ES2528798T3 - Anticuerpos anti-activina A y usos de éstos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de éste, que comprende: a. un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende: i. una secuencia CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO: 11; ii. una secuencia CDR2 de cadena ligera de SEQ ID NO:12; y iii. una secuencia CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:13; y b. un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende: i. una secuencia CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO:62; ii. una secuencia CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 63; y iii. una secuencia CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 64, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de éste se une específicamente a activina A humana.

Description

Anticuerpos anti-activina A y usos de éstos

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a dominios de nudo de cisteína de activina A y agentes de unión a antígeno capaces de unirse a activina A o fragmentos de ésta.

Antecedentes de la invención

Muchos estados patológicos graves están acompañados de una afección denominada caquexia, que se refiere a la pérdida de masa celular corporal. La masa celular corporal (BCM) consiste en masa muscular, masa visceral y masa de células inmunes. BCM es el componente corporal más activo del cuerpo humano, representando el noventa y cinco por ciento de toda la actividad metabólica. Una pérdida del cinco por ciento en BCM da lugar a morbilidad cambiada, pérdida de fuerza muscular, metabolismo alterado y riesgo incrementado de infección. Una pérdida del cuarenta por ciento puede resultar en la muerte.

Los ejemplos de afecciones en las que la caquexia juega un papel para determinar el resultado de la enfermedad subyacente abarcan un rango de los problemas sanitarios principales actuales. En la caquexia reumatoide, los pacientes con artritis reumatoide (RA) pierden de trece a quince por ciento de BCM. Dos tercios de los pacientes con RA tienen caquexia, y esto resulta en una mortalidad de dos a cinco veces mayor. Otras afecciones relacionadas incluyen obesidad caquética reumatoide y caquexia hipercitocinémica. La caquexia relacionada con el cáncer contribuye significativamente a la morbilidad y mortalidad, afectando también a la capacidad del paciente para tolerar terapias que potencialmente le salvarían la vida.

Loa anticuerpos monoclonales dirigidos a Activina A fueron generados por Rabinovici et al (Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1992). El anticuerpo se indujo frente al dímero de Activina A humana, para el que es específico. No se observó detección de monómeros disociados.

La subunidad beta A de inhibina de ovario se usó para inmunizar ratones. Los hibridomas aislados de los ratones inmunizados produjeron anticuerpos IgM e IgG2b. El último mostró unión y reactividad específicas para la subunidad beta A (Groome y Lawrence, Hybridoma, 1991).

Debido al papel común de activina A en varias enfermedades extendidas, todas las cuales tienen proporciones altas de mortalidad, existe una necesidad largamente anhelada en la técnica para composiciones y métodos para prevenir

o revertir la caquexia relacionada con enfermedades. Dichas composiciones y métodos se proporcionan en la presente memoria.

Resumen breve de la invención

La patente objeto se refiere al anticuerpo inventivo o fragmento de unión a antígeno de éste, según la reivindicación independiente 1, y las reivindicaciones dependientes 2 a 12. Además, la patente proporciona una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 12, un vector según la reivindicación 13 y 14, una célula aislada según las reivindicaciones 15 y 16, y a composiciones farmacéuticas según las reivindicaciones 17 a 20.

Además, la presente descripción proporciona una proteína de unión a antígeno aislada que comprende bien: a. una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: i. una secuencia CDR3 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias CDR3 de cadena ligera de L1-L14; ii. X73 Q X74 X75 X76 X77 X78 X79 X80 (SEQ ID NO:132); iii. L Q H N X81 Y X82 X83 T (SEQ ID NO:131); y iv. Q A W D X84 S T X85 X86 ; b. una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: i. una secuencia CDR3 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de tres adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias CDR3 de cadena pesada de H1-H14; ii. X87 X88 X89 X90 X91 X92 X93 X94 F D Y (SEQ ID NO:187); iii. X95 X96 X97 Y X98 D X99 X100 G W X101 X102 X103 (SEQ ID NO:188); iv. X104 X105 X106 X107 X108 X109 Y X110 X111 X112 X113 X114X115 X116 X117 X118; o c. la secuencia CDR3 de cadena ligera de (a) y la secuencia CDR3 de cadena pesada de (b); en la que X73 es un residuo de metionina, un residuo de glutamina, o un residuo de arginina, X74 es un residuo de alanina, un residuo de tirosina, un residuo de glutamina , o un residuo de serina, X75 es un residuo de leucina, un residuo de tirosina, o un residuo de asparagina, X76 es un residuo de glutamina, un residuo de serina, o un residuo de treonina, X77 es un residuo de treonina, un residuo de tirosina, o un residuo de isoleucina, X78 es un residuo de prolina o un residuo de serina, X79 es un residuo de cisteína, un residuo de triptófano, un residuo de leucina, o un residuo de prolina, X80 es un residuo de serina o un residuo de treonina, X81 es un residuo de treonina o un residuo de serina, X82 es un residuo de prolina o un residuo de treonina, X83 es un residuo de fenilalanina o un residuo de triptófano, X84 es un residuo de arginina o un residuo de serina, X85 es un residuo de valina o un residuo de alanina, X86 es un residuo de valina o ningún residuo, X87 es un residuo de valina o ningún residuo, X88 es un residuo de glutamina o ningún residuo, X89 es un residuo de aspartato, un residuo de triptófano, o ningún residuo, X90 es un residuo de serina, un residuo de leucina, o ningún residuo, X91 es un residuo de isoleucina, un residuo de

glutamato, o un residuo de glutamina, X92 es un residuo de alanina, un residuo de leucina , o un residuo de glicina, X93 es un residuo de alanina o un residuo de leucina, X94 es un residuo de prolina, un residuo de tirosina, o un residuo de glicina, X95 es un residuo de aspartato o ningún residuo, X96 es un residuo de glutamina o ningún residuo, X97 es un residuo de aspartato o un residuo de alanina, X98 es un residuo de de tirosina o un residuo de glicina, X99 es un residuo de serina o un residuo de tirosina, X100 es un residuo de serina o un residuo de arginina, X101 es un residuo de fenilalanina o ningún residuo, X102 es un residuo de glicina o un residuo de aspartato, X103 es un residuo de histidina o un residuo de prolina, X104 es un residuo de glicina o ningún residuo, X105 es un residuo de serina, un residuo de glutamato, o ningún residuo, X106 es un residuo de arginina, un residuo de serina, o ningún residuo, X107 es un residuo de aspartato, un residuo de asparagina, un residuo de serina, o un residuo de glutamina, X108 es un residuo de serina, un residuo de arginina, o un residuo de triptófano, X109 es un residuo de glicina, un residuo de aspartato, un residuo de asparagina, un residuo de tirosina, o un residuo de leucina, X110 es un residuo de serina, un residuo de glicina, un residuo de aspartato, o ningún residuo, X111 es un residuo de serina, un residuo de valina, un residuo de asparagina, o un residuo de tirosina, X112 es un residuo de serina, un residuo de asparagina, un residuo de tirosina, o un residuo de histidina, X113 es un residuo de triptófano, un residuo de tirosina, o un residuo de glutamina, X114 es un residuo de histidina, un residuo de aspartato, un residuo de tirosina, o ningún residuo, X115 es un residuo de fenilalanina, un residuo de alanina, o un residuo de glicina, X116 un residuo de aspartato, un residuo de fenilalanina, un residuo de leucina, o un residuo de metionina, X117 un residuo de tirosina, o un residuo de aspartato, X118 es un residuo de isoleucina, un residuo de valina, o ningún residuo, y la proteína de unión a antígeno se une específicamente a activina A humana.

En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno aislada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de seis adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L14; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L14; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L14;

d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H14; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de cinco adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H14; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H14.

En un aspecto adicional, la proteína de unión a antígeno aislada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de cinco adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L14; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de una adición, sustitución o deleción de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L14; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L14;

d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de una adición, sustitución o deleción de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H14; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H14; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H14.

En un aspecto adicional, la proteína de unión a antígeno aislada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L14; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera de L1-L14; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de una adición, sustitución o deleción de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L14; d. una secuencia CDR1 de cadena pesada de H1-H14; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H14; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H14.

En un aspecto adicional más, la proteína de unión a antígeno aislada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L14; b. una secuencia CDR3 de cadena ligera de L1-L14; c. una secuencia CDR2 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H14; y d. una secuencia CDR3 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de una adición, sustitución o deleción de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H14;

En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno aislada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L14; b. una secuencia CDR2 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de una adición, sustitución o deleción de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H14; y c. una secuencia CDR3 de cadena pesada de H1-H14.

En un aspecto adicional más, la proteína de unión a antígeno aislada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de una adición, sustitución o deleción de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L14; y b. una secuencia CDR2 de cadena pesada de H1-H14.

En un aspecto adicional más, la proteína de unión a antígeno aislada comprende una secuencia CDR1 de L1-L14.

La proteína de unión a antígeno aislada puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

a. una secuencia CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: i. (R/K)SSQS(L/I)L(H/Y)S(T/S)(G/N)(Y/N)(N/K)(-/K)YL(D/V) (SEQ ID NO:115); ii. RA(S/G)QGI(S/R)N(D/N)L-(V/G); iii. RASQSISNYLNT; y iv. SG(D/E)K(L/W)G(D/E)K(F/Y)(A/V)(F/C) (SEQ ID NO:123); b. una secuencia CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: i. (H/Q/L)D(T/N/S)KRPS (SEQ ID NO:128); y ii. X40 X41 S X42 X43 X44 S (SEQ ID NO:124), en el que X40 es un residuo de alanina, un residuo de triptófano, o un residuo de leucina, X41 es un residuo de treonina, un residuo de alanina, o un residuo de glicina, X42 es un residuo de serina, un residuo de metionina, o un residuo de fenilalanina, X43 es un residuo de leucina o un residuo de arginina, X44 es un residuo de glutamina, un residuo de glutamato, o un residuo de alanina, c. una secuencia CDR1 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: i. GGS(I/F)(N/S)(S/A)(-/G)(-/G)(F/Y)YWS ; ii. GX27 X28 F X29 X30 Y X31 X32 X33, en el que X27 es un residuo de tirosina o un residuo de fenilalanina, X28 es un residuo de treonina o un residuo de serina, X29 es un residuo de treonina, un residuo de serina, o un residuo de isoleucina, X30 es un residuo de glicina o un residuo de serina, X31 es un residuo de tirosina, un residuo de glicina, o un residuo de triptófano, X32 es un residuo de isoleucina o un residuo de metionina, X33 es un residuo de histidina o un residuo de glicina; y iii. G(Y/F)TF(T/S)-(S/A)Y(G/W)(L/M/I)(S/H) (SEQ ID NO:140); d. una secuencia CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: i. (Y/E)I(S/Y/N)(Y/H)SG(S/G)T(Y/N)YNPSLK(S/R) (SEQ ID NO:142); ii. (V/N)/(K/W)(Y/Q)DGS(N/E/T)(K/E)Y(H/Y)(A/V)DSVKG; y iii. X60 I X61 X62 X63 X64 X65 X66 T X67 X68 X69 X70 X71 X72 Q G (SEQ ID NO:180), en el que X60 es un residuo de triptófano o un residuo de isoleucina, X61 es un residuo de asparagina, un residuo de isoleucina, un residuo de serina, o un residuo de tirosina, X62 es un residuo de prolina o un residuo de alanina, X63 es un residuo de asparagina, un residuo de tirosina, o un residuo de glicina, X64 es un residuo de serina, un residuo de asparagina, o un residuo de aspartato, X65 es un residuo de glicina o un residuo de serina, X66 es un residuo de glicina, un residuo de asparagina, o un residuo de aspartato, X67 es un residuo de asparagina o un residuo de arginina, X68 es un residuo de tirosina o un residuo de serina, X69 es un residuo de alanina o un residuo de serina, X70 es un residuo de glutamina o un residuo de prolina, X71 es un residuo de lisina o un residuo de serina, y X72 es un residuo de fenilalanina o un residuo de leucina, en el que los símbolos de los residuos de aminoácidos en paréntesis identifican residuos alternativos para la misma posición en una secuencia.

En determinados aspectos, la proteína de unión a antígeno aislada comprende una secuencia CDR3 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H14.

En aspectos adicionales, la proteína de unión a antígeno aislada comprende una secuencia CDR3 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de una adición, sustitución o deleción de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H14.

En aspectos más adicionales, la proteína de unión a antígeno aislada comprende una secuencia CDR3 de cadena pesada de H1-H14.

En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno aislada comprende dos secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de seis adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L14; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L14; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L14;

d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H14; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de cinco adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H14; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H14.

En un aspecto adicional, la proteína de unión a antígeno aislada comprende tres secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de seis adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L14; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L14; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L14; d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H14; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de cinco adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H14; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que se diferencia en

no más de un total de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H14.

En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno aislada comprende cuatro secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de seis adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L14; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L14; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L14; d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H14; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de cinco adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H14; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H14.

En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno aislada comprende cinco secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de seis adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L14; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L14; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L14; d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H14; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de cinco adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H14; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H14.

En un aspecto adicional más, la proteína de unión a antígeno aislada comprende: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de seis adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L14; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L14;

c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que se diferencia en no más de un total de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L14; d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H14; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de cinco adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H14; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que se diferencia en no más de un total de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H14.

En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno aislada comprende bien: a. un dominio variable de cadena ligera que comprende: i. una secuencia CDR1 de cadena ligera; ii. una secuencia CDR2 de cadena ligera; y iii. una secuencia CDR3 de cadena ligera; b. un dominio variable de cadena pesada que comprende: i. una secuencia CDR1 de cadena pesada; ii. una secuencia CDR2 de cadena pesada; y iii. una secuencia CDR3 de cadena pesada;

o c. el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b).

En una realización, la proteína de unión a antígeno aislada comprende una combinación de un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo de combinaciones que consiste en: L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, y L14H14.

En una realización, la proteína de unión a antígeno aislada comprende además: la secuencia constante de cadena ligera kappa de SEQ ID NO:84, 100 ó 108, y/o la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO:214, 215 ó

221.

En una realización, la proteína de unión a antígeno aislada, cuando se une a activina A: a. inhibe la activina A; b. compite de manera cruzada con un anticuerpo de referencia para la unión a activina A; c. se une al mismo epítopo de la activina A que dicho anticuerpo de referencia; d. se une a la activina A con sustancialmente la misma Kd que dicho anticuerpo de referencia; o e. se une a la activina A con sustancialmente la misma velocidad de disociación que dicho anticuerpo de referencia; en el que el anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionada del grupo de combinaciones que consiste en L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, y L14H14.

En una realización, la proteína de unión a antígeno aislada, cuando se une a la activina A humana, inhibe la unión de la activina A al receptor de activina A humano; atenúa la caquexia en ratones que portan tumor de colon; mejora la pérdida de peso corporal en ratones que portan tumor de colon; mejora la pérdida de peso corporal en un modelo

animal de artritis reumatoide inducida por colágeno; mejora la pérdida de masa muscular corporal en un modelo animal de artritis reumatoide inducida por colágeno; mejora la pérdida de masa grasa en un modelo animal de artritis reumatoide inducida por colágeno; y/o mejora la pérdida de peso corporal en un modelo animal con transfección de AAV-activina A.

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno aislada comprende: a. un anticuerpo humano; b. un anticuerpo humanizado; c. un anticuerpo quimérico; d. un anticuerpo monoclonal ; e. un anticuerpo policlonal; f. un anticuerpo recombinante; g. un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno; h. un anticuerpo de cadena única; i. un fragmento divalente; j. un fragmento trivalente; k. un fragmento tetravalente; 1. un fragmento Fab; un fragmento F(ab')2; n. un anticuerpo de dominio; o. un anticuerpo IgD; p. un anticuerpo IgE; q. un anticuerpo IgM; r. un anticuerpo IgG1; s. un anticuerpo IgG2; t. un anticuerpo IgG3; u. un anticuerpo IgG4; o v. un anticuerpo IgG4 que tiene al menos una mutación en una región bisagra que alivia una tendencia de formar enlaces disulfuro intracadena H.

También se proporciona una proteína de unión a antígeno humana específica para la activina A, en la que la proteína de unión a antígeno posee al menos una actividad biológica in vivo de un anticuerpo anti-activina A humana; tal como a atenuación de la caquexia.

Se proporciona además una proteína de unión a antígeno humana que mejora la pérdida de peso corporal en ratones que portan tumor de colon, o que mejora la pérdida de peso corporal en un modelo animal de artritis reumatoide inducida por colágeno.

También se proporciona una proteína de unión a antígeno humana que mejora la pérdida de masa muscular en un modelo animal de artritis reumatoide inducida por colágeno, que mejora la pérdida de masa grasa en un modelo animal de artritis reumatoide inducida por colágeno o que mejora la pérdida de peso corporal en un modelo animal con transfección de AAV-activina A.

Se proporciona además una proteína de unión a antígeno humana específica para la activina A, en el que la proteína de unión a antígeno inhibe la unión de la activina A al receptor de activina A in vitro.

También se proporciona una proteína de unión a antígeno humana específica para la activina A, en el que la proteína de unión a antígeno inhibe la unión de la activina A al receptor de activina A in vivo.

En otro aspecto, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera, la cadena pesada, o ambas, de una proteína de unión a antígeno de la invención; se describen además polinucleótidos que pueden comprender una secuencia de ácido nucleico del dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO:1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193 ó 209 y/o una secuencia de ácido nucleico del dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194 ó 210.

También se proporciona un plásmido que comprende el polinucleótido aislado; el plásmido puede ser un vector de expresión; y se proporciona una célula aislada que comprende el polinucleótido; la célula aislada puede ser un hibridoma, y la célula puede ser una célula CHO.

Se describe además un método para preparar una proteína de unión a antígeno que se une a la activina A humana, que comprende incubar la célula aislada en condiciones que la permitan expresar dicha proteína de unión a antígeno.

También se proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a antígeno de la invención, se describe un método para tratar una afección en un sujeto que comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica, en el que la afección se puede tratar reduciendo la actividad de la activina A en dicho sujeto; el sujeto puede ser un ser humano, y la afección puede ser caquexia asociada con un tumor, en el que el tumor es un tumor gonadal, tal como cáncer de ovario, hiperplasia benigna de la próstata, neoplasia intraepitelial de la próstata, o cáncer de próstata, o en el que el tumor es cáncer de vejiga, tumor de Wilm, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de huesos, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer del cuello uterino, sarcoma sinovial, tumores que secretan péptido vasoactivo intestinal, glioblastoma, meduloblastoma, cáncer de células escamosas de la cabeza y el cuello, cáncer oral, leucoplaquia oral, cáncer anal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de huesos, o cáncer metastásico; la afección puede ser caquexia asociada con una artritis reumatoide; o la afección puede ser la necesidad de disminuir la actividad de la activina A en un sujeto.

En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a los aminoácidos K13-Y39 de la activina A in vitro o in vivo. En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a los aminoácidos V82-N107 in vitro o in vivo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona el cambio en masa muscular para ratones con artritis inducida por colágeno tratados con anticuerpo anti-activina A A1.

La Figura 2 proporciona el cambio en masa grasa para ratones con artritis inducida por colágeno tratados con anticuerpo anti-activina A A1.

La Figura 3 proporciona datos que muestran que el tratamiento anti-activina A usando los anticuerpos A1, A2 y A3 previene la pérdida de peso corporal en ratones adultos jóvenes desnudos con un xenoinjerto intramuscular CHO/Activina.

La Figura 4 proporciona datos de RMN que muestran que el tratamiento anti-activina A previene la pérdida de masa magra corporal en ratones adultos jóvenes desnudos con un xenoinjerto intramuscular CHO/Activina.

La Figura 5 proporciona el efecto del anticuerpo anti-activina A A1 en los cambios en el peso corporal en ratones transducidos con AAV-activina A.

La Figura 6 proporciona la masa muscular del gastrocnemio en un modelo de caquexia de cáncer de Colon-26 en ratones CDF1 con y sin tratamiento con el anticuerpo anti-activina A A1, dieciocho días después de la inoculación del tumor.

La Figura 7 muestra un modelo de activina A, con la región de la unión del anticuerpo rodeada por un círculo. K21, K103 y X94 se refieren a los residuos de lisina en la posición 21 y 103, y un residuo de tirosina en la posición 94.

La Figura 8 es un gráfico que muestra las afinidades de unión de los anticuerpos A1, A2 y A3 según se determina usando KinExA. La constante de disociación en equilibrio se obtuvo a partir de la regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de unión homogéneo de un sitio con curva dual usando el software KinExA.

La Figura 9 muestra las regiones de epítopo que no estaban protegidas de degradación mediante la unión de los anticuerpos A1, A2 o A3.

La Figura 10 es un gráfico que muestra las afinidades de unión de los anticuerpos A1, A2, y A3 para activina A intacta (indicada por lote 55), así como activina A que está escindida en el residuo de tirosina en la posición de aminoácido número 94 (indicada por lote 38).

La Figura 11 es un gráfico que muestra las afinidades de unión de los anticuerpos A1, A2, y A3, así como dos anticuerpos disponibles comercialmente para la activina A o activina B en superficies con anticuerpo inmovilizado.

La Figura 12 muestra la unión de anticuerpo a quimeras activina A/activina B por el anticuerpo A1 y A2, así como dos anticuerpos disponibles comercialmente para la activina A.

La Figura 13 muestra las secuencias de aminoácidos de quimeras activina A/activina B utilizadas en el ensayo de anticuerpo descrito en la Figura 11.

La Figura 14 muestra la unión de varios anticuerpos, incluyendo A1, A2, y A3, a diferentes epítopos de la activina A; también se ensayaron dos anticuerpos disponibles comercialmente para la activina A.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a regiones de la activina A humana que contienen dominios de nudo de cisteína reconocidas por anticuerpos que también se unen a activina A de longitud completa, y/o una región de activina A que se superpone o engloba una región de nudo de cisteína, y a métodos para preparar y usar estos dominios de nudo de cisteína. La invención también proporciona agentes de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos, que se unen específicamente a activina A o partes de activina A. Los agentes de unión son útiles para bloquear o alterar la unión de activina A humana a uno o más ligandos.

La mortalidad por fallo cardiaco congestivo (CHF) está relacionada con caquexia. En un estudio (Anker, S. D. y Coats, A. J., Chest 115:836-847, 1999), el dieciséis por ciento de una población de pacientes ambulatorios CHF no seleccionada fue caquéctico. Este estado fue predictivo de pronóstico alterado independiente de la edad, clasificación funcional de la enfermedad, fracción de eyección ventricular izquierda, y pico de consumo de oxígeno. La mortalidad en el cohorte caquéctico fue cincuenta por ciento a los dieciocho meses.

Una ruta común en la progresión de la enfermedad en el cáncer, artritis reumatoide, fallo renal crónico, fallo cardiaco congestivo, y otras afecciones en las que la caquexia es un factor es la ruta de la activina A. El desgaste y la debilidad muscular son comunes en muchos estados patológicos y afecciones incluyendo envejecimiento, caquexia por cáncer, sepsis, desnervación, desuso, inactividad, quemaduras, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) por VIH, fallo renal o cardiaco crónico, falta de carga/microgravedad, y distrofias musculares. Las activinas e inhibinas son miembros de la superfamilia de TGF-beta. Las activinas e inhibinas funcionan como estimuladores e inhibidores, respectivamente, de la secreción y biosíntesis de la hormona pituitaria estimulante del folículo (FSH). La activina A es la forma predominante de activina. En biología de la reproducción, las activinas e inhibinas son reguladores importantes del ciclo ovárico y del proceso de ovulación, y pueden jugar un papel en el implante del embrión, y/o mantenimiento del embarazo. (O'Connor et al., Human Reproduction, V. 14, No. 3, 827-832, marzo 1999; Draper et al., Endocrin., V. 138, No. 7: 3042-3046; Jones, et al., Endocrin. V. 147, No. 2: 724-732, feb. 2006).

La identificación de inhibinas y activinas en una amplia variedad de tejidos sugiere que estos factores juegan papeles mucho más importantes que el control de la secreción de FSH.

Las activinas interaccionan con dos clases estructuralmente relacionadas de receptores quinasa de serina/treonina (tipo I y tipo II). La inhibina antagoniza la activina mediante la unión al proteoglicano, betaglicano, y la formación de un complejo estable con y secuestrando de esta manera los receptores de activina tipo II mientras excluye a los receptores de tipo I. Existen dos formas principales de activina: la activina A es un homodímero de subunidades βA y la activina B es un homodímero de subunidades βB. (Vale, et al., Recent Prog Horm Res V. 44: 1-34, 1988). Los heterodímeros de una subunidad α que es diferente a las dos subunidades β resultan en el antagonista funcional inhibina.

La bibliografía ha mostrado que la activina A se sobreexpresa y/o localiza en tejidos cancerosos. Por ejemplo, se encontraron niveles altos de activina A sérica en mujeres con carcinoma endometrial y de cuello uterino (Petraglia,

F. et al., Jour. Clin. Endocrin. Metab. 83:1194-1200, 1998). La activina A estaba sobreexpresada en cáncer colorrectal de estadio IV (Wildi, S. et al., Gut 49:409-417, 2001). Se indicó un papel de la activina A en el cáncer de ovario (Steller, M.D. et al., Mol. Cancer Res. 3:50-61, 2005).

La bibliografía también ha implicado a la activina A en la enfermedad renal. (Yamashita, S. et al. J. Am. Soc. Nephrol. 15:91-101, 2004.) Se indicaron niveles séricos de activina A inmunoreactiva en sujetos normales y pacientes con enfermedad por Harada, K. et al. en J. Clin. Endocrin. and Metab. 81:2125-2130, 1996. La activina A es un activador potente de los fibroblastos intersticiales renales (Harada, K. et al., J. Am. Soc. Nephrol. 15:91-101, 2004). La sobreexpresión glomerular de activina A está ligada a fibrosis en glomerulonefritis anti-Thy 1 (Gaedeke, J. et al., Neph. Dial. Transpl. 20:319-328, 2005).

Los niveles séricos de activina A en los pacientes con fallo cardiaco se incrementan según la gravedad de la enfermedad (Yndestal et al., Circulation 109:1379-1385, 2004). En un modelo de rata de fallo cardiaco, la activina A sérica se elevó inmediatamente después del infarto de miocardio y persistió durante seis meses, y la inmunotinción de la activina A se localizó sólo en los cardiomiocitos (Yndestad et al., 2004). Se indicaron niveles elevados de activina A en fallo cardiaco (Yndestad, A. et al., Circulation 109:1379-1385, 2004).

La presente descripción proporciona composiciones, kits, y métodos relacionados con moléculas que se unen a la activina A, incluyendo moléculas que agonizan o antagonizan la activina A, tales como anticuerpos anti-activina A, fragmentos de anticuerpo, y derivados de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpos anti-activina A antagonistas, fragmentos de anticuerpo, o derivados de anticuerpo. También se proporcionan composiciones, kits, y métodos relacionados con moléculas que se unen específicamente a una parte de la activina A, tales como aminoácidos R13-Y39, o aminoácidos V82-N107 de la activina A. Dichas moléculas pueden incluir anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y derivados de anticuerpo. También se proporcionan ácidos nucleicos, y derivados y fragmentos de éstos, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica todo o una parte de un polipéptido que se une a la activina A, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica todo o parte de un anticuerpo anti-activina A, fragmento de anticuerpo, variante de anticuerpo, o derivado de anticuerpo, plásmidos y vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos, y células o líneas celulares que comprenden dichos ácidos nucleicos y/o vectores y plásmidos. Los métodos proporcionados incluyen, por ejemplo, métodos para preparar, identificar, o aislar moléculas que se unen a la activina A, tales como anticuerpos anti-activina A, métodos para determinar si una molécula se une a la activina A, métodos para preparar las composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden una molécula que se une a la activina A, y métodos para administrar una molécula que se une a la activina A a un sujeto, por ejemplo, métodos para tratar una afección mediada por la activina A, y para modular una actividad biológica de la activina A in vivo o in vitro.

Las secuencias de polinucleótido y polipéptido se indican usando abreviaturas estándar de una o tres letras. A no ser que se indique otra cosa, las secuencias de polipéptido tienen su extremo amino a la izquierda y su extremo carboxi a la derecha, y secuencias de ácido nucleico monocatenarias, y la cadena superior de las secuencias de ácido nucleico bicatenarias, tienen sus extremos 5' a la izquierda y sus extremos 3' a la derecha. Una secuencia particular de polipéptido o polinucleótido también puede describirse explicando cómo se diferencia de una secuencia de referencia. A no ser que se indique otra cosa, se entiende que las secuencias de polinucleótido y polipéptido incluyen cada ácido nucleico o aminoácido listado, respectivamente, así como los ácidos nucleicos o aminoácidos que intervienen. Por ejemplo, la secuencia de polipéptido R13-Y39 muestra una secuencia de polipéptido que incluye los aminoácidos R13, y Y39, así como los aminoácidos que se encuentran entre R13 y Y39 en la secuencia de polipéptido. Correspondientemente, la secuencia de polinucleótido C1-T5 muestra una secuencia de polinucleótido que incluye los ácidos nucleicos C1, y T5, así como los ácidos nucleicos en las posiciones 2, 3, y 4 de la secuencia. De acuerdo con esto, las designaciones de SEQ ID NO: 1-5 designan asimismo el grupo inclusivo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5. Finalmente, también se pretende que las agrupaciones de aminoácidos sean inclusivas, a no ser que se designe otra cosa. Por ejemplo, la expresión "aminoácidos 1-5 de SEQ ID NO: 28" incluye los aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 4, y 5 de SEQ ID NO: 28.

Las secuencias de polinucleótido y polipéptido de dominios variables de cadena ligera y pesada particulares se muestran más adelante. Los anticuerpos que comprenden una cadena ligera y cadena pesada se designan combinando el nombre de los dominios variables de la cadena ligera y del de los de la cadena pesada. Por ejemplo,

"L4H7," indica un anticuerpo que comprende el dominio variable de cadena ligera de L4 y el dominio variable de cadena pesada de H7.

Las secuencias constantes de cadena ligera kappa se muestran en SEQ ID NO:84, 100 y 108, y las secuencias constantes de cadena pesada se muestran en SEQ ID NO:214, 215 y 221. Los polinucleótidos que codifican estas secuencias se muestran, para las cadenas ligeras, respectivamente, en SEQ ID NO:222, 223 y 239, y para las cadenas pesadas, respectivamente, en SEQ ID NO:240, 241, y 242. Así, además de las secuencias variables como se describe en la presente memoria, un anticuerpo puede comprender una o ambas de SEQ ID NO:84 y 214; o SEQ ID NO:215 y 223; o SEQ ID NO:108 y 221.

Un anticuerpo puede comprender una cadena pesada o ligera específica, mientras el dominio variable de cadena ligera o pesada complementario no se especifica. En particular, determinadas realizaciones en la presente memoria incluyen anticuerpos que se unen a un antígeno específico (tal como activina A) mediante una cadena ligera o pesada específica, de manera que la cadena pesada o ligera complementaria puede ser promiscua, o incluso irrelevante, pero puede determinarse, por ejemplo, cribando bibliotecas combinatorias. Portolano et al., J. Immunol.

V. 150 (3), p. 880-887 (1993); Clackson et al., Nature v. 352 p. 624-628 (1991).

A no ser que se defina otra cosa en la presente memoria, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Además, a no ser que el contexto requiera otra cosa, los términos singulares incluirán los plurales y los términos plurales incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas en conexión con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en la presente memoria son muy conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente invención se llevan a cabo generalmente según métodos convencionales muy conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente especificación a no ser que se indique otra cosa. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se llevan a cabo según las especificaciones del fabricante, como se consigue comúnmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. La terminología usada en conexión con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritos en la presente memoria son los muy conocidos y usados comúnmente en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para las síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y administración, y tratamiento de pacientes.

Debe entenderse que los términos siguientes, a no ser que se indique otra cosa, tienen los significados siguientes:

El término "molécula aislada" (en el que la molécula, es por ejemplo, un polipéptido, un polinucleótido, o un anticuerpo) es una molécula que gracias a su origen o fuente de obtención (1) no está asociada con componentes con los que está naturalmente asociada que la acompañan en su estado nativo, (2) carece sustancialmente de otras moléculas de la misma especie (3) es expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no aparece en la naturaleza. Así, una molécula que se sintetiza químicamente, o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que se origina naturalmente, estará "aislada" de los componentes con los que está asociada naturalmente. También puede conseguirse que una molécula carezca sustancialmente de componentes con los que está asociada naturalmente por aislamiento, usando técnicas de purificación muy conocidas en la técnica. La pureza u homogeneidad de la molécula puede ensayarse mediante varios medios muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, la pureza de una muestra de polipéptido puede ensayarse usando electroforesis en gel de poliacrilamida y tiñendo el gen para visualizar el polipéptido usando técnicas muy conocidas en la técnica. Para determinados propósitos, puede proporcionarse una resolución mayor usando HPLC u otros medios muy conocidos en la técnica para la purificación.

Los términos "inhibidor de activina A" y "antagonista de activina A" se usan indistintamente. Cada uno es una molécula que inhibe de forma detectable al menos una función de la activina A. A la inversa, un "agonista de activina A" es una molécula que incrementa de forma detectable al menos una función de la activina A. La inhibición causada por un inhibidor de la activina A no necesita ser completa siempre que sea detectable usando un ensayo. Puede usarse cualquier ensayo de una función de la activina A, ejemplos de los cuales se proporcionan en la presente memoria. Los ejemplos de funciones de la activina A que pueden inhibirse por un inhibidor de la activina A, o incrementarse por un agonista de la activina A, incluyen unión a activina A. Los ejemplos de tipos de inhibidores de activina A y agonistas de activina A incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos de unión a activina A tales como proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, proteínas de unión a antígeno que inhiben la activina A), anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y derivados de anticuerpo.

Los términos "péptido," "polipéptido" y "proteína" se refieren cada uno a una molécula que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Estos términos engloban, por ejemplo, proteínas nativas y artificiales, fragmentos de proteína y análogos de polipéptido (tales como muteínas, variantes, y proteínas de fusión) de una secuencia de proteína así como proteínas modificadas después de la traducción, o modificadas de

otra forma covalentemente o no covalentemente. Un péptido, polipéptido, o proteína puede ser monomérico o polimérico.

El término "fragmento de polipéptido" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino terminal y/o carboxi terminal comparado con una proteína correspondiente de longitud completa. Los fragmentos pueden tener, por ejemplo, una longitud de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos. Los fragmentos también pueden tener, por ejemplo, una longitud de como máximo 1.000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11, ó 10 aminoácidos. Un fragmento puede comprender además, en uno o ambos de sus extremos, uno o más aminoácidos adicionales, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de una proteína diferente natural (por ejemplo, un dominio Fc o de cremallera de leucina) o una secuencia de aminoácidos artificial (por ejemplo, una secuencia conectora artificial).

Los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos que se han modificado de cualquier forma por cualquier razón, por ejemplo, para: (1) reducir la susceptibilidad a proteolisis, (2) reducir la susceptibilidad a oxidación, (3) alterar la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alterar las afinidades de unión, y (4) conferir o modificar otras propiedades fisicoquímicas o funcionales. Los análogos incluyen muteínas de un polipéptido. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples (por ejemplo, sustituciones conservativas de aminoácidos) en la secuencia natural (por ejemplo, en la parte del polipéptido que está fuera del o de los dominios que forman contactos intermoleculares). Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es una que no cambia sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que aparece en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan a la secuencia parental o que son necesarias para su funcionalidad). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature

354:105 (1991).

Una "variante" de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácidos se insertan en, se delecionan de y/o se sustituyen en la secuencia de aminoácidos respecto a la secuencia del polipéptido nativo, y retiene esencialmente la misma actividad biológica que el polipéptido nativo. La actividad biológica del polipéptido puede medirse usando técnicas estándar en la técnica (por ejemplo, si la variante es un anticuerpo, su actividad puede ensayarse mediante ensayos de unión, como se describe en la presente memoria). Las variantes de la invención incluyen fragmentos, análogos, polipéptidos recombinantes, polipéptidos sintéticos, y/o proteínas de fusión. Un "derivado" de un polipéptido es un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que se ha modificado químicamente, por ejemplo mediante conjugación con otro resto químico tal como, por ejemplo, polietilen glicol, albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano), fosforilación, y glicosilación. A no ser que se indique otra cosa, el término "anticuerpo" incluye, además de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos, y muteínas de éstos, ejemplos de los cuales se describen más adelante.

Una "proteína de unión a antígeno" es una proteína que comprende una parte que se une a un antígeno y, opcionalmente, una parte de soporte o marco que permite a la parte de unión a antígeno adoptar una conformación que estimula la unión de la proteína de unión a antígeno al antígeno. Los ejemplos de proteínas de unión a antígeno incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, una parte de unión a antígeno de un anticuerpo), derivados de anticuerpo, y análogos de anticuerpo. La proteína de unión a antígeno puede comprender, por ejemplo, un soporte de proteína alternativo o soporte artificial con CDR o derivados de CDR injertados. Dichos soportes incluyen, pero no están limitados a, soportes derivados de anticuerpos que comprenden mutaciones introducidas, por ejemplo, para estabilizar la estructura tridimensional de la proteína de unión a antígeno así como soportes completamente sintéticos que comprenden, por ejemplo, un polímero biocompatible. Véase, por ejemplo, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volumen 53, Ejemplar 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654. Además, pueden usarse miméticos peptídicos de anticuerpo ("PAM"), así como soportes basados en miméticos de anticuerpo que utilizan componentes de fibronectina como un soporte.

Una proteína de unión a antígeno puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina natural. Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina natural, cada tetrámero está compuesto por dos parejas idénticas de cadenas de polipéptido, teniendo cada pareja una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsable principalmente del reconocimiento del antígeno. La parte carboxi terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alpha, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. En las cadenas ligera y pesada, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, generalmente, Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada pareja cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo de manera que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión.

Las cadenas de inmunoglobulina naturales presentan la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Desde el extremo N al extremo C, tanto las cadenas ligeras como pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicación no. 91-3242, 1991.

Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una parte de unión a antígeno de ésta que compite con el anticuerpo intacto para la unión específica, a no ser que se especifique otra cosa. Las partes de unión a antígeno pueden producirse por técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las partes de unión a antígeno incluyen, entre otras, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio (dAb), y fragmentos de región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena única (scFv), anticuerpos quiméricos, fragmentos divalentes, fragmentos trivalentes, fragmentos tetravalentes, y polipéptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión específica a antígeno al polipéptido.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CHl; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd tiene los dominios VH y CH1; un fragmento Fv tiene los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb tiene un dominio VH , un dominio VL , o un fragmento de unión a antígeno de un dominio VH o VL (Pat. US No. 6.846.634, 6.696.245, Pub. Solic. US No. 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward et al., Nature 341:544-546, 1989).

Un anticuerpo de cadena única (scFv) es un anticuerpo en el que una región VL y una VH están unidas a través de un conector (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácidos) para formar una cadena de proteína continua en la que el conector es lo suficientemente largo para permitir que la cadena de proteína se pliegue sobre sí misma y formar un sitio de unión a antígeno monovalente (véase, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science 242:42326 y Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83). Los fragmentos bivalentes son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas de polipéptido, en el que cada cadena de polipéptido comprende dominios VH y VL unidos por un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo así que cada dominio se empareje con un dominio complementario en otra cadena de polipéptido (véase, por ejemplo, Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, y Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-23). Si dos cadenas de polipéptido de un fragmento bivalente son idénticas, entonces el fragmento bivalente que resulta de su emparejamiento tendrá dos sitios de unión a antígeno idénticos. Las cadenas de polipéptido que tienen diferentes secuencias pueden usarse para preparar un fragmento divalente con dos sitios de unión a antígeno diferentes. De manera similar, los fragmentos trivalentes y fragmentos tetravalentes son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas de polipéptido, respectivamente, y forman tres y cuatro sitios de unión a antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.

Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y las regiones marco (FR) de un anticuerpo dado pueden identificarse usando el sistema descrito por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicación no. 91-3242, 1991. Una o más CDR pueden incorporarse en una molécula bien covalentemente o no covalentemente para hacer que sea una proteína de unión a antígeno. Una proteína de unión a antígeno puede incorporar la(s) CDR como parte de una cadena de polipéptido mayor, puede unir covalentemente la(s) CDR a otra cadena de polipéptido, o puede incorporar la(s) CDR(s) no covalentemente. Las CDR permiten que la proteína de unión a antígeno se una específicamente a un antígeno particular de interés.

Una proteína de unión a antígeno puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana natural típicamente tiene dos sitios de unión idénticos, mientras un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes.

El término "anticuerpo humano," también referido como "anticuerpo completamente humano," incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humanas. En una realización, todos los dominios variables y constantes se obtienen de secuencias de inmunoglobulina humanas (un anticuerpo completamente humano). Estos anticuerpos pueden prepararse de varias formas, ejemplos de las cuales se describen más adelante, incluyendo mediante la inmunización con un antígeno de interés un ratón que está genéticamente modificado para expresar los anticuerpos derivados de genes que codifican cadenas pesadas y/o ligeras humanas.

Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que se diferencia de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana en una o más sustituciones, deleciones, y/o adiciones de aminoácidos, de manera que es menos probable que el anticuerpo humanizado induzca una respuesta inmune, y/o induce una respuesta inmune menos grave, comparado con el anticuerpo de especie no humana, cuando se administra a un sujeto humano. En una realización, determinados aminoácidos en los dominios marco y constantes de las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo de especie no humana se mutan para producir el anticuerpo humanizado. En otra realización, el o los

dominios constantes de un anticuerpo humano se fusionan con el o los dominios variables de una especie no humana. En otra realización, uno o más residuos de aminoácidos en una o más secuencias CDR de un anticuerpo no humano se cambian para reducir la inmunogenicidad probable del anticuerpo no humano cuando se administra a un sujeto humano, en el que los residuos de aminoácidos cambiados bien no son críticos para la unión inmunoespecífica del anticuerpo a su antígeno, o los cambios que se hacen en la secuencia de aminoácidos son cambios conservativos, de manera que la unión del anticuerpo humanizado al antígeno no es significativamente peor que la unión del anticuerpo no humano al antígeno. Los ejemplos de cómo preparar anticuerpos humanizados pueden encontrarse en las Pat. U.S. Nos. 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una

o más regiones de uno o más anticuerpos diferentes. En una realización, una o más CDR se obtienen de un anticuerpo anti-activina A humano. En otra realización, todas las CDR se obtienen de un anticuerpo anti-activina A humano. En otra realización, las CDR de más de un anticuerpo anti-activina A humano se mezclan y emparejan en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo anti-activina A humano, una CDR2 y una CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo anti-activina A humano, y las CDR de la cadena pesada de un tercer anticuerpo anti-activina A. Además, las regiones marco pueden obtenerse de uno de los mismos anticuerpos anti-activina A, de uno o más anticuerpos diferentes, tales como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. En un ejemplo de un anticuerpo quimérico, una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica, homóloga a, o derivada de un anticuerpo de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras el resto de la(s) cadena(s) es idéntico a, homólogo a, o derivado de un(os) anticuerpo(s) de otra especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo. También se incluyen fragmentos de dichos anticuerpos que presentan la actividad biológica deseada (es decir, la capacidad de unirse específicamente a activina A).

Los fragmentos o análogos de anticuerpos pueden prepararse fácilmente por los expertos en la técnica según las enseñanzas de esta especificación y usando técnicas muy conocidas en la técnica. Los extremos amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos aparecen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por comparación con los datos de secuencia de nucleótido y/o aminoácido de bases de datos de secuencias públicas o patentadas. Pueden usarse métodos de comparación informatizados para identificar restos de secuencia o dominios de conformación de proteína predichos que aparecen en otras proteínas con estructura y/o función conocida. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteína que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Véase, por ejemplo, Bowie et al., 1991, Science 253:164.

Además, los anticuerpos específicos de antígeno (es decir, específicos de activina A) pueden producirse por métodos conocidos en la técnica usando un dominio VL o VH específico para cribar una biblioteca del dominio variable complementario. Dichos métodos para producir anticuerpos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse fragmentos de anticuerpo fusionados con otra proteína, tal como una proteína de cubierta menor, para enriquecer fagos con antígeno. Después, usando una biblioteca combinatoria aleatoria de cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) reorganizadas de ratones inmunes al antígeno (por ejemplo, activina A), se presentan diversas bibliotecas de fragmentos de anticuerpo en la superficie del fago. Estas bibliotecas pueden cribarse para dominios variables complementarios, y los dominios pueden purificarse, por ejemplo, por columna de afinidad. Véase, Clackson et al., Nature, V. 352 p. 624-628 (1991).

En otro ejemplo, pueden usarse cadenas VL o VH individuales de un anticuerpo (es decir, anticuerpo para activina A) para buscar otras cadenas VH o VL que podrían formar fragmentos de unión a antígeno (o Fab), con la misma especificidad. Así, pueden expresarse combinaciones aleatorias de genes de Ig de cadenas VH y VL como fragmentos de unión a antígeno en una biblioteca de bacteriófagos (tal como fago fd o lambda). Por ejemplo, puede generarse una biblioteca combinatoria utilizando la biblioteca de cadena VL o VH parental combinada con bibliotecas de cadena VL o VH de unión específica a antígeno, respectivamente. Las bibliotecas combinatorias pueden cribarse por técnicas convencionales, por ejemplo, usando una sonda marcada radiactivamente (tal como activina A marcada radiactivamente). Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. V. 150 (3) p. 880-887 (1993).

Un "anticuerpo injertado con CDR" es un anticuerpo que comprende una o más CDR derivadas de un anticuerpo de una especie o isotipo particular y el marco de otro anticuerpo de la misma especie o isotipo o diferente.

Un "anticuerpo multi-específico" es un anticuerpo que reconoce más de un epítopo en uno o más antígenos. Una subclase de este tipo de anticuerpo es un "anticuerpo bi-específico" que reconoce dos epítopos distintos en el mismo

o en diferentes antígenos.

Un "dominio de unión a antígeno," "región de unión a antígeno," o "sitio de unión a antígeno" es una parte de una proteína de unión a antígeno que contiene residuos de aminoácidos (u otros restos) que interaccionan con un antígeno y contribuyen a la especificidad y afinidad de la proteína de unión a antígeno para el antígeno. Para un anticuerpo que se une específicamente a su antígeno, esto incluirá al menos parte de al menos uno de sus dominios CDR.

Un "epítopo" es la parte de una molécula a la que se une una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo). Un epítopo puede comprender partes no contiguas de la molécula (por ejemplo, en un polipéptido,

residuos de aminoácidos que no son contiguos en la secuencia primaria del polipéptido pero que, en el contexto de la estructura terciaria y cuaternaria del polipéptido, están lo suficientemente cerca entre sí como para unirse a una proteína de unión a antígeno), e incluye los aminoácidos finales de la secuencia listados. Por ejemplo, la secuencia de polipéptido R13-Y39 incluye los aminoácidos R13, y Y39, así como los aminoácidos encontrados entre R13 y Y39 en la secuencia. En realizaciones en las que el epítopo comprende partes no contiguas de una molécula, las secuencias se indicarán de acuerdo con esto

El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de polinucleótido o dos secuencias de polipéptido se determina comparando las secuencias usando el programa informático GAP (una parte del GCG Wisconsin Package, versión

10.3 (Accelrys, San Diego, CA)) usando sus parámetros por defecto.

Los términos "polinucleótido," "oligonucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente en este documento e incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm), análogos de ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos y análogos de nucleótidos no naturales), e híbridos de éstos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria

o bicatenaria. En una realización, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden un marco de lectura abierto contiguo que codifica un anticuerpo, o un fragmento, derivado, muteína, o variante de éste, de la invención.

Dos polinucleótidos monocatenarios son "el complemento" uno de otro si sus secuencia pueden alinearse en una orientación anti-paralela de manera que cada nucleótido en un polinucleótido es opuesto a su nucleótido complementario en el otro polinucleótido, sin la introducción de huecos, y sin nucleótidos no emparejados en el extremo 5' o el 3' de las secuencias. Un polinucleótido es "complementario" a otro polinucleótido si los dos polinucleótidos pueden hibridar entre sí en condiciones moderadamente astringentes. Así, un polinucleótido puede ser complementario a otro polinucleótido sin ser su complemento.

Un "vector" es un ácido nucleico que puede usarse para introducir otro ácido nucleico unido a él en una célula. Un tipo de vector es un "plásmido," que se refiere a una molécula de ADN bicatenaria lineal o circular en la que pueden ligarse segmentos adicionales de ácido nucleico. Otro tipo de vector es un vector viral (por ejemplo, retrovirus con replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados), en los que pueden introducirse segmentos adicionales de ADN en el genoma viral. Determinados vectores son capaces de replicarse autónomamente en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que comprende un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped después de la introducción en la célula huésped, y de esta manera se replican junto con el genoma huésped. Un "vector de expresión" es un tipo de vector que puede dirigir la expresión de un polinucleótido elegido.

Una secuencia de nucleótidos está "unida de manera operativa" a una secuencia reguladora si la secuencia reguladora influye en la expresión (por ejemplo, el nivel, momento, o localización de la expresión) de la secuencia de nucleótidos. Una "secuencia reguladora" es un ácido nucleico que influye en la expresión (por ejemplo, el nivel, momento, o localización de la expresión) de un ácido nucleico al que está unido de manera operativa. La secuencia reguladora puede, por ejemplo, ejercer sus efectos directamente sobre el ácido nucleico regulado, o a través de la acción de una o más moléculas diferentes (por ejemplo, polipéptidos que se unen a la secuencia reguladora y/o el ácido nucleico). Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Los ejemplos adicionales de secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA y Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06.

Una "célula huésped" es una célula que puede usarse para expresar un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico de la invención. Una célula huésped puede ser un procariota, por ejemplo, E. coli, o puede ser un eucariota, por ejemplo, un eucariota unicelular (por ejemplo, una levadura u otro hongo), una célula de planta (por ejemplo, una célula de planta de tabaco o tomate), una célula animal (por ejemplo, una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón, o una célula de insecto) o un hibridoma. El Ejemplo 3 de la presente memoria describe el uso de células CS-9. Los ejemplos de otras células huésped incluyen la línea COS7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (véase Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO) o sus derivados tales como CHO Veggie y líneas celulares relacionadas que crecen en medio sin suero (véase Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31), células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) (véase McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821), células de riñón embrionario humano tales como 293, 293 EBNA o MSR 293, células epidérmicas humanas A431, células humanas Colo205, otras líneas celulares de primates transformadas, células diploides normales, cepas celulares derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HL-60, U937, HaK o Jurkat. Típicamente, una célula huésped es una célula cultivada que puede transformarse o transfectarse con un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que puede expresarse en la célula huésped. La expresión "célula huésped recombinante" puede usarse para indicar una célula huésped que se ha transformado o transfectado con un ácido nucleico que se va a expresar. Una célula huésped también puede ser una célula que comprende el ácido nucleico pero no lo expresa a un nivel deseado a no ser que se introduzca una secuencia reguladora en la célula huésped de manera que se encuentra unida de manera operativa con el ácido nucleico. Se entiende que el término célula huésped se refiere no sólo a la

célula objeto particular sino a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Como pueden aparecer determinadas modificaciones en las generaciones sucesivas debido, por ejemplo, a mutación o influencia del entorno, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero aún así está incluida en el alcance del término tal y como se usa en la presente memoria.

Proteínas de unión a antígeno

En un aspecto, la presente invención proporciona proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpo, muteínas de anticuerpo, y variantes de anticuerpo), que se unen a activina A, por ejemplo, activina A humana, según la reivindicación 1.

Las proteínas de unión a antígeno según la presente invención incluyen proteínas de unión a antígeno que inhiben una actividad biológica de activina A. Por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno pueden atenuar la caquexia, y esta actividad puede estar presente cuando la proteína de unión a antígeno es completamente humana, tal como un anticuerpo completamente humano.

Diferentes proteínas de unión a antígeno pueden unirse a diferentes dominios o dominios de nudo de cisteína de activina A o actuar por diferentes mecanismos de acción. Los ejemplos incluyen pero no están limitados a proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a uno o más dominios de nudo de cisteína particulares, o regiones interpuestas entre enlaces disulfuro, incluyendo regiones que abarcan de aproximadamente los aminoácidos 4-12, aminoácidos 11-81, aminoácidos 11-33, aminoácidos 13-39, aminoácidos 40-113, aminoácidos 44-115, aminoácidos 81-111, y/o aminoácidos 82-107 de SEQ ID NO:1. Como se indica en la presente memoria, entre otros, la región de dominio se designan de manera que son inclusivas del grupo, a no ser que se indique otra cosa. Por ejemplo, los aminoácidos 4-12 se refiere a nueve aminoácidos: aminoácidos en las posiciones 4, y 12, así como los siete aminoácidos que intervienen en la secuencia. Otros ejemplos incluyen proteínas de unión a antígeno que inhiben la unión de la activina A a su receptor. Una proteína de unión a antígeno no necesita inhibir completamente una actividad inducida por la activina A para encontrar uso en la presente invención; en lugar de esto, las proteínas de unión a antígeno que reducen una actividad particular de la activina A también están contempladas para usarse. (Las discusiones en la presente memoria de mecanismos particulares de acción para las proteínas de unión a antígeno que se unen a la activina A para tratar enfermedades particulares son sólo ilustrativas, y los métodos presentados en la presente memoria no están forzados de esta manera.)

En otro aspecto, la presente descripción proporciona proteínas de unión a antígeno que comprenden una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en A1-A14 o una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en A1-A14, y fragmentos, derivados, muteínas, y variantes de éstas. Dicha proteína de unión a antígeno puede indicarse usando la nomenclatura "LxHy", en la que "x" corresponde al número de la región variable de cadena ligera e "y" corresponde al número de la región variable de cadena pesada como están marcados en las secuencias siguientes. Es decir, por ejemplo, que "A1HC" indica la región variable de cadena pesada del anticuerpo A1; "A1LC" indica la región variable de cadena ligera del anticuerpo A1, y así sucesivamente. Hablando más generalmente, "L2H1" se refiere a una proteína de unión a antígeno con una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de L2 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de H1. Para claridad, todos los intervalos indicados por al menos dos miembros de un grupo incluyen todos los miembros del grupo entre e incluyendo los miembros de los extremos del intervalo. Así, el intervalo de grupo A1-A14, incluye todos los miembros entre A1 y A14, así como los miembros A1 y A14 en sí mismos. El intervalo de grupo A4-A6 incluye los miembros A4, A5, y A6, etc.

También se muestran más adelante las localizaciones de las CDR, o Regiones Determinantes de la Complementariedad (sombreado y subrayado) que crean parte del sitio de unión a antígeno, mientras las Regiones Marco (FR) son los segmentos que intervienen de estas secuencias de dominio variable. Tanto en las regiones variables de cadena ligera como las regiones variables de cadena pesada hay tres CDR (CDR 1-3) y cuatro FR (FR 1-4). Las regiones CDR de cada cadena ligera y pesada también se agrupan por tipo de anticuerpo (A1, A2, A3, etc.). Las proteínas de unión a antígeno según se describe incluyen, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno que tienen una combinación de dominios variables de cadena ligera y cadena pesada seleccionados del grupo de combinaciones que consiste en L1H1 (anticuerpo A1), L2H2 (anticuerpo A2), L3H3 (anticuerpo A3), L4H4 (anticuerpo A4), L5H5 (anticuerpo A5), L6H6 (anticuerpo A6), L7H7 (anticuerpo A7), L8H8 (anticuerpo A8), L9H9 (anticuerpo A9), L10H10 (anticuerpo A10), L11H11 (anticuerpo A11), L12H12 (anticuerpo A12), L13H13 (anticuerpo A13), y L14H14 (anticuerpo A14).

Polinucleótidos de región variable de cadena pesada y ligera de los anticuerpos A1-A14 (también referidos en la presente memoria como H1-H14 y L1-L14.

A1 HC

A1 LC

A2 HC

A2LC

10 A3 HC

A3 LC

A4HC

A4 LC

A5 HC

A5 LC

10 A6 HC

A6LC

A7 HC

A7 LC

A8 HC

10 A8 LC

A9 HC

A9 LC

A10 HC

A10 LC

A11 HC

10 A11 LC

A12 HL

A12 LC

A13 HC

A13 LC

A14 HC

10 A14 LC

Secuencias de aminoácidos de los anticuerpos A1-A14, regiones variables de cadena ligera. Las regiones CDR están sombreadas y subrayadas; los segmentos o regiones que intervienen se refieren como marco (FR) en la presente memoria.

Anticuerpos A1-A14, secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada. Las regiones CDR están sombreadas y subrayadas, las demás regiones se refieren como marco (FR) en la presente memoria.

Secuencias CDR consenso para los Anticuerpos A1-A14.

Cadena Ligera

Secuencia CDR1

L4

R S S Q S L L H S T G Y N -Y L D

L5, L8

K S S Q S I L Y S S N N K K Y L V (SEQ ID NO:75)

CONSENSO:

X1S S Q S X2 L X3 S X4 X5 X6 X7 X8 Y L X9 (SEQ ID NO:115)

X1 es un residuo de arginina o un residuo de lisina, X2 es un residuo de leucina o un residuo de isoleucina, X3 es un residuo de histidina o un residuo de tirosina, X4 es un residuo de treonina o un residuo de serina, X5 es un residuo de glicina o un residuo de asparagina, X6 es un residuo de tirosina o un residuo de asparagina, X7 es un residuo de asparagina o un residuo de lisina, X8 es un residuo de lisina o ningún residuo, X9 es un residuo de aspartato o un residuo de valina

L2, L9

R A S Q G I R N N L G (SEQ ID NO:27)

L3, L12

R A S Q G I R N D L G (SEQ ID NO:43)

L6

R A S Q S I S N Y L N (SEQ ID NO:91)

L7

R A G Q G I R N D L V (SEQ ID NO:107)

CONSENSO:

R A X10 Q X11 I X12 N X13 L X14 (SEQ ID NO:116)

X10 es un residuo de serina o un residuo de glicina, X11 es un residuo de serina o un residuo de glicina,

X12 es un residuo de serina o un residuo de arginina, X13 es un residuo de tirosina, un residuo de aspartato, o un residuo de asparagina X14 es un residuo de aspartato, un residuo de valina, o un residuo de glicina

L1

S G D K L G D K Y A C (SEQ ID NO:11)

L10

S G E K W G E K Y A C (SEQ ID NO:155)

L11

S G D K L G D K F A F (SEQ ID NO:171)

L13

S G D K L G D K Y V C (SEQ ID NO:203)

L14

S G D K L G D K Y A F (SEQ ID NO:219)

CONSENSO:

S G X15 KX16 G X17 KX18X19X20 (SEQ ID NO:123)

X15 es un residuo de glutamato o un residuo de aspartato, X16 es un residuo de triptófano o un residuo de leucina, X17 es un residuo de glutamato o un residuo de aspartato, X18 es un residuo de tirosina o un residuo de fenilalanina, X19 es un residuo de alanina o un residuo de valina, X20 es un residuo de cisteína o un residuo de fenilalanina

Cadena Ligera

Secuencia CDR2

L2

A T S S L Q S (SEQ ID NO:92)

L3, L6, L7, L9, L12

A A S S L Q S (SEQ ID NO:44)

L5, L8

W T S M R E S (SEQ ID NO:76)

L4

L G S F R A S

CONSENSO:

X40X41SX42X43X44S (SEQ ID NO:124)

X40 es un residuo de alanina, un residuo de triptófano, o un residuo de leucina, X41 es un residuo de treonina, un residuo de alanina, o un residuo de glicina, X42 es un residuo de serina, un residuo de metionina, o un residuo de fenilalanina, X43 es un residuo de leucina o un residuo de arginina, X44 es un residuo de glutamina, un residuo de un residuo de glutamato, o un residuo de alanina

L10

Q D T K R P S (SEQ ID NO:156)

L11

Q D N K R P S (SEQ ID NO:172)

L1

Q D S K R P S (SEQ ID NO:12)

L13

L D N K R P S (SEQ ID NO:204)

L14

H D T K R P S (SEQ ID NO:220)

CONSENSO:

X45 D X46 K R P S (SEQ ID NO:128)

X45 es un residuo de glutamina, un residuo de leucina, o un residuo de histidina, X46 es un residuo de treonina, un residuo de asparagina, o un residuo de serina

Cadena Ligera

Secuencia CDR3

L1

Q A W D S S T A V (SEQ ID NO:13)

L10

Q A W D R S T -V (SEQ ID NO:157)

L11

Q A W D S S T V V (SEQ ID NO:173)

L13, L14

Q A W D S S T V -(SEQ ID NO:205)

L2

L Q H N S Y P W T (SEQ ID NO:29)

L7

L Q H N T Y P F T (SEQ ID NO:109)

L9

L Q H N S Y P W T (SEQ ID NO:141)

L12

L Q H N S Y T W T (SEQ ID NO:189)

CONSENSO:

L Q H N X89 Y X82 X83 T (SEQ ID NO:131)

X81 es un residuo de treonina o un residuo de serina, X82 es un residuo de prolina o un residuo de treonina, X83 es un residuo de fenilalanina o un residuo de triptófano

L3

R Q Q N T Y P L T (SEQ ID NO:45)

L4

M Q A L Q T P C S

L5

Q Q Y Y S T P W T (SEQ ID NO:77)

L6

Q Q S Y S I S P T (SEQ ID NO:93)

L8

Q Q Y Y S T P W T (SEQ ID NO:125)

CONSENSO:

X733X74X75X76X77X78X79X80 (SEQ ID NO:132)

X73 es un residuo de metionina, un residuo de glutamina, o un residuo de arginina, X74 es un residuo de alanina, un residuo de tirosina, un residuo de glutamina, o un residuo de serina, X75 es un residuo de leucina, un residuo de tirosina, o un residuo de asparagina, X76 es un residuo de glutamina, un residuo de serina, o un residuo de treonina, X77 es un residuo de treonina, un residuo de tirosina, o un residuo de isoleucina, X78 es un residuo de prolina o un residuo de serina,

X79 es un residuo de cisteína, un residuo de triptófano, un residuo de leucina, o un residuo de prolina, X80 es un residuo de serina o un residuo de treonina

Cadena Pesada

Secuencia CDR1

H5

G G S I N S --F Y W S (SEQ ID NO:78)

H6

G G S F S A --Y Y W S (SEQ ID NO:94)

H8

G G S I N S --F Y W S (SEQ ID NO:126)

H11

G G S I S S G G Y Y W S (SEQ ID NO:174)

CONSENSO:

G G SX21X22X23X24X25X26YW S

X21 es un residuo de isoleucina o un residuo de fenilalanina X22 es un residuo de asparagina o un residuo de serina X23 es un residuo de serina o un residuo de alanina X24 es un residuo de glicina o ningún residuo X25 es un residuo de glicina o ningún residuo X26 es un residuo de fenilalanina o un residuo de tirosina

H7

G F T F I S Y G M H (SEQ ID NO:110)

H4

G Y T F T G Y Y I H

H2, H9

G F T F S S Y G M H (SEQ ID NO:30)

H10

G Y S F T S Y W I G (SEQ ID NO:158)

CONSENSO:

G X27X28FX29X30YX31X32X33

X27 es un residuo de tirosina o un residuo de fenilalanina, X28 es un residuo de treonina o un residuo de serina, X29 es un residuo de treonina, un residuo de serina, o un residuo de isoleucina, X30 es un residuo de glicina o un residuo de serina, X31 es un residuo de tirosina, un residuo de glicina, o un residuo de triptófano, X32 es un residuo de isoleucina o un residuo de metionina, X33 es un residuo de histidina o un residuo de glicina

H1

G Y T F T S Y G L S (SEQ ID NO:62)

H12

G F T F S A Y G M H (SEQ ID NO:190)

H3

G F T F S S Y W M S (SEQ ID NO:46)

H13, H14

G Y T F T S Y G I S (SEQ ID NO:206)

CONSENSO:

GX34TFX35X36YX37X38X39 (SEQ ID NO:140)

X34 es un residuo de tirosina o un residuo de fenilalanina, X35 es un residuo de treonina o un residuo de serina, X36 es un residuo de serina o un residuo de alanina X37 es un residuo de glicina o un residuo de triptófano, X38 es un residuo de leucina, un residuo de metionina, o un residuo de isoleucina, X39 es un residuo de serina o un residuo de histidina

Cadena Pesada

Secuencia CDR2

H11

Y I S Y S G S T Y Y N P S L K S (SEQ ID NO:175)

H5

Y I Y Y S G ST N Y N P S L K S (SEQ ID NO:79)

H6

E I N H S G G T N Y N P S L K S (SEQ ID NO:95)

H8

Y I Y Y S G S T N Y N P S L K R (SEQ ID NO:127)

CONSENSO:

X47 I X48 X49 S G X50 T X51 Y N P S L K X52 (SEQ ID NO:142)

X47 es un residuo de tirosina o un residuo de glutamato, X48 es un residuo de serina, un residuo de tirosina, o un residuo de asparagina, X49 es un residuo de tirosina, o un residuo de histidina X50 es un residuo de serina o un residuo de glicina, X51 es un residuo de tirosina o un residuo de asparagina, X52 es un residuo de serina o un residuo de arginina

H2, H9

V I W Y D G S N K Y H A D S V K G (SEQ ID NO:31)

H12

V I W Y D G S N K Y Y A D S V K G (SEQ ID NO:191)

H3

N I K Q D G S E E Y Y V D S V K G (SEQ ID NO:47)

H7

V I W Y D G S T E Y Y A D S V K G (SEQ ID NO:111)

CONSENSO:

X53 I X54 X55 D G S X56 X57 Y X58 X59 D S V K G (SEQ ID NO:179)

X53 es un residuo de asparagina o un residuo de valina, X54 es un residuo de triptófano o un residuo de lisina, X55 es un residuo de tirosina o un residuo de glutamina, X56 es un residuo de asparagina, un residuo de glutamato, o un residuo de serina, X57 es un residuo de lisina, o un residuo de glutamato, X58 es un residuo de histidina o un residuo de tirosina, X59 es un residuo de alanina o un residuo de valina

H4

W I N P N S G G T N Y A Q K F Q G

H1

W I I P Y N G N T N S A Q K L Q G (SEQ ID NO:63)

H13

W I S A Y N G N T N Y A Q K F Q G (SEQ ID NO:207)

H14

W I S P Y N G N T N Y A Q K F Q G

H10

I I Y P G D S D T R Y S P S F Q G (SEQ ID NO:159)

CONSENSO:

X60 I X61 X62 X63 X64 X65 X66 T X67 X68 X69 X70 X71 X72 Q G (SEQ ID NO:180)

X60 es un residuo de triptófano o un residuo de isoleucina, X61 es un residuo de asparagina, un residuo de isoleucina, un residuo de serina, o un residuo de tirosina, X62 es un residuo de prolina o un residuo de alanina, X63 es un residuo de asparagina, un residuo de tirosina, o un residuo de glicina, X64 es un residuo de serina, un residuo de asparagina, o un residuo de aspartato, X65 es un residuo de glicina o un residuo de serina, X66 es un residuo de glicina, un residuo de asparagina, o un residuo de aspartato, X67 es un residuo de asparagina o un residuo de arginina, X68 es un residuo de tirosina o un residuo de serina, X69 es un residuo de alanina o un residuo de serina X70 es un residuo de glutamina o un residuo de prolina, X71 es un residuo de lisina o un residuo de serina, X72 es un residuo de fenilalanina o un residuo de leucina

Cadena Pesada

Secuencia CDR3

H5, H8

--D S I A A P F D Y (SEQ ID NO:80)

H6

V Q W L E L A Y F D Y (SEQ ID NO:96)

H10

----Q G L G F D Y (SEQ ID NO:160)

CONSENSO:

X87X88X89X90X91X92X93X94FDY (SEQ ID NO:187)

X87 es un residuo de valina o ningún residuo, X88 es un residuo de glutamina o ningún residuo, X89 es un residuo de aspartato, un residuo de triptófano, o ningún residuo, X90 es un residuo de serina, un residuo de leucina, o ningún residuo, X91 es un residuo de isoleucina, un residuo de glutamato, o un residuo de glutamina, X92 es un residuo de alanina, un residuo de leucina, o un residuo de glicina, X93 es un residuo de alanina o un residuo de leucina, X94 es un residuo de prolina, un residuo de tirosina, o un residuo de glicina

H13

D Q D Y Y D S S G W -G H (SEQ ID NO:208)

H14

D Q D Y Y D S S G W -D P (SEQ ID NO:224)

H11

--A Y G D Y R G W F D P (SEQ ID NO:176)

CONSENSO:

X95 X96 X97 Y X98 D X99 X100 G W X101 X102 X103 (SEQ ID NO:188)

X95 es un residuo de aspartato o ningún residuo, X96 es un residuo de glutamina o ningún residuo, X97 es un residuo de aspartato o un residuo de alanina, X98 es un residuo de tirosina o un residuo de glicina, X99 es un residuo de serina o un residuo de tirosina, X100 es un residuo de serina o un residuo de arginina, X101 es un residuo de fenilalanina o ningún residuo, X102 es un residuo de glicina o un residuo de aspartato, X103 es un residuo de histidina o un residuo de prolina

H4

---D S G Y S S S W H F D Y -

H1

---D R D Y G V N Y D A F D I (SEQ ID NO:64)

H2

-S R N W N Y D N Y Y Y G L D V (SEQ ID NO:32)

H12

-S R N W N Y D S Y Q Y G L D V (SEQ ID NO:192)

H9

-S R N W N Y D N Y Y Y G L D V (SEQ ID NO:144)

H3

G S S S W Y Y -Y N G M D V -

H7

-E R Q W L Y --H Y G M D V (SEQ ID NO:112)

CONSENSO:

X104X105X106Xi07X108X109YX110X111X112X113X114X115X116X117X118)

X104 es un residuo de glicina o ningún residuo X105 es un residuo de serina, un residuo de glutamato, o ningún residuo X106 es un residuo de arginina, un residuo de serina, o ningún residuo, X107 es un residuo de aspartato, un residuo de asparagina, un residuo de serina, o un residuo de glutamina X108 es un residuo de serina, un residuo de arginina, o un residuo de triptófano, X109 es un residuo de glicina, un residuo de aspartato, un residuo de asparagina, un residuo de tirosina, o un residuo de leucina, X110 es un residuo de serina, un residuo de glicina, un residuo de aspartato, o ningún residuo, X111 es un residuo de serina, un residuo de valina, un residuo de asparagina, o un residuo de tirosina, X112 es un residuo de serina, un residuo de asparagina, un residuo de tirosina, o un residuo de histidina X113 es un residuo de triptófano, un residuo de tirosina, o un residuo de glutamina, X114 es un residuo de histidina, un residuo de aspartato, un residuo de tirosina, o ningún residuo, X115 es un residuo de fenilalanina, un residuo de alanina, o un residuo de glicina,

X116 un residuo de aspartato, un residuo de fenilalanina, un residuo de leucina, o un residuo de metionina X117 un residuo de tirosina, o un residuo de aspartato, X118 es un residuo de isoleucina, un residuo de valina, o ningún residuo

La presente descripción proporciona una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la secuencia de un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en L1 a L14 sólo en 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ó 1 residuos, en el que cada tal diferencia de secuencia es independientemente una deleción, inserción, o sustitución de un residuo de aminoácido. En otra realización, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ó 99% idéntica a la secuencia de un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en L1-L14. En otra realización, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ó 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en L1-L14 (que incluye L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, y L14). En otra realización, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido que hibrida en condiciones moderadamente astringentes con el complemento de un polinucleótido que codifica un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en L1-L14. En otra realización, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido que hibrida en condiciones moderadamente astringentes con el complemento de un polinucleótido que codifica un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en L1-L14. En otra realización, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido que hibrida en condiciones moderadamente astringentes con un complemento de un polinucleótido de cadena ligera de L1-L14.

En otra realización, la presente descripción proporciona una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la secuencia de un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en H1 a H14 sólo en 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ó 1 residuo(s), en el que cada tal diferencia de secuencia es independientemente una deleción, inserción, o sustitución de un residuo de aminoácido. En otra realización, el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ó 99% idéntica a la secuencia de un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en H1-H14. En otra realización, el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ó 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en H1-H14. En otra realización, el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido que hibrida en condiciones moderadamente astringentes con el complemento de un polinucleótido que codifica un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en H1-H14. En otra realización, el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido que hibrida en condiciones moderadamente astringentes con el complemento de un polinucleótido que codifica un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en H1-H14. En otra realización, el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido que hibrida en condiciones moderadamente astringentes con un complemento de un polinucleótido de cadena pesada seleccionado de SEQ ID NO:10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 136, 154, 170, 186, 202, y 218.

Las proteínas de unión a antígeno particulares descritas comprenden una o más secuencias de aminoácidos que son idénticas a las secuencias de aminoácidos de una o más de las CDR y/o FR referenciadas en la presente memoria, por ejemplo, una o más CDR o FR de una o más de SEQ ID Nos: 9-16, 22, 25-32, 36, 41-48-57-62, 64, 7380, 89-91, 93-96, 105-107, 109-112, 115, 116, 121-128, 131, 132, 134, 137-142, 144, 153-160, 169-176, 179, 180, 185-192, 201-208, 217-220, y 223. En una realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR1 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR2 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR3 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR1 de cadena pesada ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR2 de cadena pesada ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR3 de cadena pesada ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR1 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR2 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR3 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR4 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR1 de cadena pesada ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión

a antígeno comprende una secuencia FR2 de cadena pesada ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR3 de cadena pesada ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR4 de cadena pesada ilustrada anteriormente.

5 En una realización, la presente descripción proporciona una proteína de unión a antígeno que comprende una o más secuencias CDR que se diferencian de una secuencia CDR mostrada anteriormente en no más de 5, 4, 3, 2, ó 1 residuos de aminoácidos.

En otra realización, al menos una de las secuencias CDR3 de la proteína de unión a antígeno es una secuencia CDR3 de A1-A14, como se muestra en la Tabla 1 o Tabla 2. En otra realización, la secuencia CDR3 de cadena 10 ligera de la proteína de unión a antígeno es una secuencia CDR3 de cadena ligera de A1-A14 como se muestra en la Tabla 1 y la secuencia CDR3 de cadena pesada de la proteína de unión a antígeno es una secuencia de cadena pesada de A1-A14 como se muestra en la Tabla 2. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende 1, 2, 3, 4, ó 5 secuencia(s) de CDR que cada una se diferencia independientemente en 6, 5, 4, 3, 2, 1, ó 0 adiciones, sustituciones, y /o deleciones únicas de aminoácidos de una secuencia CDR de A1-A14, y la proteína de unión a

15 antígeno comprende además 1, 2, 3, 4, ó 5 secuencia(s) CDR que cada una se diferencia independientemente en 6, 5, 4, 3, 2, 1, ó 0 adiciones, sustituciones, y /o deleciones únicas de aminoácidos de una secuencia CDR.

Las CDR de cadena ligera de los anticuerpos A1-A14 se muestran a continuación en la Tabla 1, y las CDR de cadena pesada de los anticuerpos A1-A14 se muestran a continuación en la Tabla 2.

Tabla 1

Anticuerpo

CDR1 CDR2 CDR3

A1

SGDKLGDKYAC (SEQ ID NO:11) QDSKRPS (SEQ ID NO:12) QAWDSSTAV (SEQ ID NO:13)

A2

RASQGIRNNLG (SEQ ID NO:27) AASSLQS (SEQ ID NO:28) LQHNSYPWT (SEQ ID NO:29)

A3

RASQGIRNDLG (SEQ ID NO:43) AASSLQS (SEQ ID NO:44) RQQNTYPLT (SEQ ID NO:45)

A4

RSSQSLLHSTGYNYLD LGSFRAS MQALQTPCS

A5

KSSQSILYSSNNKKYLV (SEQ NO:75) ID WTSMRES (SEQ ID NO:76) QQYYSTPWT (SEQ ID NO:77)

A6

RASQSISNYLN (SEQ ID NO:91) ATSSLQS (SEQ ID NO:92) QQSYSISPT (SEQ ID NO:93)

A7

RAGQGIRNDLV (SEQ ID NO:107) AASSLQS (SEQ ID NO:44) LQHNTYPFT (SEQ ID NO:109)

A8

KSSQSILYSSNNKKYLV (SEQ NO:75) ID WTSMRES (SEQ ID NO:76) QQYYSTPWT (SEQ ID NO:125)

A9

RASQGIRNNLG (SEQ ID NO:27) AASSLQS (SEQ ID NO:44) LQHNSYPWT (SEQ ID NO:141)

A10

SGEKWGEKYAC (SEQ ID NO:155) QDTKRPS (SEQ ID NO:156) QAWDRSTV (SEQ ID NO:157)

A11

SGDKLGDKFAF (SEQ ID NO:711) QDNKRPS (SEQ ID NO:172) QAWDSSTVV (SEQ ID NO:173)

A12

RASQGIRNDLG (SEQ ID NO:43) AASSLQS (SEQ ID NO:44) LQHNSYTWT (SEQ ID NO:189)

A13

SGDKLGDKYVC (SEQ ID NO:203) LDNKRPS (SEQ ID NO:204) QAWDSSTV (SEQ ID NO:205)

A14

SGDKLGDKYAF (SEQ ID NO:219) HDTKRPS (SEQ ID NO:220) QAWDSSTV (SEQ ID NO:205)

Tabla 2

Cadena Pesada

Anticuerpo

CDR1 CDR2 CDR3

A1

GYTFTSYGLS (SEQ NO:62) ID WIIPYNGNTNSAQKLQ G (SEQ ID NO:63) DRDYGVNYDAFDI (SEQ ID NO:64)

A2

GFTFSSYGMH (SEQ NO:30) ID VIWYDGSNKYHADSV KG (SEQ ID NO:31) SRNWNYDNYYYGL DV (SEQ ID NO:32)

A3

GFTFSSYWMS (SEQ NO:46) ID NIKQDGSEEYYVDSVK G (SEQ ID NO:47) GSSSWYYYNYGMD V (SEQ ID NO:48)

A4

GYTFTGYYIH WINPNSGGTNYAQKF QG DSGYSSSWHFDY

A5

GGSINSFYWS (SEQ NO:78) ID YIYYSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:79) DSIAAPFDY (SEQ ID NO:80)

A6

GGSFSAYYWS (SEQ NO:94) ID EINHSGGTNYNPSLKS (SEQ ID NO:95) VQWLELAYFDY (SEQ ID NO:96)

A7

GFTFISYGMH (SEQ NO:110) ID VIWYDGSTEYYADSV KG (SEQ ID NO:111) ERQWLYHYGMDV (SEQ ID NO:112)

A8

GGSINSFYWS (SEQ NO:126) ID YIYYSGSTNYNPSLKR (SEQ ID NO:127) DSIAAPFDY (SEQ ID NO:80)

A9

GFTFSSYGMH (SEQ NO:30) ID VIWYDGSNKYHADSV KG (SEQ ID NO:31) SRNWNYDNYYYGL DV (SEQ ID NO:144)

A10

GYSFTSYWIG (SEQ NO:158) ID IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO:159) QGLGFDY (SEQ ID NO:160)

A11

GGSISSGGYYWS (SEQ NO:174) ID YISYSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO:175) AYGDYRGWFDP (SEQ ID NO:176)

A12

GFTFSAYGMH (SEQ NO:190) ID VIWYDGSNKYYADSV KG (SEQ ID NO:191) SRNWNYDSYQYGL DV (SEQ ID NO:192)

A13

GYTFTSYGIS (SEQ NO:206) ID WISAYNGNTNYAQKF QG(SEQ ID NO:207) DQDYYDSSGWGH (SEQ ID NO:208)

A14

GYTFTSYGIS (SEQ NO:206) ID WISPYNGNTNYAQKF QG (SEQ ID NO:223) DQDYYDSSGWDP (SEQ ID NO:224)

Las secuencias de nucleótidos de A1-A14, o las secuencias de aminoácidos de A1-A14, pueden alterarse, por

5 ejemplo, por mutagénesis aleatoria o por mutagénesis dirigida a sitio (por ejemplo, mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótido) para crear un polinucleótido alterado que comprende una o más sustituciones, deleciones, o inserciones de nucleótidos particulares comparado con el polinucleótido no mutado. Los ejemplos de técnicas para hacer dichas alteraciones se describen en Walder et al., 1986, Gene 42:133; Bauer et al. 1985, Gene 37:73; Craik, BioTechniques, enero 1985, 12-19; Smith et al., 1981, Genetic Engineering: Principles and Methods,

10 Plenum Press; y en las Patentes U.S. Nos. 4.518.584 y 4.737.462. Éstos y otros métodos pueden usarse para preparar, por ejemplo, derivados de anticuerpos anti-activina A que tienen una propiedad deseada, por ejemplo, afinidad, avidez, o especificidad incrementadas para activina A, actividad o estabilidad incrementadas in vivo o in vitro, o efectos secundarios reducidos in vivo comparado con el anticuerpo sin derivatizar.

Otros derivados de anticuerpos anti-activina A en el alcance de esta descripción incluyen conjugados covalentes o por agregación de anticuerpos anti-activina A, o fragmentos de éstos, con otras proteínas o polipéptidos, tal como por expresión de proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados con el extremo N o extremo C de un polipéptido de anticuerpo anti-activina A. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido señal (o líder) heterólogo, por ejemplo, el líder del factor alfa de levaduras, o un péptido tal como una etiqueta de epítopo. Las proteínas de fusión que contienen la proteína de unión a antígeno pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, poli-His). Una proteína de unión a antígeno también puede unirse al péptido FLAG Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:226) como se describe en Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988, y la Patente U.S.

5.011.912. El péptido FLAG es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico (mAb), permitiendo un ensayo rápido y purificación fácil de la proteína recombinante expresada. Los reactivos útiles para preparar proteínas de fusión en los que el péptido FLAG se fusiona con un polipéptido dado están disponibles comercialmente (Sigma, St. Louis, MO).

Los oligómeros que contienen una o más proteínas de unión a antígeno pueden emplearse como antagonistas de la activina A. Los oligómeros pueden estar en la forma de dímeros, trímeros, u oligómeros superiores unidos covalentemente o unidos no covalentemente. Los oligómeros que comprenden dos o más proteínas de unión a antígeno se contemplan para uso, con un ejemplo siendo un homodímero.

Otros oligómeros incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc.

Una realización está dirigida a oligómeros que comprenden múltiples proteínas de unión a antígeno unidas mediante interacciones covalentes o no covalentes entre restos peptídicos fusionados con las proteínas de unión a antígeno. Dichos péptidos pueden ser conectores peptídicos (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de estimular la oligomerización. Las cremalleras de leucina y determinados polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden estimular la oligomerización de proteínas de unión a antígeno unidas a ellos, como se describe con más detalle más adelante.

En realizaciones particulares, los oligómeros comprenden de dos a cuatro proteínas de unión a antígeno. Las proteínas de unión a antígeno del oligómero pueden estar en cualquier forma, tal como cualquiera de las formas descritas anteriormente, por ejemplo, variantes o fragmentos. Preferiblemente, los oligómeros comprenden proteínas de unión a antígeno que tienen actividad de unión de activina A.

En una realización, se prepara un oligómero usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión que comprenden determinados polipéptidos heterólogos fusionados con varias partes de polipéptidos derivados de anticuerpo (incluyendo el dominio Fc) se ha descrito, por ejemplo, por Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; y Hollenbaugh et al., 1992 Curr. Prot.s in Immunol., Supl. 4, páginas 10.19.1 -10.19.11.

Una realización de la presente invención está dirigida a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creado por fusión de un fragmento de unión a activina A de un anticuerpo anti-activina A con la región Fc de un anticuerpo. El dímero puede prepararse, por ejemplo, insertando una fusión génica que codifica la proteína de fusión en un vector de expresión apropiado, expresando la fusión génica en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante, y permitiendo que la proteína de fusión expresada se ensamble como moléculas de anticuerpo, después de lo cual se forman enlaces disulfuro intercadena entre los restos Fc para rendir el dímero.

El término "polipéptido Fc" tal y como se usa en la presente memoria incluye formas nativas y de muteína de los polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen las formas truncadas de dichos polipéptidos que contienen la región bisagra que estimula la dimerización. Las proteínas de fusión que comprenden restos Fc (y oligómeros formados a partir de éstos) ofrecen la ventaja de una purificación fácil por cromatografía de afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G.

Un polipéptido Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151, es un polipéptido de cadena única que se extiende desde la región bisagra N terminal al extremo C nativo de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Otro polipéptido Fc útil es la muteína de Fc descrita en la Patente U.S. 5.457.035 y en Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia Fc nativa presentada en WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. La muteína presenta una afinidad reducida por los receptores Fc.

En otras realizaciones, la parte variable de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo anti-activina A pueden sustituirse por la parte variable de una cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo.

Alternativamente, el oligómero es una proteína de fusión que comprende múltiples proteínas de unión a antígeno, con o sin conectores peptídicos (péptidos espaciadores). Entre los conectores peptídicos adecuados están los descritos en las Patentes U.S. 4.751.180 y 4.935.233.

Otro método para preparar proteínas de unión a antígeno oligoméricas implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que estimulan la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión a ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), y desde entonces se han encontrado en una variedad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas están los péptidos naturales y derivados de éstos que dimerizan o trimerizan. Los ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la proteína tensioactiva de pulmón D (SPD) descrita en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada con ella se describe en Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. En una estrategia, proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento de anticuerpo anti-activina A o derivado fusionado con un péptido de cremallera de leucina se expresan en células huésped adecuadas, y los fragmentos de anticuerpo anti-activina A oligoméricos solubles o derivados que se forman se recuperan del sobrenadante del cultivo.

En un aspecto, la presente invención proporciona proteínas de unión a antígeno que interfieren con la unión de activina A con el receptor de activina A. Dichas proteínas de unión a antígeno puede prepararse frente a activina A,

o un fragmento, variante o derivado de ésta, y cribarse en ensayos convencionales para la capacidad de interferir con la unión de activina A al receptor de activina A. Los ejemplos de ensayos adecuados son ensayos que ensayan las proteínas de unión a antígeno para la capacidad de inhibir la unión de activina A a células que expresan el receptor de activina A, o que ensayan las proteínas de unión a antígeno para la capacidad de reducir una respuesta biológica o celular que resulta de la unión de activina A a los receptores de activina A de la superficie celular. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 10, así como en los Ejemplos más adelante, pueden cribarse anticuerpos según su capacidad de unirse a superficies de anticuerpo inmovilizado (activina A y/o activina B).

Los fragmentos de unión a antígeno de las proteínas de unión a antígeno de la invención pueden producirse por técnicas convencionales. Los ejemplos de dichos fragmentos incluyen, pero no están limitados a, fragmentos Fab y F(ab')2. También se contemplan los fragmentos de anticuerpo y derivados producidos por técnicas de ingeniería genética.

Las realizaciones adicionales incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo, murinos). Dichos anticuerpos humanizados pueden prepararse por técnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a seres humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende el dominio variable de un anticuerpo murino (o todo o parte del sitio de unión a antígeno de éste) y un dominio constante derivado de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de dominio variable (que carece del sitio de unión a antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y más modificados por ingeniería incluyen los descritos en Riechmann et al., 1988, Nature 332:323, Liu et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439, Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7:934, y Winter et al., 1993, TIPS 14:139. En una realización, el anticuerpo quimérico es un anticuerpo injertado con CDR. Las técnicas para humanizar anticuerpos se discuten, por ejemplo, en las Pat. U.S. Nos. 5.869.619, 5.225.539, 5.821.337, 5.859.205, 6.881.557,Padlan et al., 1995, FASEB J. 9:133-39, y Tamura et al., 2000, J. Immunol. 164:1432-41.

Se han desarrollado procedimientos para generar anticuerpos humanos o parcialmente humando en animales no humanos. Por ejemplo, se han preparado ratones en los que uno o más genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado por varios medios. Los genes de inmunoglobulina humana se han introducido en los ratones para reemplazar los genes de ratón inactivados. Los anticuerpos producidos en el animal incorporan cadenas de polipéptido de inmunoglobulina humana codificadas por el material genético humano introducido en el animal. En una realización, un animal no humano, tal como un ratón transgénico, se inmuniza con un polipéptido de activina A, de manera que se generan en el animal anticuerpos dirigidos frente al polipéptido de activina A.

Un ejemplo de un inmunógeno adecuado es una activina A humana soluble, tal como un polipéptido que comprende el dominio extracelular de la proteína de SEQ ID NO:225, u otro fragmento inmunogénico de la proteína de SEQ ID NO:225. Los ejemplos de técnicas para la producción y uso de animales transgénicos para la producción de anticuerpos humanos o parcialmente humanos se describen en las Patentes U.S. 5.814.318, 5.569.825, y 5.545.806, Davis et al., 2003, Production of human antibodies from transgenic mice en Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ:191-200, Kellermann et al., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97, Russel et al., 2000, Infect Immun. 68:1820-26, Gallo et al., 2000, Eur J Immun. 30:534-40, Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25, Green, 1999, J Immunol Methods. 231:11-23, Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42, Green et al., 1998, J Exp Med. 188:483-95, Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14, Tsuda et al., 1997, Genomics. 42:413-21, Mendez et al., 1997, Nat Genet. 15:146-56,Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63, Arbones et al., 1994, Immunity. 1:247-60, Green et al., 1994, Nat Genet. 7:13-21, Jakobovits et al., 1993, Nature. 362:255-58, Jakobovits et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA. 90: 2551-55. Chen, J., M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar. Inter'l Immunol. 5 (1993): 647-656, Choi et al., 1993, Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild et al., 1996, Nature Biotech. 14: 845-51, Harding et al., 1995, Annals of the New York Academy of Sciences, Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies en Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg et al., 1995, Internal Review of

Immunology 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826, Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-95, Taylor et al., 1994, Inter'l Immunol. 6: 579-91, Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16: 133-43, Tomizuka et al., 2000, Pro. Nat'lAcad. Sci. USA 97: 722-27, Tuaillon et al., 1993, Pro.Nat'lAcad.Sci. USA 90: 3720-24, y Tuaillon et al., 1994, J.Immunol. 152: 2912-20.

En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen a activina A. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo inmortalizando células de bazo recogidas del animal transgénico después de terminar el esquema de inmunización. Las células de bazo pueden inmortalizarse usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, fusionándolas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para uso en procedimientos de fusión que producen hibridomas preferiblemente no son productoras de anticuerpos, tienen una eficiencia de fusión alta, y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en determinados medios selectivos que apoyan el crecimiento sólo de las células fusionadas deseadas (hibridomas). Los ejemplos de líneas celulares adecuadas para uso en las fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; los ejemplos de líneas celulares usadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas celulares útiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

En una realización, se produce una línea celular de hibridoma inmunizando un animal (por ejemplo, un animal transgénico que tiene secuencias de inmunoglobulina humana) con un inmunógeno activina A; recogiendo células del bazo del animal inmunizado; fusionando las células de bazo recogidas con una línea celular de mieloma, generando de esta manera células de hibridoma; estableciendo líneas celulares de hibridoma, e identificando una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a un polipéptido activina A. Dichas líneas celulares de hibridoma, y anticuerpos monoclonales anti-activina A producidos por ellas, están englobadas por la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea celular de hibridoma pueden purificarse usando cualquier técnica conocida en la técnica. Los hibridomas o mAb pueden cribarse adicionalmente para identificar los mAb con propiedades particulares, tales como la capacidad de bloquear una actividad inducida por la activina A. Los ejemplos de dichos cribados se proporcionan en los ejemplos siguientes.

La evolución molecular de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en el centro del sitio de unión del anticuerpo también se ha usado para aislar anticuerpos con afinidad incrementada, por ejemplo, anticuerpos que tienen afinidad incrementada para c-erbB-2, como se describe por Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551. De acuerdo con esto, dichas técnicas son útiles para preparar anticuerpos frente a la activina A.

Las proteínas de unión a antígeno dirigidas frente a una activina A pueden usarse, por ejemplo, en ensayos para detectar la presencia de polipéptidos de activina A, bien in vitro o in vivo. Las proteínas de unión a antígeno también pueden emplearse para purificar proteínas de activina A mediante cromatografía de inmunoafinidad. Las proteínas de unión a antígeno que además pueden bloquear la unión de la activina A también pueden usarse para inhibir una actividad biológica que resulta de dicha unión. Las proteínas de unión a antígeno bloqueantes pueden usarse en los métodos de la presente invención. Dichas proteínas de unión a antígeno que funcionan como antagonistas de la activina A pueden emplearse para tratar cualquier afección relacionada con la activina A, incluyendo pero no limitado a caquexia. En una realización, se emplea un anticuerpo monoclonal anti-activina A humana generado por los procedimientos que implican la inmunización de ratones transgénicos para tratar dichas afecciones.

Aunque los anticuerpos humanos, parcialmente humanos, o humanizados serán adecuados para muchas aplicaciones, particularmente las que implican la administración del anticuerpo a un sujeto humano, otros tipos de proteínas de unión a antígeno serán adecuadas para determinadas aplicaciones. Los anticuerpos no humanos de la invención pueden obtenerse, por ejemplo, de cualquier animal que produce anticuerpos, tal como ratón, rata, conejo, cabra, burro, o primate no humano (tal como mono (por ejemplo, mono cinomolgus o resus) o simio (por ejemplo, chimpancé)). Los anticuerpos no humanos de la invención pueden usarse, por ejemplo, en aplicaciones basadas en cultivo celular in vitro, o en cualquier otra aplicación en la que no se produce una respuesta inmune al anticuerpo de la invención, es insignificativa, puede evitarse, no es un problema, o se desea. En una realización, un anticuerpo no humano de la invención se administra a un sujeto no humano. En otra realización, el anticuerpo no humano no incita una respuesta inmune en el sujeto no humano. En otra realización, el anticuerpo no humano es de la misma especie que el sujeto no humano, por ejemplo, un anticuerpo de ratón de la invención se administra a un ratón. Un anticuerpo de una especie particular puede prepararse, por ejemplo, inmunizando un animal de esa especie con el inmunógeno deseado (por ejemplo, un polipéptido de activina A soluble) o usando un sistema artificial para generar anticuerpos de esa especie (por ejemplo, un sistema basado en bacterias o presentación en fagos para generar anticuerpos de una especie particular), o convirtiendo un anticuerpo de una especie en un anticuerpo de otra especie reemplazando, por ejemplo, la región constante del anticuerpo por una región constante de otra especie, o reemplazando uno o más residuos de aminoácidos del anticuerpo de manera que sea más parecido a la secuencia de un anticuerpo de la otra especie. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico que comprende secuencias de aminoácidos derivadas de anticuerpos de dos o más especies diferentes.

Las proteínas de unión a antígeno pueden prepararse por cualquiera de varias técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden purificarse a partir de células que las expresan de forma natural (por ejemplo, un anticuerpo puede purificarse a partir de un hibridoma que lo produzca), o producirse en sistemas de expresión recombinantes, usando cualquier técnica conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

Puede usarse cualquier sistema de expresión conocido en la técnica para preparar los polipéptidos recombinantes de la invención. En general, las células huésped se transforman con un vector de expresión recombinante que comprende ADN que codifica un polipéptido deseado. Entre las células huésped que pueden emplearse están células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las células eucariotas superiores incluyen células de insecto y líneas celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CVI/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CVI (ATCC CCL 70) como se describe por McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821. Los vectores de clonación y expresión apropiados para uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura, y mamíferos se describen por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985).

Las células transformadas pueden cultivarse en condiciones que estimulen la expresión del polipéptido, y el polipéptido puede recuperarse por procedimientos convencionales de purificación de proteínas. Uno de dichos procedimientos de purificación incluye el uso de cromatografía de afinidad, por ejemplo, sobre una matriz que tiene unida a ella toda o parte (por ejemplo, el dominio extracelular) de la activina A. Los polipéptidos contemplados para uso en la presente memoria incluyen polipéptidos de anticuerpo anti-activina A de mamífero recombinantes sustancialmente homogéneos que carecen sustancialmente de materiales endógenos contaminantes.

Las proteínas de unión a antígeno pueden prepararse, y cribarse para propiedades deseadas, por cualquiera de varias técnicas conocidas. Algunas de las técnicas implican el aislamiento de un ácido nucleico que codifica una cadena de polipéptido (o parte de ésta) de una proteína de unión a antígeno de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-activina A), y la manipulación del ácido nucleico mediante tecnología de ADN recombinante. El ácido nucleico puede fusionarse con otro ácido nucleico de interés, o alterarse (por ejemplo, por mutagénesis u otras técnicas convencionales) para añadir, delecionar, o sustituir uno o más residuos de aminoácidos, por ejemplo.

En un aspecto, la presente invención proporciona fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo anti-activina A de la invención. Dichos fragmentos pueden consistir enteramente en secuencias derivadas de anticuerpo o pueden comprender secuencias adicionales. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen Fab, F(ab')2, anticuerpos de cadena única, fragmentos divalentes, fragmentos trivalentes, fragmentos tetravalentes, y anticuerpos de dominio. Otros ejemplos se proporcionan en Lunde et al., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:500-06.

Los anticuerpos de cadena única pueden formarse uniendo fragmentos del dominio variable de cadena pesada y ligera (región Fv) mediante un puente de aminoácido (conector peptídico corto), lo que resulta en una única cadena de polipéptido. Dichos Fvs de cadena única (scFv) se han preparado fusionando ADN que codifica un conector peptídico entre ADN que codifican los dos polipéptidos de domino variable (VL y VH). Los polipéptidos resultantes pueden plegarse sobre sí mismos para formar monómeros de unión a antígeno, o pueden formar multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros, o tetrámeros), dependiendo de la longitud de un conector flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Combinando diferentes polipéptidos que comprenden VL y VH, se pueden formar scFv multiméricos que se unen a diferentes epítopos (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena única incluyen las descritas en la Patente U.S. No. 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87. Los anticuerpos de cadena única derivados de anticuerpos proporcionados en la presente memoria incluyen, pero no están limitados a, scFv que comprenden las combinaciones de dominio variable L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, y L14H14.

Las proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y derivados de anticuerpo) de la invención pueden comprender cualquier región constante conocida en la técnica. La región constante de cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda humana. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, regiones constantes de cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma, o mu, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma, o mu humana. En una realización, la región constante de cadena ligera o pesada es un fragmento, derivado, variante, o muteína de una región constante natural.

Se conocen técnicas para derivar un anticuerpo de una subclase o isotipo diferente de un anticuerpo de interés, es decir, intercambio de subclase. Así, los anticuerpos IgG pueden derivar de un anticuerpo IgM, por ejemplo, y viceversa. Dichas técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de unión a

antígeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo parental), pero también presentan propiedades biológicas asociadas con un isotipo o subclase de anticuerpo diferente del del anticuerpo parental. Pueden emplearse técnicas de ADN recombinante. El ADN clonado que codifica polipéptidos de anticuerpo particulares puede emplearse en dichos procedimientos, por ejemplo, ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Véase también Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16.

Una proteína de unión a antígeno comprende el dominio de cadena pesada de IgG1 de cualquiera de A1-A14 (H1-H14) o un fragmento del dominio de cadena pesada de IgG1 de cualquiera de A1-A14 (H1-H14). Otra proteína de unión a antígeno de la invención comprende la región de cadena constante de cadena ligera kappa de A1-A14 (L1-L14), o un fragmento de la región constante de cadena ligera kappa de A1-A14 (L1-L14). Otra proteína de unión a antígeno de la invención comprende tanto el dominio de cadena pesada de IgG1, o un fragmento de éste, de A1-A14 (L1-L14) como el dominio de cadena ligera kappa, o un fragmento de éste, de A1-A14 (L1-L14).

De acuerdo con esto, las proteínas de unión a antígeno descritas incluyen las que comprenden, por ejemplo, las combinaciones de dominio variable L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, y L14H14, que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, e IgD) así como fragmentos Fab o F(ab')2 de éstas. Además, si se desea una IgG4, también se puede desear introducir una mutación puntual (CPSCP -> CPPCP) en la región bisagra como se describe en Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407) para aliviar la tendencia de formar enlaces disulfuro intra cadena H que pueden dar lugar a heterogeneidad en los anticuerpos IgG4.

La proteína de unión a antígeno tiene una Koff de 1x10-4 s-1 o menor. En otra realización, la Koff es 5x10-5 s-1 o menor. En otra realización, la Koff es sustancialmente la misma que un anticuerpo que tiene una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionado del grupo de combinaciones que consiste en L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, y L14H14. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une a la activina A con sustancialmente la misma Koff que un anticuerpo que comprende una o más CDR de un anticuerpo que tiene una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionado del grupo de combinaciones que consiste enL1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, y L14H14. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une a la activina A con sustancialmente la misma Koff que un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos ilustradas anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une a la activina A con sustancialmente la misma Koff que un anticuerpo que comprende una o más CDR de un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos ilustradas anteriormente.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término activina A humana se pretende que incluya la proteína de SEQ ID NO:1 y las variantes alélicas de ésta. La activina A puede purificarse a partir de las células huésped que se han transfectado con un gen que codifica activina A por elución del sobrenadante filtrado del fluido de cultivo de la célula huésped usando una columna Heparina HP, usando un gradiente de sal.

El término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión de éste. Un anticuerpo puede comprender una molécula completa de anticuerpo (incluyendo versiones policlonales, monoclonales, quiméricas, humanizadas, o humanas que tienen cadenas pesadas y/o ligeras de longitud completa), o comprender un fragmento de unión a antígeno de éste. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc, y Fd, y pueden incorporarse en anticuerpos de dominio único, anticuerpos de cadena única, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, fragmentos divalentes, fragmentos trivalentes, fragmentos tetravalentes, v-NAR y bisscFv (Véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotech., 23, 9, 1126-1136). Los polipéptidos de anticuerpo también se describen en la Patente U.S. No. 6,703,199, incluyendo monocuerpos de polipéptido de fibronectina. Otros polipéptidos de anticuerpo se describen en la Publicación de Patente U.S. 2005/0238646, que son polipéptidos de cadena única.

Los fragmentos de unión a antígeno derivados de un anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, por hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos según métodos convencionales. Como ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse por escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de escisión puede realizarse usando un grupo bloqueante para los grupos sulfidrilo que resultan de la escisión de uniones disulfuro. Como una alternativa, una escisión enzimática usando papaína produce dos fragmentos monovalentes Fab y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, Patente U.S. No. 4.331.647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., en Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967); y por Andrews, S.M. y Titus,

J.A. en Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., et al., eds), John Wiley & Sons, Nueva York (2003), páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10A.1-2.10A.5. También pueden usarse otros métodos para escindir anticuerpos, tales como separar cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes (Fd), escindir adicionalmente fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas, o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.

Un fragmento de anticuerpo también puede ser cualquier proteína sintética o preparada por ingeniería genética. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos aislados que consisten en la región variables de cadena ligera, fragmentos "Fv" que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas de polipéptido de cadena única recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un conector peptídico (proteínas scFv).

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo. Las CDR (también denominadas "unidades mínimas de reconocimiento", o "región hipervariable") pueden obtenerse construyendo polinucleótidos que codifican la CDR de interés. Dichos polinucleótidos se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable usando ARNm de células productoras de anticuerpo como un molde (véase, por ejemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995); y Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).

Así, en una realización, el agente de unión comprende al menos una CDR como se describe en la presente memoria. El agente de unión puede comprender al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR como se describe en la presente memoria. El agente de unión puede comprender además al menos un dominio de región variable de un anticuerpo descrito en la presente memoria. El dominio de región variable puede tener cualquier tamaño o composición de aminoácidos y comprenderá generalmente al menos una secuencia de CDR responsable de la unión a activina A humana, por ejemplo, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 y/o las CDR de cadena ligera descritas específicamente en la presente memoria y que es adyacente a o está en marco con una o más secuencias marco. En términos generales, el dominio de región variable (V) puede ser cualquier organización adecuada de dominios variables de cadena pesada (VH) y/o ligera (VL) de inmunoglobulina. Así, por ejemplo, el dominio de la región V puede ser monomérico y ser un dominio VH o VL , que es capaz de unirse independientemente a activina A humana con una afinidad al menos igual a 1 x 10-7M o o menos como se describe más adelante. Alternativamente, el dominio de la región V puede ser dimérico y contener dímeros VH-VH, VH-VL, o VL-VL. El dímero de la región V comprende al menos una cadena VH y al menos una cadena VL que puede estar asociada no covalentemente (referido de aquí en adelante como FV). Si se desea, las cadenas pueden acoplarse covalentemente bien directamente, por ejemplo mediante un enlace disulfuro entre los dos dominios variables, o mediante un conector, por ejemplo, un conector peptídico, para formar un Fv de cadena única (scFv).

El dominio de región variable puede ser cualquier dominio variable natural o una versión preparada por ingeniería de éste. Por versión preparada por ingeniería se quiere decir un dominio de región variable que se ha creado usando técnicas de ingeniería de ADN recombinante. Dichas versiones preparadas por ingeniería incluyen aquellas creadas, por ejemplo, a partir de una región variable de anticuerpo específico por inserciones, deleciones, o cambios en o a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo específico. Los ejemplos particulares incluyen dominios de región variable preparados por ingeniería que contienen al menos una CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos marco de un primer anticuerpo y el resto del dominio de región variable de un segundo anticuerpo.

El dominio de región variable puede unirse covalentemente en un aminoácido C-terminal al menos a otro dominio de anticuerpo o un fragmento de éste. Así, por ejemplo, un dominio VH que está presente en el dominio de región variable puede unirse a un dominio CH1 de inmunoglobulina, o un fragmento de éste. De manera similar, un dominio VL puede unirse a un dominio CK o un fragmento de éste. De esta manera, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab en el que el dominio de unión a antígeno contiene asociados dominios VH y VL unidos covalentemente en sus extremos C a un dominio CH1 y CK , respectivamente. El dominio CH1 puede extenderse con más aminoácidos, por ejemplo para proporcionar una región bisagra o una parte de un dominio de región bisagra como se encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar dominios adicionales, tales como dominios CH2 y CH3 de anticuerpo.

Como se describe en la presente memoria, los anticuerpos comprenden una de estas CDR. Por ejemplo, una o más CDR pueden incorporarse en las regiones marco conocidas de anticuerpo (IgG1, IgG2, etc.), o conjugarse con un vehículo adecuado para aumentar la vida media de éstos. Los vehículos adecuados incluyen, pero no están limitados a Fc, polietilen glicol (PEG), albúmina, transferrina, y semejantes. Éstos y otros vehículos adecuados se conocen en la técnica. Dichos péptidos CDR conjugados pueden estar en forma monomérica, dimérica, tetramérica, u otra. En una realización, uno o más polímeros solubles en agua están unidos en una o más posiciones específicas, por ejemplo en el extremo amino, de un agente de unión.

En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo comprende una o más uniones de polímero soluble en agua, incluyendo, pero no limitado a, polietilen glicol, polioxietilen glicol, o propilen glicol. Véase, por ejemplo, Pat.

U.S. Nos. 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 y 4.179.337. En determinadas realizaciones, un agente de unión derivado comprende uno o más de monometoxi-polietilen glicol, dextrano, celulosa, u otros polímeros basados en carbohidrato, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietilen glicol, homopolímeros de propilen glicol, un copolímero de polipropilen óxido/etilen óxido, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y polivinil alcohol, así como mezclas de dichos polímeros. En determinadas realizaciones, uno o más polímeros solubles en agua se unen

aleatoriamente a una o más cadenas laterales. En determinadas realizaciones, PEG puede actuar para mejorar la capacidad terapéutica para un agente de unión, tal como un anticuerpo. Determinados de dichos métodos se discuten, por ejemplo en Pat. U.S. No. 6.133.426.

Se apreciará que un anticuerpo de la presente invención puede tener al menos una sustitución de aminoácido, siempre que el anticuerpo retenga especificidad de unión. Por lo tanto, las modificaciones a las estructuras de anticuerpo están englobadas en el alcance de la invención. Éstas pueden incluir sustituciones de aminoácidos, que pueden ser conservativas o no conservativas, que no destruyen la capacidad de unión a activina A de un anticuerpo. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden englobar residuos de aminoácidos no naturales, que se incorporan típicamente por síntesis química de péptidos en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Éstos incluyen peptidomiméticos y otras formar reversas o invertidas de restos de aminoácidos. Una sustitución de aminoácidos conservativa también puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo normativo de manera que hay poco efecto o no lo hay en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición.

Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una clase de aminoácidos o miméticos de aminoácidos por un miembro de otra clase con propiedades físicas diferentes (por ejemplo, tamaño, polaridad, hidrofobicidad, carga). Dichos residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo humano que son homólogas a anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula.

Además, un experto en la técnica puede generar variantes de ensayo que contienen una única sustitución de aminoácidos en cada residuo de aminoácido deseado. Las variantes pueden cribarse usando ensayos de actividad conocidos para los expertos en la técnica. Dichas variantes podrían usarse para recoger información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio en un residuo de aminoácidos particular resulta en una actividad destruida, reducida de manera indeseada, o no adecuada, las variantes con dicho cambio pueden evitarse. En otras palabras, tomando como base la información recogida de dichos experimentos rutinarios, un experto en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos en los que deben evitarse más sustituciones bien solas o en combinación con otras mutaciones.

Un experto en la técnica será capaz de determinar variantes adecuadas del polipéptido como se muestra en la presente memoria usando técnicas muy conocidas. En determinadas realizaciones, un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad tomando como diana regiones que se cree que no son importantes para la actividad. En determinadas realizaciones, se puede identificar residuos y partes de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. En determinadas realizaciones, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente la estructura del polipéptido.

Además, un experto en la técnica puede revisar estudios de estructura-función que identifican residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. A la vista de dicha comparación, se puede predecir la importancia de residuos de aminoácidos en una proteína que corresponden a los residuos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones con aminoácidos químicamente similares para dichos residuos de aminoácidos que se predice son importantes.

Un experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. A la vista de dicha información, un experto en la técnica puede predecir el alineamiento de residuos de aminoácidos de un anticuerpo respecto a su estructura tridimensional. En determinadas realizaciones, un experto en la técnica puede elegir no hacer cambios radicales en los residuos de aminoácidos que se predice están en la superficie de la proteína, ya que dichos residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas.

Varias publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochem., 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochem., 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Además, están disponibles actualmente programas informáticos para ayudar en la predicción de la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor de 30%, o similitud mayor de 40% frecuentemente tienen topologías estructurales similares. El crecimiento reciente de la base de datos estructural de proteínas (PDB) ha proporcionado una capacidad de predicción aumentada de estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos en la estructura de un polipéptido o proteína. Véase Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) que hay un número limitado de plegamientos en un polipéptido o proteína dado y que una vez se ha resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural será dramáticamente más exacta.

Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen "reconocimiento de plegamiento" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)), "análisis de perfil" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)), y "vínculo evolutivo" (Véase Holm, supra (1999), y Brenner, supra (1997)).

En determinadas realizaciones, las variantes de anticuerpos incluyen variantes de glicosilación en las que el número y/o tipo de sitio de glicosilación se ha alterado comparado con las secuencias de aminoácidos de un polipéptido parental. En determinadas realizaciones, las variantes comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación unidos por N que la proteína nativa. Un sitio de glicosilación unido por N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que el residuo de aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución de residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato unida por N. Alternativamente, las sustituciones que eliminan esta secuencia eliminarán una cadena de carbohidrato unida por N existente. También se proporciona una reorganización de cadenas de carbohidrato unidas por N en las que uno o más sitios de glicosilación unidos por N (típicamente aquellos que son naturales) se eliminan y se crean uno o más nuevos sitios unidos por N. Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína en las que uno

o más residuos de cisteína se delecionan de o se sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina) comparado con la secuencia de aminoácidos parental. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento de los cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína tienen generalmente menos residuos de cisteína que la proteína nativa, y típicamente tienen un número par para minimizar las interacciones que resultan de cisteínas no emparejadas.

Las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sean conservativas o no conservativas) pueden determinarse por los expertos en la técnica en el momento en el que se deseen dichas sustituciones. En determinadas realizaciones, pueden usarse sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes de anticuerpos de activina A, o para incrementar o disminuir la afinidad de los anticuerpos para activina A descritos en la presente memoria.

Según determinadas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales en dichos polipéptidos. Según determinadas realizaciones, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples (en determinadas realizaciones, sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia natural (en determinadas realizaciones, en la parte del polipéptido que está fuera del

o de los dominios que forman contactos intermoleculares). En determinadas realizaciones, una sustitución de aminoácidos conservativa típicamente no cambia sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que aparece en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan a la secuencia parental). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354:105 (1991).

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden unirse químicamente a polímeros, lípidos, u otros restos.

Los agentes de unión pueden comprender al menos una de las CDR descritas en la presente memoria incorporada en una estructura marco biocompatible. En un ejemplo, la estructura marco biocompatible comprende un polipéptido o parte de éste que es suficiente para formar un soporte estructural conformacionalmente estable, o marco, o soporte, que es capaz de exponer una o más secuencias de aminoácidos que se unen a un antígeno (por ejemplo, CDR, una región variable, etc.) en una región de superficie localizada. Dichas estructuras pueden ser un polipéptido natural o "plegamiento" de polipéptido (un resto estructural), o pueden tener una o más modificaciones, tales como adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, respecto a un polipéptido o plegamiento natural. Estos soportes pueden derivar de un polipéptido de cualquier especie (o de más de una especie), tal como ser humano, otro mamífero, otro vertebrado, invertebrado, planta, bacteria o virus.

Típicamente, las estructuras marco biocompatibles se basan en soportes o esqueletos de proteína distintos de dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, pueden usarse las basadas en fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostaina, citocromo b, dedo de cinc CP1, PST1, superhélice, LACI-D1, dominio Z y dominios tendamistat (Véase, por ejemplo, Nygren y Uhlen, 1997, Curr. Opin. in Struct. Biol., 7, 463-469).

Se apreciará que los anticuerpos de la invención incluyen los anticuerpos humanizados descritos en la presente memoria. Los anticuerpos humanizados tales como los descritos en la presente memoria pueden producirse usando técnicas conocidas para los expertos en la técnica (Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42(12):1445-1451, 2005;Hwang W. et al., Methods. 36(1):35-42, 2005; Dall'Acqua WF, et al., Methods 36(1):43-60, 2005; y Clark, M., Immunology Today. 21(8):397-402, 2000).

Además, un experto en la técnica reconocerá que los agentes de unión adecuados incluyen partes de estos anticuerpos, tales como uno o más de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se describe específicamente en la presente memoria. Al menos una de las regiones de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 puede tener al menos una sustitución de aminoácidos, siempre que el anticuerpo retenga la especificidad de unión de la CDR no sustituida. La parte no CDR del anticuerpo puede ser un molécula distinta de proteína, en el que el agente de unión bloquea de manera cruzada la unión de un anticuerpo descrito en la presente memoria a activina A y/o neutraliza la activina A. La parte no CDR del anticuerpo puede ser un molécula distinta de proteína, en el que el anticuerpo presenta un patrón de unión similar a péptidos de activina A humana en un ensayo de unión de competición como el presentado por al menos uno de los anticuerpos A1-A14, y/o neutraliza la activina

A. La parte no CDR del anticuerpo puede estar compuesta por aminoácidos, en el que el anticuerpo es una proteína de unión recombinante o un péptido sintético, y la proteína de unión recombinante bloquea de manera cruzada la unión de un anticuerpo descrito en la presente memoria a activina A y/o neutraliza la activina A. La parte no CDR del anticuerpo puede estar compuesta por aminoácidos, en el que el anticuerpo es un anticuerpo recombinante, y el anticuerpo recombinante presenta un patrón de unión similar a péptidos de activina A humana en el ensayo de unión de competición a epítopo de activina A humana (descrito más adelante en la presente memoria) que el presentado por al menos uno de los anticuerpos A1-A14, y/o neutraliza la activina A.

Cuando un anticuerpo comprende una o más de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se ha descrito anteriormente, puede obtenerse por la expresión de una célula huésped que contiene el ADN que codifica estas secuencias. Un ADN que codifica para cada secuencia de CDR puede determinarse tomando como base la secuencia de aminoácidos de la CDR y sintetizarse junto con cualquier marco de región variable de anticuerpo deseada y secuencias de ADN de región constante usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos, mutagénesis dirigida a sito y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según sea apropiado. El ADN que codifica marcos de región variable y regiones constantes está ampliamente disponible para los expertos en la técnica a partir de bases de datos de secuencias genéticas tales como GenBank®.

Una vez sintetizado, el ADN que codifica un anticuerpo de la invención o fragmento de éste puede propagarse y expresarse según cualquiera de una variedad de procedimientos muy conocidos para la escisión, ligación, transformación, y transfección de ácido nucleico usando cualquier número de vectores de expresión conocidos. Así, en determinadas realizaciones, la expresión de un fragmento de anticuerpo puede preferirse en un huésped procariota, tal como Escherichia coli (véase, por ejemplo, Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178:497-515). En otras determinadas realizaciones, la expresión del anticuerpo o un fragmento de éste puede preferirse en una célula huésped eucariota, incluyendo levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,y Pichia pastoris), células animales (incluyendo células de mamífero) o células de plantas. Los ejemplos de células animales adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, células de mieloma (tal como una línea de ratón NSO), COS, CHO, o células de hibridoma. Los ejemplos de células de plantas incluyen células de tabaco, maíz, soja, y arroz.

Puede prepararse uno o más vectores de expresión replicables que contienen ADN que codifica una región variable y/o constante de anticuerpo y usarse para transformar una línea celular apropiada, por ejemplo, una línea celular de mieloma no productora, tal como una línea de ratón NSO o una bacteria, tal como E. coli, en la que se producirá la producción del anticuerpo. Con el fin de obtener una transcripción y traducción eficaces, la secuencia de ADN en cada vector debe incluir secuencias reguladoras apropiadas, particularmente un promotor y una secuencia líder unidas de manera operativa con la secuencia de dominio variable. Los métodos particulares para producir anticuerpos de esta manera son muy conocidos generalmente y usados rutinariamente. Por ejemplo, se describen procedimientos básicos de biología molecular por Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989; véase también Maniatis et al, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (2001)). La secuenciación del ADN puede realizarse como se describe en Sanger et al. (PNAS 74:5463, (1977)) y el manual de secuenciación de Amersham International plc, y la mutagénesis dirigida a sitio puede llevarse a cabo según métodos conocidos en la técnica (Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987); the Anglian Biotechnology Ltd. handbook). Además, numerosas publicaciones describen técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos por manipulación de ADN, creación de vectores de expresión, y transformación y cultivo de células apropiadas (Mountain A y Adair, J R en Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, Reino Unido); "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, Nueva York).

Cuando se desea mejorar la afinidad de anticuerpos según la invención que contienen una o más de las CDR mencionadas anteriormente puede obtenerse por varios protocolos de maduración de afinidad incluyendo mantener las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), intercambio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas de mutación de E. coli. (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), intercambio de cadenas de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), exposición en fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) y PCR sexual (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Todos estos métodos de maduración de afinidad se discuten por Vaughan et al. (Nature Biotech., 16, 535-539, 1998).

Otros anticuerpos según la invención pueden obtenerse por procedimientos convencionales de inmunización y fusión celular como se describe en la presente memoria y se conoce en la técnica. Los anticuerpos monoclonales de

la invención pueden generarse usando una variedad de técnicas conocidas. En general, los anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos específicos pueden obtenerse por métodos conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Kohler et al., Nature 256:495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Patentes U.S. Nos. RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439, y 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridorraas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, y Bechtol (eds.) (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2a Edition, Glover et al. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)). Los fragmentos de anticuerpo pueden derivar de éstos usando cualquier técnica estándar adecuada tal como digestión proteolítica, u opcionalmente, por digestión proteolítica (por ejemplo, usando papaína o pepsina) seguido de reducción suave de los enlaces disulfuro y alquilación. Alternativamente, dichos fragmentos también pueden generarse por técnicas de ingeniería genética recombinantes como se describe en la presente memoria.

Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse inyectando a un animal, por ejemplo una rata, hámster, un conejo,

o preferiblemente un ratón, incluyendo por ejemplo un transgénico o inactivado genéticamente, como se conoce en la técnica, un inmunógeno que comprende activina A humana de (SEQ ID NO:225), o un fragmento de ésta, según métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria. La presencia de la producción de anticuerpos específicos puede monitorizarse después de la inyección inicial y/o después de una inyección de refuerzo mediante la obtención de una muestra de suero y detectando la presencia de un anticuerpo que se une a activina A humana o péptido usando uno cualquiera de los varios métodos de inmunodetección conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria. De animales que producen los anticuerpos deseados, se retiran las células linfoides, más comúnmente las células del bazo o ganglio linfático, para obtener linfocitos B. Los linfocitos B se fusionan con una pareja de fusión de célula de mieloma sensibilizada a fármaco, preferiblemente una que es singénica con el animal inmunizado y que opcionalmente tiene otras propiedades deseables (por ejemplo, incapacidad de expresar productos génicos de Ig endógenos, por ejemplo P3X63 -Ag 8.653 (ATCC No. CRL 1580); NSO, SP20) para producir hibridomas, que son líneas celulares eucariotas inmortales.

Las células linfoides (por ejemplo, bazo) y las células de mieloma pueden combinarse durante unos pocos minutos con un agente que estimula la fusión de membranas, tal como polietilen glicol o un detergente no iónico, y plaquearse a baja densidad en un medio selectivo que apoya el crecimiento de las células de hibridoma pero no de las células de mieloma no fusionadas. Un medio de selección preferido es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente aproximadamente una a dos semanas, se observan colonias de células. Se aíslan colonias únicas, y los anticuerpos producidos por las células pueden ensayarse para actividad de unión a activina A humana, usando uno cualquiera de una variedad de inmunoensayos conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria. Los hibridomas se clonan (por ejemplo, por clonación de dilución limitada o por aislamiento de placa de agar blando) y los clones positivos que producen un anticuerpo específico para activina A se seleccionan y cultivan. Los anticuerpos monoclonales de los cultivos de hibridoma pueden aislarse de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma.

Un método alternativo para la producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singénico, por ejemplo, un ratón que se ha tratado (por ejemplo, se ceban con pristano) para estimular la formación de fluido de ascites que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse por una variedad de técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína-A Sefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño, y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Los anticuerpos monoclonales pueden purificarse por cromatografía de afinidad usando un ligando apropiado seleccionado tomando como base propiedades particulares del anticuerpo (por ejemplo, isotipo de cadena pesada o ligera, especificidad de unión, etc.). Los ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado en un soporte sólido, incluyen Proteína A, Proteína G, un anticuerpo de región anticonstante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo anti-idiotipo, y una proteína de unión a TGF-beta, o fragmento o variante de éstos.

Un anticuerpo de la presente invención también puede ser un anticuerpo monoclonal completamente humano. Se proporciona un anticuerpo completamente humano aislado que se une específicamente a la región de nudo de cisteína (aminoácidos C11-S33 y/o aminoácidos C81-E111) de activina A, en el que la proteína de unión a antígeno posee al menos una actividad biológica in vivo de un anticuerpo anti-activina A humana. La actividad biológica puede ser atenuación de caquexia, por ejemplo caquexia en cáncer de colon, tal como en un modelo de ratón de cáncer de colon descrito en la presente memoria. La caquexia susceptible de dicho tratamiento está asociada con pérdida de peso corporal, pérdida de masa muscular, y/o pérdida de masa grasa. La caquexia puede estar asociada con artritis reumatoide, tal como en el modelo animal de artritis reumatoide inducida por colágeno. El tratamiento con un anticuerpo completamente humano descrito en la presente memoria mejora la pérdida de peso corporal, pérdida de masa muscular, y/o pérdida de masa grasa in vivo en un modelo animal de artritis reumatoide inducida por colágeno. Un anticuerpo completamente humano descrito en la presente memoria mejora la pérdida de peso corporal en un modelo animal transfectado con AAV-activina A. Un anticuerpo completamente humano descrito en la presente memoria, que se une específicamente a la región de nudo de cisteína (aminoácidos C11-S33 y/o aminoácidos C81-E111) de activina A, inhibe la unión de activina A al receptor de activina A in vitro. Un anticuerpo completamente

humano aislado que se une específicamente a la región de nudo de cisteína (aminoácidos C11-S33 y/o aminoácidos C81-E111) de activina A, inhibe la unión de activina A al receptor de activina A in vivo.

Los anticuerpos monoclonales completamente humanos pueden generarse por cualquiera de varias técnicas que serán familiares para los expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen, pero no están limitados a, transformación con el virus de Epstein Barr (EBV) de células de sangre periférica humana (por ejemplo, que contienen linfocitos B), inmunización in vitro de células B humanas, fusión de células de bazo de ratones transgénicos inmunizados que portan genes de inmunoglobulina humana insertados, aislamiento de bibliotecas de fago de región V de inmunoglobulina humana, u otros procedimientos como se conocen en la técnica y basados en la descripción de la presente memoria. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales completamente humanos pueden obtenerse de ratones transgénicos que se han preparado por ingeniería para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a un pulso antigénico. Los métodos para obtener anticuerpos completamente humanos de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, por Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994; Patente U.S. No. 5.877.397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35. En esta técnica, se introducen elementos del locus de cadena pesada y ligera humana en cepas de ratones derivados de líneas de células madre embrionarias que contienen interrupciones dirigidas de los loci de cadena pesada y cadena ligera endógenos (véase también Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)). Por ejemplo, los transgenes de inmunoglobulina humana pueden ser mini-construcciones génicas, o transloci en cromosomas artificiales de levadura, que experimentan reorganización de ADN específico de células B e hipermutación en el tejido linfoide de ratón. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos pueden obtenerse inmunizando los ratones transgénicos, que pueden producir anticuerpos humanos específicos para activina A. Las células linfoides de los ratones transgénicos inmunizados pueden usarse para producir hibridomas secretores de anticuerpos humanos según los métodos descritos en la presente memoria. Los sueros policlonales que contienen anticuerpos completamente humanos también pueden obtenerse de la sangre de los animales inmunizados.

Otro método para generar anticuerpos humanos de la invención incluye inmortalizar células de sangre periférica humana por transformación con EBV. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. No. 4.464.456. Dicha línea celular de células B inmortalizada (o línea celular linfoblastoide) que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a activina A puede identificarse por métodos de inmunodetección como se proporciona en la presente memoria, por ejemplo, un ELISA, y aislarse por técnicas estándar de clonación. La estabilidad de la línea celular linfoblastoide que produce un anticuerpo anti-activina A puede mejorarse fusionando la línea celular transformada con un mieloma murino para producir una línea celular híbrida de ratón-humana según los métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)). Otro método más para generar anticuerpos monoclonales humanos es inmunización in vitro, que incluye cebar células B esplénicas humanas con activina A humana, seguido de la fusión de las células B cebadas con una pareja de fusión heterohíbrida. Véase, por ejemplo, Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147:86-95.

En determinadas realizaciones, una célula B que produce un anticuerpo anti-activina A humana se selecciona y las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada se clonan de la célula B según técnicas de biología molecular conocidas en la técnica (WO 92/02551; Patente U.S. 5.627.052; Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:784348 (1996)) y descritas en la presente memoria. Las células B de un animal inmunizado pueden aislarse del bazo, ganglio linfático, o muestra de sangre periférica seleccionando una célula que está produciendo un anticuerpo que se une específicamente a activina A. Las células B también pueden aislarse de seres humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. Los métodos para detectar células B únicas que están produciendo un anticuerpo con la especificidad deseada son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, por formación de placas, separación celular activada por fluorescencia, estimulación in vitro seguida de detección de anticuerpo específico, y semejantes. Los métodos para seleccionar células B productoras de anticuerpos específicos incluyen, por ejemplo, preparar una suspensión de células únicas de células B en agar blando que contiene activina A humana. La unión del anticuerpo específico producido por la célula B al antígeno resulta en la formación de un complejo, que puede ser visible como un inmunoprecipitado. Después de seleccionar las células B que producen el anticuerpo deseado, los genes del anticuerpo específico pueden clonarse por aislamiento y amplificación del ADN o ARNm según métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria.

Un método adicional para obtener anticuerpos de la invención es por exposición en fagos. Véase, por ejemplo, Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57:191-280. Pueden crearse bibliotecas combinatorias de genes de región variable de inmunoglobulina humana o murina en vectores de fagos que pueden cribarse para seleccionar fragmentos Ig (Fab, Fv, sFv, o multímeros de éstos) que se unen específicamente a la proteína de unión a TGF-beta o variante o fragmento de ésta. Véase, por ejemplo, la Patente

U.S. No. 5.223.409; Huse et al., 1989 Science 246:1275-81; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52 y referencias citadas en ellas. Por ejemplo, puede insertarse una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de región variable de Ig en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o una variante de éste, en marco con la secuencia que codifica una proteína de cubierta del fago. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína de cubierta del fago con el dominio de región variable de cadena ligera y/o con el dominio de región variable de cadena pesada. Según determinadas realizaciones, también

pueden exponerse fragmentos Fab de inmunoglobulina en una partícula de fago (véase, por ejemplo, la Patente U.S. No. 5.698.426).

También pueden prepararse bibliotecas de expresión de ADNc de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina en fago lambda, por ejemplo, usando vectores λImmunoZap™(H) y λImmunoZap™(L) (Stratagene, La Jolla, California). Brevemente, se aísla el ARNm de una población de células B, y se usa para crear bibliotecas de expresión de ADNc de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina en los vectores λImmunoZap(H) y λImmunoZap(L). Estos vectores pueden cribarse individualmente o co-expresarse para formar fragmentos Fab o anticuerpos (véase Huse et al., supra; véase también Sastry et al., supra). Las placas positivas pueden convertirse posteriormente en un plásmido no lítico que permite un alto nivel de expresión de fragmentos de anticuerpo monoclonal de E. coli.

En una realización, en un hibridoma se amplifican las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal de interés usando cebadores de nucleótidos. Estos cebadores pueden sintetizarse por un experto en la técnica, o pueden adquirirse de fuentes disponibles comercialmente. (Véase, por ejemplo, Stratagene (La Jolla, California), que vende cebadores para regiones variables de ratón y humanas incluyendo, entre otros, cebadores para las regiones VHa, VHb, VHc, VHd, CH1, VL y CL). Estos cebadores pueden usarse para amplificar regiones variables de cadena pesada o ligera, que pueden insertarse en vectores tales como ImmunoZAP™H o ImmunoZAP™L (Stratagene), respectivamente. Estos vectores pueden introducirse en E. coli, levadura, o sistemas basados en mamíferos para expresión. Pueden producirse grandes cantidades de una proteína de cadena única que contiene una fusión de los dominios VH y VL usando estos métodos (véase Bird et al., Science 242:423-426, 1988).

Una vez se han obtenido las células que producen anticuerpos según la invención usando cualquiera de las técnicas de inmunización descritas anteriormente y otras, los genes de anticuerpo específico pueden clonarse aislando y amplificando el ADN o ARNm de ellos según procedimientos estándar como se describe en la presente memoria. Los anticuerpos producidos de ellos pueden secuenciarse y las CDR identificarse y el ADN que codifica las CDR puede manipularse como se ha descrito anteriormente para generar otros anticuerpos según la invención.

Los agentes de unión a activina A de la presente invención modulan preferiblemente la función de activina A en el ensayo basado en células descrito en la presente memoria y/o el ensayo in vivo descrito en la presente memoria y/o se unen a uno o más de los dominios de nudo de cisteína descritos en la presente memoria y/o bloquean de manera cruzada la unión de uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud y/o bloquean de manera cruzada la unión a activina A de uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud. De acuerdo con esto, dichos agentes de unión pueden identificarse usando los ensayos descritos en la presente memoria.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos se generan identificando en primer lugar los anticuerpos que se unen a uno o más de los dominios de nudo de cisteína proporcionados en la presente memoria y/o neutralizan en los ensayos basados en células y/o los ensayos in vivo descritos en la presente memoria y/o bloquean de manera cruzada los anticuerpos descritos en esta solicitud y/o bloquean de manera cruzada la unión a activina A de uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud. Las regiones CDR de estos anticuerpos se usan para insertar en marcos biocompatibles apropiados para generar agentes de unión de activina A. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta por aminoácidos, o puede ser una molécula diferente de proteína. Los ensayos descritos en la presente memoria permiten la caracterización de agentes de unión. Preferiblemente, los agentes de unión de la presente invención son anticuerpos como se define en la presente memoria.

Un experto en la técnica entenderá que algunas proteínas, tales como anticuerpos, pueden experimentar una variedad de modificaciones posteriores a la traducción. El tipo y grado de estas modificaciones depende frecuentemente de la línea celular huésped usada para expresar la proteína así como las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en la glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperizina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de una residuo básico carboxi-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, R.J. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).

Ácidos nucleicos

En un aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas. Los ácidos nucleicos comprenden, por ejemplo, polinucleótidos que codifican toda o parte de la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, una o ambas cadenas de un anticuerpo de la invención, o un fragmento, derivado, muteína, o variante de ésta, polinucleótidos suficientes para uso como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores de secuenciación para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido, ácidos nucleicos antisentido para inhibir la expresión de un polinucleótido, y secuencias complementarias de lo anterior. Los ácidos nucleicos pueden tener cualquier longitud. Pueden tener, por ejemplo, una longitud de , 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 o más nucleótidos, y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o ser parte de un ácido nucleico mayor, por ejemplo, un vector. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden comprender nucleótidos de ARN y/o ADN, y variantes artificiales de éstos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos).

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de anticuerpo (por ejemplo, cadena pesada o ligera, sólo dominio variable, o longitud completa) pueden aislarse de células B de ratones que se han inmunizado con activina A. El ácido nucleico puede aislarse por procedimientos convencionales tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Las secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones variables de las regiones variables de cadena pesada y ligera se han mostrado anteriormente. El experto en la técnica apreciará que, debido a la degeneración del código genético, cada una de las secuencias de polipéptido descritas en la presente memoria está codificada por un gran número de otras secuencias de ácido nucleico. La presente invención proporciona cada secuencia de nucleótidos degenerada que codifica cada proteína de unión a antígeno de la invención.

La invención proporciona además ácidos nucleicos que hibridan con otros ácidos nucleicos en condiciones particulares de hibridación. Los métodos para hibridar ácidos nucleicos son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Curr. Prot. in Mol. Biol., John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Como se define en la presente memoria, una condición de hibridación moderadamente astringente usa una disolución de prelavado que contiene 5X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC), 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), tampón de hibridación de aproximadamente 50% formamida, 6X SSC, y una temperatura de hibridación de 55°C (u otras disoluciones de hibridación similares, tales como una que contiene aproximadamente 50% formamida, con una temperatura de hibridación de 42°C), y condiciones de lavado de 60°C, en 0,5X SSC, 0,1% SDS. Una condición de hibridación astringente hibrida en 6X SSC a 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,1X SSC, 0,2% SDS a 68°C. Además, un experto en la técnica puede manipular las condiciones de hibridación y/o lavado para incrementar o disminuir la astringencia de la hibridación de manera que los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que son al menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% idénticas entre sí típicamente permanecen hibridados entre sí. Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridación y la guía para averiguar las condiciones adecuadas se muestran, por ejemplo, por Sambrook, Fritsch, y Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y Curr. Prot. in Mol. Biol. 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4), y pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica tomando como base, por ejemplo, la longitud y/o la composición de bases del ADN.

Pueden introducirse cambios por mutación en un ácido nucleico, dando lugar de esta manera a cambios en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno) que codifica. Las mutaciones pueden introducirse usando cualquier técnica conocida en la técnica. En una realización, uno o más residuos particulares de aminoácidos se cambian usando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis dirigida a sitio. En otra realización, uno o más residuos seleccionados al azar se cambian usando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis al azar. Independientemente de cómo se haga, un polipéptido mutante puede expresarse y cribarse para una propiedad deseada (por ejemplo, unión a activina A).

Las mutaciones pueden introducirse en un ácido nucleico sin alterar significativamente la actividad biológica de un polipéptido que codifica. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótidos que dan lugar a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos no esenciales. En una realización, una secuencia de nucleótidos proporcionada en la presente memoria para A1-A14, o un fragmento, variante, o derivado deseado de ésta, se muta de maneta que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una o más deleciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que se muestran en la presente memoria para A1-A14 que son residuos en los que se diferencian dos o más secuencias. Como se describe en la presente memoria, entre otros, A1-A14 se refiere a 14 secuencias, A1, y A14, así como los 12 residuos de aminoácidos que intervienen. En otra realización, la mutagénesis inserta un aminoácido adyacente a uno o más residuos de aminoácidos mostrados en la presente memoria para A1-A14 que son residuos en los que se diferencian dos o más secuencias. Alternativamente, pueden introducirse una o más mutaciones en un ácido nucleico que cambian selectivamente la actividad biológica (por ejemplo, unión a activina A) de un polipéptido que codifica. Por ejemplo, la mutación puede cambiar cuantitativamente o cualitativamente la actividad biológica. Los ejemplos de cambios cuantitativos incluyen incrementar, reducir o eliminar la actividad. Los ejemplos de cambios cualitativos incluyen el cambio de la especificidad de antígeno de una proteína de unión a antígeno.

En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que son adecuadas para uso como cebadores o sondas de hibridación para la detección de secuencias de ácido nucleico de la invención. Una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender sólo una parte de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de longitud completa de la invención, por ejemplo, un fragmento que puede usarse como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una parte activa (por ejemplo, una parte de unión a activina A) de un polipéptido de la invención.

Las sondas basadas en la secuencia de un ácido nucleico de la invención pueden usarse para detectar el ácido nucleico o ácidos nucleicos similares, por ejemplo, transcritos que codifican un polipéptido de la invención. La sonda puede comprender un grupo marcador, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor de una enzima. Dichas sondas pueden usarse para identificar una célula que expresa el polipéptido.

En otro aspecto, la presente invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención o una parte de éste. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no están limitados a, plásmidos, vectores virales, vectores de mamífero no episomales y vectores de expresión, por ejemplo, vectores de expresión recombinantes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas tomando como base las células huésped que se van a usar para la expresión, que están unidas de manera operativa con la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped (por ejemplo, potenciador del gen temprano de SV40, promotor del virus de sarcoma de Rous y promotor de citomegalovirus), las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido, véase Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237), y las que dirigen la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en respuesta a un tratamiento o condición particular (por ejemplo, el promotor de metalotionina en células de mamífero y el promotor de respuesta a tet y/o el promotor de respuesta a estreptomicina tanto en sistemas procariotas como eucariotas (véase id.). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células huésped para producir de esta manera proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en la presente memoria.

En otro aspecto, la presente invención proporciona células huésped en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota (por ejemplo, E. coli) o célula eucariota (por ejemplo, células de levadura, insecto o mamífero (por ejemplo, células CHO)). El ADN del vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas mediante técnicas convencionales de transformación o transfección. Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usada, sólo una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) se introduce generalmente en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse por selección con fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen del marcador seleccionable sobrevivirán, mientras las otras células mueren), entre otros métodos.

Indicaciones

La descripción proporciona métodos para tratar a un sujeto. El método puede tener, por ejemplo, un efecto beneficioso en la salud del sujeto, por ejemplo, puede incrementar la longevidad esperada del sujeto. Alternativamente, el método puede, por ejemplo, tratar, prevenir, curar, aliviar, o mejorar ("tratar") una enfermedad, trastorno, afección, o dolencia ("una afección"). Entre las afecciones que se van a tratar según la presente invención están afecciones caracterizadas por la expresión o actividad inapropiada de activina A. En algunas de dichas afecciones, el nivel de expresión o actividad es demasiado alto, y el tratamiento comprende administrar un antagonista de activina A como se describe en la presente memoria.

Un ejemplo de un tipo de afección que puede tratarse usando los métodos y composiciones de la descripción es una afección que implica el crecimiento celular, por ejemplo, una afección cancerosa que está acompañada de caquexia. Así, la presente descripción proporciona composiciones y métodos para tratar una afección cancerosa. En particular, la afección cancerosa es un cáncer gonadal, incluyendo tumores del ovario y testículos. (Fujii, Y. et al., Am. J. Phys. Endocrin. Metab., 286:E927-E931, 2004; Reis, F. M. et al., J. Clin. Endocrin. 87:2277-2282, 2005.) La activina A es conocida por su acción en la estimulación de la biosíntesis y secreción de FSH en la glándula pituitaria, y tiene un papel fisiológico en la regulación de la función gonadal. La activina A se ha asociado con muchos tipos de cánceres humanos y en particular con tumores del sistema reproductor. Específicamente, la sobreexpresión o desrregulación de activina A se ha implicado en el cáncer de ovario, (Menon U, et al., BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology; 107(9):1069-74, 2000. Choi KC, et al., Molecular & Cellular Endocrinology. 174(1-2):99-110, 2001; Zheng W, et al., American Journal of Reproductive Immunology. 44(2):104-13, 2000; Lambert-Messerlian GM, et al., Gynecologic Oncology. 74(1):93-7, 1999; Steller MD, et al., Molecular Cancer Research: MCR. 3(1):50-61, 2005; Corbellis L., et al., Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 11(4):203-6, 2004; Welt CK, et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 82(11):3720-7, 1997; y Harada K., et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 81(6):2125-30, 1996, adenocarcinoma endometrial Otani, T, et al., Gynecologic Oncology. 83(1):31-8, 2001;Tanaka T, et al., International Journal of Oncology. 23(3):657-63, 2003 y cáncer de próstata (Thomas TZ, et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 82(11):3851-8, 1997; Zhang, Z, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications. 234(2):362-5, 1997; y Risbridger GP, et al., Molecular & Cellular Endocrinology. 180(12):149-53, 2001

La afección cancerosa puede ser cualquier afección cancerosa que pueda tratarse usando las composiciones comprendidas en la presente memoria, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno activina A tales como anticuerpos

anti-activina A, fragmentos de anticuerpo, o derivados de anticuerpo. Los ejemplos de afecciones cancerosas incluyen por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con SIDA, linfoma relacionado con SIDA, cáncer anal, astrocitoma cerebelar de la infancia, astrocitoma cerebral de la infancia, carcinoma de células basales, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer de vejiga, cáncer de hueso osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, tumores del cerebro (por ejemplo, glioma del tronco cerebral, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma de la ruta visual e hipotalámico), cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, tumor carcinoide gastrointestinal, carcinoma de primario desconocido, sistema nervioso central primario, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, cáncer del cuelo uterino, cánceres de la infancia, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, cáncer colorrectal, linfoma de células T cutáneo, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer esofágico, familia de ewing de tumores, tumor de célula germinal extracranenana, tumor de célula germinal extragonadal, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer de melanoma de ojo intraocular, cáncer de ojo retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumores de célula germinal (por ejemplo, extracraneano, extragonadal, y de ovario), tumor trofoblástico gestacional, glioma (por ejemplo, de adulto, tronco cerebral de la infancia, astrocitoma cerebral de la infancia, ruta visual de la infancia e hipotalámico), leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hipotalámico y de la ruta visual, melanoma intraocular, carcinoma de células del islote (páncreas endocrino), Sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (célula renal), cáncer laríngeo, leucemia (por ejemplo, linfoblástica aguda, mieloide aguda, linfocítica crónica, mielógena crónica, y célula pilosa), cáncer de labio y de la cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma (por ejemplo, relacionado con SIDA, de Burkitt, de célula T cutáneo, de Hodgkin, no de Hodgkin, y sistema nervioso central primario), Macroglobulinemia de Waldenström, histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (ojo), carcinoma de célula Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con primario oculto, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasma de célula plasmática, micosis fungoides, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica, mieloma múltiple, enfermedades mieloproliferativas crónicas, cáncer de la cavidad nasal y seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno del hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de célula germinal de ovario, tumor potencial bajo maligno de ovario, cáncer pancreático, cáncer pancreático de las células de los islotes, cáncer del seno paranasal y de la cavidad nasal, cáncer paratiroides, cáncer del pene, feocromocitoma, pineoblastoma, tumor pituitario, neoplasma de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma del sistema nervioso central primario, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales (riñón), cáncer de células transicionales de la pelvis y uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de la glándula salivar, sarcoma de tejido blando, sarcoma uterino, síndrome de Sezary, cáncer de piel no melanoma, carcinoma de piel de célula de merkel, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejido blando, carcinoma de célula escamosa, linfoma de células T cutáneo, cáncer testicular, timoma, carcinoma tímico, cáncer de tiroides, tumor trofoblástico gestacional, carcinoma de sitio primario desconocido, cáncer de sitio primario desconocido, cáncer uretral, cáncer uterino endometrial, sarcoma uterino, cáncer vaginal, glioma de la ruta visual e hipotalámico, cáncer vulvar, Macroglobulinemia de Waldenström, y Tumor de Wilms.

Se describe un oligopéptido o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica al menos a una de las CDR de los anticuerpos A1-A14; y/o a una CDR de un agente de unión a activina A que bloquea de manera cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos A1-A14 a activina A, y/o se bloquean de manera cruzada para la unión a activina A por al menos uno de los anticuerpos A1-A14; y/o a una CDR de un agente de unión a activina A en el que el agente de unión puede bloquear la unión de activina A al receptor de activina A.

Se describen polipéptidos y anticuerpos como agentes de unión a activina A que tienen secuencias de aminoácidos que son al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idénticas a una región variable de al menos uno de los anticuerpos A1-A14, y bloquea de manera cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos A1-A14 a activina A, y/o se bloquean de manera cruzada para la unión a activina A por al menos uno de los anticuerpos A1-A14; y/o pueden bloquear el efecto inhibidor de activina A sobre un receptor de activina A.

Pueden usarse anticuerpos terapéuticos que se unen específicamente a activina A intacta, en los que las secuencias en la región de aproximadamente C11-S33 (primer bucle) y aproximadamente C81-E111 (segundo bucle) retienen la conformación de la activina A nativa. Dicho mapeo y unión se describe en el Ejemplo 6, más adelante.

Los anticuerpos pueden tener una afinidad de unión para activina A humana de menos de o igual a 1 x 10-7M, menos de o igual a 1 x 10-8M, menos de o igual a 1 x 10-9M, menos de o igual a 1 x 10-10M, menos de o igual a 1 x 10-11M, o menos de o igual a 1 x 10-12M.

La afinidad de un anticuerpo o pareja de unión, así como el grado en el que un anticuerpo inhibe la unión, puede determinarse por un experto en la técnica usando técnicas convencionales, por ejemplo las descritas por Scatchard

et al. (Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660-672 (1949)) o por resonancia de plasmón superficial (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Para la resonancia de plasmón superficial, las moléculas diana se inmovilizan en una fase sólida y se exponen a ligandos en una fase móvil que corre a lo largo de una celda de flujo. Si se produce la unión del ligando a la diana inmovilizada, el índice refractario cambia, dando lugar a un cambio en el ángulo SPR, que puede monitorizarse en tiempo real detectando cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las proporciones de cambio de la señal SPR pueden analizarse para rendir constantes de proporción aparentes para las fases de asociación y disociación de la reacción de unión. La velocidad de estos valores proporciona la constante de equilibrio aparente (afinidad) (véase, por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)).

Un anticuerpo según la presente invención puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, o IgA. Puede obtenerse de o derivar de un animal, por ejemplo, ave de corral (por ejemplo, pollo) y mamíferos, que incluye pero no está limitado a un ratón, rata, hámster, conejo, u otro roedor, vaca, caballo, oveja, cabra, camello, ser humano, u otro primate. El anticuerpo puede ser un anticuerpo internalizante. La producción de anticuerpos se describe generalmente en la Publicación de Patente U.S. No. 2004/0146888 A1.

Ensayos de Caracterización

En los métodos descritos anteriormente para generar anticuerpos según la invención, incluyendo la manipulación de las CDR específicas de A1-A14 en nuevos marcos y/o regiones constantes, están disponibles ensayos apropiados para seleccionar los anticuerpos deseados (es decir, ensayos para determinar la afinidad de unión a activina A; ensayos de bloqueo cruzado; ensayo de competición de unión basado en Biacore;" ensayos in vivo).

Métodos terapéuticos y administración de proteínas de unión a antígeno

Determinados métodos descritos en la presente memoria comprenden administrar una proteína de unión a antígeno que se une a activina A a un sujeto, mediante lo cual se reduce una respuesta biológica inducida por activina A que juega un papel en una afección particular. En particular, los métodos como se describe implican poner en contacto activina A endógena con una proteína de unión a antígeno que se une a activina A, por ejemplo, mediante la administración a un sujeto o en un procedimiento ex vivo.

El término "tratamiento" engloba el alivio o prevención de al menos un síntoma u otro aspecto de un trastorno, o reducción de la gravedad de la enfermedad, y semejantes. Además, "tratamiento" se refiere además a administrar un agente terapéutico como se describe en la presente memoria para prevenir o aliviar al menos un síntoma u otro aspecto de un trastorno en un sujeto que lo necesita. Una proteína de unión a antígeno no necesita efectuar una cura completa, o erradicar cada síntoma o manifestación de una enfermedad, para constituir un agente terapéutico viable. Como se reconoce en el campo pertinente, los fármacos empleados como agentes terapéuticos pueden reducir la gravedad de un estado patológico dado, pero no necesitan suprimir cada manifestación de la enfermedad para ser considerados como agentes terapéuticos útiles. De forma similar, un tratamiento administrado profilácticamente no necesita ser completamente eficaz en la prevención del inicio de una afección con el fin e constituir un agente profiláctico viable. Es suficiente con reducir simplemente el impacto de una enfermedad (por ejemplo, reducir el número o gravedad de sus síntomas, o incrementar la eficacia de otro tratamiento, o producir otro efecto beneficioso), o reducir la probabilidad de que la enfermedad ocurrirá o empeorará en un sujeto. Una realización de la invención está dirigida a un método que comprende administrar a un paciente un antagonista de activina A en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora sostenida sobre la línea base de un indicador que refleja la gravedad del trastorno particular.

Como se entiende en el campo pertinente, las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de la invención se administran a un sujeto que lo necesita de una manera apropiada para la indicación. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por cualquier técnica adecuada, incluyendo pero no limitado a parenteralmente, tópicamente, o por inhalación. Si se inyectan, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse, por ejemplo, mediante rutas intra-articular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutánea, por inyección en bolo, o infusión continua. Se contempla la administración localizada, por ejemplo, en un sitio de enfermedad o lesión, al igual que la administración transdérmica y liberación sostenida de implantes. La administración por inhalación incluye, por ejemplo, inhalación nasal u oral, uso de un nebulizador, inhalación del antagonista en forma de aerosol, y semejantes. Otras alternativas incluyen gotas oculares; preparaciones orales incluyendo píldoras, jarabes, pastillas o chicle; y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, pulverizadores, y pomadas.

Se describe el uso de proteínas de unión a antígeno en procedimientos ex vivo. Por ejemplo, la sangre de un paciente u otro fluido corporal puede ponerse en contacto con una proteína de unión a antígeno que se une a activina A de longitud completa, una o más isoformas de activina A, u otra activina A con longitud parcial ex vivo. La proteína de unión a antígeno puede unirse a una matriz insoluble o material de soporte sólido adecuados.

Ventajosamente, las proteínas de unión a antígeno se administran en la forma de una composición que comprende uno o más componentes adicionales tales como un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Opcionalmente, la composición comprende además uno o más agentes fisiológicamente activos, por ejemplo, una segunda sustancia inhibidora del receptor de activina A, una sustancia anti-angiogénica, una sustancia

quimioterapéutica, una sustancia analgésica, etc., los ejemplos non-exclusivos de las cuales se proporcionan en la presente memoria. En varias realizaciones particulares, la composición comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis agentes fisiológicamente activos además de una proteína de unión a antígeno que se une a activina A.

En una realización la composición farmacéutica comprende una proteína de unión a antígeno de la invención junto con una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en un tampón, un antioxidante tal como ácido ascórbico, un polipéptido de bajo peso molecular (tal como los que tienen menos de 10 aminoácidos), una proteína, un aminoácido, un carbohidrato tal como glucosa, sacarosa o dextrinas, un agente quelante tal como EDTA, glutatión, un estabilizador, y un excipiente. La disolución salina tamponada neutra o disolución salina mezclada con albúmina de son ejemplos de diluyentes apropiados. Según estándares industriales apropiados, también pueden añadirse conservantes tales como alcohol bencílico. La composición puede formularse como un liofilizado usando disoluciones de excipiente apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Los componentes adecuados no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Los ejemplos adicionales de componentes que pueden emplearse en formulaciones farmacéuticas se presentan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed. (1980) y 20a Ed. (2000), Mack Publishing Company, Easton, PA.

Los kits para uso por los médicos incluyen una proteína de unión a antígeno de la invención y una etiqueta u otras instrucciones para uso en el tratamiento de cualquiera de las afecciones discutidas en la presente memoria. En una realización, el kit incluye una preparación estéril de una o más proteínas de unión a antígeno, que pueden estar en la forma de una composición como se ha descrito anteriormente, y puede estar en uno o más viales.

Las dosificaciones y la frecuencia de administración puede variar según factores tales como la ruta de administración, las proteínas de unión a antígeno particulares empleadas, la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se va a tratar, si la afección es aguda o crónica, y el tamaño y condición general del sujeto. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse por procedimientos conocidos en la técnica pertinente, por ejemplo, en estudios clínicos que pueden implicar estudios de escalada de la dosis.

Una proteína de unión a antígeno de la invención puede administrarse, por ejemplo, una vez o más de una vez, por ejemplo, a intervalos regulares durante un periodo de tiempo. En realizaciones particulares, una proteína de unión a antígeno se administra durante un periodo de al menos un mes o más, por ejemplo, durante uno, dos, o tres meses

o incluso indefinidamente. Para el tratamiento de afecciones crónicas, lo más eficaz generalmente es el tratamiento a largo plazo. Sin embargo, para el tratamiento de afecciones agudas, puede ser suficiente la administración durante periodos más cortos, por ejemplo, de una a seis semanas. En general, la proteína de unión a antígeno se administra hasta que el paciente manifiesta un grado médicamente relevante de mejoría sobre la línea base para el indicador o indicadores elegidos.

Las realizaciones particulares de la presente invención implican administrar una proteína de unión a antígeno a una dosificación de aproximadamente 1 ng de proteína de unión a antígeno por kg del peso del sujeto al día ("1 ng/kg/día") a aproximadamente 10 mg/kg/día, más preferiblemente de aproximadamente 500 ng/kg/día a aproximadamente 5 mg/kg/día, y lo más preferiblemente de aproximadamente 5 µg/kg/día a aproximadamente 2 mg/kg/día, a un sujeto. En realizaciones adicionales, una proteína de unión a antígeno se administra a adultos una vez por semana, dos veces por semana, o tres o más veces por semana, para tratar una enfermedad, afección o trastorno mediado por activina A, por ejemplo, un trastorno médico descrito en la presente memoria. Si se inyecta, la cantidad eficaz de proteína de unión a antígeno por dosis en adultos puede variar de 1-20 mg/m2, y preferiblemente es aproximadamente 5-12 mg/m2. Alternativamente, puede administrarse una dosis plana; la cantidad puede variar de 5-100 mg/dosis. Un intervalo para una dosis plana es aproximadamente 20-30 mg por dosis. En una realización de la invención, una dosis plana de 25 mg/dosis se administra repetidamente por inyección. Si se usa una ruta de administración distinta de inyección, la dosis se ajusta apropiadamente según prácticas médicas estándar. Un ejemplo de un régimen terapéutico implica inyectar una dosis de aproximadamente 20-30 mg de proteína de unión a antígeno una a tres veces por semana durante un periodo de al menos tres semanas, aunque puede ser necesario un tratamiento durante periodos más largos para inducir el grado deseado de mejoría. Para sujetos pediátricos (edad 4-17), un régimen adecuado ejemplar implica la inyección subcutánea de 0,4 mg/kg, hasta una dosis máxima de 25 mg de proteína de unión a antígeno administrada dos o tres veces por semana.

Las realizaciones particulares de los métodos proporcionados en la presente memoria implican la inyección subcutánea de 0,5 mg a 10 mg, preferiblemente de 3 a 5 mg, de una proteína de unión a antígeno, una o dos veces por semana. Otra realización está dirigida a la administración pulmonar (por ejemplo, por nebulizador) de 3 o más mg de proteína de unión a antígeno una vez por semana.

Los ejemplos de regímenes terapéuticos proporcionados en la presente memoria comprenden la inyección subcutánea de una proteína de unión a antígeno una vez por semana, a una dosis de 1,5 a 3 mg, para tratar una afección en la que la señalización de activina A juega un papel. Los ejemplos de dichas afecciones se proporcionan en la presente memoria e incluyen, por ejemplo, caquexia, cáncer, artritis reumatoide, y todas las afecciones en las que juega un papel la pérdida de peso corporal, masa corporal, grasa corporal, o incapacidad para mantener el peso corporal, masa corporal, grasa corporal. La administración semanal de proteína de unión a antígeno se continúa hasta que se consigue un resultado deseado, por ejemplo, la supresión de los síntomas en el sujeto. El tratamiento puede reanudarse según se necesite, o, alternativamente, pueden administrarse dosis de mantenimiento.

Otros ejemplos de regímenes terapéuticos proporcionados en la presente memoria comprenden la administración subcutánea o intravenosa de una dosis de 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, ó 20 miligramos de un inhibidor de activina A de la presente invención por kilogramo de masa corporal del sujeto (mg/kg). La dosis puede administrarse una vez al sujeto, o más de una vez a un intervalo determinado, por ejemplo, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez al mes, tres veces al mes, dos veces al mes, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses, o una vez al año. La duración del tratamiento, y cualesquiera cambios en la dosis y/o frecuencia de tratamiento, pueden alterarse o variarse durante el curso del tratamiento con el fin de cumplir con las necesidades particulares del sujeto.

En otra realización, una proteína de unión a antígeno se administra al sujeto en una cantidad y durante un tiempo suficiente como para inducir una mejoría, preferiblemente una mejoría sostenida, en al menos un indicador que refleja la gravedad del trastorno que se está tratando. Varios indicadores que reflejan el grado de la dolencia, enfermedad o afección del sujeto pueden evaluarse para determinar si es suficiente la cantidad y tiempo del tratamiento. Dichos indicadores incluyen, por ejemplo, indicadores clínicamente reconocidos de gravedad de la enfermedad, síntomas, o manifestaciones del trastorno en cuestión. En una realización, se considera que una mejoría es sostenida si el sujeto presenta una mejoría en al menos dos ocasiones separadas por dos a cuatro semanas. El grado de mejoría lo determina generalmente un médico, que puede hacer esta determinación tomando como base los signos, síntomas, biopsias, u otros resultados de ensayos, y que también puede emplear cuestionarios que se administran al sujeto, tales como cuestionarios sobre calidad de vida desarrollados para una enfermedad dada.

Los niveles de activina A de un sujeto pueden monitorizarse antes, durante y/o después del tratamiento con una proteína de unión a antígeno, para detectar cambios, si existen, en sus niveles. Para algunos trastornos, la incidencia de niveles elevados de activina A puede variar según factores tales como el estadio de la enfermedad o la forma particular de la enfermedad. Pueden emplearse técnicas conocidas para medir los niveles de activina A, por ejemplo, en el suero de un sujeto. Los niveles de activina A en muestras de sangre pueden medirse usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, ELISA.

Las realizaciones particulares de métodos y composiciones de la invención implican el uso de una proteína de unión a antígeno y uno o más antagonistas adicionales de activina A, por ejemplo, dos o más proteínas de unión a antígeno de la invención, o una proteína de unión a antígeno de la invención y uno o más antagonistas diferentes de activina A. En realizaciones adicionales, las proteínas de unión a antígeno se administran solas o en combinación con otros agentes útiles para tratar la afección que padece el sujeto. Los ejemplos de dichos agentes incluyen fármacos tanto proteináceos como no proteináceos. Cuando se co-administran múltiples terapéuticos, las dosificaciones pueden ajustarse de acuerdo con esto, como se reconoce en la técnica pertinente. "Coadministración" y terapia de combinación no están limitados a la administración simultánea, sino que también incluye regímenes de tratamiento en los que una proteína de unión a antígeno se administra al menos una vez durante un curso de tratamiento que implica administrar al menos un agentes terapéutico diferente al paciente.

Los ejemplos de otros agentes que pueden co-administrarse con una proteína de unión a antígeno son otras proteínas de unión a antígeno o polipéptidos terapéuticos que se eligen según la afección particular que se va a tratar. Alternativamente, los fármacos no proteináceos que son útiles para tratar una de las afecciones particulares discutidas anteriormente pueden co-administrarse con un antagonista de activina A.

Terapia de combinación

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para tratar un sujeto con una proteína de unión a antígeno que inhibe la activina A y uno o más tratamientos diferentes. Dicha terapia de combinación consigue sinergia o un efecto aditivo, por ejemplo, atacando múltiples sitios o dianas moleculares en un tumor. Los tipos de terapias de combinación que pueden usarse en conexión con la presente invención incluyen inhibir o activar (según sea apropiado) múltiples nodos en una única ruta relacionada con la enfermedad, múltiples rutas en una célula diana, y múltiples tipos celulares en un tejido diana (por ejemplo, en un tumor). Por ejemplo, un inhibidor de activina A de la presente invención puede combinarse con un tratamiento que estimula la apoptosis o inhibe la angiogénesis. En otra realización, un agente dirigido, que, cuando se usa por sí mismo, no incita un efecto terapéutico deseado, podría usarse, por ejemplo, para sensibilizar las células cancerosas o aumentar el efecto del tratamiento de otros agentes. Un inhibidor de activina A según la invención se usa en combinación con un fármaco citotóxico u otro agente dirigido que induce apoptosis. O un inhibidor de activina A se usa en combinación con uno o más agentes que inhiben diferentes dianas que están implicadas en la supervivencia celular (por ejemplo, PKB, mTOR), diferentes tirosina quinasas de receptor (por ejemplo, ErbB1, ErbB2, c-Met, c-kit), o diferentes tipos celulares (por ejemplo, inhibidores KDR, c-fms). O un inhibidor de activina A de la invención se añade a la atención médica estándar existente para una afección particular. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen, pero no están limitados a, gemcitabina, taxol, taxotere, y CPT-11.

Además, el método descrito comprende administrar uno o más antagonistas de activina A descritos en la presente memoria y uno o más tratamientos diferentes (por ejemplo, un tratamiento terapéutico o paliativo), por ejemplo, tratamientos anti-cáncer (tales como cirugía, ultrasonidos, radioterapia, quimioterapia, o tratamiento con otro agente anti-cáncer). Cuando un método comprende administrar más de un tratamiento a un sujeto, debe entenderse que el

orden, momento en el tiempo, número, concentración, y volumen de las administraciones está limitado sólo por los requerimientos médicos y limitaciones del tratamiento, es decir, dos tratamientos pueden administrarse al sujeto, por ejemplo, simultáneamente, consecutivamente, alternamente, o según cualquier otro régimen. Los ejemplos de agentes que pueden administrarse en combinación con los antagonistas de activina A descritos en la presente memoria incluyen, pero no están limitados a, agentes de refuerzo de neutrófilos, irinotecán, SN-38, gemcitabina, herstatina, o un derivado de herstatina de unión a activina A (como se describe, por ejemplo, en Solic. Pat. U.S. No. 05/0272637), AVASTIN® (Genentech, San Francisco Sur, CA), HERCEPTIN® (Genentech), RITUXAN® (Genentech), ARIMIDEX® (AstraZeneca, Wilmington, DE), IRESSA® (AstraZeneca), BEXXAR® (Corixa, Seattle, WA), ZEVALIN® (Biogen Idec, Cambridge, MA), ERBITUX® (Imclone Systems Inc., Nueva York, NY), GEMZAR® (Eli Lilly and Co., Indianápolis, IN), CAMPTOSAR® (Pfizer, Nueva York, NY), GLEEVEC® (Novartis), SU-11248 (Pfizer), BMS-354825 (Bristol-Myers Squibb), panitumumab (Abgenix, Fremont, CA/Amgen Inc., Thousand Oaks, CA), y denosumab (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA).

El desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en la presente memoria en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo por ejemplo, administración subcutánea, oral, parenteral, intravenosa, intranasal, e intramuscular y formulación, es muy conocido en la técnica, algunos de los cuales se discuten brevemente más adelante para propósitos generales de ilustración.

En determinadas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden administrarse mediante administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con vehículo comestible asimilable, o pueden incluirse en una cápsula de gelatina de cubierta dura

o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta.

En determinadas circunstancias, será deseable administrar las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria subcutáneamente, parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, o incluso intraperitonealmente. Dichas estrategias son muy conocidas para el experto en la técnica, algunas de las cuales se describen adicionalmente, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 5.543.158; Patente U.S. No. 5.641.515 y Patente U.S. No. 5.399.363. En determinadas realizaciones, pueden prepararse disoluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de éstos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contendrán generalmente un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones estériles inyectables (por ejemplo, véase la Patente U.S. No. 5.466.468). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado en el que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y deben conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol, y polietilen glicol líquido, y semejantes), mezclas adecuadas de éstos, y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y/o por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede facilitarse mediante diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo usando en las composiciones agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En una realización, para administración parenteral en una disolución acuosa, la disolución debe tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido hacerse en primer lugar isotónico con disolución salina o glucosa suficiente. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, un medio acuoso estéril que puede emplearse será conocido por los expertos en la técnica a la vista de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de disolución isotónica de NaCl y bien añadirse a 1.000 ml de fluido hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed., p. 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se está tratando. Además, para administración a seres humanos, las preparaciones cumplirán, por supuesto, preferiblemente con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, y los estándares de seguridad y pureza generales según requieren los estándares de FDA Office of Biologics.

En otra realización de la invención, las composiciones descritas en la presente memoria pueden formularse en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y semejantes. También pueden derivarse sales formadas con los grupos carboxilo libres a partir de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o hierro, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y semejantes. Después de la formulación, las disoluciones se

administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que es terapéuticamente eficaz.

Los vehículos pueden comprender además cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, tampones, disoluciones vehiculares, suspensiones, coloides, y semejantes. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es muy conocido en la técnica. Excepto en tanto que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios en las composiciones. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o similar inapropiada se administran a un ser humano.

En determinadas realizaciones, se usan liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas de lípido, vesículas, y semejantes, para la introducción de las composiciones de la presente invención en células huésped/organismos adecuados. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para administración bien encapsuladas en una partícula de lípido, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, o una nanopartícula o semejantes. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden unirse, bien covalentemente o no covalentemente, a la superficie de dichos vehículos transportadores.

La formación y uso de liposomas y preparaciones semejantes a liposomas como potenciales vehículos de fármaco se conoce generalmente por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 16(7):307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56(3):691-95, 1998; Chandran et al., Indian J. Exp. Biol. 35(8):801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3):233-61, 1995; Patente U.S. No. 5.567.434; Patente U.S. No. 5.552.157; Patente U.S. No. 5.565.213; Patente U.S. No. 5.738.868 y Patente U.S. No. 5.795.587). El uso de liposomas no parece estar asociado con respuestas autoinmunes o toxicidad inaceptable después de administración sistémica. En determinadas realizaciones, los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapa concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLV)).

Alternativamente, en otras realizaciones, la invención proporciona formulaciones en nanocápsula farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas pueden atrapar generalmente compuestos de una forma estable y reproducible (véase, por ejemplo, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12):1113-28, 1998). Para evitar los efectos secundarios debidos a sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (con un tamaño de aproximadamente 0,1µm) pueden diseñarse usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Dichas partículas pueden prepararse como se describe, por ejemplo, por Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1):1-20, 1988; zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2):149-55, 1998; Zambaux et al., J. Controlled Release 50(1-3):31-40, 1998; y Patente U.S. No. 5.145.684.

Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ponerse en contenedores, junto con material de envasado que proporciona instrucciones respecto al uso de dichas composiciones farmacéuticas. Generalmente, dichas instrucciones incluirán una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, así como en determinadas realizaciones, las cantidades relativas de ingredientes excipientes o diluyentes (por ejemplo, agua, disolución salina o PBS) que pueden ser necesarios para reconstituir la composición farmacéutica.

La dosis administrada puede variar de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal. Como será evidente para un experto en la técnica, la cantidad y frecuencia de la administración dependerá, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y gravedad de la indicación que se está tratando, la respuesta deseada, la condición del paciente, etcétera. Típicamente, las composiciones pueden administrarse por una variedad de técnicas, como se ha indicado anteriormente.

La descripción también proporciona un kit de diagnóstico que comprende al menos un agente de unión anti-activina A según la presente invención. El agente de unión puede ser un anticuerpo. Además, dicho kit puede comprender opcionalmente uno o más de lo siguiente:

(1)

instrucciones para usar el uno o más agente(s) de unión para cribar, diagnosticar, pronosticar, monitorizar terapéuticamente o cualquier combinación de estas aplicaciones;

(2)

una pareja de unión marcada del o de los agentes de unión anti-activina A;

(3)

una fase sólida (tal como una tira reactiva) sobre la que se inmoviliza el o los agentes de unión anti-activina A; y

(4)

una etiqueta o prospecto que indica la aprobación reguladora para el cribado, diagnóstico, pronóstico o uso terapéutico o cualquier combinación de éstos.

Si no se proporciona ninguna pareja de unión marcada del o de los agentes de unión, el agente o los agentes de unión en sí mismos pueden marcarse con uno o más marcadores detectables, por ejemplo, un resto quimioluminiscente, enzimático, fluorescente, o radioactivo.

Los ejemplos siguientes se ofrecen como ilustración, y no como limitación. Los ejemplos que no se encuentran en el alcance de las reivindicaciones se proporcionan como ejemplos comparativos.

Ejemplos

Ejemplo 1

EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE ACTIVINA A

Ultra filtración y diafiltración (UF/DF) de medio condicionado. R-HuActivinaA se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO). Se desarrollaron una serie de etapas para generar un material activo purificado. El proceso de purificación empezó con la concentración (dialfiltración) del medio condicionado (C.M.) entre 15 a 20 veces usando un cartucho en espiral Amicon S10Y10. El medio se sometió a intercambio de tampón (diafiltró) usando 5 volúmenes de 10mM tampón tris Ph 7,0, se filtró y se almacenó.

Cromatografía de Intercambio Catiónico. La r-HuActivina A se aplicó a 5 ml/minuto a 4-80C a una columna 2,6 X 7 cm (Pharmacia) S-Sefarosa Fast Flow equilibrada en 10 mM tampón Tris Ph 7,0. La columna se lavó con el tampón de equilibrado. La r-HuActivina A se eluyó de la columna con un gradiente de concentración creciente de cloruro de sodio hasta 0,4M durante 20 volúmenes de columna tamponado con 10Mm Tris Ph 7,0. Las fracciones apropiadas se combinaron y se almacenaron a 4-80C.

Cromatografía en Fase Reversa HPLC C4. El pH del combinado de la columna de S-Sefarosa se ajustó a 2,0 con ácido trifluroacético (TFA). El combinado se aplicó a una columna 1 X 25 cm Vydac C4 a temperatura ambiente equilibrada con 75% tampón A (0,1 % TFA en agua), y 25% tampón B (90% acetonitrilo, 0,1% TFA, 9,9% agua). La columna se lavó con el tampón de equilibrado. La R-HuActivina A se eluyó con un gradiente de 25% tampón B a 50% tampón B durante 50 minutos a una velocidad de flujo de 5 ml/minuto. Las fracciones apropiadas se combinaron, y se liofilizaron.

Cromatografía de Intercambio Catiónico de Alta Resolución. Una columna de 5ml S Sefarosa de Alta Resolución se equilibró con 8M urea, 10 mM fosfato de sodio, Ph 7,0 (tampón A) a temperatura ambiente. El combinado C4 liofilizado se resuspendió en tampón A y se aplicó a 5 ml/minuto, y se lavó con tampón A. La r-HuActivina A se eluyó de la columna con un gradiente de concentración creciente de cloruro de sodio hasta 0,15M durante 30 volúmenes de columna tamponado con 8M urea, 10Mm fosfato de sodio pH 7,0. Las fracciones apropiadas se combinaron y se almacenaron a 4-80°C.

Cromatografía en Fase Reversa HPLC C4. El pH del combinado de la columna de S-Sefarosa se ajustó a 2,0 con ácido trifluroacético (TFA). El combinado se aplicó a una columna 1 X 25 cm Vydac C4 a temperatura ambiente equilibrada con 75% tampón A (0,1 % TFA en agua), y 25% tampón B (90% acetonitrilo, 0,1% TFA, 9,9% agua). La columna se lavó extensamente para eliminar la urea y las sales con el tampón de equilibrado. La R-HuActivina A se eluyó con un gradiente de 25% tampón B a 50% tampón B durante 50 minutos a una velocidad de flujo de 5 ml/minuto. Las fracciones apropiadas se combinaron, y la r-HuActivina A final purificada se liofilizó y se almacenó en alicuotas -80°C. SEQ ID NO:225 proporciona la secuencia de aminoácidos para activina A.

Ejemplo 2

GENERACIÓN DE HIBRIDOMAS ANTI-ACTIVINA A

Se produjeron anticuerpos frente a activina A en ratones XenoMouse® (Abgenix, Fremont, Calif.), que son ratones que contienen genes de inmunoglobulina humana. Se usó la cepa XenoMouse® XMG2 se usó para producir anticuerpos IgG2 Kappa completamente humanos. Se usó una segunda cepa para producir anticuerpos IgG4 Kappa completamente humanos. Los ratones se inmunizaron con activina A.

Se inyectó a los ratones el antígeno (activina A) según protocolos estándar (US 2005/0118643; WO 2005/694879) en las almohadillas de las patas posteriores (5 µg por almohadilla de la pata). Las inyecciones iniciales contenían el adyuvante TiterMax® Gold (Sigma, Cat # T2684). En inyecciones posteriores, se inyectó a cada ratón un total de 5 µg de antígeno en el adyuvante gel alum (adyuvante de gel de fosfato de aluminio; Superfos Biosector a/s, distribuido por E. M. Sargent Pulp and Chemical Co., Clifton N.J., cat # 1452-250). La inyección final contenía un total de 10 µg de antígeno por ratón y no contenía un adyuvante.

Cada ratón se sangró dos días después de la sexta inyección. Las muestras de sangre de estos sangrados se ensayaron por ELISA para determinar la titulación de anticuerpos frente a activina A. Cuatro días después de la inyección final, los ratones se sacrificaron y sus ganglios linfáticos drenantes se recogieron y se recuperaron los linfocitos. Los linfocitos de los ratones de cada uno de los tres grupos se combinaron separadamente. Para enriquecer las muestras de linfocitos en células B, se deplecionaron las células T añadiendo lechos magnéticos anti-CD90 (Miltenyi Biotech cat. #491-01) y pasando los linfocitos a través de una columna LS+ (Miltenyi Biotech cat. # 424-01).

Cada una de las muestras de linfocitos enriquecidos en células B se fusionó con células de mieloma P3 usando un dispositivo de fusión electrocell (Genetronic, Inc., Modelo ECM 2001) para crear hibridomas. Los tres grupos de líneas de hibridoma fusionados se plaquearon en placas de 96 pocillos con medio de hibridoma como se describe (WO 2005/094879) aunque pueden usarse otros medios adecuados conocidos en la técnica. Las líneas de hibridoma se cultivaron durante 14 días a 37°C, en 15% CO2.

Después de 14 días, los sobrenadantes de los cultivos se ensayaron por ELISA para detectar la presencia de anticuerpos IgG humanos frente a activina A. Los sobrenadantes de los cultivos que se ensayaron como positivos en ese ELISA se ensayaron para la presencia de la cadena kappa humana en un segundo ELISA. En ese segundo ELISA, las condiciones fueron idénticas a las del primer ELISA, excepto que el anticuerpo secundario fue un anticuerpo de cabra anti-cadena kappa humana conjugado con peroxidasa de rábano. Los hibridomas que se ensayaron como positivos en ambos ensayos ELISA se expandieron adicionalmente para producir 5 ml de sobrenadante para ensayo posterior.

Un total de 160 muestras de hibridoma anti-activina A derivadas de los xeno ratones se cribaron usando un ensayo funcional basado en células y análisis de unión BIAcore como se describe en los Ejemplos más adelante. Veintitrés hibridomas se caracterizaron adicionalmente para sus propiedades respecto a la expresión, purificación, ensayo basado en células, análisis de unión, análisis de secuencia, MS, y SEC. De éstos, se identificaron tres Mabs potentes, A1, A2, y A3, para ensayo adicional como se describe más adelante. Las secuencias de aminoácidos para estos anticuerpos son como sigue: A1: SEQ ID NO:9 (variable cadena ligera); SEQ ID NO:84 (constante cadena ligera); SEQ ID NO:10 (variable cadena pesada); y SEQ ID NO:214 (constante cadena pesada).A2: SEQ ID NO:25 (variable cadena ligera); SEQ ID NO:100 (constante cadena ligera); SEQ ID NO:26 (variable cadena pesada); y SEQ ID NO:215 (constante cadena pesada). A3: SEQ ID NO:41 (variable cadena ligera); SEQ ID NO:108 (constante cadena ligera); SEQ ID NO:42 (variable cadena pesada); y SEQ ID NO:221 (constante cadena pesada).

Ejemplo 3

EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-HUACTIVINA A HUMANOS EN CÉLULAS CHO

Las células CS-9 usadas para transfección de los plásmidos de expresión de anti-huActivina A eran una línea celular CHO en suspensión sin suero. El clon CS-9 se seleccionó como la línea celular huésped para la expresión de proteínas recombinantes y se depositaron en medio sin suero. El depósito se ensayó para agentes adventicios y esterilidad y se encontró que no tenía agentes virales, micoplasma y microbianos.

Las líneas celulares que expresan anti-hu Activina A se aumentaron de escala usando un proceso discontinuo típico. Las células se inocularon en un biorreactor Wave después de la expansión. El cultivo se alimentó tres veces en aproximadamente el día 3, día 5 y día 9 con alimentaciones en bolo y se recogieron el día 11. Las células se centrifugaron y el medio condicionado se filtró a través de un pre filtro de diez pulgadas 0,45/0,2 micrómetros, seguido de una filtración a través de un filtro seis pulgadas 0,2 micrómetros.

Purificación de Mab del medio condicionado (C.M.) de hibridoma:

A entre 7 a 10 ml de C.M. se añadieron 100 µl de una suspensión de sólidos 1:2 de resina Mab Select equilibrada en PBS. Los tubos se pusieron en rotadores a 4-8°C toda la noche. Los tubos se centrifugaron a 1.000 X g durante 5 minutos y la fracción no unida se descantó. La resina se lavó con 5ml de PBS, y se centrifugó y se decantó como anteriormente. La resina se transfirió a un tubo de 2 ml SPIN-X, 0,45um. La resina se lavó adicionalmente dos veces con 0,5ml de PBS, y se centrifugó. Los Mab se eluyeron con 0,2ml de 0,1M ácido acético incubando a temperatura ambiente con mezclado ocasional durante 10 minutos. Los tubos se centrifugaron, y se añadieron al eluato 30ul de 1M tampón Tris Ph 8,0. Los Mab purificados se almacenaron a 4-8°C.

Ejemplo 4

ENSAYO DE ACTIVIDAD DE ACTIVINA BASADO EN CÉLULAS C2C12

Este ensayo demuestra la capacidad neutralizante de activina A del anticuerpo que se está ensayando midiendo el grado de inhibición de unión de activina A a su receptor. Se generó una línea celular informadora que responde a activina por transfección de células de mioblasto C2C12 (ATCC No: CRL-1772) con una construcción pMARE-luc. La construcción pMARE-luc se preparó clonando doce repeticiones de la secuencia CAGA, que representan los elementos de respuesta a activina (Dennler et al. EMBO 17: 3091-3100 (1998)) en un vector informador pLuc-MCS (Stratagene cat # 219087) antes del extremo 5' de la caja TATA. Las células de mioblasto C2C12 expresan de forma natural los receptores de activina IIB (actRIIB) en la superficie celular. Cuando la activina se une a los receptores celulares, se activa la ruta Smad, y Smad fosforilado se une al elemento de respuesta (Macias-Silva et al. Cell 87:1215 (1996)), lo que resulta en la expresión del gen de la luciferasa. La actividad luciferasa se mide usando un kit de ensayo informador de luciferasa comercial (cat # E4550, Promega, Madison, WI) según el protocolo del fabricante.

Una línea estable de células C2C12 que se había transfectado con pMARE-luc (C2C12/pMARE clon #44) se usó para medir la actividad activina según el procedimiento siguiente.

Se plaquearon números iguales de las células informadoras (C2C12/pMARE clon #44) en cultivos de 96 pocillos. Se realizó un primer ciclo de cribado usando dos diluciones de medio condicionado que contiene anticuerpos con la concentración de activina A fijada a 4 nM. La activina A madura recombinante se pre-incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con medio condicionado a 2 x y 5 x diluciones respectivamente. El cultivo de células informadoras se trató con activina con o sin anticuerpos durante seis horas. La actividad de activina A se midió determinando la actividad luciferasa en los cultivos tratados. Este ensayo se usó para identificar inicialmente los anticuerpos que inhibían la actividad de señalización de activina A en el ensayo informador. Posteriormente, se generó una curva de titulación de nueve puntos con la concentración de activina A fijada a 4 nM. La activina A se preincubó con cada una de las nueve concentraciones siguientes de anticuerpos purificados: 0,004 nM, 0,04 nM, 0,4 nM, 4 nM, 20 nM, 40 nM, 200 nM, 400 nM y 2 µM durante una hora antes de añadir la mezcla al cultivo celular informador. Los valores de CI50 para un número de anticuerpos A1, A2 y A3 se proporcionan en la Tabla 3.

Tabla 3

MAb

CI50 de Células (nM)

A1

< 3

A2

< 3

A3

< 3

Ejemplo 5

ENSAYO BIACORE®

Se realizó un análisis de afinidad de los anticuerpos activina A A1, A2 y A3 en un aparato BIAcore®3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ), usando un chip sensor CM5, y 0,005 por ciento de tensioactivo P20 (Biacore, Inc.) como tampón de corrida. La proteína activina A madura recombinante se inmovilizó en un chip sensor CM5 de grado investigación (Biacore, Inc.) mediante grupos amina primarios usando el Kit de Acoplamiento de Amina (Biacore, Inc.) según el protocolo sugerido por el fabricante.

Se usaron ensayos de unión directa para cribar anticuerpos para su capacidad de unirse a activina A inmovilizada. Los ensayos de unión se llevaron a cabo por inyección de dos concentraciones (40 y 400 nM) de cada anticuerpo candidato en la superficie de activina A inmovilizada a una velocidad de flujo de 50 µl/min durante 3 minutos. Después de un tiempo de disociación de 3 minutos, la superficie se regeneró. Las curvas de unión se compararon cualitativamente para intensidad de señal de unión, así como para velocidades de disociación. Los parámetros cinéticos de unión de anticuerpo que incluyeron ka (constante de velocidad de asociación), kd (constante de velocidad de disociación) y KD (constante de disociación en equilibrio) se determinaron usando el programa informático de evaluación BIA 3.1 (Biacore, Inc.). Cuanto menores son las constantes de disociación en equilibrio (expresadas en nM), mayor es la afinidad del anticuerpo para activina A.

Ejemplo 6

MAPEO DE LA REGIÓN DE UNIÓN A ACTIVINA A PARA ANTICUERPOS MONOCLONALES

Las regiones de unión del anticuerpo en la activina A se determinaron usando múltiples métodos bioquímicos, incluyendo transferencia western en condiciones reductoras o no reductoras, digestión limitada con proteasa usando LysC, análisis peptídico por MS, y competición peptídica usando BIAcore.

Los nudos de cys son características estructurales clave para los miembros de la familia TGF-β. La rotura de S-S con un agente reductor deterioró la estructura de la activina A y disminuyó la unión de activina A a anticuerpos neutralizantes, incluyendo A-1. Estos datos demuestran que los nudos de cys son importantes para la unión de activina A con estos anticuerpos neutralizantes que se unen específicamente a activina A comparado con activina B. Los nudos de cys hacen que dos bucles distantes de secuencias sean estructuralmente adyacentes entre sí. Estas dos regiones son una secuencia en la región de aproximadamente C11-S33 (primer bucle) y aproximadamente C81-E111 (segundo bucle) de activina A (Figura 7). Una digestión limitada con LysC reveló que estas dos regiones estaban protegidas por el anticuerpo A-1, lo que indica que interaccionan con los anticuerpos neutralizantes directamente. Los anticuerpos neutralizantes son sensibles a cambios conformacionales de la activina A, lo que sugiere que se unen a epítopos no lineales del antígeno. Un análisis peptídico adicional indicó que los fragmentos G1 a K7 y S57-F74 en la activina A no se requieren para su unión con los anticuerpos neutralizantes directamente. Una comparación de la secuencia de la activina A comparada con la activina B muestra que algunas de las dierencias en la secuencia ocurren en esta región.

Ejemplo 7

ENSAYOS DE SELECTIVIDAD

Estos ensayos se realizaron usando tecnología BIAcore®, para determinar la selectividad de unión de los anticuerpos A1, A2 y A3 a varias activinas y otros miembros de la familia TGF-ß, incluyendo activina A, activina B, activina AB, inhibina A, GDF-8, GDF-11, TGF-ß-1, TGF-ß-3, y BMP4 (todos de R & D Systems). ActRIIB/Fc se acopló covalentemente a chips sensores grado investigación según el protocolo sugerido por el fabricante. Como los ensayos BIAcore detectan cambios en el índice de refracción, la diferencia entre la respuesta detectada con inyección sobre las superficies de receptor inmovilizado comparado con la respuesta detectada con inyección sobre la superficie control en ausencia de ningún anticuerpo representa la unión real de los distintos ligandos al receptor. Con pre-incubación de anticuerpos y moléculas de activina y TGF-β, un cambio (incremento o disminución) en la respuesta de unión indica unión del anticuerpo a la familia TGFβ de moléculas. Todos los anticuerpos se unieron a activina A pero no a activina B, GDF-8, GDF-11, TGF-ß-1, TGF-ß-3, y BMP4, lo que indica así la especificidad para activina A.

Ejemplo 8

ENSAYOS EN EQUILIBRIO KINEX A™

Se usaron ensayos de unión en equilibrio basados en disoluciones usando tecnología KinExA™ (Sapidyne Instruments, Inc.) para determinar el equilibrio de disociación (KD) de la unión de activina A a moléculas de anticuerpo. Este ensayo basado en disolución se considera que es más sensible que el ensayo BIAcore en algunos casos. Se pre-recubrió Reacti-Gel™ 6X con aproximadamente 50 µg/ml de activina A toda la noche, y se bloqueó con BSA. Se incubaron 30pM y 100pM de muestras de anticuerpo con varias concentraciones (0,5 pM a 5 nM) de activina A en tampón de muestra a temperatura ambiente durante 8 horas antes de pasarlas a través de lechos recubiertos con activina A. La cantidad de anticuerpo unido a los lechos se cuantificó por anticuerpo de cabra anti-Fc humano marcado con fluorescencia (Cy5) a 1 mg/ml en superblock. La señal de unión fue proporcional a la concentración de anticuerpo libre en el equilibrio con una concentración de activina A dada. Se obtuvo la KD a partir de la regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de unión homogéneo de un sitio con curva dual proporcionado en el software KinEx A™ (Sapidyne Instruments, Inc.). Los resultados se muestran en la Figura

8. A1 muestra la afinidad de unión más fuerte para activina A (KD~3 pM). A2 y A3 se unieron a activina A a ~15 pM y ~8 pM, respectivamente.

Ejemplo 9

EFECTOS PROTECTORES DE ANTI-ACTIVINA EN LA PÉRDIDA DE PESO CORPORAL Y MASA MUSCULAR EN UN MODELO DE ARTRITIS INDUCIDA POR COLÁGENO

Este ejemplo se diseñó para ensayar si inhibidores de activina pueden rescatar la afección de desgaste muscular observada en artritis inducida por colágeno. La artritis inducida por colágeno (CIA) es un modelo de ratón ampliamente usado que comparte varias características clínicas y patológicas con la artritis reumatoide (RA). Los mecanismos precisos para CIA no se conocen, sin embargo, existe una evidencia considerable para sugerir que CIA es una enfermedad inflamatoria mediada por Th-1. La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmune común que da lugar a la inflamación de las articulaciones, y erosión progresiva del cartílago/hueso. Incluso si la progresión de RA está bajo control, la pérdida de BCM no se corrige sin una intervención directa adicional.

El modelo de artritis inducida por colágeno se preparó como sigue. Se usaron ratones macho DBA/1J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), de 8 semanas de edad (20-23g). La inmunización se llevó a cabo en el día 1 y día 21 inyecyando 1.000g de Colágeno Bovino II (Chondrex, Redmond, WA) emulsionado en 100µl de CFA o ICFA, intradérmicamente en la base de la cola. Se usaron tres grupos de diez ratones cada uno. El Grupo 1 (control) sólo recibió vehículo. El Grupo 2 (experimental, inyección de colágeno) recibió sólo vehículo como tratamiento. Al Grupo 3 se inyectó colágeno y se trató con anticuerpo anti-Activina A A1.

El índice clínico artrítico usado fue:

0=articulación normal sin signos de artritis

1=hinchazón y/o enrojecimiento de un dedo

2=dos articulaciones implicadas

3= más de dos articulaciones

4= artritis grave de la pata completa y dedos

El tratamiento consistió en inyección de anticuerpo activina (s.c.) empezando el Día 8, 5mg/kg, s.c. dos veces a la semana. Los puntos finales medidos fueron peso corporal, masa muscular/grasa, toma de alimentos y citoquinas inflamatorias.

Peso corporal. Los animales CIA no tratados perdieron veinticinco por ciento de su peso corporal y masa muscular comparado con los animales normales, lo que proporcionó la evidencia de caquexia reumatoide. Los tratamientos con anti-activina A (A-1) incrementaron significativamente (p<0,05) el peso corporal comparado con el de CIA control pero con los animales control normales.

Masa muscular. El tratamiento con anticuerpo monoclonal A1 incrementó significativamente la masa muscular (p<0,05) en animales CIA, comparado con el de los animales CIA no tratados. En los controles CIA, la masa muscular a los 95 días fue 1,5g; mientras en los animales CIA tratados con anticuerpo, la masa muscular a los 95 días fue 2,5g. Los resultados se muestran en la Figura 1.

Masa grasa. El anticuerpo anti-activina A no revirtió la pérdida de grasa en los animales CIA. Los resultados se muestran en la Figura 2.

La conservación del peso corporal y masa muscular en los animales tratados proporciona apoyo para los anticuerpos activina A como un terapéutico para mejorar la calidad de vida y disminuir la mortalidad en los que padecen artritis reumatoide.

Ejemplo 10

XENOINJERTO INTRAMUSCULAR CHO/ACTIVINA EN RATONES DESNUDOS ADULTOS JÓVENES

Células CHO transfectadas de manera estable con activina A (CHO/Activina) se implantaron en ratones CD1 nu/nu adultos jóvenes mediante una inyección intramuscular a varias dosis, 1x106, 5x106, y 10x106. Las mismas dosis de células CHO no transfectadas se inyectaron en grupos separados de ratones como controles. El implante de CHO/Activina indujo una pérdida de peso corporal rápida y drástica comparado con los controles.

En el día 12, el grupo CHO/control para 1x106 células tenía una pérdida de 10% de peso corporal, mientras el grupo CHO/anti-activina A tenía una ganancia de 10% en el peso corporal. Los grupos de 5x106 y 10x106 células antiactivina A también mostraron incrementos en el peso corporal de aproximadamente 10%, mientras los grupos control de 5x106 y 10x106 células perdieron 25-30% del peso corporal.

Los niveles séricos de activina A en ratones se midieron en el día 12 después del implante del xenoinjerto. Los niveles de activina A sérica en los ratones control implantados con CHO parentales fueron < 2 ng/ml. Por el contrario, los ratones que portaban el xenoinjerto CHO/Activina mostraron activina A sérica dramáticamente elevada. Hubo una correlación significativa entre el nivel sérico de activina A y la gravedad de la pérdida de peso corporal como se indica por el análisis estadístico, que indica que la sobreexpresión de activina A es responsable de la pérdida de peso corporal observada en ratones con xenoinjerto CHO/Activina.

Se implantó a los ratones (n=14 por grupo) xenoinjerto CHO/Activina y posteriormente se les inyectó bien vehículo o cada uno de los tres anticuerpos monoclonales anti-activina A, A1, A2 y A3. Doce de catorce de los ratones en el grupo vehículo murieron sobre el día 25 después del implante de CHO/Activina, mientras sólo uno de cuarenta y dos ratones implantados con CHO/Activina en los grupos de tratamiento Mab anti-activina A murieron en ese tiempo. Sobre el día 38, la mayoría de los ratones en los grupos de tratamiento Mab continuaron sobreviviendo bien, con proporciones de supervivencia como sigue: trece de catorce para el grupo A1 y diez de catorce en el grupo A2 o A3.

Los datos de peso corporal muestran que el tratamiento con Mab anti-activina A, A1 o A2, previno completamente la pérdida de peso corporal en los ratones que portaban el xenoinjerto CHO/Activina, lo que indica que los Mab antiactivina A fueron eficaces para neutralizar la actividad de activina A in vivo. Como se muestra en la Figura 3, los datos de RMN revelaron que el tratamiento con Mab anti-activina A, A1 previno la pérdida progresiva de masa magra corporal observada en los ratones que portaban CHO/Activina. El tratamiento con este anticuerpo también causó un incremento en la toma de alimento.

Los datos de las necropsias indican que el tratamiento con el Mab anti-activina A, A1 y A2, previno la reducción grave en los pesos de la parte magra de los cadáveres observados en los ratones que portan CHO/Activina (Tabla 5). Los datos de las necropsias terminales indican que el tratamiento con el Mab anti-activina A, A1 y A2, previno la reducción grave en masa grasa observados en los ratones que portan el xenoinjerto CHO/Activina (Tabla 5).

El porcentaje de animales que portan un tumor visible en el sitio del xenoinjerto se analizó durante la necropsia terminal en el día 12 después del implante de CHO/Activina. Como se muestra en la Tabla 5, los datos revelaron que el 80% de los ratones en el grupo vehículo desarrollaron tumores de xenoinjerto visualmente identificables en el sitio de la inyección. Se observó una proporción significativamente disminuida de formación de tumores visibles en los grupos de tratamiento Mab anti-activina A.

Después de la necropsia, todos los tumores visualmente identificables en los sitios de xenoinjerto CHO/Activina se diseccionaron de los animales y se pesaron. Se observó una disminución significativa en la masa tumoral en el grupo de tratamiento Mab activina A comparado con el grupo vehículo (Tabla 5).

Tabla 5

56 5

Tratamiento

Masa magra de los cadáveres (g) en el día 12 Tejido graso periuterino (g) en el día 12 Desarrollo del xenoinjerto tumoral, porcentaje de animales, en el día 12 Peso tumoral (g) en el día 12

Ratones desnudos más vehículo

9 ± 0,25 0,18±0,02 No aplicable No aplicable

CHO/Activina más vehículo

7,5±0,25 0,10±0,02 80% 0,11±,01

CHO/Activina más anticuerpo A1

9,2±0,25 0,17±0,04 20% 0,01±0,005

CHO/Activina más anticuerpo A2

8,9±0,25 0,16±0,03 50% 0,01±0,005

Los experimentos anteriores sobre el desarrollo del tumor del xenoinjerto dieron lugar a varias conclusiones respecto al uso de anticuerpos anti-activina A para mejorar la supervivencia del cáncer. La activina A jugó un papel causal en el desarrollo de síndrome de caquexia en ratones desnudos que portaban xenoinjerto CHO/Activina. La pérdida de peso corporal se correlacionó bien con el incremento en el nivel sérico de activina en este modelo. Los Mab antiactivina A previnieron la pérdida de peso corporal y síndrome de caquexia observado en los ratones que portaban tumor de xenoinjerto CHO/Activina. Los Mab anti-activina A suprimieron el crecimiento del xenoinjerto, reduciendo significativamente de esta manera el porcentaje de ratones que portaban tumores de xenoinjerto visibles así como disminuyendo los tamaños de tumor de xenoinjerto. Los Mab anti-activina A previnieron la muerte resultante del xenoinjerto CHO/Activina, estimulando de forma importante la supervivencia de los animales.

Ejemplo 11

ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI-ACTIVINA A1 EN RATONES AAV-ACTIVINA

La sobreexpresión postnatal de activina A dio lugar a síndrome de desgaste semejante a caquexia grave en ratones C57B1/6. El peso corporal disminuyó durante los días 1, 4, 9 y 11, desde 16 gramso a 14, 12,5, y finalmente 10,5 gramos en el día 11. También hubo una pérdida de peso graso, peso de la parte magra de los cadáveres, y peso del músculo gastrocnemio.

Para determinar si el anticuerpo dirigido a activina A podía aliviar o prevenir los efectos de activina A, se llevaron a cabo los experimentos siguientes. Se inyectaron AAV-Activina o vector AAV vacío (control) a 1 x 1013 pfu/ratón en ratones C57B1/6 machos de 8 semanas de edad (n=10-12) a través de las venas de la cola. La Figura 5 muestra el efecto del anticuerpo monoclonal anti-Activina A A1 en el cambio del peso corporal en los ratones transducidos en los días 1, 5, 8 y 12. El anticuerpo previno el cambio de peso corporal observado en los ratones control. El tratamiento con anticuerpo mejoró la toma de alimento en este modelo animal.

Ejemplo 12

EFECTO PROTECTOR DE MAB ANTI-ACTIVINA-A A1 FRENTE A LAS PÉRDIDAS DE PESO CORPORAL Y MASA MAGRA EN UN MODELO DE CAQUEXIA DE CÁNCER DE COLON-26

Este ejemplo demuestra el efecto conservador de músculo del anticuerpo monoclonal anti-Activina-A A-1 en un modelo murino de caquexia por cáncer. El modelo de caquexia por cáncer se estableció usando la inoculación de células de adenocarcinoma de colon 26 murino singénico en ratones CDF1 machos de 8,5 semanas de edad (0,5 x 106células/ratón) en el día 0. El tratamiento con Mab anti-Activina-A A-1 (10 mg/kg, sc) se inició en el día 4 y se proporcionó 3 veces a la semana durante 18 días. Se usó tampón de acetato de sodio (10 nm acetato de sodio, 5% sacarosa, pH 5,0) como vehículo en los ratones del grupo control que portaban tumor. Un grupo de ratones CDF1 normales de edad y peso equivalente sin tumores se usó como control de línea base paralelo. El peso corporal y toma de alimento se monitorizaron tres veces a la semana. El tamaño tumoral se midió tres veces por semana con calibradores digitales. La composición corporal se midió usando RMN al comienzo y final del estudio para monitorizar los cambios en la masa magra y grasa. Al final del experimento, los ratones se sacrificaron por eutanasia en una cámara de CO2. Se recogieron muestras de bloque terminales y los niveles séricos de Activina-A se analizaron por ELISA. Las partes magras de los cadáveres se pesaron y registraron, y los músculos gastrocnemio y los tumores se pesaron y se almacenaron apropiadamente.

Todos los resultados se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM). Se realizó un ensayo T no emparejado para determinar la diferencia estadística entre los grupos usando software Graph Pad Prizm. La significancia estadística del vehículo se representó por valores p menores de 0,05.

Los datos muestran que los ratones tratados con A-1 tenían un peso corporal significativamente mayor que los ratones tratados con vehículo (21,30 ± 0,54 g frente a 19,21 ± 0,38 g, P<0,05, Día 15 y 19,66 ± 0,22 g frente a 18,11 ± 0,19 g, P<0,05, día 18). Hubo una pérdida de peso corporal significativa en los ratones que portaban tumor tratados con vehículo comparado con los ratones que no portaban tumor con edad equivalente (25,48 ± 0,35 g frente a 18,11 ± 0,19 g, p<0,005). Así, el tratamiento con anticuerpo activina A ayudó a mantener el peso corporal.

El crecimiento tumoral se monitorizó con una medida de calibradores digitales y el tamaño tumoral se calculó con la ecuación de: Dimensión tumoral (mm3 = L (mm) * W (mm) * W (mm) * 0,5. El tamaño tumoral no fue diferente entre los dos grupos tratado con anticuerpo A1 y tratado con vehículo.

Después de la inoculación de las células tumorales C-26, los ratones en el grupo tratado con vehículo tuvieron una pérdida de peso corporal dramática comparado con los ratones que no portaban tumor (25,48 ± 0,35 g frente a 18,11 ± 0,19 g, p<0,01). Sin embargo, el tratamiento con A-1 atenuó la pérdida de peso media (19,66 ± 0,22 g frente a 18,11 ± 0,19g, P<0,05).

El tratamiento con A-1 resultó en una conservación significativa de la masa muscular esquelética. Los ratones tratados con A-1 tuvieron un peso mayor de la masa del músculo gastrocnemio (0,099 ± 0,002 g frente a 0,093 ± 0,001, p<0,05) que la del grupo tratado con vehículo C26.

Al final del experimento, se llevó a cabo disección del tejido terminal. Los ratones que portaban tumor C-26 control tuvieron un peso de la parte magra de los cadáveres significativamente menor (6,75 ± 0,11 g) que la de los ratones tratados con anticuerpo A1 (7,20 ± 0,16 g, p<0,05 frente a C-26 + grupo vehículo).

La masa magra corporal se perdió de forma importante en el grupo tratado con vehículo C-26 (-1,85 ± 0,24 g comparado con su masa magra corporal inicial). El tratamiento con A-1 en ratones que portaban tumor C-26 atenuó significativamente la pérdida de masa magra corporal (-0,60 ± 0,26 g, p<0,05 frente a grupo C26-vehículo).

El tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-Activina A A1 es eficaz en la atenuación de la pérdida de peso corporal total inducida por caquexia por cáncer. El efecto protector del anticuerpo A1 está asociado con la conservación de la masa muscular esquelética, masa magra de los cadáveres y masa magra corporal total en un modelo animal de caquexia por cáncer murino bien establecido.

El presente estudio proporciona evidencia preclínica de que la neutralización de activina A usando el anticuerpo monoclonal A1 atenuó significativamente la pérdida de peso corporal y conservó la masa muscular esquelética y masa magra corporal.

Ejemplo 13

ELISA DE ACTIVINA A

Los anticuerpos frente a activina A pueden usarse para ensayar y cuantificar activina A en muestras, tales como muestras biológicas. Se adquirieron activina A humana recombinante (100 ng/ml, cat #10-85106) y tampón de dilución de ensayo (0 mg/ml, cat #10-85101) en DSLabs (Webster, Tejas) y se almacenaron a 4°C. Se prepararon estándares frescos antes del experimento diluyendo en tampón de ensayo.

Los sueros humanos se obtuvieron en Bioreclamation Inc. (Hicksville, NY). Los sueros para la medida de activina A se alicuotaron en 110 µl para minimizar la variación debida a congelación-descongelación. Las muestras se diluyeron 1/3 con tampón de ensayo y se midieron en el ELISA.

El ELISA de Activina A (ELISA en una etapa) se lleva a cabo usando las etapas siguientes:

Se recubrieron placas de 96 pocillos Corning Costar 3590 con 100 µl de 4 µg/mL Mab anti-activina A (A2) toda la noche a temperatura ambiente mientras se agitaba suavemente a 500-600 rpm. Los pocillos (400 µl/pocillo) se lavaron tres veces con PBS que contenía 0,02% (v/v) Tween 20. Los pocillos se bloquearon en 300 µl de tampón de bloqueo I durante dos horas a temperatura ambiente y el tampón de bloqueo se eliminó.

Se añadieron 100 µl de activina A estándar / ó 100 µl de muestras diluidas, y se añadieron 25 µl de 0,5 µg/mL mAb anti-activina A marcado con HRP (A1/HRP) en tampón de ensayo. Para las medidas de activina A libre, los sueros se diluyeron en 1/3 con tampón de ensayo. Para las medidas de activina A total, los sueros se (1) acidificaron (pH 45) con 20% HCL (2 µl por 110 µl de suero), (2) incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente, (3) neutralizaron por la adición de 2 µl de 5 N NaOH (2 µl por 110 µl de suero), y (4) diluyeron en 1/3 con tampón de ensayo.

La incubación se llevó a cabo durante 2 horas a temperatura ambiente mientras se agitaba a 600-700 rpm. Los pocillos (400 µl/pocillo) se lavaron tres veces con PBS que contenía 0,02% (v/v) Tween-20. Se añadieron 100 µl de

TMB (R&D System, Minneapolis, MN), seguido de una incubación durante veinte minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 50 µl de disolución de parada (R&D System, Minneapolis, MN). La medida de DO se llevó a cabo usando 450 nm en Molecular Device SpectraMax M5.

Se generó una curva estándar representando la absorbancia a 450 nm frente al log de la concentración de rhactivina, usando un programa de ajuste de curva log-log (o logístico de cinco parámetros) de Molecular Device. Los valores para las concentraciones de las muestras se obtuvieron por interpolación de su absorbancia del estándar.

El Anticuerpo de Captura fue mAb A-3 anti-activina A, 20,78 mg/ml. El Anticuerpo de Detección fue mAb A-1 antiactivina A-HRP, 0,65 HRP/Ab, 12,05 mg/ml. El Tampón de Bloqueo fue tampón de bloqueo I. El tampón de lavado fue PBS / 0,1 % Tween-20. El tampón de ensayo (Diluyente de Reactivo) fue tampón 0 mg/ml activina A.

Ejemplo 14

ANÁLISIS DE PROTECCIÓN FRENTE A PROTEASA DE ACTIVINA A

Los ensayos de protección de proteasa se llevaron a cabo con el fin de identificar la unión al epítopo de anticuerpos activina A. Se analizó una preparación de activina A humana recombinante degradada por tres métodos. El primer método examinó una preparación de activina A que se había degradado durante la purificación. El segundo método incluyó proteolisis de la preparación de activina A con Lisina C, quimiotripsina, pepsina y termolisina. El tercer método incluyó la degradación química de la preparación usando bromuro de cianógeno.

Así, para la proteolisis del complejo activina humana y anticuerpo, se mezclaron 5 microgramos de activina A y 90 microgramos de anticuerpo en 100 microlitros de 0,1 M bicarbonato de amonio (pH 7,8) y se mantuvieron a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos antes del tratamiento con 2% en peso de la proteasa particular seleccionada. Se dejó que se produjera la digestión de la proteína a 37 grados Celsius durante 90 minutos. Las muestras control que contenían activina A sola o anticuerpo solo se llevaron a cabo de una manera idéntica. Las muestras se acidificaron antes del análisis RP-HPLC.

Para la digestión con bromuro de cianógeno de activina A, se generaron fragmentos CNBr de activina A incubando 10 microgramos de la proteína con CNBr en 100 microlitros de 90% TFA toda la noche a temperatura ambiente. La muestra se dejó en oscuridad a lo largo de la incubación y se secó en vacío antes del análisis RP-HPLC.

El RP-HPLC se utilizó para analizar los fragmentos generados como se ha descrito anteriormente. Brevemente, la columna se equilibró con disolvente, la muestra se inyectó y la columna se lavó con disolvente antes de aplicar un gradiente lineal. El efluente de la columna se monitorizó por absorbancia a 215 nm. Las muestras eluidas se recogieron manualmente y se analizaron por degradación de Edman y espectrometría de masas.

La preparación que se había degradado durante la purificación contenía las especies siguientes:

1.

Gly1-His59 (6.456,2 Da)

2.

Ser60-Tyr94 (4.102,9 Da)

3.-Asp95-Ser116 (2.452,8 Da)

4. Gly1-Tyr94 (10.541,1 Da)

La preparación que se había degradado por una actividad semejante a quimotríptica tenía las especies siguientes escindidas en las localizaciones indicadas en SEQ ID NO: 225:

1.

1GLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDII30

2.

31APSGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFH↓S60

3.

61TVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMS90

4.

91MLYY↓DDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS116

Las especies mostradas en la Figura 9 indican las localizaciones de sitios de escisión cuando la preparación de activina A se degradó con quimiotripsina, Lisina C (LysC), o Bromuro de Cianógeno (CNBr).

Ejemplo 15

ENSAYO DE UNIÓN A ACTIVINA A

Los anticuerpos monoclonales A1, A2, y A3 se unen a activina A pero no a activina B, según las afinidades de unión listadas en la Tabla 6. Así, se llevó a cabo un análisis de afinidad de los anticuerpos de activina A A1, A2, y A3 con el fin el determinar la región o estructura necesaria para la unión del anticuerpo neutralizante. Se conocen varias

proteínas de unión a activina A, incluyendo ActRII (A/B), ActRI (A/B)(Alt4), folistatina, y gen relacionado con folistatina (FLRG).

Los ensayos de unión se llevaron a cabo para cribar anticuerpos con el fin de evaluar su capacidad para unirse a superficies de anticuerpo inmovilizados (activina A y/o activina B). Los ensayos de unión se llevaron a cabo utilizando 2 nM rhActivina A y 20 nM de cada anticuerpo inmovilizado en una superficie. Los anticuerpos siguientes se inmovilizaron en una superficie y se ensayaron: AKA1 (disponible comercialmente), AKA2 (disponible comercialmente), A1, y A3. Los resultados del ensayo con anticuerpo se indican en la Figura 10.

Ab Anti-Activina A

A2 A3 A1 AKA1 AKA2

Activina A

KD ~ 25 pM KD ~ 11 pM KD ~ 3pM KD ~ 4 pM KD ~ 4 pM

Activina B

----- ----- ----- ------ ------

Ejemplo 16

MAPEO DE REGIÓN DEL ENSAYO DE UNIÓN DE ACTIVINA A (BIACORE)

Se llevaron a cabo ensayos de bloqueo en superficies con quimera de activina humana recombinante RIB-Fc inmovilizada, superficies con quimera de activina humana recombinante RIIB-Fc, y superficies con quimera recombinante RIIA-Fc humana recombinante, como se describe en el Ejemplo 5. Los anticuerpos monoclonales A1, A2, AKA1, y AKA2 en cada superficie quimera se incubaron con 1nM activina A, y se midió la respuesta de unión relativa (%). Una respuesta de unión incrementada en presencia de anticuerpos indica que la activina A es capaz de unirse a las superficies de receptor inmovilizado y los anticuerpos en disolución simultáneamente, lo que se refiere como "carry on". Los resultados se indican en la Tabla 7 y Figura 11, en las que CE50 significa la concentración eficaz que rinde 50% de unión.

Tabla 7

CE50 (nM)

Quimera rhActivina RIB/Fc Quimera rhActivina RIIB/Fc Quimera rhActivina FIIA/Fc

AKA1

Parcialmente bloqueado 0,30 0.35

AKA2

Parcialmente bloqueado 0,36 0,37

A1

0,29 0,29 0,29

A2

0,18 Carry on Carry on

Ejemplo 17

QUIMERAS ACTIVINA A/B

Las quimeras activina A/B se generaron con el fin de evaluar adicionalmente las capacidades de unión a epítopo de los anticuerpos monoclonales A1, A2, y A3, como se describe en los Ejemplos 5 y 16. Como se indica en la Figura 12, se ensayaron dos quimeras: Activina A 13/39 B (que contiene los aminoácidos 1-116 de activina A excepto que los aminoácidos en las posiciones 13-39 de activina A están sustituidos con los aminoácidos correspondientes en las posiciones 13-39 de activina B-SEQ ID NO: 243), y activina A 82/107 B (que contiene los aminoácidos 1-116 de activina A excepto que los aminoácidos en las posiciones 82-107 de activina A están sustituidos con los aminoácidos correspondientes en las posiciones 82-107 de activina B-SEQ ID NO: 244).

Brevemente, un clon de activina A de longitud completa se usó como un molde para la amplificación por PCR usando polimerasa Pfu ultra (Stratagene) y cebadores (SEQ ID NO: 245 y SEQ ID NO: 246) al inicio de la secuencia de proteína madura. El producto de PCR resultante se purificó por columna (Qiagen), se digirió con las enzimas de restricción SalI y XbaI (Roche) y se aisló por gel (Qiagen). Los casetes de gen sintéticos que contienen las secuencias de proteína madura se diseñaron utilizando las secuencias de aminoácidos de activina A y activina B de longitud completa y retro traduciendo en secuencias de ADN optimizadas con codones para la expresión en una célula huésped de mamífero usando el programa Gene Designer (Versión 1.0.4, DNA 2.0, Inc.) (BMC Bioinformatics,

7: 285 (2006)). Las secuencias se digirieron con XbaI y NotI y se aislaron por gel. El producto de PCR de activina A se ligó en condiciones de reacción estándar usando ADN ligasa T4 (New England Biolabs, Inc.) bien con el

fragmento de gen sintético 13-39 (SEQ ID NO: 247) o el fragmento de gen sintético 82-107 (SEQ ID NO: 213) y un vector de expresión digerido con SalI/NotI (pDRSalpha 24) para producir construcciones de expresión de longitud completa. La construcción génica sintética de activina A con los aminoácidos 13-39 reemplazados por la secuencia de activina B (SEQ ID NO: 247) y la construcción génica sintética de activina A con los aminoácidos 82-107 reemplazados por la secuencia de activina B (SEQ ID NO: 248) se utilizaron en los experimentos de mapeo de epítopos (resultados mostrados en la Figura 14).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Amgen Inc. 5 <120> ANTICUERPOS ANTI-ACTIVINA A Y USOS DE ÉSTOS

<130> FB21339

<150> 60/843,430

<151> 2006-09-08

<150> 60/956,653

<151> 2007-08-17 15 <160> 247

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 318

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1 25

<210> 2

<211> 366

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 3

45

tctggagata aattggggga taaatatgct tgt <210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens 33

<400> 4

caagatagca agcggccctc a

21

55

<210> 5 <211> 27

<212> ADN <213> Homo sapiens

5

<400> 5 caggcgtggg acagcagcac tgcggta 27

10

<210> 6 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 6

15

ggttacacct ttaccagtta tggtctcagc 30

20

<210> 7 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 7

25 30

tggatcatcc cttacaatgg taacacaaac tctgcacaga aactccaggg c <210> 8 <211> 39 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 51

gacagggact acggtgtcaa ttatgatgct tttgatatc

39

35

<210> 9 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens

40

<400> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 373

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 18

25

<210> 19 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 19

cgggcaagtc agggcattag aaataattta ggc

33

35

<210> 20 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 20

gctgcatcca gtttgcaaag t

21

45

<210> 21 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 21

ctacagcata atagttaccc gtggacg

27

55

<210> 22 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 22

5 10

ggattcacct tcagtagtta cggcatgcac <210> 23 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 23 30

gttatatggt atgatggaag taataaatac catgcagact ccgtgaaggg c

51

15

<210> 24 <211> 45 <212> ADN <213> Homo sapiens

20

<400> 24

agtcggaact ggaactacga caactactac tacggtctgg acgtc

45

25

<210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

30

<400> 25

<210> 26

<211> 124 35 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 369

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 34

15

<210> 35 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 35

cgggcaagtc agggcattag aaatgattta ggc

33

25

<210> 36 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 36

gctgcatcca gtttgcaaag t

21

35

<210> 37 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 37

cgacagcaaa atacttaccc gctcact

27

45

<210> 38 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 38

ggattcacct ttagtagtta ttggatgagc

30

<210> 39 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens

55

<400> 39

aacataaagc aagatggaag tgaggaatac tatgtggact ctgtgaaggg c

5

<210> 40 <211> 42 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 40

10

ggtagcagca gctggtacta ctacaactac ggtatggacg tc 42

15

<210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 123

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

<210> 46

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

35 <210> 48

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

<210> 49 45 <211> 336

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 363 55 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<211> 48

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 51

aggtctagtc agagcctcct gcatagtact ggatacaact atttggat 48

<210> 52

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 52

ttgggttctt ttcgggcctc c 21

<210> 53

<211> 26

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 53

atgcaagctc tccaaactcc gtgcag 26

<210> 54

<211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 54

ggatacacct tcaccggcta ctatatccac 30

<210> 55

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 55

tggatcaacc ctaacagtgg tggcacaaac tatgcacaga agtttcaggg c

<210> 56

<211> 36

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 56

gattcggggt atagcagcag ctggcacttt gactac 36

<210> 57

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58 10 <211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58 15

<210> 59

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 7

<212>

PRT 30 <213> Homo sapiens

<400> 60

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 10

<212>

PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 62

<210> 63

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20

<400> 63

25 <210> 64

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 64

<210> 65 35 <211> 339

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 65 40

<210> 66

<211>

488 45 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 66

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

<210> 74

<211>

117 10 <212> PRT

<210> 67 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 67

aagtccagcc agagtatttt atacagttcc aacaataaga agtatctagt t

51

<210> 68 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 68

tggacatcta tgcgggaatc c

21

<210> 69 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 69

cagcaatatt atagtactcc gtggacg

27

<210> 70 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 70

ggtggctcca tcaatagttt ctactggagc

30

<210> 71 <211> 48 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 71

tatatctatt acagtgggag caccaactac aatccctccc tcaagagt

48

<210> 72 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 72

gacagtatag cagccccctt tgactac

27

<210> 73 <211> 113

<213> Homo sapiens

<400> 74

<210> 75

<211> 17

<212>

PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 75

<210> 76

<211> 7

<212>

PRT 30 <213> Homo sapiens

<400> 76

<210> 77

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

<210> 78

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78

<210> 79

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

35 <210> 81

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 81

45 <210> 82

<211> 357

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 82

<210> 83

<211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens

5

<400> 83

cgggcaagtc agagcattag caactattta aat

33

10

<210> 84 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens

15

<400> 84

20

<210> 85 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 85

25

caacagagtt acagtatttc gcccact 27

30

<210> 86 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 86

35 40

ggtgggtcct tcagtgctta ctactggagc <210> 87 <211> 48 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 87 30

gaaatcaatc atagtggagg caccaactac aacccgtccc tcaagagt

48

45

<210> 88 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens

50

<400> 88

gtacagtggc tcgaactggc ctactttgac tac

33

<210> 89

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 89

<210> 90 10 <211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 90 15

<210> 91

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 91

<210> 92

<211> 7

<212>

PRT 30 <213> Homo sapiens

<400> 92

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 93

<210> 94

<211> 10

<212>

PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 94

<210> 95

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20

<400> 95

25 <210> 96

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 96

<210> 97 35 <211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 97 40

<210> 98

<211> 363 45 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 98

<210> 99

<211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens

5

<400> 99

cgggcaggtc agggcattag aaatgattta gtc

33

10

<210> 100 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

15

<400> 100

20

<210> 101 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 101

25

ctacaacata atacttaccc attcact 27

30

<210> 102 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 102

35 40

ggattcacct tcattagcta tggcatgcac <210> 103 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 103 30

gttatctggt atgatggaag tactgaatac tatgcagact ccgtgaaggg c

51

45

<210> 104 <211> 36 <212> ADN <213> Homo sapiens

50

<400> 104

gagaggcagt ggctctacca ctacggtatg gacgtc

36

<210> 105

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 105

<210> 106 10 <211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 106 15

<210> 107 20 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 107 25

<210> 108

<211> 107 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 108

<210> 109

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 109

<210> 110

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 110

<210> 111

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 111

<210> 112

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 112

<210> 113

<211> 339

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 113

<210> 114

<211> 351

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 114

<210> 115

<211> 17

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 1

<223> Xaa = Arg O Lys

<220>

<221> VARIANTE

<222>

6 25 <223> Xaa = Leu O Ile

<220>

<221> VARIANTE

<222> 8

<223> Xaa = His O Tyr

<220>

<221> VARIANTE

<222>

10 35 <223> Xaa = Thr O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> 11

<223> Xaa = Gly O Asn

<220>

<221> VARIANTE

<222>

12 45 <223> Xaa = Tyr O Asn

<220>

<221> VARIANTE

<222> (13)...(13)

<223> Xaa = Asn O Lys

<220>

<221> VARIANTE

<222>

(14)...(14) 55 <223> Xaa = Lys O -Xaa (Xaa delecionado)

<220>

<221> VARIANTE

<222> (17)...(17)

<223> Xaa = Asp O Val

<400> 115

<210> 116

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 3

<223> Xaa = Ser O Gly

<220>

<221> VARIANTE

<222> 5

<223> Xaa = Ser O Gly

<220>

<221> VARIANTE

<222> 7

<223> Xaa = Ser O Arg

<220>

<221> VARIANTE

<222> 9

<223> Xaa = Tyr O Asp O Asn

<220>

<221> VARIANTE

<222> 11

<223> Xaa = Asp O Val O Gly

<400> 116 <210> 122

<210> 117 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 117

cagcaatatt atagtactcc gtggacg

27

<210> 118 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 118

ggtggctcca tcaatagttt ctactggagc

30

<210> 119 <211> 48

<212> ADN <213> Homo sapiens

5

<400> 119 tatatctatt acagtgggag caccaactac aatccctccc tcaagagg 48

10

<210> 120 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 120

15

gacagtatag cagccccctt tgactac 27

20

<210> 121 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 121

<211> 117

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<400> 122

<210> 123

<211> 11

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 40

<220>

<221> VARIANTE

<222> 3

<223> Xaa = Glu O Asp

<220>

<221> VARIANTE

<222> 5

<223> Xaa = Trp O Leu

<220>

<221> VARIANTE

<222> 7

<223> Xaa = Glu O Asp

<220>

<221> VARIANTE

<222> 9

<223> Xaa = Tyr O Phe

<220>

<221> VARIANTE

<222> 10

<223> Xaa = Ala O Val

<220>

<221> VARIANTE

<222> 11

<223> Xaa = Cys O Phe

<400> 123

<210> 124

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 1

<223> Xaa = Ala O Trp O Leu

<220>

<221> VARIANTE

<222> 2

<223> Xaa = Thr O Ala O Gly

<220>

<221> VARIANTE

<222> 4

<223> Xaa = Ser O Met O Phe

<220>

<221> VARIANTE

<222> 5

<223> Xaa = Leu O Arg

<220>

<221> VARIANTE

<222> 6

<223> Xaa = Gln O Glu O Ala

<400> 124

<210> 125

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 125

<210> 126

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 126

<210> 127

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 127

<210> 128

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 1

<223> Xaa = Gln O Leu O His

<220>

<221> VARIANTE

<222> 3

<223> Xaa = Thr O Asn O Ser

<400> 128

<210> 129

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 129

<210> 130

<211> 372

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 130

<210> 131

<211> 9

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15

<220>

<221> VARIANTE

<222> 5

<223> Xaa = Thr O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> 7

<223> Xaa = Pro O Thr 25

<220>

<221> VARIANTE

<222> 8

<223> Xaa = Phe O Trp

<400> 131

35 <210> 132

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 1

<223> Xaa = Met O Gln O Arg

45 <220>

<221> VARIANTE

<222> 3

<223> Xaa = Ala O Tyr O Gln O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> 4

<223> Xaa = Leu O Tyr O Asn

55 <220>

<221> VARIANTE

<222> 5

<223> Xaa = Gln O Ser O Thr

<220>

<221> VARIANTE

<222> 6

<223> Xaa = Thr O Tyr O Ile

<220>

<221> VARIANTE

<222> 7

<223> Xaa = Pro O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8)...(8)

<223> Xaa = Cys O Trp O Leu O Pro

<220>

<221> VARIANTE

<222> (9) ... (9)

<223> Xaa = Ser O Thr

<400> 132

<210> 133

<211> 27

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 133

ctacagcata atagttaccc gtggacg 27

<210> 134

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 4

<223> Xaa = Ile O Phe

<220>

<221> VARIANTE

<222> 5

<223> Xaa = Asn O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> 6

<223> Xaa = Ser O Ala

<220>

<221> VARIANTE

<222> 7

<223> Xaa = Gly O -Xaa (Xaa delecionado)

<220>

<221> VARIANTE

<222> 8

<223> Xaa = Gly O -Xaa (Xaa delecionado)

<220>

<221> VARIANTE

<222> 9

<223> Xaa = Phe O Tyr

<400> 134

10

<210> 135 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 135

15

gttatatggt atgatggaag taataaatac catgcagact ccgtgaaggg c 51

20

<210> 136 <211> 45 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 136

25 30

agtcggaact ggaactacga caactactac tacggtctgg acgtc <210> 137 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 45

35 <210> 138

<211> 124

<212> PRT

<213> Homo sapiens

40 <400> 138 <210> 139

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 2

<223> Xaa = Tyr O Phe

<220>

<221> VARIANTE

<222> 3

<223> Xaa = Tyr O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> 5

<223> Xaa = Thr O Ser O Ile

<220>

<221> VARIANTE

<222> 6

<223> Xaa = Gly O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> 8

<223> Xaa = Tyr O Gly O Trp

<220>

<221> VARIANTE

<222> 9

<223> Xaa = Ile O Met

<220>

<221> VARIANTE

<222> (10)...(10)

<223> Xaa = His O Gly

<400> 139

<210> 140

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 2

<223> Xaa = Tyr O Phe

<220>

<221> VARIANTE

<222> 5

<223> Xaa = Thr O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> 6

<223> Xaa = Ser O Ala

<220>

<221> VARIANTE

<222> 8

<223> Xaa = Gly O Trp

<220>

<221> VARIANTE

<222> 9

<223> Xaa = Leu O Met O Ile

<220>

<221> VARIANTE

<222> 10

<223> Xaa = Ser O His

<400> 140

<210> 141

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 141

<210> 142

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 1

<223> Xaa = Tyr O Glu

<220>

<221> VARIANTE

<222> 3

<223> Xaa = Ser O Tyr O Asn

<220>

<221> VARIANTE

<222> 4

<223> Xaa = Tyr O His

<220>

<221> VARIANTE

<222> 7

<223> Xaa = Ser O Gly

5 <220>

<221> VARIANTE

<222> 9

<223> Xaa = Tyr O Asn

<220>

<221> VARIANTE

<222> 16

<223> Xaa = Ser O Arg

15 <400> 142

<210> 143

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 143

<210> 144

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 144

<210> 145

<211> 315

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 145

<210> 146

<211> 348

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 146

<210> 147

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 147

tctggagaaa aatggggaga gaaatatgct tgt 33

<210> 148

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 148 21

caagatacca agcggccctc c 21

<210> 149

<211> 24

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 149 24

caggcgtggg acaggagcac tgta 24

<210> 150

<211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 150 30

ggatacagct ttaccagcta ctggatcggc 30

<210> 151

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 151

atcatctatc ctggtgactc tgataccaga tacagcccgt ccttccaagg c

<210> 152

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 152

caaggactgg ggtttgacta c 21

<210> 153

<211> 105

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 153

<210> 154

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 154

<210> 155

<211> 11

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 155

<210> 156

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 156

30 <210> 157

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 157

<210> 158

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 158

<210> 159

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 159

<210> 160

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 160

<210> 161

<211> 318

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 161

<210> 162

<211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 162

<210> 163

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 163

tctggagata aattggggga taaatttgct ttc

33

<210> 164 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 164

caagataaca agcggccctc a

21

<210> 165 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 165

caggcgtggg acagcagcac tgtggta

27

<210> 166 <211> 36 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 166

ggtggctcca tcagcagtgg tggttactac tggagc

36

<210> 167 <211> 48 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 167

tacatctctt acagtgggag cacctactac aacccgtccc tcaagagt

48

<210> 168 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 168

gcttacggtg actatcgcgg ctggttcgac ccc

33

<210> 169 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 169

<210> 170

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 170

<210> 171

<211> 11 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 171

<210> 172

<211> 7

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 172

<210> 173

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35

<400> 173

<210> 174

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 174

<210> 175

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 175

<210> 176

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <400> 176

<210> 177

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 177

<210> 178

<211> 372

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 178

<210> 179

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 1

<223> Xaa = Asn O Val

<220>

<221> VARIANTE

<222> 3

<223> Xaa = Trp O Lys

<220>

<221> VARIANTE

<222> 4

<223> Xaa = Tyr O Gln

<220>

<221> VARIANTE

<222> 8

<223> Xaa = Asn O Glu O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> 9

<223> Xaa = Lys O Glu

<220>

<221> VARIANTE

<222> 11

<223> Xaa = His O Tyr

<220>

<221> VARIANTE

<222> (12)...(12)

<223> Xaa = Ala O Val

<400> 179

<210> 180

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 1

<223> Xaa = Trp O Ile

<220>

<221> VARIANTE

<222> 3

<223> Xaa = Asn O Ile O Ser O Tyr

<220>

<221> VARIANTE

<222> 4

<223> Xaa = Pro O Ala

<220>

<221> VARIANTE

<222> 5

<223> Xaa = Asn O Tyr O Gly

<220>

<221> VARIANTE <222> 6

<223> Xaa = Ser O Asn O Asp

<220>

<221> VARIANTE

<222> 7

<223> Xaa = Gly O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8) ... (8)

<223> Xaa = Gly O Asn O Asp

<220>

<221> VARIANTE

<222> (10) ... (10)

<223> Xaa = Asn O Arg

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11)...(11)

<223> Xaa = Tyr O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (12)...(12)

<223> Xaa = Ala O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (13)...(13)

<223> Xaa = Gln O Pro

<220>

<221> VARIANTE

<222> (14)...(14)

<223> Xaa = Lys O Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (15)...(15)

<223> Xaa = Phe O Leu

<400> 180

<210> 181 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 181

ctacagcata atagttatac gtggacg

27

<210> 182 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 182

ggattcacct tcagtgccta tggcatgcac

30

5

<210> 183 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 183

10 15

gttatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c <210> 184 <211> 45 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 184 51

agtcggaact ggaactacga ctcctaccaa tacggtttgg acgtc

45

20

<210> 185 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

25

<400> 185

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 186 35

<210> 187

<211> 11 40 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 1

<223> Xaa = Val O -Xaa (Xaa delecionado)

<220>

<221> VARIANTE

<222> 2

<223> Xaa = Gln O -Xaa (Xaa delecionado)

<220>

<221> VARIANTE

<222> 3

<223> Xaa = Asp O Trp O -Xaa (Xaa delecionado)

<220>

<221> VARIANTE

<222> 4

<223> Xaa = Ser O Leu O -Xaa (Xaa delecionado)

<220>

<221> VARIANTE

<222> 5

<223> Xaa = Ile O Glu O Gln

<220>

<221> VARIANTE

<222> 6

<223> Xaa = Ala O Leu O Gly

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7)...(7)

<223> Xaa = Ala O Leu

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8)...(8)

<223> Xaa = Pro O Tyr O Gly

<400> 187

<210> 188

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 1

<223> Xaa = Asp O -Xaa (Xaa delecionado)

<220>

<221> VARIANTE

<222> 2

<223> Xaa = Gln O -Xaa (Xaa delecionado)

<220>

<221> VARIANTE

<222> 3

<223> Xaa = Asp O Ala <220>

<221> VARIANTE

<222> 5

<223> Xaa = Tyr O Gly

<220>

<221> VARIANTE

<222> 7

<223> Xaa = Ser O Tyr

<220>

<221> VARIANTE

<222> 8

<223> Xaa = Ser O Arg

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11)...(11)

<223> Xaa = Phe O -Xaa (Xaa delecionado)

<220>

<221> VARIANTE

<222> (12)...(12)

<223> Xaa = Gly O Asp

<220>

<221> VARIANTE

<222> (13)...(13)

<223> Xaa = His O Pro

<400> 188

<210> 189

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 189

<210> 190

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 190

<210> 191

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 191

<210> 192

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 192

<210> 193

<211> 315

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 193

<210> 194

<211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens

25 <400> 194 <210> 202

<210> 195 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens

35

<400> 195 tctggagata aattggggga taaatatgtt tgt 33

<210> 196 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 196

45

ctagataaca agcggccctc a 21

<210> 197 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 197

55

caggcgtggg acagcagcac ggta 24

5

<210> 198 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 198

ggttacacct ttaccagcta tggtatcagc

30

10

<210> 199 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens

15

<400> 199

tggatcagcg cttacaatgg taacacaaac tatgcacaga agttccaggg c

51

20

<210> 200 <211> 36 <212> ADN <213> Homo sapiens

25

<400> 200 gatcaagatt actatgatag tagtggttgg ggccac 36

30

<210> 201 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 201

<211> 121

<212> PRT 40 <213> Homo sapiens

<400> 202

<210> 203

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 203

<210> 204

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 205

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 205

<210> 206

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 206

<210> 207

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 207

<210> 208

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 208

<210> 209

<211> 316

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 209

<210> 210

<211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 210

<210> 211 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 211

35

tctggagata aattggggga taaatatgct ttc <210> 212 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens 33

<400> 212

catgatacca agcggccctc a

21

45

<210> 213 <211> 360 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Quimera Activina A/B

<400> 213

<210> 214

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 214

<210> 215

<211> 326 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 215

5

<210> 216 <211> 36 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 216

10

gatcaagatt actatgatag tagtggttgg gacccc 36

15

<210> 217 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 217

<210> 218

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 218

<210> 219

<211> 11

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 219

20 25

<210> 220 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 220

His Asp Thr Lys Arg Pro Ser 1 5

30

<210> 221 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens

35

<400> 221

<210> 222

<211> 318

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 222

<210> 223

<211> 321 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 223

<210> 224

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 224

<210> 225

<211> 116

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 225

<210> 226

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 226

30 <210> 227

<211> 636

<212> ADN

<213> Homo sapiens

35 <400> 227

<210> 228

<211> 1344

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 228

<210> 229

<211> 642

<212>

ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 229

<210> 230

<211> 1350

<212>

ADN 25 <213> Homo sapiens

<400> 230 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 231 10

<210> 232

<211> 1347 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 232

<210> 233

<211> 212

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 233

<210> 234

<211> 448

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 234

<210> 235

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 235

<210> 236

<211> 450

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 236

<210> 237

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 237

<211> 449 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 238

<210> 239

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens 10

<400> 239

<210> 240

<211> 978

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 240

<210> 241

<211> 978

<212>

ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 241

<210> 242

<211> 824

<212>

ADN 25 <213> Homo sapiens

<400> 242 <210> 243

<211> 116 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Quimera Activina A/B 10

<400> 243

15 <210> 244

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> Quimera Activina A/B

<400> 244

<210> 245

<211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

5

<220> <223> Oligonucleótido

<400> 245

10

ctcgaggtcg actagaccac catgcccttg c 31

15

<210> 246 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Oligonucleótido

20

<400> 246

ccatcacact ctagaccccg ccgacgcc

28

25

<210> 247 <211> 360 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

30

<220> <223> Quimera Activina A/B

<400> 247

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de éste, que comprende:

   a. un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende:

   i. una secuencia CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO: 11; 5 ii. una secuencia CDR2 de cadena ligera de SEQ ID NO:12; y

   iii.

   una secuencia CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:13; y

   b.

   un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende:

   i.

   una secuencia CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO:62;

   ii. una secuencia CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 63; y

   10 iii. una secuencia CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 64, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de éste se une específicamente a activina A humana.
2. 2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de éste de la reivindicación 1 que comprende bien:

   a. una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 9;

   b.

   una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 10; o 15 c. el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b).

3. 3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de éste de la reivindicación 1 que, cuando se une a activina

   A:

   a.

   inhibe la activina A;

   b.

   compite de manera cruzada con un anticuerpo de referencia para la unión a activina A; 20 c. se une al mismo epítopo de la activina A que dicho anticuerpo de referencia;

   d.

   se une a la activina A con sustancialmente la misma Kd que dicho anticuerpo de referencia; o

   e.

   se une a la activina A con sustancialmente la misma velocidad de disociación que dicho anticuerpo de referencia;

   en el que dicho anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionada del grupo de combinaciones que consiste en: SEQ ID NOS: 9 y 10.

   25 4. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de éste de la reivindicación 1 ó 2 que, cuando se une a activina A humana, inhibe la unión de activina A al receptor de activina A humano.
4. 5. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de éste de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de éste posee al menos una actividad biológica in-vivo seleccionada del grupo que consiste en: atenuación de la caquexia en ratones que portan tumor de colon; mejora la pérdida de peso

   30 corporal en ratones que portan tumor de colon; mejora la pérdida de peso corporal en un modelo animal de artritis reumatoide inducida por colágeno; mejora la pérdida de masa muscular en un modelo animal de artritis reumatoide inducida por colágeno; mejora la pérdida de masa grasa en un modelo animal de artritis reumatoide inducida por colágeno; y mejora la pérdida de peso corporal en un modelo animal con transfección de AAV-activina A.
5. 6. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de éste de la reivindicación 1 ó 2, que comprende un

   35 anticuerpo completamente humano aislado que se une específicamente a la región de nudo de cisteína (aminoácidos C11-S33 y/o aminoácidos C81-E111) de activina A, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de éste posee al menos una actividad biológica in-vivo seleccionada del grupo que consiste en: atenuación de la caquexia en ratones que portan tumor de colon; mejora la pérdida de peso corporal en ratones que portan tumor de colon; mejora la pérdida de peso corporal en un modelo animal de artritis reumatoide inducida por

   40 colágeno; mejora la pérdida de masa muscular en un modelo animal de artritis reumatoide inducida por colágeno; mejora la pérdida de masa grasa en un modelo animal de artritis reumatoide inducida por colágeno; y mejora la pérdida de peso corporal en un modelo animal con transfección de AAV-activina A.
6. 7. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de éste de la reivindicación 1 ó 2, que comprende un anticuerpo completamente humano aislado que a) se une específicamente a la región de nudo de cisteína (aminoácidos C11-S33 y/o aminoácidos C81-E111) de activina A, en el que dicha proteína de unión a antígeno inhibe la unión de activina A al receptor de activina A in vitro,o

   b) se une específicamente a la región de nudo de cisteína (aminoácidos C11-S33 y/o aminoácidos C81-E111) de activina A, en el que dicha proteína de unión a antígeno inhibe la unión de activina A al receptor de activina A in vivo, o

   c) se une específicamente a los aminoácidos K13—Y39 de activina A, en el que dicha proteína de unión a antígeno inhibe la unión de activina A al receptor de activina A in vitro,o

   d) se une específicamente a los aminoácidos V82—N107 de activina A, en el que dicha proteína de unión a antígeno inhibe la unión de activina A al receptor de activina A in vitro,o

   e) se une específicamente a los aminoácidos K13-Y39 de activina A, en el que dicha proteína de unión a antígeno inhibe la unión de activina A al receptor de activina A in vivo,o

   f) se une específicamente a los aminoácidos V82-N107 de activina A, en el que dicha proteína de unión a antígeno inhibe la unión de activina A al receptor de activina A in vivo.

7. 8.

   El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de éste según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además la secuencia constante de cadena ligera kappa de SEQ ID NO: 84, 100 ó 108, y/o la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 214, 215 ó 221.

8. 9.

   El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de éste según la reivindicación 8, que comprende la secuencia constante de cadena ligera kappa de SEQ ID NO: 84 y la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 214.

9. 10.

   El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de éste según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que tiene una afinidad de unión (KD) para activina A humana de menos de o igual a 1 x 10-11 M.

10. 11.

    Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera, cadena pesada o ambas de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de éste, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

11. 12.

    Un vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 11.

12. 13.

    El vector según la reivindicación 12, que se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, un vector viral, vectores de mamífero no episomales, vectores de expresión y un vector de expresión recombinante.

13. 14.

    Una célula aislada que comprende un polinucleótido según la reivindicación 11, o en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante según la reivindicación 13.

14. 15.

    La célula aislada según la reivindicación 14, que es una célula de hibridoma o una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO).

15. 16.

    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de éste, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

16. 17.

    La composición farmacéutica según la reivindicación 16 que comprende además una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en un tampón, un antioxidante, un polipéptido de bajo peso molecular, una proteína, un aminoácido, un carbohidrato, un agente quelante, un estabilizador, y un excipiente.

17. 18.

    La composición farmacéutica según la reivindicación 16 ó 17 para uso en medicina.

18. 19.

    La composición farmacéutica según la reivindicación 18, para uso en el tratamiento de una afección cancerosa.