CZ20004134A3 - Léčivo pro snížení rizika vertebrální nebo nevertebrální zlomeniny kosti u člověka a rizika osteoporózy - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu zvyšování houževnatosti a tuhosti kostí a snižování pravděpodobnosti a/nebo závažnosti lomu kostí podáváním parathyroidního hormonu. Specielně se vynález týká způsobu zvyšování houževnatosti a tuhosti kostí v místech potenciálního nebo častého úrazu, jako je kyčel nebo osten pátere u lidí ohrožených nebo trpících osteoporózou. Zejména se vynález týká způsobu snižování případů lomu páteře, snižování případů vícenásobných lomů páteře, snižování závažnosti lomů páteře a/nebo snižování případů nepáteřních lomů.

bos avadn i s tav tec hn i ky

Stávající činidla jako estrogen, bifosfonáty, fluorid nebo kale itónin mohou zabraňovat ztrátě kostní hmoty a vyvolat hmotnostně 3¾ až 5¾ nárůst kostní hmoty vyplňováním prostoru přestavby kostí, avšak tvorba kostí není tím významně podpořena. Uchování kostí inhibici přeměny kostí nemůže být dostatečnou ochranou proti nebezpečí lomu u pacientů, u kterých došlo již k významné ztrátě kostní hmoty. Anabolika, která zvyšují pevnost kostí podporováním tvorby kostí mohou přednostně zajišťovat lepší ochranu před lomem u pacientů s rozvinutou osteoporózou .

Parathyroidní hormon (PTH) je sekretovaným 84 aminokyselinovým produktem savčí štítné žlázy, který řídí hladinu vápníku v séru působením na různé tkáně, včetně kostí. N-zakončení 34 aminokyselin hovězího a lidského PTH (PTHC1-34)) se považuje za biologický ekvivalent plné délky hormonu. Jiné amino terminální fragmenty PTH Cvčetně například 1-31 a 1-38), nebo PTHrP (peptid/protein odvozený od PTH) nebo analogy jednoho • · nebo obou, které aktivují receptor PTH/PTHrP (receptor PTH1), vykazují podobné biologické účinky na kostní hmotu, ačkoli míra takových účinků mříže kolísat.

Studie na lidech s různými formami PTH ukázaly anabolický účinek na kosti a vyvolaly okamžitě zájem o jeho použití pro léčení osteoporózy a souvisejících kostních onemocnění. Významné anabolické účinky PTH na kosti, včetně stimulace tvorby kostí, která se projevuje zřetelným nárůstem kostní hmoty a/ nebo pevnosti, byly předvedeny na četných zvířecích modelech a na lidech.

Obecně se předpokládá, že podáváním PTH lidským a odpovídajícím zvířecím modelům má záporný vliv na kortikální kosti. Skutečně přírodně se vyskytující zvyšování endogenního PTH, ke kterému dochází při nemoci hyperparathyroidismus, vede ke ztenčování kortikální kosti doprovázenému nárůstem pojiv a hmoty trabekulární kosti. Minulé studie naznačují, že když se Haverssova kortikální kost (vyskytující se u lidí a vyšších savců) přestavuje pod vlivem PTH, dochází k takové redistribucl kosti, že klesá hmotnost a pevnost kortikiální kosti, zatímco hmotnost. a pevnost trabekulární kosti se zvyšuje. Například v publikovaných klinických studiích podávání PTH, hnotnost kortikální kosti po ošetření exogenním PTH klesala a tyto poznatky vyvolaly znepokojení, že ošetřování PTH hmotnost a pevnost kortikální kosti snižuje. Jednou starostí, vyvolanou takovými studiemi, je, že diky ubývání kortikální kosti dojde ke ztrátě celkové hmotnosti kortikálních kosterních kostí. To má velký klinický význam, neboť u osteoporózy znamená větší úbytek trabekulární kosti ve srovnání s úbytkem kortikální kosti, že mechanické zatížení přenáší převážně zbývající kortikální kost. Pokračující ubývání kortikální kosti by zvyšovalo nebezpečí lomu. Proto je důležité, aby terapeutické činidlo pro osteoporózu uchovávalo nebo zvětšovalo zvývající kortikální kosti subjektu.

Účinky PTH na kortikální kost byly předmětem zkoumání zvířat s Haversovou přestavbou kostí, jako jsou psi, fretky, ovce a opice, avšak počty vzorků jsou obvykle příliš malé pro spolehlivé statistické analýzy. Dopad změn, vyvolaných léčbou PTH, na mechanické vlastnosti kortkální kosti u takových zvířat zůstává neznámý- Publikované studie hlodavců ukázali'· zvýšenou hmotnost kortikální kosti během podávání PTH, avšak ztrátu této přednosti po vynechání PTH. Kortikální kost hlodavců má však zřetelně odlišnou strukturu oproti Haversové kortikální kosti a přestavuje se povrchovým apozičním tvořením a resorpcí, spíše než intrakortikální přestavbou stavebních jesdnotek kosti. Kromě toho technologická omezení biomechanických testů na poměrně krátkých kostech hlodavců vyvolává artefakty měření, když činidlo jako PTH, změní geometrii kosti k jejímu zesílení. Takové artefakty činí extrapolaci odezvy kortikální kosti krysy na lidi nebo jiná zvířata s osteonální přestavbou nepolehlivou. Proto stávající údaje pro zvířata podobná člověku, podléhající Haversové přestavbě kostí, naznačují, že PTH může mít škodlivý vliv na kortikální kost., způsobující zřetelný pokles kostní hmoty ochuzováním kortikální kostí

Důsledkem byla běžná domněnka týkající se vlivu PTH, že pacienti potřebují průběžné nebo postupné léčení antiresorptivy k minimalizaci úbytku kostí vyvolanému PTH. Ve skutečnosti byl tento model základem pro klinické studie žen. Například klinické studie používaly PTH u post-menopauzálních žen se souběžnou terapií kalcitoninem nebo estrogenem nebo u premenopauzálních zen, beroucích agonist GnRH, Synarel pro endometriózu. Protichůdné účinky estrogenu a PTH na kortikální přeměnu kostí prakticky znemožnily pozorovat účinky právě PTH během kombinační terapie těmito dvěma činidly.

Úkolem vynálezu je tedy potřeba vyvinout způsob používání PTH ke zvyšování pevnosti a tuhosti kostí u lidí a zvířat vykazujících Haversovou přestavbu kostí a ke snížení výskytu lo-

mů kostí těchto živočichů. Kromě toho je úkolem vynálezu vyvinout způsob zvyšování kvality a množství kortikální kosti.

Podstata vynálezu

Způsob zvyšování houževnatosti a tuhosti kosti v místech potenciálního nebo skutečného úrazu jedince, který to potřebuje, spočívá podle vynálezu v tom, že se podává subjektu účinné množství parat-hyroídního hormonu CPTH).

Vnález se týká způsobu zvyšování houževnatosti a tuhosti kosti, především kortikální kosti a/nebo snižování výskytu a/nebo závažnosti lomu podáváním PTH. Zvláště se vynález týká způsobu zvyšování houževnatosti a tuhosti kosti v místě potenciálního nebo skutečného úrazu. Zvýšení houževnatosti a/nebo tuhosti kosti se může projevit řadou cest známých pracovníkům v oboru, jako je například zvýšení minerální hustoty kosti, zvýšení obsahu minerálů v kosti, zvětšováním práce do lomu. V jednom provedení se vynález týká výskytu nebo závažnosti páteřových a/nebo nepáteřových lomů. Způsobu podle vynálezu je možno použít ke snížení nebezpečí takových lomů nebo k léčeni takových zlomenin. Obzvláště může způsob podle vynálezu snižovat výskyt páteřových a/nebo nepáteřových lomů, snižovat výskyt několikanásobných lomů páteře a zlepšování kvality kostí.

Způsob může zvýšit houževnatost a tuhost v místech potenciálního úrazu, jako je kyčel nebo osten pátere osoby s osteoporózou nebo v jiném místě majícím abnormálně nízkou hmotu kosti nebo špatnou strukturu kosti. Způsob může také zvyšovat houževnatost nebo tuhost v místě skutečného úrazu, jako je zlomenina, například v kyčli nebo v páteři. Preferovaným subjekte» pro způsob podle vynálezu je žena nebo muž s nebezpečím osteoporózy nebo mající osteoporózu, s výhodou postmenopauzální žena a je nezávislý na souběžné terapii náhrady hormonu CPTH), estrogenem nebo ekvivalentní léčbou nebo antiresorpční

léčbou. Vynález se také týká způsobu, při kterém pacient dostává jako doplněk kalcium a/nebo vitamin D.

Parathyroidní hormon, jako jsou N-koncové aminokyseliny 1-34 rekombinantního lidského parathyroidního hormonu, se mflže podávat bud' cyklicky nebo přerušovaně. S výhodou zahrnuje cyklické podávání PTH dva nebo několik přestavbových cyklů a s vysazením PTH na jeden nebo několik přestavbové cykly- Způsobem podle vynálezu zvýšená houževnatost a/nebo tuhost kosti může přetrvat několik přestavbových cyklů, nebo až několik let po posledním podání parathyroidního hormonu.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení pomocí přiložených obrázků.

Seznam obrázků na výkresech

Obr. IA a IB ukazuje, že BMD (bone minerál density = hustota minerálů v kosti) a BMC Cbone minerál content = obsah minerálů v kosti) v osovém dříku stehení kosti Ckortikální kosti) CA) a v sousedství stehení kosti Cmřížkovité kosti + kortikální kosti) CB) je významně větší u zvířat ošetřených PTH než u kontrolních zvířat při obou dávkách.

Ma ose x je vždy dávka PTHC1-34) v yg/kg/den, a na druhém obr. IA je na oxe y plocha X v mm² a na druhém obr. IB je na ose y projektovaná plocha v cm².

Obr. 2A až 2D ukazuje účinky PTH na mechanickou pevnost a moment setrvačností průřezu CCSMI) v kortikální kosti osového dříku stehenní kosti.

Na ose x je vždy dávka PTHC1-34) v pg/kg/den

Na obr. 2AA znamenají prázdé sloupce maximální sílu a šrafované sloupce pevnost.

Na obr. 2BB znamenají prázdé sloupce tuhost a šrafované sloupce modul pružnosti.

• · · · · · · · · •· e ···«·· a· a·

Na obr. 2CC znamenají prázdé sloupce práci do poruchy a šrafované sloupce houževnatost.

Na obr. 2DD znamenají prázdé sloupce CSMI.

Obr. 3 ukazuje procentové změny DXA obsahu minerálů v celém tělese kostí u kontrolní a ošetřované skuplny.

Na ose x jsou měsíce, na ose y procentová změna.

Obr. 4A až 4C ukazuje procentovou změnu rozměrů DXA páteřního ostnu u kontrolní a ošetřované skupiny v lumbárním obratli 2-4 plochy kosti CA) , obsahu minerálů v kosti Cti) a hustoty minerálů v kosti CO .

Na ose x jsou měsíce, na ose y procentová změna

Obr. 5A a 5B ukazuje nárůst kostní hmoty CA) a pevnosti kosti CB) v lumbárním obratli primátů ošetřovaných parathyroidním hormonem Na ose x obr. 5A jsou měsíce ošetření, na ose y procentová změna BMC od začátku zkoušky

Obr. 6A a f«B ukazuje nárůst pevnosti kyčelního krčku CA) a konstantní pevnosti střední části kosti pažní CB) u primátů ošetřovaných parathyroidním hormonem.

Obr. 7 ukazuje aktivaci rychlosti tvoření kosti na nitrokostním a okostičním povrchu osového dříku stehenní kosti.

Na ose x je rychlost tvoření kosti BFR/BS.

Obr. 8 ukazuje histogramovou analýzu posunu voxelové hustoty kosti v lumbárním obratli způsobeného ošetřováním PTH ve srovnání s kontrolou- Patrný je nárůst hustoty kortikální části kostí po vysazení ošetření PTH.

Na ose x je hustota Cmg/cm³), na ose y je pravděpodobnost. Pevná čára platí pro ošetřování drogou, přerušovaná pro Ovx, čerchovaná pro odejmutí drogy.

V prvním oddíle je houbovitá kost, ve šrafováném oddíle nestabilní a ve třetím oddíle kortikální kost.

Obr.9 ukazuje nárůst lumbárního ostnu BMD během 23 měsíců ošetřování pacientů buď 20 ng/kg/den PTH nebo 40 ng/kg/den PTH ve srovnání s kontrolami ošetřovanými placebem.

Na ose x jsou měsíce, na ose y procentová změna.

Obr. 10 ukazuje nárůst stehenní kosti a kyčelního krcku BMD během 24 měsíčního ošetřování pacientů buď 20 ng/kg/den PTH nebo 40 ng/kg/den PTH ve srovnbání s kontrolami ošetřovanými placebem.

Na ose x jsou měsíce, na ose y procentová změna.

Vynález se týká způsobu zvyšování houževnatosti a tuhosti kosti v místech potenciálního nebo skutečného úrazu jedince, který to potřebuje, přičemž se podle vynálezu podává jedinci účinné množství parathyroidního hormonu. Způsobu lze použít ke zvýšení tuhosti a/nebo houževnatosti v místech potenciálních úrazů nebo v místě skutečného úrazu. Za úraz se zde považuje zlomenina, chirurgický zákrok, náhrada pojivá a ortopedické procesy. Zvyšování houževnatosti a/nebo tuhosti kostí zahrnuje obecně zvyšování hustoty minerálů kortikální kosti, zvyšování pevnosti kosti a zvyšování odolnosti kosti vůči zatížení. Snižování výskytu zlomenin obecně zahrnuje snižování pravděpodobnosti aktuálního výskytu lomu u daného subjektu ve srovnání s neošetřovanou kontrolní populací.

Pokud jde o pojmy, znamená ultimate force maximální sílu, kterou vzorek kosti vydrží; tuhostí Cstiffeness> se míní sklon lineární části křivky zatížení-deformace a práce do poruchy (“work to failure”) je definována jako plocha pod křivkou žatížení-deformace před vznikem lomu. Každá z těchto veličin se dá měřit a vypočítat způsoby běžnými ve studiu kostí. Tyto parametry jsou strukturálními vlastnostmi, které závisejí

9 9999

9 · · · «· · · · *

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 999999 9 9 99 na vnitřních materiálových vlastnostech a geometrii a lze je zlištovat způsoby popsanými v práci Turner CH, Burr DB (Basic biomechanical measurements of bone: název Bone 14, str. 595 až 608, 1993). Maximální síla, tuhost a práce do poruchy může být normál izavána k získání vnitřních materiálových vlastností jako je pevnost, modul pružnosti a houževnatost, které jsou nezávislé na velikosti a tvaru. Zde se pevností (ultimate strenght) míní maximální síla, kterou může vzorek vydržet; modul pružnosti vyjadřuje vnitřní tuhost materiálu a houževnatost znamená odolnost do lomu vztaženého na jednotku objemu. Každá z těchto veličin může být zjištěna způsoby známými v oboru. Pevnost femorální kosti, jak je zde uváděna, může být měřena v kycelním krčku nebo na osovém dříku za použití typického tříbodového nebo čtyřbodového ohybu na vnější straně.

Úrazy kostí

Způsob podle vynálezu je výhodný pro jedince, kteří mohou utrpět nebo už utrpěli úraz jedné nebo několika kostí. Způsob může být výhodný pro savce, jako jsou lidi, koně, psi a kočky, zejména lidé. Kostní úrazy mohou být problémem u závodních koní a psů a také u domácích zvířat. Lidé mohou utrpět různé úrazy kostí, způsobené například nehodou, lékařským zákrokem, nebo chorobou. U mladých je kostním úrazem pravděpodobně zlomenina, lékařský zákrok k napravení zlomeniny, nebo náprava spojů nebo poškozených spojovacích tkání, například při atletice. Jiné typy kostních úrazů, jako jsou úrazy způsobené osteoporózou, degenerativní chorobou kostí (jako je arthritis nebo osteoarthritis), nebo sekundární stavy související s léčbou jiných systemických stavů (například glukokortiokoidní osteoporóza, popáleniny nebo transplantace orgánů) se vyskytují spíše u starších lidí.

Přednostriě se vynález týká lidí, zejména žen, při ohrožení osteoporózou nebo trpících osteoporózou. Rizikové faktory • φ • · · · pro osteoporózu jsou v oboru známy a zahrnují hypogonádní stavy u mužů a žen nezávisle na věku, podmínkách, chorobách nebo drogách, které vyvolávají hypogonadismus, faktorech výživy spojených s osteoporózou Cnejběžněji nízká hladina vápníku nebo vitaminu D), kouření, alkoholu, drogách spojených s ubýváním kostí (jako jsou glukokortikoidy, thyroxin, heparin, lithium a arit. ikonvulzanty) , ztráta vidění vytváře jící disposici k pádům, odhadu vzdálenosti, znehybnění, chronická hospitalizace nebo upoutání na lůžku, nebo jiné systemické poruchy, které mohou být přičítány zvýšenému ohrožení osteoporózou. Indikace a doložení osteoporózy jsou v oboru známy a příkladně se uvádí radiologický výskyt alespoň jedné tlakové zlomeniny obratle, nízká hmotnost kostí (typicky alespoň 1 směrodatná odchylka od průměrné normální hodnoty za mlada) a/nebo bezúrazové zlomeniny.

Osteoporóza může vést například k obratlovým nebo neofaratlovým lomům. Příklady neobratlových lomů jsou lom kyěelního krčku, zlomenina distálniho předloktí, zlomenina proximální kosti pažní, zlomenina zápěstí, zlomenina kosti vřetení, zlomenina kotníku, zlomenina kosti stehenní, zlomenina žebra, nohy, pánve nebo jejich kombinace. Způsobu podle vynálezu je možno použít k potlačení rizika takových lomů nebo k léčení takových zlomenin. Nebezpečí lomu se zmenšuje a léčení zlomeniny se napomáhá zvýšením pevnosti a/nebo tuhosti kosti, například v kyčli a/nebo v ostnu páteře. Typickou ženou, ohroženou osteoporózou, je postmenopauzální žena nebo premenopauzální, hypogonádní žena. Hlavním subjektem je postmenopauzální žena a ošetřování nezávisí na souběžné náhradní hormonální terapii (HRT), terapii estrogenem nebo jeho ekvivalentem nebo antiresorpční terapii. Způsob podle vynálezu může být příznivý pro subjekty v jakémkoli stádiu osteoporózy, avšak obzvláště pro starší lidi a lidi v pokročilém věku.

Vynález představuje způsob obzvláště účinný pro prevenci ta * · · · · nebo snížení výskytu zlomenin u subjektů ohrožených osteoporózou nebo při její progresi. Způsob podle vynálezu může snížit výskyt obrat, lových a/nebo neobrat lových lomů, snížit závažnost obratlového lomu, snížit výskyt vícenásobného obratlového lomu a zlepšit kvalitu kostí. Podle jiného provedení může být vynález vhodný pro pacienty s nízkou kostní hmotou nebo před zlomeninou a u lidí s nebezpečím budoucích vícenásobných kosterních lomů, jako jsou pacienti, u kterých osteoporóza páteře může rych1e postupovat.

Jiní jedinci mohou být také ohroženi úrazem kostí nebo jím trpí a mohou využít výhod způsobu podle vynálezu. Například mohou velmi rozmanití jedincí, ohrožení jednou nebo několika shora def i novaným i z1omen i nam i, přede jít ch i rurgi ckému zákroku následujícímu po kostním úrazu, nebo mohou být podrobeni ortopedickému zákroku, který manipuluje s kostí v kosterním místě s abnormálně nízkou kostní hmotou nebo špatnou strukturou kostí nebo s deficitem minerálů- Například může způsob podle vynálezu napomáhat při opětném získání funkce po chirurgickém zákroku jako je náhrada kloubů (například kolene nebo kyčle) nebo po vyztužení páteře nebo po jiných zákrocích, které znehybňuji kosti nebo kostru. Způsob podle vynálezu může také napomáhat zotavení z ortopedických procedur, které manipulují s kostmi v místech abnormálně nízké kostní hmoty nebo špatné struktury kostí, což jsou procesy zahrnující chirurgické rozdělení kosti, včetně osteotomie, náhrady kloubů, kde úbytek struktury kosti vyžaduje restruktulizaci například s vytvořením výstelky kloubní jamky kosti stehenní a prevence posunu protézy. Mezi vhodné subjekty pro využívání vynálezu patří jedinci trpící hypoparat-hyroid ismem nebo vybočením páteře, kteří mohou podléhat úrazům souvisejícím se sníženou činností příštítných tělísek nebo s progresivním vybočením páteře

4 · · 4 4

4 4 4 · 4 · · · · 444 4 4 4444 444 4 4 ······

444 4 4 4444 44 4 444 444 44 44

Houževnatost a tuhost kosti

Způsob podle vynálezu snižuje nebezpečí úrazu nebo pomáhá zotavování po úrazu zvyšováním houževnatosti a/nebo tuhosti kosti. Obecně je houževnatost nebo tuhost kosti dána hmotností a pevností kortikální, trabekulární a houbovité kosti. Způsob podle vynálezu může zajistit míru houževnatosti, tuhosti, hmotnosti a/nebo pevnosti kosti jako má normální populace nebo i vyšší. S výhodou zajišťuje vynález zvýšené úrovně oproti úrovním pocházejícím z úrazu nebo zvyšujícím nebezpečí úrazu. Zvýšení houževnatosti a/nebo tuhosti snižuje nebezpečí nebo pravděpodobnost lomu ve srovnání s neoset, řenou kontrolní populací.

Zvýší-li se určité charakteristiky kosti, zajistí se zvýšení houževnatosti a/nebo tuhosti kosti. Mezi takové charakteristiky patří hustota minerálů v kosti CBMD), obsah minerálů CBMC), aktivační frekvence nebo rychlost tvoření kosti, trabekulární číslo, trabekulární tlouštka, trabekulární a jiné spoje, periosteální a endokortikální stavba kosti, kortikální porozita, plocha průřezu kosti a hmotnost kosti, odolnost vůči zatížení. a/nebo práce do lomu. Zvýšení jedné nebo několika těchto charakteristik je výhodným výsledkem způsobu podle vynálezu .

Jestliže se zhorší některé vlastnosti kosti, jako je prostor kostní dřeně a modul pružnosti, zajistí se zvýšení houževnatosti a tuhosti kostí. Mladší kost Chouževnatější a tužší) má krystality, které jsou obecně menší než krystality starší kosti. Tedy obecně zmenšování kostních krystal itů zvyšuje houževnatost a tuhost kosti a může snižovat výskyt zlomenin- Kromě toho zrání krystalitů kostí může zajišťovat další žádoucí vlastnosti kosti, včetně zvýšené houževnatosti a tuhosti kosti a/nebo může snižovat výskyt zlomenin. Snížení jedné nebo několika těchto charakteristik je výhodnou předností φφφφφφ · · ·· ·· φ φ- φ * · · · φ · · · • φ · φ · φφφφ • Φφ φ φ φφφφφφ φφφ φ φ φφφφ φφ φ φφφφφφ φφ φφ způsobu podle vynálezu.

Způsob podle vynálezu účinně zvyšuje houževnatost a/nebo tuhost každé z četných kostí. Například může způsob podle vynálezu zvyšovat houževnatost a/nebo tuhost kostí včetně kyčelní kosti jako je ilium, kostí nohy jako je stehenní kost, kost páteře jako je obratel nebo paže, jako je dlstální kost předloktí nebo proximální kost pažní. Tento nárůst houževnatosti a/nebo tuhosti může být patrný v celé kosti nebo může být lokalizován na určitou část kosti. Například může být houževnatost a/nebo tuhost stehenní kosti zvýšena zvýšením houževnatosti a/nebo tuhosti krčku nebo chocholíku stehenní kosti. Houževnatost a/nebo tuhost kyčle může být zvýšena zvýšením houževnatosti a/nebo tuhosti výčnělku i 11a nebo ostnu ilia. Houževnatost a/nebo tuhost obratle může být zvýšena zvýšením houževnatosti a/nebo tuhosti pedunkulu, ploténky nebo tělesa. S výhodou jde o účinek na obratlech v určité oblasti páteře, jako jsou obratle krční, hrudní, bederní, křížové a/nebo kostrční. S výhodou jde o účinek na jeden nebo několik středních hrudních a/nebo horních bederních obratlů.

Zvýšení houževnatosti a/nebo tuhostí lze nalézt v každém typu kostí, nebo převážně u jednoho typu kostí. Mezi typy kostí patří houbovitá Cmřížkovitá, trámcovitá nebo lamelami) kost a kompaktní Ckortikální nebo hustá) kost a lomový kalus. Způsob podle vynálezu zvyšuje s výhodou houževnatost, a/nebo tuhost působením na mřížkovítou nebo kortikální kost nebo na kortikální kost samotnou. Trámcovitá kost, ke které je připojena spojovací tkáň, může být způsobem podle vynálezu také vyztužena. Je například vhodné zajistit přídavnou houževnatost v místě napojení vaziva, šlachy a/nebo svalu.

Podle dalšího význaku vynálezu může zvýšení houževnatosti a/nebo tuhosti snižovat výskyt zlomenin. Zde může zvýšení houževnatosti a/nebo tuhosti zahrnovat snížení výskytu lomů ob• · · • · · • · · • · · »· ratlů, snížení závažných zlomenin, snížení výskytu středně závažných zlomenin, snížení výskytu neobratlových zlomenin, snížení výskytu mnohočetných zlomenin nebo jejich kombinace.

Parathyroidní hormon

Jako účinnou složku může prostředek nebo roztok obsahovat plnou délku 84 aminokyselinové formy parathyroidního hormonu, obzvláště lidskou formu hF’TH (1-84), získanou rekombinačně„ peptidovou syntesou nebo extrakcí z lidských tekutin (například americký patentový spis číslo 5 208041). Sekvence aminokyselin pro hPTH (1-84) popsal Kimura a kol. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 114,(2), str. 493).

Prostředek nebo roztok může také obsahovat jako účinnou složku fragmenty nebo varianty fragmentů lidské PTH, nebo krysí, vepřové nebo hovězí PTH, která má aktivitu lidské PTH zjištěnou na modelu osteoporózy krys s odnětím vaječníku (Kimmel a kol., Endocr1nology, 32 (4), str. 1577, 1993).

Je žádoucí, aby fragmenty PTH obsahovaly alespoň prvních 28 N-koncových zbytků, jako jsou PTHC1-28), PTHC1-31), PTH (1-34), PTH(l-37), PTH(l-38) a PTH(1-41). Jako alternativy variant PTH se uvádějí 1 až 5 substitucí aminokyselin, které zlepšují stálost PTH a poločas životností, jako je náhrada zbytků methioninu v poloze 8 a/nebo 18 leucinem nebo jinou hydrofobní aminokyselinou, která zlepšuje stálost PTH vůči οχ i dači a náhrada aminokyselin v oblasti 25-27 vůči trypsinu necitlivými aminokyselinami, jako je histidin nebo jiná aminokyselina, které zlepšují stálost PTH vůči proteáze. Jako jiné formy PTH se uvádějí PTHrP, PTHrP(l-34), PTHrP(l-36) a analogy PTH nebo PTHrP, které aktivují receptor PTH1. Tyto formy PTH zahrnuje zde zásadně používaný termín parathyroidní hormon. Hormony lze získat známými rekombinantními nebo syntetickými způsoby (americký patentový spish číslo 4 086196 a 5 556940).

• ·

• ·

• · • · • · • ·

Výhodným hormonem je lidský PTHC1-34), známý také jako teriparatid. Stabilizované roztoky lidského PTHC1-34), například rekombinantního lidského PTHC1-34), CrhPTHC1-34), kterých může být použito při způsobu podle vynálezu jsou popsány v americké přihlášce vynálezu číslo 60/069,075. Krystalická forma PTHC1-34), které může být použito podle vynálezu, je popsána v americké přihlášce vynálezu číslo 60/069,375.

Podávání parathyroidního hormonu

Parathyroidní hormon se může obvykle podávat parenterálně s výhodou subkutánní injekcí, způsoby a jako prostředky v oboru dobře známé. Stabilizované prostředky lidského PTHC1-34), kterých lze s výhodou podle vynálezu používat, jsou popsány v americké přihlášce vynálezu číslo 60/069,075. Tato přihláška vynálezu také popisuje četné jiné formulace ke skladování a podávání parathyroidního hormonu. Stabi1iozovaný roztok parathyroidního hormonu může obsahovat stabilizační činidlo, pufrovací činidlo a konzervační látku.

Stabilizační činidlo, začleněné do roztoku nebo prostředku, obsahuje polyol, který zahrnuje sacharidy, s výhodou monosacharld nebo diasacharid, například glukózu, trehalózu, rafinózu nebo sacharózu; alkohol cukru, jako je například mannitol, sorbitol nebo inositol, a několikamocný alkohol, jako je glycerin nebo propylenglykol, nebo jejich směs. Výhodným polyol em je mannitol nebo propylenglykol. Koncentrace polyolu může být hmotnostně přibližně 1 až přibližně 20 s výhodou přibližně 2 až přibližně 10 %, vztaženo na roztok jako celek.

Použitým pufrovacím činidlem v roztoku nebo prostředku podle; vynálezu může být jakákoli kyselina nebo kombinace solí, která je farmaceuticky přijatelná a schopná udržet vodný roztok na hodnotě pH 3 až 7, s výhodou 3 až 6. Výhodné pufrovací systémy jsou například na acetátové, vinanové a citrátové báx’3

00 ·· 0···

0 0 0 0 0 ······

0 0 0 0 0

000 000 00 00 zi . Výhodnější pufrovací systémy jsou na acetátové nebo vinanové bázi, nejvýhodnější je acetátový pufr. Koncentrace pufru mflže být přibližně 2 až přibližně 500 mM, s výhodou přibližně 2 mM až 100 mM.

Stabilizovaný roztok nebo prostředek podle vynálezu mflže také obsahovat konzervační látku přijatelnou pro parenterální podání- Takovými konzervačními látkami jsou například krezoly, benzylalkohol, fenol, benzalkoniumchlorid, benzethoniumchlorid, chlorbutanol, fenylethylalkohol, methylparaben, propylparaben, thimerosal a fenylrtuťový nitrát a acetát. Výhodnou konzervační látkou je m-krezol nebo benzylalkohol; nejvýhodnější je m-krezol. Množství konzervační látky mflže být hmotnostně přibližně 0,1 až přibližně 2 s výhodou přibližně 0,3 až přibližně 1,0 %, vztaženo na roztok jako celek.

Stabilizovaný teriparatidový roztok mflže tedy obsahovat mannitol, acetát a m-krezol s předpokládaným poločasem životo nosti 15 měsicfi při teplotě 5 C.

Prostředek parathyroídního hormonu mflže být případně ve formě prášku obsahujícího méně než hmotnostně 2 % vody, pocházející ze sušení vymrazováníra sterilního vodného roztoku hormonu, připraveného smísením vybraného parathyroídního hormonu, pufrovacího činidla a konzervačního činidla, jak shora popsáno. Obzvlášť výhodné pufrovací činidlo při přípravu lyofilizovaných prášků je na vinanové bázi. Obzvlášť, výhodnými konzervačními prostředky jsou glycin, sacharóza, trehalóza a rafinóza.

Kromě toho mflže být parathyroídní hormon formulován spolu s typickými pufry a excipienty používanými v oboru ke stabilizaci a solubilizaci proteinů pro parenterální podávání. Vhodné farmaceutické nosiče a jejich formulace jsou popsány v literatuře (Martin, Remingtons Pharmaceutical Sciences 15- vydání ···· 0 0 00 »0

0 00 0» 0000

0 0 0 0000

000 » » »00000

000 0 0 0000

0 000000 00 00

Mack Publishing Co. Easton, 1975). Parathyroidní hormon může být dodáván také plícemi, ústy, nosem, čípky nebo orálními prostředky.

Parathyroidní hormon je formulován k podávání dávky účinné ke zvýšení houževnatosti a/nebo tuhosti jedné nebo několika pacientových kostí nebo ke snížení pravděpodobnosti a/nebo závažnosti zlomenin kostí. S výhodou zajištuje účinná dávka zlepšení struktury, hmotnosti a/nebo pevnosti kortikální kosti. Účinná dávka s výhodou snižuje výskyt lomů obratlů, snižuje? výskyt mnohočetných lomů obratlů, snižuje závažnost lomů obratlů a/nebo snižuje výskyt neobrat1ových zlomenin. S výhodou dostává jedinec, léčený parathyroidním hormonem, také účinné dávky vápníku a vitaminu D, které mohou podpořit účinky hormonu. Účinná dávka parathyroidního hormonu je obvykle vyšší než přibližně 5 pg/kg/den ačkoli, zejména u lidí, může být vyšší než přibližně 1.0 až 40 pg/kg/den, nebo ještě vyšší k dosažení zvýšené houževnatosti a/nebo tuhosti, obzvláště kortíkální kosti, nebo ke snížení výskytu zlomenin. Pacient, trpící hypoparathyroidízrnem, může potřebovat přídavné nebo vyšší dávky parathyroidního hormonu; takový jedinec také potřebuje náhradní hormonální terapii. Dávky, nutné pro náhradní terapií při hypoparathyroidizmu, jsou v oboru dobře známy. V některých případech je možno pozorovat příslušné účinky PTH při dávkách menších než přibližně 5 pg/kg/den nebo dokonce menších než přibližně 1 pg/kg/den.

Hormon se může podávat pravidelně (například jednou nebo vícekrát každého dne nebo týdne), přerušovaně (například nepravidelně během dne nebo týdne), nebo cyklicky (například pravidelně po několik dní nebo týdnů s následnou periodou bez podávání). S výhodou se PTH podává u osteoporotíckých pacientů jednou denně po dobu 1 až 7 dní s periodou 3 měsíců až 3 let. S výhodou zahrnuje cyklické podávání podávání parathyroidního hormonu pro nejméně dva přestavbové cykly a vysazení para17 • · • « • « • · • · ·* • ** ·· •« « ♦ w · « ··'·'» • · · · · · • · · · ♦ *1« ·· thyroidního hormonu pro alespoň jeden přestavbový cyklus. Jiným výhodným režimem je cyklické podávání, které zahrnuje podávání parathyroidního hormonu po dobu nejméně 12 až přibližně 24 měsíců a vysazení F’TH po dsobu nejméně 6 měsíců. Přednosti podávání parathyroidního hormonu zůstávají typicky zachovány po periodě podávání. Příznivé účinky podávání po dobu několika měsíců mohou přetrvat rok až dva nebo více let bez dodatečného podávání.

Použití prostředků parathyroidního hormonu

Vynález se týká také soupravy Ckitu) obsahující uváděné farmaceutické prostředky k použití způsobem podle vynálezu. Kit může? obsahovat fiolu s prostředkem podle vynálezu a se vhodnými nosiči, buď v suchém nebo v tekutém stavu. Kit dále obsahuje instrukce ve vinětě nalepebné na fiale a/nebo vložené do krabičky, v níž je fiola zabalena, k použití a podávání prostředků. Instrukce mohou být také vytištěny na krabičce, do které je? fiola zabalena. Instrukce obsahují informace, jako je dostatečná dávka a podávání pro pracovníka podávajícího drogu. Předpokládá se, že pracovníkem je lékař, zdravotní sestra nebo obsluha, která smí podávat drogu.

Vynález se týká také farmaceutického prostředku včetně formulace jednoho nebo několika parathyroidních hormonů, jako je lidský PTHC1-84) nebo lidský PTHC1-34), a který je vhodný pro parenterální podávání. Podle vynálezu může být formulace jednoho nebo několika parathyroidních hormonů, jako je lidský PTHC1-84) nebo lidský PTH(1~34), použito k výrobě prostředků nebo léčiv vhodných k parenterálmu podávání. Vynález se týká také způsobu výroby prostředků včetně formulace jednoho nebo několika parathyroidních hormonů, jako je lidský PTHC1-84) nebo lidský PTHC1-34), ve formě vhodné k parenterálnímu podání. Například tekuté nebo pevné prostředky lze vyrábět o sobě známým způsobem rozpouštění jednoho nebo několika parathyroidních hormonů, jako je lidský F’THCl-84) nebo lidský PTHC1-34), ve vhodném rozpouštědle, jako je voda, pri vhodné hodnotě pH, včetně pufrů nebo jiných excipientů, například ve formě stabilizovaných roztoků, jak shora popsáno.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení pomocí přiložených obrázků.

F*ř ík 1 ady proveden í vyná 1 ezu

F’říklad 1

Zvýšení pevnosti a hustoty kostí po podání rh.F’THCl-34) králíkům

Exper i metá1η í pos tupý

Intaktní samičky novozélandských bílých králíků CHRP lne. Denver,Pa), jednoho z nejmenších zvířat vytvářejících stavební jednotky kostí intrakortikální přestavbou kostí, starých přibližně 9 měsíců, o hmotnosti 3,25 až 3,75 kg, byly rozděleny podle střední tělesné hmotností do tří skupin po 6 zvířatech Dvě experimentální skupiny dostávaly biosyntetický PTHC1-34) v dávkách 10 nebo 40 pg/ml/kg/den. Kontrolní skupina dostávala 1,0 ml/kg/den okyselené 0,9M solanky obsahující 2 % teplem Inaktivaného králičího séra. PTHC1-34) nebo nosič byly injektovány jednou denně subkutánní injekcí každý pátý den v týdnu po dobu 140 dní. Králíci měli po libosti laboratorní králičí píci obsahující 0,5 % vápníku a 0,41 % fosforu a vodu.

Výběr dávek se zakládal na předběžných studiích ukazujících Cl), že po jediné injekci PTHC1-34) při 100 pg/kg se zvýšil obsah vápníku v séru a poklesl zpět na základní úroveň po 24 hodinách, zatímco jedinou dávkou 50 pg/kg se obsah vápníku v séru vrátil na základní úroveň po 24 hodinách, C2) opakované injekce 20 pg/kg PTHC1-34) vedly k přechodnému zvýšení vápníku v séru s návratem na základní úroveň během 6 až 24 hodin a (3) PTHÍ1-34) při < 5 pg/kg nezměnil histomorf ometrí i povrchu kostí.

Před usmrcením byla podána dvojitá dávka alizarinu i.m. (Sigma, St.Louis) při 20 mg/kg 55. a &3. dne a sada dvojitých kalceinových dávek s.c. (Sigma, St.Louis) při 5 mg/kg 15. a 7. dne. Králíci byli uspáni oxidem uhličitým ve statistickém pořadí, přibližně 3 až 6 hodin po poslední injekci k získání krve srdeční punkci a pak byli zabiti pentobarbibálem sodným (100 mg/kg), injektovaným i.p. Vyjmu1a se pravá pažní kost, obě stehenní kosti, lumbární obratle (L3-L5) a pravé kosti ho1enni.

K r e v n i c h em i e

Vicekanálovou sérovou analýzou se měřily obsahy vápníku, fosforu, alkalické fosfatázy, kreatininu a dusíku v moci.

H i s t om o r f oro e t r i e

Histomorfometrická měření se prováděla na kortikální kosti osového dříku holeně a na houbovité kosti L3. Po usmrcení byly tyto kosti odebrány každému zvířeti a fixovány v 10% neutrálním pufrovaném formalinu po dobu 24 hodin. Tkáně byly dehydrovány v odstupňované sérii alkoholů (70 až 100%, 2 změny na stupeň vždy po 4 hodinách ve vakuu). Získané vzorky se umísbily do xylenu a infiltrovaly methylmethakrylátem ve vakuu 138 kPa na 2 hodiny na stupeň při 24 infiltračním plánu v automatickém procesoru Shandon Hypercenter (Shandon Lipshaw, Pittsburgh, PA). Vzorky byly uloženy do 2% DDK plastu se 0,2 % iniciátoru (Delavare Diamond Knives, Wilmington, DE). Diamantovou drátěnou pilou byly vyříznuty řezy z holenní kosti po 80 pm (Delavare Diamond Knives, lne., DE) a zbarveny Goldnerovým trichromém. Nezbarvené řezy, tlusté přibližně 80 pm, byly při20

4 4 4

praveny pro dynamickou histomorfometrix fluorchromových štítků. Sagittální řezy L3 byly rozřezány na mikrotomu ReichertJung 2050 CMagee Scientific lne., Dexter, MI) po 5 μω a zbarveny McNelovým tetrachromem, nebo ponechány nezbarvené pro dy~ nam íčko u hi s tomorf ometr i i.

Histomorfometrie se prováděla při zvětšení 150x Nikon fluorescenčním mikroskopem COptiphot, Nikon, Tokyo, Japonsko) a semiautomatickým digitalizačním systémem CBioquant IV, R&M Biometrics, Nashville, TN). Tvorba kostí a resorpce v períosteálním, endokortikálním a intrakortikálním obalu se měřily v celém průřezu mid-diafysealových řezů holeně. Měření houbovité kosti se prováděla na ploše 6 mm² uprostřed lumbárního obratle, 0,5 mm od okraje obklopujícího kortikální obal. Názvosloví je podle ASBMR Committee on histomorphometric nomenclature CParfitt AM, Drezner MK, Florieux FH, Kanis JAMalluche H, Meunier PJ, Ott SM, Recker RR 1987 “Bone histomorphometry- standardization of nomenclature, symbols and units. Report ASBMR Hisoraorphometry Nomenclature Committee J. Bone Miner. Res. 2, str. 595 až 610). Dynamické parametery byly měřeny na základě kalceinového štítku.

Měření kostní hmoty

Osový dřík stehenní kosti a čtyři lumbární obratle v roztoku 50 % ethanol/50 % solanka se snímaly na řezu kvantifikovanou počítačovou tomografií CQCT nebo pQCT) za použití 960A pQCT a analyzovaly se pomocí Dichto software verš ion 5.1 CNorland/Stratec, Ft, Atkinson, VI). Parametry plné tkáně byly měřeny včetně objemové kostní hustoty minerálů CvBMD, mg/cm³), plochy řezu (X-area, mm²) a obsahu minerálů (BMC, mg), pomocí voxel rozměrů 148x148x1200 μη. Objem lze vypočítat násobením plochy X tloušťkou plátku 1,2 mm. Pomocí periferální duální energetické absorpciometrie CpDEXA, Nor1and/Stratec) se snímal celý kyčelní krček vyoperovaného stehna v lázni 50 % ethanolu/ *4 · · * · • * * * · · · 4 • · · 4 t · * 9 4 · 4 4 * 4 4*9

4*4 4*4 44 44 % solanky. F’o snímacích krocích 0,5x1,0 mm s prahem 0,04 se měřila zdánlivá hustota kostních minerálů (aBMD, g/cm²), projekční plocha (cm²) a obsah kostních minerálů (BMC, g).

Biomechanické zkoušky

Mechanické vlastnosti kostí se měřily na osovém dříku pravé stehenní kosti a tělísku L5. Kosti se vyřízly, zbavily spojovacích tkání, zavinuly se do gázy nasáklé isotonickou soo laňkou a zmrazily se na -20 C až do dne zkoušky. Před zkouškou se vzorky nechaly roztát 1 až 2 hodiny za teploty nístnosti. Všechny vzorky se zkoušely až do poruchy v cirkulující vodné lázni o teplotě 37 C pomocí zkušebního stroje (MTS Corp., Minneapolis, MN). Křivky závislosti deformace na zatížení se zaznamenávaly vynášecím systémem HF’ 7090A CHewlet Packard, Camas, VA). Největší síla (maximální síla, kterou vzorek vydrží), tuhost (sklon lineární závislosti na křivce zatíženídeformace) a práce do poruchy (plocha pod křivkou zatížení-deformace před porušením) se měřily Číslicovým systémem (Jandel Scientific, Corte Maděra, CA). Tyto parametry jsou strukturálními vlastnostmi, které závisejí na vnitřních vlastnostech materiálu a na geometrii (Turner CH, Burr DE! Basic biomechanical measurements of bone: a tutoriál Bone 14, str.595 až 608, 1993). Hodnoty se normovaly k získání vnitřních materiálových vlastností, jako je pevnost (maximální napětí, které vzorek vydrží), modul pružnosti (vnitřní tuhost materiálu) a houževnatost (odolnost průřezu do lomu na jednotku objemu), které jsou nezávislé na velikosti a tvaru.

Pevnost stehenní kosti se měří tříbodovým ohybem. Kost se vloží do přípravku se zadní stranou směřující k zatěžovacímu trnu. Zatížení se aplikuje uprostřed mezi podporami vzdálenými 54 mm od sebe. Zatížení se aplikuje rychlostí 1 mm/s až do vzniku lomu. K normování údajů, získaných z křivky zatíženídeformace, se vypočte pevnost v ohybu podle vzorce

ft ft ·

Oi = FuLr/8I (1), kde σι je pevnost v ohybu, Fu je maximální síla do lomu, L je délka mezi podporami, r je poloměr ve směru zepředu-dozadu a I je moment setrvačnosti Id. Hodnota momentu setrvačnosti se vypočte za předpokladu eliptického průřezu stehenní kosti.

Průměrná kortikální tlouštka se vypočte z naměřených tlouštěk ve všech čtyřech kvadrantech průřezu stehenní kosti párem digitálních měřidel na 0,01 mm s přesností 0,005 mm (Mitutoyo, Japonsko).

Modul pružnosti stehenní kosti (Ef) se vypočte z rovnice

Ef = (tuhost)^(L³/481) (2),

Houževnatost stehenn í	kostí	(houževnatostí) se	vypočte;
rovnice
houževnatostí = 3*	(práce	do poruchy)’* r3 /LI	(3) ,
K mechanickým zkouškám	pátého	1umbárního obrat1e	(L5) se

pomocí Buehlerovy Isomet pomaluběžné pily (Buehler LTD, Evanston, IL) odkrojí rovnoběžně obě koncové ploténky tělesa obratle. Po resekcl posteriorních procesů se změří mechanická pevnost L5 v tlaku. Stlačovací síla se aplikuje v rázové kontrole, s rychlostí křižáku 1 m/s pomocí otočných desek k vyrovnání nerovnoběžnosti čel tělesa obratle. K normování získaných údajů z křivky závislosti zatížení-deformace a k vyhodnocení vnitřních materiálových vlastností, které jsou nezávislé na geometrii kosti, se maximální napětí vypočte jako maximální síla dělená plochou průřezu.

Plocha průřezu (CSA) se vypočte jako

CSA -Tiab/4 • · kde a a b jsou šířky ve směru zepředu dozadu a napříč). Modul pružnosti obratle CEv) se vypočte jako

Ev = Ctuhost)/CCSA/h

C5) kde? h je kranlo-kaudální výška tělesa obratle.

Houževnatost obratle Chouževnatostv) se vypočte jako houževnatostv = (práce do poruchy J/CCSA⁵* h) (6)

Akustická mikroskopie

Pomocí diamantové drátěné pily se vyříznou 500 μια tlusté řezy ze střední části pravé kosti pažní. Přesná tlouštka každého vzorku se změří mikrometrem CMitutoyo, Japonsko) s rozlišením 1 pm. Měření rychlosti zvuku se provedou pomocí řádkováčího akustického mikroskopu CUH3, Olympus, Japonsko) způsobem, který popsali Hasekava K, Turner CH, Recker RR, Wu E, Burr DB (Elastic properties of osteoporotic bone measured by scanning acoustic microscopy Bone 16, str. 85 až 90, 1995). Tímto způsobem se dají měřit podrobné vnitřní mechanické vlastnosti ve zvoleném ohnisku. K vytváření akustického vlnění způsobem puls-echo se použije 50 MHz měniče (V-390, Panametrics, Waltham, MA). Čočky 50MHz vytvářejí akustický paprsek o průměru přibližně 60 pm. Vzorky se upevní ke dnu komůrky vyplněné voo dou s konstantní teplotou C22 C). Prodleva mezi akusitickými vlnami, odraženými od vršku vzorků a od jejich spodku, se měří digitálním osciloskopem CTDS 620, Tekronix, Beaverton, 0R). Prodlevy se měří v pěti různých místech tak, že každé- místo je od druhého vzdáleno více než 300 pm ve vnější kůře kosti pažní. Rychlost zvuku se vypočte pro dvojnásobek tloušťky vzorků dělený průměrným trváním prodlevy. Měří se hmotnost CWw) ve vlhkém stavu a ponořená hmotnost (Ws) v ethylakoholu pomocí váhy CAJ100, Mettler Instrument Corp., Heightstown,

- 24 ······ · · * · ··

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 999 9 9 99

NJ). Hustota <ro) ve vlhkém stavu se vypočte podle Archimedova zákona ro = <Ww/CWv-Ws)>~roETOH C7), kde roETOH je hustota alkoholu <0,789 g/cm³). Za předpokladu, že dráha akustické vlny v kosti je homogenní, vypočte se součinitel pružnosti CC) reprezentující vnitřní tuhost vzorků

C = rov² < 8)„ kde ro je hustota ue vlhkém stavu a v je rychlost zvuku.

Statist i c ká analýza

Ke zjištění homogenity variance se použije Barlettovy analýzy. Je-li variance homogenní, použije se jednocestné ANOVA s Fisherovým testem PLSD pro statistické porovnání. Není-li variance homogenní, použije se Kruskal-Val1isovy neparametrické analýzy variance se statistickou analýzou pomocí Mann-Vhitneyova II-tes tu. Statistická významnost byla připsána při p<0,05 Výsledky jsou uvedeny jako střed ± SEM.

Výsledky

Tělesná hmotnost a biochemie

Králíci, ošetřovaní nosičem. PTH< 1-34) při 10 pg/kg/den, vykázali malé přírůstky tělesné hmotnosti po 140 dnech. Králíci, kterým byl podáván PTH<1-34) při 40 pg/kg/den, vykázali malý úbytek tělesné hmotnosti 51 g, což představuje 1,4 ± ztrátu tělesné hmotnosti během pokusu <tabulka I). Měření séra byla v normální fyziologické odezve pro králíky, ačkoli byl pozorován malý nárůst vápníku v séru a dusíku v moči. Alkalická fosfatáza v séru se zvýšila 2x při vyšší dávce • · ta ta » · · 4 » ta ta ' i ta · i » · · <

• ta · ·

PTH(l-34) (tabulka II).

Tabulka I

Účinky PTH(l-34) na tělesnou hmotnost

	Kontrola	PTHC1-34) 10 pg/kg/den	PTH(1~34) 40 ng/kg/den
počáteční tělesná
hmot nos t. ( kg )	3,43 ± 0,08	3,42 ± 0,08	3,42 ± 0,08
konečná tě1es ná
hmotnost (kg)	3,70 ± 0,05	3,51 ± 0,05	3,37 ± 0,10
přírůstek
hmotnost i	0,26 ± 0,09	0,09 ± 0,05	-0,05 ± 0,05~
Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr	± SEM. pro skupinu 6 králíků-
'‘pCO.OS porovnán s	kontrolou
Tabulka II - Vliv	PTHÍ1-34) na chemii séra

	Kont.ro 1 a	PTH(l-34) 10 ug/kg/den	PTH(l-34) 40 ug/kg/den
vápník (mg/dl)	12,1 ± 0,3	12,6 + 0,2	13,5 ± 0,3x
fosfát (mg/dl)	4,7 ± 0,2	4,7 + 0,2	5,5 ± 0,3
alkalická
fosfatáza (iu/i)	24,7 ± 4,1	41,0 ± 8,1	49,8 + 7,1^
kreatinin (mg/d1)	1,9 ± 0,1	1,6 ± 0,1	1,8 ± 0,1
dus í k v moč i (mg/dl)	18,3 ± 0,3	18,1 ± 0,8	23,9 ± 1,9

Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM pro skupinu 6 králíků. ^p<0,05 porovnán s kontrolou

Φ Φ φ φ φ φ φ φ · * φ * φ φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φφφφ φφφ φ φ φ φ

Η i stomorf ometr i e

Tvorba kosti na periosteálním CPs.MS/BS) a endokortikálním povrchu CEc.MS/BS) osového dříku holeně se zvětšovala u skupin ošetřených PTHC1-34). V tabulce III je vliv PTHC1-34) na periosteální a endokortlkální přestavbu kosti osového dříku holeně. Ps.MS/BS u skupiny s větší dávkou byla významně větší než u ostatních dvou skupin Cp<O,OOl) a Ec.MS/BS u skupiny s větší dávkou byla významně větší než u kontrolní skupiny Cp<0,05). Souhlasně s nárůstem alkalické fosfatázy v seru, byly rychlosti tvorby kostí na každém povrchu CPs.BFR/BS a Ec.BFR/BS) významně větší u skupiny s větší dávkou než u dvou skupin CpCO.QS). Rychlost ukládání minerálů CMAR) se neměnila jak na periosteálním tak na endokortikáloím obalu.

Intrakortikálně byl počet resorpčních míst CRs.M/Ct.Ar) u králíků dostávajících PTHC1-34) v dávce 40 pg/kg/den významně větší než 7-násobně ve srovnání s ostatními dvěma skupinami Cp<0,05). V tabulce IV je vliv PTHC1-34) na intrakortikalní přestavba kosti osového dříku holeně. Počet štítkovaných ostnů CL.On.N/Ct.Ar) u králíků dostávajících PTHCl-34> při 40 pg/ kg/den byl také podstatně zvětšen ve srovnání s ostatními dvěma skupinami Cp<0,01 vůči kontrolní skupině, p<0,05 vůči 10 ng/kg/den). MAR byla významně větší u obou ošetřovaných skupin než u kontrolní skupiny Cp<0,01), avšak nebyl významný rozdíl mezi skupinami ošetřovanými PTH. Rychlost tvorby kostí CBFR/ BV) a aktivační frekvence CAc.F) vzrostla Cp<0,05 a p<0,01) u obou dávek.

Ačkoli se plocha kostí CB.Ar) zvětšila u obou dávek, významný rozdíl byl zjištěn pouze mezi skupinou s vyšší dávkou a kontrolní skupinou Cp<0,01). Plocha kostní dřeně CMa.Ar) po ošetření klesla, nelišila se však významně mezi třemi skupinami. Kortikální plocha CCt.Ar) u skupiny s větší dávkou byla významně větší než u ostatních dvou skupin Cp<0,0001 vůči kontrolní skupině, p<0,05 vůči skupině s nižší dávkou). Ct.Ar u skupiny s nižší dávkou byla rovněž významně vyšší než kontrolní (p<0,05). Podobné výsledky byly zjištěny v procentech Ct.Ar

Koř11 ká 1 n i porozi ta (Ct.Po) u krá 1 í ků, dostává j ic ich PTHC1-34) v dávce 10 jug/kg/den byla dvojnásobná než u kontrolní skupiny (p<0,05), zatímco Ct.Po u králíků dostávajích PTHC1-34) v dávce 40 jag/kg/den byla 6x větší než u kontrolní skupiny Cp<0,01). Porozity jsou však uvnitř endokortikálního oddílu a uvnitř této lokace není pravděpodobné, že by přispívaly k bionechanické pevnosti, jelikož PTH také zvýšil plochu kortíkální kosti, souhlasně s nárůstem momentu setrvačnosti průřezu.

V tabulce III, IV a V jsou hodnoty vyjadřovány jako středy ± SEM skupiny šesti králíků. χρ<0,05 ve srovnání s kontrolou.

p<0,05 ve srovnání s PTHC1-34) v dávce 10 pg/kg/den

Tt

C

Φ

Ό ~š)

X

Η

Cu

O

Tf

-H

CN θ'

CN

Os ©

-H «Mi \ *X 00

O'

-H so

Ό «ΖΊ

O rl· 2

-H <N m

-H cn ·%

CN

CN

-H

Γ m

*

O cl·

-H

O *

CN •H

CN rxr

CN c

Φ ,·ϋ .

3)

X

H (X

3.

O

IA		00	o			»·—	O
c-s	cn	o		·—*	CM	O
LJ	CsT	O-	cl·	cn'	C<T	—t o	©
ti	-H	-tí	-H	-H	Ή	•H	-H
r*	Γ-	00	Os	CN	VO	(N
*\ m	IX cn	m cl·	t- cl·	oo“·	cm cn	O ©—	m ©

o fc •P c

&

		r-	CM			CN	©
O	•^r		CM	°fc	•X	O
scT	o. CM	cl·	©~		SO	cl·	cl·
-H	ti	•tí	-ti	-H	-H	-H	-H
00		m	cn	oo	Ν’	CN	O
Λ 00	r-9	m cl·	cn ’-χ	fX cn	so' CN	© cl·	Ν’ O*

cS

Ί<

>

>s •P <0 fc

N

C i

OO CQ	ř-*	u X s»x	=t
oo	ί-	Oeí	eS
O	ο
ó	ó PQ	s V3	2 ó
		&-	ω

CQ co tn

Cfc

CQ

00 CQ e2	u J>x IN* c* Γ“	oo §	u. fN z
ti.	2.	li.	Ji
A	*n r*	CQ	r·
tň	ř—	ó	#-«
Cl,	3.	ω	s_

t, <u a

&

•fc·

O éG >

O O «*» fc ^& g & O »·« t—i c

Λί r-<

§

Η λ

fc *>

Φ β

«0 fc (fc x:

o ►s ία»

o.

- s.

>x

Xk

ΙΟ

O

Ό fi

O>

>x

-o

JL o

<S.

-Λ?

ΡΤΗ(1-34) PTH0-34) c

φ .Ό *

\ο m

* τΤ ο» ο_ (0 os.

ο

Τ

C

Φ¹

-Ό ~οο ο

Λ *3 (0 $4 *

Ν

-Ή

Γ

C* ο

ο •υ

Ό

ΓΝ θ'

ΓΓΝ ο

4)

Ό «η

* ΓΝ	* 00	*» * ν>	# r-»		«** * ο	* ΜΗ
“T- ο Ή	ΓΗ~* -Η	cT -Η	οΓ -Η	•Η t-~.	ΓΝ -Η	«Ν 4)
ο Ό	•-S	00 ~JS	00 Ο	θ'	ίο	Ό S
·>.	CS	ΓΗ	m		ΓΝ

τΓ Ο ο θ'	Ό Ο ο * ο
-Η	-Μ
m
	ΓΝ
ο	Ο
cA	ο

ο

ΡΊ #· ο -Η ΓΝ ΤΤ v?

* «*>

wrf o“

Ό

Ό #

Cs γν

-Η «Λ

00~

-Η ν>

-Η m

«*?

-Η σ\ * * CN Ο

-Η -Η η γν —7 τΡ ΓΝ Ό

ΓΠ	ο
Ο	ο ο	ο ιη	Ο ΓΝ	m	ο	ΓΗ «\ ·	Γ** -Λ·^	ο	ΜΗ
θ'	ο	θ'	ch	ch	*>		cP	θ'
-Η	-Η	-Η	-Η	4)		-Η	-Η	41	Ή
Ν’		ΓΝ	σ\	‘Ω.	00	«·».	r- •χ	Ν’	X
»—«		Ο	W—	'ί		σ\	r\p	Ό	κο
ο	ο «V		•χ	Sv)		ΓΝ			ΜΗ

Ο Ο ζ

!Λ &

ε %

<ζ ο

Ž c

Ο

	'S Cj	U? .>>	£	/**s	<N	π
1	Ό --3	θ'*	<Ν £	~ε	E	r“ c
i	£		r*			£
	ti 3.	>	-ε	c	O* t«
X Η	ο4		% <✓	5	<	X— <
ό	< Μ		U, Ó	«	CÚ s	0
	2	CQ	<

υ

··· · ηm c

φ ,Ό

X

Η

α.

χ

S.

ο

Μ-

							«*-»			*
<n <*? 41 0\	co“ -tí	* S' -H	m <=r -H	# 00 ro' tí	* 41	rN O 4Í	r- o •tí	c> Ή	4ř «η •tí	V5 vo tí
r-^	Ό			r--_		-s.	o		CN	O
CN	CN	CN		r--~	V-}		φ·	*aM	-e'	rf
	*•»4		CN	**		cf		CN	V>

Ε , Φ ~οο , «*

X

Η

CL

ΟΟ =t

•Φ·	«. «Ν'	ro	ro	(N		m	ro C)		CA	O\
ro	“	θ'	θ'	*x	o		<n O	•X o	•N	00
-H	tí	-tí	•tí	tí	-H	41	-H	-H	•tí	4i
VO		•Φ-	CA	CN	ro	ΓΊ	ro	vo	φ·	KO r.
o ro	r- •Φ-		θ'	lf'	»x T—X	tr?*	θ'	•s.	rf'	00 m

fa υ>

C w

X

Λ *3 φ

fa

Α5

Ν

-Η 'Ώ,

ΓCN

ΓΟ

Γ“' •Η ττ

CN

ro	CN	ro	Ό		CN O	CN	Tf	co ·»
0'	θ'	s	θ'	cT	θ'	o'	*x
•tí	H	-tí	-Η	4	-H	-H	-tí	-H
vo	φ-	CN	Ό	CN	O	ro	-φ-	r-~ s
Κ» o	ó	1*5'		~»x ir>	Zr·			CA

ε =t

Sm·*

J=!

Η χ

Η θ'**«✓

C0 es

W

X

ΟΟ ό

Ο

Ο οο χ

Ο >

£ >

Ο

Ό ε

=L βί <

''ν ο^χ c?5 ε

=L g

=t

OQ

X cž to

X (0

Μ

Λ

Φ

Η χ

fa *3

Φ β

Φ fa $

Μ

Αί

Φ •η

X) ο

Z3		3		3
xn		•P		*3
3	X	tn		tn
0	ϋ	φ	3	φ
r-í	fa	r-H	Ό	r*
	>	Xí	•M	X
	0	0	0	0
>4	A	Φ	Φ	Φ
c			*3	<*5

Μ

Φ

X)

Φ fa *>

X W C ο φ ~ > X ο

Ό fa fa >

φ (λ η

ο χ

υ fa >

ο (X

X ϋ

fa >

ο λ

XJ •r<

φ

Ρ η

ο φ

χ

V χη •ΰ •Μ φ

*>

η ο

β φ

Ί—ι

X ο

j =<

o

Sx o w í- o

I ~ ts ·** o •e *··· • 0 · ·· · · ·*·* 9 9 9 9 · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 999 999 99 99

II houbovité kosti většina stavebních parametrů COS/BS, Ob.S/BS, OV/TV a MS/BS) s ošetřováním PTHCl-34) vzrůstá. V tabulce V je vliv PTHC1-34) na přestavbu houbovité kosti třetího lumbárního obratle. U králíků dostávajících PTHC1-34) v dávce 40 pg/kg/den jsou tyto hodnoty podstatně vyšší než u ostatních dvou skupin (p<0,01 vůči kontrolní skupině a skupině s 10 pg/ kg/den ve? všech parametrech). Rychlost tvorby kostí CBFR/BS) také významně vzrůstá u králíků dostávajících PTHC1-34) v dávce 40 pg/kg/den ve srovnání s ostatními dvěma skupinami Cp< 0,0001 vůči kontrolní skupině a skupině s 10 pg/kg/den). Ačkoli resorpce CES/BS a Oc-S/BS) rostla u obou skupin, ošetřovaných PTHC1-34), pouze erodovaný povrch CES/BS) byl u skupiny s vyšší dávkou významně větší než u kontrolní skupiny Cp<0,001) Mezí třemi skupinami nebyl rozdíl v tlouštce osteoidu CO.Th). Přespatrnou zrychlenou přeměnu kosti se po ošetřování PTHC1-34) frakcionální objem kosti CBV/TV) neměnil. U žádné skupiny nebyla patrná tunelová resorpce a peritrabekulární fibróza.

Měřen i hmotn os t i kos t í vBMD a BMC v osovém dříku stehenní kosti, hodnocené pQCT u skupiny se 40 pg/kg/den, byly významně vyšší než u ostatních dvou skupin Cp<0,001 u vBMD a pCO.OOOl u BMC vůči kontrolní skupině, p<0,05 u vBMD a p<0,01 u BMC vůči skupině s nižší dávkou) Cobr.lA). vBMD a BMC u skupiny s 10 pg/kg/den byly rovněž významně vyšší než u kontrolní skupiny Cp<0,05 u vBMD i BMC). Ačkoli plocha osového dříku stehenní kosti také vzrůstala v závislosti na dávce, významně vzrostla pouze u skupiny se 40 pg/kg/den Cp<0,05).

V závislosti na dávce vzrůstala aBMD a BMC v proximální stehenní kosti měřeno rtg. absorpciometrií CDXA nebo pDXA). Významné rozdíly byly jak u aE5MD, tak BMC mezi kontrolní skupinou a skupinou s 1.0 pg/kg/den Cp<0,05) stejně jako mezi kontrolní skupinou a skupinou se 40 pg/kg/den <p<0,001) Cobr.lB).

·· ·· * · * • · · • · · • · · ·· ··

V ploše kostí nebyly shledány u tří skupin významné rozdíly.

Celkově ukazuje obr. 1, že BMD (bone minerál density «hustota minerálů v kosti) a BMC Chcine minerál content « obsah minerálů v kosti) v ose dříku stehna (kortikální kosti) (A) a v proximální stehenní kosti (houbovitá kost + kortikální kost) (Ei) byly významně větší u zvířat ošetřených PTH než u kontrol při obou dávkách. Plocha kortikální kosti u osy dříku stehna při vyšší dávce je významně větší než u kontrol. V ploše proximální stehenní kosti nebyly mezi skupinami shledány významné rozdíly. Údaje jsou vyjádřeny jako průměry ± SEM. xP<G,05 ve srovnání s kontrolou,⁺p<0,05 ve srovnání s PTH 10 pg/kg/den.

Mezi třemi skupinami nebyl významný rozdíl ve vBMD, BMC nebo v ploše kosti lumbárního obratle CL4) hodnoceno pQCT.

Ei i omechan i. cké zkoušky

Strukturální vlastnosti osy dříku stehenní kosti, jako je maximální síla do lomu, tuhost a práce do lomu vzrůstaly v závislosti na dávce (obr.2). Obr. 2 ukazuje účinek PTH na mechanickou pevnost a moment setrvačnosti průřezu (CSM1) v kortikální kosti stehenního osového dříku. Strukturní mechanické vlastnosti (prázdé sloupce) a CSMI rostou významně u skupiny s vyšší dávkou, zatímco tuhost rostla významně u skupiny s nižší dávkou. Z vlastních materiálových vlastností (šrafované sloupce), rostl významně pouze modul pružnosti u skupiny s nižší dávkou v porovnání s kontrolní skupinou. Modul pružnosti u skupiny s vyšší dávkou významně poklesl ve srovnání se skupinou s nižší dávkou. Na obr. 2 jsou hodnoty vyjádřeny jako průměry ± SEM, χ znamená P<0,05 ve srovnání s kontrolní skupinou a ⁺ znamená P<0,05 ve srovnání s dávkou 10 pg/kg/den.

V této studii a ve výsledcích uvedených na obr. 2 jvou všechny parametry významně vyšší u králíků ošetřovaných ····

00

PTHÍ1-34) v dávce 40 pg/kg/den než u kontrolní skupiny (p<0,01 pro maximální sílu do lomu a práci do lomu, p<0,05 pro tuhost). Tuhost u skupiny s nižší dávkou je rovněž významně vyšší než u kontrolní skupiny (p<0,05). Pokud jde o vnitřní materiálové vlastnosti, je modul pružnosti významně nižší u králíků ošetřovaných 40 pg/kg/den než u králíků ošetřovaných 10 pg/kg/den P<0,01).

V tělese obratle nebyly shledány významné rozdíly mechanických vlastností lumbárních obratlů u žádné ze tří skupin.

Akust i cká m i kroskop i e

V rychlosti zvuku nebo v součiniteli pružnosti nebyly shledány významné rozdíly u žádné ze tří skupin.

Diskuse

Kosterní odezva kortikální kostí na biosyntetický hPTH(l~34) zahrnuje jak přímou regulaci materiálových vlastností, tak kompenzační regulaci biomechanických vlastností dlouhých kostí intaktních dospělých králičích samic. PTHC1-34) zvyšuje přeměnu kostí a kortikální porozitu a při dávce 40 pg/kg/den snižuje materiální modul pružnosti kortikální kosti. Snížený modul pružnosti však byl více než kompenzován zvýšenou apozicí kosti na perlosteálním a endokortikálním povrchu, což se projevilo zlepšením strukturní pevnosti, tuhosti a práce do poruchy kortikální kosti králíků.

V této studii s intaktními králičími samicemi se objem houbovité kosti lumbárního obratle po ošetření pTH(l-34) nezměnil, přes zřejmou zvýšenou přeměnu, kosti. Předchozí použití jako osteopenického modelu, přítomnost íntrakortikální přestavby a krátká doba přestavby - spolu s rychlým růstem králíků a brzké kosterní dospělosti (za 6 až 9 měsíců), vytvářela bázi pro selekci králíků jako modelu ve kterém se testovaly účinky přerušovaně podávaného PTHC1-34).

• 0 00 • 0 0

0 0

0 <0 • 0 0 ·0

Králíci mohou vykazovat velkou rozmanitost hladiny vápníku v séru <10-16 mg/dl), avšak tyto hladiny nejsou přímo ovlivněny množstvím dietního vápníku, což je další předností modelu. Ačkoli .byly zaznamenány přechodné významné nárůsty přibližně 1 mg/ml u králíků ošetřovaných PTHC1-34) v dávce 40 pg/kg, byly skutečné hodnoty vždy ve známém fyziologickém rozmezí .

V této studií zvýšil biosyntetický hPTHCl-34) za 140 dní růst kostí intrakortikálně jak na periosteálním tak na endokort ikálnim povrchu. Intrakortikální Ac. F vzrostl u skupiny s nižší dávkou 8-násobně a u skupiny s vyšší dávkou 20-násobně. To vedlo ke dvojnásobnému zvýšení kortikální porozity v holeni u skupiny s nižší dávkou a až 6-násobnému zvýšení u skupiny s vyšší dávkou. Data z akustické mikroskopie ukazují, ze pružnostní vlastnosti kostního materiálu samotného v pažní kosti nebyly ovlivněny, což naznačuje, že vnitřní kvalita kortikální kosti je normální- Zvýšená porosita musela tedy vznikat na úkor mírného snížení modulu pružnosti, pppřičemž měření mechanických vlastností zahrnuje prostory kortexu.

Zvýšená kortikální prožita byla však více než kompenzována významným nárůstem MS/BS a BFR/BS jak na periosteálním tak na endokortikálním povrchu v osovém dříku holeně u skupiny s vyšší dávkou, což vedlo k významně zvýšené ploše kosti. To by zvýšilo moment setrvačností průřezu, který je úměrný tuhosti kosti v ohybu, jak tomu bylo u osového dříku stehenní kosti (obr. 2). Důsledkem těchto změn tvaru a materiálových vlastnosti bylo zlepšení mechanické pevnosti a tuhosti stehenní diafyzy ve srovnání s kontrolou, což překrývá potenciální škodlivé mechanické účinky zvýšené kortikální porozity.

• to ···« ·· to • · to·· • to to · • · to to • · · to • ·· <

• to· · • to ··

Závěr

Konstatuje se, že nárůst přeměny kosti a kortikální porozíty po ošetření PTHC1-34), je doprovázeno souběžným nárůstem kostí na periosteálním a endokortíkalním povrchu. Výsledkem kombinace tohoto jevu je zlepšení houževnatosti, pevnosti a tuhosti a práce do poruchy stehnní kosti.

Příklad 2

Zvýšení pevnosti a hustoty kosti po podávání rhPTHCl-34) op i cím

Experimentá 1 η.í postup

Všobecně

V této části studie bylo použito volně žijících dospělých (s uzavřenými růstovými destičkami) primátů cynomolgus (Macaca fascicularis), vážících 2,77 ± 0,03 kg (střed ± směrodatná odchylka průměru [SEM]). Opice byly tři měsíce drženy v karanténě a pak se u nich začalo s dietou obsahující 0,3 % vápníku, 0,3 % fosfátu a 250 IU vitaminu D3/100 g s podáváním fluorované vody Cl ppm fluoridu) podle libosti. Obsah vápníku odpovídal 1734 mg vápníku/8373,6 J. Po jednoměsíční dietě byla zvířata rozdělena do skupin po 21 nebo 22, simulované operována sham nebo zbavena vaječníků. Jednou denně byly zahájeny subkutánní injekce nosiče (simulované operace a kontroly s odjmutými vaječníky OVX) nebo rhPTH(l-34) v dávce 1 pg/kg CPTH1) nebo 5 pg/kg CPTH5), 24 hodin po odnětí vaječníků. Zvířata byla ošetřována buď 18 měsíců (PTH1 a PTH5), nebo 1.2 měsíců, po nichž následovalo vysazení léčby (PTH1-W a PTH5-W).

Studované skupiny byly rozděleny jak uvedeno v tabulce VI.

• · · ·

Tabulka VI

Stuované skupiny studie primátů

Skup i na.	Zkratka	Op i c e na začátku <n=128)	Opice v konečné analýze Cn—121
zdánlivě zbavené vaječníků, . 18 měsíců nosiče	sham	21	21
zbaven é vajec n í k ů, 18 nes í ců nos i če	ovx	22	20
zbavené va j eční ků, 18 měsíců 1 pg rhPTHC1-34)/kg/den	PTH1	21	19
zbavené vaječn íků, 12 měsíců 1 pg rhPTHC1-34)/kg/den	PTH1-W	21	20
6 měs íc Q nos i če zbavené va j ečn í ků, 18 měsíců 5 pg rhPTH C1-34)/kg/den	PTH5	22	21
zbavené vaj ečn í ků, 12 měsíců 5 pg rhPTHC1-34)/kg/den	PTH5-W	21	20
6 měs í ců nos i če

Vzorky séra a moči se odebíraly 24 hodin po injekci nosiče nebo rhPTHCl-34) ve tříměsíčních intervalech- Vzorek pěti opic v každé skupině ošetřované rhPTHCl-34) byl použit pro farmakokínetiku se vzorkováním (pokaždé 0 až 220 minut) jako základny, 7, 11 a 17 měsíců. V čase 0 a v šestiměsíčních intervalech se posuzovala kostra a osten kostní hmoty (L-2-až L-4) dvojitou rentgenovou afasorpciometrií CDXA); periferální • · · · « 0 kvantitativní počítačové rentgenové tomografie <pQCT> se použilo k posouzení kostní hmoty v osovém dříku a v distálním poloměrech a v proximální holeni. Biopsie kyčle byla prováděna pro histomorfometrii po 6a 15 měsících. Všechna zvířata byla bezbolestně usmrcena po 18 měsících.

Biomechanické zkoušky se prováděly na lumbárních obrátíech L-3 a L-4, na kyčelním krčku, na osovém dříku pažní kosti a na vzorcích kortikální kosti obrobené z diafyzy stehenní kosti (rozměry uvedeny v tabulce VII). Běžná statická a dynamická hístomorfometrie se prováděla (rozměry uvedeny v tabulce XI) na osovém dříku pažní kosti, na lumbárním obratli L-2, na kyčelním krču, na osovém dříku stehenní kosti, na poloměru osového dříku a na distálním poloměru. Počáteční statistické analýzy porovnávaly všechny skupiny s kontrolami zbavenými vaječní kfi a zpracovanými nosičem. Údaje jsou vhodné pro dodatečné výzkumné analýzy ke zkoumání závislosti na droze, účinků vysazení, interakcí mezi počátky a změnami v čase způsoby známými pracovníkům v oboru. Všechny studie se prováděly a hodnotily způsoby známými v oboru.

U některých experimentálních jedinců byla kortikální pažní kost zkoumána histomorfometrii a infračervenou mikroskopií s polarizovanou Fourierovou transformací. Infračervená mikroskopie s polarizovanou Fourierovou transformací se prováděla adaptací známých metod pro takovou mikroskopii.

Studie modelování 3D konečnými prvky

Tyto studie určily modelovací data pomocí 3D konečných prvků na obrat!ech pokusných opic s dávkováním PTH po dobu 18 měsíců. Excisí získané obratle L-5 v roztoku 50 ethanolu/50 % solanky z vajeČníků zbavených (n=7) a PTH (n=7) skupin se sériově snímaly po 500 μπι krocích kvantitativní počítačovou tomografií (QCT, Norland, Ft.Atkinson,WI) pomocí 70x70 μη pi-

• · · 3 • * » · • · · · • « · · xelů. Každý z 500 pm řezů byl analyzován na objemovou hustotu minerálů v kosti (BMD, mg/cc), na obsah minerálů v kosti (BMC, mg), na plochu průřezu (plochu X), na objem houbovité kosti (BV/TV), na trabekulární tlouštku (Tb,Th) a na pojivovou tkáň (hustotu uzlin, analýza podpory). Pixely v každém sériovém obrazci se zprůměrovaly na vytvoření voxelů 490x490x500 pm. Sériové obrazce se pak nawrstvily a pro každou kost se vytvořila trojúhelníková povrchová síť pomocí algoritmu kráčejících krychlí (například Lorensen a Clíne Marchlng cubes a high resolution 3D surface construction algorithm Computer Graphics 21, str. 163 až 169, 1987). Nejhladší verze každé povrchové sítě byla pak použita k vytvoření tetrahedrální sítě pro 3D modelování konečnými prvky.

Modul pružnosti pro každý elementární čtyřstěn byl odvozen z původních hustot voxelů a materiálové vlastnosti ze svazku kortikální kosti odfrázované ze střední části stehenní kosti opic. Každá tetrahedrální sít se pootočila tak, že spodní povrch každého obratle koincidoval s rovinou. Lineární analýza pružných napětí se pak provedla na každém modelu L-5, ve kterém bylo aplikováno zatížení 100 H na horní povrch středu kolmo k základové rovině, přičemž spodní povrch byl ve směru zatěžování upevněn. Vyhodnotily se výsledné obrysy osového napětí a rozdělení BMD a porovnány mezi PTH a zbavenými vaječníků. Při tomto rozlišení závisí hustota každého voxelů na rozsahu, ve kterém je každý voxel naplněn kostí oproti měkké tkáni .

Výs1edky

• ·· ·

Vyšetření séra a moči

Hladiny estradiolu v séru ve 3. a 18. měsíci byly pod 5 pg/ml u všech opic zbavených vaječníků. Když se porovnala homeostasa vápníku se simulovanými kontrolami, měly kontroly zbavené vaječníků nižší hladiny vápníku a fosfátu, a 1,25 dihydroxyvitaminu D, avšak nelišily se endogenním PTH, cyklickým adenosinnonofosfátem (cAMP) v moči, vápníkem v moči, kreatininem v moči nebo močovým dusíku v séru, měřenými 24 hodin po poslední injekci. Zvířata, ošetřená rh(PTH(1-34), měla nižší fosfát v séru, nižší endogenní PTH a vyšší 1,25 dihydroxyvitamin D a cAMP v moči ve srovnání s jedinci zbavenými vaječníků. Zkoušky markéru sérové tvorby kostí ukázaly, že opice zbavené vaječníků měly nízký celkový obsah alkalické fosfatázy v séru (ALP) a osteokalcinu ve srovnání se simulovanými a rhPTH(l-34) uchované hladiny vedly zpět k simulovaným hodnotám. Exkret močového C-telopeptidu (CrossLaps), použitý jako biochemický markér resorpce kostí, se rhPTH(l-34) nezměnil ve srovnání s kontrolami zbavenými vaječníků.

Hmotnost kostí

Vlivem PTHC1-34) se významně zvětšila celková hmotnost kostry, vyjádřená jako celková BMC (obr. 3). Hustota minerálů CBMD) v kosti obratlového ostnu zůstávala stálá u kontrol zbavených vaječníků po 18 měsíců, zatímco simulované kontroly dosáhly přibližně 5 % nad základnou (obr. 4A-4C a 5A). Hormon rhPTH(l-34) zvýšil HMD ostnu o 7 až 14 % a obsah minerálů v celém těle (BMC, obr. 3) až o 6 % ve srovnání se základnou (obr. 4A-4C a 5A). Zvýšil se také obsah minerálů v kosti ostnu (obr. 5A). U primátů, ošetřovaných rhPTH(l~34), byla velikost těchto nárůstů významně vyšší než u kontrol zbavených va j ečn í ků a dos áh1a (PTH1) nebo překračova1a (PTH5) hodnotu simulovaných kontrol. Hormon rh(PTH(.1-34) nezměnil. BMB osového dříku nebo distálního poloměru. Plocha průřezu osového dříku • · 44*«

44* 4 4 4444

444 4 4 44444 4

44» 4 4 4444

4· · 4*4 «44 *4 4* se zvýšila u skupiny PTH5 o 7 %. V proximální holeni nedošlo ke zvýšení prochy průřezu, avšak rh(PTH(1-34) zvětšil BMC a BMI) ve srovnání s kontrolami zbavenými válečníků. Set měsíců po ošetřování se ošetřování vysadilo, BMD a BMC ve hrotu a v kyčelním krcku zůstaly vyšší než u kontrol zbavených vaječníků beze změny v kortikálním osovém dříku kostí pažní.

Pevnost kost í

Hormon rh(PTH(1-34) zvýšil pevnost (Fy) v obrátíech o 43 % (tabulky VII a VIII, obr. 5B). Hormon rh(PTH(l-34) zvýšil pevnost (fu) v kyčelním krču až o 12 % (tabulky VII a IX, obr. 6A). rh(PTH(1-34) nezměnil rozměry kortikální diafýzy osového dříku pažní kosti (tabulky VII a X), nebo materiálové vlastnosti trámcových vzorků vyrobených ze střední části stehenní kostí (tabulky VII a IX, obr. 6B) ve srovnání s kontrolami zbavenými vaječniků. U zvířat, ošetřovaných rh(PTH(l-34) 12 měsíců s vysazením léčby na 6 mšsíců, zůstaly hodnoty pevnosti kostí významně vyšší než u kontrol zbavených vaječniků (tabulky VII. až X, obr. 5B a 6A) Tabulka VII

Proměnné veličiny z třetího a čtvrtého lumbárního obratle (L-3 a L-4), střední části pažní kosti, proximálního kyčelního krčku a ze vzorků stehenního trámce

Proměnná	vel ičina	Jednotky	Popis
Lumbátn x	obratle L-3 a L-4
	A	mm2	plocha průřezu
	Fu	M	síla na mezi kluzu je síla při deformaci 0,2¾

• · »· · · ♦ « • · · · · • · · ·· · • · · · · »· · · o « · • · · · · · • · · r · · • · · » • · · «

s		N/mm	sklon lineární části křivky síla-deformace (tuhost)
(3^		MPa	mez kluzu
E		MPa	modul pružnosti
Střední část kosti	pažn í ....
t.		mm	průměrná kart i kálni
Fu		N	maxi málni síla, kterou
			vzorek snese
S		N/mm	sklon lineární části
			kř i vky síla-deformace
			(tuhost)
mJ/U		N-mm	plocha pod křivkou
			zat í žen í-def ormace
			5j=práce do púoruchy
Proximální kyčel ní	krček
Fu		N	maximální síla, kterou
			vzorek snese
Diafyzlkální vzorky trámce . . .
CI^		MPa	maximální napětí
			(pevnost)
E		Gpa	modul pružnosati

• · · *

- 42 p :

• * · • 0 ·

0» 6

u	J/m3	houževnatost
F		maximální deformace

Tabulka VITI

Biomechanické hodnoty pevnosti v ostnu <lumbárních obratlů L~3 a L-4) primátů zbavených vaječníků po 18 měsících

Proměnné (jednotky)a	Sham	Kontrola	OVX PTH1	PTH1-V	PTH5	PTH5-V
ň (mm2)______	90,5±2,lb.	86,7+2,3	88,3+2,0	90,9+2,3	87,3+2,7	„82,8+2,1
FvCN)________	„1738+52	1499+94s	. 1915±105°.	1899+73°	2113+77s - °.	„1792+59°
S (H/o)	?312+319.	5805+476s	7?01±474°	7401+452°	8012±367°.	„7074+314°
oy(Mpsa)	„19,4+06	l?,3+l,0	21,9+1,3°.	21,í±0,8°	24,6+1, ls°.	„21,9+0,9°
E (Mpa)	650±32	546+49	717+48°	„659+42	759±36°	698+41°

Zkratky: OVX = zbavené vaječníků, PTH1 = rhCPTHCl-34) 1 pg/kg po 18 měsících, PTH1-W = vysazení na 6 měsíců po ošetřování rhCPTH<1-34) 1 pg/kg po dobu 12 měsíců, PTH5 = rhCFTHC1-34) 5 pg/kg po 18 měsících, PTH5-V = vysazení na 6 měsíců po ošetřování rh(PTHCl-34) 5 pg/kg po dobu 12 měsíců, ³ popis proměnných je v tabulce IV.1 ^b údaje vyjádřené jako průměr + standardní chyba střední směrodatné odchylky CSEM) pro skupinu ° statisticky významné ve srovnání s kontrolou OVX

C p<0„05) ^s statisticky významné ve srovnání se simulovanou kontrolou Cp<0,05).

• · · ta · · >. ta ta ta • ta • ta ·« ta · w « · « • ta · « ta • ta · · ta ta • · · · · • ··· ta· ·>

Tabulka IX

Biomechanické veličiny materiálových vlastností ekvivalentních velikostí vzorků trámce ze střední části stehenní kosti a biomechanické veličiny pevnosti kyčelního krčku primátů zbavených vaječníků po 18 měsících

Proměnné Cjednotky)a	Sham	Kontrola OVX	PTH1
συCMpa)	222 Rb	216 + 5	. .222 + 4
E (Gpa) ......	... 7,2 ·» 0,6 .....	16,4 ± 0,4..............	17,1 ±0,4
u C m J /m3 )___	.5,9 + 0,3	5,8 ·+· 0.4.	„6,1 ± 0,4
Eu	0,035 + 0,0Ql	0,035 ± 0,002	0,036 ± 0,002
Proximální	kyčelní krček...........
Eu______________________________________	1288 + 41..	.1.105 + 53s	1235 ± 45°„
Pokračování	tabu1ky IX
Proměnné	PTH1-W	PTH5	PTH5-V

Cjednotky)^a

ou(Mpa)	214	±	β—.	206	±	6 .. . .	208	±	6
E ( Opa ) ...........	. . ........16,6	±	0,6 .	15,4	4-	0,6®_	15,3	4··	0,6s
u (mJ/m3 ).	5,5	4-	0,4. .	5,4	4-	0,4	6,1	4-	0,4
Eu	0,034	±	0,002	0,034	4-	0,002	0,038	±	0,002
Proximální	kyč e1η í krč ek
Fu......	1258	±	52°___	-.1362	±	30°_	1213	±	42

Zkratky: OVX = zbavené vaječníků, PTH1 = rhCPTHC1-34) 1 ng/kg po 18 měsících, PTH1-V = vysazení na 6 měsíců po ošetřování rhCPTHCl-34) 1. jjg/kg po dobu 12 měsíců, PTH5 - rhCPTHCl-34) 5 ug/kg po 18 měsících, PTH5-V = vysazení na 6 měsíců po ošetřování rh(PTH(l-34) 5 pg/kg po dobu 12 měsíců,

• * »· ·· •· φ · « «» · • φ φφφ· • φ · ♦ φ · · • · · φ · φ φφφ · φ· ·« ·· ^Ά popis proměnných je v tabulce IV.1 ^b údaje vyjádřené jako průměr ± standardní chyba střední směrodatné odchylky (SEM) pro skupinu ° statisticky významné ve srovnání s kontrolou OVX (p<0,05) ® statisticky významné ve srovnání se simulovanou kontrolou (p<0,05).

Tabu1ka X

Biomechanické veličiny kortikální kosti osového dříku pažní kosti primátů zbavených vaječníků po 18 měsících

Proměnné (jednotky)®	Sham	Kontrola OVX	PTH1
t (mm)	1,74 ± 0,04b	„1,63 ± 0,03®_	„1,68 ± 0,03 „
Fu (N).	.. 725 ± 26 .	636 ± 26...................	654 + 23 .........
S (N/mm)	. . „601 ± 23.......	.520 ± 26	. 544. ± 23
U (mJ)	1797 ± 85	1542 ± 92	1641 ± 137
Pokračován í	tabulky X
Proměnné	PTH1-V	PTH5	PTH5-V
(jednotky)®
t (mm) . .	1,66 + 0,04	„1,80 ± 0,04°	1,72 ± 0.05
Fu (N)	689 + 23.	680 + 15®	707 ± 24
S (N/mm). .	573 + 20	„ . .548 ± 18	„573 ± 24
U (mJ)	1751 ± 84	1804 ± 99	1775 ± 1Í3„

Zkratky- OVX = zbavené vaječníků, PTH1 « rhCPTHCl-34) 1 pg/kg po dobu 18 měsíců, PTH1-W = vysazení na 6 měsíců po ošetřování rh(PTH(1-34) 1 pg/kg po dobu 12 měsíců, PTH5 = rh(PTH(l-34) 5 pg/kg po dobu 18 měsíců, PTH5-W = vysazení na 6 měsíců po ošetřování rh(PTH(l-34) 5 pg/kg po dobu 12 měsíců

• ♦

^a popis proměnných je v tabulce IV.1 ^b údaje vyjádřené jako průměr ± standardní chyba střední směrodatné odchylky (SEM) pro skupinu ° statisticky významné ve srovnání s kontrolou OVX (p<0,05) ^s statisticky významné ve srovnání se simulovanou kontrolou (p<0,05).

Histomorfometrie kosti

Ačkoli rychlosti přeměny byly vyšší u skupiny zbavené vaječníků než u simulované kontroly, nedošlo k vážnému úbytku objemu kosti v kyčelním výčnělku. Jelikož značený tetracyklin, podávaný šest měsíců, nebyl zjistitelný u žádného zvířete, byly v tomto časovém úseku měřeny jen statické parametry. Hodnoty statické a dynamické histomorfometrie 15 měsíců ukázaly, že ošetřování rhFTIK 1-34) zvýšilo plochu houbovité kosti ve srovnání s hodnotami jedinců zbavených vaječníků a zvýšení tvorby kostí bez zvýšení resorpčních hodnot ve srovnání s hodnotami naměřenými u kontrol zbavených vaječníků- Rychlost tvoření kostí se zvýšila progresivně s vyššími dávkami rhPTHCl-34). Ačkoli tvora houbovité? kosti zůstala zvýšená ve srovnání s kontrolami zbavenými vaječníků po vysazení rhPTH(l-34) po 12 měsíčním ošetřování, tvorba a resorpce kostí se obrátila na hodnoty pro kontroly zbavené vaječníků a přeměna kostí zůstala vyšší než u simulovaných kontrol- rhPTHd-34) neovlivnil minerál izac i, aktivační frekvenci nebo periody přestavby kostí. Nebyly rozdíly v individuální kostní multicelulární jednotce (DMU), založené na rovnováze mezi resorpcí a tvorbou. Souhrnně rhPTHd-34) zvyšoval. houbovitou kost selektivní stimulací tvorby kostí.

V kortikální části pažní kosti, kde rhPTH(l-34) nemodifikoval významně BMD nebo naměřené pevnosti kostí, stimuloval rhPTHd-34) změny v periosteální, endosteální a intrakortikál- 46 “J • · · · · ♦ • ·

• · ní části <tabulky XI a XII). Ačkoli nebyly rozdíly mezi celkovou plochou nebo dřeňovou plochou mezí skupinami, zvětšoval rhPTH<l-34) kortikální plochu a skupiny PTH5 a PTH5-V měly výnamně více kortikální kosti, značící zvýšený moment setrvačnosti a pevnost. Zvětšení plochy by se mohlo přičítat zvětšené tvorbě jak periosteálního, tak endosteálního povrchu Cobr. 7).

Simulovaně ošetřené skupiny a skupiny PTH5-V měly snížené periosteální mineralizující povrchy ve srovnání s kontrolami zbavenými vaječníků a ostatními skupinami ošetřenými rhPTHCl34). Endokortíkalní mineralizující povrchy byly významně větší u kontrol zbavených vaječníků ve srovnání se simulované ošetřenými a rhPTHCl-34) nezvyšoval horní hodnoty kontroly zbavené vaječníků. V intrakortikální přestavbě bylo více míst u zvířat zbavených vaječníků a aktivační frekvence byla větší u skupin PTH1 a PTH5 zbavených vaječníků, než u simulované ošetřených kontrol nebo některé ze skupin s vysazeným podáváním. Bylo významně více značených osteonů na jednotku plochy u skupiny zbavené vaječníků ve srovnání se simulované ošetřenými kontrolami a rhPTHCl-34) je nezvýšil významně nad hodnoty skupiny zbavené vaječníků.

Intrakortikální porozita byla větší u skupin zbavených vaječníků, než u simulované ošetřených kontrol, nelišila se však mezi kontrolami zbavenými vaječníků a PTH1. PTH5 a PTH5-W zvýšily porozitu nad pozorovanou hodnotu u kontrol zbavených vaječníků. Hodnoty, pocházející ze studie s králíky, vyvolaly domněnku, že zvýšení parazity, doprovázené zvětšením kortikální kosti, může být strukturální odezvou k zachování biomechanických vlastností kosti ošetřované rhPTHCl-34)- Mezi skupinami zbavenými vaječníků a ostatími skupinami nebyl rozdíl v tvořící periodě, šířce ostenoidu, šířce stěny nebo zrání osteoidu po 18 měsících.

Souhrnně nebyl rozdíl v rychlostí přeměny mezi kontrolami ··· ·

·· »· · · · · • · · · 0 · • · « · · · · • · 0 0 0 · ··· ··· ·· ·« zbavenými vaječníků a jakoukoli dávkou rhPTHCl-34). Simulované ošetřené kontroly měly nižší rychlost přeměny než kontroly zbavené vaječníků nebo zvířata ošetřovaná rhPTHCl-34). Když bylo podávání rhPTHCl-34) vysazeno na šest měsíců, rychlosti přeměny významně poklesly, avšak naměřené BMD a mechanické pevnosti zůstaly vyšší než u kontrol zbavených vaječníků. Normální hodnoty šířky osteoidu a doby zrání intrakortikálně u všech skupin naznačují, že ošetřování nezpůsobilo žádnou závadu v normálním časování minerálizačního procesu. Normální hodnoty tloušťky stěny naznačují, že ošetřování nezměnilo normální rovnováhu nezi resorpcí a tvorbou na úrovni individuální BMU.

Tabulka XI

Histomorfometrické proměnné veličiny pro měření kortikální části pažní kosti

Proměnná3·	Jednotky	Popis
Ac.F	cykly/rok	aktivační frekvence
BFR/BS.Ec	pm/den	rychlost tvorby kosti, týká se endokortikálního povrchu
BFR/BS. F’s	pm/den	rychlost tvorby kosti, týká se periosteálního povrchu
BFR/BV	%/rok	rychlost tvorby kosti, týká se objemu kosti
FP	dny	per i oda tvorby
I. na N/Ct.A	# /mm2	počet osteonů značených fluoro-

chromém na jednotku kortikální • · ··· · • · · · · · • · · · · • * ♦ · · ·

- 48 : .· • · · 0 • ·· · plochy

MAR	μη/den	rychlost intrakortikálního ukládáni minerálů
MAR.Ec	μια/den	rychlost endokortikálního ukládání minerálů
MAR.Ps	μια/den	rychlost ukládání minerálů na per i os teá1η ím povrchu
MS/BS.Ec	%	mineralizující endokortikální povrch vztažený k celému endokor- tíkálnímu povrchu
MS/BS.Ps	%	mineralizující endokortikální povrch vztažený k celému periosteálnímu povrchu
0. V i	μια	šířka oseoidu
Rs-N/Ct.A	#/mm2	počet resorpčních míst na jednotk kortikální plochy
W.Wi	μπι	osteoidní šířka
omt	den	doba zrání ostenoidu
Po		porozita; procento plochy kosti zauj ímané dut i nami
B. Ar	mm2	plocha kosti; celková plocha uvnitř periosteálního povrchu

mm²

Ct. Ar kortikální plocha; plocha kosti ····

9 uvnitř periosteálního povrchu (včetně porozity)

Me.Ar mm² plocha medulární dutiny ^a- Názvosloví doporučené v Journal of Bone and Minerál Research, 1987 .

Poznámky k tabulce XII

Zkratky- OVX = zbavené vaječníku, PTH1 = rhCPTHC1-34) 1 pg/kg po dobu 18 měsíců, PTH1-V - vysazení po ošetřování rh(PTH(l-34) 1 pg/kg po dobu 12 měsíců, PTH5 = rhCPTHCl-34) 5 pg/kg po dobu 18 měsíců, PTH5-W = vysazení po ošetřování rh(PTH(1-34) 5 pg/kg po dobu 12 měsíců, ^a statisticky významné ve srovnání s kontrolou OVX (p<0,05) ^b popis proměnných je v tabulce IV.2 ^c údaje vyjádřené jako průměr ± standardní chyba střední směrodatné odchylky (SEM) pro skupinu

• ·· · • · • ·

999

9 9 9

9 9 9

9 9 9 » · 9

99 •3

A

Mí β

»<Η tn o

c >N <0

0,

MH >Í4

Ό

O £

Ό >

O tn o

II

C tn

XI) a

$4

»)

Φ a

o

u.

O β

o

·) tn

H —

X <0 X μ o

F-1 *mt ·> ň ·« á

o

0, •3

M

MH c

X) φ

TS (0 >

£

O 'X c

Φ >

<0

Λ

N

£ 1 V) X f- b

n SO TT 41 ST) O f CM

« m m. Ό 41 m t— cm’

Vl O, -t 41 Ch «Cl

ra m c~ r- -H H CM

o q CM tn H cn sq, 00 oo

re SD q © 4) 00 q o

re 00 «Ί- ο 41 so 00 o

Γ- *r © 41 m © * o

«Τι rf» O 41 CM 00 ©r

re OS q v-> 41 m q oo

re O m -H o ΓΊ fN

m q © 41 s© q c*s

00 '“f © 41 Ch r ©

.00 •H ΓΜ OO rn o

«η q CM 41 r-~ © vš

n CM q φ· 41 © q s©

rt Ch q- ,00 41 © 00* SCI

re O tn 4Í m oo o -tf

SO q. S© 41 m cý

Λ

m

re 00

op

tf

q

re

©

m

re

ΓΠ

tn

re

tf

©

(N

r-

p\

—

Ch

r-

m

Γ-

S©

m

SD

.0¾

m

CM.

cn

Γ-

q

00 r<

tn

XJ Os

q

q

CM

Ch

CM

Os

q

s©

tf

•v tf

m

-H

tn

-H

41

o

©

O

©

41

41

mm

O

41

mm

tf

41

41

41

iO

41

tf

4)

m

r-

41

41

41

41

r*

o

-H

41

OO

41

41

Ό

»n

X

O

©„

Os

Ch

os

tn

m

ι/Ί

s©

Xtf

©

»4·

cn

CM

«Ο

00

OO

os

00

'N

tf

Os_

* CM

*

q

,q

r> ©

A,

©

mj

sO\ A

·» tn

q

m SO

·» ©

-f

b

00

m

oo

·“*

00

mm

©

mm

n

o

so

Ό

so

l/S

T

mm

CM

Ch

re

IZS

(0

re

re

Os

re

SD

re

re

re

«Ί.

tn

m

tf

tn

tf

00

*©

Γ

tn

m

m

r-~-

tf

O

q S©

oo

r—

·*>

00

tf

—M

m

<Ί.

mm «»

··

q

00 r

.q

wm<

Γ

q

cn

|

CM

-H

m

rn

H

o

©

©

O

41

tf

©

©

41

O

mm

41

41

41

41

Ch

41

-H

tf

41

41

41

41

Tf

41

41

41

CM

41

41

tf

©

tf

tn

tf

o

Ch

Ch

o

s©

so

r~

so

S©

CM

mm

so

m

Ch

oo

H

o rf·

SD

rn.

tf

q

© #·

s©

tn r

s’-*

00

q

mm^

m

00

q

I* >53-

r 00

s m s©

b

m

·—*

m

tf

so

o

mm

©

©

rn

cs

©

SD

rn

CM

tn

m

tn

CM

tf

Ch

tf

©

re

mm

Ch

r-

SD

r-

SO

•v

tn

m

©

mm

CM

tn

tn

—

*rn

Γ-~

00

r*

©

00

Ch

c~

q

o

Ch

r-~

q

r-_

Ό

r·’

řq

r-

tn

m

- s cn

tf

-H

—

<n

41

©

O

©

©

41

tn

o

o’

41

©'

tf

41

41

41

mm

41

tf

-H

H

tf

41

41

41

41

Os

41

41

41

so

41

41

CM

X

Os

cn

m

tf

S©

00

s©

Ch

mm

Os

s©

00

<n

s©

tn

CM

SD

so

H

'«O,

00

Ό-

q

m

CM

Os

sq

q

IC

i/S •

SO_

CM ©'

—7

q

sď

cu

00

Os

s©

©

O

O

CM

oo

m

s©

rn

tf

tn

m

m

Os

tf·

Os

Os

q Ch

Γ

o

o

Os

'tf

CM

·—«

00

Os

CM

Os

<n

m

oc

mm

m

tn

M·

©

©

©

CM

rn

*Ώ-

q

tn

mm •r

(N

q

m

©

tf

c+

rf- les

cn

+1

r-

tn

41

o

©

©

©

41

41

©

©

41

41

41

41

X

41

m

41

41

tf

41

41

41

41

Ch

m

41

41

m

41

41

CM

tn

c~

sO

o

CM

SD

Os

m

r-~

tn

Os

q

©

M·

mM

s©

Γ'-

m,

00

m

tf

►>

q

o'

*«

tn

o m

©

SO

©

©

©_

ΓΜ

00

00 ·*.

q

·. CM

>c?

*» r-

o

SO

CM

Os

Ch

SD

mm

mm.

©

©

CM

mm

tf

©

SD

m

CM

tn

m

mm

SD

re’

re

re

re

re

re

re

re

s©

re

re

©

SCI

r-

O

c-

s©

c-

m

Os

Mtf

Os

Os

CM

r-

*. rn

Ό

©

tn

r-~

©

00 ·»

00

©_

© ·

m·

q

m

CM

tf r

tn

Os

mm

CM.

q

<n‘

* Yn

Tf'

m

cT

CM

-B m

©

©

©

©'

S©

<n

o

©

-H m

mrnl

©

41 CM

•B o

41 CM

-

41

-H

-H

H

41

41

41

41

41

41

41

41

41

41

s

<n

00

Ch

<n

c-

00

m*m

00

CM

Os

mrn

c-

CM

CM

00

CM

tf

t-

Λ

© m

r~- r>

CM

CM

Ch

‘’ζ.

s© V

©

00

·»>

cn

vs

rn

r m

·» c~

tn

CZ)

—·

r*

m

CM

00

©

©

©

©

m

mm

m

O

so

tf

wm

tn

m

<

o

V)

O 3

ω CZ3

b OQ ffl

>

u z

υ ω

Ph

υ ω czS

V) b 00

< G

.2 tm « >

b ύ <

b ffl

cž b ffl

b ffl

Ct* ϋχ

c O J

ffl < 2

ai <

ffl < s

gQ W s

ffl 55 S

• mrf ó

(Λ ffl

»mrf r* c o

£

* ffl

0

«* ώ s

·· * ·· ·

Analysa histomorfometrií a mikroskopií v polarizovaném Fourier transformovaném infračerveném světle ukázala, že podávání ΡΪΗ zlepšuje kvalitu kostí nahražováním staré kosti (s velkými krystality) mladou kostí (obor krystalitů se sklonem k menším velikostem). Kromě toho po vysazení PTH u opic dostávajících nízké dávky dochází k další přednosti, jelikož matrice se stává optimálně mineralizovanou a krystality dospívají. Data odvozená z histomorfometrie a Fourierovy transfornační mikroskopie v infračerveneěm světle ukazují neočekávanou přednost kostní kvality kortikální kosti, když dochází k optimální mineralizaci a minerální fáze dopívá.

Studie modelování 3D konečnými prvky

Zkoumání středního 500 pm tlustého plátku obratle L-5 ukázalo 21% nárůst BMD pro PTH ve srovnání s jedinci zbavnými vaječníků, což bylo způsobeno 27% nárůstem BMC bez změny plochy průřezu. Analysa středu z PTH ukázala 73% nárůst BV/TV, což bylo způsobeno 30% nárůstem Tb.Th a 37% větším než Tb.N, ve srovnání s jedinci zbavenými vaječníků- Analysa spojitosti pro tuto oblast ukázala o 140% větší hustotu uzlin (objem uzli n/tkáň) a o 236 % spojů mezi uzlinami u PTH obratle.

Histogram analýzy rozdělení hustot kostních voxelů u PTH ukázal snížení podílu nízkých hustot (0-355 mg/cm³), nárůst středních hustot (356-380 mg/cm³), s malým účinkem na vysokou hustotu voxelů (887-1200 mg/cm³), ve srovnání s jedinci zbavenými vaječníků (obr.8). Nejnápadnější byl posun k vyšší hustotě voxelů v kortikální části kosti následující po vysazení na šest měs íců (obr. 8 ) .

Byl vypočten podíl prvků obratlové kosti (voxelů), který spadal do určitého oboru hodnot BMD. Slo o následující zvolené obory BMD; nízké EíMD 0-300 mg/cm³ ; střední BMD, 300-700 mg/cm³; vysoké BMD 700-1000 mg/cm³; a kortikální BMD > 1000 mg/cm³ ·· ···· (tabulka XIII). Ve srovnání s kontrolami zbavenými vaječníků, ošetřování PTH významně snižovalo objem kostí s nízkým BMD a zvyšovala objem kostí se středním BMD- Po vysazení PTH došlo k poklesu kosti se střední BMD a k nárůstu kosti s vysokým BMD, což naznačuje, že kost se středním BMD se stávala hustší.

Tabulka XIII

Procento objemu obratle L5 seřazené podle hodnot BMD (průměr ± SEM)

Ošetření	BMD (%)	vysoké	kortikílni
nízké	střední
zbavené vaječníků	30,4+2,2	48, 7 ± 1,6	19,9±1,2	0,9+0,3
PTH	17,7+1,6x	58,9+1,9χ	22,8+2,7	0,6+0,3
PTH-w	22,4+1,3*	49,7+1,2	27,0+1,6χ	0,8+0,2

Tabulka XIV

BMC ve střední úrovni obratle L5 a efektivní obratlová deformace
Ošetření	BMD (mg)	efektivní deformace obratle (u)
zbavené vaj eč η í ků	37,2+1,6	701+64
PTH	47,4+1,5*	447±36x
PTH-tf	44,2+1,2x	539+34*

χ statisticky odlišné (p<0,05 podle Fisherova PLSD testu)

Hodnoty na obr. 8 ukazují, že obratle L~5 opic cynomolgus, ošetřovaných 18 měsíců PTH, odpovídají významnému nárůstu :

kostní hmoty, trabekulární tloušťky a trabekulární spojitosti s okrajovými účinky na vnější rozměry (plochy X) obratle. Analýza rozdělení kostních elementů v L-5 ukázala, že silně mineralizované oblasti kostí se mění naposled bez patrné sklerózy kostí. Spíše jde o porézní trabekulární kost, která odpovídá nejvíce na PTH. Posun BMD vede k podstatné redukci axiální deformace, což znamená mechanické zlepšení. Jak je zřetelně patrno z histogramů PTH a ovariektomie BMD, změnil PTH nízké voxely kostní hustoty na voxely střední hustoty bez významného vlivu na voxely vysoké hustoty.

Hodnoty v tabulce II ukazují, že BMC středem obrale jsou ošetřováním PTH významně zvětšeny a příznivý účinek PTH zůstává zachován po šesti měsících vysazení. Průměrná mechanická deformace v obrátíech se ošetřováním PTH snížila o 36 % a zůstávala 23 % pod OVX po vysazení PTH. Tato studie ukazuje, že vysazení ošetřování PTH na dobu šest měsíců nevedlo k resorpci nově vytvořené kosti, ale místo toho bylo příznivé rozdělení střední hustoty kosti do kosti nízké a vyšší hustoty. Toto přerozdělení vedlo k trvalému snížení deformace obratle a tedy k lepší mechanické funkci.

Diskuse

Tato studie na primátech ukázala, že PTH podávaný bez jiných léčiv, která by mohla ovlivnit kosti, zvýhodňuje jak kortikalní, tak trabekulární kostí ke zvýšení kostní hmoty celé kostry. Kromě toho vysazení podávání PTH nevedlo k významné ztrátě předností spojených s ošetřováním PTH v periodě nejméně dvou cyklů přestavby kostí.

V jiných pokusech k vyznačení účinku v kostech bylo použito náhradních markérů za předpokladu, že změny hodnot reflektují změny v kostní hmotě. Ačkoli existují publikovaná data pro lidi a primáty ukazující, že se jak tvorba tak resorpce

• · 4 4 · • . · 4 4

44 markérů zvětšuje konsistentně s aktivací přestavby kostí, například během předčasné menopauzy nebo v aktivních chorobných stavech, považuje se vysoká přestavba kostí za indikativní pro úbytek kostí. V dospívání byla vysoká přestavba kostí během zrání lidské kostry méně studována, je však doprovázena anabo1ickým získáváním kostní hmoty. Takové jevy by byly podle běžného stavu techniky zcela neočekávané v drogové terapii osteoporózy- Nárůst markérů přestavby kostí je tudíž nekonsistentní se známým anabolickým účinkem PTH na zvýšení hmoty a pevnosti kostí, jak je doloženo daty v této studií.

Data z 18-měsíční studie na opicích cynomolgus podporní jí nás 1edu j í c í neočekávané poznatky =

- celkový významný nárůst hmoty celé kostry,

- významný nárůst kostní hmoty a pevnosti v kyčelním krčku,

- mepozorovné kradení z kortikální kosti k nárůstu trabekulární kosti. Nárůst kostní hmoty a pevnosti byl statisticky významný v místech obohacení pro jak kortikální kost (kyčelní krček) tak pro trabekulární kost (lumbární obrate»!) . V čistě kortikálních místech kosti (ve střední části kosti stehenní) měl PTH sklon stabilizovat nebo mírně zvětšovat kostní hmotu a pevnost ve srovnání s kontrolami zbavenými vaječniků.

- změny kostních markérů u opic zbavených vaječniků (a u lidí) nereflektují příznivé, anabolické účinky PTH na kostru. Použití tělních tekutin od primátů v této studii připouští vývoj nových a hodnotnějších náhradních markérů,

- zachováni nárůstu kostní hmoty a pevnosti po dobu nejméně dvou cyklů přestavby kostí po vysazení léčby.

Tato studie PTH na primátech se liší od publikovaných studií na opicích rhesus a cynomolgus v tom, že bylo použito velkého poctu vzorků k prokázání patřičné statistické průkaznosti k odhalení rozdílů, které mohly a nemusely být patrné v dřívějších studiích s daleko menším počtem vzorků; kontroly ·· ««·4

- 55 i Í • · • · »· * · ·* ·» *· ·· · · · * • « 4 4 4 ·

4 4 4 4 4 4 * · 4 4 4 ·

4·· *4» <· ·» zahrnovaly jak primáty zbavené vaječníků (použité v publikovaných studiích) tak simulované operované, avšak intaktní primáty. 0 takové kontrolní skupině nebyly zmínky v dřívějších studiích takového typu, takže některé přednosti PTH a zachování určitých opatření na úrovni simulované ošetřených kontrol ve srovnání se zvířaty zbavenými vaječníků, byly vyhodnoceny poprvé .

Závěry

Tato 18-iněsíční studie na dospělých plodných opicích cynomogulus Macaca fascicularís zbavených vaječníků (OVX), zaručila účinnost a bezpečnost kostí po ošetřování rhPTH¢1-34) po jak 12 měsících následovaných vysazením ošetřování na dobu šesti měsíců tak ošetřování po dobu 18 měsíců, rhPTÍKl-34) významně zvyšoval kostní hmotu a pevnost ostnu oblatle a kyčelního krčku ve srovnání s kontrolami zbavenými vaječníků na úrovně rovnocenné nebo větší se simulované ošetřenými kontrolami. U opic zbavených vaječníků ošetřovaných rhPTH¢1-34) zůstaly míry dynamické rovnováhy vápníku (vápník, fosfát a 1,25-dihydroxyvitamin D v séru) zachovány jako u siaulovaně ošetřených kontrol. Histomorfometrické hodnoty v séru a v moci, potíži té k posouzení přeměny kostí ukázaly, že rhPTH(1-34) zachoval rychlosti tvorby kostí rovnocenné nebo vyšší než u kontrol zbavených vaječníků, přičemž biochemické markéry resorpce kostí zůstaly rovnocenné s markéry u simulované ošetřených kontrol. U všech zvířat ošetřovaných rhPTH(l-34) po dobu 18 měsíců se farmakokinetické hodnoty neměnily s časem a k hromadění rhPTH(l-34.) nedocházelo. Po 18 měsících se nevyskytla trvalá hyperkalcemie nebo ledvinová patologie. Nedošlo ke změně minerál izace nebo period přestavby. Čistý zisk obsahu kosterních minerálů pozorovaný s rhPTH(l-34) lze vysvětlit zvýšenou rychlostí tvorby kostí a tvarování povrchu kostí s nepatrným nebo se žádným účinkem na resorpci kostí. Došlo k významnému zvýšení obsahu minerálů v kostech, hustoty minerálů a biomechanických. ukazatelů pevnosti., včethě houževnatosti a tuhosti v klinicky závažných místech, jako je osten pátere, kyčelní krček a proximá1η í ho1eh.

rhPTH<l-34) zvyšoval rychlost přeměny v kortikální kosti osového dříku pažní kosti a v kosti vřetenní, neměnil však významně kostní hmotu nebo biomechanícké ukazatele pevnosti ve srovnání kontrol jak zbavených vaječníků, tak simulované ošetřených. Nárůst kortikální šířky a/nebo plochy kortikální kosti je však konsistentní s nárůstem momentu setrvačnosti průřezu kosti, což je měřítkem pevnosti a tuhosti. rhPTHCl-34) neovlivnil významně vlastní materiálové vlastnosti kortikální kosti. Tvorba endokortikální kosti byla stimulována, což zvětšilo kortikální šířku a intrakortikální porozitu. Zdá se, že tyto změny porozity zodpovídají za zachování pružnosti kostí.

U opic bylo ošetřování 12 měsíců rhPTHCl-34) s vysazením léčby na šest měsíců spojeno s malým, leč se statisticky významným ziskem kostní hmoty a pevnosti v ostnu a v kyčelním krčku. Po vysazení nebyl pozorován žádný významný vliv na osový dřík kortikální kosti pažní kosti a kosti vřetenní- Kostní markéry a historoorfometrie ukázaly sklon k návratu k nižším hodnotám, přeměny naměřeným u simulované ošetřených kontrol.

Mechanické studie u hlodavců in vivo ukázaly, že geny, související s anabolickým vstupem rhPTHCl-34), se preregulují během jedné až šesti hodin a nárůst povrchu kostí lze zjistit již 24 hodin po první dávce při chybějícím účinku na resorpcí. Zdá se, že rhPTHCl-34) rekrutuje osteoprogenitory v S-prostoru a stimuluje jejich diferenciaci v osteoblastech, čímž rychle zvětšuje procento povrchů vytvářejících kost. Samotná nebo několikanásobná injekce rhPTHCl-34) během jedné hodiny stačí k vyvolání anabolického účinku na kosti. Podá-li se ekvivalentní dávka mladým krysám v podobě několikanásobné injekce během šesti nebo osmi hodin, anabolický účinek se rozšíří, což • · naznačuje, že k vyvolání anabolického účinku je třeba krátké, omezené exposice na rhPTHC1-34).

Souhrnně rhPTH(l-34) je anabolikem na kosti u opic a králíků, zvětšujícím ukazatele kostní hmoty a biomechanické pevnosti v klinicky závažných místech, jako je osten lumbárního obratle a kyčelní krček, selektivní stimulací tvorby kostí. Zvýšení přeměny kostí, tvorby endokortikálního povrchu a porozity, zjištěné histomorfometríi v kortikálních místech, neměnilo kostní hmotnost nebo biomechanické ukazatele pevnosti kostí, ale zvyšovalo moment setrvačnosti průřezu kostí zvětšováním plochy a/nebo šířky kortíkální kostí.

Tyto studie dokládají, že podávání receptářových aktivátorů parathyroidního hormonu, jako je rekombinantní lidský PT1K1-34), zlepšuje kvalitu kostí jak během ošeřování. tak po něm. Podávání PTH jednou denně po dobu 18 měsíců, nebo stejných dávek po dobu 12 měsíců následovaným vysazením na dobu 6 měsíců, skutečně vykázaly výrazné zlepšení kvality kortíkální pažní kosti, analyzované histomorfometrií a mikroskopií a infračervenou mikroskopií s polarizovanou Fourierovou transformací CFTIR). Tyto analýzy ukázaly, že podávání PTH zlepšuje kvalitu kosti nahrazováním staré kosti Cs velkými krystality) mladou kostí <s oborem krystalitů se sklonem k menším krystalitům). Podávání PTH tudíž může zvyšovat kvalitu kortíkální kosti, zlepšovat minerálizaci a zrychlovat minerálizaci a náhradu starých kostí novými kostmi.

Po vysazení PTH opicím, dostávajícím nízké dávky, vyplývá další výhoda, jelikož matrice se stává lépe neineralizovanou a krystality dospívají. To znamená, že při nízkých dávkách může mít PTH přídavnou přednost během vysazovat; í fáze ošetřování podpořením minerál izace. Tyto hodnoty naznačují přednost ukončeného režimu ošetřování PTH následovaného periodou vysazení k dosažení zlepšené přednosti. Běžné definice kvality kostí toto hledisko zlepšené minerál izace neobsahují.

Ve starších studiích ošetřovací fáze PTH následnované fází bez ošetřování byla fáze ošetřování kratší než jeden měsíc. Prodloužená, avšak konečná fáze ošetřování 18 až 24 měsíců následovaná periodou nejméně dvou cyklů přestavby kostí nebyla dosud zkoumána. Pokračující příznivý účinek u opic po vysazení ošetřování je ve výrazném rozporu s výsledky dosahovanými u . Studie na krysách rovněž ukázaly, se kosti rychle ztrácejí CGunnes-Hey str. 447 až 452, 1989; Shen V., J. až 2487, 1993; Shen V. a kol., Cal214 až 220, 1.992; a Mosekilde I. a 437, 1997).

hlodavců pří dávkování PTH že po vysazení ošetřování M. a Hock J.M. , Bone IQ, Clin. Invest 91, str. 2479 cif. Tissue Int. 50, str. kol.., Bíne 20, str. 429 až

Takový způsob usnadnění minerálizace kostí nebyl dosud pozorován a je neočekávaný, což otevírá nový způsob, kterým PTH zpevňuje a zvětšuje houževnatost kostí a může předcházet zlomeninám. Tento nový způsob zahrnuje usnadnění a řízení minerál izace k zajištění houževnatějších s tužších kostí odolávajících lépe zlomeninám. Takové výhodné účinky vyžadují více než tvorbu nové matrice. Tyto poznatky znamenají, že PTH je příznivý pro pacienty se znehybněnými kostmi něho kostrami nebo v kostrách s deficitem minerálů, za předpokladu, že je také přiměřené doplňování vápníku a vitaminu D.

Příklad 3

Diagnóza a zařazení

Zvýšení pevností a hustoty kostí a snížení zlomenin podáváním rhPTHC1-34) lidem

Počet jedinců; rhPTHCl-34); 1093 kontrolovaných, 848 s ukončením. Placebo; 544 zúčastněných 447 s ukončením.

ženy ve věku 30 až 85 let,

0 0 ·· ♦ « · * • · · · · » • 0 0···· • 0 · 0 · 0

000 000 «« 00 kr i tér i ti ·

Dávka a podáván í:

Trvání ošetřování:

Kr i teri a hodnocen í postmenopauzální minimálně 5 let, s minimem jedné střední nebo dvou mírných neúrazových zlomenin obratlů Testovaný produkt (slepý) rhFTH(l-34)^: 20 pg/den, subkutánně rhPTH(l-34)-· 40 pg/den, subkutánně Ref erenčni terap i e (s1epá) materiál placebo studie k injektování rhPTH(l-34): 17 až 23 měsíců (s vyloučením šestiměsíční zabíhací fáze) Placebo: 17 až 23 měsíců (s vyloučením šestiměsíční zabíhací fáze) osten pátere rtg; biologické markéry v séru (vápník, alkalickčí fosfatáza specifická pro kost, prckolagen I karboxy-terminá1ový propeptid); markéry v moči (vápník, N-telopeptid, volný deoxy py i' i d i no 1 i n ) ; 1,25 - d i hydroxy vitamin D; hustota kostních minerálů;

osten, kyčel, zápěstí a celé tělo;

výška; b i ops i e f armakok i net i ka kostí (vybraná populace; studovaná místa)

Charakter i s t i ka pac i entfl

Placebo

Kavkazané věk roky po menopauze odejmutí vaječníků děloha + 0 nebo 1 vaječník ·+ 2 vaječníky neznámo i dřívější užívání léku prot i osteoporoze základní spin BMD (N=544)

98,9%

69,017,0

20,9+8,5

23,8%

9% 0,8210,17

PTH-20 (N=541)

98,9%

69,5+7,1

21,518,7

23,1%

15,5%

0,82+0,17

PTH-40	Hodnota
(N=552)	P
98/%	0,672
69,9+6,8	0,099
21,818,2	0,273
21,6%	0,682
58
51
10
13,0%	0,479
0,82+0,17	>0,990

• · · · · · • · >0,990

základní linie fx nespecifikováno

54(10,4%) 144 (27.8%) 128 (24.7%) 75 (14,5%) 59(11,4%) 28 (5,4%) 13 (2,5%) (1,2%) (1,7%) (0,2%) (0,2%) 26 (8,8%)

159(31,1%) 128 (25,0%) 67(13,1%) 49 (9,6%) 31 (6,1%) 20 (3,9%)

7(1,4%) (1,0%) (0,2%) 29 (10,1%) 169 (31,6%) 125 (23,4%) 81 (15,1%) 45 (8.,4%) 21 (3,9%) 25 (4,7%) 10(1,9%) (0,6%) (0,4%)

Výs1edky

Hodnoty z tohoto klinického pokusu s celkem 1637 ženami, ošetřovanými rekombinantním lidským parathyroidním hormonem ¢1-34), rhPTHCl-34), 0,20 nebo 40 pg/kg/den a doplněné vitaminem D a vápníkem po dobu 18 až 24 měsíců ukázala výsledky uvedené v tabulkách XV až XIX.

Tabulka XV dokládá snížení počtu a závažnosti zlomenin obratlů po ošetřování PTH. Při porovnání všech pacientek ošetřovaných PTH bylo celkové snížení počtu pacientek se zlomeninami obratlů 67¾ (p<0,001) s 65¾ snížením <p<0,001) při 20 pg/ den PTH v porovnání s placebo a 69¾ snížením při 40 pg/den PTH ve srovnání s placebo Ctabulka XV). Při porovnání všech pacientek ošetřovaných PTH s placebo je snížení počtu pacientek s vícenásobnou zlomeninou obratlů 81¾ (p<0,001) se 77¾ snížením Cp<0,001) při 20 pg/den PTH ve srovnání s placebo a 86¾ snížením při 40 pg/den PTH ve srovnání s placebo. Při porovnání pacientek ošetroaných PTH s placebo bylo celkové sníženi počtu pacientek se středními nebo závažnými zlomeninami obratlů 84¾ <p<0,001), s 90¾ snížením Cp<0,001) při 20 pg/den PTH ve? srovnání s placebo a 78¾ snížení při 40 pg/den PTH ve srovnání s placebo (tabulka XV).

Tabulka XV

Vliv ošetřování PTH na počet a závažnost zlomenin obratlů

	Placebo 20 pg/den PTH (nx=448) (n-444)	40 pg/den PTH (n=434)
Počet a procento	64	22	19
pac i entek s novým i zlomeninami obratlů	(14,3	(.5,0 %)	(4,4
Počet a procento	22	5	3
pacientek se dvěna n ebo v í c e novým i. z1omeni nam i obra11ů	(4,9	(1,1	(0,7
Počet a procento	42	4	9
pacientek s novými. (9,4 %) středním až závažnými. zlomeninami obratlů χχ	(0,9	(2,1 %)

x n = počet pacientek se základními a koncovými, rtg. paprsky xx Mírné zlomeniny vedou ve více než 25 % ke snížení výšky obratlů (nebo ekvivalentní míry). Závažné zlomeniny způsobují ve více než 40 % ztrátu výšky obratlů (nebo ekvivalentním míry). Lomy jsou podle definice, kterou podal Genant a kol. (Vertebral fracture assessaent using a semiquantitative technique [Posuzování lomů obratlů pomocí sera 1 kvantitativní techniky], J. Bone & Min Res 8, str.1137 až 1148, 1993.

Tabulka XVI dokládá účinek ošetřování PTH na řadě zlomenin v různých neobratlových kostech v těle. Počet zlomenin zřetelně poklesl v kyčli, ve vřetenní kosti, v rameni, v pažní kosti, v žebrech, v noze, v pánvi a v jiných místech (tabulka • · · · _ * · · · · « « · ·· · · ♦ · · » • · 4 · · ···· ··· · · ······ ·«· · · · · · · • · · ··· «·· ·· ··

XVI). Pokles je statisticky významný, je-li pojímán jako snížení celkového počtu zlomenin pacientek ošetřovaných PTH ve srovnání s· pacientkami ošetřovanými placebo. Pokles je ještě významnější, je-li uvažován jako snížení celkového počtu zlomenin kyčle, vřetenuí kosti, pažní kosti, žeber, nohy a pánve pacientek ošetřovaných PTH ve srovnání s pacientkami ošetřovaným i p1acebo (tabu1ka XVI).

Tabulka XVI

Účinek ošetřování PTH na počet neobratlových zlomenin

				Hodnota p
	Placebo (N-544)	PTH-20 (N=541)	PTH-40 (N=552)	Overall	PTH-pbo*	20-pbo	40-pbo
kyčel	4	2	3	0,718	0,474	0,417	0,690
ι/řetenrií kost	13	7	10	0.404 /	0,236	0,180	0,504
loket	4	2	2	0,601	0,313	0,417	0,403
I Τ» pažin í kost	5	4	3	0,767	0,534	0,744	0,465
žebra	10	5	5	0,277	0,109	0,197	0,184
noha i -	4	1	4	0,374	0,474	0,lSl	0,983
pánev	3	1	0	0,171	0,076	0,319	0,081
ostatní	16	14	9	0,338	0,296	0,723	0,146
celkem	53	34	32	0,024	0,007	0,036	0,015
celkem w/o jiné	41	21	24	0,013	0,003	0,010	0;025

χ placebo (pbo)

Účinek PTH na obsah minerálů v kostech (BMC), hustoty minerálů (BMD) a plochy kostí se zjištoval duální absorpciometrií energie (DEXA) a výsledky jsou uvedeny v tabulkách XVII až XIX. Podávání PTH způsobovalo zjevný nárůst BMC v lumbárních obrat1ech stehenní kosti a pánve, zápěstí a v celém těle pacientek (tabulka XVII). Ošetřování PTH způsobovalo významný nárůst BMD v lumbárním obratli, ve stehenní kosti a v pánvi (tabulka XVIII). Nárůsty v lumbárním obratli, ve stehenní kosti a v pánvi byly statisticky významné s (p<0,001) (tabulka XVIII). Plocha kostí po ošetřování PTH zjevně vzrostla v lumbárním obratli, ve stehenní kosti a v pánvi pacientek (tabulka XIX). Nárůsty v lumbárním obratli a v kyčelním krčku byly statisticky významně (tabulka XIX).

Účinek PTH na celé t-ělo, na kvantitu á kvalitu kostí, BMC je obzvlášť významný. Tento účinek na celé tělo naznačuje, že množství kosti v těle pacientek se zvyšuje. PTH vede nejenom pouze k přemisťování kostní hmoty z jedné části pacientova těla do druhé. Ošetřování zvyšuje PTH množství a kvalitu kostí v paci enLově tě1eObr. 9 a 10 ilustrují nárůst BMD lumbárního obratle a krčku mezi stenenní kostí a pánví v závislosti na čase u pacientek ošetřovaných PTH a u pacientek ošetřovaných placebo. BMD lumbárního obratle pacientek vzrůstal trvale po dobu nejméně 18 měsíců s více méně významným nárůstem během následujících měsících. BMD stehenní kosti/kyčle pacientek zřetelně vzrůstal po dobu nejméně 18 měsíců a může růst po další trvání ošetřování PTH.

Tabulka XVII

Vliv PTH na obsah minerálů v kosti vyjádřený jako procentová změna (SD) konečného stavu od začátečního stavu

	Placebo	PTH-20	PTH-40	Hodnota
osten lumbárního obratle	1,60 (6,92)	11,85 (8,83)	16,62(11,.1)	<0,001
stehenní kost/kyčel
celkem	-0,38(5 18)	3,50 (6 26)	4,78 (6,70)	<0,001
krček	-0,51 (7>O6)	2,99 (7,26)	5,80 (8,71)	<0,001
trochanter	0,98 (14,97)	5,68 (15,58)	6,53 (15,33)	<0,001
intertrochanter	-0,23 (6,28)	3;59 (7,.32)	4,99 (7,79)	<0,001
Wardův trojúhelník	0,01 (14,75)	5,36 (14,78)	8,86(17,02)	<0,001
zápěst í
ultradistální	-1 67 (7,44)	-0,25 (6,53)	-1,88 (7,97)	0,184
1/3 vřetenní kosti	-1,19(6,12)	-1,37(4,51)	-3,04 (6,09)	0,025
celé tělo /	-0,74(4,76)	1,30 (4,48)	2,28 (5,.44)	<0,001

Tabulka XVIII

Vliv PTH na hustotu minerálů v kosti vyjádřený jako procentová změna (SD) konečného stavu od začátečního stavu

	Placebo	PTH-20	PTH-40 Hodnota p
osten lumbárního obratle	1,13 (5,.47)	9,70(7,41)	13,7 (9,69)	<0,001
steheflní kost/kyčel
celkem	-1,01 (4,25)	2,58 (4,88)	3,60 (5/12)	<0,001
krček	-0,69 (5,39)	2,79 (5,72)	5,06 (6,73)	<0,001
tročhanter	-0,21 (6,30)	3,50 (6,81)	4,40 (7,45)	<0,001
i ntertročhanter	-1,29 (4,53)	2,62 (5,52)	3,98 (5,96)	<0,001
Wardův trojúhelník	-0,80 (11,73)	4,19 (11,93)	7,85(13,24)	<0,001
zápěst í
ultradistální	-1,89 (7,98)	-0,05 (7,14)	-1,76 (7,20)	0,108
1/3 vřetenni kosti	-1,22 (3,37)	-1,94 (4,07)	-3,17 (4.)62)	0/001

Tabulka XIX

Vliv PTH na plochu kosti vyjádřený jako procentová změna (SD) konečného stavu od začátečního stavu

	Placebo	PTH-20	PTH-40	Hodnota p
osten lumbárního obratle	0,46 (2,97)	2,52 (3,52)	3,34 (3,72)	<0,001
T· «· ·» . stehenní kost/kyčel
celkem	0,54 (3,02)	0,84 (3,16)	1,05 (2.98)	0,144
krček	0,04 (4.)50)	0,27 (4,91)	0,81 (5,56)	0,035
trochahter’*“'	0,95 (12,75)	1,99(12,16)	1,92(11^30)	0,197
i ntertrochanter	1,01 (5,17)	1,01 (4,99)	1,01 (4,89)	0,964
Wardův trojúhelník · - · - -ts- -	0,44 (7,60)	1/13 (7.J34)	0,99 (8,06)	0,309
zápěst í
ultradistální	0,25 (6/40)	-0,25 (6,00)	-0,39 (4,30) 0,01 (4,42)	0,653
1/3 vřetenni kosti	-0,02 (5,73)	0,52 (3,40)	0/586

Uvedené hodnoty dokládají, že pacientky ošetřované PTH ·« ··« ·

měly snížený počet zlomenin. PTH snižoval PTH o více než 66 % počet pacientek s dřívějšími/' lomy obratlů, které utrpěly nové zlomeniny obratlů. PTH snížil také o více než 78 % počet pacientek s dřívějšími lomy obratlů, které utrpěly nově zlomeniny obratlů. Kromě toho snižoval PTH závažnost lomů obratlů s významným snížením o 78 % počtu pacientek se středními nebo závažnými zlomeninami. Pacientky dostávající PTH měly prospěch z významného snížení všech neobratlových zlomenin (včetně zlomenin kyčle, vřetenuí kosti, zápěstí, pánve, nohy, pažní kosti, žeber nebo lokte) s významností p<0,007. Kvalita kostí rovněž vzrůstala. Pacientky s dřívějšími zlomeninami měly prospěch z významného zvýšení minerálního obsahu v kyčli, v ostnu a v celém těle, Tento nárůst znamenal, že snížení zlomenin v těchto místech se může vyskytnout nejdříve po 12 měsíční terapii.

Diskuse

Tyto údaje o zlomeninách jsou prvními doklady o snižování zlomenin působením PTH u lidí. Tyo poznatky dokládají zlepšování kvality kostí a pevnosvti kostí, podobně jako preklinické hodnoty shora uvedená. Tyto výsledky také ukazují přednosti kvality kostí a pevnosti v neobratlových místech. Poznatky o snižování počtu zlomenin ustálené během 18 až 23 měsíců ošetřování nebyly dosud pozorovány v klinických nebo preklinických studí íchOtázka zda PTH samotný zvyšuje houževnatost a pevnost kostí ke zlepšení odolnosti proti lomu nebyla dosud u lidí testována. Publikovaná literatura konsistentně poukazovala na to, že PTH musí být podáván v kombinaci s anti-resorptivem nebo s estrogenem. Dřívější publikované klinické pokusy zahrnovaly příliš malou populaci pacientů k určení významného snížení zlomenin. V jedné studií nemohly být přednosti PTH samotného posouzeny, jelikož nebyly kontroly placebo. Ve druhé studii • · ··· ·

• · • · ·

používající obecně přijímanou definici zlomeniny, nebylo snižování zlomenin pozorováno.

Poznatek o snižování zlomenin v kombinovaných neobratlových místech je obzvlášť, neočekávaný ve světle obecného názoru, že PTH má negativní účinky v těchto místech. Obecné dogma má zato, že PTH bude zvětšovat kortikální porozitu a proto bude kosti zeslabovat, obzvláště brzy po terapii- Dogma dále tvrdí, že místa kortikální kosti jsou ve velkém nebezpečí zlomení a PTH neposkytne žádnou výhodu ve snižování zlomenin v neobratlových místech. Dogma také má zato, že je nepravděpodobné, že PTH samotný je účinný a bude vyžadovat souběžnou anti-resorptivní terapii k blokování negativních vlivů na kort i ká1n í kost i. Předk1ádaná data dok1áda j í dř íve nepozorované přednosti PTH poskytované pacientům dostávajícím doplňky vitaminu D a vápníku- Neočekávaně PTH zpevňuje kosti ke snížení počtu nových zlomenin u pacientů s rizikem mnohočetných zlomenin ostnu, při riziku přídavných neobratlových zlomenin, při riziku mírných až závažných dodatečných lomů ostnu a podobných .

Tato klinická studie na menopauzálních ženách ukázala obzvláštní přednosti ošetřování pacientek s nízkou dávkou (20 pg/den), jelikož dávka PTH (která při vysokých dávkách by mohla u některých pacientů vyvolávat vedlejší účinky) byla snížena, avšak prevence zlomenin a snížení lomů zůstalo zachováno a je podobná jako při vysoké dávce (40 jug/den). Hodnoty FT-IR pro opice poskytují možné, avšak neomezujuící mechanické vysvětlení. Studie na opicích ukazuje, že nízké dávky PTH zvyšovaly tvoření krystalů a urychlovaly minerálizacl kortikální kosti. Kromě toho opice s nízkou dávkou vykázaly přídavnou přednost po vysazení, neboť PTH zlepšoval minerální obsah kostí. Předkládaná data dokládají nový poznatek, že PTH, podávaný v nízkých dávkách, pacientům dostávajícím doplňky vitaminu D a vápníku, je účinný v prevenci obratlových i neobratlových • · · · ·· ♦♦ • · · « • 9 9 1 • · · « • · · « • · · · zlomeniη. V rozporu s obecným názorem zpevňuje PTH kosti v neobratlových místech a brání tak novým zlomeninám nebo snižuje závažnost zlomenin, zřetelně zlepšením minerálizace a obsahem minerálů v kostech.

Vynález je popsán s odkazem na různá specifická provedení a techniky. Je však zřejmé, že jsou možné četné varianty a modifikace při zachování ducha a rozsahu vynálezu. Všechny publikace a přihlášky vynálezů v této specifikaci jsou indikativní pro racovníky v oboru, pro které je vynález určen.

Průmys 1 ová vy už 1. te 1 nos t

Účinná látka pro výrobu farmaceutického prostředku PTH pro jedince ohrožené osteoporózou ke zpevnění kostí a snížení nebezpečí z1omen i n-

Claims (9)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY «0 00

   0 0 0 0

   0 0 0 0 0 0 0

   0 0 0000 00 ·· 0000 0 0 • 000

   0 0«

   0 0

   1. Použití parathyroidního hormonu obsahujícího sekvenci aminokyseliny 1-34 lidského parathyroidního hormonu pro přípravu léčiva pro snížení rizika vertebrální nebo nevertebrální zlomeniny kosti u člověka s rizikem osteoporozy nebo trpícího osteoporozou, kdy parathyroidní hormon je subjektu podáván bez souběžného podávání antiresorpčního činidla jiného než vitamin D nebo vápník v denních dávkách od 20 pg do 40 pg.
2. 2. Použití parathyroidního hormonu obsahujícího sekvenci aminokyseliny 1-34 lidského parathyroidního hormonu pro přípravu léčiva pro zvýšení kostní minerální hustoty vertebrální nebo nevertebrální kosti u člověka s rizikem osteoporozy nebo trpícího osteoporozou, kdy parathyroidní hormon je subjektu podáván bez souběžného podávání antiresorpčního činidla jiného než vitamin D nebo vápník, v denních dávkách od 20 pg do 40 pg.
3. 3. Použití parathyroidního hormonu obsahujícího sekvenci aminokyseliny 1-34 lidského parathyroidního hormonu pro přípravu léčiva pro snížení rizika vertebrální nebo nevertebrální zlomeniny kosti u člověka majícího osteoporozu, kdy parathyroidní hormon je subjektu podáván bez souběžného podávání antiresorpčního činidla jiného než vitamin D nebo vápník v denních dávkách od 20 pg do 40 pg.
4. 4. Použití parathyroidního hormonu obsahujícího sekvenci aminokyseliny 1-34 lidského parathyroidního hormonu pro přípravu léčiva pro zvýšení kostní minerální hustoty vertebrální nebo nevertebrální kosti u člověka majícího ·· 00 ·«*··· ·· «ι //5 0··· 000 0000 ’- — 000 00000 00 0

   0 00000 0 000 0 0 • 000 0000

   0000 00 ·0 000 00 000 osteoporozu, kdy parathyroidní hormon je subjektu podáván bez souběžného podávání antiresorpčního činidla jiného než vitamin D nebo vápník v denních dávkách od 20 pg do 40 pg.
5. 5. Použití parathyroidního hormonu obsahujícího sekvenci aminokyseliny 1-34 lidského parathyroidního hormonu pro přípravu léčiva podle kteréhokoliv nároku 1 až 4, kdy subjektem je na věku závislá hypogondální osteoporoza.
6. 6. Použití parathyroidního hormonu obsahujícího sekvenci aminokyseliny 1-34 lidského parathyroidního hormonu pro přípravu léčiva podle kteréhokoliv nároku 1 až 4, kdy subjektem je potmenopauzální žena.
7. 7. Použití parathyroidního hormonu obsahujícího sekvenci aminokyseliny 1-34 lidského parathyroidního hormonu pro přípravu léčiva podle kteréhokoliv předcházejícího nároku, kdy léčivo je podáváno alespoň po dobu od okolo 12 měsíců do 3 let.
8. 8. Použití parathyroidního hormonu obsahujícího sekvenci aminokyseliny 1-34 lidského parathyroidního hormonu pro přípravu léčiva podle kteréhokoliv předcházejícího nároku, kdy léčivo je podáváno po dobu okolo 24 měsíců.
9. 9. Použití parathyroidního hormonu obsahujícího sekvenci aminokyseliny 1-34 lidského parathyroidního hormonu pro přípravu léčiva podle kteréhokoliv předcházejícího nároku, kdy denní dávka je 20 pg.