ES2289156T3

ES2289156T3 - Molecula de anticuerpo anti-cd28 biespecifica.

Info

Publication number: ES2289156T3
Application number: ES02779543T
Authority: ES
Inventors: Gundram Jung
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-11-12
Filing date: 2002-11-09
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2022-11-09
Also published as: US7538196B2; EP1444268A2; AU2002342896A1; WO2003042231A2; EP1444268B1; CA2505342A1; DE10156482A1; WO2003042231A3; CA2505342C; ATE364633T1; US20050244416A1; DE50210328D1

Abstract

Molécula de anticuerpo biespecífica recombinante, con un primer punto de unión para el receptor CD28 de las células T, y un segundo punto de unión para un antígeno de la superficie celular asociado a un tumor, en donde los dominios variables de la correspondiente cadena pesada (VH de los dos puntos de unión entre sí, están unidos mediante un engarce peptídico, el cual contiene la secuencia de aminoácidos Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Pro-Leu-Ala-Pro-Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 2).

Description

Molécula de anticuerpo anti-CD28 biespecífica.

La presente invención se refiere a una molécula de anticuerpo biespecífica, a una molécula de anticuerpo biespecífica con bivalencia para el CD28, para los ácidos nucleicos que codifican la molécula de anticuerpo, la molécula de anticuerpo y/o las células que contienen los ácidos nucleicos que codifican la molécula de anticuerpo, y el empleo de la molécula de anticuerpo biespecífica.

Los anticuerpos naturales son, en el caso más sencillo, glicoproteínas tetrámeras en forma de Y. Su estructura típica se compone de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. La cadena ligera se compone de dos dominios V_{L} y C_{L}, y la cadena pesada en cambio se compone de cuatro dominios V_{H}, C_{H}1, C_{H}2 y C_{H}3. A este respecto, las iniciales C y V significan en cada caso las partes constantes y variables del anticuerpo. Puentes disulfuro unen las dos cadenas pesadas entre sí y además, las cadenas pesadas con las cadenas ligeras.

Como "anticuerpo recombinante" se designa en general los fragmentos de un anticuerpo que se unen a antígenos, y se obtienen a partir de una fuente heteróloga. La unidad de anticuerpo más pequeña que puede unirse todavía a un antígeno, son fragmentos F_{V} los cuales contienen los dominios variables de las cadenas pesadas y de las cadenas ligeras.

En la investigación y terapia se emplean a menudo los llamados fragmentos F_{V} de cadena única (scF_{V}). En estos fragmentos, scF_{V} es el dominio variable de la cadena pesada con los dominios variables de la cadena ligera mediante un corto espaciador peptídico covalentemente unido. Este espaciador se introduce sobre el plano genético. Los fragmentos scF_{V} pueden ser purificados y detectados mediante la adición de cortas secuencias de marcado o bien en el terminal N ó en el terminal C.

Junto con los anticuerpos recombinantes juegan un gran papel los anticuerpos biespecíficos, en los cuales los puntos de unión con el antígeno frente a dos diferentes antígenos están unidos entre sí. Se dispone de diferentes estrategias para la obtención de fragmentos de anticuerpo recombinante biespecífico. Así por ejemplo, pueden unirse dos diferentes fragmentos scF_{V} mediante la introducción de un engarce adicional entre el terminal C del primer segmento scF_{V} y el terminal N del segundo fragmento scF_{V}. En el empleo de dos idénticos fragmentos scF_{V}, se obtienen anticuerpos los cuales son bivalentes en relación a un punto de unión, en el empleo de dos diferentes fragmentos scF_{V} se generan fragmentos los cuales son monovalentes con respecto a un punto de unión, aunque al mismo tiempo, son biespecíficos dado que presentan dos diferentes puntos de unión.

Para obtener los llamados diacuerpos, se selecciona un engarce muy corto entre el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera, para así evitar la unión de los dominios V_{H} y V_{L} en una cadena. Con ello pueden formarse moléculas dímeras, en las cuales los dominios V_{H} y V_{L} de dos diferentes cadenas forman una molécula de doble cabeza. En el empleo de dos diferentes, no copuladas especificidades de anticuerpo (por ejemplo A y B), los en la serie V_{HA} - V_{LB} y V_{HB} - V_{LA} se expresan en las mismas células, se pueden formar diacuerpos biespecíficos. Estas moléculas diacuerpos dímeras pueden obtenerse también mediante una molécula monómera, cuando se unen covalentemente dos fragmentos V_{H} - V_{L} con un engarce peptídico adicional (diacuerpo scDb de cadena única). Estos dímeros de anticuerpo biespecífico poseen pues dos valencias para cada especificidad.

Los diacuerpos biespecíficos o anticuerpos se generan ante todo a causa de aumentar tanto la valencia como también la estabilidad y con ello el potencial terapéutico. Hasta la actualidad se pudo demostrar que mediante diacuerpos de cadena única ante todo, podía mejorarse la fuerza de unión.

Tomlinson y Holliger "Methods for Generating Multivalent and Bispecific Antibody Fragments" ("Métodos para la generación de fragmentos de anticuerpo multivalentes y biespecíficos"). Methods in Enzymology ("Métodos de enzimología") (2000) 326:461-479, describen la obtención de diacuerpos biespecíficos. Estos diacuerpos biespecíficos se muestran efectivos en el reclutamiento de células T citotóxicas, del complemento y de las funciones efectoras dependientes del anticuerpo, como p. ej., la citotoxicidad mediada por la célula y la fagocitosis.

Kipriyanov et al., "Bispecific Tandem Diabody for Tumor Therapy with improved Antigen Binding and Pharmacokinetics" ("Diacuerpo biespecífico en tándem para la terapia tumoral con una mejor unión con el anticuerpo y farmacocinética"), J. Mol. Biol. (1999) 293:41-56, describen la formación del diacuerpo de una molécula de cadena única con cuatro regiones V de dos diferentes especificidades. Al mismo tiempo describe este grupo de trabajo la formación de un dímero de este anticuerpo de cadena única o respectivamente un diacuerpo en tándem biespecífico. Los diacuerpos en tándem son pues bivalentes para cada especificidad, en la presente publicación, para CD19 y CD3. Los diacuerpos en tándem mostraron realmente una mayor afinidad para su antígeno, aunque no pudo demostrarse una mayor actividad biológica ligada a la anterior. Así, estos diacuerpos en tándem poseían una actividad muy poco mayor respecto a la destrucción de células tumorales en comparación con los diacuerpos de cadena única.

Por ello, las células T inertes pueden participar en una respuesta inmunológica adaptable, para lo cual deben ser activadas para la proliferación y diferenciación. Esta activación de células T inertes tiene lugar mediante el reconocimiento de un fragmento de péptido extraño con el complejo CD3 receptor de células T específicas para el antígeno. En general, se admite que la activación efectiva de células T inertes para la proliferación y diferenciación necesita adicionalmente una segunda señal o una señal coestimuladora para el estímulo del antígeno específico mediante el complejo TCR/CD3. La molécula coestimuladora mejor caracterizada sobre las células presentadoras al antígeno son las glicoproteínas B7.1 y B7.2.

El receptor para la molécula B7 sobre células T es el CD28, y la ligación del CD28 mediante moléculas B7 (o mediante anticuerpos anti-CD28) coestimula el crecimiento de células T inertes. Según la activación de las células T aumenta también la expresión de CD28.

Entretanto, se han identificado todavía otros receptores coestimulantes, pero hasta el momento actual la interacción B7/CD28 es de mucho el coestímulo más fuerte para células T inertes.

Sobre las células T inertes, inactivas, el CD28 es el único receptor para las moléculas B7. Tan pronto las células se activan, expresan los receptores adicionales CTLA-4. El CTLA-4 forma moléculas B7 mucho más fuertes que el CD28 y proporciona señales negativas en las células T activadas, por lo cual entre otras cosas, se forma menos interleucina-2. Por este motivo una aplicación terapéutica de proteínas B7 se mostró como dudosa como moléculas coestimulantes, dado que el receptor CTLA-4 expresado sobre las células T activadas mediante B7, impedía la activación de las células T.

Una estimulación del complejo TCR/CD3 con anticuerpos biespecíficos indujo mediante aplicaciones sistémicas in vivo en humanos, importantes e inesperados efectos laterales (Tibben et alt. "Pharmacogenetics, biodistribution and biological effects of intravenously administered bispecific monoclonal antibody OC/TR Fab_{2} in ovarian carcinoma patients" ("Farmacocinética, biodistribución y efectos biológicos del anticuerpo OC/TR Fab_{2} monoclonal biespecífico administrado por vía intravenosa en pacientes de carcinoma ovárico"), (1996) Int. J. Cancer 66:447-483).

Hace algunos años se divulgó en diferentes publicaciones que los anticuerpos biespecíficos químicamente hibridados dirigidos contra antígenos asociados a tumores y contra CD28, inducían una coestimulación de células T dirigidas contra células tumorales in vitro e in vivo: ver p. ej., Jung, G. y Müller-Eberhard, H.J.; "An in vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates" ("Un modelo in vitro para la inmunoterapia tumoral con heteroconjugados de anticuerpo"), Immunology Today ("Inmunología actual") (1988) 9:257-260; Grosse-Hovest, L. et al., "Tumor growth inhibition with bispecific antibody fragments in a singeneic mouse melanoma model; The role of targeted T cell costimulation via CD28" ("Inhibición del crecimiento tumoral con fragmentos de anticuerpo biespecífico en un modelo de melanoma de ratón singeneico; papel de la coestimulación de células T seleccionadas mediante CD28") Int. J. Cancer (1999) 80:138-144.

En los experimentos se utilizaron estos anticuerpos biespecíficos en combinación con anticuerpos biespecíficos, que estimulan el complejo TCR/CD3. Empleados por separado, fueron únicamente poco efectivos.

En 1996, Hayden et al, "Costimulation by CD28sFv expressed on the tumor cell surface or as a soluble bispecific molecule targeted to the L6 carcinoma antigen" ("Coestimulación mediante el CD28sFv expresado sobre la superficie de la célula tumoral o como una molécula biespecifica soluble dirigida al antígeno del carcinoma L6"), Tissue Antigen ("Antígeno de Tejidos")((1996) 48: 242-254, describen que el anticuerpo de cadena única transfectado con CD28 y un anticuerpo biespecífico recombinante con tumor/especificidad al CD28, pueden provocar semejantes efectos coestimuladores en blastos de células T, en donde los blastos fueron ya estimulados mediante fithemaglutinina para la proliferación. La molécula scFv de cadena sencilla descrita no es sin embargo, supra-agonista.

Con estos antecedentes, la presente notificación toma como base la tarea de preparar un reactivo que pueda estimular efectivamente la célula T supra-agonista, también sin una señal adicional coestimulante.

Este objetivo se resuelve según la invención mediante una molécula de anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1.

La molécula de anticuerpo biespecífico con especificidad para el receptor CD28 de la célula T y especificidad para un antígeno tumoral, es bivalente para CD28.

En total, se prefiere que el punto de unión para el receptor CD28 de las células T se forme en el receptor CD28 de células T humanas. Su secuencia viene publicada p. ej., en Aruffo A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:8573-8577 (1987).

El problema se resuelve además mediante un procedimiento para el tratamiento de células, por el cual se emplea la molécula de anticuerpo biespecífico según la invención para provocar una activación inducida por células tumorales supra agonista de las células T, de forma que no sea necesaria ningún estímulo exógeno adicional.

El problema que está en la base de la invención se resuelve completamente de esta manera.

Los inventores de la presente notificación pueden mostrar que es posible mediante la sola activación de receptor coestimulador CD28 mediante una molécula de anticuerpo biespecífico según la invención o mediante la efectiva estimulación de un dímero de la primera molécula de anticuerpo biespecífica según la invención, sin que sea necesario otro estímulo de un antígeno específico sobre el complejo TCR/CD3. Esto significa también p. ej., que este proceso tiene lugar de manera dirigida sobre la superficie de las células tumorales.

Al mismo tiempo, se impide que la estimulación de las moléculas CTLA-4 tenga lugar sobre las células T activadas. Mediante la supresión de la estimulación de estas moléculas supresoras no queda limitada la proliferación de las células T, con lo cual, no se anula una respuesta inmunológica ajustada a la medida.

En otras palabras, las células T se activan cuando la molécula de anticuerpo biespecífica se une bivalentemente a la molécula CD28 sobre las células T y al mismo tiempo con su otro punto de unión se une al antígeno tumoral sobre una célula tumoral. Se trata por así decirlo, de una célula tumoral inducida, la activación supra agonista de células T, en lo cual la molécula de anticuerpo biespecífica según la invención, está en situación de estimular con eficacia las células T sin una señal adicional, cuando junto a la molécula CD 28 también se ha unido al antígeno tumoral. Se trata con ello de una activación selectiva inducida por las células tumorales, de las células T, para lo cual no es necesario ninguna unión al complejo TCR/CD3.

Los inventores de la presente notificación han mostrado además en diferentes investigaciones propias, que las moléculas de anticuerpo biespecíficas fueron manifiestamente efectivas en relación con la destrucción de las células tumorales.

Los inventores han descubierto que la molécula del anticuerpo cuando se obtiene recombinantemente, tiende espontáneamente a formar dímeros, y que los dímeros a causa de su bivalencia para el CD28 estimulan las células T con particular eficiencia. Los dímeros pueden a este respecto originarse también de forma dirigida. Puesto que la bivalencia para el CD28 provoca las propiedades supra agonistas de la nueva molécula de anticuerpo, la segunda molécula de anticuerpo muestra también este efecto supra agonista, pues es igualmente bivalente para el CD28, mientras que para el antígeno del tumor puede ser mono o bivalente.

En un ejemplo de ejecución, la molécula de anticuerpo biespecífica, está unida a un dímero con otra molécula de anticuerpo biespecífica.

A la vista de las propias investigaciones, los inventores han mostrado que las moléculas de anticuerpo biespecíficas según la invención forman sorprendentemente, dímeros. Una formación de dímeros de moléculas de anticuerpo construidas de esta manera, no se había descrito hasta ahora y por lo tanto fué completamente inesperada.

Mediante la dimerización se comprueba que la molécula de anticuerpo biespecífica tiene dos puntos de unión para el CD28 y dos puntos de unión para el antígeno tumoral. Los inventores pudieron demostrar con una molécula de anticuerpo de esta clase una efectiva activación inducida por células tumorales, de las células T, lo cual condujo a la muerte efectiva de las células tumorales, que expresaban el antígeno tumoral.

La molécula de anticuerpo puede además estar fusionada a una de las cadenas ligeras por lo menos una parte de un adaptador fos-jun o a una región Hinge.

Mediante la fusión de un adaptador fos-jun puede provocarse una dimerización dirigida, dado que el producto génico del adaptador fos-jun se asocia espontáneamente.

Con el nombre de región Hinge se comprende el tramo de cadena pesada de una inmunoglobulina, el cual está entre el primero y el segundo dominio constante. También esta opción lleva a la formación dirigida de un dímero.

Un empleo de estas unidades funcionales y ejemplos para sus secuencias están p. ej., comprendidos por van Spriel et al.,: "Immunotherapeutic Perspective for Bispecific Antibodies" ("Perspectiva inmunoterapéutica para los anticuerpos biespecíficos"), Immunol. Today (2000) 21 (8): 391-397.

Por regla general, se prefiere que el antígeno tumoral se seleccione del grupo que comprende el proteinoglicano asociado al melanoma, HER-2/nuevo ó CD20.

HER-2/nuevo es un oncogen y juega por ejemplo en el cáncer de mama un papel importante. El CD20 es un antígeno el cual se encuentra particularmente en células tumorales del tipo célula B.

La especificación de este antígeno tumoral es solamente a título de ejemplo, la invención se refiere también a otras moléculas de la superficie celular, las cuales están asociadas al tumor.

Se prefiere además, que el engarce peptídico en la primera molécula de anticuerpo tenga por lo menos una parte del terminal N del dominio C_{H}1 de la IgG humana.

A este respecto, es particularmente preferido que la parte del terminal N del dominio C_{H}1 de la IgG humana contenga la secuencia de aminoácidos Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Pro-Leu-Ala-Pro-Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly.

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En los dos dominios constantes de un fragmento Fab con especificidad tumoral, está siempre fusionado un fragmento scFv con la especificidad CD28.

Mediante esta construcción se crea una molécula de anticuerpo la cual es bivalente para CD28 y monovalente para el antígeno tumoral.

Una construcción de este tipo, pero sin embargo con otras especificidades, está descrita p. ej., por Schoonjans, R. et al.,: "Fab Chains as an Efficient Heterodimerization Scaffold for the Production of Recombinant Bispecific and Tri-specific Antibody Derivatives" ("Cadenas Fab como un andamio de heterodimerización eficiente para la producción de derivados de anticuerpos recombinantes biespecíficos y triespecíficos"), J. Immunol. (2000) 165(12): 7050-7057.

Además, la molécula de anticuerpo biespecífica es también bivalente para el antígeno tumoral.

La molécula de anticuerpo biespecífica según la invención es bivalente para CD28 y mono o bivalente para el antígeno tumoral en donde mediante la bivalencia para CD28 se logra el citado efecto supra agonista, mediante lo cual las células T son estimuladas sin una señal adicional, pero solamente cuando junto a la unión bivalente a la molécula CD28 sobre las células T se logra también una unión mono o bivalente en el antígeno tumoral sobre la célula tumoral.

Además, se describe una molécula de anticuerpo, en cuyas cadenas pesadas de anticuerpo completo con especificidad anti-tumoral, está fusionado cada vez un fragmento ScFv con especificidad CD28.

Con el término "anticuerpo completo" se comprende un anticuerpo el cual posee la estructura de una inmunoglobulina. Estas contienen dos cadenas pesadas cada una de ellas con un dominio variable y tres constantes, y dos cadenas ligeras cada una de ellas con un dominio variable y uno constante.

Mediante la fusión cada vez, de un fragmento scFv con especificidad CD28 a una molécula de dicho anticuerpo completo con especificidad anti-tumoral, se crea una molécula de anticuerpo biespecífica, la cual es bivalente tanto para el CD28 como también para un antígeno tumoral.

Una construcción de este tipo pero sin embargo, con otras especificidades y su funcionalidad, está p. ej., descrita en van Spriel et al.,:"Immunotherapeutic Perspective for Bispecific Antibodies" ("Perspectiva inmunoterapéutica para los anticuerpos biespecíficos"), Immunol. Today (2000) 21(8): 391-397.

La invención se refiere además a un ácido nucleico, que codifica una molécula de anticuerpo biespecífica según la invención. El ácido nucleico es en general una ADN ó un ARN, de preferencia un ADN de doble cadena.

Objeto de la invención es además un vector el cual contiene el ácido nucleico según la invención. El vector puede ser a este respecto, un vector vírico o un vector no vírico.

En una forma de ejecución de la invención, el ácido nucleico o el vector se expresa en una célula. La célula puede ser del grupo que comprende células de chupadores, bacterias, insectos, vegetales o levaduras. Las células transformadas o transfectadas con el ácido nucleico según la invención o con el vector según la invención, se cultivan y a continuación se aísla el producto génico expresado.

Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica con una molécula de anticuerpo biespecífica según la invención y un soporte farmacéuticamente aceptable.

La molécula de anticuerpo biespecífica puede emplearse para la activación de células T inducidas por las células tumorales, en particular en la terapia y/o profilaxis de enfermedades tumorales, para matar selectivamente dichas células tumorales mediante la activación de las células T, las cuales expresan el antígeno tumoral. Una muerte selectiva de las células tumorales puede p. ej., lograrse in vitro, mediante incubación de las células T y las células tumorales que expresan el antígeno tumoral, juntamente con la molécula de anticuerpo biespecífica según la invención. In vivo puede lograrse una muerte selectiva de las células tumorales mediante la administración de un medicamento que contenga la molécula de anticuerpo biespecífica. Esta molécula se une a continuación por un lado con su punto de unión para el antígeno tumoral a las células tumorales así definidas y por otro lado a las células T presentes en el cuerpo, sobre los puntos de unión bivalente para la molécula CD28, la cual se expresa en las células T. Debido a que no es necesaria otra estimulación de las células T mediante el complejo TCR/CD3, tiene lugar de esta manera supra agonista, una activación inducida por las células tumorales, de las células T, y con ello una muerte selectiva de las células tumorales.

En las células T humanas pudo observarse una activación dependiente de TCR/CD3 con el empleo de un anticuerpo CD28 particularmente inmovilizado (BW828), la cual se mostró como solamente moderada, y el anticuerpo 9,3 (CD28), empleado también en los ejemplos de versiones de la presente notificación, se mostró solamente muy poco efectivo en la activación de las células T: véase Siefken et al.,: "A CD28 associated signaling pathway leading to cytokine gene transcription and T cell proliferation without TCR engagement" ("Una ruta de señalización asociada a CD28 que conduce a la transcripción del gen citocina y a la proliferación de celulas T sin empleo de la TCR"), J. Immunol. (1998) 161:1645-1651 y en las referencias. Esto confirma que el anticuerpo solamente en la forma biespecífica, es decir, después de la unión al antígeno objetivo es supra-agonista. En este sentido la acción supra-agonista es selectiva.

Bischof et al., "Autonomous induction of proliferation, JNK and NfalphaB activation in primary resting T cells by mobilized CD28" ("Inducción autónoma de la proliferación, activación de JNK y NfalfaB en células T primarias en reposo mediante CD28 movilizado"), Eur. J. Immunol. (2000) 30 (3): 876-882, pudieron mostrar que los anticuerpos contra CD28 de ratas estimulaban una proliferación de células T sin TCR/CD3 adicional, pero sin embargo, este efecto fue atribuido a los particulares anticuerpos CD28, específicamente para el CD28 inmovilizado para disminuir el reclutamiento de CD28 dependiente de TCR/CD3. Por lo demás, estos trabajos con anticuerpos CD28 monoespecíficos describen realmente efectos supra-agonistas, pero no aquellos que se activan selectivamente mediante la unión a un antígeno diana.

Otras ventajas se derivan de la descripción y del dibujo adjunto.

Se comprende que las características citadas precedentemente y las siguientes todavía por aclarar, pueden emplearse, no solamente en la correspondiente combinación dada, sino también en otras combinaciones, o solas, sin abandonar el marco de la presente invención.

Ejemplos de ejecución de la invención están representados en las figuras del dibujo y se aclaran con más detalle en la siguiente descripción. Se muestra:

Figura 1a Una representación esquemática de la molécula de anticuerpo en el plano genético;

Figura 1b La secuencia de aminoácidos de una molécula de anticuerpo biespecífica según la invención;

Figura 2a La purificación del anticuerpo recombinante mediante filtración sobre gel;

Figura 2b Las fracciones de la filtración sobre gel, separadas mediante electroforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida;

Figura 3 La actividad de unión del anticuerpo de cadena única recombinante, monómero y dímero, con especificidad CD28/9.2.27, en células T de Jurkat de células de linfoma;

Figura 4 La activación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante células SKMe163 irradiadas, las cuales se incubaron durante tres días con el dímero del anticuerpo recombinante o el permonómero del anticuerpo recombinante;

Figura 5 La muerte de las células SKMe163 después de una incubación de cuatro días con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y el anticuerpo recombinante como monómero y como dímero;

Figura 6 La lisis de las células SKMe163 y M21 de melanoma mediante células mononucleares de sangre periférica (PBMC), las cuales han sido incubadas con células SKMe163.

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Ejemplo 1 Construcción genética y expresión de la molécula de anticuerpo biespecífica de cadena única

Se obtuvieron los anticuerpos scF_{V} monoespecíficos mediante el empleo de los sistemas RPAS (Pharmacia Biotech, Friburgo) a partir de cADN de hibridoma. Las cadenas variables V_{L} y V_{H}, cada una de ellas de una especificidad, están unidas entre sí mediante un engarce flexible de 15 aminoácidos, el cual tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_{3}

Después de la obtención de los fragmentos scF_{V} monoespecíficos funcionales se unieron éstos mediante un engarce de 19 aminoácidos. Este engarce L corresponde a una parte del terminal N del dominio C_{H}1 de la IgG humana. La secuencia de aminoácidos del engarce L es como sigue:

Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Pro-Leu-Ala-Pro-Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly

De esta manera se generó una construcción con la siguiente orientación 5'\rightarrow 3':

(V_{L}-FL-V_{H})_{9 . 3}-L-(V_{H}-FL-V_{L})_{9 . 2 . 27}-6his

V_{L} significa cada vez, el dominio variable de la cadena ligera, V_{H} el dominio variable de la cadena pesada. El fragmento de anticuerpo "9.3" es específico para el CD28, y el fragmento de anticuerpo "9.2.27" es específico para el proteoglicano asociado al melanoma. Las secuencias de aminoácidos de los fragmentos de anticuerpo están representadas en la figura 1b. La cadena ligera V_{L} 9.3 es una cadena líder intercalada para la expresión de la molécula de anticuerpo en el sobrenadante del cultivo. "L" significa el engarce de péptido, el cual reúne las dos especificidades. "FL" representa el engarce flexible de 15 aminoácidos de largo cada vez entre la cadena pesada y ligera de una especificidad. Con "6his" se indica un radical aminoácido con seis histidinas, la cual se designa como His-Tag.

Como elementos reguladores se fusionaron por una parte un fragmento K-promotor de 1,1 kB al extremo 5' de la región codificadora, y en el extremo 3' un intrón \mu de 5,5 kB, el cual contiene un fragmento potenciador ("potenciador"), y por otra parte se añadió un PolyA-Schwanz ("PolyA") de 1,8 kB de longitud (ver figura 1a). Esta construcción fue clonada en un vector, el cual se obtuvo por fusión del pCDNA-3 (Stratagene, La Jolla, CA) y el scriptovector pCR (Invitrogen, Groningen, Holanda). La figura 1a muestra esquemáticamente la organización genética de la molécula de anticuerpo (no a escala).

A continuación se transfectaron dos líneas celulares de mieloma de ratón, P3X63Ag8 y J558, mediante electroporación con la construcción anterior. Los índices de producción que se alcanzaron con la línea celular J558, fueron mayores que con las otras líneas celulares, por lo cual éstas se emplearon para la purificación del anticuerpo recombinante.

En lugar de la dimerización espontánea aquí descrita de la primera molécula de anticuerpo biespecífica, puede también tener lugar una dimerización selectiva en su obtención recombinante. También es posible mediante tecnología recombinante obtener unas segundas moléculas de anticuerpo según la invención, las cuales son bivalentes para el CD28 y mono o bivalentes para un antígeno tumoral, y al igual que los dímeros a partir de las primeras moléculas de anticuerpo según la invención, estimulan efectivamente las células T.

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Ejemplo 2 Purificación del anticuerpo recombinante

En un primer paso de purificación, se añadieron las células transfectadas del sobrenadante precipitadas con sulfato de amonio, sobre una columna de proteína L. La proteína L forma determinados V_{K} subtipos de cadenas ligeras del ratón. Durante la gelfiltración pudieron identificarse tres picos determinados, los cuales correspondían a un peso molecular de aproximadamente 55.000 (pico 1), 100.000 (pico 2) y 160.000 (pico 3) daltons (ver figura 2a). La gelfiltración se efectuó sobre una columna Superdex S200 (Pharmacia, Friburgo, Alemania), o bien con un equipo FPLC convencional para una separación preparativa, o bien con el sistema SMART (Pharmacia) para una gelfiltración analítica.

Después de una electroforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), pudieron observarse en cambio solamente dos bandas, las cuales correspondieron a un peso molecular de aproximadamente 55.000 y 160.000 Daltons, como se representa en la figura 2b: en la huella 6 se han aplicado las células transfectadas del sobrenadante precipitadas por sulfato de amonio antes de la gel-filtración. En la huella 1 se ha aplicado el material del pico 1 después de la gel-filtración. En la huella 2 se muestra el material del pico 2 después de la gel-filtración y después de la adsorción de la proteína G, y en la huella 3, el material del pico 2 después de la gel-filtración y antes de la adsorción de la proteína G. Los análisis del peso molecular se efectuaron mediante un SDS-PAGE al 10%. Se empleó material de proteína G y proteína L de la firma Devitron (Castrop-Rauxel, Alemania).

Teniendo en cuenta que la banda con un peso de 160 Kilodaltons puede ser eliminada mediante la adsorción con proteína G, esta banda puede identificarse como inmunoglobulina, la cual fue producida mediante la propia línea celular transfectada J558.

El material purificado del pico 2 de las líneas celulares J558 y P3X63Ag8 no pudo diferenciarse del material del pico 1 mediante SDS-PAGE: las dos especies de anticuerpos contenidas en los dos picos, poseen un peso molecular de aproximadamente 58 kilodaltons, lo cual está en concordancia con el peso molecular esperado de la molécula de cadena única biespecífica monómera.

Además, las dos especies de anticuerpos se mostraron como idénticas en los terminales N de la secuenciación de la proteína. Los análisis secuenciales de la proteína se efectuaron mediante un secuenciador de proteínas Hewlett Packard G241 (Hewlett Packard, Waldbronn, Alemania) mediante degradación Edman.

En resumen, pudo mostrarse también que mediante gel-filtración podía ser purificado una especie de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 115 kilodaltons (material del pico 2), y que este anticuerpo aparecía en la SDS-PAGE con exactamente la mitad del peso molecular original, que presentaba sin embargo, las mismas secuencias que la molécula de cadena única biespecífica monómera esperada. En base a esto, pudo mostrarse que el material del pico 2 presenta homodímeros de la molécula de cadena única biespecífica recombinante (dímero rM28). El dímero no puede detectarse mediante SDS-PAGE, dado que en la electroforesis sobre gel se descompone en sus monómeros.

Ejemplo 3 Actividades de la unión de las diferentes especies de anticuerpos biespecíficos

Para determinar la unión de los anticuerpos biespecíficos, se incubaron células Jurkat y M21, las cuales expresan el CD28 y el proteoglicano asociado al melanoma, con anticuerpos de diferentes concentraciones, se lavaron y se tiñeron con un anticuerpo monoclonal anti-histidina (dia 900, Dianova, Hamburgo, Alemania) y un anticuerpo (anti-ratón) de cabra (Dianova). Las células fueron analizadas en un FACSCalibur con el programa informativo CellQuest (Becton Dickinson, San José, USA).

En la figura 3 se representa la actividad de la unión de los diferentes especies de anticuerpos biespecíficos en células Jurkat. Se midió una unión tanto para el proteoglicano asociado al melanoma como también para el CD28, ambas especificidades se expresan sobre células M21 y células T Jurkat. Como puede verse en la figura 3, la unión del anticuerpo dímero recombinante (\blacklozenge dímero), muestra un mejor comportamiento a la unión en comparación con el anticuerpo monómero de cadena única (\sqbullet monómero).

Como comparación se obtuvieron además, anticuerpos biespecíficos hibridados químicamente (cM28): anticuerpos los cuales poseían especificidad para el melanoma (9.2.27) ó especificidad (9.3), se aislaron mediante proteína A cromatografía de columna a partir de sobrenadantes de hibridoma. Los anticuerpos se fragmentaron y se hibridaron mediante reducción selectiva y re-oxidación de los puentes de disulfuro de la región Hinge. El procedimiento para la hibridación química está descrito p. ej., por Jung y al.: "Target cell induced T cell activation with bi- and tri-specific antibody fragments" ("Activación de células T inducida por células diana, con fragmentos de anticuerpos bi y triespecíficos"), Eur. J. Immunol. (1991) 21:2431-2435. Mediante las condiciones de reacción empleadas pudo evitarse la formación de homodímeros. Los anticuerpos biespecíficos químicamente hibridados mostraron en los ensayos de unión una afinidad a la unión similar a los anticuerpos monómeros (datos no representados).

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Ejemplo 14 Activación de células T inducida por células diana

Para medir la activación de células T inducida por células diana, se incubaron tanto los monómeros como también los anticuerpos tumorales/CD28 biespecíficos dímeros, tres veces en placas de microtitulación de 96 pocillos con células SKMe163 irradiadas (120 Gy) (10^{4}/pocillo) y células mononucleares de sangre periférica (en adelante: PBMC) de dadores sanos (10^{5}/pocillo). Durante las últimas 18 horas de un tiempo de incubación de 4 días se añadió H^{3}-timidina (0,5 \muCi/pocillo). Se recogieron las células y se determinó su radiactividad en un contador de centelleo (MicroBeta, Wallac).

En la figura 4 está representada la inducción de la proliferación de células T mediante las diferentes construcciones de anticuerpos biespecíficos en presencia de células de melanoma SKMe163, a las cuales se unen los anticuerpos específicamente: el fragmento F(ab')_{2} químicamente hibridado (\ding{115} cM28) se mostró él mismo como moderadamente efectivo en una alta concentración de anticuerpos. Por el contrario, las moléculas dímeras recombinantes indujeron (\blacklozenge dímero rM28) una activación de las células, la cual es similar a la estimulación con fitohemaglutinina (PHA), ya a concentraciones de 10 ng/ml. El monómero (\sqbullet monómero rM28) mostró una determinada actividad a altas concentraciones, en donde esta actividad aumentó con el tiempo de almacenamiento. La activación de las células T mediante el dímero rM28 en ausencia de células diana SKMe 163 está señalizado mediante la curva con el símbolo \bullet. En dos de seis ensayos independientes mostró el cM28 una pequeña actividad en concentraciones de >300 ng/ml. Con estas excepciones el experimento representado en la figura 4 es representativo.

Cuando el material, que al principio era monómero, se analizó de nuevo después de un tiempo de almacenamiento de dos semanas a 4ºC, mediante gelfiltración, se mostró que más del 15% del material estaba en forma de dímero. Por ello se puede atribuir por lo menos una parte de la actividad del monómero al hecho de que estaban presentes pequeñas cantidades de dímeros contaminados o bien ya al principio del ensayo o bien se formaron espontáneamente durante el transcurso del mismo.

En algunos experimentos mostró una cierta actividad de fondo la molécula dímera, pero no en cambio el monómero (monómero rM28) ó el fragmento (cM28) biespecífico F(ab')_{2}, es decir, la inducción de la activación de las células T sin la presencia de células diana. Esta actividad fue siempre significativamente menor que la observada en presencia de células de melanoma, y la actividad apareció siempre solamente en altas concentraciones de anticuerpo. Cuando se empleó el UvGG como control, una línea celular de carcinoma proteoglicano-negativa, "de cáncer de ovario", no produjo la activación de las células T atribuible a este nivel de actividad de fondo.

Tampoco en el caso de las células antigenonegativas T98G y U373 pudo comprobarse ninguna activación de células T atribuible a este nivel de actividad de fondo.

Ejemplo 5 Muerte de las células tumorales

Para determinar la muerte de las células tumorales, se incubaron células viables de melanoma tres veces en placas de microtitulación de 96 pocillos (5x10^{3}/pocillo) junto con PBMC y anticuerpos. Después de cuatro días se retiraron las PBMC y se determinó la cantidad de células tumorales viables restantes, adheridas, después de la tintura con la sal de tetrazolio WST (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). La densidad óptica se determinó con un lector de ELISA (Spectra Max 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA), y se calculó el tanto por ciento de células muertas.

Alternativamente, se midió la citotoxicidad de las PBMC después de la incubación de células tumorales viables en frascos de cultivo (3x10^{4}/ml) con PBMC (6x10^{5}/ml). Después de tres días las células se estimularon en presencia de células SKW63, se recogieron y se analizaron en un ensayo de liberación de Cr^{51}, con células estimuladoras SKW63 y células M21 como células diana. Finalmente, ambas líneas celulares se marcaron con Cr^{51} (40 \muCi/ml) durante una hora, se sembraron sobre placas de microtitulación de 96 pocillos (5x10^{3}/pocillo) y se incubaron con PBMC, las cuales se estimularon en presencia de SKW63 y anticuerpos biespecíficos con una relación efector: diana de 30:1. La cesión de Cr^{51} se midió después de cuatro horas. El tanto por ciento de células tumorales muertas se calculó mediante la siguiente fórmula estándar:

(cpm_{x} - cpm_{spont}) / (cpm_{max} - cpm_{spont})

En dicha fórmula, cpm_{max} significa la radiactividad, la cual se libera con células diana lavadas con detergente, y cpm_{spont} significa la liberación espontánea en ausencia de PBMC y anticuerpos.

En la figura 5 se muestra que la activación de las células T conduce a una muerte efectiva de las células tumorales. Después de cuatro días, células de melanoma incubadas con PBMC en presencia del anticuerpo biespecífico dímero, murieron casi totalmente (\blacklozenge dímero rM28). De manera similar al ensayo de proliferación, la muerte de células tumorales aumentó significativamente, cuando en lugar del monómero (\sqbullet monómero rM28), se empleó el anticuerpo dímero (\blacklozenge dímero rM28), recombinante biespecífico. La actividad del anticuerpo biespecífico químicamente hibridado (\ding{115} cM28) fue de nuevo muy pequeña.

La figura 6 muestra la actividad de lisis de las PBMC, las cuales se incubaron durante tres días con SKMe163, en donde las células estimuladoras y las células M21 sirven como células diana en un ensayo de cesión de Cr^{51} estandarizado. Es evidente que el anticuerpo recombinante dímero es el más efectivo para la inducción de la lisis celular.

Sin embargo, esta actividad parece inespecífica, puesto que no solamente murieron las células estimuladoras sino también unas células de melanoma con diferentes tipos de HLA. Por este motivo, la actividad de lisis que se midió en estas condiciones, no es atribuible a las células T alorreactivas.

En resumen, se puede decir también que un dímero según la invención, de las primeras moléculas de anticuerpo biespecíficas con especificidad para CD28/tumor, constituye un medio prometedor para activar efectivamente las células T respecto a un determinado tumor, sin que sea necesaria una estimulación adicional del complejo TCR/CD3.

Sin embargo no es obligatoriamente necesario que la molécula de anticuerpo sea también bivalente para el antígeno tumoral, aunque la bivalencia es importante para el CD28.

<110> Jung, Gundram

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<120> Molécula de anticuerpo biespecífica

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<130> 2812P101WO

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<140> PCT/EP 02/12545

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<141> 2002-11-09

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<150> 101 56 482,1-44 DE

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<151> 2001-11-12

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<160> 3

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<170> PatentIn, versión 3.1

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<210> 1

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Engarce flexible FL entre las cadenas variables VL y VH, cada vez de una especificidad

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<400> 1

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\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

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<210> 2

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Engarce L entre las dos cadenas variables VH de las especificidades

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<400> 2

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\sa{Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Ser}

\sac{Gly Ser Gly}

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<210> 3

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<211> 543

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Molécula de anticuerpo biespecífica con la orientación

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(V_{L}-FL-V_{H})_{9.3}-L-(V_{H}-FL-V_{L})_{9.2.27}-6his

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<400> 3

1

2

3

4

Claims

1. Molécula de anticuerpo biespecífica recombinante, con un primer punto de unión para el receptor CD28 de las células T, y un segundo punto de unión para un antígeno de la superficie celular asociado a un tumor, en donde los dominios variables de la correspondiente cadena pesada (V_{H} de los dos puntos de unión entre sí, están unidos mediante un engarce peptídico, el cual contiene la secuencia de aminoácidos Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Pro-Leu-Ala-Pro-Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 2).

2. Molécula de anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el antígeno de la superficie celular asociado al tumor, se escoge del grupo compuesto por el proteoglicano asociado al melanoma, Her-2/nuevo y CD20.

3. Molécula de anticuerpo según la reivindicación 2, en donde el antígeno de la superficie celular asociado al tumor es el proteoglicano asociado al melanoma.

4. Molécula de anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 a 3, la cual tiene la secuencia (SEQ ID NO: 3) como se describe en la figura 1b.

5. Molécula de ácido nucleico, la cual codifica una molécula de anticuerpo, según una de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5, la cual está contenida en un vector.

7. Célula la cual contiene una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5 ó 6.

8. Célula según la reivindicación 7, la cual se selecciona del grupo compuesto de células de chupadores, células de bacterias, células de insectos, células vegetales y células de levaduras.

9. Procedimiento para la obtención de una molécula de anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 a 4, el cual comprende:

(a): clonación de una molécula de ácido nucleico, el cual codifica dicho fragmento de anticuerpo, en un vector apropiado,

(b): introducción del vector recombinante obtenido en (a), en una célula hospedadora adecuada, y expresión de la molécula de ácido nucleico en esta célula hospedadora apropiada, y

(c): purificación de la molécula de anticuerpo recombinante obtenida en (b).

10. Composición farmacéutica, la cual contiene una molécula de anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 a 4, y un soporte farmacéuticamente aceptable.

11. Procedimiento para la muerte selectiva de células tumorales in vitro, el cual comprende: incubación de una molécula de anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 a 4, la cual presenta especificidad para el antígeno de la superficie celular de las células tumorales que hay que aniquilar, juntamente con células T así como estas células tumorales, en donde el procedimiento se caracteriza porque la sola presencia de la molécula de anticuerpo para la inducción de las células tumorales es suficiente para la activación de las células T y en consecuencia para la muerte de las células tumorales.

12. Empleo de una molécula de anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 a 4, para la obtención de un medicamento para la profilaxis o terapia de enfermedades tumorales.