ES2342069T4

ES2342069T4 - Ligandos de tlr7 para el tratamiento de la hepatitis c.

Info

Publication number: ES2342069T4
Application number: ES04782670T
Authority: ES
Inventors: Devron R. Averett
Original assignee: Anadys Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Anadys Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2003-09-05
Filing date: 2004-09-01
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2024-09-01
Also published as: US20100256169A1; WO2005025583A2; US20090298863A1; KR20060096415A; TNSN06076A1; WO2005025583A3; US8034802B2; US20120028999A1; AU2004271972B2; JP2007504232A; CR8273A; MA28082A1; US7576068B2; AU2004271972A1; NZ545536A; US7858637B2; SG146637A1; IL173890A0; MXPA06002309A; AP2006003542A0

Abstract

El uso de un ligando de TLR7 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por el virus de la hepatitis C en un paciente, en el que el ligando de TLR7 se selecciona entre **(Ver fórmula)** en los que: cada R1 es H o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir, que puede estar interrumpido con uno o más heteroátomos O, S o N, o un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; R2 es H, OH, SH, halo o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir, que puede estar interrumpido con uno o más heteroátomos O, S o N, o un -O-(alquilo), -O-(arilo), -O-(heteroarilo), -S-(alquilo), -S-(arilo), -S-(heteroarilo), arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; R3 es H, OH o SH, o un alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, -O-(alquilo), -O-(arilo), -O-(heteroarilo), -S-(alquilo), -S-(arilo), -S-(heteroarilo), -NH(alquilo), -NH(arilo), -NH(heteroarilo), -NH(R4)(alquilo), -NH(R4)(arilo) o -NH(R4)(heteroarilo) sustituido o sin sustituir, en los que R4 es un alquilo sustituido o sin sustituir; X es O o S; Y es H, halo, OH, OR4, SH, SR4 o un alquilo o arilo sustituido o sin sustituir; Z es H, halo, OH, OR4, SH o SR4; o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de dicho estereoisómero.

Description

1. CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al uso de un ligando de TLR7 para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir infecciones por el virus de la hepatitis C en mamíferos. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de un ligando de TLR7 para la fabricación de un medicamento para administrar por vía oral una cantidad terapéuticamente eficaz del mismo para el tratamiento o prevención de la infección por el virus de la hepatitis C. La administración oral de estos ligandos inmunomoduladores de TLR7 y profármacos de los mismos a un mamífero proporciona cantidades terapéuticamente eficaces y efectos secundarios indeseables reducidos.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Puede conseguirse inmunomodulación por moléculas pequeñas por medio de la identificación de compuestos que se unen a y activan Receptores Tipo Toll (TLR). Los TLR desempeñan un papel importante en respuestas inmunes innatas en mamíferos y con frecuencia son la primera línea de defensa contra patógenos tales como bacterias y virus. Los diversos TLR varían en su abundancia en diferentes tipos celulares de mamífero y también varían con respecto a las estructuras moleculares que se unen al TLR y activan rutas de señalización. Estas rutas de señalización conducen a la serie de respuestas asociadas con la inmunidad innata.

Los TLR detectan PAMP (patrones moleculares asociados a patógenos) y estimulan a las células inmunes a través de la ruta de señalización de receptor de interleucina 1 (IL-1R)TLR dependiente de MyD88, lo cual conduce a la activación del factor de transcripción NF-κB2. En seres humanos se han identificado diez miembros de la familia funcional de TLR (TLR1 a TLR10). Akira S. y col., Nature Immunol., 2, 675-680 (2001). Los TLR2, TLR4 y TLR5 son cruciales para el reconocimiento de peptidoglicano, lipopolisacárido y flagelina. Hayashi, F. y col., Nature, 410, 1099-1103 (2001). El TLR6 se asocia con TLR2 y reconoce lipoproteínas de micoplasma. Ozinsky, A., y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA., 97, 13766-13771 (2000). El TLR9 detecta ADN bacteriano que contiene motivos CpG no metilados y el TLR3 activa a las células inmunes en respuesta al ARN bicatenario. Hemmi, H. y col., Nature, 408, 740-745 (2000).

Se han presentado varios compuestos, incluyendo análogos de guanosina, pirimidinas sustituidas e imidazoquinolinas como ligandos para TLR7. Véase, por ejemplo, Hemmi y col., Nature Immunol., 3, 196-200 (2002) (imiquimod y R-848 (resiquimod)); Jurk y col., Nat. Immunol., 3, 499 (2002) (R-848); y Lee y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 100, 6646-6651 (2003) (en el que los análogos de guanosina loxoribina, 7-tia-8-oxoguanosina (isatoribina) y 7deazaguanosina, y las imidazoquinolinas imiquimod y R-848 (resiquimod) activan

selectivamente TLR7).

Antes de asociarse como posibles ligandos de TLR7, los análogos de guanosina y otros nucleósidos de D y L purina han sido el objeto de una investigación considerable durante las dos últimas décadas. Véase, por ejemplo, Reitz y col., J. Med. Chem., 37, 3561-78 (1994); Michael y col., J. Med. Chem., 36, 3431-36 (1993) (análogos de guanosina inmunomoduladores que tienen sustituyentes en las posiciones 7 y/u 8); Patente Nº 5.821.236 de Krenitsky y col. (que describe 6-alcoxi derivados de derivados de arabinofuranosil purina que son útiles para terapia de tumores); Patente de Estados Unidos Nº 5.041.426 de Robins y col. (se describen ciertos nucleósidos de pirimido[4,5-d]pirimidina como agentes eficaces en el tratamiento contra L1210 en ratones BDF1); Revankar y col., J. Med. Chem., 27, 1489-96 (1984) (nucleósidos y nucleótidos de 3-deazaguanina que demuestran una actividad antiviral de amplio espectro significativa contra ciertos virus de ADN y ARN);

Recientemente, en la bibliografía se han identificado varios compuestos que se sabe que son inmunoestimuladores como ligandos de TLR7, véase, por ejemplo, Heil y col., Eur. J. Immunol., 33(11), 2987-97 (2003), Lore y col., J. Immunol., 171(8), 4320-8 (2003), Nagase y col., J. Immunol., 171(8), 3977-82 (2003), Mohty y col., J. Immunol., 171(7), 3385-93 (2003), Pinhal-Enfield, y col., Am. J. Pathol., 163(2), 711-21 (2003), Doxsee y col, J. Immunol., 171(3), 1156-63 (2003), Bottcher y col., Neurosci. Lett., 344(1), 17-20 (2003), Kaisho y col., Curr. Mol. Med., 3(4), 373-85 (2003), Okada y col., Eur. J. Immunol., 33(4), 1012-9 (2003), Edwards y col., Eur. J. Immunol., 33(4), 827-33 (2003), Akira y col., Immunol. Lett., 85(2), 85-95 (2003), Ito y col., Hum. Immunol., 63(12), 1120-5 (2002), Rothenfusser y col., Hum. Immunol., 63(12), 1111-9 (2002), Yamamoto y col., J. Immunol., 169(12), 6668-72 (2002), Gibson y col., Cell Immunol., 218(1-2), 74-86 (2002), Horng y col., Nature, 420 (6913), 329-33 (2002), Yamamoto y col., Nature, 420(6913), 324-9 (2002), Applequist y col., Int. Immunol., 14(9), 1065-74 (2002), Sato y col., Int. Immunol., 14(7), 783-91 (2002); Jurk y col., Nat. Immunol., 3(6), 499 (2002); Hornung y col., J. Immunol., 168(9), 4531-7 (2002), Hemmi y col., Nat. Immunot., 3(2), 196-200 (2002); Bruno y col., Eur. J. Immunol., 31(11), 3403-12 (2001); Jarrossay y col., Eur. J. Immunol., 31(11), 3388-93 (2001); Miettinen y col., Genes Immun., 2(6), 349-55 (2001), Chuang y col., Eur. Cytokine Netw., 11(3), 372-8 (2000) y Du y col., Eur. Cytokine Netw., 11(3), 362-71 (2000).

Se sabe que estos ligandos de TLR7 estimulan respuestas inmunes in vitro y en especies animales, y esto ha conducido al ensayo de los usos de estos compuestos para varios usos terapéuticos, incluyendo terapias antivirales y para cáncer. Estos compuestos se han caracterizado como análogos o derivados de a) guanosina, b) imidazoquinolina y c) pirimidina. Véase Akira, Current Opinion, 15, 5-11 (2003). Un miembro (imiquimod) de la clase química de la imidazoquinolina se ha considerado eficaz para tratar infecciones genitales tópicas por el virus del papiloma. Un segundo miembro de la clase de imidazoquinolina, resiquimod, se ha ensayado para el tratamiento del VHC, pero este compuesto no mostró efecto anti-VHC a dosis orales toleradas. Pockros y col., Gastroenterology, 124 (Suppl 1), A766 (2003).

De esta manera, aunque ha habido algún uso limitado de ligandos de TLR7 para el tratamiento de enfermedades inmunológicas e infecciones virales; véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.041.426 y 4.880.784 de Robins y col. (3-β-Dribofuranosiltiazolo[4,5-d]piridiminas que demuestran inmunoactividad significativa, incluyendo proliferación de células de bazo murinas y actividad in vivo contra el virus Semliki Forest); Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº US 2003/0199461 y documento WO 03/045968 de Averett y col. (nucleósidos de (3-β-D-ribofuranosiltiazolo[4,5-d]pirimidina que demuestran actividad contra infecciones agudas y crónicas de virus de ARN y ADN); hasta la fecha, los ligandos han resultado ineficaces para el tratamiento prevención del virus de la hepatitis C.

También se sabe que la administración oral de muchos análogos de nucleósidos de purina es el objeto de dificultades debidas a una mala absorción, baja solubilidad o degradación en el tracto digestivo como resultado de las condiciones ácidas o alcalinas o de la acción de enzimas, y/o combinaciones de estos fenómenos. De esta manera, sigue existiendo la necesidad de análogos de nucleósidos de purina con mejores disponibilidad y administración oral que se usen para modular aspectos del sistema inmune.

Además, los nucleósidos inmunomoduladores tienen una tolerabilidad oral relativamente mala en comparación con la de la vía intravenosa. Además, el tracto gastrointestinal presenta una barrera de tolerancia particular a agentes inmunológicos gracias a la gran cantidad de tejido inmune asociado con la pared intestinal (es decir, el intestino). Aunque éste es un mecanismo biológico importante para prevenir la invasión del cuerpo por la flora intestinal, el tejido inmune también puede verse afectado preferentemente después de la administración oral de compuestos inmunomoduladores debido a las altas concentraciones locales del compuesto administrado en el intestino. Esto conduce a efectos secundarios indeseables, por ejemplo en el caso de agentes activadores inmunes se observa gastroenteritis y efectos hemorrágicos localizados.

En la bibliografía no es evidente una solución al problema de la administración oral eficaz de agentes inmunomoduladores. Las pruebas disponibles indican que los niveles sistémicos de fármacos administrados en esta clase se han limitado por toxicidades gastrointestinales que se producen después de bajas dosis orales. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de ligandos de TLR7 inmunomoduladores que tengan mejor disponibilidad oral y menor irritación gastrointestinal.

3. SUMARIO DE LA INVENCIÓN 3.1 Ligandos de TLR7

5 La presente invención incluye usos de nuevos ligandos de TLR7 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección por el virus de la hepatitis C, y nuevas composiciones farmacéuticas que utilizan ligandos de TLR7 o sales, hidratos o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En una realización, la invención incluye el uso de un ligando de TLR7 para la 10 fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una infección por el virus de la hepatitis C en un paciente que lo necesita, en el que el ligando de TLR7 se selecciona entre

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en los que: cada R1 es H o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir, que puede estar interrumpido con uno o más heteroátomos O, S o N, o un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;

5 R2 es H, OH, SH, halo o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir, que puede estar interrumpido con uno o más heteroátomos O, S o N, o un -O-(alquilo), -O(arilo), -O-(heteroarilo), -S-(alquilo), -S-(arilo), -S-(heteroarilo), arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; R3 es H, OH o SH, o un alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, -O-(alquilo), -O

10 (arilo), -O-(heteroarilo), -S-(alquilo), -S-(arilo), -S-(heteroarilo), -NH(alquilo), -NH(arilo), NH(heteroarilo), -NH(R4)(alquilo), -NH(R4)(arilo) o -NH(R4)(heteroarilo)sustituido o sin sustituir, en los que R4 es un alquilo sustituido o sin sustituir; X es O o S; Y es H, halo, OH, OR4, SH, SR4 o un alquilo o arilo sustituido o sin sustituir;

15 Z es H, halo, OH, OR4, SH o SR4; o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de dicho estereoisómero.

En otra realización, el uso de la invención incluye un ligando de TLR7 seleccionado entre las Fórmulas Ia, Ib, Ic, Id, Ie, If, Ig e Ih, en las que R1 es H o un alquilo, alquenilo o 20 alquinilo sustituido o sin sustituir; R2 es H, OH, halo o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido

o sin sustituir o -CH2-O-(alquilo); R3 es H, OH o SH, o un -O-(alquilo), -S-(alquilo), o NH(alquilo) sustituido o sin sustituir; X es O o S; Y es H, halo, OH, OR4, SH o SR4; y Z es H, halo, OH, OR4, SH o SR4.

En otra realización, el uso de la invención incluye un ligando de TLR7 seleccionado 25 entre

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o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo. En un aspecto, el uso de la invención incluye el tratamiento o prevención de una infección por el virus de la hepatitis C en un mamífero que lo necesita, preferentemente en un 5 ser humano que lo necesita.

En una realización alternativa, el uso de la invención comprende adicionalmente

administrar al paciente una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un ligando de

TLR7 y un excipiente, soporte o vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización alternativa, el uso de la invención comprende adicionalmente 10 administrar al paciente una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un ligando de TLR7 por vía oral, mucosa, tópica o transdérmica.

En una realización preferida, el uso de la invención comprende adicionalmente

TLR7 por vía parenteral.

15 En otra realización, el uso de la invención comprende adicionalmente administrar al paciente una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un ligando de TLR7 y un agente terapéutico adicional, preferentemente un agente antiviral o inmunomodulador

adicional.

La invención también incluye composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral a un paciente que comprenden una cantidad terapéutica o farmacéuticamente aceptable de un ligando de TLR7 de la invención en forma estéril; composiciones farmacéuticas adecuadas para administración oral a un paciente que comprenden una cantidad terapéutica o farmacéuticamente aceptable de un ligando de TLR7 de la invención, formulándose dichas composiciones para reducir la exposición de la anatomía inmune subepitelial al ligando de TLR7 mientras que se mejora la absorción sistémica del ligando de TLR7; composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a través de la mucosa a un paciente que comprenden una cantidad terapéutica o farmacéuticamente aceptable de un ligando de TLR7 de la invención, formulándose dichas composiciones para reducir la exposición de la anatomía inmune subepitelial al ligando de TLR7 mientras se mejora la absorción sistémica del ligando de TLR7; y composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración tópica a un paciente que comprenden una cantidad terapéutica o farmacéuticamente aceptable de un ligando de TLR7 de la invención, formulándose dichas composiciones para reducir la exposición de la anatomía inmune subepitelial al ligando de TLR7 mientras se mejora la absorción sistémica del ligando de TLR7. Dependiendo del tejido específico a tratar, pueden usarse componentes adicionales tales como potenciadores de la penetración antes, junto con o después del tratamiento con principios activos de la invención. En una realización preferida, cada una de estas composiciones está en una sola forma farmacéutica monodosis y que comprende una cantidad de principio activo suficiente para tratar o prevenir la infección humana por el virus de la hepatitis C.

En una realización específica, la invención incluye una composición farmacéutica que comprende un ligando de TLR7 seleccionado entre análogos y derivados de a) guanosina, b) imidazoquinolina, c) adenina y d) pirimidina.

En otra realización específica, la invención incluye una composición farmacéutica que comprende un ligando de TLR7 seleccionado entre las Fórmulas Ia, Ib, Ic, Id, Ie, If, Ig y Ih, o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de dicho estereoisómero.

3.2 Profármacos de Ligandos de TLR7

La presente invención incluye nuevos usos de ligandos de TLR7 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección por el virus de la hepatitis C, y nuevas composiciones farmacéuticas que utilizan profármacos de ligandos de TLR7 o sales, hidratos, o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos.

También se describen procedimientos para tratar enfermedades que responden a

inmunoterapia con agentes inmunológicos, que comprenden administrar por vía oral un profármaco de ligando de TLR7 a un paciente que necesita inmunoterapia, en el que el profármaco de TLR7 consigue una concentración en plasma terapéuticamente eficaz del ligando de TLR7 en el paciente.

En una realización, la invención incluye el uso de un profármaco de ligando de TLR7 o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo para la fabricación de un medicamento para tratar una infección por el virus de la hepatitis C en un paciente, en el que la administración oral del profármaco de ligando de TLR7 consigue una concentración en plasma terapéuticamente eficaz del ligando de TLR7 reduciendo al mismo tiempo los efectos secundarios indeseables asociados con los ligandos de TLR7. En una realización preferida, el profármaco de ligando de TLR7 es un profármaco de ligando de TLR7 enmascarado.

También se describe un procedimiento para tratar enfermedades que responden a inmunoterapia reduciendo al mismo tiempo los efectos secundarios indeseables asociados con agentes inmunológicos, que comprende administrar por vía oral un profármaco de ligando de TLR7 a un paciente que necesita inmunoterapia, en el que el profármaco de TLR7 consigue una concentración en plasma terapéuticamente eficaz del ligando de TLR7 en el paciente. En una realización preferida, el profármaco de ligando de TLR7 es un profármaco de ligando de TLR7 enmascarado.

En otra realización, la administración oral del profármaco de ligando de TLR7 mejora la biodisponibilidad in vivo del ligando de TLR7. En una realización preferida, la administración oral del profármaco de ligando de TLR7 consigue una concentración en plasma eficaz in vivo del ligando de TLR7 que es del 10% al 500% de la exposición eficaz in vivo obtenida tras la administración oral del ligando de TLR7 solo. En otra realización preferida, la administración oral del ligando de TLR7 enmascarado consigue una concentración en plasma eficaz in vivo del ligando de TLR7 que es del 50% al 200% de la exposición eficaz in vivo obtenida después de la administración oral del ligando de TLR7 solo.

En otra realización, la administración oral del profármaco de ligando de TLR7 reduce efectos secundarios adversos. En una realización preferida, el efecto secundario comprende irritación gastrointestinal, comprendiendo la irritación gastrointestinal hemorragias, lesiones y emesis.

En otra realización, el profármaco de ligando de TLR7 mejora la disponibilidad oral al menos en un 25% y reduce la irritación gastrointestinal al menos en un 50% en un paciente con respecto a la administración oral del ligando de TLR7 solo. En otra realización, el profármaco de ligando de TLR7 mejora la disponibilidad oral al menos en un 50% y reduce la irritación gastrointestinal en tal medida que otras toxicidades se vuelven limitantes en un paciente con respecto a la administración oral del ligando de TLR7 solo.

En una realización preferida, el profármaco de ligando de TLR7 consigue una concentración en plasma terapéuticamente eficaz que es del 25% al 200% de la concentración eficaz in vivo del ligando de TLR7 en un paciente después de la administración oral, con una

5 irritación gastrointestinal mínima.

En una realización, los usos de la invención incluyen la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un profármaco de un ligando de TLR7 seleccionado entre análogos y derivados de a) guanosina, b) imidazoquinolina, c) adenina; y d) pirimidina.

10 En otra realización, los usos de la invención incluyen la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un profármaco de un ligando de TLR7 seleccionado entre análogos y derivados de a) guanosina, b) imidazoquinolina, c) adenina y d) pirimidina, siendo el profármaco (a) un resto amida, carbamato o amidina después de la conversión de un sustituyente amina del ligando de TLR7,

15 (b) un resto éster, carbonato, carbamato, éter, imidato, acetal, aminal o cetal después de la conversión de un sustituyente alcohol del ligando de TLR7, (c) un resto acetal o cetal después de la conversión de un sustituyente ceto del ligando de TLR7, (d) un resto imidato después de la conversión de un carbonilo de un sustituyente amido del ligando de TLR7, (e) un resto desoxigenado después de la conversión de un sustituyente oxo de pirimidina o guanosina del

20 ligando de TLR7, o (f) amina. En otra realización, los procedimientos de la invención incluyen la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un profármaco de un ligando de TLR7 seleccionado entre

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en los que: cada R1 es H o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir, que puede estar interrumpido con uno o más heteroátomos O, S o N, o un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; R2 es H, OH, SH, halo o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir, que puede estar interrumpido con uno o más heteroátomos O, S o N, o un -O-(alquilo), -O(arilo), -O-(heteroarilo), -S-(alquilo), -S-(arilo), -S-(heteroarilo), arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; R3 es H, OH o SH, o un alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo,

heteroarilo, -O-(alquilo), -O-(arilo), -O-(heteroarilo), -S-(alquilo), -S-(arilo), -S(heteroarilo), -NH(alquilo), -NH(arilo), -NH(heteroarilo), -NH(R4)(alquilo), -NH(R4)(arilo) o -NH(R4)(heteroarilo) sustituido o sin sustituir; R4 es un alquilo sustituido o sin sustituir;

R5

es independientemente H, -C(O)(alquilo C1-18) o un grupo aminoácido L, D o racémico -C(O)CHNH2R9; R6 es H, OR10 o N(R11)2; R7 es independientemente H o un -C(O)(alquilo C1-18) o -C(O)2(alquilo C1-18) sustituido o sin sustituir;

R8

es H, -OH, -O-(alquilo), -OCO2(alquilo C1-18), -OC(O)(alquilo C1-18) o un grupo aminoácido L, D o racémico -OC(O)CHNH2R1; R9

es H o un alquilo, C(O)CH(alquil C1-6)NH2 o -C(O)CH(CH2-aril)NH2 sustituido o sin sustituir; R10 es independientemente H, alquilo C1-6, alquenilo C3-7, alquinilo C3-7, -(CR12R13)t(arilo C6-C10), -(CR12R13)t(cicloalquilo C3-C10), -(CR12R13)t(heterocíclico C4-C10),

(CR12R13)t>1OH, -(CR12R13)t>0CO2alquilo C1-18 y -(CR12R13)t>0N(R14)CO2alquilo C1-18 y SO2(arilo), en los que t es un número entero de 0 a 6 a menos que se indique otra cosa, y en los que los restos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo y heterocíclico de los grupos anteriores están opcionalmente sustituidos con sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, ciano, nitro, trifluorometilo, trifluorometoxi, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, hidroxi, alcoxi C1-C6, -NH2, -NH-alquilo, -N(alquilo)2, -NH-arilo, -N(alquil)(arilo), -N(arilo)2, -NH-CHO, NHC(O)alquilo, -NHC(O)arilo, -N(alquil)C(O)H, -N(alquil)C(O)alquilo, -N(aril)C(O)H, N(aril)C(O)alquilo, -NHCO2alquilo, -N(alquil)CO2alquilo, -NHC(O)NH2, N(alquil)C(O)NH2, -NHC(O)NH-alquilo, -NHC(O)N(alquilo)2, -N(alquil)C(O)NH-alquilo, N(alquil)C(O)N(alquilo)2, -NHSO2-alquilo, -N(alquil)SO2-alquilo, -C(O)alquilo, -C(O)arilo, -OC(O)alquilo, -OC(O)arilo, -CO2-alquilo, -CO2-arilo, -CO2H, -C(O)NH2, -C(O)NHalquilo, -C(O)N(alquilo)2, -C(O)NH-arilo, -C(O)N(arilo)2, -C(O)N(alquil)(arilo), S(O)alquilo, -S(O)arilo, -SO2alquilo, -SO2arilo, -SO2NH2, -SO2NH-alquilo y SO2N(alquilo)2; R11 es independientemente H, alquilo C1-6, cicloalquilo C3-C10, o junto con nitrógeno forma un anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros; R12 y R13 son independientemente H, alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o alquinilo C2-6; R14 es H, alquilo C1-6 o -CH2-arilo; X es O o S; Y es H, halo, OH, OR4, SH, SR4 o un alquilo o arilo sustituido o sin sustituir; y

Z es H, halo, OH, OR4, SH o SR4; o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de dicho estereoisómero.

En otra realización, la invención incluye un uso de un ligando de TLR7 seleccionado

5 entre la Fórmula IIa, IIb, IIc, IId, IIe, IIf, IIg y IIh para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección por el virus de la hepatitis C en un paciente que lo necesita, en las que R1 es H o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir; R2 es H, OH, halo o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir o -CH2-O-(alquilo); R3 es H, OH o SH, o un -O-(alquilo), -S-(alquilo) o -NH(alquilo) sustituido o sin sustituir; R5 es

10 independientemente H, -C(O)(alquilo C1-18) o un grupo aminoácido L, D o racémico C(O)CHNH2R9, en el que R9 es un alquilo sin sustituir; R6 es H o OR10, en el que R10 es independientemente alquilo C1-6, alquenilo C3-7, alquinilo C3-7, -(CR12R13)t(arilo C6-C10), (CR12R13)t(heterocíclico C4-C10) y -(CR12R13)t>0N(R14)CO2alquilo C1-18, en los que t es un número entero de 0 a 4 a menos que se indique otra cosa, y en los que los restos alquilo, alquenilo,

15 arilo y heterocíclico de los grupos anteriores están opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, ciano, nitro, trifluorometilo, trifluorometoxi, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, hidroxi, alcoxi C1-C6, -CO2-alquilo, -CO2-arilo, -OC(O)alquilo y -OC(O)arilo, y en los que R12 y R13 son independientemente H, alquilo C1-6 o alquenilo C2-6; y R14 es H, -CH3 o -CH2CH3; R7 es independientemente H o un

20 C(O)(alquilo C1-18) o -C(O)2(alquilo C1-18) sustituido o sin sustituir; R8 es H, -OH, -O-(alquilo), OCO2(alquilo C1-18) o un grupo aminoácido L, D o racémico -OC(O)CHNH2R1; X es O o S; Y es H, halo, OH, OR4, SH o SR4; y Z es H, halo, OH, OR4, SH o SR4. En una realización específica, la invención incluye un uso de un ligando de TLR7 seleccionado entre

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y

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o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de dicho estereoisómero para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección por el virus de la hepatitis C en un paciente que lo necesita.

En otra realización preferida de la invención, el profármaco del ligando de TLR7 es un profármaco de éster de aminoácido del ligando de TLR7. En otra realización preferida, el profármaco de éster de aminoácido del ligando de TLR7 es un éster de valilo.

En una realización de la invención, R5 no es un grupo aminoácido L, D o racémico C(O)CHNH2R9. En otra realización, R5 no es un grupo aminoácido L, D o racémico C(O)CHNH2R9 cuando el profármaco del ligando de TLR7 se selecciona entre un compuesto de Fórmula IIh.

En otra realización alternativa, la invención incluye un uso de un profármaco de un ligando de TLR7 y un excipiente, soporte o vehículo farmacéuticamente aceptable para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección por el virus de la hepatitis C en un paciente que lo necesita.

En otra realización, la invención incluye un uso de un profármaco de un ligando de TLR7 y un agente terapéutico adicional, preferentemente un agente antiviral o inmunomodulador adicional para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección por el virus de la hepatitis C en un paciente que lo necesita.

La invención también incluye composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral a un paciente que comprenden una cantidad terapéutica o farmacéuticamente aceptable de un profármaco de un ligando de TLR7 de la invención en una forma estéril; composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral a un paciente que comprenden una cantidad terapéutica o farmacéuticamente aceptable de un profármaco de un ligando de TLR7 de la invención; composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración mucosa a un paciente que comprenden una cantidad terapéutica o farmacéuticamente aceptable de un profármaco de un ligando de TLR7 de la invención; y composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración tópica a un paciente que comprenden una cantidad terapéutica o farmacéuticamente aceptable de un profármaco de un ligando de TLR7 de la invención. Dependiendo del tejido específico que se trate, pueden usarse componentes adicionales, tales como potenciadores de la penetración, antes de, conjuntamente con, o después del tratamiento con los principios activos de la invención. En una realización preferida, cada una de estas composiciones está en una sola forma farmacéutica individual y comprende una cantidad de principio activo suficiente para tratar o prevenir la infección humana por el virus de la hepatitis C.

En una realización específica, la invención incluye una composición farmacéutica que comprende un profármaco de un ligando de TLR7 seleccionado entre la Fórmula IIa, IIb, IIc, IId, IIe, IIf, IIg y IIh, o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de dicho estereoisómero.

En otra realización de la invención, y dependiendo del tejido específico que se trate, pueden usarse componentes adicionales incluyendo, pero sin limitación, potenciadores de la penetración, moléculas que se dirigen al área de la infección y moléculas que reducen la toxicidad in vivo del profármaco de un ligando de TLR7 antes de, conjuntamente con, o después del tratamiento con uno o más profármacos de ligandos de TLR7 de la invención.

Los profármacos de ligandos de TLR7 pueden ser útiles como potenciadores del sistema inmune y tienen ciertas propiedades del sistema inmune incluyendo modulación, mitogenicidad, aumento y/o potenciación o son intermedios para compuestos que tienen estas propiedades. Se espera que los compuestos expresen efectos después de la administración a un mamífero sobre al menos una de las poblaciones de células caracterizadas como los linfocitos citolíticos naturales, macrófagos, células dendríticas y células linfocíticas del sistema inmune de un huésped. Debido a estas propiedades, son útiles como un agente anti-infeccioso incluyendo, pero sin limitación, agentes antivirales, y como agentes antitumorales o como intermedios para los mismos. Pueden usarse para tratar a un huésped afectado actuando como los principios activos de composiciones farmacéuticas adecuadas.

En un aspecto de la invención, los profármacos de ligando de TLR7 se utilizan para tratar la serie completa de enfermedades virales en mamíferos por medio de la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos. Las enfermedades virales que se contempla tratar con profármacos de ligando de TRL7 incluyen infecciones agudas y crónicas causadas tanto por virus de ARN como por virus de ADN. Sin limitar de ninguna manera la serie de infecciones virales que pueden tratarse, los profármacos de ligando de TLR7 son particularmente útiles en el tratamiento de infecciones producidas por adenovirus, citomegalovirus, virus de la hepatitis A (VHA), virus de la hepatitis B (VHB), flavivirus incluyendo el virus de la Fiebre Amarilla, hepacivirus incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC), herpes simplex tipo 1 y 2, herpes zoster, herpesvirus 6 humano, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma humano (VPH), virus de la gripe A, virus de la gripe B, sarampión, virus paragripal, pestivirus, poliovirus, poxvirus (incluyendo virus de la viruela y virus de la viruela de los monos), rinovirus, coronavirus, virus sincitial respiratorio (VSR), múltiples familias de virus que producen fiebres hemorrágicas, incluyendo los Arenavirus (LCM, virus Junin, virus Machupo, virus Guanarito y Fiebre de Lassa), los Bunyavirus (virus Hanta y Fiebre de Valle de Rift) y Filovirus (virus del Ébola y virus Marburg), una serie de encefalitis virales que incluyen el virus del Nilo Occidental, el virus de LaCrosse, el virus de la Encefalitis de California, el virus de la Encefalitis Equina de Venezuela, el virus de la Encefalitis Equina Oriental, el virus de la Encefalitis Equina Occidental, el virus de la Encefalitis Japonesa, el virus Kysanur Forest y virus que transmiten garrapatas tales como el virus de la fiebre Hemorrágica de Crimea-Congo.

Los profármacos de ligando de TLR7 pueden utilizarse para tratar infecciones bacterianas, fúngicas y protozoarias en mamíferos por medio de la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de los profármacos. Se contempla que la serie completa de microorganismos patógenos se puede tratar por los profármacos de ligando de TLR7 de la presente invención, incluyendo sin limitación los organismos que son resistentes a antibióticos. La capacidad de los profármacos de ligando de TLR7 de activar múltiples componentes del sistema inmune evita mecanismos de resistencia encontrados comúnmente para reducir la susceptibilidad a antibióticos, y de esta forma también se describe el tratamiento de infecciones causadas por dichos microorganismos resistentes en un mamífero por profármacos de ligando de TLR7.

Los profármacos de ligando de TLR7 pueden utilizarse para tratar tumores en mamíferos por medio de la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de los profármacos. Los tumores o cánceres que se contempla tratar incluyen los que se producen por aberraciones en procesos celulares normales así como los causados por virus, y el efecto puede implicar la inhibición de la propagación de células cancerosas, la aceleración de la destrucción de células cancerosas, la inhibición de la transformación de células infectadas por virus en un estado neoplásico, la inhibición de la extensión de virus desde células transformadas a otras células normales y/o la detención del crecimiento de células transformadas con virus. Es de esperar que los profármacos de ligandos de TLR7 sean útiles contra un amplio espectro de tumores que incluyen, pero sin limitación, carcinomas, sarcomas y leucemias. En esta clase se incluyen carcinomas mamarios, de colon, de vejiga, de pulmón, de próstata, de estómago y de páncreas y leucemias linfoblásticas y mieloides.

También se describe un procedimiento para tratar a un mamífero que comprende administrar una cantidad terapéutica y/o profilácticamente eficaz de un agente farmacéutico que contiene un profármaco de ligando de TLR7. En este aspecto, el efecto puede relacionarse con la modulación de alguna parte del sistema inmune del mamífero, especialmente la modulación de actividades de citocinas Th1 y Th2, incluyendo pero sin restricción la familia de las interleucinas, por ejemplo IL-1 a IL-12, y otras citocinas tales como TNF alfa, e interferones incluyendo el interferón alfa, interferón beta e interferón gama, y sus efectores aguas abajo. Cuando se produce la modulación de citocinas Th1 y Th2, se contempla que la modulación puede incluir la estimulación tanto de Th1 como de Th2, la supresión tanto de Th1 como de Th2, la estimulación de Th1 o Th2 y la supresión del otro, o una modulación bimodal en la que se produce un efecto sobre los niveles de Th1/Th2 (tal como una supresión generalizada) a una alta concentración mientras que se produce otro efecto (tal como la estimulación de Th1 o Th2 y la supresión del otro) a una concentración inferior.

Las composiciones farmacéuticas que contienen un profármaco de un ligando de TLR7 pueden administrarse en dosis terapéuticamente eficaces a un mamífero que está recibiendo fármacos inmunomoduladores no incluidos en la presente invención. Las dosis del fármaco inmunomodulador se reducen por debajo de su dosis eficaz habitual, para reducir los efectos adversos. El fármaco inmunomodulador se usa a su dosis habitual, pero con un efecto terapéutico mejorado cuando también se administra un profármaco de un ligando de TLR7.

En otro aspecto de la invención, se administran composiciones farmacéuticas que contienen un profármaco de un ligando de TLR7 en una dosis terapéuticamente eficaz a un mamífero que recibe fármacos anti-infecciosos no incluidos en la presente invención. En un aspecto preferido de la presente invención, las composiciones farmacéuticas que contienen un profármaco de un ligando de TLR7 se administran en una dosis terapéuticamente eficaz con uno o más fármacos antiinfecciosos que actúan directamente sobre el agente infeccioso para inhibir el crecimiento o destruir el agente infeccioso.

4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es una representación gráfica de niveles en plasma de isatoribina e interferón alfa en ratones.

La Figura 2 es una representación gráfica de cambios de carga viral en pacientes infectados por VHC que reciben isatoribina.

5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 5.1 DEFINICIONES

Cuando en esta memoria descriptiva se usan los siguientes términos, se usan como se define a continuación:

Las expresiones “que comprende” y “que incluye” se usan en el presente documento en su sentido abierto, no limitante.

El término “nucleósido” se refiere a un compuesto constituido por cualquier resto de pentosa o pentosa modificada unido a una posición específica de un heterociclo o a la posición natural de una purina (posición 9) o pirimidina (posición 1) o a la posición equivalente en un análogo.

El término "purina" se refiere a heterociclos bicíclicos nitrogenados.

El término “D-nucleósidos” se refiere a los compuestos nucleosídicos que tienen un resto de azúcar de D-ribosa (por ejemplo, Adenosina).

El término “L-nucleósidos” se refiere a los compuestos nucleosídicos que tienen un resto de azúcar de L-ribosa.

El término “inmunomodulador” se refiere a productos naturales o sintéticos que pueden modificar el sistema inmune normal o aberrante por medio de estimulación o supresión.

El término “NOAEL” es el nivel de Acontecimientos Adversos No Observados, que es un término de toxicología para la dosis de fármaco que no produce una toxicidad significativa en las condiciones especificadas de nivel de dosificación, frecuencia y duración en una especie seleccionada.

“Ligando” significa una molécula de bajo peso molecular capaz de unirse a un receptor biológico. Un ligando puede ser un agonista o un antagonista, o puede no tener ningún efecto.

Un “agonista” es un ligando que, después de la unión, estimula al receptor para ejercer una respuesta biológica que es coherente con la actividad biológica normal del receptor.

Un “antagonista” es un ligando que, después de la unión, hace que el receptor no ejerza la actividad biológica normal del receptor.

El término “mamífero” incluye tanto animales como seres humanos.

El término “prevención” se refiere a la capacidad de un compuesto o composición de la invención de prevenir una enfermedad identificada en el presente documento en mamíferos a los que se les ha diagnosticado la enfermedad o que tienen riesgo de desarrollar dicha enfermedad. El término también incluye la prevención de la progresión adicional de la enfermedad en mamíferos que ya padecen o tienen síntomas de dicha enfermedad.

El término “tratamiento” se refiere a:

(i): la prevención de que se produzca una enfermedad, trastorno o afección en un mamífero que puede tener predisposición a la enfermedad, trastorno y/o afección, pero en el que aún no se ha diagnosticado;

(ii): inhibición de la enfermedad, trastorno o afección, es decir, detención de su desarrollo; y

(iii) alivio de la enfermedad, trastorno o afección, es decir, provocación de la regresión de la enfermedad, trastorno y/o afección. Los términos “α”y“β” indican la configuración estereoquímica específica de un

sustituyente en un átomo de carbono asimétrico en una estructura química como la dibujada.

Los términos “paciente” o “sujeto” significan un animal (por ejemplo, vaca, caballo, oveja, cerdo, pollo, pavo, codorniz, gato, perro, ratón, rata, conejo, cobaya, etc.) o un mamífero, incluyendo animales y mamíferos quiméricos y transgénicos. En el tratamiento o prevención de la infección por VHC, el término “paciente” o “sujeto” preferentemente significa un mono o un ser humano, más preferentemente un ser humano. En una realización específica, el paciente o sujeto está infectado por o expuesto al virus de la hepatitis C. En ciertas realizaciones, el paciente es un bebé (edad 0-2), niño (edad 2-17), adolescente (edad 12-17), adulto (edad 18 y más) o paciente geriátrico (edad 70 y más) humano. Además, el paciente incluye pacientes inmunocomprometidos tales como pacientes positivos para VIH, pacientes con cáncer, pacientes sometidos a inmunoterapia o quimioterapia. En una realización particular, el paciente es un individuo sano, es decir no presenta síntomas de otras infecciones virales.

La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad del ligando de TLR7 o profármaco de un ligando de TLR7 de la invención suficiente para proporcionar un efecto beneficioso en el tratamiento o prevención de una enfermedad viral, para retrasar o minimizar síntomas asociados con la infección viral o la enfermedad inducida por virus, o para curar o mejorar la enfermedad o infección o la causa de la misma. En particular, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad suficiente para proporcionar un efecto beneficioso terapéutico in vivo. Usada en relación con una cantidad de un compuesto de la invención, el término preferentemente incluye una cantidad no tóxica que mejora la terapia global, reduce o evita los síntomas o causas de la enfermedad, o aumenta la eficacia terapéutica o sinergias con otro agente terapéutico.

La expresión “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un compuesto de la invención u otro principio activo suficiente para dar como resultado la prevención de la infección, la recurrencia o la propagación de la infección viral. Una cantidad profilácticamente eficaz puede referirse a una cantidad suficiente para prevenir la infección inicial o la recurrencia o propagación de la infección o una enfermedad asociada con la infección. Usada en relación con una cantidad de un compuesto de la invención, la expresión preferentemente incluye una cantidad no tóxica que mejora la profilaxis global o mejora la eficacia profiláctica o presenta un efecto sinérgico con otro agente profiláctico o terapéutico.

La expresión “en combinación” se refiere al uso de más de un agente profiláctico y/o terapéutico simultánea o secuencialmente y de tal manera que sus efectos respectivos sean aditivos o sinérgicos.

La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales preparadas a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, o bases que incluyen ácidos y bases inorgánicas y ácidos y bases orgánicas. Si el profármaco del ligando de TLR7 de la invención es una base, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse por cualquier procedimiento adecuado disponible en la técnica, por ejemplo, tratamiento de la base libre con un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, o con un ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, un ácido piranosidílico, tal como ácido glucurónico o ácido galacturónico, un alfa-hidroxi ácido, tal como ácido cítrico o ácido tartárico, un aminoácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, un ácido aromático, tal como ácido benzoico o ácido cinámico, un ácido sulfónico, tal como ácido p-toluenosulfónico o ácido etanosulfónico, o similares. Si el profármaco del ligando de TLR7 de la invención es un ácido, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse por cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, el tratamiento del ácido libre con una base inorgánica u orgánica, tal como una amina (primaria, secundaria o terciaria), un hidróxido de metal alcalino o hidróxido de metal alcalinotérreo, o similares. Los ejemplos ilustrativos de sales adecuadas incluyen sales orgánicas obtenidas a partir de aminoácidos, tales como glicina y arginina, amoniaco, aminas primarias, secundarias y terciarias, y aminas cíclicas, tales como piperidina, morfolina y piperazina, y sales inorgánicas obtenidas a partir de sodio, calcio, potasio, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, aluminio y litio.

El término "profármaco" pretende indicar cualquier entidad química que después de la administración se convierte a través de acciones metabólicas o solvólisis en una entidad química diferente que mantiene la actividad biológica.

La expresión "profármaco del ligando de TLR7" pretende indicar cualquier entidad química que, después de la administración, se convierte a través de acciones metabólicas o solvólisis en una entidad química diferente que mantiene la actividad biológica y que es un ligando para TLR7. Un profármaco del ligando de TLR7 puede ser por sí mismo un ligando para TLR7, o puede estar "enmascarado" de tal forma que no funciona eficazmente como un ligando de TLR7.

La expresión "profármaco del ligando de TLR7 enmascarado" pretende indicar

cualquier entidad química que, después de la administración, se convierte a través de acciones metabólicas o solvólisis en una entidad química diferente que mantiene la actividad biológica y que es un ligando para TLR7, y donde la entidad química administrada es un ligando menos eficaz para TLR7 que la entidad química que surge de la conversión metabólica o solvólisis.

La expresión "un metabolito farmacéuticamente activo" pretende indicar un producto farmacéuticamente activo producido a través del metabolismo en el cuerpo de un compuesto especificado o sal del mismo. Después de entrar en el cuerpo, la mayoría de los profármacos son sustratos para reacciones químicas que pueden cambiar sus propiedades físicas y efectos biológicos. Estas conversiones metabólicas, que normalmente afectan a la polaridad del ligando de TLR7, alteran la forma en la que los fármacos se distribuyen y se excretan del cuerpo. Sin embargo, en algunos casos, se requiere el metabolismo de un fármaco para conseguir el efecto terapéutico. Por ejemplo, muchos fármacos anticancerosos de la clase de los antimetabolitos deben convertirse en sus formas activas después de que hayan sido transportados a la célula cancerosa.

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique otra cosa, el término "alquilo" significa un hidrocarburo saturado, no cíclico, de cadena lineal o ramificada, que tiene de 1 a 20 átomos de carbono, preferentemente 1-10 átomos de carbono y aún más preferentemente 1-4 átomos de carbono. Los alquilos saturados de cadena lineal representativos incluyen -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, -n-hexilo, -n-heptilo, -noctilo, -n-nonilo y -n-decilo; mientras que los alquilos saturados de cadena ramificada incluyen isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -terc-butilo, -isopentilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 2-metilhexilo, 3-metilhexilo, 4-metilhexilo, 5metilhexilo, 2,3-dimetilbutilo, 2,3-dimetilpentilo, 2,4-dimetilpentilo, 2,3-dimetilhexilo, 2,4dimetilhexilo, 2,5-dimetilhexilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,2-dimetilhexilo, 3,3-dimetilpentilo, 3,3dimetilhexilo, 4,4-dimetilhexilo, 2-etilpentilo, 3-etilpentilo, 2-etilhexilo, 3-etilhexilo, 4-etilhexilo, 2metil-2-etilpentilo, 2-metil-3-etilpentilo, 2-metil-4-etilpentilo, 2-metil-2-etilhexilo, 2-metil-3etilhexilo, 2-metil-4-etilhexilo, 2,2-dietil-pentilo, 3,3-dietilhexilo, 2,2-dietilhexilo, 3,3-dietilhexilo y similares. Un grupo alquilo puede estar sin sustituir o sustituido.

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique otra cosa, el término "arilo" significa un anillo aromático carbocíclico que contiene de 5 a 14 átomos en el anillo. Todos los átomos en el anillo de un grupo arilo carbocíclico son átomos de carbono. Las estructuras de anillo arilo incluyen compuestos que tienen una o más estructuras de anillo tales como compuestos mono-, bi-o tricíclicos así como restos carbocíclicos benzo-condensados tales como 5,6,7,8-tetrahidronaftilo y similares. Preferentemente, el grupo arilo es un anillo monocíclico o un anillo bicíclico. Los grupos arilo representativos incluyen fenilo, tolilo, antracenilo, fluorenilo, indenilo, azulenilo, fenantrenilo y naftilo. Un grupo arilo carbocíclico puede estar sin sustituir o sustituido.

El término "sustituido" significa que el grupo o resto especificado tiene uno o más sustituyentes. El término "sin sustituir" significa que el grupo especificado no tiene eningún sustituyente. Un "alquilo sustituido" o "arilo sustituido" está sustituido con uno o más sustituyentes incluyendo halógeno (F, Cl, Br o I), alquilo (C1-6) inferior, -OH, -NO2, -CN, -CO2H, -O-alquilo inferior, -arilo, -aril-alquilo inferior, -CO2CH3, -CONH2, -OCH2CONH2, -NH2, SO2NH2, haloalquilo (por ejemplo, -CF3, -CH2CF3), -O-haloalquilo (por ejemplo, -OCF3, OCHF2) y similares.

Como se usa en el presente documento y a menos que se indique otra cosa, la expresión "ópticamente puro" o "estereoméricamente puro" significa una composición que comprende un estereoisómero de un compuesto y está sustancialmente libre de otros estereoisómeros de ese compuesto. Por ejemplo, un compuesto estereoméricamente puro que tiene un centro quiral estará sustancialmente libre del enantiómero opuesto del compuesto. Un compuesto estereoméricamente puro típico comprende más de aproximadamente el 80% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente el 20% en peso de otros estereoisómeros del compuesto, más preferentemente más de aproximadamente el 90% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente el 10% en peso de los otros estereoisómeros del compuesto, todavía más preferentemente más de aproximadamente el 95% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente 5% en peso de los otros estereoisómeros del compuesto, y lo más preferentemente de aproximadamente el 97% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente el 3% en peso de los otros estereoisómeros del compuesto. Como muchos de los compuestos de la invención comprenden sacáridos que pueden existir en las formas D o L, la invención incluye cualquiera o ambos azúcares D y L. Por lo tanto, por ejemplo, un azúcar D estereoméricamente puro puede estar sustancialmente libre de la forma

L. En una realización alternativa, el uso de formas L de un ligando de TLR7 estará sustancialmente libre de la forma D. Por lo tanto, los procedimientos y composiciones desveladas en el presente documento incluyen en una realización alternativa el uso de dichos azúcares levorrotatorios o polímeros preparados a partir de los mismos.

Los compuestos de la invención pueden mostrar el fenómeno de tautomería. Como las Fórmulas I y II no pueden representar expresamente todas las formas tautoméricas posibles, se entiende que la Fórmula I pretende representar cualquier forma tautomérica del compuesto representado y no se limitan meramente a una forma específica del compuesto representada por los dibujos de las fórmulas. Por ejemplo, se entiende que independientemente de si se muestran o no los sustituyentes en su forma enol o en su forma ceto, éstos representan el mismo compuesto (como se muestra en el ejemplo de Fórmula IIa a continuación).

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5.2 Identificación de Ligandos de TLR7

5 Los ligandos de TLR7 conocidos incluyen, pero sin limitación (1) análogos de guanosina tales como 7-deazaguanosina y compuestos relacionados, incluyendo pero sin limitación los descritos en Townsend, J. Heterocyclic Chem, 13, 1363 (1976), y Seela, y col., Chem. Ber., 114(10), 3395-3402 (1981); 7-alil, 8-oxo-guanosina (loxorabina) y compuestos relacionados, incluyendo pero sin limitación los descritos en Reitz, y col., J. Med. Chem, 37, 3561-3578

10 (1994); 7-metil, 9-deazaguanosina y compuestos relacionados incluyendo, pero sin limitación, los descritos en Girgis y col., J. Med. Chem., 33, 2750-2755 (1990); 8-bromoguanosina y otros compuestos de purinas 8-halógeno sustituidas incluyendo, pero sin limitación, los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 4.643.992; 6-amino-9-bencil-2-butoxi-9H-purin-8-ol y otras purinas 2, 6, 8, 9-sustituidas incluyendo, pero sin limitación, las descritas en Hirota y col., J.

15 Med. Chem., 45, 5419-5422 (2002), Henry y col., J. Med. Chem., 33, 2127-2130 (1990), Michael y col., J. Med. Chem., 36, 3431-3436 (1993), Fumeaux y col., J. Org. Chem., 64 (22), 8411-8412 (1999), Barrio y col; J. Org. Chem., 61, 6084-6085 (1996), Patente de Estados Unidos Nº 4.539.205, Patente de Estados Unidos Nº 5.011.828, Patente de Estados Unidos Nº 5.041.426, Patente de Estados Unidos Nº 4.880.784 y Publicación de Solicitud de Patente

20 Internacional Nº WO 94/07904; (2) imidazoquinolinas incluyendo, pero sin limitación, 1-(4amino-2-etoximetil-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)-2-metil-propan-2-ol (imiquimoid), como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional Nº WO 94/17043; 1-isobutil1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-ilamina (resiquimoid) como se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional Nº WO 94/17043 y Solicitudes de Patente de Estados

25 Unidos Nº 10/357.777 (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº US 2003/0195209), 10/357.733 (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº US 2003/0186949), 10/358.017 (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº US 2003/0176458), 10/357.995 (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº US 2003/0162806), 10/165.222 (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº US

30 2003/0100764), 10/011.921 (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº US 2003/0065005) y 10/013.059 (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº US 2002/0173655); Patente de Estados Unidos Nº 5.395.937; Publicación de Solicitud de Patente Internacional Nº WO 98/17279; y (3) derivados de pirimidina incluyendo, pero sin limitación, 2amino-6-bromo-5-fenil-3H-pirimidin-4-ona (bropirimina), y pirimidinas sustituidas similares incluyendo, pero sin limitación, las descritas en Wierenga y col., J. Med. Chem, 23, 239-240 (1980), Fan y col., J. Heterocyclic Chem., 30, 1273 (1993), Skilnick y col., J. Med. Chem., 29, 1499-1504 (1986), Fried, y col., J. Med. Chem., 23, 237-239 (1980) y Fujiwara y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10(12) 1317-1320 (2000).

Además de los ligandos de TLR7 anteriores, pueden identificarse fácilmente otros ligandos de TLR7 por procedimientos de selección conocidos. Véase, por ejemplo, Hirota y col., J. Med. Chem., 45, 5419-5422 (2002); y Akira S. y col., Immunology Letters, 85, 85-95 (2003). Usando una variante de uno de estos procedimientos de selección conocidos (como se describe en la Sección 6.1), también se identificaron análogos y derivados de adenina como ligandos de TLR7. Se describen derivados de adenina conocidos en la técnica en las Publicaciones de Solicitud de Patente Europea Nº EP 1 035 123, EP 1 043 021 y EP 0 882 727; Patente de Estados Unidos Nº 6.376.501; Patente de Estados Unidos Nº 6.329.381; Patente de Estados Unidos Nº 6.028.076 y Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº US 2003/0162806.

Los ligandos de TLR7 de Fórmulas Ia-Ih pueden sintetizarse usando procedimientos conocidos por un experto en la materia, particularmente a la luz de las referencias y patentes indicadas anteriormente.

5.3 Preparación de Profármacos de Ligandos de TLR7

Los profármacos de ligandos de TLR7 de la invención se preparan fabricando una (a) amida, carbamato o resto de amidina después de la conversión de sustituyente amina del ligando de TLR7, (b) resto éster, carbonato, carbamato, éter, imidato, acetal o cetal después de la conversión de un sustituyente alcohol del ligando de TLR7, (c) resto acetal o cetal después de la conversión de un sustituyente amina del ligando de TLR7, (d) resto imidato después de la conversión de un carbonilo del ligando de TLR7 de un sustituyente amido, (e) resto desoxigenado después de la conversión de un sustituyente oxo del ligando de TLR7 de pirimidina o guanosina, o (f) amina. Por ejemplo, los profármacos de ligandos de TLR7 se preparan (1) convirtiendo sustituyentes hidroxilo (OH) del ligando de TLR7 en un éster de aminoácido, o (2) fabricando un sustituyente de amina del ligando de TLR7 en una amida o carbamato. El procedimiento para preparar profármacos es bien conocido en la técnica y se describe por Burger's Medicinal Chemistry and Drug Chemistry, 1, 172-178, 949-982 (1995). Véase también Bertolini y col., J. Med. Chem., 40, 2011-2016 (1997); Shan, y col., J. Pharm.

Sci., 86 (7), 765-767; Bagshawe, Drug Dev. Res., 34, 220-230 (1995); Bodor, Advances in Drug Res., 13, 224-331 (1984); Bundgaard, Design of Prodrugs (Elsevier Press 1985); Larsen, Design and Application of Prodrugs, Drug Design and Development (Krogsgaard-Larsen y col., eds., Harwood Academic Publishers, 1991); Dear y col., J. Chromatogr. B, 748, 281-293

5 (2000); Spraul y col., J. Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 10, 601-605 (1992); y Prox y col., Xenobiol., 3, 103-112 (1992). Los Esquemas 1-18 muestran un procedimiento general para preparar Compuestos representativos de Fórmula II. Los Esquemas 1-6 describen cómo pueden sintetizarse ésteres de 5'-amino ácidos a 10 partir de análogos y derivados de guanosina.

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En una ruta sintética típica, los grupos 2',3'-hidroxilo del resto β-D-ribosa de Fórmula Ia, Ib, Id, Ie o Ih pueden protegerse primero, preferentemente con un acetónido como se muestra 5 para 2, 6, 10 ó 14. Después, el 5'-hidroxilo libre puede someterse a una diversidad de procedimientos de esterificación con un aminoácido N-protegido para formar 3, 7, 11 ó 15. El nitrógeno del éster de aminoácido y los 2',3'-hidroxilos de la unidad ribosa pueden someterse después a diversas condiciones desprotección, preferentemente de forma simultánea, seguido de formación de sal de la amina libre del éster de aminoácido como se ilustra para 4, 8, 12 ó

10 16.

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En las rutas sintéticas mostradas en los Esquemas 5 y 6, los grupos 2',3'-hidroxilo del resto β-D-ribosa de los compuestos 17 y 21 se protegieron primero con un acetónido para

5 formar 18 y 22 respectivamente. Después, el 5'-hidroxilo libre se sometió a esterificación con una N-terc-butoxicarbonil valina para formar 19 y 23 respectivamente. El nitrógeno del éster de aminoácido y los 2',3'-hidroxilos de la ribosa se desprotegieron al mismo tiempo formando las sales clorhidrato que se ilustran para 20 y 24. Los Esquemas 7 y 8 describen cómo pueden sintetizarse carbamatos y carbonatos a

10 partir de análogos y derivados de adenina.

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En una ruta sintética típica, el grupo amino de Fórmula If puede someterse a una diversidad de condiciones con carbonatos o cloroformiatos para formar carbamatos. En el caso de 27, la amina protegida N-terminal del éster de aminoácido resultante puede someterse a condiciones de desprotección para formar sales tales como 28.

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En el Esquema 8, el grupo hidroxilo del derivado de adenina 29 se esterificó con cloroformiato de n-hexilo para dar el carbonato 30. Los Esquemas 9 y 10 describen cómo pueden sintetizarse carbamatos a partir de 10 análogos de imidazoquinolina.

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En una ruta sintética típica, el grupo amino de los análogos de Fórmula Ic puede someterse a una diversidad de condiciones con carbonatos, pirocarbonatos o cloroformiatos para formar carbamatos.

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En el Esquema 10, la imidazoquinolina 31 se trató con pirocarbonato de n-pentilo para

dar el carbamato de pentilo 34.

Los Esquemas 11-12 describen cómo sintetizar carbamatos e imidatos de pirimidinas

de fórmula Ig.

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En una síntesis típica de carbamatos, el grupo amino de 35 se sometió a pirocarbonato

32 de etilo en las condiciones mostradas anteriormente para formar el carbamato 36.

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En una síntesis típica de imidatos, el grupo amino de 35 se sometió a alcohol etílico en las condiciones de tipo Mitsunobu mostradas anteriormente para formar el derivado de etoxi

37.

El Esquema 13 describe cómo pueden prepararse carbamatos y sintetizarse a partir de análogos de imidazoquinolina.

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10 En una ruta sintética típica, el grupo amino de un derivado de Fórmula Ic puede someterse a una diversidad de condiciones con carbonatos, pirocarbonatos o cloroformiatos para formar carbamatos. El Esquema 14 muestra un procedimiento general para preparar 7-alil-2-Amino-9-β-Dribofuranosil-7,9-dihidro-purin-8-ona.

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En una ruta sintética típica, la 7-alil-2-amino-9-β-D-ribofuranosil-7,9-dihidro-1H-purin6,8-diona 17 se protegió en los grupos 2',3',5'-hidroxilo de la β-D-ribosa, preferentemente con grupos acilo como se muestra para 40, y puede someterse a una diversidad de condiciones

5 para convertir el carbonilo de la posición C-6 en diversos grupos, incluyendo, pero sin limitación, halógeno, como se muestra para 41, que son sensibles a la reducción. Después de la reducción en condiciones de reacción hetero-u homogéneas, los 2',3',5'-hidroxilos de la unidad ribosa se someten a condiciones de desprotección apropiadas, para producir 43. El compuesto 43 puede modificarse apropiadamente si se desea.

10 El Esquema 15 muestra un procedimiento general para preparar 7-alil-2-Amino-6-etoxi9-β-D-ribofuranosil-7,9-dihidro-purin-8-ona.

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En una ruta sintética típica, 40 puede someterse a una diversidad de condiciones para convertir el carbonilo de la posición C-6 en diversos imido-éteres, incluyendo, pero sin limitación, etilo, como se muestra para 44. Los 2',3',5'-hidroxilos de la unidad ribosa se someten después a condiciones de desprotección apropiadas, para producir 45. Además, el compuesto 45 puede modificarse apropiadamente si se desea.

El Esquema 16 describe cómo pueden sintetizarse éteres a partir de análogos y derivados de adenina.

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En una ruta sintética típica, el derivado de adenina puede halogenarse en C-8.

Después, el halógeno puede desplazarse con un alcóxido apropiado para formar derivados

tales como 64.

El Esquema 17 muestra un procedimiento general para preparar 7-alil-2-Amino-6-alcoxi sustituido-9-β-D-ribofuranosil-7,9-dihidro-purin-8-onas.

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En una ruta sintética típica, los grupos hidroxilo de la ribosa de 17 pueden protegerse en forma de silil éteres. El carbonilo de la posición C-6 de 69 puede someterse a una diversidad de condiciones para convertir el carbonilo en diversos imido-éteres, incluyendo, pero sin limitación, el éter de 4-hidroximetil-5-metil-[1,3]dioxol-2-ona, como se ha mostrado para 70. Después, los 2',3',5'-hidroxilos de la unidad ribosa se someten a condiciones de desprotección apropiadas, para producir 71.

El Esquema 18 muestra un procedimiento general para preparar 7-alil-2-Amino-6-alcoxi sustituido-9-β-D-ribofuranosil-7,9-dihidro-purin-8-onas.

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El carbonilo de la posición C-6 de 69 puede someterse a una diversidad de condiciones para convertir el carbonilo en diversos imido-éteres, incluyendo, pero sin limitación, el éter de N-metil-N-(hidroximetil)uretano, como se ha mostrado para 72. Después, los 2',3',5'-hidroxilos de la unidad ribosa se someten a condiciones de desprotección apropiadas, para producir 73. Además, el compuesto 73 puede modificarse apropiadamente si se desea.

5.4 PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN DE INFECCIONES POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS C

La presente invención proporciona el uso de un ligando de TLR7 para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una infección por el virus de la hepatitis C en un paciente que lo necesita.

La presente invención proporciona además el uso de un ligando de TLR7 para la fabricación de un medicamento para introducir una cantidad terapéuticamente eficaz de un ligando de TLR7 o un profármaco del mismo, o una combinación de dichos ligandos y profármacos en el torrente sanguíneo de un paciente en el tratamiento y/o prevención de infecciones por el virus de la hepatitis C.

La magnitud de la dosis profiláctica o terapéutica de un ligando de TLR7 o profármaco de ligando de TLR7 de la invención o una sal, solvato, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo en el tratamiento o prevención aguda o crónica de una infección, variará, sin embargo, con la naturaleza y gravedad de la infección y la vía por medio de la cual se administra el principio activo. La dosis, y en algunos casos la frecuencia de dosificación, también variarán de acuerdo con la infección a tratar, la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual. Las pautas de dosificación adecuadas pueden seleccionarse fácilmente por los expertos en la materia con la consideración debida de estos factores.

Los usos de la presente invención son particularmente adecuados para pacientes humanos. En particular, los procedimientos y dosis de la presente invención pueden ser útiles para pacientes inmunocomprometidos incluyendo, pero sin limitación pacientes con cáncer, pacientes infectados por VIH, y pacientes con una enfermedad inmunodegenerativa. Además, los procedimientos pueden ser útiles para pacientes inmunocomprometidos que actualmente están en estado de remisión. Los procedimientos y dosis de la presente invención también son útiles para pacientes que se someten a otros tratamientos antivirales. Los procedimientos de prevención de la presente invención son particularmente útiles para pacientes con riesgo de infección viral. Estos pacientes incluyen, pero sin limitación, trabajadores sanitarios, por ejemplo médicos, enfermeras, cuidadores de centros de cuidados paliativos; personal militar; profesores; trabajadores del cuidado de niños; pacientes que viajan o que viven en sitios extranjeros, en particular en sitios del tercer mundo incluyendo trabajadores sociales, misioneros y diplomáticos extranjeros. Finalmente, los procedimientos y composiciones incluyen en tratamiento de pacientes refractarios o pacientes resistentes al tratamiento tal como resistencia a inhibidores de polimerasas virales, inhibidores de proteasas, etc. Dosis

La toxicidad y eficacia de los compuestos de la invención puede determinarse por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y estudios animales pueden usarse en la formulación de una serie de dosificaciones de los compuestos para uso en seres humanos. La dosificación de estos compuestos está preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con toxicidad pequeña o nula. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el procedimiento de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentraciones plasmáticas circulantes que incluyen la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue una inhibición semi-máxima de los síntomas), como se determina en cultivo celular; como alternativa, la dosis del profármaco de ligando de TLR7 puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentraciones plasmáticas circulantes del ligando de TLR7 que corresponda a la concentración necesaria para conseguir una magnitud de respuesta fija. Esta información puede usarse para determinar de forma más precisa las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.

Los protocolos y composiciones de la invención preferentemente se ensayan in vitro y después in vivo con respecto a la actividad profiláctica o terapéutica deseada, antes del uso en seres humanos. Por ejemplo, en ensayos in vitro que pueden usarse para determinar si la administración de un protocolo terapéutico específico está indicada, incluyen ensayos de cultivos celulares in vitro en los que células que responden a los efectos de los ligandos de TLR7 se exponen al ligando y se mide la magnitud de respuesta por una técnica apropiada. La evaluación de la potencia del ligando de TRL7 después se evalúa con respecto a la potencia del profármaco de ligando de TLR7, y el grado de conversión del profármaco de ligando de TLR7. Los compuestos para uso en los procedimientos de la invención pueden ensayarse en sistemas modelo animales adecuados antes del ensayo en seres humanos, incluyendo pero sin limitación ratas, ratones, pollos, vacas, monos, conejos, hámsteres etc. Los compuestos después pueden usarse en los ensayos clínicos apropiados.

La magnitud de la dosis profiláctica o terapéutica de un profármaco de un ligando de TLR7 de la invención o una sal, solvato, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo en el tratamiento o prevención aguda o crónica de una infección o afección variará con la naturaleza y gravedad de la infección y la vía por medio de la cual se administra el principio activo. La dosis y quizás la frecuencia de dosificación también variarán de acuerdo con la infección a tratar, la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual. Los regimenes de dosificación adecuados pueden seleccionarse fácilmente por los expertos en la materia con la consideración debida de estos factores. En una realización, la dosis administrada depende del compuesto específico a usar, y el peso y estado del paciente. Además, la dosis puede diferir para diversos profármacos de ligando de TLR7 particulares; las dosis adecuadas pueden predecirse basándose en las mediciones in vitro mencionadas anteriormente, en particular mediante el uso de estas mediciones del ligando de TLR7 con el que está relacionado el profármaco de ligando de TLR7 y basándose en estudios animales, de tal forma que dosis más pequeñas sean adecuadas para los profármacos de ligando de TLR7 que muestran eficacia a concentraciones menores que otros profármacos de ligando de TLR7 cuando se miden en los sistemas descritos o mencionados en el presente documento. En general, la dosis por día está en el intervalo de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg, preferentemente de aproximadamente 1 a 25 mg/kg, más preferentemente de aproximadamente 5 a 15 mg/kg. Para el tratamiento de seres humanos infectados por virus de la hepatitis C, se administra de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 15 g al día en aproximadamente una a cuatro divisiones al día, preferentemente de 100 mg a 12 g al día, más preferentemente de 100 mg a 8000 mg al día. En una realización preferida para compuestos tales como profármacos de 3-β-D-ribofuranosiltiazolo[4,5-d]pirimidinas se administra de 200 mg a 8000 mg al día en aproximadamente una a cuatro divisiones al día. Además, la dosis diaria recomendada puede administrarse en ciclos como agentes individuales o en combinación con otros agentes terapéuticos. En una realización, la dosis diaria se administra en una sola dosis o en dosis igualmente divididas. En una realización relacionada, la dosis diaria recomendada puede administrarse una vez por semana, dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana o cinco veces por semana.

En una realización preferida, los compuestos de la invención se administran para proporcionar la distribución sistémica del compuesto dentro del paciente. En una realización relacionada, los compuestos de la invención se administran para producir un efecto sistémico en el cuerpo.

En otra realización los compuestos de la invención se administran por vía oral, mucosa (incluyendo sublingual, bucal, rectal, nasal, o vaginal), parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, inyección en embolada, intraarterial, o intravenosa), administración transdérmica

o tópica. En una realización específica adicional, los compuestos de la invención se administran por administración oral. En otra realización específica, los compuestos de la invención no se administran por administración oral.

Pueden ser aplicables diferentes cantidades terapéuticamente eficaces para diferentes infecciones, como es bien conocido por los expertos habituales en la materia. De forma similar, también se incluyen por las cantidades de dosificación descritas anteriormente y los programas de frecuencia de dosificación cantidades suficientes para tratar o prevenir estas infecciones pero insuficientes para producir o suficientes para reducir los efectos adversos asociados con las terapias convencionales. Terapia de Combinación

Los usos específicos de la invención además comprenden la administración de un agente terapéutico adicional (es decir, un agente terapéutico distinto de un compuesto de la invención). En ciertas realizaciones de la presente invención, los compuestos de la invención pueden usarse en combinación con al menos otro agente terapéutico. Los agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación antibióticos, agentes antieméticos, antidepresivos y agentes antifúngicos, agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, agentes anticancerosos, agentes inmunomoduladores, interferones β, agentes alquilantes, hormonas o citocinas. En una realización preferida, la invención incluye la administración de un agente terapéutico adicional que es específico para VHC o demuestra actividad anti-VHC.

Los profármacos de ligando de TLR7 de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con antibióticos. Por ejemplo, pueden formularse con un macrólido (por ejemplo, tobramicina (Tobi®)), una cefalosporina (por ejemplo, cefalexina (Keflex®), cefradina (Velosef®), cefuroxim (Ceftin®), cefprozilo (Cefzil®), cefaclor (Ceclor®), cefixim (Suprax®) o cefadroxilo (Duricef®)), una claritromicina (por ejemplo, claritromicina (Biaxin®)), una eritromicina (por ejemplo, eritromicina (EMycin®)), una penicilina (por ejemplo, penicilina V (V-Cillin K® o Pen Vee K®)) o una quinolona (por ejemplo, ofloxacina (Floxin®), ciprofloxacin (Cipro®) o norfloxacin (Noroxin®)), antibióticos aminoglucósidos (por ejemplo, apramicina, arbecacina, bambermicinas, butirosina, dibecacina, neomicina, neomicina, undecilenato, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina y espectinomicina), antibióticos de anfenicol (por ejemplo, acidanfenicol, cloranfenicol, florfenicol y tianfenicol), antibióticos de ansamicina (por ejemplo, rifamida y rifampin), carbacefemes (por ejemplo, loracarbef), carbapenemes (por ejemplo, biapenem e imipenem), cefalosporinas (por ejemplo, cefaclor, cefadroxilo, cefamandol, cefatricina, cefacedona, cefozopran, cefpimizol, cefpiramida y cefpiroma), cefamicinas (por ejemplo, cefbuperazona, cefmetazol y cefminox), monobactamas (por ejemplo, aztreonam, carumonam y tigemonam), oxacefemes (por ejemplo, flomoxef y moxalactam), penicilinas (por ejemplo, amdinocilina, amdinocilina pivoxilo, amoxicilina, bacampicilina, ácido bencilpenicilínico, bencilpenicilina de sodio, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, penamcilina, hidruro de penetamat, penicilina obenetamina, penicilina 0, penicilina V, penicilina V benzatina, penicilina V hidrabamina, penimepiciclina y fencihicilina de potasio), lincosamidas (por ejemplo, clindamicina y lincomicina), anfomicina, bacitracina, capreomicina, colistin, enduracidina, enviomicina, tetraciclinas (por ejemplo, apiciclina, clortetraciclina, clomociclina y demeclociclina), 2,4-diaminopirimidinas (por ejemplo, brodimoprim), nitrofuranos (por ejemplo, furaltadona y furazolio de cloruro), quinolonas y análogos de los mismos (por ejemplo, cinoxacina clinafloxacina, flumequina y grepagloxacina), sulfonamidas (por ejemplo, acetil sulfametoxipirazina, bencilsulfamida, noprilsulfamida, ftalilsulfacetamida, sulfacrisoidina y sulfacitina), sulfones (por ejemplo, diatimosulfona, glucosulfona de sodio y solasulfona), cicloserina, mupirocina y tuberina.

Los profármacos de ligando de TLR7 de la invención también pueden administrarse o formularse en combinación con un agente antiemético. Los agentes antieméticos adecuados incluyen pero sin limitación metoclopromida, domperidón, proclorperacina, prometacina, clorpromacina, trimetobenzamida, ondansetron, granisetron, hidroxicina, acetilleucina monoetanolamina, alizaprida, azasetrón, benzquinamida, bietanautina, bromoprida, buclicina, cleboprida, ciclicina, dimenhidrinato, difenidol, dolasetrón, meclicina, metallatal, metopimazina, nabilona, oxiperndilo, pipamacina, escopolamina, sulpirida, tetrahidrocanabinoles, tietilperacina, tioproperacina, tropisetrón y mezclas de los mismos.

Los profármacos de ligando de TLR7 de la invención pueden administrarse o

formularse en combinación con un antidepresivo. Los antidepresivos adecuados incluyen pero sin limitación binadalina, caroxazona, citalopram, dimetazan, fencamina, indalpina, hidrocloruro de indeloxazina, nefopam, nomifensina, oxitriptán, oxipertina, paroxetina, sertralina, tiacesim, trazodona, benmoxina, iproclocida, iproniacid, isocarboxacid, nialamida, octamoxina, fenelcina, cotinina, roliciprina, rolipram, maprotilina, metralindol, mianserina, mirtazepina, adinazolam, amitriptilina, amitriptilinóxido, amoxapina, butriptilina, clomipramina, demexiptilina, desipramina, dibenzepina, dimetacrina, dotiepina, doxepina, fluacicina, imipramina, imipramina N-óxido, iprindol, lofepramina, melitraceno, metapramina, nortriptilina, noxiptilina, opipramol, pizotilina, propicepina, protriptilina, quinupramina, tianeptina, trimipramina, adrafinilo, benactizina, bupropión, butacetina, dioxadrol, duloxetina, etoperidona, febarbamato, femoxetina, fenpentadiol, fluoxetina, fluvoxamina, hematoporfirina, hipericina, levofacetoperano, medifoxamina, milnaciprán, minaprina, moclobemida, nefazodona, oxaflozano, piberalina, prolintano, pirisuccideanol, ritanserina, roxindol, cloruro de rubidio, sulpirida, tandospirona, tozalinona, tofenacina, toloxatona, tranilcipromina, L-triptófano, venlafaxina, viloxacina y cimeldina.

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligando de TLR7 de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con un agente antifúngico. Los agentes antifúngicos adecuados incluyen, pero sin limitación anfotericina B, itraconazol, quetoconazol, fluconazol, intratecal, flucitosina, miconazol, butoconazol, clotrimazol, nistatina, terconazol, tioconazol, ciclopirox, econazol, haloprogrina, naftifina, terbinafina, undecilenato y griseofuldina.

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligados de TLR7 de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con un agente antiinflamatorio. Los agentes antiinflamatorios útiles incluyen, pero sin limitación, antiinflamatorios no esteroideos tales como ácido salicílico, ácido acetilsalicílico, salicilato de metilo, diflunisal, salsalato, olsalacina, sulfasalacina, acetaminofeno, indometacina, sulindac, etodolac, ácido mefenámico, meclofenamato de sodio, tolmetina, quetorolac, diclofenac, ibuprofeno, naproxeno, naproxeno de sodio, fenoprofeno, quetoprofeno, flurbinprofeno, oxaprozina, piroxicam, meloxicam, ampiroxicam, droxicam, pivoxicam, tenoxicam, nabumetomo, fenilbutazona, oxidenbutazona, antipirina, aminopirina, apazona y nimesulida; antagonistas de leucotrienos incluyendo pero sin limitación, cileuton, aurotioglucosa, gold sodium tiomalato y auranofina; esteroides incluyendo pero sin limitación, alclometasona dipropionato, amcinonida, dipropionato de beclometasona, betametasona, betametasona benzoato, dipropionato de betametasona, betametasona de sodio fosfato, betametasona valerato, clobetasol propionato, clocortolona pivalato, hidrocortisona, derivados de hidrocortisona, desonida, desoximatasona, dexametasona, flunisolida, flucoxinolida, flurandrenolida, halcinocida, medrisona, metilprednisolona, methprednisolona acetato, metilprednisolona de sodio succinato, mometasona furoato, parametasona acetato, prednisolona, prednisolona acetato, prednisolona de sodio fosfato, prednisolona tebuatato, prednisona, triamcinolona, triamcinolona acetónido, triamcinolona diacetato y triamcinolona hexacetónido; y otros agentes antiinflamatorios incluyendo pero sin limitación, metotrexato, colchicina, alopurinol, probenecid, sulfinpirazona y benzbromarona.

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligando de TLR7 de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con otro agente antiviral. Los agentes antivirales útiles incluyen pero sin limitación inhibidores de proteasa, inhibidores de transcriptasa inversa nucleosídicos, inhibidores de transcriptasa inversa no nucleosídicos y análogos de nucleósido. Los agentes antivirales incluyen pero sin limitación zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina, levovirina, viramidina y ribavirina, tal como foscarnet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, ritonavir, los interferones alfa, interferón beta, interferón gama, adefovir, clevudina, entecavir y pleconaril.

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligando de TLR7 de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con un agente inmunomodulador. Los agentes inmunomoduladores incluyen pero sin limitación metotrexato, leflunomida, ciclofosfamida, ciclosporina A, micofenolato mofetilo, rapamicina (sirolimus), mizoribina, desoxispergualina, brequinar, malononitriloaminas (por ejemplo, leflunamida), moduladores del receptor de linfocitos T y moduladores del receptor de citocinas, miméticos de péptidos y anticuerpos (por ejemplo, humanos, humanizados, quiméricos, monoclonales, policlonales, Fvs, ScFvs, fragmentos Fab o F(ab)2 o fragmentos de unión a epítopos), moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico antisentido y triples hélices), moléculas pequeñas compuestos orgánicos y compuestos inorgánicos. Los ejemplos de moduladores del receptor de linfocitos T incluyen pero sin limitación anticuerpos contra receptores de linfocitos T (por ejemplo, anticuerpos anti-CD4 (por ejemplo, cM-T412 (Boeringer), IDEC-CE9,1® (IDEC y SKB), mAB 4162W94, Orthoclone y OKTcdr4a (Janssen-Cilag)), anticuerpos anti-CD3 (por ejemplo, Nuvion (Product Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson), o Rituxan (IDEC)), anticuerpos anti-CD5 (por ejemplo, un inmunoconjugado anti-CD5 unido a ricina), anticuerpos anti-CD7 (por ejemplo, CHH-380 (Novartis)), anticuerpos anti-CD8, anticuerpos monoclonales antiligando de CD40 (por ejemplo, IDEC-131 (IDEC)), anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, CAMPATH 1H (Ilex)), anticuerpos anti-CD2, anticuerpos anti-CD11a (por ejemplo, Xanelim (Genentech)) y anticuerpos anti-B7 (por ejemplo, IDEC-114 (IDEC)) y CTLA4-inmunoglobulina. Los ejemplos de moduladores de receptores de citocinas incluyen, pero sin limitación, receptores de citocinas solubles (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor de TNF-α o un fragmento del mismo, el dominio extracelular de un receptor de IL-1β o un fragmento del mismo, y el domino extracelular de un receptor de IL-6 o un fragmento del mismo), citocinas o fragmentos de las mismas (por ejemplo, interleucina (IL)-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, TNF-α, interferón (IFN)-α, IFN-β, IFNγ y GM-CSF), anticuerpos antireceptor de citocinas (por ejemplo, anticuerpos anti-receptor de IFN, anticuerpos anti-receptor de IL-2 (por ejemplo, Zenapax (Protein Design Labs)), anticuerpos anti-receptor de IL-4, anticuerpos anti-receptor de IL-6, anticuerpos anti-receptor de IL-10 y anticuerpos anti-receptor de IL-12, anticuerpos anti-citocina (por ejemplo, anticuerpos anti-IFN, anticuerpos anti-TNF-α, anticuerpos anti-IL-1β, anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-IL-8 (por ejemplo, ABX-IL-8 (Abgenix)) y anticuerpos anti-IL-12).

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligandos de TLR de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con un agente que inhibe enzimas virales, incluyendo pero sin limitación inhibidores de la proteasa de VHC, tales como BILN 2061 e inhibidores de la NS5b polimerasa tales como NM107 y su profármaco NM283 (Idenix Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, MA).

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligando de TLR7 de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con un agente que inhibe polimerasa de VHC tales como los descritos en Wu, Curr Drug Targets Infect Disord. 2003;3 (3):207-19 o en combinación con compuestos que inhiben la función de la helicasa del virus tales como los descritos en Bretner M, y col Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003; 22(5-8):1531, o con inhibidores de otras dianas específicas de VHC tales como los descritos en Zhang X. IDrugs. 2002; 5(2):154-8.

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligando de TLR7 de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con un agente que inhibe la replicación viral.

Los ligandos de TRL7 o profármacos de ligandos de TLR de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con citocinas. Los ejemplos de citocinas incluyen, pero sin limitación, interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina-12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), interleucina 18 (IL-18), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), eritropoyetina (Epo), factor del crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), prolactina e interferón (IFN), por ejemplo, IFN-alfa e IFN-gama).

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligando de TLR7 de la invención pueden

administrarse o formularse en combinación con hormonas. Los ejemplos de hormonas incluyen pero sin limitación hormona de liberación de hormona luteinizante (LHRH), hormona de crecimiento (GH), hormona de liberación de hormona de crecimiento, ACTH, somatostatina, somatotropina, somatomedina, hormona paratifoidea, factores de liberación hipotalámicos, insulina, glucagón, encefalinas, vasopresina, calcitonina, heparina, heparinas de bajo peso molecular, heparinoides, opioides sintéticos y naturales, hormonas estimuladoras del tiroides insulina, y endorfinas.

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligando de TLR7 de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con interferones beta que incluyen, pero sin limitación el interferón beta 1a y el interferón beta 1b.

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligando de TLR7 de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con interferones alfa que incluyen, pero sin limitación, interferón alfa-1, interferón alfa-2a (roferón), interferón alfa-2b, intrón, Peg-Intron, Pegasys, interferón consenso (infergen) y albuferon.

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligando de TLR7 de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con un potenciador de la absorción, particularmente los que se dirigen al sistema linfático, incluyendo pero sin limitación glicocolato sódico; caprato sódico; N-lauril-γ-D-maltopiranósido; EDTA; micelas mixtas; y los presentados en Muranishi Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 7-1-33, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. También pueden usarse otros potenciadores de la absorción conocidos. De esta manera, la invención también incluye una composición farmacéutica que comprende uno o más profármacos de ligando de TLR7 de la invención y uno o más potenciadores de la absorción.

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligando de TLR7 de la invención pueden administrarse o formularse en combinación con un agente alquilante. Los ejemplos de agentes alquilantes incluyen pero sin limitación mostazas nitrogenadas, etileniminas, metilmelaminas, alquil sulfonatos, nitrosoureas, triacenos, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan, clorambucilo, hexametilmelanina, tiotepa, busulfán, carmustina, estreptozocina, dacarbacina y temozolomida.

Los compuestos de la invención y los otros agentes terapéuticos pueden actuar de forma aditiva o, más preferentemente, de forma sinérgica. En una realización preferida, una composición que comprende un compuesto de la invención se administra conjuntamente con la administración de otro agente terapéutico, que puede formar parte de la misma composición o en una composición diferente de la que comprende los compuestos de la invención. En otra realización, un compuesto de la invención se administra antes o después de la administración de otro agente terapéutico. En una realización distinta, un compuesto de la invención se administra a un paciente que previamente no ha experimentado o no está experimentando actualmente tratamiento con otro agente terapéutico, particularmente un agente antiviral.

En una realización, los procedimientos de la invención comprenden la administración de uno o más ligandos de TLR7 o profármacos de ligandos de TRL7 de la invención sin un agente terapéutico adicional. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y FORMAS FARMACÉUTICAS

La invención también incluye composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas unitarias individuales que comprenden un ligando de TLR7 o profármaco de la invención, o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable, del mismo. La formas farmacéuticas individuales de la invención pueden ser adecuadas para administración oral, mucosa (incluyendo sublingual, bucal, rectal, nasal o vaginal), parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, inyección en embolada, intraarterial o intravenosa), transdérmica o tópica. Las composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas de la invención típicamente también comprenden uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. También se contemplan formas farmacéuticas estériles.

En una realización alternativa, una composición farmacéutica incluida en esta realización incluye un ligando o profármaco de TLR7 de la invención, o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, y al menos un agente terapéutico adicional. Los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales incluyen, pero sin limitación, los indicados anteriormente en la sección 5.2.2.

La composición, forma y tipo de las formas farmacéuticas de la invención típicamente variarán dependiendo de su uso. Por ejemplo, una forma farmacéutica usada en el tratamiento agudo de una enfermedad o una enfermedad relacionada puede contener mayores cantidades de uno o más de los principios activos si comprende más de una forma farmacéutica usada en el tratamiento crónico de la misma enfermedad. De forma similar, una forma farmacéutica parenteral puede contener menores cantidades de uno o más de los principios activos si comprende más de una forma farmacéutica oral usada para tratar la misma enfermedad o trastorno.

Estos y otros modos en los que la presente invención incluye formas farmacéuticas específicas variarán de uno a otro como será evidente para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990). Los ejemplos de formas farmacéuticas incluyen, pero sin limitación: comprimidos; comprimidos oblongos; cápsulas tales como cápsulas de gelatina elásticas blandas; obleas; trociscos; pastillas para chupar; dispersiones; supositorios; pomadas; cataplasmas; pastas; polvos; vendas; cremas; emplastos; soluciones; parches; aerosoles (por ejemplo pulverizaciones nasales o inhaladores); geles; formas farmacéuticas líquidas adecuadas para administración oral o mucosa a un paciente, incluyendo suspensiones (por ejemplo, suspensiones líquidas acuosas o no acuosas, emulsiones de aceite en agua o emulsiones líquidas de agua en aceite), soluciones y elixires; formas farmacéuticas líquidas adecuadas para administración parenteral a un paciente; y sólidos estériles (por ejemplo sólidos cristalinos

o amorfos) que pueden reconstituirse para proporcionar formas farmacéuticas líquidas adecuadas para administración parenteral a un paciente.

Las composiciones farmacéuticas típicas y las formas farmacéuticas típicas comprenden uno o más vehículos, excipientes o diluyentes. Los expertos en el campo farmacéutico conocen bien los excipientes adecuados y en el presente documento se proporcionan ejemplos no limitantes de excipientes adecuados. Si un excipiente particular es adecuado para incorporarse en una composición o forma farmacéutica depende de una diversidad de factores bien conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, la forma en la que se administrará la forma farmacéutica a un paciente. Por ejemplo, formas farmacéuticas orales tales como comprimidos pueden contener excipientes no adecuados para uso en las formas farmacéuticas parenterales. La idoneidad de un excipiente particular también puede depender de los principios activos específicos en la forma farmacéutica.

La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas anhidras que comprenden principios activos, ya que el agua puede facilitar la degradación de algunos compuestos. Por ejemplo, la adición de agua (por ejemplo un 5%) está ampliamente aceptada en las técnicas farmacéuticas como medio para simular el almacenamiento a largo plazo para determinar características tales como la vida útil o la estabilidad de formulaciones a lo largo del tiempo. Véase, por ejemplo Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 2d. Ed., Marcel Dekker, NY, NY, 1995, pp. 379-80. En efecto, el agua y el calor aceleran la descomposición de algunos compuestos. De esta manera, el efecto del agua sobre una formulación puede tener gran significado ya que durante la fabricación, manipulación, envasado, almacenamiento, transporte y uso de las formulaciones comúnmente se encuentra humedad y/o humectación.

Las composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas anhidras de la invención pueden prepararse usando ingredientes anhidros o que contienen poca humedad y condiciones de baja humedad o baja humectación.

Una composición farmacéutica anhidra debe prepararse y almacenarse de tal manera que se mantenga su naturaleza anhidra. Por consiguiente, las composiciones anhidras preferentemente se envasan usando materiales que se sabe que impiden la exposición al agua de tal forma que puedan incluirse en kits de formulación adecuados. Los ejemplos de envases adecuados incluyen, pero sin limitación, laminados cerrados herméticamente, plásticos, recipientes de una sola dosis (por ejemplo, viales), blisteres y tiras.

La invención incluye además composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos que reducen la velocidad en la que se descompondrá un principio activo. Estos compuestos, que en el presente documento se denominan “estabilizantes”, incluyen pero sin limitación antioxidantes tales como ácido ascórbico, tampones de pH o tampones de sales.

Del mismo modo las cantidades y tipos de excipientes, las cantidades y tipos específicos de principios activos en una forma farmacéutica pueden diferir dependiendo de factores tales como, pero sin limitación, la vía mediante la cual se van a administrar a los pacientes. Sin embargo, las formas farmacéuticas típicas de la invención comprenden profármacos de ligando de TLR7 de la invención, o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de los mismos, que comprenden de 0,1 mg a 1500 mg por unidad para proporcionar dosis de aproximadamente 0,01 a 200 mg/kg al día. Formas Farmacéuticas Orales

Las composiciones farmacéuticas de la invención que son adecuadas para administración oral pueden presentarse como formas farmacéuticas discretas, tales como, pero sin limitación comprimidos (por ejemplo comprimidos masticables), comprimidos oblongos, cápsulas y líquidos (por ejemplo jarabes aromatizados). Estas formas farmacéuticas contienen cantidades predeterminadas de principios activos y pueden prepararse por procedimientos de farmacia bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, en general, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18 ed., Mack Publishing, Easton PA (1990).

Las formas farmacéuticas orales típicas de la invención se preparan combinando el principio (o principios) activo en una mezcla íntima con al menos un excipiente de acuerdo con técnicas de composición farmacéutica convencionales. Los excipientes pueden adaptar una amplia diversidad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración. Por ejemplo, los excipientes adecuados para usar en formas farmacéuticas líquidas o de aerosol orales incluyen, pero sin limitación, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes aromatizantes, conservantes y agentes colorantes. Los ejemplos de excipientes adecuados para uso en formas farmacéuticas sólidas orales (por ejemplo, polvos, comprimidos, cápsulas y comprimidos oblongos) incluyen, pero sin limitación almidones, azúcares, celulosa micro-cristalina, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes y agentes disgregantes.

Debido a su facilidad de administración, los comprimidos y las cápsulas representan las

formas farmacéuticas unitarias orales más ventajosas, en cuyo caso se emplean excipientes sólidos. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse por técnicas acuosas o no acuosas convencionales. Estas formas farmacéuticas pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos de farmacia. En general, las composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas se preparan mezclando de forma uniforme e íntima los principios activos con vehículos líquidos, vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y después transformando el producto en la presentación deseada si es necesario.

Por ejemplo, un comprimido puede prepararse por compresión o moldeo. Los comprimidos de compresión pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada los principios activos en una forma fluida tal como polvos o gránulos, opcionalmente mezclados con un excipiente. Los comprimidos de moldeo pueden prepararse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte.

Los ejemplos de excipientes que pueden usarse en formas farmacéuticas orales de la invención incluyen, pero sin limitación, aglutinantes, cargas, disgregantes y lubricantes. Los aglutinantes adecuados para uso en composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas incluyen, pero sin limitación, almidón de maíz, almidón de patata u otros almidones, gelatina, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, alginato sódico, ácido algínico otros alginatos, tragacanto en polvo, goma guar, celulosa y sus derivados (por ejemplo etil celulosa, acetato de celulosa, carboxilmetil celulosa de calcio, carboximetil celulosa de sodio), polivinilpirrolidona, metilcelulosa, almidón pre-gelatinizado, hidroxipropilmetil celulosa (por ejemplo Nº 2208, 2906, 2910), celulosa micro-cristalina y mezclas de los mismos.

Los ejemplos de cargas adecuadas para uso en las composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, talco, carbonato de cálcico (por ejemplo, gránulos o polvo), celulosa microcristalina, celulosa en polvo, dextratos, caolín, manitol, ácido silícico, sorbitol, almidón, almidón pre-gelatinizado y mezclas de los mismos. El aglutinante o carga en las composiciones farmacéuticas de la invención típicamente está presente en una cantidad de aproximadamente el 50 a aproximadamente el 99 por ciento en peso de la composición o forma farmacéutica.

Las formas adecuadas de celulosa microcristalina incluyen, pero sin limitación, los materiales vendidos como AVICEL-PH-101, AVICEL-PH-103 AVICEL RC-581, AVICEL-PH-105 (disponibles en FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, PA), y mezclas de los mismos. Un aglutinante específico es una mezcla de celulosa microcristalina y carboximetil celulosa sódica vendida como AVICEL RC-581. Los excipientes o aditivos anhidros o de baja humedad adecuados incluyen AVICEL-PH-103™ y Starch 1500 LM.

En las composiciones de la invención, los disgregantes se usan para proporcionar comprimidos que se disgregan cuando se exponen a un medio acuoso. Los comprimidos que contienen demasiado disgregante pueden disgregarse en almacenamiento, mientras que los que contienen demasiado poco pueden no disgregarse a una velocidad deseada o en las condiciones deseadas. De esta manera, para formar formas farmacéuticas orales sólidas de la invención debe usarse una cantidad suficiente de disgregante que no sea ni demasiado grande ni demasiado pequeña para no modificar de forma perjudicial la liberación de los principios activos La cantidad de disgregante usado varia basándose en el tipo de formulación y se puede averiguar fácilmente por los expertos habituales en la materia. Las composiciones farmacéuticas típicas comprenden de aproximadamente un 0,5 a aproximadamente un 15 por ciento en peso de disgregante, específicamente de aproximadamente un 1 a aproximadamente un 5 por ciento en peso de disgregante.

Los disgregantes que pueden usarse en composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas de la invención incluyen, pero sin limitación, agar-agar, ácido algínico, carbonato cálcico, celulosa microcristalina, croscarmelosa sódica, crospovidona, polacrilina potásica, almidón glicolato sódico, almidón de patata o tapioca, almidón pre-gelatinizado, otros almidones, arcillas, otras alginas, otras celulosas, gomas y mezclas de los mismos.

Los lubricantes que pueden usarse en composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas de la invención incluyen, pero sin limitación, estearato cálcico, estearato de magnesio, aceite mineral, aceite mineral ligero, glicerina, sorbitol, manitol, polietilenglicol otros glicoles, ácido esteárico, lauril sulfato sódico, talco, aceite vegetal hidrogenado (por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de girasol, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja), estearato de cinc, oleato de etilo, laureato de etilo, agar y mezclas de los mismos. Los lubricantes adicionales incluyen, por ejemplo, un gel de sílice siloide (AEROSIL 200, fabricado por W.R. Grace Co. de Baltimore, MD), un aerosol coagulado de sílice sintética (comercializado por Degussa Co. de Plano, TX), CAB-O-SIL (un producto de dióxido de silicio pirogénico vendido por Cabot Co. de Boston, MA) y mezclas de los mismos. Si se usan, los lubricantes típicamente se usan en una cantidad menor de aproximadamente un 1 por ciento en peso de las composiciones farmacéuticas o formas farmacéuticas en las que se incorporan. Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada

Los principios activos de la invención pueden administrarse por medios de liberación controlada o por dispositivos de liberación conocidos por los expertos habituales en la materia. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, los descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 3.845.770; 3.916.899; 3.536.809; 3.598.123; y 4.008.719, 5.674.533, 5.059.595, 5.591.767, 5.120.548, 5.073.543, 5.639.476, 5.354.556 y 5.733.566, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia. Esta formas farmacéuticas pueden usarse para proporcionar la liberación lenta o controlada de uno o más principios activos usando, por ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa, otras matrices de polímeros, geles, membranas permeables, sistemas osmóticos, recubrimientos multicapa, micropartículas, liposomas, microesferas o una combinación de los mismos para proporcionar el perfil de liberación deseado en proporciones variables. Las formulaciones de liberación controlada adecuadas conocidas por los expertos en la materia, incluyendo las descritas en el presente documento, pueden seleccionarse fácilmente para uso con los principios activos de la invención. De esta manera, la invención incluye formas farmacéuticas monodosis adecuadas para administración oral tales como, pero sin limitación, comprimidos cápsulas, cápsulas de gel y comprimidos oblongos que se adaptan para la liberación controlada.

Todos los productos farmacéuticos de liberación controlada tienen el objetivo común de mejorar la terapia con fármacos con respecto a lo conseguido por sus homólogos no controlados. Idealmente, el uso de una preparación de liberación controlada diseñada de forma óptima en el tratamiento médico se caracteriza por emplear un mínimo de sustancia farmacéutica para curar o controlar la afección en una cantidad de tiempo mínima. Las ventajas de las formulaciones de liberación controlada incluyen una actividad prolongada del fármaco, una frecuencia de dosificación reducida y un aumento del seguimiento por parte del paciente. Además, pueden usarse formulaciones de liberación controlada para afectar al tiempo de inicio de la acción u otras características, tales como los niveles en sangre del fármaco, y por lo tanto puede afectar a la aparición de efectos secundarios (por ejemplo adversos).

La mayoría de las formulaciones de liberación controlada están diseñadas para liberar inicialmente una cantidad de fármaco (principio activo) que produce inmediatamente el efecto terapéutico deseado, y liberar de forma gradual y continua otras cantidades de fármaco para mantener este nivel de efecto terapéutico o profiláctico durante un periodo de tiempo prolongado. Para mantener este nivel constante de fármaco en el cuerpo, el fármaco debe liberarse de la forma farmacéutica a una velocidad que reemplace la cantidad de fármaco que se está metabolizando y excretando del cuerpo. La liberación controlada de un principio activo puede estimularse por diversas condiciones que incluyen, pero sin limitación, el pH, la temperatura, enzimas, agua u otros estados fisiológicos o compuestos. Formas Farmacéuticas Parenterales

Las formas farmacéuticas parenterales pueden administrarse a los pacientes por diversas vías que incluyen, pero sin limitación, la vía subcutánea, intravenosa (incluyendo inyección en embolada), intramuscular e intraarterial. Como su administración típicamente evita las defensas naturales de los pacientes contra contaminantes, las formas farmacéuticas parenterales preferentemente son estériles o capaces de esterilizarse antes de la administración a un paciente. Los ejemplos de formas farmacéuticas parenterales incluyen, pero sin limitación, soluciones listas para inyección, productos secos y/o liofilizados listos para disolverse o suspenderse en un vehículo farmacéuticamente aceptable para inyección (polvos reconstituibles), suspensiones listas para inyección y emulsiones.

Los vehículos adecuados que pueden usarse para proporcionar formas farmacéuticas parenterales de la invención son bien conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: Agua para Solución Inyectable USP; vehículos acuosos tales como, pero sin limitación, Solución Inyectable de Cloruro Sódico, Solución Inyectable de Ringer, Solución Inyectable de Dextrosa, Solución Inyectable de Dextrosa y Cloruro Sódico, Solución Inyectable de Ringer con Lactato; vehículos miscibles con agua tales como, pero sin limitación, alcohol etílico, polietilenglicol, y polipropilenglicol; y vehículos no acuosos tales como, pero sin limitación, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y benzoato de bencilo.

Los compuestos que aumentan la solubilidad de uno o más de los principios activos descritos en el presente documento también pueden incorporarse en las formas farmacéuticas parenterales de la invención. Formas Farmacéuticas Transdérmicas

Las formas farmacéuticas transdérmicas incluyen parches de “tipo de depósito” o “tipo de matriz” que pueden aplicarse a la piel y llevarse puestas durante un periodo de tiempo específico para permitir la penetración de una cantidad deseada de principios activos.

Los excipientes adecuados (por ejemplo, vehículos y diluyentes) y otros materiales que pueden usarse para proporcionar formas farmacéuticas transdérmicas y tópicas incluidas en la presente invención son bien conocidos por los expertos en las técnicas farmacéuticas y dependen del tejido particular al que se le aplica una composición o forma farmacéutica dada. Con este hecho en mente, los excipientes típicos incluyen, pero sin limitación, agua, acetona, etanol, etilenglicol, propilenglicol, butano-1,3-diol, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, aceite mineral y mezclas de los mismos.

Dependiendo del tejido específico a tratar, pueden usarse componentes adicionales antes, junto con o después del tratamiento con principios activos de la invención. Por ejemplo, pueden usarse potenciadores de la penetración para ayudar a administrar los principios activos en el tejido. Los potenciadores de la penetración adecuados incluyen, pero sin limitación: acetona; diversos alcoholes tales como etanol, oleilo y tetrahidrofurilo; alquil sulfóxidos tales como dimetilsulfóxido; dimetil acetamida; dimetil formamida; polietilenglicol; pirrolidonas tales como polivinilpirrolidona; calidades Kollidon (Povidone, Polyvidone); urea; y diversos ésteres de azúcar solubles o insolubles en agua tales como Tween 80 (polisorbato 80) y Span 60 (monoestearato de sorbitan).

El pH de una composición o forma farmacéutica, o del tejido en el que se aplica la composición o forma farmacéutica también puede ajustarse para mejorar la administración de uno o más principios activos. De forma similar, la polaridad de un vehículo o disolvente, su fuerza iónica o tonicidad pueden ajustarse para mejorar la liberación. También pueden añadirse a las composiciones farmacéuticas o formas farmacéuticas compuestos tales como estearatos para modificar ventajosamente la hidrofilia o lipofilia de uno o más principios activos para mejorar la liberación. A este respecto, los estearatos pueden servir como vehículo lipídico para la formulación, como un agente emulsionante o tensioactivo y como un agente potenciador de la liberación o potenciador de la penetración. Para ajustar adicionalmente las propiedades de la composición resultante pueden usarse diferentes sales, hidratos o solvatos de los principios activos. Formas Farmacéuticas Tópicas

Las formas farmacéuticas tópicas de la invención incluyen, pero sin limitación, cremas, lociones, pomadas, geles, soluciones, emulsiones, suspensiones u otras formas conocidas por un experto en la materia. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th eds., Mack Publishing, Easton PA (1990); y Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985).

Los excipientes adecuados (por ejemplo, vehículos y diluyentes) y otros materiales que pueden usarse para proporcionar formas farmacéuticas transdérmicas y tópicas incluidas en la presente invención son bien conocidos por los expertos en las técnicas farmacéuticas, y dependen del tejido particular al que se aplicará una composición o forma farmacéutica dada. Con este hecho en mente, los excipientes típicos incluyen, pero sin limitación, agua, acetona, etanol, etilenglicol, propilenglicol, butano-1,3-diol, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, aceite mineral y mezclas de los mismos.

Dependiendo del tejido específico a tratar, pueden usarse componentes adicionales antes, junto con o después del tratamiento con principios activos de la invención. Por ejemplo, pueden usarse potenciadores de la penetración para ayudar a liberar los principios activos en el tejido. Los potenciadores de la penetración adecuados incluyen, pero sin limitación: acetona; diversos alcoholes tales como etanol, oleilo y tetrahidrofurilo; alquil sulfóxidos tales como dimetilsulfóxido; dimetil acetamida; dimetil formamida; polietilenglicol; pirrolidonas tales como polivinilpirrolidona; calidades Kollidon (Povidone, Polyvidone); urea; y diversos ésteres de azúcar solubles o insolubles en agua tales como Tween 80 (polisorbato 80) y Span 60 (monoestearato de sorbitano). Formas Farmacéuticas para la Mucosa

Las formas farmacéuticas de la invención para la mucosa incluyen, pero sin limitación, soluciones oftálmicas, pulverizaciones y aerosoles u otras formas conocidas por un experto en la materia. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18t eds., Mack Publishing, Easton PA (1990); y Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985). Las formas farmacéuticas adecuadas para tratar tejidos mucosos dentro de la cavidad oral pueden formularse como elixires bucales o como geles orales. En una realización, el aerosol comprende un vehículo. En otra realización, el aerosol carece de vehículo.

Los ligandos de TLR7 o profármacos de ligando de TLR7 de la invención también pueden administrarse directamente en el pulmón por inhalación. Para la administración por inhalación, un ligando de TLR7 puede liberarse convenientemente en el pulmón por varios dispositivos diferentes. Por ejemplo, para liberar un ligando de TLR7 directamente en el pulmón puede usarse un inhalador de dosis medida (“MDI”) que utiliza cartuchos que contienen un propulsor de bajo punto de ebullición adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. Los dispositivos MDI están disponibles en varios proveedores tales como 3M Corporation, Aventis, Boehringer Ingleheim, Forest Laboratories, Glaxo-Wellcome, Schering Plough y Vectura.

Como alternativa, para administrar un ligando de TLR7 en el pulmón puede usarse un dispositivo Inhalador de Polvo Seco (DPI) (véase, por ejemplo, Raleigh y col., Proc. Amer. Assoc. Cancer Research Annual Meeting, 1999, 40, 397, que se incorpora en el presente documento por referencia). Los dispositivos DPI típicamente usan un mecanismo tal como una liberación rápida de gas para crear una niebla de polvo seco dentro de un recipiente, que después puede inhalar el paciente. Los dispositivos DPI también son bien conocidos en la técnica y pueden adquirirse a partir de varios vendedores que incluyen, por ejemplo, Fisons, Glaxo-Wellcome, Inhale Therapeutic Systems, ML Laboratories, Qdose y Vectura. Una variación conocida es el sistema DPI de múltiples dosis (“MDDPI”), que permite la liberación de más de una dosis terapéutica. Los dispositivos MDDPI están disponibles en compañías tales como AstraZeneca, Glax-oWellcome, IVAX, Schering Plough, SkyePharma y Vectura. Por ejemplo, pueden formularse cápsulas y cartuchos de gelatina para uso en un inhalador o insuflador que contienen una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón para estos sistemas.

Otro tipo de dispositivo que puede usarse para liberar un ligando de TLR7 o un profármaco de ligando de TRL7 en el pulmón es un dispositivo de pulverización líquida suministrado, por ejemplo, por Aradigm Corporation. Los sistemas de pulverización de líquidos usan orificios de boquilla extremadamente pequeños para aerosolizar formulaciones líquidas de fármaco que después pueden inhalarse directamente en el pulmón.

En una realización preferida, se usa un dispositivo nebulizador para liberar ligandos de TLR7 o profármacos de ligando de TLR7 en el pulmón. Los nebulizadores crean aerosoles a partir de formulaciones líquidas de fármaco usando, por ejemplo, energía ultrasónica partículas finas que pueden inhalarse fácilmente (Véase, por ejemplo, Verschoyle y col., British J. Cancer, 1999, 80, Suppl 2, 96, que se incorpora en el presente documento por referencia). Los ejemplos de nebulizadores incluyen dispositivos suministrados por Sheffield/Systemic Pulmonary Delivery Ltd, Aventis, and Batelle Pulmonary Therapeutics. Véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5.954.047; 5.950.619; 5.970.974, que se incorporan en el presente documento por referencia.

En una realización particularmente preferida, se usa un dispositivo de aerosol electrohidrodinámico (“EHD”) para liberar ligandos de TLR7 y profármacos de ligando de TLR7 en el pulmón. Los dispositivos de aerosol EHD usan energía eléctrica para aerosolizar soluciones o suspensiones líquidas de fármaco (véase, por ejemplo, Noakes y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.765.539; Coffee, Patente de Estados Unidos Nº 4.962.885; Coffee, Solicitud de Patente PCT WO 94/12285; Coffee, Solicitud de Patente PCT WO 94/14543; Coffee, Solicitud de Patente PCT WO 95/26234, Coffee, Solicitud de Patente PCT WO 95/26235, Coffee, Solicitud de Patente PCT WO 95/32807, que se incorporan en el presente documento por referencia). Las propiedades electroquímicas de los ligandos de TLR7 y las formulaciones de profármacos de ligando de TLR7 pueden ser parámetros importantes para optimizar cuando se libera este fármaco en el pulmón con un dispositivo de aerosol EHD y esta optimización se realiza rutinariamente por un experto en la materia. Los dispositivos de aerosol EHD pueden liberar fármacos de forma más eficaz en el pulmón que las tecnologías de liberación pulmonar existentes. Los expertos en la materia conocerán otros métodos de liberación intrapulmonar de ligando de TLR7 y profármacos de ligando de TLR7 y están dentro del alcance de la invención.

Las formulaciones líquidas de fármaco adecuadas para uso con nebulizadores y dispositivos de pulverización de líquidos y dispositivos de aerosol EHD típicamente incluirán un ligando de TLR7 o profármaco de ligando de TLR7 con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un líquido tal como alcohol, agua, polietilenglicol o un perfluorocarburo. Opcionalmente, puede añadirse otro material para modificar las propiedades de aerosol de la solución o suspensión del ligando de TLR7 o profármaco de un ligando de TLR7. Preferentemente, este material es líquido tal como un alcohol, glicol, poliglicol o un ácido graso. Los expertos en la materia conocen otros procedimientos de formulación de soluciones líquidas de fármaco o suspensiones adecuadas para uso en dispositivos de aerosol (véase, por ejemplo, Biesalski, Patente de Estados Unidos Nº 5.112.598; Biesalski, 5.556.611, que se incorporan en el presente documento por referencia). Un ligando de TLR7 o profármaco de un ligando de TLR7 también puede formularse en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas previamente, un ligando de TLR7 o profármaco de ligando de TLR7 también puede formularse como preparación de depósito. Estas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.

Como alternativa, pueden emplearse otros sistemas de liberación farmacéutica. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de liberación que pueden usarse para liberar ligandos de TLR7 y profármacos de ligando de TLR7. También pueden emplearse ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, aunque normalmente a costa de una mayor toxicidad. Un ligando de TLR7 o profármaco de un ligando de TLR7 también puede liberarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (Sefton, CRC Crit. Ref Biomed Eng., 1987, 14,201; Buchwald y col., Surgery, 1980, 88, 507; Saudek y col., N. Engl. J. Med., 1989, 321, 574). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 1983, 23, 61; véase también Levy y col., Science, 1985, 228, 190; During y col., Ann. Neurol., 1989, 25, 351; Howard y col., 1989, J. Neurosurg. 71, 105). En otra realización, puede colocarse un sistema de liberación controlada en las proximidades de la diana de los compuestos de la invención, por ejemplo el pulmón, requiriéndose de esta manera sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, anteriormente, vol. 2, pág. 115 (1984)). Puede usarse otro sistema de liberación controlada (véase, por ejemplo Langer, Science, 1990, 249, 1527).

Los excipientes adecuados (por ejemplo, vehículos y diluyentes) y otros materiales que

pueden usarse para proporcionar formas farmacéuticas para la mucosa incluidos por la invención son bien conocidos por los expertos en las técnicas farmacéuticas y dependen del sitio particular o procedimiento con el que se administrará una composición o forma farmacéutica dada. Con este hecho en mente, los excipientes típicos incluyen, pero sin limitación, agua, etanol, etilenglicol, propilenglicol, butano-1,3-diol, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, aceite mineral y mezclas de los mismos, que son no tóxicos y farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de estos ingredientes adicionales son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th eds., Mack Publishing, Easton PA (1990).

El pH de una composición o forma farmacéutica, o el tejido en el que se aplica la composición o forma farmacéutica, también pueden ajustarse para mejorar la liberación de uno

o más principios activos. De forma similar, la polaridad de un vehículo disolvente, su fuerza iónica o tonicidad pueden ajustarse para mejorar la liberación. También pueden añadirse compuestos tales como estearatos a las composiciones farmacéuticas o formas farmacéuticas para modificar ventajosamente la hidrofilia o lipofilia de uno o más principios activos para mejorar la liberación. A este respecto, los estearatos pueden servir como vehículo lipídico para la formulación, como un agente emulsionante o tensioactivo y como agente potenciador de la liberación o potenciador de la penetración. Pueden usarse diferentes sales, hidratos o solvatos de los principios activos para ajustar adicionalmente las propiedades de la composición resultante. KITS

La invención proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que comprenden un profármaco de ligando de TLR7 útil para el tratamiento o prevención de la infección por el virus de la hepatitis C. En otras realizaciones, la invención proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que comprenden un profármaco de ligando de TLR7 útil para el tratamiento o prevención de una infección por el virus de la hepatitis C y uno o más recipientes que comprenden un agente terapéutico adicional, incluyendo pero sin limitación los indicados en la sección 5.2.2 anterior, en particular un agente antiviral, un interferón, un agente que inhibe enzimas virales o un agente que inhibe la replicación viral, preferentemente el agente terapéutico adicional es específico de VHC o demuestra actividad anti VHC.

La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que comprenden uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociado con dicho recipiente o recipientes puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, reflejando dicho aviso la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración en seres humanos. ENSAYOS

Los ligandos de TLR7, profármacos de ligandos de TLR, composiciones y formas farmacéuticas de la invención pueden ensayarse in vitro o in vivo por una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica para ensayar la actividad. Véanse, por ejemplo, los procedimientos analizados más adelante y usados a lo largo de los ejemplos.

Se dispone de una serie de ensayos con el objetivo de evaluar la actividad de TLR7, y se describen en las siguientes publicaciones, cada una de las cuales incorporada por referencia: Hirota y col., J. Med. Chem., 45, 5419-5422 (2002); y Akira S. y col., Immunology Letters, 85, 85-95 (2003). Por ejemplo, un sistema útil para el ensayo de ligandos de TLR7 es uno en el que el gen de TLR7 se clona por procedimientos conocidos por los expertos en la materia y se introduce por transfección en un tipo celular apropiado de tal forma que TLR7 se expresa y se acopla a un plásmido indicador de NFkB-luciferasa. En este sistema celular, la exposición a profármacos de ligando de TLR7 en cultivo celular produce una señal de luminiscencia medible. Véase, por ejemplo, Lee y col., Proc. Nat. Acad USA, 100, 6646-6651 (2003); Hemmi y col., Nat. Immunol., 3, 196-200 (2002); y Jurk y col., Nat. Immunol., 3, 499 (2002) (wherein the Lee y col., Hemmi y col., y Jurk y col.

Otro ejemplo de un procedimiento in vitro es exponer células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas al profármaco de ligando de TLR7 candidato durante un intervalo predeterminado (por ejemplo, de 2 horas a 24 horas), seguido de la medición de la actividad inmunológica. Esta actividad inmunológica puede incluir la inducción de la síntesis de citocinas, que puede medirse en el sobrenadante de cultivo por ensayo ELISA de la proteína citocina, tal como un interferón de Tipo 1 (interferón alfa, interferón beta) o interferón de Tipo 2 (interferón gamma). Como alternativa, las CMSP pueden recogerse después de la incubación con el profármaco de ligando de TLR7 candidato, extraerse el ARN de las CMSP y determinarse el nivel de inducción de genes del sistema inmune por ensayos de protección de ARNasa del ARN extraído. Los genes típicamente inducidos incluyen 2’5’-OAS, o interferón gama, pero puede medirse una serie de citocinas. Véase, por ejemplo, Hirota y col., J. Med. Chem., 45, 5419-5422 (2002).

Los ensayos de protección de ARNasa (RPA) son un procedimiento conocido en la técnica en la que se cuantifican analitos de ARN hibridándolos primero con una secuencia de ARN radiomarcada específica para el ARN del analito, seguido de digestión con enzimas que degradan selectivamente el ARN monocatenario. La muestra después se somete a electroforesis en gel en condiciones que resuelven el ARN bicatenario protegido hibridado. El gel después se autorradiografía para revelar la localización e intensidad de las bandas. Éstas pueden cuantificarse por procedimientos bien conocidos en la técnica. Pueden ensayarse simultáneamente múltiples especies de ARN de analito si los fragmentos protegidos son suficientemente diferentes en tamaño como para permitir su separación por electroforesis en gel. La comparación de los niveles de un ARN de analito con una especie de ARN de control que se expresa a niveles constantes en células proporciona un control interno que permite controlar cambios en los niveles de la especie de ARN de analito aunque varíe la cantidad total de ARN. Estos ensayos de protección de ARNasa pueden realizarse como se indica a continuación:

Se purifica ARN a partir de sedimentos de CMSP usando el kit “RNAeasy” (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pueden obtenerse series de moldes a partir de PharMingen (BD Biosciences); una serie útil que está disponible en el mercado de este proveedor contiene materiales que permiten el ensayo de TNF-a, IL12 p35, IP10, IL-1a, IL-1b, IL-6, Interferón gama y la especie de ARN de control L32 y GAPDH. Esta serie de moldes contiene ADN que es apropiado para la síntesis de la sonda de ARN apropiada para cada uno de los genes indicados.

La síntesis de sondas se realiza usando el kit de transcripción in vitro PharMingen proporcionado en el kit. La reacción contiene inhibidor de ARNasa; tampón de transcripción; 50 ng de la serie de moldes; 0,1375 mM de cada uno de rGTP, rCTP, rATP; rUTP 0,003 mM; DTT 10 mM, 0,010 mCi de [alfa 32P] UTP y 20 Unidades de ARN polimerasa de T7 en un volumen de 20 microlitros. La mezcla de reacción se incuba durante una hora a 37ºC y después se detiene por la adición de 2 unidades de ADNasa sin ARNasa con una incubación adicional de 30 minutos a 37ºC. Las sondas de ARN sintetizadas en esta incubación se extraen una vez con EDTA 5,2 mM, 25 µl de fenol Saturado con Tris, 25 µl de cloroformo y 4 µg de ARNt de levadura, y después se extraen con 50 µl de cloroformo. El ARN se precipita por adición de 50 µl de acetato amónico 4 M y 250 µl e etanol al 100% enfriado con hielo, y después de la incubación a -80ºC durante 30 minutos, la preparación se centrifuga a alta velocidad durante 30 minutos. El sedimento se lava en etanol al 10% y después de retirar el etanol la sonda se resuspende y se usa en la incubación de protección de ARNasa.

El ensayo de protección de ARNasa usa el material de sonda preparado anteriormente y ARN extraído de CMSP. El ARN de CMSP se lava en etanol al 100%, se cuantifica por absorbancia a 260 nM. El RPA se realiza como se ha descrito en el protocolo proporcionado en el kit RiboQuant de PharMingen. Se mezclan 8 µl del ARN de CMSP con los 2 µl de la serie de sondas en un tubo de PCR de paredes finas, se mezcla bien, se centrifuga brevemente y después se recubre con aceite mineral. El tubo después se pone en un bloque de PCR a 90ºC, se enfría a 56ºC y se incuba durante 16 horas. Las muestras después se enfrían a 37ºC y se añade ARNasa y ARNasa T1. La mezcla se incuba durante 45 minutos a 30ºC y la reacción se detiene con una mezcla de proteasa K y ARNt de levadura. El ARN se extrae con fenolcloroformo y después se precipita del fenol-cloroformo con acetato amónico-etanol. El sedimento se lava con etanol y se resuspende en tampón para la electroforesis. Las muestras se analizan por electroforesis en gel por procedimientos bien conocidos en biología molecular.

De acuerdo con la presente invención pueden emplearse varios ensayos para determinar el grado de actividad antiviral de un compuesto de la invención tal como cultivo celular, modelos animales y administración a seres humanos. Los ensayos descritos en el presente documento pueden usarse para ensayar el crecimiento viral a lo largo del tiempo para determinar las características de crecimiento de un virus en presencia de un compuesto de la invención.

En otra realización, se administra un virus y un compuesto de la invención a sujetos animales susceptibles de infección con el virus. La incidencia, gravedad, duración, carga de virus, mortalidad, porcentaje de infección, etc. puede compararse con la incidencia, gravedad, duración, carga de virus, mortalidad, porcentaje de infección etc. observados cuando a los sujetos se les administra el virus solo (en ausencia de un compuesto de la invención). La actividad anti-virus del compuesto de la invención se demuestra por una reducción en la incidencia, gravedad, duración, carga de virus, mortalidad, porcentaje de infección etc. en presencia del compuesto de la invención. En una realización específica, el virus y el compuesto de la invención se administran al sujeto animal al mismo tiempo. En otra realización específica, el virus se administra animal antes que el compuesto de la invención. En otra realización específica, el compuesto de la invención se administra al sujeto animal antes que el virus.

En otra realización, la velocidad de crecimiento del virus puede ensayarse extrayendo muestras de fluidos biológicos/muestras clínicas (por ejemplo aspirado nasal, frotis de garganta, esputos, lavado broncoalveolar, orina, saliva, sangre o suero) de los sujetos humanos o animales en múltiples momentos después de la infección tanto en presencia como en ausencia de un compuesto de la invención y midiendo los niveles de virus. En realizaciones específicas, la velocidad de crecimiento de un virus se ensaya evaluando la presencia de virus en un muestra después del crecimiento en cultivo celular, crecimiento en un medio de crecimiento permisible o crecimiento en un sujeto usando cualquier procedimiento bien conocido en la técnica, por ejemplo pero sin limitación inmunoensayo (por ejemplo ELISA; para un análisis en relación con los ELISA véase, por ejemplo, Ausubel y col., eds, 1994, Current Protocols en Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11,2,1), tinción inmunofluorescente o análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo que reconoce inmunoespecíficamente el virus a ensayar o la detección de un ácido nucleico específico de virus (por ejemplo, por transferencia Southern o análisis de RT-PCR, etc.).

En una realización específica, pueden determinarse los títulos virales obteniendo fluidos biológicos/muestras clínicas de células infectadas o de un sujeto infectado, preparando una dilución en serie de la muestra e infectando una monocapa de células que son susceptibles de infección con el virus (por ejemplo, células primarias, líneas celulares transformadas, muestras de tejido de pacientes etc) a una dilución del virus que permite la aparición de pequeñas placas. Las placas después pueden contarse y el título viral expresarse como unidades de formación de placas por mililitro de muestra.

En una realización específica, la velocidad de crecimiento de un virus en un sujeto puede estimarse por el título de anticuerpos contra el virus en el sujeto. El título de suero de anticuerpos puede determinarse por cualquier procedimiento bien conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitación, la cantidad de anticuerpo o fragmento de anticuerpo en muestras de suero puede cuantificarse, por ejemplo, por ELISA.

Además, la actividad in vivo de un ligando de TLR7 o un profármaco de un ligando de TLR7 puede determinarse administrando directamente el compuesto a un animal de ensayo, recogiendo fluidos biológicos (por ejemplo aspirado nasal, frotis de garganta, esputos, lavado broncoalveolar, orina, saliva, sangre o suero) y ensayando la actividad antivirus en el fluido.

En realizaciones en las que las muestras a ensayar con respecto a los niveles de virus son fluidos biológicos/muestras clínicas (por ejemplo, aspirado nasal, frotis de garganta, esputo, lavado broncoalveolar, orina, saliva, sangre o suero), las muestras pueden contener o no células intactas. Las muestras de sujetos que contienen células intactas pueden procesarse directamente, mientras que los aislados sin células intactas pueden cultivarse primero o no en una línea celular permisiva (por ejemplo células primarias, líneas celulares transformadas, muestras de tejidos de pacientes etc) o medio de crecimiento (por ejemplo caldo LB/agar, caldo YT/agar, agar sangre, etc.). Las suspensiones celulares pueden aclararse por centrifugación, por ejemplo, a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, seguido de un lavado con PBS, PH 7,4 (sin Ca++ y Mg++) en las mismas condiciones. Los sedimentos celulares pueden resuspenderse en un pequeño volumen de PBS para el análisis. Los aislados clínicos primarios que contienen células intactas pueden mezclarse con PBS y centrifugarse a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se retira moco de la superficie de contacto con una punta de pipeta estéril y los sedimentos celulares pueden lavarse una vez más con PBS en las mismas condiciones. Después los sedimentos pueden resuspenderse en un pequeño volumen de PBS para el análisis.

En otra realización, un compuesto de la invención se administra a un sujeto humano

infectado con un virus. La incidencia, gravedad, duración, carga viral, mortalidad, porcentaje de infección etc. puede compararse con la incidencia, gravedad, duración, carga viral, mortalidad, porcentaje de infección etc. observado en sujetos humanos infectados con un virus en ausencia de un compuesto de la invención o en presencia de un placebo. La actividad antiviral del compuesto de la invención se demuestra por una reducción en la incidencia, gravedad, duración, carga viral, mortalidad, porcentaje de infección etc. en presencia del compuesto de la invención. Puede usarse cualquier procedimiento conocido en la técnica para determinar la actividad antiviral en un sujeto tales como los descritos previamente.

Además, la actividad in vivo de un ligando de TLR7 o profármaco de ligando de TLR7 puede determinarse administrando directamente el compuesto a un sujeto animal o humano, recogiendo fluidos biológicos/muestras clínicas (por ejemplo aspirado nasal, frotis de garganta, esputo, lavado broncoalveolar, orina, saliva, sangre y suero) y ensayando en los fluidos biológicos/muestras clínicas la actividad antiviral (por ejemplo por adición a las células en cultivo en presencia del virus).

Lo anterior ha demostrado las características pertinentes e importantes de la presente invención. Un experto en la materia apreciará que pueden preverse numerosas modificaciones y realizaciones. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones adjuntas incluyan todas estas modificaciones y realizaciones. 6 EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos tienen el objetivo único de ilustración y no deben considerarse limitantes del alcance de la invención.

6.1 Identificación de Ligandos de TLR7

Hay tres clases químicas conocidas de ligandos de TLR7: guanosinas, imidazoquinolinas y pirimidinas (véase la Sección 5.2). Como se ha descrito anteriormente, los ligandos de TLR7 adicionales se identifican fácilmente por procedimientos de exploración conocidos. Por ejemplo, los análogos de adenina y derivados se identificaron como ligandos de TLR usando el siguiente procedimiento de exploración. Véanse las Tablas 1 y 2.

Se obtuvo una línea celular HEK293-hTLR7 estable en Invivogen (San Diego, California), se transfectó con pNiFty2-Luc, un plásmido indicador de luciferasa inducible por NF-κB (Invivogen) y se seleccionaron transfectantes estables (dobles). Las líneas celulares dobles (hTLR7/pNiFty2-Luc) resultantes se ensayaron funcionalmente por respuesta a loxoribina e isatoribina como se mide por inducción de luciferasa en veces con respecto a un control sin fármaco. Se eligió la línea C23 debido a su perfil de sensibilidad y respuesta satisfactoria con estos (y otros) agonistas de TLR7. El fundamento biológico que relaciona el vínculo de TLR7 y la activación de NF-κB se ha encontrado con una aceptación extendida (para una revisión, véase Akira S. y col., Immunol. Lett., 85, 85-95 (2003)) y como consecuencia el sistema indicador inducible HEK293-TLR-NF-kB se acepta como ensayo convencional que se ha usado consecuentemente para ensayar agonistas de TLR(7), en un formato de sistema estable o transitorio. Véase, por ejemplo, Hemmi H. y col., Nat. Immunol.,

5 3, 196-200 (2002); Jurk M. y col., Nat. Immunol., 3, 499 (2002); y Lee J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 6646-51 (2003).

Para un ensayo C23 típico, las células se siembran a 6x104 células/pocillo en placas de 96 pocillos y 4-24 horas después se tratan con diversas concentraciones de compuesto. Después de 2-48 horas de exposición, las monocapas celulares se lisan con tampón de lisis

10 pasiva (Promega) y el ensayo de luciferasa de luciérnaga se realiza usando el reactivo de ensayo de luciferasa (Promega) como se especifica por el fabricante. Las actividades relativas de luciferasa se expresan como veces de inducción en comparación con el control sin fármaco. Una inducción de dos veces con respecto al nivel basal se considera un agonista de TLR7 auténtico, dependiente de que esto que sea un aumento estadísticamente significativo.

15 Tabla 1: La Isatoribina Activa el TLR7 Humano en Ensayo en HEK293

Compuesto: Concentración de compuesto, µM

Nº: 50 100 250 500

21: 3,1 (±0,2) 3,4 (±0,1) 6,2 (± 0,5) 10,9 (± 0,7)

Tabla 2: El Derivado de Adenina Activa el TLR7 Humano en Ensayo de HEK293

Compuesto Nº: Concentración de compuesto, µM

1,0: 3,2 10 32

29: 20,8 (± 1,1) 37,3 (± 0,5) 47,5 (± 0,2) 48,4 (± 0,4)

En la Tabla 1 se añadió isatoribina a células C23 durante cuarenta y ocho horas, y las

células después se recogieron y ensayaron con respecto a la actividad luciferasa. Cada

momento se ensayó por triplicado. Los datos presentados son la media de veces de inducción

20 en comparación con el control sin fármaco, junto con la desviación típica entre paréntesis. En la Tabla 2 se añadió un derivado de adenina 29 a células C23 durante veinticuatro horas, y las células después se recogieron y se ensayaron con respecto a la actividad luciferasa. Cada momentose ensayó por triplicado. Los datos presentados son la media en veces de inducción en comparación con el control sin fármaco, junto con la desviación típica

25 entre paréntesis.

6.2 Ligandos de TLR7 Ensayados como Agentes Anti-VHC Reducción de Carga Viral de VHC

Se suministró el producto farmacéutico de investigación isatoribina como una solución de 1 mg/ml en solución salina normal estéril contenida en un vial de 50 ml. La isatoribina se administró a seres humanos por infusión intravenosa una vez al día durante 7 días, a 200, 400, 600 u 800 mg por dosis. Todas las dosis se administraron por una infusión de velocidad constante durante un periodo de 60 minutos, excepto la dosis de 800 mg que se administró durante un periodo de 80 minutos. El caudal para cada dosis fue el siguiente: 3,33 ml/min para la dosis de 200 mg; 6,67 ml/min para la dosis de 400 mg; 8,33 ml/min para la dosis de 500 mg;

o 10,0 ml/min para la dosis de 600 mg y 800 mg.

En cada uno de los grupos de dosificación (200 mg, 400 mg, 600 mg, 800 mg por dosis) se incluyeron de cuatro a doce pacientes y recibieron infusiones intravenosas una vez al día durante 7 días. Antes de la dosificación, se extrajo una muestra de sangre de cada paciente para la evaluación del genotipo del virus VHC.

Se determinó el ARN de VHC en plasma inicialmente (una media de 2 mediciones antes del tratamiento tomadas el Día -1 o antes del tratamiento y en el Día 1) y una vez al día antes del inicio del primer día de infusión intravenosa de isatoribina los Días 2 a 7 para estos grupos de dosificación diaria (x 7 días). Véase la Figura 2. La carga viral se midió por el procedimiento de ADN ramificado (ensayo Versant™ v3,0 bDNA, Bayer Diagnostics). Para el ARN de VHC en plasma, se estimó el cambio máximo del nivel basal previo al tratamiento usando valores transformados en logaritmos.

El ARN de VHC en plasma se redujo durante el transcurso del tratamiento con isatoribina, produciéndose los mayores cambios en general en pacientes que recibieron las mayores dosis diarias (Figura 2). Ocho de 12 pacientes que recibieron 800 mg de isatoribina QD x 7 días mostraron una reducción de carga viral en plasma mayor de 0,5 unidades log10, con un cambio medio en estos 12 pacientes de -0,76 unidades log10 y un intervalo de -2,85 a +0,21 unidades log10. Esta reducción en la carga viral fue estadísticamente significativa para el grupo de dosificación de 800 mg QD (p=0,008). La carga viral en plasma desciende generalmente de forma inversa después de cesar el tratamiento. Bioensayo Viral Basado en Replicón de VHC

Se ha demostrado que los replicones de VHC son muy sensibles a los efectos inhibidores del interferón α y el interferón γ. Por lo tanto, el replicón de VHC pasa a ser un sistema muy útil para medir la cantidad de interferones biológicamente activos en sobrenadantes de CMSP humanas estimuladas con un agonista de TLR7. Se desarrolló un ensayo cuantitativo que se basa en la medición de la actividad del gen indicador de luciferasa que se integró en un replicón de VHC. Usando este sistema se midieron interferones de CMSP tratadas con agonista de TLR7 y se evaluó su actividad inhibidora usando replicón indicador de luciferasa.

Se pusieron CMSP humanas aisladas de un donante sano en pocillos de cultivo de células por replicado (5 x 106 células por pocillo). Las CMSP se incuban en ausencia de compuestos de ensayos a 37ºC en una atmósfera humidificada que contiene un 5% de CO2 durante 24 horas para permitir la estabilización a las condiciones de cultivo, y después se añade ligando de TLR7 o un control sin fármaco a los pocillos por replicado que contienen CMSP del mismo donante. Las concentraciones de ligando de TRL7 pueden variarse para adaptarse al experimento particular, y los cultivos de CMSP después se incuban a 37ºC en una atmósfera humidificada que contiene un 5% de CO2 durante 8 horas. Se toman muestras del sobrenadante de cultivo celular en el momento de 8 horas (o el momento de 24 horas en el caso de loxoribina y sus profármacos) a partir de los pocillos tratados con ligando de TLR7 y de control y se ensaya con respecto a la producción de interferón alfa por ELISA. Los sobrenadantes de las células tratadas con compuesto y un control sin fármaco se diluyeron a 1:10, 1:100 y 1:1000 en medio RPMI y se aplicaron a una placa de 96 pocillos de hepatocitos Huh7 que contenían el replicón indicador de luciferasa. Las células se incubaron durante 48 horas a 37ºC en un incubador de cultivo de tejidos.

Después del periodo de incubación, las placas de 96 pocillos se lavaron 2 veces con PBS y se lisaron con tampón de lisis pasivo (Promega). Las placas se agitan a temperatura ambiente durante 20 minutos y se añade reactivo de ensayo luciferasa convencional (Promega) a cada pocillo por inyección y la placa se lee en un luminómetro Lmax (Molecular Devices). Las unidades de luz relativas de partida se convierten en un porcentaje de inhibición que se compara con los pocillos de control sin fármaco para determinar el nivel de inhibición observado en el ensayo replicón. La concentración máxima estimada de interferones necesaria para inhibir la replicación del replicón de VHC se determinó a una dilución 1:10 de sobrenadante de células estimuladas con CMSP que está dentro de nuestro intervalo de ensayo de la serie de dilución. Para todos los agonistas de TLR7 ensayados, se observó una inhibición del 100% en el sistema de replicón de indicador de luciferasa a la dilución de 1:10.

Los datos presentados en las Tablas 3-8 representan la inhibición del sistema replicón de VHC por el sobrenadante recogido después de la exposición de células CMSP al compuesto a una concentración inicial durante el tiempo de incubación indicado y diluidas como se especifica en la primera columna (“CMSP expuestas al compuesto”). Como control se usó un sobrenadante recogido a partir de células CMSP no expuestas al compuesto y diluidas como se especifica en la primera columna (“sobrenadante Blanco”). Las células CMSP se aislaron a partir de un solo donante de sangre como se especifica.

Nº 1 Tiempo de incubación: 8 horas Concentración inicial: 100 µM Número de donante de sangre: FL72035

Dilución de sobrenadante: Inhibición de replicón de VHC, %

CMPS Blanco: CMPS expuestas a compuesto

1:100: 0 100

1:1000: 0 94

Nº 2 Tiempo de incubación: 8 horas Concentración inicial: 100 µM Número de donante de sangre: FL75287

Dilución de sobrenadante: Inhibición de replicón de VHC, %

CMPS Blanco: CMPS expuestas a compuesto

1:10: 0 100

1:100: 0 87

1:1000: 0 6

Nº 3 Tiempo de incubación: 24 horas Concentración inicial: 100 µM Número de donante de sangre: FL75864

Dilución de sobrenadante: Inhibición de replicón de VHC, %

CMPS Blanco: CMPS expuestas a compuesto

1:10: 0 100

1:100: 23 99

1:1000: 0 64

Nº 1 Tiempo de incubación: 24 horas Concentración inicial: 100 µM Número de donante de sangre: FL75864

Dilución de sobrenadante: Inhibición de replicón de VHC, %

CMPS Blanco: CMPS expuestas a compuesto

1:10: 0 100

1:100: 23 74

1:1000: 0 17

Tabla 5: Efecto Antiviral de Imiquimod en el Bioensayo de Replicón de VHC in vitro

Nº 1 Tiempo de incubación: 8 horas Concentración inicial: 3,2 µM Número de donante de sangre: FL75287

Dilución de sobrenadante: Inhibición de replicón de VHC, %

CMPS Blanco: CMPS expuestas a compuesto

1:10: 0 100

1:100: 0 100

1:1000: 0 89

Nº 2 Tiempo de incubación: 8 horas Concentración inicial: 3,2 µM Número de donante de sangre: FL75287

Dilución de sobrenadante: Inhibición de replicón de VHC, %

CMPS Blanco: CMPS expuestas a compuesto

1:10: 3 100

1:100: 13 75

1:1000: 3 1

Nº 1 Tiempo de incubación: 8 horas Concentración inicial: 10 µM Número de donante de sangre: FL75287

Dilución de sobrenadante: Inhibición de replicón de VHC, %

CMPS Blanco: CMPS expuestas a compuesto

1:10: 0 100

1:100: 0 98

1:1000: 0 21

Nº 2 Tiempo de incubación: 8 horas Concentración inicial: 10 µM Número de donante de sangre: FL75287

Dilución de sobrenadante: Inhibición de replicón de VHC, %

CMPS Blanco: CMPS expuestas a compuesto

1:10: 3 100

1:100: 13 88

1:1000: 3 6

Tabla 7: Efecto Antiviral de Bromopirimina en el Bioensayo de Replicón de VHC in vitro

Dilución de sobrenadante: Inhibición de replicón de VHC, %

CMPS Blanco: CMPS expuestas a compuesto

1:10: 0 100

1:100: 0 95

1:1000: 0 0

Nº 2 Tiempo de incubación: 8 horas Concentración inicial: 100 µM

Dilución de sobrenadante: Inhibición de replicón de VHC, %

CMPS Blanco: CMPS expuestas a compuesto

1:10: 0 100

1:100: 8 95

1:1000: 0 33

Tabla 8: Efecto Antiviral de Derivado de Adenina en el Bioensayo de Replicón de VHC in vitro

Nº 1 Tiempo de incubación: 8 horas Concentración inicial: 0,1 µM Número de donante de sangre: FL76418 Forma del compuesto: una sal de TFA

Dilución de sobrenadante: Inhibición de replicón de VHC,%

CMPS Blanco: CMPS expuesta a compuesto

1:10: 0 100

1:100: 3 73

1:1000: 3 0

Nº 2 Tiempo de incubación: 8 horas Concentración inicial: 0,1 µM Número de donante de sangre: FL76418 Forma del compuesto: una sal de TFA

Dilución de sobrenadante: Inhibición de replicón de VHC,%

CMPS Blanco: CMPS expuesta a compuesto

1:10: 0 100

1:100: 3 64

1:1000: 3 9

6.3 Preparación de Profármacos de Ligando de TLR7

Los compuestos de la invención pueden sintetizarse usando la metodología descrita en los Esquemas 1-18 presentados anteriormente. A menos que se indique otra cosa, todas las temperaturas se indican en grados Centígrados y todas las partes y porcentajes son en peso. Los reactivos se adquieren a partir de proveedores comerciales tales como Aldrich Chemical Company o Lancaster Synthesis Ltd. y se usan sin purificación adicional a menos que se indique otra cosa. El tetrahidrofurano (THF) y la N,N-dimetilformamida (DMF) se adquieren en Aldrich en frascos Sure Seal y se usan como se reciben. A menos que se indique otra cosa, los siguientes disolventes y reactivos se destilan bajo una atmósfera de nitrógeno seco. El THF y Et2O se destilan en Na-benzofenona cetilo; el CH2Cl2 (DCM), diisopropilamina, piridina y Et3N se destilan en CaH2; el MeCN se destila primero en P2O5, y después en CaH2; el MeOH se destila en Mg; el PhMe, EtOAc e i-PrOAc se destilan en CaH2; el TFAA se purificó por medio de una destilación atmosférica sencilla en una atmósfera de argón seco.

Las reacciones indicadas se realizan generalmente bajo una presión positiva de argón a una temperatura ambiente (a menos que se indique otra cosa) en disolventes anhidros, y a los matraces de reacción se les ajustan tabiques de goma para la introducción de sustratos y reactivos por medio de una jeringa. Los artículos de vidrio se secan en una estufa y/o se secan por calor. Las reacciones se ensayan por TLC y se terminan a juzgar por el consumo del material de partida. La cromatografía de capa fina (TLC) analítica se realiza en placas de gel de sílice con soporte de aluminio 60 F254 de 0,2 mm (EM Science) y se visualiza con luz UV (254 nm) seguido de calentamiento con ácido fosfomolíbdico etanólico comercial. La cromatografía de capa fina (TLC) preparativa se realiza en placas de gel de sílice con soporte de aluminio 60 F254 de 1,0 mm (EM Science) y se visualizan con luz ultra violeta (254 nm). La HPLC se realiza en el sistema Waters Micromass ZQ consistente en una bomba de gradiente binario modelo 2525 con un detector ELSD Alltech modelo 800 y un detector de matriz de fotodiodos Waters modelo 996.

Los procedimientos típicamente se realizan duplicando el volumen de reacción con el disolvente de reacción o disolvente de extracción y después lavando con las soluciones acuosas indicadas usando un 25% del volumen de extracción a menos que se indique otra cosa. Las soluciones de productos se secan sobre Na2SO4 y/o Mg2SO4 anhidro antes de la filtración y evaporación de los disolventes a presión reducida en un evaporador rotatorio y se indica como disolvente retirados al vacío. La cromatografía en columna se completa a presión positiva usando gel de sílice de malla 230-400 o alúmina neutra de malla 50-200. La hidrogenolisis se realiza a la presión indicada en los ejemplos o a temperatura ambiente.

Los espectros de RMN 1H se registran en un instrumento Varian Mercury-VX400 que funciona a 400 MHz y los espectros de RMN 13C se registran funcionando a 75 MHz. Los espectros de RMN se obtienen como soluciones de CDCl3 (presentadas en ppm), usando cloroformo como patrón de referencia (7,27 ppm y 77,00 ppm), CD3OD (3,4 y 4,8 ppm y 49,3 ppm), DMSO-d6, o tetrametilsilano internamente (0,00 ppm) cuando es apropiado. Cuando es

5 necesario se usan otros disolventes de RMN. Cuando se presentan multiplicidades de picos, se usan las siguientes abreviaturas: s (singlete), d (doblete), t (triplete), c (cuadruplete), m (multiplete), a (ancho), dd (doblete de dobletes), dt (doblete de tripletes). Las constantes de acoplamiento, cuando se proporcionan, se presentan en Hercios (Hz).

Los espectros infrarrojos (IR) se registran en un Thermo Nicolet Avatar 370 FT-IR como

10 aceites puros o sólidos, y cuando se proporcionan se indican en números de onda (cm-1). Los espectros de masas presentados como (+)-ES Thermo Finnegan LCQ CL/EM se realizaron por el Analytical Chemistry Department en Anadys Pharmaceuticals, Inc. Los análisis elementales se realizan por el Atlantic Microlab, Inc. en Norcross, GA o por NuMega, en San Diego, CA. Los puntos de fusión (pm) se determinan en un aparato capilar abierto y están sin corregir.

15 Las rutas sintéticas descritas y los procedimientos experimentales utilizan muchas abreviaturas químicas comunes, THF (tetrahidrofurano), DMF (N,N-dimetilformamida), EtOAc (acetato de etilo), DMSO (dimetil sulfóxido), DMAP (4-dimetilaminopiridina), DBU (1,8diazaciclo[5,4,0]undec-7-eno), DCM (4-(dicianometileno)-2-metil-6-(4-dimetilamino-estiril)-4-Hpirano), MCPBA (ácido 3-cloroperoxibenzoico), EDC (clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3

20 etilcarbodiimida), HATU (hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3tetrametiluronio), HOBT (hidrato de 1-hidroxibenzotriazol), TFAA (anhídrido trifluoroacético), pyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio), DIEA (diisopropiletilamina) y similares.

imagen2

Etapa 1: Preparación de 7-Alil-2-amino-9-(2',3',5'-tri-O-acetil-β-D-ribofuranosil)-7,9-dihidro-1Hpurin-6,8-diona (40)

Una mezcla heterogénea de 7-alil-2-amino-9-β-D-ribofuranosil-7,9-dihidro-1H-purin-6,8diona 17 (1,00 g, 2,95 mmol, preparada de acuerdo con Reitz y col., JMC, 37, 3561-3578 (1994)), DMAP (0,036 mg, 0,29 mmol) y NEt3 (2,05 ml, 14,74 mmol) se agitó en acetonitrilo seco (25 ml). A la suspensión se le añadió lentamente anhídrido acético (0,862 ml, 9,13 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. El disolvente se retiró al vacío y el residuo se disolvió en diclorometano (DCM). Después, la fase orgánica se lavó con bicarbonato sódico acuoso saturado (NaHCO3) y salmuera y posteriormente se secó con sulfato de magnesio anhidro (MgSO4) El disolvente se concentró al vacío y se secó a temperatura ambiente a alto vacío, dando 1,33 g de 40 (97%) en forma de un sólido de color amarillo pálido: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 6,12 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 5,89 (m, 1H), 5,82 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 5,39 (s a, 2H), 5,21 (m, 2H), 4,58 (s a, 2H), 4,51 (m, 1H), 4,32 (m, 2H), 2,16 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 2,10 (s, 3H); EM EN-(+) [M+H]+ 466,2 m/z. Etapa 2: Preparación de 7-Alil-2-amino-6-cloro-9-(2',3',5'-tri-O-acetil-β-D-ribofuranosil)-7,9dihidro-purin-8-ona (41)

El Compuesto 40 (0,65 g, 1,39 mmol) se disolvió en oxicloruro de fósforo (10 ml) y se calentó a 75ºC durante 16 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío y el producto en bruto se disolvió en DCM. Después, la mezcla se lavó con una solución de NaHCO3 y salmuera, se secó (MgSO4) y se filtró. El filtrado se concentró al vacío y se purificó por cromatografía ultrarrápida usando un gradiente del 10 al 50% de acetato de etilo en hexanos. La retirada del disolvente proporcionó 280 mg (41%) del producto deseado 41: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 6,04 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 6,03 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 5,86 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 5,18 (m, 4H), 4,59 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 4,45 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,31 (m, 2H), 2,10 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,04 (s, 3H); EM EN-(+) [M+H]+ 484,2 m/z. Etapa 3: Preparación de 7-Alil-2-amino-9-(2',3',5'-tri-O-acetil-β-D-ribofuranosil)-7,9-dihidropurin-8-ona (42)

El Compuesto 41 (0,27 g, 0,56 mmol) se disolvió en ácido acético y a la solución se le añadió la pareja Zn-Cu. La mezcla se calentó a 70ºC durante 18 h. Las partículas suspendidas se retiraron por filtración y el filtrado se concentró al vacío. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida usando un gradiente del 10% al 100% de acetato de etilo en hexanos. El disolvente se retiró, dando 150 mg (60%) de 42 en forma de un sólido de color blanquecino: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 6,05 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 6,03 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,87 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 5,83 (m, 1H), 5,48 (s a, 2H), 5,33 (s, 1H), 5,29 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,49 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 4,46 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 4,41 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 4,27 (m, 2H), 2,12 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 2,05 (s, 3H); EM EN-(+) [M+H]+ 450,0 m/z. Etapa 4: Preparación de 7-Alil-2-amino-9-β-D-ribofuranosil-7,9-dihidro-purin-8-ona (43)

A una solución de 42 (0,13 g, 0,29 mmol) en metanol (4 ml) se le añadió K2CO3 sólido (0,024 g, 0,17 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. A la mezcla turbia se le añadió Amberlite CG-50 (0,5 g), se agitó hasta que se volvió neutra y se filtró. El filtrado se concentró, dando un sólido de color blanquecino, que se lavó con agua y se secó a alto vacío, dando 93,5 mg de 43 puro con rendimiento cuantitativo en forma de un sólido de

5 color blanquecino: RMN de 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 7,88 (s, 1H), 6,33 (s a, 2H), 5,85 (m, 1H), 5,66 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,30 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,20 (s, 1H), 5,16 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,01 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,89 (c, J = 5,6 Hz, 1H), 4,75 (s a, 1H), 4,35 (d, J= 5,2 Hz, 2H), 4,10 (t, J = 8,4 Hz, 1) 3,80 (c, J = 3,6 Hz, 1H), 3,57 (m, 1H), 3,44 (m, 1H). EM EN-(+) [M+H]+ 324,1 m/z.

10 Ejemplo 2: 7-Alil-2-amino-6-etoxi-9-imagen3 -D-ribofuranosil-7,9-dihidro-purin-8-ona (45)

imagen1

Etapa 1: Preparación de 7-Alil-2-amino-6-etoxi-9-(2',3',5'-tri-O-acetil-β-D-ribofuranosil)-7,9dihidro-purin-8-ona (44)

A una solución de 40 (0,30 g, 0,64 mmol) en THF seco (15 ml) se le añadieron

15 trifenilfosfina soportada con polímero (0,89 g, 1,93 mmol) y EtOH (0,11 ml, 1,93 mmol) a temperatura ambiente. A la mezcla en agitación se le añadió azodicarboxilato de dietilo (0,12 ml, 0,77 mmol) y la agitación se continuó durante 18 h. El soporte polimérico consumido se retiró por filtración y el disolvente se retiró al vacío. Después, el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida usando un gradiente del 10 al 50% de acetato de etilo en hexanos.

20 La retirada del disolvente proporcionó 85 mg (26%) del producto deseado 6 en forma de un aceite transparente: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 6,07 (d, J= 4,0 Hz, 1H), 6,06 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 6,01 (d, J= 3,6 Hz, 1H), 5,96 (t, J= 6,0 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 5,14 (d, J= 2,2 Hz, 1H), 5,15 (m, 1H), 4,80 (s a, 2H), 4,46 (m, 4H), 4,37 (c, J= 7,2 Hz, 2H), 4,29 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 1,35 (t, J= 7,6 Hz, 3H); EM EN-(+) [M+H]+ 494,1 m/z.

25 Etapa 2: Preparación de 7-Alil-2-amino-6-etoxi-9-β-D-ribofuranosil-7,9-dihidro purin-8-ona (45) A una solución de 44 (0,084 g, 0,17 mmol) en metanol (4 ml) se le añadió K2CO3 sólido (0,014 g, 0,17 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. A la mezcla turbia se le añadió Amberlite CG-50 (0,5 g), se agitó hasta que se volvió neutra y se filtró. El

filtrado se concentró y se purificó por cromatografía ultrarrápida usando de DCM al 100% a 10% de metanol en DCM. La retirada del disolvente proporcionó 62 mg de 7 (99%) en forma de un aceite transparente: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,97 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 5,93 (m, 1H), 5,25 (d, J= 32,4, Hz, 1H), 5,21 (s, 1H), 5,02 (t, J= 8,0 Hz, 1H), 4,62 (s a, 2H), 4,47 (d, J= 5,6 Hz, 2H), 4,25-4,45 (m, 3H), 4,21 (c, J= 6,8 Hz, 2H), 3,77 (ABc, ΔυAB = 0,14, JAB = 12,4 Hz, 2H), 1,37 (t, J= 6,8 Hz, 3H), 1,27 (t, 7,6, 2H); EM EN-(+) [M+H]+ 368,0 m/z. Ejemplo 3: 5-Bromo-4-etoxi-6-fenil-pirimidin-2-ilamina (37)

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Etapa 1: Preparación de 5-Bromo-4-etoxi-6-fenil-pirimidin-2-ilamina (37)

10 De una manera similar a la etapa 2 del Ejemplo 2 se preparó el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco a partir de 2-amino-5-bromo-6-fenil-3H-pirimidin-4-ona 35 (Wierenga, y col., JMC, 23, 239-240 (1980)) con un rendimiento del 13%: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,61 (m, 2H0, 7,42 (m, 3H), 5,15 (s a, 2H), 4,23 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 1,44 (t, 6,8 Hz, 3H); EM EN-(+) [M]+ 294,1 [M+2]+ 296,0 m/z. Análisis elemental para C12H12BrN3O: calc.: C,

15 49,00; H, 4,11; N, 14,29; encontrado: C, 48,94; H, 4,18; N, 14,01, Ejemplo 4: 4-(2-Amino-5-bromo-6-fenil-pirimidin-4-iloximetil)-5-metil-[1,3]dioxol-2-ona (46)

imagen1

Etapa 1: Preparación de 4-(2-Amino-5-bromo-6-fenil-pirimidin-4-iloximetil)-5-metil-[1,3]dioxol-2ona (46)

De una manera similar a la etapa 2 del Ejemplo 2 se preparó el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco a partir de 2-Amino-5-bromo-6-fenil-3H-pirimidin-4-ona 35 con un rendimiento del 4%: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,62 (m, 2H), 7,45 (m, 3H), 5,18 (s, 2H), 5,07 (s, 2H), 2,26 (s, H); EM EN-(+) [M]+378,2 [M+2]+ 380,1 m/z. Análisis elemental para C15H12BrN3O4: calc.: C, 47,64; H, 3,20; N, 11,11; encontrado: C, 46,98; H, 3,23; N, 10,70,

74 Ejemplo 5: 5-Bromo-4-fenil-pirimidin-2-ilamina (48)

imagen1

Etapa 1: Preparación de 4-Fenil-pirimidin-2-ilamina (47)

A una solución de bromobenceno (4,43 ml, 42,06 mmol) en THF seco (100 ml) a -78ºC

5 se le añadió BuLi (394 ml, 63,08 mmol) y la mezcla se dejó en agitación a -78ºC durante 2 h. A esto se le añadió 2-aminopirimidina (2,0 g, 21,03 mmol) en tolueno caliente (80 ml) durante un periodo de 15 minutos. La mezcla se calentó a reflujo durante 16 h, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se inactivó cuidadosamente con NaHCO3 acuoso. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró al vacío. Después, el residuo se disolvió en DCM, se lavó con NaHCO3

10 acuoso y salmuera y se secó (MgSO4) El disolvente se retiró, proporcionando 350 mg de 47 (10%) en forma de un sólido de color amarillo pálido: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,32 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,97 (m, 2H), 7,45 (m, 3H), 7,02 (J = 4,8 Hz, 1H). 5,27 (s a, 2H); EM EN-(+) [M+H]+ 172,2 m/z. Etapa 2: Preparación de 5-Bromo-4-fenil-pirimidin-2-ilamina (48)

15 El Compuesto 47 (0,30 g, 1,75 mmol) se disolvió en ácido acético glacial (15 ml) y se calentó a 45ºC. Se añadió lentamente Br2 (0,09 ml, 1,75 mmol). Después, la mezcla resultante se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 3 h. El disolvente se retiró al vacío, dando un residuo sólido. Después, éste se transfirió a un embudo de filtración y se lavó con DCM, seguido de agua. Después, el sólido restante se secó a alto vacío durante 16 h, dando 197 mg

20 de 13 (45%) en forma de un sólido de color amarillo pálido: RMN de 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 8,40 (s, 1H), 7,61 (m, 2H), 7,45 (m, 3H), 6,96 (s, 2H); EM EN-(+) [M]+ 250,0 [M+2]+ 252,0 m/z. Análisis elemental para C10H8BrN3: calc.: C, 48,02; H, 3,22; Br, 31,95; N, 16,80; encontrado: C, 47,91; H, 3,28; Br, 32,15; N, 16,80, Ejemplo 6: Éster etílico del ácido (5-bromo-6-oxo-4-fenil-1,6-dihidro-pirimidin-2-il)

25 carbámico (36)

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Etapa 1: Preparación de Éster etílico del ácido (5-bromo-6-oxo-4-fenil-1,6-dihidro-pirimidin-2-il)carbámico (36)

5

10

15

20

25

30

75

A una solución de 35 (0,25 g, 0,94 mmol) en DMF (8 ml) se le añadieron NEt3 (0,14 ml, 0,99 mmol) y pirocarbonato de dietilo (0,27 ml, 1,89 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo at 65ºC durante 20 h. El disolvente se retiró y el residuo se trató con DCM. La mezcla resultante se filtró para retirar el material de partida restante 35 y el filtrado se lavó con NaHCO3 acuoso y salmuera y se secó (MgSO4). El filtrado se concentró y se purificó por HPLC (columna Thomson ODS-A 100A 5 µm 150 x 21,2 mm; caudal = 30 ml/min; CH3CN con TFA al 0,05% (A), Agua con TFA al 0,05% (B); Flujo de la bomba de preparación = 0,9 ml/min; Fase móvil de la bomba de preparación; MeOH con TFA al 0,05% usando un sistema de gradiente como se indica a continuación: t = 0; 15% de A, 85% de B; t = 3,0 min; 15% de A, 85% de B; t = 9,5 min; 70% de A, 30% de B; t = 10,0 min; 100% de A, 0% de B; t = 12,0 min; 100% de A, 0% de B; t = 12,5 min; 15% de A, 85% de B; t = 15,0 min; 15% de A, 85% de B), proporcionando 54 mg de 36 (17%) en forma de un aceite transparente: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,66 (m, 1H), 7,44 (m, 3H), 4,26 (c, J = 7,6 Hz, 2H), 1,32 t, J = 6,8 Hz, 3H); EM EN(+) [M]+ 338,1 [M+2]+ 340,0 m/z. Análisis elemental para C13H12BrN3O3: calc.: C, 46,17; H, 3,58; N, 12,43; encontrado: C, 46,43; H, 3,74; N, 11,95. Ejemplo 7: Éster pentílico del ácido (5-bromo-6-oxo-4-fenil-1,6-dihidro-pirimidin-2-il)carbámico (49)

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Etapa 1: Preparación de Éster pentílico del ácido (5-bromo-6-oxo-4-fenil-1,6-dihidro-pirimidin-2il)-carbámico (49)

De una manera similar a la etapa 1 del Ejemplo 6, el compuesto del título se preparó a partir de 35 y pirocarbonato de dipentilo en forma de un aceite transparente con un rendimiento del 9% después de la purificación por HPLC (columna Thomson ODS-A 100A 5 µm 150 x 21,2 mm; caudal = 30 ml/min; CH3CN con TFA al 0,05% (A), Agua con TFA al 0,05% (B); Flujo de la bomba de preparación = 0,9 ml/min; Fase móvil de la bomba de preparación; MeOH con TFA al 0,05% usando un sistema de gradiente como se indica a continuación: t = 0; 35% de A, 65% de B; t = 3,0 min; 35% de A, 65% de B; t = 10 min; 100% de A, 0% de B; t = 12,0 min; 100% de A,0%deB;t=12,5min;35%deA,65%deB;t=15,0min;35%deA,65%deB).RMNde 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,69 (s a, 1H), 7,67 (m, 2H), 7,43 (d, J= 2,0 Hz, 3H), 4,17 (t, J= 7,2 Hz, 2H), 1,64 (t; J= 6,8 Hz, 2H), 1,34 (m, 4H), 0,92 (t, J= 6,4 Hz, 3H); EM EN-(+) [M]+ 380,1 [M+2]+ 382,1 m/z. Ejemplo 8: Éster pentílico del ácido (1-isobutil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-il)-carbámico

(34)

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Etapa 1: Preparación de Éster pentílico del ácido (1-isobutil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-il)carbámico (34)

5 A una suspensión de la 1-Isobutil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-ilamina 31 (0,15 g, 0,62 mmol, preparada de acuerdo con el procedimiento dado en el documento WO94/17043) en CHCl3 (5 ml) se le añadieron NEt3 (0,09 ml, 0,65 mmol) y pirocarbonato de dipentilo (0,231 g, 0,94 mmol). La mezcla se agitó a 40ºC durante 60 h. La mezcla de reacción se lavó con NaHCO3 acuoso y salmuera y se secó sobre MgSO4. El filtrado se concentró y se purificó por

10 cromatografía ultrarrápida usando un gradiente del 10% al 70% de acetato de etilo en hexanos, dando 50,5 mg de 34 (23%) en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,31 (s a, 1H), 8,15 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 7,85 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,77 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 4,43 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 4,36 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,31 (m, 1H), 1,75 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 1,36 (m, 4H), 1,06 (d, J = 6,4 Hz, 6H), 0,89 (t, J = 6,8 Hz, 2H); EM EN-(+) [M+H]+ 355,3 m/z.

15 Ejemplo 9: Éster etílico del ácido (1-isobutil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-il)-carbámico

(50)

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Etapa 1: Preparación de (1-Isobutil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-il)-carbámico éster etílico del ácido (50)

20 De una manera similar a la etapa 1 del Ejemplo 8, se preparó el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco a partir de 31 y pirocarbonato de dietilo con un rendimiento del 67% en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,32 (s a, 2H), 8,2 (d, J = 8,0 Hz, 2H) 8,12 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,83 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,74 (t, J = 8,0 Hz,1H) 4,43 (m, 4H), 2,35 (m, 1H), 1,39 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,08 (d, J = 6,4 Hz, 6H); EM EN-(+) [M+H]+

25 313,2 m/z.

Ejemplo 10: Éster etílico y ester de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-8-ilo del ácido carbónico (51)

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Etapa 1: Preparación de éster etílico y éster de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-85 ilo del ácido carbónico (51)

Se suspendió 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-8-ol, 29 (11,75 mg, 0,027 mmol, preparado de acuerdo con el procedimiento descrito por Kurimota, y col., Bioorg. Med Chem., 12, 1091-109 (2004) en CH2Cl2 (0,6 ml) y se enfrió a 0ºC. Después, a la suspensión se le añadieron DIEA (11,96 µl, 0,068 mmol) y etil cloroformiato (3,86 mg, 0,036 mmol, añadido en

10 forma de una solución al 10% en volumen en diclorometano). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 10 minutos y después se dejó calentar a temperatura ambiente durante 15 minutos. El análisis por TLC de la mezcla de reacción muestra que aún queda material de partida. La mezcla de reacción se calentó a 35ºC, se añadieron DMAP (cat.) y metanol (porciones de 60 µl) para disolver 29 y se añadieron alícuotas adicionales de cloroformiato de

15 etilo (3,86 mg, 0,036 mmol, añadido en forma de una solución al 10% en volumen en diclorometano) hasta que se completaron las reacciones. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida usando un gradiente del 0 al 100% de acetato de etilo en hexano. Los picos deseados se recogieron y se concentraron al vacío, dando 8,5 mg (80%) del compuesto 51 en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 8 7,45 (d, J

20 = Hz, 2H), 7,27 (m, 3H), 4,98 (s, 2H), 4,46 (m, 4H), 3,74 (m, 2H), 3,42 (s, 2H), 1,46 (t, 3H); EM [M+H]+ m/z 388,3, Los Ejemplos 11-20 se prepararon a partir de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9Hpurin-8-ol, 29 y el cloroformiato apropiado de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 10.

25 Ejemplo 11: Éster propílico y éster de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-8-ilo del ácido carbónico (52)

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Rendimiento del 86% en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,45 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 7,27 (m, 3H), 4,98 (s, 2H), 4,46 (m, 4H), 3,74 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,42 (s, 3H), 1,46 (t, J = 7,6 Hz, 3H); EM [M+H]+ m/z 402,2, Ejemplo 12: Éster isobutílico y éster de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-8-ilo del ácido carbónico (53)

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Rendimiento del 92% en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,45 (d, J = 6,4 Hz 2H), 7,27 (m, 3H), 4,99 (s, 2H), 4,45 (m, 2H), 4,17 (d, J =7,4 Hz,

10 2H), 3,73 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,4 (s, 3H), 2,15 (m, 1H), 1,06 (d, J = 6,8 Hz, 6H); EM [M+H]+ m/z 416,3, Ejemplo 13: Éster pentílico y éster de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-8-ilo del ácido carbónico (54)

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Rendimiento del 92% en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz,

CDCl3) δ 7,45 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 7,27 (m, 3H), 4,99 (s, 2H), 4,45 (t, J = 4,8 Hz, 2H, 4,39 (t, J =

7,2 Hz, 2H), 3,73 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,4 (s, 3H), 2,15 (m, 1H), 1,82 (m, 2H), 1,40 (m, 4H), 0,93

(t, J = 6,8 Hz, 3H); EM [M+H]+ m/z 430,2. Ejemplo 14: Éster alílico y éster de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-8-ilo del ácido carbónico (55)

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5 Rendimiento del 93% en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,46 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,25 (m, 3H), 6,0 (m, 1H), 5,5 (m, 1H), 5,35 (m, 1H), 4,99 (s, 2H), 4,89 (d, J = 2,4 Hz, 2H), 4,46 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,74 (d, J = 5,2 Hz, 2H), 3,42 (s, 3H); EM [M+H]+ m/z 400,2. Ejemplo 15: Éster de 4-cloro-butilílico de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-8

10 ilo del ácido carbónico (56)

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Rendimiento del 98% en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,44 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,25 (m, 3H), 4,98 (s, 2H), 4,45 (m, 4H), 3,63 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,42 (s, 3H), 1,99 (m, 4H); EM [M+H]+ m/z 450,2.

15 Ejemplo 16: Éster butílico y éster de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-8-ilo éster del ácido carbónico (57)

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Rendimiento del 100% en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz,

CDCl3) δ 7,45 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,27 (m, 3H), 4,99 (s, 2H), 4,46 (m, 2H), 4,41 (t, J = 4,4 Hz,

2H), 3,73 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 3,42 (s, 3H), 1,79 (m, 2H), 1,48 (m, 2H), 0,96 (t, J = 7,6 Hz, 3H);

EM [M+H]+ m/z 416,2.

Ejemplo 17: Éster fenílico y éster de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-8-ilo del

ácido carbónico (58)

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Rendimiento del 100% en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,52 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 7,41 (m, 2H), 7,30 (m, 3H), 7,25 (m, 3H), 4,99 (s, 2H), 4,47

10 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,75 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,43 (s, 3H); EM [M+H]+ m/z 436,2. Ejemplo 18: Éster de 2,2-Dimetil-propílico y éster de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)9H-purin-8-ilo del ácido carbónico (59)

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15 CDCl3) δ 7,43 (d, 2H), 7,25 (m, 3H), 4,99 (s, 2H), 4,47 (t, 2H), 4,08 (s, 2H), 3,75 (t, 2H), 3,42 (s, 3H), 1,07 (s, 9H); EM [M+H]+ m/z 430,2. Ejemplo 19: Éster heptílico y éster de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-8-ilo del ácido carbónico (60)

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CDCl3) δ 7,45 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,27 (m, 3H), 4,99 (s, 2H), 4,46 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 4,39 (t, J

= 7,2 Hz, 2H), 3,74 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,42 (s, 3H), 1,8 (m, 2H), 1,4 (m, 2H), 1,3 (m, 6H) 0,87

(t, J = 7,2 Hz, 3H); EM [M+H]+ m/z 458,3.

Ejemplo 20: Éster hexílico y éster de 6-amino-9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-8-ilo

del ácido carbónico (30)

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Rendimiento del 74% en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz,

10 CDCl3) δ 7,45 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 7,27 (m, 3H), 4,98 (s, 2H), 4,45 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 4,41 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 3,73 (t, J = 4,4 Hz, 2H), 3,42 (s, 3H), 1,81 (m, 2H), 1,34 (m, 2H), 1,31 (m, 2H), 1,26 (m, 2H), 0,89 (t, J = 2 Hz, 3H); EM [M+H]+ m/z 444,4. Los Ejemplos 22 y 23 se prepararon a partir de 9-bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-6ilamina, 62, a través de 9-bencil-8-bromo-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-6-ilamina, 63 y etóxido o

15 metóxido sódico, respectivamente, de acuerdo con los procedimientos de Kurimota y col., Bioorg. Med. Chem., 12, 1091-1099 (2004). Ejemplo 21: 9-Bencil-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-6-ilamina (62)

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Rendimiento del 100% en forma de un sólido de color pardo: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,59 (s, 1H), 7,27 (m, 5H), 5,83 (s, 2H), 5,26 (s, 2H), 4,49 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,75 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,43 (s, 3H); EM [M+H]+ m/z 300,2. Ejemplo 22: 9-Bencil-8-etoxi-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-6-ilamina (64)

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Rendimiento del 91% en forma de un sólido de color pardo: RMN de 1H (400 MHz, d6DMSO) δ 7,24 (m, 2H), 7,24 (m, 3H), 5,00 (s, 2H), 4,42 (m, 2H), 4,27 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,58 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,26 (s, 3H), 1,32 (t, J= 7,2 Hz, 3H); EM [M+H]+ m/z 344,1,

10 Ejemplo 23: 9-Bencil-8-metoxi-2-(2-metoxi-etoxi)-9H-purin-6-ilamina (65)

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Rendimiento del 91% en forma de un sólido de color pardo: RMN de 1H (400 MHz, d6DMSO) δ 7,28 (m, 2H), 7,22 (m, 3H), 6,86 (s, 2H), 5,01 (s, 2H), 4,26 (t, J = 4,4 Hz, 2H), 4,02 (s, 3H), 3,58 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,25 (s, 3H); EM [M+H]+ m/z 330,2.

15 Ejemplo 24: 7-Alil-2-Amino-9-(5'-O-L-valinil-imagen3 -D-ribofuranosil)-7,9-dihidro-1H-purin-6,8diona (68)

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Etapa 1: Preparación de 7-Alil-2-amino-9-(2',3'-O-isopropilideno-β-D-ribofuranosil)-7,9-dihidro1H-purin-6,8-diona (66)

El Compuesto 17 (0,17 g, 0,49 mmol) se disolvió en DMF (4,0 ml) y a la suspensión se le añadió acetona (3,0 ml). A la mezcla se le añadieron 2,2-dimetoxipropano (0,18 ml, 1,47 mmol) y MeSO3H (0,02 ml, 0,05 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 n y se inactivó con NaHCO3 acuoso saturado. Después, la fase acuosa se extrajo (4 x) con CH2Cl2. La fase orgánica combinada se secó (MgSO4), se filtró y se concentró al vacío, proporcionando 130 mg de 66 con un rendimiento del 70% en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) δ 5,97 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,93 (m, 1H), 5,34 (dd, J = 4,4, 2,0 Hz, 1H), 5,15 (m, 1H), 5,12 (dd, J = 7,6, 1,2 Hz, 1H), 4,98 (m, 1H), 4,52 (d, J = 5,6, 2H), 4,16 (m, 1H), 3,71 (m, 2H), 1,56 (s, 3H), 1,36 (s, 3H); EM EN-(+) [M+H]+ 380,0 m/z. Etapa 2: Preparación de 7-Alil-2-amino-9-(2',3'-O-isopropilideno-5'-N-terc-butoxicarbonil-Lvalinil)-β-D-ribofuranosil)-7,9-dihidro-1H-purin-6,8-diona (67)

Una mezcla de 66 (0,13 g, 0,34 mmol), BOC-Valina (0,08 g, 0,36 mmol), EDC (0,07 g, 0,38 mmol), DMAP (0,05 g, 0,38 mmol) en THF (8,0 ml) y piridina (0,8 ml) en una atmósfera de N2 se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Los disolventes se retiraron al vacío y el residuo se disolvió en EtOAc. La fase orgánica se lavó con NaHCO3 acuoso saturado y salmuera, se secó (MgSO4) y se filtró. El filtrado se concentró al vacío y se purificó por cromatografía ultrarrápida usando un gradiente del 2% al 5% de MeOH en CH2Cl2, dando 180 mg de 67 (91%) en forma de un sólido de color amarillo pálido: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 6,07 (s, 1H), 5,80 (m, 1H), 5,56 (s a, 2H), 5,41 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,15 (m, 3H), 4,97 (s a, 1H), 4,53 (s a, 2H), 4,46 (m, 1H), 4,32 (m, 2H), 4,20 (m, 1H), 2,11 (m, 1H), 1,56 (s, 3H), 1,44 (s, 9H), 1,36 (s, 3H), 0,93 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,84 (d, J = 6,8 Hz, 3H); EM EN-(+) [M]+ 578,9 m/z. Etapa 3: 7-Alil-2-Amino-9-(5'-O-L-valinil-β-D-ribofuranosil)-7,9-dihidro-1H-purin-6,8-diona (68)

A una solución de 67 (0,18 g, 0,311 mmol) en MeOH (10 ml) se le añadió AcCl (0,86 ml, 12,07 mmol) en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 18 h y después se neutralizó cuidadosamente con NaHCO3

acuoso saturado. A la mezcla se le añadió gel de sílice y se concentró al vacío. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida usando un gradiente del 10% al 20% de MeOH en CH2Cl2, dando 80 mg de 68 (59%) en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 6,72 (s a, 2H), 5,84 (m, 1H), 5,59 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,43 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,15 (s a, 1H), 5,07 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,0 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 4,77 (c, J = 4,8 Hz, 1H), 4,36 (m, 3H), 4,26 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,20 (m, 1H), 3,93 (m, 1H), 3,57 (s a, 1H), 2,01 (m, 1H), 0,86 (d, J = 4,4 Hz, 3H), 0,85 (d, J = 5,2 Hz, 3H); EM EN-(+) [M+H]+ 439,1 m/z. Ejemplo 25: 7-Alil-2-amino-9-β-D-ribofuranosil-6-(5-metil-2-oxo-[1,3]dioxol-4-ilmetoxi)-7,9dihidro-purin-8-ona (71)

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Etapa 1: Preparación de 7-Alil-2-amino-9-(2',3',5'-tris-O-trietilsilanil-β-D-ribofuranosil)-7,9dihidro-1H-purin-6,8-di-ona (69) A una solución de 17 (0,46 g, 1,36 mmol) e imidazol (0,93 g, 13,64 mol) en DMF (13 ml) se le añadió gota a gota cloro-trietilsilano (0,92 ml, 5,46 mmol) y se agitó a temperatura

15 ambiente durante 2,5 h. La mezcla de reacción se trató con NaHCO3 acuoso saturado y las dos fases resultantes se separaron. La fase acuosa se lavó con éter dietílico (2 x). Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron con agua, se secaron (MgSO4) y se concentraron después de la filtración. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida usando un gradiente del 2% al 10% de MeOH en CH2Cl2, dando 830 mg de 69 (89%) en forma de un

20 aceite de color amarillo pálido: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,92 (m, 1H), 5,85 (d, J= 6,8 Hz, 1H), 5,3 (m, 1H), 5,15-5,23 (m, 2H), 5,09 (s a, 2H), 4,54 (d, J= 4,4 Hz, 2H), 4,33 (m, 1H), 3,98 (m, 1H), 3,67-3,80 (m, 2H), 0,85-1,02 (m, 26H), 0,48-0,71 (m, 19H): EM EN-(+) [M]+ 682,6

m/z. Etapa 2: Preparación de 7-Alil-2-amino-9-(2',3',5'-tris-O-trietilsilanil-β-D-ribofuranosil)-6-(5-metil25 2-oxo-[1,3]dioxol-4-ilmetoxi)-7,9-dihidro-purin-8-ona (70)

De una manera similar a la Etapa 1 del Ejemplo 2, el compuesto 70 se preparó a partir

del compuesto 69 y 4-hidroximetil-5-metil-[1,3]dioxol-2-ona (preparada de acuerdo con el procedimiento de Alepegiani, Syn. Comm., 22(9), 1277-82 (1992)) con un rendimiento del 5% en forma de un sólido de color blanco después de la purificación por HPLC (columna Thomson ODS-A 100A 5u 50 x 21,2 mm; caudal = 30 ml/min; CH3CN con TFA al 0,05% (A), Agua con

5 TFA al 0,05% (B); Flujo de la bomba de preparación = 1,0 ml/min; Fase móvil de la bomba de preparación; MeOH con TFA al 0,05% usando un sistema de gradiente como se indica a continuación: t = 0; 50% de A, 50% de B; t = 2,0 min; 50% de A, 50% de B; t = 5,0 min; 100% de A, 0% de B; t = 9,5 min; 100% de A, 0% de B; t = 10,0 min; 50% de A, 50% de B; t = 13,0 min; 50% de A, 50% de B); EM EN-(+) [M]+ 794,1 m/z.

10 Etapa 3: Preparación de 7-Alil-2-amino-9-β-D-ribofuranosil-6-(5-metil-2-oxo-[1,3]dioxol-4ilmetoxi)-7,9-dihidro-purin-8-ona (71) A una solución de 70 (9,0 mg, 0,012 mmol) en MeOH (1,5 ml) se le añadió 3HFNEt3 (0,01 ml, 0,07 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. El disolvente se retiró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida. El producto deseado se eluyó con

15 un gradiente del 2% al 5% de MeOH en CH2Cl2, proporcionando 3,26 mg de 71 (64%) en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 5,96 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 5,85 (m, 1H), 5,17 (m, 4H), 4,96 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 4,47 (d, J= 6,0 Hz, 2H), 4,25 (J = 5,2 Hz, 1H), 4,24 (s, 1H), 3,81 (ABc, ΔυAB = 0,17, JAB = 11,6 Hz, 2H), 2,22 (s, 3H): EM EN-(+) [M+H]+ 452,4 m/z. Ejemplo 26: Éster etílico del ácido (7-alil-2-amino-9-imagen3 -D-ribofuranosil-8-oxo-8,9-dihidro

20 7H-purin-6-iloximetil)-metil-carbámico (73)

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Etapa 1: Preparación de Éster etílico del ácido (7-alil-2-amino-9-(2'3',5'-tris-O-trietilsilanil-β-Dribofuranosil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purin-6-iloximetil)-metil-carbámico (72)

De una manera similar a la Etapa 1 del Ejemplo 2, el compuesto 72 se preparó con un

25 rendimiento del 4% a partir del compuesto 69 y N-metil-N-(hidroximetil)uretano (Kelper, JOC, 52, 1987, p. 453-455) en forma de un sólido de color blanco después de la purificación por HPLC: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,94 (m, 1H), 5,82 (d, J= 6,4 Hz, 1H), 5,53 (s a, 1H), 5,23-5,29 (m, 2H), 5,15 (t, J= 9,6 Hz, 1H), 4,57 (d, J= 5,2 Hz, 2H), 4,35 (s a, 1H), 4,21 (m,

2H), 3,96 (s a, 1H), 3,73 (m, 2H), 3,06 (s, 3H), 1,30 (m, 4H), 0,87-1,01 (m, 24H), 0,57-0,68 (m, 19H): EM EN-(+) [M+H]+ 797,7 m/z. Etapa 2: Preparación de Éster etílico del ácido (7-alil-2-amino-9-β-D-ribofuranosil-8-oxo-8,9dihidro-7H-purin-6-iloximetil)-metil-carbámico (73)

5 De una manera similar a la Etapa 3 del Ejemplo 25 se preparó el compuesto del título 73 en un 64% en forma de un sólido de color blanco después de la purificación por HPLC (columna Thomson ODS-A 100A 5 µm 50 x 21,2 mm; caudal = 30 ml/min; CH3CN con TFA al 0,05% (A), Agua con TFA al 0,05% (B); Flujo de la bomba de preparación = 1,0 ml/min; Fase móvil de la bomba de preparación; MeOH con TFA al 0,05% usando un sistema de gradiente

10 como se indica a continuación: t = 0; 50% de A, 50% de B; t = 2,0 min; 50% de A, 50% de B; t = 5,0 min; 100% de A, 0% de B; t = 9,5 min; 100% de A, 0% de B; t = 10,0 min; 50% de A, 50% de B; t = 13,0 min; 50% de A, 50% de B). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,92 (m, 1H), 5,92 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 5,51 (m, 2H), 5,22 (d, J= 15,6 Hz, 1H), 5,16 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 4,92 (t, J= 7,2 Hz, 1H), 4,57 (d, J= 6,0, 2H), 4,40 (d, J= 6,0, 1H), 4,21 (m, 3H), 3,79 (ABc, ΔυAB = 0,178,

15 JAB = 14,0 Hz, 2H), 3,06 (s, 3H), 1,31 (t, J= 7,2 Hz, 3H): EM EN-(+) [M]+ 455,4 m/z. Ejemplo 27: Diclorhidrato de 5-amino-3-(5'-O-L-valinil-[3-D-ribofuranosil)tiazolo[4,5d]pirimidin-2,7-diona (24)

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Etapa 1: Preparación de 5-Amino-3-(2',3'-O-isopropilideno-β-D-ribofuranosil)tiazolo[4,520 d]pirimidin-2,7-diona (22)

A una mezcla heterogénea de 21 (5,37 g, 17,0 mmol, preparada de acuerdo con el procedimiento dado en la patente de Estados Unidos Nº 5.041.426 (Ejemplo 2), que se incorpora por referencia en su totalidad) en acetona (40 ml) contenida en un matraz Morton de 250 ml se le añadieron sucesivamente 2,2-DMP (6,26 ml, 50,9 mmol), DMSO (6,6 ml) y

25 MeSO3H (220 µl, 3,39 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó vigorosamente, volviéndose homogénea y de color amarillo dorado según se consumía el diol. El análisis por TLC (SiO2 MeOH al 10%-CHCl3) indicó que la reacción se había completado después de 6 h. Los sólidos no disueltos se retiraron por filtración por gravedad usando papel de filtro Whatman tipo 1 doblado en forma de zig-zag. Esto vertido fue seguido por vertido del filtrado en 10 volúmenes de agua enfriada con hielo (~400 ml), dando como resultado la inmediata precipitación de un sólido de color blanco. Después de un breve periodo de agitación, se añadió NaHCO3 (285 mg, 3,39 mmol) disuelto en agua (10 ml) para neutralizar el MeSO3H. la agitación vigorosa en el reactor Morton se continuó durante 15 min, después de lo cual la mezcla se filtró a través de un embudo de vidrio sinterizado grueso. El material sólido se lavó con agua enfriada con hielo (100 ml), se secó al aire y después se secó adicionalmente a alto vacío a 65ºC, proporcionando 5,36 g (88%) del acetónido 22 en forma de un sólido de color blanco: p.f. 280-81ºC; 1H (DMSO-d6) δ 1,28 (s, 3H), 1,47 (s, 3H), 3,43-3,55 (m, 2H), 3,953,99 (m, 1H), 4,77-4,80 (m, 1H), 4,88-4,91 (m, 1H), 5,24-5,26 (m, 1H), 5,99 (s, 1H), 6,97 (s a, 2H), 11,25 (s, 1H).

Etapa 2: Preparación de 5-Amino-3-(2',3'-O-isopropilideno -5'-N-terc-butoxicarbonil-L-valinil)-βD-ribofuranosil)-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2,7-diona (23)

A una solución de N-butoxicarbonil-(L)-valina (671 mg, 2,81 mmol) en THF (9 ml) a 0ºC se le añadió EDC (588 mg, 3,07 mmol). La mezcla homogénea resultante se agitó durante 45 min a 0ºC, momento en el que se volvió heterogénea, y se añadió en una porción el acetónido sólido 2 de la Etapa 1 anterior (1,00 g, 2,81 mmol). Posteriormente, se añadió DMAP sólido (522 mg, 4,27 mmol). Se dejó que la mezcla de reacción alcanzara la temperatura ambiente, y se agitó durante 5 h más, después de lo cual se concentró a 25ºC por evaporación rotatoria, dando un jarabe de color amarillo. El residuo se disolvió en EtOAc (50 ml) y se repartió con HCl 1 N (10 ml) seguido de neutralización del ácido con NaHCO3 acuoso saturado (10 ml). La fase acuosa ácida se extrajo adicionalmente con EtOAc (2 x 50 ml) y después se repartió con la fase acuosa básica. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron a través de un lecho corto de SiO2 y se concentraron, proporcionando 1,480 g (96%) del éster de aminoácido protegido con Boc 23 en forma de una espuma: p.f. 158ºC (desc.); 1H (CDCl3) δ 0,86 (d, J= 7,0, 3H), 0,95 (d, J = 7,0, 3H), 1,35 (s, 3H), 1,44 (s, 9H), 1,56 (s, 3H), 1,75 (s a, 1H), 2,08-2,19 (m, 1H), 4,20-4,24 (m, 2H), 4,30-4,37 (m, 1H), 4,56 (dd, J =11,0, 5,9, 1H), 4,96 (dd, J = 6,2, 3,7, 1H), 5,11 (d a, J = 8,8, 1H), 5,29 (d a, J= 6,6, 1H), 5,88 (s a, 2H), 6,23 (s, 1H). Etapa 3: Preparación de Diclorhidrato de 5-amino-3-(5'-O-L-valinil-β-D-ribofuranosil)tiazolo[4,5 d]pirimidin-2,7-diona (24)

Se pasó una corriente de gas HCl a través de un burbujeador de H2SO4 concentrado, y posteriormente se llevó (mediante un tubo de dispersión fritado) a un matraz Morton de 3 bocas y de 250 ml que contenía acetato de isopropilo seco (80 ml) a 0ºC hasta que se obtuvo una solución saturada. A esto se le añadió una solución del éster de Boc-aminoácido de la Etapa 2 anterior (5,53 g, 9,95 mmol) en acetato de isopropilo (30 ml), dando como resultado la

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formación de un precipitado sólido de color blanco en un intervalo de 5 min. A esto se le añadió IPA al 10% (v/v) (11 ml). La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y después se agitó durante 12 h. La mezcla de reacción heterogénea se diluyó con tolueno seco (100 ml). La filtración usando un embudo de vidrio sinterizado de poro medio en una atmósfera de N2 proporcionó un sólido amorfo de color blanquecino. La trituración del sólido en THF seco filtración y secado al vacío a 65ºC, proporcionando 3,677 g (81%) del compuesto del título 24 en forma de un sólido de color blanco: p.f. 166-68ºC (desc.); 1H (DMSO-d6) δ 0,90 (d, J= 7,0, 3H), 0,94 (d, J= 7,0, 3H), 2,14-2,18 (m, 1H), 3,83-3,85 (m, 1H), 3,96-4,00 (m, 1H), 4,23-4,28 (m, 2H), 4,42 (dd, J = 11,7, 3,4, 1H), 4,75 (dd, J= 10,3, 5,5, 1H), 5,81 (d, J= 4,4, 1H), 6,46 (s a, 3H), 7,23 (s a, 2H), 8,47 (s, 3H), 11,5 (s a, 1H). Análisis elemental para C15H21N5O7S • 2HCl: calc.: C, 36,89; H, 4,75; Cl, 14,52; N, 14,34; S, 6,57; encontrado: C, 37,03: H, 4,74; Cl, 14,26; N, 14,24; S, 6,42. Ejemplo 28: 5-Acetilamino-3-(2',3',5'-tri-O-acetil-P-D-ribofuranosil)tiazolo[4,5-d]pirimidin2,7(6H)-diona (74)

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Etapa 1: Preparación de 5-Acetilamino-3-(2',3',5'-tri-O-acetil-β-D-ribofuranosil)tiazolo[4,5d]pirimidin-2,7(6H)-diona (74)

El compuesto 21 anhidro (8,0 g, 39,5 mmol) se disolvió en piridina seca (65 ml). Se añadieron secuencialmente DMAP (3,1 g, 25,3 mmol) y anhídrido acético (19,1 ml 202,4 mmol). Se dejó que la reacción se desarrollara durante 2 h a temperatura ambiente, después de lo cual se interrumpió con NaHCO3 saturado (100 ml) y se extrajo con DCM (3 x 200 ml). La fase orgánica se concentró y después se trituró con éter. Esto proporcionó 12,5 g (103%) de 5acetilamino-3-(2,3,5-tri-O-acetil-β-D-ribofuranosil)tiazolo-[4,5-d]pirimidin-2,7(6H)-diona ligeramente impura en forma de un sólido de color blanco 74: p.f. 246,7-248,1ºC; Fr = 0,20 (SiO2, EtOAc al 50%-CHCl3); RMN de 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 12,23 (s, 1H), 11,85 (s, 1H), 5,97 (m, 2H), 5,48 (t, J = 6, 1H), 4,35-4,40 (m, 1H), 4,25-4,31 (m, 1H), 4,08-4,18 (m, 1H), 2,49 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 2,00 (s, 3H). Ejemplo 29: 5-Amino-3-(2',3',5'-tri-O-acetil-β-D-ribofuranosil)tiazolo[4,5-d]pirimidin2,7(6H)-diona (75)

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Etapa 1: Preparación de 5-Amino-3-(2',3',5'-tri-O-acetil-β-D-ribofuranosil)tiazolo[4,5-d]pirimidin2,7(6H)-diona (75) A una suspensión de 21 (5,00 g, 15,8 mmol) en acetonitrilo (160 ml) a 0ºC se le

5 añadieron sucesivamente Et3N (11,0 ml, 79,0 mmol), DMAP (195 mg, 1,59 mmol) y Ac2O (4,47 ml, 47,4 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, después de lo cual se concentró, dando un jarabe de color pardo. El residuo se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (sílice, MeOH/CHCl3 = 1-10%), proporcionando 6,22 g (89%) del triacetato 75 en forma de un sólido de color blanco: p.f. 198-199ºC; 1H (400 MHz, d6

10 DMSO) δ 11,34 (s, 1H), 7,02 (s a, 2H), 5,90 (m, 2H), 5,51 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,36 (dd, J = 12,4, 3,2 Hz, 1H), 4,21 (m, 1H), 4,08 (c, J = 6,0 Hz, 1H), 2,06 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,00 (s, 3H); EM EN-(+) [M+H]+ m/z 443,3. Ejemplo 30: 5-Amino-7-etoxi-3-β-D-ribofuranosil-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2-ona (77)

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15 Etapa 1: Preparación de 5-Acetilamino-7-etoxi-3-(2',3',5'-tri-O-acetil-β-D-ribofuranosil)tiazolo[4,5-d]pirimidin-2-ona (76) De una manera similar al Ejemplo 2, etapa 1, se preparó 76 a partir de 74 y etanol con un rendimiento del 72% en forma de una espuma de color blanco: EM EN-(+) [M+H]+ m/z 513, Fr = 0,45 (acetato de etilo al 75%-CHCl3).

20 Etapa 2: Preparación de 5-Amino-7-etoxi-3-β-D-ribofuranosil-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2-ona (77) De una manera similar al Ejemplo 2, etapa 2, el compuesto del título se preparó a partir de 76 con un rendimiento del 65% en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 6,87 (s, 2H), 5,85 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,27 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,96 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,78 (m, 1H), 4,66 (m, 1H), 4,36 (m, 2H), 4,09 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 3,58 (m, 1H),

3,40 (m, 1H), 1,29 (m, 3H); EM EN-(+) [M+H]+ m/z 445, [2M+H]+ m/z 689. Fr = 0,2 (50% THFCHCl3). Análisis Elemental para C12H16N4O6S-0,25 H2O: calc.: C, 41,31; H, 4,77; N, 16,06; S, 9,19. Encontrado: C, 41,24; H, 4,71; N, 15,89; S, 9,06. Ejemplo 31: 5-Amino-7-metoxi-3-β-D-ribofuranosil-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2-ona (79)

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Etapa 1: Preparación de 5-Acetilamino-7-metoxi-3-(2',3',5'-tri-O-acetil-β-D-ribofuranosil)tiazolo[4,5-d]pirimidin-2-ona (78) De una manera similar al Ejemplo 2, etapa 1, se preparó 77 a partir de 74 y metanol con un rendimiento del 65% en forma de una espuma de color blanco: EM EN-(+) [M+H]+ 499. 10 Fr = 0,5 (acetato de etilo al 75%-CHCl3). Etapa 2: Preparación de 5-Amino-7-metoxi-3-β-D-ribofuranosil-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2-ona (79)

De una manera similar al Ejemplo 2, etapa 2, el compuesto del título se preparó a partir de 78 con un rendimiento del 78% en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 6,91 (s, 2H), 5,86 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 5,28 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,96 (d, J =

15 5,2 Hz, 1H), 4,77 (m, 1H), 4,66 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,75 (m, 1H), 3,56 (m, 1H), 3,43 (m, 1H); EM EN-(+) [M+H]+ 331. Fr = 0,2 (50% THF=CHCl3). Análisis Elemental para C11H14N4O6S·0,25 H2O: calc.: C, 39,46; H, 4,37; N, 16,73; S, 9,58. Encontrado: C, 39,59; H, 4,17; N, 16,55; S, 9,52. Ejemplo 32: Éster etílico del ácido (5-amino-2-oxo-3-β-D-ribofuranosil-2,3-dihidro

20 tiazolo[4,5-d]pirimidin-7-iloximetil)-carbámico (82)

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Etapa 1: Preparación de 5-Amino-3-(2',3;,5'-tris-O-trietilsilanil-β-D-ribofuranosil)-tiazolo[4,5d]pirimidin-2,7-diona (80)

A una suspensión de 21 (1,00 g, 3,16 mmol) en DMF (20 ml) a temperatura ambiente se le añadieron sucesivamente imidazol (753 mg, 11,06 mmol), DMAP (39 mg, 0,32 mmol) y clorotrietilsilano (1,64 ml, 9,80 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, después de lo cual se interrumpió con una solución saturada de NaHCO3 (20 ml). La mezcla se extrajo con CHCl3 (3 x 20 ml), se secó sobre MgSO4 y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (sílice, MeOH/CHCl3 = 1-5%), proporcionando 1,91 g (92%) del compuesto 80 en forma de un sólido de color blanco: 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 5,99 (s, 1H), 5,62 (s a, 2H), 5,19 (dd, J= 4,4, 6,0 Hz, 1H), 4,35 (dd, J = 2,8, 4,4 Hz, 1H), 3,99 (m, 1H), 3,77 (dd, J= 7,6, 10,8 Hz, 1H), 3,68 (dd, J = 4,8, 10,4 Hz, 1H), 1,10 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 0,96 (t, J= 7,1 Hz, 3H), 0,89 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 0,68 (c, J = 7,1 Hz, 2H), 0,61 (c, J= 7,1 Hz, 2H), 0,54 (m, 2H); EM EN-(+) [M+H]+ m/z 660,0. Etapa 2: Preparación de Éster etílico del ácido 5-amino-3-(2',3',5'-tris-O-trietilsilanil-β-Dribofuranosil)-2,3-dihidro-tiazolo[4,5-d]pirimidin-7-iloximetil)-carbámico (81)

De una manera similar a la Etapa 1 del Ejemplo 2, el compuesto 81 se preparó a partir de 80 yN-etiluretano en forma de un sólido de color blanco con un rendimiento del 31%: [M+H]+ 760,5; RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 6,43 (s a, 2H), 6,09 (t, J= 7,6 Hz, 1H), 5,94 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,31 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 5,19 (dd, J = 6,0, 4,8 Hz, 1H), 4,35 (dd, J = 4,8, 2,8 Hz, 1H), 4,19 (c, J= 6,4 Hz, 2H), 3,98 (m, 1H), 3,76 (dd, J= 10,8, 7,6 Hz, 1H), 3,68 (dd, J= 10,4, 4,8 Hz, 1H), 1,29 (t, J= 6,8 Hz, 3H), 1,02 (t, J= 8,0 Hz, 3H), 0,96 (t, J= 7,6 Hz, 3H), 0,90 (t, J = 8,0 Hz, 3H), 0,69 (c, J= 8,0 Hz, 2H), 0,61 (c, J= 8,0 Hz, 2H), 0,55 (m, 2H); [M+H]+ 760,5. Etapa 3: Preparación de Éster etílico del ácido (5-amino-2-oxo-3-β-D-ribofuranosil-2,3-dihidrotiazolo[4,5-d]pirimidin-7-iloximetil)-carbámico (82)

Una solución de 81 (244 mg, 321 |mmol), HF 5 M en piridina (321 µl, 1,60 mmol) y THF (3,20 ml) se agitaron a temperatura ambiente durante 5 h. La retirada de los disolventes al vacío dejó un residuo que se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO2, MeOH al 10%CHCl3), proporcionando 82 (119 mg, 90%) en forma de un sólido de color blanco: RMN de 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 8,43, (s a, 1H), 7,76 (s a, 2H), 5,82 (d, J= 5,2 Hz, 1H), 5,78 (s, 2H), 5,32 (d, J= 5,6 Hz, 1H), 5,24 (dd, J= 6,0, 4,8 Hz, 1H), 5,00 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,82 (c, J= 5,6 Hz, 1H), 4,68 (t, J= 6,0, 1H), 4,11 (c, J= 5,2 Hz, 1H), 4,09 (c, J= 7,2 Hz, 2H), 3,78 (c, J= 5,6 Hz, 1H), 3,60 (m, 1H), 3,46 (m, 1H), 1,21 (t, J= 7,2 Hz, 3H); [M+H]+ 418,2. Ejemplo 33: Éster etílico del ácido (5-amino-2-oxo-3-imagen3 -D-ribofuranosil-2,3-dihidrotiazolo[4,5-d]pirimidin-7-iloximetil)-metil-carbámico (84)

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Etapa 1: Preparación de Éster etílico del ácido (5-amino-2-oxo-3-(2',3',5-tri-O-acetil-β-Dribofuranosil)-2,3-dihidro-tiazolo[4,5-d]pirimidin-7-iloximetil)-metil-carbámico (83) De una manera similar al Ejemplo 2, etapa 1, el compuesto 83 se preparó a partir de 75

5 y N-metil-N-(hidroximetil)uretano en forma de un sólido de color blanco con un rendimiento del 24%: Fr = 0,4 (EtOAc al 33%-CHCl3); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 11,49 (s a, 1H), 6,08 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,75 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 5,53 (s, 2H), 4,49 (dd, J = 13,5, 8,4 Hz, 1H), 4,30 (m, 5H), 3,62 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 2,30 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 1,36 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,20 (t, J = 6,8 Hz, 3H); [M+H]+ 614,2.

10 Etapa 2: Preparación de Éster etílico del ácido (5-amino-2-oxo-3-β-D-ribofuranosil-2,3-dihidrotiazolo[4,5-d]pirimidin-7-iloximetil)-metil-carbámico (84)

De una manera similar al Ejemplo 1, etapa 4, el compuesto del título se preparó a partir de 83 en forma de un sólido de color blanco con un rendimiento del 20%: RMN de 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 7,86 (s a, 2H), 5,82 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,47 (s, 2H), 5,31 (d, J = 5,2 Hz, 1H),

15 5,00 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,82 (c, J = 5,2 Hz, 1H), 4,67 (c, J = 5,6 Hz, 1H), 4,18 (c, J = 6,4 Hz, 2H), 4,12 (m, 1H), 3,78 (c, J = 6,0 Hz, 1H), 3,60 (m, 1H), 3,47 (m, 1H), 3,30 (s, 3H), 1,27 (t, J = 6,8 Hz, 3H); [M+H]+ 432,3. Ejemplo 34: 5-Amino-7-(5-metil-2-oxo-[1,3]dioxol-4-ilmetoxi)-3-(2',3',5'-tri-O-acetil-β-D

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Etapa 1: Preparación de 5-Amino-7-(5-metil-2-oxo-[1,3]dioxol-4-ilmetoxi)-3-(2',3',5'-tri-O-acetilβ-D-ribofuranosil)-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2-ona (85) A una solución del triacetato 75 (1,55 g, 3,50 mmol) en THF (50 ml) a 0ºC se le añadió trifenilfosfina soportada en polímero (4,95 g, 10,50 mmol, Argonaut). A esta mezcla se le

5 añadió 4-hidroximetil-5-metil-[1,3]dioxol-2-ona (0,91 g, 7,00 mmol), preparada de acuerdo con el procedimiento de Alepegiani, Syn. Comm., 22(9), 1277-82 (1992). Después, se añadió gota a gota azodicarboxilato de dietilo (0,73 ml, 4,60 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 48 h, se filtró y se lavó con MeOH y CHCl3. El filtrado se concentró y se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (sílice, acetona/CHCl3 = 10

10 20%), proporcionando el derivado de dioxolona 85 (1,38 g, 71%) en forma de un sólido de color blanco: 1H (400 MHz, d6-DMSO); δ 7,06 (s, 2H), 6,00 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,92 (dd, J = 6,6, 4,4 Hz, 1H), 5,56 (t, J = 6,4 Hz, 1H), 5,30 (s, 2H), 4,38 (dd, J = 11,6, 3,6 Hz, 1H), 4,25 (t, J = 3,6 Hz, 1H), 4,10 (c, J = 6,0 Hz, 1H), 2,23 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 2,00 (s, 3H); EM EN(+) [M+H]+ m/z 555,3. Análisis Elemental calc. para C21H22N4O12S·Me2CO: C, 47,06; H, 4,61; N,

15 9,15; S, 5,23. Encontrado: C, 47,25; H, 4,37; N, 9,53; S, 5,52. Ejemplo 35: 5-Amino-7-(5-metil-2-oxo-[1,3]dioxol-4-ilmetoxi)-3-β-D-ribofuranosiltiazolo[4,5-d]pirimidin-2-ona (87)

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Etapa 1: Preparación de 5-Amino-7-(5-metil-2-oxo-[1,3]dioxol-4-ilmetoxi)-3-(2',3',5'-tris-O20 trietilsilanil-β-D-ribofuranosil)-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2-ona (86)

De una manera similar al Ejemplo 34, el compuesto 86 se preparó a partir de 80 y 4hidroximetil-5-metil-[1,3]dioxol-2-ona en forma de un sólido de color blanco con un rendimiento del 45%: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 6,06 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,21 (dd, J = 6,0, 4,8 Hz, 1H), 5,18 (d, J = 3,2 Hz, 2H), 4,94 (s a, 2H), 4,38 (dd, J = 4,8, 2,8 Hz, 1H), 4,00 (m, 1H), 3,79 25 (dd, J = 11,2, 8,0 Hz, 1H), 3,69 (dd, J = 10,8, 5,2 Hz, 1H), 2,23 (s, 3H), 1,02 (t, J = 8,0 Hz, 3H), 0,96 (t, J = 7,6 Hz, 3H), 0,89 (t, J = 8,4 Hz, 3H), 0,70 (c, J = 7,6 Hz, 2H), 0,61 (c, J = 8,0 Hz,

2H), 0,53 (m, 2H); [M+H]+ 771,5.

Etapa 2: Preparación de 5-Amino-7-(5-metil-2-oxo-[1,3]dioxol-4-ilmetoxi)-3-β-D-ribofuranosiltiazolo[4,5-d]pirimidin-2-ona (87)

De una manera similar a la Etapa 3 del Ejemplo 32, el compuesto del título se preparó a partir de 86 en forma de un sólido de color blanco con un rendimiento del 89%: RMN de 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 7,03 (s a, 2H), 5,90 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 5,33 (s, 2H), 5,02 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,83 (c, J = 5,6 Hz, 1H), 4,71 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,14 (c, J = 5,2 Hz, 1H), 3,80 (c, J = 4,8 Hz, 1H), 3,62 (m, 1H), 3,47 (m, 1H), 2,27 (s, 3H); [M+H]+ 429,2.

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Etapa 1: Preparación de 5-Amino-7-tioxo-3-(2',3',5'-tri-O-acetil-β-D-ribofuranosil)-tiazolo[4,5d]pirimidin-2-ona (88) A una solución de 75 (1 g, 2,26 mmol) en piridina (50 ml) se le añadió a temperatura ambiente P2S5 (2,13 g, 4,79 mmol). La solución se calentó suavemente a reflujo (temperatura

15 del baño 130-140ºC) durante 29 h. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad al vacío. El exceso de P2S5 se descompuso mediante la adición de H2O (40 ml) a 60ºC. La mezcla se agitó durante 1 h a 60ºC y después se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla se extrajo con CHCl3 (3 x 40 ml). La fase orgánica secada (MgSO4) se evaporó, produciendo un jarabe, que se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (sílice, acetona/CHCl3 = 15%),

20 proporcionando 0,93 g (90%) de 88 en forma de un sólido de color amarillo: 1H (400 MHz, d6DMSO) δ 12,50 (s, 1H), 7,35 (s a, 2H), 5,89 (m, 2H), 5,51 (t, J= 6,4 Hz, 1H), 4,36 (dd, J= 12,0,4,0 Hz, 1H), 4,24 (m, 1H), 4,10 (c, J= 6,0 Hz, 1H), 2,07 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,01 (s, 3H); EM EN-(+) [M+H]+ m/z 459,3. Etapa 2: Preparación de 5-Amino-3-(2',3',5'-tri-O-acetil-β-D-ribofuranosil)-3H-tiazolo[4,5

25 d]pirimidin-2-ona (89)

Una suspensión de níquel Raney® 2800 (3 espátulas grandes, prelavada con H2O, MeOH y acetona) en acetona (50 ml) se agitó a la temperatura de reflujo durante 1 h. Posteriormente, a la suspensión anterior se le añadió el triacetato 88 (0,93 g, 2,03 mmol) a la temperatura de reflujo. La mezcla se agitó durante 5 min y se enfrió a temperatura ambiente

30 durante 30 min. La reacción se interrumpió burbujeando H2S (g) en la mezcla durante 2 h. La

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mezcla resultante se filtró a través de un lecho corto de Celite® y se lavó con EtOH. El filtrado se concentró y se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (sílice, MeOH/CHCl3 = 12%), proporcionando 0,52 g (60%) de 89 en forma de un sólido de color blanco: p.f. 121-123ºC; 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 8,38 (s, 1H), 6,93 (s, 2H), 6,03 (d, J= 3,6 Hz, 1H), 5,93 (dd, J= 6,4, 3,6 Hz, 1H), 5,58 (t, J= 6,0 Hz, 1H), 4,38 (dd, J= 11,6, 3,6 Hz, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,11 (c, J= 6,0 Hz, 1H), 2,08 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 2,00 (s, 3H); EM EN-(+) [M+H]+ m/z 427,2. Análisis Elemental calc. para C16H18N4O8S·0,5 CH3OH·0,25 H2O: C, 44,34; H, 4,62; N, 12,54; S 7,17. Encontrado: C, 44,54; H, 4,88; N, 12,16; S, 7,17. Etapa 3: Preparación de 5-Amino-3-β-D-ribofuranosil-3H-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2-ona (90)

A una solución de 89 (0,52 g, 1,22 mmol) en MeOH (20 ml) se le añadió K2CO3 (25 mg, 0,18 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche y después se neutralizó con AcOH (21 µl, 0,36 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 30 min más, se concentró y se trituró con H2O (2 ml), proporcionando 0,33 g del compuesto 90 (89%) en forma de un sólido de color blanco: p.f. 220ºC (Desc.); 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 8,34 (s, 1H), 6,85 (s, 2H), 5,90 (d, J= 4,8 Hz, 1H), 5,31 (d, J= 5,6 Hz, 1H), 4,98 (d, J= 5,6 Hz, 1H), 4,81 (c, J= 5,2 Hz, 1H), 4,67 (t, J= 6,0 Hz, 1H), 4,11 (c, J= 5,2 Hz, 1H), 3,77 (dd, J= 10,8, 4,8 Hz, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,44 (m, 1H); EM EN-(+) [M+H]+ m/z 301,1. Análisis Elemental calc. para C10H12N4O5S·0,3 H2O: C, 39,29; H, 4,15; N, 18,33; S 10,49. Encontrado: C, 39,51; H, 4,18; N, 17,95; S, 10,27. Ejemplo 37: 5-Amino-3-(2',3'-di-O-acetil-B-D-ribofuranosil)-3H-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2ona (93)

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Etapa 1: Preparación de 5-Amino-3-(5'-O-terc-butil-dimetilsilanil-β-D-ribofuranosil)-3H tiazolo[4, 5-d]pirimidin-2-ona (91)

A una solución de 90 (0,68 g, 2,28 mmol) en DMF (10 ml) se le añadieron secuencialmente imidazol (0,54 g, 7,93 mmol) y cloruro de terc-butildimetilsililo (0,68 g, 4,56 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, momento en el que se concentró y se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (sílice, MeOH/CHCl3; gradiente = 5-20%), proporcionando 0,49 g (52%) de 91 en forma de un sólido de color blanco: 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 8,33 (s, 1H), 6,87 (s, 2H), 5,90 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,33 (d, J = 5,6

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Hz, 1H), 5,00 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,79 (c, J = 5,2 Hz, 1H), 4,16 (c, J = 5,2 Hz, 1H), 3,77 (m, 2H), 3,64 (dd, J = 12,0, 7,2 Hz, 1H), 0,84 (s, 9H), 0,00 (s, 6H); EM EN-(+) [M+H]+ m/z 415,4. Etapa 2: Preparación de 5-Amino-3-(2',3'-di-O-acetilo, 5'-O-terc-butil-dimetilsilanil-β-Dribofuranosil)-3H-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2-ona (92)

A una solución de 91 (0,20 g, 0,48 mmol) en acetonitrilo (5 ml) a 0ºC se le añadieron sucesivamente Et3N (0,26 ml, 1,86 mmol) y Ac2O (91 µl, 0,96 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h, después de lo cual se concentró y se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (sílice, acetona/CHCl3: gradiente = 5-10%), proporcionando 0,22 g (92%) de 92 en forma de un sólido de color blanco: 1H (400 MHz, d6DMSO) δ 8,36 (s, 1H), 6,90 (s, 2H), 6,00 (m, 2H), 5,57 (t, J= 6,0 Hz, 1H), 4,07 (c, J= 5,2 Hz, 1H), 3,77 (m, 2H), 2,07 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 0,83 (s, 9H), 0,00 (d, J= 2,4 Hz, 6H); EM EN-(+) [M+H]+ m/z 499,5. Etapa 3: Preparación de 5-Amino-3-(2',3'-di-O-acetil-β-D-ribofuranosil)-3H-tiazolo[4,5d]pirimidin-2-ona (93)

A una solución de 92 (0,22 g, 0,44 mmol) en THF (5 ml) en un vial de plástico se le añadió HF/piridina (0,70 ml). La reacción se agitó durante 2 h, se concentró y se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (sílice, MeOH/CHCl3: gradiente = 5-10%), proporcionando 0,17 g (100%) del compuesto del título en forma de un sólido de color blanco:

p.f. 109-111ºC; 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 8,37 (s, 1H), 6,91 (s, 2H), 6,00 (m, 2H), 5,48 (t, J= 6,0 Hz, 1H), 4,91 (t, J= 6,0 Hz, 1H), 4,04 (dd, J= 10,4, 6,0 Hz, 1H), 3,64 (m, 1H), 3,52 (m, 1H), 2,08 (s, 3H), 2,05 (s, 3H); EM EN-(+) [M+H]+ m/z 385,3. Análisis Elemental calc. para C14H16N4O7S·0,5 CH3OH·0,2 CHCl3: C, 41,61; H, 4,32; N, 13,21; S 7,56: Encontrado: C, 41,73; H, 4,29; N, 12,86; S, 7,33. Ejemplo 38: Éster etílico del ácido [2-etoximetil-1-(2-hidroxi-2-metil-propil)-1Himidazo[4,5-c]quinolin-4-il]-carbámico (39)

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Etapa 1: Preparación de [2-Etoximetil-1-(2-hidroxi-2-metil-propil)-1H-imidazo[4,5

De una manera similar a la etapa 1 del Ejemplo 8, con la excepción de que se sustituyó MeOH como disolvente, se preparó el compuesto del título a partir de 1-(4-amino-2-etoximetilimidazo[4,5-c]quinolin-1-il)-2-metil-propan-2-ol (38) (preparado de acuerdo con el procedimiento dado en la Publicación Internacional Nº: WO 94/17043) y pirocarbonato de dietilo en forma de un aceite con un rendimiento del 39%: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,36 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,70 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,61 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 4,96 (s a, 2H), 4,80 (s, 2H), 4,39 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 3,62 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 1,40 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,36 (s a, 6H), 1,24 (t, J = 6,8 Hz, 3H); EM EN-(+) [M+H]+ 387,4 m/z.

6.4 Efecto de Enmascarado del Profármaco de Ligando de TRL7

Un experimento típico usaría células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas aisladas de un donante sano y colocadas en pocillos de cultivo celular por duplicado; típicamente, se ponen 2x106 a 5x106 células en cada pocillo. Las CMSP se incuban en ausencia de compuestos de ensayo a 37ºC en una atmósfera humidificada que contiene un 5% de CO2 durante 24 horas para permitir la estabilización en las condiciones de cultivo, y después se añaden isatoribina 100 micromolar, el ligando de TLR7 y un profármaco de ligando de TLR7 correspondiente a pocillos separados que contienen CMSP del mismo donante; y se incluyen controles sin tratar. Las concentraciones de ligando de TLR7 y profármaco de ligando de TLR7 pueden variarse para adecuarse al experimento particular, y los cultivos de CMSP después se incuban a 37ºC en una atmósfera humidificada que contiene un 5% de CO2 durante un periodo de tiempo que varía de dos horas a 48 horas. Se toman muestras de medio de sobrenadante de cultivo celular durante la incubación. Estas se ensayan con respecto a la producción de citocinas por ELISA. Además, la cantidad de ligando de TLR7 y profármaco de ligando de TRL7 que queda al final de la incubación puede ensayarse por CL-EM. La producción de citocinas se calcula con respecto a la producción en el control de isatoribina, después de restar la producción de citocinas en controles no tratados. Los resultados de citocinas se comparan para determinar el grado en el que el ligando de TLR7 es más activo que el profármaco de ligando de TRL7 correspondiente.

De esta manera, si el ligando de TLR7 genera más interferón alfa (una citocina medida convenientemente) que el profármaco de ligando de TRL7 correspondiente después de una duración similar de exposición y concentración, el profármaco de ligando de TRL7 puede considerarse un profármaco de ligando de TRL7 “enmascarado”. La magnitud de reducción en la producción de citocinas que constituye el “enmascarado” puede ser tan pequeña como una reducción del 25% con respecto al TLR parental, ya que esto produciría un aumento correspondiente en dosis administrada para un nivel de tolerancia dado.

Las Tablas 9 a 14 proporcionan datos que ilustran que ligandos de TRL7 de múltiples clases químicas pueden enmascararse. Los ejemplos mostrados demuestran el enmascarado sustancial con respecto al ligando de TRL7 parental. Las sustituciones químicas mostradas son ilustrativas y de ninguna forma restrictivas de la invención, ya que otras sustituciones químicas adicionales también pueden presentar enmascarado y se contemplan en la invención. El enmascarado puede conseguirse por introducción de sustituciones en un intervalo de localizaciones en cualquier ligando de TRL7, y como se muestra puede incorporar una diversidad de enlaces químicos. Se apreciará que la sustitución y el enlace preferido pueden variar para diferentes ligandos de TRL7 parentales.

Tabla 9: Enmascarado de Profármacos de Isatoribina

Molécula parental y sus profármacos: Compuesto Nº Cantidad de INFa con respecto a la inducida por isatoribina a 100 µM, %

Molécula parental: Isatoribina Profármaco: éster de aminoácido Profármaco: Desoxi Profármaco: 6-Etoxi Profármaco: 6-Metoxi Profármaco: Aminal Profármaco: Aminal Profármaco: Dioxolenona: 21 24 93 77 79 84 82 85 100 1 0 0 0 0 0 0

La propiedad enmascarada de los profármacos de isatoribina puede demostrarse en un

ensayo de CMSP. Los resultados del ensayo de CMSP (Tabla 9) muestran la cantidad de INFa

liberado después de la exposición del compuesto parental y sus profármacos durante 8 horas

10 (val-isatoribina, 24) o 24 horas (otros profármacos) a la concentración inicial de 100 µM. La cantidad de INFa liberado se normalizó con respecto a la inducida por una concentración 100 µM de isotiribina a 100 µM en el mismo donante de sangre con el mismo tiempo de exposición. Tabla 10: Enmascarado de Profármacos de Loxoribina

Molécula parental: Loxoribina Profármaco: 6-Etoxi Profármaco: Desoxi Profármaco: Éster valílico: 17 45 43 68 50 0 0 0

La propiedad enmascarada de los profármacos de loxoribina puede demostrarse en un

15 ensayo de CMSP. Los resultados del ensayo de CMSP (Tabla 10) muestran la cantidad de INFa liberado después de la exposición del compuesto parental y sus profármacos durante 24 horas a la concentración inicial de 100 µM. La cantidad de INFa liberado se normalizó con respecto a la inducida por una concentración 100 µM de isotiribina a 100 µM en el mismo donante de sangre con el mismo tiempo de exposición.

Tabla 11: Enmascarado de Profármacos de Imiquimod

Molécula parental: Imiquimod Profármaco: Carbamato de pentilo Profármaco: Carbamato de etilo: 31 34 50 60-76* 0 0

Resultados de dos experimentos con tres donantes diferentes.

5 La propiedad enmascarada de los profármacos de imiquimod puede demostrarse en un ensayo de CMSP. Los resultados del ensayo de CMSP (Tabla 11) muestran la cantidad de INFa liberado después de la exposición del compuesto parental y sus profármacos durante 24 horas a la concentración inicial de 100 µM. La cantidad de INFa liberado se normalizó con respecto a la inducida por una concentración 100 µM de isotiribina a 100 µM en el mismo

10 donante de sangre con el mismo tiempo de exposición. Tabla 12: Enmascarado de Profármacos de Resiquimod

Molécula parental: Resiquimod Profármaco: Carbamato de etilo: 39 38 95 a 1 µM 9 a 100 µM

La propiedad enmascarada de los profármacos de resiquimob puede demostrarse en

un ensayo de CMSP. Los resultados del ensayo de CMSP (Tabla 11) muestran la cantidad de

INFa liberado después de la exposición del compuesto parental y sus profármacos durante 24

15 horas a la concentración inicial de 100 µM. La cantidad de INFa liberado se normalizó con respecto a la inducida por una concentración 100 µM de isatoribina a 100 µM en el mismo donante de sangre con el mismo tiempo de exposición.

Molécula parental: Bropirimina Profármaco: Desoxi Profármaco: Etoxi Profármaco: Carbamato de etilo Profármaco: Carbamato de pentilo: 35 48 37 36 49 22 0 0 0 0

La propiedad enmascarada de los profármacos de bropirimina puede demostrarse en un ensayo de CMSP. Los resultados del ensayo de CMSP (Tabla 13) muestran la cantidad de INFa liberado después de la exposición del compuesto parental y sus profármacos durante 24 horas a la concentración inicial de 100 µM. La cantidad de INFa liberado se normalizó con respecto a la inducida por una concentración 100 µM de isatoribina a 100 µM en el mismo donante de sangre con el mismo tiempo de exposición.

Tabla 14: Enmascarado de Profármacos de Adenina

Molécula parental Profármaco: Metoxi Profármaco: Etoxi Profármaco: Desoxi Profármaco: Carbonato de etilo Profármaco: Carbonato de pentilo: 29 65 64 62 51 54 128 a 0,1 µM 0 a 100 µM 0 a 10 µM 0 a 0,1 µM 18 a 32 µM 15 a 10 µM

La propiedad enmascarada de los profármacos de adenina puede demostrarse en un

10 ensayo de CMSP. Los resultados del ensayo de CMSP (Tabla 14) muestran la cantidad de INFa liberado después de la exposición del compuesto parental y sus profármacos durante 24 horas a la concentración inicial de 100 µM. La cantidad de INFa liberado se normalizó con respecto a la inducida por una concentración 100 µM de isatoribina a 100 µM en el mismo donante de sangre con el mismo tiempo de exposición.

15 Los profármacos de ligando de TLR7 también pueden ensayarse in vitro con respecto a su conversión en el ligando de TLR7 parental activo. Esto puede medirse por incubación del profármaco en sangre, plasma o en un cultivo celular de hepatocitos. A intervalos de tiempo seleccionados, se toman muestras para determinar la cantidad de profármaco que queda y la cantidad de ligando de TLR7 producido. Estas determinaciones se realizan fácilmente mediante el uso de herramientas analíticas conocidas en la técnica tales como CL-EM. La determinación del grado de conversión de un profármaco de ligando de TLR7 enmascarado en el ligando de TLR7 parental es útil para interpretar datos en los que el enmascarado es evidente a tiempos más cortos pero disminuye después de largas incubaciones en el ensayo de PBMC descrito en el presente documento. La velocidad de conversión del profármaco en el ligando de TRL7 puede determinarse para asegurar que los resultados de citocinas se producen predominantemente por la exposición al profármaco en lugar de por la exposición al ligando de TRL7 generado por conversión rápida del profármaco en las condiciones del experimento.

6.5 Ensayos Biológicos de Profármacos de Ligando de TLR7 que Demuestran una Mayor Disponibilidad Oral y Menos Efectos Secundarios Disponibilidad Oral

La biodisponibilidad mejorada de profármacos de ligando de TLR7 puede evaluarse realizando estudios in vivo. En estos experimentos, los profármacos candidatos se administran por administración oral a ratones, ratas, monos y/o perros, y se toman muestras de sangre a intervalos seleccionados. Las muestras de sangre se analizan tanto con respecto al profármaco como con respecto al ligando de TLR7 deseado. Pueden analizarse muestras adicionales de sangre o hígado con respecto a la presencia de interferones y otras citocinas que indican activación funcional de la ruta de TLR7 in vivo. Los candidatos deseados demostrarán una exposición de la sangre al profármaco y también demostrarán un exposición de la sangre al ligando de TLR7 deseado de aproximadamente un 10% a un 90% de la dosis aplicada, medido en una base molar.

Un ejemplo representativo es el resultado obtenido con el profármaco de ligando de TLR7 val-isatoribina (24), que como se describe más adelante en el ratón y perro generaba cantidades significativas del ligando de TRL7 parental isatoribina (21) en la sangre. Véase la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/305,061 (incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad)

imagen1

Concentraciones de Interferón Alfa (Mu-IFN-α) en Ratones El ratón normal proporciona un sistema útil para la evaluación del grado en el que las invenciones descritas en el presente documento proporcionan mejora de material en el

5 suministro oral de 21 (isatoribina). No sólo se pueden medir las concentraciones plasmáticas de isatoribina procedentes de la administración oral de dicho profármaco (o profármacos), sino también la investigación inmunológica extensiva realizada en el ratón que ha proporcionado reactivos adecuados para medir los niveles de interferón alfa, una citocina de interés que refleja una de las actividades biológicas deseadas de la isatoribina.

10 Los presentes solicitantes han usado el sistema murino en una serie de experimentos que demuestran que 24, el éster de 5’ valina de 21 (val-isatoribina) induce una respuesta de interferón sustancialmente mejorada con respecto a la resultante de la administración de la propia isatoribina.

La Tabla 15 registra los resultados de un ensayo con respecto al interferón alfa murino

15 en el plasma de ratones que se dosificaron dos veces con isatoribina, formulada en bicarbonato, a un nivel de 50 mg/kg por vía oral. Es evidente que no pudo medirse interferón incluso cuando la dosis se repitió después de un intervalo de cuatro horas. Tabla 15: Concentración Plasmática de Interferón Alfa (Mu-IFN-α) (pg/ml) en Ratones Después

de Dos Dosis Orales de 50 mg/kg de Isatoribina Administradas Separadas por 4 horas

20

Tiempo, h Valor Individual Media DT

Primera Dosis

0,00 BQL50 BQL125 BQL50 0,00 0,00 0,03 BQL25 BQL250 BQL25 0,00 0,00 0,08 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00 0,25 BQL50 BQL25 BQL25 0,00 0,00 0,50 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00 1,00 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00

Tiempo, h Valor Individual Media DT

1,50 BQL100 BQL25 BQL25 0,00 0,00 2,00 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00 3,00 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00 4,00 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00

Segunda Dosis

4,03 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00 4,08 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00 4,25 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00

BQL37,5

4,50 BQL50 BQL50 0,00 0,00

5,00 BQL50 BQL50 BQL50 0,00 0,00 BQ37,5 BQL37,5 BQL37,5

5,50 0,00 0,00 BQL41,3 BQL37,5

6,00 BQL50 0,00 0,00 7,00 BQL50 BQL50 BQL50 0,00 0,00 8,00 BQL50 BQL25 BQL50 0,00 0,00

BQLn – Por Debajo del Límite Cuantificable Elevado < n

imagen6

el plasma de ratones que primero se dosificaron con bicarbonato y después, cuatro horas más tarde se dosificaron por vía oral con isatoribina, formulada en bicarbonato, a un nivel de 50 mg/kg. El interferón se presentó en el plasma de cuatro ratones, incluyendo dos que habían

5 recibido la dosis de vehículo de bicarbonato. Todos los valores indicados en este experimento eran bajos y los niveles de interferón indicados no se presentaron sistemáticamente para los tres ratones evaluados en cada momento, lo que sugiere que estas señales pueden ser artefactos debidos a la medición cerca de los límites inferiores del ensayo. Tabla 16: Concentración en Plasma de Interferón Alfa (Mu-IFN-α) (pg/ml) en Ratones Después

10 de Una Dosis de Vehículo y Una Dosis de 50 mg/kg de Isatoribina 4 horas Después

Tiempo, h Valor Individual Media DT

Primera Dosis

BQL100 BQL62,5

0,00 BQL50 0,00 0,00 BQL37,5

0,03 BQL50 BQL50 0,00 0,00 0,08 BQL50 BQL50 BQL50 0,00 0,00

Tiempo, h Valor Individual Media DT

BQL62,5

0,25 BQL50 BQL50 0,00 0,00 0,50 BQL50 BQL50 BQL50 0,00 0,00 1,00 BQL50 BQL50 BQL100 0,00 0,00 1,50 BQL50 BQL100 BQL50 0,00 0,00 2,00 34,9 BQL25 BQL25 11,6 20,15 3,00 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00 4,00 BQL25 35m4 BQL100 11,8 20,44

Segunda Dosis

4,03 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00 4,08 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00 4,25 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00 4,50 BQL100 BQL25 133,2 44,4 76,90 5,00 74,9 BQL50 NR 37,5 52,96 5,50 BQL250 BQL75 BQL25 0,00 0,00 6,00 BQL25 BQL75 BQL75 0,00 0,00 7,00 BQL50 BQL50 BQL25 0,00 0,00 8,00 BQL25 BQL25 BQL25 0,00 0,00

BQLn -Por Debajo del Límite Cuantificable Elevado < n pg/ml. NR – No reseñable

La Tabla 17 registra los resultados de ensayos con respecto al interferón alfa murino en el plasma de ratones que se dosificaron por vía oral con val-isatoribina, disuelta en bicarbonato, a una dosis que es equivalente a 50 mg/kg de isatoribina en una base molar. Es evidente que el interferón ya podía medirse fácilmente a 1,0 horas, 1,5 horas y 2,0 horas

5 después de la dosificación. Se detectó interferón en todos los ratones ensayados en un momento dado, lo que indica la fiabilidad del efecto después de la administración de valisatoribina. De esta manera, una sola administración de val-isatoribina fue superior a una sola dosis o a una dosis repetida de isatoribina.

Tabla 17: Concentración Plasmática (pg/ml) de Interferón Alfa (Mu-IFN-α) en Ratones Después de Una Sola Dosis de 73,0 mg/kg de Val-Isatoribina

Tiempo, h Valor Individual Media DT

0,00 BQL BQL125 BQL25 0,00 0,00 0,25 BQL BQL BQL 0,00 0,00 0,50 BQL25 BQL25 BQL 0,00 0,00 0,75 BQL BQL BQL25 0,00 0,00 1,00 173,2 125,1 89,0 129,1 42,24 1,50 202,9 145,9 294,8 214,5 75,13 2,00 49,2 137,9 138,3 108,5 51,33 3,00 BQL25 NR NR 0,00 0,00 4,00 BQL25 27,6 BQL 9,20 15,90 5,00 BQL BQL25 BQL25 0,00 0,00

BQL – Por Debajo del Límite Cuantificable < 12,5 pg/ml BQLn – Por Debajo del Límite Cuantificable Elevado < n pg/ml NR – No Reseñable

imagen7

punto de vista de la incidencia de los niveles de interferón que pueden medirse. Se detectó

5 interferón en el plasma de sólo 4 de los 114 ratones usados en los estudios de isatoribina, mientras que en 10 de los 30 ratones que recibieron val-isatoribina se detectó interferón en su plasma. De esta manera, el profármaco aumentó la proporción de ratones que presentaban una respuesta de interferón del 4% al 30% y la magnitud de la respuesta media y máxima se aumentó dos veces (100%).

10 En otros experimentos, se midieron los niveles plasmáticos de isatoribina e interferón alfa en ratones que se dosificaron con isatoribina por vía intravenosa, y estos niveles se compararon con los niveles de isatoribina e interferón alfa que se produjeron después de la administración oral de val-isatoribina. Estos datos se resumen en la Figura 1. En esta Figura es evidente que los niveles de interferón alfa inducidos por val-isatoribina oral (“val-isator”) (a 50

15 mg/kg de equivalente molar de isatoribina) fueron similares a los de la isatoribina intravenosa (“isator”) a 25 mg/kg. De esta manera, la val-isatoribina oral proporciona niveles de isatoribina e interferón que son aproximadamente un 50% de los observados después de la administración intravenosa de la propia isatoribina.

Perro Sabueso

Se investigó el efecto de un profármaco (val-isatoribina, 24) sobre la exposición sistémica a isatoribina (21) después de la administración oral en perros sabuesos. Se preparó isatoribina en solución de bicarbonato sódico. La val-isatoribina e isatoribina se prepararon como las siguientes formulaciones, que se eligieron para asegurar la solubilidad:

Formulación 1: Isatoribina en solución de bicarbonato sódico 1 y 4 mg/ml.

Formulación 2: Val-isatoribina en solución salina tamponada con fosfato, 1,62 y 6,48 mg/ml, equivalente a 1 y 4 mg/ml de isatoribina en una base molar.

Al principio del estudio se usaron cuatro perros sabuesos adultos machos y cuatro hembras que pesaban entre 15 y 27 kg de aproximadamente 1-2 años de edad. Los animales se dividieron en 2 grupos de 2 machos y 2 hembras cada uno. El material de ensayo se administró por medio de una sonda los Días 1 y 8, dejando un periodo de eliminación de 7 días entre las administraciones. Se recogieron muestras de sangre (2 ml) de cada animal antes de la dosis, 15, 30 minutos, 1, 2, 3, 4, 6, 8 y 10 horas en tubos con heparina de litio después de cada dosificación. El plasma se congeló a -70ºC hasta el análisis. El plasma se analizó con respecto al contenido de isatoribina por un ensayo de HPLC-EM/EM.

Los parámetros farmacocinéticos para la isatoribina procedente de isatoribina o valisatoribina en cada perro se resumen en las Tablas 18 y 19. Las relaciones para los parámetros farmacocinéticos clave que definen la concentración máxima (Cmax) y la exposición total medida por el área bajo la curva de tiempo-concentración (AUC) para el profármaco y la solución de bicarbonato a la dosis de 50mg/kg se resumen en la Tabla 20. Para el Profármaco 24, la relación de Cmax fue 2,98 ± 0,695 y la relación del AUC 2,38 ± 0,485. Estos resultados indican que a una dosis de 50 mg/kg, el profármaco val-isatoribina proporcionaba una Cmax sustancialmente mayor y mayor biodisponibilidad que la isatoribina en solución bicarbonato.

Las relaciones para la Cmax y el AUC para el Profármaco con respecto a la solución de bicarbonato para la dosis de 10 mg/kg se resumen en la Tabla 21. Para el profármaco, la relación de Cmax fue de 2,24 ± 0,249 y la relación del AUC fue de 1,82 ± 0,529. Estos resultados indican que a la dosis de 10 mg/kg, el profármaco val-isatoribina proporcionó mayor Cmax y mayor biodisponibilidad que isatorbina en solución bicarbonato.

De esta manera, las máximas concentraciones de isatoribina conseguidas después de la dosificación oral al menos se duplican, y la exposición sistémica a isatoribina se aumenta aproximadamente dos veces después de la administración oral del profármaco val-isatoribina en comparación con la propia isatoribina, tanto a una dosis de 10 como a una dosis de 50 mg/kg.

Tabla 18: Parámetros Farmacocinéticos de Isatoribina en Perros dosificados a 50 mg/kg Periodo de Dosificación

Formulación: Isatoribina Val-isatoribina

Número de Animal: Dosis, mg/kg de equivalente molar de isatoribina 50 50

Perro 3517322 Cmax, ng/ml 3038,7 11741,5 Tmax, h 0,50 0,50 AUC(0-inf), 15227,0 33038,1 ng⋅h/ml T1/2, h 6,4 2,4

Perro 3521451 Cmax, ng/ml 3354,0 10652,1 Tmax, h 1,00 1,00 AUC(0-inf), ng⋅h/ml 9422,2 26552,7 T1/2, h 1,9 1,6

Perro 3528707 Cmax, ng/ml 8915,3 20340,6 Tmax, h 0,50 0,50 AUC(0-inf), ng⋅h/ml 29701,7 53273,0 T1/2, h 2,2 2,3

Perro 3532828 Cmax, ng/ml 6134,7 15987,9 Tmax, h 0,50 0,50 AUC(0-inf), ng⋅h/ml 12069,7 32987,0 imagen1 T1/2, h 1,4 1,6

Tabla 19: Parámetros Farmacocinéticos de Isatoribina en Perros Dosificados a 50 mg/kg Periodo de 1 2 Dosificación

Formulación: Isatoribina Val-isatoribina

Número de Animal: Dosis, mg/kg de equivalente molar de isatoribina 10 10

Perro 3524523: Cmax, ng/ml 4091,5 8594,6

108

Número de Animal: Periodo de Dosificación Formulación Dosis, mg/kg de equivalente molar de isatoribina 1 Isatoribina 10 2 Val-isatoribina 10

Tmax, h 1,00 0,50 AUC(0-inf), ng⋅h/ml 13305,8 17166,2 T1/2, h 2,1 1,7 Perro 3526402 Cmax, ng/ml 1859,5 4047,0 Tmax, h 1,00 1,00 AUC(0-inf), ng⋅h/ml 5774,4 10548,9 T1/2, h 1,6 2,2 Perro 357450 Cmax, ng/ml 1620,3 4228,7 Tmax, h 0,50 1,00 AUC(0-inf), ng⋅h/ml 4387,3 11158,0 T1/2, h 1,5 2,3 Perro 354708 Cmax, ng/ml 2781,2 5784,8 Tmax, h 0,50 0,50 AUC(0-inf), ng⋅h/ml 7522,1 12259,1 imagen1 T1/2, h 1,6 2,0

Tabla 20: Relación de Parámetros Farmacocinéticos de Isatoribina en Perros Dosificados a 50 mg/kg

Formulación Isatoribina Val-isatoribina

Número de Animal

Perro 3517322: Relación de Cmax 1,00 3,86

Relación del AUC: 1,00 2,17

Perro 3521451: Relación de Cmax 1,00 3,18

Relación del AUC: 1,00 2,82

Perro 3528707: Relación de Cmax 1,00 2,28

Relación del AUC: 1,00 1,79

Perro 3532828: Relación de Cmax 1,00 2,61

Relación del AUC: 1,00 2,73

Media de Relación de: N/A 2,98

Número de Animal

Formulación: Isatoribina Val-isatoribina

Cmax DT de Relación de Cmax Media de Relación del AUC DT de Relación del: N/A N/A N/A 0,695 2,38 0,485

imagen8

Tabla 21: Relación de Parámetros Farmacocinéticos de Isatoribina en Perros Dosificados a 10 mg/kg

Formulación Isatoribina Val-isatoribina

Número de Animal

Perro 3517322: Relación de Cmax 1,00 2,10

Relación del AUC: 1,00 1,29

Perro 3521451: Relación de Cmax 1,00 2,18

Relación del AUC: 1,00 2,20

Perro 3528707: Relación de Cmax 1,00 2,61

Relación del AUC: 1,00 2,54

Perro 3532828: Relación de Cmax 1,00 2,08

Relación del AUC: 1,00 1,63

Media de Relación de Cmax: N/A 2,24

DT de Relación de Cmax: N/A 0,249

Media de Relación del AUC: N/A 1,82

imagen1: DT de Relación del N/A 0,529

imagen9

profármaco se formula fácilmente para proporcionar una alta proporción de agente activo. Esto tiene como resultado cápsulas de pequeño tamaño para una dosis dada, que es una ventaja para el producto oral. En segundo lugar, a las dosis ensayadas, la val-isotarbina proporciona niveles plasmáticos de isatoribina que están bien dentro del intervalo deseable para el efecto

biológico después de la administración oral, que no es el caso para la propia isatoribina. Mono Cynomolgus En el estudio de ensayo en animales se usaron de dos a cuatro monos cynomolgus macho o hembra. El compuesto del estudio se formuló en un vehículo apropiado para la

5 administración oral o intravenosa al animal. Los vehículos usados fueron como tampones acuosos o una solución que contenía Cremophor. Los animales se dosificaron por medio de una sonda oral o una inyección en embolada intravenosa para cada artículo de ensayo. Se recogieron muestras de sangre (aproximadamente 0,5 ml) en momentos predeterminados (normalmente, antes de la dosis, 15, 30 y 45 minutos y 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 8 y 24 horas

10 después de la dosis), se pusieron en tubos que contenían EDTA disódico. Las muestras se pusieron en hielo húmedo después de la recogida y el plasma se separó tan rápidamente como fue posible. Las muestras de plasma se dividieron en alícuotas en un solo vial y se almacenaron congeladas a aproximadamente -20ºC hasta que se transportaron en hielo seco al patrocinador. Los animales recibieron alimento y agua aproximadamente 4 horas después

15 de la dosis. Las muestras de plasma se analizaron con respecto al profármaco y un compuesto parental usando técnicas de cuantificación de CLEM/EM bien conocidas por instrumentos de triple cuadrupolo, es decir, Sciex API3000. Los resultados de cuantificación para el compuesto parental liberado por administración oral del propio compuesto parental o por su profármaco

20 administrado por vía oral se usaron para calcular los valores del área bajo la curva (AUC) de tiempo 0 a 24 horas (PO AUC0-24h). La comparación de los valores del AUC para el compuesto parental liberado en la circulación sistémica con el liberado por el profármaco permitió calcular una biodisponiblidad oral relativa del profármaco. Véanse los resultados proporcionados en las Tablas 22-26. Cuando los datos del AUC para el compuesto parental

25 liberado por el propio compuesto parental después de su administración intravenosa estaban disponibles (AUC IV), esto permitió el cálculo de la biodisponiblidad oral absoluta dividiendo el PO AUC (0-24h) para el profármaco por el IV AUC (0-24 h) para la molécula parental.

Tabla 22: Biodisponibilidad Oral de Isatoribina y sus Profármacos en Monos

Molécula Parental y sus Profármacos: Estructura Biodisponibilidad oral en mono cynomolgus,%

Molécula Parental: Isatoribina Profármaco: Éster de Aminoácido: 21 24 3 7-9*

Profármaco: Desoxi Profármaco: 6-Etoxi Profármaco: 6-Metoxi Profármaco: Aminal Profármaco: Aminal Profármaco: Dioxolenona: 93 77 79 84 82 85 80 28 21 14 4 17

* Medida de múltiples experimentos a diferentes dosis. Tabla 23: Biodisponibilidad Oral de Loxoribina y sus Profármacos en Monos

Molécula Parental y sus Profármacos: Compuesto Nº Biodisponibilidad oral en mono cynomolgus,%

Molécula Parental: Loxoribina Profármaco: 6-Etoxi Profármaco: Desoxi: 17 45 43 2 9 13

Tabla 24: Biodisponibilidad Oral de Imiquimod y sus Profármacos en Monos

Molécula Parental: Imiquimod Profármaco: Carbamato de Pentilo Profármaco: Carbamato de Etilo: 31 34 50 100 AUC(0-24h) = 9,0 555 AUC(0-24h) = 50 234 AUC(O-24h) = 21,1

Molécula parental: Bropirimina Profármaco: Desoxi Profármaco: Etoxi Profármaco: Carbamato de Etilo Profármaco: Carbamato de Pentilo: 35 48 37 36 49 100 137* 94 33 6

* La bioidisponibilidad oral que supera el 100% puede asociarse con diferencias de sexo ya que le compuesto parental se estudió en monos macho y el profármaco se estudió en monos hembra.

Tabla 26: Biodisponibilidad Oral de Profármacos de Adenina en Monos

Molécula Parental y sus Profármacos: Compuesto Nº Biodisponibilidd oral en mono cynomolgus,%

Molécula Parenteral: Profármaco: Metoxi Profármaco: Etoxi Profármaco: Desoxi Profármaco: Carbonato de Pentilo: 29 65 64 62 54 46 1,3 4,6 0,7 9,7

Reducción de la Irritación Gastrointestinal Los profármacos de ligando de TLR7 de la invención también demuestran efectos 5 toxicológicos inesperados y muy reducidos, y en particular una irritación GI reducida.

El tracto gastrointestinal (“GI”) está revestido con un tejido inmune sustancial (por ejemplo placas de Peyer etc.). Los profármacos del ligando de TLR7 ofrecen la posibilidad de enmascarar la estructura activa cuando el agente pasa a través del tejido linfoide que reviste el intestino, lo que minimizaría la activación de este tejido y por lo tanto reduciría la irritación GI.

10 Robins y col. han demostrado que la eliminación del 5-hidroxilo del nucleósido de isatoribina elimina la actividad. Véase Robins y col., Adv. Enzyme Regul., 29, 97-121 (1989). Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se propuso la hipótesis de que el bloqueo de este sitio hidroxilo por una sustitución de éster eliminaría de forma similar la actividad pero permitiría el transporte en la circulación sistémica, en la cual el éster de valina se escindiría y produciría la exposición a isatoribina.

Los presentes inventores han descubierto que la hipótesis se confirmó. Se realizaron estudios toxicológicos formales de isatoribina administrada por vía intravenosa e isatoribina administrada por vía oral y val-isatoribina en perros sabuesos. Los resultados toxicológicos

5 para la isatoribina administrada por vía oral proceden de un estudio realizado por ICN/Nucleic Acid Research Institute.

Los presentes inventores compararon en el perro la toxicología oral de 21 y 24, yla toxicología intravenosa de 21. Se observó que la toxicología oral de 24 era mucho más parecida a 21 intravenososo que lo era 21 oral. En particular, la toxicología limitante de la dosis

10 de 3 oral fue similar en naturaleza a la de 21 intravenoso, y se produjo a exposiciones sanguíneas que fueron similares a las observadas después de 21 intravenoso. Por el contrario, 21 oral tenía una toxicidad limitante diferente (lesiones gastrointestinales) y esta toxicidad se observó a un dosis menor que la dosis tóxica de 21 intravenoso o 24 oral. Además, se observó emesis en perros tratados con 21 oral a dosis menores que la dosis de 24 oral que produjo la

15 emesis. Véase la Tabla 27. También se muestran otros sistemas para la evaluación de la emesis tales como en hurones, que permiten la comparación de la administración oral e intravenosa de compuestos. Véase, por ejemplo, Strominger N. y col., Brain Res. Bull, 5, 445451 (2001). En cada caso, el compuesto se administró como una solución, por medio de una sonda

20 esofágica o por infusión intravenosa. Se evaluaron múltiples parámetros, como es habitual en un estudio de toxicología. En los estudios que proporcionan mayor exposición potencial a isatoribina, la concentración plasmática de isatoribina se evaluó por un procedimiento de CL/EM. Los descubrimientos GI notables se clasificaron y se presentan en la Tabla 27.

TABLA 27: Efecto Sobre la Tolerancia GI en Perros después de la Dosificación de Isatoribina 25 (21) o Val-Isatoribina (24) Clasificado por Exposición Sistémica (AUC) a Isatoribina en Estudios Toxicológicos.

Isatoribina Oral: Isatoribina IV Val-Isatoribina Oral

Dosis aplicada equivalente de isatoribina (mg/kg): AUC 0-24 h (µg.h/ml ) Emesis o deposiciones sueltas Lesiones o irritación GI Emesis o deposiciones sueltas Lesiones o irritación GI Emesis o deposiciones sueltas Lesiones o irritación GI

2,5: n.d Neg. Neg.

Isatoribina Oral: Isatoribina IV Val-Isatoribina Oral

5: n.d. + Neg.

10: n.d. ++ ++

8,1: 11,4 Neg. Neg.

16: 15,6 Neg. Neg.

12,5: 19,5 Neg. Neg.

32: 31,7 Neg. Neg.

25: 42,8 Neg. Neg.

64: 71 Neg. Neg.

130: 75,3 + Neg.

50: 87,8 + Neg.

260: 127 ++ Neg.

390: 180 +++ Neg.

100: 209 ++ Neg.

Para la isatoribina administrada por vía oral los descubrimientos principales estaban relacionados con la tolerancia GI como se mide por la irritación GI. Los signos clínicos indicados en la Tabla 27 fueron emesis y/o deposiciones sueltas. Estos signos clínicos fueron

5 más frecuentes en el grupo de 10 mg/kg, y en un animal a esta dosis se observó una deposición sanguinolenta. La evaluación histopatológica macroscópica del tracto GI detectó múltiples lesiones rojas dispersas en la mucosa intestinal en cuatro de ocho perros a 10 mg/kg, que en una evaluación microscópica reveló congestión celular y hemorragia como podría esperarse a partir de un procedimiento inflamatorio localizado en curso. Los efectos GI

10 establecieron el NOAEL como 5 mg/kg. La isatoribina administrada por vía intravenosa produjo emesis y/o deposiciones sueltas como un descubrimiento común en perros; este efecto se produjo a dosis aplicadas sustancialmente mayores que la isatoribina administrada por vía oral. No se observaron lesiones en el tracto GI ni en la necropsia ni en la evaluación histopatológica de los tejidos. La

toxicidad GI no afectó al NOAEL, que se estableció como 12,5 mg/kg basándose en otros descubrimientos.

La val-isatoribina administrada por vía oral demostró un perfil de toxicología similar a la isatoribina administrada por vía intravenosa. A mayores dosis aplicadas, se observaron emesis y deposiciones sueltas. No se observaron lesiones GI, aunque esto fue un centro de evaluación en este estudio. En cuanto a la isatoribina administrada por vía intravenosa, el NOAEL se estableció basándose en otros descubrimientos. La correspondencia de la toxicidad observada con exposiciones sistémicas de isatoribina es de interés en este estudio; el umbral del AUC de isatoribina para la observación de la emesis y las deposiciones sueltas es similar para la isatoribina administrada por vía intravenosa y la val-isatoribina administrada por vía oral (Tabla 27).

Los datos de la Tabla 27 indican que la val-isatoribina administrada por vía oral proporciona un perfil de toxicidad mejorado con respecto a la isatoribina administrada por vía oral, y es coherente con la hipótesis de que el enmascaramiento químico de la actividad de isatoribina se produce sustituyendo químicamente un éster en la posición 5’ hidroxilo del nucleósido. Como se ilustra en las Tablas 9 a 14, es posible enmascarar químicamente cualquier ligando de TLR7 usando una diversidad de sustituyentes. Modificando por ingeniería genética esta sustitución para que pueda escindirse tras la entrada en el cuerpo se produce una exposición sistémica a la actividad útil del compuesto sin la toxicidad GI limitante debida a la estructura anatómica del tracto GI. Como se ilustra en las Tablas 22 a 25, es posible diseñar la sustitución química en un ligando de TLR7 enmascarado para que sea escindible después de la administración. De esta manera, pueden generarse profármacos de ligando de TLR7 enmascarados para cualquier ligando de TLR7. Esto permite la administración de dosis que son sustancialmente mayores en una base molar de lo que sería aceptable de otra manera, con el resultado de una mayor eficacia y menos efectos secundarios en comparación con la administración del compuesto “no enmascarado” parental solo.

6.6 Composición Oral

La Tabla 28 ilustra una formulación de lote y una formulación de una unidad monodosis que contiene 100 mg de val-isatoribina.

Material: Porcentaje Peso en Cantidad (mg/comprimido) Cantidad (kg/lote)

val-isatoribina: 40% 100,00 20,00

Celulosa Microcristalina, NF: 53,5% 133,75 26,75

Tensioactivo Pluronic F-68: 4,0% 10,00 2,00

Croscarmelosa Sódica Tipo A, NF: 2,0% 5,00 1,00

Estearato de Magnesio, NF: 0,5% 1,25 0,25

Total: 100,0% 250,00 mg 50,00 kg

Los componentes de celulosa microcristalina, croscarmelosa sódica y la val-isatoribina se pasan a través de un tamiz de malla Nº 30 (de aproximadamente 430 µ a aproximadamente 655 µ). El tensioactivo Pluronic F-68® (fabricado por JRH Biosciences, Inc. of Lenexa, KS) se

5 pasa a través de un tamiz de malla Nº 20 (de aproximadamente 457 µ a aproximadamente 1041 µ). El tensioactivo Pluronic F-68® y 0,5 kg de croscarmelosa sódica se cargan en un mezclador giratorio de doble cubierta de 16 qt y se mezclan durante aproximadamente 5 minutos. La mezcla después se transfiere a un mezclador giratorio de doble cubierta de 3 pies cúbicos en el que se añade la celulosa microcristalina y se mezcla durante aproximadamente 5

10 minutos. Se añade la talidomida y se mezcla durante 25 minutos más. Esta premezcla se pasa a través de un compactador de rodillo con un molino de martillo unido a la descarga del compactador de rodillo y se desplaza de nuevo al mezclador giratorio. La croscarmelosa sódica restante y el estearato de magnesio se añaden al mezclador giratorio y se mezclan durante aproximadamente 3 minutos. La mezcla final se comprime en una prensa rotatoria de

15 comprimidos con 250 mg por comprimido (tamaño del lote de comprimidos 200.000).

6.7 Composición para la Mucosa

Se prepara un concentrado combinando isatoribina y una parte de 12,6 kg del tricloromonofluorometano en un recipiente de acero inoxidable cerrado herméticamente equipado con un mezclador de alta cizalla. La mezcla se realiza durante aproximadamente 20

20 minutos. Después se prepara la suspensión a granel en un recipiente cerrado herméticamente combinando el concentrado con el resto de los propulsores en un depósito de producto a granel que tiene la temperatura controlada a 21º a 27ºC y la presión controlada a 2,8-4,0 BAR. Recipientes de aerosol de 17 ml que tienen una válvula dosificadora que está diseñada para proporcionar 100 inhalaciones de la composición de la invención. Cada recipiente se

25 proporciona con los siguientes:

5

10

15

20

25

30

117

val-isatoribina: 0,0120 g

tricloromonofluorometano: 1,6960 g

diclorodifluorometano: 3,7028 g

diclorotetrafluoroetano: 1,5766 g

total: 7,0000 g

6.8 Composición Intravenosa

La formulación intravenosa se prepara reconstituyendo un compuesto de la invención con un medio líquido apropiado, tal como agua para solución inyectable (WFI) o una solución de dextrosa al 5%. Puede obtenerse una concentración deseada de la formulación intravenosa reconstituyendo una cantidad apropiada de un compuesto de la invención con un volumen apropiado de medio líquido. Una concentración deseada de la formulación intravenosa proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención al paciente, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano, en necesidad de la formulación farmacéutica intravenosa y mantiene un nivel terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención en el paciente. La dosis que es terapéuticamente eficaz dependerá de la velocidad a la que se libera la formulación intravenosa al paciente y la concentración de la formulación intravenosa.

Por ejemplo, un vial que contiene una composición (por ejemplo 50 mg de un compuesto de la invención por vial) se reconstituye con una solución de dextrosa al 5% (14 ml de solución de dextrosa al 5% por vial) produciendo un total de 25 ml de solución. La solución reconstituida se incorpora en una solución de dextrosa en una bolsa de infusión y c.s. hasta 50 ml, dando como resultado una solución que contiene 1 mg/ml de un compuesto de la invención adecuado para la administración por infusión intravenosa. La concentración preferida de un compuesto de la invención en el medio líquido, en la bolsa de infusión, es de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 3 mg/ ml, preferentemente de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 1 mg/ ml.

Lo anterior ha demostrado las características pertinentes e importantes de la presente invención. Pueden realizarse muchas modificaciones y variaciones de la presente invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como será evidente por los expertos en la materia. Las realizaciones específicas descritas en el presente documento se ofrecen a modo de ejemplo solamente y la invención sólo debe limitarse por los términos de las reivindicaciones adjuntas junto con el alcance entero de equivalentes a los que otorgan derecho dichas reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. El uso de un ligando de TLR7 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por el virus de la hepatitis C en un paciente, en el que el ligando de TLR7 se selecciona entre

imagen1

en los que: cada R1 es H o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir, que puede estar interrumpido con uno o más heteroátomos O, S o N, o un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; R2 es H, OH, SH, halo o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir, que puede estar interrumpido con uno o más heteroátomos O, S o N, o un -O-(alquilo), -O(arilo), -O-(heteroarilo), -S-(alquilo), -S-(arilo), -S-(heteroarilo), arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; R3 es H, OH o SH, o un alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, -O-(alquilo), -O(arilo), -O-(heteroarilo), -S-(alquilo), -S-(arilo), -S-(heteroarilo), -NH(alquilo), -NH(arilo), NH(heteroarilo), -NH(R4)(alquilo), -NH(R4)(arilo) o -NH(R4)(heteroarilo) sustituido o sin

5 sustituir, en los que R4 es un alquilo sustituido o sin sustituir; X es O o S; Y es H, halo, OH, OR4, SH, SR4 o un alquilo o arilo sustituido o sin sustituir; Z es H, halo, OH, OR4, SH o SR4;

o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo o una sal o 10 hidrato farmacéuticamente aceptable de dicho estereoisómero.
2. El uso de la reivindicación 1 en el que el ligando de TLR7 se selecciona entre la Fórmula Ia, Ib, Ic, Id, Ie, If, Ig e Ih, en las que R1 es H o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir; R2 es H, OH, halo o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin

15 sustituir o -CH2-O-(alquilo); R3 es H, OH o SH, o un -O-(alquilo), -S-(alquilo), o -NH(alquilo) sustituido o sin sustituir; X es O o S; Y es H, halo, OH, OR4, SH o SR4; y Z es H, halo, OH, OR4, SH o SR4.
3. El uso de la reivindicación 1 en el que el ligando de TLR7 se selecciona entre la 20 Fórmula Ic y If.
4.

El uso de la reivindicación 1 en el que el ligando de TLR7 se selecciona entre
5.

El uso de la reivindicación 1 en el que el ligando de TLR7 se administra por vía parenteral, en el que el ligando de TLR7 se administra por vía intravenosa, en el que el ligando

imagen1

5 de TLR7 se administra por vía oral o en el que el ligando de TLR7 se administra por vía mucosa.
6. Uso de un profármaco de un ligando de TLR7 enmascarado para la fabricación de un medicamento para la administración oral en el tratamiento de una infección por el virus de la 10 hepatitis C en un paciente, en el que la administración oral del profármaco de un ligando de TLR7 enmascarado alcanza una concentración plasmática terapéuticamente eficaz del ligando de TLR7 reduciendo al mismo tiempo los efectos secundarios indeseables asociados con la administración oral de ligandos de TLR7, en el que el profármaco es (a) un resto de amida, carbamato o amidina después de la conversión de un sustituyente amina del ligando de TLR7,

15 (b) un resto éster, carbonato, carbamato, éter, imidato, acetal, aminal o cetal después de la conversión de un sustituyente alcohol del ligando de TLR7, (c) un resto acetal o cetal después de la conversión de un sustituyente ceto del ligando de TLR7, (d) un resto imidato después de

la conversión de un carbonilo de un sustituyente amido de TLR7, (e) un resto desoxigenado después de la conversión de un sustituyente oxo de pirimidina o guanosina del ligando de TLR7, o (f) una amina y en el que el profármaco del ligando de TLR7 enmascarado se

imagen2

en los que: cada R1 es H o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir, que puede estar interrumpido con uno o más heteroátomos O, S o N, o un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; R2 es H, OH, SH, halo o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir, que puede estar interrumpido con uno o más heteroátomos O, S o N, o un -O-(alquilo), -O(arilo), -O-(heteroarilo), -S-(alquilo), -S-(arilo), -S-(heteroarilo), arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; R3 es H, OH o SH, o un alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, -O-(alquilo), -O(arilo), -O-(heteroarilo), -S-(alquilo), -S-(arilo), -S-(heteroarilo), -NH(alquilo), -NH(arilo), NH(heteroarilo), -NH(R4)(alquilo), -NH (R4)(arilo) o -NH(R4)(heteroarilo) sustituido o sin sustituir; R4 es un alquilo sustituido o sin sustituir;

R5

es independientemente H, -C(O)(alquilo C1-18) o un grupo aminoácido L, D o racémico -C(O)CHNH2R9; R6 es H, OR10 o N(R11)2; R7 es independientemente H o un -C(O)(alquilo C1-18) o -C(O)2(alquilo C1-18) sustituido o sin sustituir;

R8

es H, -OH, -O-(alquilo), -OCO2(alquilo C1-18), -OC(O)(alquilo C1-18) o un grupo aminoácido L, D o racémico -OC(O)CHNH2R1; R9

es H o un alquilo, C(O)CH(alquil C1-6)NH2 o -C(O)CH(CH2-aril)NH2 sustituido o sin sustituir; R10 es independientemente H, alquilo C1-6, alquenilo C3-7, alquinilo C3-7, -(CR12R13)t(arilo C6-C10), -(CR12R13)t(cicloalquilo C3-C10), -(CR12R13)t(heterocíclico C4-C10), (CR12R13)t>1OH, -(CR12R13)t>0CO2alquilo C1-18 y -(CR12R13)t>0N(R14)CO2alquilo C1-18 y SO2(arilo), en los que t es un número entero de 0 a 6 a menos que se indique otra cosa, y en los que los restos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo y heterocíclico de los grupos anteriores están opcionalmente sustituidos con sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, ciano, nitro, trifluorometilo, trifluorometoxi, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, hidroxi, alcoxi C1-C6, -NH2, -NH-alquilo, -N(alquilo)2, -NH-arilo, -N(alquil)(arilo), -N(arilo)2, -NHCHO, -NHC(O)alquilo, -NHC(O)arilo, -N(alquil)C(O)H, -N(alquil)C(O)alquilo, -N(aril)C(O)H, -N(aril)C(O)alquilo, NHCO2alquilo, -N(alquil)CO2alquilo, -NHC(O)NH2, -N(alquil)C(O)NH2, -NHC(O)NHalquilo, -NHC(O)N(alquilo)2, -N(alquil)C(O)NH-alquilo, N(alquil)C(O)N(alquilo)2, -NHSO2alquilo, -N(alquil)SO2-alquilo, -C(O)alquilo, -C(O)arilo, -OC(O)alquilo, -OC(O)arilo, -CO2alquilo, -CO2-arilo, -CO2H, -C(O)NH2, -C(O)NH-alquilo, -C(O)N(alquilo)2, -C(O)NH-arilo, -C(O)N(arilo)2, -C(O)N(alquil)(arilo), -S(O)alquilo, -S(O)arilo, -SO2alquilo, -SO2arilo, SO2NH2, -SO2NH-alquilo y -SO2N(alquilo)2;

R11

es independientemente H, alquilo C1-6, cicloalquilo C3-C10, o junto con nitrógeno forma un anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros; R12 y R13 son independientemente H, alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o alquinilo C2-6;

R14 es H, alquilo C1-6 o -CH2-arilo;

X es O o S;

Y es H, halo, OH, OR4, SH, SR4, NH2, NHR4, N(R4)2 o un alquilo o arilo sustituido o sin

sustituir; y

Z es H, halo, OH, OR4, SH o SR4 ; o una sal, hidrato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de dicho estereoisómero.
7. El uso de la reivindicación 6 en el que R1 es H o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir; R2 es H, OH, halo o un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir o -CH2-O-(alquilo); R3 es H, OH o SH, o un -O-(alquilo), -S-(alquilo) o -NH(alquilo)

R5

sustituido o sin sustituir; es independientemente H, -C(O)-(alquilo C1-18) o un grupo

aminoácido L, D o racémico -C(O)CHNH2R9, en el que R9 es un alquilo sin sustituir; R6 es H o R10

OR10

, en el que es independientemente alquilo C1-6, alquenilo C3-7, alquinilo C3-7, (CR12R13)t(arilo C6-C10), -(CR12R13)t(heterocíclico C4-C10) y -(CR12R13)t>0N (R14)CO2alquilo C1-18, en los que t es un número entero de 0 a 4 a menos que se indique otra cosa, y en los que los restos alquilo, alquenilo, arilo y heterocíclico de los grupos anteriores están opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, ciano, nitro, trifluorometilo, trifluorometoxi, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, hidroxi, alcoxi C1

R12 R13

C6, -CO2-alquilo, -CO2-arilo, -OC(O)alquilo y -OC(O)arilo, y en los que y son independientemente H, alquilo C1-6 o alquenilo C2-6; y R14 es H, -CH3 o -CH2CH3; R7 es independientemente H o un -C(O)(alquilo C1-18) o -C(O)2(alquilo C1-18) sustituido o sin sustituir;

R8

es H, -OH, -O-(alquilo), -OCO2(alquilo C1-18) o un grupo aminoácido L, D o racémico OC(O)CHNH2R1; X es O o S; Y es H, halo, OH, OR4, SH o SR4; y Z es H, halo, OH, OR4, SH o SR4.
8.

El uso de la reivindicación 6 en el que el profármaco del ligando de TLR7 enmascarado se selecciona entre IIc y IIf.
9.

El uso de la reivindicación 6 en el que el profármaco del ligando de TLR7 enmascarado se selecciona entre

imagen1

imagen1

imagen1

imagen3

5 10. El uso de la reivindicación 6, en el que la administración oral del profármaco de ligando de TLR7 enmascarado consigue una concentración en plasma eficaz in vivo del ligando de TLR7 que es del 10% al 500% de la exposición eficaz in vivo obtenida después de la administración oral del ligando de TLR7 solo, o en el que la administración oral del profármaco de ligando de TRL7 enmascarado consigue una concentración en plasma eficaz in vivo del

10 ligando de TRL7 que es del 50% al 200% de la exposición eficaz in vivo obtenida después de la administración oral del ligando de TRL7 solo.
11. El uso de la reivindicación 10, en el que la administración oral del profármaco de

ligando de TLR7 enmascarado consigue una concentración en plasma terapéuticamente eficaz 15 del ligando de TRL7 correspondiente sin producir irritación gastrointestinal.
12. El uso de la reivindicación 6, en el que la administración oral del profármaco de ligando de TLR7 enmascarado reduce los efectos secundarios indeseables en un paciente con respecto a los efectos secundarios después de la administración oral del ligando de TRL7 solo, o en el que la administración oral del profármaco de ligando de TLR7 enmascarado reduce los efectos secundarios indeseables en un 50% en un paciente con respecto a los efectos secundarios después de la administración oral del ligando de TRL7 solo.

5 13. El uso de la reivindicación 6, en el que el efecto secundario es irritación gastrointestinal.
14. El uso de la reivindicación 13, en el que la irritación es hemorragia, en el que la irritación es lesiones o en el que la irritación es emesis.

10 15. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 6, en el que el paciente es un ser humano.
16.

El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 6 que comprende además administrar un excipiente, soporte o vehículo farmacéuticamente aceptable.
17.

El uso de la reivindicación 10, que comprende además administrar un agente terapéutico adicional.

15
18. El uso de la reivindicación 17, en el que el agente terapéutico adicional es un agente 20 antiviral.
19. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 6, en el que la dosis terapéutica o profilácticamente eficaz es de 0,001 a 100 mg/kg al día, en el que la dosis terapéutica o profilácticamente eficaz es de aproximadamente 0,1 a 25 mg/kg al día o en el que la dosis

25 terapéutica o profilácticamente eficaz es de aproximadamente 1 a 20 mg/kg al día.
20. El uso de la reivindicación 6, en el que el profármaco de ligando de TRL7 enmascarado se administra por vía parenteral, oral o mucosa.

30 21. El uso de la reivindicación 20, en el que, en caso de administración parenteral, el profármaco de ligando de TLR7 enmascarado se administra por vía intravenosa.

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