ES2421260T7

ES2421260T7 - Compuestos y sus sales específicos de los receptores PPAR y los receptores del EGF, y su uso en el campo de la medicina

Info

Publication number: ES2421260T7
Application number: ES06766085.2T
Authority: ES
Inventors: Giancarlo Naccari; Sergio Baroni
Original assignee: Nogra Pharma Ltd
Current assignee: Nogra Pharma Ltd
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-24
Publication date: 2016-10-11
Also published as: EA014665B3; ES2421260T3; IL205992A; EP1910270B3; AU2006271165C1; US20150045436A1; US20150265563A1; WO2007010516A2; NO20080325L; PT1910270E; ZA200801671B; AU2006271165A1; US20090048343A1; JP2009502777A; NO340680B1; CN102020577B; US8153841B2; US9133099B2; CA2616146C; EA017566B1

Description

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DESCRIPCION

Compuestos y sus sales espedficos de los receptores PPAR y los receptores del EGF, y su uso en el campo de la medicina

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a compuestos y a sus sales, espedficos de los receptores PPAR y los receptores del EGF, y a su uso en el campo de la medicina.

Objeto de la invencion

En particular, los compuestos y sus sales, de acuerdo con la presente invencion, se pueden usar ventajosamente para la prevencion y el tratamiento de tumores que expresan los receptores PPARy (receptores activados por proliferadores de peroxisomas) y los receptores del EGF (receptores del factor de crecimiento epidermico) tales como tumores de: esofago, estomago, pancreas, colon, prostata, mama, utero y apendices, rinones y pulmones. Por otra parte, los compuestos y sus sales, de acuerdo con la invencion, se pueden usar para el tratamiento de enfermedades inflamatorias cronicas, en particular de enfermedades intestinales cronicas tales como la enfermedad de Crohn y la rectocolitis ulcerosa.

Antecedentes de la invencion

Los receptores PPARy son receptores nucleares (grupo de aprox. 50 factores de transcripcion) que controlan la expresion de muchos genes que son importantes para la regulacion del metabolismo de los lfpidos, la smtesis de la insulina y los procesos de la carcinogenesis e inflamacion. (Bull A. W., Arch Pathol Lab Med 2003;127: 1121-1123) (Koeffler H. P., Clin Cancer Res 2003; 9: 1-9) (Youssef J. et al., J. Biomed Biotec 2004; 3: 156-166).

Hay diversos agonistas naturales y sinteticos que se unen a los receptores PPARy y alteran su configuracion, dando lugar a su activacion. En “The Lancet” 2002; 360:1410-1418, se describen ligandos naturales y sinteticos.

Estudios recientes han demostrado que el tratamiento de celulas tumorales con ligandos de los receptores PPARy produce una disminucion de la proliferacion celular, la diferenciacion celular y la apoptosis, lo que sugiere la posible aplicacion de dichos compuestos como agentes para la prevencion de la carcinogenesis (Osawa E. et al., “Gastroenterology”, 2003; 124:361-367).

Otros estudios han demostrado que los ligandos de los receptores PPARy (por ejemplo, la troglitazona) tienen efectos antiinflamatorios e inhiben la respuesta inflamatoria mucosa en modelos animales de la EII (Tanaka T et al., Cancer Res 2001; 61: 2424-2428).

Por otra parte, muy recientemente, se han publicado pruebas de que la actividad antiinflamatoria intestinal de 5-ASA, el patron de referencia en el tratamiento de la EII, depende de la union, y la consiguiente activacion, de los receptores PPARy (Rousseaux C. et al., J Exp Med 2005; 201: 1205-1215).

El receptor transmembrana con actividad tirosina-quinasa del EGF se expresa a un nivel muy alto en forma activada en diversos tipos de neoplasias (Mendelsohn J., Endocr Relat Cancer 2001; 8:3-9) (Harari P. M., Endocr Relat Cancer 2004; 11: 689-708).

La sobreexpresion del receptor tambien esta relacionada con la capacidad potencial de las celulas tumorales para sufrir metastasis. En relacion con esto, se ha demostrado que el EGF promueve la migracion y la invasion de diversos tipos de celulas relacionadas con las lesiones a nivel de las interacciones con la matriz extracelular (Brunton et al., “Oncogene” 1997; 14:283-293).

Numerosos estudios realizados tanto en animales de experimentacion como en seres humanos han demostrado la eficacia de los inhibidores del receptor del EGF en el control de la proliferacion y la propagacion de los tumores (Mendelsohn J., Endocr Relat Cancer 2001; 8:3-9) (Harari P. M., Endocr Relat Cancer 2004; 11:689-708).

No hay duda de que las senales intracelulares desencadenadas por la activacion del receptor del EGF facilitan el crecimiento y la supervivencia de las celulas neoplasicas, lo que contribuye al desarrollo de la patologfa, y que dichas senales son esenciales para la determinacion de la capacidad de las celulas tumorales para propagarse y colonizar organos distantes (Mendelsohn J., Endocr Relat Cancer 2001; 8:3-9) (Kari C et al., Cancer Res 2003; 63:15).

A partir de lo anterior y teniendo en cuenta, ademas, que desde el punto de vista biologico, los procesos inflamatorios cronicos desempenan un papel en la carcinogenesis, es obvio que existe una necesidad real de investigar de manera innovadora nuevas entidades qmmicas que, por su accion complementaria tanto en los receptores PPARy como en los receptores del EGF, sean capaces de ejercer una accion antiinflamatoria y antitumoral de tipo quimio-preventiva, antiproliferativa y antimetastasica.

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La presente invencion proporciona una nueva clase de compuestos que son adecuados para la prevencion y el tratamiento del cancer y de la inflamacion cronica mediante la modulacion de receptores espedficos tales como los receptores PPARy y los receptores del EGF.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a nuevos e innovadores usos medicos y terapeuticos de una serie de compuestos. En la medida en que cualquiera de estos compuestos no sea conocido, la invencion tambien se refiere a estos compuestos.

En un primer aspecto de la invencion, se proporciona un compuesto y sales del mismo seleccionados del grupo que consiste en:

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Los compuestos de la invencion corresponden a los compuestos seleccionados del grupo que consiste en:

acido 3-(3'-aminofenil)2-hidroxipropanoico (compuesto 20) acido 2-(4-aminofenil)2-metoxiacetico (compuesto 23) acido 2-(3-aminofenil)2-etoxiacetico (compuesto 32) acido 2-(4-aminofenil)2-etoxiacetico (compuesto 33) acido 3-(4-aminofenil)2-metoxipropionico (compuesto 34) acido 3-(4-aminofenil)2-etoxipropionico (compuesto 39).

Los nombres de los compuestos anteriores tambien se pueden escribir en la nomenclatura qmmica estandar de la siguiente manera (nomenclatura que se usara a lo largo del texto):

acido (±)-2-hidroxi-3-(3-aminofenil)propionico (compuesto 20) acido (±)-2-metoxi-2-(4-aminofenil)acetico (compuesto 23) acido (±)-2-etoxi-2-(3-aminofenil)acetico (compuesto 32) acido (±)-2-etoxi-2-(4-aminofenil)acetico (compuesto 33) acido (±)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil)propionico (compuesto 34) acido (±)-2-etoxi-3-(4'-aminofenil)propionico (compuesto 39) acido (±)-2-etoxi-3-(3'-aminofenil)propionico (compuesto 40).

En un segundo aspecto de la invencion, los compuestos de acuerdo con la presente invencion o acido 3-(3'- aminofenil)2-etoxipropionico (compuesto 40) se pueden usar ventajosamente en el campo de la medicina. Por lo tanto, un cuarto aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende uno o mas compuestos segun lo definido anteriormente y/o acido 3-(3'-aminofenil)2-etoxipropionico (compuesto 40) como principios activos en combinacion con uno o mas excipientes o adyuvantes farmaceuticamente aceptables.

La presente invencion se refiere ademas al uso de los compuestos segun lo definido anteriormente o acido 3-(3'- aminofenil)2-etoxipropionico (compuesto 40), para la preparacion de un producto medicinal para la prevencion y el tratamiento de tumores que expresen los receptores PPARy y los receptores del EGF tales como, por ejemplo, tumor

de esofago, estomago, pancreas, colon, prostata, mama, utero y sus apendices, de los rinones y de los pulmones.

Ademas, la invencion se refiere al uso de los compuestos de acuerdo con la invencion o acido 3-(3'-aminofenil)2- etoxipropionico (compuesto 40), para la preparacion de un producto medicinal para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias cronicas tales como, por ejemplo, la enfermedad de Crohn y la rectocolitis ulcerosa.

5 En otro aspecto mas de la invencion, otros compuestos adicionales que se pueden usar en las aplicaciones anteriormente mencionadas, al margen de los que ya se han descrito, pueden ser los siguientes:

acido (R,S)-2-hidroxi-3-(4'-aminofenil)propi6nico (compuesto 21) y acido (R,S)-2-metoxi-3-(3'-aminofenil)propionico (compuesto 35).

Los nombres de los compuestos anteriores tambien se pueden escribir en la nomenclatura qmmica estandar de la 10 siguiente manera (nomenclatura que se usara a lo largo del texto):

acido (±)-2-hidroxi-3-(4'-aminofenil)propionico (compuesto 21) y acido (±)-2-metoxi-3-(3'-aminofenil)propionico (compuesto 35).

Un compuesto preferido tiene la formula (II):

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15 Un compuesto preferido tiene la formula (III):

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Un compuesto preferido tiene la formula (IV):

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Un compuesto preferido tiene la formula (V):

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Un compuesto preferido tiene la formula (VI):

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De acuerdo con otro aspecto de la invencion, el compuesto y las sales del mismo que tienen formula (VII) se pueden 5 usar en el campo de la medicina.

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Un compuesto preferido tiene la formula (VIII):

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Los compuestos preferidos de la invencion se pueden seleccionar del grupo que consiste en:

acido (±)-2-hidroxi-3-(3-aminofenil)propionico (compuesto 20) acido (±)-2-metoxi-2-(4-aminofenil)acetico (compuesto 23) acido (±)-2-etoxi-2-(3-aminofenil)acetico (compuesto 32) acido (±)-2-etoxi-2-(4-aminofenil)acetico (compuesto 33) acido (±)-2-metoxi-3-(4-aminofenil)propionico (compuesto 34) acido (±)-2-etoxi-3-(4-aminofenil)propionico (compuesto 39).

Los compuestos de acuerdo con la presente invencion o acido 3-(3'-aminofenil)2-etoxipropionico (compuesto 40), puede usarse ventajosamente en el campo de la medicina. Por lo tanto, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende uno o mas compuestos segun lo definido anteriormente y/o acido 3-(3'- aminofenil)2-etoxipropionico (compuesto 40), como principios activos en combinacion con uno o mas excipientes o adyuvantes farmaceuticamente aceptables.

La presente invencion se refiere ademas al uso de los compuestos segun lo definido anteriormente o acido 3-(3'- aminofenil)2-etoxipropionico (compuesto 40), para la preparacion de un producto medicinal para la prevencion y el tratamiento de tumores que expresen los receptores PPARy y los receptores del EGF tales como, por ejemplo, tumor de esofago, estomago, pancreas, colon, prostata, mama, utero y sus apendices, de los rinones y de los pulmones.

Ademas, la invencion se refiere al uso de los compuestos de acuerdo con la invencion o acido 3-(3-aminofenil)2- etoxipropionico (compuesto 40), para la preparacion de un producto medicinal para el tratamiento de enfermedades inflamatorias cronicas tales como, por ejemplo, la enfermedad de Crohn y la rectocolitis ulcerosa. La presente invencion se refiere ademas a procedimientos de tratamiento de seres humanos y/o marnfferos (incluyendo roedores, animales de granja, animales domesticos, ratones, ratas, hamsteres, conejos, perros, gatos, cerdos, ovejas, vacas, caballos).

En particular, los compuestos de acuerdo con la invencion que se pueden usar en las aplicaciones anteriormente mencionadas, al margen de las que ya se han descrito, pueden ser los siguientes:

acido (±)-2-hidroxi-2-(3-aminofenil)acetico (compuesto 10) acido (±)-2-hidroxi-2-(4-aminofenil)acetico (compuesto 11) acido (±)-2-hidroxi-3-(4-aminofenil)propionico (compuesto 21) acido (±)-2-metoxi-3-(3'-aminofenil)propionico (compuesto 35) acido (±)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil)propionico (compuesto 34).

Los usos de los compuestos descritos no se limitan a su uso en la forma racemica. La presente invencion engloba el uso de cualquiera de los compuestos descritos en las formas enantiomericamente puras R o S, o en cualquier mezcla en la que un enantiomero este en exceso con respecto al otro, en cualquier proporcion.

De hecho, los estudios de acoplamiento realizados indican que el enantiomero S es mas activo que el enantiomero R, aunque el enantiomero R puro no muestra actividad.

Las moleculas de la presente invencion se obtuvieron mediante un trabajo de modelizacion molecular usando mesalazina como patron de referencia, y se evaluaron todas las variaciones qmmicamente viables para lograr la mejor puntuacion (afinidad y activacion del receptor) en los experimentos de acoplamiento por ordenador. Por consiguiente, se cree que los compuestos de la presente invencion o acido 3-(3'-aminofenil)2-etoxipropionico (compuesto 40) que muestran una funcion y/o actividad comparables con la mesalazina lo hacen a traves de rutas biologicas similares. Se cree que las caractensticas similares a mesalazina inherentes a las moleculas de la invencion confieren a las moleculas una actividad similar en relacion con la ruta del EGF.

Los ejemplos proporcionados en la presente memoria son modelos utiles para su uso en la prediccion del uso de los compuestos en los diversos campos de la medicina ya descritos. Por tanto, los modelos proporcionan resultados valiosos y significativos, independientemente de su mecanismo de accion.

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A continuacion, se describira la presente invencion a efectos ilustrativos, pero no restrictivos, de acuerdo con sus realizaciones preferidas, haciendo referencia particularmente a los diagramas de las figuras adjuntas.

Breve descripcion de las figuras y tabla

Tabla 1. Porcentajes de la inhibicion de celulas DLD-1 en dosis graduadas (0,5-10 mM) de los compuestos especificados. Se cultivaron las celulas en presencia o en ausencia de los compuestos y luego se evaluo el crecimiento celular mediante el ensayo colorimetrico (BrdU) tras un cultivo de 48 horas.

Figura 1: muestra las estructuras de los compuestos 20, 23, 32, 33, 34, 35, 39 y 40.

Figura 2: actividad de PPARy mediante el tratamiento con compuestos.

Figuras 3-4: efecto de las sustancias especificadas en la proliferacion de lmeas celulares de carcinoma de colon humano (es decir, HT29, HT115 y DLD1). Las celulas se trataron con concentraciones crecientes de sustancias (0,5-10 mM)) durante 48 horas y la proliferacion se determino usando un ensayo colorimetrico para la medicion de la incorporacion de BrdU. La densidad optica (DO) se determino a 450 nm usando un lector de ELISA. Los datos indican la media ± DE de 3 experimentos separados.

Figura 5: Acoplamiento del Compuesto 34 (R) al receptor PPARy (se muestra el marcaje de los residuos de aminoacido y el puente de hidrogeno).

Figura 6: Acoplamiento del Compuesto 34 (S) al receptor PPARy (se muestra el marcaje de los residuos de aminoacido y el puente de hidrogeno).

Figura 7: Acoplamiento del Compuesto 35 (R) al receptor PPARy (se muestra el marcaje de los residuos de aminoacido y el puente de hidrogeno).

Figura 8: Acoplamiento del Compuesto 35 (S) al receptor PPARy (se muestra el marcaje de los residuos de aminoacido y el puente de hidrogeno).

Figura 9: Acoplamiento del Compuesto 39 (R) al receptor PPARy (se muestra el marcaje de los residuos de aminoacido y el puente de hidrogeno).

Figura 10: Acoplamiento del Compuesto 39 (S) al receptor PPARy (se muestra el marcaje de los residuos de aminoacido y el puente de hidrogeno).

Figura 11: Acoplamiento de la mesalamina al receptor PPARy (se muestra el marcaje de los residuos de aminoacido y el puente de hidrogeno).

Figura 12: Smtesis esquematica y posterior resolucion del Compuesto 39.

Ejemplo 1

Procedimiento de preparacion de acido (±)-2-hidroxi-3-(3'-aminofenil)-propanoico (Compuesto 20)

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Etapa 1

Se mezclaron 3-nitro-benzaldel‘ndo (45,3 g, 0,3 mol), W-acetilglicina (42,1 g, 0,36 mol) y acetato de sodio (32 g, 0,39 mol) con anhfdrido acetico (142 ml, 1,5 mol), y se calento la mezcla resultante con agitacion a 120 °C durante 6 horas, dando una solucion de color oscuro. Despues, se enfrio la mezcla hasta la T.A. durante una noche, dando como resultado la formacion de un solido precipitado. Se vertio la mezcla de reaccion en agua con hielo (130 g) y se recogio por filtracion el solido suspendido resultante. Se lavo el producto solido en bruto (72 g) con acetona (80 ml), despues se recristalizo en acetona caliente (320 ml), dando un solido cristalino que se lavo con etanol acuoso al 50

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% que luego se seco a 40 °C/5,3 kPa, dando 2-metil-4-(3-nitrobenciliden)oxazol-5(4H)-ona (49,0 g, 78 %) en forma de agujas de color amarillo palido. RMN de 1H (8, 250 MHz, CDCla) = 2,47 (3H, s), 7,15 (1H, s), 7,63 (1H, dd, 8,2 y

7.6 Hz), 8,27 (1H, d, 8,2 Hz), 8,34 (1H, d, 7,6 Hz), 9,02 (1H, s).

Etapa 2

Se mezclo 2-metil-4-(3-nitrobenciliden)oxazol-5(4H)-ona (52,0 g, 0,224 mol) con acido clorhndrico 3 M (1,3 l) y se agito la suspension a 100 °C durante 6 h. Se agito la suspension resultante a T.A. durante una noche y despues se recogio el solido suspendido por filtracion, se lavo con agua (2 x 40 ml), y luego se seco al vado, dando acido 2- hidroxi-3-(3-nitrofenil)acnlico (29,3 g). Se extrajeron el filtrado combinado y los lavados con acetato de etilo (4 x 0,5 l), despues se secaron los extractos organicos combinados sobre sulfato de sodio y se concentraron hasta la sequedad, dando un cultivo adicional de acido 2-hidroxi-3-(3-nitrofenil)acnlico (12,0 g). El rendimiento total del acido 2-hidroxi-3-(3-nitrofenil)acnlico fue de 41,3 g (88 %).

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6) = 6,56 (1H, s), 7,64 (1H, t, 8Hz), 8,0-8,1 (2H, m), 8,78 (1H, s), 9,95 (1H, s ancho), 12,80 (1H, s ancho).

Etapa 3

Se anadio etoxido de sodio (1,8 g, 26,4 mmol) en porciones a 0 °C a una solucion agitada de acido 2-hidroxi-3-(3- nitrofenil)acnlico (5,25 g, 25,0 mmol) en metanol (131 ml) para formar una solucion de color amarillo palido, transparente. A continuacion, se anadio borohidruro de sodio (1 g, 26,4 mmol) cuidadosamente en dos porciones, y se agito la mezcla a 5-10 °C durante 30 minutos. Despues se anadio una pequena cantidad de agua para detener la reaccion y destruir cualquier exceso de NaBH4. Se elimino el metanol al vado, dando un residuo solido que se trituro con una mezcla a 5:2 de acetato de etilo y heptano (21 ml), luego se siguio moliendo con metanol acuoso al 3 %. Se recogio el solido resultante por filtracion y se seco al vado, dando acido 2-hidroxi-3-(3-nitrofenil)propionico (3,0 g, 57 %).

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6) = 2,97 (1H, dd, 14 y 8,2 Hz), 3,15 (1H, dd, 14 y 4,2 Hz), 4,23 (1H, dd, 8,2 y 4,2 Hz), 7,58 (1H, t, 8Hz), 7,70 (1H, d, 8Hz), 8,0-8,15 (2H, m).

Etapa 4

Se hidrogeno una mezcla de acido 2-hidroxi-3-(3-nitrofenil)propionico (3,0 g, 14,2 mmol), metanol (129 ml) y paladio sobre carbon vegetal activado al 5 % (600 mg, 2 % molar) en una atmosfera de H2 de 68,9 kPa durante 1 h. Despues, se filtro la mezcla a traves de celita, se lavo la torta de filtro con metanol y se concentraron los filtrados a 40 °C bajo un alto vado, dando el producto en forma de un solido espumoso. Se disolvio este en agua y se liofilizo la solucion, dando acido (±)-2-hidroxi-3-(3'-amino-fenil)-propanoico (2,6 g, 100 %) en forma de un solido blanco.

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6) = 2,61 (1H, dd, 13,6 y 8,3 Hz), 2,81 (1H, dd, 13,6 y 4,6 Hz), 4,09 (1H, dd, 8,25 y

4.6 Hz), 6,35-6,43 (2H, m), 6,45 (1H, d, 1Hz), 6,90 (1H, t, 7,6 Hz).

Ejemplo 2

Procedimiento de preparacion de acido (±)-2-metoxi-2-(4'-ammofeml)acetico (compuesto 23)

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Etapa 1

Se anadio una solucion de hidroxido de potasio (6,72 g, 0,12 mol) en metanol (25 ml) a una solucion enfriada (-7 °C) de 4-acetamidobenzaldeddo (24,5 g, 0,15 mol) y cloroformo (40,1 g, 0,33 mol) en DMF (100 ml) a una velocidad para mantener la temperatura por debajo de -5 °C. Se dejo calentar la mezcla hasta 2 °C durante 5,5 h, y luego se anadio a una mezcla de HCl ac. 1 M (200 ml) y tolueno (200 ml), y se agito durante la noche. Se recogio el 2-(4- acetamidofenil)-triclorocarbinol resultante por filtracion (29 g) y seco por succion.

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Etapa 2

Se combinaron soluciones de 2-(4-acetamidofenil)-triclorocarbinol (14,0 g, 49,5 mmol) en metanol (330 ml) e hidroxido de potasio (13,8 g, 250 mmol) en metanol (150 ml), y se calento la mezcla hasta 70-80 °C durante 3 h. Despues de enfriar, se retiro el subproducto de KCI por filtracion y, luego, la concentracion del filtrado al vado dio acido 2-(4-acetamidofenil)-2-metoxiacetico (14 g) en forma de un solido blanco.

Etapa 3

Se calento acido 2-(4-acetamidofenil)-2-metoxiacetico (7,1 g, 31,8 mmol) con monohidrato de hidrazina (40 ml) durante 16 horas, y se enfrio y se concentro al vado. Se purifico el aceite residual resultante mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (eluyente: metanol al 20-40 % en CH2Ch), dando 2,6 g (45 %) de acido (±)-2-metoxi-2- (4'-aminofenil)-acetico. RMN de rH (8, 250 MHz, CD3OD): 3,27 (3H, s), 4,43 (1H, s), 6,66 (2H, d, 8,5 Hz), 7,18 (2H, d, 8,2 Hz).

Ejemplo 3

Procedimiento de preparacion de acido (±)-2-metoxi-2-(3'-ammofeml)acetico (compuesto 32)

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Etapa 1

Se disolvieron 3-nitrobenzaldelddo (25 g, 165 mmol) y cloroformo (30 ml, 375 mmol) en DMF (100 ml) y se enfrio la solucion hasta entre -5 °C y -10 °C. Se anadio una solucion reden preparada de hidroxido de potasio (7,5 g, 134 mmol) en metanol (22,5 ml) lentamente para mantener la temperatura interna por debajo de -5 °C. Se mantuvo la reaccion por debajo de -5 °C durante 2 horas y despues se detuvo con una mezcla enfriada de acido clorhidrico acuoso (225 ml) en tolueno (225 ml). Se dejo calentar la solucion lentamente hasta la temperatura ambiente durante la noche en el bano de hielo. Tras este tiempo, se separo la capa de tolueno y se extrajo ademas la capa acuosa con tolueno. Se lavaron las capas organicas combinadas con agua (2 x 225 ml), solucion de bicarbonato de sodio al 5 % (225 ml) y agua (225 ml). Se seco la solucion (MgSO4), se filtro y se concentro al vado, dando 2-(3-nitrofenil)- triclorocarbinol en forma de un solido naranja (42 g, 155 mmol, 94 %).

RMN de 1H (8, 250 MHz, CDCla): 3,7 (s ancho, 1H), 5,4 (s, 1H), 7,6 (t, 1H, 8,0 Hz), 8,0 (d, 1H, 8,0 Hz), 8,3 (d, 1H, 8,0 Hz), 8,5 (s, 1H).

Etapa 2

Se disolvio 2-(3-nitrofenil)-triclorocarbinol (20 g, 74 mmol) en etanol absoluto (74 ml) y se anadio lentamente una solucion de hidroxido de potasio (20,7 g, 369 mmol) en etanol absoluto (150 ml). Se calento la solucion a reflujo durante 4 horas, se dejo enfriar y despues se concentro al vado. Se acidifico el residuo con acido clorhfdrico diluido y se extrajo el producto en acetato de etilo (x 3). Se secaron las capas organicas combinadas (MgSO4), se filtraron y se concentraron al vado, dando acido 2-etoxi-2-(3-nitrofenil)acetico en forma de un solido de color marron (6,4 g, 28,4 mmol, 38 %).

RMN de 1H (8, 250 MHz, CD3OD): 1,0 (t, 3H, 7,0 Hz), 3,6 (m, 1H), 3,7 (m, 1H), 5,1 (s, 1H), 7,7 (t, 1H, 7,8H), 7,9 (d, 1H, 7,8 Hz), 8,3 (d, 1H, 7,8 Hz), 8,4 (s, 1H).

Etapa 3

Se disolvio acido 2-etoxi-2-(3-nitrofenil)acetico (6,4 g, 28,4 mmol) en etanol absoluto (500 ml), se anadio paladio sobre carbon al 5 % (humedo) (1,5 g) y se hidrogeno la mezcla a 413,7 kPa durante una noche. Se filtro la suspension a traves de celita y se concentro el filtrado, dando acido (±)-2-etoxi-2-(3'-amino-fenil)-acetico (3,0 g, 15,3 mmol, 54 %) en forma de un solido de color marron.

RMN de 1H (8, 250 MHz, CD3OD): 1,2 (t, 3 H, J = 6,9 Hz), 3,5 (m, 1 H), 3,6 (m, 1 H), 4,6 (s, 1 H), 6,7 (d, 1 H, J = 7,6 Hz), 6,9 (m, 2 H), 7,0 (t, 1H, J = 7,6 Hz).

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5 Vease el "Compuesto 23, etapa 1".

Etapa 2

Se combinaron soluciones de 2-(4-acetamidofenil)-triclorocarbinol (14,0 g, 49,5 mmol) en etanol (400 ml) e hidroxido de potasio (13,8 g, 250 mmol) en etanol (150 ml), y se calento la mezcla a 70-80 °C durante 2,5 horas. Se enfrio la mezcla, se filtro para eliminar el subproducto de Kcl y se concentro al vado, dando acido 2-(4-acetamidofenil)-2- 10 etoxiacetico (14 g) en forma de un solido amarillo.

Etapa 3

Se calento acido 2-(4-acetamidofenil)-2-etoxiacetico (7,54 g, 31,8 mmol) con monohidrato de hidrazina (40 ml)

durante 16 horas, se enfrio la mezcla y despues se concentro al vado. Se purifico el aceite residual mediante

cromatograffa en columna de silice (eluyente de metanol al 20-40 % en CH2Ch), dando acido (±)-2-etoxi-2-(4'- 15 aminofenil)-acetico (2,3 g, 37 %) en forma de una espuma blanca.

RMN de 1H (8, 250 MHz, CD3OD): 1,18 (3H, t, 7,0 Hz), 4,42 (1H, c, 7,3, 2,4 Hz), 4,56 (2H, s), 5,50 (1H, c, 7,0; 2,1

Hz), 6,66 (2H, d, 8,7 Hz), 7,20 (2H, d, 8,5 Hz).

Ejemplo 5

Procedimiento de preparacion de acido (±)-2-metoxi-3-(4'-ammofenN)-propi6mco (Compuesto 34)

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Etapa 1

Se mezclaron 4-nitro-benzaldehndo (53,7 g, 0,356 mol), /V-acetilglicina (49,9 g, 0,427 mol) y acetato de sodio (37,9 g, 0,463 mol) con anhfdrido acetico (168 g, 1,78 mol) y se calento la mezcla resultante con agitacion a 120 °C durante 6

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horas, dando una suspension de color oscuro. Despues, se enfrio la mezcla hasta la T.A. durante una noche, dando como resultado la formacion de un solido precipitado. Se vertio la mezcla de reaccion en agua con hielo (150 g) y se recogio el solido suspendido resultante por filtracion. Se lavo el producto solido en bruto con acetona (100 ml), despues se recristalizo en acetona caliente (650 ml), dando un solido cristalino que se lavo con etanol acuoso al 50 %, que despues se seco al vado, dando 2-metil-4-(4-nitrobenciliden)oxazol-5(4H)-ona (55,0 g, 66 %) en forma de agujas de color amarillo palido. Se combinaron los licores madre de cristalizacion y los lavados, y se evaporaron, dando un residuo solido que se recristalizo en acetona, dando una segunda cosecha de 2-metil-4-(4- nitrobenciliden)oxazol-5(4H)-ona (8 g, 10 %). El rendimiento combinado de 2-metil-4-(4-nitrobenciliden)oxazol-5(4H)- ona fue de 63 g (76 %).

RMN de 1H (8, 250 MHz, CDCla) = 2,47 (3H, s), 7,14 (1H, s), 8,28 (4H, m).

Etapa 2

Se mezclo 2-metil-4-(4-nitrobenciliden)oxazol-5(4H)-ona (63,0 g, 0,272 mol) con acido clorlmdrico 3 M (1,2 l) y se agito la suspension a 100 °C durante 6 h. Se agito la suspension resultante a T.A. durante una noche y despues se recogio el solido suspendido por filtracion, se lavo con agua (2 x 50 ml), y despues se seco al vado, dando acido 2- hidroxi-3-(4-nitrofenil)acnlico (46,6 g, 81 %). Se extrajeron el filtrado combinado y los lavados con acetato de etilo (4 x 0,5 l), despues se secaron los extractos organicos combinados sobre sulfato de sodio y se concentraron hasta la sequedad, dando una cosecha adicional de acido 2-hidroxi-3-(4-nitrofenil)acnlico (0,8 g, 1 %). El rendimiento total del acido 2-hidroxi-3-(4-nitrofenil)acnlico fue de 47,4 g (82 %).

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6) = 6,52 (1H, s), 8,01 (2H, d, 8,5 Hz), 8,22 (2H, d, 8,5 Hz).

Etapa 3

Se agito una mezcla de acido 2-hidroxi-3-(4-nitrofenil)acnlico (15 g, 71,7 mmol), carbonato de cesio (56 g, 172,1 mmol) y sulfato de dimetilo (14,2 ml, 150,6 mmol) en DMF (270 ml) a T.A. durante 18 horas. Se anadieron agua (220 ml) y acetato de etilo (150 ml), y se separaron las capas. Se extrajo ademas la capa acuosa con acetato de etilo (4 x 100 ml) y luego se lavaron los organicos combinados con agua (6 x 100 ml), salmuera (2 x 120 ml) y se concentraron hasta la mitad del volumen. Se anadio heptano (70 ml) y se concentro la mezcla hasta 200 ml de volumen. Se recogio el solido precipitado resultante por filtracion, se lavo con heptano (2 x 100 ml) y se seco por succion sobre el filtro, dando 2-metoxi-3-(4-nitrofenil)acrilato de metilo en forma de un solido de color tostado (9,2 g, rendimiento del 54 %) que contema una traza de heptano.

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6): 3,82 (s, 3-H, OMe), 3,84 (s, 3-H, OMe), 7,02 (s, 1-H, CH=), 8,04 (d, 2-H, CH aromatico), 8,26 (d, 2-H, CH aromatico).

Etapa 4

Se disolvio 2-metoxi-3-(4-nitrofenil)acrilato de metilo (7,8 g, 32,8 mmol) en IMS (156 ml). Se anadio una solucion de NaOH (1,44 g, 36,1 mmol) en agua (78 ml) y se agito la mezcla a temperatura ambiente (18 °C) durante 18 horas. Se acidifico la mezcla de reaccion con HCl 1 M (120 ml) y se recogio el solido precipitado resultante por filtracion, se lavo con agua (2 x 100 ml) y se seco parcialmente mediante succion sobre el filtro durante 30 minutos, seguido del secado en horno al vado a 18 °C durante 18 horas. Por lo tanto se proporciono 2-metoxi-3-(4-nitrofenil)acnlico en forma de un solido de color tostado que contema un poco de agua de cristalizacion (6,7 g, 91 %).

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6): 3,83 (s, 3-H, OMe), 6,97 (s, 1-H, CH=), 8,02 (d, 2-H, CH aromatico), 8,25 (d, 2- H, CH aromatico).

Etapa 5

Se recogio acido 2-metoxi-3-(4-nitrofenil)acnlico (6,7 g, 30 mmol) en metanol (700 ml) y THF (300 ml), y se anadio Pd sobre C al 10 % (base humeda) (0,67 g). Se hidrogeno la mezcla a 310,26 kPa durante 43 min, seguido de recargas repetidas a 310,26-330,94 kPa por hora durante 3 horas y, finalmente, a 330,94 kPa durante 18 horas. Se filtro la suspension resultante a traves de papel filtrante GF/F y se lavo el residuo de filtracion con MeOH (200 ml). Se concentraron los filtrados, dando un solido de color blanquecino. Se suspendio el solido en IMS (75 ml) a 20 °C durante 1,5 horas, se filtro y se lavo con IMS/heptano (1:2) (20 ml) y se seco en el filtro durante 1 hora, proporcionando acido (±)-2-metoxi-3-(4'-amino-fenil)-propionico en forma de un solido de color blanquecino (5,1 g, rendimiento del 88 %).

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6): 2,74 (m, 2-H), 3,23 (s, 3-H, CH3), 3,80 (dd, 1-H, CH); 6,47 (d, 2-H, aromatico), 6,87 (d, 2-H, aromatico).

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Como en el Compuesto 20.

Etapa 3

Se anadio sulfato de dimetilo (13,23 g, 105 mmol) a una mezcla agitada de acido 2-hidroxi-3-(3-nitrofenil)acnlico (10,5 g, 50,0 mmol) y carbonato de cesio (39,1 g, 120 mmol) en DMF (105 ml) para formar una mezcla de color amarillo palido transparente, que se agito a T.A. durante una noche. Se concentro la suspension de color rojo oscuro resultante al vado y se repartio el residuo entre agua (100 ml) y diclorometano (150 ml). Se separo la capa organica, se lavo despues con agua (2 x 100 ml), se seco sobre sulfato de sodio y se filtro a traves de gel de sflice. Se evaporo la solucion amarilla resultante hasta la sequedad al vado, dando clorhidrato de 2-metoxi-3-(3- nitrofenil)acrilato en forma de un solido amarillo (8,1 g, 67 %). RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6) = 3,81 (3H, s), 3,83 (3H, s), 7,08 (1H, s), 7,71 (1H, dd, 7,9 y 8,2 Hz), 8,10-8,22 (2H, m), 8,66 (1H, s).

Etapa 4

Se anadio una solucion de hidroxido de potasio (2,0 g, 35,9 mol) en agua (25 ml) a una solucion agitada de 2- metoxi-3-(3-nitrofenil)acrilato de metilo (8,1 g, 34,2 mmol) en metanol (150 ml) y se agito la mezcla resultante a T.A. durante la noche. Se anadio una cantidad adicional de KOH (0,5 g, 8,9 mmol) en agua (10 ml) y se calento la mezcla hasta 80 °C durante 1 hora. Despues, se evaporo el metanol al vado y se diluyo el residuo con agua (200 ml). Se lavo la solucion con diclorometano (2 x 100 ml), se filtro a traves de un lecho corto de celita y despues se acidifico mediante la adicion de HCl 3 M a pH 3. Se refrigero la mezcla durante 18 h y despues se recogio el solido precipitado por filtracion, se lavo con agua (3 x 30 ml) y se seco al vado a 40 °C, dando acido 2-metoxi-3-(3- nitrofenil)acnlico en forma de un solido de color amarillo (6,4 g, 84 %).

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6) = 3,82 (3H, s), 7,02 (1H, s), 7,70 (1H, t, 7,93 Hz), 8,10-8,22 (2H, m), 8,65 (1H, s).

Etapa 5

Se hidrogeno una mezcla de acido 2-metoxi-3-(3-nitrofenil)acnlico (3,4 g, 15,25 mmol), metanol (340 ml) y paladio sobre carbon vegetal activado al 5 % (1,36 g, 4 % molar) en una atmosfera de H2 de 82,74-248,21 kPa durante 1,5 h. Despues, se filtro la mezcla a traves de celita, se lavo la torta de filtro con metanol y se concentraron los filtrados a 40 °C bajo un alto vado, dando el producto en forma de un solido espumoso. Se disolvio este en agua (100 ml) y se liofilizo la solucion, dando acido (±)-2-metoxi-3-(3'-aminofenil)-propionico (2,6 g, 100 %) en forma de un solido blanquecino.

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6) = 2,68 (1H, dd, 13,9 y 8 Hz), 2,80 (1H, dd, 13,9 y 4,6 Hz), 3,21 (3H, s), 3,84 (1H, dd, 8,25 y 4,6 Hz), 6,36-6,44 (3H, m), 6,91 (1H, dd, 7,6 Hz).

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Procedimiento de preparacion de acido (±)-2-etoxi-3-(4'-aminofenil)-propionico (Compuesto 39). Resolucion enantiomerica (Figure 12)

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Como para el compuesto 34, etapas 1 y 2.

Etapa 3

Se suspendio acido 2-hidroxi-3-(4-nitrofenil)acnlico (20 g, 95,6 mmol) en DMF (200 ml). Se anadieron CS2CO3 (74,9 g, 229,9 mmol) y sulfato de dietilo (26,3 ml, 201 mmol), y se observo la disolucion. Despues de agitar durante 18 horas a 18 °C, se anadieron agua (350 ml) y acetato de etilo (250 ml), y se separaron las capas. Se extrajo ademas la capa acuosa con acetato de etilo (5 x 200 ml) y luego se lavaron los organicos combinados con agua (2 x 200 ml) y salmuera (2 x 200 ml), y se secaron sobre sulfato de magnesio. Se concentraron los compuestos organicos hasta la sequedad, obteniendose acetato de 2-etoxi-3-(4-nitrofenil)-acrilato en forma de un solido de color naranja que contema 3,6 % en masa de DMF (27,6 g humedo, rendimiento de >100 %). RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-da): 1,32 (t, 6-H, 2 x CH2CH3), 4,13 (c, 2-H, CH2CH3), 4,30 (c, 2-H, CH2CH3), 6,99 (s, 1-H, CH=), 8,06 (d, 2-H, CH aromatico), 8,26 (d, 2-H, CH aromatico).

Etapa 4

Se disolvio 2-etoxi-3-(4-nitrofenil)acrilato de etilo que contema 3,6 % en peso de DMF (26,07 g corregidos, 98,3 mmol) en IMS (500 ml), y se anadio una solucion de NaOH (1,44 g, 36,1 mmol) en agua (260 ml). Se agito la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 18 horas, y luego se acidifico con HCl 1 M (120 ml) y se recogio el solido resultante por filtracion, se lavo con agua (2 x 100 ml) y seco por succion sobre el filtro durante 30 minutos, seguido de un secado en horno al vado a 18 °C durante 18 horas. De ese modo, se obtuvo acido 2-etoxi-3-(4- nitrofenil)acnlico en forma de un solido de color naranja que contema agua de cristalizacion (18,4 g, 79 %).

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6): 1,31 (t, 3-H, Me), 4,11 (c, 2-H, CH2), 6,98 (s, 1-H, CH=), 8,05 (d, 2-H, CH aromatico), 8,25 (d, 2-H, CH aromatico).

Etapa 5

Se disolvio acido 2-etoxi-3-(4-nitrofenil)acnlico (18,4 g humedo, aprox. 77,5 mmol) en MeOH (1,1 l) y se anadio Pd sobre C al 10 % (base humeda) (1,84 g). Se hidrogeno la mezcla a 82,74 kPa durante 10 minutos, seguido de una recarga repetida a 137,89-193,05 kPa cada 10-20 minutos durante 5 h, y luego a 317,16 kPa durante 18 horas. Se filtro la mezcla a traves de papel GF/F y se suspendio el residuo en iMs (100 ml), se filtro, se lavo con heptano (100 ml) y se seco por succion sobre el filtro. Por lo tanto, se obtuvo acido (+)-2-metoxi 3-(4'-aminofenil)-propionico en forma de un solido de color blanco (11,2 g, 69 %).

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6): 1,03 (t, 3-H, CH3), 2,73 (m, 2H), 3,29 (m, 1H), 3,46 (m, 1H), 3,80 (dd, 1H), 6,50 (d, 2-H), 6,87 (d, 2-H).

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Como para el compuesto 20, etapas 1 y 2.

Etapa 3

Se anadio sulfato de dietilo (12 g, 78,2 mmol) a una mezcla agitada de acido 2-hidroxi-3-(3-nitrofenil)acnlico (6,1 g, 30,0 mmol) y carbonato de cesio (29,3 g, 90 mmol) en DMF (61 ml) para formar una mezcla de color amarillo palido transparente, que se agito a T.A. durante una noche. Se calento la suspension de color rojo oscuro resultante hasta 50°C durante 4 h, luego se concentro al vado y se repartio el residuo entre agua (100 ml) y diclorometano (150 ml). Se separo la capa organica, se lavo despues con agua (2 x 100 ml), se seco sobre sulfato de sodio y se filtro a traves de un lecho corto gel de sflice. Se evaporo la solucion amarilla resultante hasta la sequedad al vado, dando

2- etoxi-3-(3-nitrofenil)acrilato de etilo en forma de un solido amarillo (5,6 g, 72 %).

Etapa 4

Se anadio una solucion de hidroxido de potasio (1,3 g, 22,2 mol) en agua (20 ml) a una solucion agitada de 2-etoxi-

3- (3-nitrofenil)acrilato de etilo (5,6 g, 21,1 mmol) en metanol (100 ml) y se calento la mezcla resultante a reflujo durante una noche. Despues, se evaporo el metanol al vado y se diluyo el residuo con agua (150 ml). Se lavo la solucion con diclorometano (2 x 80 ml), se filtro a traves de un lecho corto de celita y despues se acidifico mediante la adicion de HCl 3 M a pH 3. Se refrigero la mezcla durante 18 h y despues se recogio el solido precipitado por filtracion, se lavo con agua (3 x 30 ml) y se seco al vado a 40 °C. Se recristalizo el solido resultante en acetato de etilo y heptano, dando acido 2-etoxi-3-(3-nitrofenil)acnlico en forma de un solido amarillo (3,06 g, 61 %).

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6) = 1,34 (3H, t, 7Hz), 4,10 (2H, c, 7Hz), 7,04 (1H, s), 7,69 (1H, t, 7,93Hz), 8,078,22 (2H, m), 8,80 (1H, m), 13,25 (1H, s ancho).

Etapa 5

Se hidrogeno una mezcla de acido 2-etoxi-3-(3-nitrofenil)acnlico (3,06 g, 12,9 mmol), metanol (150 ml) y paladio sobre carbon vegetal activado al 5 % (0,60 g, 2 % molar) en una atmosfera de H2 de 82,74-206,84 kPa durante 2 h. Despues, se filtro la mezcla a traves de celita, se lavo la torta de filtro con metanol y se concentraron los filtrados a 40 °C bajo un alto vado, dando el producto en forma de un solido espumoso. Se disolvio este en agua (100 ml) y se liofilizo la solucion, dando acido (±)-2-etoxi-3-(3'-aminofenil)-propanoico (2,7 g, 100 %) en forma de un solido blanquecino.

RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-d6) = 1,07 (3H, t, 7 Hz), 2,6-2,85 (2H, m), 3,20-3,38 (1H, m), 3,40-3,60 (1H, m), 3,92 (1H, dd, 5 y 7,7 Hz), 6,3-6,45 (3H, m), 7,01 (1H, t, 7,6 Hz).

Ejemplo 9

Modelizacion molecular

Los estudios de modelizacion molecular se realizaron con el programa informatico SYBYL version 6.9.1 (Tripos Associates Inc., St Louis, MO) que se ejecuta en estaciones de trabajo Silicon Graphics. Se construyo el modelo

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tridimensional de la forma dipolar de 5-ASA a partir de una biblioteca de fragmentos estandar, y luego se optimizo su geometna con el campo de fuerza Tripos (3). Como todav^a se desconoce la pKa de los compuestos, se uso la calculadora en lmea SPARC para determinar las especies que se dan a pH fisiologico (7,4) (
http://ibmlc2.chem.uga.edu/sparc/index.cfm). Se construyo un modelo tridimensional de compuestos ionizados a partir de una biblioteca de fragmentos estandar, y se optimizo despues su geometna con el campo de fuerza Tripos (3) incluyendo el termino electrostatico calculado a partir de las cargas atomicas de Gasteiger y Huckel. Se uso el procedimiento de Powell disponible en el procedimiento Maximin2 para minimizar la energfa hasta que el valor del gradiente fue inferior a 0,001 kcal/mol.A.

Se obtuvo la estructura del dominio de union al ligando de PPARy humano a partir de su estructura cristalina por rayos X compleja con el tesaglitazar (AZ 242) disponible en el banco de datos de protemas RCSB (1.171) (4,5). Se realizo el acoplamiento flexible de los compuestos en el sitio activo del receptor con el programa informatico GOLD (6). Se seleccionaron los modelos de acoplamiento mas estables de acuerdo a la configuracion con mejor puntuacion predicha por las funciones de puntuacion GoldScore (6) y X-Score (7). Se minimizaron energeticamente los complejos usando el procedimiento Powell disponible en el procedimiento Maximin2 con el campo de fuerza Tripos y una constante dielectrica de 4,0 hasta que el valor del gradiente alcanzo 0,01 kcal/mol.A. Se uso la funcion de atemperado que define una region caliente (10 A) y una region interesante (15 A) en torno al ligando.

Resultados

Los estudios de acoplamiento de los receptores mediante modelizacion molecular predijeron que, en general, el enantiomero S es mas activo que el enantiomero R, a pesar de que el enantiomero R tambien muestra actividad. Este fenomeno de que un enantiomero sea mas biologicamente activo es bien conocido.

Por consiguiente, la presente invencion proporciona un procedimiento para resolver los compuestos en enantiomeros. El procedimiento de resolucion para el compuesto 32 se muestra esquematicamente en la Figura 11.

Aunque no se desee quedar vinculados a la teona, se cree que los enantiomeros S de los compuestos proporcionaran una mayor actividad. Los resultados de los estudios de acoplamiento se muestran en las Figuras 510.

Ejemplo 7

Procedimiento de preparacion de acido (±)-2-etoxi-3-(4'-ammofenM)-propi6mco (Compuesto 39). Resolucion enantiomerica (Figure 12)

imagen19

Como para el compuesto 34, etapas 1 y 2.

Etapa 3

Se suspendio acido 2-hidroxi-3-(4-nitrofenil)acnlico (20 g, 95,6 mmol) en DMF (200 ml). Se anadieron Cs2CO3 (74,9 g, 229,9 mmol) y sulfato de dietilo (26,3 ml, 201 mmol), y se observo la disolucion. Despues de agitar durante 18 horas a 18 °C, se anadieron agua (350 ml) y acetato de etilo (250 ml), y se separaron las capas. Se extrajo la capa acuosa despues con acetato de etilo (5 x 200 ml) y luego se lavaron los organicos combinados con agua (2 x 200 ml) y salmuera (2 x 200 ml), y se secaron sobre sulfato de magnesio. Se concentraron los compuestos

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organicos hasta la sequedad, obteniendose acetato de 2-etoxi-3-(4-nitrofenil)-acrilato en forma de un solido de color naranja que contema 3,6 % en masa de DMF (27,6 g humedo, rendimiento de >100 %). RMN de 1H (8, 250 MHz, DMSO-da): 1,32 (t, 6-H, 2 x CH2CH3), 4,13 (c, 2-H, CH2CH3), 4,30 (c, 2-H, CH2CH3), 6,99 (s, 1-H, CH=), 8,06 (d, 2-H, CH aromatico), 8,26 (d, 2-H, CH aromatico).

Etapa 4

Se disolvio 2-etoxi-3-(-nitrofenil)acrilato de etilo que contema 3,6 % en peso de DMF (26,07g corregidos, 98,3 mmol) en IMS (500 ml) y se anadio una solucion de NaOH (1,44 g, 36,1 mmol) en agua (260 ml). Se agito la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 18 horas, y luego se acidifico con HCl 1 M (120 ml) y se recogio el solido resultante por filtracion, se lavo con agua (2 x 100 ml) y seco por succion sobre el filtro durante 30 minutos, seguido de.

Resultados

La activacion de PPARy produce una cascada de reacciones que conduce a una union a los elementos espedficos de la secuencia de ADN denominados elementos de respuesta de los proliferadores de peroxisomas (PPRE) (7-9).

Se investigo la actividad transcripcional de PPARy mediante transfecciones transitorias de celulas epiteliales con la luciferasa Renilla y plamidos de PPRE. Para evaluar si las nuevas moleculas eran mas eficacia que 5-ASA en la estimulacion de la activacion de los PPARy, se probaron estas moleculas a una concentracion de 1 mM. Se comparo el efecto de las nuevas moleculas a una concentracion de 1 mM con 5-ASA y rosiglitazona, usados como controles positivos a concentraciones optimas de 30 mM y 10-5 M, respectivamente. Las celulas se estimularon con diferentes moleculas durante 24 horas.

El analisis de la actividad de PPARy en celulas HT-29 transfectadas mostro que las nuevas moleculas 34, 39, 35 y 40 a 1 mM aumentaron la actividad del gen indicador en 4,8 ± 0,71; 2,73 ± 0,31; 2,64 ± 0,46; 3,4 ± 0,97 veces, respectivamente, mostrando con ello una actividad similar o superior a 5-ASA a 30 mM (2,8 ± 0,7) y rosiglitazona a 10'5M (3,17 ± 0,29).

La Figura 2 representa todos los resultados obtenidos para cada molecula evaluada en 2 o 3 experimentos realizados por triplicado. La reproducibilidad entre los diferentes experimentos es buena y similar a los datos descritos en la bibliograffa.

Este estudio permitio a los inventores identificar 4 nuevas moleculas que eran de 30 a 50 veces mas eficaces que 5- ASA para activar los PPARy.

Ejemplo 11

Crecimiento de celulas cancerosas de colon

Se analizaron las siguientes sustancias (es decir, 20, 34, 35, 39 y 40) para determinar su capacidad para modular el crecimiento de celulas cancerosas de colon. Con este fin, se usaron tres lmeas celulares de carcinoma de colon humano (es decir, HT-29, HT-115 y DLD-1). Estos tipos de celulas se seleccionaron basandose en la expresion de la ciclooxigenasa-2 (COX-2). De hecho, las celulas hT-115 expresan COX-2 biologicamente activa, las celulas HT-29 expresan una isoforma de COX-2 no funcional y DLD-1 son celulas deficientes en COX-2. Se cree que estas moleculas tambien son activas en las celulas que no expresan la COX-2, y por lo tanto las moleculas de la presente invencion se pueden usar en las celulas que no expresan COX-2 con el fin de tratar tumores y otras aplicaciones segun lo descrito en la presente memoria.

Se cultivaron celulas HT-29 y DLD-1 en medios McCoy y RPM11640, respectivamente, suplementados con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, penicilina/estreptomicina (P/E) al 1 % y 50 mg/ml de gentamicina. Se cultivaron HT-115 en medio DMEM suplementado con FBS al 15 % y P/E al 1 %. Se mantuvieron las celulas en una incubadora humidificada a 37 °C, en presencia de CO2 al 5 %.

Para los ensayos de crecimiento celular, se sembraron suspensiones de celulas simples a 2 x 103 celulas/pocillo (4 x 103 celulas/pocillo para HT115) en placas de cultivo de 96 pocillos en medio que contema FBS al 0,5 %, y se permitio su adherencia. A continuacion, se eliminaron las celulas no adherentes, y se anadio medio recien preparado que contema FBS al 0,5 % en cada pocillo. Se cultivaron las celulas en presencia o ausencia de las sustancias especificadas. Se disolvio cada sustancia en forma de una solucion madre 25 mM en medio de cultivo que contema FBS al 0,5 %, y se ajusto el pH de cada solucion madre hasta 7,4, cuando fue necesario, con NaOH. Las sustancias se usaron a una concentracion final que variaba de 0,5 a 10 mM.

Se determino la proliferacion celular mediante la medicion de la incorporacion de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) en el ADN usando un kit de proliferacion celular disponible en el mercado (Roche Diagnostics, Monza, Italia). Se anadio BrdU a los cultivos celulares durante las ultimas 6 horas de incubacion, y se evaluo el nivel de celulas positivas en BrdU tras 48 h de cultivo mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La densidad optica (DO) se determino a 450 nm usando un lector de ELISA. Los experimentos se realizaron por triplicado, y los resultados se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

presentan como la media ± la desviacion estandar (DE).

Resultados

Los compuestos difirieron en su capacidad para inhibir el crecimiento de celulas cancerosas de colon. Los resultados se resumen en la Tabla 1, en la que se muestra el porcentaje de inhibicion del crecimiento de celulas DLD-1 por los compuestos especificados. La sustancia 20 presenta un notable efecto antiproliferativo de una manera dependiente de la dosis en cada una de las tres lmeas celulares analizadas (Figuras 3 y 4). Cuando se usaron los compuestos a una concentracion final de 10 mM, se observo una inhibicion del crecimiento celular de mas del 90 %. La capacidad del compuesto 20 para inhibir significativamente el crecimiento celular se observo al usarlo a una concentracion final de 5 o 10 mM.

Los compuestos 34 y 39 redujeron ligeramente el crecimiento celular cuando se usaron a dosis altas (10 mM) (Figura 4), pero las diferencias entre los grupos no fueron estadfsticamente significativas. Del mismo modo, no se observo ninguna inhibicion del crecimiento celular en los cultivos a los que se anadieron las sustancias 35 y 40 (vease la Tabla 1).

Conclusiones

Este primer conjunto de ejemplos de la invencion (Ejemplo 10) muestra la capacidad de cuatro moleculas optimizadas 34, 39, 35 y 40 a una concentracion de 1 mM para aumentar la actividad de PPARy en las celulas HT-29 transfectadas, mostrando una actividad similar o superior a 5-ASA a 30 mM y rosiglitazona a 10"5M.

Los ejemplos del segundo conjunto de la invencion (Ejemplo 11) muestran que los compuestos afectan a la inhibicion del crecimiento de las lmeas celulares de cancer de colon, HT-29, HT-115 y DLD1 en diversos grados. Los compuestos difirieron en su capacidad para inhibir el crecimiento celular del cancer de colon. La sustancia 20 muestra un notable efecto antiproliferativo en las lmeas celulares analizadas.

Estas moleculas de la presente invencion tambien son activas en las celulas que no expresan COX-2, y por lo tanto las moleculas de la presente invencion se pueden usar en las celulas que no expresan COX-2 con el fin de tratar los tumores y otras aplicaciones segun lo descrito en la presente memoria.

Conclusiones generales

Todos los compuestos sintetizados de mas alto rango, indicados a partir de estudios de modelizacion, muestran una actividad similar/superior a la de la mesalazina.

Referencias

1. Dubuquoy, L., E. A. Jansson, S. Deeb, S. Rakotobe, M. Karoui, J. F. Colombel, J. Auwerx, S. Pettersson y P. Desreumaux. 2003, “Impaired expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma in ulcerative colitis”. Gastroenterology 124:1265-1276.

2. Rousseaux C., Lefebvre B., Dubuquoy L., Lefebvre P., Romano O., Auwerx J., Metzger D., Wahli W., Desvergne B., Naccari G. C., Chavatte P., Farce A., Bulois P., Cortot A., Colombel J. F., Desreumaux P., “Intestinal anti-inflammatory effect of 5-amino salicylic acid is dependent on PPARy”. J Exp Med 2005; 201: 1205-15.

3. Clark, M. C. R. D. I. V. O., N. 1989, “Validation of the General Purpose Tripos 5.2 Field”. J. Comput Chem. 10:982-1012.

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5. Jones, G., P. Willett, R. C. Glen, A. R. Leach y R. Taylor. 1997, “Development and validation of a genetic algorithm for flexible docking”. J Mol Biol 267:727-748.

6. Wang, R., L. Lai, y S. Wang. 2002, “Further development and validation of empirical scoring functions for structure-based binding affinity prediction”. J Comput Aided Mol Des 16:19-26.

7. Westin, S., R. Kurokawa, R. T. Nolte, G. B. Wisely, E. M. Mclnerney, D. W. Rose, M. V. Milburn, M. G. Rosenfeld y C. K. Glass. 1998, “Interactions controlling the assembly of nuclear-receptor heterodimers and coactivators”. Nature 395:199-202.

8. Mangelsdorf, D. J., C. Thummel, M. Beato, P. Herrlich, G. Schutz, K. Umesono, B. Blumberg, P. Kastner, M. Mark, P. Chambon et al., 1995, “The nuclear receptor superfamily: the second decade”. Cell 83:835-839.

9. Misra, P., E. D. Owuor, W. Li, S. Yu, C. Qi, K. Meyer, Y. J. Zhu, M. S. Rao, A. N. Kong y J. K. Reddy. 2002, “Phosphorylation of transcriptional coactivator peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-binding protein (PBP). Stimulation of transcriptional regulation by mitogen-activated protein kinase”. J Biol Chem 277:4874548754, Epub 42002 Sep 48727.

TABLA 1: % de inhibicion de celula DLD-1 por dosis graduadas (0,5-10 mM) de los compuestos especificados

% de inhibicion del crecimiento

mM: 0,5 1 2,5 5 10

2-20: 4,3 12,8 16,2 25,6 47

2-34: 0 3,6 1,8 15,1

2-35: 0 3,2 1,6 6,4 4,8

2-39: 1,6 3,3 8,2 11,5 12,8

2-40: 2 0 0 0 2,7

Claims

5

10

15

20

25

REIVINDICACIONES

1. Compuesto y sales del mismo, seleccionado del grupo que consiste en:

imagen1

imagen2
2. El compuesto de la reivindicacion 1 en forma R o S enantiomericamente pura.
3. Compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

acido (±)-2-hidroxi-3-(3'-aminofenil)propionico (compuesto 20) acido (±)-2-metoxi-2-(4'-aminofenil)acetico (compuesto 23) acido (±)-2-etoxi-2-(3'-aminofenil)acetico (compuesto 32) acido (±)-2-etoxi-2-(4'-aminofenil)acetico (compuesto 33) acido (±)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil)propionico (compuesto 34) acido (±)-2-etoxi-3-(4'-aminofenil)propionico (compuesto 39) y

acido (±)-2-etoxi-3-(3'-aminofenil)propionico (compuesto 40) para su uso en el campo de la medicina.
4. Compuesto de acido 2-metoxi-3-(3'-aminofenil)propionico o acido (±)-2-hidroxi-3-(4-aminofenil)propionico (compuesto 21) para su uso en el campo de la medicina.
5. Compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 3 o la reivindicacion 4, en el que el campo de la medicina es el tratamiento de una enfermedad inflamatoria cronica o un tumor que expresa PPAR y EGF.
6. Compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que los tumores estan seleccionados del grupo que consiste en tumores de esofago, estomago, pancreas, colon, prostata, mama, utero y sus apendices, rinon y pulmon.
7. Compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el compuesto es acido (±)-2-metoxi-3-(4'- aminofenil)propionico (compuesto 34) o acido (±)-2-etoxi-3-(4'-aminofenil)propionico (compuesto 39).
8. Compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la enfermedad inflamatoria cronica es la enfermedad de Crohn o la rectocolitis ulcerosa.
9. Compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que el compuesto es:

acido (±)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil)propionico (compuesto 34) acido (±)-2-etoxi-3-(4'-aminofenil)propionico (compuesto 39) o acido (±)-2-etoxi-3-(3'-aminofenil)propionico (compuesto 40).
10. Compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que el uso del compuesto es en una mezcla en la que un enantiomero esta en exceso con respecto al otro, en cualquier proporcion.
11. Composicion farmaceutica que comprende uno o mas compuestos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, 5 como principios activos, en combinacion con uno o mas excipientes o adyuvantes farmaceuticamente aceptables.