KR101317519B1

KR101317519B1 - Ｐｐａｒ 수용체 및 ｅｇｆ 수용체에 특이적인 화합물 및이들의 염, 및 의학 분야에서의 이들의 용도

Info

Publication number: KR101317519B1
Application number: KR1020087003953A
Authority: KR
Inventors: 지안카를로 나카리; 세르지오 바로니
Original assignee: 지울리아니 인터내셔널 리미티드
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-24
Publication date: 2013-10-15
Also published as: EA014665B3; ES2421260T3; IL205992A; EP1910270B3; AU2006271165C1; US20150045436A1; US20150265563A1; WO2007010516A2; NO20080325L; PT1910270E; ZA200801671B; AU2006271165A1; US20090048343A1; JP2009502777A; NO340680B1; CN102020577B; US8153841B2; US9133099B2; CA2616146C; EA017566B1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.

<화학식 I>

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이할 수 있으며, -H, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기를 포함하는 군으로부터 선택되거나 또는 함께 5 또는 6개의 원자를 갖는 방향족 또는 지방족 고리를 형성하고;

Y 및 Z는 동일하거나 상이할 수 있으며, -H, -OH, -COOH, -OR₃, -CH(OR₃)COOH를 포함하는 군으로부터 선택되고, 여기서 R₃은 H, 페닐, 벤질, -CF₃ 또는 -CF₂CF₃, 비닐, 알릴 및 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기로부터 선택된다.

PPARγ 수용체, EGF 수용체, 종양, 만성 염증성 질환

Description

ＰＰＡＲ 수용체 및 ＥＧＦ 수용체에 특이적인 화합물 및 이들의 염, 및 의학 분야에서의 이들의 용도{COMPOUNDS AND THEIR SALTS SPECIFIC TO THE PPAR RECEPTORS AND THE EGF RECEPTORS AND THEIR USE IN THE MEDICAL FIELD}

본 발명은 PPAR 수용체 및 EGF 수용체에 특이적인 화합물 및 이들의 염, 및 의학 분야에서의 이들의 용도에 관한 것이다.

<본 발명의 목적>

특히, 본 발명에 따른 화합물 및 이들의 염은 PPARγ 수용체 (퍼록시좀 증식인자-활성화된 수용체) 및 EGF 수용체 (상피 성장 인자 수용체)를 발현시키는 종양, 예컨대 식도, 위, 췌장, 결장, 전립선, 유방, 자궁 및 부속 기관, 신장 및 폐의 종양의 예방 및 치료에 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화합물 및 이들의 염은 만성 염증성 질환, 특히 만성 장 질환, 예컨대 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 직장결장염의 치료에 사용될 수 있다.

PPARγ 수용체는 지질 대사, 인슐린 합성, 및 발암 및 염증 과정의 조절에 중요한 다수의 유전자의 발현을 제어하는 핵 수용체 (대략 50 가지의 전사 인자 군)이다 (문헌 [Bull AW, Arch Pathol Lab Med 2003; 127:1121-1123], [Koeffler HP, Clin Cancer Res 2003; 9:1-9], [Youssef J et al., J Biomed Biotec 2004; 3:156-166]).

PPARγ 수용체에 결합하고 이들의 형태를 변화시킴으로써 활성화를 유도하는 다양한 천연 및 합성 효능제가 존재한다. 천연 및 합성 리간드는 문헌 [The Lancet 2002; 360:1410-1418]에 기재되어 있다.

최근의 연구는 종양 세포를 PPARγ 수용체의 리간드로 처치하는 것이 세포 증식, 세포 분화 및 아팝토시스의 감소를 유도한다는 것을 보여주며, 이는 이러한 화합물이 발암 예방을 위한 제제로 적용될 수 있는 가능성을 시사한다 (문헌 [Osawa E et al., Gastroenterology 2003; 124:361-367]).

다른 연구는 PPARγ 수용체의 리간드 (예를 들면, 트로글리타존)가 소염 효과를 나타내고, IBD의 동물 모델에서 점막 염증 반응을 억제한다는 것을 보여준다 (문헌 [Tanaka T et al., Cancer Res 2001; 61:2424-2428]).

또한, 최근에 5-ASA의 장 소염 활성 (IBD 치료에서의 최적 기준)이 PPARγ 수용체의 결합 및 이로 인한 활성화에 의존한다는 증거가 공개되었다 (문헌 [Rousseaux C et al., J Exp Med 2005; 201:1205-1215]).

티로신-키나제 EGF 활성을 갖는 막횡단 수용체는 다양한 형태의 신생물에서 매우 높은 정도로 활성화된 형태로 발현된다 (문헌 [Mendelsohn J, Endocr Relat Cancer 2001; 8:3-9], [Harari PM, Endocr Relat Cancer 2004; 11:689-708]).

수용체의 과다 발현은 또한 암종 세포의 잠재적 전이 능력과 관련된다. 이와 관련하여, EGF가 세포외 매트릭스와 상호작용하는 수준에서 병소와 연관된 다양한 세포 유형의 이동 및 침입을 증진시킨다는 것이 입증되었다 (문헌 [Brunton et al., Oncogene 1997; 14:283-293]).

실험 동물 및 인간 둘 모두에서 수행한 다수의 연구는 종양의 증식 및 확산을 제어하는데 있어 EGF 수용체 억제제의 효능을 확립하였다 (문헌 [Mendelsohn J, Endocr Relat Cancer 2001; 8:3-9], [Harari PM, Endocr Relat Cancer 2004; 11:689-708]).

EGF 수용체의 활성화에 의해 촉발된 세포내 신호는 신생물성 세포의 성장 및 생존을 용이하게 하여 병의 발생에 기여하고, 이 신호가 멀리 떨어진 기관으로 전이되어 군집을 형성하는 종양 세포의 능력을 결정하는데 필수적이라는 것은 의심의 여지가 없다 (문헌 [Mendelsohn J, Endocr Relat Cancer 2001; 8:3-9], [Kari C et al., Cancer Res 2003; 63:1-5]).

또한, 상기 내용 및 만성 염증성 과정이 발암시 소정의 역할을 일부 수행한다는 생물학적 견지를 고려하여, PPARγ 수용체 및 EGF 수용체 둘 모두에서의 보완적 작용에 의해 소염 작용 및 항-종양 작용을 수행할 수 있는, 화학적-예방성, 항-증식성 및 항-전이성 유형의 신규 화학 물질에 대한 혁신적인 연구가 실질적으로 필요하다는 것이 명확해졌다.

본 발명은 PPARγ 수용체 및 EGF 수용체와 같은 특정 수용체의 조절에 의해 암 및 만성 염증을 예방 및 치료하기에 적합한 신규 화합물 군을 제공한다.

<발명의 요약>

본 발명은 일련의 화합물의 신규하고 독창적인 의학적 용도 및 치료 용도에 관한 것이다. 본 발명은 화합물들 중 어느 것도 알려져 있지 않은 경우 이들 화합물에 관한 것이다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 포함하는 화합물에 관한 것이다.

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이할 수 있으며, -H, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기를 포함하는 군으로부터 선택되거나, 또는 함께 5 또는 6개의 원자를 갖는 방향족 또는 지방족 고리를 형성하고;

Y 및 Z는 동일하거나 상이할 수 있으며, -H, -OH, -COOH, -OR₃, -CH(OR₃)COOH를 포함하는 군으로부터 선택되고, 여기서 R₃은 H, 페닐, 벤질, -CF₃ 또는 -CF₂CF₃, 비닐, 알릴, 및 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기로부터 선택된다.

본 발명은 또한 하기 화학식 Ia의 화합물의 하위군에 관한 것이다.

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이할 수 있으며, -H, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기를 포함하는 군으로부터 선택되고;

Y 및 Z는 동일하거나 상이할 수 있으며, -H, -OH, -COOH, -OR₃, -CH(OR₃)COOH를 포함하는 군으로부터 선택되고, 여기서 R₃은 -H, 및 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기로부터 선택된다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, Z 및 Y는 상이하다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, Y 또는 Z 중 적어도 하나가 -COOH에서 종결된다. 따라서, 본 발명의 몇몇 실시양태에서, Y 또는 Z는 (몇몇 실시양태에서는 Y 또는 Z 중 적어도 하나, 몇몇 실시양태에서는 Y 또는 Z 중 하나만) -COOH이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, Y 또는 Z는 (몇몇 실시양태에서는 Y 또는 Z 중 적어도 하나, 몇몇 실시양태에서는 Y 또는 Z 중 하나만) -CH(OR₃)COOH이다.

본 발명은 또한, Y 및 Z가 동일하거나 상이할 수 있으며 -H, -COOH, -OR₃, -CH(OR₃)COOH를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 제외한, 화학식 I 및 Ia 둘 모두에 따른 화합물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 몇몇 실시양태에서, Z 또는 Y는 -OH가 아닐 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서는, 화합물 10 및 11이 제외된다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, Y가 -H이고 Z가 -CH(OH)COOH인 경우, NR₁R₂ 기는 3' 위치에서 연결된다. 따라서, 본 발명의 몇몇 실시양태에서는, 화합물 21이 제외된다.

본 발명의 다른 실시양태에서, Z가 -OCH₃이고 Y가 -COOH인 경우, NR₁R₂ 기는 4' 위치에서 연결된다. 따라서, 본 발명의 몇몇 실시양태에서는, 화합물 22가 제외된다.

발명의 몇몇 실시양태에서, Y가 -H이고 Z가 -CH(OCH₃)COOH인 경우, NR₁R₂ 기는 4' 위치에서 연결된다. 따라서, 본 발명의 몇몇 실시양태에서는, 화합물 35가 제외된다.

특히, 상기 언급된 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기는 -CH₃, -CH₂CH₃, -CH(CH₃)₂, -CH₂CH₂CH₃, -C_nH_2n _-1-로부터 선택될 수 있다.

화학식 I 및 Ia의 화합물은

3-(3'-아미노페닐)2-히드록시프로판산 (화합물 20),

2-(4-아미노페닐)2-메톡시아세트산 (화합물 23),

2-(3-아미노페닐)2-에톡시아세트산 (화합물 32),

2-(4-아미노페닐)2-에톡시아세트산 (화합물 33),

3-(4'-아미노페닐)2-메톡시프로피온산 (화합물 34),

3-(4'-아미노페닐)2-에톡시프로피온산 (화합물 39),

3-(3'-아미노페닐)2-에톡시프로피온산 (화합물 40)

을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 화합물 명칭은 또한 다음과 같은 표준 화학 명명법 (이 명명법은 본원 전체에 걸쳐 사용될 것임)에 따라 기재될 수 있다.

(±)-2-히드록시-3-(3'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 20),

(±)-2-메톡시-2-(4'-아미노페닐)아세트산 (화합물 23),

(±)-2-에톡시-2-(3'-아미노페닐)아세트산 (화합물 32),

(±)-2-에톡시-2-(4'-아미노페닐)아세트산 (화합물 33),

(±)-2-메톡시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 34),

(±)-2-에톡시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 39),

(±)-2-에톡시-3-(3'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 40).

본 발명에 따른 화합물은 의학 분야에서 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 활성 주성분으로서의 하나 이상의 상기 정의된 바와 같은 화합물을 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 아주반트와 함께 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 PPARγ 수용체 및 EGF 수용체를 발현시키는 종양, 예를 들면 식도, 위, 췌장, 결장, 전립선, 유방, 자궁 및 부속 기관, 신장 및 폐의 종양의 예방 및 치료용 의약품의 제조를 위한 상기 정의된 바와 같은 화합물의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 만성 염증성 질환, 예를 들면 크론병 및 궤양성 직장결장염 치료용 의약품의 제조를 위한 본 발명에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다.

특히, 상기 언급된 적용에 사용될 수 있는 본 발명에 따른 화합물은 이미 기 재된 것들과는 별도로 다음과 같을 수 있다.

(R,S)-2-히드록시-2-(3-아미노페닐)아세트산 (화합물 10),

(R,S)-2-히드록시-2-(4-아미노페닐)아세트산 (화합물 11),

(R,S)-2-히드록시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 21),

(R,S)-2-메톡시-3-(3'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 35),

(R,S)-2-메톡시-3-(3-아미노페닐)프로피온산(화합물 34).

(±)-2-히드록시-2-(3'-아미노페닐)아세트산 (화합물 10),

(±)-2-히드록시-2-(4'-아미노페닐)아세트산 (화합물 11),

(±)-2-히드록시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 21),

(±)-2-메톡시-3-(3'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 35),

(±)-2-메톡시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산(화합물 34).

한 실시양태에 따라, 화학식 I의 화합물의 R₃은 하기 화학식 II에 따라 H일 수 있다.

상기 식에서, R₁, R₂, X 및 Y는 상기 정의된 바와 같다.

다른 실시양태에 따라, 화학식 I의 화합물의 R₃은 하기 화학식 III에 따라 -CH₃일 수 있다.

상기 식에서, R₁, R₂, X 및 Y는 상기 정의된 바와 같다.

다른 실시양태에 따라, 화학식 I의 화합물의 R₃은 하기 화학식 IV에 따라 -CH₂CH₃일 수 있다.

상기 식에서, R₁, R₂, X 및 Y는 상기 정의된 바와 같다.

다른 실시양태에 따라, 화학식 I의 화합물의 R₃은 하기 화학식 V에 따라 -CH₂CH₃일 수 있다.

상기 식에서, R₁, R₂, X 및 Y는 상기 정의된 바와 같다.

다른 실시양태에 따라, 화학식 I의 화합물의 R₃은 하기 화학식 VI에 따라 -CH₃일 수 있다.

상기 식에서, R₁, R₂, X 및 Y는 상기 정의된 바와 같다.

<화학식 VI>

상기 식에서, R₁, R₂, X 및 Y는 상기 정의된 바와 같다.

다른 실시양태에 따라, 화학식 I의 화합물의 R₃은 하기 화학식 VII에 따라 -CH₂CH₃일 수 있다.

상기 식에서, R₁, R₂, X 및 Y는 상기 정의된 바와 같다.

다른 실시양태에 따라, 화학식 I의 화합물의 R₃은 하기 화학식 VIII에 따라 -CH₂CH₃일 수 있다.

상기 식에서, R₁, R₂, X 및 Y는 상기 정의된 바와 같다.

다른 실시양태에 따라, 화학식 I의 화합물의 R₃은 하기 화학식 IX에 따라 -CH₃일 수 있다.

상기 식에서, R₁, R₂, X 및 Y는 상기 정의된 바와 같다.

바람직하게는, 화학식 I의 화합물은

(±)-2-히드록시-3-(3'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 20),

(±)-2-메톡시-2-(4'-아미노페닐)아세트산 (화합물 23),

(±)-2-에톡시-2-(3'-아미노페닐)아세트산 (화합물 32),

(±)-2-에톡시-2-(4'-아미노페닐)아세트산 (화합물 33),

(±)-2-메톡시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 34),

(±)-2-에톡시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 39),

(±)-2-에톡시-3-(3'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 40)

을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 만성 염증성 질환, 예를 들면 크론병 및 궤양성 직장결장염 치료용 의약품의 제조를 위한 본 발명에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 및/또는 포유동물 (설치류, 농장 동물, 가내 애완동물, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 양, 소, 말 포함)의 치료 방법에 관한 것이다.

특히, 상기 언급된 적용에 사용될 수 있는 본 발명에 따른 화합물은 이미 기재된 것들과는 별도로 다음과 같을 수 있다.

(±)-2-히드록시-2-(3-아미노페닐)아세트산 (화합물 10),

(±)-2-히드록시-2-(4-아미노페닐)아세트산 (화합물 11),

(±)-2-히드록시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 21),

(±)-2-메톡시-3-(3'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 35),

(±)-2-메톡시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 34).

기재된 화합물의 사용은 이들의 라세미 형태의 사용으로만 제한되지는 않는다. 본 발명에서는 임의의 기재된 화합물의 사용이 거울상이성질체적으로 순수한 R 또는 S 형태 또는 하나의 거울상이성질체가 다른 것보다 임의의 비율로 과량으로 존재하는 임의의 혼합물 형태의 사용까지 확장된다.

실제로, 수행된 도킹(docking) 연구에서는 순수한 R 거울상이성질체가 활성을 나타내기는 하지만, S 거울상이성질체가 R 거울상이성질체보다 높은 활성을 나타낸다는 것을 보여준다.

본 발명의 분자는 기초 화합물로 메살라진을 사용하는 분자 모델링 작업으로부터 유래되었으며, 화학적으로 적합할 수 있는 모든 변화가 컴퓨터 도킹 실험에서 최고의 스코어 (수용체의 친화성 및 활성화)를 달성하기 위해 평가되었다. 결과적으로, 메살라진에 비해 유사한 기능 및/또는 활성을 나타내는 본 발명의 화합물은 유사한 생물학적 경로를 통해 작용하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 분자에 내재된 메살라진과 유사한 특성이 EGF 경로와 관련된 유사한 활성을 분자에 부여하는 것으로 여겨진다.

본원에 제공된 예는 이미 논의된 다양한 의학 분야에서의 화합물의 용도를 예측하는데 사용하기 유용한 모델이다. 따라서, 모델은 이들의 작용 메카니즘에 관계없이 가치있고 의미있는 결과를 제공한다. 상기 언급된 화합물 이외에도, 본 발명은 하기 화합물들의 용도를 제공한다.

2_10

(R,S) 2-히드록시-2-(3-아미노페닐)아세트산

2_11

(R,S) 2-히드록시-2-(4-아미노페닐)아세트산

2_21

(R,S) 2-히드록시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산

2_22

(R,S) 2-메톡시-2-(3-아미노페닐)아세트산

본 발명은 이제 그의 바람직한 실시양태에 따라 특히 첨부된 도면의 그림을 참조하여 설명 목적을 위해 기재될 것이나 본 발명이 이들로 한정되는 것은 아니다.

<도면 및 표의 간단한 설명>

표 1. 등급화된 투여량 (0.5 내지 10 mM)의 특정 화합물에 의한 DLD-1 세포 억제의 백분율. 세포를 화합물의 존재 또는 부재하에 배양하고, 이어서 48 시간 동안 배양한 후에 세포 성장을 비색 (BrdU) 분석에 의해 평가하였다.

도 1: 화합물 20, 23, 32, 33, 34, 35, 39 및 40의 구조.

도 2: 화합물로의 처치에 의한 PPARγ 활성

도 3 및 4: 인간 결장 암종 세포주 (즉, HT29, HT115 및 DLD1)의 증식에 대한 특정 물질의 효과. 세포를 48 시간 동안 물질의 농도를 증가시키면서 (0.5 내지 10 mM) 처리하고, BrdU 혼입의 측정을 위한 비색 분석을 이용하여 증식을 측정하였다. 흡광도 (OD)는 ELISA 판독기를 이용하여 450 nm에서 결정하였다. 데이타는 3 가지 독립적인 실험의 평균±SD로 나타내었다.

도 5: 화합물 34 (R)의 PPAPγ 수용체로의 도킹 (아미노산 잔기 표지 및 수 소 결합이 표시되어 있음).

도 6: 화합물 34 (S)의 PPAPγ 수용체로의 도킹 (아미노산 잔기 표지 및 수소 결합이 표시되어 있음).

도 7: 화합물 35 (R)의 PPAPγ 수용체로의 도킹 (아미노산 잔기 표지 및 수소 결합이 표시되어 있음).

도 8: 화합물 35 (S)의 PPAPγ 수용체로의 도킹 (아미노산 잔기 표지 및 수소 결합이 표시되어 있음).

도 9: 화합물 39 (R)의 PPAPγ 수용체로의 도킹 (아미노산 잔기 표지 및 수소 결합이 표시되어 있음).

도 10: 화합물 39 (S)의 PPAPγ 수용체로의 도킹 (아미노산 잔기 표지 및 수소 결합이 표시되어 있음).

도 11: 메살라민의 PPAPγ 수용체로의 도킹 (아미노산 잔기 표지 및 수소 결합이 표시되어 있음).

도 12: 화합물 39의 개략적 합성 및 이후의 분할.

실시예 1

(±)-2-히드록시-3-(3'-아미노페닐)-프로판산 (화합물 20)의 제조 방법

단계 1

3-니트로벤즈알데히드 (45.3 g, 0.3 mol), N-아세틸글리신 (42.1 g, 0.36 mol) 및 나트륨 아세테이트 (32 g, 0.39 mol)를 아세트산 무수물 (142 ml, 1.5 mol)과 혼합하고, 생성된 혼합물을 6 시간 동안 120 ℃로 교반하면서 가열하여 어두운 색 용액을 수득하였다. 이어서, 혼합물을 밤새 실온으로 냉각시켰으며, 이 때 침전된 고체가 형성되었다. 반응 혼합물을 빙수 (130 g)에 붓고, 생성된 현탁된 고체를 여과에 의해 수집하였다. 조질의 고체 생성물 (72 g)을 아세톤 (80 ml)으로 세척한 후에 고온의 아세톤 (320 ml)으로부터 재결정화시켜 결정질 고체를 수득하였으며, 이를 50％ 수성 에탄올로 세척한 후에 40 ℃/40 mmHg에서 건조시켜 2-메틸-4-(3-니트로벤질리덴)옥사졸-5(4H)-온 (49.0 g, 78％)을 담황색 침상 물질로 수득하였다.

단계 2

2-메틸-4-(3-니트로벤질리덴)옥사졸-5(4H)-온 (52.0 g, 0.224 mol)을 3M 염산 (1.3 L)과 혼합하고, 현탁액을 100 ℃에서 6 시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 실온에서 밤새 교반한 후에 현탁된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물 (2×40 ml)고 세척한 후에 진공하에 건조시켜 2-히드록시-3-(3-니트로페닐)아크릴산 (29.3 g)을 수득하였다. 합한 여과물 및 세척물을 에틸 아세테이트 (4×0.5 L)로 추출한 후에, 합한 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켜 추가 수확량의 2-히드록시-3-(3-니트로페닐)아크릴산 (12.0 g)을 수득하였다. 2-히드록시-3-(3-니트로페닐)아크릴산의 총 수득량은 41.3 g (88％)이었다.

단계 3

나트륨 에톡시드 (1.8 g, 26.4 mmol)를 0 ℃에서 메탄올 (131 ml) 중 2-히드록시-3-(3-니트로페닐)아크릴산 (5.25 g, 25.0 mmol)의 교반된 용액에 나누어 첨가하여 맑은 담황색 용액을 형성하였다. 이어서, 나트륨 보로히드라이드 (1 g, 26.4 mmol)를 2회로 나누어 조심스럽게 첨가하고, 혼합물을 5 내지 10 ℃에서 30 분 동안 교반하였다. 이어서, 소량의 물을 첨가하여 반응물을 켄칭하고, 임의의 과량의 NaBH₄를 제거하였다. 메탄올을 진공하에 제거하여 고체 잔류물을 수득하였으며, 이를 에틸 아세테이트 및 헵탄 (21 ml)의 5:2 혼합물로 분쇄한 후에 3％ 수성 메탄올로 추가로 분쇄하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공하에 건조시켜 2-히드록시-3-(3-니트로페닐)프로피온산 (3.0 g, 57％)을 수득하였다.

단계 4

2-히드록시-3-(3-니트로페닐)프로피온산 (3.0 g, 14.2 mmol), 메탄올 (129 ml) 및 활성화된 검탄상 5％ 팔라듐 (600 mg, 2 몰％)의 혼합물을 10 psi의 H₂ 대기에서 1 시간 동안 수소화시켰다. 이어서, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여과 케이크를 메탄올로 세척하고, 여과물을 고진공하에 40 ℃에서 농축시켜 생성물을 발포성 고체로 수득하였다. 이를 물에 용해시키고, 용액을 동결건조시켜 (±)-2-히드록시-3-(3'-아미노페닐)-프로판산 (2.6 g, 100％)을 백색 고체로 수득하였다.

실시예 2

(±)-2-메톡시-2-(4'-아미노페닐)-아세트산 (화합물 23)의 제조 방법

단계 1

메탄올 (25 ml) 중 수산화칼륨 (6.72 g, 0.12 mol)의 용액을 DMF (100 ml) 중 4-아세트아미도벤즈알데히드 (24.5 g, 0.15 mol) 및 클로로포름 (40.1 g, 0.33 mol)의 냉각된 (-7 ℃) 용액에 -5 ℃ 미만의 온도를 유지하도록 하는 속도로 첨가하였다. 혼합물을 5.5 시간에 걸쳐 2 ℃로 가온한 후에, 이를 1M 수성 HCl (200 ml) 및 톨루엔 (200 ml)의 혼합물에 첨가하고, 밤새 교반하였다. 생성된 2-(4-아세트아미도페닐)-트리클로로카르비놀을 여과에 의해 수집하고 (29 g), 흡인 건조시켰다.

단계 2

메탄올 (330 ml) 중 2-(4-아세트아미도페닐)-트리클로로카르비놀 (14.0 g, 49.5 mmol)의 용액 및 메탄올 (150 ml) 중 수산화칼륨 (13.8 g, 250 mmol)의 용액을 합하고, 혼합물을 3 시간 동안 70 내지 80 ℃로 가열하였다. 냉각시킨 후에, KCl 부산물을 여과에 의해 제거하고, 이어서 여과물을 진공하에 농축시켜 2-(4-아세트아미도페닐)-2-메톡시아세트산 (14 g)을 백색 고체로 수득하였다.

단계 3

2-(4-아세트아미도페닐)-2-메톡시아세트산 (7.1 g, 31.8 mmol)을 16 시간 동안 히드라진 일수화물 (40 ml)과 가열하고, 냉각시키고, 진공하에 농축시켰다. 생성된 잔류 오일을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용출액 - CH₂Cl₂ 중 20 내지 40％ 메탄올)에 의해 정제하여 (±)-2-메톡시-2-(4'-아미노페닐)-아세트산 2.6 g (45％)을 수득하였다.

실시예 3

(±)-2-에톡시-2-(3'-아미노페닐)-아세트산 (화합물 32)의 제조 방법

단계 1

3-니트로벤즈알데히드 (25 g, 165 mmol) 및 클로로포름 (30 ml, 375 mmol)을 DMF (100 ml)에 용해시키고, 용액을 -5 ℃ 내지 -10 ℃ 사이로 냉각시켰다. 메탄올 (22.5 ml) 중 수산화칼륨 (7.5 g, 134 mmol)의 신선한 용액을 내부 온도가 -5 ℃ 미만으로 유지되도록 서서히 첨가하였다. 반응물을 -5 ℃ 미만에서 2 시간 동안 유지시킨 후에 톨루엔 (225 ml) 중 수성 염산 (225 ml)의 냉각된 혼합물로 켄칭하였다. 용액을 빙조에서 밤새 서서히 실온으로 가온하였다. 그 후에, 톨루엔 층을 분리하고, 수성층을 톨루엔으로 추가로 추출하였다. 합한 유기층을 물(2×225 ml), 5％ 중탄산나트륨 용액 (225 ml) 및 물 (225 ml)로 세척하였다. 용액을 건조시키고 (MgSO₄), 여과하고, 진공하에 농축시켜 2-(3-니트로페닐)-트리클로로카르비놀을 오렌지색 고체 (42 g, 155 mmol, 94％)로 수득하였다.

단계 2

2-(3-니트로페닐)-트리클로로카르비놀 (20 g, 74 mmol)을 순수 에탄올 (74 ml)에 용해시키고, 순수 에탄올 (150 ml) 중 수산화칼륨 (20.7 g, 369 mmol)의 용액을 서서히 첨가하였다. 용액을 환류 온도에서 4 시간 동안 가열하고, 냉각시킨 후에 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 묽은 염산으로 산성화시키고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출 (×3)하였다. 합한 유기층을 건조시키고 (MgSO₄), 여과하고, 진공하에 농축시켜 2-에톡시-2-(3-니트로페닐)아세트산을 갈색 고체 (6.4 g, 28.4 mmol, 38％)로 수득하였다.

단계 3

2-에톡시-2-(3-니트로페닐)아세트산 (6.4 g, 28.4 mmol)을 순수 에탄올 (500 ml)에 용해시키고, 탄소상 5％ 팔라듐 (습윤) (1.5 g)을 첨가하고, 혼합물을 60 psi에서 밤새 수소화시켰다. 현탁액을 셀라이트를 통해 여과하고, 여과물을 농축시켜 (±)-2-에톡시-2-(3'-아미노페닐)-아세트산 (3.0 g, 15.3 mmol, 54％)을 갈색 고체로 수득하였다.

실시예 4

(±)-2-에톡시-2-(4'-아미노페닐)-아세트산 (화합물 33)의 제조 방법

단계 1

"화합물 23 단계 1" 참조

단계 2

에탄올 (400 ml) 중 2-(4-아세트아미도페닐)-트리클로로카르비놀 (14.0 g, 49.5 mmol)의 용액 및 에탄올 (150 ml) 중 수산화칼륨 (13.8 g, 250 mmol)의 용액을 합하고, 혼합물을 70 내지 80 ℃에서 2.5 시간 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고, 여과하여 KCl 부산물을 제거하고, 진공하에 농축시켜 2-(4-아세트아미도페닐)-2-에톡시아세트산 (14 g)을 황색 고체로 수득하였다.

단계 3

2-(4-아세트아미도페닐)-2-에톡시아세트산 (7.54 g, 31.8 mmol)을 16 시간 동안 히드라진 일수화물 (40 ml)과 가열한 후에 냉각시킨 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 이어서, 잔류 오일을 실리카 컬럼 크로마토그래피 (용출액 - CH₂Cl₂ 중 20 내지 40％ 메탄올)에 의해 정제하여 (±)-2-에톡시-2-(4'-아미노페닐)-아세트산 (2.3 g, 37％)을 백색 발포체로 수득하였다.

실시예 5

(±)-2-메톡시-3-(4'-아미노페닐)-프로피온산 (화합물 34)의 제조 방법

단계 1

4-니트로벤즈알데히드 (53.7 g, 0.356 mol), N-아세틸글리신 (49.9 g, 0.427 mol) 및 나트륨 아세테이트 (37.9 g, 0.463 mol)를 아세트산 무수물 (168 g, 1.78 mol)과 혼합하고, 생성된 혼합물을 6 시간 동안 120 ℃로 교반하면서 가열하여 어두운 색 현탁액을 수득하였다. 이어서, 혼합물을 실온으로 밤새 냉각시키고, 이 때 침전된 고체가 형성되었다. 반응 혼합물을 빙수 (150 g)에 붓고, 생성된 현탁된 고체를 여과에 의해 수집하였다. 조 고체 생성물을 아세톤 (100 ml)으로 세척한 후에 고온의 아세톤 (650 ml)으로부터 재결정화시켜 결정질 고체를 수득하였으며, 이를 50％ 수성 에탄올로 세척한 후에 진공하에 건조시켜 2-메틸-4-(4-니트로벤질리덴)옥사졸-5(4H)-온 (55.0 g, 66％)을 담황색 침상 물질로 수득하였다. 결정화 모액 및 세척물을 합하고, 증발시켜 고체 잔류물을 수득하였으며, 이를 아세톤으로부터 재결정화시켜 제2의 수확물 2-메틸-4-(4-니트로벤질리덴)옥사졸-5(4H)-온 (8 g, 10％)을 수득하였다. 2-메틸-4-(4-니트로벤질리덴)옥사졸-5(4H)-온의 합 한 수득량은 63 g (76％)이었다.

단계 2

2-메틸-4-(4-니트로벤질리덴)옥사졸-5(4H)-온 (63.0 g, 0.272 mol)을 3M 염산 (1.2 L)과 혼합하고, 현탁액을 100 ℃에서 6 시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 실온에서 밤새 교반한 후에 현탁된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물 (2×50 ml)로 세척한 후에 진공하에 건조시켜 2-히드록시-3-(4-니트로페닐)아크릴산 (46.6 g, 81％)을 수득하였다. 합한 여과물 및 세척물을 에틸 아세테이트 (4×0.5 L)로 추출한 후에 합한 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켜 추가 수확량의 2-히드록시-3-(4-니트로페닐)아크릴산 (0.8 g, 1％)을 수득하였다. 2-히드록시-3-(4-니트로페닐)아크릴산의 총 수득량은 47.4 g (82％)이었다.

단계 3

DMF (270 ml) 중 2-히드록시-3-(4-니트로페닐)아크릴산 (15 g, 71.7 mmol), 탄산세슘 (56 g, 172.1 mmol) 및 디메틸 술페이트 (14.2 ml, 150.6 mmol)의 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. 물 (220 ml) 및 에틸 아세테이트 (150 ml)를 첨가하고, 층을 분리하였다. 수성층을 에틸 아세테이트 (4×100 ml)로 추가로 추출한 후에 합한 유기물을 물 (6×100 ml), 염수 (2×120 ml)로 세척하고, 절반의 부피로 농축시켰다. 헵탄 (70 ml)을 첨가하고, 혼합물을 200 ml 부피로 농축시켰 다. 생성된 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 헵탄 (2×100 ml)으로 세척하고, 필터 상에서 흡인 건조시켜 메틸 2-메톡시-3-(4-니트로페닐)아크릴레이트를 미량의 헵탄을 함유하는 황갈색 고체 (9.2 g, 54％ 수율)로 수득하였다.

단계 4

메틸 2-메톡시-3-(4-니트로페닐)아크릴레이트 (7.8 g, 32.8 mmol)를 IMS (156 ml)에 용해시켰다. 물 (78 ml) 중 NaOH (1.44 g, 36.1 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 상온 (18 ℃)에서 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1M HCl (120 ml)로 산성화시키고, 생성된 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물 (2×100 ml)로 세척하고, 30 분 동안 필터 상에서 부분적으로 흡인 건조시킨 후에 18 ℃에서 18 시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. 이에 따라, 2-메톡시-3-(4-니트로페닐)아크릴산을 결정화수를 일부 함유하는 황갈색 고체 (6.7 g, 91％)로 수득하였다.

단계 5

2-메톡시-3-(4-니트로페닐)아크릴산 (6.7 g, 30 mmol)을 메탄올 (700 ml) 및 THF (300 ml)에 녹이고, 탄소상 10％ Pd (습윤 기재) (0.67 g)를 첨가하였다. 혼합물을 45 psi에서 43 분 동안 수소화시킨 후에 3 시간 동안 매 시간마다 45 내지 48 psi로 반복하여 다시 채우고 마지막으로 18 시간 동안 48 psi로 다시 채웠다. 생성된 현탁액을 GF/F 여과지를 통해 여과하고, 여과 잔류물을 MeOH (200 ml)로 세척하였다. 여과물을 회백색 고체로 농축시켰다. 고체를 IMS (75 ml) 중에서 1.5 시간 동안 20℃에서 슬러리화시키고, 여과하고, IMS/헵탄 (1:2) (20 ml)으로 세척하고, 필터 상에서 1 시간 동안 건조시켜 (±)-2-메톡시-3-(4'-아미노페닐)-프로피온산을 회백색 (5.1 g, 88％ 수율)로 수득하였다.

실시예 6

(±)-2-메톡시-3-(3'-아미노페닐)-프로피온산 (화합물 35)의 제조 방법

단계 1 및 2

화합물 20에 따름

단계 3

디메틸 술페이트 (13.23 g, 105 mmol)를 DMF (105 ml) 중 2-히드록시-3-(3- 니트로페닐)아크릴산 (10.5 g, 50.0 mmol) 및 탄산세슘 (39.1 g, 120 mmol)의 교반된 혼합물에 첨가하여 맑은 담황색 혼합물을 형성하였으며, 이를 실온에서 밤새 교 반하였다. 생성된 어두운 적색 현탁액을 진공하에 농축시키고, 잔류물을 물 (100 ml)과 디클로로메탄 (150 ml) 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고, 물 (2×100 ml)로 추가로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 실리카 겔을 통해 여과하였다. 생성된 황색 용액을 진공하에 증발 건조시켜 메틸 2-메톡시-3-(3-니트로페닐)아크릴레이트를 황색 고체 (8.1 g, 67％)로 수득하였다.

단계 4

물 (25 ml) 중 수산화칼륨 (2.0 g, 35.9 mol)의 용액을 메탄올 (150 ml) 중 메틸 2-메톡시-3-(3-니트로페닐)아크릴레이트 (8.1 g, 34.2 mmol)의 교반된 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물 (10 ml) 중 KOH (0.5 g, 8.9 mmol)의 추가 분량을 첨가하고, 혼합물을 1 시간 동안 80 ℃로 가열하였다. 이어서, 메탄올을 진공하에 증발시키고, 잔류물을 물 (200 ml)로 희석하였다. 용액을 디클로로메탄 (2×100 ml)으로 세척하고, 셀라이트 패드를 통해 여과한 후에 3M HCl을 첨가하여 pH 3으로 산성화시켰다. 혼합물을 18 시간 동안 냉동시킨 후에 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물 (3×30 ml)로 세척하고, 40 ℃에서 진공하에 건조시켜 2-메톡시-3-(3-니트로페닐)아크릴산을 황색 고체 (6.4 g, 84％)로 수득하였다.

단계 5

2-메톡시-3-(3-니트로페닐)아크릴산 (3.4 g, 15.25 mmol), 메탄올 (340 ml) 및 활성화된 검탄상 5％ 팔라듐 (1.36 g, 4 몰％)의 혼합물을 12 내지 36 psi의 H₂ 대기에서 1.5 시간 동안 수소화시켰다. 이어서, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여과 케이크를 메탄올로 세척하고, 여과물을 40 ℃에서 진공하에 농축시켜 생성물을 발포성 고체로 수득하였다. 이를 물 (100 ml)에 용해시키고, 용액을 동결건조시켜 (±)-2-메톡시-3-(3'-아미노페닐)-프로피온산 (2.6 g, 100％)을 회백색 고체로 수득하였다.

실시예 7

(±)-2-에톡시 3-(4'-아미노페닐)-프로피온산 (화합물 39)의 제조 방법, 거울상이성질체 분할 (도 12).

단계 1 및 2

화합물 34 단계 1 및 2에 따름

단계 3

2-히드록시-3-(4-니트로페닐)아크릴산 (20 g, 95.6 mmol)을 DMF (200 ml)에 현탁시켰다. Cs₂CO₃ (74.9 g, 229.9 mmol) 및 디에틸 술페이트 (26.3 ml, 201 mmol)를 첨가하였으며, 이 때 용해되는 것이 관찰되었다. 18 ℃에서 18 시간 동안 교반한 후에, 물 (350 ml) 및 에틸 아세테이트 (250 ml)를 첨가하고, 층을 분리하였다. 수성층을 에틸 아세테이트 (5×200 ml)로 추가로 추출한 후에 합한 유기물을 물 (2×200 ml), 염수 (2×200 ml)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 유기물을 농축 건조시켜 에틸 2-에톡시-3-(4-니트로페닐)-아크릴레이트를 3.6 질량％의 DMF를 함유하는 오렌지색 고체 (27.6 g (습윤), ＞ 100％ 수율)로 수득하였다.

단계 4

3.6 중량％의 DMF를 함유하는 에틸 2-에톡시-3-(4-니트로페닐)아크릴레이트 (26.07 g (교정됨), 98.3 mmol)를 IMS (500 ml)에 용해시키고, 물 (260 ml) 중 NaOH (1.44 g, 36.1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 상온에서 18 시간 동안 교반한 후에 1M HCl (120 ml)로 산성화시키고, 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물 (2×100 ml)로 세척하고, 30 분 동안 필터 상에서 흡인 건조시킨 후에 18 ℃에서 18 시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. 이에 따라, 2-에톡시-3-(4-니트로페닐)아크릴산을 결정화수를 함유하는 오렌지색 고체 (18.4 g, 79％)로 수득하였다.

단계 5

2-에톡시-3-(4-니트로페닐)아크릴산 (18.4 g (습윤), 대략 77.5 mmol)을 MeOH (1.1 L)에 용해시키고, 탄소상 10％ Pd (습윤 기재) (1.84 g)를 첨가하였다. 혼합물을 12 psi에서 10 분 동안 수소화시킨 후에 5 시간 동안 10 내지 20 분 마다 20 내지 28 psi로 반복하여 다시 채운 후에 18 시간 동안 46 psi로 다시 채웠다. 혼합물을 GF/F 여과지를 통해 여과하고, 잔류물을 IMS (100 ml)에서 슬러리화시키고, 여과하고, 헵탄 (100 ml)으로 세척하고, 필터 상에서 흡인 건조시켰다. 이에 따라, (±)-2-에톡시 3-(4'-아미노페닐)-프로피온산을 회백색 고체 (11.2 g, 69％)로 수득하였다.

실시예 8

(±)-2-에톡시-3-(3'-아미노페닐)-프로판산 (화합물 40)의 제조 방법

단계 1 및 2

화합물 20 단계 1 및 2에 따름.

단계 3

디에틸 술페이트 (12 g, 78.2 mmol)를 DMF (61 ml) 중 2-히드록시-3-(3-니트로페닐)아크릴산 (6.1 g, 30.0 mmol) 및 탄산세슘 (29.3 g, 90 mmol)의 교반된 혼합물에 첨가하여 맑은 담황색 혼합물을 형성하였으며, 이를 실온에서 밤새 교반하였다. 생성된 어두운 적색 현탁액을 4 시간 동안 50 ℃로 가열한 후에 진공하에 농축시키고, 잔류물을 물 (100 ml)과 디클로로메탄 (150 ml) 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고, 물 (2×100 ml)로 추가로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 실리카 겔 패드를 통해 여과하였다. 생성된 황색 용액을 진공하에 증발 건조시켜 에틸 2-에톡시-3-(3-니트로페닐)아크릴레이트를 황색 고체 (5.6 g, 72％)로 수득하였다.

단계 4

물 (20 ml) 중 수산화칼륨 (1.3 g, 22.2 mol)의 용액을 메탄올 (100 ml) 중 에틸 2-에톡시-3-(3-니트로페닐)아크릴레이트 (5.6 g, 21.1 mmol)의 교반된 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 환류 온도로 밤새 가열하였다. 이어서, 메탄올을 진공하에 증발시키고, 잔류물을 물 (150 ml)로 희석하였다. 용액을 디클로로메탄 (2×80 ml)으로 세척하고, 셀라이트 패드를 통해 여과한 후에, 3M HCl을 첨가하여 pH 3으로 산성화시켰다. 혼합물을 18 시간 동안 냉동시킨 후에 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물 (3×30 ml)로 세척하고, 40 ℃에서 진공하에 건조시켰다. 생성된 고체를 에틸 아세테이트 및 헵탄으로부터 재결정화시켜 2-에톡시-3-(3-니트로페 닐)아크릴산을 황색 고체 (3.06 g, 61％)로 수득하였다.

단계 5

2-에톡시-3-(3-니트로페닐)아크릴산 (3.06 g, 12.9 mmol), 메탄올 (150 ml) 및 활성화된 검탄상 5％ 팔라듐 (0.60 g, 2 몰％)의 혼합물을 12 내지 30 psi의 H₂ 대기에서 2 시간 동안 수소화시켰다. 이어서, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여과 케이크를 메탄올로 세척하고, 여과물을 40 ℃에서 진공하에 농축시켜 생성물을 발포성 고체로 수득하였다. 이를 물 (100 ml)에 용해시키고, 용액을 동결건조시켜 (±)-2-에톡시-3-(3'-아미노페닐)-프로판산 (2.7 g, 100％)을 회백색 고체로 수득하였다.

실시예 9

분자 모델링

분자 모델링 연구는 실리콘 그래픽스 워크스테이션(Silicon Graphics workstation) 상에서 작동하는 SYBYL 소프트웨어 버젼 6.9.1 (트리포스 어소시에이츠 인크.(Tripos Associates Inc.), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 사용하여 수행하였다. 표준 단편 라이브러리로부터 양쪽성 이온 형태의 5-ASA의 3-차원 모델을 구축하고, 이후에 그의 기하학적 구조를 트리포스 역장(Tripos force field) (3)을 이용하여 최적화시켰다. 화합물의 pKa는 아직 알려져 있지 않으므로, SPARC 온라인 계산기를 이용하여 생리학적 pH (7.4)에서 발생하는 종을 결정하였다 (http://ibmlc2.chem. uga.edu/sparc/index.cfm). 표준 단편 라이브러리로부터 이온화된 화합물의 3-차원 모델을 구축하고, 이후에 그의 기하학적 구조를 가스티거(Gasteiger)와 휴켈(Hueckel) 원자 전하로부터 계산된 정전기적 간격을 포함하는 트리포스 역장(3)을 이용하여 최적화시켰다. 기울기 값이 0.001 kcal/mol.Å 보다 작아질 때까지 Maximin2 절차에서 이용가능한 포웰(Powell)의 방법을 이용하여 에너지를 최소화시켰다.

인간 PPARγ 리간드-결합 도메인의 구조를 RCSB 단백질 데이타 뱅크 (1I7I) (4, 5)에서 이용가능한 테사글리타자르(tesaglitazar) (AZ 242)를 사용하여 그의 복합체화된 X-선 결정 구조로부터 수득하였다. 화합물의 수용체 활성 부위로의 가요성 도킹은 골드 소프트웨어 (6)를 이용하여 수행하였다. 가장 안정한 도킹 모델은 골드스코어(GoldScore) (6) 및 X-스코어 득점 함수 (7)에 의해 예상되는 가장 높은 스코어를 득점한 형태에 따라 선별하였다. 복합체는 기울기 값이 0.01 kcal/mol.Å에 도달할 때까지 트리포스 역장 및 4.0의 유전율로 Maximin2 절차에 이용가능한 포웰 방법을 이용하여 에너지를 최소화시켰다. 어닐링(anneal) 함수를 이용하여 리간드 주변에 고온 영역 (10 Å) 및 관심 영역 (15 Å)을 한정하였다.

결과

분자 모델링 수용체 도킹 연구는, 일반적으로 R 거울상이성질체도 활성을 나타내기는 하지만 S 거울상이성질체가 R 거울상이성질체보다 높은 활성을 나타낼 것 으로 예상한다. 이와 같이 한 가지 거울상이성질체가 생물학적으로 보다 높은 활성을 나타내는 현상은 잘 알려져 있다.

그 결과, 본 발명은 화합물을 거울상이성질체로 분할하는 방법을 제공한다. 화합물 32의 분할 방법은 도 11에 개략적으로 도시되어 있다.

이론에 얽매이지 않고도, 화합물의 S-거울상이성질체가 보다 높은 활성을 제공할 것으로 여겨진다. 도킹 연구의 결과는 도 5 내지 10에 나타내었다.

실시예 10
결과

PPARγ의 활성화는 퍼록시좀 증식인자 반응 요소 (PPRE) (7-9)로 지칭되는 특정 DNA 서열 요소에 대한 결합을 유도하는 단계적 반응을 유발한다.

본원 발명자들은 상피 세포를 레닐라 루시퍼라제 및 PPRE 플라스미드를 사용하여 일시적으로 형질감염시킴으로써 PPARγ 전사 활성을 조사하였다. 새로운 분자가 PPARγ 활성화를 자극하는데 있어 5-ASA가 보다 높은 효능을 나타내는지 여부를 평가하기 위해, 본원 발명자들은 이들 분자를 1 mM의 농도에서 시험하였다. 1 mM의 농도에서의 새로운 분자의 효과를 각각 3O mM 및 10^-5 M의 최적 농도에서 양성 대조군으로 사용되는 5-ASA 및 로시글리타존과 비교하였다. 세포를 24 시간 동안 상이한 분자들로 자극시켰다.

형질감염된 HT-29 세포에서의 PPARγ 활성 분석은 1 mM의 새로운 분자 34, 39, 35 및 40이 리포터 유전자 활성을 각각 4.8±0.71; 2.73±0.31; 2.64±0.46; 3.4±0.97 배 증가시켰으며, 이것이 3O mM의 5-ASA (2.8+0.7) 및 10^-5 M의 로시글리 타존 (3.17±0.29)에 비해 유사하거나 우수한 활성을 나타내는 것임을 보여준다.

도 2는 2 또는 3 실험 (3회 수행함)에서 평가된 각각의 분자에 대해 수득한 모든 결과를 나타낸다. 다른 실험들 사이의 재현성은 우수하였으며, 문헌에 기재된 데이타와 유사하였다.

본원 발명자들은 상기 연구로부터 PPARγ를 활성화시키는데 있어 5-ASA보다 효능이 30 내지 50배 높은 4 가지 새로운 분자를 확인하였다.

실시예 11

결장암 세포 성장

다음과 같은 물질들 (즉, 20, 34, 35, 39 및 40)을 이들의 결장암 세포 성장 조절 능력에 대해 시험하였다. 상기 목적을 위해, 3 가지 인간 결장 암종 세포주 (즉, HT-29, HT-115 및 DLD-1)를 사용하였다. 이들 세포 유형은 시클로옥시게나제-2 (COX-2) 발현을 기초로 하여 선택하였다. 또한, HT-115 세포는 생물학적으로 활성인 COX-2를 발현시키고, HT-29 세포는 비-기능성 COX-2 이소형을 발현시키며, DLD-1은 COX-2-결핍 세포이다. 이들 분자는 또한 COX-2를 발현시키지 않는 세포 상에서 활성이므로 본 발명의 분자가 종양 치료 목적 및 본원에 기재된 다른 적용을 위해 COX-2를 발현시키지 않는 세포에 사용될 수 있을 것으로 여겨진다.

HT-29 및 DLD-1 세포는 각각 10％ 태아 소 혈청 (FBS), 1％ 페니실린/스트렙토마이신 (P/S) 및 50 mg/ml 겐타마이신을 보충한 McCoy 및 RPM11640 배지에서 배양하였다. HT-115는 15％ FBS 및 1％ P/S를 보충한 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 5％ CO₂의 존재하에 37 ℃의 가습 인큐베이터에 넣어 두었다.

세포 성장 분석의 경우, 단일-세포 현탁액을 0.5％ FBS를 함유하는 배지가 포함된 96-웰 배양 접시에서 2×10³개 세포/웰 (HT115의 경우, 4×10³개 세포/웰)로 플레이팅하여 부착시켰다. 이어서, 부착되지 않은 세포를 제거하고, 0.5％ FBS를 함유하는 신선한 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 특정 물질의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 각각의 물질을 0.5％ FBS를 함유하는 배양 배지에 25 mM 원액으로 용해시키고, 각 원액의 pH를 필요한 경우에는 NaOH를 사용하여 7.4로 조정하였다. 물질들은 0.5 내지 10 mM 범위의 최종 농도에서 사용하였다.

세포 증식은 시판되는 세포 증식 키트 (로쉐 디아그노스틱스(Roche Diagnostics), 이탈리아 몬자 소재)를 이용하여 DNA에 혼입되는 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU)을 측정하여 결정하였다. BrdU는 인큐베이션 마지막 6 시간 동안 세포 배양물에 첨가하고, 48 시간 동안 배양한 후에 BrdU-양성 세포의 수준을 효소-연결 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 평가하였다. 흡광도 (OD)는 ELISA 판독기를 이용하여 450 nm에서 결정하였다. 실험은 3회 수행하였으며, 결과는 평균±표준 편차 (SD)로 기록하였다.

결과

화합물의 결장암 세포 성장 억제 능력은 상이하였다. 결과를 표 1에 요약하였으며, 여기에 특정 화합물에 의한 DLD-1 세포의 성장 억제 백분율을 표시하였다. 물질 20은 시험된 3 가지 세포주 각각에서 투여량-의존성 방식으로 현저한 항-증식 효과를 나타내었다 (도 3 및 4). 화합물을 10 mM의 최종 농도로 사용하였을 때 90％를 초과하는 세포 성장 억제가 관찰되었다. 세포 성장을 유의하게 억제하는 화합물 20의 능력은 5 또는 10 mM의 최종 농도로 사용하였을 때 관찰되었다.

화합물 34 및 39는 고투여량 (10 mM)으로 사용되었을 때 세포 성장을 약간 감소시켰으나 (도 4), 그룹들 사이의 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다. 이와 마찬가지로, 물질 35 및 40을 첨가한 배양물에서는 세포 성장 억제가 관찰되지 않았다 (표 1 참조).

결론

본 발명의 제1 세트 실시예 (실시예 10)는 1 mM의 농도의 4 가지 최적 분자 34, 39, 35 및 40이 형질감염된 HT-29 세포에서 PPARγ 활성을 증가시키는 능력을 보여주었으며, 이는 30 mM의 5-ASA 및 10^-5 M의 로시글리타존에 비해 유사하거나 우수한 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.

본 발명의 제2 세트 실시예 (실시예 11)는 화합물이 결장암 세포주 HT-29, HT-115 및 DLD1의 성장의 억제에 다양한 정도로 영향을 미친다는 것을 보여준다. 화합물들의 결장암 세포 성장 억제 능력은 상이하였다. 물질 20이 시험된 세포주에 대해 현저한 항-증식 효과를 나타내었다.

이들 본 발명의 분자는 또한 COX-2를 발현시키지 않는 세포 상에서 활성이므로, 본 발명의 분자는 종양 치료 목적 및 본원에 기재된 다른 적용을 위해 COX-2를 발현시키지 않는 세포에 사용될 수 있다.

종합적 결론

모델링 연구로부터 나타난 합성된 최고 순위 화합물은 모두 메살라진의 활성에 비해 유사/우수한 활성을 나타내었다.

<참고 문헌>

Claims

하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염.

<화학식 I>

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이할 수 있으며, -H, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 함께 5 또는 6개의 원자를 갖는 방향족 또는 지방족 고리를 형성하고;

Y는 -H, -OH, -COOH, -OR₃, -CH(OR₃)COOH로 이루어지는 군으로부터 선택되고, Z는 -CH(OR₃)COOH이며, 여기서 R₃은 페닐, 벤질, -CF₃, -CF₂CF₃, 비닐, 알릴, 및 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기로부터 선택되고;

-NR₁R₂는 3' 또는 4' 위치에 있으며;

2-메톡시-3-(3'-아미노페닐)-프로피온산은 제외한다.
제1항에 있어서, R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이할 수 있으며, -H, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Y는 -H, -OH, -COOH, -OR₃, -CH(OR₃)COOH를 포함하는 군으로부터 선택되고, Z는 -CH(OR₃)COOH이며, 여기서 R₃은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알칼기로부터 선택되는 화합물.
제1항에 있어서, R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이할 수 있으며, -H, Me 또는 Et이고; Y는 -H, -OH, -COOH, -OR₃, -CH(OR₃)COOH로 이루어지는 군으로부터 선택되고, Z는 -CH(OR₃)COOH이며, 여기서 R₃은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알칼기로부터 선택되는 화합물.
하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염.

<화학식 I>

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 -H 또는 Me이고;

Y는 -COOH이고;

Z는 -OR₃이며, 여기서 R₃은 -CH₃, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂CH₃ 또는 -CH(CH₃)₂로부터 선택되는 선형 또는 분지형 알킬기로부터 선택되고;

Y가 -COOH이고 Z가 -OCH₃일 때, -NR₁R₂는 4' 위치에 있다.
하기 화학식 I의 화합물.

<화학식 I>

상기 식에서,

-NR₁R₂는 3-위치에서 페닐 고리에 결합되고;

R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이할 수 있으며, -H, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 함께 5 또는 6개의 원자를 갖는 방향족 또는 지방족 고리를 형성하고;

Y는 -H, -COOH, 및 -CH(OR₃)COOH로 이루어지는 군으로부터 선택되고, Z는 -CH(OR₃)COOH이며, 여기서 R₃은 -H이다.
제1항 또는 제5항에 있어서, R₁ 및 R₂가 -H인 화합물.
제1항 또는 제5항에 있어서, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기가 -CH₃, -CH₂CH₃, -CH(CH₃)₂ 및 -CH₂CH₂CH₃로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물.
제1항에 있어서, Y가 -H이고, Z가 --CH(OR₃)COOH이며, 여기서 R₃은 -CH₃ 또는 -CH₂CH₃인 화합물.
하기 화학식의 화합물.

(화합물 34)
하기 화학식의 화합물.

(화합물 39)
하기 화학식의 화합물.

(화합물 40)
하기 화학식의 화합물.

(화합물 32)
하기 화학식의 화합물.

(화합물 33)
하기 화학식의 화합물.

(화합물 23)
하기 화학식의 화합물.

(화합물 20)
제1항, 제4항, 제5항 및 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, R 또는 S 거울상이성질체 형태인 화합물.
활성 주성분으로서의 하나 이상의 제1항, 제4항, 제5항 및 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 화합물을 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 아주반트와 함께 포함하는, 만성 염증성 질환, 및 PPARγ 수용체 및 EGF 수용체를 발현시키는 종양으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 제약 조성물.
제17항에 있어서, 화합물이 한 가지 거울상이성질체가 다른 것보다 임의의 비율로 과량으로 존재하는 혼합물로 사용되는 것인 제약 조성물.
활성 주성분으로서의 하나 이상의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 아주반트와 함께 포함하는, 만성 염증성 질환, 및 PPARγ 수용체 및 EGF 수용체를 발현시키는 종양으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 제약 조성물.

<화학식 I>

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이할 수 있으며, -H, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 함께 5 또는 6개의 원자를 갖는 방향족 또는 지방족 고리를 형성하고;

Y는 -H, -OH, -COOH, -OR₃, -CH(OR₃)COOH로 이루어지는 군으로부터 선택되고, Z는 -CH(OR₃)COOH이며, 여기서 R₃은 페닐, 벤질, -CF₃, -CF₂CF₃, 비닐, 알릴, 및 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기로부터 선택되고;

-NR₁R₂는 3' 또는 4' 위치에 있다.
제19항에 있어서, 화합물이

(±)-2-메톡시-3-(3'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 35),

(±)-2-메톡시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 34),

(±)-2-에톡시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 39), 및

(±)-2-에톡시-3-(3'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 40)

으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
활성 주성분으로서의 하나 이상의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 아주반트와 함께 포함하는, 만성 염증성 질환, 및 PPARγ 수용체 및 EGF 수용체를 발현시키는 종양으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 제약 조성물.

<화학식 I>

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 -H 또는 Me이고;

Y는 -COOH이고;

Z는 -OR₃이며, 여기서 R₃은 -H, 또는 -CH₃, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂CH₃ 또는 -CH(CH₃)₂로부터 선택되는 선형 또는 분지형 알킬기로부터 선택된다.
제21항에 있어서,

(±)-2-메톡시-2-(4'-아미노페닐)아세트산 (화합물 23),

(±)-2-에톡시-2-(3'-아미노페닐)아세트산 (화합물 32),

(±)-2-에톡시-2-(4'-아미노페닐)아세트산 (화합물 33),

(±)-2-히드록시-2-(3'-아미노페닐)아세트산 (화합물 10), 및

(±)-2-히드록시-2-(4'-아미노페닐)아세트산 (화합물 11),

으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
활성 주성분으로서의 하나 이상의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 아주반트와 함께 포함하는, 만성 염증성 질환, 및 PPARγ 수용체 및 EGF 수용체를 발현시키는 종양으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 제약 조성물.

<화학식 I>

상기 식에서,

-NR₁R₂는 3-위치 또는 4-위치에서 페닐 고리에 결합되고;

R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이할 수 있으며, -H, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 함께 5 또는 6개의 원자를 갖는 방향족 또는 지방족 고리를 형성하고;

Y는 -H, -COOH, 및 -CH(OR₃)COOH로 이루어지는 군으로부터 선택되고, Z는 -CH(OR₃)COOH이며, 여기서 R₃은 -H이다.
제23항에 있어서, 화합물이

(±)-2-히드록시-3-(3'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 20), 및

(±)-2-히드록시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 21)

으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 식도, 위, 췌장, 결장, 전립선, 유방, 자궁 및 부속 기관, 신장 및 폐의 종양으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 염증성 질환이 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 직장결장염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
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