ES2335272T3 - Procesos y vectores para amplificacion o expresion de secuencias de acido nileico de interes en plantas. - Google Patents

Abstract

Un proceso para causar la amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular, caracterizado por que la célula vegetal se proporciona con por lo menos dos vectores precursores diseñados para experimentar procesamiento por recombinación de sitio específico en dicha célula vegetal, donde debido al procesamiento por recombinación de sitio específico entre dichos vectores precursores, se dota a dicha célula vegetal con por lo menos un replicón capaz de replicación autónoma in dicha célula vegetal, donde dicho replicón proporciona a dicha amplificación y/o expresión.

Description

Procesos y vectores para la amplificación o expresión de secuencias de ácido nucleico de interés en plantas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procesos y vectores para causar la amplificación o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en una célula vegetal.

Antecedentes de la invención

El progreso significativo en la biotecnología vegetal durante las últimas dos décadas ha ampliado las oportunidades de agricultura molecular a escala comercial en plantas. La producción de proteínas recombinantes en plantas es una alternativa atractiva con respecto a los sistemas más tradicionales basados en bacterias y levaduras. Tiene una ventaja evidente con respecto a los sistemas existentes basados en producción de fermentadores debido a su menor costo y la facilidad de aumento de escala de la producción al simplemente incrementar la recolección de la biomasa vegetal.

En general, la agricultura molecular en plantas se puede conseguir mediante la expresión estable o transitoria de una proteína recombinante de interés (Franken et al., 1997, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 411-416; Fischer et al., 1999, Biotechnol. Appl. Biochem., Pt 2, 101-108; Herbers & Sonnewald, 1999, Curr. Opin. Biotechnol., 10, 163-168). Se pueden usar plantas transgénicas estables para producir tejidos vegetativos o semillas ricas en proteína recombinante. Tejido vegetativo puede usarse directamente para el procesamiento mientras que las semillas son más adecuadas para almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, para alcanzar un elevado nivel de expresión de proteína en plantas no es una tarea común, especialmente para la producción de proteínas que comprometen el crecimiento de la planta. Requiere el desarrollo de sistemas de expresión regulados apropiadamente, por tanto permitiendo activar la producción de proteína en la etapa correcta del desarrollo de la planta.

Las tecnologías existentes para controlar la expresión de genes en plantas habitualmente se basan en promotores específicos de tejido e inducibles y prácticamente la totalidad de estos sufren de una actividad de expresión basal incluso cuando no son inducidos, es decir, son "permeables". Los promotores específicos de tejido (US05955361; WO09828431) presentan una herramienta poderosa pero su uso se limita a áreas de aplicaciones muy específicas, por ejemplo, para producir plantas estériles (WO9839462) o expresar genes de interés en semillas (WO00068388; US05608152). Los promotores inducibles se pueden dividir en dos categorías de acuerdo con sus condiciones de inducción - aquellos inducidos por factores abióticos (temperatura, luz, sustancias químicas) y aquellos que se pueden inducir por factores bióticos, por ejemplo, ataque de patógenos o plagas. Ejemplos de la primera categoría son los promotores inducibles por calor (US 05187287) e inducibles por frío (US05847102), un sistema inducible por cobre (Mett et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 4567-4571), sistemas inducibles por esteroides (Aoyama & Chua, 1997, Plant J, 11, 605-612; McNellis et al., 1998, Plant J., 14, 247-257; US06063985), un sistema inducible por etanol (Caddick et al., 1997, Nature Biotech., 16, 177-180; WO09321334), y un sistema inducible por tetraciclina (Weinmann et al., 1994, Plant J., 5, 559-569). Uno de los últimos avances en el área de los sistemas inducibles químicamente para plantas es un promotor quimérico que puede ser activado por el glucocorticoide dexametasona y que puede ser inactivado por tetraciclina (Bohner et al., 1999, Plant J., 19, 87-95). Para una revisión de sistemas inducibles químicamente véase: Zuo & Chua, (2000, Current Opin. Biotechnol., 11, 146-151). Otros ejemplos de promotores inducibles son los promotores que controlan la expresión de genes relacionados con patogénesis (PR) en plantas. Estos promotores pueden ser inducidos por tratamiento de la planta con ácido salicílico, un componente importante de las rutas de señalización de plantas en respuesta al ataque de patógenos u otros compuestos químicos (benzo-1,2,3-tiadiazol o ácido isonicotínico) que son capaces de activar la expresión del gene PR (US05942662).

Existen informes de sistemas de expresión transgénica controlable usando ARN/ARN polimerasa viral proporcionados por infección viral (véase por ejemplo US6093554; US5919705). En estos sistemas, una secuencia de ADN vegetal recombinante incluye las secuencias de nucleótidos del genoma viral reconocido por el ARN/ARN polimerasa viral. La eficacia de estos sistemas es limitada debido a la baja capacidad de polimerasas virales en proporcionar funciones in trans y su incapacidad para controlar procesos aparte de amplificación de ARN.

Los sistemas descritos anteriormente son de interés significativo como oportunidades para obtener patrones deseados de expresión transgénica, pero no permiten un control estricto sobre los patrones de expresión, en tanto que los agentes inductores (cobre) o sus análogos (brasinoesteroides en el caso de un sistema controlable por esteroides) pueden estar presentes en tejidos vegetales a niveles suficientes para provocar expresión residual. De manera adicional, el uso de antibióticos y esteroides como inductores químicos no es deseable para aplicaciones a gran escala. Cuando se usan promotores de genes PR o ARN/ARN polimerasas virales como medios de control para transgenes, los requerimientos de un control estricto sobre la expresión transgénica tampoco se satisface, en tanto que infección o estrés ocasional por un patógeno pueden causar la expresión. Los promotores específicos de tejido o de órgano se limitan a áreas muy estrechas de aplicaciones ya que confinan la expresión a un órgano o a una etapa específica del desarrollo de la planta, pero no permiten que el transgen se active a voluntad.

Una manera de conseguir un elevado nivel de producción de proteína es la expresión transitoria, en donde el transgen se puede distribuir y expresar en la etapa deseada del desarrollo de la planta, aprovechando por completo los recursos de la planta y permitiendo un rendimiento elevado del producto deseado. El planteamiento de expresión transitoria más adecuada para la producción de escala media a grande incluye sistemas mediados por Agrobacterium (Kapila et al., 1996, Plant Sci., 122, 101-108) y los mediados por vector viral vegetal (para revisión véase: Porta & Lomonossoff, 1996, Mol. Biotechnol., 5, 209-221; Yusibov et al., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94). Los sistemas de expresión basados en vector viral ofrecen un rendimiento significativamente mayor del producto transgénico en comparación con los transgenes nucleares de la planta. Por ejemplo, el nivel de la proteína transgénica puede alcanzar 5-10% del contenido total celular de la planta, cuando se expresa desde un vector viral (Kumagai et al., 2000, Gene, 245, 169-174; Shivprasad et al., 1999, Virology, 255, 312-323). Los virus ARN son los más adecuados ya que ofrecen un mayor nivel de expresión en comparación con los virus ADN. Existen varias patentes publicadas que describen vectores virales adecuados para expresión sistémica de material transgénico en plantas (US5316931; US5589367; US5866785). En general, estos vectores pueden expresar un gen extraño como una fusión traduccional con una proteína viral (US5491076; US5977438), desde un promotor subgenómico adicional (US5466788; US5670353; US5866785), o desde ARN viral policistrónico usando elementos IRES para traducción independiente de proteínas (Solicitud de Patente Alemana Número 10049587.7, solicitud PCT PCT/EP01/11629). El primer planteamiento - fusión traduccional de una proteína recombinante con una proteína estructural viral (Hamamoto et al., 1993, BioTechnology, 11, 930-932; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; JP6169789; US5977438) proporciona un rendimiento significativo. Sin embargo, el uso de tal planteamiento es limitado, ya que la proteína recombinante no se puede separar fácilmente de la viral. Una de las versiones de este planteamiento emplea la fusión traduccional a través de una secuencia de péptidos reconocida por una proteasa viral de sitio específico o a través de un péptido catalítico (Dolja et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10208- 10212; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; US5162601; US5766885; US5491076).

Los procesos de expresión que utilizan vectores virales construidos sobre promotores subgenómicos heterólogos proporcionan el nivel más elevado de producción de proteína hasta ahora (US5316931). La desventaja más grave de tales vectores y de muchos otros es su capacidad limitada con respecto al tamaño del ADN a amplificar. Normalmente, los constructos estables acomodan insertos no mayores de un kb. En algunas áreas de genómina funcional vegetal esto puede no ser una limitación grave como G. della-Cioppa et al. (WO993651) describió el uso de vectores virales basados en TMV para expresar genotecas de ADNc vegetal con el propósito de silenciar genes endógenos. Los sistemas de amplificación de dos componentes que usan los virus auxiliares pueden ofrecer una capacidad ligeramente mejor (US5889191). Sin embargo, para la mayoría de las aplicaciones, incluyendo la producción de proteínas o compuestos de peso molecular bajo en plantas, estas limitaciones no se pueden remediar dentro de los procesos existentes. Por ejemplo, para producir plásticos biodegradables en plantas, deben expresarse hasta cuatro genes recombinantes (Hanley et al., 2000, Trends Plant Sci., 5, 45-46) y se requieren por lo menos siete genes bacterianos para la modulación de la ruta biosintética de mevalonato en plantas (Dewick, P., 1999, Nat. Prod. Rep., 16, 97-130).

Una preocupación grave adicional con los sistemas de expresión vegetales basados en virus de la técnica anterior es su seguridad biológica. Por un lado, la elevada infectividad del virus recombinante es una característica muy deseada para facilitar la propagación del virus por toda la planta y por las plantas vecinas, de ese modo incrementando el rendimiento del producto de gen deseado. Por otro lado, tal infectividad elevada compromete la contención del material recombinante ya que la dispersión a plantas no deseadas puede ocurrir fácilmente. Por consiguiente, más seguros sistemas de expresión vegetal basados en virus son muy deseados.

Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar un proceso de amplificación o expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en una célula vegetal que no tenga los inconvenientes mencionados anteriormente y que notablemente no tenga la limitación de tamaño de la secuencia de interés.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un nuevo proceso que permita la amplificación o expresión de más de una secuencia de ácido nucleico de interés en una célula vegetal.

Además, un objetivo de la invención es proporcionar un proceso de amplificación o expresión de una(s) secuencia(s) de ácido nucleico de interés en una célula vegetal que sea de mejorada seguridad ecológica y biológica.

En este documento se describe un sistema que carece de las limitaciones anteriores: no tiene un límite detectable en el tamaño del ADN a ser expresado, permite la expresión de genes múltiples en la misma célula y planta y posee parámetros de bioseguridad incorporados elevados.

Sumario de la invención

Esta invención proporciona un proceso para causar amplificación y/o expresión, de una o más secuencias de ácido nucleido de interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular, caracterizado en que la célula vegetal se proporciona con un vector precursor diseñado para someterse a procesamiento en dicha célula por lo que, debido al procesamiento, se dota a dicha célula vegetal con por lo menos dos replicones que

(a)

están relacionados estructuralmente entre si debido a dicho procesamiento;

(b)

son funcionalmente distintos entre si; y

(c)

proporcionan dicha amplificación y/o expresión.

Además, la invención proporciona un proceso para causar la amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular, caracterizado en que la célula vegetal se proporciona con por lo menos dos vectores precursores diseñados para someterse a procesamiento en dicha célula, por recombinación de sitio específico por lo que, debido a dicho procesamiento por recombinación de sitio específico entre dichos vectores precursores, se dota dicha célula vegetal con por lo menos un replicón que proporciona la amplificación o expresión. Preferiblemente, por lo menos un dicho replicón está relacionado estructuralmente con cada uno de por lo menos dos dichos vectores precursores debido al procesamiento.

Esta invención describe adicionalmente un proceso para la producción de un producto bioquímico, un proceso para la determinación de la función del gen y un proceso para la evolución artificial o dirigida por lo que cada uno de estos procesos comprende uno de los procesos anteriores para causar amplificación o expresión.

Además, se describen vectores o vectores precursores y material viral para este proceso y material viral, replicones y material vegetal obtenidos o que se puedan obtener al efectuar este proceso. El material viral comprende ácidos nucleicos capaces de replicarse en una célula vegetal. Comprende ADN o ARN infeccioso. El material viral puede estar desnudo o cubierto con una proteína de recubrimiento.

Además se describe un conjunto de partes que comprende: (i) células vegetales, semillas o plantas, y (ii) los vectores anteriores, vectores precursores, material viral o replicones. Se describe un conjunto de partes adicional que comprende: (i) células vegetales, semillas o plantas y (ii) células de Agrobacterium que contienen los vectores anteriores, vectores precursores, material viral o replicones. La invención también proporciona el sistema de la reivindicación 34.

El proceso de la invención causa amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en una célula vegetal. La amplificación se refiere a la producción de ADN o ARN (por ejemplo para tecnología antisentido). La expresión se refiere a la formación de un polipéptido o proteína. En ambos casos, el objetivo final puede ser un producto bioquímico cuya producción pueda requerir la amplificación de dicho ADN o ARN, y/o la expresión de un polipéptido o proteína.

El proceso de la invención puede realizarse en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular. Se prefiere realizar dicho proceso en células vegetales. De manera más preferible, dicho proceso se realiza en una planta.

De acuerdo con la invención, se proporciona una célula vegetal con un vector precursor que comprende transfección viral, distribución mediada por Agrobacterium, distribución no biológica, o conversión de un ADN preprecursor replicón que se preintegra en un ADN nuclear vegetal para formar un vector o vectores precursores. Sin embargo, dicho proporcionamiento de una célula vegetal con un vector precursor puede comprender además, adicionalmente a la transfección o transformación, acción celular, por ejemplo en el caso de vectores precursores basados en virus ARN, un ADN primario transformado o transfectado puede requerir transcripción con el fin de producir un vector precursor de ARN en la célula. En el caso de distribución mediada por Agrobacterium, el vector precursor debe ser suprimido o transcrito del ADN-T distribuido por Agrobacterium.

Un replicón es una molécula de ADN o ARN capaz de replicación autónoma en una célula de dicha planta. Ejemplos incluyen: plásmidos bacterianos y de levadura, plástidos y ADN mitocondrial, virus ADN y ARN, viroides, fagos. Un replicón debe tener un origen de replicación. El origen de replicación puede reconocerse por una polimerasa de ADN o ARN de la célula vegetal hospedadora, dependiendo en si el replicón es un replicón de ADN o de ARN, o por una polimerasa heteróloga, por ejemplo de origen viral. En este caso, la célula vegetal debe proporcionarse con dicha polimerasa heteróloga, por ejemplo por uno de dichos replicones. La replicación autónoma de los replicones en la célula vegetal probablemente tiene el efecto de que se aumente su concentración, lo cual puede aumentar el nivel de expresión de las secuencias de interés y apoyar la propagación de célula a célula y por toda la planta. Preferiblemente, los replicones tienen infectividad y capacidad de propagación aumentadas en comparación con los vectores precursores.

Dicho por lo menos uno o dicho por lo menos dos replicones pueden retener capacidades virales adicionales, tales como un montaje de partícula viral, infectividad, supresión del silenciamiento genético, transcripción inversa, integración en el cromosoma hospedador, movimiento de célula a célula, o movimiento a larga distancia. Uno de dichos replicones puede esencialmente ser un virus de tipo auxiliar que proporciona funciones in trans necesarias para replicación de otro replicón o replicones. Además, uno de dichos replicones puede ser esencialmente un retrovirus silvestre o un retrotransposón que proporcione funciones in trans necesarias para replicación, transcripción inversa, integración en un cromosoma hospedador de otro replicón o replicones.

Dicho por lo menos uno o dicho por lo menos dos replicones proporcionan, preferiblemente juntos, la amplificación y/o expresión de dichas secuencias de ácido nucleico de interés. Si una secuencia de interés se amplifica o se expresa desde uno de dichos replicones, otro replicón puede requerirse, por ejemplo para una función necesaria para la replicación de dichos replicones o para la propagación de por lo menos un replicón a las células vecinas si dicho proceso se realiza en cultivo celular o en una planta. En este caso, los replicones cooperan funcionalmente uno con el otro.

\newpage

Si más de una secuencia de interés se va a amplificar o expresar, cada secuencia puede ser expresada preferiblemente desde un replicón, por lo que los replicones proporcionan (juntos) dicha amplificación o expresión. Además, en este caso, los replicones preferiblemente cooperan funcionalmente uno con el otro. Como ejemplo, una función para la replicación o difusión de dicho replicón o propagación de dichos replicones se puede expresar desde uno o algunos de dichos replicones que amplifican o expresan dichas secuencias de interés o desde un replicón adicional. Sin cooperación funcional, el nivel de amplificación o expresión sería mucho menor o estaría limitado a la(s) célu-
la(s) a las que se les proporciona uno o varios de dicho(s) vector(es) precursor(es), si se desea la amplificación o la expresión en células vegetales o en una planta.

Dicho por lo menos uno o dichos por lo menos dos replicones son funcionalmente distintos entre si en que proporcionan funciones diferentes para amplificación y/o expresión de dicha(s) secuencia(s) de interés. Ejemplos de tales funciones incluyen, además de la codificación de dicha(s) secuencia(s) de ácido nucleico de interés, la expresión de productos necesarios para replicar los replicones, expresión de factores o productos (preferiblemente enzimas) que facilitan el procesamiento de de el(los) vector(es) precursor(es) para dar dichos replicones, la expresión de productos necesarios para el movimiento de célula a célula o a larga distancia o de planta a planta de dichos replicones (por ejemplo el movimiento de proteínas o proteína de recubrimiento), etc. Estos productos pueden funcionar in trans o in cis. La distinción funcional no incluye mutaciones aleatorias en los replicones que pueden ocurrir en el desarrollo del procesamiento en la célula vegetal.

Debido a dicho procesamiento, dichos por lo menos replicones están relacionados estructuralmente uno con el otro en que comparten porciones de secuencia entre si. El tipo de relación depende del tipo de procesamiento (proceso de modificación). Si un replicón se produce en el dicho proceso, dicho replicón se relaciona estructuralmente a dicho por lo menos uno o a cada uno de dicho por lo menos dos vectores precursores debido a dicho procesamiento.

Los vectores precursores de la invención se someten a procesamiento en la célula vegetal por uno de los siguientes procesos de modificación de ADN o ARN, los que dotan a la célula vegetal con el replicón o replicones de acuerdo con la invención. El procesamiento en la célula vegetal puede implicar modificación de ADN, tal como recombinación, inserción o supresión de ADN, etc. De manera alternativa, puede implicar modificación de ARN, tal como empalme, ligamiento o recombinación de ARN etc. Dentro de esta invención, dicho procesamiento no incluye transcripción. El vector precursor mismo puede ser una molécula de ADN o ARN capaz de replicación autónoma en una célula de dicha planta.

El(los) vector(es) precursor(es) de esta invención son preferiblemente de origen viral vegetal, de manera más preferible, de origen virus ARN o virus ADN. Ejemplos de virus específicos se proporcionan a continuación. Los vectores precursores pueden ser capaces de replicación autónoma en la célula vegetal como lo son los replicones.

La célula vegetal puede proporcionarse con uno o más vectores precursores. Si se proporciona a la célula con sólo un vector precursor, este precursor dota a la célula vegetal con por lo menos dos replicones. Si la célula se proporciona con dos o más vectores precursores, la célula está dotada preferiblemente con dicho por lo menos uno o dicho por lo menos dos replicones por un procesamiento que implica interacción entre dichos vectores precursores, por ejemplo recombinación. Al proporcionar a la célula vegetal con dos o más vectores precursores aumenta enormemente las posibilidades para generar le replicón o replicones de la invención. Pueden ocurrir varias modificaciones diferentes de ADN o ARN en la célula vegetal dependiendo del diseño de los vectores precursores.

El proceso de acuerdo con la invención se basa en el uso de célula(s) vegetal(es) silvestre(s) o de una(varias) célu-
la(s) vegetal(es) que es(son) modificada(s) por ingeniería genética a fin de proporcionar funciones necesarias para dicho procesamiento, o proporcionar in trans una o más funciones necesarias para infectividad, replicación del replicón, montaje de partícula viral, supresión del silenciamiento genético por el hospedador, integración en el cromosoma hospedador, transcripción inversa, movimiento de célula a célula o a larga distancia de dichos replicones resultantes. Dicha ingeniería genética de dicha célula vegetal se hace por expresión transitoria, transfección mediada por virus o por Agrobacterium, integración estable en los genomas de los núcleos u orgánulos o dentro de plásmidos replicantes de manera autónoma de dicha célula vegetal. Las células vegetales y las plantas para el proceso de esta invención, preferiblemente, son plantas superiores o células de las mismas. Se prefieren particularmente plantas de cosecha.

El proceso para causar la amplificación o expresión de acuerdo con la invención presenta varias ventajas importantes sobre la técnica anterior. El tamaño de la(s) secuencia(s) de ácido nucleico de interés a amplificar o expresar es mucho menos limitado que en la técnica anterior, ya que las funciones necesarias para amplificación o expresión son compartidas por al menos dos replicones, por lo que los replicones son más pequeños que lo que sería el vector de la técnica anterior. Por consiguiente, la amplificación o expresión es más eficaz.

Además, el proceso de la invención permite la amplificación y/o expresión de más de una secuencia de ácido nucleico de interés. Se proporcionan ejemplos para la expresión de dos genes de interés. Sin embargo, es factible dentro de esta invención la expresión de tres, cuatro o incluso más secuencias de ácido nucleico de interés. Esto permite la expresión de una ruta o cascada bioquímica completa o de una proteína con subunidades múltiples. Cada secuencia de interés preferiblemente se puede expresar desde un replicón. Función(es) adicional(es) para el funcionamiento eficaz del proceso como las que se enumeran a continuación se pueden localizar en un replicón adicional. De manera alternativa, un replicón puede codificar más de una de estas funciones.

Una tercera ventaja importante de la invención es que hay varias posibilidades de mejorar la seguridad biológica sobre los procesos de la técnica anterior. En realizaciones donde se emplea más de un vector precursor, el proceso es funcional únicamente cuando todos los precursores se meten en la célula vegetal. De manera alternativa, el procesamiento en la célula para generar dicho por lo menos uno o dicho por lo menos dos replicones pueden depender de un componente adicional, por ejemplo una enzima que cataliza dicho procesamiento. Entonces, el sistema es funcional únicamente si el componente adicional se distribuye en la célula o si se usa una célula transgénica que exprese dicho componente. En una realización, el replicón que expresa una secuencia de interés puede propagarse por toda la planta desde la célula infectada primaria, pero no es posible la propagación a otras plantas.

Ejemplos de secuencias de ácido nucleico de interés incluyen secuencias codificantes o partes de la misma, o cualquier elemento genético. En este documento, un elemento genético es cualquier elemento de ADN o ARN que tiene una función genética distinta aparte de la codificación para una parte estructural de un gen. Ejemplos incluyen: potenciador transcripcional, promotores, potenciadores traduccionales, sitios de recombinación, secuencias de terminación transcripcional, sitios de entrada de ribosoma interno (los IRES), sitios de restricción. Un elemento genético preferido es un IRES_{mp}75 tobamovirus usado como potenciador traduccional unido operablemente a una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica para una proteína de interés.

En una realización preferida de la invención, se dota dicha célula vegetal con por lo menos un (tipo de) replicón. Dicho un replicón se forma preferiblemente por recombinación de sitio específico entre por lo menos dos vectores precursores. Dicha recombinación de sitio específico tiene lugar preferiblemente a nivel de ADN. Por lo tanto, dicho un replicón puede ser ADN. De manera alternativa, dicho un replicón puede formarse por ARN por medio de transcripción siguiendo dicha recombinación de sitio específico. En esta realización, dichos vectores precursores preferiblemente no son capaces de replicación autónoma en dicha célula vegetal. Esta realización es preferida particularmente desde el punto de vista de seguridad biológica.

En otra realización preferida de la invención, una célula vegetal se proporciona con ADNc de un vector precursor (Figuras 2 y 4). Después de la transcripción que produce el vector precursor, el procesamiento en la célula por empalme dota a la célula con un replicón basado en ARN viral del que se puede amplificar o expresar una secuencia de interés. Ya que el empalme es lento y/o no sucede en todas las moléculas del vector precursor en la célula, las moléculas precursoras no empalmadas permanecerán en la célula. Para el propósito de esta invención, estos vectores precursores no empalmados restantes son replicones también proporcionados y capaces de replicación autónoma. En esta invención, se utilizan para la expresión de: (una) función(es) necesaria(s) para amplificación o expresión de dicha secuencia de interés, por ejemplo una función para la propagación de el(los) replicón(es) a células vecinas.

En otra realización preferida se generan un conjunto de replicones del tipo AB_{1}, AB_{2},..., AB_{n} o del tipo B_{1}A, B_{2}A, ..., B_{n}A en una célula por medio de recombinación de sitio específico de un vector (A) precursor primario con un conjunto de por lo menos dos vectores precursores secundarios (B_{1}, B_{2}, ..., B_{n}), donde n es un número entero \geq2. En la realización que se muestra en la Figura 8, los vectores precursores (vectores secundarios) que contienen una secuencia a expresar o amplificar se recombinan con otro vector precursor (vector precursor primario) para formar replicones del tipo AB_{1}, AB_{2} y AB_{3}, de donde se pueden amplificar o expresar estas secuencias. Se necesitan por lo menos tres vectores precursores para dotar a la célula con por lo menos dos replicones. Preferiblemente, las funciones para propagar los replicones se expresan desde uno o más de dichos replicones.

Para efectuar los procesos de la invención, los vectores precursores pueden ser usados directamente para la transformación o transfección de una planta o célula vegetal. Esto es particularmente cierto para replicones basados en ADN viral. Para replicones basados en ARN viral, los vectores de ADN usados para transformación o transfección requieren la transcripción para producir los vectores precursores dentro de la célula.

Los procesos de la invención pueden usarse para generar grandes cantidades de una o más secuencias de ácido nucleico en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular de una manera ambientalmente segura. En particular, dichos procesos puede usarse para generar grandes cantidades de dicho por lo menos uno o dicho por lo menos dos replicones. Dicho replicón(es) puede(n) purificarse o enriquecerse del material vegetal. Dichos replicón(es) puede(n) ser vectores o material viral que puede usarse, opcionalmente después de enriquecimiento o purificación, para transformar o transfectar una planta, tejido vegetal, células vegetales o cultivo celular adicional. En esta realización, los procesos de la invención puede ser procesos biológicamente seguros para producir material viral infeccioso o vectores para transformar o transfectar plantas a gran escala como en una escala agrícola o de granja. Dicho material viral infeccioso o dichos vectores pueden ser material viral empacado o recubierto. El material de proteína necesario para empacar dicho material viral puede expresarse desde dicho(s) replicón(es).

Los procesos de la invención pueden usarse para la producción de un producto bioquímico. Dicho producto bioquímico es preferiblemente una proteína, más preferiblemente una proteína farmacéutica. Dicha proteína farmacéutica puede ser un anticuerpo funcional.

El proceso de la invención puede usarse adicionalmente para la determinación de función de gen, en particular para la determinación de función de gen rápida o para análisis genómico funcional.

Los procesos de la invención pueden usarse adicionalmente para evolución artificial o dirigida, en particular para evolución artificial o dirigida de genes o para evolución artificial o dirigida de elementos genéticos.

Descripción breve de los dibujos

La Figura 1 representa el principio general de la generación de replicones a partir de vectores precursores in planta.

La Figura 2 representa la estructura de un vector precursor basado en PVX, su generación por transcripción para dar la forma completa del transcrito y su empalme. La expresión puede ocurrir del transcrito (vector precursor y replicón) y el transcrito empalmado.

La Figura 3 representa las construcciones básicas y la estrategia de clonación usada para clonación del ADNc de un vector precursor basado en PVX.

La Figura 4 representa el esquema general de la expresión de dos genes (CP y GFP) usando un vector precursor (provector) apto para corte y empalme basado en CrTMV.

La Figura 5 representa la estrategia de clonación del constructo intermedio pIC3342.

La Figura 6 representa la estrategia de clonación de las construcciones intermedias pIC3378 y pIC3382.

La Figura 7 representa las etapas finales de clonación del plásmido pIC3393.

La Figura 8 representa el esquema general de expresión de varios genes a través de vectores precursores basados en CrTMV (a-c y el vector mostrado en la parte superior) y la generación de replicones (A-C) por recombinación de sitio específico en los sitios LoxP catalizados por la enzima recombinasa Cre.

La Figura 9 representa el esquema de clonación del constructo pIC3461 - un componente primario de un sistema de recombinación.

La Figura 10 representa el esquema de clonación del constructo pIC3441 - uno de los componentes secundarios de un sistema de recombinación.

La Figura 11 representa el esquema de clonación del constructo pIC3941 - uno de los componentes secundarios de un sistema de recombinación.

La Figura 12 representa el esquema de clonación del constructo pIC3521 - uno de los componentes secundarios de un sistema de recombinación.

La Figura 13 representa el esquema principal de expresión transgénica a través de un vector viral no contagioso.

La Figura 14 representa la estructura del plásmido pIC1593 usado para introducir un gen de recombinasa Cre en el genoma de N-benthamiana.

La Figura 15 representa el esquema general de expresión de varios genes a través de vectores precursores basados en CrTMV (a-c y el vector mostrado en la parte superior) y la generación de replicones (A-C) al usar el sistema integrasa/att para recombinación de sitio específico. Los vectores precursores se clonan en vectores binarios con bordes de T-ADN (LB y RB).

La Figura 16 representa el esquema de clonación del constructo pICH4851 - uno de los componentes secundarios del sistema de recombinación.

La Figura 17 representa el esquema de clonación del constructo pICH5151 - uno de los componentes secundarios del sistema de recombinación.

La Figura 18 representa el esquema de clonación del constructo pICH5161 - uno de los componentes secundarios del sistema de recombinación.

La Figura 19 representa el esquema de clonación del constructo pICH5951 - uno de los componentes secundarios del sistema de recombinación.

La Figura 20 representa el sistema de clonación de las construcciones pICH6871 y pICH6891 - dos de los componentes secundarios del sistema de recombinación.

La Figura 21 representa el esquema de clonación del constructo pICH4371 - uno de los componentes secundarios del sistema de recombinación.

La Figura 22 representa el esquema de clonación del plásmido pICH4461 - uno de los componentes secundarios del sistema de recombinación.

La Figura 23 representa el plásmido pICP1010 que se usó como una fuente de integrasa en el sistema att-provector.

Descripción detallada de la invención

En la presente invención se describe un planteamiento para amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés que tiene todos los potenciales de los sistemas de vectores virales pero carece de sus desventajas tales como capacidad limitada. Además, proporciona mejores características de bioseguridad. Para la construcción de vectores basados en virus de acuerdo con los principios de la presente invención se pueden usar virus que pertenezcan a grupos taxonómicos diferentes. Esto es cierto para ambos virus que contienen ARN y ADN, ejemplos para los que se dan seguidamente (por todo este documento, cada nombre de especie tipo se precede por el nombre del orden, familia y género al que pertenece. Los nombres de los órdenes, familias y géneros están en cursiva, si se han aprobado por el ICTV. Los nombres taxa entre comillas (y no en cursiva) indican que este taxón no tiene un nombre aprobado por el ICTV internacional. Los nombres (vernáculos) de las especie se dan en tipo de letra normal. Se indican los virus sin asignación formal a género o familia):

ADN virus

Virus ADNbc circulares: Familia: Caulimoviridae, Género: Badnavirus, Especie tipo: virus del moteado amarillo de la commelina, Género: Caulimovirus, Especie tipo: virus del mosaico de la coliflor, Genero: "virus similares a SbCMV", Especie tipo: virus del moteado clorótico de la semilla de soja, Género: "virus similares a CsVMV", Especie tipo: virus del mosaico de la vena de Cassava, Género: "virus similares a RTBV", Especie tipo: virus baciliforme de tungro del arroz, Género: "virus similares al aclaramiento de la vena de Petunia", Especie tipo: virus del aclaramiento de la vena de Petunia;

Virus ADNmc circulares: Familia: Geminiviridae, Género: Mastrevirus (Geminivirus subgrupo I), Especie tipo: virus delestriado del maíz, Género: Curtovirus (Geminivirus del subgrupo II), Especie tipo: virus de la rizomanía de la remolacha; Género: Begomovirus (Geminivirus subgrupo III), Especie tipo: virus del mosaico dorado de la judía;

ARN virus

Virus ARNmc: Familia: Bromoviridae, Género: Alfamovirus: Especie tipo: virus del mosaico de la alfalfa, Género: ilarvirus, Especie tipo: virus del estriado del tabaco, Género: Bromovirus, Especie tipo: virus del mosaico del bromo, Género: Cucumovirus, Especie tipo: virus del mosaico del pepino; Familia: Closteroviridae, Género: Closterovirus, Especie tipo: virus del amarilleo de la remolacha, Género: Crinivirus, Especie tipo: virus del amarilleo infeccioso de la lechuga, Familia: Comoviridae, Género: Comovirus, Especie tipo: virus del mosaico del fréjol, Género: Fabavirus, Especie tipo: virus 1 de la marchitez de la haba, Género: Nepovirus, Especie tipo: virus del mosaico anular del tabaco. Familia: Potyviridae, Género: Potyvirus, Especie tipo: virus Y de la papa, Género: Rymovirus, Especie tipo: virus del mosaico del raygrass, Género: Bymovirus, Especie tipo: virus del mosaico amarillo de la cebada; Familia: Sequiviridae, Género: Sequivirus, Especie tipo: virus del moteado amarillo de la pastinaca, Género: Waikavirus, Especie tipo: virus esférico del tungro del arroz; Familia: Tombusviridae, Género: Carmovirus, Especie tipo: virus del moteado del clavel, Género: Dianthovirus, Especie tipo: virus del mosaico anular del clavel, Género: Machlomovirus, Especie tipo: virus del moteado clorótico del maíz; Género: Necrovirus, Especie tipo: virus de la necrosis del tabaco, Género: Tombusvirus, Especie tipo: virus del enanismo arbustivo del tomate, Géneros no asignados de virus ARNmc, Género: Capillovirus, Especie tipo: virus de la madera asurcada del manzano; Género: Carlavirus, Especie tipo: virus latente del clavel; Género: Enamovirus, Especie tipo: virus de las excrecencias y mosaico del guisante, Género: Furovirus, Especie tipo: virus del mosaico del trigo transmitido por el suelo, Género: Hordeivirus, Especie tipo: virus del mosaico estriado de la cebada, Género: Idaeovirus, Especie tipo: virus del enanismo arbustivo de la frambuesa; Género: Luteovirus, Especie tipo: virus del enanismo amarillo de la cebada; Género: Marafivirus, Especie tipo: virus del rayado fino del maíz; Género: Potexvirus, Especie tipo: virus X de la papa; Género: Sobemovirus, Especie tipo: virus del mosaico sureño de la judía, Género: Tenuivirus, Especie tipo: virus del estriado del arroz, Género: Tobamovirus, Especie tipo: virus del mosaico del tabaco, Género: Tobravirus, Especie tipo: virus del cascabeleo del tabaco, Género: Trichovirus, Especie tipo: virus de las manchas cloróticas del manzano; Género: Tymovirus, Especie tipo: virus del mosaico amarillo del nabo, Género: Umbravirus, Especie tipo: virus del moteado de la zanahoria;

Virus ARNmc negativos: Orden: Mononegavirales, Familia: Rhabdoviridae, Género: Cytorhabdovirus, Especie tipo: virus del amarilleo necrótico de la lechuga, Género: Nucleorhabdovirus, Especie tipo: virus del enanismo amarillo de la papa;

Virus ARNmc negativos: Familia: Bunyaviridae, Género: Tospovirus, Especie tipo: virus de las manchas bronceadas del tomate;

Virus ARNbc: Familia: Partitiviridae, Género: Alphacryptovirus, Especie tipo: virus críptico 1 del trébol blanco, Género: Betacryptovirus, Especie tipo: virus críptico 2 del trébol blanco, Familia: Reoviridae, Género: Fijivirus, Especie tipo: virus de la enfermedad de Fiji, Género: Phytoreovirus, Especie tipo: virus tumoral de las heridas, Género: Oryzavirus, Especie tipo: virus del raquitismo andrajoso del arroz;

Virus no Asignados: genoma ADNmc: Especie: virus del cogollo racimoso del plátano, Especie: virus de la caída foliar del coco, Especie: virus del enanismo del trébol subterráneo, Genoma: ADNbc Especie: virus de las venas amarillas delpepino; Genoma: ARNbc Especie: virus del enamismo del tabaco, Genoma: ARNmc Especie: virus del ajo A, B, C y D, Especie: virus del moteado de la vid, Especie: virus del mosaico de la línea blanca de maíz, Especie: virus 2 latente del olivo, Especie, virus del melón de ourmia, Especie: virus de las manchas por zonas del geranio

Satélites y Viroides: Satélites: Virus satélite de ARNmc: Virus satélite del Subgrupo 2, especie tipo: satélite de la necrosis del tabaco,

ARN Satélite, Satélites de ARNm de tipo B subgrupo 2, Satélites de ARN de tipo lineal del subgrupo 3C, satélites de ARN de tipo circular del subgrupo 4D, Viroides, especie tipo: viroide de tubérculo espinado de la patata.

\vskip1.000000\baselineskip

En la mayoría de los casos, los vectores de origen viral de las plantas se usan como plásmidos capaces de replicación autónoma en plantas (replicones). Sin embargo, se conocen los principios necesarios para modificar por ingeniería genética tales plásmidos utilizando elementos no virales. Por ejemplo, se han descrito muchos orígenes de replicación supuestos de células vegetales (Berlani et al., 1988, Plant Mol. Biol., 11, 161-162; Hernandes et al., 1988, Plant Mol. Biol., 10, 413-422; Berlani et al., 1988, Plant Mol. Biol., 11, 173-182; Eckdahl et al., 1989, Plant Mol. Biol., 12, 507-516).Se ha demostrado que las secuencias de replicación de manera autónoma (elementos ARS) de genomas de plantas superiores tienen características estructurales y de secuencia en común con elementos ARS de levaduras y animales superiores (Eckdahl et al., 1989, Plant Mol. Biol., 12, 507-516). Los elementos ARS vegetales son capaces de conferir la capacidad de replicación autónoma a plásmidos en Saccharomyces cerevisiae. Los estudios en secuencias de ADN nuclear del maíz capaces de promover la replicación autónoma de plásmidos en levaduras muestran dos familias de secuencias muy repetidas dentro del genoma del maíz. Estas secuencias tienen un patrón de hibridación genómico característico. Típicamente existe solo una copia de una secuencia homóloga de ARS en cada 12-15 kb del fragmento genómico (Berlani et al., 1988, Plant Mol. Biol., 11:161-162).Otra fuente de replicones de origen vegetal son los elementos espaciadores de ADN ribosomal vegetal que pueden estimular la amplificación y expresión de genes heterólogos en plantas (Borisjuk et al., 2000, Nature Biotech., 18, 1303-1306).

Por lo tanto, un replicón o un vector precursor contemplado en esta invención no necesariamente se obtiene de un virus vegetal. Los virus de ADN de plantas proporcionan una manera sencilla de modificar replicones por ingeniería genética (vectores) que pueden ser útiles específicamente para la transformación de ADN dirigido, sino que también son posibles vectores formados total o parcialmente por elementos de virus de ARN vegetal u otros virus no vegetales. Los replicones basados en virus vegetales evidentemente son ventajosos. Tales replicones, además de la replicación, pueden proporcionar funciones útiles adicionales, por ejemplo, para movimiento de una célula a otra y a larga distancia. Además, con frecuencia se pueden separar con mayor facilidad de la célula vegetal a posteriori mediante el uso de métodos de erradicación de virus conocidos de plantas infectadas.

En la figura 1 se muestra el principio general de la invención. En el ejemplo más sencillo, se proporciona un tipo de vector precursor (pro-vector) (A) en la célula vegetal en donde, ante su procesamiento en la célula, produce al menos uno o al menos dos replicones estructuralmente relacionados y funcionalmente distintos (F y G) los cuales son capaces de proporcionar la amplificación o la expresión de las secuencias de interés. Se puede introducir en la célula vegetal más de un vector precursor [A(+C,D,E...)]. Opcionalmente, dicha célula vegetal puede ser transgénica y contener otro componente adicional (B) necesario para el procesamiento del vector precursor y/o la expresión, replicación o movimiento célula a célula o sistémico.

En una realización de la invención, se describe un sistema pro-vector (vector precursor) que se basa en el corte y empalme del ARN del pro-vector en el núcleo de la planta. Este sistema comprende una molécula de ADN del pro-vector que contiene partes de ADNc del genoma del virus de la planta, uno o varios de los genes de interés y sitios de corte y empalme funcionales en la célula vegetal (véanse, por ejemplo, las figuras 2 ó 4). Después de transcripción en la célula vegetal transfectada, el producto primario de ARN (pro-vector o vector precursor) se puede procesar por corte y empalme. Debido al diseño del pro-vector (vector precursor), el gen de interés (por ejemplo GFP) sustituye uno de los genes virales (por ejemplo CP) en esta forma cortada y empalmada. Esto permite que el gen de interés (GFP) se exprese a través de la ruta viral normal en vez de la proteína viral sustituida. Sin embargo, dado que el corte y empalme no puede avanzar con una eficacia del 100%, una fracción del transcrito primario permanece sin cortar ni empalmar y se exporta desde el núcleo tal cual, en forma cortada y empalmada. Como resultado, aparecen en el citoplasma de la célula vegetal transfectada dos tipos de ARN de vector viral auto-replicantes (replicones). Esto conduce a la expresión tanto de GFP como de CP a partir de los replicones generados utilizando un vector precursor. Debe mencionarse que, en el caso ejemplificado, el nivel de expresión de GFP probablemente sea mucho más elevado que el de CP. Se ha demostrado en tobamovirus que la cantidad de proteína viral producida durante la infección depende de la distancia entre el gen que codifica la proteína y el extremo 3' del virus. Dado que GFP se expresa de la forma cortada y empalmada del ARN, el ARN subgenómico correspondiente es significativamente más corto que el ARN a partir del cual se expresa CP (figura 4; sGFP indica un GFP sintético o modificado por ingeniería genética).

Como ejemplo de esta realización se construyen dos pro-vectores (vectores precursores) basándose en dos virus vegetales bien conocidos: el virus X de la patata (PVX) y el tobamovirus que infecta a crucíferas (CrTMV). En ambos casos, el gen CP del virus se flanquea con sitios de corte y donante (aguas arriba) y aceptor (aguas abajo) (SA y SD, respectivamente). GFP se clonó aguas arriba del sitio aceptor para expresar únicamente el transcrito cortado y empalmado. Las funciones fisiológicas de CP en PVX y CrTMV son diferentes. En el caso de PVX, CP es necesario para el movimiento del virus de célula a célula. En CrTMV, CP participa principalmente en la propagación del virus a larga distancia (infección sistémica) y no es crucial para la infección de las células colindantes. Estos ejemplos proporcionan dos patrones diferentes de la expresión del gen indicador (GFP). En el caso del sistema basado en PVX, la propagación viral se detiene en las células transfectadas primarias hasta que se exprese la cantidad necesaria de CP desde un replicón menos eficaz que se forma a partir de ARN no cortado ni empalmado. Esto conduce a la súper-producción de GFP sintetizado mucho más rápidamente en la misma célula. Finalmente, la cantidad necesaria de CP se acumula y ambos replicones penetran en las células colindantes donde se repite el proceso. Por el contrario, en el caso del pro-vector basado en CrTMV, la propagación viral no se limita al movimiento de una célula a otra. Ambas formas del vector actúan independientemente, lo que conduce a un crecimiento más rápido del área
infectada.

Aunque los ejemplos específicos que describen la modificación del ARN como un mecanismo para generar replicones de acuerdo con la invención se basan en el corte y empalme del ARN, también se pueden utilizar otros mecanismos de modificación de ARN para el proceso de esta invención. Estos incluyen, por ejemplo, modificaciones inter alia como ligación de ARN o recombinación de ARN. La ligación de moléculas diferentes de ARN por enzimas tales como ARN ligasa permite producir una pluralidad de diferentes replicones de ARN dentro de una célula basada en la actividad enzimática interna de las células vegetales o basada en la expresión de las ligasas bien conocidas, tales como la ligasa de ARN T4 (Nishigaki et al., 1998, Mol. Divers., 4, 187-190) o la ligasa de ARN mitocondrial de Leishmania (Blanc et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 24289-24269). La recombinación de ARN-ARN es un fenómeno bien estudiado. Se produce con facilidad en una planta hospedadora entre moléculas de ARN viral con cierto grado de homología (Allison et al., 1990, Proc. Natl. Cad. Sci. 87, 1820-1824; Rao et al., 1990, J. Gen. Virol., 71, 1403-1407; E.U.A. 5,877,401).

En otra realización, los vectores precursores se procesan por recombinación de ADN de sitio específico produciendo un replicón o replicones parcialmente diferentes o ensamblando un replicón viral in vivo. En este caso, los rearreglos moleculares transcurren a nivel de ADN. Se redistribuyen varias moléculas (pro-vectores) por medio de recombinación para producir una o varias moléculas vectores (replicones). El primer componente de ADN del sistema puede contener un promotor vegetal (actina 2 de Arabidopsis) fusionado a la parte principal del genoma de CrTMV - el gen de polimerasa más el gen de MP seguido por un sitio de recombinación específico. Los componentes secundarios son ADN plasmídicos que comprenden el mismo sitio de recombinación seguido por un(os) gen(es) de interés (cualquier gen indicador) o un gen CP viral. El 3'-UTR de CrTMV debe clonarse utilizando aguas abajo en el gen de interés. El último componente del sistema puede ser Cre-recombinasa o integrasa que exprese ADN. Estas enzimas promueven la reorganización de componentes de pro-vector en moléculas de vector activas (replicones). Debe resaltarse que ninguno de los componentes pro-vector es infeccioso en solitario, lo cual es importante en términos de la seguridad biológica del sistema.

Después de proporcionar una célula vegetal con todos los componentes del sistema de componentes múltiples descrito, la recombinación ocurre y se pueden formar uno o varios replicones (véase las Figuras 8, A, B y C). Estas moléculas de ADN rearregladas pueden transcribirse (dado que transportan el promotor de actina 2 de Arabidopsis) en el núcleo y se exportan al citoplasma. Finalmente, al igual que en el caso que implica corte y empalme de ARN, varios vectores replicantes de ARN aparecen en el citoplasma de la célula transfectada. En esta realización se describe el sistema donde la totalidad de estos vectores contienen un gen MP funcional y un gen ubicado utilizando aguas abajo. Esto permite que cada ARN vector exprese ambos un gen MP funcional y un gen colocado ubicado utilizando aguas abajo y que penetre dentro de células vecinas. Se debe establecer que son posibles también otras combinaciones y que se contemplan que están dentro del ámbito de esta invención.

En la invención se ilustran dos planteamientos diferentes de la distribución de recombinasa. La recombinasa puede distribuirse en la célula en un proceso de co-bombardeo o por expresión transitoria mediada por Agrobacterium junto con otros componentes de ADN del sistema. Como otro planteamiento, se ha obtenido una planta transgénica que exprese la Cre-recombinasa. Esto reduce el número de componentes que se deben proporcionar a la célula y, como un resultado, incrementa la eficacia total del sistema. Adicionalmente, esto mejora aún más la seguridad del proceso ya que no puede ocurrir afuera de una planta que fue manipulada genéticamente para apoyar el proceso.

Durante la clonación de los componentes del pro-vector, se clona un sitio de recombinación LoxP utilizando aguas arriba de el/los gen(es) de interés. Un sitio LoxP contiene dos pequeñas repeticiones invertidas separadas por varios nucleótidos y forma una estructura de tallo-lazo en el ARN. El tallo contiene únicamente 4 pares de GC de manera que no es muy estable. Sin embargo, este tallo puede reducir la eficacia de traducción de un gen utilizando aguas abajo. Para resolver este problema, se puede clonar cualquier potenciador traduccional entre LoxP y el gen de interés. En los ejemplos con Cre recombinasa se usó un líder omega de TMV U1. Sin embargo, se puede usar cualquier otra secuencia potenciadora de traducción (por ejemplo, IRES_{mp}75 desde CrTMV o TMV U1) así como IRES vegetales. Los elementos IRES_{mp}75 preferiblemente se pueden usar como potenciadores traduccionales como en los ejemplos con integrasa del fago PhiC31. En este caso, en un conjunto de provectores, los sitios de recombinación LoxP se sustituyeron por sitios att (sitios de unión) del fago PhiC31 de Streptomyces (Thorpe & Smith, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 5505-5510; Groth et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 5995-6000) que son las secuencias diana para la recombinación de la enzima integrasa. Se clonaron en los provectores dos sitios att diferentes: mientras que se insertaron attP en los vectores de tipo polimerasa-MP-LoxP, se clonó un sitio attB-recombinación dentro de los provectores que transportan el gen de interés seguido por una secuencia 3'NTR y un terminador nos. Similar al sistema Cre, los sitios de recombinación att limitan la eficacia de traducción de un gen, el cual se localiza utilizando aguas abajo. Por lo tanto, también en este sistema se clonaron secuencias potenciadoras traduccionales entre los sitios attB y los genes de interés. Se mostró que las secuencias IRES_{mp}75 tienen un efecto comparable o incluso mejor como potenciadores traduccionales en comparación con el líder omega de TMV U1.

Los sistemas adecuados de sitio de recombinasas/recombinación incluyen inter alia el sistema Cre-Lox de bacteriófago P1 (Austin et al., 1981, Cell, 25, 729-736), el sistema Flp-Frt de Saccharomyces cerevisiae (Broach et al., 1982, Cell, 29, 227-234), el sistema R-Rs de Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al., 1985, J. Mol. Biol., 182, 191-203), la integrasa del fago PhiC31 de Streptomyces (Thorpe & Smith, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 5505-5510; Groth et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 5995-6000) y las resolvasas. Además se contempla que otros métodos de rearreglo o redistribución de ADN estén dentro del alcance de la presente invención. Se pueden usar otros sistemas de ADN para modificación de enzimas para generar replicones relacionados pero funcionalmente distintos dentro de una célula vegetal silvestre o sometida a ingeniería genética: endonucleasa de restricción, transposasa, recombinasa general o específica, etc.

Se pueden utilizar métodos diferentes para proporcionar a una célula vegetal con vectores precursores. ADN puede transformarse en células vegetales por un vector Ti-plásmido transportado por Agrobacterium (US 5,591,616; US 4,940,838; US 5,464,763) o bombardeo de partículas o microproyectiles (US 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616B1). También pueden usarse otros métodos de transformación de plantas como microinyección (WO
09209696; WO 09400583A1; EP 175966B1), electroporación (EP00564595B1; EP00290395B1; WO 08706614A1) o transformación de protoplastos mediada por PEG, etc. La elección del método de transformación depende de la especie vegetal a transformar. Por ejemplo, el bombardeo con microproyectiles se prefiere de manera general para la transformación de monocotiledóneas mientras que para dicotiledóneas en general se obtienen mejores resultados con la transformación mediada por Agrobacterium, se prefiere la distribución de vectores precursores mediado por Agrobacterium.

La construcción de vectores virales vegetales para la expresión de genes no virales en plantas se ha descrito en diversos documentos (Dawson et al., 1989, virology, 172, 285-293; Brisson et al., 1986, Methods in Enzymology, 118, 659; MacFarlane & Popovich, 2000, Virology, 267, 29-35; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; Voinnet et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14147-14152) y puede efectuarse fácilmente por los expertos en la técnica.

La presente invención tiene muchas ventajas en comparación con las estrategias existentes basadas en vector viral para expresar genes extraños en plantas.

Lo que es más importante, el proceso puede usarse para la expresión de más de una secuencia de ácido nucleico de interés y por lo tanto, puede usarse para la expresión de genes múltiples de una ruta o cascada bioquímica. En este sentido, el proceso de la invención es el único método disponible que puede ser usado eficazmente para la expresión de genes con el propósito de determinación de la función del gen o con el propósito de producción bioquímica.

La invención también abre una amplia gama de oportunidades para cualquier clase de construcción de cascada biológica. En la Figura 13 se presenta un ejemplo. Este sistema usa la recombinación de tres componentes de vector precursor en dos replicones. En primer lugar, el replicón A expresa MP y un gen de interés (GFP en el ejemplo). Debido a la expresión de la proteína de movimiento (MP), este vector es capaz de moverse de una célula a otra en la hoja inoculada. Sin embargo, no puede dispersarse sistémicamente en la planta infectada y no puede transmitirse a otras plantas debido a la ausencia de la proteína de recubrimiento (CP). En otras palabras, este replicón es infeccioso únicamente si se distribuye artificialmente dentro de la célula vegetal. El segundo replicón B expresa únicamente CP. Nótese que no es capaz de formar partículas virales ya que su ARN carece del origen del ensamblado de virus (colocado dentro del gen MP). Sin embargo, sí expresa CP en cantidades significativas.

El proceso que se propone es inherentemente más seguro en la medida en que es operable sólo en presencia de todos los vectores precursores. Si están presentes ambos replicones descritos anteriormente en la misma célula, se complementan entre sí y ambos componentes son capaces de moverse a células vecinas. Sin embargo, sólo el vector A puede recubrirse con CP para formar partículas virales y por lo tanto únicamente se exportará este componente de la hoja infectada a toda la planta. Si tales partículas virales penetran a hojas no infectadas, distribuyen únicamente el componente infeccioso A, pero no el B. Esto lleva a una propagación sistémica de infección en toda la planta pero el virus no puede infectar a otras plantas debido a que las partículas virales se pueden formar únicamente en hojas inoculadas primarias y estas partículas contienen únicamente un componente de replicón, el cual no es suficiente para infección sistémica de otra planta. Este sistema representa un ejemplo único de expresión altamente eficaz de un transgen en una planta completa a través de un vector viral no contagioso.

Adicionalmente, el proceso de ensamblado de un replicón viral desde por lo menos dos precursores de replicón a través de recombinación de ADN de sitio específico garantiza un nivel superior de seguridad en comparación con un vector viral conveniente que se usa para infectar células vegetales. Dicho proceso de ensamblado de replicón viral desde por lo menos dos componentes requiere que estén presentes en la misma célula vegetal los dos componentes y la recombinasa de sitio específico. Dicha recombinasa puede distribuirse in cis junto con uno de dichos componentes. Preferiblemente, la recombinación puede distribuirse por separado. De manera más preferible, la planta hospedadora puede ser sometida a ingeniería genética para que exprese la recombinasa. En este último caso, el ensamblado del vector funcional a partir de los elementos de provector se limitará específicamente a la planta hospedadora sometida a ingeniería genética.

La tecnología descrita permite una mayor eficacia de la expresión de genes en comparación con los sistemas convencionales. Esto se obtiene al reducir el tamaño del replicón o de los replicones que expresan el gen. En nuestro sistema, el tamaño se reduce significativamente en comparación con otros vectores virales ya que el vector precursor puede permitirse expresar algún(os) gen(es) viral(es) necesario(s) para la función del sistema a partir de componentes adicionales o vectores (replicones) in trans. Como se menciona anteriormente, el tamaño del ARN viral afecta drásticamente el nivel de expresión de un(os) transgen(es).

Otra ventaja técnica del sistema es que los usuarios no necesitan clonar nada dentro de la copia de ADNc de longitud completa del virus. Esta proceso difícil y que toma tiempo se evita debido a que puede usarse una construcción pre-hecha (similar a pIC3461, Figura 9) que contiene un promotor, un gen para replicasa viral y (opcionalmente) un gen para proteína de movimiento. Este constructo no requiere modificación adicional para aplicación alguna. La única clonación que necesita realizar el usuario es fusionar un gen de interés con algunas de las secuencias adicionales pequeñas (sitio de recombinación 3'-UTR del virus y señal terminadora de transcripción, donde el tamaño total es menor de 1 kb) en cualquier clase de plásmido con un número alto de copias. Esta ventaja es especialmente importante en el caso de genes cuyos productos son tóxicos para las bacterias y que requieren manejo especial durante la clonación, así como para procesos de alto rendimiento.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Ejemplo 1

Construcción de provector basado en PVX apto para corte y empalme

Se han construido dos provectores basados en 35-PVX. Se usó el plásmido PVX-201 como un plásmido recombinante básico para clonación (Chapman S et al. 1992, Plant J 1992 Jul;2(4):549-57). Este plásmido contiene ADNc de longitud completa del genoma del virus X de patata (PVX) (Gene Bank Números de Acceso NC 001455; AF172259) fusionado al promotor 35S y al terminador nos. La región promotora subgenómica CP se duplica y se insertan algunos sitios de clonación entre las regiones duplicadas en PVX-201 (véase la figura 3).

En la primera etapa se obtiene un plásmido recombinante intermediario pIC2518. Este plásmido contiene por consiguiente: el extremo C de CP (62 pb) del sitio XhoI al terminador con un sitio HindIII introducido justo después del codón de terminación, un gen mejorado GFP (sGFP) (codón de inicio incluido dentro del sitio NcoI) y el extremo 3' del virus PVX que incluye el extremo C de CP (62nt), 3'UTR y la secuencia s poli (A) seguida por un sitio SacI (Figura 3).

\vskip1.000000\baselineskip

Se sintetizaron dos grupos de oligonucleótidos para clonar dos pares diferentes de sitios de corte y empalme donador/aceptor:

100

\newpage

Después de la hibridación entre si, los oligonucleótidos correspondientes forman los siguientes fragmentos de ADN de cadena doble:

101

\vskip1.000000\baselineskip

Los extremos 5' sobresalientes de los fragmentos son adhesivos a ADN restringido por ClaI/SalI en el caso de D1 y D2. Los fragmentos A1 y A2 se pueden ligar a sitios HindIII-NcoI.

El plásmido PVX-201 descrito anteriormente (Figura 3) se digiere con ClaI y SalI. Después, el fragmento D1 o D2 se liga en el vector digerido, lo que produce el constructo pIC3033 (en el caso de D1) de pIC3053 (en el caso de D2).

El plásmido pIC2518 (Figura 3) se digiere con HindIII y NcoI. La ligación del fragmento A1 o A2 produce el constructo pIC3041 (A1) o pIC3068 (A2), respectivamente.

Se obtienen dos variantes de un plásmido provector PVX apto para corte y empalme por clonación del fragmento XhoI-SacI a partir de pIC3041 en pIC3033 y al fragmento XhoI-SacI a partir de pIC3068 en pIC3053. Los plásmidos resultantes se denominan pIC3242 (sitios de corte y empalme D1+A1) y pIC3258 (sitios de corte y empalme D2+A2) (Figura 2).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Bombardeo con microproyectiles

El bombardeo con microproyectiles se realiza con el sistema biolístico PDS-1000/He de distribución de partículas (Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery Systems (Bio-Rad)). Se bombardean hojas separadas de N. benthamiana a 6205 kPa (900 psi) con una distancia de 15 mm desde un punto de lanzamiento de macroportadora a una pantalla de detención y una distancia de 60 mm desde la pantalla de detención al tejido objetivo. La distancia entre el disco de ruptura y el punto de lanzamiento en la macroportadora es de 12 mm. Las células se bombardean después de 4 horas de pre-tratamiento osmótico.

El proceso de recubrimiento con oro de ADN (PEG/Mg) se realiza de la siguiente manera: se mezclan 25 \mul de suspensión de oro (60 mg/ml en glicerol 50%) con 10 \mul de ADN plasmídico (hasta 1 \mug/\mul) en un tubo Eppendorf y se suplementa subsecuentemente con 10 \mul de PEG 40% en MgCl_{2} 1.0 M. La mezcla se agita en vortex durante 2 min y después se incuba durante 30 min a temperatura ambiente sin mezclar. Después de centrifugación (2000 rpm, 1 min), el sedimento se lava dos veces con 1 ml de etanol 70%, una vez con 1 ml de etanol 99.5% y finalmente se dispersa en 30 \mul de etanol 99.5%. Se cargan alícuotas (6 \mul) de suspensión de ADN-oro en etanol sobre discos de macroportadora y se permite que se sequen hasta por 5-10 min.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación del ADN plasmídico

Los plásmidos se transforman en cepas E. coli DH10B y JM109, se hacen crecer preparaciones máximas en medio LB y el ADN se purifica utilizando el conjunto Qiagen.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Inoculación mecánica de plantas con ADN plasmídico provector

Se inoculan con ADN plasmídico hojas desarrolladas completamente de cinco a siete semanas de edad de plantas de Nicotiana benthamiana mediante generación mecánica de heridas. Para este propósito, se mezclan 10-50 \mug de ADN con amortiguador GKP 3x (glicina 50 mM, K_{2}HPO_{4} 30 mM, Celite 3%, bentonita 3%) y se raspa suavemente sobre el lado superior de las hojas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Expresión de un gen indicador en hojas de plantas por provector basado en PVX convertido (cortado y empal- mado)

Las hojas de N. Benthamiana desarrolladas completamente se bombardean con los plásmidos pIC3242 y pIC3258. Se espera que se sinteticen dos transcritos diferentes de ARN en la célula vegetal a partir de cada uno de estos plásmidos - la forma completa y la forma cortada y empalmada (véase la Figura 2).

La presencia del segundo transcrito puede detectarse por fluorescencia de GFP en una célula transfectada con el provector.

Se ha observado fluorescencia GFP fuerte en numerosas células de hoja bombardeadas con pIC3242 (48 horas después del bombardeo). No se detecta expresión de GFP en el caso de pIC3258 - de manera que este constructo puede servir como un control negativo en este experimento. Esta diferencia ocurre debido a los diferentes sitios donadores/aceptores usados en los constructos (véase el ejemplo 1). En el caso de pIC3258, se usa una secuencia de 9-nt que representa consenso de sitios de corte y empalme de Arabidopsis thaliana. En el caso de pIC3242, los sitios donador y aceptor se diseñan como se describe en Nussaume et al., Mol. gen. genet, 1995, 249:91-101, en donde se sometieron a exámenes y pruebas para que fueran activos en plantas.

De acuerdo con diversas investigaciones (Fedorkin et al., J Gen Virol 2001; 82(Pt 2):449-58, Cruz et al., Plant Cell 1998; 10(4):495-510), se requiere CP de PVX para el transporte viral de célula a célula. En el caso del constructopIC3242, el gen para CP debe cortarse y empalmarse fuera del ARN. Esto significa que la forma cortada y empalmada del transcrito (Figura 3) no puede expresar el CP y proporcionar un movimiento de célula a célula del virus. Sin embargo, en varios experimentos con pIC3242, se detectaron no sólo células únicas sino también loci de células múltiples (10-1000 células) que expresan GFP. Esto indica que el corte y empalme del transcrito del provector no ocurre con una eficacia de 100%. Una fracción del ARN de longitud completa permanece sin cortar y empalmar y por lo tanto CP puede expresarse a partir de esta forma del transcrito, mientras que el gen para GFP permanece silenciado en este ARN (dado que no expresión de GFP se detecta en el caso de pIC3258).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Generación de plantas transgénicas de N. benthamiana que expresan recombinasa Cre

El fragmento terminador Orf-Nos del promotor-LoxP-Cre de actina 2 a partir de pIC1321 se subclona como un fragmento Not1 romo-SacI en los sitios SmaI y SacI del vector binario pBIN19, lo que resulta en el constructo pIC1593 (Figura 14).

Se introduce el plásmido pIC1593 en Agrobacterium cepa AgI1 por electroporación y las agrobacterias transformadas se usan para transformar ADN de N. benthamiana extraído de 10 transformantes y se usa para detectar la presencia del transgen, por PCR. Todas las plantas dieron resultado positivo cuando se realiza PCR con cebadores para el marcador de transformación de canamicina o para el gen Cre.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Generación de vectores funcionales a partir de provectores utilizando recombinación de sitio específico a) Descripción general del sistema

El sistema descrito consiste de dos tipos de núcleo de vectores basados en CrTMV los cuales llevan sitios de recombinación LoxP (figura 8):

i)

Tipo de vector: Polimerasa-MP-LoxP: El vector codifica el RdRp de CrTMV y la proteína de movimiento (MP), lo que permite que el virus se mueva de una célula a otra, pero que no se mueva de manera sistémica. La transcripción viral se controla por un promotor de Arabidopsis-actina 2.

ii)

Tipo de vector: El LoxP-gen de interés-3'NTR-terminador nos (véase la Figura 8 a-c): Esta clase de vectores codifican un gen indicador (sGFP o GUS) y elementos reguladores (nos: terminador de nopalina sintasa; 3'NTR: región no traducida, pseudonudos y estructura similar a ARNt de CrTMV). La expresión de la proteína de recubrimiento (CP; véase la Figura 8 b) permite que el vector se disperse sistémicamente en la planta hospedadora.

iii)

Tipo de vector: polimerasa-MP-attP: véase i), con sitio de recombinación attP

iv)

Tipo de vector: attB-gen de interés-3'NTR-terminador nos (véase la Figura 15 a-c): véase ii), con sitio de recombinación attB.

\vskip1.000000\baselineskip

Después de la recombinación catalizada por la recombinasa Cre o integrasa (a través de co-infección de un constructo viral que codifica para Cre o para integrasa) se forman unidades funcionales (replicones) que son capaces de expresar un gen indicador de manera eficaz y son capaces de moverse de una célula a otra (Figura 8 A-C, 15 A-C) o sistémicamente (Figura 8 B).

\vskip1.000000\baselineskip

b) Construcción de plásmido A. Clonación del vector tipo polimerasa-MP-LoxP (Figura 9)

Se toma un fragmento de MP EcoRI-XhoI del plásmido pIC3312 (Figura 5) y se clona en el plásmido pIC1212 el cual lleva dos sitios LoxP en orientaciones opuestas. El gen MP del plásmido pIC3342 contiene un codón terminador el cual se introduce 25 AA antes del tope natural. En el producto resultante pIC3431, un fragmento que contiene parte del gen MP se localiza junto a un sitio LoxP. Ambos elementos se aíslan a través de la restricción EcoRI-SacI. Después de hacer romos los sitios de restricción SacI, el fragmento se clona en un vector que contiene parte del plásmido pIC3301, que contiene un único sitio de restricción EcoRI en el gen para MP. Se elige NotI (romo) como un segundo sitio de restricción. En el producto de ligación resultante (pIC3461) el gen para CP, la secuencia IRES, el gen para sGFP y la región 3' no traducida de pIC3301 se sustituyen por LoxP (Figura 9).

\vskip1.000000\baselineskip

B. Clonación de los vectores de LoxP-gen indicador-3'NTR-terminador nos

a)

Constructo LoxP-sGFP-3'NTR-nos (Figura 8 a)

El fragmento XhoI-NcoI que lleva un sitio LoxP junto a una secuencia líder \Omega se toma del vector pIC2744. Con el fin de colocar las secuencias adyacentes a un gen indicador, el fragmento se clona en el plásmido pIC1721, que contiene los sitios de restricción apropiados junto a un gen para sGFP y una secuencia 3'NTR. La sustitución de una secuencia IRES por el fragmento conduce al plásmido resultante pIC3421. Con el fin de agregar una secuencia terminadora nos, se corta el plásmido pIC3421 con KpnI y NotI. El fragmento se introduce en la parte que contiene el vector del plásmido pIC3232 y puede obtenerse el constructo final pIC3441 (véase las Figuras 10 y 8a).

b)

Constructo LoxP-CP-sGFP-3'NTR-nos (Figura 8 b)

Se utilizan como vectores iniciales los plásmidos descritos anteriormente, pIC3342 y pIC1212. El fragmento PstI-SacI de pIC3342 que contiene los genes para CP y sGFP se clona en pIC1212. Como un resultado, el sitio LoxP se localiza cercano a CP y sGFP en el producto pIC3451. Para agregar una secuencia de terminador nos, se usa un planteamiento similar alcaso a): Se introduce un fragmento de pIC3451 tratado con EcoRI-NotI dentro de la parte que contiene el vector de pIC3232 que resulta en el plásmido pIC3491 (véase la Figura 11).

c)

Constructo LoxP-CP-GUS-3'NTR-nos (Figura 8 c)

El plásmido pIC751 es análogo a pIC1721 y lleva un gen indicador GUS en lugar de sGFP. Al cortar con NcoI y NotI, el gen GUS y la región 3' no traducida se pueden clonar directamente en pIC3441 y por lo tanto se obtiene constructo final pIC3521 (Figura 12).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

Expresión de un solo gen indicador en hojas de plantas por provector basado en CrTMV convertido (recombinado)

Hojas separadas de N. benthamiana se bombardean con partículas de una mezcla de tres plásmidos: pIC3441 (LoxP-GFP, Figura 10), pIC3461 (promotor de actina 2-CrTMV RdRp-MP-LoxP, Figura 9) y pIC2721 (recombinasa Cre bajo el control del promotor hbt). Se detecta fluorescencia de GFP en varios loci multicelulares 38 horas después del bombardeo. Se observa durante los siguientes días un gran incremento de la fluorescencia y del tamaño del área infectada (las hojas bombardeadas se incuban a 25ºC sobre papel de filtro húmedo). No se detecta fluorescencia de GFP en las hojas control bombardeadas con pIC3441 junto con pIC2721, sin pIC3461.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

Expresión de varios genes en hojas de plantas mediante provector basado en CrTMV convertido (recombinado)

Se bombardean con partículas hojas separadas de N. benthamiana con una mezcla de varios plásmidos:

a)

pIC3441 (LoxP-GFP, Figura 10), pIC3461 (promotor de actina 2-CrTMV RdRp-MP-LoxP, Figura 9) y pIC2721 (recombinasa Cre bajo el control del promotor hbt), pIC3521 (LoxP-GUS, Figura 12).

b)

pIC3441 (LoxP-GFP, Figura 10), pIC3461 (promotor de actina 2-CrTMV RdRp-MP-LoxP, Figura 9) y pIC2721 (recombinasa Cre bajo el control del promotor hbt), pIC3491 (LoxP-CP, Figura 11).

Ambos genes indicadores GFP y GUS se expresan fuertemente en hojas bombardeadas en el caso a). La formación de partículas virales y el movimiento sistémico del virus se lleva a cabo en el caso b).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

Construcción de un provector basado en CrTMV apto para corte y empalme

El provector apto para corte y empalme basado en virus CrTMV tiene ciertas ventajas en comparación al basado en PVX. En la Figura 4 se describe un sistema que permite crear un gen indicador que exprese el sistema con el virus, que es completamente funcional en la hoja infectada. Al contrario de PVX, la proteína de recubrimiento de CrTMV no se requiere para el movimiento viral de célula a célula de manera que el corte y empalme no influye sobre la propagación viral en la hoja infectada.

\vskip1.000000\baselineskip

A. Clonación del constructo intermediario pIC3312

Se obtiene un fragmento de PCR usando ADNc clonado de CrTMV y los siguientes cebadores:

MPERI+ (que corresponde a la región media de MP que incluye el sitio EcoRI - posición 5455 en el genoma de CrTMV): GTGGTTGACGAATTCGTC

MP- (Complementario al extremo C de MP 17 aminoácidos utilizando aguas arriba del terminador natural de codón introduciendo un terminador artificial con los sitios ClaI y XhoI utilizando aguas abajo. Además, este cebador contiene una mutación puntual de CP, ATG en ACG, que elimina el inicio natural del gen para CP sin cambio de aminoácido en MP): GGTCTCGAGTTATCGATTATTCGGGTTTGTAATGTTGTAAGACGTTTTCTTC TTTC

\vskip1.000000\baselineskip

Se obtiene otro fragmento de PCR usando la misma plantilla y los siguientes cebadores:

CP+ (que corresponde al inicio del gen para CP con sitios XhoI y PstI introducidos utilizando aguas arriba de ATG): TAACTCGAGACCTGCAGCATGTCTTACAACATTACAAACC-CGAATCAG

CP- (Complementario al extremo C de CP introduciendo la sustitución del nucleótido sencillo para eliminar el sitio NcoI en el gen para CP. Además, este cebador introduce los sitios de restricción HindIII y NcoI utilizando aguas abajo del gen para CP): CTACTCCATGGTCAAGCTTAAGTAGCAGCAGCAGTAGTCCACGGCACC

\vskip1.000000\baselineskip

En primer lugar, el fragmento de PCR se digiere con las enzimas EcoRI y XhoI. En segundo lugar, los fragmentos digeridos con XhoI y NcoI se unen por ligación en el vector pIC1721 (Figura 5) por los sitios EcoRI y NcoI produciendo el plásmido pIC3151 (Figura 5). Después se digiere pIC3151 con KpnI y EcoRV, el sitio KpnI se vuelve romo con ADN polimerasa T4 y el plásmido cortado se autoliga para eliminar los sitios entre KpnI y EcoRV. El plásmido resultante se denomina pIC3312 (véase la Figura 5).

\vskip1.000000\baselineskip

B. Clonación del provector pIC3393 apto para corte y empalme y construcción de control pIC3401

Los fragmentos de ADNbc descritos en el ejemplo 1 que contienen sitios de corte y empalme donadores y aceptores se clonan en pIC3312 usando los sitios ClaI y XhoI en el caso del donador y HindIII y NcoI en el caso de los sitios de corte y empalme aceptores (véase la Figura 6). Los plásmidos que se obtienen se denominan pIC3378 (sitio donador) y pIC3382 (sitio aceptor).

Para obtener un plásmido recombinante de control negativo, se clona el fragmento pIC3401 EcoRI-NotI de pIC3382 en pIC3301 (Figura 7).

El plásmido final pIC3393 se obtiene en la clonación de dos fragmentos usando el fragmento EcoRI-PstI a partir de pIC3378 con el fragmento PstI-NotI a partir de pIC3382 y pIC3301 digerido con EcoRI y NotI como un vector (Figura 7).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Expresión del gen indicador en hojas de plantas mediante el provector apto para corte y empalme basado en CrTMV convertido

Las hojas separadas de N. benthamiana se bombardean con partículas con plásmidos pIC3393 y pIC3401. La fluorescencia de GFP se detecta en varios loci multicelulares 48 horas después del bombardeo en el caso de pIC3393. No aparece fluorescencia GFP en hojas bombardeadas con el plásmido recombinante de control pIC3401.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11

Expresión de un gen de interés a partir de un vector viral ensamblado desde dos provectores basados en CrTMV a través de un sistema de sitio específico basado en att/integrasa a) Descripción general del sistema

El sistema descrito consiste en dos tipos de núcleo de vectores basados en CrTMV que llevan los sitios de recombinación attB o attP (Figura 15):

i)

Tipo de vector: Polimerasa-MP-attP: El vector codifica el RdRp de CrTMV y la proteína de movimiento (MP), lo que permite que el movimiento del virus de una célula a otra, pero no un movimiento sistémico. La transcripción viral se controla por un promotor de Arabidopsis-actina 2.

ii)

Tipo de vector: attB-gen de interés-3'NTR-terminador nos (véase la Figura 15 a-b): Esta clase de vectores codifican un gen indicador (sGFP o GUS) y elementos reguladores (nos: terminador nopalina-sintasa; 3'NTR: región no traducida, pseudonudos y estructura de CrTMV similar a ARNt).

iii)

Tipo de vector: attB-gen de ubiquitina de interés-3'NTR-terminador nos (véase la Figura 15 c): Con el fin de obtener una proteína definida que puede aislarse de plantas, se introduce una secuencia de señal de escisión de ubiquitina entre el sitio de recombinación attB y el gen de interés localizado utlizando aguas abajo (por ejemplo GFP, interferona 2B, insulina o somatotropina). Mediante el uso de este sistema, se puede elegir cualquier aminoácido, excepto prolina, como el primer aminoácido de la proteína sintetizada.

Después de la recombinación catalizada por la enzima integrasa (a través de coinfección de un constructo viral que codifica integrasa), se forman unidades funcionales (replicones) que son capaces de expresar el gen de interés eficazmente y son capaces de movimiento de célula a célula (Figura 8 A-C).

\vskip1.000000\baselineskip

b) Construcción de plásmido A) Clonación del tipo de vector: polimerasa-MP-attP (Figura 16)

Se toma un fragmento de KpnI-XhoI del plásmido pIC3461 (Figura 16). Después de hacer romo el sitio de restricción XhoI, el fragmento se clona en el vector binario pIC3994 que lleva dos sitios attB en orientaciones directas, límites de ADN-T izquierdo y derecho (LB y RB) y un casete de expresión de canamicina como un marcador de transformación vegetal. Similar al clon análogo del sistema Cre/Lox, el plásmido resultante pICH4851 lleva un gen MP con un codón terminador que se introduce 25 AA antes del tope natural.

\vskip1.000000\baselineskip

B. Clonación del tipo de vector: attB-gen de interés-3'NTR-terminador nos (Figuras 17-20)

a) Constructo attB-sGFP-3'NTR-nos

Combinación de cebador A)

attB Xho(+):

ATCACTCGAGCTCGAAGCCGCGGTGCGGGT:

Complementario a la parte 5' de attB y que lleva un sitio de restricción XhoI en el extremo 5'

\vskip1.000000\baselineskip

attB \Omega(-):

GGTAATTGTTGTAAAAATACGATGGGTGAAGGTGGAGTACG:

La parte 3' del cebador corresponde a la región 3' de la secuencia attB, la parte 5' contiene 20 nucleótidos que presentan complementariedad con la parte 5' del elemento \Omega.

\vskip1.000000\baselineskip

La combinación de cebador A se usa en una plantilla que contiene attB para crear un producto de PCR que consiste de la secuencia completa de attB, 20 nucleótidos de la secuencia líder \Omega y un sitio de restricción XhoI en el extremo 5'.

\vskip1.000000\baselineskip

Combinación de cebador B)

attB\Omega(+):

CGTACTCCACCTCACCCATCGTATTTTTACAACAATTACC:

La parte 3' del cebador corresponde a la región 5' de la secuencia \Omega, la parte 5' contiene 20 nucleótidos que presentan complementariedad con la parte 5' del elemento attB.

\vskip1.000000\baselineskip

\Omega NcoI(-):

CATGCCATGGGTAATTGTAAATAGTAATTGTAATGTT

Complementariedad con la parte 3' de \Omega y que lleva un sitio de restricción NcoI en el extremo 5'.

\vskip1.000000\baselineskip

La combinación B de cebador se usa en una plantilla que contiene la secuencia \Omega para crear un producto de PCR que contiene la secuencia completa del líder \Omega, 20 nucleótidos de recombinación attB y un sitio de restricción NcoI en el extremo 3'.

Después de obtener productos de PCR de la combinación de cebador A) y B), los oligonucleótidos aislados se usan juntos como plantillas para una reacción de PCR mediante el uso de los cebadores attB XhoI (+) y \Omega NcoI(-). Como un producto PCR final, se puede sintetizar una fusión de la recombinación de attB y la secuencia líder \Omega. Este fragmento contiene sitios de restricción XhoI y NcoI en sus extremos. Se aísla el producto de PCR, se digiere y se clona en los sitios XhoI y NcoI del plásmido pICH3441 con el fin de sustituir la fusión LoxP-\Omega. El plásmido intermedio se trata con KpnI y HindIII. Al insertar este fragmento en los sitios correspondientes del vector binario BV10, se puede obtener un vector attB-sGFP-3'NTR-nos que es transformable en Agrobacterium (pICH5151, véase Figura 17).

Se usa un planteamiento similar para clonar un provector análogo con el gen indicador GUS. El fragmento de PCR descrito anteriormente se clona en los sitios XhoI y NcoI del plásmido pICH3521 que contiene GUS lo que resulta en el plásmido pICH4061. Finalmente, se liga en el vector binario BV10 un fragmento KpnI-HindIII del plásmido pICH4061, resultando en el vector final pICH5161 que es capaz de transformación estable en Agrobacterium (pICH5161, véase la Figura 18).

\vskip1.000000\baselineskip

C) Construcción del provector 3' que contiene attB-ubiquitina-interferón

Con el fin de clonar una fusión de una secuencia de ubiquitina e interferón \alpha2B en un provector attB-3', se sintetizan ambas secuencias como una fusión y se clonan en pUC19 (obteniéndose el plásmido pUC5760). El vector se digiere con NcoI y PstI y el fragmento resultante se liga en los sitios de restricción correspondientes del plásmido pICH5781. El plásmido resultante pICH5951 contiene un sitio de recombinación attB, la fusión de ubiquitina- interferón y la región 3' no traducida, un promotor nos y un casete de expresión de canamicina. La totalidad de dichas secuencias están franqueadas por límites de ADN T (LB y RB, véase la Figura 19).

\vskip1.000000\baselineskip

D) Para sustituir la secuencia \Omega por diferentes elementos IRES que pueden servir como potenciadores traduccionales, se toma un fragmento ClaI/ApaI del plásmido pIC1701 (que contiene IRES_{mp}75(U1)) o pICH1731 (que contiene IRES_{mp}75(cr)), respectivamente. Los fragmentos se clonan en el plásmido pICH5939 (similar al plásmido pICH5781, pero sin el sitio de restricción NcoI con secuencia ATG en el codón de inicio de transcripción). En los vectores binarios finales (pICH6871, pIC6891), el sitio de recombinación attB se localiza adyacente a una secuencia IRES de 75 pares de bases (6871: origen U1, 6891: origen CrTMV), un gen indicador sGFP y los elementos reguladores 3'NTR y nos.

\vskip1.000000\baselineskip

E) Clonación del vector de tipo polimerasa-MP-LoxP en vectores binarios

Para clonar el provector LoxP que presenta polimerasa-MP en un vector

binario, se liga junto a un fragmento KpnI/XhoI y XhoI/HindIII en el vector pICBV10 que se digiere con HindIII y KpnI. El plásmido resultante pICH4371 puede transformarse de manera estable en Agrobacterium (Figura 21).

\vskip1.000000\baselineskip

F) Clonación del vector de tipo LoxP-gen de interés-3'NTR-terminador nos en un vector binario

Se usa una estrategia de clonación análoga similar a E) para clonar el provector del gen indicador LoxP en un vector binario. El plásmido pICH3441 se digiere con la enzima KpnI y HindIII. El fragmento resultante se inserta en los lados correspondientes de pICBV10 lo que resulta en el plásmido binario pICH4461 (véase la Figura 22).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12

Distribución de constructos de vectores virales por infiltración de una suspensión de Agrobacterium tumefaciens en hojas de plantas de N. benthamiana y N. tabacum

Todos los provectores del sistema Cre/Lox e integrasa/att se han clonado en vectores binarios que pueden transformarse de forma estable en Agrobacteria. Por lo tanto, hay disponibles métodos de distribución de ADN alternativos a las técnicas descritas.

Un método de distribución muy sencillo es la infiltración de suspensiones de Agrobacteria en hojas intactas. Esta denominada agroinfiltración fue desarrollada inicialmente para analizar la expresión de genes extraños y el silenciamiento genético en plantas (Kaplia et al., 1997, Plant Science, 122, 101-108; Schöb et al., 1997, Mol. Gen. Genet., 256, 581-588). La agroinfiltración de plantas transgénicas de tabaco se realiza de acuerdo con un protocolo modificado descrito por Yang et al., 2000, The Plant Journal, 22(6), 543-551. Se transforma cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens con constructos individuales (pICH4851, pICH5151, pICP1010, Figura 23) que se hacen crecer en el medio LB suplementado con rifampicina 50 mg/l, carbencilina 50 mg/l y acetosiringona 100 \mum a 28ºC. Las células de Agrobacterium de un cultivo de 5 ml durante toda la noche se recolectan por centrifugación (10 min, 4500 g) y se resuspenden en amortiguador MES 10 mM (pH 5.5) suplementado con MgSO_{4} 10 mM y acetosiringona 100 \muM. Se ajusta la suspensión bacteriana a una DO_{600} final de 0.8. En caso de la distribución de varios constructos, se mezclan suspensiones de Agrobacteria de diferentes constructos en volúmenes iguales antes de la infiltración.

La agroinfiltración se conduce en hojas expandidas casi completamente que aún están unidas a la planta intacta. Se infiltra una suspensión bacteriana usando una jeringa de 5 ml. Al infiltrar 100 \mul de suspensión bacteriana en cada punto (típicamente 3-4 cm^{2} en el área infiltrada), de 8 a 16 puntos separados por venas se pueden distribuir en una hoja de tabaco única. Después de la infiltración, las plantas se hacen crecer aún más bajo condiciones de invernadero a 22ºC y 16 h de luz.

Las hojas de N. benthamiana y N. tabacum que se han infiltrado con los constructos muestran sectores de gran expansión de GFP 8-12 días después de la infiltración. La expresión puede ser detectada bajo luz UV directamente en las hojas infiltradas. No se observa expresión de GFP en caso de controles (combinación de provector sin el clon de integrasa).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13

Distribución de provectores virales por infiltración de una suspensión de Agrobacterium tumefaciens en hojas de plantas transgénicas de tabaco que expresan la recombinasa Cre (pICH1754)

Las hojas de plantas transgénicas de tabaco (constructo transformado: pICH1754, especie Nicotiana tabacum) infiltradas con el constructo pICH4371 y pICH4461 mostró 16 días después de la infiltración sectores de crecimiento de gran expresión de GFP que se pueden observar sin microscopio bajo luz UV en plantas intactas. No es visible expresión de GFP en hojas de tipo silvestre infiltradas con la misma mezcla de suspensión de Agrobacteria.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 14

Uso de secuencias de IRES de origen viral (IRES_{mp}75 a partir de CrTMV o U1) como secuencias potenciadoras traduccionales

La presencia de un sitio de recombinación att o LoxP entre el promotor y el gen localizado utilizando aguas abajo limita la eficacia de la traducción. Por lo tanto, en la mayor parte de los casos, es necesario usar elementos de potenciación traduccional para alcanzar un nivel apropiado de expresión del gen indicador en el sistema provector. La clonación de las secuencias IRES viral IRES_{mp}75(U1) o IRES_{mp}75(cr) respectivamente entre el sitio de recombinación attB y GFP incrementa claramente la expresión del gen indicador. Mientras que en plantas que han sido infiltradas con provectores que contienen GFP que no llevan un potenciador traduccional, muestran expresión de GFP casi no detectable después de 10 días, el uso de dichas secuencias de IRES conduce a la expresión de GFP, la cual se puede detectar bajo luz UV sin usar un microscopio después de 5 días. El nivel de expresión del gen de interés proporcionado por una actividad potenciadora traduccional basada en IRES_{mp}75 es comparable o incluso superior a la proporcionada por potenciadores traduccionales "omega".

Claims (34)

1. Un proceso para causar la amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular, caracterizado por que la célula vegetal se proporciona con por lo menos dos vectores precursores diseñados para experimentar procesamiento por recombinación de sitio específico en dicha célula vegetal, donde debido al procesamiento por recombinación de sitio específico entre dichos vectores precursores, se dota a dicha célula vegetal con por lo menos un replicón capaz de replicación autónoma in dicha célula vegetal, donde dicho replicón proporciona a dicha amplificación y/o expresión.

2. El proceso de la reivindicación 1, donde dicho proporcionamiento a la célula vegetal con un vector precursor se hace por transfección viral, distribución mediada por Agrobacterium, distribución no biológica, o por conversión de un vector preprecursor ADN que se pre-integrado en un ADN nuclear vegetal para formar un vector precursor o vectores precursores.

3. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde el vector precursor es de origen de virus vegetal.

4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el vector precursor es de origen de virus de ADN.

5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el vector precursor es de origen de virus de ARN.

6. El proceso como de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el vector precursor es esencialmente de origen de retrotransposón.

7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el procesamiento del vector precursor es por modificación de ADN.

8. El proceso de la reivindicación 7, donde dicho proceso comprende la producción de un conjunto de por lo menos dos replicones del tipo AB_{1}, AB_{2},..., AB_{n} o del tipo B_{1}A, B_{2}A, ..., B_{n}A por recombinación de sitio específico de un vector (A) precursor primario con un conjunto de por lo menos dos vectores precursores secundarios (B_{1}, B_{2}, ..., B_{n}), donde n es un número entero \geq 2.

9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde se proporcionan condiciones que facilitan el procesamiento del vector precursor para dar dichos replicones.

10. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la célula vegetal es silvestre.

11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la célula vegetal se modifica por ingeniería genética de manera que proporciona las funciones necesarias para dicho procesamiento en la célula vegetal.

12. El proceso de la reivindicación 11, donde la célula vegetal se modifica por ingeniería genética de manera que proporciona in trans una o más funciones necesarias para la replicación del replicón, ensamblado de la partícula de virus, infectividad, supresión de silenciamiento por el hospedador, transcripción inversa, integración en un cromosoma hospedador, movimiento de célula a célula o a larga distancia de dichos replicones o para recombinación o corte y empalme.

13. El proceso de las reivindicaciones 11 ó 12, donde dicha modificación por ingeniería genética de dicha planta se hace por expresión transitoria, transfección mediada por virus o por Agrobacterium, integración estable en los genomas de núcleos u organelos o dentro de plásmidos de replicación autónoma de dicha célula vegetal.

14. El proceso de la reivindicación 1, donde la recombinación de por lo menos dos moléculas vectores precursores resulta en el ensamblado in vivo de un gen expresable dentro de un replicón, por lo que se combinan módulos de genes funcionales diferentes, tales como promotor, potenciador de transcripción, potenciador de traducción, terminador, partes codificantes de proteína de interés, péptidos de señal o de tránsito o de transporte de membrana, purificación o visualización de una etiqueta polipeptídica u otras proteínas de fusión, dichos diferentes módulos de genes funcionales originalmente se localizan en dos o más moléculas precursoras.

15. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que resulta en amplificación y/o expresión de dos o más secuencias de ácido nucleico de interés.

16. El proceso de la reivindicación 15, donde el proceso resulta en amplificación y/o expresión de genes múltiples de una ruta o cascada bioquímica.

17. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde uno o más de dichos replicones retienen capacidades virales adicionales tales como ensamblado de partícula viral, infectividad, supresión del silenciamiento genético, transcripción inversa, integración dentro del cromosoma hospedador, movimiento de célula a célula, o movimiento a larga distancia.

18. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde uno de dichos replicones es esencialmente un virus de tipo silvestre que proporciona en condiciones in trans necesarias para replicación de otro replicón o replico-
nes.

19. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde uno de los replicones es esencialmente un virus de tipo auxiliar que proporciona in trans funciones necesarias para replicación de otro replicón o replicones.

20. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde uno de dichos replicones es esencialmente un retrovirus de tipo silvestre o retrotransposón el cual proporciona, in trans, funciones necesarias para replicación, transcripción inversa, integración en el cromosoma hospedador de otro replicón o replicones.

21. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 20, donde por lo menos dos de dichos replicones cooperan funcionalmente entre si.

22. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 21, donde por lo menos uno de dichos replicones proporciona además para una expresión de productos necesarios para replicación de los replicones.

23. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, donde por lo menos uno de dichos replicones proporciona además para expresión de productos necesarios para movimiento de una célula a otra, larga distancia o de planta a planta, supresión del silenciamiento genético, transcripción inversa, integración en el cromosoma hospedador.

24. El proceso de la reivindicación 22 ó 23, donde dichos productos funcionan in trans.

25. El proceso como de la reivindicación 22 ó 23, donde dichos productos funcionan in cis.

26. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 25, donde uno de dichos replicones contiene un potenciador traduccional IRES_{mp}75 unido operablemente a una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica una proteína de interés.

27. Un proceso para generar amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleido de interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular, caracterizado por que una célula vegetal se proporciona con un vector precursor diseñado para experimentar procesamiento en dicha célula, por lo que, debido a dicho procesamiento, se dota a dicha célula vegetal con por lo menos dos replicones capaces de replicación autónoma en dicha célula vegetal, donde dichos replicones

(a)

están relacionados estructuralmente entre si debido a dicho procesamiento;

(b)

son funcionalmente distintos entre si; y

(c)

proporcionan la amplificación y/o expresión.

28. El proceso de la reivindicación 27, donde el procesamiento del vector precursor es por la modificación de ARN.

29. El proceso para la producción de un producto bioquímico, que comprende la amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.

30. El proceso de la reivindicación 29, donde el producto bioquímico es una proteína, específicamente una proteína farmacéutica o un anticuerpo funcional.

31. Un proceso para la determinación de función de gen, que comprende amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.

32. Un proceso para evolución artificial o dirigida, que comprende amplificación o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.

33. Un proceso de transformación genética, que comprende la amplificación de una o más secuencias de ácido nucleico de interés, de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 28, seguido por la integración de dichas secuencias en el genoma de célula vegetal utilizando un proceso de integración basado en retrovirus o en retrotransposón.

34. Un sistema para causar la amplificación y/o expresión de un gen de interés en una célula vegetal, que comprende:

-

una construcción que contiene un promotor y un gen replicasa viral seguido por un sitio específico de recombinación y

-

un plásmido que se clona en un gen de interés fusionado con un sitio de recombinación, un 3'-UTR de un virus y una señal de terminación de trascripción,

donde una célula vegetal se proporciona con dicho constructo y dicho plásmido se dota de un replicón por la recombinación entre dicho constructo y dicho plásmido.