ES2357736T3 - Método para obtener líneas de células empaquetadoras retrovirales, productoras de un sobrenadante retroviral de elevada eficacia de transducción. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA OBTENER UNA CELULA DE ENCAPSULACION RETROVIRICA RECOMBINANTE, CAPAZ DE PRODUCIR VECTORES RETROVIRICOS, ASI COMO LA CELULA DE ENCAPSULACION RECOMBINANTE OBTENIDA MEDIANTE EL PROCEDIMIENTO. TAMBIEN SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR PARTICULAS RETROVIRICAS RECOMBINANTES, OBTENIDAS INTRODUCIENDO EN LAS CELULAS DE ENCAPSULACION OBTENIDAS SEGUN LOS PROCEDIMIENTOS DESCRITOS EN LA PRESENTE, UN VECTOR RETROVIRICO RECOMBINANTE Y PROPAGANDO LAS CELULAS PRODUCTORAS RESULTANTES BAJO CONDICIONES FAVORABLES PARA LA PRODUCCION Y SECRECION DE SOBRENADANTE DE VECTOR RETROVIRICO. LOS SOBRENADANTES RETROVIRICOS PRODUCIDOS MEDIANTE ESTOS PROCEDIMIENTOS TAMBIEN SE REIVINDICAN EN LA PRESENTE. ESTA INVENCION ADEMAS DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA SELECCIONAR UN SOBRENADANTE DE VECTOR RETROVIRICO PARA OBTENER UNA ELEVADA EFICACIA DE TRANSDUCCION, Y PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR UN SOBRENADANTE DE VECTOR RETROVIRICO PARA TRANSDUCIR CELULAS CON UNA ELEVADA EFICACIAEN APLICACIONES DE TERAPIA GENICA.

Description

Método para obtener líneas de células empaquetadoras retrovirales, productoras de un sobrenadante retroviral de elevada eficacia de transducción.

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere generalmente a la derivación y uso de líneas de células empaquetadoras para la producción de sobrenadante retroviral de transducción.

Antecedentes de la invención

La transferencia de genes humanos implica la transferencia de uno o más genes terapéuticos y las secuencias que controlan su expresión a células diana apropiadas. Se ha desarrollado un cierto número de sistemas de vectores para la transferencia de los genes terapéuticos para diversas indicaciones clínicas. La transferencia de genes in vivo implica la administración directa del vector a las células diana en un paciente. La transferencia de genes ex vivo implica separar células diana de un individuo, modificarlas ex vivo y devolver las células modificadas al paciente.

La mayoría de los protocolos de terapia génica aprobados para ensayos clínicos por el NIH Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) han utilizado vectores retrovirales anfotrópicos (ORDA Reports Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) Data Management Report, junio 1994, (1994) Human Gene Therapy 5:1295-1302). Los vectores retrovirales son el vehículo de elección, principalmente debido a la generalmente elevada tasa de transferencia de genes obtenida en experimentos con líneas de células y la capacidad de obtener una integración estable del material genético, asegurando que la progenie de la célula modificada vaya a contener el material genético transferido. Para una revisión de vectores retrovirales y su uso en la transferencia y expresión de genes extraños, véase Gilboa (1988) Adv. Exp. Med. Biol. 241:29; Luskey et al. (1990) Ann. N.Y. Acad. Sci. 612: 398; y Smith (1992) J. Hematother 1:155-166.

Muchos vectores retrovirales actualmente en uso se derivan del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV- siglas en inglés). En la mayoría de los casos, las secuencias virales gag, pol y env se separan del virus, permitiendo la inserción de secuencias de ADN extraño. Genes codificados por el ADN extraño son a menudo expresados bajo el control del fuerte promotor viral en la LTR. Una construcción de este tipo se puede empaquetar, eficazmente, en partículas de vector si las funciones gag, pol y env se proporcionan in trans mediante una línea de células empaquetadoras. Así, cuando la construcción del vector se introduce en la célula empaquetadora, las proteínas Gag-Pol y Env producidas por la célula se reúnen con el ARN del vector para producir viriones defectuosos en la replicación o transductores que son secretados en el medio de cultivo. Las partículas de vector, así producidas, pueden infectar e integrarse en el ADN de la célula diana, pero generalmente no producirán virus infecciosos, ya que carecen de secuencias virales esenciales.

La mayoría de las líneas de células empaquetadoras actualmente en uso han sido transfectadas con plásmidos separados que codifican Gag-Pol y Env, de modo que son necesarios múltiples eventos de recombinación antes de que se pueda producir un retrovirus competente para la replicación (RCR- siglas en inglés). Líneas de células empaquetadoras de vectores retrovirales, comúnmente utilizadas, se basan en la línea de células NIH/3T3 murina, e incluyen PA317 (Miller y Buttimore (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 2895; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7: 980), CRIP (Danos y Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460) y gp + am12 (Markowitz et al. (1988) Virology 167: 400). A pesar de que la ruptura de los genes gag-pol y env dentro del genoma de la célula empaquetadora disminuye la incidencia de RCR, RCR se observa ocasionalmente en producciones a escala clínica de preparados de vectores retrovirales y es una preocupación de seguridad muy importante. Probablemente, esto se deba, al menos en parte, al hecho de que células NIH/3T3 contienen secuencias del MLV endógenas (Irving et al. (1993) Bio/Technol. 11: 1042-1046) que podrían participar en la recombinación para formar RCR (Cosset et al. (1993) Virology 193:385-395 y Vanin et al. (1994) J. Virology 68: 4241-4250), particularmente en cultivos en masa durante la producción de vectores a gran escala clínica.

La gama de células hospedantes que pueden ser infestadas por un retrovirus o transducidas por un vector retroviral se determina por la proteína viral Env. El virus recombinante se puede utilizar para infestar virtualmente a cualquier tipo de célula reconocida por la proteína Env proporcionada por la célula empaquetadora, dando como resultado la integración del genoma viral en la célula transducida y la producción estable del producto génico extraño. La eficacia de la infección está también relacionada con el nivel de expresión del receptor en la célula diana. En general, Env ecotrópica murina de MMLV permite la infección de células de roedores, mientras que Env anfotrópica permite la infección de células de roedores, aves y de algunos primates, incluidas células humanas. Sistemas de vectores xenotrópicos que utilizan Env xenotrópica murina también permitirían la transducción de células humanas.

La gama de hospedadores de vectores retrovirales ha sido alterada sustituyendo la proteína Env del virus base con la de un segundo virus. La partícula de vector "pseudotipada" resultante tiene la gama hospedadora del virus que dona la proteína de la envoltura y que es expresada por la línea de células empaquetadoras. Por ejemplo, la glicoproteína G procedente del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) ha sido sustituida por la proteína Env de MMLV, ampliando con ello el intervalo de hospedadores. Véase, p. ej., Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037 y la solicitud de patente PCT internacional, nº de publicación WO 92/14829.

Los resultados inconsistentes y la transferencia ineficaz de genes a algunos tipos de células diana son dos problemas adicionales asociados con los actuales sistemas de vectores retrovirales. Por ejemplo, células madre hematopoyéticas son un tipo de célula diana atractivo para la terapia génica, debido a su capacidad de auto-renovación y a su capacidad para diferenciarse en todos los linajes hematopoyéticos, repoblando con ello a un paciente con las células modificadas. Sin embargo, la transferencia de genes retrovirales en células madre hematopoyéticas ha sido inconsistente e ineficaz de manera decepcionante. Kantoff et al. (1987) J. Exp. Med. 166: 219-234; Miller, A. D. (1990) Blood 76: 271-278; y Xu et al. (1994) J. Virol. 68: 7634. Esfuerzos para incrementar la eficacia de transferencia de genes incluyen producir sobrenadantes de vectores retrovirales de mayor título de punto final. El título de punto final es una medida del número de partículas de vector funcionales en un preparado que, cuando aumenta, debería aumentar en teoría la eficacia de la transducción al aumentar la relación de vector funcional a células diana, es decir, aumentar la multiplicidad de infección (m. o. i. - siglas en inglés). Sin embargo, a pesar de títulos de punto final incrementados, la eficacia de la transferencia de genes retrovirales (eficacia de la transducción) no ha aumentado de manera correspondiente (Xu et al. (1994), supra; Paul (1993) Hum. Gene Therapy 4: 609-615; Fraes-Lutz et al. (1994) 22: 857-865).

Esfuerzos para aumentar el título de punto final han incluido mejorar la producción de sobrenadantes de vectores retrovirales (véase Kotani et al. (1994) Human Gene Therapy, 5: 19-28) y la concentración física de partículas de vector mediante ultrafiltración (Paul, et al. (1993), supra. y Kotani, et al. (1994) supra). Se ha demostrado que la incubación de células productoras a 32ºC más que a 37ºC proporcionaba sobrenadantes con mayores títulos de punto final, pero no se compararon las eficacias de la transducción (véase Kotani et al. (1994) supra). Los autores de Kotani et al. (1994) supra, postularon que los elevados títulos se debían a una menor tasa de inactivación, combinada con una tasa más rápida de la producción de viriones a 32ºC. En otro estudio, la eficacia de la transducción se midió antes y después de la concentración de tres sobrenadantes con títulos de punto final similares Paul et al. (1993) supra. En cada caso, la concentración aumentó el título de punto final y mejoró modestamente la eficacia de la transducción. Sin embargo, la eficacia de la transducción conseguida con uno de los sobrenadantes no concentrados era significativamente mayor que la lograda con los otros concentrados (Paul et al. (1993) supra).

Para aplicaciones de terapia génica in vivo es importante que el vector retroviral no sea inactivado por el suero humano antes de transducir las células diana. Informes demuestran que el suero humano inactiva un cierto número de retrovirus recombinantes, aparentemente a través de una vía de complemento. Se ha informado que tanto la envoltura viral como los componentes de la célula productora son los responsables de la sensibilidad viral al complemento humano (Takeuchi et al. (1994) J. Virol. 68(12):8001).

La publicación PCT nº WO 92/05266 describe un método para obtener retrovirus recombinantes y células empaquetadoras retrovirales recombinantes que comprenden un plásmido que contiene un marco de lectura abierto gag-pol y un plásmido que contiene un marco de lectura abierto env, estando los dos plásmidos exentos de repeticiones terminales largas retrovirales.

El documento WO 94/29483 describe un sistema de empaquetamiento retroviral, en el que construcciones empaquetadoras retrovirales y transcritos de vectores empaquetadores se producen a partir de plásmidos de expresión por transfección en células humanas.

Así, existe la necesidad de métodos para aumentar de forma reproducible la eficacia de la transducción y para proporcionar líneas de células empaquetadoras estables y seguras para producir preparados retrovirales de elevada eficacia de la transducción. Esta invención satisface estas necesidades y proporciona asimismo ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Por consiguiente, la presente invención proporciona una célula empaquetadora retroviral recombinante seleccionada del grupo que consiste en ProPak-A.6 con el nº de acceso de ATCC CRL 12006 y ProPak-X.36 con el nº de acceso de ATCC CRL 12007.

Esta solicitud describe, entre otros, un método para obtener una célula empaquetadora retroviral recombinante, capaz de producir vectores retrovirales. El método puede comprender las etapas de seleccionar un retrovirus y obtener una célula exenta de ácido nucleico retroviral endógeno. Estas etapas se llevan a cabo de forma intercambiable. Sin embargo, después de la selección del retrovirus, se aísla del retrovirus un inserto de un marco de lectura abierto (ORF- siglas en inglés) gag-pol mínimo. Alternativamente, en los métodos descritos en esta memoria se puede aislar y utilizar una molécula de ácido nucleico que codifica un ORF mínimo retroviral funcionalmente equivalente. De la misma manera, un ORF env mínimo se aísla a partir de retrovirus de tipo salvaje o se obtiene una molécula de ácido nucleico equivalente. Las moléculas de ácido nucleico de ORF mínimo se amplifican luego, ya sea por inserción en un vector o plásmido de replicación adecuado y mediante replicación de una célula hospedadora que contiene al vector y/o plásmido o por otros métodos no biológicos (PCR- siglas inglesas de reacción en cadena de la polimerasa). Después de la amplificación, y consistente con el método de amplificación, las moléculas de ácido nucleico del ORF mínimo se insertan en una célula que ha sido preseleccionada para estar desprovista de ácido nucleico retroviral endógeno. Las células transformadas se propagan entonces en condiciones favorables para la expresión de los ORFs gag-pol y env retrovirales mínimos.

Líneas de células empaquetadoras candidatas adecuadas incluyen, pero no se limitan a células de mamíferos tales como COS, Vero, HT-1080, D17 MRC-5, FS-4, TE671, riñón embrionario humano (293) y HeLa.

También se describe el uso de un método ELISA para rastrear la producción de proteínas estructurales retrovirales para identificar una célula empaquetadora retroviral, capaz de producir partículas de vectores retrovirales de transducción recombinantes. Las células que producen altos niveles de la proteína Gag-Pol retroviral y de la proteína Env retroviral se identifican y seleccionan sometiendo a ensayo los productos de la traducción de ORF de gag-pol y/o env en el sobrenadante.

También se proporciona la célula empaquetadora recombinante, obtenida por los métodos descritos en esta memoria, incluida la línea de células anfotrópica designada ProPak-A y la línea de células empaquetadoras xenotrópica designada ProPak-X. Otras realizaciones de las líneas de células empaquetadoras producidas por los métodos descritos en esta memoria son líneas de células empaquetadoras caracterizadas por tener la capacidad de producir un sobrenadante de transducción que es: resistente al complemento humano; tiene una eficacia de transducción mayor que o igual al 50% cuando se somete a ensayo en células NIH/3T3, o mayor que la conseguida con el sobrenadante procedente de células basadas en PA317, o tiene una eficacia de transducción mayor que o igual al 20% cuando se somete a ensayo en células 293; y está esencialmente exento de RCR tras la interacción de secuencias de vectores retrovirales y del cultivo continuo durante más de 2 semanas con una línea de células indicadoras.

Se proporciona, además, un método para producir partículas retrovirales recombinantes, obtenidas al introducir en las células empaquetadoras obtenidas de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria, un vector retroviral recombinante, y propagar las células productoras resultantes, bajo condiciones favorables para la producción y secreción de sobrenadante de vector retroviral.

Con respecto a la propagación de las células productoras, se proporcionan métodos para obtener un sobrenadante de vector retroviral con una elevada eficacia de la transducción, cultivando las células productoras en un biorreactor de lecho empaquetado y recolectar el sobrenadante resultante. En un método, el biorreactor de lecho empaquetado tiene una relación de superficie a volumen de 5 a 50 cm^{2}/ml, y las células productoras se cultivan a una temperatura de 30ºC a aproximadamente 37ºC.

Los sobrenadantes retrovirales producidos por estos métodos también se describen en esta memoria.

También se proporciona un método para el rastreo de sobrenadante de vector retroviral para una elevada eficacia de la transducción y métodos para producir un sobrenadante de vector retroviral para transducir células con una elevada eficacia en aplicaciones de terapia génica.

Aún se describe un método para aumentar la eficacia de la transducción de una célula, al transducir una célula con un sobrenadante de vector retroviral obtenido del cultivo de una o más células empaquetadoras recombinantes, producidas por los métodos descritos en esta memoria. Partículas que contienen sobrenadante del vector de más de un tropismo se pueden producir mediante el co-cultivo de dos o más células productoras de tropismos complementarios.

Se proporciona, además, un método para producir un sobrenadante de vector viral de elevada eficacia de la transducción. La visión que prevalece en la técnica es que el incremento del título viral dará como resultado un incremento en la eficacia de la transducción. Tal como se demuestra en esta memoria, este no es el caso. Más bien, una mayor eficacia de la transducción se correlaciona con números incrementados de partículas de vectores funcionales. Las partículas de vectores no se producen todas de forma idéntica y sobrenadantes de elevado título pueden contener muchas partículas no transductoras.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra esquemáticamente las construcciones de plásmidos para la expresión de genes estructurales de MLV, que se utilizaron como plásmidos de inserción para la construcción de las líneas de células empaquetadoras ProPak-A y Pro-Pak-X. Las tres construcciones de la parte superior son para la expresión de Gag-Pol, y las tres de la parte inferior son construcciones de expresión de Env. Secuencias de MLV mínimas son una característica común entre estos plásmidos. CMV-IE designa un promotor inmediato temprano del citomegalovirus. SD/SA designa un sitio de donante de corte y empalme/aceptor de corte y empalme. MLV es el promotor viral de la leucemia murina presente en la LTR viral. RSV LTR es el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. SV40 designa el promotor temprano del virus del simio 40. pA es el sitio de poli-adenilación. Ea se refiere al gen de la envoltura anfotrópica, Ex se refiere al gen de la envoltura xenotrópica y Eax designa al gen quimérico de la envoltura anfotrópica/xenotrópica.

La Figura 2 muestra la estructura de varios de los vectores retrovirales utilizados en este estudio. El nombre de cada uno de los vectores se indica a la izquierda. Las cajas abiertas representan elementos LTR de MLV; RevM10, mutante trans-dominante de la proteína Rev de VIH; TK, promotor de la timidina quinasa del virus Herpes Simplex-1; Neo, neomicina fosfotransferasa; SV, promotor temprano del virus del simio 40; nls, señal de localización nuclear; IRES, sitio de entrada al ribosoma interno; NGFR, receptor del factor de crecimiento nervioso; puro, gen de resistencia a puromicina; CMV, promotor de CMV-IE, LMiLy y LLySN codifican el antígeno de superficie Lyt2 expresado directamente a partir del promotor de LTR retroviral en LLySN, o a través de un elemento IRES (ires) en LMiLy.LLySN contiene el gen de neomicina fosfotransferasa (Neo) expresado a partir de un promotor de SV40 interno (SV).

La Figura 3 muestra el resultado de exponer a suero humano sobrenadantes que contienen el vector que codifica lacZ, preparados a partir de células productoras estables (PA317; PE501), mediante transfección transitoria del vector en células empaquetadoras (ProPak-A) o mediante co-transfección de construcciones empaquetadoras y de vector en células 293 (293). Los sobrenadantes se mezclaron con un volumen igual de una agrupación de suero humano procedente de 4 donantes sanos, se incubaron durante 1 hora a 37ºC y el título residual se determinó en NIH/3T3. El suero era suero no tratado (HS) o había sido inactivado por calor durante 30 min a 56ºC (HI-HS). La agrupación de suero humano tenía un título hemolítico (CH_{50}; EZ Complement Assay Diamedix, Miami, Florida) de 117 a 244 antes, y < 8 después de la inactivación por calor. Los títulos de punto final (ufc x 10^{-5}/ml) de sobrenadantes tratados con suero inactivado por calor (100%) eran: PA317, 5,0; ProPak-A, 1,0; PE501, 1,4 y 293, 1,1. Las barras indican el intervalo de muestras duplicadas. HI-HS designa suero humano inactivado por calor. HS designa suero humano.

Las Figuras 4A, 4B y 4C muestran eficacias de transducción de sobrenadantes de vectores. La Figura 4A es una comparación de la eficacia de transducción de sobrenadantes virales (vector LMiLy) que codifican Lyt-2, producidos a partir de células ProPak-A y PA317 cultivadas en un biorreactor de lecho empaquetado, según se ensaya en células NIH/3T3. La Figura 4B es una comparación de la eficacia de transducción de sobrenadantes de vectores (vector LMiLy) producidos a partir de células ProPak-A y PA317 cultivados en un biorreactor de lecho empaquetado aireado, según se ensaya en células 293. La Figura 4C es una comparación de las eficacias de transducción conseguidas con sobrenadantes de vectores (LLySN) que codifican Lyt2, producidos a partir de células PA317 o células productoras basadas en ProPak-A, mostrada como la proporción (%) de células NIH/3T3 que se tiñeron con anticuerpo anti-Lyt2 (Pharmingen, San Diego, CA) 2 días después de la inoculación de las células NIH/3T3 con las diluciones del sobrenadante del vector. Los sobrenadantes se prepararon a partir de cultivos confluentes de células productoras después del cultivo durante 12 horas a 32ºC.

Las Figuras 5A y 5B muestran los resultados de la comparación de la transducción mediada por diversos sobrenadantes de vectores virales. 5A es una comparación del título de punto final y de la eficacia de transducción para sobrenadantes PA.SVNLZ medidos en células NIH/3T3. La Figura 5B es una comparación de las eficacias de transducción medidas en células NIH/3T3, HeLa o Jurkat para tres sobrenadantes PA.LMTNL con el título de punto final medido en células NIH/3T3. IE + 0,5 significa un título de punto final de 1x10^{5} ufc/ml en células NIH/3T3. Las barras de errores muestran el error típico para tres determinaciones.

La Figura 6 muestra la eficacia de transducción de sobrenadantes PA.SVNLZ antes o después de la concentración. El sobrenadante original y el concentrado (véase el Ejemplo 2 y la Tabla 4) se diluyeron con medio y se inocularon sobre células NIH/3T3.

Las Figuras 7A y 7B muestran la medición de la eficacia de transducción (Figura 7A) o el título de punto final del sobrenadante del vector retroviral PA.SVNLZ en células NIH/3T3 (Figura 7B), mostrando la inactivación del vector incubado a 37ºC, 32ºC ó 0ºC.

Las Figuras 8A y 8B muestran el curso en el tiempo de la producción del vector retroviral PA.SVNLZ en un matraz de cultivo tisular de 75 cm^{2} a 32ºC ó 37ºC, medido como la eficacia de transducción (Figura 8A) o el título de punto final en células NIH/3T3 (Figura 8B).

La Figura 9 es un curso en el tiempo de la producción del vector PA.LMTNL a partir de un cultivo en botella de cultivo rotatoria confluente a 32ºC, según se mide por la eficacia de transducción o el título de punto final.

Las Figuras 10A y 10B muestran un curso en el tiempo de la producción del vector para cultivos productores de PA.SVNLZ en una botella de cultivo rotatoria (900 cm^{2}) o en un biorreactor de lecho empaquetado (12.000 cm^{2}), mostrado por la eficacia de transducción (Figura 10A) o el título de punto final (Figura 10B). 1E + 0,5 significa un título de punto final de 1x10^{5} ufc/ml en células NIH/3T3.

La Figura 11 ilustra un biorreactor que es adecuado para la producción de sobrenadante de vector retroviral. Los números indican lo siguiente: 1: entrada de medio procedente del recipiente de 10 L; 2: entrada de aire medipure/5% de CO_{2}; 3: discos Fibercell 10 g; 4: velocidad de agitación siembra a 80 rpm, producción a 250 rpm; 5: salida del medio: a recipientes de 2 L en hielo; y 6: muestras de sobrenadante.

La Figura 12 ilustra la disposición de un biorreactor de lecho empaquetado de perfusión continua que es adecuado para la producción de sobrenadante de vector retroviral. Las partes de la disposición se indican por los números, como sigue: 1, bomba peristáltica; 2, tanque de alimentación de medio (10 L); 3, biorreactor de lecho empaquetado (500 ml); 4, agitador magnético; 5, mezcla de aire/CO_{2}; 6, recipiente de 2 L para la recogida diaria de sobrenadante mantenido a 0ºC. Las temperaturas de la incubadora se encuentran a 37ºC para el crecimiento de las células productoras y a 32ºC-37ºC para la producción del vector.

La Figura 13 muestra los resultados de la comparación de la producción del vector a partir de células productoras de ProPak-A.855 en matraces T frente a un biorreactor de lecho empaquetado aireado, y medidas en células 293. El tiempo (h) es en horas. La eficacia de transducción se presenta como el porcentaje de células que expresan la proteína marcadora en superficie codificada por el vector. Véase la Figura 2 para la estructura del vector PG855.

La Figura 14 muestra la transducción de células 293 con sobrenadantes derivados de ProPak-X recolectados a diferentes instantes después de la siembra de células en un matraz T o en el biorreactor de lecho empaquetado.

La Figura 15 es una comparación de la eficacia de transducción conseguida con sobrenadantes recolectados a partir de células ProPak-A.LMiLy, cultivadas en diferentes recipientes, tal como se muestra.

Las Figuras 16A y 16B muestran la transducción de sobrenadantes de la médula ósea (CD34^{+}) con sobrenadantes en lecho empaquetado LMiL. La Figura 16A muestra la transducción después de la espinoculación con sobrenadantes sencillos. La Figura 16B muestra la transducción después de la espinoculación con un sobrenadante sencillo o mixto (anfo + xeno).

Las Figuras 17A y 17B muestran la transducción de líneas celulares con preparaciones del vector que codifica Lyt2 con diversos tropismos. Se representan los valores medios para muestras duplicadas. En la Figura 17A, las líneas de células se inocularon a una gravedad unitaria con el vector LLySN procedente de poblaciones productoras basadas en ProPak-X (PP-X), ProPak-A (PP-A) o PG13 (PG). MLV (V-G).LMiLy es un sobrenadante de pseudotipo MLV(VSV-G) preparado mediante transfección transitoria. En la Figura 17B, células Quail (Qcl.3; Cullen et al., 1983) se inocularon con partículas de vector LMiLy que portan la envoltura quimérica (Eax; preparada por transfección transitoria), la envoltura xenotrópica (ProPak-X) o la envoltura anfotrópica (ProPak-A).

Figura 18. Resistencia del complemento del vector empaquetado en líneas de células empaquetadoras ProPak-X, ProPak-A o PA317. Los sobrenadantes se incubaron durante 30 min a 37ºC con un volumen igual de suero humano. La actividad de transducción residual con respecto a muestras incubadas en el medio se determinó en células 293 (ProPak-X) o NIH/3T3 (ProPak-A, PA317). El suero humano, una agrupación procedente de 4 donantes sanos, tenía un título hemolítico (CH_{50}) de 150 a 313 (EZ Complement Assay, Diamedix, Miami, FL). Las barras representan la gama de muestras duplicadas.

La Figura 19 muestra una comparación de los métodos de producción de vectores. Sobrenadantes
ProPak-A.52.LMiLy se recolectaron un día después de la confluencia (monocapa visual en matraz T y los cultivos en botella rotatoria), se diluyeron en 8 L y se inocularon sobre células NIH/3T3. La expresión de Lyt2 se analizó 3 días después mediante FACS.

La Figura 20 muestra el análisis del fenotipo 3 días después de la espinoculación de células CD34-positivas. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-Lyt2-ficoeritrina y anzufre-rodamina anti-CD34 (paneles A y B) o un panel de anticuerpos específicos para el linaje y marcados con isotiocianato de fluoresceína (paneles C y D). El panel de los anticuerpos específicos para el linaje contenía anticuerpos contra los siguientes linajes de células hematopoyéticas: timocitos (CD2); granulocitos, monocitos y macrófagos (CD14, CD15); células exterminadoras naturales (CD16); linfocitos B (CD19); y eritrocitos (glicoforina). Las muestras se analizaron en un citrómetro de flujo Vantage de Becton-Dickinson. Los paneles A y C proceden de células no inoculadas, y los paneles B y D proceden de células inoculadas. Los valores representan la proporción de la población de células en los cuadrantes respectivos.

Modo(s) para llevar a cabo la invención Definiciones

A menos que se especifique de otra manera en esta memoria, las definiciones comunes pretenden darse mediante las palabras y términos utilizados en esta memoria. Por ejemplo, "retrovirus" designa una clase de virus que utilizan ADN polimerasa dirigida a ARN, o "transcriptasa inversa" para copiar un genoma de ARN viral en un producto intermedio de ADN de doble cadena que puede ser incorporado en ADN cromosómico (un "provirus") de una célula hospedadora de ave o mamífero. Los retrovirus existen también en forma de viriones libres que contienen las proteínas estructurales y enzimáticas de los retrovirus (incluida la transcriptasa inversa), dos copias del genoma viral y partes de la membrana del plasma de la célula hospedadora en la que está embebida la glicoproteína de la envoltura viral. Muchos retrovirus de este tipo son conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Weiss et al., eds, RNA Tumor Viruses, 2ª ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1984 y 1985). Plásmidos que contienen genomas retrovirales están también ampliamente disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), y otras fuentes según se describe en Gacesa y Ramji, Vectors: Essential Data, John Wiley & Sons, Nueva York (1994). Se conocen las secuencias de ácidos nucleicos de un gran número de estos virus y están generalmente disponibles en las bases de datos tales como GENBANK, por ejemplo. La secuencia de ácidos nucleicos completa del MoMLV y MLVs es conocida en la técnica.

"Línea de células empaquetadoras" es una línea de células recombinantes que contiene ácido nucleico que expresa las proteínas estructurales Gag, Pol y Env retrovirales. Dado que la línea de células empaquetadoras carece del ácido nucleico retroviral que codifica la señal de empaquetamiento y otros elementos de actuación cis, no se pueden producir viriones infecciosos.

Una "célula productora" es una célula empaquetadora según se define antes, que también contiene un vector retroviral defectuoso en la replicación, que está empaquetado en la partícula del vector. La célula productora produce partículas basadas en retrovirus de transducción que contienen genes "extraños" (es decir, no retrovirales) tal como genes terapéuticos o marcadores.

Una "célula diana" es una célula a ser transducida con un vector retroviral recombinante. Así, células diana pueden ser, por ejemplo, una línea de células utilizada para confirmar la calidad de una preparación de vector retroviral, una célula primaria para la modificación genética ex vivo, o una célula dentro de un paciente que será modificada por la introducción in vivo de un vector retroviral.

Los términos y expresiones "polinucleótido", "oligonucleótido", "ácidos nucleicos" y "moléculas de ácidos nucleicos" se utilizan de forma intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Lo que sigue son ejemplos no limitativos de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, modificaciones a la estructura del nucleótido pueden impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización tal como por conjugación con un componente de marcaje.

El término polinucleótido, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere de manera intercambiable a moléculas de doble cadena y de cadena sencilla. A menos que se especifique o se requiera de otro modo, cualquier realización descrita en esta memoria que sea un polinucleótido comprende tanto la forma de doble cadena como cada una de las dos formas de cadena sencilla complementarias que se conocen o predicen para constituir la forma de doble cadena.

Un "gen" puede referirse a un polinucleótido o a una parte de un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica una proteína. A menudo, es deseable que el gen comprenda también un promotor operativamente enlazado a la secuencia codificadora, con el fin de fomentar eficazmente la transcripción. También pueden estar incluidos reforzadores, represores y otras secuencias reguladoras, con el fin de modular la actividad del gen, como es bien conocido en la técnica (véase, p. ej., las referencias citadas en esta memoria).

Un gen "marcador detectable" es un gen que permite que células portadoras del gen sean detectadas específicamente (es decir, sean distinguidas de células que no portan el gen marcador). En la técnica se conoce una amplia diversidad de genes marcadores de este tipo. Ejemplos preferidos de genes marcadores de este tipo codifican proteínas que aparecen en las superficies celulares, facilitando con ello una detección y/o clasificación celular simplificada y rápida.

Un gen "marcador seleccionable" es un gen que permite que células que portan el gen sean seleccionadas específicamente para actuar en favor o en contra, en presencia de un agente selectivo correspondiente. A modo de ilustración, un gen de resistencia a antibióticos se puede utilizar como un gen marcador seleccionable positivo que permite que una célula hospedadora sea positivamente seleccionada en presencia del antibiótico correspondiente. Una diversidad de marcadores seleccionables positivos o negativos son conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen en esta memoria.

En el contexto de polinucleótidos, una "secuencia lineal" o una "secuencia" es un orden de nucleótidos en un polinucleótido en una dirección 5' a 3', en la cual residuos que son vecinos uno con otro en la secuencia son contiguos en la estructura primaria del polinucleótido. Una "secuencia parcial" es una secuencia lineal de parte de un polinucleótido que se sabe comprende residuos adicionales en una o en las dos direcciones.

"Hibridación" se refiere a una reacción en la cual uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza a través de la unión con hidrógeno entre las bases de los residuos nucleótidos. La unión con hidrógeno puede producirse mediante apareamiento de bases de Watson-Crick, unión de Hoogsteen o de cualquier otra manera específica para la secuencia. El complejo puede comprender dos cadenas que forman una estructura dúplex, tres o más cadenas que forman un complejo de múltiples cadenas, una cadena auto-hibridante sencilla, o cualquier combinación de éstas. Una reacción de hibridación puede constituir una etapa en un procedimiento más extenso tal como la iniciación de una PCR, o la escisión enzimática de un polinucleótido por parte de una ribozima.

Reacciones de hibridación se pueden llevar a cabo en condiciones de diferente "rigor". Condiciones que aumentan el rigor de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y están publicadas en la técnica: véase, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) infra.

"T_{m}" es la temperatura en grados centígrados a la que el 50% de un dúplex de polinucleótidos, constituido por cadenas complementarias y unido con hidrógeno en una dirección antiparalela mediante el apareamiento de bases de Watson-Crick se disocia en cadenas sencillas bajo las condiciones del experimento. T_{m} se puede predecir de acuerdo con la fórmula convencional, por ejemplo:

T_{m} = 81,5 + 16,6 log [Na^{+}] + 0,41 (%G/C) - 0,61 (%F) - 600/L

en que Na^{+} es la concentración de cationes (habitualmente el ion sodio) en mol/L; (%G/C) es el número de residuos G y C como un porcentaje de los residuos totales en el dúplex; (%F) es el porcentaje de formamida en disolución (p/vol); y L es el número de nucleótidos en cada una de las cadenas del dúplex.

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Una secuencia lineal de nucleótidos es "idéntica" a otra secuencia lineal, si el orden de nucleótidos en cada una de las secuencias es el mismo y se produce sin sustitución, deleción o sustitución del material. Ha de entenderse que las bases nitrogenadas purina y pirimidina con estructuras similares pueden ser funcionalmente equivalentes en términos del apareamiento de bases de Watson-Crick; y la inter-sustitución de bases nitrogenadas similares, particularmente uracilo y timina, o la modificación de bases nitrogenadas, tal como por metilación, no constituyen una sustitución del material. Un polinucleótido de ARN y un polinucleótido de ADN tienen secuencias idénticas, cuando la secuencia para el ARN refleja el orden de bases nitrogenadas en el polirribonucleótido, la secuencia para el ADN refleja el orden de bases nitrogenadas en el polidesoxirribonucleótido, y las dos secuencias satisfacen los otros requisitos de esta definición. En los casos en que al menos una de las secuencias sea un oligonucleótido degenerado que comprende un residuo ambiguo, las dos secuencias son idénticas y al menos una de las formas alternativas del oligonucleótido degenerado es idéntica a la secuencia con la que se compara. Por ejemplo AYAAA es idéntica a ATAAA, si AYAAA es una mezcla de ATAAA y ACAAA.

Cuando se realiza una comparación entre polinucleótidos, se ha de entender implícitamente que cadenas complementarias se generan fácilmente y que la cadena sentido o antisentido se selecciona o predice que maximiza el grado de identidad entre los polinucleótidos que están siendo comparados. Por ejemplo, en los casos en los que uno o los dos polinucleótidos que están siendo comparados es de doble cadena, las secuencias son idénticas si una cadena del primer polinucleótido es idéntica con una cadena del segundo polinucleótido. De manera similar, cuando una sonda de polinucleótidos se describe como idéntica a su diana, se entiende que es la cadena complementaria de la diana que participa en la reacción de hibridación entre la sonda y la diana.

Una secuencia lineal de nucleótidos es "esencialmente idéntica" a otra secuencia lineal, si las dos secuencias son capaces de hibridarse para formar dúplex con el mismo polinucleótido complementario. Secuencias que se hibridan en condiciones de mayor rigurosidad son más preferidas. Ha de entenderse, que las reacciones de hibridación pueden albergar inserciones, deleciones y sustituciones en la secuencia de nucleótidos. Así, secuencias lineales de nucleótidos pueden ser esencialmente idénticas, incluso si algunos de los residuos nucleótidos no se corresponden o alinean con precisión. Secuencias que se corresponden o alinean más estrechamente con las secuencias descritas en esta memoria son comparativamente más preferidas. En general, una región de polinucleótidos de aproximadamente 25 residuos es esencialmente idéntica a otra región, si las secuencias tienen una identidad de al menos aproximadamente el 80%; más preferiblemente, son al menos aproximadamente un 90% idénticas; más preferiblemente, son al menos aproximadamente un 95% idénticas; todavía más preferiblemente, las secuencias tienen una identidad del 100%. Una región del polinucleótido de 40 residuos o más será esencialmente idéntica a otra región, después de la alineación de porciones homólogas, si las secuencias son al menos aproximadamente un 75% idénticas; más preferiblemente, al menos aproximadamente un 80% idénticas, más preferiblemente, son al menos aproximadamente un 85% idénticas; incluso más preferiblemente, son al menos aproximadamente un 90% idénticas; todavía más preferiblemente, las secuencias son idénticas en un 100%.

Para determinar si las secuencias de polinucleótidos son esencialmente idénticas, se prefiere particularmente una secuencia que conserve la funcionalidad del polinucleótido con el cual está siendo comparada. La funcionalidad se puede determinar por diferentes parámetros. Por ejemplo, si el polinucleótido se ha de utilizar en reacciones que implican la hibridación con otro polinucleótido, entonces secuencias preferidas son aquellas que se hibridan a la misma diana bajo condiciones similares. En general, la T_{m} de un dúplex de ADN disminuye en aproximadamente 10ºC para cada disminución de 1% en la identidad de la secuencia para dúplex de 200 o más residuos; o en aproximadamente 50ºC para dúplex menores que 40 residuos, dependiendo de la posición de los residuos desapareados. Secuencias esencialmente idénticas de aproximadamente 100 residuos formarán generalmente un dúplex estable con cualquier otra secuencia complementaria respectiva a aproximadamente 20ºC menos que la T_{m}; preferiblemente, formarán un dúplex estable a aproximadamente 15ºC menos; más preferiblemente, formarán un dúplex estable a aproximadamente 10ºC menos; incluso más preferiblemente, formarán un dúplex estable a aproximadamente 50ºC menos; todavía más preferiblemente, formarán un dúplex estable a aproximadamente la T_{m}. En otro ejemplo, si el polipéptido codificado por el polinucleótido es una parte importante de su funcionalidad, entonces secuencias preferidas son aquellas que codifican polinucleótidos idénticos o esencialmente idénticos. Así, se prefieren diferencias de nucleótidos que provocan una sustitución conservativa de los aminoácidos frente a las que provocan una sustitución no conservativa, diferencias en los nucleótidos que no alteran la secuencia de los aminoácidos son las más preferidas, mientras que se prefieren incluso más nucleótidos idénticos. Se prefieren inserciones o deleciones en el polinucleótido que den como resultado inserciones o deleciones en el polipéptido frente a las que resultan en la región codificadora de aguas abajo que está desfasada; incluso más preferidas son secuencias de polinucleótidos que no comprenden inserciones ni deleciones. La importancia relativa de las propiedades de hibridación y la secuencia de polipéptidos codificada de un polinucleótido depende de la aplicación.

Un polinucleótido tiene las mismas "características" que otro polinucleótido, si los dos son capaces de formar un dúplex estable con un tercer polinucleótido particular en condiciones similares de máxima rigurosidad. Preferiblemente, además de propiedades de hibridación similares, los polinucleótidos también codifican polipéptidos esencialmente idénticos.

Residuos "conservados" de una secuencia de polinucleótidos son los residuos que se producen sin alterar en la misma posición de dos o más secuencias relacionadas que están siendo comparadas. Residuos que están relativamente conservados son aquellos que se conservan entre secuencias más relacionadas que los residuos que aparecen en otro lugar en la secuencia.

Polinucleótidos "relacionados" son polinucleótidos que comparten una proporción importante de residuos idénticos.

Una "sonda", cuando se utiliza en el contexto de la manipulación de polinucleótidos, se refiere a un oligonucleótido que se proporciona en forma de un reactivo para detectar una diana, presente en potencia en una muestra de interés, al hibridarse con la diana. Habitualmente, una sonda comprenderá un marcador o medios mediante los cuales se puede fijar un marcador, ya sea antes o después de la reacción de hibridación. Marcadores adecuados incluyen, pero no se limitan a radioisótopos, fluorocromos, compuestos quimioluminiscentes, colorantes y proteínas, incluidas enzimas.

Un "cebador" es un oligonucleótido, generalmente con un grupo 3'-OH libre, que se une a una diana presente en potencia en una muestra de interés al hibridarse con la diana y, después de ello, fomenta la polimerización de un polinucleótido complementario a la diana.

A procedimientos para producir copias duplicadas del mismo polinucleótido tal como PCR o clonación de genes se les alude colectivamente en esta memoria como "amplificación" o "replicación". Por ejemplo, ADN de cadena sencilla o doble se puede replicar para formar otro ADN con la misma secuencia. El ARN se puede replicar, por ejemplo, mediante una ARN polimerasa dirigida a ARN, o mediante transcripción inversa del ADN y luego se puede llevar a cabo una PCR. En este último caso, la copia amplificada del ARN es un ADN con la secuencia idéntica.

Una "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") es una reacción en la que se hacen copias duplicadas de un polinucleótido diana utilizando uno o más cebadores y un catalizador de polimerización tal como una transcriptasa inversa o una ADN polimerasa y, particularmente una enzima polimerasa térmicamente estable. Generalmente, una PCR implica formar reiterativamente tres etapas: "reasociación", en la que la temperatura se ajusta de manera que se permite que los cebadores de oligonucleótidos formen un dúplex con el polinucleótido a amplificar; "alargamiento", en el que la temperatura se ajusta de modo que los oligonucleótidos que han formado un dúplex se alargan con una ADN polimerasa utilizando el polinucleótido al que han formado el dúplex en forma de un molde; y "fusión", en la que la temperatura se ajusta de manera que se disocian el polinucleótido y los oligonucleótidos alargados. El ciclo se repite después hasta que se obtenga la cantidad deseada de polinucleótido amplificado. Métodos para la PCR se enseñan en las patentes de EE.UU. nºs 4.683.195 (Mullis) y 4.683.202 (Mullis et al.).

Un "elemento de control" o "secuencia de control" es una secuencia de nucleótidos implicada en una interacción de moléculas que contribuye a la regulación funcional de un polinucleótido, incluida la replicación, duplicación, transcripción, corte y empalme, traducción o degradación del polinucleótido. La regulación puede afectar a la frecuencia, velocidad o especificidad del proceso, y puede ser reforzadora o inhibidora por naturaleza. En la técnica se conocen elementos de control. Por ejemplo, un "promotor" es un ejemplo de un elemento de control. Un promotor es una región de ADN capaz, bajo determinadas condiciones, de unir ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una región codificadora situada aguas abajo (en la dirección 3') del promotor. Secuencias de repeticiones terminales largas (LTR - siglas en inglés) retrovirales contienen fuertes promotores que se utilizan adecuadamente.

"Operativamente enlazados" se refiere a una yuxtaposición de elementos genéticos, en donde los elementos se encuentran en una relación que les permite funcionar de la manera esperada. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una región codificadora, si el promotor ayuda a iniciar la transcripción de la secuencia codificadora. Pueden existir residuos intermedios entre el promotor y la región codificadora, en tanto que se mantenga esta relación funcional.

El gen "gag" de un retrovirus se refiere al gen 5' en genomas de retrovirus y es una abreviatura (en inglés) para antígenos específicos para el grupo. Se traduce para dar una poliproteína precursora que subsiguientemente se escinde para proporcionar de tres a cinco proteínas de la cápsida.

El gen "pol" se refiere a un gen que codifica una polimerasa. Así, el gen pol codifica una transcriptasa inversa de retrovirus y también codifica la proteína IN necesaria para la integración viral en el ADN de la célula.

La región "env" o de envoltura de un genoma de retrovirus codifica las proteínas de la envoltura. El gen "env" incluye no solamente las secuencias env que se producen de forma natural a partir de un virus, sino también modificaciones del gen env tales como genes env que se modifican para alterar la especificidad de la diana de retrovirus, o genes env alternativos que se utilizan para generar retrovirus "pseudotipados". Genes env preferidos para uso en esta invención incluye, pero no se limitan a env anfotrópico, env xenotrópico murino, env del virus de la leucemia de monos Gibón GaLV) y el gen que codifica la proteína VSV-G.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en esta memoria para aludir a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también comprenden un polímero de aminoácido que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación tal como conjugación con un componente de marcaje.

La "función bioquímica" o "actividad biológica" de un polipéptido incluye cualquier característica del polipéptido detectable por cualquier investigación experimental adecuada. Función bioquímica "alterada" puede aludir a un cambio en la estructura primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria del polipéptido, detectable, por ejemplo, por la determinación del peso molecular, el dicroismo circular, la unión al anticuerpo, la espectroscopía de diferencia o la resonancia magnética nuclear. También puede aludir a un cambio en la reactividad tal como la capacidad de catalizar una determinada reacción, o la capacidad de unir un cofactor, sustrato, inhibidor, fármaco, hapteno u otro polipéptido. Se puede decir que una sustancia "interfiere" con la función bioquímica de un polipéptido si altera la función bioquímica del polipéptido en cualquiera de estas maneras.

Un "polipéptido de fusión" es un polipéptido que comprende regiones en una posición diferente en la secuencia de la que se produce en la naturaleza. Las reacciones pueden existir normalmente en proteínas separadas y son reunidas en el polipéptido de fusión; o pueden existir normalmente en la misma proteína, pero estar dispuestas en una nueva disposición en el polipéptido de fusión. Un polipéptido de fusión se puede crear, por ejemplo, por síntesis química o creando y traduciendo un polinucleótido, en el que las regiones de péptido son codificadas en la relación
deseada.

Un polinucleótido, polipéptido, proteína, anticuerpo, ácido nucleico, orácido u otra sustancia "aislado" se refiere a una preparación de la sustancia desprovista de al menos alguno de los otros componentes que también pueden estar presentes en los casos en los que la sustancia o una sustancia similar se produce en la naturaleza o es una técnica de purificación para enriquecerla a partir de una mezcla de fuentes. El enriquecimiento se puede medir sobre una base absoluta tal como peso por volumen de disolución, o se puede medir en relación con una segunda sustancia, potencialmente interferente, presente en la mezcla de fuentes. También se puede proporcionar una sustancia en un estado aislado mediante un proceso de reunión artificial tal como por síntesis química o expresión recombinante.

A un polinucleótido utilizado en una reacción tal como una sonda utilizada en una reacción de hibridación, un cebador utilizado en una PCR o un polinucleótido presente en un preparado farmacéutico se le alude como "específico" o "selectivo" si se hibrida o reacciona con la diana pretendida de manera más frecuente, más rápida o con una mayor duración que lo hace con sustancias alternativas. Similarmente, a un polinucleótido se le alude como "específico" o "selectivo" si une una diana pretendida tal como un ligando, hapteno, sustrato, anticuerpo u otro polinucleótido con mayor frecuencia, más rápidamente o con una mayor duración que lo hace con sustancias alternativas. A un anticuerpo se le alude como "específico" o "selectivo" si se une, a través de al menos un sitio de reconocimiento del antígeno a la diana pretendida con mayor frecuencia, más rápidamente o con una mayor duración que lo hace a sustancias alternativas. Se dice que un polinucleótido, polipéptido o anticuerpo "inhibe selectivamente" o "interfiere selectivamente" una reacción, si inhibe o interfiere con la reacción entre sustratos particulares en un mayor grado o durante una mayor duración que lo hace con la reacción entre sustratos alternativos.

Una "línea de células" o "cultivo de células" designa células eucarióticas superiores crecidas o mantenidas in vitro. Ha de entenderse que los descendientes de una célula pueden no ser completamente idénticos (ya sea morfológica, genotípica o fenotípicamente) a la célula parental.

El término "primate", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier miembro del orden superior de la especie mamífero. Éste incluye (pero no se limita a) prosimios tales como lemures y lorises; tarsioideos, tales como tarsieres; monos del Nuevo Mundo tales como monos ardilla (Saimiri sciureus) y tamarines; monos del Viejo Mundo tales como macacos (incluidos Macaca nemestrina, Macaca fascicularis y Macaca fuscata); hilobátidos tales como gibones y siamangos; póngidos tales como orangutanes, gorilas y chimpacés; y homínidos, incluidos seres humanos.

"Tiempo de permanencia medio" es la cantidad media de tiempo que el medio de cultivo permanece en contacto con las células productoras durante la fase de producción. El tiempo de permanencia medio óptimo se determina mediante las siguientes consideraciones: 1) tasa de producción del vector específico para la célula; 2) tasa de inactivación del vector; 3) tasas de absorción de nutrientes específicos para la célula; 4) tasas de producción de metabolitos específicos para la célula; 5) temperatura; 6) densidad celular volumétrica; y 7) las células diana para las cuales se pretende el sobrenadante del vector. Dada una densidad volumétrica de células productoras de \geq 1x10^{6} células/ml, el tiempo de permanencia medio óptimo oscila entre 3 y 6 horas con cultivos basados en PA317; entre 6 y 12 horas con cultivos basados en ProPak-A; y entre 12 y 24 horas con cultivos basados en ProPak-X o PG13. Estos tiempos de permanencia medios se basan en la transducción máxima de líneas de células.

Descripción de realizaciones

Se proporciona un método para obtener una célula empaquetadora retroviral recombinante segura, capaz de producir vectores basados en retrovirus y sobrenadante del vector retroviral.

El método comprende las etapas de seleccionar un retrovirus que proporcionará las secuencias de oligonucleótidos env y gag-pol retrovirales para la producción recombinante de productos de genes env y gag-pol retrovirales y obtener una célula eucariótica exenta de ácidos nucleicos u oligonucleótidos retrovirales relacionados endógenos del mismo tipo retroviral. A pesar de que en el método se puede utilizar adecuadamente cualquier retrovirus, se describe en esta memoria el uso del virus de la leucemia murina (MLV). Así, si cualquiera de los genes gag, pol o env han de derivarse de un MLV, la célula empaquetadora candidata debería ser rastreada en cuanto a la ausencia de ácido nucleico retroviral de MLV endógeno y de aquellas secuencias estrechamente relacionadas con MLV, las cuales por recombinación, producirían retrovirus competentes para la replicación.

El producto génico env determina la especificidad de la célula diana de la partícula de retrovirus recombinante y, por lo tanto, se seleccionará con el fin de que proporcione una transducción óptima de las células diana de interés. Env puede ser Env anfotrópica de MLV o cualquier envoltura capaz de combinarse para formar partículas de retrovirus "pseudotipadas" infecciosas. Por ejemplo, se sabe que vectores retrovirales anfotrópicos de MLV y xenotrópicos murinos transducen células humanas. Otros genes env de interés incluyen los del virus de la leucemia de mono gibón (GaLV), RD114, FeLV-C, FeLV-B, BLV y VIH-1. Véase la publicación PCT nº WO 92/14829 (página 25, línea 1 hasta la página 34, línea 1). Además, el gen env puede modificarse con el fin de que fije como objetivo con más especificidad el retrovirus recombinante a las células diana de interés. Por ejemplo, la proteína Env puede ser modificada por combinación con un sitio de unión a anticuerpo específico para un antígeno de la superficie de la célula en las células diana de interés, p. ej., un anticuerpo anti-CD34 para fijar como objetivo células madre y progenitoras hematopoyéticas (Cossett et al. (1995) J. Virol. 69: 6314-6322 y Kasahara, et al. (1994) Science 266: 1373-1376). El gen env también se puede modificar con el fin de ampliar el tropismo celular del virus, p. ej. construyendo una env quimérica que se puede unir tanto a receptores anfotrópicos como xenotrópicos o a un único receptor en células. En una realización, un gen de la envoltura anfotrópica/xenotrópica quimérico, Eax, se construyó según se describe en los Ejemplos 6 y 7. Partículas del vector con una envoltura Eax exhibieron un tropismo celular doble y, por lo tanto, transducirán una gama más amplia de células diana.

Para aplicaciones de terapia génica clínicas, es importante que las secuencias del vector retroviral y las secuencias del gen estructural sean diseñadas para minimizar la recombinación para formar retrovirus competentes para la replicación (RCR). Al introducir las secuencias de los genes gag-pol y env en la célula empaquetadora por separado, de modo que se integren en diferentes zonas del genoma de la célula empaquetadora, disminuye la tasa de formación de RCR, dado que se requieren múltiples eventos de recombinación para generar RCR. No obstante, a veces se encuentran RCRs en preparados de vectores retrovirales recombinantes. Un posible motivo es la presencia de secuencias retrovirales endógenas en las células murinas (NIH/3T3) en las que se basan las líneas de células empaquetadoras utilizadas más comúnmente, que pueden recombinarse con las secuencias retrovirales introducidas. Por lo tanto, las células empaquetadoras seguras se generan a partir de una línea de células eucarióticas que carece de secuencias retrovirales endógenas que serían capaces de producir RCR por recombinación con secuencias retrovirales introducidas.

Así, las células empaquetadoras se derivan de una línea de células que no tiene secuencias retrovirales endógenas detectables relacionadas con MLV. Además, según se describe en los ejemplos de esta memoria, la línea de células se rastrea preferiblemente en cuanto a su capacidad de secretar establemente proteínas Gag-Pol y Env y para transducir eficazmente células diana más que para producir elevados títulos de punto final solos. Preferiblemente, la línea de células eucariótica será una línea de células no murínica, más preferiblemente una línea de células de primates y, lo más preferiblemente, una línea de células de seres humanos. Los autores de la invención han encontrado que células 293 humanas están exentas de secuencias retrovirales relacionadas con MLV y, cuando se utilizan como base para células empaquetadoras estables, son capaces de producir vectores retrovirales de elevada eficacia de la transducción.

Se obtiene una célula exenta de ácido nucleico retroviral relacionado rastreando una célula candidata en cuanto a ácidos nucleicos retrovirales endógenos utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica y ejemplificados más adelante. Por ejemplo, varias líneas de células disponibles tales como los fibroblastos de la cola de Mus dunni (véase Lander y Chattopadhyay (1984) J. Virol. 52: 695-698) son reseñadas exentas de ácido nucleico retroviral endógeno y, así, se utilizan adecuadamente en los métodos descritos en esta memoria. Alternativamente, un experto en la técnica puede determinar si la línea de células contiene ácido nucleico retroviral endógeno aislando una muestra de ácido nucleico a partir de la línea de células candidatas y sondando el ADN o ARN utilizando métodos tales como análisis de hibridación Southern y Northern tradicionales o la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"), utilizando sondas específicas retrovirales y, cuando estén disponibles, kits de PCR comercialmente disponibles (Invitrogen, San Diego, CA). Los análisis de hibridación Southern y Northern se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) infra. Métodos de PCR se describen en Gene Expression Technology, Goeddel, et al. eds., Academic Press, Inc. Nueva York (1991). Una célula está exenta de ácido nucleico retroviral relacionado endógeno si no se detecta hibridación alguna, incluso a bajas condiciones de rigurosidad de iones sodio 500 mM, o si el cebador utilizado para el análisis por PCR no proporciona un ácido nucleico amplificado. En calidad de sondas se utilizan preferiblemente secuencias muy conservadas que abarcan LTR viral, secuencia de empaquetamiento y regiones del gen gag-pol.

La célula eucariótica candidata es de cualquier tipo adecuado, es decir murínica, no murínica, de mamífero, primate, canina y humana, con la condición de que la línea de células carezca de secuencias retrovirales endógenas, crezca bien en cultivo, pueda ser transfectada o transducida con las construcciones de expresión gag-pol y env apropiadas y pueden expresar las proteínas virales. La línea de células candidata es preferiblemente de primates y, lo más preferiblemente, humana. Se ha encontrado que para producir vectores retrovirales resistentes al complemento humano se pueden utilizar células empaquetadoras basadas en primates y, preferiblemente basadas en humanos.

Además, el método comprende adicionalmente utilizar secuencias mínimas gag-pol y env para disminuir adicionalmente las posibilidades de recombinación para producir RCR. A partir de los retrovirus seleccionados se obtiene un marco de lectura abierto (ORF) gag-pol mínimo y un ORF env mínimo. Los ORFs mínimos de las secuencias retrovirales se definen para incluir solamente las secuencias retroviales procedentes del ATG a través del codón de terminación del gen sin secuencias flanqueantes. También se pueden utilizar fragmentos del gen, así como equivalentes biológicos del mismo, con la condición de que la proteína funcional se produzca cuando se produce en la línea de células empaquetadoras candidata. Para uso se puede seleccionar un ácido nucleico retroviral aislado que codifica los ORFs gag-pol y env mínimos. El ácido nucleico se puede seleccionar a partir de MLV y las secuencias mínimas se pueden determinar con el fin de que consistan en los nucleótidos de aproximadamente 621 a 5837 (gag-pol) (numeración de Shinnick et al. (1981) y los nucleótidos de aproximadamente 37 a 2000 (env) (numeración de Ott et al. (1990)). Estas posiciones de los nucleótidos variarán con diferentes MLVs. Ha de entenderse, a pesar de que no se señale siempre explícitamente, que secuencias o moléculas de ácidos nucleicos que son "equivalentes", determinadas para producir el mismo efecto fenotípico que el ORF mínimo aislado descrito en esta memoria se pueden utilizar como las secuencias de ORF mínimo en los métodos descritos en esta memoria. Por ejemplo, a moléculas de ácidos nucleicos alteradas, pero fenotípicamente equivalentes, se les alude como "ácidos nucleicos equivalentes".

Las moléculas de ácidos nucleicos del ORF gag-pol y env mínimo se pueden aislar utilizando la técnica descrita en la sección experimental descrita más abajo, o se pueden replicar utilizando la PCR (Perkin-Elmer) y la información publicada de la secuencia. Por ejemplo, la secuencia se puede replicar mediante PCR (Perkin-Elmer) que, en combinación con la síntesis de oligonucleótidos, permite una fácil reproducción de secuencias de ADN. La tecnología PCR es la materia objeto de las patentes de Estados Unidos de América nºs 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 y 4.683.202 y se describen en PCR: The Polymerase Chain Reaction Mullis et al. eds., Birkhauser Press, Boston (1994) y referencias citadas en la misma. Como resulta evidente para los expertos en la técnica, se realizan modificaciones y/o adiciones a las secuencias virales para facilitar el aislamiento y la expresión del ADN amplificado.

Se concibe que líneas de células anfotrópicas y xenotrópicas se produzcan mediante este método y se determina por la selección del gen env. Así, la selección de los genes gag-pol y env no queda restringida al aislamiento a partir del mismo virus, o del mismo tipo de virus. Un ejemplo de una línea de células empaquetadoras productoras anfotrópicas por este método es ProPak-A, y un ejemplo de una línea de células empaquetadoras xenotrópica, también producida por este método, es ProPak-X.

Así, se proporcionan adicionalmente los genes aislados, operativamente enlazados a un promotor de la transcripción del ARN, así como otras secuencias reguladoras para la replicación y/o expresión transitoria o estable del ADN.

Para minimizar la posibilidad de RCR, se prefiere evitar utilizar secuencias virales externas. La expresión "operativamente enlazado" se define anteriormente.

El promotor puede ser una LTR de MLV mínima, y es preferiblemente "heterólogo" con respecto al gen retroviral. Promotores adecuados son aquellos que impulsan una expresión estable y de alto nivel de gag-pol y env. Ejemplos de promotores adecuados incluyen, pero no se limitan al promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), LTR del virus de la leucemia de Moloney murina (MMLV) u otras secuencias de LTR virales. Vectores y plásmidos que contienen un promotor o un promotor/reforzador, con codones de terminación y secuencias de marcador seleccionables, así como un sitio de clonación en el que puede estar operativamente enlazado a ese promotor un trozo insertado de ADN, son bien conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles. Para minimizar la posibilidad de una formación de RCR, genes gag-pol y env se incorporan preferiblemente en plásmidos de expresión separados, y los plásmidos se introducen secuencialmente en las células hospedadoras eucarióticas. En la amplificación del plásmido, las células hospedadoras bacterianas se propagan a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 28ºC a aproximadamente 32ºC y, más preferiblemente, a aproximadamente 30ºC, con el fin de prevenir la recombinación de secuencias virales portadas en los plásmidos y para conservar la integridad de los plásmidos.

Los plásmidos de expresión separados que contienen los genes retrovirales gag-pol y env se introducen luego, en etapas secuenciales separadas, en las células empaquetadoras candidatas por técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica tales como precipitaciones con fosfato de calcio, electroporación y lipofección (Sambrook et al. (1989) supra). La técnica de inserción también puede implicar el uso de una enzima integrasa modificada que reconocerá un sitio específico en el genoma de la célula diana. Una inserción específica del sitio de este tipo permite que el gen sea insertado en sitios del ADN de células hospedadoras que minimizarán las posibilidades de una mutagénesis insercional, minimizarán la interferencia entre otras secuencias de células hospedadoras y permitirán la inserción de secuencias a sitios diana específicos con el fin de reducir o eliminar la expresión de genes indeseables.

La introducción de genes gag-pol y env se puede hacer en cualquier orden. Después de la inserción e integración de los genes gag, pol y env, las células se rastrean en cuanto a la expresión del gen retroviral. Si en la combinación con las secuencias retrovirales se utilizó un gen marcador seleccionable tal como de resistencia a antibióticos, la población puede ser enriquecida en células para expresar el marcador seleccionable (y, por lo tanto, los genes retrovirales) haciendo crecer las células candidatas en presencia del antibiótico. Células que sobrevivan y se propaguen contendrán tanto el gen de resistencia a antibióticos como las secuencias retrovirales. Todavía adicionalmente, un ELISA con el anticuerpo apropiado contra un producto de las secuencias expresadas será un ensayo simple y rápido para determinar si y en qué medida las células contienen y expresan los genes retrovirales.

Así, también se proporciona un método ELISA para el rastreo en cuanto a la expresión de genes retrovirales en células empaquetadoras candidatas para identificar una célula empaquetadora retroviral capaz de producir partículas de vector retroviral de transducción, recombinantes. En particular, el ELISA se utilizará para el rastreo en cuanto a la producción de proteínas estructurales retrovirales tales como Gag, Pol y Env. El método ELISA también puede tener un uso diagnóstico en pacientes que hayan sufrido una terapia génica.

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Proteína Env puede detectarse en un ensayo ELISA de sándwich utilizando un anticuerpo procedente de hibridoma 83A25 en calidad de anticuerpo primario para capturar la proteína. La proteína capturada se detecta entonces utilizando un anticuerpo secundario, antisueros 79S-834, seguido de un anticuerpo anti-especies conjugado con la enzima y el sustrato para la enzima. De una manera similar, Gag se detecta por separado utilizando un anticuerpo primario, un anticuerpo procedente de hibridoma R187, seguido de los antisueros 77S-227, anticuerpo anti-especie conjugado con enzima y sustrato enzimático. El anticuerpo primario se puede proporcionar en forma de un sobrenadante del cultivo de hibridoma, ascitis o anticuerpo purificado. El anticuerpo anti-especie se conjuga preferiblemente a un marcador tal como una enzima. Enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. Se utiliza el sustrato apropiado para la enzima particular. Esta realización particular del ensayo ELISA se describe en detalle en los Ejemplos que figuran más abajo.

Preferiblemente, las líneas de células empaquetadoras candidatas se rastrean adicionalmente en cuanto a su capacidad de producir sobrenadante del vector con una elevada eficacia de transducción. La eficacia de transducción se mide por la capacidad del sobrenadante del vector de transducir una población de células diana. La población de células diana puede ser células 293 humanas, células NIH/3T3 o células primarias.

También se proporcionan células empaquetadoras recombinantes, obtenidas por el método descrito anteriormente. Las líneas de células empaquetadoras recombinantes son una mejora frente a las líneas de células empaquetadoras de la técnica anterior, ya que cuando se transducen con un vector retroviral adecuado y se propagan, las líneas de células producen un título retroviral con una elevada eficacia de transducción. Así, la línea de células se caracteriza por producir un sobrenadante viral que es resistente al complemento humano; tiene una elevada eficacia de la transducción; y está esencialmente exento de RCR después del cultivo continuo durante más de 2 semanas y hasta al menos 12 semanas. Tal como se utiliza en esta memoria, "eficacia de transducción" se refiere al porcentaje de la población de células diana inoculadas que ha sido marcada con el vector. El marcaje con el gen puede medirse determinando la fracción de células que tienen un vector proviral integrado (p. ej. por PCR) o determinando la fracción de células que expresan el transgen (p. ej. mediante análisis FACS). Una preparación de retrovirus recombinante (p. ej. sobrenadante o concentrado de sobrenadante) que tenga una elevada eficacia de transducción producirá un porcentaje incrementado de células diana inoculadas que han sido marcadas con el vector viral. Las células empaquetadoras, según se describen en esta memoria, son capaces de producir sobrenadantes retrovirales recombinantes capaces de una eficacia de transducción mayor que las células estándares murínicas PA317, según se ensaya en células NIH/3T3 y, particularmente, según se ensaya en células 293 humanas o primarias. Reactivos adecuados y métodos para llevar a cabo este análisis se proporcionan en la sección experimental que figura más abajo.

También se proporciona en esta memoria un método para producir sobrenadantes del vector retroviral, que comprende transducir las nuevas células empaquetadoras producidas de acuerdo con el método descrito anteriormente, con un vector retroviral adecuado para generar células productoras. Además, se proporciona el sobrenadante retroviral, así producido. Además del gen de interés a suministrar a la célula hospedadora, el vector retroviral contendrá la "señal de empaquetamiento" que permite que el ácido nucleico del vector retroviral sea empaquetado en la partícula del vector en la línea de células empaquetadora recombinante, y la repetición terminal larga que permite que el ácido nucleico del vector quede eficazmente integrado en el genoma de la célula diana. Las LTRs se sitúan en cualquier extremo del ácido nucleico proviral y también contienen generalmente secuencias reguladoras tales como promotor/reforzadores que afectan a la expresión del gen terapéutico o marcador de interés. El gen o los genes de interés también pueden estar operativamente enlazados a un promotor adecuado que puede ser constitutivo, específico para el tipo de célula, específico para la fase y/o modulable. También pueden incluirse reforzadores tales como los procedentes de otros virus.

En una realización separada, los vectores retrovirales pueden contener genes que codifican marcadores seleccionables y/o detectables que facilitan el aislamiento de células transducidas. En otras realizaciones, puede ser deseable que el vector incluya un "gen suicida" que permita eliminar selectivamente a elección células receptoras. El aislamiento, la inserción y el uso de marcadores y genes suicidas de este tipo son bien conocidos por los expertos en la técnica, según se ejemplifica en las publicaciones PCT de nºs WO 92/08796 y WO 94/28143.

Métodos de la técnica anterior para mejorar la eficacia de transferencia (transducción) de genes con vectores retrovirales fueron enfocados a menudo en el incremento del título de punto final. La evidencia presentada en esta memoria no sustenta una correlación entre el título de punto final y la eficacia de transducción. La evidencia presentada en esta memoria tampoco sustenta la conclusión de que el aumento de título de punto final aumenta necesariamente la eficacia de transducción, dado que partículas no transductoras interfieren con viriones transductores y reducen la eficacia de transducción sin reducir el título de punto final. De hecho, la evidencia demuestra que clones de líneas de células empaquetadoras deberían ser rastreados en cuanto a su capacidad para generar sobrenadante basado en la eficacia de transducción más que en los títulos de punto final.

Así, se proporciona adicionalmente un método para producir sobrenadante de vector retroviral con una elevada eficacia de transducción que es más adecuado para la terapia génica que comprende cultivar células productoras en un biorreactor de lecho empaquetado que tiene una relación de superficie a volumen de aproximadamente 5 a 50 cm^{2}/ml, cultivar la población de células productoras a una temperatura de alrededor de 30ºC hasta aproximadamente 37ºC y recolectar el sobrenadante producido por dichas células productoras en el instante en el que la eficacia de transducción del sobrenadante sea óptima para una célula diana, obteniendo con ello un sobrenadante de elevada eficacia de transducción.

Tal como se utiliza en esta memoria, un biorreactor de lecho empaquetado se refiere a un recipiente para el cultivo de células que comprende una matriz de lecho en la que las células crecen en un espacio tridimensional restringido. El tamaño del volumen del reactor y el volumen de la matriz de lecho empaquetado pueden variar en función de la cantidad de sobrenadante retroviral requerida.

La matriz que comprende el lecho empaquetado tiene las siguientes propiedades:

1) La matriz está hecha de un material que permite la fijación y el crecimiento de células dependientes del anclaje. El material también puede ser revestido en superficie o tratado en superficie para conseguir esta calidad; 2) la matriz puede atrapar células normalmente cultivadas en suspensión, con el fin de confinarlas a un espacio tridimensional; 3) la matriz tiene una gran relación de superficie específica a volumen (5 a 50 cm^{2}/ml) permitiendo que las células crezcan hasta elevadas densidades volumétricas (10^{6} a 10^{8} células/ml). Esta propiedad asegura una elevada producción volumétrica del vector. En una realización específica, la relación de superficie a volumen es de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 cm^{2}/ml y, preferiblemente, es de aproximadamente 24 cm^{2}/ml; 4) la matriz tiene un gran volumen hueco cuando se empaqueta para minimizar la caída de presión a través del lecho durante el funcionamiento. Una despreciable caída de presión asegura un suministro uniforme de nutrientes a las células por todo el lecho.

El biorreactor está comercialmente disponible y la matriz del lecho se puede empaquetar por separado. Preferiblemente, la matriz del lecho está construida de manera que la caída de presión a través de la matriz del lecho se encuentre en el intervalo de 0-0,25 mbar/cm. De manera ideal, la caída de presión es despreciable.

Se pretende que cualquier línea de células productoras retrovirales pueda ser cultivada en el biorreactor de lecho empaquetado. Sin embargo, las células productoras derivadas de las líneas de células empaquetadoras, producidas de acuerdo con el método anterior, son particularmente bien adecuadas para uso en este método para producir sobrenadantes de vectores retrovirales. Células de este tipo incluyen, pero no se limitan a células productoras derivadas de células 3T3 o 293. Ejemplos de líneas de células productoras basadas en 3T3 y 293 son las basadas en las líneas de células empaquetadoras PA317, PG-Am12, CRIP, PG13, ProPak-A y ProPak-X.

Después de la siembra de células productoras en el reactor de lecho empaquetado, las células se pueden cultivar a temperaturas que oscilan entre 30º y 37ºC. Preferiblemente, las células se cultivarán inicialmente a 37ºC para permitir un crecimiento máximo de las células. Una vez que el cultivo alcance una elevada densidad de células (10^{6} células/ml o mayor), la temperatura se puede reducir hasta 32º durante la fase de producción para minimizar la pérdida de vector de transducción debido a la inactivación térmica. La temperatura seleccionada para la fase de producción dependerá de las siguientes variables: diferencias de temperatura en la tasa de producción del vector específico para las células; la tasa de inactivación del vector a una temperatura dada; la densidad de las células; y la tasa a la que el recipiente se perfunde con medio reciente.

El tiempo hasta recolectar el sobrenadante retroviral para obtener una eficacia de transducción óptima variará con el tipo de célula parental de las células productoras. "Tiempo de permanencia medio" y "eficacia de la transducción" se definen anteriormente. Una eficacia de transducción óptima para un sobrenadante retroviral se refiere al porcentaje más elevado de la población de células diana inoculadas que está marcada con el vector viral, obtenida bajo las condiciones de cultivo sometidas a ensayo. Si las células productoras se derivan de células PA317, el sobrenadante se puede recolectar después de un tiempo de permanencia medio de 2 a 12 horas, partiendo del tiempo en el que las células productoras alcanzan una densidad de células de al menos 10^{6} células por ml. Para células productoras derivadas de 293 humanas, el sobrenadante se recolecta después de un tiempo de permanencia medio de 1 a 24 horas, habitualmente de 6 a 24 horas. El tiempo de permanencia medio se puede disminuir a medida que aumente la densidad de las células.

El biorreactor de lecho empaquetado se puede hacer funcionar en un modo discontinuo o de perfusión. El funcionamiento discontinuo se refiere al cambio de una parte o de la totalidad del medio de cultivo a intervalos de tiempo discretos. El modo de perfusión se refiere al suministro continuo de medio reciente a una tasa de perfusión especificada que es equivalente a la tasa a la que se recolecta de forma continua el sobrenadante del vector. Se prefiere el modo de funcionamiento por perfusión, ya que conserva un entorno del cultivo más estable, proporcionando menos estrés a las células productoras. Dependiendo de la línea de células productoras y de la densidad de células volumétrica, la tasa de perfusión óptima puede variar desde 1 volumen de reactor por día hasta 24 volúmenes de reactor por día. Preferiblemente, la tasa de perfusión es de 2-12 volúmenes de reactor por día, incluso más preferiblemente de 2-6 volúmenes de reactor por día y, lo más preferiblemente, a una tasa constante de aproximadamente 4 volúmenes de reactor por día. La tasa de perfusión puede incrementarse proporcionalmente a la densidad de las células. La densidad de las células se puede vigilar indirectamente mediante el consumo de nutrientes, la producción de metabolitos o, preferiblemente, mediante la absorción de oxígeno. La tasa de perfusión óptima, para una línea de células productora dada a una densidad de células volumétrica dada, se establece determinando el tiempo de permanencia medio del medio de cultivo, requerido para producir un sobrenadante del vector que proporcione la eficacia de transducción máxima de la población de células diana.

Las condiciones y los parámetros del cultivo de células descritos anteriormente también se aplican a un método para producir un sobrenadante retroviral que tenga una elevada eficacia de transducción, a partir de células productoras derivadas de un organismo no murínico. Después de la siembra en el biorreactor de lecho empaquetado, las células se pueden cultivar continuamente a 37ºC ó 32ºC. Alternativamente, las células se cultivan inicialmente a 37ºC hasta que las células produzcan una monocapa confluente y, después de ello, se cultivan a 32ºC. Las células productoras derivadas de las líneas de células empaquetadoras no murínicas, producidas de acuerdo con el método anterior, son particularmente adecuadas para uso en este método para obtener el sobrenadante del vector. Células de este tipo incluyen, pero no se limitan a células productoras derivadas de células 293, células HT1080 y células D17. Las células productoras no murínicas se pueden derivar de células 293, y el sobrenadante retroviral se recolecta después de un tiempo de permanencia medio de 6 a 24 horas, partiendo del tiempo en el que las células productoras alcanzan una densidad de células de al menos 10^{6} células por ml.

Con el fin de conseguir densidades de células productoras máximas en el biorreactor de lecho empaquetado, es importante una ventilación adecuada del recipiente. Se ha señalado que con una transferencia de oxígeno suficiente, se obtienen sobrenadantes con eficacias de transducción elevadas. Condiciones de ventilación que proporcionan una saturación del aire mayor del 20%, de preferencia entre 20% y aproximadamente 60%, son necesarias para conseguir una producción eficaz de vectores. Las más preferidas son condiciones de ventilación que proporcionan más del 40% de saturación de aire.

Un experto en la técnica puede determinar fácilmente el medio de cultivo más adecuado para las células utilizando un medio basal comercialmente disponible y suplementando el medio según se proporciona en la técnica. Las células se pueden cultivar en el medio suplementado con suero de bovino fetal (FBS - siglas en inglés), y los sobrenadantes del vector producidos en presencia de FBS. Sin embargo, para uso clínico, se prefiere medio exento de suero. Para conseguir esto, las células se pueden expandir inicialmente y hacer crecer en el biorreactor de lecho empaquetado en medio suplementado con FBS, y pueden ser conmutadas a una formulación de medio exento de suero para la producción de sobrenadantes del vector exentos de suero. Lo más preferiblemente, las células se cultivarán y los sobrenadantes del vector se producirán en medios exentos de suero partiendo de células derivadas de un banco de células primarias exentas de suero.

El método descrito también se puede utilizar para producir sobrenadante de vector retroviral que tenga una elevada eficacia de transducción, al sembrar células productoras de primates en un biorreactor de lecho empaquetado. Células productoras de primates adecuadas incluyen las derivadas de células 293, células ProPak-A y ProPak-X. Cuando la célula productora se deriva de una célula 293, es preferible recolectar el sobrenadante retroviral cuando el tiempo de permanencia medio en el medio de cultivo en el reactor sea de aproximadamente 6-24 horas, comenzando desde el instante en el las células productoras alcanzaron una densidad celular de al menos 10^{6} células por ml.

Se proporciona, además, un método para obtener un sobrenadante retroviral basado en MLV de elevada eficacia de transducción, adecuado para la terapia génica, que comprende cultivar células productoras derivadas de seres humanos bajo las condiciones descritas anteriormente. Células productoras derivadas de seres humanos se siembran en un biorreactor de lecho empaquetado que tiene una relación de superficie específica a volumen de aproximadamente 5 a 50 cm^{2}/ml, a una concentración que comienza a partir de aproximadamente 2 a 3 x 10^{4} células/cm^{2}, bajo perfusión constante, con una ventilación suficiente para mantener el medio de cultivo en aproximadamente un 20% a 60% de saturación de aire, preferiblemente en o mayor que 40% de saturación de aire. Las células se cultivan a una temperatura de aproximadamente 37ºC hasta que crezcan hasta una densidad celular de al menos 10^{6} células por ml, tras lo cual la temperatura se hace descender hasta 32ºC. Después, el sobrenadante retroviral se recoge tras 6 hasta aproximadamente 24 horas adicionales de tiempo de incubación. Células humanas útiles en este método incluyen, pero no se limitan a las derivadas de células 293, células HT1080, células ProPak-A y células ProPak-X.

El presente método para producir sobrenadantes de vectores retrovirales comprende también co-cultivar dos o más líneas de células productoras bajo las condiciones descritas anteriormente. En estas circunstancias, el biorreactor de lecho empaquetado se siembra con dos o más líneas de células productoras diferentes, que contienen preferiblemente el mismo vector y que tienen tropismos complementarios, p. ej. células productoras derivadas de líneas de células empaquetadoras anfotrópicas y xenotrópicas humanas. Esta técnica de co-cultivo da como resultado una amplificación del número de copias del vector dentro de las células productoras, y proporciona sobrenadantes de vectores que contienen una mezcla de partículas de vectores retrovirales que fijan como objetivo distintos receptores expresados en la mayoría de las células humanas.

También se proporciona el sobrenadante del cultivo producido por los métodos descritos en esta memoria.

Se ha demostrado que el sobrenadante transduce células y, en particular, células madre de manera muy eficaz.

Antes de la transducción, las células madre se aíslan y seleccionan. Métodos de aislar y seleccionar células son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se utilizan células CD34^{+}Thy1^{+}lin^{-} clasificadas a partir de médula ósea de adulto (ABM- siglas en inglés) o sangre periférica movilizada (MPB- siglas en inglés). CD34^{+}Thy1^{+}lin^{-} están muy enriquecidas en células madre hematopoyéticas humanas. Véase la patente de EE. UU. nº 5.061.620.

Para aislar células madre se pueden utilizar diversos métodos. Con el fin de ilustrar un método para preparar células madre a partir de ABM, 20 mL de médula ósea reciente se pueden aislar mediante aspiración de la cresta iliaca de voluntarios humanos normales. La médula se separa tomando una fracción de células mononucleares siguiendo una separación de Ficoll-Perque y se seleccionaron de manera positiva para células CD34^{+} de acuerdo con el método descrito por Sutherland et al. (1992) Exp. Hematol, 20: 590. En síntesis, las células se resuspenden en tampón de tinción (SB - siglas en inglés) (HBSS que contiene HEPES 10 mM, FCS inactivado por calor al 2%) a razón de 5 x 10^{7} células/ml. Se añaden QBEND10^{TM} (anti-CD34) (Amac, Westbrook, ME) a una dilución de 1/100, y después las células se incuban en hielo durante 30 min. Luego, las células se lavan en SB con una subcapa de FCS y se resuspenden a razón de 4 x 10^{7}/mL en SB. Un volumen igual de perlas magnéticas de Fc de IgG_{1} anti-ratón de oveja Dynal lavadas (Dyanl, Oslo, Noruega) se añade a una relación de perla a célula de 1:1 para dar una concentración final de células de 2 x 10^{7} células/mL. Después de 30 min de incubación en hielo, con una inversión suave, el tubo se colocó contra un imán Dynal (Dynal) durante 2 minutos y las células CD34^{-} se separaron. Después de dos lavados, se añaden 20 mL de "glicoproteasa" (O-sialoglicoproteína endopeptidasa, Accurate Chemical, Westbury, Nueva York) más 180 mL de RPMI (JRH Bioesciences)/FCS al 20%, y las perlas se incuban a 37ºC durante 30 min para escindir el epítopo QBEND10, y liberar células CD34^{+} a partir de las perlas. Luego, las perlas se lavan tres veces para maximizar la recuperación de células. La glicoproteasa utilizada para la etapa de liberación en el proceso de selección positivo ha demostrado
no llevar a cabo una subsiguiente expansión ex vivo de los progenitores (Marsh et al. (1992) Leukemia 6: 926).

Muestras de sangre periférica movilizada (MPB) se pueden obtener con un consentimiento informado de pacientes de mieloma múltiple. Los pacientes se tratan el día 1 con ciclofosfamida a razón de 6 g /m^{2} (1,5 g/m^{2} cada 3 horas x 4 dosis). Desde el día 1 hasta el comienzo de la leucoforesis (habitualmente 10-28 días), se administra factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF- siglas en inglés) a razón de 0,25 mg/m^{2}/día. La aferesis para los glóbulos blancos totales se inicia cuando el recuento de glóbulos blancos en la sangre periférica es mayor que 500 células/ml, y el recuento de plaquetas es mayor que 50.000 células/ml. Los pacientes se someten a aferesis diariamente hasta que se recogen de 6 x 10^{8} células mononucleares (NMC - siglas en inglés).

Después, muestras recientes de MPB se elutrían con un dispositivo de elutriación a contraflujo JE5.0 de Beckman, equipado con una cámara Sanderson (Beckman, Palo Alto, CA). Las células se resuspenden en medio de elutriación (Biowhittaker, Walkersville, MD) a pH 7,2, suplementado con albúmina de suero humano (HSA- siglas en inglés) al 0,5%. La velocidad del rotor se ajusta a 2000 rmp, las células se introducen y la primera fracción se recoge a un caudal de 9,6 ml/min. Las fracciones 2 y 3 se recogen a los caudales respectivos de 14 y 16 ml/min. Las células mayores que permanecen en la cámara se recogen después de parar el rotor. Las células se resuspenden en RPMI suplementado con HSA al 5%, 10 mg/ml de ADNasaI y penicilina/estreptomicina a 50 U/ml y 50 g/ml, respectivamente. Las fracciones 2 y 3 se agrupan y se incuban con 1 mg/ml de gamma-globulina humana inactivada por calor para bloquear la unión de Fc no específica. Los granulocitos se agotan adicionalmente mediante incubación con CD15 conjugado a perlas magnéticas Dynal M450^{TM}, Oslo, Noruega) seguido de selección magnética.

Células CD34^{+}Thy1^{+}lin^{-} se aíslan a partir de ABM y MPB mediante citometría de flujo como sigue. Anticuerpos contra CD14 y CD15 se obtuvieron en forma de conjugados de FITC de Becton-Dickinson. Los anticuerpos contra Thy-1 (GM201) se pueden obtener a partir de una fuente comercial o se pueden preparar y detectar con conjugado anti-IgG1-PE de Caltag. El anticuerpo contra CD34 (Tük 3) también se puede obtener comercialmente y detectar con un conjugado anti-IgG3-Texas Red (Southern Biotechnologies).

El anticuerpo anti-CD34 o un control apareado de isotipo IgG3 se añade a células en tampón de tinción (HBSS, FCS al 2%, HEPES 10 mM) durante 20 minutos en hielo, junto con anticuerpo anti-Thy-1 a razón de 5 \mug/ml. Las células se lavan con una subcapa de FCS y luego se incuban con anticuerpo IgG3 anti-ratón de cabra conjugado con Texas Red y anticuerpo IgG1 anti-ratón de cabra conjugado con ficoeritrina durante 20 minutos en hielo. IgG1 bloqueante se añade después durante 10 minutos. Después del bloqueo, se añade el panel de anticuerpos de linaje conjugado con FITC (CD14 y CD15) y se incuba durante otros 20 minutos en hielo. Después de un lavado final, las células se resuspenden en tampón de tinción que contiene yoduro de propidio (PI- siglas en inglés).

Las células se clasifican en un clasificador de células Vantage (Becton Dickinson) equipado con lásers de ion argón duales, emitiendo el láser principal a 480 nm y emitiendo un láser de tinción (Rhodamine 6G) a 600 nm (Coherent Innova 90, Santa Cruz, CA). Eritrocitos residuales, desechos y células muertas son excluidos mediante análisis restringido a subpoblaciones seleccionadas basándose en la dispersión de luz más una puerta baja FL3 (PI). La población de células clasificadas se diluye a razón de 1:1 en HBSS, se sedimenta y se resuspende en HBSS para el recuento por el hemocitómetro.

Para la transducción, las células clasificadas se suspenden en sobrenadante retroviral reciente o recientemente descongelado, diluido en medios apropiados que tienen citoquinas. Después, las células y el vector se centrifugan y resuspenden y se cultivan en medios enriquecidos en citoquinas durante aproximadamente tres días. Para cultivar células madre o progenitoras hematopoyéticas CD34+, las citoquinas son preferiblemente una combinación que incluye, pero no exclusivamente, IL-3, IL-6, LIF y SCF. Al cabo de tres días, las células se recolectan y se utilizan para determinar la frecuencia de transducción a granel según se describe más abajo. Alternativamente, las células se pueden introducir en un paciente por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica de la terapia génica.

Se proporciona, además, un método para aumentar la eficacia de transducción de genes de una célula al transducir células diana con un sobrenadante de vector retroviral derivado de una o más células empaquetadoras recombinantes producidas por los métodos descritos en esta memoria.

Preferiblemente, la célula diana es una célula hematopoyética primaria tal como una célula madre. El sobrenadante retroviral se puede derivar del cultivo de ProPak-A.6 o ProPak-A.52 y ProPak-X. La eficacia de transducción de una población de células también se puede incrementar inoculando o transduciendo la población de células diana con partículas de vector de más de un tropismo. Esto se consigue transduciendo las células con una partícula de vector que tiene una proteína de la envoltura modificada según se describe antes, en donde la proteína de la envoltura se puede unir a más de un receptor. Los Ejemplos 6 y 7 que figuran a continuación proporcionan la transducción de células diana con una partícula de vector que tiene una envoltura anfotrópica/xenotrópica quimérica, codificada por el gen env de Eax. Alternativamente, las células se transducen simultáneamente con sobrenadantes de vectores que contienen partículas de tropismos complementarios, p. ej. sobrenadantes de vectores anfotrópicos y xenotrópicos, mezclados en un único inóculo. El inóculo que contiene sobrenadantes de vectores de diferentes tropismos se puede preparar mezclando los dos sobrenadantes obtenidos de sus respectivas células protectoras cultivadas por separado, o las dos líneas de células productoras complementarias se pueden co-cultivar para producir un único sobrenadante que contiene los dos tipos de partículas de vectores. En un co-cultivo, un recipiente de producción, preferiblemente un biorreactor de lecho empaquetado, se siembra con una mezcla de células productoras con tropismos complementarios que producen partículas de vector que son capaces de transducir células humanas.

Las células se pueden transducir con un sobrenadante retroviral producido a partir del co-cultivo de una línea de células productoras ProPak-A y una línea de células productoras ProPak-X, específicamente ProPak-A.52LMiLy y ProPak-XLMiLy. El co-cultivo de células productoras ProPak-A y ProPak-X tiene la ventaja de que no produce RCR. Se consiguió casi un 100% de transferencia de genes utilizando sobrenadantes de co-cultivo de este tipo en células CD34+ derivadas de MPB.

Todavía otro aspecto es un método para producir una línea de células empaquetadoras capaz de expresar más de una proteína de la envoltura con tropismo para células humanas, p. ej. proteínas de la envoltura anfotrópicas y xenotrópicas. Esta línea de células empaquetadoras se deriva por introducción de plásmidos de expresión para otros genes de la envoltura en una línea de células empaquetadoras existente. Por ejemplo, células ProPak-A.6 se pueden transfectar con el plásmido de expresión pCI-Ex, y se pueden aislar clones de células que secretan partículas de vectores que transducen células Quail u otras células que son transducidas por partículas xenotrópicas, pero no por partículas anfotrópicas. Sería de esperar que partículas de multitropismo de este tipo transdujeran células diana con una elevada eficacia en situaciones en las que las células diana expresan los receptores individuales, pero a concentraciones demasiado bajas como para permitir una formación estable del complejo vector-célula por parte de las partículas anfotrópicas o xenotrópicas puras.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, no limitar el alcance de la invención según se define en las reivindicaciones.

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Parte experimental

Tal como se señala anteriormente, una terapia génica de éxito mediada por retrovirus requiere líneas de células empaquetadoras seguras y eficaces para la producción de partículas del vector. Líneas empaquetadoras existentes para vectores basados en virus de la leucemia murina se derivan predominantemente de células NIH/3T3 que portan secuencias virales murinas endógenas que podrían participar en la recombinación para formar retrovirus competentes para la replicación (RCR), haciéndoles con ello inseguros. Se proporcionan en esta memoria métodos para construir líneas de células empaquetadoras retrovirales seguras y eficaces para la producción de partículas de vectores así como las líneas de células, así obtenidas.

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Materiales y Métodos

A menos que se establezca de otro modo, los materiales y reactivos se preparan y los métodos se realizan según se recoge más abajo. Las líneas de células productoras se denominan señalando la línea de células empaquetadoras y el vector insertado. Por ejemplo, PA.SVNLZ designa una línea de células productoras derivada de la línea de células empaquetadoras PA317 que porta el vector SVNLZ. PP-A y PP-X designan ProPak-A y ProPak-X, respectivamente.

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Líneas de células basadas en PA317 y vectores retrovirales

Las líneas de células productoras de vectores retrovirales descritas en esta memoria se generaron a partir de la línea de células empaquetadoras PA317 anfotrópicas, producida de acuerdo con los métodos de Miller y Buttimore, (1986) Mol. Cell Biol. 6: 2895-2902.Líneas de células productoras, la línea de células empaquetadoras GP+E86, producida de acuerdo con el método de Markowitz, et al. (1988) J. Virol. 62. 1120-1124, y células NIH/3T3 (ATCC CRL1658) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM - siglas en inglés) suplementado con 4,5 g/L de glucosa, L-glutamina 4 mM y suero de ternero cósmico al 5% (CCS- siglas en inglés, Hyclone, UT). La línea de carcinoma epitelial humana HeLa (ATCC CCL2) se cultivó en DMEM suplementado con 4,5 g/l de glucosa, L-glutamina 4 mM y suero de bovino fetal al 10% (FBS, Hyclone, UT). La línea de células linfoide humana Jurkat se cultivó en RPMI suplementado con 4,5 g/L de glucosa, L-glutamina 2 mM y FBS al 10%. Todas las líneas de células se mantuvieron en una incubadora a 37ºC bajo 5% de CO_{2}, a menos que se establezca de otro modo.

Los vectores SVNLZ (véase Bonnerot, et al, (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 84: 6795-6799) y LMTNL se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Escaich et al. (1995) Human Gene Therapy 6: 625-634). La Figura 2 recoge un mapa de estos vectores. El vector SVNLZ codifica el gen LacZ con una señal de localización nuclear expresada a partir del promotor temprano del virus de simio 40 (Figura 2). El vector LMTNL codifica un mutante trans-dominante de la proteína Rev de VIH (RevM10) expresada de la LTR de MMLV y el gen neomicina fosfotransferasa (neo) expresado a partir del promotor de timidina quinasa (Figura 2).

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Condiciones de cultivo de PA317

Para la producción del vector, células productoras basadas en PA317 se sembraron en recipientes de cultivo a una densidad de 3 x 10^{4} células/cm^{2}, a modo que se indique de otro modo. Una vez que las células habían formado una monocapa confluente (aproximadamente 3 días), se sustituyó el medio y la temperatura se hizo descender de 37ºC a 32ºC. Se utilizaron tres tipos de recipientes de cultivo: (1) matraces de cultivo de tejidos de 75 cm^{2} con tapones de filtro (Costar, Cambridge, MA): (2) botellas rotatorias de 900 cm^{2} con tapones de filtro (Costar, Cambridge, MA); ó (3) un biorreactor de lecho empaquetado a pequeña escala (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) con 10 g de discos Fibra Cell^{TM} (12.000 cm^{2}). Se separaron muestras del biorreactor (1 ml) con una jeringa estéril a través de una lumbrera de muestreo. Las muestras de sobrenadante se clarificaron de desechos celulares mediante filtración a través de filtro de nitrocelulosa de 0,45 \mum (Nalgene, Rochester, NY), se congelaron rápidamente en metanol/hielo seco y se almacenaron a -70ºC. Los sobrenadantes congelados se descongelaron a 37ºC y se mantuvieron en hielo hasta el ensayo. Todos los sobrenadantes utilizados en este estudio estaban exentos de retrovirus competentes para la replicación, según se determina por el ensayo S+L en células PG4, según se describe en Cornetta, et al. (1993) Human Gene Therapy 4: 579-588 y Forestell et al. (1996) J. Virological Methods 60:171-178.

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Ensayos de vectores retrovirales Titulación de punto final de LacZ

Células NIH/3T3 se extendieron en placas de 24 pocillos a razón de 5 x 10^{4} células por pocillo y se inocularon al día siguiente con 0,2 ml de sobrenadante de vector diluido (series de dilución de 10^{-1} a 10^{-6}) en presencia de polibreno (8 \mug/ml). Después de tres horas, el inóculo se aspiró y se añadieron 0,5 ml de medio reciente. Tres días después de la inoculación, las células se fijaron con glutaraldehído al 0,5% y se tiñeron con X-gal utilizando el protocolo de Bagnis et al. (1993) Oncogene 8: 737-743. El título de punto final (ufc/ml) se calculó haciendo un recuento del número estadísticamente representativo de colonias azules en un pocillo, multiplicado por el factor de dilución y se dividió por el volumen del inóculo. Todas las titulaciones de punto final se llevaron a cabo por duplicado.

Para los vectores xenotrópicos preparados utilizando ProPak-X, las titulaciones se realizaron utilizando el mismo proceso, excepto que como células diana se utilizaron células 293 humanas.

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Eficacia de transducción de LacZ

Células se extendieron en placas de 24 de pocillos a razón de 5 x 10^{4} células por pocillo y se inocularon al día siguiente con 0,2 ml de sobrenadante de una dilución 1:1 de sobrenadante de vector con medio en presencia de polibreno (8 \mug/ml). Tres horas más tarde, el inóculo se aspiró y se añadieron 0,5 ml de medio reciente. Las eficacias de transducción se determinaron tres días después de la inoculación mediante citometría de flujo utilizando el kit de detección de LacZ FluoReporter^{TM} (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Para células NIH/3T3 ó 293, la reacción con fluoresceína di-\beta-galactopiranósido (FDG) se enfrió bruscamente después de un minuto con fenetiltio-\beta-D-galactopiranósido (PETG) 1 mM. Para células Jurkat y HeLa, PETG se añadió después de una hora de incubación en hielo. La adquisición y el análisis se realizaron utilizando un FACScan de Becton Dickinson y el paquete de software LYSYS. La eficacia de transducción se determinó como el porcentaje de células que expresan el gen LacZ (intensidad de fluorescencia verde) por encima de los niveles de fluorescencia basales definidos como la de células control no transducidas.

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Titulo de punto final de resistencia a G418

Se llevaron a cabo titulaciones en placas de 6 pocillos sembradas con 2,5 x 10^{4} células NIH/3T3 por pocillo y se inocularon al día siguiente con 1,0 ml de sobrenadante de vector diluido (series de dilución 10^{-1} a 10^{-6}). Tres horas más tarde, el inóculo se aspiró y se añadieron 2,0 ml de medio reciente. Un día después de la inoculación, se añadió G418 a cada uno de los pocillos a una concentración final de 0,7 mg/ml y el medio se sustituyó según se requería hasta que se podían observar colonias individuales (típicamente, 10 a 14 días). El título de punto final (ufc/ml) se calculó mediante un recuento del número estadísticamente representativo de colonias resistentes a G418 en un pocillo y se multiplicó por el factor de dilución.

Para los vectores xenotrópicos preparados utilizando ProPak-X, las titulaciones se llevaron a cabo utilizando el mismo proceso, excepto que como células diana se utilizaron células 293 humanas.

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Eficacia de transducción de resistencia a G418

Células se sembraron en placas de 6 pocillos a razón de 1 x 10^{5} células por pocillo. Al día siguiente, las células se inocularon con 1,0 ml de una dilución 1:1 de sobrenadante de vector con medio en presencia de polibreno (8 \mug/ml). Tres horas más tarde, el inóculo se aspiró y se añadieron 2,0 ml de medio reciente. Tres días después de la inoculación las células adherentes se tripsinizaron y se sembraron en placas de 6 pocillos a series de dilución de 10 veces desde 10^{5} células/pocillo a 1 célula/pocillo. Las células Jurkat se extendieron en medio de metilcelulosa para permitir puntuar a colonias individuales. Se sembraron placas por duplicado y se incubaron en presencia o ausencia de G418. El porcentaje de la eficacia de transducción se calculó como el número de colonias resistentes a G418, dividido por el número de colonias que se formaban en ausencia de G418, multiplicado por 100.

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Los siguientes métodos se refieren a los Ejemplos 6-12.

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Cultivo de células empaquetadoras retrovirales

Líneas de células empaquetadoras y productoras se hicieron crecer en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM: JRH Biosciences, Lenexa, KS) suplementado con suero de bovino fetal (FBS: HyClone Laboratories Inc., Logan, UT) al 5% (PA317 (Miller y Buttimore, (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 2895-2902), PG13 (Miller et al., (1991) J. Virol. 65: 2220-2224)) o al 10% (ProPak).

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Construcciones de expresión y vectores retrovirales

Proteínas Gag-Pol y Env se expresaron a partir de plásmidos separados que, junto con los vectores retrovirales utilizados en este estudio, se describen en las Figuras 1 y 2. En esta memoria se describen métodos para la derivación y el análisis de células que expresan proteínas MLV, el análisis de proteínas Gag-Pol y Env y sobrenadantes de cultivos de tejidos y la titulación de vectores retrovirales que codifican el antígeno Lyt2 (Rigg et al. (1995) J. Immunol. Meth. 188: 501-509). Una línea de células productoras y el respectivo sobrenadante del vector retroviral se indican por el nombre de la célula seguido por un punto y el nombre del vector, p. ej. ProPak-A.LLySN (anfotrópica), ProPak-X.LLySN (xenotrópica), PA317.LMiLy o PG13.LMiLy. Co-cultivos de líneas de células productoras basadas en ProPak-X y ProPak-A se indican con una barra inclinada, es decir ProPak-A/X.LMiLy.

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Producción de sobrenadante de vector

Células productoras se sembraron en recipientes de cultivo a una densidad de 3 x 10^{4} célula/cm^{2} o mayor. Una vez que las células habían formado una monocapa confluente (aproximadamente a los 3 días), el medio se sustituyó y la temperatura se hizo descender desde 37ºC a 32ºC. Después de ello, el sobrenadante se recolectó a intervalos de 12 horas. Para la producción del sobrenadante en matraces T procedentes de agrupaciones de células productoras portadoras de LLySN, el medio se recolectó repetidamente durante hasta 10 días a 32ºC. Después, los sobrenadantes se compararon en cuanto a su capacidad para transducir líneas de células NIH/3T3 ó 293, y aquellos sobrenadantes que proporcionaban la transducción más elevada se utilizaron en los estudios que se recogen en esta memoria. Se utilizaron tres tipos de recipientes de cultivo: (1) matraces de cultivo de tejidos de 75, 162 ó 225 cm^{2} con tapones de filtro (Costar, Cambridge, MA): (2) botellas rotatorias de 900 cm^{2} con tapones de filtro (Costar, Cambridge, MA); y (3) un biorreactor de lecho empaquetado de 500 ml a pequeña escala (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) con 10 g de discos Fibre Cell (12.000 cm^{2}). El biorreactor se sembró con 5 x 10^{5} células/ml, y el medio se hizo circular mediante un impulsor de tipo marino. Una ventilación suplementaria se consiguió mediante micro-rociado directo de una mezcla de calidad médica de aire con 5% de CO_{2}, y para prevenir el deterioro de las células por cizalladura se añadió Pluronic F-68 al 0,01% (Sigma, St. Louis, MO). Los sobrenadantes del vector se despejaron de desecho celular mediante filtración a través de filtros de nitrocelulosa de 0,45 \mum (Nalgene, Rochester, NY), se congelaron rápidamente en metanol/hielo seco y se almacenaron a -70ºC. Partes alícuotas se descongelaron a 37ºC y se mantuvieron en hielo hasta ser usadas. Todos los sobrenadantes utilizados en los experimentos de transferencia génica estaban exentos de retrovirus competentes para la replicación (RCR) según se determina por el ensayo de S+L extendido en células PG4 (Forestell et al., (1996) J. Virol. Meth. supra).

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Procesos de inoculación

A menos que se establezca de otro modo, las células se inocularon con vector una vez a la gravedad unidad durante 3 h a 37ºC. La inoculación bajo centrifugación, denominada espinoculación (Kotani et al., (1994) Hum. Gene Ther. 5: 19-28; Bahnson et al., (1995) J. Virol. Meth. 54: 131-143; Forestell et al., (1996) supra) se realizó a 2550 g durante 3 ó 4 h. Se añadió polibreno (8 \mug/ml) o sulfato de protamina (4 \mug/ml) para inocular las líneas de células o las células primarias, respectivamente.

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Purificación de células hematopoyéticas primarias

PBL se aislaron de células mononucleares de la sangre periférica según se describe (Rigg et al., (1995) supra) y se desproveyeron de células CD8-positivas. La fracción CD34-positiva (CD34+) se aisló a partir de sangre periférica movilizada (MPB) o médula ósea de adulto (ABM - siglas en inglés) con la columna de afinidad Baxter Isolex^{TM} (Baxter Healthcare, Deerfield, IL). La purificación ulterior para obtener la fracción que porta el antígeno Thy-1 (CD34+/Thy+) se consiguió mediante clasificación citométrica de flujo a alta velocidad, según se describe por Sasaki et al., (1995) J. Hemat. 4: 503-514). Células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC- siglas en inglés) se cultivaron en una mezcla 1:1 de medios IMDM y RPMI que contenían FBS al 10%, IL-3 e IL-6 (20 ng/ml cada uno; Sandoz Pharma, Basilea, Suiza) y factor de células madre (SCF - siglas en inglés; Amgen. Inc., Thousand Oaks, CA) o factor inhibidor de la leucemia (LIF - siglas en inglés; Sandoz) (100 ng/ml).

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Ensayos de eficacia de transducción

Las eficacias de transducción conseguidas con sobrenadantes del vector codificante de Lyt2 se cuantificaron como la proporción de células diana que expresaban antígeno Lyt2, 2 ó 3 días después de la inoculación (Rigg et al., (1995) supra). La integración del gen RevM10 en la progenie clonogénica de HSPC se determinó mediante PCR. Metilcelulosa (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá) se suplementó con IL-3, IL-6; SCF, eritropoyetina (Amgen. Thousand Oaks, CA) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (Immunex, Seattle. WA). Se tomaron colonias individuales de todos los linajes (CFU-C), después de 12 a 14 días de cultivo en cultivo de metilcelulosa y se ensayaron en cuanto al gen revM10 en ADN celular utilizando un ensayo de PCR según se describe en Plavec et al. (1996) Gene Therapy 3: 723. Las colonias fueron puntuadas positivas si se detectaron secuencias tanto revM10 como de \beta-globina.

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Ejemplo 1 Construcción de células empaquetadoras

Para minimizar la posibilidad de recombinación con secuencias virales endógenas para formar RCR, líneas de células candidatas se rastrearon en cuanto a ácidos nucleicos retrovirales endógenos y, en particular, ácidos nucleicos de MMLV endógenos. El ADN genómico procedente de una diversidad de líneas de células se analizó mediante hibridación por transferencia Southern por el método generalmente descrito en Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, utilizando sondas específicas para repeticiones terminales largas (LTR) de MMLV de retrovirus o secuencias gag-pol de MMLV. Se rastrearon las siguientes líneas de células: células CHO que se utilizan para producir proteínas recombinantes; células Vero y MRC-5, en las que se producen vacunas (OMS (1989) "Technical Report Series nº 786" OMS, Ginebra) y células 293 de riñón embrionario humano (ATCC CRL 1573) que se utilizan para producir vectores de adenovirus para aplicaciones de terapia génica clínicas y vectores retrovirales (Pear et al., (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 90: 8392-8396; Finer et al. (1994) Blood 83: 43-50). También se incluyeron fibroblastos de la cola de Mus dunni (NIH), dado que se informa que estas células están exentas de secuencias de MMLV endógenas (Lander y Chattopadhtyay (1984) J. Virol. 53: 695-698). ADN genómico procedente de células NIH/3T3, la base para la mayoría de las líneas de células empaquetadoras existentes, se hibridaba muy intensamente con las dos sondas específicas para MMLV a una rigurosidad baja o elevada. Las condiciones de hibridación se proporcionan en las claves que figuran debajo de la Tabla 1. En contraposición, ninguna sonda se hibridaba cruzadamente con ADN genómico procedente de células 293 o MRC-5, incluso a una baja rigurosidad (Tabla 1). Además, no se observó hibridación cruzada alguna con ADN genómico procedente de Mus dunni, MDCK, células Vero o células de pulmón de zorro a elevada rigurosidad (véase la Tabla 1 que figura a continuación).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Rastreo de líneas de células para la hibridación cruzada a LTR de MMLV o secuencias gag-pol.

1

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Se descartaron células de pulmón de zorro y MRC-5 debido al deficiente crecimiento o al limitado potencial de división celular, respectivamente, que excluiría la subclonación de células establemente transfectadas. Así, células 293, MDCK, de Mus dunni y Vero fueron identificadas como líneas de células candidatas a partir de las cuales se pueden derivar líneas de células empaquetadoras.

Para disminuir la probabilidad de la formación de RCR, se construyeron plásmidos de expresión separados para gag-pol y env, según se describe en Danos (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 6460-6464; Danos y Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 6460-6464; Markovitz et al. (1988) J. Virol. 62: 1120-1124; Miller (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14; Morgenstern y Land (1990) Nucl. Acids Res. 18: 3587-3596. Sin embargo, en contraposición a células empaquetadoras existentes, únicamente se incluyó la información genética mínima requerida para codificar proteínas Gag-Pol y Env. Las secuencias de genes estructurales se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los cebadores mostrados más abajo para obtener los marcos de lectura abiertos (ORFs) desde los codones de iniciación a los de terminación de los genes gag-pol o env flanqueados por sitios de restricción NotI, y los fragmentos se subclonaron en pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, California). Cebadores de oligonucleótidos (Genosys Biotechnologies, Woodlands, Texas), correspondientes al extremo N de los genes, también colocaron el AUG en el contexto ideal para la traducción (Kozak (1987)) J. Mol. Biol. 196: 947-950) y los correspondientes al extremo C codificaron un segundo codón de detención en marco. La integridad de los productos de la PCR se verificó mediante secuenciación del ADN. El ORF de gag-pol se amplificó a partir del plásmido pVH-2 el cual porta la secuencia infecciosa del MLV de Moloney (Miller y Verma (1984) J. Virol. 49: 214-222), utilizando el par de cebadores:

5'-AAAAAAAAGCGGCCGCGCCGCCACCATGGGCCAGACTGTTACCAC-3'

(SEQ ID NO:1), y

5'-AAAAAAAAGCGGCCGCTCAttaGGGGGCCTCGCGGG-3'

(SEQ ID NO: 2).

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El ATG subrayado es el de p15Gag (bases 621 a 623) y el codón en minúsculas corresponde al codón de terminación pol (bases 5835 a 3837). El plásmido de expresión pCMV-gp con el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) humano se construyó insertando el fragmento gag-pol en el plásmido pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), del cual se había suprimido la casete de expresión de resistencia a neomicina (DraIII a BsmI). La Figura 1 muestra esquemáticamente las construcciones de plásmidos utilizadas para la expresión de genes estructurales de MMLV. Plásmidos que portan el ORF de gag-pol se propagaron a 30ºC para prevenir la recombinación bajo las condiciones recogidas en Joshi y Jeang (1993) Bio Techniques 14: 883-336.

Para amplificar el gen env, se construyó una secuencia de la envoltura anfotrópica contigua a partir de p4070A construida de acuerdo con el método de Ott et al. (1990) J. Virol 64: 757-766 y se amplificó con el par de cebadores:

3'-TAATCTACGCGGCCGCCACCATGGCGCGTTCAACGCTC-3'

(SEQ ID Nº 3) y

5'-AATGTGATGCGGCCGCtcaTGGCTCGTACTCTATGG-3'

(SEQ ID Nº 4).

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El ATG subrayado corresponde a las bases 37 a 39, y el codón de terminación (minúsculas) a las bases 1998 a 2000 (Ott et al., (1990) supra). El plásmido de expresión del promotor-env de CMV pCMV*Ea se creó mediante la inserción del ORF de env en lugar del gen beta-galactosidasa de pCMV\beta (Clontech, Palo Alto, CA), modificado por mutación de un ATG externo en el intrón SV40 en ACG (SD/SA*). La integridad de los productos de la PCR se verificó mediante secuenciación del ADN.

Para identificar adicionalmente la línea celular óptima, se desarrollaron ensayos ELISA de sándwich para detectar proteínas Gag y Env en células transfectadas y, particularmente, en sobrenadantes. Las placas se revistieron con sobrenadantes del cultivo de hibridoma de 83A25 (disponible de NIH) según se describe en Evans et al. (1990) J. Virol 64: 6176-6183, para Env o R187 (para ATCC CRL 1912) para Gag. Las proteínas capturadas se detectaron con antisueros 79S-834 y 77S-227 (Quality Biotech, Camden, Nueva Jersey), respectivamente, y anticuerpos anti-especies conjugados con peroxidasa de rábano picante y el sustrato, 2,2-azinobis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (Pierce, Rockford, Illinois).

La capacidad de producir partículas de vector se confirmó mediante transfección de un plásmido de expresión de gag-pol en líneas celulares candidatas y la selección de agrupaciones resistentes a fármacos. Únicamente, los sobrenadantes de células 293 transfectadas con gag-pol o células Mus dunni contenían proteína Gag. No se secretó Gag por parte de células Vero o MDCK transfectadas, a pesar de que el Gag estaba presente en los lisados celulares. Células Vero y MDCK se descartaron como líneas de células candidatas y células 293 humanas se eligieron para derivar células empaquetadoras.

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Construcción de ProPak-A

Para derivar células empaquetadoras anfotrópicas, el plásmido pCMV*Ea se introdujo en células 294 (ATCC CRL 1573) o mediante co-transfección (Profection Kit^{TM}, Promega, Madison, Wisconsin) a una relación de 15:1 con el plásmido pHA58 (según se describe en Riele et al., (1990) Nature 348: 649-651) que confieren resistencia a higromicina B (250 mg/ml: Boehringer, Indianapolis, Indiana). Poblaciones seleccionadas establemente se tiñeron con anticuerpo anti-Env (83A25, disponible de NIH) y células Env-positivas individuales se aislaron mediante deposición automática de las células en un FACStar Plus^{TM} (Becton Dickinson, San Jose, CA). Se caracterizaron adicionalmente tres clones con la intensidad de fluorescencia más elevada. Los tres proporcionaron títulos equivalentes tras co-transfección transitoria con plásmidos gag-pol y de vectores.

Seguidamente, la construcción pCMV-gp se transfectó establemente en uno de los tres clones 293-Env mediante co-transfección con el plásmido pSV2pac (según se describe en Vara et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 4617-4624). Clones resistentes a puromicina (1 mg/ml; Sigma, St. Louis, Missouri) se hicieron crecer hasta confluencia, el medio se sustituyó y los sobrenadantes se recogieron 16 horas más tarde, se filtraron y se analizaron en cuanto a la producción de Gag y Env utilizando el ELISA de sándwich según se describe en la página anterior. Se identificaron dieciseis clones (16/37) que secretaban altos niveles de antígenos Gag y Env. De éstos, seis clones producían virus en transfecciones transitorias a títulos de 2 a 3 veces de células Oz 2 (Tabla 2 A), el equivalente anfotrópico de células BOSC23 (véase Pear et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 8392-8396).

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TABLA 2A Comparación de títulos de punto final a partir de clones de células ProPak-A transitoriamente transfectados

2

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Las células se sembraron a razón de 2 x 10^{5} células/cm^{2} en placas de 6 pocillos y se transfectaron 16 horas más tarde con 2,5 mg/pocillo de ADN de MFG-lacZ (Dranoff et al. (1993) supra y descrito en esta memoria) en presencia de cloroquina 25 mM (Pear et al. (1993), supra). Los títulos son la media y el intervalo para transfecciones por duplicado. Las células Oz 2 se denominan también células Bing y son el equivalente anfotrópico de células BOSC23 (véase Pear et al. (1993)).

TABLA 2B Comparación de títulos de punto final a partir de clones de células productoras estables con el vector LMTNL

3

Se seleccionó un clon con elevados títulos de transfección transitorios y se designó ProPak-A.6. ProPak-A.6 se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 EE.UU. el 15 de diciembre de 1995, bajo las provisiones del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes, y se le asignó el Nº de acceso ATCC CRL 12006. Los títulos transitorios reflejan la eficacia de la transfección transitoria, y los títulos obtenidos con células ProPak-A son más bajos que los conseguidos con células Oz 2, posiblemente debido a que Oz 2 se basa en el clon de células 293T, seleccionado para una elevada eficacia de la transfección transitoria (Pear et al. (1993) supra).

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Construcción de ProPak-X

Una línea de células empaquetadoras xenotrópica, designada ProPak-X se construyó como sigue. El ATG en el donante de corte y empalme/aceptor de corte y empalme del plásmido pCMV se mutó a ACG según se describe antes. El promotor CMV se escindió (EcoRI/XhoI, de extremos romos) y se reemplazó por la LTR de MoMLV (Asp 718/HindIII, extremos romos) procedente del plásmido pVH2. El gen \beta-galactosidasa fue reemplazado por el ORF de gag-pol (fragmento NotI) para generar pMoMLVgp. pMoMLVgp fue co-transfectado con pHA58 en células 293 (ATCC CRL 1573) mediante co-precipitación con fosfato de calcio, y se seleccionaron células resistentes a higromicina B. Los clones se rastrearon en cuanto al nivel de secreción de Gag y se seleccionó un clon que secretaba altos niveles de Gag (designado ProGag); este clon proporcionaba elevados títulos virales en la transfección transitoria.

El plásmido pNZBxeno, que contenía el gen env xenotrópico murínico, se obtuvo de Christine Kozak (NIH). Las secuencias env no contiguas en pNZBxeno se convirtieron en contiguas mediante digestión con SalI y EcoRI y ligamiento en el sitio SalI de pBluescript (Stratagene). El ORF de env xeno se amplificó mediante PCR y se clonó en pCI digerido con XhoI/XbaI (Promega) para generar el plásmido de expresión pCI*Ex. pCI*Ex se co-transfectó con pSV2pac en la línea de células seleccionada como antes (ProGag) mediante precipitación con fosfato de calcio y se seleccionaron células resistentes a puromicina. Las células resultantes se rastrearon en cuanto a la expresión de Env mediante citometría de flujo, y clones designados ProPak-X que expresan altos niveles de Env, se rastrearon en cuanto a su capacidad de producir un vector de transducción. Muestras de un clon, el clon 36 designado ProPak-X.36, han sido depositadas ante la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, EE.UU. el 15 de diciembre de 1995 bajo las provisiones del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes, y el depósito fue acordado bajo el nº de acceso ATCC CRL 12007.

Sobrenadante producido por células productoras basadas en ProPak-X se sometió a ensayo en cuanto al título de punto final y la eficacia de transducción según se describe antes, excepto que como células diana se utilizaron células 293 humanas.

De una manera similar a ProPak-X, líneas de células anfotrópicas también se derivaron mediante transfección del plásmido codificador de la envoltura anfotrópica, pCMV*Ea, en células ProGag y el aislamiento de clones, produciendo elevadas eficacias de transducción. Uno de estos, el clon número 52 (ProPak-A.52) se utiliza ampliamente en experimentos descritos en esta memoria.

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Carencia de RCR

La seguridad de las células ProPak-A se determinó sometiendo a ensayo riguroso la capacidad de recombinarse para generar RCR. En trabajos previos, se encontró que el vector BC140revM10 (Bevec et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 9870-9874) daba lugar, de manera reproducible, a RCR en células PA317. BC140revM10 porta la secuencia empaquetadora extendida, incluido el ATG del ORF de gag. El vector LMTNL (construido según se describe en Escaich et al. (1995) supra), en contraposición, carece de parte de la región 5' no traducida y no contiene secuencias gag y, por lo tanto, es menos probable que se recombine y forme RCR. (Véase la Figura 2). Los vectores BC140revM10 o LMTNL se introdujeron en cada caso en células PA317 o ProPak-A y los sobrenadantes del cultivo se sometieron a ensayo en cuanto a RCR (utilizando los métodos descritos en Haapala et al. (1985) J. Virol. 53: 827-833 y Printz et al. (1995) Gene Therapy 2: 143-150) a intervalos semanales. La combinación PA317/BC140revM10 (transfectada o transducida) dio lugar a RCR detectable mediante inoculación directa del sobrenadante del cultivo sobre células PG4 a las 4 semanas (Tabla 3, más abajo). Los cultivos se mantuvieron durante 4 semanas más y también se sometieron a ensayo mediante co-cultivo de células productoras con células M. dunni para amplificar cualquier RCR en el cultivo, seguido de ensayo S+L en células PG4. Incluso mediante este ensayo riguroso para RCR, las agrupaciones productoras basadas en ProPak-A estaban todas ellas exentas de RCR (Tabla 3)

TABLA 3 Ensayo en cuanto a la presencia de RCR en cultivos que portan el vector BC140revM10 o LMTNL

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Resistencia a la inactivación por parte de suero humano

Recientemente, ha surgido un interés por la aplicación in vivo de la transferencia de genes retrovirales mediante administración directa de partículas de vector en seres humanos. Además, se ha reseñado la fijación como objetivo de partículas que portan genes env ecotrópicos de ligandos híbridos a receptores específicos (Kasahara et al. (1994); Science 266: 1373-1376; Somia et al. (1995); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 7570-7574; Cosset et al. 1995) J. Virol. 69: 6314-6322). Un requisito previo es que las partículas no sean inactivadas por suero humano. Por lo tanto, partículas de vector empaquetadas con ProPak-A.6 o A.52, ProPak-X o PA317 se analizaron en cuanto a la susceptibilidad a la inactivación por parte de suero humano. Adicionalmente, se analizaron sobrenadantes ecotrópicos empaquetados en células PE501 (basado en NIH/3T3; véase Miller y Rosman, (1989) Biotechniques 7: 980-990) o en células 293. Partículas de vector con las diversas envolturas, producidas a partir de células 293, eran resistentes, mientras que los sobrenadantes empaquetados en células NIH/3T3 fueron inactivados mediante incubación con suero humano (Figura 3). Takeuchi et al. (1994) supra concluyeron que la resistencia de partículas de vector al suero humano se determinó tanto por el tipo de célula hospedadora como por la envoltura viral. Los datos presentados en esta memoria demuestran que el empaquetamiento de vectores anfotrópicos, xenotrópicos y ecotrópicos en células basadas en 293 es suficiente para conferir resistencia al complemento humano.

Para los datos presentados en los Ejemplos 2 y 3 en esta memoria, la línea de células empaquetadoras parental era PA317 a menos que se señale de otro modo.

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Ejemplo 2 Comparación del título de punto final y la eficacia de transducción

Para aplicaciones de terapia génica, es necesario generar grandes volúmenes de sobrenadantes caracterizados, que no se pueden preparar fácilmente mediante transfección transitoria.

Por lo tanto, era necesario determinar los títulos de punto final estables y las eficacias de transducción. Los títulos de punto final se determinaron para sobrenadantes procedentes de clones de células productoras que habían sido transducidos con el vector PA.LMTNL, en el que un promotor de timidina quinasa interno (T en el nombre del vector) activa el gen neomicina fosfotransferasa (N). Tal como se muestra en la Tabla 2B, títulos de punto final procedentes de células productoras basadas en ProPak-A eran marginalmente más elevados que los del mejor clon productor basado en PA317. Además, los títulos procedentes de agrupaciones productoras de ProPak-A.LMTNL eran estables cuando se hicieron pasar durante 3 meses en ausencia de una selección de fármacos.

Tal como se muestra en esta memoria, mientras que se utilizan ampliamente títulos de punto final, la eficacia de la transducción es una mejor medida de la potencia de la transferencia de genes. Sin embargo, el ensayo puede ser laborioso con vectores que codifican genes de resistencia a fármacos. Por lo tanto, poblaciones de células productoras basadas en PA317 o ProPak-A, que portan un vector (LLySN, Figura 2) derivado del vector LXSN (Miller y Rosman (1989) supra) se prepararon mediante inserción del gen marcador de superficie Lyt2 (Tagawa et al. (1986) supra). La expresión en superficie del antígeno Lyt2 permite una determinación simple y cuantitativa de la eficacia de transducción mediante FACS. Mayores eficacias de transducción se lograron con sobrenadantes procedentes de dos poblaciones de ProPak-A-LLySN derivadas independientemente que con sobrenadantes procedentes de tres agrupaciones de PA317.LLySN ensayadas en células NIH/3T3 (véase la Figura 4 C). Sorprendentemente, cuando se sometieron a ensayo los mismos sobrenadantes en cuanto a la eficacia de la transducción en células 293 humanas, la superioridad de ProPak-A es incluso mayor (Figura 4 B).

Para determinar la relación de título de punto final a eficacia de transducción, se recolectaron sobrenadantes de células productoras cultivadas bajo una diversidad de condiciones para optimizar la producción de sobrenadantes de vectores retrovirales. Además de someter a ensayo títulos de punto final, también se determinó la proporción de células transducidas después de una única inoculación (es decir, eficacia de transducción). La Figura 5A muestra los títulos de punto final y las eficacias de transducción obtenidas con 70 diferentes sobrenadantes de vectores SVNLZ que codifican \beta-galactosidasa derivados de PA317 (PA.SVNLZ; Figura 2). No se encontró correlación directa alguna entre el título de punto final y la eficacia de transducción de los sobrenadantes (factor de correlación, r = 0,07). Con el fin de confirmar que la ausencia de correlación entre la eficacia de transducción y el título de punto final no era específica para las células NIH/3T3 o el método de citometría de flujo utilizado para cuantificar la proporción de células transducidas con el vector SVNLZ derivado de PA317, sobrenadantes que contenían un retrovirus anfotrópico que codifica el gen de neomicina fosfotransferasa (LMTNL, Figura 2) se sometieron a ensayo en NIH/3T3 así como en células Jurkat y HeLa (Figura 5B). Los resultados demuestran que el sobrenadante que proporcionaba la eficacia de transducción más elevada en células NIH/3T3 también dio la eficacia de transducción más elevada tanto en células Jurkat como en células HeLa (Figura 5B). Además, el sobrenadante que proporcionaba la eficacia de transducción más elevada no tenía el título de punto final más alto, distinguiendo de nuevo entre estas dos mediciones funcionales. Resultados similares se obtuvieron también con el vector PA.SVNLZ en varias líneas celulares diferentes, sugiriendo que la ausencia de correlación entre el título de punto final y la eficacia de transducción no es ni específica para el gen indicador ni para la especie de células diana.

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Concentración de sobrenadantes del vector

La ausencia de correlación entre el título de punto final y la eficacia de transducción también era evidente cuando se examinó el efecto de concentrar físicamente sobrenadantes de vectores retrovirales mediante ultrafiltración. Los sobrenadantes de los vectores se concentraron utilizando tres sistemas de ultrafiltración diferentes. El sistema de ultrafiltración de flujo cruzado Sartocon Mini (Sartorius, Bohemia, NY), se utilizó con un módulo de polisulfona de 77,4 cm^{2}, con un corte de peso molecular (MWCO - siglas en inglés) de 100.000 kDa, a una presión de alimentación de 20,7 kilopascales (kPa) (3 libras por pulgada cuadrada) (psi)). La concentración se alcanzó en el espacio de una hora a la temperatura ambiente. Se utilizó un aparato Amicon Stirred Cell^{TM} modelo 8050 (Amicon, Beverly, MA) con un ultrafiltro YM100 (3,4 cm^{2}, MWCO de 100.000 kDa). La presión positiva se mantuvo con aire estéril, filtrado y regulado y la concentración se alcanzó en el espacio de 30 minutos a la temperatura ambiente. Se concentraron pequeños volúmenes (5 a 20 ml) utilizando concentradores centrífugos Filtron^{TM} de MWCO de 300.000 kDa (Filtron Tech. Corp. Northborough, MA). La concentración se consiguió en el espacio de 45 minutos mediante centrifugación a 3.000 g en una centrífuga Beckman^{TM} GS-6KR (Beckman, Palo Alto, CA) a 4ºC.

La Tabla 4 resume los datos de cinco experimentos independientes utilizando dos vectores retrovirales diferentes y los tres sistemas de ultrafiltración diferentes. Los títulos de punto final aumentaron en proporción a la reducción en volumen (hasta 19 veces), indicando que el vector no fue inactivado mediante este proceso. Sin embargo, no se alcanzaron eficacias de transducción elevadas. Eficacias de transducción equivalentes se consiguieron con sobrenadantes producidos a 32ºC antes y después de la concentración (Tabla 4). En contraposición, sobrenadantes de vectores retrovirales producidos a 37ºC tenían eficacias de transducción bajas después de la ultrafiltración (Tabla 4). De manera interesante, las bajas eficacias de transducción se pudieron reestablecer al nivel del sobrenadante original diluyendo los concentrados (véase la Figura 6), lo que sugiere que un agente inhibidor había sido co-concentrado con las partículas en transducción. En principio, el inhibidor podía ser partículas retrovirales no transductoras, proteína de la envoltura no asociada al vector o un componente no viral del sobrenadante del cultivo de tejidos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Inhibición específica para la envoltura de la transducción de vectores retrovirales

Para establecer la naturaleza del agente inhibidor, sobrenadante de cultivo de tejidos procedente de líneas de células empaquetadoras diferentes o células NIH/3T3 se sometió a ensayo para determinar si podía inhibir la transducción. Sobrenadantes de líneas de células empaquetadoras contienen todas las proteínas necesarias de las partículas del vector, pero carecen de genoma del vector y, por lo tanto, son incapaces de transducir células. Vectores ecotrópicos utilizan diferentes receptores para penetrar en células que los vectores anfotrópicos, y la competición por unirse a receptores solamente puede producirse entre partículas virales con el mismo tropismo. Sobrenadante de PA.SVNLZ se mezcló con sobrenadante procedente de lo siguiente: células empaquetadoras PA317 anfotrópicas parentales; sobrenadante de la línea de células empaquetadoras GP + E86 ecotrópica; concentrado de PA.SVNLZ de antes o sobrenadante de células NIH/3T3, y se midieron la eficacia de transducción y los títulos de punto final.

La adición de sobrenadante procedente de células NIH/3T3 o de la línea de células empaquetadoras GPE+86 no tenía efecto alguno sobre la eficacia de transducción o el título de punto final (Tabla 5). En contraposición, la adición de sobrenadante de PA317 parentales o de vector concentrado, derivado de la línea de células productora PA.SVNLZ, redujo la eficacia de transducción, incluso a pesar de que en este último caso el título de punto final había aumentado mediante la adición del sobrenadante PA.SVNLZ concentrado (Tabla 5). Estos datos indican la inhibición de la transducción del vector anfotrópico por parte de la proteína de la envoltura anfotrópica en forma de partículas o en forma libre.

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TABLA 5 Comparación de la transducción de células NIH/3T3 conseguida con sobrenadante PA.SVNLZ diluido en la relación 1:1 con otros sobrenadantes

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Estabilidad de partículas de vectores retrovirales a diferentes temperaturas

La concentración de sobrenadante producido a 37ºC redujo la eficacia de transducción con respecto al sobrenadante original (Tabla 4). Es posible que estos sobrenadantes contengan una proporción más elevada de vector inactivado que los sobrenadantes producidos a 32ºC. Para someter a ensayo la estabilidad de las partículas del vector a diferentes temperaturas, sobrenadante SVNLZ producido a 32ºC se incubó a 37ºC, a 32ºC o a 0ºC durante diversos espacios de tiempo. El sobrenadante original tenía una eficacia de transducción de 25% (véase la Figura 7A) y, después de la incubación durante 24 horas a 37ºC, 32ºC ó 0ºC, las eficacias de transducción se redujeron a 2, 14 y 22%, respectivamente. La incubación a 0ºC durante 4 días redujo adicionalmente la eficacia de transducción al 12%, mientras que el título de punto final permanecía relativamente estable (véase la Figura 6B). A todas las temperaturas examinadas, la eficacia de transducción disminuyó más rápidamente que el título de punto final. La semivida de las partículas de vector a 37ºC se calculó como 4,1 horas, en base al título de punto final, similar a informes previos. La semivida del vector a 32ºC y 0ºC era de 12,0 horas y 123,4 horas, respectivamente. Es interesante señalar que a todas las temperaturas examinadas, el título de punto final permanecía relativamente estable (2,5 \pm 0,4 x 10^{6} ufc/ml) durante al menos las primeras ocho horas. Esta estabilidad inicial en el título de punto final, que no se observó para la eficacia de transducción, ha sido observada en tres experimentos separados utilizando el vector PA.SVNLZ o PA.LMTNL.

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Cinética de producción retroviral

Dada la mayor estabilidad de partículas de vectores retrovirales a 32ºC que a 37ºC, se llevaron a cabo experimentos para estudiar la cinética de la producción del vector a estas temperaturas. Células productoras de SVNLZ se hicieron crecer hasta una confluencia de aproximadamente el 80% a 37ºC, momento en el que el medio fue sustituido y las células se colocaron a 37ºC ó 32ºC. Muestras de sobrenadantes se recogieron a instantes diferentes, se congelaron rápidamente y se ensayaron tanto en cuanto al título de punto final (Figura 8A) como en cuanto a la eficacia de transducción (Figura 8B). A lo largo de las primeras 6 horas, cantidades similares de vector de transducción se acumulaban en cultivos a 37ºC ó 32ºC (Figuras 7A y 7B). Cálculos que incorporan la tasa de inactivación del vector a 37ºC ó 32ºC muestran que la tasa de producción del vector es ligeramente más alta a 37ºC que a 32ºC (0,031 ufc/célula/hora en comparación con 0,027 ufc/célula/hora). Consistente con esto, la cantidad de cápsida p30 o proteína de la envoltura gp70 presentes en las muestras medidas mediante ELISA demostraron que la secreción del vector es también marginalmente mayor a 37ºC que a 32ºC. Resultados similares se encontraron también con el vector LMTNL.

Mientras que la tasa de inactivación de viriones es menor a 32ºC que a 37ºC, la inactivación de las partículas de vector a 32ºC sigue siendo importante (Figura 7A) y, por lo tanto, debería minimizarse el tiempo en el que los sobrenadantes permanecen a esta temperatura. Se llevaron a cabo experimentos para determinar el tiempo mínimo requerido para producir sobrenadantes con una eficacia de transducción máxima. La Figura 9 proporciona el curso en el tiempo de la producción del vector a partir de un cultivo de células productoras PA.LMTNL confluente en una botella rotatoria a 32ºC, y demuestra que la eficacia de transducción alcanza una meseta 3 horas después de la sustitución del medio.

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Ejemplo 3 Comparación de métodos de producción

La cinética de la producción de vectores a partir de células productoras basadas en PA317 sugiere que una vez que las células productoras alcanzan la confluencia, los sobrenadantes deberían ser recogidos cada 3 a 5 horas para obtener un sobrenadante con una elevada eficacia de transducción. Para conseguir estas condiciones, un biorreactor de lecho empaquetado a pequeña escala se hizo funcionar bajo un modo discontinuo (sustitución periódica del medio) o de perfusión (perfusión continua del medio). En este último caso, el sobrenadante que abandona el biorreactor se recogió en un recipiente a 0ºC con el fin de minimizar la inactivación. Experimentos iniciales con la línea de células productoras PA.SVNLZ, cultivadas en el biorreactor de lecho empaquetado hecho funcionar en un modo discontinuo, mostraron una producción equiparable de vectores mediante el título de punto final y la eficacia de transducción a la obtenida en matraces de cultivo de tejidos. Seguidamente, el biorreactor de lecho empaquetado se hizo funcionar en modo de perfusión y se comparó con una botella rotatoria hecha funcionar en un modo discontinuo (Tabla 6). La toma de muestras de sobrenadantes a partir del biorreactor o de las botellas rotatorias comenzó un día después de sembrar las células. En ambos cultivos, la incubación se inició a 37ºC y se hizo descender a 32ºC después de 50 horas. Las células en los dos sistemas de cultivo alcanzaron confluencia después de aproximadamente 100 horas de incubación. Las eficacias de transducción conseguidas con sobrenadantes producidos en el biorreactor de lecho empaquetado eran mayores que las de cultivos en botella rotatoria (Figura 10A). Sin embargo, los sobrenadantes producidos en el biorreactor de lecho empaquetado tenían títulos de punto final menores que los sobrenadantes procedentes de la botella rotatoria (Figura 10B), posiblemente debido al menor tiempo de permanencia del medio en el reactor (5,75 horas en comparación con 24 horas para la botella rotatoria). A lo largo de un período de 5 días, se recogió un total de 10 L de sobrenadante utilizando el biorreactor de lecho empaquetado, en comparación con 1 L de la botella rotatoria.

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TABLA 6 Parámetros operativos de diferentes sistemas de producción

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Ejemplo 4 Comparación de la producción de vectores a partir de la producción de sobrenadante de células ProPak-A y PA317 del biorreactor

10 g de los discos Fiber Cell de New Brunswick Scientific (nº de catálogo M1176-9984) se dispusieron en la canasta rotatoria del biorreactor de lecho empaquetado (nº de catálogo M 1222-9990), y se lavaron varias veces con PBS antes de someterlos a autoclave. Antes de la siembra, el biorreactor y los discos Fiber Cell se lavaron dos veces en medio que contenía FBS al 5%.

El reactor se sembró con 2,4 a 3,6 x 10^{8} células productoras (las mismas para ProPak y PA317) en un volumen total de 500 ml de medio (es decir, 2 a 3 x 10^{4} células/cm^{2}) (DMEM con FBS al 5% a 10%). La velocidad de agitación tras la siembra se estableció en aproximadamente 80 rpm. Se requirió un mínimo de 3 horas para que todas las células quedaran fijadas a los discos Fiber Cell.

Aproximadamente 4 a 18 horas después de la siembra, se sustituyó el 50% del medio y se añadieron 5 ml de Pluronic F68 (Sigma, nº de catálogo P5556) al biorreactor hasta una concentración final de 0,1%. En este momento, se inició la ventilación mediante rociado suave de una mezcla de aire/5% de CO_{2} de calidad médica (Altair nº de catálogo 39222) en el reactor a través de un filtro de 0,2 mm. La agitación se aumentó hasta aproximadamente 250 rpm. Se dejó que las células crecieran durante tres días a 37ºC y luego la temperatura se disminuyó a 32ºC. Las sustituciones del medio deberían llevarse a cabo en las células cada 4 a 12 horas, o el reactor debería hacerse funcionar en un modo de perfusión. La velocidad de perfusión era de 2 a 6 volúmenes del reactor por día. El sobrenadante perfundido recolectado del biorreactor se recogió en recipientes de vidrio de 2 L (con tampón ventilado) mantenidos en hielo. El sobrenadante recolectado se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum, se repartió en partes alícuotas y se congeló en MeOH/hielo seco. La congelación se puede llevar a cabo de otra manera, tal como en nitrógeno líquido. El biorreactor y el ajuste del funcionamiento por perfusión continua se muestra en las Figuras 11 y 12.

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Preparación del sobrenadante a partir de botellas rotatorias

Células productoras se sembraron a razón de 3 x 10^{4}células/cm^{2} en 0,25 ml de DMEM más FBS al 5% por cada cm^{2} de superficie específica. La velocidad rotatoria se estableció en 0,6 rpm. Las células se hicieron crecer a 37ºC durante dos días. El día tres, la temperatura se redujo a 32ºC. El medio se aspiró y se reemplazó por medio DMEM reciente más FCS al 5% (0,2 ml/cm^{2} de superficie específica). El medio se añadió con una pipeta al fondo del matraz para evitar que las células se desprendieran y para evitar la formación de burbujas y el contacto de las células. La concentración de suero puede reducirse hasta 2% de FBS.

Para productores basados en PA317, dos tandas de medio se recogieron cada día (cada 12 horas) y se agruparon para preparar un lote único. Para productores basados en ProPak-A, los sobrenadantes se recogieron cada 12 a 24 horas. Cada tanda se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum inmediatamente, y se mantuvo a 4ºC hasta que las tandas se agruparon (preferiblemente durante no más de aproximadamente 12 a 24 horas). Las tandas agrupadas se dividieron en partes alícuotas, se congelaron y se almacenaron hasta -80ºC. La recogida de sobrenadante puede continuar en tanto que las células productoras sean sanas.

La Figura 13 muestra la comparación de la producción de vectores a partir de un cultivo de células ProPak-A en matraces T y en el biorreactor de lecho empaquetado con ventilación, según se analiza en células 293. El sobrenadante producido utilizando el biorreactor de lecho empaquetado media en una transducción considerablemente más elevada que la producida en matraces T. La Figura 14 muestra que células ProPak-X también producían un sobrenadante de elevada eficacia de transducción cuando se cultivaban en el biorreactor de lecho empaquetado en comparación con matraces T. La dilución del sobrenadante del vector producido mediante ProPak-A en diferentes condiciones de cultivo se muestra en la Figura 15. De nuevo, el biorreactor de lecho empaquetado ventilado producía sobrenadantes de vector de mayor calidad, según se determina por la eficacia de transducción.

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Ejemplo 5 Transducciones de células primarias Selección y análisis de células

Muestras aferesadas se obtuvieron con consentimiento informado de pacientes de mieloma múltiple o de cáncer de mama. Células madre se movilizaron en la sangre periférica mediante tratamiento con ciclofosfamida (Cytoxan) y GM-CSF (mieloma múltiple), G-CSF anterior (cáncer de mama) o Cytoxan + VP-16 + CDDP + G-CSF (cáncer de mama). La aferesis para el total de glóbulos blancos se inició cuando el recuento de glóbulos blancos de la sangre periférica era mayor que 500 células/ml y el recuento de plaquetas era mayor que 50.000 células/ml. Los pacientes se aferesaron diariamente hasta recoger 6 x 10^{8} células mononucleares (MNC- siglas en inglés).

Las células se lavaron dos veces en PBS (plaquetas parcialmente agotadas) y células CD34+ se seleccionaron positivamente utilizando un selector de células Baxter Isolex^{TM}. Las células recuperadas promediaban un 85% a 99% de pureza de CD34+, según se determina mediante análisis FACS.

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Transducción

Células CD34^{+} (0,5 x 10^{6}) se suspendieron en 0,5 ml de sobrenadante retroviral recientemente descongelado y se diluyeron en la relación 1:1 en medio de Whitlock/Witte (IMDM al 50%, RPMI 1640 al 50%, FCS al 10%, 4 x 10^{-5} M de 2-mercaptoetanol, HEPES 10 mM, 100 \mu/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y glutamina 4 mM) que contenían citoquinas a las siguientes concentraciones finales: ligando c kit (Amgen) 100 ng/ml o factor inhibidor de leucemia (LIF- siglas en inglés, Sandoz); IL-3 (Sandoz) 20 ng/ml; IL-6 (Sandoz) 20 ng/ml. Sulfato de protamina se añadió a una concentración final de 4 \mug/ml o polibreno se añadió a una concentración final de 8 \mug/ml. Las células y el vector se centrifugaron a 2800 x g, a 33ºC hasta 35ºC durante tres horas. Las células se resuspendieron en medio con citoquinas y se cultivaron durante tres días. Al cabo de tres días, las células se recolectaron y se utilizaron aproximadamente 4 x 10^{5} células para determinar la eficacia de la transducción a granel y se extendieron en placas de metilcelulosa para determinar la eficacia de transducción de células progenitoras (véase más abajo).

Para los vectores LLySN y LMily, que contienen el gen marcador Lyt-2 murino, la eficacia de transducción a granel se determinó mediante tinción con anti-Lyt-2 conjugado con APC o PE (Pharmingen) y anti-CD34 conjugado con rodamina de azufre. Los resultados se muestran en las Figuras 16A y 16B. El sobrenadante de los vectores de ProPak-A o ProPak-X transducían células humanas primarias con una mayor eficacia que la de células PA317. Además, la combinación de vector anfotrópico y xenotrópico puede útil para suministrar dos vectores a la misma célula, ya que no compiten por el mismo receptor.

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Análisis de metilcelulosa

Células procedentes de cada una de las transducciones (2,5 x 10^{3} a 10 x 10^{3}) se añadieron a 4 ml de medio de metilcelulosa (Stem Cell Technologies) más 1 ml de IMDM que contenía las siguientes citoquinas (concentración final): ligando c-kit 100 ng/ml; GM-CSF (Amgen) 10 ng/ml; IL-3, 10 ng/ml; IL-6, 10 ng/ml; rhEPO (Amgen) 2 unidades/ml. 1,0 ml de la mezcla de metilcelulosa de células/citoquina se colocaron en cinco placas de 35 mm utilizando una jeringa de 5 ml y una aguja de calibre 16, y las placas se colocaron en una incubadora a 37ºC durante 2 semanas.

Después de 14 días, se recogieron colonias de metilcelulosa sencillas y se analizaron en cuanto a la presencia de neo o RevM10 mediante PCR.

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Análisis

Colonias individuales se recogieron mediante aspiración en 5 \mul y se transfirieron a 25 \mul hasta 50 \mul de tampón de lisis de PCR. El tampón de lisis de PCR es una mezcla 1:1 de tampón A (KCl 100 mM, Tris 10 mM pH 8,2, MgCl_{2} 2,5 mM) y tampón B (Tris 10 mM pH 8,3, MgCl_{2} 2,5 mM, Tween 20 al 1%. NP40 al 1%, 100 \mul/ml de proteinasa K). La mezcla se dejó incubar durante una noche a 37ºC o durante 2 h a 56ºC. La proteinasa K se inactivó mediante calentamiento a 94ºC durante 10 a 30 minutos, y se utilizaron 5-10 \mul del lisado para la reacción de PCR.

La reacción de PCR amplificaba un fragmento de 100 pb del gen \beta-globina y un fragmento de 240 pb del gen neo o un fragmento de 180 pb de RevM10, dependiendo del vector utilizado. Los cebadores utilizados eran como sigue:

Rev:	5' TCgATTAgTgAACggATCCTT 3'	(SEQ ID NO: 5)
	5' CTCCtgACTCCAATATTgCAg 3'	(SEQ ID Nº 6)
Neo:	5' TCgACgTTgTCACTgAAgCG 3'	(SEQ ID NO: 7)
	5' gCTCTTCgTCCAgATCATCC 3'	(SEQ ID NO: 8)
Beta-globina:	5' ACACAACTgTgTTCACTAgC 3'	(SEQ ID NO: 9)
	5' CAACTTCATCCACgTTCACC 3'	(SEQ ID NO: 10)

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Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 40 \mul en un ciclador térmico Perkin Elmer 9600 como sigue: 5 min de desnaturalización a 94ºC; 40 ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 62ºC, 1 min a 72ºC; y 10 min a 72ºC. Los productos de la PCR se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio (Sambrook et al. (1989) supra) y los productos de la PCR se confirmaron mediante hibridación por transferencia Southern. Una muestra se consideró positiva si estaban presentes tanto la banda Rev o neo como la banda \beta-globina. Los resultados, resumidos en la Tabla 7, demuestran que para dos tejidos diferentes (MPB y ABM), los sobrenadantes ProPak se comportaban mejor que los sobrenadantes PA317.

Los resultados en la Figura 16A demuestran que tanto ProPak-X xenotrópica (X.36) como la ProPak-A.6 anfotrópica eran capaces de producir preparados de vectores retrovirales que transducían células madre/progenitoras hematopoyéticas humanas con una mayor eficacia que las producidas a partir de células PA317.

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Las siguientes series de ejemplos describen la generación de sobrenadantes del vector de elevada calidad con envoltura xenotrópica de MLV, anfotrópica de MLV o de Gal V, y la capacidad de estos diferentes vectores con envoltura procedentes de células empaquetadoras humanas o basadas en murinos de transducir células hematopoyéticas humanas primarias. También se explotaron los tropismos de complementariedad y la seguridad de las líneas celulares ProPak-A y ProPak-X para producir sobrenadantes de vectores mediante co-cultivo. Se demostró que después de la inoculación de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) con sobrenadantes de co-cultivo que contenían tanto partículas de vector anfotrópicas como xenotrópicas, el 100% de la progenie formadora de colonias contenía transgenes. También se demostró la expresión de transgenes en células con un fenotipo característico de células progenitoras hematopoyéticas.

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Ejemplo 6 Derivatización de células empaquetadoras

Para facilitar la derivatización de líneas celulares empaquetadoras con una diversidad de envolturas, se construyó primero una línea celular que expresa las funciones Gag-Pol de MLV. El gen gag-pol se expresó a partir del promotor de LTR de MMLV, el promotor de CMV-IE o la LTR del virus del sarcoma de Rous (Figura 1). El marco de lectura abierto (ORF) de gag-pol (Rigg et al., (1996) supra) se sub-clonó en el vector de expresión pMLV*. Este plásmido se derivó de pCMV* (Rigg et al., (1996) supra) mediante reemplazo del promotor de CMV con el promotor de LTR de MLV (M-LTR). Los ORFs de las proteínas de la envoltura se sub-clonaron en los sitios de restricción mostrados en el plásmido pCI (Promega, Madison, WI) que contiene el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV-IE), un intrón quimérico (SD/SA) y la secuencia de poliadenilación tardía (pA) del virus 40 de simio

El gen de la envoltura xenotrópica (Ex) se obtuvo mediante PCR a partir de un molde lineal derivado del plásmido pXeno (O'Neill et al. (1985) J. Virol. 53: 100-106) utilizando el siguiente par de cebadores de oligonucleótidos:

5'-ACCTCGAGCCGCCAGCCATGGAAGGTTCAGCGTTCTC-3'

(SEQ ID NO: 11) y

5'-AATCTAGACttaTTCACGCGATTCTACTTC-3'

(SEQ ID NO: 12).

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El ATG subrayado corresponde a los nucleótidos 291 a 293, y las letras en minúscula designan el codón de terminación, nucleótidos 223 a 225 (O'Neill et al. (1985) supra).

El gen de la envoltura quimérica (Eax) se construyó reemplazando la secuencia entre los sitio ApaI y BglII del gen de la envoltura anfotrópica (nucleótidos 772 a 963; Ott et al. (1990) J. Virol. 64: 757-766) con un ADN sintético correspondiente a la secuencia del gen de la envoltura xenotrópica procedente de 10A1 (nucleótidos 801 a 965; Ott et al., (1990) supra).

Plásmidos que codifican Gag-Pol se co-transfectaron en células 293 que están exentas de una secuencias similares a MLV, que están exentas de secuencias similares a MLV endógenas (Rigg et al. (1996) supra). La expresión transitoria de Gag se detectó mediante ELISA en todos los casos, pero sólo fue posible aislar clones que expresaban Gag de modo estable a niveles equivalentes a las células ProPak-A.6 (Rigg et al., (1996) supra) con el Gag impulsado por LTR de MLV. La co-transfección transitoria con plásmidos de vector y de la envoltura de las células 293/Gag-Pol (denominadas ProGag) proporcionó sobrenadantes de mayor título que la co-transfección de células Anjou (Pear et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8392-8396).

Seguidamente, plásmidos de expresión que portan los genes para las proteínas de la envoltura xenotrópicas (Ex, Figura 1) o anfotrópica (Rigg et al., (1996), supra) se introdujeron de forma estable en células ProGag, y clones que expresan las proteínas de la envoltura xenotrópicas (denominadas ProPak-X) o anfotrópicas (ProPak-A.52) se aislaron mediante citometría de flujo. A su vez, los vectores LLySN y LMiLy (Figura 2) se transdujeron en estas células, y las células productoras resultantes se utilizaron para generar los sobrenadantes utilizados en este estudio.

Se han descrito vectores retrovirales LMiLy y LLySN (Rigg et al., (1995) supra) y Rigg et al, (1996) Virol. 218: 290-295). LMiLy y LLySN codifican el antígeno de superficie Lyt-2 (Ly) (Tagawa et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3422-3426), expresada directamente a partir del promotor de LTR (L) retroviral en LLySN o a través de un sitio de entrada al ribosoma interno (i) en LMiLy. La secuencia empaquetadora (psi) en LMiLy es al nucleótido 566 (Shinnick et al., (1981) Nature 293: 543-548) y LLySN tiene la secuencia psi más larga y ATG no funcional (Bender et al., (1987) J. Virol. 64: 1639-1646; Miller y Rosman, (1989) Biotechniques 7: 980-990), y también contiene el gen neomicina fosfotransferasa (N) expresado a partir de un promotor de SV40 interno (S). A menos que se indique de otro modo, los sobrenadantes de LLySN se prepararon en matraces T a partir de poblaciones de células resistentes a G418 y los sobrenadantes LMiLy se prepararon a partir de clones de células productoras en el biorreactor de lecho empaquetado rociado.

En contraposición a las envolturas Ex y Ea (Figura 1), no se pudieron aislar células que expresan de manera estable las proteínas de la envoltura quimérica Eax (Figura 1) o GaLV en intentos repetidos, ya que tenía lugar una lisis de las células. Mientras que se podían preparar sobrenadantes transitorios mediante co-transfección de células ProGag con los plásmidos de expresión Eax y de vectores, no se consiguió expresión estable alguna de la envoltura Eax en células 293, ProGag o HT1080. La más drástica fue la transfección del plásmido codificador de la envoltura de GALV que dio como resultado una lisis total de cultivo de células ProGag o 293 en el espacio de 24 horas. No se podían producir sobrenadantes transitorios de GaLV con células ProGag co-transfectadas, a pesar de que el gen de la envoltura GaLV era funcional, ya que las partículas del vector se liberaron si se co-transfectaban células murínicas.

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Ejemplo 7 Determinación de tropismos

Con el fin de confirmar el fenotipo de partículas de vectores que portan la envoltura anfotrópica, xenotrópica o quimérica anfo/xeno, sobrenadantes se inocularon sobre líneas celulares procedentes de diferentes especies seleccionadas para distinguir entre los diversos tropismos de la envoltura. Las células se inocularon con partículas de vector empaquetadas en las nuevas líneas celulares ProPak-X (xenotrópicas) o ProPak-A.52 (anfotrópicas), o con sobrenadantes de vectores procedentes de la co-transfección del vector y el plásmido de expresión que codifica la envoltura Eax. Para fines comparativos, partículas MLV pseudotipadas con la glicoproteína GaLV (procedente de células PG13) o la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G, Yee et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9564-9568) también estaban incluidas. El tropismo observado para las envolturas xenotrópicas, anfotrópicas y GaLV (Fig. 20A) se correspondían con los establecidos para retrovirus (Teich, (1984) Cold Spring Harbor Laboratory).

Por analogía al genotipo y al tropismo de los receptores de MLV-10A1 (Ott et al., (1990) supra; Wilson et al., (1994) J. Virol. 68: 7697-7703; y Wilson et al. (1995) J. Virol. 69: 534-537), la envoltura Eax debería mediar en la unión del vector retroviral tanto a los receptores anfotrópicos como xenotrópicos. Partículas de vector que portan la envoltura Eax transducían células Quail, que son resistentes a partículas anfotrópicas pero susceptibles al vector xenotrópico (Figura 17B) y también transducían células NIH/3T3 murínicas que son resistentes al vector xenotrópico (Figura 17A). Por lo tanto, esta modificación de la proteína de la envoltura anfotrópica confería especificidad para una línea celular que no se puede transducir con un vector anfotrópico, estableciendo el tropismo extendido. Como era de esperar, todos los tipos de células se transdujeron con las partículas de vector PLV (VSV-G) pantrópicas. Se consiguieron eficacias de transducción menores con este pseudotipo posiblemente como resultado de tener que preparar sobrenadantes mediante co-transfección transitoria, debido a la toxicidad de la proteína VSV-G.

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Ejemplo 8 Resistencia a suero humano

Se demostró anteriormente que las partículas anfotrópicas y ecotrópicas generadas a partir de células 293 no fueron inactivadas mediante tratamiento con suero humano bajo condiciones que inactivan al vector anfotrópico empaquetado en células PA317 murínicas. El vector xenotrópico se sometió a ensayo de manera similar en cuanto a la resistencia, y se encontró que las partículas xenotrópicas no fueron inactivadas mediante tratamiento con suero humano (Figura 18). Partículas del vector procedentes del clon empaquetador de ProPak-A.52 también eran resistentes, mientras que el vector empaquetado PA317 se había casi inactivado por completo (Figura 18), como ha sido previamente demostrado (Takeuchi et al., (1994) J. Virol. 68: 8001-8007; Rigg et al., (1996) supra).

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Ejemplo 9 Test de generación de RCR

Las funciones empaquetadoras de Gag-Pol en líneas celulares ProPak-X y ProPak-A.52 se expresan a partir del promotor LTR de MLV y estas células portan, por lo tanto, más secuencias derivadas de MLV que las células ProPak-A.6. Sin embargo, no es probable la generación de RCR debido a la recombinación de secuencias derivadas de MLV, ya que se seguiría requiriéndose un mínimo de tres eventos de recombinación. Únicamente 32 nucleótidos de la secuencia de R son retenidos en el promotor de LTR utilizado, una homología de la secuencia relativamente corta con vectores. No obstante, cultivos y sobrenadantes se sometieron rigurosamente a ensayo en cuanto a RCR. Se mantuvieron co-cultivos de células ProPaK-A y ProPak-X portadoras del vector BC140revM10. Este vector, al igual que antes (Rigg et al., (1996) supra) generó rápidamente RCR en células PA317 (Tabla 8). A pesar de que se mantuvieron los cultivos durante hasta 3 meses, en ningún caso se podía detectar una RCR ya sea en sobrenadantes o en células de cultivos que contenían células ProPak (Tabla 8).

TABLA 8 Ensayos en cuanto a RCR en cultivos de o co-cultivos de células productoras

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Ejemplo 10 Producción de sobrenadantes de vectores retrovirales mejorada en un biorreactor

Aplicando principios de la producción de vectores retrovirales definidos con las líneas de células productoras basadas en PA317 (Forestell et al., (1995) supra), se investigó la producción de vectores a partir de líneas de células ProPak en un biorreactor de lecho empaquetado. Utilizando la línea de células productoras PP-A.52.LMiLy, se comparó el biorreactor de lecho empaquetado hecho funcionar de un modo discontinuo con una botella rotatoria y el matraz T para la producción de sobrenadante del vector. También se examinó el efecto del rociado suplementario de una mezcla de aire/CO_{2} en el biorreactor para determinar si la transferencia de oxígeno procedente del espacio de cabeza del biorreactor estaba limitando el crecimiento de la célula y la producción del vector. Se consiguió una ventilación suplementaria mediante micro-rociado directo de una mezcla de calidad médica de aire con 5% de CO_{2}, y se añadió Pluronic F-68 al 0,01% (Sigma, St. Louis, MO), para prevenir un deterioro de la célula por la cizalladura. Los sobrenadantes del vector recolectados a partir de los diferentes recipientes de producción se compararon en cuanto a su capacidad para transducir células NIH/3T3 (Figura 19). Los sobrenadantes recolectados de los cultivos en matraz T y en botellas rotatorias proporcionaban eficacias de transducción del 62% y 63%, respectivamente, mientras que el sobrenadante procedente del biorreactor de lecho empaquetado no rociado proporcionaba una eficacia de transducción del 78%. La transferencia de genes era la máxima (100%) con el vector producido con el biorreactor de lecho empaquetado rociado, indicando que la transferencia de oxígeno del espacio de cabeza sola estaba limitando la producción del vector y el crecimiento de las células en el biorreactor no rociado. Mediciones de las concentraciones de glucosa y glutamina indicaban que estos nutrientes claves no estaban ejerciendo un poder limitador en ninguno de los cultivos. En este experimento particular, también se analizó la producción del vector por medición de las proteínas de la envoltura viral y Gag mediante ELISA para determinar si la eficacia de transducción mejorada era debida a una producción incrementada del vector. A pesar de que la densidad de células volumétrica final en el biorreactor de lecho empaquetado barrido era ligeramente inferior en el matraz T (4,0 x 10^{6} y 4,7 x 10^{6} células/ml, respectivamente), los sobrenadantes del vector procedentes del biorreactor de lecho empaquetado rociado proporcionaban concentraciones mayores de proteínas virales así como una mayor transducción que los sobrenadantes del matraz T. Estos resultados indicaban que la producción mejorada en el biorreactor de lecho empaquetado rociado era debida a una productividad incrementada del vector específico para las células.

Líneas de células producidas basadas en PA317, PG13, ProPak-A.6, ProPak-A.52 y ProPak-X se cultivaron en el biorreactor de lecho empaquetado bajo condiciones de rociado. En cualquier caso, se consiguió una mejora de 2 a 20 veces en la producción de los vectores en comparación con cultivos en matraz T.

En particular, se determinó si la transferencia incrementada de genes en todas las líneas de células también se podría conseguir en células primarias. Además de la mayor transducción de células NIH/3T3 (Figura 19), los sobrenadantes de ProPak, producidos en el biorreactor de lecho empaquetado rociado, proporcionaban eficacias de transducción aproximadamente 3 veces superiores con células CD34-positivas que las preparaciones de vector procedentes de cultivos en matraces T (Tabla 9). Utilizando dos ensayos diferentes (expresión de Lyt2 en cultivos a granel o análisis por PCR de CFU-C) se obtuvieron diferentes estimaciones para la eficacia de transferencia de genes; sin embargo, los números relativos eran consistentes.

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TABLA 9 Transducción de células CD34-positivas a partir de MPB (donante normal); comparación de sobrenadantes de matraz T y de biorreactor de lecho empaquetado

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Ejemplo 11 Producción de células primarias con diferentes tropismos de vectores

Este Ejemplo comparó la transducción de células progenitoras hematopoyéticas CD34-positivas o PBL CD4-positivas con vectores de diferentes tropismos (anfotrópicos, xenotrópicos, GaLV) preparados a partir de líneas de células productoras estables. Las células se expusieron al vector una vez para comparar directamente las eficacias de transducción que se presentan como la expresión del marcador en superficie de Lyt2 con relación a la expresión conseguida con preparados de vectores empaquetados con PA317 (Tabla 10). Independientemente de los tropismos, todos los tipos de vectores transducían con éxito células CD34-positivas aisladas de MPB o ABM o PBL CD4-positiva (Tabla 10). Esto implica que los receptores para los tres tipos de vectores se expresan en estas células. Mientras que no parecía que ningún tropismo de vector único mediara de manera significativa en los elevados niveles de transducción más que cualquier otro, las eficacias de transducción más altas se consiguieron con sobrenadantes ProPak-A o ProPak-X (Tabla 10). A pesar de derivada por diferentes medios, la transducción equiparable se consiguió con el vector procedente de clones ProPak-A.6 o ProPak-A.52 (Tabla 10). También en estas comparaciones, sobrenadantes de vectores anfotrópicos procedentes de las líneas de células ProPak-A humanas transducían consistentemente una mayor proporción de células diana que el vector anfotrópico preparado a partir de células productoras basadas en PA317 (Tabla 10).

El fenotipo de las células progenitoras transducidas se determinó mediante citometría de flujo. La mayoría de células que expresan el gen Lyt2 exhibía un fenotipo característico de células progenitoras hematopoyéticas tempranas, esto es, el antígeno CD34 se expresaba (Figura 20, panel B) en ausencia de antígenos específicos para linajes de células hematopoyéticas diferenciadas (Figura 20, panel D).

Dado que no parecía que ningún tropismo sencillo transdujera preferentemente células primarias, las células se inocularon también con una mezcla de vector empaquetado por separado en células ProPak-A y ProPak-X, para someter a ensayo si se podía conseguir una mayor transducción mediante inoculación simultánea con vectores unidos a distintos receptores. En todos los cinco casos, excepto uno (mezcla de PP-A y PP-X; Tabla 3) se consiguió una transducción ligeramente mayor con la mezcla (Tabla 10). Es posible que en estos experimentos, la concentración de vector en los sobrenadantes pueda ser limitante, ya que los sobrenadantes individuales se diluyeron 4 veces en la mezcla en comparación con diluciones dobles en las que se utilizaron inóculos sencillos.

TABLA 10 Transducción de células hematopoyéticas humanas primarias con sobrenadantes de vector de diferentes tropismos de matraces T (A, vector LLySN) o el biorreactor de lecho empaquetado rociado (B. vector LMiLy)

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Transducción de diferentes tipos de células primarias conseguida después de inoculación simple con sobrenadantes que contienen el vector LLySN (A) o el vector LMiLy (B). Las eficacias de transducción se midieron como la proporción de células que expresan Lyt2, y los valores han sido normalizados a los conseguidos utilizando sobrenadantes basados en PA317. Se inocularon poblaciones de células hematopoyéticas aisladas de seis tejidos diferentes, específicamente PBL CD4+ o células CD34+, seleccionadas de: ABM o MPB de 2 pacientes de cáncer de mama (a y c), un paciente de mieloma múltiple (b) o un donante normal (d). ND = no determinado.

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Ejemplo 12 Producción del vector en co-cultivos de células productoras

En intentos para aumentar la eficacia de transducción, se produjeron sobrenadantes de vectores a partir de un co-cultivo de las células productoras ProPak-X.MiLy y ProPak-A.52.LMiLy complementarias en biorreactor de lecho empaquetado. Esta técnica, conocida como amplificación ping-pong, da como resultado títulos elevados con líneas de células productoras murínicas y aviares, probablemente como resultado del número incrementado de copias de vectores (Bodine et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3738-3742; Cosset et al., (1993) Virol. 193: 385-395; Hoatlin et al., (1995) J. Mol. Med. 73: 113-120). El problema que ha surgido en el pasado con la producción en co-cultivo es la generación de RCR (Bodine et al., (1990) supra; Cosset et al., (1993) supra; Muenchau et al., (1990) Virol 176: 262-265. Sin embargo, ya se demostró en esta memoria que no surge ningún RCR durante el co-cultivo extendido de células ProPak-A y ProPak-X que portan el vector BC140revM10 (Tabla 8), un evento que es incluso menos probable con el vector LMiLy que carece de secuencias que se solapan con las construcciones empaquetadoras ProPak. No obstante, se sometieron a ensayo exhaustivo sobrenadantes y células de final de producción y se encontró que estaban exentas de RCR mediante análisis rigurosos (incubación o co-cultivo con Mus dunni y ensayo S+L en células PG-4). Además, se confirmó la presencia tanto de partículas de vectores anfotrópicas como xenotrópicas mediante transducción de líneas de células permisivas y restrictivas.

Primero se comparó la capacidad de sobrenadantes de vectores PA317, ProPak-A, ProPak-X o ProPak-A/X.LMiLy de transducir células CD34-positivas tras una espinoculación sencilla. Las muestras de células se analizaron en cuanto la expresión de Lyt2, y la presencia del transgen revM10 en células progenitoras comprometidas se determinó mediante PCR. Consistente con los ensayos de la expresión de Lyt2 (Tabla 10), los sobrenadantes procedentes de productores de ProPak-A o -X basados en seres humanos, transducían células más eficazmente que el vector empaquetado con PA317, y el nivel más elevado de transducción se consiguió con el sobrenadante ProPak-A/X (Tabla 11).

Utilizando el sobrenadante ProPak-A/X.LMiLy, se investigaron diferentes combinaciones de citoquinas y múltiples rondas de inoculación en un esfuerzo por maximizar la eficacia de la transferencia de genes. Células CD34-positivas se espinocularon con vector PP-A/X.LMiLy una vez, dos veces, el mismo día, o una vez al día en dos días consecutivos, en presencia de IL-3, IL-6 y LIF o SCF. Antes de la primera espinoculación, las células se incubaron durante 1 día en 20 ng/ml de cada uno de IL-3 e IL-6, y 50 ng/ml de SCF o de LIF según se describe antes. Los resultados en la Tabla 12 muestran que mientras que la transferencia de genes era mayor en cultivos tratados con SCF después de una sola inoculación, la transferencia de genes en CFU-C era del 100% para cultivos inoculados dos veces en días consecutivos en LIF o SCF. Además, en los dos cócteles de citoquinas el transgen Lyt2 se expresaba en hasta el 40% de la población total de células, y en el 35% de las células que también eran CD34-positivas.

TABLA 11 Transducción de células CD34+/Thy+ a partir de MPB: comparación de sobrenadantes de diferentes líneas de células productoras

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Las eficacias de transducción conseguidas con sobrenadantes de vectores preparados en el biorreactor de lecho empaquetado rociado a partir de las líneas de células productoras mostradas. Células CD34+/Thy+ procedentes de MPB normal se inocularon la gravedad unidad durante 1 hora, seguido de espinoculación durante 3 horas. La eficacia de transducción se da como la expresión de del antígeno de superficie Lyt 2 o la frecuencia de marcaje de colonias de metil-celulosa individuales (CFU-C; Tabla 9).

TABLA 12 Transducción de células CD34+ a partir de MPB: comparación de protocolo de inoculación y cóctel de citoquinas

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Transducción de células CD34+ (MPB) con sobrenadante de biorreactor de lecho empaquetado procedente de un co-cultivo de células productoras LMiLy anfotrópicas y xenotrópicas. Las células se espinocularon e incubaron tal como se muestra, en presencia de IL-3, IL-6 y LIF o SCF. La expresión de Lyt2 se determinó 2 días después de la última inoculación, y se determinó la frecuencia de marcaje de colonias de metil-celulosa (CFU-C) individuales (Tabla 9).

TABLA 13 Características de las líneas de células ProPak

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En lo que antecede se describen líneas de células empaquetadoras de vectores retrovirales seguras y nuevas que pueden dirigirse a distintos receptores en células humanas y proporcionar una eficaz transferencia de genes a células humanas para aplicaciones de terapia génica. Las nuevas líneas descritas en el Ejemplo 6 difieren del clon 6 de ProPak-A del Ejemplo 1, dado que los ORFs de Gag-Pol se expresaron a partir del promotor LTR de MLV (Tabla 13) en lugar del promotor CMV en ProPak-A.6. A pesar de portar secuencias específicas para MLV adicionales no se podía detectar RCR alguno en sobrenadantes o células utilizando un test riguroso, a saber co-cultivo extendido de células ProPak-X y ProPak-A.52 que portan el vector BC140revM10. Estas partículas de vector ProPak son resistentes al suero humano y, por lo tanto, deberían permanecer funcionales si se administran in vivo a seres humanos.

Las líneas de células ProPak-X y ProPak-A producen partículas que utilizan distintos receptores en células humanas, y los tropismos se confirmaron determinando la capacidad de transducir líneas de células procedentes de diversas especies. Los dos receptores pueden ser fijados como objetivo al producir sobrenadantes de un co-cultivo de líneas de células productoras ProPak-A y ProPak-X. La seguridad de las líneas de células ProPak permite una amplificación de ping-pong eficaz del vector sin el riesgo de la formación de RCR. Utilizando el vector ProPak-A/X, se consiguió un 100% de marcaje de CFU-C derivado de células CD34-positivas purificadas a partir de MPB. De manera significativa, los presentes experimentos demostraron una expresión del transgen Lyt2 en el 40% de las células CD34-positivas inoculadas, derivadas de MPB, 2 días después de la inoculación.

Los presentes experimentos también indicaban que se consigue de la mejor manera la mayor eficacia de transferencia de genes con sobrenadantes preparados a partir de cultivos de células productoras estables. El enfoque descrito anteriormente es aplicable a la producción a partir de células estables, sistemas de vectores existentes y futuros.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(A)

SOLICITANTE: RIGG, RICHARD J.

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DANDO, JONATHAN S.

\hskip5.4cm

CHEN, JINGYI

\hskip5.4cm

FORESTELL, SEAN P.

\hskip5.4cm

PLAVEC, IVAN

\hskip5.4cm

BÖHNLEIN, ERNST

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(B)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO PARA OBTENER LÍNEAS DE CÉLULAS EMPAQUETADORAS RETROVIRALES, PRODUCTORAS DE UN SOBRENADANTE RETROVIRAL DE ELEVADA EFICACIA DE TRANSDUCCIÓN

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(C)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 12

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(D)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(viii)

DESTINATARIO: MORRISON & FOERSTER

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(ix)

CALLE: 755 PAGE MILL ROAD

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(x)

CIUDAD: PALO ALTO

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(xi)

ESTADO: CA

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(xii)

PAÍS: EE.UU.

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(xiii)

CÓDIGO POSTAL: 93304-1018

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(E)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: DISCO BLANDO

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(B)

ORDENADOR: IBM PC COMPATIBLE

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Version nº 1.30

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(F)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(i)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US96/

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(ii)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(iii)

CLASIFICACIÓN:

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(2) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: KONSKI, ANTOINETTE F.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34.202

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 20296-20036.40

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(3) INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:

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(xi)

TELÉFONO: (415) 813-5600

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(xii)

TELEFAX: (415) 494-0792

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(xiii)

TELEX: 706141

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(B)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

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(2) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(xi)

LONGITUD: 45 pares de bases

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(xii)

TIPO: ácido nucleico

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(xiii)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(xiv)

TOPOLOGÍA: lineal

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(2) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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19

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(xi)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

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(2) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(xi)

LONGITUD: 36 pares de bases

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(xii)

TIPO: ácido nucleico

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(xiii)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(xiv)

TOPOLOGÍA: lineal

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(2) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

(xii)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xiii)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.800000\baselineskip

(xiv)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip1.000000\baselineskip

(3) TIPO: ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

(4) TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip1.000000\baselineskip

(5) TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.500000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.500000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

30

Claims (1)

1. Una célula empaquetadora viral recombinante, seleccionada del grupo consistente en ProPak-A.6 con el nº de acceso ATCC CRL 12006 y ProPak-X.36 con el nº de acceso ATCC CRL 12007.