ES2285757T3

ES2285757T3 - Procedimiento para producir acidos dicarboxilicos.

Info

Publication number: ES2285757T3
Application number: ES98903871T
Authority: ES
Inventors: Nhuan Phu Nghiem; Mark Donnelly; Cynthia S. Millard; Lucy Stols
Original assignee: UT Battelle LLC; UChicago Argonne LLC
Current assignee: UT Battelle LLC; UChicago Argonne LLC
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2018-01-30
Also published as: EP1012323B1; JP2000515389A; CN1121500C; AU724274B2; HUP0001997A2; EP1012323A4; CA2278892A1; AU6052398A; CA2278892C; DE69837607T2; EP1012323A1; US5869301A; CN1246155A; JP3681404B2; PT1012323E; BR9806822A; ATE360084T1; HU227509B1; BR9806822B1; DK1012323T3

Abstract

Un procedimiento para la producción de ácidos carboxílicos que comprende las etapas de: a) la inoculación de un medio que tiene una fuente de carbono con un microorganismo que produce un ácido carboxílico que tiene una biomasa; b) la incubación de dicho microorganismo en una atmósfera aeróbica para promover el crecimiento rápido de dicho microorganismo incrementando así dicha biomasa de dicho microorganismo; c) la liberación de oxígeno de manera controlada para mantener dicha atmósfera aeróbica; d) la alimentación de manera controlada a dicho microorganismo con una disolución que contiene dicha fuente de carbono para mantener una concentración de dicha fuente de carbono dentro de dicho medio entre 0, 5 g/l aproximadamente y 1 g/l aproximadamente; e) la privación a dicha atmósfera aeróbica de dicho oxígeno para producir una atmósfera anaeróbica para provocar que dicho microorganismo cambie a metabolismo anaeróbico; f) la alimentación de manera controlada a dicho microorganismo con dicha disolución que contiene dicha fuente de carbono para mantener una concentración de dicha fuente de carbono dentro de dicho medio de = 1 g/l; y g) la conversión de dicha fuente de carbono a ácidos carboxílicos usando dicho metabolismo anaeróbico de dicho microorganismo.

Description

Procedimiento para producir ácidos dicarboxílicos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de ácidos dicarboxílicos, particularmente a un procedimiento de fermentación que usa una cepa de Escherichia coli para producir grandes cantidades de ácidos dicarboxílicos tales como el ácido málico, ácido fumárico y ácido succínico.

Antecedentes de la invención

Los ácidos carboxílicos y sus derivados se usan mucho como compuestos químicos especializados para aplicaciones en polímeros, alimentos, compuestos farmacéuticos, y cosméticos. El ácido succínico, por ejemplo, es útil para la producción de precursores plásticos tales como 1,4-butanodiol (BDO), tetrahidrofurano, y gamma-butirolactona. Nuevos productos procedentes del ácido succínico están en desarrollo continuo, incluyendo el desarrollo de poliéster. El poliéster se prepara uniendo ácido succínico y BDO. Generalmente, los ésteres de ácidos succínicos tienen el potencial de ser nuevos disolventes "verdes" que pueden reemplazar a disolventes más perjudiciales y servir como precursores para millones de kilos anuales de compuestos químicos con un valor total en el mercado por encima de los mil millones de dólares.

La producción de ácidos carboxílicos, tales como el ácido málico, el ácido succínico y el ácido fumárico, procedentes de materias primas renovables (en este caso mediante procesos de fermentación) es una vía para reemplazar los procedimientos de obtención de tales ácidos que demandan más energía a partir de fuentes no renovables. El succinato es un intermedio para bacterias que producen propionato por fermentaciones anaeróbicas, pero esos procesos dan como resultado rendimientos y concentraciones bajos.

Se han aislado muchos de los organismos que producen ácido succínico, tales como las bacterias ruminicolas anaeróbicas, Bacteroides ruminicola y Bacteroides amylophilus. No obstante, los organismos ruminicolas son característicamente inestables en procesos de fermentación. Otro organismo que produce ácido succínico es Anaerobiospirillum succiniciproducens (A. succiniciproducens). Se han expedido varias patentes sobre el uso de este organismo para producir ácido succínico en un proceso de fermentación anaeróbico. Una de tales patentes de Glassner y col., patente de EE.UU. Nº 5.143.834, explica a grandes rasgos el uso de este organismo en procesos de fermentación para producir ácido succínico de manera natural con rendimientos moderados. No obstante, los procesos de fermentación que usan A. succiniciproducens presentan una serie de problemas. Un problema es que el organismo es un anaerobio estricto, su cultivo debe realizarse en un entorno absolutamente exento de oxígeno. La propagación de este organismo en una planta de fermentación comercial es difícil y requiere trabajadores altamente cualificados. El A. succiniciproducens también es difícil de manejar incluso en trabajo a escala de laboratorio y tiende a degenerar en condiciones desfavorables. Su degeneración no se puede revertir. El organismo nunca se ha usado en procesos de fermentación comerciales. En otras palabras, la experiencia de fermentación a escala de producción con este organismo particular es inexistente. Además, el organismo requiere una fuente externa de dióxido de carbono para conseguir un rendimiento elevado de ácido succínico. En un proceso de fermentación, se debe inyectar una corriente de dióxido de carbono puro en el caldo de fermentación. El A. succiniciproducens produce una mezcla de los ácidos succínico y acético en una relación molar de succinato:acetato de 2 aproximadamente. La presencia de ácido acético a concentraciones elevadas en el caldo de fermentación incrementa los costes de purificación del ácido succínico. La producción del coproducto acetato ilustra que un tercio de la costosa glucosa no se convierte en succinato. Además, la cepa hospedadora de A. succiniciproducens ha demostrado no ser muy osmotolerante puesto que no tolera concentraciones de sales elevadas y además se inhibe a concentraciones moderadas del producto. Otro problema que presenta el uso de A. succiniciproducens es que la preparación del medio para el inóculo requiere la adición de triptófano y también requiere la mezcla de 4 disoluciones diferentes, una de las cuales contiene H_{2}S corrosivo y tóxico.

Desde hace tiempo se sabe que a partir de la fermentación de E. coli se produce una mezcla de ácidos, según lo elaborado por J. L. Stokes en 1949, "Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli", J. Bacteriol., 57: 147-158. No obstante, por cada mol de glucosa fermentado, sólo se producen 1,2 moles de ácido fórmico, 0,1-0,2 moles de ácido láctico, y 0,3-0,4 moles de ácido succínico. Como tales, los esfuerzos para producir ácidos carboxílicos por fermentación han dado como resultado que cantidades relativamente grandes de sustratos de crecimiento, tales como la glucosa, no se conviertan en el producto deseado.

Fairoz Mat-Jan y col., describe en el J. Bacteriol., v. 171 (1989), págs. 342-348, un estudio realizado sobre mutantes aislados de Escherichia coli deficientes en lactato deshidrogenasa fermentativa unida a NAD (LDH), no presentan defectos en el crecimiento en condiciones anaeróbicas a menos que esté presente junto con un defecto en la piruvato formato liasa (PFL). Los mutantes dobles (PFL + LDH) eran incapaces de crecer anaeróbicamente en glucosa u otros azúcares, incluso cuando se suplementaba con acetato, mientras que los mutantes PFL pueden hacerlo. El estudio no describe ni investiga la producción de ácido succínico o ácidos dicarboxílicos.

Aunque el ión succinato es un intermedio habitual en la ruta metabólica de numerosos microorganismos anaeróbicos, existe una necesidad en la técnica de un proceso de fermentación para producir ácido succínico económicamente así como otros ácidos carboxílicos tales como el ácido málico y el ácido fumárico, en grandes cantidades o con rendimientos elevados. El procedimiento debería utilizar nutrientes y sustratos de bajo coste, la velocidad de fermentación debería ser elevada para una productividad elevada, y la concentración del producto en el caldo de fermentación debería ser elevada.

Objetos de la invención

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un nuevo procedimiento mejorado, práctico y económico para la producción de ácidos dicarboxílicos que supere las desventajas y problemas presentados por la técnica anterior.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento mejorado, práctico y económico para la producción de ácido succínico, ácido málico y ácido fumárico con rendimientos elevados.

Aún es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de fermentación que utiliza un mutante de Escherichia coli para la producción de ácido succínico, ácido málico y ácido fumárico con rendimientos elevados.

Todavía es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de fermentación mejorado, práctico y económico que utiliza un mutante de Escherichia coli para la producción de ácido succínico, ácido málico y ácido fumárico con rendimientos elevados en el que el procedimiento de fermentación se lleva a cabo en un único reactor, que permite el control preciso de la oxigenación, los niveles de glucosa, el pH y las velocidades de adición de los nutrientes.

Éstos y otros objetos de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción contenida en el presente documento.

Resumen

Según un aspecto de la presente invención, los anteriores objetos y otros se consiguen mediante un procedimiento para la producción de ácidos carboxílicos que comprende las etapas de a) la inoculación de un medio que tiene una fuente de carbono con un organismo que produce ácidos carboxílicos; b) la incubación del organismo que produce ácidos carboxílicos en una atmósfera aeróbica para promover el crecimiento rápido del organismo incrementando así la biomasa del organismo; c) la liberación de oxígeno de manera controlada para mantener la atmósfera aeróbica; d) la alimentación de manera controlada al organismo que tiene una biomasa incrementada con una disolución que contiene la fuente de carbono para mantener la concentración de la fuente de carbono dentro del medio entre 0,5 g/l aproximadamente y 1 g/l aproximadamente; e) la privación de la atmósfera aeróbica de oxígeno para producir una atmósfera anaeróbica para provocar que el organismo cambie a metabolismo anaeróbico; f) la alimentación de manera controlada al organismo que tiene una biomasa incrementada con una disolución que contiene una fuente de carbono para mantener la concentración de la fuente de carbono dentro del medio de \geq 1 g/l; y g) conversión de la fuente de carbono a ácidos carboxílicos usando el metabolismo anaeróbico del organismo.

Según otro aspecto de la presente invención, se pueden conseguir otros objetos mediante un procedimiento para la producción de ácidos carboxílicos que comprende las etapas de a) la inoculación de un medio que tiene una fuente de carbono con un organismo que produce ácidos carboxílicos; b) la incubación del organismo en un entorno con un valor de pH mantenido y con una atmósfera aeróbica para promover el crecimiento rápido del organismo, incrementando así la biomasa del organismo; c) la liberación de oxígeno de manera controlada para mantener la atmósfera aeróbica; d) la alimentación de manera controlada al organismo con una disolución que contiene una fuente de carbono para mantener la concentración de la fuente de carbono dentro del medio entre 0,5 g/l aproximadamente y 1 g/l aproximadamente; e) la transferencia del organismo que tiene una biomasa incrementada a un fermentador de producción que tiene una atmósfera anaeróbica para provocar que el organismo cambie a metabolismo anaeróbico; f) la alimentación de manera controlada del organismo con una disolución que contiene la fuente de carbono para mantener una concentración de la fuente de carbono dentro del fermentador de producción de \geq 1 g/l, y g) la conversión de la fuente de carbono a ácidos carboxílicos usando el metabolismo anaeróbico del organismo.

Breve descripción de los dibujos

Para una mejor comprensión de la presente invención, junto con éstos y otros objetos, ventajas y competencias adicionales, se hace referencia a la siguiente descripción y reivindicaciones anexas leídas en relación con los dibujos anexos, en los que:

la Fig. 1 muestra los resultados del experimento descrito en el Ejemplo 1;

la Fig. 2 muestra los resultados del experimento descrito en el Ejemplo 2;

la Fig. 3 muestra los resultados del experimento descrito en el Ejemplo 3;

la Fig. 4 muestra los resultados del experimento descrito en el Ejemplo 4;

la Fig. 5 muestra los resultados del experimento descrito en el Ejemplo 5;

la Fig. 6 muestra los resultados del experimento descrito en el Ejemplo 6;

la Fig. 7 muestra los resultados del experimento descrito en el Ejemplo 7.

Descripción detallada de la invención

La presente invención es un nuevo medio económico, y aún así práctico, para la producción de grandes cantidades de ácido succínico, ácido fumárico y ácido málico en un proceso de fermentación controlado. En el proceso de fermentación de la presente invención se ha utilizado una cepa de Escherichia coli (E. coli), denominada AFP-111, para solucionar los problemas presentados en la técnica. La AFP-111, una E. coli NZN-111 mutante, es un organismo facultativo. La E. coli es muy fácil de manejar. Su biología molecular y su fisiología se conocen con mucho detalle. Por tanto se puede conseguir fácilmente una mejora del proceso a través de la biología molecular o la modificación de los parámetros del proceso o de ambos. Además, la E. coli se ha usado ampliamente en procesos de fermentación para la fabricación de compuestos biofarmacéuticos y compuestos químicos. Se tiene una abundante experiencia a escala de producción con este organismo.

La E. coli también produce una mezcla de los ácidos succínico y acético, sin embargo, la relación molar de succinato:acetato en condiciones no optimizadas ya es de 3 aproximadamente o superior. Esta relación se puede incrementar sustancialmente. Concentraciones de ácido acético inferiores en el caldo de fermentación reducirán significativamente los costes de purificación del ácido succínico. Además, la E. coli puede no necesitar un suministro externo de dióxido de carbono para conseguir un rendimiento elevado de ácido succínico. Sin la introducción del dióxido de carbono, el rendimiento del ácido succínico durante el periodo de producción máximo es comparable al obtenido con A. succiniciproducens con la inyección de dióxido de carbono.

Normalmente, en condiciones anaeróbicas, la E. coli de tipo natural produce una mezcla de productos de fermentación, de los cuales el ácido succínico es un componente secundario. No obstante, cuando la AFP-111 se cultiva en condiciones anaeróbicas, el producto metabólico principal es el ácido succínico. La AFP-111 contiene una mutación cromosómica espontánea única que produce una mezcla de ácido succínico, ácido acético y etanol, con el ácido succínico como componente principal. Con la AFP-111 se produce un rendimiento máximo del 99% en peso de ácido succínico por peso de glucosa. El uso de la AFP-111 reduciría significativamente los costes de producción de ácido succínico mediante procesos de fermentación.

El proceso de fermentación de E. coli consta de dos fases. En la primera, la cepa AFP-111 se cultiva en condiciones aeróbicas en el fermentador, en un entorno con un bajo contenido en glucosa, hasta una densidad celular elevada. En la presente invención, la glucosa se usa como fuente de carbono tanto para el crecimiento de la biomasa del organismo como para la producción de ácidos dicarboxílicos. Cuando se consigue la densidad celular deseada, se detiene el suministro de aire para forzar al organismo a cambiar a su metabolismo anaeróbico, que resulta en la producción de ácidos dicarboxílicos, incluyendo los ácidos málico, fumárico y succínico como producto final. En una forma de realización de la presente invención, este proceso de fermentación en dos fases tiene lugar en un único reactor.

La ruta bioquímica de la producción del ácido succínico en E. coli implica una serie de etapas de conversión. El ácido pirúvico se convierte primero a ácido oxaloacético, a continuación a ácido málico, ácido fumárico, y finalmente, a ácido succínico. De estos ácidos, el ácido málico, el ácido fumárico y el ácido succínico son industrialmente importantes. La AFP-111 acumula ácido succínico como producto final. Si el producto deseado es el ácido fumárico, se suprime el gen que codifica para la enzima responsable de la conversión del ácido fumárico al ácido succínico y el organismo resultante acumulará ácido fumárico en lugar de ácido succínico. De manera similar, si el producto deseado es el ácido málico, se suprime el gen que codifica para la enzima responsable de la conversión del ácido málico al ácido fumárico para crear un organismo que produce ácido málico. Con las actuales técnicas de biología molecular de vanguardia y el conocimiento de todo el mapa de combinaciones de E. coli, la delección de un gen particular es sólo una simple rutina. Para la producción de los ácidos málico y fumárico se aplica fácilmente un proceso de fermentación para la producción de ácido succínico que usa organismos que producen ácido málico y que producen ácido fumárico, respectivamente.

Todo el proceso es en continuo. En este proceso, una disolución concentrada de glucosa que también contiene agua de maceración ligera, como fuente de nitrógeno orgánico y factores de crecimiento, y nutrientes inorgánicos, se alimenta al fermentador a una velocidad suficiente para mantener la concentración de glucosa residual a o por debajo de 1 g/l. La baja concentración de glucosa es necesaria para prevenir la formación excesiva de ácido acético. La formación de ácido acético a concentraciones elevadas durante la fase de crecimiento aeróbico eventualmente detendrá el crecimiento del organismo y no se podrá conseguir una densidad celular elevada. Durante la fase de producción anaeróbica, las concentraciones elevadas de ácido acético disminuirán la velocidad de producción del ácido succínico y eventualmente la detendrán completamente. El uso de la AFP-111 puede reducir significativamente los costes de producción del ácido succínico mediante procesos de fermentación.

El mantenimiento de una baja concentración de glucosa en fermentadores comerciales se puede conseguir fácilmente mediante el control computerizado de la velocidad de alimentación de glucosa basado en el análisis del gas emitido o del análisis de la glucosa en el circuito. Esto se ha convertido en una práctica industrial muy común.

La fermentación anaeróbica es la ruta más antigua para la obtención de energía a partir de combustibles tales como la glucosa. En células anaeróbicas es el único proceso de producción de energía. En la mayoría de células facultativas, es una primera fase obligatoria en el catabolismo de la glucosa, a la cual sigue la oxidación aeróbica de los productos de fermentación a través del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.

El tipo de fermentación utilizado más ampliamente es la glucolisis, con el piruvato como penúltimo producto producido. La disposición del piruvato depende de qué genes están presentes en el organismo. En presencia de la enzima lactato deshidrogenasa, la glucolisis termina cuando el piruvato se reduce a lactato vía NADH y H^{+}. En presencia de la piruvato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa, se forma etanol. En presencia de la piruvato formato liasa (PFL), la fermentación termina con la producción de acetato, etanol, y formato, o hidrógeno más dióxido de carbono.

Si una mutación o una pluralidad de mutaciones en el genoma de la bacteria elimina los genes responsables en el organismo del catabolismo del piruvato, entonces el piruvato se acumulará. En el cultivo anaeróbico de E. coli, estos genes son la piruvato formato liasa (PFL) y la lactato deshidrogenasa (LDH). La cepa NZN-111 de E. coli, disponible ampliamente para los investigadores del Dr. David Clark, Southern Illinois University, Carbondale, Ill. 62901, contiene mutaciones en ambos genes por lo que ambas PFL y LDH están inactivadas debido a cambios en la secuencia del ADN cromosómico de E. coli. Como tal, la NZN-111 no puede crecer de manera fermentativa. La AFP-111, que procede de la NZN-111 aplicando cambios genéticos adicionales, produce una mezcla de ácido succínico, ácido acético y etanol en condiciones anaeróbicas, con el ácido succínico como producto principal.

Se ha encontrado que cambios adicionales en la NZN-111, que se producen tanto espontáneamente como durante el cultivo selectivo o mediante la transformación con plásmidos, finalmente da como resultado la aparición de la AFP-111 que produce ácido succínico como producto principal.

Las mutaciones cromosómicas espontáneas de NZN-111, que dan lugar a las características del tipo AFP-111, se producen cuando se utilizan entornos selectivos en técnicas de cultivo en serie. En una primera etapa, la biomasa de la NZN-111 se incrementa aeróbicamente en un medio rico, tal como el caldo Luria Bertaini (LB) (0,5% de extracto de levadura, 1% de triptona, y 1% de NaCl, pH 7,5). Son deseables rendimientos de entre 10^{9} a 10^{10} células por mililitro aproximadamente. Aunque los periodos de incubación pueden variar, duraciones de la fase de crecimiento de entre 5-7 horas, a 37ºC, y a una presión estándar producen las concentraciones anteriormente mencionadas.

Como segunda etapa, la biomasa ahora acumulada se somete a condiciones anaeróbicas ricas en glucosa para facilitar el crecimiento sólo de aquellas células (mutantes) capaces de catabolizar el piruvato. Por ejemplo, las células se extienden en placas de agar al 1,5% que contienen de 1 a 30 gramos por litro (g/l) de glucosa aproximadamente, preferentemente 10 g/l de glucosa, y 30 microgramos (\mug)/ml de kanamicina. El gen para la resistencia a kanamicina está insertado dentro del gen para la lactato deshidrogenasa en la NZN-111. Los cultivos se cultivan durante 24 horas a 37ºC, en una atmósfera anaeróbica controlada. Una atmósfera anaeróbica que produjo buenos resultados fue una mezcla de dióxido de carbono e hidrógeno, que se suministró mediante el uso de un dispositivo para el control de la atmósfera disponible comercialmente en Becton-Dickinson, Cockeysville, Maryland como
GASPAK^{TM}.

El periodo de incubación dio muchas colonias de AFP-111 (aproximadamente 2 por 10^{7} células) y aproximadamente la mitad de ellas eran capaces de crecer en medio líquido para producir la mezcla de productos deseada.

En el caso de la transformación con plásmidos, cuando la NZN-111 se transforma con el plásmido pMDH13 que contiene el gen mdh para una enzima malato deshidrogenasa mutante, se reanuda el catabolismo del piruvato para producir lactato. El cultivo en serie de este transformando (NZN-111 (pMDH13) da como resultado la AFP-111 que contiene una mutación cromosómica espontánea. La AFP-111 produce una mezcla de ácido succínico, ácido acético y etanol como productos de fermentación, produciéndose hasta el 99% en peso de ácido succínico comparado con el peso de la glucosa usada en el medio de cultivo. El protocolo de elaboración y transformación de pMDH13 es similar a aquel descrito en W.E. Boernke, y col. (10 de septiembre de 1995), Archives of Biochemistry and Biophysics 322, Nº 1, págs 43-52.

Para la evaluación experimental de las cepas descritas en el presente documento, las células se cultivaron aeróbicamente en medio de crecimiento exento de glucosa (Luria Broth) hasta que se alcanzaron unas densidades celulares de entre 0,5 y 10 de DO_{600}.

Una vez alcanzada esta biomasa apropiada de AFP-111, las células se inyectaron o se transfirieron de otra forma a la cámara de la reacción de fermentación sellada para estar contenidas en ella. El caldo se mezcló con glucosa o algún otro carbohidrato adecuado, tal como xilosa, galactosa o arabinosa a concentraciones variables entre 10 y 30 g/l aproximadamente. La mezcla ahora contenida se sometió a un cambio atmosférico mediante el cual se consiguieron condiciones anaeróbicas. Un medio para la consecución del cambio atmosférico es a través de una estación de gasificación mediante la cual el aire del ambiente se intercambia por dióxido de carbono.

Antes de la alimentación de la mezcla en la cámara de la reacción de fermentación, la cámara se provee con una cantidad apropiada de medio tamponante, tal como MgCO_{3}, CaCO_{3} o CaMg(CO_{3})_{2} para así mantener un pH cercano a la neutralidad. Para una capacidad tamponante adecuada normalmente se utiliza medio tamponante entre el 4 y el 8% en peso aproximadamente. Se obtienen resultados especialmente buenos cuando el medio tamponante está presente en forma de sólido para así conferir capacidad tamponante al líquido de fermentación por liberación a lo largo del tiempo.

El procedimiento anterior da como resultado rendimientos elevados de ácido succínico. Por ejemplo, se obtiene una relación 6:1 en peso de ácido succínico a ácido acético, con un rendimiento del 99%. La relación de ácido succínico a ácido acético aumenta incluso más cuando la fermentación se lleva a cabo en presencia de hidrógeno gaseoso a concentraciones de H_{2} de entre el 25% aproximadamente y el 100%. Estos resultados indican que, a diferencia de los organismos más modernos, el mutante AFP-111 usa hidrógeno exógeno como reductor. Por ejemplo, cuando están presentes caldo luria, glucosa, agente tamponante, y una mezcla de hidrógeno gaseoso y dióxido de carbono (el CO_{2} que se libera del agente tamponante), se obtienen relaciones de ácido succínico a ácido acético que se aproximan a 9. Este resultado refleja otra ventaja de la identificación del catabolismo de la glucosa al producto deseado, sin reacciones secundarias de producción de acetato no deseadas.

La Tabla 1 a continuación ilustra la distribución del producto de los ácidos dicarboxílicos para las cepas W1485 parental original (también disponible en la Souther Illinois University), NZN-111 y AFP-111.

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TABLA 1 Rendimiento del producto en rendimiento molar, a saber, glucosa inicial (porcentaje molar) para la AFP-111 y los antecesores

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\text{*}: Los valores del rendimiento molar en teoría pueden ser del 200% debido a que una molécula de glucosa puede dar dos de todos los productos.

Cuando se utiliza una atmósfera de dióxido de carbono al 100%, se mejora la producción de ácido succínico con concentraciones de ácido succínico que alcanzan los 45 gramos por litro aproximadamente, la productividad que alcanza los 1,6 gramos por litro y hora aproximadamente, el porcentaje del rendimiento de gramos de ácido succínico a gramos de glucosa que alcanza el 99% y la relación ponderal de ácido succínico a ácido acético que llega a 6 aproximadamente.

También se produce ácido succínico cuando la enzima málica dependiente de NAD de E. coli se produce en NZN-111 (mediante la adición o inducción del gen maeA). En este caso, se usa el plásmido inducible pMEE2-1 para permitir la expresión del gen de la enzima málica en el transformante NZN-111 (pMEE2-1).

El ADN genómico aislado de E. coli MC1061 se usó como molde para la clonación de la enzima málica por PCR. La E. coli MC1061 se digirió con las endonucleasas de restricción Hind III y Pst I, con el material digerido resultante clasificado por tamaño en gel de agarosa TAE al 1%. El tamaño del fragmento de ADN genómico que contiene el gen de la enzima málica se determinó usando el análisis de transferencia Southern con el sistema de detección de ácidos nucleicos PhotoGen (Cat. 8192SA), como se ha descrito anteriormente.

Los cebadores estaban basados en la secuencia de ADN parcial publicada del gen:

	Sentido:	CGAAGAACAAGCGGAACGAGCAT
	Antisentido:	GGCAGCAGGTTCGGCATCTTGTC.

Estos cebadores se combinaron en 1 microlitro (\muM) con 20 nanogramos (ng) de ADN genómico en una reacción de PCR de 100 microlitros (\mul) normal que produjo el fragmento interno de 0,8 kilobases (kb) esperado del gen de la enzima málica. El producto de la PCR se purificó usando un Qiaex Gel Extraction Kit (Qiagen, Inc., Chatsworth, California) y se biotiniló usando un BioNick Labeling System (GibcoBRL, Gaithersburg, Maryland). El producto biotinilado de la PCR se usó como sonda en el análisis de transferencia Southern del ADN genómico de E. coli que se había escindido con Hind III y una de diversas otras segundas endonucleasas. Se determinó que el gen de la enzima málica estaba localizado en la región que contiene fragmentos de 2,0-2,5 kb del ADN digerido con Hind III y Pst I.

Un microgramo de ADN de E. coli se digirió con Hind III y Pst I y se clasificó por tamaño en un gel de agarosa TAE al 1% preparativo. Los fragmentos del ADN de E. coli en la región de 2,0-2,5 kb se aislaron y purificaron usando el Qiaex Gel Extraction Kit. Los fragmentos de ADN purificados se ligaron en la región del poliligador de pUC19 que se había escindido con Pst I y Hind III y se trataron con fosfatasa alcalina de camarón. A continuación el material ligado se usó como molde para una reacción de PCR para amplificar todo el gen de la enzima málica. Se usó un microlitro de la mezcla de ligación como molde con 1 \muM del cebador sentido GATGCCCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGT, que tiene como diana el gen de la enzima málica y 0,25 \muM del cebador antisentido TTTTCCCAGTCACGACGTTG, que tiene como diana el ADN de pUC19 ligado. Los parámetros de amplificación fueron desnaturalización a 94ºC, hibridación a 55ºC durante un minuto y extensión a 72ºC durante tres minutos para un total de 35 ciclos. El producto de la PCR se analizó en un gel de agarosa TAE al 1% y el fragmento de 1,8 kb se aisló y se purificó usando el Qiaex Gel Extraction Kit. Una fracción del producto de la PCR se digirió con Bcl y Bgl para demostrar que el producto contenía el gen de la enzima málica. El resto del producto de la PCR se digirió con Pst I y Nco I, se aisló en gel, se volvió a purificar y a continuación se ligó dentro de la región del poliligador del vector de expresión pTRC99a (Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey) que se había escindido con Pst I y Nco I. La cepa NZN-111 de E. coli se transformó con la mezcla de ligación mediante procedimientos habituales y las colonias resultantes (cuatro colonias de los experimentos y dos colonias del control) se seleccionaron para el gen de la enzima málica mediante el análisis de los fragmentos de restricción usando Xmn (fragmentos esperados de 0,7 kb, 1,4 kb y 3,9 kb). El plásmido que contiene el gen de la enzima málica clonado se denominó pMEE3.

Un cultivo de 100 ml de NZN (pMEE3) se cultivó en un cultivo durante toda la noche y el plásmido se aisló usando un Qiagen Plasmid Kit. El plásmido aislado se usó como molde para la reacción de la PCR. Se diseñó un nuevo cebador para dar un N-término alternativo que estaba 81 pares de bases corriente abajo del cebador usado en la primera clonación de la enzima málica. Se usaron 20 nanogramos de plásmido como molde con 1 \muM de cebador sentido AGGATCCATGGAACCAAAAACAAAAAAC y cebador antisentido CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC. Los parámetros de amplificación fueron idénticos a los indicados anteriormente. De nuevo se verificó una fracción del producto de la PCR mediante el mapeo por restricción con Bcl I y Bgl II que verificó que el producto contenía el gen de la enzima málica. El resto del material de la PCR se digirió con Pst I y Nco I y se aisló con un gel, se volvió a purificar y a continuación se ligó dentro de la región del poliligador del vector de expresión pTRC99a (Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.) que se había escindido con Nco I y Pst I. La cepa JM109 de E. coli se transformó con la mezcla de ligación mediante procedimientos habituales y las colonias resultantes (tres clones experimentales y un clon control) se seleccionaron para el inserto deseado mediante el análisis de los fragmentos de restricción. El plásmido que contenía esta versión del gen de la enzima málica se denominó pMEE2.

30 ml del caldo LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina se inocularon con 1,5 ml de un cultivo de pMEE2 durante toda la noche. Después de dos horas de crecimiento, el cultivo de 30 ml se separó en alícuotas de 3-10 ml. La actividad enzimática se indujo con isopropiltiogalactósido (IPTG) 0, 100 \muM, y 10 \muM. Se extrajo una muestra de 2 ml de cada cultivo a las 0, 1, 2, 3 y 4 horas. La proteína se aisló según los procedimientos habituales y la actividad se determinó como se ha indicado anteriormente.

La producción enzimática, a lo largo del tiempo se presenta en la Tabla 2 a continuación:

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TABLA 2 Producción de la enzima málica inducida por IPTG en caldo LB

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Se cultivaron aeróbicamente cultivos duplicados de NZN-111 (pMEE2) y, como control, NZN-111 (pTRC99a) en 2 ml de medio LB que contenía ampicilina. Un cultivo de cada se indujo con IPTG 10 \muM. Después de tres horas, la DO_{600} se había incrementado desde 0,6 a 4,8. Un mililitro de los cultivos se inyectó en viales de 58 ml sellados que contenían 10 ml de medio LB con glucosa a 20 g/l, acetato a 1 g/l y 0,5 g de MgCO_{3} sólido. La atmósfera consistía en aire:hidrógeno:dióxido de carbono en una relación de 1:1:2 a 1 atmósfera de presión por encima de la presión atmosférica. Se tomaron muestras del cultivo inmediatamente y a intervalos durante la incubación a 37ºC con agitación a 100 rpm. La Tabla 3 a continuación proporciona una comparación de los rendimientos del producto cuando NZN-111 se transforma con un vector en bruto (pTRC99a) frente a pMEE2.

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TABLA 3 Efecto de la expresión de la enzima málica en NZN-111 (pMEE2) frente a NZN-111 (pTRC99a)

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Los resultados presentados en la Tabla 3 son el resultado de periodos de incubación de entre 19 y 42 horas aproximadamente.

El ácido málico, un precursor del ácido succínico, en principio es un mejor producto final que el ácido succínico, puesto que su producción requiere una etapa reductora menos. La estequiometría teórica para la producción de ácido málico es un mol de glucosa y dos moles de dióxido de carbono convertidos en dos moles de ácido málico. Como tal, la producción de ácido málico se puede producir sin el desperdicio de glucosa. También se podría formar ácido fumárico, que es el producto de deshidratación del ácido málico y el precursor del succinato en la ruta de reducción. Tanto el ácido málico como el ácido fumárico también se podrían formar sin la producción de coproducto, pero la mayor solubilidad del ácido málico lo hace preferible para procesos de producción a gran escala.

La transformación de bacterias adecuadas con un gen responsable de la producción de la enzima málica (tal como maeA) podría dar como resultado en un exceso de malato. Generalmente, la bacteria ideal carecerá de actividad lactato deshidrogenasa, y otras enzimas que metabolicen el piruvato, dando así como resultado en una acumulación del piruvato. En su lugar las bacterias se transforman con maeA para producir directamente malato. Para mantener los niveles elevados de malato producido, la bacteria no puede ser capaz de convertir el malato de nuevo a lactato, o en fumarato o succinato. Puesto que algunas cepas del Lactobacillus carecen de la enzima malolactato, fumarasa, y fumarato reductasa responsables de tales conversiones, estas cepas son candidatos particularmente adecuados para la producción de malato en procesos de fermentación. La idoneidad del Lactobacillus es mayor dadas sus características altamente osmotolerantes. El Lactobacillus gasseri es un hospedador a corto plazo para tal manipulación puesto que se ha demostrado que no metaboliza el malato durante la fermentación de la glucosa y está bastante bien caracterizado genéticamente. El Lactobacillus casei también tiene un potencial considerable puesto que presenta una osmotolerancia relativamente superior al L. gasseri.

Generalmente, un gen de la enzima málica (tal como maeA) en un vector de expresión de Lactobacillus adecuado, tal como pTRK327 inducido en un hospedador Lactobacillus que carece de un gen funcional para la lactato deshidrogenasa, permitirá la formación de ácido málico. Esto se puede conseguir mediante la inserción de la enzima málica dentro del gen de la lactato deshidrogenasa del hospedador.

Los compuestos químicos usados para los siguientes ejemplos para la producción de ácidos carboxílicos incluyen: extracto de levadura y triptona (Difco), glucosa (A. E. Staley), agua de maceración ligera (A. E. Staley, planta de procesado de maíz en Loudon, Tn.), compuestos químicos inorgánicos (E. Merck Science o J.T. Baker, calidad de reactivo). El equipamiento usado incluye: fermentador de 1 L (Virtis), fermentador de 5 L (New Brunswick, Bioflow 3000), bombas (Cole-Parmer, Master Flex), sondas de pH (Cole-Parmer), controladores de pH (Cole-Parmer, Chem Cadet), medidor del oxígeno disuelto (Cole-Parmer, 01971-00), sondas del oxígeno disuelto (Ingold), autoclave (Amsco, Eagle 3000), agitador (New Brunswick), viales criogénicos (Cole-Parmer).

El analizador de glucosa procede de la Yellow Springs Instrument Company (YSI 2700 Select). Además, el espectrofotómetro para la medición de las DO es de Milton Roy (SPEC 21D).

La cepa AFP-111 de E. coli se obtuvo del Argonne National Laboratory. La cepa AFP-111 procedía de la NZN-111. El cultivo madre se preparó poniendo 1 g de carbonato de magnesio (MgCO_{3}) en un matraz de 250 ml, cubriendo con un tapón de espuma y autoclavando a 121ºC durante 20 minutos. A continuación, se prepararon 500 ml de medio que contenían 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de glucosa, 10 g/l de cloruro sódico (NaCl), 7 g/l de fosfato de potasio (K_{2}HPO_{4}), 3 g/l de fosfato de potasio (KH_{2}PO_{4}). A continuación el medio se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se transfirieron asépticamente 50 ml de medio al primer matraz que contenía el carbonato de magnesio. A continuación el matraz se inoculó con un bucle de inoculación completo de AFP-111 de un cultivo en agar inclinado enviado por el Argonne National Laboratory. A continuación el matraz inoculado se incubó en un agitador a 250 rpm a 37ºC.

A continuación se preparó un litro de medio que contenía 10 g/l de triptona, 5 g/l de glucosa, 10 g/l de NaCl, 7 g/l de K_{2}HPO_{4}, 3 g/l de KH_{2}PO_{4} y 0,2 g/l de sulfato de magnesio (MgSO_{4}). El medio se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos y se dejó enfriar. A continuación se transfirieron asépticamente 850 ml a un fermentador de 1 litro.

Cuando el matraz de 250 ml se hubo incubado durante 16 horas, todo su contenido se transfirió asépticamente al fermentador de 1 litro. El fermentador se mantuvo a 37ºC y a un pH de 7,0. Se inyectó aire en la parte inferior del fermentador y la velocidad del impulsor se ajustó a 500 rpm o superior para asegurar una transferencia de oxígeno suficiente al caldo de fermentación para evitar la limitación de oxígeno. El pH se mantuvo a 7 mediante un controlador de pH que activaba una bomba bajo demanda para añadir una disolución básica al fermentador.

La disolución básica se preparó poniendo 250 ml de agua desionizada en una probeta graduada de 500 ml con un agitador magnético. La probeta graduada se cubrió con dos capas de cubierta de papel para autoclavado y se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos, y a continuación se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se añadieron 250 ml de hidróxido de amonio al 30% (NH_{4}OH). A continuación se añadió una sobrecubierta de aceite para prevenir el escape de amoniaco. El aceite se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos antes de añadirlo a la probeta. La disolución se mezcló agitando en una placa magnética. La disolución básica resultante era una disolución de NH_{4}OH al 15%.

Para preparar una disolución de glicerol, se pusieron 15 g de glicerol en un matraz pequeño al cual se añadieron 15 ml de agua desionizada. Se añadió un agitador magnético pequeño al matraz y a continuación el matraz se cubrió con un tapón de espuma y se mezcló en una placa magnética para preparar una disolución de glicerol al 50%. La disolución de glicerol se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos, y a continuación se dejó enfriar a temperatura ambiente.

Cuando la concentración de glucosa en el fermentador era de 1 g/l aproximadamente, se extrajeron asépticamente 30 ml del fermentador y se añadieron al matraz de glicerol al 50%. A continuación la mezcla se agitó en una placa magnética. La mezcla se transfirió asépticamente a viales criogénicos (esterilizados antes del empaquetamiento por el fabricante), aproximadamente 1,2 ml por vial. Los viales se sellaron y se almacenaron en un congelador a -70ºC. Estos viales sirvieron como cultivo madre de la AFP-111 para todos los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1

El inóculo se cultivó en un matraz de agitación. El medio contenía 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de glucosa, 10 g/l de NaCl, 14 g/l de K_{2}HPO_{4}, 6 g/l de KH_{2}PO_{4}, 2 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4} y 0,2 g/l de MgSO_{4}. 50 ml de medio se pusieron en un matraz de 250 ml. El matraz se tapó, se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos, se enfrió a temperatura ambiente y se inoculó con 1 ml de un vial del cultivo madre. A continuación se incubó a 37ºC a 200 rpm durante 16 horas. El medio de fermentación contenía 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de glucosa, 10 g/l de NaCl, 1,4 g/l de K_{2}HPO_{4}, 0,6 g/l de KH_{2}PO_{4}, 2 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4} y 0,2 g/l de MgSO_{4}. Se preparó un litro de medio, se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos, y se dejó enfriar a temperatura ambiente antes de que se transfirieran 850 ml al fermentador de un litro. El fermentador se inoculó con todo el contenido del matraz. (El medio de fermentación contiene bajas concentraciones de glucosa inferiores a 10 g/l). La fermentación se llevó a cabo a 37ºC y a un pH de 7,0 con ventilación. El pH se mantuvo a 7,0 añadiendo una disolución de NH_{4}OH al 15% bajo demanda mediante la acción de un controlador del pH. Cuando la glucosa inicial se hubo agotado en el caldo de fermentación, se puso en marcha una bomba de alimentación para añadir una disolución de alimentación al
fermentador.

La disolución de alimentación (disolución 1) se preparó disolviendo 250 g de glucosa y 50 g de agua de maceración ligera en 400 ml de agua desionizada. Esta disolución 1 se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos y se enfrió a temperatura ambiente. A continuación para la disolución 2, se disolvieron 5 g/l de NaCl, 7 g/l de K_{2}HPO_{4}, 3 g/l de KH_{2}PO_{4}, 22,5 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4} y 1 g/l de MgSO_{4} en 100 ml de agua desionizada. A continuación la disolución se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos, se enfrió a temperatura ambiente y se añadió a la disolución 1. La disolución resultante se usó como alimentación para el fermentador.

La velocidad de la bomba de alimentación se controló manualmente para mantener la concentración de glucosa residual en el fermentador a o por debajo de 1 g/l. Cuando la concentración de glucosa ascendió por encima de 1 g/l, la velocidad de la bomba se redujo. Cuando la concentración de glucosa era demasiado elevada, 5 g/l aproximadamente o superior, la bomba se desconectó hasta que la concentración de glucosa hubo descendido por debajo de 1 g/l. Durante las primeras 24 horas, el fermentador se aireó para proporcionar un entorno aeróbico que permitió al organismo crecer hasta una densidad celular elevada. La densidad óptica medida a 660 nm (DO_{660}) fue de 24 a las 24 horas. A continuación se cerró la llave del aire para establecer un entorno anaeróbico y forzar al organismo al metabolismo anaeróbico para la producción del ácido succínico. Las condiciones anaeróbicas se mantuvieron hasta el final del experimento. Durante la fase anaeróbica, la concentración de glucosa se mantuvo a o por encima de 1
g/l.

Los resultados del Ejemplo 1 se representan en la Fig. 1 y se resumen a continuación en la Tabla 4.

TABLA 4

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Ejemplo 2

El experimento en este ejemplo se llevó a cabo exactamente de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que la llave del aire se cerró después de seis horas en lugar de después de 24 horas. En el momento del cierre de la llave del aire, la DO_{660} era 6.

Los resultados se representan en la Fig. 2 y se resumen en la Tabla 5.

TABLA 5

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Los resultados indicaron una mejora significativa por la transición temprana desde condiciones aeróbicas a condiciones anaeróbicas en el fermentador.

Ejemplo 3

El medio usado en este ejemplo contenía lo siguiente: 2 g/l de extracto de levadura, 15 g/l de triptona, 2 g/l de NaCl, 2 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,6 g/l de CaCl_{2}, 0,5 g/l de MgSO_{4}, 1,3 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,01 g/l de MnCl_{2}. Se llevaron a cabo cuatro fermentaciones en el fermentador de cinco litros. El pH en estos experimentos se controló a 6,2, 6,6, 7,0 y 7,4 añadiendo NaOH 5 N bajo demanda. El inóculo se cultivó en un matraz de agitación usando el mismo medio ajustado a pH 7,0. En los fermentadores, las células se cultivaron aeróbicamente con inyección de aire y la velocidad del impulsor a 500 rpm hasta que la DO_{660} alcanzó 6 (de 5 a 6 horas aproximadamente). A continuación la agitación se redujo a 250 rpm y la inyección de gas se cambió por dióxido de carbono puro.

Los resultados del Ejemplo 3 se representan en la Fig. 3 y se resumen en la Tabla 6. La Tabla 6 es una comparación de los resultados de la fermentación a las 100 horas a diferentes valores de pH.

TABLA 6

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Los resultados indicaron que el ácido succínico se podía producir a lo largo de un amplio intervalo de pH, preferentemente a pH de 6,6 a 7,0 aproximadamente.

Ejemplo 4

En este ejemplo, tanto el extracto de levadura como la triptona se reemplazaron por agua de maceración ligera, que es un subproducto de muy bajo coste de la industria del procesamiento del maíz. El agua de maceración ligera se preparó ajustando el pH del agua de maceración a 7,0 con NaOH al 50%. Los sólidos suspendidos se retiraron por filtración a través de un papel de filtro Whatman del Nº 2. El filtrado claro se usó en el experimento de fermentación.

El inóculo se cultivó en un matraz de agitación. Se preparó una disolución con lo siguiente: 20 g/l de NaCl, 28 g/l de K_{2}HPO_{4}, 12 g/l de KH_{2}PO_{4}, 4 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,4 g/l de MgSO_{4}. La disolución se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos. A continuación, se añadieron 30 ml del filtrado del agua de maceración ligera a un matraz de 250 ml. El matraz se tapó, se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos y a continuación se dejó enfriar a temperatura ambiente. A continuación se añadió al matraz 30 ml de la disolución 1 (del Ejemplo 1). Por tanto, este medio contenía el filtrado del agua de maceración ligera al 50%. El matraz se inoculó con 0,1 ml de un vial del cultivo madre de glicerol (Ejemplo 1) y se incubó a 35ºC y 200 rpm durante 16 horas.

Se preparó una disolución 2 con lo siguiente: 20 g/l de NaCl, 2,8 g/l de K_{2}HPO_{4}, 1,2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 4 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, y 0,4 g/l de MgSO_{4}. A continuación esta disolución se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Al fermentador de un litro se le añadieron 425 ml del filtrado del agua de maceración ligera. El fermentador se autoclavó a 121ºC durante 20 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente. A continuación se añadieron 425 ml de la disolución 2 al fermentador de un litro que da como resultado que el medio de fermentación contenga el filtrado del agua de maceración ligera al 50%. El fermentador se inoculó con todo el contenido del matraz de agitación. La fermentación se llevó a cabo a 37ºC y a pH 7,0. El pH se mantuvo a 7,0 añadiendo una disolución de carbonato sódico 1,5 M bajo demanda. Esta disolución se esterilizó autoclavando a 121ºC. Inicialmente las células se cultivaron aeróbicamente inyectando aire en el fermentador durante seis horas. El oxígeno disuelto se controló durante este periodo. Ocasionalmente, el nivel de oxígeno disuelto cayó por debajo del 5% de saturación, pero con la inyección continua de aire, las condiciones en el interior del fermentador aún eran aeróbicas. Al final de ese periodo, se cerró la llave del aire para iniciar la producción de ácido succínico mediante el metabolismo anaeróbico del organismo. Al mismo tiempo, se puso en marcha una bomba para alimentar en el fermentador una disolución que contenía 500 g/l de glucosa aproximadamente. La velocidad de la bomba de alimentación se ajustó manualmente para mantener la concentración de glucosa en el caldo de fermentación por encima de o igual a 1 g/l.

Los resultados del Ejemplo 4 se representan en la Fig. 4 y se resumen en la Tabla 7. La Tabla 7 muestra la acumulación de ácido succínico en el medio de fermentación del agua de maceración ligera al 50%.

TABLA 7

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Estos resultados indicaron que el ácido succínico se puede producir en un medio barato en el que tanto el extracto de levadura y la triptona caros se sustituyen por el agua de maceración ligera barata.

Ejemplo 5

En este ejemplo, la concentración de agua de maceración ligera tanto en el matraz de agitación como en el medio de fermentación se redujo hasta el 25%. El resto de condiciones eran exactamente iguales a aquellas descritas en el Ejemplo 4. Se añadió agua para compensar el déficit de volumen debido a las menores cantidades de agua de maceración ligera usadas.

Los resultados se representan en la Fig. 5 y se resumen en la Tabla 8. La Tabla 8 muestra la acumulación de ácido succínico en el medio de fermentación de agua de maceración ligera al 25%.

TABLA 8

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Los resultados indicaron que el ácido succínico se puede producir en un medio incluso más económico en el que el agua de maceración ligera se redujo hasta el 25%.

Ejemplo 6

En este ejemplo, la concentración de agua de maceración ligera tanto en el matraz de agitación como en el medio de fermentación era del 25% y la base era carbonato amónico 1,5 M. El resto de condiciones eran idénticas a las descritas en el Ejemplo 4.

Los resultados se representan en la Fig. 6 y se resumen en la Tabla 9 que muestra la acumulación de ácido succínico en el medio de fermentación de agua de maceración ligera al 25% con carbonato amónico para el control del pH.

TABLA 9

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Los resultados indicaron que las sales carbonato distintas del carbonato sódico, tales como el carbonato de amonio, carbonato de magnesio, etc. se pueden usar para el control del pH en un proceso de fermentación del ácido succínico.

Ejemplo 7

En este ejemplo se describen cuatro experimentos. En dos experimentos, la concentración de agua de maceración ligera tanto en el matraz de agitación como en el medio de fermentación era del 25% y la base era NaOH 2 M. En los otros dos experimentos, la concentración de agua de maceración ligera era del 50% y la base era NH_{4}OH al 15%. Dentro de cada grupo de dos experimentos que usa la misma base para el control del pH, se inyectó dióxido de carbono puro dentro del fermentador a 100 ml por minuto aproximadamente en un experimento durante la fase anaeróbica para la producción del ácido succínico mediante metabolismo anaeróbico.

Los resultados se representan en la Fig. 7 y se resumen en la Tabla 10. La Tabla 10 muestra la acumulación de ácido succínico en el medio de fermentación de agua de maceración ligera con hidróxido de amonio e hidróxido sódico para el control del pH.

TABLA 10

111

Los resultados indicaron que si se usa una base distinta de una sal carbonato para el control del pH, se necesitaría la inyección de dióxido de carbono gaseoso dentro del fermentador durante la fase anaeróbica para una producción significativa de ácido succínico.

La presente invención también prevé un procedimiento para la producción de ácido málico por fermentación. El ácido málico, un precursor del ácido succínico, en principio es un mejor producto final que el ácido succínico, puesto que su producción requiere una etapa reductora menos. La estequiometría teórica para la producción del ácido málico es un mol de glucosa y dos moles de dióxido de carbono convertidos en dos moles de ácido málico. Como tal, la producción del ácido málico se puede producir sin el desperdicio de glucosa. También se puede formar ácido fumárico, que es el producto de deshidratación del ácido málico y el precursor del succinato en la ruta de reducción. Tanto el ácido málico como el ácido fumárico también se pueden formar sin la producción del coproducto, pero la mayor solubilidad del ácido málico lo hace preferible para los procesos de producción a gran escala.

La presente invención también puede ser un proceso de fermentación en continuo que consta de un fermentador y un tanque de sedimentación. Las células que sedimentan en el fondo del tanque de sedimentación se devuelven al fermentador para incrementar la concentración celular, que a su vez incrementa la productividad. Se ha observado que las células floculan y sedimentan extremadamente bien cuando se detiene la mezcla.

El ácido succínico también se produce mediante un proceso de fermentación en continuo que consta de un fermentador y una unidad de ultrafiltración. Las células recogidas en esta unidad se devuelven al fermentador para incrementar la concentración celular, que a su vez incrementa la productividad. La retirada del producto(s) de fermentación del caldo mediante la unidad de ultrafiltración disminuye la inhibición del producto e incrementa el rendimiento.

El ácido succínico también se produce mediante un proceso de fermentación en continuo en el que un adsorbente se añade a y se retira del fermentador de manera continua. La retirada del producto(s) de fermentación del caldo disminuye la inhibición del producto e incrementa el rendimiento.

El ácido succínico también se produce mediante un proceso en discontinuo que consta de dos fermentadores en serie. El organismo se cultiva en condiciones aeróbicas en el primer fermentador (fermentador de crecimiento) hasta una densidad celular elevada. A continuación la biomasa se transfiere al segundo fermentador (fermentador de producción) en el que se aplican condiciones anaeróbicas para promover la producción de ácido succínico. A continuación el fermentador de crecimiento se puede limpiar y se puede usar para crecer más biomasa para transferir a otro fermentador de producción. Puesto que el tiempo de producción es mucho más prolongado que el tiempo de crecimiento, se puede usar un fermentador de crecimiento para proporcionar biomasa a una serie de fermentadores de producción.

Aunque se ha mostrado y descrito lo que hasta ahora se consideran las formas de realización preferidas de la invención, será obvio para aquellos expertos en la materia que se pueden introducir en ellas diversos cambios y modificaciones, sin apartarse del alcance de la invención definida por las reivindicaciones anexas.

Claims

1. Un procedimiento para la producción de ácidos carboxílicos que comprende las etapas de:

a): la inoculación de un medio que tiene una fuente de carbono con un microorganismo que produce un ácido carboxílico que tiene una biomasa;

b): la incubación de dicho microorganismo en una atmósfera aeróbica para promover el crecimiento rápido de dicho microorganismo incrementando así dicha biomasa de dicho microorganismo;

c): la liberación de oxígeno de manera controlada para mantener dicha atmósfera aeróbica;

d): la alimentación de manera controlada a dicho microorganismo con una disolución que contiene dicha fuente de carbono para mantener una concentración de dicha fuente de carbono dentro de dicho medio entre 0,5 g/l aproximadamente y 1 g/l aproximadamente;

e): la privación a dicha atmósfera aeróbica de dicho oxígeno para producir una atmósfera anaeróbica para provocar que dicho microorganismo cambie a metabolismo anaeróbico;

f): la alimentación de manera controlada a dicho microorganismo con dicha disolución que contiene dicha fuente de carbono para mantener una concentración de dicha fuente de carbono dentro de dicho medio de \geq 1 g/l; y

g): la conversión de dicha fuente de carbono a ácidos carboxílicos usando dicho metabolismo anaeróbico de dicho microorganismo.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho microorganismo se selecciona del grupo constituido por las bacterias Escherichia coli y Lactobacillus.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho microorganismo es osmotolerante por lo que dicho microorganismo es capaz de producir ácidos orgánicos sin ninguna inhibición del metabolismo de dicho microorganismo.

4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho microorganismo es una bacteria Escherichia coli procedente de un microorganismo parental que carece de los genes para la piruvato formato liasa y la lactato deshidro-
genasa.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicho microorganismo está manipulado genéticamente para expresar una enzima que permite que dicho microorganismo convierta el piruvato a ácidos dicarboxílicos.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicha enzima es la enzima málica.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho microorganismo que usa dicho metabolismo anaeróbico produce ácido succínico, ácido acético y etanol, en el que dicho ácido succínico es el producto principal.

8. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho microorganismo que usa dicho metabolismo anaeróbico produce ácido málico, ácido acético y etanol, en el que dicho ácido málico es el producto principal.

9. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho microorganismo que usa dicho metabolismo anaeróbico produce ácido fumárico, ácido acético y etanol, en el que dicho ácido fumárico es el producto principal.

10. Un procedimiento para la producción de ácidos carboxílicos que comprende:

a): la inoculación de un medio que tiene una fuente de carbono con un microorganismo que produce ácidos carboxílicos que tiene una biomasa;

b): la incubación de dicho microorganismo en un entorno con un valor de pH mantenido y con una atmósfera aeróbica para promover el crecimiento rápido de dicho microorganismo incrementando así dicha biomasa de dicho microorganismo;

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e): la transferencia de dicho microorganismo que tiene una biomasa incrementada a un fermentador de producción con una atmósfera anaeróbica para provocar que dicho microorganismo cambie a metabolismo anaeróbico;

f): la alimentación de manera controlada a dicho microorganismo con una disolución que contiene dicha fuente de carbono para mantener una concentración de dicha fuente de carbono dentro de dicho fermentador de producción de \geq 1 g/l; y

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho microorganismo se selecciona del grupo constituido por las bacterias Escherichia coli y Lactobacillus.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho microorganismo es osmotolerante por lo que dicho microorganismo es capaz de producir ácidos orgánicos sin ninguna inhibición del metabolismo de dicho microorganismo.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho microorganismo es una cepa de Escherichia coli procedente de un microorganismo parental que carece de los genes para la piruvato formato liasa y la lactato deshidrogenasa.

14. El procedimiento de la reivindicación 10 en el que dicho microorganismo está manipulado genéticamente para expresar una enzima que permite que dicho microorganismo convierta el piruvato a ácidos dicarboxílicos.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha enzima es la enzima málica.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho microorganismo que usa dicho metabolismo anaeróbico produce ácido succínico, ácido acético y etanol, en el que dicho ácido succínico es el producto principal.

17. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho microorganismo que usa dicho metabolismo anaeróbico produce ácido málico, ácido acético y etanol, en el que dicho ácido málico es el producto principal.

18. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho microorganismo que usa dicha atmósfera anaeróbica produce ácido fumárico, ácido acético y etanol, en el que dicho ácido fumárico es el producto principal.