PT1012323E

PT1012323E - Método para a preparação de ácidos dicarboxílicos.

Info

Publication number: PT1012323E
Application number: PT98903871T
Authority: PT
Inventors: Mark Donnelly; Cynthia S Millard; Lucy Stols; Nhuan Phu Nghiem
Original assignee: Ut Battelle Llc; Uchicago Argonne Llc
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2007-05-31
Also published as: EP1012323B1; JP2000515389A; CN1121500C; AU724274B2; HUP0001997A2; EP1012323A4; CA2278892A1; AU6052398A; CA2278892C; DE69837607T2; EP1012323A1; US5869301A; CN1246155A; ES2285757T3; JP3681404B2; BR9806822A; ATE360084T1; HU227509B1; BR9806822B1; DK1012323T3

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDOS DICARBOXÍLICOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para a produção de ácidos dicarboxilicos, particularmente um método de fermentação utilizando uma estirpe de Escherichia coli para produzir quantidades elevadas de ácidos dicarboxilicos, tais como ácido málico, ácido fumárico e ácido succinico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os ácidos carboxilicos e seus derivados são amplamente utilizados como substâncias quimicas especializadas para aplicações em polímeros, alimentos, fármacos e cosméticos. 0 ácido succinico, por exemplo, é útil para a produção de tais precursores plásticos como butano-1,4-diol (BDO) , tetra-hidrofurano e gama-butirolactona. Estão em desenvolvimento continuo novos produtos derivados de ácido succinico, incluindo o desenvolvimento de poliéster. 0 poliéster é preparado pela ligação de ácido succinico e BDO. Geralmente, os ésteres de ácidos succinicos têm o potencial de serem novos solventes "verdes" que podem suplantar solventes mais nocivos e servem como precursores de milhões de libras de substâncias quimicas anualmente, num valor de mercado total de mais de mil milhões de dólares. 1 A produção de ácidos carboxilicos, tais como ácido málico, ácido succinico e ácido fumárico, a partir de matérias-primas renováveis (neste caso através de processos de fermentação) constitui uma via para suplantar os métodos intensivos mais energéticos de obtenção de tais ácidos a partir de fontes não renováveis. 0 succinato é um intermediário de fermentações anaeróbias por bactérias produtoras de propionato mas esses processos resultam em baixos rendimentos e baixas concentrações.

Foram isolados muitos organismos produtores de ácido succinico, tais como as bactérias anaeróbias do rúmen, Bacteroides ruminicola e Bacteroides amylophilus. Contudo, os organismos do rúmen são caracteristicamente instáveis em processos de fermentação. Outro organismo produtor de ácido succinico é o Anaerobiospirillum succiniciproducens {A. succiniciproducens) . Foram concedidas várias patentes acerca da utilização deste organismo para produzir ácido succinico num processo de fermentação anaeróbio. Uma tal patente por Glassner et al, Patente U.S. N°. 5143834, descreve a utilização deste organismo em processos de fermentação para produzir naturalmente ácido succinico com rendimentos moderados. Contudo, os processos de fermentação utilizando A. succiniciproducens possuem num número de problemas. Um problema é que o organismo é um anaeróbio estrito, a sua cultura deve ser realizada num ambiente absolutamente livre de oxigénio. A propagação deste organismo numa instalação de fermentação comercial é dificil e requer trabalhadores altamente especializados. 0 A. succiniciproducens é igualmente dificil de manusear, mesmo na prática à escala laboratorial, e tende a degenerar sob condições desfavoráveis. A sua degeneração não pode ser invertida. 0 organismo nunca foi utilizado num processo de fermentação comercial. Por outras palavras, a experiência de fermentação à escala de produção com 2 este organismo específico é inexistente. Além disso, o organismo requer uma fonte externa de dióxido de carbono para alcançar um rendimento elevado de ácido succínico. Num processo de fermentação, uma corrente de dióxido de carbono puro deve ser injectada para dentro do caldo de fermentação. 0 A. succiniciproducens produz uma mistura de ácidos succínico e acético a uma razão molar succinato:acetato de cerca de 2. A presença de ácido acético no caldo de fermentação em concentrações elevadas aumenta o custo de purificação do ácido succínico. A produção do co-produto acetato ilustra que um terço da dispendiosa glucose não é convertido em succinato. Além disso, demonstrou-se que a estirpe hospedeira A. succiniciproducens não era grandemente osmotolerante, na medida em que não tolera concentrações elevadas de sais e é, adicionalmente, inibida por concentrações moderadas de produto. Outro problema que a utilização de A. succiniciproducens apresenta é que a preparação de meio para o inoculo requer a adição de triptofano e requer, igualmente, a mistura de quatro soluções diferentes, uma das quais contém H2S, corrosivo e tóxico.

Sabe-se, desde há muito, que é produzida uma mistura de ácidos a partir da fermentação de E. coli, como elaborado por J.L. Stokes em 1949 "Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli," J. Bacteriol., 57: 147-158. Contudo, para cada mole de glucose fermentada, são apenas produzidas 1,2 moles de ácido fórmico, 0,1-0,2 moles de ácido láctico e 0,3-0,4 moles de ácido succínico. Como tal, esforços para produzir fermentativamente ácidos carboxílicos resultaram na não conversão no produto desejado de quantidades relativamente grandes de substratos de crescimento, tal como glucose. 3

Fairoz Mat-Jan et al descrevem no J. Bacteriol., v. 171 (1989), pp. 342-348, um estudo conduzido em mutantes de

Escherichia coli deficiente na lactato desidrogenase (ldh) fermentativa ligada a NAD que tinham sido isolados, não apresentou defeitos de crescimento sob condições anaeróbias, a menos que presente juntamente com um defeito na piruvato formato liase (pfl). Mutantes duplos (pfl ldh) foram incapazes de crescer anaerobiamente em glucose ou outros açúcares, mesmo quando suplementados com acetato, ao passo que mutantes pfl conseguem fazê-lo. 0 estudo não discutiu nem investigou a produção de ácido succinico ou ácidos dicarboxilicos.

Embora o ião succinato seja um intermediário comum na via metabólica de diversos microrganismos anaeróbios, existe uma necessidade na técnica de um processo de fermentação para produzir economicamente ácido succinico, bem como outros ácidos carboxilicos, tais como ácido málico e ácido fumárico, em grandes quantidades ou com elevados rendimentos. 0 processo deve utilizar nutrientes e substratos de baixo custo, a taxa de fermentação deve ser elevada para produtividade elevada e a concentração de produto no caldo de fermentação deve ser elevada.

OBJECTIVOS DA INVENÇÃO

Consequentemente, é um objectivo da presente invenção proporcionar um método aperfeiçoado, prático e económico para a produção de ácidos dicarboxilicos que supere as desvantagens e problemas apresentados pela técnica anterior. 4 É outro objectivo da presente invenção proporcionar um método aperfeiçoado, prático e económico para a produção de ácido succinico, ácido málico e ácido fumárico com rendimentos elevados. E ainda outro objectivo da presente invenção proporcionar um método de fermentação utilizando um mutante de Escherichia coli para a produção de ácido succinico, ácido málico e ácido fumárico com rendimentos elevados. É ainda mais outro objectivo da presente invenção proporcionar um método de fermentação aperfeiçoado, prático e económico utilizando um mutante de Escherichia coli para a produção de ácido succinico, ácido málico e ácido fumárico com rendimentos elevados, em que o método de fermentação é efectuado num único recipiente, permitindo o controlo preciso de oxigenação, níveis de glucose, pH e taxas de adição de nutrientes.

Todos e quaisquer objectivos da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição aqui contida.

SUMÁRIO

Em conformidade com um aspecto da presente invenção, os precedentes e outros objectivos são alcançados por intermédio de um método para a produção de ácidos carboxílicos compreendendo as etapas de a) inocular um meio possuindo uma fonte de carbono com um organismo produtor de ácido carboxílico; b) incubar o organismo produtor de ácido carboxílico numa atmosfera aeróbia para promover o rápido crescimento do organismo aumentando, 5 desse modo, a biomassa do organismo; c) libertar controladamente oxigénio para manter a atmosfera aeróbia; d) alimentar controladamente o organismo possuindo biomassa aumentada com uma solução contendo a fonte de carbono, para manter a concentração da fonte de carbono dentro do meio de cerca de 0,5 g/L até cerca de 1 g/L; e) privar de oxigénio a atmosfera aeróbia para produzir uma atmosfera anaeróbia, para obrigar o organismo a submeter-se a um metabolismo anaeróbio; f) alimentar controladamente o organismo possuindo biomassa aumentada com uma solução contendo a fonte de carbono, para manter a concentração da fonte de carbono dentro do meio em ^ 1 g/L; e g) converter a fonte de carbono em ácidos carboxilicos utilizando o metabolismo anaeróbio do organismo.

Em conformidade com outro aspecto da presente invenção, outros objectivos são alcançados por intermédio de um método para a produção de ácidos carboxilicos compreendendo as etapas de a) inocular um meio possuindo uma fonte de carbono com um organismo produtor de ácido carboxílico; b) incubar o organismo num ambiente possuindo um valor de pH sustentado e possuindo uma atmosfera aeróbia, para promover o rápido crescimento do organismo aumentando, desse modo, a biomassa do organismo; c) libertar controladamente oxigénio para manter a atmosfera aeróbia; d) alimentar controladamente ao organismo uma solução contendo a fonte de carbono, para manter uma concentração da fonte de carbono dentro do meio de cerca de 0,5 g/L até cerca de 1 g/L; e) transferir o organismo possuindo uma biomassa aumentada para um fermentador de produção possuindo uma atmosfera anaeróbia, para obrigar o organismo a submeter-se a um metabolismo anaeróbio; f) alimentar controladamente ao organismo uma solução contendo a fonte de carbono, para manter uma concentração da fonte de carbono dentro do fermentador de 6 produção em > 1 g/L; e g) converter a fonte de carbono em ácidos carboxílicos utilizando o metabolismo anaeróbio do organismo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Para uma melhor compreensão da presente invenção, juntamente com todos e quaisquer objectivos, vantagens e suas capacidades, faz-se referência à seguinte divulgação e reivindicações apensas quando lidas com respeito aos desenhos apensos, em que: A Fig. 1 apresenta os resultados da experiência descrita no EXEMPLO 1. A Fig. 2 apresenta os resultados da experiência descrita no EXEMPLO 2. A Fig. 3 apresenta os resultados da experiência descrita no EXEMPLO 3. A Fig. 4 apresenta os resultados da experiência descrita no EXEMPLO 4. A Fig. 5 apresenta os resultados da experiência descrita no EXEMPLO 5. A Fig. 6 apresenta os resultados das experiências descritas no EXEMPLO 6. 7 A Fig. 7 apresenta os resultados das experiências descritas no EXEMPLO 7.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é num novo meio económico, embora prático, para a produção de grandes quantidades de ácido succinico, ácido fumárico e ácido málico, num processo de fermentação controlado. Uma estirpe de Escherichia coli (E. coli), designada como AFP-111, foi utilizada no processo de fermentação da presente invenção, para superar os problemas apresentados pela técnica. AFP-111, um mutante NZN-111 de E. coli, é um organismo facultativo. A E. coli é muito fácil de manusear. A sua biologia molecular e fisiologia conhecem-se com grande pormenor. Por conseguinte, pode ser facilmente alcançado um aperfeiçoamento do processo através de biologia molecular ou da modificação de parâmetros do processo ou ambos. Além disso, a E. coli foi utilizada extensamente em processos de fermentação para a preparação de biofármacos e substâncias quimicas. Existe uma grande experiência à escala de produção com este organismo. A E. coli produz igualmente uma mistura de ácidos succinico e acético, contudo, a razão molar de succinato:acetato sob condições não optimizadas é já cerca de 3 ou superior. Esta razão pode ser substancialmente aumentada. Concentrações mais baixas de ácido acético no caldo de fermentação reduzirão significativamente o custo de purificação de ácido succinico. Adicionalmente, a E. coli pode não necessitar de um fornecimento externo de dióxido de carbono para alcançar um rendimento elevado de ácido succinico. Sem a injecção de dióxido de carbono, o rendimento de ácido succinico durante o pico do 8 período de produção é comparável àquele obtido com A. succiniciproducens com injecção de dióxido de carbono.

Normalmente sob condições anaeróbias, a E. coli de tipo selvagem produz uma mistura de produtos de fermentação, dos quais o ácido succínico é um componente menor. Contudo, quando AFP-111 é crescido sob condições anaeróbias, o principal produto metabólico é o ácido succínico. 0 AFP-111 contém uma mutação cromossómica espontânea única que produz uma mistura de ácido succínico, ácido acético e etanol, com o ácido succínico como o principal produto. Um rendimento máximo de 99 %, peso de ácido succínico por peso de glucose, é produzido com AFP-111. A utilização de AFP-111 poderia reduzir significativamente o custo de produção de ácido succínico por intermédio de processos de fermentação. 0 processo de fermentação de E. coli consiste de duas etapas. Na primeira, a estirpe AFP-111 foi crescida no fermentador sob condições aeróbias, num ambiente de baixa glucose, até elevada densidade celular. Na presente invenção, a glucose é utilizada como uma fonte de carbono, tanto para o crescimento da biomassa do organismo, como para a produção de ácidos dicarboxílicos. Quando foi alcançada a desejada densidade celular, cortou-se o fornecimento de ar para forçar o organismo a mudar para o seu metabolismo anaeróbio, o que resultou na produção de ácidos dicarboxílicos, incluindo ácido málico, fumárico e succínico como o derradeiro produto final. Numa forma de realização da presente invenção, este processo de fermentação bietápico ocorre num único recipiente. A via bioquímica de produção de ácido succínico em E. coli envolve uma série de etapas de conversão. 0 ácido pirúvico é, 9 primeiro, convertido em ácido oxaloacético, depois em ácido málico, ácido fumárico e, finalmente, em ácido succínico. Destes ácidos, o ácido málico, o ácido fumárico e o ácido succínico são industrialmente importantes. 0 AFP-111 acumula ácido succínico como o produto final. Se o ácido fumárico for o produto desejado, o gene que codifica para a enzima responsável pela conversão de ácido fumárico em ácido succínico é removido e o organismo resultante acumulará ácido fumárico em vez de ácido succínico. Analogamente, se o ácido málico for o produto desejado, o gene que codifica para a enzima responsável pela conversão de ácido málico em ácido fumárico é removido para estabelecer um organismo produtor de ácido málico. Com as actuais técnicas de ponta de biologia molecular e o conhecimento da totalidade do mapa de ligações de E. coli, a remoção de um gene específico é, apenas, uma tarefa simples. Um processo de fermentação para produção de ácido succínico é facilmente aplicável à produção dos ácidos málico e fumárico utilizando os organismos produtores de ácido málico e produtores de ácido fumárico, respectivamente.

Todo o processo é contínuo com alimentação. Neste processo, uma solução concentrada de glucose que contém igualmente água de maceração leve, como uma fonte de azoto orgânico e factores de crescimento, e nutrientes inorgânicos, é alimentada ao fermentador a uma taxa suficiente de forma a manter a concentração residual de glucose a, ou abaixo de, 1 g/L. Uma concentração baixa de glucose é necessária para impedir a formação excessiva de ácido acético. A formação de ácido acético em concentrações elevadas durante a fase de crescimento aeróbio cessará eventualmente o crescimento do organismo e não pode ser alcançada uma densidade celular elevada. Durante a fase de produção anaeróbia, concentrações elevadas de ácido acético 10 diminuirão a taxa de produção de ácido succinico e poderão, eventualmente, cessá-la por completo. A utilização de AFP-111 pode reduzir significativamente o custo de produção de ácido succinico por intermédio de processos de fermentação. A manutenção de concentração baixa de glucose em fermentadores comerciais é facilmente alcançável através de controlo computorizado da taxa de alimentação de glucose com base na análise do efluente gasoso ou na análise em linha de glucose. Esta tornou-se uma prática industrial muito comum. A fermentação anaeróbia é a via mais antiga de obtenção de energia a partir de combustíveis, tal como glucose. Nas células anaeróbias é o único processo produtor de energia. Na maioria das células facultativas, constitui uma primeira etapa obrigatória no catabolismo da glucose, que é seguida pela oxidação aeróbia dos produtos de fermentação através do ciclo do ácido tricarboxilico. 0 tipo de fermentação mais amplamente utilizado é a glicólise com piruvato produzido como um penúltimo produto. A disposição de piruvato depende de que genes estão presentes no organismo. Na presença da enzima lactato desidrogenase, a glicólise termina quando o piruvato é reduzido via NADH e H+ a lactato. Na presença de piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase, é formado etanol. Na presença de piruvato formato liase (pfl), a fermentação termina com a produção de acetato, etanol e formato, ou hidrogénio mais dióxido de carbono.

Se uma mutação ou uma pluralidade de mutações num genoma bacteriano eliminar os genes nesse organismo responsáveis pelo catabolismo do piruvato, então o piruvato irá acumular. Em E. 11 coli crescendo anaerobiamente, esses genes são o piruvato formato liase (pfl) e lactato desidrogenase (ldh). A estirpe de E. coli NZN 111, amplamente disponível para investigadores a partir do Dr. David Clark, Southern Illinois University, Carbondale, III. 62901, contém mutações em ambos os genes, pelo que tanto o pfl como o ldh foram inactivados em virtude de alterações na sequência de ADN cromossómica de E. coli. Como tal, o NZN 111 não pode crescer fermentativamente. O AFP-111, que foi derivado de NZN-111 pela aplicação de alterações genéticas adicionais, produz uma mistura de ácido succínico, ácido acético e etanol sob condições anaeróbias, com o ácido succínico sendo o principal produto.

Verificou-se que alterações adicionais em NZN 111, ocorrendo quer espontaneamente, quer durante a cultura selectiva ou via transformação plasmídica resultam, em última análise, na emergência de AFP-111 que produz ácido succínico como principal produto.

Mutações cromossómicas espontâneas em NZN 111, que conduzem a características de tipo AFP-111, ocorrem quando são utilizados ambientes selectivos em técnicas de cultura em série. Numa primeira etapa, a biomassa de NZN 111 é aumentada aerobiamente num meio rico, tal como caldo Luria Bertaini (LB) (0,5 por cento de extracto de levedura, 1 por cento de triptona e 1 por cento de NaCl, pH 7,5). São desejáveis rendimentos de aproximadamente entre 109 a IO10 células por mililitro. Embora os períodos de incubação possam variar, durações da fase de crescimento de entre 5-7 horas, a 37 °C e a pressão padrão produzem as concentrações acima mencionadas. 12

Numa segunda etapa, a biomassa agora acumulada é submetida a condições anaeróbias, ricas em glucose, para facilitar o crescimento apenas daquelas células (mutantes) capazes de catabolizar o piruvato. Por exemplo, as células são propagadas em placas de Agar a 1,5 por cento, contendo aproximadamente 1 a 30 gramas por litro (g/L) de glucose, de um modo preferido 10 g/L de glucose, e 30 microgramas (yg)/mL de canamicina. O gene para resistência a canamicina é inserido no gene para a lactato desidrogenase em NZN 111. As culturas são crescidas durante 24 horas a 37 °C, numa atmosfera anaeróbia controlada. Uma atmosfera anaeróbia produzindo bons resultados foi uma mistura de dióxido de carbono e hidrogénio, que foi proporcionada através da utilização de um dispositivo de controlo de atmosfera, disponível comercialmente a partir de Becton-Dickinson, Cockeysville, Maryland denominado GASPAK™. 0 período de incubação produziu muitas colónias de AFP 111 (aproximadamente 2 por 107 células) e aproximadamente metade delas foram capazes de crescer em meio líquido para produzir a mistura desejada de produtos.

Na circunstância de transformação plasmídica, quando NZN 111 é transformado com o plasmídeo pMDH13, contendo o gene mdh para uma enzima mutante malato desidrogenase, o catabolismo do piruvato retoma a produção de lactato. A cultura em série deste transformante (NZN 111 (pMDH13)) tem como resultado o AFP 111 conter uma mutação cromossómica espontânea. O AFP 111 produz uma mistura de ácido succínico, ácido acético e etanol como produtos de fermentação, com ácido succínico sendo produzido até 99 por cento, em peso, comparado ao peso da glucose utilizada no meio de crescimento. 0 protocolo de desenvolvimento e transformação de pMDH 13 é semelhante ao divulgado em W.E. Boernke, et al. (10 13 de Setembro de 1995) Archives of Biochemístry and Bíophysics 322, N°. 1 pp. 43-52.

Para avaliação experimental das estirpes aqui descritas, as células são cultivadas aerobiamente em meio de crescimento isento de glucose (caldo de Luria), até que sejam atingidas densidades celulares de entre 0,5 e 10 OD6oo·

Assim que esta biomassa apropriada de AFP 111 é atingida, as células são então injectadas ou então transferidas para dentro de uma câmara de reacção de fermentação selada para ficarem contidas nesta. O caldo é misturado com glucose ou algum outro hidrato de carbono adequado, tal como xilose, galactose ou arabinose a concentrações variando entre aproximadamente 10 a 30 g/L. A mistura agora contida é submetida a uma alteração atmosférica, pelo que são alcançadas condições anaeróbias. Um meio para alcançar a alteração atmosférica é através de uma estação de gaseificação, pela qual o ar ambiente é trocado por dióxido de carbono.

Antes da introdução da mistura dentro da câmara de reacção de fermentação, a câmara é abastecida com uma quantidade apropriada de meio de tamponização, tal como MgCOa, CaCCu ou CaMg(C03)2, de forma a manter o pH quase neutro. Entre aproximadamente 4 e 8 por cento, em peso , de meio de tamponização é tipicamente utilizado para uma capacidade de tamponização adequada. Obtêm-se resultados especialmente bons quando o meio de tamponização está presente sob a forma de um sólido, de forma a conferir ao licor de fermentação uma capacidade de tamponização de libertação retardada. 14 0 processo supracitado resulta em rendimentos elevados de ácido succinico. Por exemplo, foi obtida uma razão 6:1 de ácido succinico para ácido acético, em peso, com um rendimento de 99 por cento. A razão de ácido succinico para ácido acético aumenta ainda mais quando a fermentação é conduzida na presença de hidrogénio gasoso em concentrações de H2 de entre aproximadamente 25 por cento a 100 por cento. Estes resultados indicam que, ao contrário dos organismos do estado da técnica, o mutante AFP 111 utiliza hidrogénio exógeno como agente redutor. Por exemplo, quando estão presentes caldo luria, glucose, agente de tamponização e uma mistura de hidrogénio gasoso e dióxido de carbono (sendo o C02 libertado a partir do agente de tamponização), são obtidas razões de ácido succinico para ácido acético que se aproximam de 9. Este resultado reflecte outra vantagem da identificação do catabolismo da glucose no produto desejado, sem as indesejadas reacções secundárias produtoras de acetato. A Tabela 1 abaixo ilustra a distribuição de produto dos ácidos dicarboxilicos do precursor original W1485 (disponível igualmente a partir de Southern Illinois University), NZN 111 e AFP 111. 15 TABELA 1:

Rendimento de produto em rendimento molar, viz., glucose inicial (por cento em mole) para AFP 111 e ancestrais

Produto Precursor original W1485 Precursor mais próximo NZN 111 Mutante AFP 111 Ácido 17 2 109 Ácido láctico 24 0 0 Ácido 1 17 0 Ácido fórmico 26 0 0 Ácido acético 51 6 49 Etanol 80 15 47 Produto Total 193% 41% 206%* *0s valores de rendimento molar podem, em teoria, ser 200 por cento, porque uma molécula de glucose pode originar dois da totalidade dos produtos.

Quando é utilizada uma atmosfera 100 por cento de dióxido de carbono, a produção de ácido succinico é melhorada, com concentrações de ácido succinico atingindo aproximadamente 45 gramas por litro, a produtividade atingindo aproximadamente 1,6 gramas por litro por hora, rendimento percentual de gramas de ácido succinico para gramas de glucose atingindo 99 por cento e a razão, em peso, de ácido succinico para ácido acético atingindo aproximadamente seis. 16 0 ácido succínico é igualmente produzido quando a enzima málica dependente de NAD de E. coli é produzida em NZN 111 (pela adição e indução do gene maeA). Nesta circunstância, é utilizado o plasmideo indutivel pMEE2-l para permitir a expressão do gene da enzima málica no transformante NZN 111 (pMEE2-l). 0 ADN genómico isolado a partir de MC1061 de E. coli foi utilizado como molde para a clonagem da enzima málica por PCR. 0 MC1061 de E. coli foi digerido com as endonucleases de restrição Hind III e Pst I, com o material digerido resultante resolvido num gel de agarose com 1 por cento de TAE. 0 tamanho do fragmento de ADN genómico contendo o gene da enzima málica foi determinado utilizando análise de transferência de Southern com o PhotoGene Nucleic Acid Detection System (Cat. 8192SA), como acima descrito.

Os iniciadores foram baseados na sequência de ADN parcial publicada do gene:

Sentido: CGAAGAACAAGCGGAACGAGCAT;

Anti-sentido: GGCAGCAGGTTCGGCATCTTGTC;

Estes iniciadores foram combinados a 1 microlitro (μΜ) com aproximadamente 20 nanogramas (ng) de ADN genómico numa reacção de PCR padrão de 100 microlitros (yL) que produziu o esperado fragmento interno de 0,8 quilobases (Kb) do gene da enzima málica. O produto de PCR foi purificado utilizando um Qiaex Gel Extraction Kit (Qiagen, Inc., Chatsworth, Califórnia) e biotinilado utilizando um BioNick Labeling System (GibcoBRL, Gaithersburg, Maryland). O produto de PCR biotinilado foi utilizado como a sonda na análise de transferência de Southern de ADN genómico de E. coli que tinha sido clivado com Hind III e 17 uma de várias outras segundas endonucleases. Determinou-se que o gene da enzima málica se localiza na região contendo fragmentos de 2,0-2,5 Kb de ADN digerido com Hind III e Pst I.

Um micrograma de ADN de E. coli foi digerido com Hind III e Pst I e resolvido num gel de agarose preparativo com 1 por cento de TAE. Os fragmentos de ADN de E. coli na região de 2,0-2,5 Kb foram isolados e purificados utilizando o Qiaex Gel Extraction Kit. Os fragmentos de ADN purificados foram ligados dentro da região do multiadaptador de pUC19 que tinha sido clivado com Pst I e Hind III e tratado com fosfatase alcalina de camarão. O material ligado foi então utilizado como molde para uma reacção de PCR para amplificar a totalidade do gene da enzima málica. Um microlitro da mistura de ligação foi utilizado como molde com 1 μΜ do iniciador sentido GATGCCCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGT, que alvejou o gene da enzima málica, e 0,25 μΜ do iniciador anti-sentido TTTTCCCAGTCACGACGTTG, que alvejou o ADN ligado de pUC19. Os parâmetros de amplificação foram desnaturação a 94 °C, hibridização a 55 °C durante um minuto e uma extensão a 72 °C durante três minutos para um total de 35 ciclos. O produto de PCR foi analisado num gel de agarose com 1 por cento de TAE e o fragmento de 1,8 Kb foi isolado e purificado utilizando o Qiaex Gel Extraction Kit. Uma porção do produto de PCR foi digerida com Bcl e Bgl para demonstrar que o produto continha, de facto, o gene da enzima málica. O restante do produto de PCR foi digerido com Pst I e Nco I, isolado em gel, purificado novamente e depois ligado dentro da região do multiadaptador do vector de expressão pTRC99a (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) que tinha sido clivado com Nco I e Pst I. A estirpe NZN 111 de E. coli foi transformada com a mistura de ligação por intermédio de métodos padrão e as colónias resultantes (quatro colónias da experiência e 2 colónias do controlo) foram pesquisadas para o gene da 18 enzima málica por análise de fragmento de restrição utilizando Xmn (fragmentos esperados de 0,7 Kb, 1,4 Kb e 3,9 Kb). O plasmideo contendo o gene da enzima málica clonado foi denominado pMEE3.

Uma cultura de 100 mL de NZN (pMEE3) foi crescida numa cultura de um dia para o outro e o plasmideo foi isolado utilizando um Qiagen Plasmid Kit. O plasmideo isolado foi utilizado como molde para a reacção de PCR. Foi concebido um novo iniciador para proporcionar uma extremidade N terminal alternativa que foi 81 pares de bases a jusante do iniciador utilizado na primeira clonagem da enzima málica. Foram utilizadas vinte nanogramas de plasmideo como molde com 1 μΜ do iniciador sentido AGGATCCATGGAACCAAAAACAAAAAAC e iniciador anti-sentido CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC. Os parâmetros de amplificação foram os mesmos como acima registado. Uma parte do produto de PCR foi novamente verificada por mapeamento de restrição com Bcl I e Bgl II a qual verificou que o produto continha o gene da enzima málica. O restante do material de PCR foi digerido com Pst I e Nco I e isolado em gel, repurificado e depois ligado dentro da região do multiadaptador do vector de expressão pTRC99a (Pharmacia, Inc. Piscataway, N.J.) que tinha sido clivado com Nco I e Pst I. A estirpe JM109 de E. coli foi transformada com a mistura de ligação por intermédio de métodos padrão e as colónias resultantes (três clones experimentais e 1 clone de controlo) foram pesquisadas para o desejado inserto por análise de fragmento de restrição. O plasmideo contendo esta versão do gene da enzima málica foi denominado pMEE2.

Trinta mililitros de caldo LB contendo ampicilina a 100 pg/mL foram inoculados com 1,5 mLs de uma cultura de um dia para o outro de pMEE2. Após duas horas de crescimento, a cultura 19 de 30 mL foi separada em 3 alíquotas de 10 mL. A actividade enzimática foi induzida com isopropiltiogalactosídeo (IPTG) a 0, 100 μΜ e 10 μΜ. Foi removida de cada cultura uma amostra de 2 mL às 0, 1, 2, 3 e 4 horas. A proteína foi isolada de acordo com métodos padrão e a actividade foi determinada como acima registado. A produção enzimática, ao longo do tempo, está representada na Tabela 2 abaixo:

Tabela 2

Produção de enzima málica induzida por IPTG em caldo LB.

Tempo IPTG a 100 μΜ - Sem IPTG - IPTG a 10 μΜ (hora) pg/min/mg de proteína 0 3,09 - - 1—1 4,83 26, 5 5,84 2 4,26 38,2 10,06 3 8,46 75,3 32,7 4 9, 92 88,2 38,95

Culturas duplicadas de NZN 111 (pMEE2) e, como controlo, NZN 111 (pTRC99a) foram crescidas aerobiamente em 2 mL de meio LB contendo ampicilina. Uma cultura de cada foi induzida com IPTG a 10 μΜ. Após três horas, a OD60o tinha aumentado de 0,6 para 4,8. Um mililitro das culturas foi injectado para dentro de frasquinhos de vidro de 58 mL contendo 10 mL de meio LB contendo glucose a 20 g/L, acetato a 1 g/L e 0,5 g de MgC03 sólido. A 20 atmosfera consistiu de ar: hidrogénio:dióxido de carbono numa razão 1:1:2 a uma pressão de 1 atm acima da pressão ambiente. A cultura foi amostrada imediatamente e a intervalos de tempo durante a incubação a 37 °C com agitação a 100 rpm. A Tabela 3 abaixo proporciona uma comparação de rendimentos de produto quando NZN 111 é transformado com o vector natural (pTRC99a) versus pMEE2.

Tabela 3

Efeito da expressão da enzima málica em NZN 111 (pMEE2) versus NZN 111 (pTRC99a) Produto Vector maeA Ácido Succinico 0,3 g/L 6,5 Ácido Láctico 0,4 0,4 Ácido Acético 0 0 Etanol 0 0,2

Os resultados representados na Tabela 3 são o resultado de periodos de incubação de entre aproximadamente 19 e 42 horas. O ácido málico, um precursor do ácido succinico é, em principio, um melhor produto final do que o ácido succinico, na medida em que a sua produção requer menos uma etapa redutiva. A estequiometria teórica de produção do ácido málico é de uma mole de glucose e duas moles de dióxido de carbono convertidas para duas moles de ácido málico. Como tal, a produção de ácido málico poderia ocorrer sem desperdício de glucose. Poderia ser igualmente formado o ácido fumárico que, na via de redução, é o 21 produto de desidratação do ácido málico e o precursor do succinato. Tanto o ácido málico como o ácido fumárico poderiam ser igualmente formados sem a produção do co-produto, mas a maior solubilidade do ácido málico torna-o preferível para processos de produção em larga escala. A transformação de bactérias adequadas com um gene responsável pela produção da enzima málica (tal como maeA) poderia resultar num excedente de malato. Geralmente, as bactérias ideais não teriam actividade de lactato desidrogenase, e outras enzimas que metabolizam o piruvato resultando, desse modo, numa acumulação de piruvato. Em vez disso, as bactérias são transformadas com maeA para produzirem o malato directamente. Para manter os elevados níveis de malato produzido, as bactérias não devem ser capazes de converter o malato de volta em lactato, ou em fumarato ou succinato. Na medida em que algumas estirpes de Lactobacillus não possuem a enzima malolactato, fumarase e fumarato redutase responsáveis por tais conversões, estas estirpes são candidatos particularmente adequados para a produção de malato em processos de fermentação. A adequação de Lactobacillus é adicionalmente melhorada, dadas as suas características osmotolerantes muito elevadas. 0 Lactobacillus gasseri é um hospedeiro de curto prazo para essa manipulação, visto que se demonstrou que não metaboliza o malato durante a fermentação de glucose e está razoavelmente bem caracterizado geneticamente. 0 Lactobacillus casei possui igualmente um potencial considerável, na medida em que exibe uma osmotolerância relativamente maior que L. gasseri.

Geralmente, um gene da enzima málica (tal como maeA) num vector de expressão de lactobacillus adequado, tal como pTRK327, induzido num hospedeiro de lactobacillus que não tem um gene 22 funcional da lactato desidrogenase, permitiria a formação de ácido málico. 0 que poderia ser alcançado pela inserção da enzima málica no gene da lactato desidrogenase do hospedeiro.

As substâncias químicas utilizadas nos exemplos seguintes para a produção de ácidos carboxílicos incluem: extracto de levedura e triptona (Difco), glucose (A.E. Staley), água de maceração leve (fábrica de processamento de milho A.E. Staley em Loudon, Tn.), substâncias químicas inorgânicas (E. Merck Science ou J.T. Baker, reagente de grau analítico). 0 equipamento utilizado inclui: fermentador de 1 L (Virtis), fermentador de 5 L (New Brunswick, Bioflow 3000), bombas (Cole-Parmer, Master Flex), sondas de pH (Cole-Parmer), controladores de pH (Cole-Parmer, Chem Cadet), medidor de oxigénio dissolvido (Cole-Parmer, 01971-00), sondas de oxigénio dissolvido (Ingold), autoclave (Amsco, Eagle 3000), agitador (New Brunswick), frasquinhos de vidro criogénicos (Cole Parmer). 0 analisador de glucose veio de Yellow Springs Instrument Company (YSI 2700 Select). Adicionalmente, o espectrofotómetro para a medição de OD é de Milton Roy (SPEC 21D). A estirpe de E. coli AFP-111 foi obtida do Argonne National Laboratory. A estirpe AFP-111 foi derivada de NZN-111. A cultura stock foi preparada pondo 1 g de carbonato de magnésio (MgC03) num balão de 250 mL, cobrindo com uma tampa de espuma e autoclavando a 121 °C durante 20 minutos. Em seguida, foi preparado um meio de 500 mL contendo triptona a 10 g/L, extracto de levedura a 5 g/L, glucose a 5 g/L, cloreto de sódio (NaCl) a 10 g/L, fosfato de potássio (K2HP04) a 7 g/L, fosfato de potássio (KH2P04) a 3 g/L. O meio foi depois autoclavado a 121 °C durante 20 minutos e deixado arrefecer à temperatura ambiente. Cinquenta 23 mililitros do meio foram assepticamente transferidos para o primeiro balão contendo o carbonato de magnésio. 0 balão foi então inoculado com um gancho de inoculação inteiro de AFP-111 a partir de um slant de agar enviado do Argonne National Laboratory. 0 balão inoculado foi depois incubado num agitador a 250 rpm a 37 °C.

Em seguida, foi preparado um litro de um meio contendo triptona a 10 g/L, extracto de levedura a 5 g/L, glucose a 5 g/L, NaCl a 10 g/L, K2HP04 a 7 g/L, KH2P04 a 3 g/L e sulfato de magnésio (MgS04) a 0,2 g/L. O meio foi autoclavado a 121 °C durante 20 minutos e deixado a arrefecer. Em seguida, 850 mL foram assepticamente transferidos para um fermentador de 1 litro.

Quando o balão de 250 mL foi incubado durante 16 horas, todo o seu conteúdo foi assepticamente transferido para o fermentador de 1 litro. 0 fermentador foi mantido a 37 °C e a um pH de 7,0. Foi injectado ar para dentro do fundo do fermentador e a velocidade do rotor foi regulada a 500 rpm ou superior para assegurar suficiente transferência de oxigénio para o caldo de fermentação para evitar a limitação de oxigénio. O pH foi mantido a 7 através de um controlador de pH que activava uma bomba quando solicitado para adicionar uma solução alcalina ao fermentador. A solução alcalina foi preparada pondo 250 mL de água desionizada dentro de um cilindro graduado de 500 mL com uma barra de agitação. O cilindro graduado foi coberto com duas camadas de capa de papel de autoclavagem e autoclavado a 121 °C durante 20 minutos, em seguida deixado arrefecer à temperatura ambiente. Depois, foram adicionados 250 mL de hidróxido de 24 amónio (NH4OH) a 30%. Em seguida foi adicionado um revestimento de óleo para impedir a fuga de amoniaco. O óleo foi autoclavado a 121 °C durante 20 minutos antes de ser adicionado ao cilindro. A solução foi misturada por agitação numa placa magnética. A solução alcalina resultante era uma solução de NH40H a 15%.

Para preparar uma solução de glicerol, foram colocadas 15 gramas de glicerol num pequeno balão ao qual foram adicionados 15 mL de água desionizada. Uma pequena barra de agitação foi adicionada ao balão e em seguida o balão foi coberto com uma tampa de espuma e misturado numa placa magnética para preparar uma solução de glicerol a 50%. A solução de glicerol foi autoclavada a 121 °C durante 20 minutos, depois foi deixada arrefecer à temperatura ambiente.

Quando a concentração de glucose no fermentador era cerca de 1 g/L, 30 mL foram assepticamente removidos do fermentador e adicionados ao balão de glicerol a 50%. Em seguida a mistura foi agitada numa placa magnética. A mistura foi depois assepticamente transferida para frasquinhos de vidro criogénicos (esterilizados antes do acondicionamento pelo fabricante) , cerca de 1,2 mL por frasquinho de vidro. Os frasquinhos de vidro foram selados e guardados numa arca congeladora a -70 °C. Estes frasquinhos de vidro serviram como cultura stock de AFP-111 para todos os exemplos que se seguem. EXEMPLO 1 O inoculo foi cultivado num balão de agitação. O meio continha triptona a 10 g/L, extracto de levedura a 5 g/L, glucose a 5 g/L, NaCl a 10 g/L, K2HP04 a 14 g/L, KH2P04 a 6 g/L, 25 (NH4)2S04 a 2 g/L e MgS04 a 0,2 g/L. Cinquenta mililitros do meio foram colocados num balão de 250 mL. O balão foi tapado, autoclavado a 121 °C durante 20 minutos, arrefecido à temperatura ambiente e inoculado com 1 mL de cultura stock de um frasquinho de vidro. Foi depois incubado a 37 °C a 200 rpm durante 16 horas. O meio de fermentação continha triptona a 10 g/L, extracto de levedura a 5 g/L, glucose a 5 g/L, NaCl a 10 g/L, K2HP04 a 1,4 g/L, KH2P04 a 0,6 g/L, (NH4)2S04 a 2 g/L e

MgS04 a 0,2 g/L. Foi preparado um litro do meio, autoclavado a 121 °C durante 20 minutos e deixado a arrefecer à temperatura ambiente antes de serem transferidos 850 mL para o fermentador de um litro. O fermentador foi inoculado com todo o conteúdo do balão. (0 meio de fermentação contém concentrações baixas de glucose menores que 10 g/L). A fermentação foi efectuada a 37 °C e a um pH de 7,0 com arejamento. 0 pH foi mantido a 7,0 pela adição de uma solução de NH40H a 15% quando solicitado através da acção de um controlador de pH. Quando a glucose inicial no caldo de fermentação se esgotou, foi ligada uma bomba de alimentação para adicionar uma solução de alimentação ao fermentador. A solução de alimentação (solução 1) foi preparada pela dissolução de 250 g de glucose e 50 g de água de maceração leve em 400 mL de água desionizada. Esta solução 1 foi autoclavada a 121 °C durante 20 minutos e arrefecida à temperatura ambiente. Em seguida, para a solução 2, foram dissolvidos NaCl a 5 g/L, K2HP04 a 7 g/L, KH2PO4 a 3 g/L, (NH4)2S04 a 22,5 g/L e MgS04 a 1 g/L em 100 mL de água desionizada. A solução foi depois autoclavada a 121 °C durante 20 minutos, arrefecida à temperatura ambiente e adicionada à solução 1. A solução resultante foi utilizada como a alimentação ao fermentador. 26 A velocidade da bomba de alimentação foi controlada manualmente para manter a concentração residual de glucose no fermentador a, ou abaixo de, 1 g/L. Quando a concentração de glucose subiu acima de 1 g/L, a velocidade da bomba foi reduzida. Quando a concentração de glucose era demasiado elevada, cerca de 5 g/L ou superior, a bomba foi desligada até que a concentração de glucose caiu abaixo de 1 g/L. Durante as primeiras 24 horas, o fermentador foi arejado para proporcionar um ambiente aeróbio que permitiu que o organismo crescesse até uma densidade celular elevada. A densidade óptica medida a 660 nm (OD660 ) foi 24 às 24 horas. Em seguida o ar foi desligado para estabelecer um ambiente anaeróbio para forçar o organismo a entrar num metabolismo anaeróbio de produção de ácido succinico. O estado anaeróbio foi mantido até ao fim da experiência. Durante a etapa anaeróbia, a concentração de glucose foi mantida a, ou acima de, 1 g/L.

Os resultados do Exemplo 1 estão traçados na Fig. 1 e sumariados abaixo na TABELA 4. 27 TABELA 4

Concentração final de ácido succínico (g/L) 40,5

Rendimento global (g de ácido succínico/g de glucose) 0,54 Rendimento durante a fase de produção (g de ácido succ./g de glucose) 0,95

Produtividade global (g/L-h) 0,21

Produtividade durante a fase de produção (g/L-h) 0,24

Concentração de ácido succínico às 47 horas (g/L) 17,9

Produtividade às 47 horas (g/L-h) 0,38

Razão molar final succinato:acetato 1,35 EXEMPLO 2 A experiência neste exemplo foi realizada exactamente da mesma maneira que no EXEMPLO 1, com a excepção de que o ar foi desligado após seis horas, em vez de após 24 horas. No momento em que o ar foi desligado, a OD66o era 6.

Os resultados estão traçados na Fig. 2 e sumariados na TABELA 5. TABELA 5

Tempo de fermentação (h) 24 47 Concentração de ácido succínico (g/L) 16,0 29,20 Produtividade (g/L-h) 0, 67 0,62 28

Os resultados indicaram um melhoramento significativo através da transição antecipada das condições aeróbias para anaeróbias no fermentador. EXEMPLO 3 0 meio utilizado neste exemplo continha o seguinte: Extracto de levedura a 2 g/L, triptona a 15 g/L, NaCl a 2 g/L, (NH4)2S04 a 2 g/L, CaCl2 a 0,6 g/L, MgS04 a 0,5 g/L, KH2P04 a 1,3 g/L, MnCl2 a 0,01 g/L. No fermentador de cinco litros foram realizadas quatro fermentações. Nestas experiências o pH foi controlado a 6,2, 6,6, 7,0 e 7,4 pela adição de NaOH a 5 N quando solicitado. O inoculo foi cultivado num balão de agitação utilizando o mesmo meio ajustado para pH 7,0. Nos fermentadores, as células foram crescidas aerobiamente com injecção de ar e velocidade de rotor a 500 rpm até que a OD66o atingiu 6 (cerca de 5 a 6 horas) . A agitação foi depois reduzida para 250 rpm e a injecção de gás foi alterada para dióxido de carbono puro.

Os resultados para o EXEMPLO 3 estão traçados na Fig. 3 e sumariados na TABELA 6. A TABELA 6 é uma comparação de resultados de fermentação às 100 horas a diferentes valores de PH. 29 TABELA 6 pH 6,2 6, 6 7,0 7,4 Ácido succínico (g/L) 23,3 35, 7 30,1 27,5 Ácido acético (g/L) 3,3 5,3 6,3 6,0 Glucose utilizada (g) 126 224 193 184 Volume de caldo de fermentação (L) Rendimento (g de ácido succínico/ 3,6 4,3 4,4 4,5 g de glucose) 0, 67 0,68 ,69 0,67 Razão molar succinato:acetato 3,6 3,4 2,4 2,3

Os resultados indicaram que o ácido succínico poderia ser produzido numa ampla gama de pH, de um modo preferido a pH cerca de 6,6 a 7,0. EXEMPLO 4

Neste exemplo, tanto o extracto de levedura como a triptona foram substituídos por água de maceração leve, que é um

subproduto de muito baixo custo da indústria de processamento de milho. A água de maceração leve foi preparada pelo ajuste do pH da água de maceração para 7,0 com NaOH a 50%. Os sólidos em suspensão foram removidos por filtração através de papel de filtro Whatman No. 2. O filtrado límpido foi utilizado na experiência de fermentação. O inoculo foi cultivado num balão de agitação. Foi preparada uma solução com o seguinte: NaCl a 20 g/L, K2P04 a 28 g/L, KH2P04 a 12 g/L, (NH4)2S04 a 4 g/L, MgS04 a 0.4 g/L. A solução foi em seguida autoclavada a 121 °C durante 20 minutos. 30

Em seguida, 30 mL do filtrado da água de maceração leve foram adicionados a um balão de 250 mL. 0 balão foi tapado, autoclavado a 121 °C durante 20 minutos e, em seguida, deixado arrefecer à temperatura ambiente. Depois, foram adicionados ao balão 30 mL da solução 1 (do EXEMPLO 1) . Por conseguinte, este meio continha 50% de filtrado da água de maceração leve. O balão foi inoculado com 0,1 mL de cultura stock de glicerol de um frasquinho de vidro (EXEMPLO 1) e incubado a 35 °C e 200 rpm durante 16 horas.

Foi preparada uma solução 2 com o seguinte: NaCl a 20 g/L, K2HP04 a 2,8 g/L, KH2P04 a 1,2 g/L, (NH4)2S04 a 4 g/L e MgS04 a 0,4 g/L. Esta solução foi depois autoclavada a 121 °C durante 20 minutos e deixada arrefecer à temperatura ambiente. Ao fermentador de um litro, foram adicionados 425 mL de filtrado da água de maceração leve. O fermentador foi autoclavado a 121 °C durante 20 minutos e deixado arrefecer à temperatura ambiente. Em seguida, 425 mL da solução 2 foram adicionados ao fermentador de um litro tendo, como resultado, o meio de fermentação conter 50% de filtrado de água de maceração leve. O fermentador foi inoculado com todo o conteúdo do balão de agitação. A fermentação foi realizada a 37 °C e a um pH de 7,0. O pH foi mantido a 7,0 pela adição de uma solução de carbonato de sódio a 1,5 M quando solicitado. Esta solução foi esterilizada autoclavando a 121 °C. Inicialmente as células foram crescidas aerobiamente pela injecção de ar no fermentador durante seis horas. Durante este período foi monitorizado o oxigénio dissolvido. Ocasionalmente, o nível de oxigénio dissolvido caiu abaixo de 5% de saturação, mas com a injecção contínua de ar, 0 estado dentro do fermentador era ainda aeróbio. No fim desse período, o ar foi desligado para se iniciar a produção de ácido succínico pelo metabolismo anaeróbio do organismo. 31

Simultaneamente, foi ligada uma bomba para alimentar ao fermentador uma solução contendo cerca de 500 g/L de glucose. A velocidade da bomba de alimentação foi ajustada manualmente para manter a concentração de glucose no caldo de fermentação maior ou igual a 1 g/L.

Os resultados do EXEMPLO 4 estão traçados na Fig. 4 e sumariados na TABELA 7. A TABELA 7 apresenta a acumulação de ácido succinico em meio de fermentação de água de maceração leve a 50%. TABELA 7

Tempo de fermentação (h) 24 48 99 Concentração de ácido succinico (g/L) 11,9 25,5 51,0 Produtividade (g/L-h) 0,50 0,53 0,52 Estes resultados indicaram que o ácido succinico poderia ser produzido num meio pouco dispendioso em que, tanto o dispendioso extracto de levedura como a triptona, foram substituídos pela água de maceração leve de baixo custo. EXEMPLO 5

Neste exemplo, a concentração da água de maceração leve, tanto no balão de agitação como nos meios de fermentação, foi reduzida para 25%. Outras condições foram exactamente as mesmas que aquelas descritas no EXEMPLO 4. Foi adicionada água para compensar o défice de volume devido às menores quantidades de água de maceração leve utilizadas. 32

Os resultados estão traçados na Fig. 5 e sumariados na TABELA 8. A TABELA 8 apresenta a acumulação de ácido succínico em meio de fermentação de água de maceração leve a 25%. TABELA 8

Tempo de fermentação (h) 24 48 97 Concentração de ácido succínico (g/L) 20,9 35,7 46,3 Produtividade (g/L-h) 0, 87 0,74 0,48

Os resultados indicaram que o ácido succínico poderia ser produzido num meio ainda mais económico, em que a água de maceração leve foi reduzida para 25%. EXEMPLO 6

Neste exemplo, a concentração da água de maceração leve, tanto no balão de agitação como nos meios de fermentação, foi 25% e a base foi carbonato de amónio a 1,5 M. Outras condições foram as mesmas como descrito no EXEMPLO 4.

Os resultados estão traçados na Fig. 6 e sumariados na TABELA 9 que mostra a acumulação de ácido succínico em meio de fermentação de água de maceração leve a 25% com carbonato de amónio para controlo de pH. 33 TABELA 9

Tempo de fermentação (h) 24 48 Concentração de ácido succinico (g/L) 14,8 24,9 Produtividade (g/L-h) 0,62 0,52

Os resultados indicaram que os sais de carbonato, à excepção de carbonato de sódio, tais como carbonato de amónio, carbonato de magnésio, etc., poderiam ser utilizados para controlo de pH num processo de fermentação de ácido succinico. EXEMPLO 7

Neste exemplo são descritas quatro experiências. Em duas experiências, a concentração da água de maceração leve, tanto no balão de agitação como nos meios de fermentação, foi 25% e a base foi NaOH a 2 M. Nas outras duas experiências, a concentração da água de maceração leve foi 50% e a base foi NH40H a 15%. Em cada conjunto de duas experiências que utilizaram a mesma base para controlo de pH, foi injectado dióxido de carbono puro para dentro do fermentador a cerca de 100 mL por minuto numa experiência durante a fase anaeróbia para a produção de ácido succinico por metabolismo anaeróbio.

Os resultados estão traçados na Fig. 7 e sumariados na TABELA 10. A TABELA 10 apresenta a acumulação de ácido succinico em meio de fermentação de água de maceração leve com hidróxido de amónio e hidróxido de sódio para controlo de pH. 34 TABELA 10

Com C02 Sem CO2 Tempo de fermentação (h) 48 72 48 72 Concentração de ácido succinico (g/L) 17,5 23, 9 6, 0 6, 0 Produtividade (g/L-h) 0,36 0,33 0,13 0,08 Base = NH4OH Com CO2 Sem C02 Tempo de fermentação (h) 48 72 46 52 Concentração de ácido succinico (g/L) 22,5 33,4 8,7 8,4 Produtividade (g/L-h) 0, 47 0,46 0,19 0,16

Os resultados indicaram que se uma base, à excepção de um sal de carbonato, fosse utilizada para controlo de pH, seria necessária a injecção de dióxido de carbono gasoso para dentro do fermentador durante a fase anaeróbia para produção significativa de ácido succinico. A presente invenção proporciona igualmente um método para produção de ácido málico por meio de fermentação. O ácido málico, um precursor do ácido succinico é, em principio, um melhor produto final do que o ácido succinico, na medida em que a sua produção requer menos uma etapa redutiva. A estequiometria teórica da produção de ácido málico é de uma mole de glucose e duas moles de dióxido de carbono convertidas para duas moles de ácido málico. Como tal, a produção de ácido málico pode ocorrer sem desperdício de glucose. O ácido fumárico, que é o produto de 35 desidratação do ácido málico e o precursor do succinato na via de redução, pode ser igualmente formado. Tanto o ácido málico como o ácido fumárico podem igualmente ser formados sem a produção do co-produto, mas a maior solubilidade do ácido málico torna-o preferível para processos de produção em larga escala. A presente invenção pode ser igualmente um processo de fermentação contínuo que consiste num fermentador e num tanque de decantação. As células que sedimentam no fundo do tanque de decantação são devolvidas ao fermentador para aumentar a concentração celular que, por sua vez, aumenta a produtividade. Foi observado que as células flocularam e sedimentaram extremamente bem quando a mistura foi cessada. 0 ácido succínico é igualmente produzido através de um processo de fermentação contínuo que consiste de um fermentador e uma unidade de ultrafiltração. As células recolhidas nesta unidade são devolvidas ao fermentador para aumentar a concentração celular que, por sua vez, aumenta a produtividade. A remoção do(s) produto(s) de fermentação do caldo pela unidade de ultrafiltração alivia a inibição de produto e aumenta o rendimento. 0 ácido succínico é igualmente produzido através de um processo de fermentação contínuo, em que um adsorvente é continuamente adicionado e removido ao fermentador. A remoção do(s) produto(s) de fermentação do caldo alivia a inibição de produto e aumenta o rendimento. 0 ácido succínico é igualmente produzido através de um processo descontínuo consistindo de dois fermentadores em série. 0 organismo é crescido sob condições aeróbias no primeiro 36 fermentador (fermentador de crescimento) até elevada densidade celular. A biomassa é depois transferida para o segundo fermentador (fermentador de produção) onde são aplicadas condições anaeróbias para promover a produção de ácido succinico. 0 fermentador de crescimento pode depois ser lavado e utilizado para crescer mais biomassa para transferir para outro fermentador de produção. Visto que o tempo de produção é muito mais longo que o tempo de crescimento, um fermentador de crescimento pode ser utilizado para proporcionar biomassa para um número de fermentadores de produção.

Embora tenha sido demonstrado e descrito o que são presentemente consideradas as formas de realização preferidas da invenção, será óbvio para os especialistas na técnica que podem ser feitas várias alterações e modificações nesta, sem contudo alterar o âmbito da invenção definido pelas reivindicações apensas.

Lisboa, 8 de Maio de 2007 37

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para a produção de ácidos carboxílicos compreendendo as etapas de: a) inocular um meio possuindo uma fonte de carbono com um microrganismo produtor de ácido carboxilico possuindo uma biomassa; b) incubar o referido microrganismo numa atmosfera aeróbia para promover o rápido crescimento do referido microrganismo aumentando, desse modo, a referida biomassa do referido microrganismo; c) libertar controladamente oxigénio para manter a referida atmosfera aeróbia; d) alimentar controladamente ao referido microrganismo uma solução contendo a referida fonte de carbono para manter uma concentração da referida fonte de carbono no referido meio de cerca de 0,5 g/L até cerca de 1 g/L; e) privar a referida atmosfera aeróbia do referido oxigénio para produzir uma atmosfera anaeróbia, para obrigar o referido microrganismo a submeter-se a um metabolismo anaeróbio; d) alimentar controladamente, ao referido microrganismo, a referida solução contendo a referida fonte de carbono, para manter uma concentração da referida fonte de carbono dentro do referido meio de > 1 g/L; e 1 g) converter a referida fonte de carbono em ácidos carboxilicos utilizando o referido metabolismo anaeróbio do referido microrganismo.
2. Método da reivindicação 1, em que o referido microrganismo é seleccionado a partir do grupo consistindo das bactérias Escherichia coli e Lactobacillus.
3. Método da reivindicação 1, em que o referido microrganismo é osmotolerante, pelo que o referido microrganismo é capaz de produzir ácidos orgânicos sem qualquer inibição do metabolismo do referido microrganismo.
4. Método da reivindicação 2, em que o referido microrganismo é uma bactéria Escherichia coli derivada de um microrganismo precursor que não tem os genes para a piruvato formato liase e para a lactato desidrogenase.
5. Método da reivindicação 1, em que o referido microrganismo é manipulado geneticamente para expressar uma enzima que possibilita ao referido microrganismo converter piruvato em ácido dicarboxilico.
6. Método da reivindicação 5, em que a referida enzima é a enzima málica.
7. Método da reivindicação 6, em que o referido microrganismo, utilizando o referido metabolismo anaeróbio produz ácido succinico, ácido acético e etanol, em que o referido ácido succinico é o principal produto. 2
8. Método da reivindicação 6, em que o referido microrganismo, utilizando o referido metabolismo anaeróbio produz ácido málico, ácido acético e etanol, em que o referido ácido málico é o principal produto.
9. Método da reivindicação 6, em que o referido microrganismo, utilizando o referido metabolismo anaeróbio produz ácido fumárico, ácido acético e etanol, em que o referido ácido fumárico é o principal produto.
10. Método para a produção de ácidos carboxilicos compreendendo: a) inocular um meio possuindo uma fonte de carbono com um microrganismo produtor de ácido carboxilico possuindo uma biomassa; b) incubar o referido microrganismo num ambiente possuindo um valor de pH sustentado e possuindo uma atmosfera aeróbia, para promover o rápido crescimento do referido microrganismo aumentando, desse modo, a referida biomassa do referido microrganismo; c) libertar controladamente oxigénio, para manter a referida atmosfera aeróbia; d) alimentar controladamente ao referido microrganismo uma solução contendo a referida fonte de carbono, para manter uma concentração da referida fonte de carbono dentro do referido meio de cerca de 0,5 g/L até cerca de 1 g/L; 3 e) transferir o referido microrganismo possuindo uma biomassa aumentada para um fermentador de produção possuindo uma atmosfera anaeróbia, para obrigar o referido microrganismo a submeter-se a um metabolismo anaeróbio; d) alimentar controladamente ao referido microrganismo uma solução contendo a referida fonte de carbono, para manter uma concentração da referida fonte de carbono dentro do referido fermentador de produção em á 1 g/L; e g) converter a referida fonte de carbono em ácidos carboxilicos utilizando o referido metabolismo anaeróbio do referido microrganismo.
11. Método da reivindicação 10, em que o referido microrganismo é seleccionado a partir do grupo consistindo das bactérias Escherichia coli e Lactobacillus.
12. Método da reivindicação 10, em que o referido microrganismo é osmotolerante, pelo que o referido microrganismo é capaz de produzir ácidos orgânicos sem qualquer inibição do metabolismo do referido microrganismo.
13. Método da reivindicação 11, em que o referido microrganismo é uma estirpe de Escherichia coli derivada de um microrganismo precursor que não tem os genes para a piruvato formato liase e para a lactato desidrogenase.
14. Método da reivindicação 10, em que o referido microrganismo é manipulado geneticamente para expressar uma enzima que possibilita ao referido microrganismo converter piruvato em ácido dicarboxilico. 4
15. Método da reivindicação 14, em que a referida enzima é a enzima málica.
16. Método da reivindicação 15, em que o referido microrganismo utilizando o referido metabolismo anaeróbio produz ácido succinico, ácido acético e etanol, em que o referido ácido succinico é o principal produto.
17. Método da reivindicação 15, em que o referido microrganismo utilizando o referido metabolismo anaeróbio produz ácido málico, ácido acético e etanol, em que o referido ácido málico é o principal produto.
18. Método da reivindicação 15, em que o referido microrganismo utilizando a referida atmosfera anaeróbia produz ácido fumárico, ácido acético e etanol, em que o referido ácido fumárico é o principal produto. Lisboa, 8 de Maio de 2007 5