ES2306807T3

ES2306807T3 - Late-pcr.

Info

Publication number: ES2306807T3
Application number: ES02795963T
Authority: ES
Inventors: Lawrence J. Wangh; Kenneth Pierce; Cristina Hartshorn; John Rice; J. Aquiles Sanchez
Original assignee: Brandeis University
Current assignee: Brandeis University
Priority date: 2001-12-19
Filing date: 2002-12-19
Publication date: 2008-11-16
Anticipated expiration: 2022-12-19
Also published as: AU2002360685A1; US7198897B2; US20040053254A1; DE60226500D1; US8367325B2; CA2511128A1; ATE394508T1; US20080280292A1; HK1120088A1; US9476092B2; JP4355211B2; EP1468114A1; JP2005512577A; CA2511128C; EP1468114A4; EP1468114B1; DK1468114T3; US20130210656A1; WO2003054233A1; PT1468114E

Abstract

Procedimiento de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) no simétrica que comprende termociclar una mezcla de reacción de PCR que contiene una secuencia diana de amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN), un par de cebadores para PCR, dNTP y una polimerasa termoestable de manera repetida a través de las etapas de PCR de fundido de la cadena, apareamiento de cebador y extensión de cebador, en el que, al principio de la amplificación (a) la mezcla de reacción contiene hasta 1.000.000 de copias de la secuencia diana de amplificación, (b) el par de cebadores para PCR comprende un cebador limitativo y un cebador en exceso, estando presente el cebador limitativo en una concentración de hasta 200 nM y estando presente el cebador en exceso en una concentración por lo menos cinco veces superior que el cebador limitativo, (c) la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador limitativo es igual a o superior a la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso, (d) si el cebador limitativo no es totalmente complementario a dicha secuencia diana, la temperatura de fusión ajustada a la concentración de esa parte del cebador limitativo que hibrida con dicha secuencia diana no es superior a 5ºC por debajo de la temperatura de fusión ajustada a la concentración del cebador en exceso, (e) la temperatura de fusión del amplicón producido mediante la extensión del cebador en exceso supera la temperatura de fusión ajustada a la concentración inicial del cebador en exceso en no más de 18ºC, y (f) el termociclado se repite un número de veces suficiente para incluir múltiples ciclos de amplificación lineal usando el cebador en exceso tras el agotamiento del cebador limitativo.

Description

LATE-PCR.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la amplificación de secuencias de ácido nucleico mediante procedimientos que emplean, en su totalidad o en parte, la amplificación exponencial mediante el procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Antecedentes

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza ampliamente para amplificar tramos de ADN, incluyendo ADNc obtenido por transcripción inversa a partir de ARN, para ensayos para fines diagnósticos y otros. Véanse las patentes US nº 4.683.202, nº 4.683.195 y nº 4.965.188. Véase, generalmente, PCR PROTOCOLS, a Guide to
Methods and Applications, Innis et al. ed., Academic Press (San Diego, CA (EE.UU.) 1990). Las reacciones de PCR generalmente se diseñan para ser simétricas, es decir, para preparar copias bicatenarias utilizando un cebador directo y un cebador inverso en concentraciones equimolares. Los dos cebadores se diseñan para presentar "temperaturas de fusión" o "T_{m}" que están "equilibradas" (Innis et al., página 9), lo que generalmente se entiende que significa igual o dentro de algunos grados (ºC) entre sí. Un programa de software para ordenador comúnmente utilizado para diseñar cebadores advierte a los usuarios evitar una diferencia de T_{m} alta y presenta una característica de apareamiento a T_{m} automático. (Manual de software de análisis de cebadores Oligo®, versión 6.0 para Windows, Molecular Biology Insights, Inc., sexta edición, marzo de 2000). Las T_{m} de cebadores lineales compuestos por desoxirribonucleótidos (ADN) se han determinado comúnmente mediante el procedimiento de "porcentaje de GC" (Innis et al., página 9) o el procedimiento "2 (A+T) más 4 (G+C)" (Wallace et al. (1979) "Hybridization of Synthetic Oligodeoxyribonucletides to phi chi 174 DNA: the Effect of a Single Base Pair Mismatch", Nucleic Acids Res. 6 (11): 3543-3557) o el procedimiento del "vecino más próximo" (SantaLucia, J. (1998) "A Unified view of Paymer, Dumbbell, and Oligonucleotide DNA Nearest Neighbor Thermodynamics", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1460-1465; Allawi, H.T. y SantaLucia, J. (1997) "Thermodynamics and NMR of Internal G\cdotT Mismatches In DNA", Biochem. 36: 10581-10594).

La PCR es una serie repetida de etapas de desnaturalización, o fundido de la cadena, para crear moldes monocatenarios; apareamiento de cebador; y extensión de cebador mediante una ADN polimerasa termoestable tal como ADN polimerasade Thermus aquaticus (Taq). Un protocolo típico de PCR de tres etapas (véase Innis et al., capítulo 1) puede incluir desnaturalización, o fundido de la cadena, a 93-95ºC durante más de 5 s, apareamiento de cebador a 55-65ºC durante 10-60 s y extensión de cebador durante 15-120 s a una temperatura a la que la polimerasa es sumamente activa, por ejemplo, 72ºC para la Taq ADN polimerasa. Un protocolo típico de PCR de dos etapas puede diferir presentando la misma temperatura para el apareamiento de cebador que para la extensión de cebador, por ejemplo, 60ºC o 72ºC. Para o bien la PCR de tres etapas o bien la PCR de dos etapas, una amplificación implica ciclar la mezcla de reacción a través de la serie anterior de etapas numerosas veces, normalmente 25-40 veces. Durante el transcurso de la reacción, los tiempos y las temperaturas de las etapas individuales en la reacción pueden permanecer sin cambios de ciclo en ciclo, o pueden cambiarse en uno o más puntos en el transcurso de la reacción para favorecer la eficacia o potenciar la selectividad. Además del par de cebadores y el ácido nucleico diana, una mezcla de reacción de PCR contiene normalmente cada uno de los cuatro desoxirribonucleótidos 5'trifosfato (dNTP) a concentraciones equimolares, una polimerasa termoestable, un catión divalente y un agente de tamponamiento. Se incluye una transcriptasa inversa para dianas de ARN, a menos que la polimerasa presente esa actividad. El volumen de tales reacciones es normalmente de 25-100 \mul. Pueden amplificarse múltiples secuencias diana en la misma reacción. En el caso de la amplificación de ADNc, la PCR va precedida por una reacción separada para la transcripción inversa de ARN en ADNc, a menos que la polimerasa utilizada en la PCR presente actividad transcriptasa inversa. El número de ciclos para una amplificación por PCR particular depende de varios factores incluyendo: a) la cantidad de material de partida, b) la eficacia de la reacción, y c) el procedimiento y la sensibilidad de detección o el análisis posterior del producto. Las condiciones de ciclado, las concentraciones de reactivos, el diseño de cebadores, y los aparatos apropiados para reacciones de amplificación cíclica típicas se conocen bien en la materia (véase, por ejemplo, Ausubel, F. Current Protocols in Molecular Biology (1988) capítulo 15: "The Polymerase Chain Reaction", J. Wiley (Nueva York, NY (EE.UU.)).

De manera ideal, cada cadena de cada molécula de amplicón se une a un cebador en un extremo y sirve como molde para una ronda posterior de síntesis. La tasa de generación de productos de extensión de cebador, o amplicones, es por tanto exponencial, duplicándose durante cada ciclo. Los amplicones incluyen tanto cadenas positivas (+) como negativas (-), que hibridan entre sí para formar cadenas dobles. Para diferenciar la PCR típica de las variaciones especiales descritas en la presente memoria, se hace referencia a la PCR típica como PCR "simétrica". Por tanto, la PCR "simétrica" da como resultado un aumento exponencial de una o más moléculas de amplicón bicatenarias, y ambas cadenas de cada amplicón se acumulan en cantidades iguales durante cada ronda de replicación. La eficacia de la amplificación exponencial mediante PCR simétrica disminuye finalmente, y la tasa de acumulación de amplicón se reduce y finaliza. El análisis cinético de la PCR simétrica revela que las reacciones están compuestas por: a) una fase de amplificación no detectada (ciclos iniciales) durante la cual aumentan exponencialmente ambas cadenas de la secuencia diana, pero la cantidad del producto hasta aquí acumulado está por debajo del nivel detectable para el procedimiento particular de detección empleado; b) una fase de amplificación detectada (ciclos adicionales) durante la cual continúan aumentando en paralelo ambas cadenas de la secuencia diana y la cantidad del producto es detectable; c) una fase de meseta (ciclos terminales) durante la cual finaliza gradualmente la síntesis de ambas cadenas del amplicón y la cantidad de producto ya no aumenta. Las reacciones simétricas se reducen y finalizan porque las concentraciones crecientes de las cadenas de amplicón complementarias hibridan entre sí (se vuelven a aparear) y esto supera a la capacidad de los cebadores separados para hibridar con sus cadenas diana respectivas. Normalmente, las reacciones se ejecutan el tiempo suficiente para garantizar la acumulación de una cantidad detectable de producto, sin considerar el número exacto de ciclos necesarios para lograr ese fin.

El análisis del producto amplificado se realiza mediante cualquiera de los diversos medios. Por ejemplo, la electroforesis en gel o, más recientemente, la electroforesis capilar se ha utilizado ampliamente para separar secuencias diana amplificadas, o "amplicones", según el tamaño. Normalmente se hacen visibles las bandas en un gel mediante la utilización de un colorante intercalador, tal como el bromuro de etidio o SYBR®Green, o mediante transferencia del ácido nucleico a una membrana y entonces visualizándolo con una sonda de hibridación marcada con fluorescencia o radiactividad. El análisis mediante secuenciación implica de la manera más común amplificación adicional, utilizando un cebador en cada uno de los cuatro recipientes de reacción junto con un didesoxi dNTP diferente. En estas condiciones, cada reacción genera un producto lineal de amplificación compuesto por un conjunto de oligonucleótidos que terminan en A, T, C o G dependiendo de qué didesoxi dNTP se incluyó en la reacción. Véase, por ejemplo, la patente US nº 5.075.216.

La PCR "en tiempo real" se refiere a las reacciones de PCR en las que un indicador, normalmente un resto fluorescente, está presente para monitorizar la acumulación del amplicón mediante un cambio en la señal durante la reacción. Tales restos incluyen un colorante intercalador, tal como SYBR® Green, o una sonda de hibridación (ya pueda extenderse o no como cebador). Un procedimiento de PCR en tiempo real, el procedimiento de 5' nucleasa, utiliza sondas lineales marcadas, por ejemplo sondas doblemente marcadas con fluorescencia ("sondas TaqMan^{TM}"), que se digieren por la ADN polimerasa durante la etapa de extensión de cebador, dando como resultado un cambio de señal detectable (véanse las patentes US nº 5.210.015, nº 5.487.972 y nº 5.538.848). Otro procedimiento utiliza un colorante que fluoresce cuando está en contacto con el ADN bicatenario (véase la patente US nº 5.994.056). Un tercer procedimiento utiliza sondas doblemente marcadas con fluorescencia tales como "sondas de baliza molecular", que son sondas en horquilla que presentan un fluoróforo en un extremo y un extintor de en el otro extremo, y que se abren y fluorescen cuando hibridan con su secuencia diana (véanse las patentes US nº 5.925.517, nº 6.103.476 y nº 6.365.729). Otras sondas marcadas con fluorescencia útiles para la PCR en tiempo real incluyen los cebadores Scorpion, (cebadores que presentan una secuencia de sonda en horquilla (que contiene un resto fluoróforo y un resto extintor ubicados en estrecha proximidad en el tallo de la horquilla) unidos a su extremo 5' mediante un terminador de PCR de modo que se produce la fluorescencia sólo cuando la secuencia de sonda específica se une a su complemento dentro de la misma cadena de ADN tras la extensión de los cebadores durante la PCR; Whitcombe et al. (1999) "Detection of PCR Products Using Self-Probing Amplicons and Fluorescence", Nat. Biotechnol. 17: 804-807), cebadores Amplifluor (cebadores que presentan una secuencia de sonda en horquilla (que contienen un resto fluoróforo y un resto extintor ubicados en estrecha proximidad en el tallo de la horquilla) unidos a su extremo 5' de modo que se produce la fluorescencia sólo cuando la horquilla se despliega con la replicación del cebador tras su incorporación en un producto de amplificación; Nazarenko et al. (1997) "A Closed Tube Format for Amplification and Detection of DNA Based on Energy Transfer", Nucleic Acids Res. 15: 2516-21, sondas Eclipse (sondas de ADN lineales que presentan un complejo de extintor-proteína de unión al surco menor (MGB) situado en el extremo 5' de la sonda y un fluoróforo ubicado en el extremo 3' de la sonda de modo que se produce la fluorescencia sólo cuando la sonda se aparea con una secuencia diana ayudada por la proteína de MGB que se une a ADN y el extintor se traslada lejos del fluoróforo, (Afonina et al., (2002) "Minor Groove Binder-Conjugated DNA Probes for Quantitative DNA Detection by Hybridization-Triggered Fluorescence", Biotechniques 32: 946-9), sondas FRET (un par de sondas espirales al azar, o lineales, cada una de las cuales está marcada con fluorescencia, que hibridan de manera contigua en una secuencia diana, haciendo que sus marcadores interaccionen mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia ("FRET") y produzcan un cambio de señal detectable), y sondas fluorescentes bicatenarias, (Li, Q. et al. (2002) "A New Class of Homogeneous Nucleic Acid Probes Based on Specific Displacement Hybridization", Nucl. Acid Res. 30: (2)e5). Las sondas que no van a cortarse, hidrolizarse o extenderse (es decir, las sondas que no son cebadores) se diseñan normalmente para que se suelten de su molde antes de o durante la etapa de extensión de cebador de PCR de modo que no interfieran con esta fase de la reacción. Para sondas tales como sondas de baliza molecular, la temperatura de fusión de la sonda es generalmente 7-10ºC superior a la temperatura utilizada para aparear los cebadores. En la práctica esto significa que la temperatura de fusión de la sonda es superior a la temperatura de fusión del cebador que hibrida con la misma cadena que la sonda (Mackay, I.M. (2002) "Survey and Summary: Real-time PCR in Virology", Nucleic Acids Res. 30(6): 1292-1305). Por tanto, a medida que la temperatura de la reacción se enfría tras la fusión de la cadena a 95ºC, la sonda hibrida con su cadena diana (más adelante en la presente memoria cadena (+)) seguido de la hibridación del cebador para la cadena (+), a medida que la reacción se aproxima a la temperatura de apareamiento. A medida que la reacción se calienta de nuevo al final de la etapa de apareamiento, la sonda debe soltarse de la cadena (+) mientras que el cebador se extiende a lo largo de la cadena (+). Por tanto, el propósito es que la sonda no deba interferir con la extensión de cebador. La hibridación y la extensión del otro cebador en la cadena (-) complementaria también tiene lugar durante estas etapas. Una segunda sonda dirigida a la cadena (-) también puede estar presente en la reacción.

Una técnica que ha encontrado utilidad limitada para preparar ADN monocatenario directamente en una reacción de PCR es la "PCR asimétrica". Gyllensten y Erlich, "Generation of Single-Stranded DNA by the polymerase chain reaction and its application to direct sequencing of the HLA-DQA Locus", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 85: 7652-7656 (1988); Gyllensten, U.B. y Erlich, H.A. (1991) "Methods for generating single stranded DNA by the polymerase chain reaction" patente US número 5.066.584, 19 de noviembre de 1991. La PCR asimétrica difiere de la PCR simétrica porque uno de los cebadores se añade en cantidad limitativa, normalmente de 1/100 a 1/5 de la concentración del otro cebador. El amplicón bicatenario se acumula durante los ciclos de temperatura tempranos, como en la PCR simétrica, pero se agota un cebador, normalmente tras 15-25 ciclos de PCR, dependiendo del número de moldes de partida. La amplificación lineal de una cadena tiene lugar durante ciclos posteriores utilizando el cebador no agotado. Los cebadores utilizados en las reacciones de PCR asimétrica notificados en la bibliografía, incluyendo la patente de Gyllensten, a menudo son los mismos cebadores conocidos para su uso en la PCR simétrica. Poddar (Poddar, S. (2000) "Symmetric vs. Asymetric PCR and Molecular Beacon Probe in the Detection of a Target Gene of Adenovirus", Mol. Cell Probes 14: 25-32 comparó la PCR simétrica y la asimétrica para amplificar un sustrato de adenovirus mediante un ensayo de punto final que incluía 40 ciclos térmicos. Notificó que una razón de cebadores de 50:1 era óptima y que los ensayos de PCR asimétrica tenían mejor sensibilidad que, sin embargo, disminuía significativamente para disoluciones de sustratos diluidos que contenían presumiblemente números inferiores de moléculas diana.

La patente US nº 5.627.054 da a conocer un procedimiento de PCR no simétrica en el que una reacción de PCR simétrica con cebadores en igual concentración se ejecuta durante un número de ciclos, tras lo cual se abre el recipiente de reacción y se añade un oligonucleótido que no puede extenderse competitivo con el cebador inverso para parar la copia con ese cebador. Entonces, se continúa el termociclado con sólo el cebador directo de manera eficaz.

La solicitud de patente internacional WO 01/94638 A2 da a conocer un procedimiento de PCR no simétrica denominado PCR asincrónica en la que los cebadores se aparean y se extienden en etapas separadas en cada ciclo de PCR. Tras la etapa de PCR de fundido de la cadena a alta temperatura, la temperatura se reduce de modo que sólo se aparea un cebador en exceso, directo, a alta T_{m}, tras lo cual la temperatura se eleva para extender ese cebador; entonces la temperatura se disminuye de nuevo, esta vez aún más, para aparear el cebador limitativo, inverso, a baja T_{m}, tras lo cual la temperatura se eleva para extender ese cebador. El procedimiento de amplificación por PCR de esa solicitud de patente utiliza los dos cebadores en etapas separadas de apareamiento/extensión.

Aunque se conoce la PCR asimétrica desde 1988, no se ha utilizado extensivamente como una técnica debido a la necesidad de invertir bastante tiempo optimizando las condiciones experimentales para cada amplicón. J. K. Ball y R. Curran (1997) "Production of Single-Stranded DNA Using a Uracil-N-glycosylase-Mediated Asymmetric polymerase Chain Reaction Method", Analytical Biochemistry 253: 264-267, expone: "para garantizar que la amplificación asimétrica se produce se establecen varios tubos repetidos que contienen diferentes concentraciones de cada cebador, y por esta razón la técnica no se utiliza extensivamente".

Sumario

Tal como se utiliza en la presente memoria, determinados términos presentan los significados definidos tal como sigue:

T_{m}, o temperatura de fusión, de un oligonucleótido describe la temperatura (en grados Celsius) a la que el 50% de las moléculas en una población de un oligonucleótido monocatenario están hibridadas con su secuencia complementaria y el 50% de las moléculas en la población no están hibridadas con dicha secuencia complementaria. La T_{m} de un cebador o una sonda puede determinarse empíricamente por medio de una curva de fusión. En algunos casos, también puede calcularse. Para el diseño de pares de cebadores para PCR simétrica y asimétrica, generalmente se calculan las T_{m} en equilibrio mediante uno de los tres procedimientos tratados anteriormente, es decir, el "% de GC", o la "2(A+T) más 4 (G+C)", o la fórmula del "vecino más próximo" en algún conjunto elegido de condiciones de concentración salina monovalente y concentración de cebador. En el caso de los cálculos del vecino más próximo, las T_{m} de ambos cebadores dependerán de las concentraciones elegidas para su utilización en el cálculo o medición, la diferencia entre las T_{m} de los dos cebadores no cambiará sustancialmente siempre que las concentraciones de cebador sean equimolares, tal como son normalmente con respecto a los cálculos y las mediciones de cebadores para PCR. T_{m[1]} describe la T_{m} calculada de un cebador para PCR en condiciones convencionales particulares de concentración de cebador 1 micromolar (1 \muM = 10^{-6}M), y cationes monovalentes 0,07 molar. En esta solicitud, a menos que se indique lo contrario, T_{m[1]} se calcula utilizando la fórmula del vecino más próximo, T_{m} = \DeltaH/(\DeltaS + R In (C/2)) - 273,15 + 12 log [M]. Esta fórmula se basa en la fórmula publicada (Le Novere, N. (2001), "MELTING, Computing the Melting Temperature of Nucleic Acid Duplex", Bioinformatics 17: 1226-7). \DeltaH es la entalpía y \DeltaS es la entropía (los cálculos tanto de \DeltaH como de \DeltaS se basan en Allawi y SantaLucia, 1997), C es la concentración del oligonucleótido (10^{-6} M), R es la constante universal de los gases, y [M] es la concentración molar de cationes monovalentes (0,07). Según esta fórmula la composición de bases de nucleótidos del oligonucleótido (contenido en los términos \DeltaH y \DeltaS), la concentración salina y la concentración del oligonucleótido (contenido en el término C) influyen en la T_{m}. En general para los oligonucleótidos de la misma longitud, la T_{m} aumenta a medida que aumenta el porcentaje de bases guanina y citosina del oligonucleótido, pero la T_{m} disminuye a medida que disminuye la concentración del oligonucleótido. En el caso de un cebador con nucleótidos distintos de A, T, C y G o con modificación covalente, T_{m[1]} se mide empíricamente mediante análisis de fusión de hibridación tal como se conoce en la materia.

T_{m[0]} significa la T_{m} de una sonda o un cebador para PCR al inicio de una amplificación por PCR teniendo en cuenta su concentración, longitud y composición de partida. A menos que se indique lo contrario, T_{m[0]} es la T_{m} calculada de un cebador para PCR a la concentración de partida real de ese cebador en la mezcla de reacción, en condiciones convencionales supuestas de cationes monovalentes 0,07 M y la presencia de una concentración en exceso muy extenso de un oligonucleótido diana que presente una secuencia complementaria a la del cebador. En casos en los que una secuencia diana no es totalmente complementaria a un cebador es importante considerar no sólo la T_{m[0]} del cebador frente a sus complementos sino también el punto de fusión ajustado a la concentración del hibrido imperfecto formado entre el cebador y la diana. En esta solicitud, la T_{m[0]} para un cebador se calcula utilizando la fórmula del vecino más próximo y las condiciones expuestas en los párrafos anteriores, pero utilizando la concentración micromolar de partida real del cebador. En el caso de un cebador con nucleótidos distintos de A, T, C y G o con modificación covalente, la T_{m[0]} se mide empíricamente mediante el análisis de fusión de hibridación tal como se conoce en la materia.

Tal como se utiliza en la presente memoria el superíndice X se refiere al cebador en exceso, el superíndice L se refiere al cebador limitativo, el superíndice A se refiere al amplicón y el superíndice P se refiere a la sonda.

T_{m}^{A} significa la temperatura de fusión de un amplicón, o bien un amplicón bicatenario o bien un amplicón monocatenario hibridado con su complemento. En esta solicitud, a menos que se indique lo contrario, el punto de fusión de un amplicón, o T_{m}^{A}, se refiere a la T_{m} calculada mediante la siguiente fórmula del % de GC: T_{m}^{A} = 81,5 + 0,41 (%G + %C) - 500/L + 16,6 log [M]/ (1 + 0,7 [M]), en la que L es la longitud en nucleótidos y [M] es la concentración molar de cationes monovalentes.

T_{m[0]}^{P} se refiere a la temperatura de fusión ajustada a la concentración de la sonda con respecto a su diana, o la parte de sonda que realmente es complementaria a la secuencia diana (por ejemplo, la secuencia en bucle de una sonda de baliza molecular). En el caso de las sondas más lineales, T_{m[0]}^{P} se calcula utilizando la fórmula del vecino más próximo dada anteriormente, tal como para T_{m[0]}, o preferiblemente se mide empíricamente. En el caso de balizas moleculares, una estimación aproximada de T_{m[0]}^{P} puede calcularse utilizando programas informáticos disponibles comercialmente que utilizan el procedimiento del % de GC, véase Marras, S.A. et al. (1999) "Multiplex Detection of Single-Nucleotide Variations Using Molecular Beacons", Genet. Anal. 14:151-156, o utilizando la fórmula del vecino más próximo, o preferiblemente se mide empíricamente. En el caso de sondas que presentan bases no convencionales y para sondas bicatenarias, T_{m[0]}^{P} se determina empíricamente.

C_{T} quiere decir ciclo umbral y significa el ciclo de un ensayo de amplificación por PCR en tiempo real en el que una señal de un indicador indicativa de la generación de amplicones se vuelve por primera vez detectable por encima del nivel de fondo. Ya que los niveles de fondo medidos empíricamente pueden variarse ligeramente, es de práctica habitual medir el C_{T} en el momento en la reacción en el que la señal alcanza 10 desviaciones estándar por encima del nivel de fondo promediado a lo largo de los 5 a 10 ciclos térmicos anteriores.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "hibridar" o "hibridación" se conocen en la materia e incluyen el enlace de hidrógeno de las secuencias de ARN y/o ADN complementarias para formar una molécula dúplex. Tal como se utiliza en la presente memoria, la hibridación tiene lugar en condiciones que pueden ajustarse a un nivel de rigurosidad que reduce o incluso evita el apareamiento de bases entre un primer cebador de oligonucleótido o una primera sonda de oligonucleótido y una secuencia diana, si las secuencias complementarias se aparean de manera errónea en tan sólo un par de bases. Por tanto, la expresión "condiciones de rigurosidad" para la hibridación incluyen condiciones que minimizan o evitan el apareamiento de bases entre un cebador de oligonucleótido o una sonda de oligonucleótido y otra secuencia si las secuencias complementarias se aparean de manera errónea. Si se utilizan sondas de hibridación tales como las sondas de baliza molecular específicas de secuencia marcadas de manera diferente en condiciones de rigurosidad se observa que son "discriminantes de alelos" porque son suficientes apareamientos erróneos en tan sólo un par de bases para desestabilizar la hibridación de la sonda incorrecta. En el contexto de la PCR en tiempo real, la "discriminación de alelos" se logra mediante atención cuidadosa en el diseño de la sonda, la concentración de magnesio y la temperatura a la que hibrida con su diana. Los apareamientos erróneos de pares de bases individuales entre la secuencia en bucle de la sonda y su secuencia diana tienden a presentar efectos de desestabilización mayores en el caso de balizas moleculares con secuencias en bucle cortas en lugar de largas. Por esta razón, las balizas moleculares con secuencias en bucle cortas en lugar de largas son normalmente más "discriminantes de alelos".

Tal como se utiliza en la presente memoria "secuencia diana de amplificación" para la amplificación por PCR significa una secuencia de ADN que proporciona un molde para copiar mediante las etapas de PCR. Una secuencia diana de amplificación puede ser monocatenaria o bicatenaria. Si el material de partida es ARN, por ejemplo ARN mensajero, la secuencia diana de amplificación de ADN se crea mediante transcripción inversa de ARN para crear ADN complementario y la secuencia diana de amplificación es una molécula de ADNc. Por tanto, en un ensayo de PCR para determinar ARN, una sonda de hibridación señaliza las copias de una secuencia diana de amplificación de ADNc, que indirectamente significa la presencia de ARN cuya transcripción inversa producía las moléculas de ADN que contienen la secuencia diana de amplificación. Una secuencia diana de amplificación está incluida en longitud por el par de cebadores utilizados para amplificarla. Existirá una pequeña cantidad de producto de extensión más larga, tal como se explica en la patente US de Mullis 4.683.202, que no se amplifica exponencialmente, pero el producto de extensión de interés, ya sea bicatenario o, en la PCR no simétrica, monocatenario, la secuencia amplificada exponencialmente, el amplicón, está incluida por el par de cebadores. Una secuencia diana de amplificación puede ser una única secuencia. Sin embargo, en algunos casos, una secuencia diana de amplificación contendrá variaciones alélicas y, por tanto, no será una única secuencia, incluso aunque se amplifique por un único par de cebadores. Un ensayo para determinar una secuencia diana de amplificación que contiene variaciones puede utilizar una sonda detectora para todas las variaciones, una única sonda discriminante de alelos para una variante, o múltiples sondas discriminantes de alelos, una para cada variante.

Tal como se de manera intercambiable en la presente memoria, las expresiones "cebador de ácido nucleico", "molécula de cebador", "cebador" y "cebador de oligonucleótido" incluyen oligonucleótidos monocatenarios cortos (normalmente entre aproximadamente 16 y aproximadamente 50 bases) que, tras la hibridación con una molécula de ácido nucleico de molde correspondiente, sirven como punto de partida para la síntesis de la cadena de ácido nucleico complementaria mediante una molécula de polimerasa apropiada. Las moléculas de cebador pueden ser complementarias a o bien la cadena sentido o la antisentido de un molécula de ácido nucleico de molde. Un cebador puede estar compuesto por oligonucleótidos sintéticos o que se producen de manera natural, o una mezcla de los dos. Si los cebadores en un par de cebadores para PCR se utilizan en concentraciones distintas, el cebador añadido a la concentración inferior es el "cebador limitativo" y el cebador añadido a la concentración superior es el "cebador en exceso". Tal como se utiliza de manera intercambiable en la presente memoria, las expresiones "sonda de ácido nucleico", "molécula de sonda" y "sonda de oligonucleótido" y "sonda de hibridación" incluyen las secuencias de ácido nucleico definidas complementarias a una secuencia de ácido nucleico diana que va a detectarse de modo que la sonda hibridará con la diana. Las sondas están normalmente marcadas de manera detectable, de modo que la hibridación de la sonda a la secuencia diana puede evaluarse fácilmente. Las sondas pueden estar compuestas por oligonucleótidos sintéticos o que se producen de manera natural e incluyen cebadores marcados. Algunas sondas de hibridación, por ejemplo sondas de baliza molecular, emiten una señal detectable tras hibridar con su secuencia complementaria sin acción enzimática para hidrolizar las sondas para generar una señal. Se hace referencia a sondas tales como sondas que hibridan con su diana y "señalizan tras la hibridación". Otras sondas, por ejemplo sondas espirales al azar doblemente marcadas con fluorescencia TaqMan^{TM} se cortan, o se hidrolizan, durante la reacción de amplificación, y la hidrólisis conduce a un cambio de señal que se detecta. Las sondas que se basan en la hidrólisis como parte de la generación de señales no son sondas que "señalizan tras la hibridación".

Una "sonda de baliza molecular" es un oligonucleótido monocatenario, normalmente de 25-35 bases de longitud, en el que las bases en los extremos 3' y 5' son complementarias, normalmente durante de 5-8 bases. Una sonda de baliza molecular forma una estructura en horquilla a temperaturas a y por debajo de las utilizadas para aparear los cebadores con el molde (normalmente por debajo de aproximadamente 60ºC). El tallo de doble hélice de la horquilla lleva un fluoróforo unido al extremo 5' de la sonda muy próximo a un extintor unido al extremo 3' de la sonda. La sonda no fluoresce en esta conformación. Si una sonda se calienta por encima de la temperatura necesaria para fundir el tallo bicatenario de manera separada, o se deja que la sonda hibride con un oligonucleótido diana que es complementario a la secuencia dentro del bucle de cadena sencilla de la sonda, el fluoróforo y el extintor están separados y la conformación resultante fluoresce. Por tanto, en una serie de ciclos de PCR la fuerza de la señal de fluorescencia aumenta en proporción a la cantidad de la baliza hibridada con el amplicón, si la señal se lee a la temperatura de apareamiento. Las balizas moleculares con diferentes secuencias en bucle pueden conjugarse a diferentes fluoróforos con el fin de monitorizar aumentos de amplicones que difieren en tan sólo una base (Tyagi, S. y Kramer, F.R. (1996) "Molecular Beacons: Probes That Fluoresce Upon Hybridization", Nat. Biotech. 14:303-308; Tyagi, S. et al., (1998) "Multicolor Molecular Beacons for Allele Discrimination". Nat. Biotech. 16: 49-53; Kostrikis, L.G. et al., (1998) "Spectral Genotyping of Human Alleles", Science 279: 1228-1229).

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "etiqueta detectable" incluye restos que proporcionan una señal que puede detectarse fácilmente y, en algunas formas de realización, cuantificarse. Tales marcadores se conocen bien para los expertos en la materia e incluyen restos quimioluminiscentes, radioactivos, de ión metálico, de ligando metálico, fluorescentes o coloreados, o grupos enzimáticos que, tras la incubación con un sustrato apropiado, proporcionan una señal quimioluminiscente, fluorescente, radioactiva, eléctrica o colorimétrica. Los procedimientos de detección de tales señales también se conocen bien en la materia.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "tampón" incluye compuestos que actúan para mantener el pH de una disolución manteniendo los niveles relativos de iones hidroxilo e hidrógeno en la disolución. Los tampones presentan intervalos de pH específicos a los que son funcionales, y su función depende frecuentemente de la temperatura. Los tampones y la dependencia de la temperatura de la capacidad de tamponamiento de los mismos se conocen por los expertos en la materia.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "en tiempo real", con respecto a una reacción de amplificación, se refiere al procedimiento mediante el cual se detecta la reacción de amplificación. En una reacción de amplificación "en tiempo real", se mide la acumulación de amplicón o producto durante la evolución de la reacción, a diferencia de únicamente tras completarse la reacción, siendo la última el análisis de "punto final".

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "temperatura de apareamiento óptima" es la temperatura más alta a la que la fase exponencial de la reacción avanza con eficacia máxima y sin generar productos no específicos sustanciales a tiempos de ciclado y concentraciones de reactivos específicos. Por "eficacia máxima" se quiere decir la condición que genera el valor C_{T} más bajo durante la fase exponencial de la reacción, en la que se acumula el producto específico a la tasa más alta.

La presente invención incluye un procedimiento de amplificación que se denomina "PCR lineal tras la exponencial" (Linear-After-The Exponential) o, para abreviar, "LATE-PCR". LATE-PCR es un procedimiento de PCR no simétrica; es decir, utiliza concentraciones distintas de cebadores y proporciona productos de extensión de cebador monocatenarios, o amplicones. La LATE-PCR incluye innovaciones en el diseño de cebadores, en los perfiles de ciclado de temperatura y en el diseño de sondas de hibridación. Siendo un tipo de procedimiento de PCR, la LATE-PCR utiliza las etapas básicas de fundido de la cadena, apareamiento de cebador y extensión de cebador mediante una ADN polimerasa producidas o se permite que se produzcan repetidamente mediante una serie de ciclos de temperatura. En los ciclos tempranos de una amplificación por LATE-PCR, si están presentes ambos cebadores, la amplificación por LATE-PCR amplifica ambas cadenas de una secuencia diana exponencialmente, tal como se produce en la PCR simétrica convencional. Entonces la LATE-PCR cambia a la síntesis de sólo una cadena de la secuencia diana para ciclos adicionales de amplificación. En ensayos de LATE-PCR en tiempo real preferidos según esta invención, el cebador limitativo se agota en el plazo de unos pocos ciclos después de que la reacción alcance su valor C_{T}, y en el ensayo más preferido un ciclo después de que la reacción alcance su valor C_{T}. Tal como se definió anteriormente, el valor C_{T} es el ciclo térmico en el que la señal se vuelve detectable por encima del nivel de fondo determinado empíricamente de la reacción. Mientras que una amplificación por PCR simétrica normalmente alcanza una fase de meseta y deja de generar nuevos amplicones en el 50º ciclo térmico, las amplificaciones por LATE-PCR no forman meseta y continúan generando amplicones monocatenarios bastante más allá del 50º ciclo, incluso hasta el 100º ciclo. Los ensayos y amplificaciones por LATE-PCR normalmente incluyen por lo menos 60 ciclos, preferiblemente por lo menos 70 ciclos cuando están presentes bajos números (10.000 o menos) de moléculas diana al inicio de la amplificación.

Con las excepciones y limitaciones que van a describirse, los componentes de una mezcla de reacción para la amplificación por LATE-PCR son los mismos que los componentes de una mezcla de reacción para una amplificación por PCR simétrica correspondiente. La mezcla normalmente incluye cada uno de los cuatro desoxirribonucleótidos 5' trifosfato (dNTP) a concentraciones equimolares, una polimerasa termoestable, un catión divalente y un agente de tamponamiento. Tal como con las amplificaciones por PCR simétrica, puede incluir componentes adicionales, por ejemplo transcriptasa inversa para dianas de ARN. Pueden utilizarse dNTP no naturales. Por ejemplo, dUTP puede sustituirse por dTTP y usarse a 3 veces la concentración de los otros dNTP debido a la incorporación menos eficaz por la Taq ADN polimerasa.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sonda a baja T_{m}" significa una sonda de hibridación marcada que señaliza tras la hibridación con su diana, que en una LATE-PCR es la cadena de cebador en exceso generada mediante extensión del cebador en exceso, y que presenta una T_{m[0]}^{P} por lo menos 5ºC por debajo y más preferiblemente por lo menos 10ºC por debajo de la T_{m[0]} del cebador que hibrida con y se extiende a lo largo de la cadena de cebador en exceso, que en una LATE-PCR es el cebador limitativo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sonda a super-baja T_{m}" significa una sonda de hibridación marcada que señaliza tras la hibridación con su diana, que en una LATE-PCR es la cadena de cebador en exceso generada mediante extensión del cebador en exceso (es decir, una sonda a baja T_{m}), y que presenta una T_{m[0]}^{P} que es por lo menos 5ºC por debajo, y más preferiblemente 10ºC por debajo de la temperatura de apareamiento media de la fase exponencial de la reacción.

La T_{m[1]} para un cebador para PCR se calcula en condiciones habituales de concentración de cebadores y concentración salina. Se ha elegido 1 \muM como la concentración convencional de los cebadores, porque esa concentración es una concentración típica para el cebador en exceso en una amplificación por LATE-PCR. En amplificaciones por LATE-PCR, la concentración del cebador limitativo es normalmente muchas veces inferior que la concentración convencional. Al disminuir la concentración del cebador limitativo, disminuye su temperatura de fusión, T_{m[0]}^{L}, en una mezcla de reacción. Por tanto, un par de cebadores apareados para una PCR simétrica, presentando T_{m[1]} iguales, no tendrán T_{m[0]} apareadas, cuando se utilizan a concentraciones distintas. Como regla general, un par de cebadores que está perfectamente apareado, es decir, para el que (T_{m[1]}^{L}-T_{m[1]}^{X}) es cero, (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) será inferior a cero a concentraciones de cebador utilizadas para una LATE-PCR. La observación es que los pares de cebadores que presentan temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial equivalente al inicio de la reacción, es decir (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) = 0, presentará según esta invención una diferencia en sus temperaturas de fusión calculadas habituales, por ejemplo (T_{m[1]}^{L}-T_{m[1]}^{X}) en el intervalo de +5 a +20ºC (por ejemplo, aproximadamente 5ºC, 6ºC, 7ºC, 8ºC, 9ºC, 10ºC, 11ºC, 12ºC, 13ºC, 14ºC, 15ºC, 16ºC, 17ºC, 18ºC, 19ºC ó 20ºC).

Para amplificaciones según esta invención, la concentración molar de partida de un cebador, el "cebador limitativo", es inferior a la concentración molar de partida del otro cebador, el "cebador en exceso". La razón de las concentraciones de partida del cebador en exceso y el cebador limitativo es por lo menos de 5:1, preferiblemente por lo menos 10:1, y más preferiblemente por lo menos 20:1. La razón de cebador en exceso con respecto a cebador limitativo puede ser de 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50: 1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 ó 100:1, lo más preferiblemente en el intervalo de 20:1 a 100:1. La secuencia y longitud del cebador se ajustan o modifican, preferiblemente en el extremo 5' de la molécula, de modo que la temperatura de fusión ajustada a la concentración del cebador limitativo al inicio de la reacción, T_{m[0]}^{L}, es superior a o igual (\pm 0,5ºC) al punto de fusión ajustado a la concentración del cebador en exceso al inicio de la reacción, T_{m[0]}^{X}. Preferiblemente, la diferencia (T_{m[0]}^{L} - T_{m[0]}^{X}) es por lo menos de +3, y más preferiblemente la diferencia es por lo menos de +5ºC.

Las amplificaciones según esta invención pueden utilizarse para generar productos monocatenarios para su uso adicional, por ejemplo como material de partida para la secuenciación de ADN o como sondas en otras reacciones, o pueden usarse en ensayos, incluyendo ensayos cuantitativos en tiempo real, de secuencias de ácido nucleico específicas. En todos los casos existe una relación entre T_{m[0]}^{X} y T_{m}^{A}, que la LATE-PCR tiene en cuenta. T_{m}^{A} es superior a T_{m[0]}^{X}, pero si la diferencia entre estos dos valores es demasiado grande, se generarán cantidades inferiores de producto monocatenario. En el caso de reacciones diseñadas para generar productos para su análisis o uso posterior (T_{m}^{A} - T_{m[0]}^{X}) debe ser inferior a o igual a 18ºC, preferiblemente no superior a 15ºC. Para ensayos en tiempo real que emplean sondas no hidrolizantes, (T_{m}^{A} - T_{m[0]}^{X}) debe ser en todos los casos inferior a 25ºC, preferiblemente inferior a 20ºC y más preferiblemente inferior a 18ºC.

Las amplificaciones y ensayos según esta invención pueden realizarse con mezclas de reacción iniciales que presentan intervalos de concentraciones de cebadores y moléculas diana. Los ensayos de LATE-PCR según esta invención son particularmente adecuados para las amplificaciones que utilizan pequeños volúmenes de mezcla de reacción y relativamente pocas moléculas que contienen la secuencia diana, a veces denominada "bajo número de copias". Mientras que la LATE-PCR puede usarse para someter a ensayo muestras que contienen grandes cantidades de diana, por ejemplo hasta 10^{6} copias de moléculas diana, el intervalo preferido es una cantidad mucho menor, desde 1 hasta 50.000 copias, más preferiblemente de 1 a 10.000 copias e incluso más preferiblemente de 1 a 1.000 copias. La concentración de cebador limitativo debe ser de desde unos pocos nanomolares (nM) hasta 200 nM. La concentración de cebador limitativo está preferiblemente tan alejada hacia el extremo bajo del intervalo que permite la sensibilidad de detección. El intervalo preferido con sondas y detecciones disponible en este caso, tal como se describe a continuación, es de 20-100 nM.

Tal como con PCR, o bien simétrica o asimétrica, las amplificaciones por LATE-PCR según esta invención incluyen un termociclado repetido a través de las etapas de fundido de la cadena, apareamiento de cebador y extensión de cebador. Las temperaturas y los tiempos para estas tres etapas son normalmente, tal como con una PCR simétrica, de 93-95ºC durante por lo menos 5 s para el fundido de la cadena, de 55-65ºC durante 10-60 s para el apareamiento de cebadores y de 72ºC durante de 15-120 s para la extensión de cebador. Para las amplificaciones por PCR de tres etapas según esta invención, no se prefieren tiempos de apareamiento de cebador superiores a 30 s. El intervalo más preferido es de 10-20 s. Las variaciones de temperatura y el tiempo para las amplificaciones por PCR se conocen por los expertos en la materia y pueden aplicarse generalmente a LATE-PCR también. Por ejemplo, la denominada PCR de "dos etapas", en la que se utiliza una temperatura para tanto el apareamiento de cebador como la extensión de cebador, puede usarse para la LATE-PCR. En el caso de reacciones de "2 etapas" la etapa de apareamiento-extensión combinada puede ser superior a 30 s, pero preferiblemente tan corta como sea posible y no superior a 120 s.

Un aspecto de esta invención es un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) no simétrica que comprende termociclar de manera repetida una mezcla de reacción de PCR que contiene una secuencia diana de ácido desoxirribonucleico (ADN), un par de cebadores para PCR, dNTP y una polimerasa termoestable a través de las etapas de PCR de fundido de la cadena, apareamiento de cebador y extensión de cebador, en el que, al principio (a) la mezcla de reacción contiene hasta 1.000.000 de copias de la diana de ácido nucleico, (b) el par de cebadores para PCR comprende un cebador limitativo y un cebador en exceso, estando presente el cebador limitativo a una concentración de hasta 200 nM y estando presente el cebador en exceso a una concentración por lo menos cinco veces superior que el cebador limitativo, (c) la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador limitativo es igual a o superior a la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso, (d) la temperatura de fusión ajustada a la concentración de esa parte del cebador limitativo que hibrida con dicha secuencia diana no es superior a 5ºC por debajo de la temperatura de fusión ajustada a la concentración del cebador en exceso, (e) la temperatura de fusión del amplicón producido mediante extensión del cebador en exceso supera la temperatura de fusión ajustada a la concentración inicial del cebador en exceso en no más de 18ºC, y (f) el termociclado se repite un número de veces suficiente para incluir múltiples ciclos de la amplificación lineal utilizando el cebador en exceso tras el agotamiento del cebador limitativo. El procedimiento anterior también puede ser para dos o más secuencias diana en el que la mezcla de reacción incluye un par de cebadores para PCR para cada diana. El procedimiento también puede incluir la transcripción inversa de una molécula de ácido ribonucleico (ARN) para generar la secuencia diana de ADN.

Otro aspecto de esta invención es el procedimiento de amplificación descrito anteriormente aplicado a bajos números de copia de diana, en el que la mezcla de reacción contiene sólo 50.000 copias de la diana de ácido nucleico o incluso 10.000 copias, 1.000 copias o una copia, o ADN o ADNc de una única célula.

Otro aspecto de esta invención es el procedimiento de amplificación descrito anteriormente en el que la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador limitativo es 3-10ºC superior a la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso y, opcionalmente pero preferiblemente, en el que el cebador en exceso está presente a una concentración de 500-2000 nM y por lo menos diez veces superior al cebador limitativo, y, también opcionalmente pero preferiblemente, en el que la temperatura de fusión del amplicón es de 7-15ºC superior a la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso.

Otro aspecto de esta invención es el procedimiento descrito anteriormente en el que la duración de la etapa de apareamiento de cebador no es superior a 30 segundos.

Otro aspecto de esta invención es una variante del procedimiento descrito anteriormente que incluye además por lo menos un ciclo térmico terminal en el que el producto de extensión monocatenario del cebador en exceso se convierte en un producto bicatenario, incluyendo en la mezcla de reacción de PCR un cebador a baja temperatura que puede cebar el producto de extensión del cebador en exceso y que presenta un punto de fusión ajustado a la concentración, inicial por lo menos 5ºC por debajo, más preferiblemente por lo menos 10ºC por debajo, del punto de fusión ajustado a la concentración, inicial del cebador en exceso, y en el que la temperatura de apareamiento se mantiene por encima de la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador a baja temperatura excepto durante por lo menos un ciclo térmico en el que la temperatura de apareamiento se disminuye para hibridar el cebador a baja temperatura.

\newpage

Otro aspecto de esta invención es un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) no simétrica que comprende termociclar una mezcla de reacción de PCR que contiene una secuencia diana de ácido desoxirribonucleico (ADN), un par de cebadores para PCR limitativos apareados, un cebador en exceso adicional, dNTP y una polimerasa termoestable de manera repetida a través de las etapas de PCR de fundido de la cadena, apareamiento de cebador y extensión de cebador, en el que los cebadores para PCR apareados están presentes en una concentración aproximadamente equimolar de hasta 200 nM, el cebador en exceso está presente a una concentración por lo menos cinco veces superior a los cebadores limitativos, las temperaturas de fusión ajustadas a la concentración, iniciales de los cebadores en exceso son por lo menos 5ºC por debajo, más preferiblemente por lo menos 10ºC por debajo, de las temperaturas de fusión ajustadas a la concentración de los cebadores limitativos, y en el que la reacción comprende una primera fase en la que la temperatura de apareamiento es superior a la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso, y los cebadores limitativos apareados generan un primer amplicón, y una segunda fase en la que la temperatura de apareamiento se disminuye y el cebador en exceso genera un segundo amplicón, más corto que el primer amplicón, utilizando el primer amplicón como cadena de molde, y en la que la temperatura de fusión del segundo amplicón supera la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso en no más de 25ºC, más preferiblemente en no más de 18ºC.

Otro aspecto de esta invención es un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) no simétrica con eliminación del amplicón monocatenario que comprende

a) termociclar una mezcla de reacción de PCR que contiene una diana de ADN, un par de cebadores para PCR para dicha diana, dNTP y una ADN polimerasa termoestable a través de ciclos repetidos de fundido de la cadena, apareamiento de cebador y extensión de cebador, en el que (i) el par de cebadores para PCR comprende un cebador limitativo y un cebador en exceso, (ii) el cebador limitativo está presente a una concentración de hasta 200 nM, y el cebador en exceso está presente a una concentración por lo menos cinco veces superior que el cebador limitativo, (iii) la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador limitativo es por lo menos igual a, más preferiblemente 3-10ºC superior a, la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso, y (iv) el termociclado se repite un número de veces suficiente para incluir múltiples ciclos de amplificación lineal utilizando el cebador en exceso tras el agotamiento del cebador limitativo; y

b) durante por lo menos los ciclos de amplificación lineal, tras la etapa de extensión de cebador, eliminar de manera permanente el producto de extensión monocatenario del cebador en exceso de la mezcla de reacción hibridando dicho producto con sondas de captura inmovilizadas. En versiones preferidas del procedimiento, las sondas de captura inmovilizadas están en una zona de eliminación de producto aislada térmicamente y dicha etapa de eliminación comprende hacer pasar la mezcla de reacción a través de dicha zona. En determinadas versiones preferidas de este procedimiento, las sondas de captura puede aislarse (por ejemplo, perlas que pueden eliminase físicamente de la mezcla de reacción) o están en una zona de eliminación de producto que por sí misma puede aislarse físicamente de dicha por lo menos una zona de reacción, incluyendo además el aislamiento periódico de dichas sondas de captura y recogiendo el producto hibridado con dichas sondas de captura que no están en contacto con la mezcla de reacción, tal como mientas que la mezcla de reacción está en dicha por lo menos una zona de reacción. En otras versiones preferidas, la temperatura de fusión del amplicón supera la temperatura de fusión ajustada a la concentración del cebador en exceso en no más de 18ºC. En aún otras versiones preferidas, el cebador en exceso está presente a una concentración de 500-2000 nM y por lo menos diez veces superior que el cebador limitativo.

Otro aspecto de esta invención es un ensayo de detección en tiempo real homogéneo para determinar una secuencia diana de ADN que emplea la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) no simétrica, que comprende termociclar una mezcla de reacción de PCR que contiene dicha secuencia diana, un par de cebadores para PCR para amplificar dicha secuencia diana, dNTP, por lo menos una sonda de hibridación marcada que se une al producto de amplicón mediante dicha amplificación, y una ADN polimerasa termoestable a través de las etapas de PCR repetidas de fundido de la cadena, apareamiento de cebador y extensión de cebador, en el que (i) el par de cebadores para PCR comprende un cebador limitativo y un cebador en exceso, (ii) el cebador limitativo está presente a una concentración de hasta 200 nM, y el cebador en exceso está presente a una concentración de por lo menos cinco veces superior que el cebador limitativo, (iii) la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador limitativo es por lo menos igual a la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso, (iv) dicha sonda hibrida con dicho amplicón durante la etapa de apareamiento de cebador de PCR, (v) la temperatura de fusión del amplicón supera la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso en no más de 25ºC, y (vi) el termociclado se repite un número de veces suficiente para incluir múltiples ciclos de la amplificación lineal utilizando el cebador en exceso tras el agotamiento del cebador limitativo, y (vii) dicha sonda emite una señal detectable indicativa de la generación de producto durante dicha amplificación lineal. En determinadas versiones de este ensayo, la sonda de hibridación es una sonda doblemente marcada con fluorescencia que se une al producto de extensión del cebador limitativo y que se hidroliza por la polimerasa durante la extensión del cebador en exceso, generando de ese modo una señal detectable. En versiones más preferidas, la sonda (o sondas) de hibridación es una sonda doblemente marcada con fluorescencia que se une al producto de extensión del cebador en exceso y que señala tras la hibridación, tales como sondas de baliza molecular, pares de sonda FRET, pares de sonda hibridada y cebadores en exceso que contienen sondas en horquilla unidas. Determinadas versiones preferidas incluyen una primera sonda para una variante alélica y una segunda sonda para otra variante alélica. El ensayo puede incluir la transcripción inversa de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) para generar ADNc que contiene secuencias diana.

\newpage

El ensayo anterior puede ser para determinar bajos números de copia de dianas, tal como en el que la mezcla de reacción contiene hasta 50.000 copias de la diana de ácido nucleico, o incluso 1000 copias, o una copia o ADNc de una única célula. En determinadas formas de realización preferidas, la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador limitativo es de 3-10ºC superior a la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso. En determinadas formas de realización preferidas, el cebador en exceso está presente a una concentración de 500-2000 nM y por lo menos diez veces superior al cebador limitativo. En determinadas formas de realización preferidas, la temperatura de fusión del amplicón es 7-15ºC superior a la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso. En las formas de realización más preferidas, la duración de la etapa de apareamiento de cebador no es superior a 30 segundos.

La LATE-PCR puede combinarse con la utilización de sondas muy brillantes, tales como sondas marcadas con Quantum Dots®, que permiten la detección de bajos números o muy bajos números de moléculas de ADN, en el intervalo de 1000 a un millón de cadenas sencillas. A medida que se aumenta la fuerza de la señal de la sonda, disminuye el número de moléculas monocatenarias que han de generarse por la LATE-PCR. Esto puede realizarse reduciendo la concentración absoluta del cebador limitativo o disminuyendo el volumen de la reacción a una concentración de cebador limitativo constante. A medida que se disminuye la concentración absoluta del cebador limitativo y el número de moléculas monocatenarias producidas, la detección de números inferiores de moléculas tiene lugar en condiciones en las que el cebador en exceso no tiene que competir con el nuevo apareamiento de la cadena sencilla producto con la cadena diana. Las reacciones de LATE-PCR llevadas a cabo en presencia de sondas brillantes se adaptan bien a la miniaturización, por ejemplo para la producción de chips y cámaras que llevan a cabo reacciones utilizando microfluidos. Por tanto, el requisito de que (T_{m}^{A} -T_{m[0]}^{X}) \leq 25 se relaja.

Otro aspecto de esta invención es un ensayo de detección homogéneo para determinar una secuencia diana de ADN que emplea la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) no simétrica, que comprende termociclar una mezcla de reacción de PCR que contiene dicha secuencia diana, un par de cebadores para PCR para dicha secuencia diana, dNTP, una sonda de hibridación marcada a baja temperatura y una ADN polimerasa termoestable de manera repetida a través de las etapas de PCR de fundido de la cadena, apareamiento de cebador y extensión de cebador, en el que (i) el par de cebadores para PCR comprende un cebador limitativo y un cebador en exceso, (ii) el cebador limitativo está presente a una concentración de hasta 200 nM, y el cebador en exceso está presente a una concentración de por lo menos cinco veces la concentración del cebador limitativo, (iii) la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial delcebador limitativo es igual a o superior a la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso, (iv) la temperatura de fusión del amplicón supera la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso en no más de 25ºC, (v) la sonda de hibridación a baja temperatura se une al producto de extensión del cebador en exceso y emite una señal detectable tras la hibridación, (vi) la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial de la sonda de hibridación a baja temperatura es por lo menos 5º por debajo de la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador limitativo, (vii) el termociclado se repite un número de veces suficiente para incluir múltiples ciclos de la amplificación lineal utilizando el cebador en exceso tras el agotamiento del cebador limitativo, y (viii) la detección se realiza a una temperatura por debajo de dicha temperatura de apareamiento óptima.

En determinadas formas de realización de este ensayo, la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial de la sonda de hibridación a baja temperatura es por lo menos 10ºC por debajo de la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador limitativo. En algunas formas de realización de este ensayo, el apareamiento de cebador es de temperatura lo suficientemente baja y de duración suficiente que la sonda a baja temperatura hibrida durante el apareamiento de cebador, la detección de señal se realiza durante esa etapa. En formas de realización más preferidas la amplificación por PCR incluye, durante por lo menos los últimos ciclos de la amplificación exponencial y los ciclos posteriores de la amplificación lineal, una etapa de detección añadida tras la extensión de cebador, siendo dicha etapa de detección de temperatura lo suficientemente baja y duración suficiente para que la sonda de hibridación a baja temperatura hibride y señalice, y en la que la etapa de PCR de apareamiento de cebador no es de temperatura lo suficientemente baja y/o de duración suficiente para que dicha sonda hibride y señalice. En determinadas formas de realización preferidas, la temperatura de fusión ajustada a la concentración inicial de la sonda de hibridación a baja temperatura es por lo menos 5ºC por debajo, más preferiblemente por lo menos 10ºC por debajo, de la temperatura de la etapa de apareamiento de la reacción de amplificación, y en las que por lo menos los ciclos de amplificación lineal incluyen una etapa de detección a baja temperatura, preferiblemente de 10-30 segundos de duración, tras la extensión de cebador en la que la temperatura se disminuye por debajo de la temperatura de apareamiento para hibridar dicha sonda, y la detección se realiza. En una versión de estas formas de realización, la mezcla de reacción de PCR incluye adicionalmente un oligonucleótido de enmascaramiento a baja temperatura que es complementario al cebador en exceso y que presenta un punto de fusión ajustado a la concentración, inicial por lo menos 5ºC por debajo del punto de fusión ajustado a la concentración, inicial del cebador en exceso. En otras versiones, la sonda de hibridación a baja temperatura es una sonda de baliza molecular.

Los procedimientos de la invención pueden emplearse utilizando conjuntos de oligonucleótidos que contienen los cebadores o los cebadores y las sondas para realizar las amplificaciones y los ensayos anteriores. Los cebadores se utilizan preferiblemente juntos en un único tampón de modo que se fija la razón de cebador limitativo con respecto a cebador en exceso. También preferiblemente un conjunto de oligonucleótidos especifica una concentración deseada de por lo menos un cebador o una mezcla de los dos, para garantizar que (T_{m[0]}^{L} - T_{m[0]}^{X}) cumpla el criterio de la invención.

También pueden usarse kits de reactivos para realizar los ensayos anteriores para llevar a cabo los procedimientos de la invención. Tales kits incluyen, además de los cebadores y las sondas, por lo menos una ADN polimerasa y dNTP. Preferiblemente, están incluidos todos los reactivos necesarios para realizar el ensayo. Sin embargo, los reactivos individuales, tales como por ejemplo la polimerasa, puede envasarse por separado. Los kits deben incluir las instrucciones para realizar ensayos particulares.

Otro aspecto de esta invención es un procedimiento para la amplificación de una secuencia diana de ácido nucleico presente en una muestra que contiene desde una hasta aproximadamente 10.000 copias de dicha secuencia diana, comprendiendo el procedimiento:

a) poner en contacto la secuencia diana de ácido nucleico con un primer cebador de oligonucleótidos y un segundo cebador de oligonucleótidos, siendo la T_{m} del primer cebador por lo menos 5ºC superior, preferiblemente 10ºC o incluso 20ºC superior a la T_{m} del segundo cebador y siendo la concentración del segundo cebador de hasta 1000 nM y por lo menos aproximadamente 10 veces superior, o incluso de 20-100 veces superior a la concentración del primer cebador; y

b) amplificar la secuencia diana mediante una reacción en cadena de la polimerasa utilizando dichos primer y segundo cebadores de oligonucleótidos, presentando dicha reacción una fase exponencial de generación de amplicón seguida de una fase lineal de generación de amplicón que utiliza sólo el segundo cebador.

Otro aspecto de esta invención es un procedimiento para detectar por lo menos una secuencia de ácido nucleico en una muestra que contiene hasta aproximadamente 10.000 copias de dicha por lo menos una secuencia de ácido nucleico, comprendiendo el procedimiento:

a) poner en contacto la por lo menos una secuencia diana de ácido nucleico con un primer cebador de oligonucleótidos que puede hibridar con ella y un segundo cebador de oligonucleótidos que puede hibridar con ella, siendo la T_{m} del primer cebador por lo menos 5ºC superior, preferiblemente de 10ºC a 20ºC superior a la T_{m} del segundo cebador y siendo la concentración del segundo cebador de hasta 1000 nM y por lo menos aproximadamente 10 veces superior a la concentración del segundo cebador;

b) amplificar la por lo menos una secuencia diana mediante una reacción en cadena de la polimerasa utilizando dichos primer y segundo cebadores de oligonucleótidos, presentando dicha reacción una fase exponencial de generación de amplicón seguida de una fase lineal de generación de amplicón que utiliza sólo el segundo cebador, y

c) detectar el amplicón generado a partir de dicho segundo cebador en tiempo real durante la reacción en cadena de la polimerasa por medio de una primera sonda de hibridación seleccionada dirigida al mismo. La secuencia de ácido nucleico puede ser una secuencia genética sometida a mutación alélica, dirigiéndose dicha primera sonda de hibridación a una primera variante alélica. El amplicón generado a partir de dicho segundo cebador puede detectarse en tiempo real durante la reacción en cadena de la polimerasa por medio de una segunda sonda de hibridación dirigida a una segunda variante alélica. En determinadas formas de realización, la concentración del segundo cebador es 20-100 veces la concentración del primer cebador. Este procedimiento puede utilizarse para detectar por lo menos dos secuencias de ácido nucleico diferentes, caso en el que el procedimiento comprende poner en contacto cada secuencia de ácido nucleico con un primer cebador que puede hibridar con ella y un segundo cebador que puede hibridar con ella. En determinadas formas de realización preferidas, la detección se realiza entre las etapas de PCR de la etapa de extensión de cebador y la etapa de fundido de la cadena, preferiblemente a una temperatura por debajo de la temperatura de extensión de cebador. La sonda puede ser una sonda de baliza molecular o una sonda bicatenaria, entre otras.

Los procedimientos de la invención pueden hacer uso de una composición que comprende por lo menos un par de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa para por lo menos una secuencia diana de ácido nucleico preseleccionada, comprendiendo dicho por lo menos un par un primer cebador y un segundo cebador, siendo la T_{m} del primer cebador por lo menos 5ºC superior, preferiblemente de 10 a 20ºC superior a la T_{m} del segundo cebador y siendo la concentración del segundo cebador por lo menos 10 veces superior, preferiblemente de 20 a 100 veces superior a la concentración del primer cebador.

Es también útil para llevar a cabo los procedimientos según la invención un kit de reactivos para realizar un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para determinar por lo menos una secuencia diana de ácido nucleico preseleccionada, que comprende por lo menos un par de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa incluyendo un primer cebador y un segundo cebador, cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato, una ADN polimerasa termoestable y una sonda de hibridación marcada que emite una señal detectable tras la hibridación, en el que

a) la T_{m} del primer cebador es por lo menos 5ºC superior, preferiblemente de 10 a 20ºC, superior a la T_{m} del segundo cebador y la concentración del segundo cebador es por lo menos 10 veces superior, preferiblemente de 20 a 100 veces superior a la concentración del segundo cebador, y

b) dicha sonda de hibridación marcada, que puede ser una baliza molecular, se dirige al producto de extensión de dicho segundo cebador.

La presente invención también incluye ensayos que utilizan la amplificación por LATE-PCR, incluyendo tanto ensayos de punto final, que pueden o no ser ensayos homogéneos, como ensayos en tiempo real homogéneos que utilizan sondas de hibridación marcadas (incluyendo cebadores marcados) que producen un cambio de señal debido a la extensión del cebador en exceso para preparar amplicones monocatenarios durante los últimos ciclos de la amplificación. Pueden aplicarse a los ensayos de LATE-PCR procedimientos de detección conocidos para PCR.

Los ensayos de LATE-PCR preferidos utilizan sondas de hibridación marcadas que son complementarias a una secuencia en el amplicón monocatenario producido mediante la extensión del cebador en exceso y emiten una señal detectable tras la hibridación. Durante la última fase de LATE-PCR cuando está produciéndose el amplicón monocatenario, esa única cadena no sirve como cadena molde. Por tanto, aunque pueden usarse sondas doblemente marcadas TaqMan^{TM} que se cortan por la ADN polimerasa durante la extensión de cebador en ensayos de LATE-PCR, no son adecuadas para medir directamente el producto monocatenario. Sondas tales como sondas de baliza molecular, sondas bicatenarias y sondas de hibridación FRET son adecuadas para ese fin. En ensayos de LATE-PCR en tiempo real, homogéneos, las sondas que se dirigen al amplicón monocatenario están presentes en la mezcla de reacción inicial. Durante la fase exponencial de la amplificación tales sondas se dirigen a la misma cadena de amplicón que el cebador limitativo.

Una forma de realización adicional de la invención es usar sondas de hibridación a baja T_{m}. La T_{m[0]}^{P} de sondas a baja T_{m} es igual a o por debajo de, preferiblemente, por lo menos 5ºC por debajo, lo más preferiblemente por lo menos 10ºC por debajo de la T_{m[0]}^{L} del cebador limitativo. Las sondas a baja T_{m} utilizadas en una LATE-PCR o bien pueden detectarse durante la etapa de apareamiento de una reacción de 2 ó 3 etapas, o bien pueden detectarse durante una etapa añadida después de la etapa de extensión y antes de la siguiente etapa de fusión. Estas sondas presentan el beneficio añadido de ser más discriminantes de alelos que las sondas de hibridación convencionales.

Una forma de realización preferida de la invención utiliza sondas de hibridación a super-baja T_{m}. La T_{m[0]}^{P} de una sonda a super-baja T_{m} es por lo menos 5ºC por debajo, y más preferiblemente 10ºC por debajo de la temperatura de apareamiento media de la reacción. Las sondas a super-baja T_{m} se emplean preferiblemente en ensayos de LATE-PCR conjuntamente con la etapa de detección nueva, descrita anteriormente, que se lleva a cabo en condiciones preferidas de temperatura disminuida para satisfacer las propiedades de tales sondas. Si se utiliza una temperatura constante para la etapa de apareamiento a través de la fase exponencial de la reacción, la T_{m[0]}^{P} es por lo menos 5ºC, lo más preferiblemente por lo menos 10ºC, por debajo de esa temperatura. Si la temperatura de apareamiento no es constante durante los ciclos de la fase exponencial de la reacción, la temperatura preferida en este caso es por lo menos 5ºC, lo más preferido por lo menos 10ºC por debajo de la temperatura media de la etapa de apareamiento de la fase exponencial de la reacción. Como las sondas a baja T_{m}, las sondas a super-baja T_{m} son más discriminantes de alelos que las sondas de hibridación convencionales.

Determinadas formas de realización preferidas utilizan una etapa de detección añadida en todos o, preferiblemente sólo algunos de los ciclos de amplificación. La etapa de detección es de duración mínima, generalmente de 10 a 30 segundos, suficiente para que las sondas hibriden y señalicen. Se prefiere utilizar esta etapa comenzando de 5 a 10 ciclos antes del ciclo umbral anticipado, C_{T}. Se prefiere también utilizar esta etapa de detección añadida tras la etapa de extensión de cebador. Esta etapa separa de manera eficaz el apareamiento y la extensión de cebador del apareamiento y la detección de sonda.

Determinadas formas de realización preferidas utilizan una versión a baja temperatura de la etapa de detección añadida en todos o algunos de los ciclos de amplificación, concretamente, una etapa de detección a baja temperatura, que comprende la disminución de la temperatura por debajo de la temperatura de la etapa de apareamiento anterior durante un tiempo suficiente para que las sondas a baja T_{m} hibriden y señalicen, generalmente de 10 a 30 s. Se prefiere utilizar esta etapa comenzando de 5 a 10 ciclos antes del ciclo umbral anticipado, C_{T}. Se prefiere también utilizar esta etapa de detección añadida para seguir la etapa de extensión. En otras formas de realización, la detección a baja temperatura se realiza después de la fusión de la cadena pero antes de la extensión de cebador. Después de la detección a baja temperatura, se eleva la temperatura o bien hasta la temperatura de fusión de la cadena o bien hasta la temperatura de extensión de cebador.

En formas de realización preferidas, las sondas no se hibridan con las cadenas de amplicón y diana durante el apareamiento de cebador y la extensión de cebador, y la detección se desacopla del apareamiento de cebador. Por lo contrario, los ensayos de PCR en tiempo real convencionales de la técnica anterior que utilizan sondas que señalizan tras la hibridación, tales como sondas de baliza molecular, hibridan tanto los cebadores como las sondas durante la etapa de apareamiento, y los ensayos se basan en un aumento de la temperatura para la extensión de cebador para eliminar sondas pero no cebadores de las cadenas molde.

Los procedimientos de la invención pueden hacer uso de conjuntos de cebadores y sondas para realizar ensayos y amplificaciones por LATE-PCR. Éstos se denominan a veces "conjuntos de oligonucleótidos". El conjunto para una amplificación o un ensayo incluye uno o más pares de un cebador en exceso y un cebador limitativo que presentan temperaturas de fusión y razones de concentración tal como se describe en la presente memoria. Para los ensayos en tiempo real, el conjunto incluye además por lo menos una sonda de hibridación marcada según se describe en la presente memoria, incluyendo para determinadas formas de realización preferidas, sondas de hibridación a baja T_{m} o sondas de hibridación a super-baja T_{m} que sólo hibridan durante la etapa de detección a baja temperatura descrita anteriormente. Un conjunto de oligonucleótidos que contiene un par de cebadores puede contener más de una sonda, por ejemplo, una para la secuencia de tipo natural que está amplificándose y otra para su alelo mutante. Para conjuntos de oligonucleótidos, uno puede incluir los cebadores o los cebadores y las sondas en tampones separados o, según se prefiera, en un único tampón para fijar sus razones de concentración. Los conjuntos de oligonucleótidos se diseñan según los principios de la LATE-PCR y por tanto presentan concentraciones, razones y temperaturas de fusión ajustadas a la concentración, iniciales especificadas o "deseadas". Por ejemplo, la temperatura de fusión ajustada a la concentración, deseada del cebador limitativo debe ser por lo menos igual a la temperatura de fusión ajustada a la concentración deseada del cebador en exceso, y etcétera.

Los procedimientos de la invención también pueden hacer uso de kits de reactivos para amplificaciones y ensayos. Los kits para amplificación incluyen, además de los conjuntos de cebadores, por lo menos una ADN polimerasa, cuatro dNTP y tampón de amplificación. Los kits de ensayo homogéneo en tiempo real contienen conjuntos de oligonucleótidos que incluyen cebadores y sondas de hibridación marcadas así como ADN polimerasa, cuatro dNTP y tampón de amplificación. Los kits pueden contener componentes adicionales para la preparación de muestras, así como controles. Los kits completos contienen todos los reactivos necesarios para realizar un ensayo o una amplificación por LATE-PCR y, opcionalmente, materiales desechables que van a usarse. Los kits pueden estar en un envase o en múltiples envases, es decir, modular.

La multiplexación implica la amplificación simultánea en un único recipiente de reacción de dos o más secuencias diana utilizando múltiples pares de cebadores, uno para cada diana. Un aspecto de esta invención son los ensayos de LATE-PCR múltiplex. En los ensayos múltiplex se prefiere que la T_{m[0]}^{L} de todos los cebadores limitativos en la reacción se haga igual a o superior a la T_{m[0]}^{X} de todos los cebadores en exceso en la reacción. Se recomienda que los candidatos de cebadores se sometan a análisis informático para seleccionar casos obvios de formación dímeros de cebadores, así como interacciones de cadenas de producto inapropiadas.

Los detalles de una o más formas de realización de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención se pondrán de manifiesto a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción de los dibujos

La figura 1 presenta curvas de fluorescencia en tiempo real de amplificaciones por PCR con un par de cebadores según esta invención y con un par de cebadores para PCR simétrica.

La figura 2A presenta curvas de fluorescencia en tiempo real de amplificaciones por PCR con pares de cebadores que presentan valores variables de la diferencia (T_{m[0]}^{L} - T_{m[0]}^{X}), utilizando una temperatura de apareamiento constante.

La figura 2B presenta curvas de fluorescencia en tiempo real de amplificaciones por PCR con pares de cebadores que presentan valores variables de la diferencia (T_{m[0]}^{L} - T_{m[0]}^{X}), y una temperatura de apareamiento con relación a T_{m[0]}^{L}.

Las figuras 3A, 3B, 3C presentan curvas de fluorescencia en tiempo real de amplificaciones por PCR repetidas con pares de cebadores que presentan diversas relaciones de T_{m} a concentraciones tanto iguales como no iguales.

Las figuras 4A, 4B presentan curvas de fluorescencia en tiempo real de amplificaciones por PCR repetidas con pares de cebadores que presentan diferentes relaciones de T_{m} a concentraciones tanto iguales como no iguales.

Las figuras 5A, 5B, 5C presentan curvas de fluorescencia en tiempo real de amplificaciones por PCR que presentan pares de cebadores que presentan diferentes relaciones de T_{m} a varias razones de concentración.

La figura 6 presenta curvas de fluorescencia en tiempo real de amplificaciones por PCR que presentan valores variables de (T_{m}^{A} - T_{m[0]}^{X}) con (T_{m[0]}^{L} - T_{m[0]}^{X}) en el intervalo de 0,0ºC.

La figura 7 presenta curvas de fluorescencia en tiempo real de amplificaciones por PCR que presentan valores variables de (T_{m}^{A} - T_{m[0]}^{X}) con (T_{m[0]}^{L} - T_{m[0]}^{X}) en el intervalo de 5-6ºC.

La figura 8 presenta curvas de fluorescencia en tiempo real de amplificaciones por PCR que presentan diferentes concentraciones de sonda a baja T_{m}.

La figura 9 presenta curvas de fluorescencia en tiempo real de amplificaciones por PCR de células homocigóticas en comparación con las células heterocigóticas.

La figura 10 presenta curvas de fluorescencia en tiempo real de una amplificación por PCR múltiplex de dos secuencias diana.

Las figuras 11A, 11B presentan análisis de fusión y curvas de fluorescencia de amplificaciones por LATE-PCR realizadas con una etapa de apareamiento riguroso y una etapa de apareamiento no riguroso.

Los símbolos de referencia iguales presentes en los diversos dibujos designan elementos iguales.

Descripción detallada Diseño de pares de cebadores limitativos y en exceso

El diseño de pares de cebadores para su utilización en esta invención puede realizarse directamente, tal como se explicará. Alternativamente, puede comenzarse seleccionando o diseñando un par de cebadores para PCR simétrica mediante procedimientos conocidos, seguido de modificaciones para la LATE-PCR. Los cebadores para PCR simétrica se diseñan para que presenten puntos de fusión iguales en algún conjunto de condiciones habituales de concentración de cebadores y concentración salina. Los cebadores para PCR simétrica se diseñan y analizan convenientemente utilizando un programa informático disponible. Para la PCR simétrica y asimétrica, las técnicas habituales para calcular las temperaturas de fusión (T_{m}) han sido el procedimiento del "vecino más próximo" y el procedimiento de "2(A+T) + 4(G+C)". Para aclaración se introduce el concepto de T_{m[1]} que es la T_{m} del cebador a una concentración de cebador habitual de 1 \muM y sal 0,07 M (cationes monovalentes). La conversión de la T_{m} dada mediante un programa informático típico a T_{m[1]} generalmente presenta un efecto mínimo sobre la relación de las T_{m} de un par de cebadores. Para determinar las temperaturas de fusión ajustadas a la concentración de pares de cebadores según esta invención, se requiere o bien una medición real o bien un cálculo apropiado. Para el fin de describir y comparar puntos de fusión de cebadores según esta memoria descriptiva y reivindicaciones, "punto de fusión ajustado a la concentración", o "T_{m[0]}", se calcula el punto de fusión según la fórmula del vecino más próximo expuesta anteriormente en las definiciones utilizadas en esta memoria descriptiva si es posible; por otro lado de determina T_{m[0]} empíricamente.

En la práctica, una vez se ha elegido una secuencia diana (por ejemplo una secuencia que flanquea una mutación dentro de un gen) particular para la amplificación, varios pares candidatos de cebadores a igual T_{m} se diseñan mediante un programa informático tal como Oligo 6.0® utilizando los valores por defecto del programa. Los pares de cebadores candidatos se examinan entonces, basándose en los criterios adicionales, tales como la posible formación de dímeros de cebadores, que se conocen en la materia por producir calidades de cebadores no deseables. Además se examinan los pares satisfactorios de cebadores candidatos utilizando un software tal como "Blast" para determinar posibles apareamientos no específicos con secuencias de ADN en otro sitio en el genoma conocido de las especies de la secuencia diana (Madden, T.L. et al. (1996) "Applications of Network BLAST Server", Meth. Enzymol. 266: 131-141). Entonces se comparan los pares de cebadores con respecto a sus valores de T_{m[0]} a varias concentraciones y razones diferentes posibles de modo que el cebador elegido para ser el cebador limitativo presentará una T_{m[0]} igual o superior con relación al cebador elegido para ser el cebador en exceso. Además, se examinan los pares de cebadores candidatos en relación a la secuencia del amplicón que se espera que generen. Por ejemplo, determinadas secuencias diana pueden contener una secuencia rica en GC en un extremo y una secuencia menos rica en GC en el otro extremo. Cuando esto se produce, elegir la secuencia del cebador limitativo dentro de las secuencias en el extremo rico en GC ayudará a lograr un punto de fusión superior para el cebador limitativo en relación al cebador en exceso, que consistirá en secuencias en el extremo menos rico en GC. El examen de los pares de cebadores candidatos en relación a la secuencia de amplicón puede sugerir maneras nuevas o adicionales de modificar las secuencias de uno o ambos miembros del par, tal como aumentar o disminuir deliberadamente la longitud del cebador, lo más preferiblemente en su extremo 5', o introducir cambios en las secuencias de bases dentro del cebador que hace deliberadamente que se aparee de manera errónea con su diana en regiones pequeñas. Tales cambios aumentarán o disminuirán la T_{m[0]} del cebador o bien limitativo o bien en exceso.

La tabla I ilustra dos posibles pares de cebadores para un alelo en el gen HEX-A que es responsable de la enfermedad de Tay-Sachs, así como el criterio de LATE-PCR utilizado para juzgar si era o no probable que fueran adecuados para LATE-PCR. De acuerdo con los principios teóricos de LATE-PCR, el ensayo experimental tratado a continuación con respecto a la figura 1 establecía que sólo el par de cebadores para el que (T_{m[0]}^{L} - T_{m[0]}^{X}) \geq0 (es decir, el conjunto 2 de cebadores, tabla I) era adecuado para LATE-PCR. Comparando los dos conjuntos de cebadores, se observará que el cebador limitativo en el conjunto 2 presenta dos nucleótidos en 5' adicionales en comparación con su correspondiente cebador en el conjunto 1. El cebador en exceso es el mismo en ambos conjuntos.

1

Tal como se explicó anteriormente, en el caso de LATE-PCR, T_{m[1]}^{L} debe ser superior a T_{m[1]}^{X} con el fin de garantizar que la temperatura de fusión real del cebador limitativo es superior a o igual a la temperatura de fusión real del cebador en exceso a las concentraciones de cebador real en la reacción, es decir (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) \geq0. Si esta condición no se cumple, es decir (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) < 0, las reacciones de amplificación se ejecutan de manera ineficaz. Estas características de LATE-PCR se ilustran en la figura 1, que muestra las reacciones de LATE-PCR en tiempo real con los pares de cebadores de la tabla 1 en las que los productos bicatenarios sintetizados durante la fase exponencial de la reacción se han visualizado utilizando SYBR® Green. La curva 12 muestra la reacción eficaz (producto detectado en algunos ciclos térmicos menos), (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) = 0 y (T_{m[1]}^{L}-T_{m[1]}^{X}) = 5, mientras que la curva 11 muestra la reacción ineficaz (producto detectado en más ciclos térmicos), (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) = -5 y (T_{m[1]}^{L}-T_{m[1]}^{X}) = 1. Ambas reacciones amplificaron la misma región del gen HEX-A y ambas se iniciaron con 1000 genomas. En el caso de la curva 12, T_{m[1]}^{L} = 69ºC y T_{m[1]}^{X} = 64ºC, mientras que en el caso de la curva 11, T_{m[1]}^{L} = 64 mientras que T_{m[1]}^{X} = 64ºC (véase la tabla I). El diseño y la ejecución de este experimento se describen en detalle en el ejemplo 1.

La figura 2A, basada en los pares de cebadores descritos en el ejemplo 3, ilustra el hecho de que a medida que se aumenta T_{m[1]}^{L} varios grados por encima de T_{m[1]}^{X}, (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) se vuelve > 0, y la eficacia de la LATE-PCR aumenta aún más. Cada una de las curvas en la figura 2A muestra el aumento medio de fluorescencia en tiempo real en muestras con (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) = +7 (curva 21), +5 (curva 22), +3 (curva 23), 0 (curva 24), y -3 (curva 25). Cada curva representa la fluorescencia promedio de 3 muestras repetidas. La detección más temprana (el valor de C_{T} medio más bajo) se obtuvo utilizando el par de cebadores con el valor más alto de (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}), curva 21. Los valores de C_{T} medios aumentaron con cada disminución del valor de (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}). Los valores de C_{T} inferiores demuestran una tasa superior de amplificación (es decir, aumento de la eficacia) durante la fase exponencial de la reacción. Los detalles experimentales acerca de este experimento se proporcionan a continuación en el ejemplo 3. El ejemplo 3 (y la figura 2B en este respecto) también describe un experimento adicional que ilustra que la eficacia y especificidad de la LATE-PCR mejora cuando (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) se vuelve > 0.

Las figuras 3A a 3C muestran ejemplos de amplificación utilizando tres conjuntos diferentes de cebadores de CFTR. Los detalles experimentales de la figura 3 se describen en el ejemplo 4. Los cebadores eran o bien equimolares (ambos a 500 nM; curvas 32, 34 y 36) o estaban presentes a una razón de 1:10 (cebador limitativo 50 nM:cebador en exceso 500 nM; curvas 31, 33 y 35). Todos los experimentos utilizaron una sonda de baliza molecular que monitorizaba la síntesis de la cadena de cebador en exceso del amplicón para el alelo \DeltaF508 de fibrosis quística. Los valores de T_{m} para los cebadores se obtuvieron inicialmente utilizando los parámetros por defecto del programa Oligo® 6.0. Basándose en este programa los valores de T_{m} equimolares de los cebadores utilizados en la figura 3 fueron tal como sigue: la figura 3A ambos cebadores a 65ºC; la figura 3B cebador limitativo a 70ºC y cebador en exceso a 65ºC; la figura 3C cebador limitativo a 75ºC y cebador en exceso a 65ºC.

Tal como se muestra en la figura 3A, la reacción asimétrica (razón de cebadores de 1:10, curva 31) utilizando los dos cebadores con las mismas T_{m} da como resultado una señal de fluorescencia que está retardada (C_{T} superior), en comparación con la reacción simétrica (cebadores equimolares, curva 32). Sin embargo, cuando se introduce una diferencia de 5ºC en las T_{m} (figura 3B), el C_{T} para los cebadores con una razón de 1:10 (curva 33) se produce mucho antes, casi tan pronto como para los cebadores equimolares (curva 34). Adicionalmente, la señal de fluorescencia final para los cebadores con una razón de 1:10 (curva 33) es muy superior a la señal para los cebadores equimolares (curva 34), y no ha formado meseta, incluso más allá de 60 ciclos. Cuando se introduce una diferencia de 10ºC en las T_{m} (figura 3C), el C_{T} para los cebadores con una razón de 1:10 (curva 35) es el mismo que para los cebadores equimolares (curva 36), y la fluorescencia final es muy superior y no forma meseta.

Las figuras 4A a 4B muestran un ejemplo similar utilizando dos conjuntos de cebadores para la enfermedad de Tay-Sachs, gen HEX-A. En este caso, los cebadores eran o bien equimolares (ambos 300 nM; curvas 41 y 44) o estaban presentes a una razón de 1:100 (cebador limitativo 10 nM; cebador en exceso 1000 nM; curvas 42 y 43). Todos los experimentos utilizaron una sonda de baliza molecular que monitorizaba la síntesis del producto monocatenario del cebador en exceso para el alelo normal del gen HEX-A, en la región del gen que incluye 1278 alelos que provocan la enfermedad. Una vez más, los valores de T_{m} de los cebadores se obtuvieron inicialmente utilizando los parámetros por defecto del programa Oligo® 6.0. Basándose en este programa los valores de T_{m} equimolares de los cebadores utilizados en la figura 4 fueron tal como sigue: la figura 4A ambos cebadores a 72ºC; la figura 4B cebador limitativo a 84ºC y cebador en exceso a 72ºC.

Una vez más, la reacción asimétrica (razón de cebadores de 1:100, curva 42) utilizando cebadores a igual T_{m} (tal como se calcula mediante los valores por defecto del programa Oligo® 6.0) da como resultado una señal de fluorescencia que está retardada (C_{T} superior), en comparación con la reacción simétrica (cebadores equimolares, curva 42, figura 4A). Sin embargo, cuando se introduce una diferencia de 12ºC en las T_{m} (figura 4B), el C_{T} para los cebadores con una razón de 1:100 (curva 43) es el mismo que para los cebadores equimolares (curva 44), y la fluorescencia final es muy superior no forma meseta.

La aplicación de la fórmula del "vecino más próximo" permite que los valores de T_{m} por defecto obtenidos a partir del programa Oligo® 6.0 se conviertan en valores T_{m[0]} que tienen en cuenta la concentración de partida real de cada cebador, tal como se muestra en la tabla II. Los valores de T_{m} calculados mediante Oligo 6.0 son útiles sólo como una aproximación aproximada, puesto que se basan en los valores termodinámicos y factores de corrección de la sal de Breslauer et al. (Breslauer KJ et al., (1986) "Predicting DNA Duplex Stability From The Base Sequence", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3746-50), y son relativamente imprecisos (Owczarzy R, et al., (1998) "Predicting Sequence-Dependent Melting Stability of Short Duplex DNA Oligomers", Biopolymers 44: 217-39; SantaLucia J. (1998) "A Unified View of Polymer, Dumbbell, and Oligonucleotide DNA Nearest-Neighbor Thermodynamics", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1460-5). Los datos resultantes representan completamente los resultados mostrados en las figuras 3 y 4 en cuanto a los principios de LATE-PCR. Sólo las reacciones ilustradas en las figuras 3C y 4B cumplen el requerimiento de que (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) \geq0, y por tanto son reacciones de LATE-PCR. Sólo estas reacciones tienen los valores de C_{T} más bajos y las señales de fluorescencia finales más altas y no forman meseta como las reacciones que utilizan cebadores equimolares. Por el contrario, las reacciones asimétricas convencionales en las figuras 3A, 3B y 4A presentan (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X})< 0. Estas reacciones son ineficaces (valores de C_{T} superiores y fluorescencia inferior).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

2

Las figuras 5A a 5C ilustran que los cebadores para LATE-PRC bien diseñados generan reacciones eficaces a lo largo de un amplio intervalo de razones de cebador limitativo con respecto a cebador en exceso. En este caso, los cebadores de HEX-A utilizados en la figura 4B se prepararon a tres razones diferentes: 1:10, 1:40, 1:100. La concentración de partida del cebador en exceso se mantuvo constante (a 1000 nM) en cada caso, mientras que la concentración de partida del cebador limitativo disminuyó (desde 100 nM hasta 25 nM hasta 10 nM). Las eficacias y cinéticas de estos ensayos (curvas 51, 53 y 55, respectivamente) se compararon con un ensayo que contenía concentraciones equimolares de los mismos dos cebadores (500 nM:500 nM, curvas 52, 54 y 56). Cada ensayo se realizó repetidas veces (5 reacciones cada uno) y los promedios de estas repeticiones se muestran en las figuras 5A a 5C. Los resultados muestran que las tres reacciones de LATE-PCR (curvas 51, 53 y 55) fueron eficaces, es decir presentaron valores de C_{T} equivalentes o ligeramente inferiores al ensayo de PCR simétrica (curvas 52, 54, 56), y no formaron meseta mientras que la reacción simétrica si lo hizo. El análisis de los conjuntos de cebadores utilizados en la figura 5 se proporciona en la tabla III y explica estos resultados en cuanto a los principios de la LATE-PCR. Las tres reacciones asimétricas en la figura 5 (curvas 51, 53 y 55) presentan (T_{m[0]}^{L}-_{Tm[0]}^{X}) \geq0.

TABLA III Comparación de (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) para diferentes razones de cebadores

3

Diseño del cebador en exceso en relación al amplicón

LATE-PCR, al contrario que la mayoría de PCR simétrica y asimétrica, también tiene en cuenta el punto de fusión del amplicón, T_{m}^{A}, particularmente cuando se refiere al punto de fusión ajustado a la concentración del cebador en exceso. Puesto que los amplicones casi siempre son superiores a 50 nucleótidos de longitud, se calcula la T_{m}^{A} del amplicón mediante el procedimiento del "% de GC", véase anteriormente. Aunque pueden utilizarse otras fórmulas matemáticas o incluso otros medios, tales como prueba y error, para diseñar cebadores según esta invención, se analizan las relaciones de punto de fusión descritas en la presente memoria utilizando las fórmulas dadas anteriormente. Estas fórmulas son útiles tanto para el diseño como la evaluación a pesar del hecho de que no consideran las concentración de ión magnesio (Mg^{++}), que está incluida casi de manera universal en mezclas de reacción de PCR en concentraciones de desde 1 hasta 5 mM, y afecta a los puntos de fusión de cebadores y amplicones. El ejemplo 5 describe el diseño de diferentes pares de cebadores que tienen en cuenta la T_{m}^{A}, así como determinadas propiedades de cebadores que se prefieren.

Para cualquier diana de ADN elegida (por ejemplo, la secuencia que flanquea una mutación en un gen particular) T_{m}^{A} es normalmente similar para pares candidatos de cebador limitativo y en exceso. Por esta razón, el tamaño aproximado del amplicón (y ubicación aproximada de los cebadores) se elige primero, estableciendo la T_{m}^{A} aproximada. A continuación se seleccionan varios cebadores en exceso posibles, de modo que (T_{m}^{A} - T_{m[0]}^{X}) está dentro del intervalo preferido de 7-18ºC, más preferiblemente de 7-15ºC, para amplificaciones, o de 7-25ºC, más preferiblemente de 7-18ºC y lo más preferiblemente de 7-18ºC, para ensayos en tiempo real. Una vez que se ha seleccionado un conjunto de posibles cebadores en exceso, la secuencia de la diana se examina para determinar la presencia de posibles secuencias ricas en GC en la que se diseñan cebadores limitativos candidatos. A continuación se diseñan varios cebadores limitativos posibles para un intervalo de posibles razones de cebador en exceso/limitativo, con el objetivo de asegurar que (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) \geq0.

La figura 6 muestra un conjunto de tales reacciones en las que (T_{m[0]}^{A}-T_{m[0]}^{X}) se varía desde +7 hasta +19ºC, y (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) se fija específicamente a cero. Los detalles experimentales para estos datos se describen en el ejemplo 5. Cada curva representa el aumento promedio de la fluorescencia de baliza molecular de 3 muestras repetidas. Los ensayos con (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) = 12 (curva 61) dieron la señal de baliza más intensa (es decir, la cantidad más grande del producto de CFTR monocatenario) en esta serie. Las muestras con (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) = 19 (curva 65) dieron la señal más baja. Las muestras con valores intermedios de (T_{m[0]}^{A}-T_{m[0]}^{X}) = 14 (curva 62), o 16 (curva 64) dieron intensidad de señal promedio intermedia correspondiente a ese valor. Las muestras con (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) = 7 (curva 63) también dieron intensidad de señal final intermedia.

La figura 7 ilustra varias reacciones en tiempo real en las que (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) varía desde +13 hasta +23ºC y (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) = 5 a 6ºC en todos los casos, (ejemplo 5, tabla IX). La señal de baliza molecular media más alta (ciclos 35 a 60) estaba en muestras con (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) = 13 (curva 71), lo que indica una síntesis monocatenaria eficaz. La intensidad media de la señal de baliza molecular disminuye con cada aumento de (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) hasta valores de 17 (curva 72), 19 (curva 73), 20 (curva 74) y 23 (curva 75). Ninguna de estas muestras mostraron una meseta de amplificación, lo que ilustra otra ventaja de presentar (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) \geq5ºC. La electroforesis de estas muestras reveló sólo el amplicón mono y bicatenario específico. Los detalles experimentales de los datos en la figura 7 se proporcionar en el ejemplo 5.

Los cebadores para las amplificaciones y los ensayos según esta invención pueden utilizar secuencias de cebador universales añadidas al extremo 5' de uno o ambos cebadores de un par. Las secuencias de cebado universales presentan utilidades particulares, tales como la introducción de secuencias de enzima de restricción específicas, o para potenciar la multiplexación. Una secuencia de cebado universal incluida en un cebador limitativo no elevará su temperatura de fusión con la diana deseada durante los ciclos iniciales de amplificación, si la especificad es particularmente crucial, pero elevará su temperatura de fusión después de eso para la generación de amplicones que contienen secuencias complementarias a la secuencia de cebado universal. Aunque la temperatura de apareamiento durante los pocos primeros, generalmente de 5 a 10, ciclos puede disminuirse para mejorar la eficacia si el cebador limitativo contiene una adición de secuencia universal, debe tenerse cuidado en no provocar la amplificación no específica debido a la hibridación no específica del cebador en exceso que puede resultar. En algunos casos puede ser preferible sacrificar la eficacia durante los pocos primeros ciclos utilizando una temperatura de apareamiento superior según la T_{m} de la parte del cebador que es complementaria a las dianas de partida. Si se añade una secuencia de cebado universal al cebador en exceso, habrá un aumento del punto de fusión similar tras los pocos primeros ciclos, que reducirá la diferencia del punto de fusión entre los dos cebadores. Si se añade una secuencia de cebado universal al cebador limitativo, o se introduce cualquier otro apareamiento erróneo en el cebador limitativo, de modo que el cebador limitativo no hibride perfectamente a lo largo de su longitud completa con su diana inicial, el punto de fusión ajustado a la concentración del cebador completo, T_{m[0]}^{L}, se diseña para ser superior a o igual al punto de fusión ajustado a la concentración del cebador en exceso T_{m[0]}^{X}, con la condición añadida de que el punto de fusión ajustado a la concentración funcional de la parte del cebador limitativo con respecto a su secuencia diana inicial no es más de 5ºC inferior a, y preferiblemente por lo menos igual al punto de fusión ajustado a la concentración del cebador en exceso. Los cebadores útiles en esta invención pueden contener nucleótidos modificados, por lo que significa generalmente nucleótidos diferentes de los cuatro dNTP naturales. Tales nucleótidos pueden afectar al punto de fusión del cebador. Si no puede establecerse una fórmula matemática para determinar el efecto de un nucleótido modificado particular, el punto de fusión ajustado a la concentración, T_{m[0]}, puede determinarse empíricamente.

Protocolo para optimizar la concentración absoluta del cebador limitativo y el cebador en exceso

En ensayos de LATE-PCR en tiempo real es deseable que el cebador limitativo se agote en aproximadamente el mismo ciclo térmico en el que el producto monocatenario de la reacción se vuelve por primera vez detectable por encima del nivel de fondo, el valor de C_{T} de la reacción. Tal como se conoce en la materia, el ciclo en el que el valor de C_{T} se alcanza depende, entre otras cosas, de la cantidad de ADN diana presente al inicio de la reacción, la eficacia de amplificación, la naturaleza del equipo de detección y la intensidad de la señal (normalmente una señal fluorescente o eléctrica) generada mediante la sonda de hibridación. En LATE-PCR uno de los cebadores se agota tras aproximadamente de 15 a 35 ciclos de PCR, tras los cual la amplificación lineal de una cadena tiene lugar durante ciclos posteriores utilizando el cebador en exceso. Con el fin de maximizar la cantidad de producto monocatenario, es útil optimizar la cantidad absoluta del cebador limitativo para cualquier razón elegida de cebadores. En la práctica, también es deseable evitar que las concentraciones de cebador limitativo superen 200 nM. Por encima de esta concentración, la fase exponencial prolongada de la reacción puede producir una razón de producto bicatenario con respecto a monocatenario que inaceptable para algunas aplicaciones y puede reducir realmente la cantidad total de producto monocatenario generado. Además, a una razón de 10:1 o superior, la concentración de cebador en exceso se extendería por encima de 2000 nM. En estas condiciones es difícil evitar la iniciación no específica de la amplificación.

La concentración preferida de cebador limitativo depende principalmente de la naturaleza general de la sonda (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia del estado hibridado frente al no hibridado), la sensibilidad del equipo de detección y la capacidad de la sonda específica de hibridar con su diana a la temperatura de detección. La concentración de cebador limitativo necesaria depende menos de la concentración de diana inicial, ya que el aumento de números de diana agotará simplemente al cebador limitativo en un ciclo térmico temprano, en el que la señal de la sonda se vuelve detectable.

Un procedimiento para elegir la concentración de cebador limitativo que da la transición deseada desde la amplificación exponencial hasta la lineal es a través de determinación empírica. En primer lugar, se diseñan varios pares de cebador limitativo/cebador en exceso para someter a prueba una o más razones de cebadores (por ejemplo, de 1 a 20). A continuación, se somete a prueba empíricamente cada uno de los pares de cebadores a varias temperaturas de apareamiento, tiempos de apareamiento y/o concentraciones de magnesio para determinar qué par de cebadores y qué condiciones generan el amplicón específico deseado con la mayor eficacia y especificidad. En reacciones en tiempo real, la eficacia de la amplificación global puede seguirse mediante la utilización de SYBR® Green para determinar el valor de C_{T} de la reacción. Las condiciones de apareamiento óptimas deben determinarse para cada concentración de pares de cebadores que van a someterse a ensayo utilizando una sonda específica de secuencia, véase a continuación.

A continuación, la amplificación se lleva a cabo en presencia de la sonda específica en condiciones óptimas para varias concentraciones del cebador limitativo en el intervalo esperado para la sonda que se utilizará. Si la sonda es una baliza molecular, la concentración preferida de cebador limitativo se encuentra en el intervalo de 10 nM a 100 nM. La concentración preferida de cebador limitativo corresponde a la concentración más baja del cebador limitativo que da un valor de C_{T} medio similar a los de las muestras con concentraciones superiores de ese cebador. La concentración por debajo de las concentraciones preferidas muestra aumentos de más de 1 ciclo a medida que la concentración se disminuye, lo que indica que en estas circunstancias, el agotamiento del cebador limitativo se produce con demasiada antelación para alcanzar el umbral de detección. Además, las muestras con concentraciones preferidas de cebador limitativo mostrarán una tasa lineal de aumento de señal para varios ciclos tras alcanzar el umbral sin formar meseta, normalmente incluso 30 ciclos tras la detección inicial.

\vskip1.000000\baselineskip

Protocolo para optimizar la temperatura de apareamiento para LATE-PCR

Una vez que se ha elegido un par de cebador limitativo/en exceso adecuado para su utilización a una razón fija y concentración absoluta, se habrá calculado o podrá calcularse la T_{m[0]} de cada cebador, utilizando la fórmula del vecino más próximo tal como se describió anteriormente. Una vez hecho esto, es importante establecer empíricamente la temperatura de apareamiento óptima a la que utilizar estos cebadores. La temperatura de apareamiento óptima es la temperatura más alta a la que continúa la fase exponencial de la reacción con eficacia máxima y especificidad máxima a tiempos de ciclado y concentraciones de reactivo específicos. Por "eficacia máxima" se quiere decir la condición que genera el valor C_{T} más bajo durante la fase exponencial de la reacción, en la que se acumula el producto específico a la tasa más alta. Cuando la temperatura de apareamiento se ajusta además de manera descendente hacia la temperatura de apareamiento óptima, la eficacia de la fase exponencial de la LATE-PCR tiende a aumentar. Cuando la temperatura de apareamiento se ajusta de manera descendente por debajo de la temperatura de apareamiento óptima, las reacciones tienden a amplificar amplicones no específicos. Si, como a veces es el caso, el par de cebadores que se está utilizando no hibrida de manera no específica con secuencias alternas dentro de la muestra diana, la disminución de la temperatura de apareamiento por debajo de la temperatura de apareamiento óptima no aumenta la eficacia de la reacción significativamente y no disminuye sustancialmente la especificidad de la reacción. Por tanto, la expresión temperatura de apareamiento óptima tal como se utiliza en esta solicitud tiene un valor específico definido empíricamente, incluso para las amplificaciones en las que disminuir la temperatura de apareamiento por debajo de la temperatura no es perjudicial.

\vskip1.000000\baselineskip

Protocolo para la detección del producto en PCR en tiempo real convencional

En el caso de la PCR en tiempo real convencional, el producto bicatenario se detecta mediante la inclusión de un colorante fluorescente o algún tipo de una sonda marcada, normalmente una sonda fluorescente. La detección de cadenas dobles utilizando un colorante fluorescente puede realizarse durante la etapa de extensión de cebador. Las sondas de hibridación normalmente se unen a una o ambas cadenas del amplicón cuando se está enfriando la reacción entre las etapas de fundido de la cadena y apareamiento de cebador. En la práctica, esto significa que la temperatura de fusión de la sonda es superior a la temperatura de fusión del cebador que hibrida con la misma cadena que la sonda (Mackay, I.M. (2002) "Survey y Summary: Real-time PCR in Virology", Nucleic Acids Res. 30(6):1292-1305). Cuando se calienta de nuevo la reacción, la sonda está diseñada para soltarse de su cadena diana mientras que el cebador se extiende a lo largo de la cadena diana. La hibridación y la extensión del otro cebador sobre la cadena complementaria también tienen lugar durante estas etapas. Las sondas que generan la señal detectada a través de la hibridación se detectan durante la etapa de apareamiento. Las sondas que generan la señal detectada cuando se están hidrolizando se detectan tras su degradación durante la etapa de extensión posterior. En cualquier caso, la cantidad de sonda hibridada está limitada al volver a aparearse las cadenas del amplicón a medida que aumenta su concentración. Esto significa que realmente sólo se detecta una fracción del número total de secuencias diana presentes al final de una reacción en tiempo real convencional.

Además, en las condiciones de reacción en tiempo real convencional, la sonda de hibridación debe o bien desprenderse de la secuencia diana antes de la etapa de extensión o bien hidrolizarse durante la etapa de extensión. Si la sonda de hibridación no se elimina por fusión de su cadena molde rápidamente a medida que se eleva la temperatura desde el apareamiento de cebador hasta extensión de cebador en una reacción de PCR simétrica, se ha encontrado que la sonda puede interferir con la extensión de cebador y reducir la eficacia de amplificación de la reacción.

\vskip1.000000\baselineskip

Protocolo para la detección de producto en LATE-PCR en tiempo real

Los ensayos de LATE-PCR en tiempo real, al igual que los ensayos de PCR simétrica en tiempo real, incluyen una o más sondas marcadas o colorantes fluorescentes para la detección de los productos bicatenarios y/o monocatenarios. De nuevo, al igual que en el caso de la PCR simétrica, puede llevarse a cabo la detección del producto bicatenario sintetizado durante la fase exponencial de la LATE-PCR durante o bien la etapa de apareamiento de cebador o bien la de extensión de cebador, lo más preferiblemente durante la etapa de extensión de cebador. El producto bicatenario generado durante la fase exponencial de la LATE-PCR puede detectarse utilizando un colorante se une al ADN bicatenario, tal como SYBR® Green. Sin embargo, el ADN bicatenario no puede detectarse durante una etapa de detección a baja temperatura mediante la utilización de una sonda de hibridación, tal como una sonda monocatenaria o una baliza molecular, porque la inmensa mayoría de las dos cadenas de amplicón vuelven a aparearse entre sí a baja
temperatura.

En una forma de realización de la invención, puede llevarse a cabo la detección de las moléculas monocatenarias que se acumulan durante la etapa de apareamiento, es decir, antes de la etapa de extensión. Se prefiere que la sonda sea una sonda a baja T_{m} con una T_{m[0]}^{P} por lo menos 5ºC, preferiblemente por lo menos 10ºC por debajo de la T_{m[0]}^{L}. (Sondas lineales doblemente marcadas para el ensayo de 5' nucleasa (por ejemplo sondas TaqMan®) nunca son sondas a baja T_{m}, porque deben permanecer unidas a la cadena molde hasta que se degradan durante la extensión del cebador.) En estas condiciones, las sondas a baja T_{m} detectan las cadenas sencillas que se acumulan más una fracción de cadenas diana que, en caso contrario, se volverían a aparear con sus cadenas complementarias si la sonda no estuviera presente. La magnitud exacta de la fracción depende de la T_{m[0]}^{P} así como de las condiciones de reacción y tiende a variar ligeramente entre las reacciones repetidas, introduciendo así una variable en estas mediciones. Con el fin de minimizar este error, se prefiere utilizar, para la detección durante la etapa de apareamiento, una sonda a super-baja T_{m} y reducir la temperatura de la etapa de apareamiento por debajo de la temperatura de apareamiento media para la hibridación del cebador durante la fase exponencial de la reacción, con la condición de que este cambio en el perfil térmico no conducirá a un cebado erróneo. El procedimiento preferido para evitar el cebado erróneo en estas circunstancias es sólo disminuir la temperatura de apareamiento en, o preferiblemente algunos ciclos antes de, el ciclo en el que el cebador limitativo llega a agotarse y la reacción cambia a la síntesis de la cadena de cebador en exceso
únicamente.

En una forma de realización más preferida de la invención, se introduce una etapa de detección en el perfil térmico de la reacción entre la extensión de cebador de un ciclo térmico y la fusión de la cadena del siguiente ciclo térmico. En este caso, se introduce la etapa de detección con el fin de detectar moléculas de cadena sencilla que se acumulan una vez finalizada la etapa de extensión, utilizando sondas de hibridación que son complementarias a secuencias dentro de la cadena formada mediante la extensión del cebador en exceso. La detección puede llevarse a cabo a cualquier temperatura a la que la sonda hibrida con su diana, en la mayoría de los casos por debajo de la temperatura de extensión, y preferiblemente a o por debajo de la temperatura de apareamiento, en combinación con una sonda a baja T_{m}. En la realización más preferida de la invención, la detección añadida se lleva a cabo a una temperatura baja, preferiblemente 5ºC por debajo y lo más preferiblemente 10ºC por debajo, de la temperatura media de la etapa de apareamiento de la fase exponencial de la reacción y utiliza una sonda a super-baja T_{m}. La detección del producto monocatenario es la más precisa cuando la detección se lleva a cabo tras la etapa de extensión de un ciclo y la etapa de fusión del siguiente ciclo, en comparación con la detección durante la etapa de apareamiento.

La introducción de una etapa de detección separada en la LATE-PCR, preferiblemente una etapa de detección a baja temperatura, presenta varias ventajas con respecto a la estrategia convencional de la detección de la sonda antes de/o durante la etapa de extensión. Esto posibilita separar el apareamiento y la extensión de cebador de la hibridación y detección de la sonda. Esto, a su vez, posibilita utilizar temperaturas de apareamiento elevadas y/o tiempos de apareamiento extremadamente cortos (tal como apareamiento con rampa decreciente de temperatura), diseñado para aumentar la rigurosidad de la reacción y disminuir la posibilidad de amplificar un amplicón incorrecto. También posibilita utilizar rutinariamente sondas a baja T_{m} y/o a super-baja T_{m} no hidrolizables en lugar de las sondas de hibridación convencionales. Además, la introducción de una etapa de detección a baja temperatura también posibilita monitorizar la presencia del producto de extensión del cebador limitativo (la cadena de cebador limitativo) que permanece constante durante la fase lineal de la LATE-PCR, mientras que simultáneamente se mide la acumulación de la cadena del cebador en exceso que aumenta linealmente durante la fase lineal de la LATE-PCR. Esto puede realizarse mediante la utilización de un cebador limitativo marcado que se incorpora en la cadena de cebador limitativo y también utilizando una sonda a baja T_{m} o una sonda a super-baja T_{m} que emite su propia señal distinta para medir las cadenas de cebador en exceso que se acumulan. Además, dado que la temperatura de la reacción aumenta inmediatamente hasta la temperatura de fusión cuando se utiliza la etapa de detección, hay una disminución de la oportunidad de que se extienda un cebador con apareamiento erróneo. En contraposición, cuando se utiliza una sonda convencional, una sonda con apareamiento erróneo presenta una posibilidad excelente de extenderse, porque la etapa de detección convencional durante el apareamiento de cebador va seguida de la etapa de extensión convencional.

\vskip1.000000\baselineskip

Ventajas de las sondas a baja T_{m} y las sondas a super-baja T_{m}

Las sondas a baja T_{m} y super-baja T_{m} presentan las siguientes ventajas en comparación con las sondas de hibridación convencionales: a) estas sondas aumentan la fuerza de la señal porque, cuando se utilizan a altas concentraciones, se unen a todas las cadenas sencillas acumuladas; b) estas sondas son más específicas de alelo que las sondas convencionales; y c) estas sondas presentan una mejor razón señal:ruido que las sondas convencionales, porque se detectan a temperaturas más bajas a las que el ruido de fluorescencia específico normalmente es inferior.

\vskip1.000000\baselineskip

Protocolo para diseñar y caracterizar sondas a baja T_{m}

Las sondas a baja T_{m} y las sondas a super-baja T_{m} compatibles con LATE-PCR incluyen, pero no se limitan a, una o más sondas de los siguientes tipos: 1) sondas lineales monocatenarias marcadas tal como se conoce en la materia, incluyendo sondas FRET; 2) sondas bicatenarias, tal como se conoce en la materia; 3) sondas monocatenarias de tipo tallo-bucle, incluyendo balizas moleculares, marcadas tal como se conoce en la materia. Estas clases generales incluyen sondas que contienen nucleótidos no convencionales tales como PNA o modificaciones con 2-O-metilo, sondas con restos unidos que afectan a la estabilidad del híbrido tales como las sondas de unión al surco menor (por ejemplo, sondas Eclipse^{TM}), y sondas que están unidas físicamente a cebadores (por ejemplo, sondas Scorpion). Las sondas a baja T_{m} y las sondas a super-baja T_{m} están construidas basándose en las siguientes etapas lógicas:

1) El experimentador elige qué tipo de sonda ha de utilizarse;

2) El experimentador decide sobre la secuencia diana de la sonda, la longitud aproximada y la composición química. El experimentador diseña la sonda utilizando un paquete de software apropiado, mientras aplica determinados principios generales bien conocidos de bioquímica de ácidos nucleicos. Se conocen en la materia muchos paquetes de software para este fin, pero no están disponibles para los tipos de sonda compuesta por subunidades no convencionales. El paquete de software puede ofrecer una estimación aproximada de T_{m[0]}^{P} de la sonda. Los siguientes principios generales son útiles para diseñar estas sondas: a) en condiciones experimentales constantes, los híbridos de sonda/diana más cortos tienden a presentar valores de T_{m} inferiores a las sondas más largas; b) en condiciones experimentales constantes los híbridos de sondas/diana con menores puentes de hidrógeno tienden a presentar valores de T_{m} inferiores que las sondas con más puentes de hidrógeno; c) en condiciones experimentales constantes, los híbridos de sonda/diana que presentan apareamientos erróneos tienden a presentar valores de T_{m} inferiores que los híbridos de sonda/diana que están perfectamente apareados.

3) El experimentador establece empíricamente la T_{m[0]}^{P} aproximada de una o más sondas posibles utilizando un ensayo de temperatura de fusión. En la materia se conocen bien muchos tipos de ensayos de temperatura de fusión para híbridos de sonda/diana. Una versión de un ensayo de temperatura de fusión se explica resumidamente en la presente memoria. Se prepara una mezcla experimental de la sonda y su diana en condiciones que simulan la composición de la mezcla de reacción de LATE-PCR. Se preparan las pruebas a razones de sonda:diana de 1:1 y una o más concentraciones de sonda dentro del intervalo de sensibilidad del instrumento que se empleará para el ensayo de temperatura de fusión. Se someten entonces estas mezclas a un ensayo de temperatura de fusión. En el caso de las sondas marcadas mediante fluorescencia, el ensayo de temperatura de fusión se lleva a cabo en un fluorímetro que presenta regulación térmica. La temperatura de fusión de cada par sonda-diana es la temperatura a la que el 50% de las moléculas de sonda se hibridan con las moléculas diana. La temperatura de fusión determinada experimentalmente es la T_{m[0]}^{P} de esa sonda en esas condiciones. Sin embargo, tal como entenderán los expertos en la materia, este valor determinado empíricamente es diferente del punto de fusión real de los híbridos sonda-diana en una LATE-PCR real. Esto se debe a que la concentración de la diana añadida al ensayo de punto de fusión es igual a la concentración de la sonda, mientras que en una LATE-PCR la sonda está en exceso de la concentración de la diana, que comienza la reacción a cero y casi nunca alcanza la concentración de la sonda durante el transcurso de la reacción.

4) En el caso de las sondas a baja T_{m}, la temperatura de fusión T_{m[0]}^{P} establecida empíricamente debe ser por lo menos 5ºC por debajo de, lo más preferiblemente por lo menos 10ºC por debajo de, la T_{m[0]}^{L} del cebador limitativo. En el caso de las sondas a super-baja T_{m}, la T_{m[0]}^{P} establecida empíricamente debe estar por debajo de, preferiblemente por lo menos 5ºC por debajo de, más preferiblemente por lo menos 10ºC por debajo de, la temperatura de apareamiento media utilizada para el par de cebadores durante la fase exponencial de la reacción.

5) La etapa de detección a baja temperatura, cuando se utiliza, no necesita incluirse en cada ciclo térmico de LATE-PCR. De hecho, en determinadas circunstancias es deseable utilizar una sonda a baja T_{m} o una sonda a super-baja T_{m} sin incluir la etapa de detección hasta el final de la reacción. Por ejemplo, puede ser deseable mantener muy alta la rigurosidad de la fase de amplificación de cadenas sencillas durante muchos ciclos para evitar la evolución del producto (tratado más adelante) o el cebado erróneo. En estas circunstancias, disminuir la temperatura por debajo de la requerida para la rigurosidad, durante cualquier etapa en el ciclo térmico, podría estimular la evolución del producto de cadenas sencillas, o podría conducir a la generación de productos no específicos. Sin embargo, una vez que se ha acumulado el número deseado de moléculas de producto monocatenarias en LATE-PCR, puede utilizarse la introducción de una etapa de detección a baja temperatura para medir la cantidad de cadenas sencillas acumuladas. Si también está presente SYBR® Green en la reacción, o también está presente en la reacción una segunda sonda para la cadena opuesta, también puede obtenerse una medida del número de moléculas bicatenarias. Los datos resultantes, junto con el conocimiento del ciclo térmico en el que la LATE-PCR cambió de amplificación exponencial a amplificación lineal, pueden utilizarse para valorar la eficacia de la síntesis de cadenas sencillas en la reacción.

\vskip1.000000\baselineskip

Protocolo para optimizar las concentraciones de la sonda a baja T_{m} y la sonda a super-baja T_{m} para LATE-PCR

Se llevan a cabo ensayos repetidos de LATE-PCR cada uno con una concentración de sonda inicial que oscila por encima o por debajo de la utilizada para establecer la T_{m[0]}^{P} empírica para la sonda (véase anteriormente). Se comparan las intensidades de las señales generadas en las reacciones y se elige la concentración de sonda óptima como la menor concentración que da la señal máxima. Por ejemplo, la figura 8 muestra cuatro ensayos paralelos de LATE-PCR conteniendo cada uno una concentración diferente de una baliza molecular a baja T_{m} (0,6 \muM, curva 81; 1,2 \muM, curva 82; 2,4 \muM, curva 83; 4,0 \muM, curva 84). Los resultados muestran que 2,4 \muM (curva 83) es la concentración óptima para esta sonda a baja T_{m} en las condiciones de esta LATE-PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

Protocolo para optimizar la concentración absoluta del magnesio en una LATE-PCR

Las alteraciones en la concentración de Mg^{++} afectan a muchos otros aspectos de la LATE-PCR, como en el caso de la PCR convencional. Los factores afectados incluyen la T_{m}^{A}, T_{m[0]}^{L}, T_{m[0]}^{X}, la temperatura de apareamiento óptima, T_{m[0]}^{P}, el cierre del tallo de una baliza molecular y la actividad de la Taq ADN polimerasa. Generalmente, la T_{m} de cada componente en la reacción aumenta cuando aumenta la concentración de Mg^{++}, pero disminuye la especificidad de las interacciones entre cada oligonucleótido y susecuencia diana. Estos efectos de Mg^{++} son bien conocidos por los expertos en la materia de la PCR. Por tanto, es necesario definir empíricamente la concentración óptima de Mg^{++} a través de una serie de reacciones paralelas. Se prefieren concentraciones óptimas de Mg^{++} en el intervalo de 1-6 mM, lo más preferiblemente en el intervalo de 2-4 mM.

\vskip1.000000\baselineskip

Kits de ensayo para LATE-PCR

Se ha diseñado un kit de reactivos para LATE-PCR para su uso en la detección de los alelos con \DeltaF508 y normales del gen de la fibrosis quística humana durante el diagnóstico genético preimplantatorio (PGD). El kit descrito en la presente memoria es modular; es decir, contiene ADN polimerasa en un envase y todos los demás reactivos y materiales en otro envase. Se apreciará que los cebadores y sondas juntos comprenden un conjunto de oligonucleótidos, que puede comercializarse como un producto separado. El kit, su uso y el ensayo realizado con el kit, que se denomina "CF\Delta508 Kit", se describen en el ejemplo 6 en un formato que puede aparecer en un prospecto del producto que acompaña al kit.

Pueden diseñarse kits similares para su uso con otras dianas generalmente, incluyendo pero sin limitarse a células individuales de fuentes distintas de embriones humanos, o pluralidades de células, o ADN o ARN recuperado de células vegetales o animales u otras fuentes de células. En el caso de muestras compuestas por ARN, el kit para LATE-PCR puede usarse junto con una variedad de procedimientos conocidos en la materia para el aislamiento o la purificación de ARN y la conversión de dicho ARN en ADNc.

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayos de LATE-PCR basados en la utilización de tres cebadores

Ciertas formas de realización de ensayos de LATE-PCR utilizan un cebador limitativo adicional para generar un amplicón bicatenario relativamente largo a partir de dos cebadores limitativos durante la fase inicial, exponencial de la reacción, seguido de la generación de un amplicón monocatenario más corto utilizando una cadena del amplicón largo como molde y el cebador en exceso como el cebador. Aunque esto puede lograrse abriendo el recipiente de reacción para añadir el cebador en exceso tras múltiples ciclos de la amplificación exponencial, los ensayos de LATE-PCR de 3 cebadores preferidos utilizan mezclas de reacción iniciales que contienen los tres cebadores junto con un protocolo de amplificación que utiliza preferentemente el cebador en exceso solamente en ciclos posteriores. Los cebadores limitativos son un par de cebadores apareados para PCR, designados L1 y L2, para generar el amplicón grande. Los cebadores están "apareados"; es decir, sus T_{m} están "equilibradas". La concentración de L2 es aproximadamente igual a la concentración de L1, es decir, desde 0,2-5 veces la concentración de L1, preferiblemente equimolar. Las temperaturas de fusión dependientes de la concentración inicial, T_{m[0]}^{L1} y T_{m[0]}^{L2}, de L1 y L2 están tan próximas como sea posible entre sí, mientras que T_{m[0]}^{X}, del cebador en exceso es por lo menos 5ºC, preferiblemente por lo menos 10ºC, por debajo de la T_{m[0]} de ambos cebadores limitativos. Los ciclos iniciales de la amplificación por PCR, o bien PCR de 3 etapas o bien PCR de 2 etapas, utilizan una temperatura de apareamiento superior a la T_{m[0]}^{X} del cebador en exceso, de modo que el cebador en exceso no participa materialmente en la generación de amplicones. Tras un número seleccionado de estos ciclos de alta temperatura, preferiblemente cerca del punto en el que la amplificación exponencial cesa debido al agotamiento de L1 y L2, la temperatura de apareamiento se disminuye de modo que durante ciclos posteriores el cebador en exceso participa en la amplificación (amplificación exponencial, si su cebador limitativo del par no se ha agotado completamente, seguido de amplificación lineal del producto monocatenario de LATE-PCR). Por tanto, la relación entre la temperatura de fusión del amplicón más corto formado mediante la extensión del cebador en exceso, es decir la T_{m}^{A} del amplicón no es superior a 25ºC por encima de la T_{m[0]}^{X} del cebador en exceso, preferiblemente no más de 20ºC por encima y más preferiblemente no más de 18ºC
por encima.

La presente invención es una mejora en el procedimiento de PCR digital (Vogelstein, B., & Kinzler, K.W. (1999) "Digital PCR" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9236-9241). Según este procedimiento se amplifican moléculas de ADN individuales mediante PCR simétrica. Una vez se ha completado la reacción simétrica, se añade un único cebador adicional a la reacción para amplificar sólo una cadena de las moléculas bicatenarias acumuladas. Entonces se detectan las cadenas individuales resultantes mediante la adición de una sonda fluorescente apropiada o mediante electroforesis. Puede usarse la LATE-PCR para realizar la amplificación tanto del producto bicatenario como del producto monocatenario en una reacción. En algunas aplicaciones, tales como la detección de moléculas de ADN de cáncer presentes en las heces (Shih, I., et al. (2001) "Evidence That Genetic Instability Occurs at an Early Stage of Colorectal Tumorigenesis" Cancer Res. 61:818-822), pueden llevarse a cabo amplificaciones por LATE-PCR in situ, tal como en gel de poliacrilamida o agarosa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayos de LATE-PCR cuantitativos

Los ensayos basados en LATE-PCR permiten obtener una medición cuantitativa de tres modos. En primer lugar, puede utilizarse la LATE-PCR en tiempo real para medir el valor de C_{T} de una señal. Como en el caso de la PCR simétrica en tiempo real, puede utilizarse el valor de C_{T} para deducir el número de moléculas diana presentes en la muestra inicial. Esto se logra comparando el valor de C_{T} de la muestra con una curva patrón generada analizando cantidades conocidas de la misma secuencia diana en condiciones que simulan las de la muestra desconocida. En segundo lugar, pueden medirse las pendientes de la señal durante la fase de amplificación lineal de la LATE-PCR en tiempo real. Tal como se ilustra más adelante para una secuencia de copia individual, las pendientes lineales de células diploides homocigóticas son aproximadamente dos veces aquéllas para la misma secuencia en células diploides heterocigóticas. En tercer lugar, puede utilizarse LATE-PCR en condiciones optimizadas para determinar el número relativo de copias alélicas diferentes presentes por medio de ensayos de punto final.

También pueden utilizarse ensayos de LATE-PCR de punto final para proporcionar una estimación del número de dianas en la muestra original, si el número relativo de alelos se conoce y la pendiente de la línea es similar entre las muestras repetidas. Esto es posible debido a que las reacciones de LATE-PCR no forman una meseta sino que continúan aumentando linealmente durante muchos ciclos. Por tanto, una vez se han establecidos los valores de C_{T} esperados de tales reacciones, pueden usarse puntos de datos individuales para extrapolar las pendientes de las líneas y por tanto el número de moléculas diana presentes al inicio de la reacción. De manera similar, si se establecen en primer lugar el número de moléculas diana y valores de C_{T} esperados, pueden usarse ensayos de punto final para cuantificar las frecuencias de secuencias alélicas diferentes entre ellas.

En el caso tanto de ensayos en tiempo real como de punto final, se apreciará que pueden monitorizarse tanto los productos bicatenarios como los productos monocatenarios de una amplificación por LATE-PCR simultáneamente mediante la utilización de una combinación de colorantes y sondas de hibridación, o una combinación de sondas de hibridación y sondas de cebador. A continuación se enumeran algunas estrategias posibles que pueden utilizarse, pero, tal como apreciarán los expertos en la materia, son posibles estrategias adicionales:

En el caso de amplicones individuales pueden utilizarse dos sondas de hibridación para medir simultáneamente la síntesis y la acumulación del producto de extensión del cebador limitativo que deja de sintetizarse al final de la fase exponencial, así como el producto de extensión del cebador en exceso que sigue acumulándose linealmente.

Alternativamente, puede monitorizarse la acumulación del producto de extensión del cebador limitativo utilizando un cebador bicatenario marcado y su cadena complementaria extinguida (tal como describen Li et al., mientras que puede monitorizarse el producto de extensión del cebador en exceso mediante la utilización de una sonda de hibridación apropiada, tal como una baliza molecular o una sonda bicatenaria.

Alternativamente, puede monitorizarse los amplicones bicatenarios que se acumulan uniendo un colorante intercalador, tal como SYBR Green®, mientras que el producto de extensión monocatenario del cebador en exceso puede monitorizarse mediante la utilización de una sonda de hibridación apropiada, tal como una baliza molecular.

En el caso de reacciones múltiplex pueden utilizarse varias sondas para monitorizar simultáneamente varias cadenas que siguen acumulándose durante la fase de cadenas sencillas de la reacción.

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayos de LATE-PCR utilizados para establecer la cigosidad genómica

Los ensayos de esta invención permiten la discriminación entre genomas que son homocigócitos para un alelo particular frente a los que son heterocigóticos para ese alelo. Pueden realizarse ensayos que puedan distinguir entre células homocigóticas y células heterocigóticas partiendo de células individuales o genomas individuales, pero también pueden utilizarse otras muestras, siempre que las dos muestras que están comparándose presenten aproximadamente las mismas cantidades de ADN al inicio de la reacción. Los ensayos que pueden distinguir entre células homocigóticas y heterocigóticas son clínica o comercialmente importantes, debido a que pueden distinguir entre organismos que portan o no una o dos copias de un alelo particular o variante de ese alelo.

Tal como se muestra en la figura 9, la presencia de una copia de una secuencia de ácido nucleico seleccionada presente en una célula diploide heterocigótica puede distinguirse de la presencia de dos copias de la misma secuencia de ácido nucleico en una célula diploide homocigótica por medio de un ensayo de LATE-PCR en tiempo real en el que se utiliza una baliza molecular para detectar uno de los alelos en la célula heterocigótica, o se utilizan dos balizas moleculares coloreadas de manera diferente, una para un alelo y la otra para el otro alelo en la célula heterocigótica. Las señales fluorescentes resultantes generadas a partir de tales muestras demuestran que, para cada alelo, la pendiente lineal de la señal que surge a partir células homocigóticas que contienen dos copias de ese alelo particular (curva 91) aumenta a una velocidad que es aproximadamente dos veces la velocidad de la señal para el mismo alelo generado por el número equivalente de células heterocigóticas que contiene una copia cada una de dos alelos diferentes (curva 92).

Se apreciará que para esta utilización de la invención es particularmente importante que se optimice la reproducibilidad de las pendientes de las líneas generadas durante la fase de cadenas sencillas de la reacción, es decir, que muestren la mínima dispersión posible entre las repeticiones. A este respecto, lo más preferido es que (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) \geq+3. La figura 9 ilustra un caso optimizado de este tipo para genomas que son homocigóticos frente a heterocigóticos para el alelo 1421 del gen HEX-A, uno de los alelos comunes responsables de la enfermedad de Tay-Sachs. Cada una de las curvas 91, 92 en la figura 9 es el promedio de 15 pruebas repetidas. En este ejemplo es evidente que el ADN normal homocigótico (sometido a ensayo para detectar el alelo de tipo natural) presenta una pendiente promedio aproximadamente dos veces tan pronunciada como la pendiente promedio para el alelo de tipo natural presente en células heterocigóticas para el alelo 1421. Puede utilizarse cada uno de o bien las pendientes de las curvas generadas mediante ensayos de LATE-PCR, o bien valores de punto final generados mediante ensayos de LATE-PCR para distinguir entre células homocigóticas y heterocigóticas.

También puede utilizarse la LATE-PCR para distinguir entre genomas que son heterocigóticos para un alelo particular y genomas que son hemicigóticos para el mismo alelo. Pueden realizarse ensayos que pueden distinguir entre células hemicigóticas y células heterocigóticas partiendo de células individuales o genomas individuales, pero también pueden usarse otras muestras, siempre que las dos muestras que se estén comparando presenten aproximadamente las mismas cantidades de ADN al inicio de la reacción. Ensayos que pueden distinguir entre células hemicigóticas y heterocigóticas son clínica o comercialmente importantes debido a que, entre otros fenómenos, pueden utilizarse para detectar la "pérdida de heterocigosidad" un acontecimiento bien conocido que tiene lugar en ciertos cánceres y en células normales del sistema inmunitario que experimentan recombinación y pérdida de una parte de los genes de inmunoglobina durante el transcurso de la diferenciación celular. En tales casos, se pierde una parte pequeña o parte grande de un cromosoma, convirtiendo de ese modo una parte del genoma en hemicigótica. Las células heterocigóticas generan señales en un ensayo de LATE-PCR, monitorizado con una sonda apropiada, que presente pendientes y/o puntos finales que son aproximadamente un medio de los generados por la misma sonda que monitoriza la amplificación del ADN de una célula hemicigótica.

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayos múltiplex de LATE-PCR

Los ensayos según esta invención incluyen ensayos múltiplex para la amplificación simultánea de dos o más secuencias diana con diferentes pares de cebadores en la misma mezcla de reacción. Para ensayos múltiplex, se recomienda que se analicen diversos cebadores para eliminar por selección los casos obvios de hibridación cruzada no deseable entre dos amplicones y entre un par de cebadores y amplicones de otros pares de cebadores. Para ensayos múltiplex, las temperaturas de fusión ajustadas a la concentración, T_{m[0]}^{L}, de todos los cebadores limitativos debe ser igual a o superior a las temperaturas de fusión ajustadas a la concentración, T_{m[0]}^{X}, de todos los cebadores en exceso. Preferiblemente, la fase lineal de las amplificaciones múltiplex se lleva a cabo en condiciones rigurosas para minimizar el cebado falso. La figura 10 muestra los resultados de un ensayo múltiplex según esta invención. Se sintetizaron dos amplicones separados a partir del gen HEX-A. Una secuencia diana incluía el sitio para la mutación 1278. La otra secuencia diana incluía el sitio para la mutación 1421. Se utilizaron sondas de baliza molecular marcadas de diferente manera (TET en un caso, FAM en el otro) para monitorizar los dos amplicones en tiempo real. Los dos diagramas de fluores-
cencia en la figura 10 (curvas 101 y curva 102) muestran que se amplificaron ambas dianas de manera satisfactoria.

Los ensayos según esta invención, particularmente ensayos múltiplex, pueden incluir la utilización de secuencias de cebado universales. Se ha diseñado un ensayo múltiplex que utiliza un par de cebadores para cada amplicón en el que cada cebador limitativo presenta una secuencia en 5' universal y que también utiliza un cebador adicional, un cebador universal, que incluye sólo la secuencia universal. El cebador universal presenta una temperatura de fusión ajustada a la concentración, T_{m[0]}^{U}, es decir menor que la T_{m[0]}^{X} de los cebadores en exceso. Los cebadores limitativos y los cebadores en exceso presentan puntos de fusión ajustados a la concentración tal como se describió anteriormente. Éstos se añaden a la razón descrita, por ejemplo, 1:20 o superior, pero a muy baja concentración, por ejemplo 1 nM para los cebadores limitativos. Un ejemplo de concentraciones preferidas es 1 nM para los cebadores limitativos y 50 nM para el cebador en exceso. Los ciclos iniciales de amplificación son en condiciones apropiadas para los pares de cebadores, y los cebadores limitativos se agotan tras relativamente pocos ciclos. El cebador universal no participa en estos ciclos iniciales. A partir de aproximadamente ese punto en adelante, los cebadores en exceso funcionan como "cebadores limitativos" en relación con el cebador universal, que presenta una temperatura de fusión ajustada a la concentración, T_{m[0]}^{U}, inferior a la de los cebadores en exceso presentes en la reacción, pero está presente a una concentración por lo menos 5 veces, preferiblemente por lo menos 10 veces, superior a la concentración utilizada para los cebadores en exceso. Los ciclos de temperatura adicionales durante esta segunda fase de la amplificación utilizan una temperatura de apareamiento disminuida apropiada para el cebador universal. Tras el agotamiento de los cebadores en exceso, ciclos continuados conducen a la síntesis de productos monocatenarios mediante extensión del cebador universal. En esencia, este procedimiento acopla una primera amplificación por LATE-PCR a una secunda reacción de LATE-PCR, en el que el/los cebador(es) en exceso en la primera amplificación es/son el/los cebador(es) limitativo(s) en la segunda.

La eficacia del ensayo múltiplex descrito anteriormente puede limitarse durante los ciclos iniciales de la reacción debido a que las concentraciones de los cebadores limitativos y los cebadores en exceso son bajas. Si fuera necesario, pueden aumentarse las eficacias iniciales de la producción de amplicones aumentando las concentraciones de estos pares de cebadores. Aumentar la concentración de estos pares de cebadores puede lograrse mediante un cambio de volumen, es decir, llevando a cabo la primera fase de la amplificación utilizando un volumen de mezcla de reacción mucho más pequeño que el volumen de mezcla de reacción de la segunda fase. En estas condiciones, el volumen de la reacción puede aumentarse a o próximo al ciclo térmico al que la temperatura de la fase de apareamiento se disminuye para permitir que el cebador universal comience a funcionar. Una versión alternativa de los ensayos múltiplex descritos anteriormente es añadir el cebador universal al ensayo en el momento que se necesite por primera vez.

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayos y amplificaciones por LATE-PCR adicionales

Puede ser deseable convertir uno o más de los productos de cadenas sencillas en una amplificación por LATE-PCR de nuevo en los productos bicatenarios. Esto puede lograrse incluyendo un "cebador a baja T_{m}" en una reacción. Un "cebador a baja T_{m}" sólo hibrida con su secuencia complementaria cuando la temperatura se disminuye por debajo del valor de T_{m[0]} de dicho cebador durante una etapa adicional incluida en los ciclos térmicos tarde en la reacción y entonces se eleva lentamente para permitir la extensión de dicho cebador y, por tanto, permitiendo que las moléculas monocatenarias acumuladas se conviertan de nuevo en ADN bicatenario. Si los intentos iniciales de conversión se muestran ineficaces, puede disminuirse el tiempo empleado en la etapa a baja temperatura y/o puede ralentizarse la tasa de aumento de temperatura a partir de la baja temperatura. Alternativamente pueden llevarse a cabo varias oscilaciones de temperatura hacia abajo y hacia arriba, por ejemplo entre 45ºC-72ºC-45ºC-72ºC- ... antes de o bien finalizar la reacción o continuar hasta la etapa de fusión del siguiente ciclo térmico. Una versión de esta realización de la invención es diseñar un "cebador a baja T_{m}" que pueda hibridar con una secuencia dentro del producto monocatenario que se acumula, en lugar de en o cerca de su extremo 5'. En este caso, sólo la parte de la cadena sencilla que está en 3' con respecto al "cebador a baja T_{m}" se convierte en una cadena doble. Las cadenas de producto de esta reacción pueden llegar a ser sustratos para la síntesis de cadenas sencillas truncadas adicionales utilizando el cebador en exceso original.

El procedimiento descrito en el párrafo anterior presenta varios usos nuevos posibles: 1) puede ser útil para "cubrir" una secuencia dentro de la molécula monocatenaria que podría de otro modo "interferir" con una etapa posterior, por ejemplo la captura de la molécula monocatenaria sobre una matriz sólida; 2) puede utilizarse para medir o desplegar regiones dentro de una molécula monocatenaria que muestran estructuras secundarias tales como horquillas; 3) puede utilizarse para bloquear la evolución de producto (el fenómeno de la evolución de producto se describe más adelante); 4) puede utilizarse para permitir la detección de la molécula monocatenaria mediante la tinción con un colorante, tal como SYBR® Green, que puede unirse a la parte bicatenaria de la molécula monocatenaria; 5) puede utilizarse para aumentar la tasa de síntesis de cadenas sencillas mediante la extensión del cebador en exceso; 6) usando un cebador a baja T_{m} marcado, puede utilizarse este procedimiento para marcar la cadena complementaria al producto monocatenario.

La conversión de cadena sencilla a cadena doble puede combinarse con el análisis de punto final para lograr otra forma del ensayo de LATE-PCR de punto final. En este caso la reacción se lleva a cabo en presencia de un cebador en exceso, que está marcado de manera fluorescente en su extremo 5' y un oligonucleótido adicional, que es complementario a este cebador y está bloqueado con un resto de extinción, tal como dabcilo, en su extremo 3'. El oligonucleótido complementario (OC) se diseña para que presente una T_{m[0]}^{OC} por lo menos 5ºC por debajo de la T_{m[0]}^{X} del cebador en exceso para su secuencia diana en el amplicón (véase Li et al. 2002). También se añade a la reacción un oligonucleótido corto adicional, el cebador a baja T_{m}. El cebador a baja T_{m} se diseña para hibridar con una secuencia dentro del producto monocatenario de la reacción, cuando la temperatura de la reacción se disminuye en la etapa a baja temperatura. Entonces, cuando se aumenta lentamente la temperatura, la ADN polimerasa extiende el cebador a baja T_{m}, convirtiendo el extremo 5' de la cadena sencilla en una cadena doble.

En estas circunstancias, se incorpora el cebador en exceso marcado de manera fluorescente en cada copia de la cadena de amplicón que ceba, durante tanto la fase exponencial como la lineal de la LATE-PCR. En el punto final de la reacción, cuando la temperatura de la reacción se disminuye y luego se aumenta, el cebador a baja T_{m} se extiende y el oligonucleótido complementario hibridado con el extremo 5' de la cadena sencilla se desplaza. Cuando se disminuye la temperatura de reacción durante un tiempo final, las copias incorporadas del cebador en exceso fluorescen, mientras que las copias no incorporadas del cebador en exceso hibridan con sus cadenas complementarias que extinguen su fluorescencia, según los hallazgos de Li et al. (2002). La fluorescencia resultante de los cebadores incorporados puede utilizarse como una medida del número de moléculas monocatenarias que se han sintetizado en la reacción.

También puede utilizarse la LATE-PCR para generar moléculas monocatenarias in situ, que se detectan entonces posteriormente mediante la utilización de un procedimiento de amplificación secundario, tal como amplificación por círculo rodante combinada con diversos medios de detección de las cadenas sencillas resultantes. Esta aplicación de la LATE-PCR se aprovecha del alto nivel de especificidad cebador-diana proporcionada por la PCR, pero no requiere que el número de moléculas monocatenarias así generadas sea directamente detectable. El procedimiento de amplificación secundario, que podría generar de otro modo una tasa inaceptablemente alta de falsos positivos, se utiliza entonces para detectar la presencia del conjunto de moléculas monocatenarias específicas generadas por la reacción de LATE-PCR. Tal como reconocerán los expertos en la materia, la LATE-PCR con amplificación secundaria también es útil para la multiplexación, debido a que impide la generación de altas concentraciones de productos de LATE-PCR que podrían tender a interaccionar.

Cuando se combina la LATE-PCR con un procedimiento de amplificación secundario para amplificar adicionalmente, la relación entre la T_{m}^{A} de amplicón y el cebador en exceso, T_{m[0]}^{X} llega a ser menos restrictiva y puede superar los 25ºC.

\vskip1.000000\baselineskip

Utilización de la LATE-PCR para la producción de moléculas monocatenarias

Además de los ensayos, la LATE-PCR puede utilizarse para sintetizar productos monocatenarios para cualquier fin. Un fin de este tipo es la generación de material de partida para procedimientos posteriores de secuenciación. Otro es la producción de oligonucleótidos monocatenarios para su utilización como sondas de hibridación, por ejemplo, sondas de hibridación in situ.

\vskip1.000000\baselineskip

Evolución de producto durante la amplificación por LATE-PCR

Mientras que las amplificaciones por PCR simétrica tienden a formar mesetas y a parar tras aproximadamente 50 ciclos, las amplificaciones según esta invención siguen generando amplicones monocatenarios durante 75 ciclos o más. Se ha descubierto, sin embargo, que en algunos casos las moléculas monocatenarias que se acumulan durante la amplificación de algunas dianas tienden a interaccionar y "evolucionar", si los ciclos térmicos no se mantienen a un nivel alto de rigurosidad. Las "moléculas derivadas" resultantes se amplifican entonces como moléculas bicatenarias. Esto se denomina "evolución de producto". La evolución de producto no se observa constantemente mediante la utilización de una sonda de hibridación, tal como balizas moleculares, debido a que estas sondas tienden a hibridar tanto con el producto monocatenario inicial de la reacción como con las "moléculas derivadas" generadas mediante la evolución de producto. Sin embargo, el proceso de evolución de producto puede detectarse y analizarse mediante la utilización de SYBR® Green, que tiñe moléculas bicatenarias independientemente de su secuencia, y mediante el análisis del punto de fusión de los productos resultantes. La evolución de producto puede analizarse adicionalmente mediante la electroforesis de los productos amplificados.

La evolución de producto es estocástica e indeseable, en la medida en que altera la secuencia del producto amplificado. Se ha notificado este fenómeno para la PCR asimétrica (Gyllensten y Erlich, (1988)), aunque en este momento se desconoce el mecanismo molecular. La evolución de producto puede iniciarse mediante un cebado inapropiado de amplicones derivados. La figura 11ilustra el fenómeno de evolución de producto y demuestra que aumentar la rigurosidad de la etapa de apareamiento en un ensayo o amplificación por LATE-PCR retrasa la evolución de producto. La comparación de la figura 11A y la figura 11B muestra cómo el fenómeno de evolución de producto es distinto de la amplificación de productos no específicos. Las comparaciones de las inserciones muestran cómo el producto puede evolucionar hasta un pico de fusión más alto en condiciones no rigurosas. La curva 111 es el análisis de fusión de una muestra generada en condiciones rigurosas y la curva 112 muestra la cinética de la amplificación en condiciones rigurosas. La curva 113 es el análisis de fusión de una muestra generada en condiciones no rigurosas, y la curva 114 muestra el análisis cinético de la amplificación en condiciones no rigurosas. Las flechas horizontales en los gráficos indican el número de ciclos de acumulación de ADN monocatenario en ausencia de evolución de producto; las flechas verticales en las inserciones muestran el pico de fusión de temperatura para el producto correcto.

Los expertos en la materia reconocerán que existen diversos modos de aumentar la rigurosidad de la reacción y de ese modo suprimir la iniciación inapropiada. Los modos posibles de aumentar la rigurosidad incluyen:

a) aumentar la temperatura de apareamiento para limitar la hibridación de los cebadores, particularmente el cebador en exceso,

b) aumentar o disminuir la temperatura de extensión lejos de la óptima de la ADN polimerasa,

c) disminuir la concentración de la ADN polimerasa,

d) disminuir la concentración del cebador en exceso,

e) en ensayos que emplean una etapa de detección a baja temperatura, limitar esa etapa hasta la duración mínima seguido de un ascenso rápido hasta las temperaturas de fusión con el fin de minimizar una posible extensión de cebador en sitios con apareamientos erróneos.

Una explicación alternativa para explicar la evolución de producto es que se produce mediante el apareamiento imperfecto del cebador en exceso con un sitio dentro de o bien a) el genoma inicial, o bien b) las cadenas sencillas que se acumulan durante la fase lineal de la LATE-PCR. El apareamiento imperfecto no se producirá si las condiciones de amplificación siguen siendo rigurosas, pero se favorecería cada vez que se disminuye la temperatura durante una etapa de detección a baja temperatura en un ensayo. Un cebador hibridado de manera imperfecta, una vez unido, se extenderá hasta el extremo 5' de un molde de cadena sencilla. En el caso b), la cadena parcial resultante se amplificaría entonces como una molécula bicatenaria corta en ciclos térmicos posteriores, debido a que el mismo cebador en exceso cebaría la replicación en ambas direcciones.

La evolución de producto y la amplificación no específica pueden suprimirse disminuyendo temporalmente la concentración eficaz del cebador en exceso y por tanto, aumentando la especificidad, cada vez que un ensayo avanza a través de la etapa de detección a baja temperatura. Este objetivo puede lograrse mediante la inclusión de un oligonucleótido que es complementario al cebador en exceso, pero sólo se une al cebador en exceso cuando la temperatura de la reacción se reduce por debajo de la temperatura de apareamiento del cebador en exceso con su secuencia diana en el amplicón. La secuencia de base óptima del oligonucleótido complementario depende de la composición de secuencia del cebador en exceso particular y se establece de manera experimental. Sin embargo, puede anticiparse que el oligonucleótido complementario presentará las siguientes características:

La temperatura de fusión ajustada a la concentración del oligonucleótido complementario, T_{m[0]}^{OC}, debe ser por lo menos 3ºC por debajo de la T_{m[0]}^{X}. Esto puede lograrse o bien disminuyendo la concentración del oligonucleótido complementario en relación con el cebador en exceso, o bien alterando la longitud o la secuencia del oligonucleótido complementario en relación con el cebador en exceso. Sin embargo, lo más deseable es mantener la concentración del oligonucleótido complementario en exceso de la concentración del cebador en exceso, de modo que cuando la temperatura de la reacción se disminuye por debajo de la T_{m[0]}^{OC}, la mayoría de moléculas de cebador en exceso hibridarán con moléculas de oligonucleótido complementario. Por tanto, lo más deseable es o bien acortar el oligonucleótido complementario en relación con el cebador en exceso, o bien aparear de manera errónea deliberadamente el oligonucleótido complementario del cebador en exceso o ambos. Lo más preferiblemente, el oligonucleótido complementario puede acortarse en su extremo 3'. Por lo menos las tres bases en el extremo 5' del oligonucleótido complementario deben aparearse perfectamente con las tres bases en el extremo 3' del cebador en exceso para evitar que el cebador en exceso inicie la replicación de la cadena. Además, el extremo 3' del oligonucleótido complementario debe bloquearse mediante una modificación tal como un grupo fosfato para garantizar que el oligonucleótido complementario no puede actuar como un cebador.

Los ensayos que utilizan la amplificación según esta invención incluyen ensayos homogéneos de punto final y ensayos homogéneos en tiempo real. En los ensayos homogéneos no se requiere la separación de productos. Generalmente, no se necesita abrir los tubos de la reacción de amplificación, como medios de detección, por ejemplo pueden añadirse colorantes fluorescentes o sondas fluorescentes antes del inicio de la amplificación. Los ensayos según esta invención pueden utilizar o bien PCR de 2 etapas o bien PCR de 3 etapas. Determinadas formas de realización preferidas incluyen adicionalmente una etapa de detección a baja temperatura tras la extensión de cebador. Si se utiliza una etapa de detección a baja temperatura, no necesita incluirse en los ciclos de amplificación tempranos y preferiblemente se omite hasta 5-10 ciclos antes del C_{T} para promover la especificidad y suprimir la evolución de producto, tratada anteriormente, mientras que todavía hace posible establecer niveles de fondo de fluorescencia antes del C_{T}.

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayos de LATE-PCR combinados con la recogida de productos monocatenarios

Ya se lleve a cabo la LATE-PCR para el fin de generar un único amplicón o bien muchos amplicones, es deseable minimizar la interacción inapropiada de moléculas monocatenarias con el fin de reducir la posibilidad de que se produzca la evolución de producto a medida que la concentración de estas moléculas aumenta. La captura y eliminación periódicas de moléculas monocatenarias de una reacción en curso, durante ciclos de amplificación lineal seleccionados o todos, proporciona medios simples y versátiles de mantener baja la concentración de los productos. La captura y la eliminación de moléculas monocatenarias pueden lograrse en una variedad de dispositivos y formatos. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una amplificación por LATE-PCR en un "circuito" como una cámara alrededor de la que los reactivos circulan repetidamente. La velocidad a la que los reactivos giran alrededor del circuito puede controlarse, y secciones adyacentes del circuito pueden calentarse o enfriarse de manera diferencial para lograr el patrón requerido de termociclado. Un sector del circuito, o varios sectores adyacentes del circuito, pueden presentar superficies que incluyen sondas de captura covalentemente unidas con una o más secuencias complementarias a uno o más productos monocatenarios. A medida que los reactivos pasan a través de estos sectores, la temperatura de la reacción puede enfriarse, tal como en una etapa de detección a baja temperatura. En estas condiciones, cada molécula monocatenaria hibridará con sus sondas de captura particulares, mientras que las moléculas de molde bicatenarias, así como la Taq ADN polimerasa (y otras proteínas) y todas las moléculas pequeñas de la mezcla de reacción se desplazan hacia delante hasta la siguiente cámara en el circuito. Una vez los reactivos han aclarado el sector de sonda de captura del circuito, puede aislarse y aumentarse su temperatura para liberar y recuperar las moléculas monocatenarias para su análisis o manipulación posteriores. Los expertos en la materia apreciarán que los principios anteriores pueden aplicarse a sistemas y dispositivos adicionales diseñados para recoger los productos monocatenarios de una LATE-PCR.

Se anticipa que la captura y la eliminación de los productos monocatenarios de una reacción de LATE-PCR permitirán rondas repetidas de síntesis de producto bastante más allá del número de rondas observadas en una reacción de PCR simétrica típica. Por ejemplo, se ha mostrado que algunos ensayos de LATE-PCR pueden mantenerse durante por lo menos 100 ciclos térmicos en una reacción de tubo cerrado de 25-100 \mul. Esto significa que ni la Taq ADN polimerasa, ni el colorante indicador, ni el cebador en exceso, ni los precursores de nucleótidos llegan a ser necesariamente limitativos en una reacción de LATE-PCR. Esta observación se encuentra en oposición a la visión comúnmente mantenida en la bibliografía científica para la PCR simétrica. Por ejemplo Liu y Saint escriben, "Puesto que la reacción se realiza en un tubo cerrado que contiene una cantidad pequeña de mezcla de reacción (25-50 \mul), la cinética de la reacción puede verse afectada por todos los componentes en la mezcla de reacción, incluyendo el colorante indicador, la concentración de nucleótido, la concentración de cebador y el número (o concentración) de copias iniciales de molde. Debido a que el colorante indicador, la concentración de cebador, nucleótido, y la actividad enzimática pueden llegar a ser limitativos para la tasa de síntesis de amplicón, la tasa de síntesis de amplicón será más lenta y finalmente cesará". (Liu, W. & Saint, D.A. (2002) "A New Quantitative Methog of Real Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay Based on Simulation of Polymerase Chain Reaction Kinetics", Analytical Biochemistry 302: 52-59).

\newpage

Por el contrario, nuestros resultados demuestran que los límites en la amplificación según esta invención se deben al hecho de que la concentración de la(s) cadena(s) del amplicón alcanza niveles que les permiten competir eficazmente con sus propios cebadores (particularmente el producto de extensión del cebador en exceso compite con el cebador en exceso) para la hibridación con las mismas moléculas diana. Tal como se mostró anteriormente en la solicitud, un medio de producción sostenible del producto de cadena sencilla es optimizar (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) hasta un intervalo de 7-25ºC, lo más preferiblemente 12ºC. Sin embargo, la optimización de (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) no siempre es posible, por ejemplo si los amplicones son ricos en GC o muy largos. En estas circunstancias, la captura y eliminación de las cadenas sencillas que se acumulan pueden servir como sustituto para mantener el diferencial de punto de fusión específico entre el amplicón y el cebador en exceso. Esto posibilita que la LATE-PCR continúe sintetizando cadenas sencillas durante muchos ciclos.

En otra forma de realización de la invención la LATE-PCR puede llevarse a cabo en condiciones en las que uno de los cebadores, lo más preferiblemente el cebador en exceso, está fijado a una superficie o matriz sólida de modo que cada ciclo de extensión de cebador da como resultado la construcción de una cadena de cebador extendida que permanece unida a la superficie sólida, por ejemplo, una perla o la pared de la cámara de reacción. Se anticipa que en estas condiciones la T_{m[0]} del cebador unido será dependiente adicionalmente del hecho de que el cebador no puede difundir libremente, así como por la densidad de empaquetamiento del cebador sobre la superficie, por el volumen y por la geometría del espacio en el que tienen lugar la reacción. Por tanto, la T_{m[0]} del cebador, por ejemplo T_{m[0]}^{X}, habrá de determinarse empíricamente en las condiciones experimentales de la reacción.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1 Diseño de pares de cebadores, gen HEX-A de Tay Sachs

En lugar de comenzar con un par apareado existente de cebadores para PCR simétrica y hacer modificaciones para logar un par de cebadores según esta invención, se prefiere diseñar pares de cebadores utilizando programas informáticos disponibles. Se ha utilizado de manera satisfactoria el programa informático Oligo® 6.0 (Oligo® Primer Analysis Software Manual, versión 6.0 para Windows, Molecular Biology Insights, Inc. sexta edición, marzo de 2000) para identificar pares de cebadores candidatos. Para determinar la T_{m[0]} para cebadores candidatos utilizando el procedimiento del "vecino más próximo", se ha utilizado de manera satisfactoria la fórmula proporcionada en las secciones previas que se basan en los valores de Allawi y SantaLucia (1997) para la entalpía y entropía. Se diseñó un par de cebadores para LATE-PCR para la identificación de las secuencias alélicas del tipo natural y 1278+TATC en el exón 11 del gen de la subunidad alfa de la beta-N-acetilhexosaminidasa (HEX-A). Estos alelos están asociados con la enfermedad de Tay-Sachs. El alelo mutante, 1278+TATC, representa el 82-90% de los portadores de Tay-Sachs dentro de la población judía Ashkenazi. (Para una revisión reciente véase Advances in Genetics, vol. 44, editado por Desnick y Kaback (2001), que está dedicado completamente a la enfermedad de Tay-Sachs).

Se utilizó el programa Oligo® 6.0 para identificar un conjunto de cebadores compatibles para la amplificación por PCR simétrica de un segmento en el exón 11 de HEX-A que contenía la posición de nucleótido 1278 (nº de registro de GenBank: NM 000520). Se ajustaron los parámetros de búsqueda para identificar pares de cebadores que generarían amplicones menores de 100 pares de bases. Entre los pares de cebadores candidatos, se eligió un conjunto de cebadores cuyas secuencias se facilitan a continuación en la tabla IV. Según los parámetros por defecto de Oligo® 6.0, estos cebadores presentan unas T_{m} de apareamiento (cebador superior: 73,6ºC; cebador inferior: 73,0ºC). Entonces, se continuó calculando los valores de T_{m[1]} del cebador a una concentración habitual de 1 \muM y calculando los valores de T_{m[0]} para los cebadores limitativos y en exceso a concentraciones de 1 \muM y 25 nM, respectivamente (razón de cebadores de 1:40; se ajustó la concentración de catión monovalente para estos cálculos hasta 0,07 M) utilizando la fórmula del vecino más próximo, tal como se indicó anteriormente. Por comodidad, se realizaron los cálculos de la entalpía y la entropía con los valores del vecino más próximo de Allawi y SantaLucia (1997) utilizando el programa informático MELTING (Le Novère, N. (2001) "MELTING, Computing the Melting Temperature of Nucleic Acid Duplex", Bioinformatics 17: 1226-7). Los resultados se facilitan en la tabla IV. Se eligieron las concentraciones y la razón de cebadores anteriores basándose en ensayos que implicaban la monitorización de cada cadena de amplicón con balizas moleculares durante la amplificación asimétrica y revelaron que a 25 nM el cebador limitativo se agota poco después de que la reacción alcance el ciclo umbral (C_{T}). Por tanto, se alcanza el C_{T} antes de que se detenga la amplificación exponencial y comience la amplificación lineal.

Se utilizó el cebador en exceso a 1 \muM para promover la síntesis máxima de ADN monocatenario durante la fase lineal de la LATE-PCR. La tabla V muestra los valores de T_{m[1]} y T_{m[0]} calculados. Los valores de la T_{m[1]} de apareamiento hacen que este conjunto de cebadores sea adecuado para la PCR simétrica. El hecho de que T_{m[0]}^{L} < T_{m[0]}^{X} hace que este conjunto de cebadores sea inadecuado para su utilización en ensayos y amplificaciones por LATE-PCR.

TABLA IV Par de cebadores inicial sugerido por Oligo® 6.0

4

\vskip1.000000\baselineskip

A continuación, se alteraron los cebadores seleccionados para cumplir los criterios requeridos para la amplificación por LATE-PCR. Se alargó el cebador TSD1242S20 en su extremo 5' utilizando la secuencia de HEX-A endógena, y la tabla IV muestra los resultados. En la tabla V, los nucleótidos de las secuencias de cebadores que se presentan en negrita corresponden a las secuencias de la tabla IV. Los dos nucleótidos en letra normal en el extremo 5' del cebador limitativo son los nucleótidos añadidos.

El par original de cebadores enumerado en la tabla IV genera un amplicón de 81 pb de longitud cuya T_{m}^{A} es de 78,6ºC (según el procedimiento del % de GC: T_{m}^{A} = 81,5 + 16,6 log [M]/(1+0,7[M]) + 0,41 (% de G + % de C) - 500/longitud, a una concentración salina de 70 mM: (Wetmur, J.G. (1991). ``Applications of the Principles of Nucleic Acid Hybridization, Crit Rev Biochem Mol Biol 26: 227-259.) Los cebadores modificados utilizados para la LATE-PCR, tabla V, generan un amplicón de 83 pb de longitud que presenta una T_{m}^{A} = 79,2ºC. La diferencia (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) es de 15ºC (79,2 - 64,3 = 14,9, que se redondea hasta 15ºC). Por tanto, este par de cebadores satisface las condiciones (T_{m}^{L}_{[0]}-T_{m}^{X}_{[0]}) \geq 0 y (T_{m}^{A}-T_{m}^{X}_{[0]}) < 18ºC.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA V Cebadores modificados para cumplir las especificaciones de la LATE-PCR

5

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Diseño de pares de cebadores, gen de la betaglobina humana

Se proporciona otro diseño de cebadores mediante la elección de cebadores para la detección de mutaciones específicas en la betaglobina humana. Se eligió la ubicación de las secuencias de cebadores de modo que se incluyeron en el amplicón los sitios de las mutaciones IVS1-110 y el codón 39 que se sabe que provocan beta talasemia. Se limitó la posible ubicación del extremo 3' de cada cebador a regiones sin homología con los otros miembros de la familia del gen de la globina para garantizar que el gen de la betaglobina se amplificase preferentemente. Una vez que se identificaron los posibles sitios, se examinaron las secuencias usando el software Oligo® 6.0 y se eligió la región que es más probable que produzca un cebador con una T_{m[1]} superior para el cebador limitativo, en este caso la secuencia de la cadena inferior. Se eligió una concentración de 50 nM para el cebador limitativo y se determinó la T_{m[0]}^{L} de posibles cebadores de diferentes longitudes tal como se describió en el ejemplo 1. Se determinó la T_{m[0]}^{X} de posibles cebadores en exceso a una concentración de 1000 nM de la misma manera. Se seleccionó inicialmente un cebador limitativo de 26 nucleótidos de longitud con una T_{m[0]}^{L}= 66ºC, y se eligió un cebador en exceso de 28 nucleótidos de longitud con una T_{m[0]}^{X} = 66ºC, siendo esa T_{m[0]}^{X} 15 grados por debajo de la T_{m}^{A} de 81ºC (amplicón de 191 pares de bases, 52,4% de GC). Incluyendo una modificación de A a G cerca del extremo 5' del cebador limitativo seleccionado inicialmente y aumentando su longitud hasta 30 nucleótidos, se obtuvo un cebador limitativo final que presentaba
una T_{m[0]}^{L}=72ºC.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Diseño de cebadores para LATE-PCR para el gen de la fibrosis quística

Los criterios descritos en la presente memoria para (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) y para (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}), solos y en combinación, presentan efectos demostrables sobre la amplificación por PCR. Se ha demostrado ciertos efectos utilizando cebadores, que se designan cebadores "CFTR" para amplificar la secuencia genómica que rodea a la mutación \Delta508, la causa más común de fibrosis quística. Para las pruebas notificadas en este ejemplo, se han utilizado cebadores limitativos y cebadores en exceso de entre los enumerados a continuación en la tabla VI, que expone para cada cebador su secuencia de nucleótidos y su T_{m[0]} para una concentración de cebador limitativo de 50 nM y una concentración de cebador en exceso de 1000 nM. En pruebas que utilizan una sonda de hibridación contra el amplicón monocatenario generado por la extensión del cebador en exceso, se utilizó una baliza molecular modificada con un extintor en un extremo y un fluoróforo en el otro extremo, que presentaba la siguiente secuencia 5' FAM-CGCGCTTATCATCTTTGGTGTTTCCTATAGCGC-Dabcilo 3' (SEC ID Nº: 9) en la que los seis nucleótidos en cada extremo (subrayados) forman el tallo y por tanto no se utilizaron para calcular la T_{m[0]}^{P}. Esta sonda presentaba una T_{m[0]}^{P} de 56ºC medida empíricamente en condiciones que incluían magnesio 3 mM, baliza molecular 600 nM y diana 600 nM.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA VI Secuencias del cebador limitativo y en exceso de CFTR

6

\vskip1.000000\baselineskip

Se notifica una primera demostración en la tabla VII y en las figuras 2A y 2B. Se realizaron dos series de cinco amplificaciones por PCR cada una utilizando el cebador en CF 479 A20 y una de cinco cebadores limitativos identificados en la tabla VII. En la primera serie, todas las amplificaciones utilizaron la misma temperatura de apareamiento, 52ºC (2ºC por debajo de la T_{m[0]}^{X}). En la segunda serie, todas las amplificaciones utilizaron una temperatura de apareamiento 2ºC por debajo de T_{m[0]}^{L}. Todas las amplificaciones se monitorizaron con SYBR® Green, un colorante fluorescente que se une a ADN bicatenario y, por tanto, monitoriza la producción del amplicón bicatenario durante la fase inicial de amplificación cuando están presentes ambos cebadores.

La tabla VII expone la diferencia (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) redondeada hasta el número entero más próximo tras la resta. La tabla VII también expone el C_{T} medio a partir de tres repeticiones cuando la temperatura de apareamiento era de 52ºC (primera serie) y cuando la temperatura de apareamiento era 2ºC por debajo de la T_{m[0]}^{L} (segunda serie). Las lecturas de fluorescencia (promedio de tres repeticiones) a partir de la primera serie se exponen en la figura 2A (primera serie) y la figura 2B (segunda serie).

TABLA VII Efecto de (T_{m[0]}^{L} - _{Tm[0]}^{X})

7

\vskip1.000000\baselineskip

Las mezclas de amplificación incluían cebador en exceso 1000 nM, cebador limitativo 50 nM, cada dNTP 0,4 mM, 0,2X SYBR® Green (Molecular Probes), MgCl_{2} 3,5 mM, Platinum Taq ADN Polimerasa 0,06 unidades/\mul (Invitrogen), 1X tampón de PCR (Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM) y 1X reactivo de aditivo (BSA 1 mg/ml, trehalosa 750 mM, Tween-20 al 1%) y 600 picogramos de ADN genómico humano en un volumen total de 25 \mul. Se realizaron la amplificación y detección de fluorescencia utilizando un instrumento termociclador Smart Cycler de Cepheid con detección de fluorescencia en tiempo real. A una etapa de desnaturalización inicial de 3 minutos a 95ºC le siguieron 60 ciclos de: 95ºC durante 5 segundos, 52ºC (u otra temperatura de apareamiento especificada) durante 15 segundos y 72ºC durante 15 segundos con adquisición de fluorescencia.

La figura 2A muestra el aumento medio en fluorescencia en tiempo real en muestras de la primera serie. Cada curva corresponde a reacciones que utilizan cebadores con diferentes valores de (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) tal como se enumeran en la tabla VII. Se obtuvo la detección más temprana (valor de C_{T} medio más bajo) utilizando el par de cebadores con el valor de (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) más alto (+7, véase la curva 21). Los valores de C_{T} medios aumentaron con cada disminución en el valor de (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) (+5, curva 22; +3, curva 23; +0, curva 24; -5, curva 25). Los valores de C_{T} inferiores demostraron una tasa de amplificación superior (es decir, aumento de la eficacia) durante la fase exponencial de la reacción. Todas las muestras alcanzaron finalmente una fluorescencia final similar, correspondiendo ese punto a la finalización de la síntesis del ADN bicatenario. (No se detecta la síntesis continuada de ADN monocatenario usando este procedimiento).

La electroforesis en gel reveló que cada muestra para la que el valor de (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) estaba entre 0 y +7 produjo una cantidad similar de amplicón específico. Sin embargo, una de las tres muestras con (T_{m[0]}^{L} - T_{m[0]}^{X}) igual a -3 presentó considerablemente menos amplicón específico y contenía grandes cantidades de productos no específicos. El nivel promedio de producto no específico era inferior en muestras con (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) igual a 0 ó +3, y extremadamente bajo en muestras con (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) igual a +5 ó +7. Los resultados demuestran que el aumento en T_{m[0]}^{L} varios grados por encima de la temperatura de apareamiento determinada como óptima para el cebador en exceso no aumenta la cantidad de cebado erróneo detectable por el cebador limitativo, y de hecho, aumenta la especificidad de la
reacción.

La figura 2B muestra los resultados de muestras con los mismos pares de cebadores que anteriormente, pero realizando el apareamiento a 2ºC por debajo de la T_{m[0]}^{L}. De nuevo, cada curva corresponde a reacciones que utilizan cebadores con diferentes valores de (T_{m[0]}^{L} - T_{m[0]}^{X}) tal como se enumera en la tabla VII. Las curvas 26 y 27, que corresponden a muestras en las que (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) es igual a +5 ó +7, respectivamente presentan un valor de C_{T} medio que era inferior que las muestras con delta-T_{m} igual a +3 o inferior (+3, curva 28; +0, curva 29; -3, curva 210) lo que indica la eficacia de amplificación superior en las primeras. La comparación de los valores de C_{T} medios obtenidos a las diferentes temperaturas de apareamiento para cada par de cebadores muestra que el aumento de la temperatura de apareamiento por encima de la T_{m[0]} del cebador en exceso da como resultado sólo un ligero aumento en los valores de C_{T} medios. Sin embargo, el aumento de la temperatura de apareamiento mejora la especificidad de la reacción incluso más, reduciendo el nivel promedio de producto no específico que se observa utilizando electroforesis en gel. A la inversa, la disminución de la temperatura de apareamiento del par de cebadores con (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) igual a -3 da como resultado una ligera reducción en el valor de C_{T} medio, pero la cantidad promedio de amplicón específico se redujo y la cantidad promedio de producto no específico aumentó. La especificidad reducida de la reacción se debe presumiblemente al cebado erróneo por el cebador en exceso a la temperatura de apareamiento inferior. Por tanto, una ventaja de presentar una T_{m[0]}^{L} > T_{m[0]}^{X} es que puede ajustarse la temperatura de apareamiento óptima verdadera para ambos cebadores, lo suficientemente baja para permitir una alta eficacia de amplificación a partir del cebador limitativo, pero lo suficientemente alta para limitar el cebado erróneo a partir del cebador en exceso que puede generar productos no específicos.

\newpage

Las mezclas de reacciones de PCR que contienen uno de tres de los cebadores limitativos de la tabla VII, concretamente CF 403 S18, CF 402 S19 y CF 399 S22, pero que incluyen una sonda de baliza molecular en lugar de SYBR® Green, se sometieron a ambas series de amplificaciones. La primera serie (temperatura de apareamiento de 52ºC) produjo valores de C_{T} medios de 38,9, 37,6 y 36,8, respectivamente. La segunda serie (temperatura de apareamiento 2ºC por debajo de la T_{m[0]}^{L}) produjo valores de C_{T} medios de 38,5, 38,6 y 38,9, respectivamente. Cuando se realizó el apareamiento a 2 grados por debajo de la T_{m[0]}^{L}, se obtuvo el valor de C_{T} medio más bajo para muestras con (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) = +5 y se obtuvo el valor de C_{T} medio más alto para muestras con (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) = -3, verificando el hecho de que la eficacia de amplificación aumenta cuando se eleva la T_{m[0]}^{L} del cebador limitativo. El aumento de fluorescencia posterior fue a tasas similares en todos los grupos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Diseño de cebadores eficaces para LATE-PCR

Se diseñaron un conjunto de cebadores para PCR y una sonda de baliza molecular para el alelo \DeltaF508 del gen de la fibrosis quística basándose en secuencias génicas publicadas. (Riordan et al. (1989) "Identification of the Cystic Fibrosis Gene: Cloning and Characterization of the Complementary DNA", Science 245: 1006-73). Las secuencias del cebador y de la baliza molecular eran:

cebador superior:	5'-CCTGGATTATGCCTGGCACCAT-3'	(SEC ID Nº: 7)

cebador inferior:	5'-CCTGATGACGCTTCTGTATCTA-3'	(SEC ID Nº: 8)

sonda de baliza molecular: 5'-TET-CGCGCTAAAATATCATTGGTGTTTCCTAAGCGCG-DABCILO-3' (SEC ID Nº: 23), en la que las secuencias terminales subrayadas en la sonda forman un tallo de horquilla.

Se analizaron los cebadores y se variaron para que presentaran una diferencia en las T_{m} utilizando el software Oligo® 6,0. De esta forma, se obtuvieron pares de cebadores para los que el programa (como es habitual, en el modo por defecto) había calculado las T_{m} tal como sigue: o bien no había diferencia en la T_{m} (ambas a 65ºC; figura 3A), una diferencia de 5ºC en la T_{m} (cebador superior a 70ºC, cebador inferior a 65ºC; figura 3B), o bien una diferencia de 10ºC en la T_{m} (cebador superior a 75ºC, cebador inferior a 65ºC; figura 3C). Adicionalmente, los cebadores eran o bien equimolares (ambos a 500 nM, curvas 32, 34 y 36) o bien estaban presentes a una razón de 1:10 (cebador superior 50 nM : cebador inferior 500 nM, curvas 31, 33 y 35). Se añadieron quince microlitros de mezcla de reactivo de PCR concentrado a cada tubo que contenía una célula lisada para dar un volumen de muestra final de 25 microlitros con concentraciones finales de 1X tampón de PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), MgCl_{2} 3,75 mM, dATP 0,25 mM, dCTP 0,25 mM, dGTP 0,25 mM, dUTP 0,75 mM, cebadores tal como se indicó, baliza molecular 1,2 \muM y 1,5 unidades de Platinum Taq ADN polimerasa (Invitrogen). Se llevaron a cabo la amplificación y la detección de fluorescencia en un instrumento termociclador AB1 7700 con detección de fluorescencia en tiempo real (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.). El termociclado consistió en una desnaturalización de 5 minutos inicial a 95ºC seguida de 4 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 30 segundos, seguido de 21 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos, seguido de 35 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 52ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos con adquisición de fluorescencia durante la etapa de 52ºC. Se incluyeron balizas moleculares específicas para el alelo \DeltaF508 y para el alelo normal en cada reacción y se dirigieron a la cadena de cebador inferior. Se llevaron a cabo la amplificación y la detección de fluorescencia en un detector de secuencia Prism 7700 de ABI.

Los resultados se muestran en las figuras 3A a 3C. Los resultados se representan como el número de ciclos (eje X) frente a las unidades de fluorescencia delta de baliza molecular (eje Y). La figura 3A muestra los resultados de amplificaciones repetidas con los cebadores a igual T_{m} (65ºC, 65ºC) en una amplificación simétrica por PCR que presenta un razón 1:1 de cebadores (curva 32) y en una amplificación asimétrica que presenta una razón 1:10 (curva 31). La figura 3B muestra los resultados de amplificaciones repetidas con cebadores que presentan T_{m} que difieren en 5ºC (70ºC, 65ºC) con una razón 1:1 de cebadores (curva 44) y con una razón 1:10 (curva 33). La figura 3C muestra los resultados de amplificaciones repetidas con cebadores que presentan T_{m} que difieren en 10ºC (75ºC, 65ºC) con una razón 1:1 de cebadores (curva 36) y con una razón 1:10 (curva 35).

La reacción asimétrica (razón de cebadores 1:10, curva 31) utilizando resultados de cebadores a igual T_{m} en una señal de fluorescencia que está retardada (C_{T} posterior), en comparación con la reacción simétrica (cebadores equimolares, curva 32) (figura 3A). Sin embargo, cuando se introduce una diferencia de 5ºC en T_{m} (figura 3B), el C_{T} para los cebadores con una razón 1:10 (curva 33) se produce mucho antes, casi tan pronto como para los cebadores equimolares (curva 34). Adicionalmente, la señal de fluorescencia final para los cebadores con una razón 1:10 (curva 33) es mucho mayor que la señal para los cebadores equimolares (curva 34), y no ha formado meseta, incluso a los 60 ciclos. Cuando se introduce una diferencia de 10ºC en T_{m} (figura 3C), el C_{T} para los cebadores con una razón 1:10 (curva 35) es el mismo que para los cebadores equimolares (curva 36), y la fluorescencia final es mucho mayor y no forma meseta.

Ejemplo 5 Diseño de cebadores basado en la relación entre T_{m[0]}^{X} y T_{m}^{A}

La LATE-PCR también tiene en cuenta la diferencia entre T_{m[0]}^{X} y T_{m}^{A}. T_{m}^{A} es superior a T_{m[0]}^{X}, pero si la diferencia entre estos dos valores es demasiado grande, entonces se generarán cantidades inferiores de producto monocatenario. Una demostración de esto se notifica en la tabla VIII y la figura 6. Se ha demostrado esto utilizando pares de cebadores "CFTR" para los que (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) = 0ºC, pero esos valores son diferentes en cada conjunto de muestras repetidas, y varían con respecto a T_{m}^{A}. Se prepararon muestras de amplificación por PCR tal como se describió en el ejemplo 3, con una sonda de baliza molecular añadida a una concentración de 600 nM en vez de SYBR® Green. El perfil de termociclado también era el mismo, excepto que el apareamiento era a 2ºC por debajo de T_{m[0]}^{L} para los primeros 25 ciclos, entonces se desplazó hasta 52ºC para unos 50 ciclos adicionales con el fin de monitorizar la fluorescencia de baliza molecular en condiciones equivalentes para todas las muestras.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA VIII Efecto de variar (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) para (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) = 0

8

\vskip1.000000\baselineskip

La fluorescencia de baliza molecular promedio para cada grupo de 3 muestras repetidas se muestra en la figura 6. Cada curva en la figura 6 corresponde a un valor (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) de la tabla VIII. Los valores de C_{T} medios y las tasas de aumento de señal (pendientes) se representan en la tabla VIII. Las muestras con (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) = 12ºC (curva 61) proporcionaron la señal de baliza más fuerte y presumiblemente la mayor cantidad de producto de CFTC monocatenario en esta serie. Las muestras con (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) = 19ºC (curva 65) proporcionaron la menor señal. Las muestras con valores intermedios de (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) = 14ºC (curva 62), o 16 (curva 64) proporcionaron una intensidad de señal promedio intermedia que se corresponde con este valor. Las muestras con (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) = 7ºC (curva 63) también proporcionaron una intensidad de señal final intermedia, pero mostraron una cinética diferente que los otros grupos; la fluorescencia permaneció relativamente baja durante varios ciclos tras la detección inicial, pero la tasa de aumento (pendiente) promedio estaba en las mayores durante los 15 ciclos finales, lo que sugiere que el cebador en exceso en esas muestras continuaba amplificando eficazmente a medida que la concentración de la cadena producto competidor aumentaba. Los resultados de este tipo pueden ser ventajosos para aplicaciones que requieren la síntesis continuada del amplicón monocatenario sin generar un producto no específico. Obsérvese que aunque la mayoría de las muestras (todos los grupos) mostraron un aumento de la fluorescencia continuado hasta el ciclo 75 con pendientes sólo ligeramente reducidas, unas pocas muestras individuales mostraron una pendiente muy reducida o alcanzaron una meseta durante los últimos 5 a 10 ciclos. Esto puede deberse a la evolución del producto o la generación de producto no específico en las muestras con T_{m[0]} de cebador apareado.

Los beneficios de optimizar simultáneamente (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) y (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) se ilustran en la tabla IX y la figura 7. Cada par de cebadores en este experimento se diseñó de modo que (T_{m[0]}^{L} -T_{m[0]}^{X}) = +5ºC a +6ºC. Los valores para (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) oscilaban desde +13 hasta +23. Las curvas en la figura 7 corresponden a las curvas de amplificación que utilizan cebadores con los valores de (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) enumerados en la tabla X. La preparación de muestras, amplificación y detección se realizaron tal como se describió anteriormente.

TABLA IX Efectos de variar (T_{m}^{A} - T_{m[0]}^{X}) para (T_{m[0]}^{L} - T_{m[0]}^{X}) = +5-6

9

\vskip1.000000\baselineskip

Resulta evidente a partir de los gráficos cinéticos de la figura 7 y la tabla IX que las mayores señales de baliza molecular (ciclos 35-60) estaban en las muestras con (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) = 13 (curva 71), lo que indica una síntesis monocatenaria eficaz. La intensidad media de la señal de baliza molecular disminuyó con cada aumento en (T_{m}^{A}-T_{m[0]}^{X}) hasta valores de 17 (curva 72), 19 (curva 73), 20 (curva 74) y 23 (curva 75). Al contrario que la serie en la figura 6, ninguna de estas muestras mostró una meseta de amplificación, lo que ilustra otra ventaja de presentar (T_{m[0]}^{L}-T_{m[0]}^{X}) \geq +5ºC. La electroforesis de estas muestras reveló sólo el amplicón mono y bicatenario específico. No se detectó producto no específico, incluso en el grupo de muestras para el que se redujo la temperatura de apareamiento desde 59ºC hasta 52ºC para los ciclos 26 a 75.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Kit para el ensayo de LATE-PCR en tiempo real

Se ha diseñado un reactivo para LATE-PCR para su utilización en la detección de los alelos normales y \DeltaF508 del gen de la fibrosis quística humana durante el diagnóstico genético preimplantatorio (PGD). El kit es modular; es decir, contiene ADN polimerasa en un envase y todos los demás reactivos y materiales en otro envase. Se apreciará que los cebadores y las sondas comprenden conjuntamente un conjunto de oligonucleótidos, que puede comercializarse como un producto separado. El kit, su utilización y el ensayo realizado con el kit, que se denomina "CF\Delta508 Kit", se describen en este ejemplo en un formato que puede aparecer en un prospecto que acompaña al kit.

\vskip1.000000\baselineskip

Una prueba diagnóstica para genotipar una célula humana diploide en la región F508 del gen CFTC

10 Kit de ensayo

SÓLO PARA SU UTILIZACIÓN EN DIAGNÓSTICO IN VITRO

IMPORTANTE: Lea todas las instrucciones antes de comenzar esta prueba.

\vskip1.000000\baselineskip

Utilización pretendida

El CF\DeltaF508 Kit está diseñado para demostrar si una o una pluralidad de células humanas diploides nucleadas son genéticamente homocigóticas normales (normal/normal), heterocigóticas (normal/\DeltaF508) u homocigóticas afectadas (\DeltaF508/\DeltaF508). Estas determinaciones se llevan a cabo in vitro recogiendo y sometiendo a prueba una o más células, o el ADN derivado de tales células. El conocimiento derivado de tales pruebas puede utilizarse para tomar una decisión sobre la vida de un individuo o el tratamiento de atención sanitaria de tal individuo. Por ejemplo, aquéllas llevadas a cabo en una única célula de un embrión humano, o las células de un feto, pueden ayudar a los futuros padres a decidir si debe implantarse o no un embrión particular, o si debe considerarse o no la interrupción de un embarazo. En otro caso, puede utilizarse el conocimiento posnatal sobre el genotipo de un individuo para ayudar a optimizar la atención sanitaria y el estilo de vida de dicho individuo.

Explicación

La fibrosis quística (CF) es la enfermedad heredada más común entre las poblaciones caucásicas con una incidencia de aproximadamente 1 en 2500 partos (Welsh et al., 1995). Los estados provocados por las mutaciones en el gen CF, que funciona como un canal de cloruro en los pulmones y otros tejidos. Las mutaciones en el gen CF presentan fenotipos que oscilan desde leves hasta potencialmente mortales. Una deleción de 3 pares de bases dentro del gen CF, denominada \DeltaF508, es responsable de aproximadamente el 70% de los casos de CF y provoca manifestaciones graves de la enfermedad. Da como resultado la ausencia de fenilalanina en la posición 508 de la proteína reguladora de la conductancia transmembrana en la fibrosis quística (CFTR) y este error impide el procesamiento y la translocación normales de la cadena polipeptídica a las membranas apicales de las células epiteliales (Cheng et al., 1990). Las primeras pruebas para detectar \DeltaF508 en células individuales utilizaban PCR anidada para amplificar la secuencia requerida seguido de la verificación del producto final mediante o bien digestión con enzima de restricción (Coutelle et al., 1989), hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo (Wu et al., 1993) o bien formación de heterodúplex (Liu et al., 1993; Avner et al., 1994). Los primeros informes clínicos de PGD para CF utilizaban también análisis de heterodúplex de los productos de PCR (Handyside et al., 1992; Verlinsky et al., 1992; Ao et al., 1996). Ensayos de PCR más recientes han utilizado cebadores marcados con fluorescencia para aumentar la sensibilidad y reducir la tasa de amplificación desigual de los alelos (ADO), un defecto para amplificar un alelo de un célula heterocigótica (Findlay et al., 1995; Verlinsky y Kuliev, 2000; Goossens et al., 2000). Cuando se emplea este enfoque, los productos marcados con fluorescencia se separan y se identifican mediante electroforesis capilar tras finalizar la amplificación
por PCR.

Las parejas en las que los dos individuos portan una copia mutante del alelo \DeltaF508 presentan una posibilidad de uno entre cuatro de presentar un niño afectado. Un diagnóstico alternativo disponible para tales parejas, conocido como diagnóstico genético preimplantatorio (PGD), ofrece a tales parejas la oportunidad de determinar la composición genética de sus embriones antes de iniciar un embarazo. Si uno o más embriones resulta ser negativo en las pruebas para el alelo \DeltaF508 o heterocigótico para el alelo \DeltaF508, la pareja presenta la oportunidad de iniciar un embarazo basándose en el conocimiento de que presentan una probabilidad muy baja de tener un feto o bebé afectado. Sin embargo, el PGD es técnicamente difícil porque cada ensayo ha de llevarse a cabo en una célula individual recuperada de un embrión en la fase de escisión. El diagnóstico prenatal proporciona una alternativa al PGD. El diagnóstico prenatal para la CF se lleva a cabo en células amnióticas recuperadas mediante amniocentesis, una técnica para recoger fluido amniótico y células que rodean al feto en un embarazo en curso. Si un feto está afectado por CF puede recurrirse al aborto si la mujer lo elige así dentro del segundo trimestre de su embarazo. Alternativamente, pueden realizarse pruebas para detectar la CF y diagnosticarse de manera posnatal utilizando células sanguíneas y/u otro tipos de células. El diagnóstico de un individuo afectado es muy importante para proporcionar una atención sanitaria rápida y
óptima.

En este kit, se describe la utilización de una LATE-PCR, ensayo en tiempo real con balizas moleculares para identificar los alelos normales y \DeltaF508 de fibrosis quística en células humanas individuales.

\vskip1.000000\baselineskip

Principio del procedimiento

El ensayo con kit hace uso de una sonda de ADN marcada con fluorescencia conocida como baliza molecular para detectar secuencias de ADN específicas amplificadas por medio de una forma modificada de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)^{1,2}, conocida a continuación en la presente memoria como LATE-PCR. El kit contiene dos sondas de baliza molecular específicas, una que fluoresce en amarillo y está configurada para hibridarse al alelo normal del gen CFTR y una que fluoresce en rojo y está configurada para hibridarse al alelo \DeltaF508 del gen CFTR. Cada sonda de baliza molecular presenta un tallo de 6 pares de bases de longitud y sólo fluoresce en presencia de su secuencia diana específica. Un único apareamiento erróneo de nucleótidos es suficiente para impedir la fluorescencia de la sonda de baliza molecular. Las reacciones de LATE-PCR comienzan con la amplificación simétrica de ambas cadenas y entonces cambia abruptamente a la amplificación lineal de una única cadena. Debido a que todas las copias de la cadena diana que se acumulan son monocatenarias, se detectan fácilmente con una sonda de baliza molecular. Estas características proporcionan una señal elevada a la razón de ruido y potencian la sensibilidad y la precisión del ensayo.

El kit contiene dos cebadores que amplifican conjuntamente dos amplicones de aproximadamente 85 pares de bases de longitud en la región del gen CFTR que incluye la región F508. La secuencia del cebador limitativo es 5' CCTGG
ATTATGCCTGGCACCAT 3' (SEC ID Nº: 7); se utiliza a una concentración de 50 nM. La secuencia del cebador en exceso 5' CCTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3'(SEC ID Nº: 24); se utiliza a una concentración de 1.000 nM. Estos cebadores presentan temperaturas de fusión (T_{m}) que coinciden aproximadamente a las concentraciones iniciales, tal como se calculan utilizando una fórmula del vecino más próximo (Allawi y SantaLucia, 1997), proporcionando una eficacia y especificidad óptimas para la amplificación de ADN.

\vskip1.000000\baselineskip

Materiales proporcionados

Los contenidos del kit de prueba CF\DeltaF508 Kit son suficientes para realizar un análisis frecuente muestras individuales, conteniendo cada una 1-10.000 células. Todas las muestras, incluyendo las muestras control deben prepararse el mismo día. No volver a congelar o reutilizar ningún tubo ni reactivo. Desechar los materiales no utilizados.

: 10 tubos de reacción de muestra que contienen tampón de lisis celular

: 2 tubos de reacción control sin células

: 2 tubos de reacción control positivos con ADN heterocigótico para \DeltaF508

: 16 tapas de sustitución para tubos de reacción

: Base de soporte para tubos de reacción

: 1 tubo de tampón para PCR (235 \mul) 60 ml de tampón de lavado celular

: 30 ml de tampón de lavado final

: 12 pipetas de transferencia estériles

: Formulario para la identificación de muestras celulares

: Bolsa de basura para tubos de reacción utilizados

\vskip1.000000\baselineskip

Materiales adicionales requeridos

Microscopio invertido o microscopio de disección equipado con un micromanipulador u otro dispositivo para coger células individuales u otras muestras pequeñas.

Termociclador con detección por fluorescencia: (ABI PRISM 7700 o equivalente) Campana de flujo laminar o campana de contención sin circulación

: Microcentrífuga de mesa para tubos de 0,2 ml

: Micropipetas u otro dispositivo para el aislamiento celular y la transferencia a tubos

: Placas Petri estériles

: Guantes libres de polvo

: Bata de laboratorio, mascarilla y gorro

: Pipeteadores y puntas de pipeta estériles con filtro

: Platinum Taq ADN Polimerasa (Invitrogen) [módulo de kit separado]

\vskip1.000000\baselineskip

Almacenamiento y manipulación

Almacenar los reactivos del CF\DeltaF508 Kit en un congelador susceptible de helarse (-20ºC). Evitar descongelar y volver a congelar de manera repetida. Proteger el tubo de tampón para PCR de la exposición a la luz durante el almacenamiento. Manipular los tubos y botellas con guantes limpios, libres de polvo.

\vskip1.000000\baselineskip

Precauciones generales

UTILIZAR SÓLO PARA EL DIAGNÓSTICO IN VITRO EN LABORATORIO

* Los componentes de la prueba no deben utilizarse para ningún otro fin que el descrito en estas instrucciones

* La manipulación indebida de los componentes pueden conducir a contaminación y a un diagnóstico erróneo de las muestras

* El almacenamiento indebido de los reactivos puede afectar a las reacciones e impedir el diagnóstico de las muestras

* No utilizar los reactivos cerrados tras la fecha de caducidad mostrada en la caja

\newpage

\global\parskip0.930000\baselineskip

Precauciones para el control de la contaminación

El CF\DeltaF508 Kit se ha diseñado para minimizar el riesgo de contaminación. Deben seguirse las siguientes etapas para garantizar que el riesgo permanece a un nivel bajo aceptable.

* Abrir los tubos de reacción y el tubo de tampón para PCR sólo en una campana de flujo laminar o campana de contención sin circulación.

* Tratar las superficies con lejía al 10% o esterilizar con luz UV antes de su utilización.

* Llevar puesta una bata de laboratorio, mascarilla, gorro y guantes libres de polvo limpios.

* Manipular todos los componentes del kit SÓLO con guantes en las manos.

* Los guantes deben cambiarse tras tocar cualquier objeto que pueda estar contaminado con células o ADN humanos (por ejemplo, cualquier superficie fuera de la zona tratada).

* Debe tenerse un CUIDADO EXTREMO para evitar la transferencia no intencionada de células al tubo de ensayo. Estas células pueden proporcionar un molde para la amplificación por LATE-PCR y fluorescencia de baliza molecular.

* Utilizar pipeteadores mecánicos que estén concebidos para un sistema de PCR y no se utilicen para otros fines.

* Utilizar puntas de pipeta estériles con filtros.

* Desechar las puntas de pipeta utilizadas inmediatamente tras una única utilización.

* No volver a introducir NUNCA una punta de pipeta utilizada en un tubo de reacción o el tubo de reactivo para PCR.

* La PCR debe realizarse en una ubicación separada de la biopsia celular y la preparación de muestras.

* NO abrir los tubos de reacción en ningún momento tras retirarlos del termociclador tras la amplificación por PCR. La apertura de los tubos libera aerosoles que contienen ADN que pueden contaminar el laboratorio y podrían poner en peligro todos los ensayos posteriores.

* Colocar los tubos de reacción utilizados en la bolsa de basura, sellarla completamente y eliminarla de manera apropiada según las normativas locales, estatales o federales. Sólo someter a autoclave si se requiere por ley. Si se requiere someter a autoclave, NO debe realizarse en o cerca de los laboratorios utilizados para la preparación de muestras o PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

Procedimiento de ensayo con CF\Delta508 Kit Configuración previa a la biopsia

Etapa A. Poner la base de soporte que contiene 2 tubos de reacción control sin células y 10 tubos de reacción de muestra en hielo. Una vez finalizada la descongelación, centrifugar brevemente todos los tubos para garantizar que los contenidos líquidos están en el fondo. Devolver los tubos al hielo, colocándolos en las posiciones apropiadas de la base de soporte. Mantener todos los tubos de reacción cerrados en este momento.

Etapa B. En el formulario de identificación celular adjunto, registrar la denominación para cada muestra que va a someterse a prueba a continuación del código de color/número del tubo de reacción de muestra que se utilizará para ese embrión. NO hacer directamente ninguna marca en los tubos o las tapas ya que esto interfiere con la detección por fluorescencia.

Etapa C. Trabajando en una campana de contención, preparar dos placas Petri con tampón de lavado celular y una placa Petri con tampón de lavado final (de 0,5 ml a 3,0 ml de tampón por placa) para cada embrión que va a biopsiarse. Asegurarse de que cada placa está etiquetada de manera apropiada.

\vskip1.000000\baselineskip

Biopsia y lavado celular: Completar las etapas D-F antes de repetir con otro embrión

Etapa D. Debe tenerse cuidado para evitar la transferencia de células no embrionarias. En particular, en el caso de una biopsia de un embrión para PGD, debe eliminarse todo el esperma y células del cumulus circundantes o adheridas al embrión de una manera tan completa como sea posible antes de comenzar con la biopsia. Realizar la biopsia del embrión utilizando cualquier técnica establecida, incluyendo aspiración directa^{3}, perforación de la zona y aspiración^{4}, perforación de la zona y desplazamiento^{5}, o corte de la zona con láser y aspiración^{6}. Deben aislarse uno o dos blastómeros intactos para cada embrión. Los blastómeros dañados durante la biopsia o las etapas de lavado posteriores no deben utilizarse para el diagnóstico.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Etapa E1 - en casos de biopsia de un embrión. Las etapas de lavado siguientes son importantes para eliminar componentes del medio de cultivo que pueden interferir con la lisis celular. PCR y detección por fluorescencia. Transferir la microgota que contiene el/los blastómero(s) a la campana que contiene el microscopio de disección. Mientras se observa bajo el microscopio, utilizar una pipeta de transferencia estéril (proporcionada en el kit) para mover un blastómero biopsiado a la primera placa que contiene tampón de lavado celular sin utilizar, tal como sigue: A) aspirar una cantidad pequeña de tampón de lavado celular en la pipeta de transferencia; B) aspirar el blastómero en la punta de la pipeta; C) expulsar con cuidado el blastómero en la primera placa que contiene tampón de lavado celular. Tan pronto como el blastómero salga de la pipeta, mover la pipeta a otra región de la placa para expulsar el lavado celular restante y aclarar la pipeta. Repetir este procedimiento para transferir el blastómero a la segunda placa que contiene tampón de lavado celular sin utilizar, seguido de la tercera placa que contiene tampón de lavado final. Todos los lavados deben ser breves.

Etapa E2 - en casos distintos de embriones humanos. Se colocan las células en un tubo de 200 ml y se lavan tres veces en 10 volúmenes de tampón de lavado celular por medio de centrifugación suave, aspiración del sobrenadante y resuspensión en tampón de lavado final. Todos los lavados deben ser breves y pueden realizarse a 4ºC si se desea.

\vskip1.000000\baselineskip

Lisis celular

Etapa F. Utilizar la pipeta de transferencia para coger el blastómero, u otro tipo de célula, en un volumen pequeño de tampón de lavado final. El fluido aspirado no debe extenderse más de 1 cm por encima de la punta de la pipeta. Abrir el tubo de reacción de muestra que se ha designado para ese blastómero y colocar la tapa en una superficie estéril. Evitar tocar la parte interna de la tapa. Colocar la punta de la pipeta de transferencia que contiene la célula directamente en el tampón en el tubo de reacción de muestra y expulsar el contenido de la pipeta. Cerrar el tubo. Si hay burbujas, o hay gotas de tampón en los lados del tubo, debe centrifugarse la muestra brevemente (unos pocos segundos). Poner el tubo de reacción de muestra en hielo tan pronto como sea posible tras añadir el blastómero. Las muestras DEBEN permanecer en hielo hasta la etapa I. NO dejar la muestra a temperatura ambiente ya que esto dará como resultado reacciones subóptimas que pueden impedir un diagnóstico preciso.

Etapa G. Garantizar que se ha registrado la identificación celular correcta con el número del tubo de reacción de muestra. Si se ha obtenido una segunda célula a partir de la misma fuente, debe lavarse y transferirse a un tubo de reacción de muestra separado utilizando una nueva pipeta de transferencia. Desechar todas las pipetas utilizadas y lavar las placas.

Etapa H. Repetir las etapas D a G utilizando nuevas pipetas y lavar las placas para cada embrión sometido a prueba. Transferir un volumen equivalente de tampón de lavado final a ambos tubos de reacción control sin células.

Etapa I. Precalentar el bloque de termociclador hasta 50ºC. El bloque debe estar equipado con una cubierta calentada diseñada para evitar la condensación en la tapa de los tubos. Colocar todos los tubos de reacción de muestra, así como ambos tubos de reacción control sin células en el bloque precalentado. Incubar a 50ºC durante 30 min., luego a 95ºC durante 15 minutos. Una vez que se ha enfriado el bloque hasta temperatura ambiente, retirarlo y examinar cada tubo de reacción. Si hay condensación en la tapa o los lados de los tubos, puede que las muestras no proporcionen una amplificación adecuada para el diagnóstico. Poner los tubos en hielo tal como se describió en la etapa A. Durante el periodo de incubación de la etapa I, continuar con las etapas J y K.

Sistema de PCR (las etapas K y L deben llevarse a cabo o bien en una campana de flujo laminar o campana de contención sin circulación diferente que la utilizada para las etapas D-H, o bien la campana utilizada para las etapas D-H debe librarse de todos los materiales innecesarios y limpiarse con una disolución de lejía al 10% antes de utilizarla para las etapas K y L)

Etapa J. [LATE-PCR con Hotstart]

Añadir 4,8 \mul de Platinum Taq ADN Polimerasa (5 unidades/ml) al tubo de tampón para PCR y mezclar meticulosamente para garantizar una distribución homogénea de la enzima.

Etapa K. Descongelar los dos tubos control de ADN normal/heterocigótico para \DeltaF508 colocándolos en la rejilla de soporte en hielo. Añadir cada tubo de reacción de muestra y cada tubo de reacción control sin células a la rejilla de soporte una vez que la incubación para lisis (etapa J) está completa.

Etapa L. Abrir el primer tubo de reacción de muestra y añadir 15 ml de tampón para PCR que contiene Taq ADN polimerasa añadida. Volver a tapar el tubo inmediatamente utilizando una tapa de sustitución. Desechar la tapa vieja y la punta de pipeta utilizada. Repetir esta etapa para cada tubo de reacción, incluyendo los dos tubos control positivos y los dos tubos control sin células. Deben analizarse todos los tubos control en paralelo con muestras celulares desconocidas para una interpretación precisa de los resultados de la prueba. Como una precaución adicional frente a la contaminación cruzada, se recomienda cambiar los guantes tras cada muestra.

\vskip1.000000\baselineskip

\global\parskip0.900000\baselineskip

PCR y detección por fluorescencia

Etapa M. [Parámetros de ciclado recomendados]

Cargar los tubos en un termociclador con detección por fluorescencia. El programa siguiente se basa en el detector de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems):

Fase 1. 95ºC, 3 minutos (1 repetición)

Fase 2. 95ºC, 10 segundos, 55ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos (25 repeticiones)

Fase 3. 95ºC, 10 segundos, 52ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos (35 repeticiones)

Fijar la obtención de fluorescencia para FAM y TET durante la etapa de 52ºC.

Fijar el volumen de muestra a 25 \mul.

Seleccionar las posiciones de bloque que se utilizan y teclearlas en las identificaciones de muestra correctas.

Etapa N. No abrir nunca los tubos de reacción tras la amplificación ya que esto puede dar como resultado una contaminación del laboratorio que puede poner en peligro todos los ensayos posteriores. Tras la finalización de la PCR, retirar todos los tubos de reacción sin abrir y colocarlos inmediatamente en la bolsa de basura. Sellar completamente la bolsa y desecharla de manera apropiada según cualquier normativa local, estatal o federal. Si se requiere someter a autoclave, sellar la bolsa con tan poco aire como sea razonablemente posible, proceder entonces a someter a autoclave en un sitio alejado del laboratorio, en un autoclave que no se utilice para preparar ningún otro material utilizando en el laboratorio.

\vskip1.000000\baselineskip

Análisis e interpretación de los resultados del ensayo

La siguiente descripción es apropiada para un detector de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems); los parámetros apropiados para otras máquinas se desconocen actualmente. Fijar un valor umbral de 200 unidades y un inicio de referencia en el ciclo 3 y una parada en el ciclo 12 de la fase 3 (ciclos 28 y 37 de la reacción global) para cada tinte indicador (FAM y TET) en la ventana de análisis del ABI 7700. Estos valores se utilizan para calcular el ciclo umbral (C_{T}) para la detección por fluorescencia en cada muestra.

El intervalo de los valores de C_{T} y los valores de fluorescencia final requeridos para clasificar como positivo para el alelo normal (señal FAM) y para el alelo mutante \DeltaF508 (señal TET) se proporcionan en el certificado de análisis de producto separado y se basan en las pruebas de cada lote. Los valores por encima del umbral, pero por debajo de estos valores requeridos indica la posibilidad de contaminación o lisis celular inadecuada. Las muestras que generan tales valores no deben clasificarse y los embriones no deben transferirse basándose en los resultados de la prueba.

\vskip1.000000\baselineskip

Limitaciones de la prueba

El CF\DeltaF508 Kit se ha diseñado para utilizar Platinum Taq ADN Polimerasa (Invitrogen) y el detector de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems). La utilización de otra ADN polimerasa con arranque en caliente u otros termocicladores con detección por fluorescencia puede ser posible, pero debe optimizarse por el usuario antes de someter a prueba las células de los embriones. Este kit está diseñado para identificar la mutación \DeltaF508 y la secuencia de alelos normales en esa región del gen CFTR. Otras mutaciones en el gen CFTR no pueden detectarse utilizando este kit.

El mosaicismo cromosómico está presente en algunos embriones obtenidos a partir de IVF y es común en embriones con una mala morfología. Por tanto, un único blastómero biopsiado puede no ser representativo de la composición genética del embrión.

Algunos embriones humanos contienen células sin núcleo que darán resultados negativos si se utilizan en este ensayo. Se obtendrán los resultados más precisos si se observan núcleos en blastómeros biopsiados. No debe utilizarse un blastómero si se observan señales de lisis celular tras la biopsia, puesto que el daño celular puede incluir degradación de ADN.

\vskip1.000000\baselineskip

Bibliografía

^{1}Tyagi, S. y Kramer, F.R. (1996) Nature Biotechnology 14, 303-308

^{2}Piatek et al. (1998) Nature Biotechnology 16, 359-363

^{3}Wilton, L.J. y Trounson, A.O. (1989) Biology of Reproduction 40, 145-152

\global\parskip1.000000\baselineskip

^{4}Hardy, K. et al. (1990) Human Reproduction 5, 708-714

^{5}Pierce, K.E. et al. (1997) Human Reproduction 12, 351-356

^{6}Boada et al. (1998) J. Assist Reprod Genet 15, 302-307

\vskip1.000000\baselineskip

Composiciones y componentes del CF\Delta508 Kit

Tubos de reacción

Tubos ópticos de 0,2 ml de Perkin Elmer (Pt nº N801-0933)

con tapas ópticas (Pt nº N801-0935)

\vskip1.000000\baselineskip

Composición de tampón de lisis celular (tubos de reacción de muestra y sin células):

Proteinasa K 100 \mug/ml (Roche Molecular Biochemicals)

Dodecilsulfato de sodio 5 \muM

Tris 10 mM, pH 8,3 (cristales prefijados Trizma, Sigma)

agua de calidad molecular

\vskip1.000000\baselineskip

Composición de muestra contenida en un tubo de reacción control normal/\Delta508:

60 picogramos de ADN humano heterocigótico para el alelo \Delta508 del gen CF.

Dodecilsulfato de sodio 5 \muM

Tris 10 mM, pH 8,3 (cristales prefijados Trizma, Sigma)

agua de calidad molecular hasta un volumen final de 10 microlitros

\vskip1.000000\baselineskip

Composición de tampón de lavado celular:

Solución salina tamponada con fosfato sin Ca^{++} o Mg^{++} (Sigma, nº de cat. D-8537)

Polivinilpirrolidona al 0,1% (Sigma, nº de cat. PVP-40)

\vskip1.000000\baselineskip

Composición de tampón de lavado final:

Solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesio

Polivinilpirrolidona al 0,01%

\vskip1.000000\baselineskip

Composición de tampón para PCR:

1,67 X tampón para PCR (Invitrogen)

MgCl_{2} 6,25 mM

0,42 mM de cada uno de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dCTP, dTTP, dATP, dGTP)

Cebador limitativo 0,083 \muM

Cebador en exceso 1,67 \muM

1,0 \muM de cada baliza molecular (2 en total)

Agua de calidad molecular hasta un volumen final de 235 microlitros

\vskip1.000000\baselineskip

Cebadores CF:

Limitativo: 5' CCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3' [SEC ID Nº: 7]

En exceso: 5' CCTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3' [SEC ID Nº: 24]

\vskip1.000000\baselineskip

Baliza molecular de alelo normal:

5' FAM - CGCGCTTATCATCTTTGGTGTTTCCTATAGCGCG - Dabcilo 3' [SEC ID Nº: 9]

\vskip1.000000\baselineskip

Baliza molecular de alelo \Delta508:

5' TET - CGCGCTAAAATATCATTGGTGTTTCCTAAGCGCG - Dabcilo 3' [SEC ID Nº: 23]

Claims

1. Procedimiento de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) no simétrica que comprende termociclar una mezcla de reacción de PCR que contiene una secuencia diana de amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN), un par de cebadores para PCR, dNTP y una polimerasa termoestable de manera repetida a través de las etapas de PCR de fundido de la cadena, apareamiento de cebador y extensión de cebador, en el que, al principio de la amplificación (a) la mezcla de reacción contiene hasta 1.000.000 de copias de la secuencia diana de amplificación, (b) el par de cebadores para PCR comprende un cebador limitativo y un cebador en exceso, estando presente el cebador limitativo en una concentración de hasta 200 nM y estando presente el cebador en exceso en una concentración por lo menos cinco veces superior que el cebador limitativo, (c) la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador limitativo es igual a o superior a la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso, (d) si el cebador limitativo no es totalmente complementario a dicha secuencia diana, la temperatura de fusión ajustada a la concentración de esa parte del cebador limitativo que hibrida con dicha secuencia diana no es superior a 5ºC por debajo de la temperatura de fusión ajustada a la concentración del cebador en exceso, (e) la temperatura de fusión del amplicón producido mediante la extensión del cebador en exceso supera la temperatura de fusión ajustada a la concentración inicial del cebador en exceso en no más de 18ºC, y (f) el termociclado se repite un número de veces suficiente para incluir múltiples ciclos de amplificación lineal usando el cebador en exceso tras el agotamiento del cebador limitativo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 para por lo menos dos secuencias diana en el que la mezcla de reacción incluye un par de cebadores para PCR para cada diana, y en el que los puntos de fusión ajustados a la concentración, iniciales de todos los cebadores limitativos son iguales a o superiores a los puntos de fusión ajustados a la concentración, iniciales de todos los cebadores en exceso.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador limitativo es por lo menos 3ºC superior a la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la mezcla de reacción contiene hasta 10.000 copias de la secuencia diana de amplificación.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la duración de la etapa de apareamiento de cebador no es superior a 30 segundos.

6. Ensayo de detección homogéneo para por lo menos una secuencia diana de amplificación de ADN que emplea la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) no simétrica, que comprende (a) termociclar, a través de múltiples ciclos de etapas de PCR de fundido de la cadena, apareamiento de cebador y extensión de cebador, una mezcla de reacción de PCR que contiene al principio de la amplificación dicha por lo menos una secuencia diana de amplificación, una ADN polimerasa termoestable, dNTP, y para cada secuencia diana de amplificación un par de cebadores para PCR para amplificar dicha secuencia diana de amplificación y por lo menos una sonda de hibridación marcada que hibrida con el amplicón producido mediante dichos cebadores y (b) detectar la señal producida mediante dicha por lo menos una sonda como indicación de la presencia de dicha por lo menos una secuencia diana de amplificación, en el que (i) cada par de cebadores para PCR comprende un cebador limitativo y un cebador en exceso, (ii) el cebador limitativo está presente a una concentración de hasta 200 nM, y para cada par de cebadores, el cebador en exceso está presente a una concentración de por lo menos cinco veces superior a la concentración del cebador limitativo, (iii) las temperaturas de fusión ajustadas a la concentración, iniciales de todos los cebadores limitativos son por lo menos iguales a las temperaturas de fusión ajustadas a la concentración, iniciales de todos los cebadores en exceso, (iv) para cada par de cebadores, la temperatura de fusión del amplicón supera la temperatura de fusión ajustada a la concentración inicial del cebador en exceso en no más de 25ºC, (v) el termociclado se repite un número de veces suficiente para incluir múltiples ciclos de amplificación lineal usando los cebadores en exceso tras el agotamiento de los cebadores limitativos, y (vi) dicha por lo menos una producción de señales de sonda de cadena de producto producida mediante la extensión del cebador en exceso.

7. Ensayo según la reivindicación 6, en el que dicha por lo menos una sonda de hibridación es una sonda fluorescente doblemente marcada que hibrida con el producto de extensión del cebador limitativo y que se hidroliza por la polimerasa durante la extensión del cebador en exceso, generando de este modo una señal detectable.

8. Ensayo según la reivindicación 6, en el que dicha por lo menos una sonda hibrida con el producto de extensión del cebador en exceso y señaliza tras la hibridación y en el que la amplificación por PCR incluye una etapa de detección añadida tras la extensión de cebador durante por lo menos algunos ciclos de amplificación lineal, siendo dicha etapa de detección de temperatura lo suficientemente baja y duración suficiente para que dicha por lo menos una sonda hibride y señalice, y en el que la etapa de PCR de apareamiento de cebador no es de temperatura lo suficientemente baja y duración suficiente para que dicha por lo menos una sonda hibride y señalice.

9. Ensayo según la reivindicación 8, en el que la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial de dicha por lo menos una sonda es por lo menos 5ºC por debajo de la temperatura media de la etapa de apareamiento de la fase exponencial de la reacción de amplificación.

10. Ensayo según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que la etapa de detección se realiza comenzando algunos ciclos antes del ciclo umbral de la reacción.

11. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la etapa de detección a baja temperatura no es superior a 30 segundos de duración.

12. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que la duración de la etapa de apareamiento de cebador no es superior a 30 segundos.

13. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en el que, para cada par de cebadores, la temperatura de fusión del amplicón supera la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso en no más de 18ºC.

14. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en el que, para cada par de cebadores, la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador limitativo es por lo menos 3ºC superior a la temperatura de fusión de ajuste a la concentración, inicial del cebador en exceso.

15. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, en el que la mezcla de reacción contiene hasta 50.000 copias de dicha por lo menos una secuencia diana de amplificación.

16. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, en el que dicha por lo menos una sonda de hibridación comprende una primera sonda para una variante alélica y una segunda sonda para otra variante alélica.

17. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 16, en el que dicha etapa de detección es una detección de punto final.

18. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 16, en el que dicha etapa de detección es una detección en tiempo real.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 18, en el que las temperaturas de fusión ajustadas a la concentración iniciales de los cebadores limitativos y en exceso son temperaturas de fusión derivables usando una fórmula del vecino más próximo.

20. Procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) no simétrica que comprende termociclar una mezcla de reacción de PCR que contiene una secuencia diana de amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN), un par de cebadores para PCR limitativos apareados, un cebador en exceso, dNTP y una polimerasa termoestable de manera repetida a través de las etapas de PCR de fundido de la cadena, apareamiento de cebador y extensión de cebador, en el que los cebadores para PCR limitativos apareados están presentes en concentraciones iniciales aproximadamente equimolares de hasta 200 nM, el cebador en exceso está presente en una concentración inicial por lo menos cinco veces superior a los cebadores limitativos, una temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso es por lo menos 5ºC por debajo de una temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial de los cebadores limitativos si la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial se determina usando una fórmula del vecino más próximo, y en el que la reacción comprende una primera fase en la que la temperatura de apareamiento es superior a la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso y los cebadores limitativos apareados generan un primer amplicón, y una segunda fase en la que la temperatura de apareamiento se disminuye y el cebador en exceso genera un segundo amplicón, más corto que el primer amplicón, utilizando el primer amplicón como cadena molde, y en la que la temperatura de fusión del segundo amplicón supera la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador en exceso en no más de 25ºC.

21. Ensayo de detección homogéneo para por lo menos una secuencia diana de amplificación de ADN que emplea amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) no simétrica, que comprende (a) termociclar, a través de múltiples ciclos de etapas de PCR de fundido de la cadena, apareamiento de cebador y extensión de cebador, una mezcla de reacción de PCR que contiene dicha por lo menos una secuencia diana de amplificación, una ADN polimerasa termoestable, dNTP y para cada secuencia diana de amplificación un par de cebadores para PCR para amplificar la secuencia diana de amplificación y por lo menos una sonda de hibridación a baja temperatura marcada que hibrida con el amplicón producido mediante los cebadores y (b) detectar la señal producida mediante dicha por lo menos una sonda como indicación de la presencia de dicha por lo menos una secuencia diana de amplificación, en el que (i) cada par de cebadores para PCR comprende un cebador limitativo y un cebador en exceso, (ii) cada cebador limitativo está presente en una concentración inicial de hasta 200 nM, y para cada par de cebadores el cebador en exceso está presente a una concentración inicial por lo menos cinco veces superior a la concentración de cebador limitativo, (iii) para cada secuencia diana de amplificación, la sonda de hibridación a baja temperatura se une al producto de extensión del cebador en exceso y emite una señal detectable tras la hibridación, (iv) para cada secuencia diana de amplificación una temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial de la sonda de hibridación a baja temperatura está por lo menos 5ºC por debajo de una temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial del cebador limitativo si la temperatura de fusión ajustada a la concentración, inicial se determina usando una fórmula del vecino más próximo, (v) el termociclado se repite un número de veces suficiente para incluir múltiples ciclos de amplificación lineal usando los cebadores en exceso tras el agotamiento de los cebadores limitativos, y (vi) la detección se realiza a una temperatura lo suficientemente baja para que las sondas a baja temperatura hibriden y señalicen.

22. Procedimiento según las reivindicaciones 19 a 21, en el que la fórmula del vecino más próximo es: T_{m}= \DeltaH / (\DeltaS+R In(C/2))-273,15+12 log [M], en la que

\DeltaH es entalpía,

\DeltaS es entropía,

C es concentración del cebador,

R es constante universal de los gases, y

[M] es concentración molar de cationes monovalentes.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 18, en el que la polimerasa termoestable es Taq ADN polimerasa.