BRPI0613396B1 - Composto, uso do mesmo, e, composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

COMPOSTO, USO DO MESMO, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A invenção refere- se a um composto da fórmula geral (I), em que R1 e R2, que podem ser iguais ou diferentes, são selecionados do grupo que compreende H, ou um grupo alquil linear ou ramificado tendo de 1 a 6 átomos de carbono, ou juntos formam um anel aromático ou alifático com 5 ou 6 átomos; Y e Z, que podem ser iguais ou diferentes, são selecionados do grupo que compreende: -H, -OH, -COOH, -OR3, - CH(OR3) COOH, em que R3 é selecionado dentre H, fenil, benzil, -CF3 ou -CF2 CF3, vinil, alil e um grupo linear ou ramificado tendo de 1 a 6 átomos de carbono.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a compostos e a seus sais específicos para os receptores de PPAR e aos receptores de EGF e ao seu uso no campo médico.

OBJETO DA INVENÇÃO

[002] Em particular, os compostos e seus sais de acordo com a presente invenção podem ser usados vantajosamente para a prevenção e para o tratamento de tumores que expressam os receptores de PPARy (Receptores Ativados por Proliferador de Peroxisoma) e os receptores de EGF (receptores de Fator de Crescimento Epidermal) tais como tumores do: esôfago, estômago, pâncreas, cólon, próstata, seio, útero e anexos, rins e pulmões. Além disso, os compostos e seus sais de acordo com a presente invenção podem ser usados para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas, particularmente doenças intestinais crônicas, tais como doença de Chron e rectocolite ulcerativa.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Os receptores de PPARy são receptores nucleares (grupo de cerca de 50 fatores de transcrição) que controlam a expressão de muitos genes que são importantes para a regulação de metabolismo de lipídeos, a síntese de insulina e os processos de carcinogênese e inflamação (Buli AW, Arch Pathol Lab Med 2003;127: 1121-1123) (Koeffler HP, Clin Cancer Res 2003; 9: 1-9) (Youssef J et al., J Biomed Biotec 2004; 3: 156-166).

[004] Há vários agonistas naturais e sintéticos que se ligam aos receptores de PPARY e alteram sua conformação, fazendo surgir a ativação. Os ligandos naturais e sintéticos são descritos em The Lancet 2002; 360:1410-1418.

[005] Estudos recentes mostraram que o tratamento de células com tumor com ligandos dos receptores de PPARY induz uma diminuição na proliferação celular, na diferenciação celular e na apoptose, sugerindo uma aplicação potencial de tais compostos como agentes para a prevenção de carcinogênese (Osawa E et al., Gastroenterology 2003; 124:361-367).

[006] Outros estudos mostraram que ligandos dos receptores de PPARY (e.g., troglitazona) têm efeitos antiinflamatórios e inibem a resposta inflamatória mucosal em modelos animais de IBD (Tanaka T et aí., Cancer Res 2001; 61: 2424-2428).

[007] Além disso, evidência foi publicada muito recentemente de que a atividade antiinflamatória intestinal de 5-ASA, o padrão de ouro no tratamento de IBD, é dependente da ligação, e conseqüente ativação, dos receptores de PPARY (Rousseaux C et al., J Exp Med 2005; 201: 1205-1215).

[008] O receptor de transmembrana com atividade de tirosina- quinase EGF é expressado em um grau muito alto na forma ativada em vários tipos de neoplasmas (Mendelsohn J, Endocr Relat Cancer 2001; 8: 3-9) (Harari PM, Endocr Relat Cancer 2004; 11: 689-708).

[009] A sobre-expressão do receptor é também relacionada com a capacidade potencial de células carcinomatosas para metástase. Em conexão com isto, foi demonstrado que EGF promove a migração e a invasividade de vários tipos de células conectados com lesões no nível de interações com a matriz extracelular (Brunton et al., Oncogene 1997; 14: 283-293).

[0010] Vários estudos realizados em animais experimentais e em homens têm estabelecido a eficácia de inibidores do receptor de EGF no controle da proliferação e no espalhamento de tumores (Mendelsohn J, Endocr Relat Cancer 2001; 8: 3-9) (Harari PM, Endocr Relat Cancer 2004; 11: 689-708).

[0011] Não há dúvidas de que os sinais intracelulares acionados pela ativação do receptor de EGF facilitam o crescimento e a sobrevivência de células neoplásticas, contribuindo para o desenvolvimento da patologia, e que tais sinais são essenciais na determinação da capacidade de células com tumor de se espalhar e colonizar órgãos remotos (Mendelsohn J, Endocr Relat Cancer 2001; 8: 3-9) (Kari C et al., Cancer Res 2003; 63: 1-5).

[0012] Do exposto acima e tendo em mente, além disso, que do ponto de vista biológico, processos de inflamação crônicos exercem uma parte na carcinogênese, se torna claro que há uma necessidade real por uma pesquisa inovadora em novas entidades químicas que, por sua ação complementar nos receptores de PPARY e nos receptores de EGF, são capazes de exercer uma ação antiinflamatória e anti-tumor, do tipo quimio-preventivo, anti- proliferativo e anti-metastático.

[0013] A presente invenção fornece uma nova classe de compostos que são adequados para a prevenção e para o tratamento de câncer e de inflamação crônica pela modulação de receptores específicos, tais como receptores de PPARY e os receptores de EGF.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] A presente invenção se refere a novos usos médicos e terapêuticos da presente invenção de uma série de compostos, uma vez que qualquer destes compostos não é conhecido, a presente invenção também se refere a estes compostos.

[0015] A presente invenção se refere especificamente aos compostos da fórmula geral (I) em que R1 e R2, que podem ser iguais ou diferentes, são selecionados do grupo que compreende H ou um grupo alquil linear ou ramificado tendo de 1 a 6 átomos de carbono, ou juntos formam um anel aromático ou alifático com 5 ou 6 átomos; Y e Z, que podem ser iguais ou diferentes, são selecionados do grupo que compreende: - H, -OH, -COOH, -OR3, -CH(OR3)COOH, em que R3 é selecionado dentre H, fenil, benzil, -CF3 ou -CF2CF3, vinil, alil e um grupo linear ou ramificado tendo de 1 a 6 átomos de carbono.

[0016] A presente invenção também se refere ao subgrupo específico de compostos da fórmula geral (Ia) em que: R1 e R2, que podem ser iguais ou diferentes, são selecionados do grupo que compreende H, ou um grupo alquil linear ou ramificado tendo de 1 a 6 átomos de carbono Y e Z, que podem ser iguais ou diferentes, são selecionados do grupo que compreende: - H, -OH, -COOH, -OR3, -CH(OR3)COOH, em que R3 é selecionado dentre H e um grupo linear ou ramificado tendo de 1 a 6 átomos de carbono.

[0017] Em algumas formas de realização, Z e Y são diferentes. Em algumas formas de realização da presente invenção, pelo menos um dentre Y ou Z termina em -COOH. Portanto, em algumas formas de realização da presente invenção, Y ou Z (e em algumas formas de realização pelo menos um dentre Y ou Z, e, em algumas formas de realização, somente um dentre Y ou Z) é -COOH. Em algumas formas de realização da presente invenção, Y ou Z (e em algumas formas de realização pelo menos um dentre Y ou Z, e em algumas formas de realização, somente um dentre Y ou Z) é - CH(OR3)COOH.

[0018] A presente invenção também se refere a compostos citados nas fórmulas (I) e (Ia), exceto em que Y e Z, que podem ser iguais ou diferentes, são selecionados do grupo que consiste de -COOH, -OR3, -CH(OR3)COOH. Portanto, em algumas formas de realização da presente invenção, Z ou Y podem não ser -OH. Em tais formas de realização da presente invenção, os compostos 10 e 11 são excluídos.

[0019] Em algumas formas de realização da presente invenção, quando Y for -H e Z for -CH(OH)COOH, o grupo NR1R2 é conectado na posição 3'. Assim, em algumas formas de realização da presente invenção, o composto 21 é excluído.

[0020] Em outras formas de realização da presente invenção, quando Z for -OCH3 e Y for -COOH, o grupo NR1R2 é conectado na posição 4'. Assim, em algumas formas de realização da presente invenção, o composto 22 é excluído.

[0021] Em algumas formas de realização da presente invenção, quando Y for -H e Z for -CH(OR3)COOH, o grupo NR1R2 é conectado na posição 4'. Assim, em algumas formas de realização da presente invenção, o composto 35 é excluído.

[0022] Em particular, o grupo alquil linear ou ramificado mencionado acima tendo de 1 a 6 átomos de carbono pode ser selecionado dentre -CH3, - CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH2CH3, -CnH2-1.

[0023] Os compostos das Fórmulas (I) e (Ia) podem ser selecionados do grupo que compreende: ácido 3-(3'-aminofenil)2-hidroxipropanóico (composto 20) ácido 2-(4-aminofenil)2-metoxiacético (composto 23) ácido 2-(3-aminofenil)2-etoxiacético (composto 32) ácido 2-(4-aminofenil)2-etoxiacético (composto 33) ácido 3-(4'-aminofenil)2-metoxipropiônico (composto 34) ácido 3-(4'-aminofenil)2-etoxipropiônico (composto 39) ácido 3-(3'-aminofenil)2-etoxipropiônico (composto 40).

[0024] Os nomes dos compostos acima podem também ser escritos na nomenclatura química padrão a seguir (a qual nomenclatura vai ser usada no texto): ácido (±)-2-hidróxi-3-(3'-aminofenil) propiônico (composto 20) ácido (±)-2-metóxi-2-(4'-aminofenil) acético (composto 23) ácido (±)-2-etóxi-2-(3'-aminofenil) acético (composto 32) ácido (±)-2-etóxi-2-(4'-aminofenil) acético (composto 33) ácido (±)-2-metóxi-3-(4'-aminofenil) propiônico (composto 34) ácido (±)-2-etóxi-3-(4'-aminofenil) propiônico (composto 39) ácido (±)-2-etóxi-3-(3'-aminofenil) propiônico (composto 40).

[0025] Os compostos de acordo com a presente invenção podem ser usados vantajosamente no campo médico. Portanto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais compostos definidos acima como princípios ativos em combinação com um ou mais excipientes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

[0026] A presente invenção se refere, além disso, ao uso dos compostos definidos acima para a preparação de um produto medicinal para a prevenção e para o tratamento de tumores que expressam os receptores de PPARY e os receptores de EGF, tais como, por exemplo, tumor do esôfago, estômago, pâncreas, cólon, próstata, seio, útero e anexos, rins e dos pulmões.

[0027] Além disso, a presente invenção se refere ao uso dos compostos de acordo com a presente invenção para a preparação de um produto medicinal para o tratamento de doença inflamatória crônica, tais como doença de Crohn e rectolite ulcerativa.

[0028] Em particular, os compostos de acordo com a presente invenção que podem ser usados nas aplicações acima, além daqueles já descritos, podem ser como a seguir: ácido (R,S)-2-hidróxi-2-(3-aminofenil)acético (composto 10) ácido (R,S)-2-hidróxi-2-(4-aminofenil)acético (composto 11) ácido (R,S)-2-hidróxi-3-(4'-aminofenil)propiônico (composto 21) ácido (R,S)-2-metóxi-3-(3'-aminofenil)propiônico (composto 35) ácido (R,S)-2-metóxi-3-(3-aminofenil)propiônico (composto 34). Os nomes de compostos acima também podem ser escritos na nomenclatura química padrão a seguir (a qual vai ser usada no texto): ácido (±)-2-hidróxi-2-(3'-aminofenil)acético (composto 10) ácido (±)-2-hidróxi-2-(4'-aminofenil)acético (composto 11) ácido (±)-2-hidróxi-3-(4'-aminofenil)propiônico (composto 21) ácido (±)-2-metóxi-3-(3'-aminofenil)propiônico (composto 35) ácido (±)-2-metóxi-3-(4'-aminofenil)propiônico (composto 34).

[0029] De acordo com uma forma de realização, R3 dos compostos da fórmula (I) pode ser H de acordo com a seguinte fórmula (II) em que R1, R2, X e Y são definidos acima.

[0030] De acordo com outra forma de realização, R3 dos compostos da fórmula (I) pode ser -CH3 de acordo com a seguinte fórmula (III) em que R1, R2, X e Y são definidos acima.

[0031] De acordo com outra forma de realização, R3 dos compostos da fórmula (I) pode ser -CH2CH3 de acordo com a seguinte fórmula (IV) em que R1, R2, X e Y são definidos acima.

[0032] De acordo com outra forma de realização, R3 dos compostos da fórmula (I) pode ser -CH2CH3 de acordo com a seguinte fórmula (V) em que R1, R2, X e Y são definidos acima.

[0033] De acordo com outra forma de realização, R3 dos compostos da fórmula (I) pode ser -CH3 de acordo com a seguinte fórmula (VI) em que R1, R2, X e Y são definidos acima.

[0034] De acordo com outra forma de realização, R3 dos compostos da fórmula (I) pode ser -CH3 de acordo com a seguinte fórmula (VI) em que R1, R2, X e Y são definidos acima.

[0035] De acordo com outra forma de realização, R3 dos compostos da fórmula (I) pode ser -CH2CH3 de acordo com a seguinte fórmula (VII) em que R1, R2, X e Y são definidos acima.

[0036] De acordo com outra forma de realização, R3 dos compostos da fórmula (I) pode ser -CH2CH3 de acordo com a seguinte fórmula (VIII) em que R1, R2, X e Y são definidos acima.

[0037] De acordo com outra forma de realização, R3 dos compostos da fórmula (I) podem ser CH3 de acordo com a seguinte fórmula (IX) em que R1, R2, X e Y são definidos acima.

[0038] Preferivelmente, os compostos da fórmula (I) podem ser selecionados do grupo que compreende: ácido (±)-2-hidróxi-3-(3'-aminofenil) propiônico (composto 20) ácido (±)-2-metóxi-2-(4'-aminofenil) acético (composto 23) ácido (±)-2-etóxi-2-(3'-aminofenil) acético (composto 32) ácido (±)-2-etóxi-2-(4'-aminofenil) acético (composto 33) ácido (±)-2-metóxi-3-(4'-aminofenil) propiônico (composto 34) ácido (±)-2-etóxi-3-(4'-aminofenil) propiônico (composto 39) ácido (±)-2-etóxi-3-(3'-aminofenil) propiônico (composto 40).

[0039] Os compostos de acordo com a presente invenção podem ser usados vantajosamente no campo médico. Portanto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais compostos definidos acima como princípios ativos em combinação com um ou mais excipientes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

[0040] A presente invenção se refere, além disso, ao uso dos compostos definidos acima para a preparação de um produto medicinal para a prevenção e para o tratamento de tumores que expressam os receptores de PPARY e os receptores de EGF, tais como, por exemplo, tumor do esôfago, estômago, pâncreas, cólon, próstata, seio, útero e anexos, rins e dos pulmões.

[0041] Além disso, a presente invenção se refere ao uso dos compostos de acordo com a presente invenção para a preparação de um produto medicinal para o tratamento de doença inflamatória crônica, tais como doença de Crohn e rectolite ulcerativa. A presente invenção também se refere aos métodos de tratamento de humanos e/ou mamíferos (incluindo roedores, animais de fazenda, animais domésticos, ratos, camundongos, hamsters, coelhos, cães, gatos, porcos, ovelha, vacas, cavalos).

[0042] Em particular, os compostos de acordo com a presente invenção que podem ser usados nas aplicações mencionadas, além daqueles já descritos, podem ser os seguintes: ácido (±)-2-hidróxi-2-(3-aminofenil)acético (composto 10) ácido (±)-2-hidróxi-2-(4-aminofenil)acético (composto 11) ácido (±)-2-hidróxi-3-(4'-aminofenil)propiônico (composto 21) ácido (±)-2-metóxi-3-(3'-aminofenil)propiônico (composto 35) ácido (±)-2-metóxi-3-(4'-aminofenil)propiônico (composto 34)

[0043] Os usos dos compostos descritos não são restritos ao seu uso na forma racêmica. A presente invenção se estende ao uso de quaisquer compostos nas formas R ou S enantiomericamente puras, ou qualquer mistura na qual um enantiômero está em excesso do outro, em qualquer proporção.

[0044] De fato, os estudos de docking realizados indicam que o enantiômero S são mais ativos do que o enantiômero R, embora o enantiômero R puro mostre atividade.

[0045] As moléculas da presente invenção foram derivadas do trabalho de modelamento molecular usando mesalazina como uma base e todas as variações quimicamente viáveis foram avaliadas de forma a alcançar o melhor resultado (afinidade e ativação do receptor) em experimentos de docking de computador. Conseqüentemente, acredita-se que os compostos da presente invenção que mostram função e/ou atividade comparável à mesalazina o façam através de vias biológicas similares. Acredita-se que características similares à mesalazina inerentes nas moléculas da presente invenção confiram nas moléculas uma atividade similar em relação à via de EGF.

[0046] Os exemplos fornecidos aqui são modelos úteis para uso na previsão do uso dos compostos nos vários campos médicos já discutidos. Os modelos, portanto, fornecem resultados valiosos e significativos independentemente de seu mecanismo de ação.

[0047] Em adição aos compostos mencionados acima, a presente invenção fornece o uso dos seguintes compostos:

[0048] A presente invenção vai agora ser descrita para propósitos de ilustração, mas sem limitá-la, de acordo com suas formas de realização preferidas, com referência particular aos diagramas nos desenhos em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E TABELA

[0049] Tabela 1. Percentagens de inibição de célula DLD-1 por doses graduadas (0,5-10 mM) dos compostos especificados. As células foram cultivadas na presença ou na ausência dos compostos, e o crescimento das células foi então avaliado pelo ensaio colorimétrico (BrdU) após 48 horas de cultura.

[0050] A Figura 1 mostra as estruturas dos compostos 20, 23, 32, 33, 34, 35, 39 e 40.

[0051] Figura 2: Atividade de PPARY por tratamento com compostos.

[0052] Figuras 3-4: Efeito das substâncias especificadas na proliferação de linhagens de células de carcinoma de cólon humano (i.e., HT29, HT115 e DLD1). As células foram tratadas com concentrações crescentes de substâncias (0,5-10 mM) por 48 horas e a proliferação foi determinada pelo uso de um ensaio colorimétrico para a medição de incorporação de BrdU. A densidade óptica (OD) foi determinada a 450 nm usando uma leitora de ELISA. Os dados indicam a média ± SD de 3 experimentos separados.

[0053] Figura 5: Docking de (R) Composto 34 ao receptor de PPARY (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogênio são mostradas).

[0054] Figura 6: Docking de (S) Composto 34 ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogênio são mostradas).

[0055] Figura 7: Docking de (R) Composto 35 ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogênio são mostradas).

[0056] Figura 8: Docking de (S) Composto 35 ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogênio são mostradas).

[0057] Figura 9: Docking de (R) Composto 39 ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogênio são mostradas).

[0058] Figura 10: Docking de (S) Composto 39 ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogênio são mostradas).

[0059] Figura 11: Docking de mesalamina ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogênio são mostradas).

[0060] Figura 12: Síntese esquemática e Resolução subseqüente do Composto 39.

EXEMPLO 1

[0061] Método de Preparação de ácido (±)-2-hidróxi-3-(3'- aminofenil)-propanóico (Composto 20)

Etapa 1

[0062] 3-Nitrobenzaldeído (45,39, 0,3mol), N-acetilglicina (42,1 g, 0,36mol) e acetato de sódio (329, 0,39mol) foram misturados com anidrido acético (142 ml, 1,5mol) e a mistura resultante aquecida com agitação a 120°C por 6 horas, dando uma solução escura. A mistura foi então resfriada até a RT durante a noite, resultando na formação de um sólido precipitado. A mistura de reação foi despejada em água gelada (130 g) e o sólido suspenso resultante foi coletado por filtração. O produto sólido bruto (72 g) foi lavado com acetona (80 ml), depois recristalizado a partir de acetona quente (320 ml) para dar um sólido cristalino que foi lavado com 50% de etanol aquoso, então seco a 40°C/40 mmHg para dar 2-metil-4-(3-nitrobenzilideno)oxazol-5(4H)- ona (49,09, 78%) como agulhas amarelas pálidas. 1H RMN (δ, 250MHz, CDCl3) = 2,47 (3H, s), 7,15 (1 H, s), 7,63 (1 H, dd, 8,2 & 7,6Hz), 8,27 (1 H, d, 8,2Hz), 8,34 (1 H, d, 7,6Hz), 9,02 (1 H, s).

Etapa 2

[0063] 2-Metil-4-(3-nitrobenzilidene)oxazol-5(4H)-ona (52,0 g, 0,224 mol) foi misturado com ácido clorídrico 3M (1,3 l) e a suspensão agitada a 100°C por 6 h. A suspensão resultante foi agitada à RT durante a noite, depois o sólido suspenso foi coletado por filtração, lavado com água (2 x 40 ml), depois seco in vacuo para dar ácido 2-hidróxi-3-(3-nitrofenil)acrílico (29,3g). O filtrado combinado e as lavagens foram extraídos com acetato de etila (4 x 0,5 l), depois os extratos orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio e concentrados até a secura para dar um outro grupo de ácido 2-hidróxi- 3-(3-nitrofenil)acrílico (12,0g). A produção total de ácido 2-hidróxi-3-(3- nitrofenil)acrílico foi 41,3 g (88%).

[0064] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6): 6,56 (1 H, s), 7,64 (1 H, t, 8Hz), 8,0-8,1 (2H, m), 8,78 (1 H, s), 9,95 (1 H, brs), 12,80 (1 H, brs).

Etapa 3

[0065] Etóxido de sódio (1,8 g, 26,4 mmol) foi adicionado em porções a 0°C a uma solução agitada de ácido 2-hidróxi-3-(3- nitrofenil)acrílico (5,25 g, 25,0 mmol) em metanol (131 ml) para formar uma solução amarela pálida clara. Boroidreto de sódio (1 g, 26,4 mmol) foi então cuidadosamente adicionado em duas porções e a mistura agitada a 5-10°C por 30 min. Uma pequena quantidade de água foi então adicionada para extinguir a reação e destruir qualquer NaBH4 em excesso. O metanol foi removido in vacuo para dar um resíduo sólido, que foi moído com uma mistura 5:2 de acetato de etila e heptano (21 ml), depois outra moagem com 3% de metanol aquoso. O sólido resultante foi coletado por filtração e seco in vacuo para dar ácido 2-hidróxi-3-(3-nitrofenil)propiônico (3,0 g, 57%).

[0066] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6) = 2,97 (1 H, dd, 14 & 8,2Hz), 3.15 (1 H, dd, 14 & 4,2Hz), 4,23 (1 H, dd, 8,2 & 4,2Hz), 7,58 (1 H, t, 8Hz), 7,70 (1 H, d, 8Hz), 8,0-8,15 (2H, m).

Etapa 4

[0067] Uma mistura de ácido 2-hidróxi-3-(3-nitrofenil)propiônico (3,0 g, 14,2 mmol), metanol (129 ml) e 5% de paládio em carvão ativado (600 mg, 2% em moles) foi hidrogenada em 69 kPa em atmosfera de H2 por 1 h. A mistura foi então filtrada através de celite, a torta do filtro foi lavada com metanol e os filtrados concentrados a 40°C sob alto vácuo para dar o produto como um sólido espumoso. Este foi dissolvido em água e a solução seca por congelamento para dar ácido (±)-2-hidróxi-3-(3'-aminofenil)propiônico (2,6 g, 100%) como um sólido branco.

[0068] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6): 2,61 (1 H, dd, 13.6 & 8,3Hz), 2,81 (1 H, dd, 13.6 & 4,6Hz), 4,09 (1 H, dd, 8,25 & 4,6Hz), 6,35-6,43 (2H, m), 6,45 (1 H, d, 1 Hz), 6,90 (1 H, t, 30 7,6Hz).

EXEMPLO 2

[0069] Método de Preparação de ácido (±)-2-hidróxi-3-(4'- aminofenil)-acético (Composto 23)

Etapa 1

[0070] Uma solução de hidróxido de potássio (6,72 g, 0,12 mol) em metanol (25 ml) foi adicionada a uma solução resfriada (-7°C) de 4- acetamidobenzaldeído (24,59, 0,15mol) e clorofórmio (40,1g, 0,33mol) em DMF (100 ml) em uma taxa tal que mantenha a temperatura abaixo de -5°C. A mistura foi deixada aquecer até 2°C durante 5,5 h, então ela foi adicionada a uma mistura de HCl aq. 1M (200 ml) e tolueno (200 ml) e agitada durante a noite. O 2-(4-acetamidofenil)-triclorocarbinol resultante foi coletado por filtração (29 g) e seco por sucção.

Etapa 2

[0071] As soluções de 2-(4-acetamidofenil)-triclorocarbinol (14,0 g, 49,5 mmol) em metanol (330 ml) e hidróxido de potássio (13,8 g, 250 mmol) em metanol (150 ml) foram combinadas e a mistura aquecida até 70-80°C por 3 h. Após o resfriamento, o subproduto de KCl foi removido por filtração, depois a concentração do filtrado in vacuo deu ácido 2-(4-acetamidofenil)-2- metoxiacético (14g) como um sólido branco.

Etapa 3

[0072] O ácido 2-(4-acetamidofenil)-2-metoxiacético (7,1 g, 31,8 mmol) foi aquecido com hidrazina monoidratada (40 ml) por 16 h, resfriado e concentrado in vacuo. O óleo residual resultante foi purificado por cromatografia de coluna de sílica gel (eluente 20-40% de metanol em CH2Cl2) para dar 2,69 (45%) de ácido (±)-2-metóxi-2-(4'-aminofenil)-acético 1H RMN (δ, 250MHz, CD3OD): 3,27 (3H, s), 4,43 (1 H, s), 6,66 (2H, d, 8,5Hz), 7,18 (2H, d, 8,2Hz).

EXEMPLO 3

[0073] Método de Preparação de ácido (±)-2-hidróxi-3-(4'- aminofenil)-acético (Composto 23)

Etapa 1

[0074] 3-Nitrobenzaldeído (25g, 165 mmol) e clorofórmio (30 ml, 375 mmol) foram dissolvidos em DMF (100 ml) e a solução resfriada até entre -5°C e -10°C. Uma solução fresca de hidróxido de potássio (7,5 g, 134 mmol) em metanol (22,5 ml) foi adicionada vagarosamente de forma a manter a temperatura interna <-5°C. A reação foi mantida em <-5°C por 2 h e então extinta com uma mistura resfriada de ácido clorídrico aquoso (225 ml) em tolueno (225 ml). A solução foi deixada aquecer vagarosamente até a temperatura ambiente durante a noite em banho de gelo. Após este tempo, a camada de tolueno foi separada e a camada aquosa também extraída com tolueno. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (2 x 225 ml), solução 5% de bicarbonato de sódio (225 ml) e água (225 ml). A solução foi seca (MgSO4), filtrada, e concentrada in vacuo para dar 2-(3-nitrofenil)- triclorocarbinol como um sólido laranja (42 g, 155 mmol, 94%).

[0075] 1H RMN (δ, 250MHz, CDCl3): 3,7 (br. s, 1 H), 5,4 (s, 1 H), 7,6 (t, 1 H, 8,0Hz), 8,0 (d, 1 H, 8,0Hz), 8,3 (d, 1 H, 8,OHz), 8,5 (s, 1 H).

Etapa 2

[0076] 2-(3-Nitrofenil)-triclorocarbinol (20 g, 74 mmol) foi dissolvido em etanol absoluto (74 ml) e uma solução de hidróxido de potássio (20,7 g, 369 mmol) em etanol absoluto (150 ml) foi adicionado vagarosamente. A solução foi aquecida em refluxo por 4 h, deixada resfriar e então concentrada in vacuo. O resíduo foi acidificado com ácido clorídrico diluído e o produto extraído em acetato de etila (x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas (MgSO4), filtradas e concentradas in vacuo para dar ácido 2-etóxi-2-(3- nitrofenil)acético como um sólido marrom (6,4g, 28,4 mmol, 38%).

[0077] 1H RMN (δ, 250MHz, CD3OD): 1,0 (t, 3H, 7,0Hz), 3.6 (m, 1 H), 3.7 (m, 1 H), 5,1 (s, 1 H), 7,7 (t, 1 H, 7,8Hz), 7,9 (d, 1 H, 7,8Hz), 8,3 (d, 1 H, 7,8Hz), 8,4 (s, 1 H).

Etapa 3

[0078] Ácido 2-etóxi-2-(3-nitrofenil)acético (6,49, 28,4 mmol) foi dissolvido em etanol absoluto (500 ml1), 5% de paládio em carbono (úmido) (1,5g) adicionado e a mistura hidrogenada em 413 kPa durante a noite. A suspensão foi filtrada através de celite e o filtrado concentrado para dar ácido (±)-2-etóxi-2-(3'-aminofenil)acético (3,0 g, 15,3 mmol, 54%) como um sólido marrom.

[0079] 1H RMN (δ, 250MHz, CD3OD): 1,2 (t, 3 H, J = 6,9 Hz), 3.5 (m, 1 H), 3.6 (m, 1 H), 4,6 (s, 1 H), 6,7 (d, 1 H, J = 7,6 Hz), 6,9 (m, 2 H), 7,0 (t, 1 H, J = 7,6 Hz).

EXEMPLO 4

[0080] Método de Preparação de ácido (±)-2-etóxi-2-(4'-aminofenil)- acético (Composto 33)

Etapa 1

[0081] Ver "etapa 1 do composto 23"

Etapa 2

[0082] Soluções de 2-(4-acetamidofenil)-triclorocarbinol (14,0 g, 49,5 mmol) em etanol (400m1) e hidróxido de potássio (13,8g, 250 mmol) em etanol (150 ml) foram combinadas e a mistura aquecida a 70-80°C por 2,5 h. A mistura foi resfriada, filtrada para remover o subproduto de KCl, e concentrada in vacuo para dar ácido 2-(4-acetamidofenil)-2-etoxiacético (14 g) como um sólido amarelo.

Etapa 3

[0083] Ácido 2-(4-acetamidofenil)-2-etoxiacético (7,54 g, 31,8 mmol) foi aquecido com hidrazina monoidratada (40 ml) por 16 h, a mistura resfriada e depois concentrada in vacuo. O óleo residual foi então purificado por cromatografia em coluna de sílica (20-40% de metanol em eluente de CH2Cl2) para dar ácido (±)-2-etóxi-2-(4'-aminofenil)acético (2,3g, 37%) como uma espuma branca.

EXEMPLO 5

[0084] Método de Preparação de ácido (±)-2-metóxi-3-(4'- aminofenil)-propiônico (Composto 34)

Etapa 1

[0085] 4-Nitrobenzaldeído (53,79, 0,356mol), N-acetilglicina (49,99, 0,427mol) e acetato de sódio (37,99, 0,463mol) foram misturados com anidrido acético (168g, 1,78 mol) e a mistura resultante aquecida com agitação até 120°C por 6 h, dando uma suspensão escura. A mistura foi então resfriada até a RT durante a noite, resultando na formação de um sólido precipitado. A mistura de reação foi despejada em água gelada (150 g) e o sólido suspenso resultante foi coletado por filtração. O produto sólido bruto foi lavado com acetona (100 ml), depois recristalizado a partir de acetona quente (650 ml) para dar um sólido cristalino que foi lavado com 50% de etanol aquoso, então seco in vacuo para dar 2-metil-4-(4- nitrobenzilideno)oxazol-5(4H)-ona (55,08, 66%) como agulhas amarelas pálidas. Os licores mãe de cristalização e as lavagens foram combinados e evaporados para dar um resíduo sólido que foi recristalizado a partir de acetona para dar um segundo grupo de 2-metil-4(4-nitrobenzilideno)oxazol- 5(4H)-ona (8g, 10%). A produção combinada de 2-metil-4-(4- nitrobenzilideno)oxazol-5(4H)-ona foi 639 (76%)

[0086] 1H RMN (δ, 250MHz, CDCl3) = 2,47 (3H, s), 7,14 (1 H, s), 8,28 (4H, m).

Etapa 2

[0087] 2-Metil-4-(4-nitrobenzilidene)oxazol-5(4H)-ona (63,09, 0,272mol) foi misturada com ácido clorídrico 3M (1,2 l) e a suspensão foi agitada a 100°C por 6 h. A suspensão resultante foi agitada à RT durante a noite, depois o sólido suspenso foi coletado por filtração, lavado com água (2 x 50 ml), depois seco in vacuo para dar ácido 2-hidróxi-3-(4- nitrofenil)acrílico (46,69, 81 %). O filtrado e as lavagens combinados foram extraídos com acetato de etila (4 x 0,5 l), depois os extratos orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio e concentrados até a secura para conseguir um outro grupo de ácido 2-hidróxi-3-(4-nitrofenil)acrílico (0,8 g, 1%). A produção total de ácido 2-hidróxi-3-(4-nitrofenil)acrílico foi 47,4 g (82%).

[0088] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6) = 6,52 (1 H, s), 8,01 (2H, d, 8,5Hz), 8,22 (2H, d, 8,5Hz).

Etapa 3

[0089] Uma mistura de ácido 2-hidróxi-3-(4-nitrofenil)acrílico (15 g, 71,7 mmol), carbonato de césio (56 g, 172,1 mmol) e sulfato de dimetil (14,2 ml, 150,6 mmol) em DMF (270 ml) foi agitada à RT por 18 h. Água (220 ml) e acetato de etila (150 ml) foram adicionados e as camadas separadas. A camada aquosa foi também extraída com acetato de etila (4 x 100 ml), depois os orgânicos combinados foram lavados com água (6 x 100 ml), salmoura (2 x 120 ml) e concentrados até metade do volume. O heptano foi adicionado (70 ml) e a mistura concentrada até um volume de 200 ml. O sólido precipitado resultante foi coletado por filtração, lavado com heptano (2 x 100 ml) e seco por sucção no filtro para produzir 2-metóxi-3-(4-nitrofenil)acrilato de metil como um sólido queimado (9,2g, 54% de rendimento) contendo um traço de heptano.

[0090] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6): 3,82 (s, 3-H, OMe), 3,84 (s, 3-H, OMe), 7,02 (s, 1-H, CH=), 8,04 (d, 2-H, CHaromático), 8,26 (d, 2-H, CHaromático).

Etapa 4

[0091] 2-metóxi-3-(4-nitrofenil)acrilato de metil (7,8 g, 32,8 mmol) foi dissolvido em IMS (156 ml). Uma solução de NaOH (1,44 g, 36,1 mmol) em água (78 ml) foi adicionada e a mistura agitada à temperatura ambiente (18°C) por 18 h. A mistura de reação foi acidificada com HCl 1M (120 ml) e o sólido precipitado resultante foi coletado por filtração, lavado com água (2 x 100 ml) e parcialmente seco por sucção no filtro por 30 min, seguida por secagem em forno a vácuo a 18°C por 18 h. Assim, ácido 2-metóxi-3-(4- nitrofenil)acrílico foi produzido como um sólido queimado contendo alguma água de cristalização (6,7 g, 91%).

[0092] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6): 3,83 (s, 3-H, OMe), 6,97 (s, 1-H, CH=), 8,02 (d, 2-H, CHaromático), 8,25 (d, 2-H, CHaromático).

Etapa 5

[0093] Ácido 2-Metóxi-3-(4-nitrofenil)acrílico (6,7g, 30 mmol) foi colocado em metanol (700 ml) e THF (300 ml) e 10% Pd em C (base úmida) (0,67g) foi adicionado. A mistura foi hidrogenada em 310 kPa por 43 min, seguido por recargas repetidas em 310-331 kPa a camada hora por 3 h e finalmente 331 kPa por 18 h. A suspensão resultante foi filtrada através de papel de filtro GF/F e o resíduo de filtro lavado com MeOH (200 ml). Os filtrados foram concentrados até um sólido branco sujo. O sólido foi transformado em pasta em IMS (75 ml) a 20°C por 1,5 h, filtrado, e lavado com IMS/heptano (1:2) (20 ml) e seco no filtro por 1 h para produzir ácido (±)-2-metóxi-3-(4'-aminofenil)-propiônico como um sólido branco sujo (5,1g, 88% de rendimento).

[0094] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6): 2,74 (m, 2-H), 3.23 (s, 3-H, CH3), 3.80 (dd, 1-H, CH), 6,47 (d, 2-H, aromático), 6,87 (d, 2-H, aromático).

EXEMPLO 6

[0095] Método de Preparação de ácido (±)-2-metóxi-3-(3'- aminofenil)-propiônico (Composto 35)

Etapas 1 e 2

[0096] Como para o composto 20

Etapa 3

[0097] Sulfato de dimetil (13,23 g, 105 mmol) foi adicionado a uma mistura agitada de ácido 2-hidróxi-3-(3nitrofenil)acrílico (10,5g, 50,0 mmol) e carbonato de césio (39,1 g, 120 mmol) em DMF (105 ml) para formar uma mistura amarela pálida clara, que foi agitada à RT durante a noite. A suspensão vermelha escura resultante foi concentrada in vacuo e o resíduo dividido entre água (100 ml) e diclorometano (150 ml). A camada orgânica foi separada, depois lavada com água (2 x 100 ml), seca sobre sulfato de sódio e filtrada através de sílica gel. A solução amarela resultante foi evaporada até a secura in vacuo para dar 2-metóxi-3-(3-nitrofenil)acrilato de metil como um sólido amarelo (8,1g, 67%).

[0098] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6) = 3,81 (3H, s), 3,83 (3H, s), 7,08 (1 H, s), 7,71 (1 H, dd, 7,9 & 8,2Hz), 8,10-8,22 (2H, m), 8,66 (1 H, s).

Etapa 4

[0099] Uma solução de hidróxido de potássio (2,0 g, 35,9 mol) em água (25 ml) foi adicionada a uma solução agitada de 2-metóxi-3-(3- nitrofenil)acrilato de metil (8,1 g, 34,2 mmol) em metanol (150 ml) e a mistura resultante foi agitada à RT durante a noite. Uma outra quantidade de KOH (0,5 g, 8,9 mmol) em água (10 ml) foi adicionada e a mistura aquecida a 80°C por 1 h. O metanol foi então evaporado in vacuo e o resíduo diluído com água (200 ml). A solução foi lavada com diclorometano (2 x 100 ml), filtrada através de um bloco de celite e então acidificada pela adição de HCl 3M até pH 3. A mistura foi refrigerada por 18 h, depois o sólido precipitado foi coletado por filtração, lavado com água (3 x 30 ml) e seco in vacuo a 40°C para dar ácido 2-metóxi-3-(3-nitrofenil)acrílico como um sólido amarelo (6,4 g, 84%).

[00100] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6) = 3,82 (3H, s), 7,02 (1 H, s), 7,70 (1 H, t, 7,93Hz), 8,108,22 (2H, m), 8,65 (1 H, s).

Etapa 5

[00101] Uma mistura de ácido 2-metóxi-3-(3-nitrofenil)acrílico (3,4 g, 15,25 mmol), metanol (340 ml) e 5% de paládio em carvão ativado (1,36 g, 4% em moles) foi hidrogenada a 82 a 248 kPa, em atmosfera de H2 por 1,5 h. A mistura foi então filtrada através de celite, a torta do filtro lavada com metanol e os filtrados concentrados a 40°C sob vácuo para dar o produto como um sólido espumoso. Este foi dissolvido em água (100 ml) e a solução seca por congelamento para dar ácido (±)-2-metóxi-3-(3'-aminofenil)- propiônico (2,6g, 100%) como um sólido branco sujo.

[00102] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6) = 2,68 (1 H, dd, 13,9 & 8Hz), 2,80 (1 H, dd, 13,9 & 4,6Hz), 3,21 (3H, s), 3.84 (1 H, dd, 8,25 & 4,6Hz), 6,36-6,44 (3H, m), 6,91 (1 H, dd, 7,6Hz).

EXEMPLO 7

[00103] Método de Preparação de ácido (±)-2-metóxi-3-(4'- aminofenil)-propiônico (Composto 39). Resolução Enantiomérica (Figura 12)

Etapas 1 e 2

[00104] Como para o composto 34, etapas 1 e 2

Etapa 3

[00105] Ácido 2-hidróxi-3-(4-nitrofenil)acrílico (20 g, 95,6 mmol) foi suspenso em DMF (200 ml). CS2CO3 (74,99, 229,9 mmol) e sulfato de dietil (26,3 ml, 201 mmol) foram adicionados e a dissolução foi observada. Após agitação por 18 h a 18°C, água (350 ml) e acetato de etila (250 ml) foram adicionados e as camadas separadas. A camada aquosa foi também extraída com acetato de etila (5 x 200 ml), depois os extratos orgânicos combinados foram lavados com água (2 x 200 ml), salmoura (2 x 200 ml) e secos sobre sulfato de magnésio. Os extratos orgânicos foram concentrados até a secura para obter 2-etóxi-3-(4-nitrofenil)acrilato de etil como um sólido laranja contendo 3,6% em massa de DMF (27,6 g úmido, >100% de rendimento).

[00106] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6): 1,32 (t, 6-H, 2 x CH2CH3), 4,13 (q, 2-H, CH2CH3), 4,30 (q, 2-H, CH2CH3), 6,99 (s, 1-H, CH=), 8,06 (d, 2-H, CHaromático), 8,26 (d, 2-H, CHaromático).

Etapa 4

[00107] 2-Etóxi-3-(4-nitrofenil)acrilato de etil contendo 3,6% em peso de DMF (26,07 g corrigido, 98,3 mmol) foi dissolvido em IMS (500 ml) e uma solução de NaOH (1,44 g, 36,1 mmol) em água (260 ml) foi adicionada. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 18 h, depois acidificada com HCl 1M (120 ml) e o sólido resultante coletado por filtração, lavado com água (2 x 100 ml) e seco por sucção no filtro por 30 min, seguido por secagem em forno a vácuo a 18°C por 18 h. O ácido 2-hidróxi-3-(4- nitrofenil)acrílico foi assim obtido como um sólido laranja contendo água de cristalização (18,4 g, 79%).

[00108] 1H RMN (s, 250MHz, DMSO-d6): 1,31 (t, 3-H, Me), 4,11 (q, 2-H, CH2), 6,98 (s, 1-H, CH=), 8,05 (d, 2-H, CHaromático), 8,25 (d, 2-H, CHaromático).

Etapa 5

[00109] Ácido 2-hidróxi-3-(4-nitrofenil)acrílico (18,4 g úmido, cerca de 77,5 mmol) foi dissolvido em MeOH (1,1 l) e 10% Pd em C (base úmida) (1,84 g) foi adicionado. A mistura foi hidrogenada a 82 kPa por 10 min, seguido por recarga repetida a 138-193 kPa a cada 10-20 min por 5 h, depois a 317 kPa por 18 h. A mistura foi filtrada através de papel GF-F e o resíduo foi transformado em pasta em IMS (100 ml), filtrado, lavado com heptano (100 ml) e seco por sucção no filtro. Assim, ácido (±)-2-etóxi 3-(4'- aminofenil)-propiônico foi obtido como um sólido branco sujo (11,2 g, 69%).

[00110] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6): 1,03 (t, 3-H, CH3), 2,73 (m, 2-H,), 3.29 (m, 1H), 3.46 (m, 1 H), 3.80 (dd, 1-H), 6,50 (d, 2-H), 6,87 (d, 2-H).

EXEMPLO 8

[00111] Método de preparação de ácido (±)-2-etóxi-3-(3'-aminofenil)- propanóico (Composto 40)

Etapas 1 e 2

[00112] Como para o composto 20, etapas 1 e 2

Etapa 3

[00113] Sulfato de dietila (12 g, 78,2 mmol) foi adicionado a uma mistura agitada de ácido 2-hidróxi-3-(3-nitrofenil)acrílico (6,1g, 30,0 mmol) e carbonato de césio (29,3g, 90 mmol) em DMF (61 ml) para formar uma mistura amarela clara pálida, que foi agitada à RT durante a noite. A suspensão vermelha escura resultante foi aquecida até 50°C por 4 h, então concentrada in vacuo e o resíduo dividido entre água (100 ml) e diclorometano (150 ml). A camada orgânica foi separada, depois lavada com água (2 x 100 ml), seca sobre sulfato de sódio e filtrada através de um bloco de sílica gel. A solução amarela resultante foi evaporada até a secura in vacuo para dar 2-etóxi-3-(3-nitrofenil)acrilato de etil como um sólido amarelo (5,6 g, 72%).

Etapa 4

[00114] Uma solução de hidróxido de potássio (1,3 g, 22,2 mol) em água (20 ml) foi adicionada a uma solução agitada de 2-etóxi-3-(3- nitrofenil)acrilato de etil (5,6 g, 21,1 mmol) em metanol (100 ml) e a mistura resultante aquecida até o refluxo durante a noite. O metanol foi então evaporado in vacuo e o resíduo diluído com água (150 ml). A solução foi lavada com diclorometano (2 x 80 ml), filtrada através de um bloco de celite e então acidificada pela adição de HCl 3M até pH 3. A mistura foi refrigerada por 18 h, depois o sólido precipitado foi coletado por filtração, lavado com água (3 x 30 ml) e seco in vacuo a 40°C. O sólido resultante foi recristalizado a partir de acetato de etila e heptano para dar ácido 2-etóxi-3-(3- nitrofenil)acrílico como um sólido amarelo (3,06g, 61%).

[00115] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6) = 1,34 (3H, t, 7Hz), 4,10 (2H, q, 7Hz), 7,04 (1 H, s), 7,69 (1 H, t, 7,93Hz), 8,07-8,22 (2H, m), 8,80 (1 H, m), 13,25 (1 H, brs).

Etapa 5

[00116] Uma mistura de ácido 2-etóxi-3-(3-nitrofenil)acrílico (3,06g, 12,9 mmol), metanol (150 ml) e 5% de paládio em carvão ativado (0,60 g, 2% mol) foi hidrogenada a 82 a 207 kPa, em atmosfera de H2 por 2 h. A mistura foi então filtrada através de celite, a torta do filtro lavada com metanol e os filtrados concentrados a 40°C sob vácuo para dar o produto como um sólido espumoso. Este foi dissolvido em água (100 ml) e a solução seca por congelamento para dar ácido (±)-2-etóxi-3-(3'-aminofenil)- propanóico (2,79, 100%) como um sólido branco sujo.

[00117] 1H RMN (δ, 250MHz, DMSO-d6) = 1,07 (3H, t, 7Hz), 2,6-2,85 (2H, m), 3.20-3.38 (1 H, m), 3.40-3.60 (1 H, m), 3.92 (1 H, dd, 5 & 7,7Hz), 6,3-6,45 (3H, m), 7,01 (1 H, t, 7,6Hz).

EXEMPLO 9 Modelagem Molecular

[00118] Os estudos de modelagem molecular foram realizados usando um software SYBYL 6.9.1 (Tripos Associatos IncTM, St Louis, MO) correndo em estações de trabalho Silicon GraficsTM. O modelo tridimensional dos zwitteríons de 5-ASA foi crescido de uma coleção de fragmentos padrão, e sua geometria foi subseqüentemente otimizada usando o campo de força Tripos (3). Como o pKa dos compostos é ainda desconhecido, a calculadora online SPARC foi usada para determinar a espécie que ocorre em pH fisiológico (7,4) (http://ib mlc2.chem.uga/sparc/index.cfm). Os modelos tridimensionais de compostos ionizados foram crescidos de uma coleção de fragmentos padrão, e sua geometria foi subseqüentemente otimizados usando o campo de força Tripos (3) incluindo o termo eletrostático calculado de cargas atômicas de Gasteiger and Hückel. O método de Powell disponível no procedimento Maximin2 foi usado para minimização de energia até o valor de gradiente ser menor que 0,001 kcal/mol.Â.

[00119] A estrutura do domínio de ligação de ligando de PPARY foi obtida de sua estrutura de cristal de raio X complexa com o tesaglitazar (AZ 242) disponibilizado no Banco de Dados de Proteína RCSB (1l7l) (4,5). A docking flexível dos compostos no sítio ativo receptor foi realizada usando software GOLD (6). Os modelos de docking mais estáveis foram selecionados de acordo com a melhor conformação conseguida prevista pelo Goldscore (6) e as funções de classificação X (7). Os complexos foram minimizados em energia usando o método de Powell no procedimento de Maximin2 com o campo de força Tripos e uma constante dielétrica de 4,0 até que o valor de gradiente alcançasse 0,01 kcal/mol. Â. A função de recozimento foi usada definindo o ligando em uma região quente (10 Â) e uma região interessante (15 Â).

RESULTADOS

[00120] Os estudos de docking receptor de modelagem molecular previram que, em geral, o enantiômero S é mais ativo que o enantiômero R, mesmo se o enantiômero R mostrar atividade também. Este fenômero de um enantiômero ser mais biologicamente ativo é bem conhecido

[00121] Como conseqüência, a presente invenção fornece um método para resolver os compostos em enantiômeros. O método de resolução para o composto 32 é mostrado esquematicamente na Figura 11.

[00122] Embora não se deseje estar ligado a nenhuma teoria, acredita- se que os enantiômeros S dos compostos vão fornecer maior atividade. Os resultados dos estudos de docking são mostrados nas Figura 5-10.

EXEMPLO 10

[00123] Efeitos de novos compostos em ativação de PPARY

MATERIAIS E MÉTODOS Materiais

[00124] 5-ASA foi adquirida na Sigma-Aldrich™ (ST Quentin Fallavier, França). Rosiglitazona foi adquirida na Spi Bio™ (Massy, França). Novas moléculas 20, 34, 35, 39, 40 foram sintetizadas como descritas nos exemplos 1 a 8. As estruturas desses compostos foram mostradas na Figura 1.

Linhas de células

[00125] A linha de célula de carcinoma de cólon HT-29 STD (ATCC HTB-38) foi desenvolvida rotineiramente em DMEM suplementada com 10% de calor-FCS, e antibióticos. Células foram desenvolvidas em monocamadas, incubadas a 37°C em 5% de CO2 e 95% de umidade relativa.

Transfecção transiente com PPARy e estimulação de células

[00126] Células HT-29 STD foram transientemente transfectadas usando o reagente de transfecção Effectene™. Para testar ativação PPARY, realizaram transfecção com 500 ng de um construto promotor mínimo contendo duas cópias de PPRE obtido do citocromo p450 (2XCYP) (1). O plasmídeo luciferase renilla (0,1 μg/poço) foi também transfectado como um controle interno para monitorar eficiência de transfecção e para normalizar a atividade de luciferase do vaga-lume. Células transfectadas foram deixadas incubadas por 24 horas a 37 °C. Estimulações foram realizadas após incubação de células durante 18 horas com todos compostos 20, 34, 35, 39 e 40 em uma concentração de 1mM e comparado com os ligandos sintéticos PPARy 5-ASA (30 mM) (2) e rosiglitazona (10-5 M(2)) usada como controles positivos. O pH de soluções de drogas foram ajustadas a 7,4 com NaOH. Extratos de células total foram preparados usando o Passive Lysis Buffer (Promega™, Madison, Wis). Ativadade Luciferase foi ensaiada em 20 μl de extrato usando sistema de ensaio Luciferase Dual de Promega de acordo com o protocolo de fabricante. Transfecções foram ensaiadas em triplicata em pelo menos três experimentos separados. A atividade de luciferase foi expressada como vezes de atividade obtida em células tratadas com as moléculas diferentes dividindo pela atividade de luciferase de células não estimuladas.

RESULTADOS

[00127] A ativação de PPARy resulta em uma cascata de reações, levando a uma ligação a elemento de seqüência de DNA específicos chamados de elementos de resposta proliferadores de peroxisoma (PPRE) (79).

[00128] Foi investigada a atividade transcricional de PPARy por transfecções transientes de células epiteliais com os plasmídeos de PPRE de renilla luciferase. Para avaliar se as novas moléculas têm mais eficácia do que 5-ASA para estimular a ativação de PPARy, foram testadas estas moléculas em uma concentração de 1 mM. O efeito das novas moléculas em uma concentração de 1 mM foi comparado com 5-ASA, usado como o controle positivo em uma concentração ótima de 30 mM e 10-5 M, respectivamente. As células foram estimuladas com as diferentes moléculas durante 24 h.

[00129] A análise da atividade de PPARY em células HT-29 transfectadas mostrou que as novas moléculas 34, 39, 35 e 40 em 1 mM aumentaram a atividade de gene repórter por 4,8 ± 0,71; 2,73 ± 0,31; 2,64±0,46; 3,4+0,97 vezes, respectivamente, desta forma exibindo uma atividade similar ou superior a 5-ASA a 30 mM (2,8±0,7) e rosiglitazona a 105M (3,17±0,29).

[00130] A Figura 2 representa todos os resultados obtidos para cada molécula avaliada em 2 ou 3 experimentos feitos em triplicata. A reprodução entre os experimentos diferentes é boa e similar aos dados descritos na literatura.

[00131] Este estudo permitiu identificar 4 novas moléculas tendo de 30 a 50 vezes mais eficácia do que 5-ASA para ativar PPARy.

EXEMPLO 11 Crescimento de células de câncer de cólon

[00132] As seguintes substâncias 20, 34, 35, 39 e 40 foram testadas quanto à sua capacidade de modular o crescimento de células de câncer de cólon. Para este propósito, três linhagens celulares de carcinoma de cólon humano (i.e., HT-29, HT-115 e DLD1) foram usadas. Estes tipos de células foram selecionados na base da expressão de ciclooxigenase-2 (COX-2). Na verdade, as células de HT-115 expressam um COX-2 biologicamente ativo, as células de HT-29 expressam uma isoforma de COX-2 não-funcional, e DLD- 1 são células deficientes em COX-2. Acredita-se que estas moléculas sejam também ativas nas células que não expressam COX-, e assim as moléculas da presente invenção podem ser usadas em células que não expressão COX-2 para os propósitos de tratamento de tumor e outras aplicações descritas aqui.

[00133] As células de HT-29 e DLD-1 foram cultivadas nos meios McCoy e RPMI1640, respectivamente, suplementadas com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) e 50 μg/ ml de gentamicina. HT-115 foram cultivadas no meio DMEM suplementado com 15% de FBS e 1% de P/S. As células foram mantidas em uma incubadora umedecida a 37°C, na presença de 5% de CO2.

[00134] Para análises do crescimento celular, as suspensões de célula única foram colocadas em placas em 2 x 103 células/poço (4 x 103 células/poço para HT115) em placas de cultura com 96 poços em meio contendo 0,5% FBS e deixadas aderir. As células não-aderentes foram então removidas, e meio fresco contendo 0,5% FBS foi adicionado em cada poço. As células foram cultivadas na presença ou na ausência das substâncias especificadas. Cada substância foi dissolvida como uma solução de carga de 25 mM no meio de cultura contendo 0,5% FBS, e o pH de cada solução de carga foi ajustado para 7,4. Se necessário, com NaOH. As substâncias foram usadas em uma concentração final variando de 0,5 a 10 mM.

[00135] A proliferação celular foi determinada pela medição da incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) em DNA usando um kit de proliferação de célula comercialmente disponibilizado (Roche DiagnosticsTM, Monza, Itália). BrdU foi adicionado às culturas celulares durante as últimas 6 horas de incubação, e o nível de células positivas de BrdU foi avaliado após 48 horas de cultura por ensaio imunossorvente ligado por enzima (ELISA). A densidade óptica (OD) foi determinada a 450 nm usando uma leitora de ELISA. Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados são relatados como a média ± desvio padrão (SD).

RESULTADOS

[00136] Os compostos diferiram em suas capacidade de inibir o crescimento de células de câncer do cólon. Os resultados são mostrados na tabela 1, onde a percentagem de inibição do crescimento de células de DLD-1 pelos compostos especificados é mostrada. A substância 20 exibe um efeito anti-proliferativo notável, em uma maneira dependente da dose, em cada uma das três linhagens celulares testadas (Fig. 3 e 4). Mais que 90% da inibição de crescimento celular foram vistos quando os compostos foram usados em uma concentração final de 10 mM. A capacidade do composto 20 de inibir significativamente o crescimento celular foi vista quando usado em uma concentração final de 5 ou 10 mM.

[00137] Os compostos 34 e 39 reduziram levemente o crescimento celular quando usados em altas doses (10 mM) (Figura 4), mas as diferenças dentre os grupos não foram estatisticamente significativas. Similarmente, nenhuma inibição no crescimento celular foi vista em culturas adicionadas com as substâncias 35 e 40 (ver Tabela 1).

CONCLUSÕES

[00138] O primeiro conjunto de exemplos da presente invenção (Exemplo 10) mostra a capacidade de quatro moléculas otimizadas 34, 39, 35 e 40 na concentração de 1 mM, para aumentar a atividade de PPARY em células HT-29 transfectadas, exibindo uma atividade similar ou superior a 5- ASA a 30 mM e rosiglitazona a 10-5 M.

[00139] O segundo conjunto de exemplos da presente invenção (Exemplo 9) indica que também no outro teste as moléculas exibem uma atividade similar a, ou superior a 5-ASA em uma concentração de trabalho trinta vezes menor que aquela de 5-ASA, durante um período de 24 horas.

[00140] O conjunto final de exemplos da presente invenção (Exemplo 11) mostra que os compostos afetam a inibição do crescimento das linhagens de células de câncer de cólon, HT-29, HT-115 e DLD1 em graus variados. Os compostos diferiram em sua capacidade de inibir o crescimento de células de câncer no cólon. A substância 20 exibe um efeito anti-proliferativo notável em linhagens celulares testadas.

[00141] Estas moléculas da presente invenção são também ativas nas células que não expressam COX-2, e assim as moléculas da presente invenção podem ser usadas em células que não expressam COX-2 para os propósitos de tratamento de tumores e outras aplicações descritas aqui.

CONCLUSÕES GERAIS

[00142] Os compostos com maior classificação sintetizados, indicados dos estudos de modelagem, mostram uma atividade similar/superior àquela de mesalazina.

REFERÊNCIAS

[00143] 1. Dubuquoy, L., E.A. Jansson, S. Deeb, S. Rakotobe, M. Karoui, J.F. Colombel, J. Auwerx, S. Pettersson, and P. Desreumaux. 2003, Impaired expression of peroxisome proliferator-activatod receptor gamma in ulcerative colitis. Gastroenterology 124:1265-1276,

[00144] 2. Rousseaux C, Lefebvre B, Dubuquoy L, Lefebvre P, Romano O, Auwerx J, Metzger D, Wahli W, Desvergne B, Naccari GC, Chavatte P, Farce A, Bulois P, Cortot A, Colombel JF, Desreumaux P. Intestinal anti-inflammatory effect of amino salicylic acid is dependent on PPARY. J Exp Med; 201: 1205-15.

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[00148] 6. Wang, R., L. Lai, and S. Wang. 2002. Furter development and validation of empirical scoring functions for structure-based binding affinity prediction. J Comput Aided Mol Des 16:11-26.

[00149] 7. Westin, S., R. Kurokawa, R.T. Noite, G.B. Wisely, E.M. Mclnerney, D.W. Rose, M.V. Milburn, M.G. Rosenfeld, and C.K. Glass. 1998, Interactions controlling the assembly of nuclear-receptor heterodimers and co-activators. Nature 395:199-202.

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Claims (12)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que é representado por:

2. Composto, caracterizado pelo fato de que é representado por:

3. Composto, caracterizado pelo fato de que é representado por:

4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o composto está em uma forma R ou S enantiomericamente pura.

5. Uso de um composto, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo que consiste de: ácido 2-hidróxi-3-(3'-aminofenil) propiônico, ácido 2-metóxi-3-(4'-aminofenil) propiônico, ácido 2-etóxi-3-(4'-aminofenil) propiônico, e ácido 2-etóxi-3-(3’aminofenil) propiônico, na preparação de um produto medicinal para o tratamento de um câncer ou uma doença inflamatória crônica, em que a doença inflamatória crônica é selecionada de doença de Chron e rectocolite ulcerativa.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer ou doença inflamatória crônica expressa receptores de PPARy e receptores de EGF.

7. Uso de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo de tumores do esôfago, estômago, pâncreas, cólon, próstata, seio, útero e anexos, rins e pulmões; e a doença inflamatória crônica é doença de Chron ou rectocolite ulcerativa.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais compostos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um ou mais excipientes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o composto está em uma mistura na qual um enantiômero está em excesso do outro, em qualquer proporção.

10. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um produto medicinal para a prevenção e tratamento de um tumor que expressa receptores de PPARY e receptores de EGF selecionados do grupo consistindo de tumores do esôfago, estômago, pâncreas, cólon, próstata, seio, útero e anexos, rins e pulmões.

11. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um produto medicinal para o tratamento de uma doença inflamatória crônica selecionada de doença de Crohn e rectolite ulcerativa.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, 10, e 11, caracterizado pelo fato de que o composto está em uma mistura na qual um enantiômero está em excesso do outro, em qualquer proporção.