óssea. Em vez disso, é o osso trabecular poroso que respondeu melhor a PTH. 0 desvio na BMD conduziu a uma redução substancial no esforço axial, indicando melhoria mecânica. Como claramente mostrado nos histogramas de PTH e BMD de ovariectomia, PTH converteu os voxels de osso de densidade baixa em voxels de densidade média sem efeito significativo nos voxels de densidade alta.

Os dados resumidos na Tabela 2 mostram que o BMC através do meio das vértebras foi significativamente aumentado por tratamento de PTH e um efeito benéfico de PTH permaneceu após 6 meses de retirada. 0 esforço mecânico médio na vértebra foi reduzido 36% por tratamento de PTH e permaneceu 23% abaixo de OVX após retirada de PTH. Este estudo indica que a retirada do tratamento de PTH durante 6 meses não conduziu a reabsorção do osso recentemente formado, mas pelo contrário houve uma redistribuição benéfica do osso de densidade média em osso de densidade mais baixa e mais alta. Esta redistribuição conduziu a redução de esforço continuada nas vértebras e, desta forma, função mecânica melhorada.

Discussão

Este estudo em primata indica que a PTH, dada na ausência de outros medicamentos que possam afetar o osso, beneficia o osso cortical e trabecular para aumentar a massa óssea esquelética global. Além disso, a retirada de PTH não resultou em perda significativa de benefícios associados com o tratamento de PTH durante pelo menos 2 ciclos de remodelação.

Marcadores substitutos foram usados noutros ensaios para indicar a atividade no osso, e eles assumiram que as variações no valor refletem variações na massa óssea. Embora existam dados publicados em seres humanos e primatas para mostrar que os marcadores de formação e de reabsorção aumentam, consistentes com a ativação da renovação óssea, por exemplo, durante menopausa precoce ou em estados de doença ativos, a alta renovação é considerada ser indicativa de perda óssea. Na adolescência, a alta renovação durante a maturação do esqueleto humano foi menos bem estudada, mas é acompanhada de um ganho anabólico na massa óssea. Tal fenómeno seria totalmente inesperado em farmacoterapia da osteoporose, de acordo com a atual técnica. Assim, o aumento em marcadores de renovação óssea é inconsistente com o efeito anabólico conhecido de PTH para aumentar a massa e a resistência óssea, como mostrado por dados no presente estudo.

Os dados deste estudo de 18 meses em macacos cinomolgos apoiam os seguintes resultados inesperados: • Aumento significativo global na massa esquelética total • Aumento significativo na massa e resistência óssea no colo do fémur. • Nenhuma evidência de "roubo" a partir de osso cortical para aumentar o osso trabecular. 0 aumento na massa e na resistência óssea foi estatisticamente significativa em locais enriquecidos para osso cortical (colo do fémur) ou osso trabecular (vértebras lombares). Em locais de osso puramente cortical (diáfise média do fémur), havia uma tendência para a PTH estabilizar ou aumentar levemente a massa e a resistência óssea, comparativamente a controlos ovariectomizados. • As variações em marcadores de osso em macacos ovariectomizados (e seres humanos) não refletem os efeitos anabólicos benéficos de PTH no esqueleto. A utilização de fluidos corporais de primatas no presente estudo permite o desenvolvimento de marcadores substitutos novos e mais válidos. • Retenção do ganho em massa e resistência óssea durante pelo menos 2 ciclos de remodelação após retirada do tratamento.

Este estudo em primata de PTH difere dos estudos publicados em macacos rhesus e cinomolgos uma vez que usou um grande tamanho de amostra para proporcionar poder estatístico apropriado para detetar diferenças que podem não ter sido evidentes em estudos anteriores muito menores; os controlos incluíram tanto primatas ovariectomizados (usados em estudos publicados) como operados ficticiamente, mas primatas intactos. 0 último grupo de controlo não foi previamente reportado neste tipo de estudo, pelo que alguns dos benefícios da PTH, e a restauração de determinadas medições para niveis de controlo fictícios, comparativamente a valores para animais ovariectomizados fossem avaliados pela primeira vez.

Conclusões

Este estudo de 18 meses em macacos cinomolgos ovariectomizados (OVX) maduros selvagens, Macaca fascicularis, assegurou eficácia e segurança no osso após tratamento com rhPTH(l-34) durante 12 meses após retirada do tratamento por 6 meses, ou tratamento durante 18 meses. A rhPTH(l-34) aumentou significativamente a massa e a resistência óssea da coluna vertebral e do colo do fémur acima de controlos ovariectomizados para niveis equivalentes ou maiores do que aqueles de controlos fictícios. Em macacos ovariectomizados tratados com rhPTH(l-34), as medições de homeostasia do cálcio (cálcio, fosfato e 1,25-di-hidroxivitamina D séricos) foram restauradas para aquelas de controlos fictícios. As medições séricas, de urina e histomorfometrias usadas para avaliar a renovação óssea mostraram que a rhPTH(l-34) manteve taxas de formação equivalentes ou maiores do que aquelas de controlos ovariectomizados, enquanto os marcadores bioquímicos da reabsorção óssea permaneceram equivalentes aqueles de controlos fictícios. Em todos os animais tratados com rhPTH(l-34) durante até 18 meses, as medições farmacocinéticos não mudaram com o tempo, e não se verificou acumulação de rhPTH(l-34). Não se verificou qualquer evidência de hipercalcemia sustentada ou patologia renal após 18 meses de tratamento. Não se verificou qualquer variação nos periodos de mineralização ou remodelação. 0 ganho global no teor mineral ósseo esquelético observado com rhPTH(l-34) pode ser explicado por taxa de formação óssea e de superfície formadora de osso aumentadas, com pouco ou nenhum efeito na reabsorção óssea. Verificaram-se aumentos significativos no teor mineral ósseo, na densidade mineral óssea e nas medições biomecânicas de resistência, incluindo resistência e rigidez, em locais clinicamente relevantes, tais como a coluna vertebral, colo do fémur e tibia proximal. A rhPTH(l-34) aumentou a taxa de renovação em osso cortical da diáfise do úmero e rádio, mas não alterou significativamente a massa óssea ou as medições de resistência biomecânica comparativamente a controlos ovariectomizados ou fictícios. Contudo, o aumento na largura cortical e/ou na área óssea cortical é consistente com um aumento no momento de inércia da seção transversal, uma medida da resistência e rigidez. A rhPTH(l-34) não teve qualquer efeito significativo nas propriedades materiais intrínsecas de osso cortical. A formação óssea endocortical foi estimulada, aumentando assim a largura cortical e a porosidade intracortical. Parece que estas variações em porosidade são responsáveis pela manutenção da elasticidade do osso.

Em macacos, 12 meses de tratamento com rhPTH(l-34) seguida por retirada por 6 meses foi associada com ganhos menores, mas ainda significativos, na massa e resistência óssea na coluna vertebral e colo do fémur. Depois da retirada, nenhum efeito significativo foi notado na diáfise de osso cortical do úmero e rádio. Marcadores ósseos e histomorfometria mostraram tendências de retorno aos baixos valores de renovação medidos em controlos fictícios.

Estudos mecanisticos in vivo em roedores mostraram que genes associados com resultados anabólicos de rhPTH(l-34) são regulados positivos dentro de 1 a 6 horas, e o aumento nas superficies formadoras de osso pode ser detetado dentro de 24 horas após a primeira dose na ausência de efeitos detetáveis na reabsorção. A rhPTH(l-34) parece recrutar osteoprogenitores na fase S, e estimular a sua diferenciação em osteoblastos, aumentando assim rapidamente a percentagem de superficies formadoras de osso. Injeções simples ou múltiplas da rhPTH(l-34) podem ser dadas dentro de um periodo de 1 hora para induzir o efeito anabólico em osso. Contudo, quando a dose equivalente é dada em ratos jovens como injeções múltiplas durante 6 horas ou 8 horas, o efeito anabólico foi anulado, sugerindo que uma breve exposição limitada à rhPTH(l-34) é requerida para induzir o efeito anabólico.

Em resumo, a rhPTH(l-34) é anabólica no osso em macacos e coelhos, aumentando a massa óssea e as medições de resistência biomecânica em locais clinicamente relevantes, tais como a coluna vertebral lombar e o colo do fémur por estimulação seletiva da formação óssea. Os aumentos na renovação óssea, formação de superfície endocortical e porosidade, detetados por histomorfometria em locais corticais, não alteraram a massa óssea ou as medições biomecânicas de resistência óssea, mas aumentaram o momento de inércia da seção transversal por aumento da área e/ou largura óssea cortical.

Estes estudos demonstram que a administração de ativadores do recetor da hormona paratiroideia, tal como a PTH(l-34) humana recombinante, melhora a qualidade óssea durante e após o tratamento. De facto, a administração da PTH uma vez ao dia durante 18 meses, ou às mesmas doses durante 12 meses, seguidos por uma fase de retirada de 6 meses, mostrou melhoria acentuada da qualidade do osso cortical do úmero, como analisado por histomorfometria e microscopia de infravermelhos com transformada de Fourier polarizada (FTIR). Esta análise revelou que a administração de PTH pode melhorar a qualidade de osso por substituição do osso velho (cristalitos grandes) com osso novo (gama de cristalitos de vários tamanhos, tendendo para menor tamanho). Assim, a administração de PTH pode aumentar a qualidade do osso cortical, melhorar a mineralização e acelerar a mineralização e a substituição de osso velho por osso novo.

Além disso, após retirada da PTH de macacos que receberam doses baixas, existe um beneficio adicional uma vez que a matriz se torna mais otimamente mineralizada, e os cristalitos maturam. Isto é, a doses baixas, a PTH pode ter benefícios adicionais durante a fase de retirada de tratamento por aumento da mineralização. Estes dados indicam benefícios de um regime finito de tratamento com PTH seguido de um periodo de retirada para conseguir um beneficio aumentado. As definições atuais de qualidade óssea não incluem estes aspetos da mineralização melhorada.

Em estudos iniciais de uma fase de tratamento de PTH seguida de uma fase sem tratamento, a fase de tratamento era menos de 1 mês. A fase prolongada mas finita de tratamento de 18-24 meses seguida de um periodo de pelo menos 2 ciclos de remodelação não tinha sido anteriormente explorada. 0 beneficio continuado em primatas após retirada do tratamento está em acentuado contraste com os resultados conseguidos em roedores após dosagem com PTH. Os estudos de ratos mostraram regularmente que o osso é rapidamente perdido depois da retirada do tratamento. Gunness-Hey, M. e Hock, J. M. (1989) Bone 10: 447-452; Shen, V. et al. (1993) J. Clin Invest 91: 2479-2487; Shen, V. et al. (1992) Calcif. Tissue Int. 50: 214-220; e Mosekilde, L. et al. (1997) Bone 20: 429-437.

Tal método de aumentar a mineralização óssea não tinha sido anteriormente observado e é inesperado, revelando um novo método através do qual a PTH aumenta a resistência e a rigidez óssea e pode prevenir fraturas.

Este novo método inclui aumentar e regularizar a mineralização, para proporcionar um osso mais resistente, mais rigido, mais resistente à fratura. Tais efeitos benéficos requerem mais do que nova formação de matriz. Estes resultados indicam que a PTH tem benefícios em doentes com ossos ou esqueletos imobilizados, ou em esqueletos deficientes em minerais, desde que também exista uma suplementação adequada de cálcio e vitamina D.

Exemplo 3 - Resistência e densidade óssea aumentada e fraturas reduzidas após administração de rhPTH(l-34) a seres humanos Número de rhPTH(l-34): 1093 registados, 848 indivíduos: terminaram.

Placebo: 544 registados, 447 terminaram.

Critérios de Mulheres com idades de 30 a 85 anos, pós- diagnóstico e menopáusicos durante um minimo de 5 anos, de inclusão: com um minimo de uma fratura moderada ou duas fraturas ligeiras vertebrais atraumáticas.

Dosagem e administração: Produto de teste (cego) rhPTH(l-34): 20 pg/dia, dado subcutaneamente rhPTH(l-34): 40 pg/dia, dado subcutaneamente

Terapia da referência (cego)

Material de estudo de placebo para inj eção

Duração do rhPTH(l-34): 17-23 meses (excluindo 6-

Tratamento: meses de face preparatória)

Placebo: 17-23 meses (excluindo 6 meses de face preparatória)

Critérios para Raio X da coluna vertebral; marcadores avaliação: biológicos séricos (cálcio, fosfatase alcalina especifica do osso, procolagénio I - propéptido do terminal carboxilo); marcadores de urina (cálcio, N-telopéptido, desoxipiridinolina livre); 1,25-di-hidroxivitamina D; densidade mineral óssea: coluna vertebral, anca, pulso e corpo total; altura; farmacocinética da população; biópsia óssea (locais selecionados de estudo).

Caracteristicas dos doentes

Resultados

Os dados deste ensaio clínico são reportados nas Tabelas 15-19. A Tabela 15 ilustra os dados que mostram a redução após tratamento com PTH do número e gravidade de fraturas vertebrais. Comparando todos os doente tratados com PTH com o placebo, a redução global no número de doentes com fraturas vertebrais foi 67% (p<0,001), com redução de 65% (p<0,001) e 20 yg/dia PTH comparativamente ao placebo, e uma redução de 69% a 40 yg/dia PTH comparativamente ao placebo (Tabela 15) . Comparando todos os doentes tratados com PTH com o placebo, a redução global no número de doentes com múltiplas fraturas vertebrais foi 81% (p<0,001), com uma redução de 77% (p<0,001) a 20 yg/dia PTH comparativamente ao placebo, e uma redução de 86% a 40 yg/dia PTH comparativamente ao placebo. Comparando todos os doentes tratados com PTH com o placebo, a redução global no número de doentes com fraturas vertebrais moderadas a graves foi 84% (p<0,001), com uma redução de 90% (p<0,001) a 20 yg/dia PTH comparativamente ao placebo, e uma redução de 78% a 40 yg/dia PTH comparativamente ao placebo (Tabela 15) .

Tabela 15 - Efeito do tratamento com PTH no número e gravidade de fraturas vertebrais.

*n = número de doentes com raios X de linha de base e de ponto final ** Fratura moderada resulta em mais de 25% de perda de altura vertebral (ou uma medida equivalente). Fratura grave resulta em mais de 40% de perda de altura vertebral (ou uma medida equivalente). As fraturas são como definidas por Genant et al. (1993) Vertebral fracture assessment using a semiquantitative technique; J. Bone &amp; Min Res 81137-1148. A Tabela 16 ilustra o efeito do tratamento com PTH no número de fraturas em vários ossos não-vertebrais ao longo de todo o corpo. O número de fraturas aparentemente diminuiu em cada um de anca, rádio, tornozelo, úmero, costelas, pé, bacia, e outros locais (Tabela 16) . A redução é estatisticamente significativa quando vista como a redução no número total de fraturas entre os doentes tratados com PTH comparativamente aos doentes tratados com placebo. A redução é ainda mais significativa quando considerada como a redução no número total de fraturas da anca, rádio, tornozelo, úmero, costelas, pé, e bacia entre os doentes tratados com PTH comparativamente aos doentes tratados com placebo (Tabela 16).

Tabela 16 - Efeito do tratamento com PTH no número de fraturas não-vertebrais.

*Placebo (pbo)

0 efeito de PTH no teor mineral ósseo (BMC) , na densidade mineral óssea (BMD) e na área óssea foram determinados por absorciometria de dupla energia (DEXA), e os resultados são reportados nas Tabelas 17-19. A administração de PTH causou aumentos aparentes em BMC na coluna vertebral lombar do doente, fémur e anca, pulso, e ao longo de todo o corpo do doente (Tabela 17). 0 tratamento com PTH causou aumentos significativos na BMD do doente na coluna vertebral lombar, fémur e anca (Tabela 18) . Os aumentos na coluna vertebral lombar, fémur e anca foram estatisticamente significativos com p<0,001 (Tabela 18) . A área óssea aumentou aparentemente após tratamento de PTH para a coluna vertebral lombar do doente, fémur e anca (Tabela 19) . Os aumentos foram estatisticamente significativos para a coluna vertebral lombar e colo da anca (Tabela 19). 0 efeito de PTH em todo o corpo, a medida da quantidade e qualidade de osso, BMC, é particularmente significativa. Este efeito de todo o corpo indica que a quantidade de osso no corpo do doente está a aumentar. A PTH não resulta meramente na movimentação de massa óssea de uma porção do corpo do doente para outra. Em vez disso, o tratamento com PTH aumenta a quantidade e a qualidade do osso no corpo do doente.

As Figuras 9 e 10 ilustram os aumentos ao longo do tempo na BMD da coluna vertebral lombar e na BMD do colo do fémur/anca, respetivamente, para doentes tratados com PTH e de controlo de placebo. A BMD da coluna vertebral lombar do doente aumenta consistentemente durante pelo menos 18 meses, com pouco significativo ou nenhum aumento ao longo dos meses subsequentes. A BMD do fémur/anca do doente aparentemente aumenta pelo menos 18 meses, e pode aumentar após duração adicional do tratamento de PTH.

Tabela 17-0 efeito de PTH no teor mineral ósseo expresso como % de variação de ponto final (SD) a partir da linha de

Tabela 18-0 efeito de PTH na densidade mineral óssea expressa como % de variação de ponto final (SD) a partir da

Tabela 19 - Efeito de PTH na área óssea expressa como % de

Em resumo, os dados apresentados acima indicam que os doentes tratados com PTH têm fraturas reduzidas. Especificamente, o tratamento de PTH reduziu em mais de 66% o número de doentes com fraturas vertebrais prévias que sofreram novas fraturas vertebrais. 0 tratamento de PTH também reduziu em mais de 7 8% o número de doentes com fraturas vertebrais prévias que sofreram de novas fraturas vertebrais múltiplas. Além disso, a PTH diminuiu a gravidade das fraturas vertebrais, com uma redução significativa de 78% no número de doentes com fraturas moderadas ou graves. Os doentes que recebem PTH beneficiaram de uma redução significativa em todas as fraturas não-vertebrais (incluindo fraturas da anca, rádio, pulso, bacia, pé, úmero, costelas ou tornozelo) com significância a um nivel de p<0,007. A qualidade óssea também aumentou. Os doentes com fratura prévia beneficiaram de um aumento significativo no teor mineral ósseo da anca, coluna vertebral e corpo total. Este aumento indica que a redução da fratura nestes locais pode ocorrer tão cedo quanto após 12 meses de terapia.

Discussão

Estes dados sobre fraturas são os primeiros dados sobre a redução de fratura por PTH em seres humanos. Estes resultados demonstram uma melhoria na qualidade óssea e a resistência óssea, como os dados pré-clinicos aqui reportados acima. Estes resultados também mostram benefícios na qualidade e resistência óssea em locais não-vertebrais. Os resultados de uma redução nos números de fraturas sustentadas durante o periodo de 18-23 meses de tratamento não tinham sido previamente observados em estudos clinicos ou pré-clinicos. A questão se PTH isoladamente aumenta a solidez e a resistência óssea para melhorar a resistência à fratura não tinha sido previamente testada em seres humanos. A literatura publicada sugeriu consistentemente que PTH devesse ser dada em combinação com um anti-reabsortivo ou um estrogénio. Os ensaios clinicos anteriores publicados incluíram populações doentes demasiado pequenas para determinar uma redução significativa da fratura. Num estudo, os benefícios de PTH isoladamente não puderam ser avaliados porque não havia nenhum controlo de placebo. Num segundo estudo, empregando a definição geralmente aceite de fratura, não foi observado qualquer redução na fratura.

Os resultados de uma redução de fraturas em locais não-vertebrais combinados são particularmente inesperados à luz da convicção comum que a PTH tem efeitos negativos em tais locais. 0 dogma comum sustenta que a PTH aumentará a porosidade cortical e consequentemente enfraquece o osso, especialmente no inicio da terapia. Além disso, este dogma afirma que os locais de osso cortical têm em elevado risco de fratura e que a PTH não irá oferecer qualquer beneficio na redução da fratura em locais não-vertebrais. 0 dogma também sustenta que a PTH isoladamente é improvável de ser eficaz e irá requerer terapia anti-reabsortiva simultânea para bloquear os efeitos negativos no osso cortical. Os presentes dados demonstram os benefícios previamente não observados da PTH dada a doentes que recebem vitamina D e suplementos de cálcio. Inesperadamente, a PTH reforça o osso para reduzir o número de novas fraturas num doente em risco de fraturas múltiplas da coluna vertebral, em risco de fraturas não-vertebrais adicionais, em risco de fraturas adicionais moderadas a graves da coluna vertebral e semelhantes.

Este ensaio clinico em mulheres pós-menopáusicas mostrou benefícios particulares de tratar doentes com dose baixa (20 yg/dia) uma vez que a dose de PTH (que, em doses altas, poderia mostrar efeitos secundários em alguns doentes) foi reduzida, mas a prevenção de fratura e a redução de fratura foram retidas, e semelhante àquelas notadas na dose alta (40 yg/dia) . Os dados de FT-IR de macaco proporcionam uma possível, mas não limitante, explicação mecanística. O estudo de macaco mostra que a dose baixa de PTH aumentou a formação de cristal e acelerou a mineralização no osso cortical. Além disso, os macacos de dose baixa mostraram benefícios adicionais após a retirada, uma vez que a PTH aumentou o teor mineral ósseo. Os presentes dados demonstram a nova observação de que a PTH dada em doses baixas a doentes que recebem vitamina D e suplementos ao cálcio, é eficaz na prevenção de fraturas vertebrais e não-vertebrais. Contrariamente à convicção comum, a PTH reforça o osso em locais não-vertebrais para prevenir novas fraturas ou para reduzir a gravidade das fraturas, aparentemente melhorando a mineralização e o teor mineral ósseo.

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. PTH(1-34) humana para utilização na prevenção ou redução da incidência de fratura vertebral e não-vertebral num ser humano com osteoporose ou em risco de progressão para osteoporose, em que: a PTH(l-34) é administrada por injeção subcutânea a uma dose de 20 yg/dia, em que o ser humano também recebe doses eficazes de cálcio e de vitamina D; e a PTH(l-34) é formulada com um tampão e um excipiente, com um agente de tamponamento capaz de manter a solução numa gama de pH de 3 a 7.
2. 2. PTH(l-34) humana para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o agente de tamponamento é capaz de manter a solução numa gama de pH de 3 a 6.
3. 3. PTH(l-34) humana para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o agente de tamponamento é acetato, tartarato ou citrato.
4. 4. PTH(l-34) humana para utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a concentração de tampão está na gama de 2 mM a 500 mM.
5. 5. PTH(l-34) humana para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a concentração de tampão está na gama de 2 mM a 100 mM.
6. 6. PTH (1-34) humana para utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a PTH(l-34) é formulada numa solução estabilizada que inclui um agente estabilizador, um agente de tamponamento e um conservante.
7. 7. PTH(l-34) humana para utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o conservante é selecionado de cresóis, álcool benzilico, fenol, cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio, clorobutanol, álcool feniletilico, metilparabeno, propilparabeno, timerosal e nitrato e acetato de fenilmercúrio.
8. 8. PTH(l-34) humana para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o conservante é m-cresol ou álcool benzilico.
9. 9. PTH(l-34) humana para utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o conservante é m-cresol.
10. 10. PTH(l-34) humana para utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a quantidade de conservante varia de 0,1 a 2% em peso de solução total.
11. 11. PTH(l-34) humana para utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a quantidade de conservante varia de 0,3 a 1,0% em peso de solução total.
12. 12. PTH(l-34) humana para utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o ser humano é uma mulher.
13. 13. PTH(l-34) humana para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que a mulher é uma mulher pós-menopáusica.