PT1910270E

PT1910270E - Compostos e seus sais específicos para os receptores ppar e os receptores de egf e sua utilização no campo médico

Info

Publication number: PT1910270E
Application number: PT67660852T
Authority: PT
Inventors: Sergio Baroni; Giancarlo Naccari
Original assignee: Nogra Pharma Ltd
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-24
Publication date: 2013-07-17
Also published as: US20090048343A1; AU2006271165B2; NO340680B1; CY1114294T1; DK1910270T6; IL205992A; SI1910270T1; EA017566B1; ZA201008268B; MX366596B; EA201000708A1; CN102020577A; IL188878A; NO20080325L; PL1910270T6; KR20080039428A; US20150265563A1; WO2007010516A3; EP1910270B1; AU2006271165A1

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSTOS E SEUS SAIS ESPECÍFICOS PARA OS RECEPTORES PPAR E OS RECEPTORES DE EGF E SUA UTILIZAÇÃO NO CAMPO MÉDICO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a compostos e a seus sais específicos para os receptores PPAR e aos receptores de EGF e à sua utilização no campo médico.

OBJECTO DA INVENÇÃO

Em particular, os compostos e seus sais de acordo com a presente invenção podem ser usados vantajosamente para a prevenção e para o tratamento de tumores que expressam os receptores PPARy (Receptores Activados por Proliferador de Peroxissoma) e os receptores de EGF (receptores de Factor de Crescimento Epidérmico) tais como tumores do: esófago, estômago, pâncreas, cólon, próstata, mama, útero e anexos do útero, rins e pulmões. Além disso, os compostos e seus sais de acordo com a presente invenção podem ser usados para o tratamento de doenças inflamatórias crónicas, particularmente doenças intestinais crónicas, tais como doença de Crohn e rectocolite úlcero-hemorrágica. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os receptores PPARy são receptores nucleares (grupo de cerca de 50 factores de transcrição) que controlam a expressão de muitos genes que são importantes para a regulação de metabolismo de lípidos, a síntese de insulina e os processos de carcinogénese e inflamação (Buli AW, Arch Pathol Lab Med 2003; 127: 1121-1123) (Koeffler HP, Clin Câncer Res 2003; 9: 1-9) (Youssef J et al., J Biomed Biotec 2004; 3: 156-166). Há vários agonistas naturais e sintéticos que se ligam aos receptores PPARy e alteram a sua conformação, fazendo 2 surgir a activação. Os ligandos naturais e sintéticos são descritos em The Lancet 2002; 360:1410-1418.

Estudos recentes mostraram que o tratamento de células com tumor com ligandos dos receptores PPARy induz uma diminuição na proliferação celular, na diferenciação celular e na apoptose, sugerindo uma aplicação potencial de tais compostos como agentes para a prevenção de carcinogénese (Osawa E et al., Gastroenterology 2003; 124:361-367).

Outros estudos mostraram que ligandos dos receptores PPARy (por exemplo, troglitazona) têm efeitos anti-inflamatórios e inibem a resposta inflamatória mucosal em modelos animais de IBD (Tanaka T et al., Câncer Res 2001; 61: 2424-2428) .

Além disso, publicou-se muito recentemente evidência de que a actividade anti-inflamatória intestinal de 5-ASA, o padrão de ouro no tratamento de IBD, é dependente da ligação, e consequente activação, dos receptores PPARy (Rousseaux C et ai., J Exp Med 2005; 201: 1205-1215). O receptor transmembranar com actividade de tirosina-quinase EGF é expresso num grau muito alto na forma activada em vários tipos de neoplasias (Mendelsohn J, Endocr Relat Câncer 2001; 8: 3- 9) (Harari PM, Endocr Relat Câncer 2004; 11: 689-708). A sobre-expressão do receptor é também relacionada com a capacidade potencial de células carcinomatosas para metástase. Em conexão com isto, foi demonstrado que EGF promove a migração e a invasividade de vários tipos de células conectados com lesões ao nivel das interacções com a matriz extracelular (Brunton et al., Oncogene 1997; 14: 283-293). Vários estudos realizados em animais experimentais e em seres humanos têm estabelecido a eficácia de inibidores 3 do receptor de EGF no controlo da proliferação e na disseminação de tumores (Mendelsohn J, Endocr Relat Câncer 2001; 8: 3-9) (Harari PM, Endocr Relat Câncer 2004; 11: 689-708). Não há dúvidas de que os sinais intracelulares accionados pela activação do receptor de EGF facilitam o crescimento e a sobrevivência de células neoplásicas, contribuindo para o desenvolvimento da patologia, e que tais sinais são essenciais na determinação da capacidade de células tumorais de se disseminar e colonizar órgãos remotos (Mendelsohn J, Endocr Relat Câncer 2001; 8: 3-9) (Kari C et al., Câncer Res 2003; 63: 1-5).

Do exposto acima e tendo em mente, além disso, que do ponto de vista biológico, processos de inflamação crónicos desempenham um papel na carcinogénese, torna-se claro que há uma necessidade real de uma pesquisa inovadora em novas entidades químicas que, por sua acção complementar nos receptores PPARy e nos receptores de EGF, sejam capazes de exercer uma acção anti-inflamatória e anti-tumoral, do tipo quimiopreventivo, anti-proliferativo e anti-metastático. A presente invenção fornece uma nova classe de compostos que são adequados para a prevenção e para o tratamento de cancro e de inflamação crónica por meio da modulação de receptores específicos, tais como receptores PPARy e os receptores de EGF.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novas e inventivas utilizações terapêuticas e médicas de uma série de compostos, uma vez que qualquer destes compostos não é conhecido, a presente invenção também se refere a estes compostos.

Num primeiro aspecto de a invenção, proporciona-se um composto, e sais do mesmo, seleccionado a partir do grupo 4 que consiste em:

Os compostos da invenção correspondem aos compostos seleccionados a partir do grupo que consiste em: ácido 3-(3'-aminofenil)2-hidroxipropanóico (composto 20) ácido 2-(4-aminofenil)2-metoxiacético (composto 23) ácido 2-(3-aminofenil)2-etoxiacético (composto 32) ácido 2-(4-aminofenil)2-etoxiacético (composto 33) ácido 3-(4'-aminofenil)2-metoxipropiónico (composto 34) ácido 3-(4'-aminofenil)2-etoxipropiónico (composto 39) ácido 3-(3'-aminofenil)2-etoxipropiónico (composto 40).

Os nomes dos compostos acima podem também ser escritos na nomenclatura química padrão a seguir (cuja nomenclatura será usada no texto): ácido (±)-2-hidroxi-3-(3'-aminofenil) propiónico (composto 20) ácido (±)-2-metoxi-2-(4'-aminofenil) acético (composto 23) ácido (±)-2-etoxi-2-(3'-aminofenil) acético (composto 32) ácido (±)-2-etoxi-2-(4'-aminofenil) acético (composto 33) ácido (±)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil) propiónico (composto 34) 5 ácido (±)-2-etoxi-3-(4'-aminofenil) propiónico (composto 39) ácido (±)-2-etoxi-3-(3'-aminofenil) propiónico (composto 40) .

Num segundo aspecto da invenção, os compostos de acordo com a presente invenção podem ser usados vantajosamente no campo médico. Portanto, um quarto aspecto da invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um ou mais compostos como foram definidos acima como princípios activos em combinação com um ou mais excipientes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. A presente invenção refere-se, além disso, à utilização dos compostos como foram definidos acima para a preparação de um produto medicinal para a prevenção e para o tratamento de tumores que expressam os receptores PPARy e os receptores de EGF, tais como, por exemplo, tumor do esófago, estômago, pâncreas, cólon, próstata, mama, útero e anexos do útero, rins e dos pulmões.

Além disso, a presente invenção refere-se à utilização dos compostos de acordo com a presente invenção para a preparação de um produto medicinal para o tratamento de doença inflamatória crónica, tais como doença de Crohn e rectolite ulcerativa.

Num aspecto adicional da invenção, compostos adicionais que podem ser usados nas aplicações acima, além daqueles já descritos, podem ser como se segue: ácido (R,S)-2-hidroxi-3-(4'-aminofenil)propiónico (composto 21) e ácido (R,S)-2-metoxi-3-(3'-aminofenil)propiónico (composto 35).

Os nomes de compostos acima também podem ser escritos na nomenclatura quimica padrão a seguir (a qual será usada 6 no texto): ácido (±)-2-hidroxi-3-(4'-aminofenil)propiónico (composto 21) e ácido (±)-2-metoxi-3-(3'-aminofenil)propiónico (composto 35) .

Um composto preferido tem a fórmula (II)

OH

o (II) (composto 20).

Um composto preferido tem a fórmula (III)

HO

(III) (composto 23).

Um composto preferido tem a fórmula (IV) o

HO

(IV) (composto 32).

Um composto preferido tem a fórmula (V) o

HO

(V) (composto 33).

Um composto preferido tem a fórmula (VI) 7 De acordo sais do mesmo campo médico

(VI) (composto 34). com outro aspecto da invenção, que tem a fórmula (VII) pode o composto ser usado e no

(VII) (composto 35).

Um composto preferido tem a fórmula (VIII'

(composto 39).

Um composto preferido tem a fórmula (IX)

o (ix) (composto 40).

Compostos preferidos da invenção podem ser seleccionados a partir do grupo que consiste em: ácido (±)-2-hidroxi-3-(3'-aminofenil) propiónico (composto 20) ácido (±)-2-metoxi-2-(4'-aminofenil) acético (composto 23) 8 ácido (±)-2-etoxi-2-(3'-aminofenil) acético (composto 32) ácido (±)-2-etoxi-2-(4'-aminofenil) acético (composto 33) ácido (±)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil) propiónico (composto 34) ácido (±)-2-etoxi-3-(4'-aminofenil) propiónico (composto 39) ácido (±)-2-etoxi-3-(3'-aminofenil) propiónico (composto 40) .

Os compostos de acordo com a presente invenção podem ser usados vantajosamente no campo médico. Portanto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um ou mais compostos como foram definidos acima como princípios activos em combinação com um ou mais excipientes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. A presente invenção refere-se, além disso, à utilização dos compostos como foram definidos acima para a preparação de um produto medicinal para a prevenção e para o tratamento de tumores que expressam os receptores PPARy e os receptores de EGF, tais como, por exemplo, tumor do esófago, estômago, pâncreas, cólon, próstata, mama, útero e anexos do útero, rins e dos pulmões.

Além disso, a presente invenção refere-se à utilização dos compostos de acordo com a presente invenção para a preparação de um produto medicinal para o tratamento de doença inflamatória crónica, tais como doença de Crohn e rectolite ulcerativa. A presente invenção também se refere aos métodos de tratamento de seres humanos e/ou mamíferos (incluindo roedores, animais de fazenda, animais domésticos, ratos, camundongos, hamsters, coelhos, cães, gatos, porcos, ovelha, vacas, cavalos).

Em particular, os compostos de acordo com a presente invenção que podem ser usados nas aplicações mencionadas, 9 além daqueles já descritos, podem ser os seguintes: ácido (±)-2-hidroxi-2-(3-aminofenil)acético (composto 10) ácido (±)-2-hidroxi-2-(4-aminofenil)acético (composto 11) ácido (±)-2-hidroxi-3-(4'-aminofenil)propiónico (composto 21) ácido (±)-2-metoxi-3-(3'-aminofenil)propiónico (composto 35) ácido (±)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil)propiónico (composto 34) .

As utilizações dos compostos descritos não são restritas à sua utilização na forma racémica. Esta invenção estende-se à utilização de quaisquer compostos nas formas R ou S enantiomericamente puras, ou qualquer mistura na qual um enantiómero está em excesso do outro, em qualquer proporção.

De facto, os estudos de docking realizados indicam que o enantiómero S é mais activo do que o enantiómero R, embora o enantiómero R puro mostre actividade.

As moléculas da presente invenção foram derivadas do trabalho de modelamento molecular usando mesalazina como uma base e todas as variações quimicamente viáveis foram avaliadas de forma a alcançar o melhor resultado (afinidade e activação do receptor) em experimentos de docking de computador. Consequentemente, acredita-se que os compostos da presente invenção que mostram função e/ou actividade comparável à mesalazina o façam através de vias biológicas similares. Acredita-se que caracteristicas similares à mesalazina inerentes nas moléculas da presente invenção confiram nas moléculas uma actividade similar em relação à via de EGF.

Os exemplos fornecidos aqui são modelos úteis para utilização na previsão da utilização dos compostos nos vários campos médicos já discutidos. Os modelos, portanto, 10 fornecem resultados valiosos e significativos independentemente de seu mecanismo de acção. A presente invenção vai agora ser descrita para propósitos de ilustração, mas sem limitá-la, de acordo com suas formas de realização preferidas, com referência particular aos diagramas nos desenhos em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E QUADRO

Quadro 1. Percentagens de inibição de célula DLD-1 por doses graduadas (0,5-10 mM) dos compostos especificados. As células foram cultivadas na presença ou na ausência dos compostos, e o crescimento das células foi então avaliado pelo ensaio colorimétrico (BrdU) após 48 horas de cultura. A Figura 1 mostra as estruturas dos compostos 20, 23, 32, 33, 34, 35, 39 e 40.

Figura 2: Actividade de PPARy por tratamento com compostos.

Figuras 3-4: Efeito das substâncias especificadas na proliferação de linhas de células de carcinoma de cólon humano (isto é, HT29, HT115 e DLD1). As células foram tratadas com concentrações crescentes de substâncias (0,5-10 mM) por 48 horas e a proliferação foi determinada pela utilização de um ensaio colorimétrico para a medição de incorporação de BrdU. A densidade óptica (OD) foi determinada a 450 nm usando uma leitora de ELISA. Os dados indicam a média ± SD de 3 experiências separadas.

Figura 5: Docking de (R) Composto 34 ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogénio são mostradas).

Figura 6: Docking de (S) Composto 34 ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogénio são mostradas).

Figura 7: Docking de (R) Composto 35 ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de 11 hidrogénio são mostradas).

Figura 8: Docking de (S) Composto 35 ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogénio são mostradas).

Figura 9: Docking de (R) Composto 39 ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogénio são mostradas).

Figura 10: Docking de (S) Composto 39 ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogénio são mostradas).

Figura 11: Docking de mesalamina ao receptor de PPARy (rotulagem de resíduos de aminoácido e ligação de hidrogénio são mostradas).

Figura 12: Síntese esquemática e Resolução subsequente do Composto 39. EXEMPLO 1 Método de Preparação de ácido (±)-2-hidroxi-3-(3'- aminofenil)- propanóico (Composto 20)

Etapa 1 3-Nitrobenzaldeído (45,39, 0,3 mol), N-acetilglicina (42,1 g, 0,36 mol) e acetato de sódio (329, 0,39 mol) foram misturados com anidrido acético (142 ml, 1,5 mol) e a mistura resultante aquecida com agitação a 120 °C por 6 12 horas, dando uma solução escura. A mistura foi então arrefecida até a RT durante a noite, resultando na formação de um sólido precipitado. A mistura de reacção foi vertida em água gelada (130 g) e o sólido suspenso resultante foi colhido por filtração. O produto sólido bruto (72 g) foi lavado com acetona (80 ml), depois recristalizado a partir de acetona quente (320 ml) para dar um sólido cristalino que foi lavado com 50 % de etanol aquoso, então seco a 40 °C/40 mmHg para dar 2-metil-4-(3-nitrobenzilideno)oxazol-5 (4H)— ona (49, 09, 78 %) como agulhas amarelas pálidas. ΧΗ RMN (δ, 250 MHz, CDC13) = 2,47 (3H, s), 7,15 (1 H, s), 7,63 (1 H, dd, 8,2 & 7,6 Hz), 8,27 (1 H, d, 8,2 Hz), 8,34 (1 H, d, 7, 6 Hz) , 9, 02 (1 H, s) .

Etapa 2 2-Metil-4-(3-nitrobenzilidene)oxazol-5(4H)-ona (52,0 g, 0,224 mol) foi misturado com ácido cloridrico 3M (1,3 1) e a suspensão agitada a 100 °C por 6 h. A suspensão resultante foi agitada à RT durante a noite, depois o sólido suspenso foi colhido por filtração, lavado com água (2 x 40 ml), depois seco a vácuo para dar ácido 2-hidroxi-3-(3-nitrofenil)acrílico (29,3 g) . O filtrado combinado e as lavagens foram extraídos com acetato de etilo (4 x 0,5 1), depois os extractos orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio e concentrados até a secura para dar um outro grupo de ácido 2-hidroxi- 3-(3-nitrofenil)acrílico (12,0 g) . A produção total de ácido 2-hidroxi-3-(3-nitrofenil)acrílico foi 41,3 g (88 %). ΧΗ RMN (δ, 250 MHz, DMSO-d6) : 6,56 (1 H, s) , 7,64 (1 H, t, 8 Hz), 8,0-8,1 (2H, m) , 8,78 (1 H, s) , 9,95 (1 H, s 1), 12,80 (1 H, s 1) .

Etapa 3

Etóxido de sódio (1,8 g, 26,4 mmol) foi adicionado em porções a 0 °C a uma solução agitada de ácido 2-hidroxi-3- 13

(3- nitrofenil)acrílico (5,25 g, 25,0 mmol) em metanol (131 ml) para formar uma solução amarela pálida clara. Boroidreto de sódio (1 g, 26,4 mmol) foi então cuidadosamente adicionado em duas porções e a mistura agitada a 5-10 °C por 30 min. Uma pequena quantidade de água foi então adicionada para extinguir a reacção e destruir qualquer NaBH4 em excesso. O metanol foi removido a vácuo para dar um resíduo sólido, que foi moído com uma mistura 5:2 de acetato de etilo e heptano (21 ml), depois outra moagem com 3 % de metanol aquoso. O sólido resultante foi colhido por filtração e seco a vácuo para dar ácido 2-hidroxi-3-(3-nitrofenil)propiónico (3,0 g, 57 %). 1H RMN (δ, 250 MHz, DMSO-de) = 2, 97 (1 H, dd, 14 & 8,2 Hz), 3.15 (1 H, dd, 14 & 4,2 Hz) , 4,23 d H, dd, 8,2 & 4,2 Hz), 7,58 (1 H, t, 8 Hz ), 7,70 (1 H, d, 8 Hz), 8, 0-8,15 (2H, m). Etapa 4 Uma mistura de ácido 2 -hidroxi-3- (3- nitrofenil)propiónico (3,0 g, 14,2 mmol), metanol (129 ml) e 5 % de paládio em carvão activado (600 mg, 2 % em moles)

foi hidrogenada em 69 kPa em atmosfera de H2 por 1 h. A mistura foi então filtrada através de celite, a torta do filtro foi lavada com metanol e os filtrados concentrados a 40 °C sob alto vácuo para dar o produto como um sólido espumoso. Este foi dissolvido em água e a solução seca por congelamento para dar ácido (±)-2-hidroxi-3-(3'-aminofenil)propiónico (2,6 g, 100 %) como um sólido branco. ΧΗ RMN (δ, 250 MHz, DMSO-d6) : 2,61 (1 H, dd, 13.6 & 8,3 Hz), 2,81 (1 H, dd, 13.6 & 4,6 Hz), 4,09 (1 H, dd, 8,25 & 4,6 Hz), 6, 35-6, 43 (2H, m) , 6,45 (1 H, d, 1 Hz), 6,90 (1 H, t, 30 7, 6 Hz) . EXEMPLO 2 Método de Preparação de ácido (±)-2-hidroxi-3-(4'-aminofenil)-acético (Composto 23) 14

OH KOH, CHC1; ΚΟΗ,ΜεΟΧ ^

NHAC W^-mhAc COOH

Etapa 1

Uma solução de hidróxido de potássio (6,72 g, 0,12 mol) em metanol (25 ml) foi adicionada a uma solução arrefecida (-7 °C) de 4- acetamidobenzaldeido (24,5 g, 0,15 mol) e clorofórmio (40,1 g, 0,33 mol) em DMF (100 ml) numa taxa tal que mantenha a temperatura abaixo de -5 °C. A mistura foi deixada aquecer até 2 °C durante 5,5 h, então ela foi adicionada a uma mistura de HC1 aq. 1M (200 ml) e tolueno (200 ml) e agitada durante a noite. O 2 — (4 — acetamidofenil)-triclorocarbinol resultante foi colhido por filtração (29 g) e seco por sucção.

Etapa 2

As soluções de 2-(4-acetamidofenil)-triclorocarbinol (14,0 g, 49,5 mmol) em metanol (330 ml) e hidróxido de potássio (13,8 g, 250 mmol) em metanol (150 ml) foram combinadas e a mistura aquecida até 70-80 °C por 3 h. Após o resfriamento, o subproduto de KCl foi removido por filtração, depois a concentração do filtrado a vácuo deu ácido 2-(4-acetamidofenil)-2- metoxiacético (14 g) como um sólido branco.

Etapa 3 O ácido 2-(4-acetamidofenil)-2-metoxiacético (7,1 g, 31,8 mmol) foi aquecido com hidrazina monoidratada (40 ml) por 16 h, arrefecido e concentrado a vácuo. O óleo residual resultante foi purificado por cromatografia de coluna de silica gel (eluente 20-40 % de metanol em CH2CI2) para dar 2,69 (45 %) de ácido (±)-2-metoxi-2-(4'-aminofenil)-acético 15 ΧΗ RMN (δ, 250 ΜΗζ, CD3OD) : 3,27 (3Η, s) , 4,43 (1 Η, s) , 6,66 (2Η, d, 8,5 Ηζ) , 7,18 (2Η, d, 8,2 Ηζ) . EXEMPLO 3 Método de Preparação de ácido (±)-2-hidroxi-3-(4'-aminofenil)-acético (Composto 23)

Etapa 1 3-Nitrobenzaldeído (25 g, 165 mmol) e clorofórmio (30 ml, 375 mmol) foram dissolvidos em DMF (100 ml) e a solução arrefecida até entre - 5 °C e -10 °C. Uma solução fresca de hidróxido de potássio (7,5 g, 134 mmol) em metanol (22,5 ml) foi adicionada vagarosamente de forma a manter a temperatura interna <-5 °C. A reacção foi mantida em <-5 °C por 2 h e então extinta com uma mistura arrefecida de ácido clorídrico aquoso (225 ml) em tolueno (225 ml) . A solução foi deixada aquecer vagarosamente até a temperatura ambiente durante a noite em banho de gelo. Após este tempo, a camada de tolueno foi separada e a camada aquosa também extraida com tolueno. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (2 x 225 ml) , solução 5 % de bicarbonato de sódio (225 ml) e água (225 ml) . A solução foi seca (MgS04) , filtrada, e concentrada a vácuo para dar 2-(3-nitrofenil)- triclorocarbinol como um sólido laranja (42 g, 155 mmol, 94 %). RMN (δ, 250 MHz, CDC13) : 3,7 (s 1, 1 Η) , 5,4 (s, 1 Η) , 7,6 (t, 1 H, 8,0 Hz), 8,0 (d, 1 H, 8,0 Hz), 8,3 (d, 1 H, 8, 0 Hz) , 8,5 (s, 1 H) .

Etapa 2 16 2-(3-Nitrofenil)-triclorocarbinol (20 g, 74 mmol) foi dissolvido em etanol absoluto (74 ml) e uma solução de hidróxido de potássio (20,7 g, 369 mmol) em etanol absoluto (150 ml) foi adicionado vagarosamente. A solução foi aquecida em refluxo por 4 h, deixada arrefecer e então concentrada a vácuo. O resíduo foi acidificado com ácido clorídrico diluído e o produto extraído em acetato de etilo (x 3) . As camadas orgânicas combinadas foram secas (MgS04) , filtradas e concentradas a vácuo para dar ácido 2-etoxi-2-(3- nitrofenil)acético como um sólido castanho (6,4 g, 28,4 mmol, 38 %). RMN (δ, 250 MHz, CD3OD) : 1,0 (t, 3H, 7,0 Hz), 3.6 (m, 1 H) , 3.7 (m, 1 H), 5,1 (s, 1 H), 7,7 (t, 1 H, 7,8 Hz), 7,9 (d, 1 H, 7,8 Hz), 8,3 (d, 1 H, 7,8 Hz), 8,4 (s, 1 H) . Etapa 3 Ácido 2-etoxi-2-(3-nitrofenil)acético (6,49, 28,4 mmol) foi dissolvido em etanol absoluto (500 ml), 5 % de paládio em carbono (húmido) (1,5 g) adicionado e a mistura hidrogenada em 413 kPa durante a noite. A suspensão foi filtrada através de celite e o filtrado concentrado para dar ácido (±)-2-etoxi-2-(3'-aminofenil)acético (3,0 g, 15,3 mmol, 54 %) como um sólido castanho. XH RMN (δ, 250 MHz, CD3OD) : 1,2 (t, 3 H, J = 6, 9 Hz) , 3.5 (m, 1 H), 3.6 (m, 1 H) , 4,6 (s, 1 H) , 6,7 (d, 1 H, J = 7.6 Hz), 6,9 (m, 2 H) , 7,0 (t, 1 H, J = 7,6 Hz). EXEMPLO 4 Método de Preparação de ácido (±)-2-etoxi-2-(4'-aminofenil)-acético (Composto 33)

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Etapa 1

Veja-se "etapa 1 do composto 23"

Etapa 2

Soluções de 2-(4-acetamidofenil)-triclorocarbinol (14,0 g, 49,5 mmol) em etanol (400 ml) e hidróxido de potássio (13,8 g, 250 mmol) em etanol (150 ml) foram combinadas e a mistura aquecida a 70-80 °C por 2,5 h. A mistura foi arrefecida, filtrada para remover o subproduto de KC1, e concentrada a vácuo para dar ácido 2-(4-acetamidofenil)-2-etoxiacético (14 g) como um sólido amarelo.

Etapa 3 Ácido 2-(4-acetamidofenil)-2-etoxiacético (7,54 g, 31,8 mmol) foi aquecido com hidrazina monoidratada (40 ml) por 16 h, a mistura arrefecida e depois concentrada a vácuo. O óleo residual foi então purificado por cromatografia em coluna de silica (20-40 % de metanol em eluente de CH2CI2) para dar ácido (±)-2 -etoxi-2-(4'-aminofenil) acético (2,3 g, 37 %) como uma espuma branca. EXEMPLO 5 Método de Preparação de ácido (±)-2-metoxi-3-(4-aminofenil)- propiónico (Composto 34) CO^l AíHtf^>COOH f**)» M%SOí,CsiCOi r NíOAt, AC]Q g íS “ Λ |l V KJ MO* NOj

NaOH, HjO ^-OMe H,,S%Pd-C

MsOH

MsQH

Etapa 1 4-Nitrobenzaldeído (53,79, 0,356 mol), N-acetilglicina 18 (49,99, 0,427 mol) e acetato de sódio (37,99, 0,463 mol) foram misturados com anidrido acético (168 g, 1,78 mol) e a mistura resultante aquecida com agitação até 120 °C por 6 h, dando uma suspensão escura. A mistura foi então arrefecida até a RT durante a noite, resultando na formação de um sólido precipitado. A mistura de reacção foi vertida em água gelada (150 g) e o sólido suspenso resultante foi colhido por filtração. O produto sólido bruto foi lavado com acetona (100 ml), depois recristalizado a partir de acetona quente (650 ml) para dar um sólido cristalino que foi lavado com 50 % de etanol aquoso, então seco a vácuo para dar 2-metil-4-(4-nitrobenzilideno)oxazol-5(4H)-ona (55,08, 66 %) como agulhas amarelas pálidas. Os licores mãe de cristalização e as lavagens foram combinados e evaporados para dar um residuo sólido que foi recristalizado a partir de acetona para dar um segundo grupo de 2-metil-4(4- nitrobenzilideno)oxazol-5(4H)-ona (8 g, 10 %) . A produção combinada de 2- metil-4-(4- nitrobenzilideno)oxazol-5(4H)-ona foi 639 (76 %) . ΧΗ RMN (δ, 250 MHz, CDC13) = 2,47 (3H, s) , 7,14 (1 H, s) , 8,28 (4H, m) .

Etapa 2 2-Metil-4-(4-nitrobenzilidene)oxazol-5 (4H)-ona (63, 0 g, 0,272 mol) foi misturada com ácido clorídrico 3M (1,2 1) e a suspensão foi agitada a 100 °C por 6 h. A suspensão resultante foi agitada à RT durante a noite, depois o sólido suspenso foi colhido por filtração, lavado com água (2 x 50 ml) , depois seco a vácuo para dar ácido 2-hidroxi-3-(4- nitrofenil) acrílico (46, 69, 81 %) . O filtrado e as lavagens combinados foram extraídos com acetato de etilo (4 x 0,5 1), depois os extractos orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio e concentrados até a secura para conseguir um outro grupo de ácido 2-hidroxi-3-(4- 19 nitrofenil)acrílico (0,8 g, 1 %). A produção total de ácido 2-hidroxi-3-(4-nitrofenil)acrílico foi 47,4 g (82 %) . XH RMN (δ, 250 MHz, DMSO- -d6) = 6,52 d H, s), 8,01 (2H, d, 8,5 Hz) , 8,22 (2H, d, 8 ,5 Hz) . Etapa 3 Uma mis fura de ácido 2- hidroxi-3-(4- nitrofenil)acrílico (15 g, 71,7 mmol), carbonato de césio (56 g, 172,1 mmol) e sulfato de dimetilo (14,2 ml, 150,6 mmol) em DMF (270 ml) foi agitada à RT por 18 h. Água (220 ml) e acetato de etilo (150 ml) foram adicionados e as camadas separadas. A camada aquosa foi também extraída com acetato de etilo (4 x 100 ml), depois os orgânicos combinados foram lavados com água (6 x 100 ml), salmoura (2 x 120 ml) e concentrados até metade do volume. O heptano foi adicionado (70 ml) e a mistura concentrada até um volume de 200 ml. O sólido precipitado resultante foi colhido por filtração, lavado com heptano (2 x 100 ml) e seco por sucção no filtro para produzir 2-metoxi-3-(4-nitrofenil)acrilato de metilo como um sólido queimado (9,2 g, 54 % de rendimento) contendo um traço de heptano. 1H RMN (5, 250 MHz, DMSO-d6) : 3,82 (s, 3-H, OMe), 3,84 (s, 3-H, OMe), 7,02 (s, 1-H, CH=) , 8,04 (d, 2-H, CHaromático), 8,26 (d, 2-H, CHaromático).

Etapa 4

2-metoxi-3-(4-nitrofenil)acrilato de metilo (7,8 g, 32,8 mmol) foi dissolvido em IMS (156 ml) . Uma solução de NaOH (1,44 g, 36,1 mmol) em água (78 ml) foi adicionada e a mistura agitada à temperatura ambiente (18 °C) por 18 h. A mistura de reacção foi acidificada com HC1 1M (120 ml) e o sólido precipitado resultante foi colhido por filtração, lavado com água (2 x 100 ml) e parcialmente seco por sucção no filtro por 30 min, seguida por secagem em forno a vácuo a 18 °C por 18 h. Assim, ácido 2-metoxi-3-(4- 20 nitrofenil)acrílico foi produzido como um sólido queimado contendo alguma água de cristalização (6,7 g, 91 %) . RMN (Ô, 250 MHz, DMSO-d6) : 3,83 (s, 3-H, OMe) , 6,97 (s, 1-H, CH=) , 8,02 (d, 2-H, CHaromático) , 8,25 (d, 2-H, CHaromático).

Etapa 5 Ácido 2-Metoxi-3-(4-nitrofenil)acrílico (6,7 g, 30 mmol) foi colocado em metanol (700 ml) e THF (300 ml) e 10 % Pd em C (base húmida) (0,67 g) foi adicionado. A mistura foi hidrogenada em 310 kPa por 43 min, seguido por recargas repetidas em 310-331 kPa a camada hora por 3 h e finalmente 331 kPa por 18 h. A suspensão resultante foi filtrada através de papel de filtro GF/F e o resíduo de filtro lavado com MeOH (200 ml) . Os filtrados foram concentrados até um sólido branco-pérola. O sólido foi transformado em pasta em IMS (75 ml) a 20 °C por 1,5 h, filtrado, e lavado com IMS/heptano (1:2) (20 ml) e seco no filtro por 1 h para produzir ácido (±)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil)-propiónico como um sólido branco-pérola (5,1 g, 88 % de rendimento). ΧΗ RMN (δ, 250 MHz, DMSO-d6) : 2,74 (m, 2-H), 3.23 (s, 3-H, CH3) , 3.80 (dd, 1-H, CH) , 6,47 (d, 2-H, aromático), 6,87 (d, 2-H, aromático). EXEMPLO 6 Método de Preparação de ácido (±)-2-metoxi-3-(3'-aminofenil)- propiónico (Composto 35) 21

HCW j**" vrí MejSÕji

Etapas 1 e 2

Como para o composto 20 Etapa 3

Sulfato de dimetilo (13,23 g, 105 mmol) foi adicionado a uma mistura agitada de ácido 2-hidroxi-3-(3-nitrofenil)acrílico (10,5 g, 50,0 mmol) e carbonato de césio (39,1 g, 120 mmol) em DMF (105 ml) para formar uma mistura amarela pálida clara, que foi agitada à RT durante a noite. A suspensão vermelha escura resultante foi concentrada a vácuo e o resíduo dividido entre água (100 ml) e diclorometano (150 ml). A camada orgânica foi separada, depois lavada com água (2 x 100 ml) , seca sobre sulfato de sódio e filtrada através de sílica gel. A solução amarela resultante foi evaporada até a secura a vácuo para dar 2-metoxi-3-(3-nitrofenil)acrilato de metilo como um sólido amarelo (8,1 g, 67 %). ΧΗ RMN (δ, 250 MHz, DMSO-d6) = 3,81 (3H, s), 3,83 (3H, s), 7,08 (1 H, s), 7,71 (1 H, dd, 7,9 & 8,2 Hz), 8,10-8,22 (2H, m) , 8, 66 (1 H, s) .

Etapa 4

Uma solução de hidróxido de potássio (2,0 g, 35,9 mol) em água (25 ml) foi adicionada a uma solução agitada de 2-metoxi-3-(3- nitrofenil)acrilato de metilo (8,1 g, 34,2 mmol) em metanol (150 ml) e a mistura resultante foi 22 agitada à RT durante a noite. Uma outra quantidade de KOH (0,5 g, 8,9 mmol) em água (10 ml) foi adicionada e a mistura aquecida a 80 °C por 1 h. O metanol foi então evaporado a vácuo e o resíduo diluído com água (200 ml). A solução foi lavada com diclorometano (2 x 100 ml), filtrada através de um bloco de celite e então acidificada pela adição de HC1 3M até pH 3. A mistura foi refrigerada por 18 h, depois o sólido precipitado foi colhido por filtração, lavado com água (3x30 ml) e seco a vácuo a 40 °C para dar ácido 2-metoxi-3-(3-nitrofenil)acrílico como um sólido amarelo (6,4 g, 84 % ) · XH RMN (δ, 250 MHz, DMSO-de) = 3,82 (3H, s), 7,02 d H, s) , 7,70 (1 H, t, H, s) . 7, 93 Hz), 8,10 - 8,22 (2H, m) , 8, 65 d

Etapa 5

Uma mistura de ácido 2-metoxi-3-(3-nitrofenil)acrílico (3,4 g, 15,25 mmol), metanol (340 ml) e 5 % de paládio em carvão activado (1,36 g, 4 % em moles) foi hidrogenada a 82 a 248 kPa, em atmosfera de H2 por 1,5 h. A mistura foi então filtrada através de celite, a torta do filtro lavada com metanol e os filtrados concentrados a 40 °C sob vácuo para dar o produto como um sólido espumoso. Este foi dissolvido em água (100 ml) e a solução seca por congelamento para dar ácido (±)-2-metoxi-3-(3'-aminofenil)-propiónico (2,6 g, 100 %) como um sólido branco-pérola. ΧΗ RMN (δ, 250 MHz, DMSO-d6) = 2,68 (1 H, dd, 13,9 & 8 Hz), 2,80 (1 H, dd, 13,9 & 4,6 Hz), 3,21 (3H, s) , 3,84 (1 H, dd, 8,25 & 4,6 Hz), 6, 36-6, 44 (3H, m) , 6,91 (1 H, dd, 7,6 Hz) . EXEMPLO 7 Método de Preparação de ácido (±)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil)- propiónico (Composto 39) . Resolução

Enantiomérica (Figura 12) 23

Etapas 1 e 2

Como para o composto 34, etapas 1 e 2

Etapa 3 Ácido 2-hidroxi-3-(4-nitrofenil)acrílico (20 g, 95,6 mmol) foi suspenso em DMF (200 ml). CS2C03 (74, 99, 229,9 mmol) e sulfato de dietilo (26,3 ml, 201 mmol) foram adicionados e a dissolução foi observada. Após agitação por 18 h a 18 °C, água (350 ml) e acetato de etilo (250 ml) foram adicionados e as camadas separadas. A camada aquosa foi também extraída com acetato de etilo (5 x 200 ml) , depois os extractos orgânicos combinados foram lavados com água (2 x 200 ml) , salmoura (2 x 200 ml) e secos sobre sulfato de magnésio. Os extractos orgânicos foram concentrados até a secura para obter 2-etoxi-3-(4- nitrofenil)acrilato de etilo como um sólido laranja contendo 3,6 % em massa de DMF (27,6 g húmido, >100 % de rendimento). ΧΗ RMN (δ, 250 MHz, DMSO-d6) : 1,32 (t, 6-H, 2 x CH2CH3), 4,13 (q, 2-H, CH2CH3) , 4,30 (q, 2-H, CH2CH3) , 6,99 (s, 1-H, CH=) , 8,06 (d, 2-H, CHaromático) , 8,26 (d, 2-H, CHaromático).

Etapa 4 2-Etoxi-3_(4-nitrofenil)acrilato de etilo contendo 3,6 % em peso de DMF (26,07 g corrigido, 98,3 mmol) foi dissolvido em IMS (500 ml) e uma solução de NaOH (1,44 g, 36,1 mmol) em água (260 ml) foi adicionada. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 18 h, depois acidificada com HC1 1M (120 ml) e o sólido resultante colhido por filtração, lavado com água (2 x 100 ml) e seco por sucção no filtro por 30 min, seguido por secagem em forno a vácuo a 18 °C por 18 h. O ácido 2- hidroxi-3-(4- nitrofenil)acriiico foi assim obtido como um sólido laranja contendo água de cristalização (18,4 g, 79 %). ΧΗ RMN (δ, 250 MHz, DMSO-de) : 1,31 (t, 3-H, Me), 4,11 (q, 2-H, CH2) , 6,98 (s, 1-H, CH=) , 8,05 (d, 2-H, CHaromático), 8,25 (d, 2-H, CHaromático).

Etapa 5 Ácido 2-hidroxi-3-(4-nitrofenil)acrílico (18,4 g húmido, cerca de 77,5 mmol) foi dissolvido em MeOH (1,1 1) e 10 % Pd em C (base húmida) (1,84 g) foi adicionado. A mistura foi hidrogenada a 82 kPa por 10 min, seguido por recarga repetida a 138-193 kPa a cada 10-20 min por 5 h, depois a 317 kPa por 18 h. A mistura foi filtrada através de papel GF-F e o residuo foi transformado em pasta em IMS (100 ml), filtrado, lavado com heptano (100 ml) e seco por sucção no filtro. Assim, ácido (±)-2-etoxi 3 — (4' — aminofenil)-propiónico foi obtido como um sólido branco-pérola (11,2 g, 69 %). ΧΗ RMN (δ, 250 MHz, DMSO-d6) : 1,03 (t, 3-H, CH3) , 2,73 (m, 2-H,), 3.29 (m, IH) , 3.46 (m, 1 H) , 3.80 (dd, 1-H) , 6,50 (d, 2-H), 6,87 (d, 2- H) . EXEMPLO 8 Método de preparação de ácido (±)-2-etoxi-3-(3'-aminofenil)-propanóico (Composto 40)

25 CKO

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H;,íííp«: j'· 3*SeOH ‘Et «Qi ÇOsH '^O!

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Etapas 1 e 2

Como para o composto 20, etapas 1 e 2 Etapa 3

Sulfato de dietilo (12 g, 78,2 mmol) foi adicionado a uma mistura agitada de ácido 2-hidroxi-3-(3-nitrofenil)acrilico (6,1 g, 30,0 mmol) e carbonato de césio (29,3 g, 90 mmol) em DMF (61 ml) para formar uma mistura amarela clara pálida, que foi agitada à RT durante a noite. A suspensão vermelha escura resultante foi aquecida até 50 °C por 4 h, então concentrada a vácuo e o residuo dividido entre água (100 ml) e diclorometano (150 ml). A camada orgânica foi separada, depois lavada com água (2 x 100 ml) , seca sobre sulfato de sódio e filtrada através de um bloco de silica gel. A solução amarela resultante foi evaporada até a secura a vácuo para dar 2-etoxi-3- (3-nitrofenil)acrilato de etilo como um sólido amarelo (5,6 g, 72 %) .

Etapa 4

Uma solução de hidróxido de potássio (1,3 g, 22,2 mol) em água (20 ml) foi adicionada a uma solução agitada de 2-etoxi-3-(3- nitrofenil)acrilato de etilo (5,6 g, 21,1 mmol) em metanol (100 ml) e a mistura resultante aquecida até o refluxo durante a noite. 0 metanol foi então evaporado a vácuo e o residuo diluido com água (150 ml). A solução foi lavada com diclorometano (2 x 80 ml) , filtrada através de 26 um bloco de celite e então acidificada pela adição de HC1 3M até pH 3. A mistura foi refrigerada por 18 h, depois o sólido precipitado foi colhido por filtração, lavado com água (3x30 ml) e seco a vácuo a 40 °C. O sólido resultante foi recristalizado a partir de acetato de etilo e heptano para dar ácido 2-etoxi-3-(3- nitrofenil)acrílico como um sólido amarelo (3,06 g, 61 %) . ΧΗ RMN (δ, 250 MHz, DMSO-d6) = 1,34 (3H, t, 7 Hz), 4,10 (2H, q, 7 Hz), 7,04 (1 H, s), 7,69 (1 H, t, 7,93 Hz), 8, 07-8,22 (2H, m), 8,80 (1 H, m) , 13,25 (1 H, s 1) .

Etapa 5

Uma mistura de ácido 2-etoxi-3-(3-nitrofenil)acrílico (3,06 g, 12,9 mmol) , metanol (150 ml) e 5 % de paládio em carvão activado (0,60 g, 2 % mol) foi hidrogenada a 82 a 207 kPa, em atmosfera de H2 por 2 h. A mistura foi então filtrada através de celite, a torta do filtro lavada com metanol e os filtrados concentrados a 40 °C sob vácuo para dar o produto como um sólido espumoso. Este foi dissolvido em água (100 ml) e a solução seca por congelamento para dar ácido (±)-2-etoxi-3-(3'-aminofenil) - propanóico (2,79, 100 %) como um sólido branco-pérola. XH RMN (δ, 250 MHz, DMSO-d6) = 1,07 (3H, t, 7 Hz), 2,6 - 2,85 (2H, m) , 3,20 - 3, 38 (1 H, m) , 3, 40 - 3, 60 (1 H, m) , 3,92 (1 H, dd, 5 & 7,7 Hz), 6,3-6,45 (3H, m) , 7,01 (1 H, t, 7,6 Hz) . EXEMPLO 9

Modelagem Molecular

Os estudos de modelagem molecular foram realizados usando um software SYBYL 6.9.1 (Tripos Associates Inc™, St Louis, MO) que se executa em estações de trabalho Silicon Grafics™. O modelo tridimensional dos zwitteriões de 5-ASA foi crescido de uma colheita de fragmentos padrão, e sua geometria foi subsequentemente optimizada usando o campo de 27 força Tripos (3). Como o pKa dos compostos é ainda desconhecido, a calculadora online SPARC foi usada para determinar a espécie que ocorre em pH fisiológico (7,4) (http://ibmlc2.chem.uga/sparc/index.cfm). Os modelos tridimensionais de compostos ionizados foram crescidos de uma colheita de fragmentos padrão, e sua geometria foi subsequentemente optimizada usando o campo de força Tripos (3) incluindo o termo electrostático calculado de cargas atómicas de Gasteiger e Huckel. 0 método de Powell disponível no procedimento Maximin2 foi usado para minimização de energia até o valor de gradiente ser menor que 0,001 kcal/mol.Â. A estrutura do dominio de ligação de ligando de PPARy foi obtida de sua estrutura de cristal de raio X complexa com o tesaglitazar (AZ 242) disponibilizado no Banco de Dados de Proteina RCSB (1171) (4,5). A docking flexivel dos compostos no sitio activo receptor foi realizada usando software GOLD (6). Os modelos de docking mais estáveis foram seleccionados de acordo com a melhor conformação conseguida prevista pelo Goldscore (6) e as funções de classificação X (7). Os complexos foram minimizados em energia usando o método de Powell no procedimento de Maximin2 com o campo de força Tripos e uma constante dielétrica de 4,0 até que o valor de gradiente alcançasse 0,01 kcal/mol. Â. A função de recozimento foi usada definindo o ligando numa região quente (10 Â) e uma região interessante (15 Â).

RESULTADOS

Os estudos de docking de receptor de modelagem molecular previram que, em geral, o enantiómero S é mais activo que o enantiómero R, mesmo se o enantiómero R mostrar actividade também. Este fenómeno de um enantiómero ser mais biologicamente activo é bem conhecido. 28

Como consequência, a presente invenção fornece um método para resolver os compostos em enantiómeros. 0 método de resolução para o composto 32 é mostrado esquematicamente na Figura 11.

Embora não se deseje estar ligado a nenhuma teoria, acredita-se que os enantiómeros S dos compostos vão fornecer maior actividade. Os resultados dos estudos de docking são mostrados nas Figura 5-10. EXEMPLO 7 Método de Preparação de ácido (±)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil)- propiónico (Composto 39) . Resolução Enantiomérica (Figura 12)

Etapas 1 e 2

Como para o composto 34, etapas 1 e 2 Etapa 3 Ácido 2-hidroxi-3-(4-nitrofenil)acrílico (20 g, 95,6 mmol) foi suspenso em DMF (200 ml). CS2CO3 (74, 99, 229,9 mmol) e sulfato de dietilo (26,3 ml, 201 mmol) foram adicionados e a dissolução foi observada. Após agitação por 18 h a 18 °C, água (350 ml) e acetato de etilo (250 ml) foram adicionados e as camadas separadas. A camada aquosa foi também extraída com acetato de etilo (5 x 200 ml) , depois os extractos orgânicos combinados foram lavados com água (2 x 200 ml) , salmoura (2 x 200 ml) e secos sobre 29 sulfato de magnésio. Os extractos orgânicos foram concentrados até a secura para obter 2-etoxi-3- (4- nitrofenil)acrilato de etilo como um sólido laranja contendo 3,6 % em massa de DMF (27,6 g húmido, >100 % de rendimento). RMN (δ, 250 MHz, DMSO-d6) : 1,32 (t, 6-H, 2 x CH2CH3), 4,13 (q, 2-H, CH2CH3) , 4,30 (q, 2-H, CH2CH3) , 6,99 (s, 1-H, CH=) , 8,06 (d, 2-H, CHaromático) , 8,26 (d, 2-H, CHaromático).

Etapa 4

2-Etoxi-3-(4-nitrofenil)acrilato de etilo contendo 3,6 % em peso de DMF (26,07 g corrigido, 98,3 mmol) foi dissolvido em IMS (500 ml) e uma solução de NaOH (1,44 g, 36,1 mmol) em água (260 ml) foi adicionada. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 18 h, depois acidificada com HC1 1M (120 ml) e o sólido resultante colhido por filtração, lavado com água (2 x 100 ml) e seco por sucção no filtro por 30 min, seguido por RESULTADOS A activação de PPARy resulta numa cascata de reacções, levando a uma ligação a elemento de sequência de DNA específicos chamados de elementos de resposta proliferadores de peroxissoma (PPRE) (7-9).

Foi investigada a actividade transcricional de PPARy por transfecções transientes de células epiteliais com os plasmídeos de PPRE de renilla luciferase. Para avaliar se as novas moléculas têm mais eficácia do que 5-ASA para estimular a activação de PPARy, foram testadas estas moléculas numa concentração de 1 mM. O efeito das novas moléculas numa concentração de 1 mM foi comparado com 5-ASA, usado como o controlo positivo numa concentração óptima de 30 mM e 10”5 M, respectivamente. As células foram estimuladas com as diferentes moléculas durante 24 h. 30 A análise da actividade de PPARy em células HT-29 transfectadas mostrou que as novas moléculas 34, 39, 35 e 40 em 1 mM aumentaram a actividade de gene repórter por 4,8 ± 0,71; 2,73 ± 0,31; 2,64±0,46; 3,4+0,97 vezes, respectivamente, desta forma exibindo uma actividade similar ou superior a 5-ASA a 30 mM (2,8±0,7) e rosiglitazona a 10”5M (3,17±0,29). A Figura 2 representa todos os resultados obtidos para cada molécula avaliada em 2 ou 3 experimentos feitos em triplicata. A reprodução entre os experimentos diferentes é boa e similar aos dados descritos na literatura.

Este estudo permitiu identificar 4 novas moléculas tendo de 30 a 50 vezes mais eficácia do que 5-ASA para activar PPARy. EXEMPLO 11

Crescimento de células de cancro de cólon

As seguintes substâncias 20, 34, 35, 39 e 40 foram testadas quanto à sua capacidade de modular o crescimento de células de cancro de cólon. Para este propósito, três linhas celulares de carcinoma de cólon humano (isto é, HT-29, HT-115 e DLD1) foram usadas. Estes tipos de células foram seleccionados na base da expressão de ciclooxigenase-2 (COX-2). Na verdade, as células de HT-115 expressam um COX-2 biologicamente activo, as células de HT-29 expressam uma isoforma de COX-2 não-funcional, e DLD-1 são células deficientes em COX-2. Acredita-se que estas moléculas sejam também activas nas células que não expressam COX-, e assim as moléculas da presente invenção podem ser usadas em células que não expressam COX-2 para os propósitos de tratamento de tumor e outras aplicações descritas aqui.

As células de HT-29 e DLD-1 foram cultivadas nos meios McCoy e RPMI1640, respectivamente, suplementadas com 10 % de soro bovino fetal (FBS), 1 % de 31 penicilina/estreptomicina (P/S) e 50 mg/ml de gentamicina. HT-115 foram cultivadas no meio DMEM suplementado com 15 % de FBS e 1 % de P/S. As células foram mantidas numa incubadora umedecida a 37 °C, na presença de 5 % de C02.

Para análises do crescimento celular, as suspensões de o célula única foram colocadas em placas em 2 x 10 células/poço (4 x 103 células/poço para HT115) em placas de cultura com 96 poços em meio contendo 0,5 % FBS e deixadas aderir. As células não-aderentes foram então removidas, e meio fresco contendo 0,5 % FBS foi adicionado em cada poço. As células foram cultivadas na presença ou na ausência das substâncias especificadas. Cada substância foi dissolvida como uma solução de carga de 25 mM no meio de cultura contendo 0,5 % FBS, e o pH de cada solução de carga foi ajustado para 7,4. Se necessário, com NaOH. As substâncias foram usadas numa concentração final variando de 0,5 a 10 mM.

A proliferação celular foi determinada pela medição da incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) em DNA usando um kit de proliferação de célula comercialmente disponibilizado (Roche Diagnostics™, Monza, Itália). BrdU foi adicionado às culturas celulares durante as últimas 6 horas de incubação, e o nivel de células positivas de BrdU foi avaliado após 48 horas de cultura por ensaio imunossorvente ligado por enzima (ELISA). A densidade óptica (OD) foi determinada a 450 nm usando uma leitora de ELISA. Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados são relatados como a média ± desvio padrão (SD). RESULTADOS

Os compostos diferiram em sua capacidade de inibir o crescimento de células de cancro do cólon. Os resultados são mostrados no quadro 1, onde a percentagem de inibição do crescimento de células de DLD- 1 pelos compostos 32 especificados é mostrada. A substância 20 exibe um efeito anti-proliferativo notável, numa maneira dependente da dose, em cada uma das três linhas celulares testadas (Fig. 3 e 4) . Mais que 90 % da inibição de crescimento celular foram vistos quando os compostos foram usados numa concentração final de 10 mM. A capacidade do composto 20 de inibir significativamente o crescimento celular foi vista quando usado numa concentração final de 5 ou 10 mM.

Os compostos 34 e 39 reduziram levemente o crescimento celular quando usados em altas doses (10 mM) (Figura 4), mas as diferenças dentre os grupos não foram estatisticamente significativas. Similarmente, nenhuma inibição no crescimento celular foi vista em culturas adicionadas com as substâncias 35 e 40 (veja-se Quadro 1). CONCLUSÕES 0 primeiro conjunto de exemplos da presente invenção (Exemplo 10) mostra a capacidade de quatro moléculas optimizadas 34, 39, 35 e 40 na concentração de 1 mM, para aumentar a actividade de PPARy em células HT-29 transfectadas, exibindo uma actividade similar ou superior a 5- ASA a 30 mM e rosiglitazona a 10~5 M. O segundo conjunto de exemplos da presente invenção (Exemplo 9) indica que também no outro teste as moléculas exibem uma actividade similar a, ou superior a 5-ASA numa concentração de trabalho trinta vezes menor que aquela de 5-ASA, durante um periodo de 24 horas. O conjunto final de exemplos da presente invenção (Exemplo 11) mostra que os compostos afectam a inibição do crescimento das linhas de células de cancro de cólon, HT-29, HT-115 e DLD1 em graus variados. Os compostos diferiram em sua capacidade de inibir o crescimento de células de cancro no cólon. A substância 20 exibe um efeito anti-prolif erativo notável em linhas celulares testadas. 33

Estas moléculas da presente invenção são também activas nas células que não expressam COX-2, e assim as moléculas da presente invenção podem ser usadas em células que não expressam COX-2 para os propósitos de tratamento de tumores e outras aplicações descritas aqui.

CONCLUSÕES GERÀIS

Os compostos com maior classificação sintetizados, indicados dos estudos de modelagem, mostram uma actividade similar/superior àquela de mesalazina.

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REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto, e sais do mesmo, seleccionado a partir do grupo que consiste em:

2. 0 composto de acordo com a reivindicação 1 na forma R ou S enantiomericamente pura.

3. Composto seleccionado a partir do grupo que consiste em: ácido (+-)-2-hidroxi-3-(3'-aminofenil) propiónico (composto 20) ácido (+-)-2-metoxi-2-(4'-aminofenil) acético (composto 23) ácido (+-)-2-etoxi-2-(3'-aminofenil) acético (composto 32) ácido (+-)-2-etoxi-2-(4'-aminofenil) acético (composto 33) propiónico ácido (+-)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil) 2 (composto 34) ácido (+-)-2-etoxi-3-(4'-aminofenil) propiónico (composto 39) e ácido (+-)-2-etoxi-3-(3'-aminofenil) propiónico (composto 40) para utilização no campo médico.

4. Composto ácido 2-metoxi-3-(3'-aminofenil)propiónico ou ácido (±)-2-hidroxi-3-(4'-aminofenil)propiónico (composto 21) para utilização no campo médico.

5. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 3 ou reivindicação 4 em que o campo médico é o tratamento de uma doença inflamatória crónica ou um tumor que expressa PPAR e EGF.

6. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 5 em que os tumores são seleccionados a partir do grupo que consiste em tumores do esófago, estômago, pâncreas, cólon, próstata, mama, útero e anexos do útero, rins e pulmão.

7. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 6 em que o composto é ácido (+-)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil) propiónico (composto 34) ou ácido ( + -)-2-etoxi-3- (4'-aminofenil) propiónico (composto 39)

8. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 5 em que a doença inflamatória crónica é doença de Crohn ou rectocolite úlcero-hemorrágica.

9. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 8 em que o composto é ácido (+-)-2-metoxi-3-(4'-aminofenil) propiónico (composto 34) 3 ácido (+-)-2-etoxi-3-(4'-aminofenil) propiónico (composto 39) ou ácido (+-)-2-etoxi-3-(3'-aminofenil) propiónico (composto 40)

10. Composto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9 onde a utilização do composto é numa mistura em que um enantiómero está numa quantidade maior em relação ao outro, em qualquer proporção.

11. Composição farmacêutica que compreende um ou mais compostos de acordo com as reivindicações 1 a 3 como princípios activos em combinação com um ou mais excipientes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.