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Abstract
Description
オリゴヌクレオチドのTmまたは融解温度とは、一本鎖オリゴヌクレオチドの集団中の50%の分子がその相補配列とハイブリダイズしているが、前記集団中の50%の分子がその相補配列とハイブリダイズしていない温度(℃)を意味する。プライマーまたはプローブのTmは融解曲線を用いて実験的に決定することができる。ある場合には、計算によってもTmを得ることができる。対称および非対称PCRプライマー対の設計の場合は、つり合いのとれたTmが、一般的に、1価塩濃度とプライマー濃度の条件の所定のセットで、初期のころに論じられた3つの方法のうちの1つ、すなわち「GC%」、「2(A+T) + 4(G+C)」、または「Nearest Neighbor」式により算出される。Nearest Neighborで算出する場合には、両プライマーのTmは計算または測定で使用するために選ばれた濃度に左右され、2つのプライマーのTmの差はプライマー濃度が等モルであるかぎり実質的に変化することはなく、PCRプライマーの測定および計算に関しても通常それらは同様である。Tm[1]は、1マイクロモル(1μM=10-6M)のプライマー濃度および0.07モルの1価カチオンの特定の標準条件で算出されたPCRプライマーのTmを意味する。本出願においては、特に断らないかぎり、Tm[1]はNearest Neighbor式:Tm = ΔH/(ΔS + R ln (C/2)) -273.15 + 12 log [M]を用いて計算される。この式は発表された式(Le Novere, N. (2001), "MELTING, Computing the Melting Temperature of Nucleic Acid Duplex," Bioinformatics 17: 1226-7)に基づくものである。ΔHはエンタルピーであり、ΔSはエントロピーであり(ΔHおよびΔSの計算はいずれもAllawiおよびSantaLucia, 1997に基づく)、Cはオリゴヌクレオチドの濃度(10-6M)であり、Rは普遍的な気体定数であり、[M]は1価カチオンのモル濃度(0.07)である。この式に従うと、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基組成(項目ΔHおよびΔSに含まれる)、塩濃度、およびオリゴヌクレオチドの濃度(項目Cに含まれる)がTmに影響する。一般的に、同じ長さのオリゴヌクレオチドの場合、オリゴヌクレオチドのグアニンおよびシトシン塩基の含量が増加するにつれてTmは上昇するが、オリゴヌクレオチドの濃度が低下するにつれてTmは降下する。A、T、CおよびG以外のヌクレオチドを含むかまたは共有結合修飾を有するプライマーの場合は、当技術分野で知られているハイブリダイゼーション融解分析によりTm[1]を実験的に測定する。
a) DNA標的、前記標的のための1対のPCRプライマー、dNTP、および耐熱性DNAポリメラーゼを含有するPCR反応混合物を、鎖融解、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のPCR段階からなる熱サイクルに繰り返し供すること、ここにおいて、(i)前記PCRプライマーの対は制限プライマーと余剰プライマーを含み、(ii)制限プライマーは最大200nMまでの濃度で存在し、余剰プライマーは制限プライマーより少なくとも5倍高い濃度で存在し、(iii)制限プライマーの初期の濃度調整融解温度は、余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度に少なくとも等しく、さらに好ましくはそれより3〜10℃高く、(iv)制限プライマーの消耗後に、余剰プライマーを用いる線形増幅の複数サイクルを含めるのに十分な回数、熱サイクルを繰り返すこと、
b) 少なくとも線形増幅のサイクルの間、プライマー伸長段階の後に、余剰プライマーの一本鎖伸長産物を、固定化された捕捉プローブに前記産物をハイブリダイズさせることで反応混合物から永久的に分離すること、
を特徴とする。この方法の好ましい変形は、固定化された捕捉プローブが熱的に隔離された産物分離ゾーンにあり、前記分離段階が反応混合物を前記ゾーンに通すことを含む。この方法のいくつかの好ましい変形において、捕捉プローブは分離可能(例えば、反応混合物から物理的に分離することができるビーズ)であるか、または少なくとも1つの反応ゾーンから物理的に隔離しうる産物分離ゾーンにあり、前記捕捉プローブを定期的に分離して、反応混合物との接触なしに、例えば反応混合物が少なくとも1つの反応ゾーンにある間に、前記捕捉プローブにハイブリダイズされた産物を回収することをさらに含む。その他の好ましい変形において、アンプリコンの融解温度は余剰プライマーの濃度調整融解温度を18℃以下上回る。さらに他の好ましい変形において、余剰プライマーは500〜2000nMの濃度で存在し、かつ制限プライマーより少なくとも10倍高い濃度で存在する。
a) 核酸標的配列を第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第2のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、ここにおいて、第1のプライマーのTmは第2のプライマーのTmより少なくとも5℃、好ましくは10℃または20℃高く、第2のプライマーの濃度は最大1000nMで、第1のプライマーの濃度より少なくとも約10倍、好ましくは20〜100倍高いこと、
b) 前記標的配列をポリメラーゼ連鎖反応により前記第1および第2のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅すること、ただし、前記反応はアンプリコン生成の指数期と、これに続く第2のプライマーのみを利用するアンプリコン生成の線形期とを有すること、
を特徴とする。
a) 少なくとも1つの核酸標的配列を、それとハイブリダイズできる第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよびそれとハイブリダイズできる第2のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、ここにおいて、第1のプライマーのTmは第2のプライマーのTmより少なくとも5℃、好ましくは10〜20℃高く、第2のプライマーの濃度は最大1000nMで、第1のプライマーの濃度より少なくとも約10倍高いこと、
b) 前記少なくとも1つの標的配列をポリメラーゼ連鎖反応により前記第1および第2のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅すること、ただし、前記反応はアンプリコン生成の指数期と、これに続いて第2のプライマーのみを利用するアンプリコン生成の線形期とを有すること、
c) 第2のプライマーから生成されたアンプリコンを、それにターゲッティングされる第1のハイブリダイゼーションプローブを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応中にリアルタイムで検出すること、
を特徴とする。核酸配列は対立遺伝子変異を受けやすい遺伝子配列であり、前記第1のハイブリダイゼーションプローブは第1の対立遺伝子変異体にターゲッティングされる。第2のプライマーから生成されたアンプリコンは、第2の対立遺伝子変異体にターゲッティングされる第2のハイブリダイゼーションプローブを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応中にリアルタイムで検出することができる。いくつかの実施形態において、第2のプライマーの濃度は第1のプライマーの濃度の20〜100倍である。この方法は少なくとも2つの異なる核酸配列を検出するために使用することができ、その場合には、前記方法が、各核酸配列を、それとハイブリダイズできる第1のプライマーおよびそれとハイブリダイズできる第2のプライマーと接触させることを含む。いくつかの好ましい実施形態では、検出がプライマー伸長と鎖融解のPCR段階の間に、好ましくはプライマー伸長温度より低い温度で行われる。プローブは、とりわけ、分子ビーコンプローブまたは二本鎖プローブでありうる。
a) 第1のプライマーのTmは第2のプライマーのTmより少なくとも5℃、好ましくは10〜20℃高く、第2のプライマーの濃度は第1のプライマーの濃度より少なくとも10倍、好ましくは20〜100倍高いこと、
b) 分子ビーコンでありうる標識ハイブリダイゼーションプローブは第2のプライマーの伸長産物に対してターゲッティングすること、
を特徴とする。
本発明で使用するプライマー対の設計は、以下に説明するように、直接的に実施することができる。あるいは、公知の方法により対称PCR用のプライマー対を選択または設計することから開始し、続いてLATE-PCR用に改変してもよい。対称PCRプライマーは、プライマー濃度および塩濃度の標準条件のセットで、等しい融解温度を有するように設計する。利用可能なコンピュータプログラムを使用して対称PCRプライマーを設計および分析するのが有利である。対称および非対称PCRの場合、融解温度(Tm)を計算する標準方法は、「Nearest Neighbor」法および「2 (A+T)+4(G+C)」法であった。簡潔にするために、本発明者らは、1μMの標準プライマー濃度および0.07Mの塩(一価陽イオン)でのプライマーのTmであるTm[1]の概念を導入する。典型的コンピュータプログラムにより与えられるTmからTm[1]への変換は、一般に、プライマー対のTmの関係に最小限の影響しか与えない。本発明に従うプライマー対の濃度調整融解温度には、実際の測定または適切な計算のいずれかが必要である。本明細書および特許請求の範囲に従うプライマー融点、「濃度調整融点」、すなわち「Tm[0]」を説明および比較する目的で、本発明者らは、可能であれば、本明細書で用いた定義で先に示したNearest Neighbor式に従って融点を計算するか、さもなくば、実験的にTm[0]を決定する。
ほとんどの従来の対称および非対称PCRとは対照的に、LATE-PCRは、アンプリコンの融点、Tm Aを考慮に入れる。というのは、特に、これが余剰プライマーの濃度調整融点に関係するからである。アンプリコンは、ほぼ常に長さが50ヌクレオチドより大きいため、本発明者らは、「GC%」法(前記参照)によりアンプリコンのTm Aを計算する。他の数式もしくはその他の手段(例えば、試行錯誤)を本発明のプライマーの設計に用いることもできるが、本明細書に記載する融点関係は前記の式を用いて分析する。これらの式は、マグネシウムイオン(Mg++)の濃度(1〜5mMの濃度でPCR反応混合物にほぼ例外なく含まれ、プライマーおよびアンプリコンの融点に影響を与える)を考慮しないにもかかわらず、設計および評価の両方に有用である。実施例5は、Tm Aを考慮に入れた様々なプライマー対の本発明者らの設計、並びに本発明者らが選択する特定のプライマー特性を記載する。
リアルタイムLATE-PCRアッセイでは、反応の二本鎖産物が最初にバックグラウンドを超えて検出可能になるのとほぼ同じ熱サイクル(すなわち、反応のCT値)で、制限プライマーを消耗させるのが望ましい。当分野では公知のように、CT値に到達するサイクルは、中でも、反応の開始時に存在する標的DNAの量、増幅の効率、検出装置の種類、並びにハイブリダイゼーションプローブにより生成されるシグナル(通常蛍光または電気シグナル)の強度に左右される。LATE-PCRでは、約15〜35 PCRサイクル後にプライマーの一方を消耗させ、それから、余剰プライマーを用いる後続サイクルの間に、一本鎖の線形増幅を行なう。一本鎖産物の量を最大限にするためには、選択した任意のプライマー比に対し制限プライマーの絶対量を最適化するのが有用である。実際には、200nMを超える制限プライマー濃度を回避することも望ましい。この濃度を超えると、反応の指数期が長引くため、用途によっては許容されない二本鎖対一本鎖産物の比が発生し、実際に、生成した一本鎖産物の総量が減少する恐れがある。また、10:1以上の比では、余剰プライマー濃度が押し上げられ、2,000nMを上回ることになる。このような条件下では、増幅の非特異的開始を回避することは困難である。
一定の比および絶対濃度で使用するための好適な制限/余剰プライマー対をいったん選択したら、前記のようにNearest Neighbor式を用いて、各プライマーのTm[0]を計算しておく、もしくは計算することができる。これが完了すると、これらのプライマーを用いるべき最適アニーリング温度を実験により確認することが重要である。最適アニーリング温度は、特定の試薬濃度およびサイクル時間で最大効率および最大特異性でもって反応の指数期が進行するときの最高温度である。「最大効率」とは、反応の指数期において最低CT値を生ずる条件を意味し、ここでは、特定の産物が最高速度で蓄積する。アニーリング温度を最適アニーリング温度に向けてさらに下方に調整すると、LATE-PCRの指数期の効率は高くなる傾向がある。アニーリング温度を最適アニーリング温度より下に調節すると、反応は非特異的アンプリコンを増幅する傾向がある。往々にしてそうであるように、用いるプライマー対が標的サンプル内の別の配列と非特異的にハイブリダイズしなければ、アニーリング温度を最適アニーリング温度より低く下げても、反応の効率は顕著には上がらず、反応特異性は実質的に低下しない。従って、本出願で用いる用語「最適アニーリング温度」は、実験により確認した特定の値を有し、その温度よりアニーリング温度を低くすることが有害ではない増幅でも同様である。
従来のリアルタイムPCRの場合には、蛍光染料、もしくはあるタイプの標識プローブ、典型的には、蛍光プローブを含めることにより、二本鎖産物を検出する。蛍光染料を用いた二本鎖の検出は、プライマー伸長段階の間に実施することができる。ハイブリダイゼーションプローブは、典型的には、鎖融解とプライマーアニーリングの各段階の間に反応物が冷却される際、アンプリコンの一方または両方の鎖に結合する。実際に、これは、プローブの融解温度が、プローブと同じ鎖にハイブリダイズするプライマーの融解温度より高いことを意味している(Mackay, I. M. (2002) "Survey and Summary: Real-time PCR in Virology", Nucleic Acids Res. 30(6): 1292-1305)。反応物を再び温めると、プローブは標的鎖から遊離するように設計されているが、プライマーは標的鎖に沿って伸長する。相補鎖への別のプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長もこれらの段階の間に起こる。ハイブリダイゼーションにより、検出シグナルを発生するプローブは、アニーリング段階の間に検出される。加水分解されて、検出シグナルを発生するプローブは、次の伸長段階でのそれらの分解後に検出される。いずれの場合にも、ハイブリダイズしたプローブの量は、その濃度が上がると、アンプリコンの鎖の再アニーリングにより制限される。これは、従来のリアルタイム反応の終了時に存在する標的配列の総数の一部だけが、実際に検出されることを意味する。
リアルタイムLATE-PCRアッセイは、リアルタイム対称PCRアッセイと同様に、二本鎖および/または一本鎖産物の検出のための1以上の標識プローブもしくは蛍光染料を含む。やはり対称PCRの場合と同様に、LATE-PCRの指数期の間に合成された二本鎖産物の検出は、プライマーアニーリングまたはプライマー伸長段階のいずれか、最も好ましくはプライマー伸長段階の間に実施することができる。LATE-PCRの指数期中に生成された二本鎖産物は、二本鎖DNAに結合する染料(例:SYBR(商標登録)グリーン)を用いて検出することができる。しかし、二本鎖DNAは、ハイブリダイゼーションプローブ(例えば、一本鎖プローブまたは分子ビーコン)を用いた低温検出段階中に検出することができない。何故なら、2つのアンプリコン鎖の大部分が低温で互いに再アニーリングするからである。
低Tmおよび超低Tmプローブには、従来のハイブリダイゼーションプローブと比較して、次のような利点がある:a)これらのプローブは、高濃度で用いると、蓄積したすべての一本鎖に結合するため、シグナル強度を高める;b)これらのプローブは、従来のプローブより対立遺伝子特異的である;c)これらのプローブは、非特異的蛍光バックグラウンドが典型的に弱くなる低い温度で検出されるため、従来のプローブよりS/N比が優れている。
LATE-PCRと適合性の低Tmプローブおよび超低Tmプローブとしては、限定するものではないが、以下に示すタイプの1以上のプローブが挙げられる:1)当分野で公知のように標識した一本鎖線状プローブ(例:FRETプローブ);2)当分野で公知の二本鎖プローブ;3)当業者には公知のように標識したステム−ループ一本鎖プローブ(例:分子ビーコン)。これらの一般的クラスは、下記のプローブを含む:PNAまたは2-O-メチル修飾のような非慣用のヌクレオチドを含むプローブ;副溝結合(Minor-Grove-Binding)プローブ(例:Eclipse(商標)プローブ)のようなハイブリッド安定性に影響を与える結合成分を含むプローブ;プライマーに物理的に結合したプローブ(例:Scorpionプローブ)。低Tmプローブおよび超低Tmプローブは、以下の論理的段階に基づき構築される:
1)実験者はどのタイプのプローブを用いるかを選択する;
2)実験者は、プローブの標的配列、近似長さ、および化学組成について決定する。実験者は、適切なソフトウエアパッケージを用いてプローブを設計するとともに、よく知られる核酸生化学の特定の一般原理を適用する。この用途の多くのソフトウエアパッケージは当業者には公知であるが、非慣例的サブユニットからなるタイプのプローブには利用できない。ソフトウエアパッケージは、プローブのTm[0] Pの推定近似値を提供することができる。これらのプローブの設計には下記の一般原理が有用である:a)一定の実験条件下では、短いプローブ/標的ハイブリッドの方が、長いプローブより低いTm値を有する傾向がある;b)一定の実験条件下では、水素結合の少ないプローブ/標的ハイブリッドの方が、水素結合の多いプローブより低いTm値を有する傾向がある;c)一定の実験条件下では、ミスマッチのあるプローブ/標的ハイブリッドの方が、完全にマッチしたプローブより低いTm値を有する傾向がある。
当該プローブについて実験的Tm[0] Pを確認するのに用いた範囲を超える、もしくはそれに満たない初期プローブ濃度範囲を各々用いて、反復LATE-PCRアッセイを実施する(前記参照)。反応で生じたシグナルの強度を比較し、最大シグナルをもたらす最低濃度として最適プローブ濃度を選択する。例えば、図8は、各々が様々な濃度の低Tm分子ビーコン(0.6μM、曲線81;1.2μM、曲線82;2.4μM、曲線83;4.0μM、曲線84)を含む4つの並行LATE-PCRアッセイを示す。これらの結果から、2.4μM(曲線83)が、このLATE-PCRの条件下で上記低Tmプローブについての最適濃度であることがわかった。
Mg++濃度の変化は、従来のPCRの場合と同様に、LATE-PCRの他の多くの態様に影響を与える。影響を受ける要素としては、Tm A、Tm[0] L、Tm[0] X、最適アニーリング温度、Tm[0] P、分子ビーコンのステムの閉鎖、並びにTaq DNAポリメラーゼの活性が挙げられる。一般に、反応物中の各成分のTmは、Mg++濃度とともに上昇するが、各オリゴヌクレオチドとその標的配列との相互作用の特異性は低下する。Mg++のこのような作用はPCRの技術分野の当業者にはよく知られている。従って、一連の平行した反応を通じて最適Mg++を実験により決定する必要がある。本発明では、1〜6mMの範囲の最適Mg++濃度が好ましく、2〜4mMの範囲のMg++濃度が最も好ましい。
移植前遺伝子診断(PGD)中にヒト嚢胞性繊維症遺伝子の正常およびΔF508対立遺伝子の検出に用いることを目的とするLATE-PCR試薬キットが設計されている。本明細書に記載するキットは、モジュール式、すなわち、1つのパッケージにDNAポリメラーゼを、そして別のパッケージに他のすべての試薬および材料を含んでいる。プライマーとプローブは一緒に、オリゴヌクレオチドセットを含み、これらは個別の製品として市場に出すことができることが理解されよう。このキット、その使用、およびキット(「CFΔ508 Kit」と呼ぶ)を用いて実施するアッセイについては、キットに付属の製品挿入物に明示されると考えられるフォーマットで、実施例6に記載されている。
LATE-PCRアッセイの特定の実施形態では、追加の制限プライマーを用いて、反応の初期指数期の間に2つの制限プライマーから比較的長い二本鎖アンプリコンを生成し、次に、長いアンプリコンの一方の鎖を鋳型として、また余剰プライマーをプライマーとして用いて、上記より短い一本鎖アンプリコンを生成する。これは、多サイクルの指数増幅の後、反応容器をあけて余剰プライマーを添加することにより達成することができるが、一方、好ましいLATE-PCR 3-プライマーアッセイでは、好ましくは後期サイクルでのみ余剰プライマーを用いる増幅プロトコルと一緒に、3つのプライマーすべてを含む初期反応混合物を使用する。制限プライマーは、大きなアンプリコンを生成するための1対のマッチしたPCRプライマー(L1およびL2と称する)である。これらのプライマーは「マッチ」している;すなわち、それらのTmが「つり合っている」。L2の濃度は、L1の濃度に大体等しい、すなわち、L1の濃度の0.2〜5倍、好ましくは等モルである。L1およびL2の初期濃度依存融解温度、Tm[0] L1およびTm[0] L2は、可能な限り互いに近い値であるのに対し、余剰プライマーのTm[0] Xは、両制限プライマーのTm[0]より少なくとも5℃、好ましくは、少なくとも10℃低い。PCR増幅の初期サイクル、すなわち、3段階PCRまたは2段階PCRのいずれかは、余剰プライマーのTm[0] Xより高いアニーリング温度を用いて、余剰プライマーがアンプリコンの生成に実質的に参加しないようにする。選択した回数のこれらの高温サイクルが、好ましくは、点指数増幅付近でL1およびL2の消耗のために停止した後、アニーリング温度を下げることにより、後続のサイクル中に余剰プライマーが増幅(もしその対合制限プライマーが完全に消耗されていない場合には、指数増幅であり、その後、一本鎖LATE-PCR産物の線形増幅が続く)に参加するようにする。このように、余剰プライマーの伸長により形成された短い方のアンプリコンの融解温度の関係、すなわち、該アンプリコンのTm Aは、余剰プライマーのTm[0] Xより25℃以上超えない、好ましくは20℃、さらに好ましくは18℃以上超えない。
LATE-PCRに基づくアッセイにより、定量測定を3つの方式で達成することができる。第1に、リアルタイムLATE-PCRを用いて、シグナルのCT値を測定することができる。リアルタイム対称PCRの場合と同様に、CT値を用いて、初期サンプルに存在する標的分子の数を推定することができる。これは、サンプルのCT値と、未知サンプルの量を刺激する条件下で、同じ標的配列の既知量を分析することにより作成した標準曲線とを比較することにより達成される。第2に、リアルタイムLATE-PCRの線形増幅期の間のシグナルの勾配を測定することができる。単一コピー配列について以下に説明するように、ホモ接合二倍体細胞の線形勾配は、同じ順序でヘテロ接合二倍体細胞における線形勾配の約2倍である。第3に、最適化条件下でのLATE-PCRを用いて、エンドポイントアッセイにより、存在する様々な対立遺伝子コピーの相対数を決定することができる。
本発明のアッセイにより、特定の対立遺伝子についてホモ接合のゲノムと、同じ対立遺伝子についてヘテロ接合のゲノムとの間の識別が可能になる。ホモ接合細胞とヘテロ接合細胞とを識別することができるアッセイは、単一細胞または単一ゲノムで出発して実施することができるが、比較しようとする2つのサンプルが反応開始時にほぼ同量のDNAを含んでいれば、別のサンプルを用いていもよい。ホモ接合細胞とヘテロ接合細胞とを識別することができるアッセイは、臨床または商業的に重要である。何故ならば、このようなアッセイにより、特定の対立遺伝子または同対立遺伝子の変異型の1または2個のコピーを保有するまたは保有しない生物間を識別することができるからである。
本発明のアッセイは、同じ反応混合物における様々なプライマー対による2以上の標的配列の同時増幅を目的とする多重アッセイを含む。多重アッセイの場合には、各種プライマーを分析して、2つのアンプリコン間の、並びに1つのプライマー対と他のプライマー対由来のアンプリコンとの間の望ましくないクロスハイブリダイゼーションが明らかなケースを排除することが推奨される。多重アッセイのためには、全制限プライマーの濃度調整融解温度、Tm[0] Lが、全余剰プライマーの濃度調整融解温度、Tm[0] Xに等しいか、またはそれより高くなければならない。好ましくは、多重増幅の線形期をストリンジェントな条件下で実施することにより、偽プライミングを最小限にする。図10は、本発明の多重アッセイの結果を示す。2つの個別のアンプリコンをHEX-A遺伝子から合成した。一方の標的配列は、1278突然変異の部位を含んでいた。他方の標的配列は、1421突然変異の部位を含んでいた。異なる標識付けした(一方はTET、他方はFAM)分子ビーコンプローブを用いて、2つのアンプリコンをリアルタイムでモニタリングした。図10における2つの蛍光プロット(曲線101および曲線102)は、両標的ともうまく増幅されたことを示している。
LATE-PCR増幅における1以上の一本鎖産物を二本鎖産物に再び変換するのが望ましい場合もある。これは、「低Tmプライマー」を反応に含有させることにより達成することができる。「低Tmプライマー」は、反応後期の熱サイクルに含まれる追加段階の間に、温度がこのプライマーのTm[0]値より低く降下してから、ゆっくりと上昇して、該プライマーを伸長させる、従って、蓄積した一本鎖分子を二本鎖DNAに再変換させるとき初めて、その相補的配列とハイブリダイズする。変換の最初の試みが不十分であることがわかった場合には、低温段階で費やす時間を短縮する、および/または低温からの温度の上昇速度を遅くすることができる。あるいは、反応を停止する前、もしくは次の熱サイクルの融解段階まで反応を続行する前に、上下の温度振動、例えば、45℃−72℃−45℃−72℃を数回行うことができる。本発明のこの実施形態の態様は、蓄積一本鎖産物内の配列(その5’末端または付近ではなく)とハイブリダイズすることができる「低Tmプライマー」を設計することを目的とする。この場合、「低Tmプライマー」の3’である一本鎖の部分だけを二本鎖に変換する。この反応の産物鎖は、初期余剰プライマーを用いて追加の切断型一本鎖を合成するための基質になることができる。
アッセイに加えて、LATE-PCRを用いて、あらゆる目的のための一本鎖産物を合成することができる。このような目的の1つに、続く配列決定方法のために出発材料を生産することがある。別の目的は、ハイブリダイゼーションプローブ、例えば、in situハイブリダイゼーションプローブとして用いるための一本鎖オリゴヌクレオチドの生産である。
対称PCR増幅は約50サイクル後にプラトーになって、停止する傾向があるのに対し、本発明の増幅は75サイクル以上にわたって一本鎖アンプリコンを生成し続ける。しかし、本発明者らは、いくつかの例で、熱サイクルが高レベルのストリンジェンシーで維持されなければ、ある特定の標的の増幅中に蓄積する一本鎖分子が相互作用し、「進化する」傾向があることをみいだした。次に、こうして得られた「誘導体分子」を二本鎖分子として増幅する。本発明者らはこれを「産物進化」と呼ぶ。産物進化は、ハイブリダイゼーションプローブ(例えば、分子ビーコン)の使用により一貫して観察されるわけではない。何故なら、これらのプローブは、反応の初期一本鎖産物と、産物進化によって生成された「誘導体分子」の両方にハイブリダイズする傾向があるからである。しかし、産物進化の過程は、SYBR(商標登録)Green(配列とは無関係に二本鎖分子を染色する)を使用し、得られた産物の融点分析により検出および分析することができる。産物進化は、増幅した産物の電気泳動によりさらに分析することができる。
a)アニーリング温度を高めることにより、プライマー、特に余剰プライマーのハイブリダイゼーションを制限する、
b)伸長温度をDNAポリメラーゼの最適条件よりはるかに高くまたは低くする、
c)DNAポリメラーゼの濃度を低下させる、
d)余剰プライマーの濃度を低下させる、
e)低温検出段階を用いるアッセイにおいて、その段階を最小限の時間に制限した後、融解温度への急勾配を形成することにより、ミスマッチの部位で起こりうるプライマー伸長を最小限にする。
相補的オリゴヌクレオチドの濃度調整融解温度、Tm[0] COは、Tm[0] Xより少なくとも3℃低いはずである。これは、余剰プライマーに対して相補的オリゴヌクレオチドの濃度を低下させるか、あるいは、余剰プライマーに対して相補的オリゴヌクレオチドの長さまたは配列を改変するかにより達成することができる。しかし、相補的オリゴヌクレオチドの濃度を余剰プライマーの濃度より高く維持し、反応温度がTm[0] COより低い温度に降下したら、大部分の余剰プライマー分子が相補的オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズするようにするのが最も望ましい。従って、余剰プライマーに対して相補的オリゴヌクレオチドを短くするか、あるいは、余剰プライマーの相補的オリゴヌクレオチド、もしくは両者を故意にミスマッチさせるのが最も望ましい。最も好ましくは、相補的オリゴヌクレオチドをその3’末端で短くすることができる。余剰プライマーが鎖複製を開始するのを阻止するために、相補的オリゴヌクレオチドの5’末端の少なくとも3つの塩基を、余剰プライマーの3’末端の3つの塩基と完全に対合させなければならない。さらに、相補的オリゴヌクレオチドの3’末端を、リン酸基のような改変によって遮断することにより、確実に相補的オリゴヌクレオチドがプライマーとして作用できないようにしなければならない。
一本鎖アンプリコンまたは多数のアンプリコンを生成するいずれの目的でLATE-PCRを実施する場合でも、一本鎖分子の不適切な相互作用を最小限にすることにより、これら分子の濃度が高くなるにつれ産物進化が起こる機会を低減することが望ましい。選択した、もしくは全線形増幅サイクルにおける、進行中の反応からの一本鎖分子の定期的捕獲および除去によって、産物の濃度を低く維持する単純かつ多用途の手段がもたらされる。一本鎖分子の捕獲および除去は、多様な装置およびフォーマットで達成することができる。例えば、LATE-PCR増幅は、「レーストラック(racetrack)」様チャンバ中で実施することができ、このチャンバの周りを反応体が繰り返し循環する。反応体がレーストラックの周囲を回転する速度は制御することができ、レーストラックの隣接部分を別々に加熱または冷却することにより、必要なパターンの熱サイクルを達成することができる。レーストラックの1セクターまたはレーストラックの数個の隣接するセクターには、1以上の一本鎖産物に相補的な1以上の配列を有する共有結合捕獲プローブを含む表面を備えることができる。低温検出段階と同様に、反応体がこれらのセクターを通過するにつれ、反応物の温度を冷却させることができる。これらの条件下で、各一本鎖分子が、その特定の捕獲プローブにハイブリダイズし、一方、二本鎖鋳型分子、並びにTaqDNAポリメラーゼ(およびその他のタンパク質)および反応混合物の小分子の全部が、レーストラック中の次のチャンバに移動する。いったん反応体がレーストラックの捕獲プローブセクターを通過してしまうと、これを隔離することができ、その温度が上昇して、一本鎖分子を放出するため、次の分析または操作のためにこれを回収する。当業者であれば、以上の原理をLATE-PCRの一本鎖産物を回収するように設計した追加のシステムおよび装置に適用できることは理解されるであろう。
対称PCRプライマーの既存のマッチした対で出発し、改変を実施して、本発明のプライマー対を達成するのではなく、本発明では、入手可能なコンピュータソフトウエアを用いて、プライマー対を設計するのが好ましい。本発明者らは、コンピュータプログラムOligo(登録商標)6.0(Oligo(登録商標)Primer Analysis Software Manual、ウインドウズ用バージョン6.0、Molecular Biology Insights, Inc. 第6版、2000年3月)を用いて、候補プライマー対を同定するのに成功した。「Nearest-Neighbor」法を用いて、候補プライマーのTm[0]を決定するために、本発明者らはエンタルピーおよびエントロピーのAllawiおよびSantaLucia(1997)値に基づく前記節に記載した式を好適に用いた。本発明者らは、β-N-アセチルヘキソサミニダーゼ(HEX-A)遺伝子のαサブユニットのエキソン11における野生型および1278+TALC対立遺伝子配列の同定のためのLATE-PCRプライマー対を設計した。これらの対立遺伝子はテイ−サックス病に関連する。突然変異対立遺伝子である、1278+TALCは、アシュクナージ系ユダヤ人集団におけるテイ−サックス保菌者の82〜90%に原因している(近年の概説では、テイ−サックス病をもっぱら扱っているAdvances in Genetics, 第44巻、DesnickおよびKaback編(2001)を参照されたい)。
ヒトβグロビンにおける特定の突然変異を検出するためのプライマーの選択によって、別のプライマー設計が達成される。プライマー配列の位置は、βサラセミアを引き起こすことが知られているIVS1-110およびコドン39突然変異の部位がアンプリコンに含まれるように選択した。各プライマーの3’末端として考えられる位置は、βグロビン遺伝子が優先的に増幅されるのを確実にするため、グロビン遺伝子ファミリーの他のメンバーに対して相同性を持たない領域に限定した。いったん予想部位を決定したら、Oligo(登録商標)6.0ソフトウェアを用いて、これらの配列を調べ、制限プライマーとして、より高いTm[1]を有するプライマー提供しそうな領域を選択するが、この場合、下方鎖配列であった。制限プライマーには50nMの濃度を選択し、考えられる様々な長さのプライマーのTm[0] Lを実施例1に記載したように決定した。同様に、1,000nMの濃度で、考えられる余剰プライマーのTm[0] Xを決定した。初めに、Tm[0] L=66℃で長さが26ヌクレオチドの制限プライマーを選択し、次に、Tm[0] X=66℃で長さが28ヌクレオチドの余剰プライマーを選択した。その際、Tm[0] Xは81℃のTm A(191塩基対、52.4%GCのアンプリコン)より15℃低い。最初に選択した制限プライマーの5’末端付近に1つのAからのGへの改変を含み、その長さを30ヌクレオチドまで増加することにより、本発明者らはTm[0] L=72℃の最終制限プライマーを得た。
(Tm[0] L−Tm[0] X)および(Tm A−Tm[0] X)について本明細書に記載した基準は、単独で、ならびに、組み合わせて、PCR増幅に対する明白な作用を有する。本発明者らは、嚢胞性繊維症の最も一般的原因であるΔ508突然変異を取り囲むゲノム配列を増幅するためのプライマー(「CFTR」プライマーと称する)を用いて、特定の作用を証明した。この実施例で報告する試験のために、本発明者らは、以下の表VIに記載するものの中から制限プライマーおよび余剰プライマーを使用した。表VIは、各プライマーについて、そのヌクレオチド配列、並びに50nMの制限プライマー濃度および1,000nMの余剰プライマー濃度についてのそのTm[0]を記載する。余剰プライマーの伸長により生成された一本鎖アンプリコンに対するハイブリダイゼーションプローブを用いる試験では、本発明者らは、一末端をクエンチャー(quencher)で、また他末端を発蛍光団で改変した分子ビーコンを用いたが、これは下記の配列を有する:5'FAM-CGCGCTTATCATCTTTGGTGTTTCCTATAGCGCG-Dabcyl 3'(配列番号9)(ここで、各末端の6つのヌクレオチド(下線部)は、ステムを形成することから、従って、これらを用いて、Tm[0] Pを計算しなかった)。このプローブのTm[0] Pは56℃であり、これは、3mMマグネシウム、600nM分子ビーコンおよび600nM標的を含む条件下で経験的に測定した。
公開されている遺伝子配列に基づく嚢胞性繊維症遺伝子のΔF508対立遺伝子のためのPCRプライマーのセットと分子ビーコンプローブを設計した(Riordanら (1989) "Identification of the Cystic Fibrosis Gene: Cloning and Characterization of the Complementary DNA", Science 245: 1006-73)。プライマーおよび分子ビーコン配列は以下の通りであった:
上方プライマー:5'-CCTGGATTATGCCTGGCACCAT-3'(配列番号7)
下方プライマー:5'-CCTGATGACGCTTCTGTATCTA-3'(配列番号8)
分子ビーコンプローブ:
5'-TET-CGCGCTAAAATATCATTGGTGTTTCCTAAGCGCG-DABCYL-3'(配列番号23)(ここで、プローブにおいて下線を引いた末端配列はヘアピンステムを形成する)。
LATE-PCRはTm[0] XとTm Aの差も考慮に入れる。Tm AはTm[0] Xより高いが、これら2つの値の差が大きすぎると、生成される一本鎖産物の量が少なくなる。これについての実験結果を表VIIIおよび図6に示す。本発明者らは、これを(Tm[0] L−Tm[0] X)=0℃のCFTRプライマー対を用いて証明する。しかし、これらの値は反復サンプルの各セットで異なり、Tm Aに対して変動する。SYBR(登録商標)Greenではなく、600nMの濃度で添加した分子ビーコンプローブを用いて、図3に記載したようにPCR増幅混合物を調製した。熱サイクルプロファイルも同じであるが、ただし、最初の25サイクルは、アニーリングがTm[0] Lより2℃低く、次に、追加の50サイクルでは52℃に移行することにより、すべてのサンプルについて同等の条件下で分子ビーコン蛍光をモニタリングする。
着床前遺伝子診断(PGD)の際にヒト嚢胞性繊維症遺伝子の正常およびΔF508対立遺伝子の検出に用いるためのLATE-PCR試薬を設計した。このキットはモジュール式である。すなわち、1つのパッケージにDNAポリメラーゼを、もう1つのパッケージにその他すべての試薬および材料を含んでいる。プライマーとプローブは一緒になってオリゴヌクレオチドセットを構成し、これは個別の製品として市販できることが理解されよう。上記キット、その使用、および上記キット(「CFΔF508 Kit」と称する)を用いて実施するアッセイについては、キット付属の製品挿入物に明記されるフォーマットで、この実施例で説明する。
10アッセイキット
in vitro診断用途に限る
重要:この試験を始める前に指示内容をすべて読むこと
意図される用途
CFΔF508 Kitは、1または複数の有核二倍体ヒト細胞が遺伝子的にホモ接合正常(正常/正常)、ヘテロ接合(正常/ΔF508)、もしくはホモ接合異常(ΔF508/ΔF508)であるか否かを明らかにするように設計されている。これらの決定は、1以上の細胞、または該細胞に由来するDNAを回収および試験することにより、in vitroで実施する。このような試験から得た情報を用いて、個体の生活、もしくはその個体の健康管理に関する判断を下すことができる。例えば、ヒト胚からの単一細胞、または胎児の細胞に対し実施した試験結果は、将来の両親が特定の胚を移植すべきか否か、または妊娠の停止を考慮すべきか否かを決定する助けとなりうる。別の例では、個体の遺伝子型に関する生後の情報を用いて、その個体の健康管理および生活様式を最適化するのに役立てることができる。
嚢胞性繊維症(CF)は、白人集団において最も一般的な遺伝病であり、その発生率は2,500件の出産につき約1件の割合である(Welshら、1995)。これは、肺およびその他の組織においてクロライドチャネルとして機能するCF遺伝子内の突然変異によって起こる状態である。CF遺伝子内の突然変異は、軽度から生命を脅かす程度までの広範な表現型を有する。CF遺伝子内の3塩基対欠失(ΔF508と呼ばれる)は、CF症例の約70%の原因であり、この疾患の重篤な症状を引き起こす。その結果、嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節タンパク質(CFTR)の508位でフェニルアラニンの欠失が起こり、このエラーがポリペプチド鎖の正常なプロセシングおよび上皮細胞の頂膜への輸送を妨害する(Chengら、1990)。単一細胞におけるΔF508の最初の試験は、プライマーシフトPCRを用いて必要な配列を増幅した後、制限酵素消化(Coutelleら、1989)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション(Wuら、1993)、もしくはヘテロ二本鎖形成(Liuら、1993;Avnerら、1994)のいずれかにより最終産物を確認する。CFに関するPGDの最初の臨床報告書では、PCR産物のヘテロ二本鎖分析も使用されていた(Handysideら、1992;Verlinskyら、1992;Aoら、1996)。さらに近年のPCRアッセイは、蛍光標識したプライマーを用いて感度を高め、対立遺伝子脱落(ADO)(ヘテロ接合細胞からの一対立遺伝子を増幅しそこなうこと)率を低減する(Findlayら、1995;Verlinsky およびKuliev, 2000;Goossens ら、2000)。この手法を使用する場合には、PCR増幅終了後、蛍光標識した産物を分離し、キャピラリー電気泳動により同定する。
本キットは、分子ビーコンとして知られる蛍光標識DNAプローブを利用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の改変された形態1,2(以後、LATE-PCRと呼ぶ)により増幅される特定のDNA配列を検出する。本キットは、2つの特定の分子ビーコンプローブを含むが、1つは黄色の蛍光を発して、CTFR遺伝子の正常な対立遺伝子にハイブリダイズするように構成され、もう1つは、赤色の蛍光を発して、CTFR遺伝子のΔF508対立遺伝子にハイブリダイズするよう構成されている。各分子ビーコンプローブは、長さが6塩基対のステムを有し、その特異的標的配列の存在下でしか蛍光を発しない。分子ビーコンプローブの蛍光を阻止するには、単一のヌクレオチドミスマッチで十分である。LATE-PCR反応は、両鎖の対称的増幅で開始し、一本鎖の線形増幅に突然移行する。蓄積してきた標的鎖のコピーはすべて一本鎖であるため、これらは容易に分子ビーコンプローブで検出される。これらの特徴により、高いシグナル対ノイズ比が達成され、アッセイの感度および精度を高める。
CFΔF508 Kit試験キットの内容物は、10個の個別サンプルの分析を実施するのに十分なものであり、各サンプルは1〜10,000個の細胞を含む。サンプル(対照サンプルも含む)はすべて、同じ日に調製しなければならない。管または試薬を再凍結または再使用してはならない。未使用の材料は廃棄すること。
細胞溶解バッファーを含むサンプル反応管10本
無細胞対照反応管2本
ΔF508についてのヘテロ接合DNAを含む陽性対照反応管2本
反応管用の交換キャップ16個
反応管の支持台
PCRバッファー管(235μl)1本
細胞洗浄バッファー60ml
最終洗浄バッファー30ml
滅菌ホールピペット12個
細胞サンプル識別のための用紙
使用済反応管の廃棄袋
マイクロマニピュレータまたは単一細胞もしくはその他の微小サンプルを摘み上げるための別の装置を備えた倒立顕微鏡または解剖顕微鏡
蛍光検出:(ABI PRISM 7700または同等物)を備えるサーマルサイクラー
層流フードまたは非循環収納フード
0.2ml管用テーブルトップ微小遠心分離装置
細胞単離および管に移すための微量ピペットもしくはその他の装置
滅菌ペトリ皿
無粉手袋
実験衣、外科マスクおよびキャップ
ピペット装置およびフィルター付き滅菌ピペットチップ
Platinum TaqDNAポリメラーゼ(Invitrogen)[個別のキットモジュール]
CFΔF508 Kit試薬を非霜防止冷凍庫(−20℃)内に保存する。解凍および凍結を繰り返さない。保存中PCRバッファー管を光への暴露から保護する。管およびビンは清潔な無粉手袋で扱う。
実験室in vitro診断用途に限る
*試験の構成要素は、指示書きに記載されている以外の目的に用いてはならない。
*構成要素の不適切な取扱いにより、サンプルの汚染および誤った診断を招く可能性がある。
*試薬の不適切な保存により、反応が影響を受け、サンプルの診断が妨害される。
*箱に記されている期限を過ぎた封入試薬は用いない。
CFΔF508 Kitは、汚染の危険性を最小限にするよう設計されている。以下に示すステップを実施することにより、この危険性を許容可能な低レベル*に維持することを確実にしなければならない。開口している反応管およびPCRバッファー管は、層流フードまたは非循環収納フード内でしかあけてはならない。
*使用前に10%漂白剤で表面処理するか、または紫外線で滅菌する。
*清潔な実験衣、外科マスク、キャップおよび無粉手袋を着用する。
*キットの全構成要素の取扱いは、必ず手袋をつけた手で行う。
*手袋で、ヒト細胞またはDNAで汚染されている可能性がある物体(例えば、処理した部位の外側表面)に触れた後は、必ず手袋を取り替えなければならない。
*意図しない細胞をアッセイ管に移すことがないよう、厳重に注意しなければならない。このような細胞は、LATE-PCR増幅の鋳型および分子ビーコンの蛍光をもたらす可能性がある。
*PCR装置専用のピペット装置を用い、他の目的には使用しない。
*フィルター付きの滅菌ピペットチップを用いる。
*1回使用したら直ちにピペットチップを廃棄する。
*使用済のピペットチップを反応管またはPCR試薬管に絶対再導入しない。
*PCRは、細胞生検およびサンプル調製とは離れた場所で実施しなければならない。
*PCR増幅後の熱サイクラーから取り出した以後は反応管を絶対あけてはならない。管をあけると、DNA含有エーロゾルが放出し、これが実験室を汚染し、後に続くすべてのアッセイを危険にさらす恐れがある。
*使用済反応管は廃棄袋に入れ、完全に密閉してから、地方、州もしくは連邦の規定に従って適切に処分する。法律で要求される場合にのみ、廃棄物をオートクレーブで処理する。オートクレーブ処理が必要な場合には、サンプル調製またはPCRに使用した実験室内またはその付近で実施してはならない。
生検前準備
ステップA:2本の無細胞対照反応管と10本のサンプル反応管を含む支持台を氷上に配置する。解凍が完了したら、すべての管を短時間遠心分離して、確実に液体内容物が底部にあるようにする。管を氷上に戻し、支持台の適正な位置に配置する。この時点では、すべての反応管を密閉状態に維持する。
ステップD:非胚細胞の転移がないよう注意を払わなければならない。特に、PGDのための胚生検の場合には、生検を開始する前に、胚の周囲もしくはこれに付着する精子または丘細胞を可能な限り完全に除去しなければならない。確立された方法(例えば、直接吸引3、透明帯穿孔と吸引4、透明帯穿孔と置換5、もしくはレーザーによる透明帯穿孔と吸引6など)のいずれかを用いて、胚の生検を実施する。各胚から1または2つのインタクトな割球を単離しなければならない。生検中または後の洗浄段階で損傷した割球を診断に使用してはならない。
ステップF:ホールピペットを用いて、少量の最終洗浄バッファー中の割球もしくはその他のタイプの細胞をつまみ上げる。吸引された液体は、ピペットの先端から上方に1cmを超えてはならない。その割球用であることが明示されているサンプル反応管をあけ、キャップを滅菌表面に載せる。キャップの内側部分には触れないようにする。細胞を含むホールピペットの先端をサンプル反応管内のバッファーに直接入れ、ピペットの内容物を排出する。管を閉じる。管の側面に泡または泡の水滴が存在する場合には、サンプルを手早く(数秒)遠心分離する。割球を添加したらすぐに、サンプル反応管を氷上に配置する。サンプルはステップIまで氷上に保持しなければならない。サンプルを室温で放置すると、最適に満たない反応が起こり、正確な診断が妨げられるため、室温で放置してはならない。
ステップJ:[ホットスタート(Hotstart)によるLATE-PCR]
4.8μlのPlatinum Taq DNAポリメラーゼ(5単位/μl)をPCRバッファー管に添加し、入念に混合することにより、酵素の均一分布を確実にする。
ステップM:[推奨されるサイクルパラメーター]
蛍光検出器を備えるサーマルサイクラー中に管を導入する。下記のプログラムは、ABI PRISM 7700配列検出器(Applied Biosystems)に基づくものである:
段階1:95℃、3分(1回)
段階2:95℃、10秒;55℃、30秒;72℃、30秒(25回)
段階3:95℃、10秒;52℃、30秒;72℃、30秒(35回)
52℃工程の間にFAMおよびTETについて蛍光捕捉を設定する。
サンプル量を25μlに設定する。
使用するブロック位置、および正確なサンプル識別内容においてタイプを選択する。
以下の記載事項は、ABI PRISM 7700配列検出器(Applied Biosystems)に適しているが、その他の装置に適したパラメーターは現在のところまだわかっていない。ABI 7700の分析ウインドウにおける各リポーター染料(FAMおよびTET)について、閾値:200単位と、段階3のサイクル3でのベースライン開始およびサイクル13での停止(反応全体のサイクル28および37)を設定する。これらの値を用いて、各サンプルでの蛍光検出についての閾値サイクル(CT)を計算する。
CFΔF508 Kitは、Platinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)およびABI PRISM 7700配列検出器(Applied Biosystems)を用いるように設計されている。ホットスタートを含む別のDNAポリメラーゼもしくは蛍光検出器を含むその他のサーマルサイクラーの使用も可能ではあるが、胚からの細胞を試験する前に、ユーザによる最適化が必要である。このキットは、CFTR遺伝子の該当領域におけるΔF508突然変異対立遺伝子配列と正常対立遺伝子配列を識別するように設計されている。このキットを用いて、CFTR遺伝子におけるその他の突然変異を検出することはできない。
1Tyagi, S.およびKramer, F. R. (1996) Nature Biotechnology 14, 303-308
2Piatekら (1998) Nature Biotechnology 16, 359-363
3Wilton, L. J.およびTrounson, A.O. (1989) Biology of Reproduction 40,145-152
4Hard, K.ら (1990) Human Reproduction 5,708-714
5Pierce, K. E.ら (1997) Human Reproduction 12, 351-356
6Boadaら (1998) J. Assist Reprod Genet 15,302-307
反応管
Perkin Elmer製の0.2ml光学管(Pt#N801-0933)光学キャップ(Pt#N801-0935)付き
細胞溶解バッファーの組成(サンプルおよび無細胞反応管):
100μg/mlプロテイナーゼK(Roche Molecular Biochemicals)
5μMドデシル硫酸ナトリウム
10mM Tris、pH8.3(トリズマプリセットクリスタル、Sigma)
分子グレード水
正常/Δ508対照反応管に含まれるサンプルの組成:
CF遺伝子のΔ508対立遺伝子についてヘテロ接合のヒトDNA60ピコグラム
5μMドデシル硫酸ナトリウム
10mM Tris、pH8.3(トリズマプリセットクリスタル、Sigma)
最終容量10マイクロリットルまでの分子グレード水
細胞洗浄バッファーの組成:
Ca++またはMg++を含まないリン酸緩衝食塩水(Sigma, カタログ No. D-8537)
0.1%ポリビニルピロリドン(Sigma, カタログ No.PVP-40)
最終洗浄バッファーの組成:
カルシウムまたはマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水
0.01%ポリビニルピロリドン
PCRバッファーの組成:
1.67×PCRバッファー(Invitrogen)
6.75mM MgCl2
各々0.42mMの4つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dCTP、dTTP、dATP、dGTP)
0.083μM制限プライマー
1.67μM余剰プライマー
1.0μMの各分子ビーコン(合計2)
最終容量235マイクロリットルまでの分子グレード水
CFプライマー:
制限:5'CCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3' [配列番号7]
余剰:5'CCTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3' [配列番号24]
正常対立遺伝子分子ビーコン:
5' FAM - CGCGCTTATCATCTTTGGTGTTTCCTATAGCGCG - Dabcyl 3'[配列番号9]
Δ508対立遺伝子分子ビーコン:
5'TET-CGCGCTAAAATATCATTGGTGTTTCCTAAGCGCG-Dabcyl 3'[配列番号23]
Claims (93)
- デオキシリボ核酸(DNA)増幅標的配列、1対のPCRプライマー、dNTP、および耐熱性ポリメラーゼを含有するPCR反応混合物を、鎖融解、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のPCR段階からなる熱サイクルに繰り返し供することを含んでなる非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅方法であって、増幅の開始時に、(a)前記反応混合物が最大1,000,000コピーまでの増幅標的配列を含有すること、(b)PCRプライマー対が制限プライマーと余剰プライマーを含み、その際制限プライマーは最大200nMまでの濃度で存在し、余剰プライマーは制限プライマーより少なくとも5倍高い濃度で存在すること、(c)制限プライマーの初期の濃度調整融解温度が、余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度に等しいか、またはそれより高いこと、(d)制限プライマーが前記標的配列に対し完全には相補的でない場合は、前記標的配列とハイブリダイズする制限プライマーの部分の濃度調整融解温度が、余剰プライマーの濃度調整融解温度より5℃以下低いこと、(e)余剰プライマーの伸長により生成されたアンプリコンの融解温度が、余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度を18℃以下上回ること、(f)制限プライマーの消耗後に、余剰プライマーを用いる線形増幅の複数サイクルを含めるのに十分な回数、熱サイクルを繰り返すこと、を特徴とする方法。
- 少なくとも2つの標的配列のための請求項1に記載の方法であって、前記反応混合物が各標的に対し1対のPCRプライマーを含有すること、全ての制限プライマーの初期の濃度調整融解温度が、全ての余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度に等しいか、またはそれより高いことを特徴とする方法。
- リボ核酸(RNA)分子を逆転写して前記DNA標的配列を生成させることをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記反応混合物が50,000コピーまでの核酸標的を含有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 制限プライマーの初期の濃度調整融解温度が、余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも3℃高い、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- アンプリコンの融解温度が、余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度より7〜15℃高い、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応混合物が1000コピーまでのDNA標的を含有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- プライマーアニーリング段階の持続時間が30秒より長くならない、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 余剰プライマーの一本鎖の伸長産物を二本鎖の産物に変換する少なくとも1回の最終熱サイクルをさらに含み、その際、PCR反応混合物は、余剰プライマーの伸長産物をプライミングすることができかつ余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも5℃低い初期の濃度調整融解温度を有する低温プライマーをさらに含有し、またその際、アニーリング温度を低温プライマーの初期の濃度調整融解温度より高く維持するが、少なくとも1回の最終熱サイクルにおいては、低温プライマーをハイブリダイズさせるためにアニーリング温度を下げる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 低温プライマーの初期の濃度調整融解温度が、余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも10℃低い、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応混合物が余剰プライマーの3’末端にハイブリダイズする相補的オリゴヌクレオチドをさらに含有し、相補的オリゴヌクレオチドが余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも3℃低い初期の濃度調整融解温度を有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 相補的オリゴヌクレオチドが、開始時に、余剰プライマーの濃度より高い濃度で存在する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- デオキシリボ核酸(DNA)増幅標的配列、1対のマッチした制限PCRプライマー、追加の余剰プライマー、dNTP、および耐熱性ポリメラーゼを含有するPCR反応混合物を、鎖融解、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のPCR段階からなる熱サイクルに繰り返し供することを含んでなる非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法であって、マッチしたPCRプライマーが最大200nMまでのほぼ等モル濃度で存在すること、余剰プライマーが制限プライマーより少なくとも5倍高い濃度で存在すること、余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度が制限プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも5℃低いこと、また、この反応は第1期と第2期を含んでなり、第1期ではアニーリング温度が余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度より高く、マッチした制限プライマーが第1のアンプリコンを生成し、第2期ではアニーリング温度が下げられ、余剰プライマーが、第1のアンプリコンを鋳型として使用して、第1のアンプリコンより短い第2のアンプリコンを生成すること、ここにおいて、第2のアンプリコンの融解温度が余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度を25℃以下上回ること、を特徴とする方法。
- 余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度が制限プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも10℃低い、請求項13に記載の方法。
- 第2のアンプリコンの融解温度が余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度を18℃以下上回る、請求項13または14に記載の方法。
- 一本鎖アンプリコンの分離を伴う非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法であって、
a) DNA増幅標的配列、前記増幅標的配列のための1対のPCRプライマー、dNTP、および耐熱性DNAポリメラーゼを含有するPCR反応混合物を、鎖融解、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のPCR段階からなる熱サイクルに繰り返し供すること、ここにおいて、(i)前記PCRプライマーの対は制限プライマーと余剰プライマーを含み、(ii)制限プライマーは最大200nMまでの濃度で存在し、余剰プライマーは制限プライマーより少なくとも5倍高い濃度で存在し、(iii)制限プライマーの初期の濃度調整融解温度は余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度に少なくとも等しく、(iv)制限プライマーの消耗後に、余剰プライマーを用いる線形増幅の複数サイクルを含めるのに十分な回数、熱サイクルを繰り返すこと、
b) 少なくとも数サイクルの線形増幅の間、プライマー伸長段階の後に、余剰プライマーの一本鎖伸長産物を、捕捉プローブに前記産物をハイブリダイズさせることで反応混合物から分離すること、
を含んでなる方法。 - 前記捕捉プローブが熱的に隔離された産物分離ゾーンにあり、前記分離段階が反応混合物を前記ゾーンに通すことを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記産物分離ゾーンが少なくとも1つの反応ゾーンから物理的に隔離可能であり、前記産物分離ゾーンを定期的に隔離して、反応混合物が少なくとも1つの反応ゾーンにある間に、前記捕捉プローブにハイブリダイズされた産物を回収することをさらに含む、請求項16または請求項17に記載の方法。
- 制限プライマーの初期の濃度調整融解温度が余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも3℃高い、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
- アンプリコンの融解温度が余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度を18℃以下上回る、請求項16〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 余剰プライマーが500〜2000nMの濃度で存在し、かつ制限プライマーより少なくとも10倍高い濃度で存在する、請求項16〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を用いて少なくとも1つのDNA増幅標的配列を検出するための均一アッセイ法であって、(a) 少なくとも1つのDNA増幅標的配列、耐熱性DNAポリメラーゼ、dNTP、前記増幅標的配列を増幅するための各増幅標的配列に対し1対のPCRプライマー、および前記プライマーにより生成されたアンプリコンにハイブリダイズする少なくとも1つの標識ハイブリダイゼーションプローブを含有するPCR反応混合物を、鎖融解、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のPCR段階からなる熱サイクルに複数回供すること、(b) 少なくとも1つの前記増幅標的配列の存在を示すものとして少なくとも1つの前記プローブにより生じたシグナルを検出することを含んでなり、その際、(i)各PCRプライマー対は制限プライマーと余剰プライマーを含み、(ii)制限プライマーは最大200nMまでの濃度で存在し、各プライマー対において、余剰プライマーは制限プライマーの濃度より少なくとも5倍高い濃度で存在し、(iii)全ての制限プライマーの初期の濃度調整融解温度は、全ての余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度に少なくとも等しく、(iv)各プライマー対において、アンプリコンの融解温度は余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度を25℃以下上回り、(v)制限プライマーの消耗後に、余剰プライマーを用いる線形増幅の複数サイクルを含めるのに十分な回数、熱サイクルを繰り返し、(vi)前記プローブは、制限プライマーの伸長産物とハイブリダイズするプローブ、および余剰プライマーの伸長産物とハイブリダイズしかつハイブリダイズしたときシグナルを発するプローブからなる群より選択され、(viii)前記プローブはプライマーアニーリングのPCR段階の間に前記アンプリコンとハイブリダイズする、ことを特徴とするアッセイ法。
- 検出段階がエンドポイント検出である、請求項22に記載のアッセイ法。
- 検出段階がリアルタイム検出であり、少なくとも数サイクルの線形増幅のアニーリング段階の間に行われる、請求項22に記載のアッセイ法。
- 検出段階がリアルタイム検出であり、少なくとも数サイクルの線形増幅の伸長段階の後で、次のサイクルの鎖融解の前に行われる、請求項22に記載のアッセイ法。
- プライマーアニーリング段階の持続時間が30秒より長くない、請求項22〜25のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 各プライマー対において、アンプリコンの融解温度が余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度を18℃以下上回る、請求項22〜26のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 各プライマー対において、制限プライマーの初期の濃度調整融解温度が余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも3℃高い、請求項22〜27のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 前記反応混合物が最大50,000までの少なくとも1つの増幅標的配列を含有する、請求項22〜28のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 少なくとも1つの前記ハイブリダイゼーションプローブが、制限プライマーの伸長産物とハイブリダイズしかつ余剰プライマーの伸長の間にポリメラーゼによって加水分解されて検出可能なシグナルを発する二重標識蛍光プローブである、請求項22〜29のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 少なくとも1つの前記ハイブリダイゼーションプローブが、余剰プライマーの伸長産物とハイブリダイズしたとき検出可能なシグナルを発する、請求項22〜29のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 少なくとも1つのPCRプライマー対において、前記反応混合物が余剰プライマーの3’末端にハイブリダイズする相補的オリゴヌクレオチドをさらに含有し、相補的オリゴヌクレオチドが余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも3℃低い初期の濃度調整融解温度を有する、請求項31に記載のアッセイ法。
- 相補的オリゴヌクレオチドが、開始時に、余剰プライマーの濃度より高い濃度で存在する、請求項32に記載のアッセイ法。
- 少なくとも1つの前記ハイブリダイゼーションプローブが、1つの対立遺伝子変異体のための第1のプローブおよび別の対立遺伝子変異体のための第2のプローブを含む、請求項22〜33のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 前記DNA標的配列を生成するためのリボ核酸(RNA)分子の逆転写をさらに含む、請求項22〜34のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 少なくとも1つの前記増幅標的配列が少なくとも2つの増幅標的配列を含む、請求項22〜35のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を用いて少なくとも1つのDNA増幅標的配列を検出するための均一アッセイ法であって、(a) 少なくとも1つのDNA増幅標的配列、耐熱性DNAポリメラーゼ、dNTP、前記増幅標的配列を増幅するための各増幅標的配列に対し1対のPCRプライマー、および前記プライマーにより生成されたアンプリコンにハイブリダイズする少なくとも1つの標識低温ハイブリダイゼーションプローブを含有するPCR反応混合物を、鎖融解、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のPCR段階からなる熱サイクルに複数回供すること、(b) 少なくとも1つの前記増幅標的配列の存在を示すものとして少なくとも1つの前記プローブにより生じたシグナルを検出することを含んでなり、その際、(i)各PCRプライマー対は制限プライマーと余剰プライマーを含み、(ii)各制限プライマーは最大200nMまでの濃度で存在し、各プライマー対において、余剰プライマーは制限プライマーの濃度より少なくとも5倍高い濃度で存在し、(iii)各増幅標的配列において、低温ハイブリダイゼーションプローブは余剰プライマーの伸長産物と結合しかつハイブリダイゼーション時に検出可能なシグナルを発し、(iv)各増幅標的配列において、低温ハイブリダイゼーションプローブの初期の濃度調整融解温度は、制限プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも5℃低く、(v)制限プライマーの消耗後に、余剰プライマーを用いる線形増幅の複数サイクルを含めるのに十分な回数、熱サイクルを繰り返し、(vi)前記低温プローブがハイブリダイズしてシグナルを発するのに十分低い温度で検出を行う、ことを特徴とするアッセイ法。
- 低温ハイブリダイゼーションプローブの初期の濃度調整融解温度が、制限プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも10℃低い、請求項37に記載のアッセイ法。
- 各プローブが前記反応混合物中に少なくとも1μMの濃度で存在する、請求項37または38に記載のアッセイ法。
- 少なくとも数サイクルの線形増幅の間のプライマーアニーリングのPCR段階が、プライマーアニーリング中に低温プローブをハイブリダイズさせるために十分低温で、かつ十分な時間にわたり行われ、検出をその段階に行う、請求項37〜39のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 全ての制限プライマーの初期の濃度調整融解温度が、全ての余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度に少なくとも等しい、請求項37〜40のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- PCR増幅が少なくとも数サイクルの線形増幅の間のプライマーアニーリング後に追加の検出段階を含み、前記検出段階は低温ハイブリダイゼーションプローブがハイブリダイズしてシグナルを発するのに十分低温で、かつ十分な時間にわたり行われ、プライマーアニーリングのPCR段階は前記プローブがハイブリダイズしてシグナルを発するほど低温でなく、かつ十分な時間にわたるものでもない、請求項37〜39のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 低温ハイブリダイゼーションプローブの初期の濃度調整融解温度が、指数期の増幅反応のアニーリング段階の平均温度より少なくとも5℃低い、請求項42に記載のアッセイ法。
- 検出段階が、増幅反応の閾値サイクル前の数サイクルを開始しただけで行われる、請求項42または43に記載のアッセイ法。
- 低温検出段階が30秒以下の持続時間である、請求項37〜44のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 検出が増幅反応の完了後に行われるエンドポイント検出である、請求項37〜45のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 各プライマー対において、アンプリコンの融解温度が余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度を25℃以下上回る、請求項37〜46のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 約10,000コピーまでの核酸標的配列を含有するサンプル中に存在する前記標的配列を増幅する方法であって、
a) 核酸標的配列を第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第2のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、ここにおいて、第1のプライマーのTmは第2のプライマーのTmより少なくとも5℃高く、第2のプライマーの濃度は最大1000nMで、第1のプライマーの濃度より少なくとも約10倍高いこと、
b) 前記標的配列をポリメラーゼ連鎖反応により前記第1および第2のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅すること、ただし、前記反応はアンプリコン生成の指数期と、これに続く第2のプライマーのみを利用するアンプリコン生成の線形期とを有すること、
を特徴とする方法。 - 前記サンプルが単一の細胞に由来する核酸を含有する、請求項48に記載の方法。
- 第1のプライマーのTmが第2のプライマーのTmより10〜20℃高い、請求項48または49に記載の方法。
- 第2のプライマーの濃度が第1のプライマーの濃度より20〜100倍高い、請求項48〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 約10,000コピーまでの少なくとも1つの核酸標的配列を含有するサンプル中の前記少なくとも1つの標的配列を検出する方法であって、
a) 少なくとも1つの核酸標的配列を、それとハイブリダイズできる第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよびそれとハイブリダイズできる第2のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、ここにおいて、第1のプライマーのTmは第2のプライマーのTmより少なくとも5℃高く、第2のプライマーの濃度は最大1000nMで、第1のプライマーの濃度より少なくとも約10倍高いこと、
b) 前記少なくとも1つの標的配列をポリメラーゼ連鎖反応により前記第1および第2のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅すること、ただし、前記反応はアンプリコン生成の指数期と、これに続いて第2のプライマーのみを利用するアンプリコン生成の線形期とを有すること、
c) 第2のプライマーから生成されたアンプリコンを、それにターゲッティングされる第1のハイブリダイゼーションプローブを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応中にリアルタイムで検出すること、
を特徴とする方法。 - 前記少なくとも1つの核酸配列が対立遺伝子変異を受けやすい遺伝子配列を含み、前記第1のハイブリダイゼーションプローブが第1の対立遺伝子変異体にターゲッティングされる、請求項52に記載の方法。
- 第2のプライマーから生成されたアンプリコンを、第2の対立遺伝子変異体にターゲッティングされる第2のハイブリダイゼーションプローブを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応中にリアルタイムで検出することをさらに含む、請求項52または53に記載の方法。
- 第1のプライマーのTmが第2のプライマーのTmより10〜20℃高い、請求項52〜54のいずれか1項に記載の方法。
- 第2のプライマーの濃度が第1のプライマーの濃度の20〜100倍である、請求項52〜55のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの核酸配列が少なくとも2つの異なる核酸配列を含み、前記方法が、各核酸配列を、それとハイブリダイズできる第1のプライマーおよびそれとハイブリダイズできる第2のプライマーと接触させることを含む、請求項52〜56のいずれか1項に記載の方法。
- 検出がプライマー伸長と鎖融解のPCR段階の間に行われる、請求項52〜57のいずれか1項に記載の方法。
- 検出がプライマー伸長温度より低い温度で行われる、請求項52〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 第1のハイブリダイゼーションプローブが分子ビーコンプローブである、請求項52〜59のいずれか1項に記載の方法。
- 所定のDNA配列を非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅するための一対のプライマーを含むオリゴヌクレオチドセットであって、200nMを超えない濃度で使用することを意図した第1の量の制限プライマー、および前記制限プライマーの濃度より少なくとも5倍高い濃度で使用することを意図した、第1の量より少なくとも5倍多い第2の量の余剰プライマーを含んでなり、制限プライマーの意図した濃度調整融解温度が、余剰プライマーの意図した濃度調整融解温度に等しいか、またはそれより高いこと、前記プライマー対により生成されたアンプリコンの融解温度が、余剰プライマーの意図した濃度調整融解温度を18℃以下上回ること、を特徴とするオリゴヌクレオチドセット。
- 制限プライマーの意図した濃度調整融解温度が、余剰プライマーの意図した濃度調整融解温度より少なくとも3℃高い、請求項61に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 第2の量が第1の量より少なくとも10倍多く、余剰プライマーが制限プライマーの濃度より少なくとも10倍高い濃度で使用される、請求項61または62に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- アンプリコンの融解温度が、余剰プライマーの意図した濃度調整融解温度を7〜15℃上回る、請求項61〜63のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 所定のDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅するためのオリゴヌクレオチドセットであって、第1のアンプリコンを生成するための1対のマッチしたPCR制限プライマー、および前記第1のアンプリコンを鋳型として使用して第2の一本鎖アンプリコンを生成するための余剰プライマーを含んでなり、(i)制限プライマーのそれぞれが第1の量で存在しかつ200nMを超えない濃度で使用されること、(ii)余剰プライマーが第1の量より少なくとも5倍多い第2の量で存在し、かつ各制限プライマーの濃度より少なくとも5倍高い濃度で使用されること、(iii)余剰プライマーの意図した濃度調整融解温度が、両方の制限プライマーの意図した濃度調整融解温度より少なくとも5℃低いこと、を特徴とするオリゴヌクレオチドセット。
- 第2のアンプリコンの融解温度が、余剰プライマーの意図した濃度調整融解温度を18℃以下上回る、請求項65に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 第2の量が第1の量より少なくとも10倍多く、余剰プライマーが制限プライマーの濃度より少なくとも10倍高い濃度で使用される、請求項65または66に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 所定のDNA配列を非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅により検出する均一アッセイ法のためのオリゴヌクレオチドセットであって、200nMを超えない濃度で使用することを意図した第1の量の制限プライマー、制限プライマーの濃度より少なくとも5倍高い濃度で使用することを意図した、第1の量より少なくとも5倍多い第2の量の余剰プライマー、および余剰プライマーの伸長により生成された産物の存在を示すシグナルを発する標識ハイブリダイゼーションプローブを含んでなり、制限プライマーの意図した濃度調整融解温度が、余剰プライマーの意図した濃度調整融解温度に少なくとも等しいこと、前記アンプリコンの融解温度が、余剰プライマーの意図した濃度調整融解温度を25℃以下上回ること、を特徴とするオリゴヌクレオチドセット。
- 前記アンプリコンの融解温度が、余剰プライマーの意図した濃度調整融解温度を18℃以下上回る、請求項68に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 制限プライマーの意図した濃度調整融解温度が、余剰プライマーの意図した濃度調整融解温度を少なくとも3℃上回る、請求項68または69に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 第2の量が第1の量より少なくとも10倍多く、余剰プライマーが制限プライマーの濃度より少なくとも10倍高い濃度で使用される、請求項68〜70のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 前記プローブが余剰プライマーの伸長産物とハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションの際にシグナルを発する、請求項68〜71のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 前記プローブが第1の対立遺伝子に特異的な第1のハイブリダイゼーションプローブと第2の対立遺伝子に特異的な第2のハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項68〜72のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが分子ビーコンプローブである、請求項68〜73のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 前記プローブが意図したプローブ濃度で使用され、前記プローブの意図したプローブ濃度調整融解温度が制限プライマーの意図した濃度調整融解温度より少なくとも5℃低い、請求項68〜74のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 前記プローブの意図したプローブ濃度調整融解温度が制限プライマーの意図した濃度調整融解温度より少なくとも10℃低い、請求項68〜75のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 少なくとも1つの予め選択したDNA標的配列について均一ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを行うための試薬キットであって、第1のプライマーと第2のプライマーを含む少なくとも1対のポリメラーゼ連鎖反応プライマー、4種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、耐熱性DNAポリメラーゼ、およびハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを発する標識ハイブリダイゼーションプローブを含んでなり、
a) 第1のプライマーのTmが第2のプライマーのTmより少なくとも5℃高く、第2のプライマーの濃度が第1のプライマーの濃度より少なくとも10倍高いこと、
b) 標識ハイブリダイゼーションプローブが第2のプライマーの伸長産物と結合すること、
を特徴とするキット。 - 第1のプライマーのTmが第2のプライマーのTmより10〜20℃高い、請求項77に記載のキット。
- 第2のプライマーの濃度が第1のプライマーの濃度より20〜100倍高い、請求項77または78に記載のキット。
- 少なくとも1つの予め選択したDNA標的配列について均一ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを行うための試薬キットであって、耐熱性DNAポリメラーゼ、dNTP、各標的配列に対し、最大200nMまでの濃度で使用される第1の量の制限プライマー、制限プライマーの濃度より少なくとも5倍高い濃度で使用される、第1の量より少なくとも5倍多い第2の量の余剰プライマー、および余剰プライマーの伸長により生成された産物の存在を示すシグナルを発する標識ハイブリダイゼーションプローブを含んでなり、ここにおいて、制限プライマーの初期の濃度調整融解温度が、余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度に少なくとも等しいこと、アンプリコンの融解温度が余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度を25℃以下上回ること、を特徴とするキット。
- 少なくとも2つの標的配列について多重アッセイを行うためのキットであり、全ての制限プライマーの初期の濃度調整融解温度が、全ての余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度に少なくとも等しい、請求項80に記載のキット。
- 制限プライマーの初期の濃度調整融解温度が、余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも3℃高い、請求項81または82に記載のキット。
- 前記プローブが余剰プライマーの伸長産物とハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションの際にシグナルを発する、請求項80〜82のいずれか1項に記載のキット。
- 少なくとも1つの標的のための前記プローブが、1つの対立遺伝子変異体のための第1のプローブと第2の対立遺伝子変異体のための第2のプローブとを含む、請求項80〜83のいずれか1項に記載のキット。
- 前記プローブの初期の濃度調整融解温度が、制限プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも5℃低い、請求項80〜84のいずれか1項に記載のキット。
- 前記プローブの初期の濃度調整融解温度が、制限プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも10℃低い、請求項85に記載のキット。
- 少なくともいくつかのPCRサイクルのプライマーアニーリング後に検出段階を行うことを明記し、制限プライマーのアニーリングに用いる1以上のアニーリング温度を指定する使用説明書をさらに含み、その際、前記プローブの初期の濃度調整融解温度が前記1以上のアニーリング温度の平均より少なくとも5℃低い、請求項85に記載のキット。
- 前記プローブの初期の濃度調整融解温度が前記1以上のアニーリング温度の平均より少なくとも10℃低い、請求項87に記載のキット。
- 前記アンプリコンの融解温度が余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度を18℃以下上回る、請求項80〜88のいずれか1項に記載のキット。
- 前記アンプリコンの濃度調整融解温度が余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度を7〜15℃上回る、請求項89に記載のキット。
- 少なくとも1つの予め選択したDNA標的配列について均一ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを行うための試薬キットであって、耐熱性DNAポリメラーゼ、dNTP、各標的配列に対し、第1のアンプリコンを生成するための1対のマッチしたPCR制限プライマー、第1のアンプリコンを鋳型として利用して第2の一本鎖アンプリコンを生成するための余剰プライマー、および第2のアンプリコンの存在を示すシグナルを発する標識ハイブリダイゼーションプローブを含んでなり、ここにおいて、制限プライマーは最大200nMまでの濃度で第1の等モル量で使用するものであること、余剰プライマーは制限プライマーの濃度より少なくとも5倍高いの濃度で、かつ第1の量より少なくとも5倍多い第2の量で使用するものであること、余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度は制限プライマーの初期の濃度調整融解温度より少なくとも5℃低いこと、を特徴とするキット。
- 第2のアンプリコンの融解温度が、余剰プライマーの初期の濃度調整融解温度を25℃以下上回る、請求項91に記載のキット。
- 第2の量が第1の量より少なくとも10倍多く、余剰プライマーが制限プライマーの濃度より少なくとも10倍高い濃度で使用される、請求項91または92に記載のキット。
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