RU2123529C1 - Способ получения пировиноградной кислоты - Google Patents
Способ получения пировиноградной кислоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2123529C1 RU2123529C1 RU96101052A RU96101052A RU2123529C1 RU 2123529 C1 RU2123529 C1 RU 2123529C1 RU 96101052 A RU96101052 A RU 96101052A RU 96101052 A RU96101052 A RU 96101052A RU 2123529 C1 RU2123529 C1 RU 2123529C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- catalase
- reaction
- glycolate oxidase
- activity
- oxidase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 72
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 title claims description 36
- 108010062584 glycollate oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 102100038837 2-Hydroxyacid oxidase 1 Human genes 0.000 claims abstract description 76
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 70
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims abstract description 66
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 49
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 29
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 29
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 23
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims abstract description 12
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 101
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 20
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M Glycolate Chemical compound OCC([O-])=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 abstract description 18
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 abstract description 11
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 abstract description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 abstract description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 36
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 35
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 35
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 33
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 23
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229940001447 lactate Drugs 0.000 description 18
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 18
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 16
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 15
- 229940013640 flavin mononucleotide Drugs 0.000 description 15
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000011768 flavin mononucleotide Substances 0.000 description 15
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 15
- 229940116871 l-lactate Drugs 0.000 description 14
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 10
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- NGSFWBMYFKHRBD-DKWTVANSSA-M sodium;(2s)-2-hydroxypropanoate Chemical compound [Na+].C[C@H](O)C([O-])=O NGSFWBMYFKHRBD-DKWTVANSSA-M 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000219315 Spinacia Species 0.000 description 8
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 5
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N D-lactic acid Chemical compound C[C@@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 4
- FBWADIKARMIWNM-UHFFFAOYSA-N N-3,5-dichloro-4-hydroxyphenyl-1,4-benzoquinone imine Chemical compound C1=C(Cl)C(O)=C(Cl)C=C1N=C1C=CC(=O)C=C1 FBWADIKARMIWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 229960000448 lactic acid Drugs 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000004251 Ammonium lactate Substances 0.000 description 3
- 229930182843 D-Lactic acid Natural products 0.000 description 3
- 108050006365 L-lactate oxidases Proteins 0.000 description 3
- 101100190845 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pmp-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 229940061720 alpha hydroxy acid Drugs 0.000 description 3
- 229940059265 ammonium lactate Drugs 0.000 description 3
- 235000019286 ammonium lactate Nutrition 0.000 description 3
- RZOBLYBZQXQGFY-HSHFZTNMSA-N azanium;(2r)-2-hydroxypropanoate Chemical compound [NH4+].C[C@@H](O)C([O-])=O RZOBLYBZQXQGFY-HSHFZTNMSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229940022769 d- lactic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010022399 L-2-hydroxyacid oxidase Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241001464837 Viridiplantae Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- -1 alkaline earth metal salts Chemical class 0.000 description 2
- 150000001280 alpha hydroxy acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- GKQWYZBANWAFMQ-DKWTVANSSA-M lithium;(2s)-2-hydroxypropanoate Chemical compound [Li+].C[C@H](O)C([O-])=O GKQWYZBANWAFMQ-DKWTVANSSA-M 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M (R)-lactate Chemical compound C[C@@H](O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-M (S)-lactate Chemical compound C[C@H](O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-M 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000761389 Copa Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 description 1
- 235000006439 Lemna minor Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000000231 kidney cortex Anatomy 0.000 description 1
- 150000003893 lactate salts Chemical group 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O phosphonium Chemical class [PH4+] XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 150000004714 phosphonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000004728 pyruvic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000004717 pyruvic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Способ включает ферментативную реакцию L-молочной кислоты с кислородом в водном растворе в присутствии биокатализаторов - гликолат-оксидазы (оксидазы (S)-2-гидроксикислот) и каталазы. В качестве биокатализаторов используют растворимые ферменты или микробные клетки-трансформанты, в частности Pichia pastoris NRRL У-21001 или Hansenula polymorpha NRRL У-21065. Растворимые ферменты используют при активности 0,01-1000 МЕ/мл (гликолат-оксидаза) и 50-5000 МЕ/мл (каталаза). Процесс осуществляют при рН 7-9. Предпочтительно используют гликолат-оксидазу с активностью 0,1-10 МЕ/мл, а каталазу с активностью 2000-15000 МЕ/мл при соотношении МЕ/мл каталазы и гликолат-оксидазы по меньшей мере 250:1. Технический результат реализации способа - высокие выходы целевого продукта (96%) с высокой частотой (в виде натриевой соли 98% чистоты). 4 з.п.ф-лы, 1 табл.
Description
Изобретение относится к способу получения пировиноградной кислоты путем взаимодействия L-молочной кислоты с кислородом в водном растворе в присутствии биокатализаторов гликолат-оксидазы (оксидазы (S)-2-гидроксикислот (КФ 1.1.3.15) и каталазы (КФ 1.11.1.6).
Известны методы получения пировиноградной кислоты процессом сбраживания различных источников углерода (например, глюкозы, дрожжевых экстрактов и пептона). Однако при таких методах пировиноградная кислота обычно образуется с низкими выходами (в расчете на вводимый источник углерода) и с относительно низкой концентрацией ее как одного из компонентов сбраживаемой биомассы. Процесс разделения и выделения пировиноградной кислоты из такого сложного состава смеси продуктов брожения затруднен и дорогостоящ.
В патенте США N 4900668, выданном 13 февраля 1990 года, Cooper раскрывает способ получения пировиноградной кислоты микробиологическим окислением оптически чистой D(-)молочной кислоты. Хотя преимущество указанного способа по сравнению с другими известными методами проведения процесса ферментации состоит в том, что D-молочную кислоту не используют в качестве источника углерода для получения необходимой для реакции биомассы, он требует использования ростовой среды, содержащей второй источник углерода (например маннитол и кукурузный экстракт) как для продукции биомассы, так и ферментативного превращения D-молочной кислоты в пировиноградную кислоту. Кроме того, D-молочная кислота, по сравнению с L-молочной кислотой, менее распространена в природе и является гораздо более дорогостоящим материалом как для производства, так и для покупки.
Известен способ превращения L-молочной кислоты в пировиноградную кислоту с использованием в качестве биокатализатора L-лактат-оксидазы (L-лактат: O-оксидоредуктаза, некарбоксиллирующая, КФ 1.1.3.2) (B.A. Burdick and J.R. Schaeffer, Biotech. Lett. , том 9, стр. 253-258, 1987). L-лактат-оксидаза (выделенная из Pediococcus) катализирует окисление L-лактата при действии O2 с образованием комплекса пирувата с перекисью водорода
Для ингибирования окисления пирувата побочным продуктом, перекисью водорода, которая приводит к образованию ацетата и CO2, используют L-лактат-оксидазу, соиммибилизованную на одном носителе с каталазой (соотношение оксидазы к каталазе 1:281, М.ед./М.ед.). Окисление 49 мМ растворов L-лактата в 0,1 М фосфатном буфере при pH 7 приводило к 47% суммарному выходу пировиноградной кислоты (выделенную затем в виде производного 2,4-динитрофенилгидразона).
Для ингибирования окисления пирувата побочным продуктом, перекисью водорода, которая приводит к образованию ацетата и CO2, используют L-лактат-оксидазу, соиммибилизованную на одном носителе с каталазой (соотношение оксидазы к каталазе 1:281, М.ед./М.ед.). Окисление 49 мМ растворов L-лактата в 0,1 М фосфатном буфере при pH 7 приводило к 47% суммарному выходу пировиноградной кислоты (выделенную затем в виде производного 2,4-динитрофенилгидразона).
Гликолат-оксидаза (оксидаза (S)-2-гидроксикислот, КФ 1.1.3.15), фермент, обнаруженный, как известно, в листьях зеленых растений и клетках тканей млекопитающих, катализирует окисление гликолевой кислоты до глиоксалевой кислоты. Этот же фермент также катализирует окисление L-молочной кислоты до пировиноградной кислоты, причем с одновременной продукцией перекиси водорода. C. O. Clagget, N.E. Tolbert и R.H.Burris впервые сообщили в журнале J. Biol. Chem., вып. 178, стр. 977-987, 1949 данные об оксидазе α- гидроксикислот, выделенной из большого разнообразия лиственных зеленых растений, которая катализирует окисление гликолевой кислоты и, кроме того, проявляет специфичность относительно L-изомера молочной кислоты. При окислении 80 мМ раствора dl-лактата pH оптимум составлял 7,6, при этом не было идентифицировано или выделено никаких продуктов реакции окисления. N.E. Tolbert и др., J.Biol.Chem., вып. 181 стр. 905-914, 1949 использовали очищенную оксидазу α- гидроксикислот, выделенную из листьев табака, для окисления примерно 113 мМ раствора DL-молочной кислоты в фосфатном буфере при pH 8; в результате реакции было выделено некоторое количество пировиноградной кислоты, о котором не сообщалось, в виде 2,4-динитрофенилгидразона, а также обнаружено значительное количество двуокиси углерода. K.E. Richarson и N.E. Tolbert и др., опубликовали позднее в журнале J.Biol.Chem., вып. 236 стр. 1280-1284, 1961 данные о том, что эта оксидаза α- гидроксикислот, общеизвестна специалистам как оксидаза гликолевой кислоты (или иначе, гликолат-оксидаза).
I Zelitch и S. Ochoa опубликовали в журнале J.Biol.Chem., вып. 201 стр. 707-718, 1953 данные о том, что оксидаза гликолевой кислоты катализирует окисление L-молочной кислоты в присутствии молекулярного кислорода с образованием пировиноградной кислоты и перекиси водорода и что при отсутствии каталазы перекись водорода взаимодействует неферментативным путем с пируватом, образуя при этом ацетат, CO2 и воду. Флавинмононуклеотид (ФМН) был идентифицирован как кофактор, необходимый ферменту для осуществления реакции, и прибавление ФМН к водным растворам этого фермента значительно повышало устойчивость гликолат-оксидазы. В результате окисления 3,3 мМ растворов L-лактата в 50 мМ фосфатном буфере (pH 8,0) и в присутствии избытка вводимой каталазы получена реакционная масса, содержащая 3,3 мМ пировиноградной кислоты (определенное колориметрическим методом); не было выделено ни одного продукта.
Известен также метод окисление лактата до пирувата с использованием оксидазы L -α- гидроксикислот, выделенной из почки крысы M.Blanchard и др., J. Biol. Chem., вып. 163 стр. 137-144, 1946). При окислении 33 мМ раствора лактата в 0,167 М фосфатном буфере, pH 8,0 и в присутствии каталазы, вводимой в избытке, получен 79% выход пирувата (выделенного в виде производного 2,4-динитрофенилгидразона). В качестве дополнительных источников информации, относящихся к катализируемому растворимыми ферментами окислению молочной кислоты до пировиноградной кислоты, можно указать: J.C.Robinson и др., J. Biol. Chem., вып. 237 стр. 2001-2010, 1962 (оксидаза L -α- гидроксикислот из коркового вещества почки свиньи), D.W.Fry и K.E. Richardson, Biochim.Biophys. Acta, вып. 568, стр. 135-144, 1979 (оксидаза гликолевой кислоты из человеческой печени), M.E.Emes и K.H.Erismann, Int.J.Biochem., вып. 16, стр. 1373-1378, 1984 (L-гликолат-оксидаза из Lemna minor), H.S.Kim и J.D.Choi, Korean Biochem.J, вып. 20, стр. 350-356, 1987 (гликолат-оксидаза из листьев шпината).
Хотя специалисты хорошо знакомы с катализируемым ферментами окислением L-молочной кислоты в присутствии кислорода, высокая избирательность к пировиноградной кислоте была продемонстрирована только в одном эксперименте (I Zelitch и S. Ochoa), где концентрация L-лактата составляла 3,3 мМ; такая низкая концентрация L-лактата ограничивала концентрацию образующейся перекиси водорода, а присутствие избытка каталазы лимитировало реакцию перекиси водорода с пируватом до выхода ацетата и CO2. Выделение пирувата при такой низкой концентрацией (примерно 3,2 мМ) из водных растворов реакционной массы нецелесообразно на практике по экономическим соображениям.
Данное изобретение относится к способу получения пировиноградной кислоты (или ее соли, которая более подробно раскрывается далее в описании) путем окисления кислородом L-молочной кислоты (или ее соли) в водном растворе в присутствии комплексных катализаторов, состоящих из двух ферментов гликолат-оксидазы (оксидазы (S)-2-гидроксикислот (КФ 1.1.3.15) и каталазы (КФ 1.11.1.6). Таким образом, изобретение предлагает улучшенный способ получения пировиноградной кислоты, состоящий из стадий взаимодействия в водном растворе L-молочной кислоты с кислородом в присутствии ферментов гликолат-оксидазы и каталазы в течение времени, достаточном для конверсии L-молочной кислоты в пировиноградную кислоту с высокими ее выходами, в котором исходная концентрация L-молочной кислоты составляет примерно от 0,1 до 2,0 М и последующего выделения пировиноградной кислоты. Необходимо понимать, что для целей настоящего изобретения использование терминов для характеристики пировиноградной кислоты и L-молочной кислоты, особенно касающиеся водного раствора при pH от 6 до 10, относятся более конкретно к состоянию с высокой степенью диссоциации, где частично нейтрализованные кислоты в растворе преимущественно присутствуют в виде пируват-иона и L-лактат-иона соответственно. Пировиноградную кислоту можно использовать в качестве химического промежуточного соединения для получения продуктов тонкого органического синтеза, агрохимикатов и лекарственных веществ. Таким образом, в соответствии с целями настоящего изобретения следует понимать, что ссылка в описании изобретения на высокие выходы пировиноградной кислоты и ее выделение предназначена для включения в качестве варианта способ, в котором пировиноградную кислоту получают как промежуточный продукт, включая любое производное пировиноградной кислоты, образуемое соответственно с высоким выходом.
В соответствии с предлагаемым изобретением пировиноградную кислоту получают путем катализируемого ферментами окисления L-молочной кислоты, взятой при концентрациях до 0,5 М, и последующего выделения пирувата при 96% выходе конечного продукта (в виде натриевой соли, 98% чистоты). Использование высокой исходной концентрации L-молочной кислоты, как можно было ожидать, приводит к ингибированию активности гликолат-оксидазы в субстрате, которая обычно ограничивает скорость реакции и/или конечную концентрацию целевого продукта. Аналогичным образом, 0,5 М концентрация пировиноградной кислоты должна была привести к ингибированию активности фермента, который в свою очередь ограничивает концентрацию получаемого продукта.
Кроме того, в ходе создания настоящего изобретения установлено, что высокие выходы пирувата вплоть до 98-99% можно получить в незабуференных реакционных средах без какого-либо регулирования pH; во всех приводимых ранее примерах ферментативное окисление L-лактата осуществляли с использованием буфера, обычно фосфатного буфера.
Высокие выходы пирувата, полученного при отсутствии буфера, аналогичны или превышают его выходы при проведении реакции в присутствии буфера. Получение пирувата при осуществлении реакции в отсутствии буфера позволяет осуществлять выделение продукта непосредственно из реакционной массы; катализатор удаляют фильтрацией или центрифугированием, при этом остается водный раствор, содержащий пируват, который можно легко извлечь при удалении воды (например путем отгонки воды при пониженном давлении, методом лиофилизации и т.п.)
В объеме предлагаемого изобретения показано, что полученные методом генной инженерии биокатализаторы из целых клеток с регулируемой проницаемостью мембраны (например, микробные клетки-трансформанты, содержащие как гликолат-оксидазу, так и каталазу), можно использовать для окисления L-лактата до пирувата. Такие биокатализаторы из целых клеток имеют ряд преимуществ по сравнению с растворимыми ферментами, используемыми в качестве катализаторов в предлагаемом изобретении. Растворы, содержащие биокатализатор из целой клетки, можно барботировать кислородом или кислородсодержащим газом, что приводит к ускорению реакции окисления; барботирование же реакционной массы, содержащей растворимые ферменты, приводит к быстрой необратимой денатурации гликолат-оксидазы.
В объеме предлагаемого изобретения показано, что полученные методом генной инженерии биокатализаторы из целых клеток с регулируемой проницаемостью мембраны (например, микробные клетки-трансформанты, содержащие как гликолат-оксидазу, так и каталазу), можно использовать для окисления L-лактата до пирувата. Такие биокатализаторы из целых клеток имеют ряд преимуществ по сравнению с растворимыми ферментами, используемыми в качестве катализаторов в предлагаемом изобретении. Растворы, содержащие биокатализатор из целой клетки, можно барботировать кислородом или кислородсодержащим газом, что приводит к ускорению реакции окисления; барботирование же реакционной массы, содержащей растворимые ферменты, приводит к быстрой необратимой денатурации гликолат-оксидазы.
На заключительной стадии реакции такой биокатализатор из целой клетки можно легко извлечь фильтрованием или центрифугированием для повторного использования, в то время как растворимые ферменты нельзя отделять центрифугированием, а фильтрование приводит к значительной потере активности растворимой гликолат-оксидазы. Показатель восстановления ферментативной активности биокатализаторов из целых клеток чрезвычайно высок после каждого рецикла катализатора (примерно 95% и выше), в то время как активность, определенная в оставшейся растворимой гликолат-оксидазе после одной реакции, обычно варьирует от 40 до 60%. Использование гликолат-оксидазы и каталазы, прикрепленных или иммобилизованных на одной инертной подложке-носителе, имеет множество аналогичных преимуществ и по существу их следует рассматривать как вариант осуществления настоящего изобретения.
Сравнительные данные, полученные в результате окисления 0,50 М растворов L-лактата с использованием 1) растворимой гликолат-оксидазы (ГО) и растворимой каталазы, 2) биокатализатора из клетки-продуцента Hansenula polymorpha с регулированной проницаемостью и 3) биокатализатора из клетки-продуцента Pichia pastoris с регулируемой проницаемостью при одинаковых реакционных условиях, сведены в таблицу (см. примеры 5, 12 и 13, раскрывающие реакционные условия):
Из данных таблицы видно, что выход пирувата выше, а продуцирование побочного ацетата ниже при использовании обоих биокатализаторов из целой клетки с проницаемой мембраной по сравнению с растворимой гликолат-оксидазой и каталазой, используемых в качестве катализатора. При использовании биокатализатора H.polymorpha, взятого при такой же концентрации, которую в эксперименте с растворимыми ферментами используют для гликолат-оксидазы, образуется меньшее количество ацетата (продуцируемого в результате взаимодействия побочной перекиси водорода с пируватом), даже хотя концентрация внутриклеточной каталазы в реакционной массе составляет половину концентрации, используемой в реакции с растворимыми ферментами. Эти результаты и данные, приведенные в примерах, свидетельствуют о неожиданном увеличении продукции пирувата при использовании клеток-трансформантов с регулированной проницаемостью мембраны в качестве катализаторов.
Из данных таблицы видно, что выход пирувата выше, а продуцирование побочного ацетата ниже при использовании обоих биокатализаторов из целой клетки с проницаемой мембраной по сравнению с растворимой гликолат-оксидазой и каталазой, используемых в качестве катализатора. При использовании биокатализатора H.polymorpha, взятого при такой же концентрации, которую в эксперименте с растворимыми ферментами используют для гликолат-оксидазы, образуется меньшее количество ацетата (продуцируемого в результате взаимодействия побочной перекиси водорода с пируватом), даже хотя концентрация внутриклеточной каталазы в реакционной массе составляет половину концентрации, используемой в реакции с растворимыми ферментами. Эти результаты и данные, приведенные в примерах, свидетельствуют о неожиданном увеличении продукции пирувата при использовании клеток-трансформантов с регулированной проницаемостью мембраны в качестве катализаторов.
Каталитическое окисление L-молочной кислоты или соответствующей ее соли целесообразно проводить путем взаимодействия L-молочной кислоты с источником молекулярного кислорода в присутствии биокатализатора, который катализирует реакцию окислительной конверсии L-молочной кислоты O2 в пировиноградную кислоту. В качестве такого катализатора используют фермент - гликолат-оксидазу, называемый также оксидазой гликолевой кислоты. Гликолат-оксидазу можно выделить из многочисленных источников, известных специалистам в данной области (которые упоминались выше). Гликолат-оксидазу необходимо использовать в эффективной концентрации в реакции окисления, обычно при концентрации примерно от 0,01 до 1000 МЕ/мл, предпочтительно от примерно 0,01 до примерно 10 МЕ/мл. МЕ (Международная единица активности) определена как количество фермента, которое катализирует трансформацию одного микромоля субстрата в минуту. Методику проведения анализа этого фермента описывают I.Zelitch S. Ochoa, J. Biol.Chem., вып. 201, стр. 707-718, 1953. Этот метод также используют для определения активности извлеченной или регенерированной для повторного использования гликолат-оксидазы.
Оптимальные результаты при использовании гликолат-оксидазы в качестве катализатора окислительной конверсии L-молочной кислоты в пирувиновую кислоту получают введением в реакционный раствор катализатора для разложения перекиси водорода, образующейся в процессе окисления. В качестве одного такого пероксид-разлагающего катализатора, который может действовать в комбинации с гликолат-оксидазой, используют каталазу (КФ 1.11.1.6). Каталаза катализирует разложение перекиси водорода на воду и молекулярный водород. Полагают, что каталаза повышает конечный выход пировиноградной кислоты в предлагаемом способе в результате ускорения реакции распада перекиси водорода, образующейся вместе с пировиноградной кислотой в катализированной гликолат-оксидазой реакции молочной кислоты с O2. Каталазу необходимо использовать при концентрации в интервале от 50 до 50000 МЕ/мл, предпочтительно 2000 - 15000 МЕ/мл. Концентрации каталазы и гликолат-оксидазы целесообразно поддерживать в вышеуказанных интервалах так, чтобы соотношение (определенное в МЕ активности для каждого фермента) каталазы к гликолат-оксидазе составляло по крайней мере 250:1.
Кроме растворимых ферментов, используемых в качестве катализаторов, были получены микробные клетки-трансформанты, которые экспрессируют гликолат-оксидазную активность, а также активность эндогенной каталазы, и продемонстрированы их использование в качестве микробного биокатализатора в пределах объема предлагаемого изобретения. Используемый в предлагаемом изобретении биокатализатор из микробной клетки представляет собой трансформант клеток Hansenula polymorpha (метилотрофных дрожжей). Несколько H. polymorpha трансформантов, имеющих достаточную гликолат-оксидазную активность, получено путем введения фрагмента ДНК, содержащего ген гликолат-оксидазы в экспрессирующий вектор при регуляции промотором форматдегидрогеназой (ФМД). Клетки H. polymorpha трансформировали этой векторной ДНК и проводили селекцию штамма, продуцирующего высокий уровень гликолат-оксидазы, обозначенного как штамм H. polymorpha G01 (депонированный в коллекции типовых культур ARS Patent Culture Collection при лаборатории Nothern Regional Research Laboratory, рег. номер: Y-21065, присвоенный USDA, Peoria, Illinois).
Биокатализаторы из клетки-трансформанта H. polymorpha получены путем выращивания вначале инокулята трансформанта H. polymorpha в 500 мл дрожжевой пептонодекстрозной среде (фирмы Difco), pH 4,4. Полученный инокулят затем вносили в ферментер с 10 л среды, включающей в свой состав 14 г азотистого основания без аминокислот с дрожжами, 50 г сульфата аммония и 100 г метанола, pH 5,0. Ферментер работал в течение 42,5 ч при 37oC, скорости перемешиванием биомассы 400 об/мин, постоянном значении pH 5,0, с 40% содержанием растворенного кислорода (с регулируемой подачей) и давлении воздуха 0,984 кг/см2. На заключительной стадии процесса ферментации прибавляли 1,0 кг глицерина, после чего урожай клеток собирали центрифугированием, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80oC.
Второй биокатализатор на основе микробной клетки, используемый в предлагаемом изобретении, представляет собой трансформант клеток Pichia pastoris (метилотрофных дрожжей), который экспрессирует гликолат-оксидазу из шпината, а также эндогенную каталазу. Несколько клеток-трансформантов Pichia pastoris, имеющих достаточную гликолат-оксидазную активность, получено путем введения фрагмента ДНК, содержащего ген гликолат-оксидазы шпината, в экспрессирующий вектор Pichia pastoris (pHIL-D4) при регуляции промотором метанол-индуцируемой алкоголь-оксидазой I, в результате чего получили плазмиду pMP1. Штамм P. pastoris GTS115 (NRRL Y-15851) трансформировали плазмидой pMP1, а селекцию проводили с возможностью интеграции линеаризованной плазмиды pMP1 в хромосомный локус алкоголь-оксидазы I и заменой гена алкоголь-оксидазы геном гликолат-оксидазы. Затем проводили селекцию пула указанных трансформантов на максимальное количество число копий интегрированных генов из кассеты генной экспрессии. Выделенный высококопийный трансформант, обозначенный как штамм P. pastoris GTS115-MSP10 был депонирован как штамм NRRL Y-21001.
Клетки P. pastoris получены путем выращивания вначале инокулята в 100 мл среды из дрожжей и азотистого основания, содержащей 1% глицерин. Через 48 ч инкубирования при 30oC клеточную суспензию переносили в ферментер с 10 л среды, включающей в свой состав 134 г азотистого основания без аминокислот с дрожжами, 100 г глицерина и 20 г биотина. Ферментацию проводили при pH 5,0 (регулируемую NH4OH), температуре 30oC, скорости перемешиванием 200 об/мин, аэрации 5 л/мин, давлении воздуха 0,0352 кг/см2 и в присутствии растворенного кислорода, поддерживаемого на уровне по меньшей мере 50% насыщения. Сразу же после истощения глицерина клетки для экспрессии гликолат-оксидазы активировали инкубированием в той же самой среде, за исключением того, что вместо глицерина брали 50 г метанола. Во время индукции проводили ферментативный анализ для определения активности гликолат-оксидазы. Через 24 часовой цикл индуцирования клеточный урожай собирали и обрабатывали глицерином (1 кг). После этого клетки замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80oC.
Перед использованием в качестве катализатора для ускорения окислительной конверсии гликолевой кислоты в глиоксалевую кислоту клетки-трансформантов H. polymorha и Pichia pastoris необходимо активировать. Для получения клеток с достаточной гликолат-оксидазной активностью можно использовать большое разнообразие известных методов, чтобы увеличить клеточную проницаемость (см., например, Felix, Anal. Biochem, вып. 120, стр. 211-234, 1982). В соответствии со стандартной методикой суспензию, содержащую 10 мас.% мокрых клеток в 0,1% растворе (об/об) Тритона X-100 и 20 мМ фосфатного буфера (pH 7,0) перемешивают в течение 15 мин, затем обработанные клетки замораживают в жидком азоте, оттаивают и промывают в буферной системе 20 мМ фосфата и 0,1 мМ флавинмонуклеотид (pH 7,0). Второй способ увеличения клеточной проницаемости проводят перемешиванием суспензии, содержащей 10 мас.% мокрых клеток в 0,2% растворе (мас./об) бензалконийхлорида и 20 мМ фосфатного буфера (pH 7,0), перемешивают в течение 60 мин, затем обработанные клетки промывают в буферной системе 20 мМ фосфата и 0,1 мМ флавинмонуклеотид (pH 7,0). Сразу же после активации количество биокатализатора из целых клеток, добавляемое в реакционную массу, подбирают с возможностью обеспечения необходимого уровня гликолат-оксидазной и каталазной активности, о чем упоминалось ранее в описании для соответствующих растворимых ферментов. Восстановление активности глаколат-оксидазы и каталазы более чем 100% от их первоначальных значений является результатом увеличения проницаемости клеток в течение всего времени протекания реакционного процесса.
Анализ микробных клеток-трансформантов для определения активности глаколат-оксидазы проводили путем точного отмера примерно 5-10 мг мокрых клеток (блотированных на фильтровальной бумаге для удаления избыточной влаги) в 3-мл кварцевую кювету, снабженную магнитной мешалкой и содержащую 2,0 мл раствора, который представлял собой буферную систему, приготовленную из 0,12 мМ 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) и 80 мМ Трис (трис(гидроксиметил) аминометана), pH 8,3. Кювету закрывали крышкой с резиновой прокладкой и затем раствор барботировали азотом в течение 5 мин для выделения свободного кислорода. После этого в кювету вводили с помощью шприца 40 мкл смешанного раствора из 1,0 М гликолевой кислоты и 1,0 М трис-буфера, (pH 8,3), и полученную смесь перемешивали с одновременным измерением изменения величины поглощения в зависимости от времени при 605 нм (ε = 22,000).
Анализ каталазной активности проводили путем точного отмера примерно 2-5 мг мокрых клеток (блотированных на фильтровальной бумаге для удаления избыточной влаги) в 3-мл кварцевую кювету, снабженную магнитной мешалкой и содержащую 2,0 мл дистиллированной воды раствора, к которой затем добавляли 1,0 мл 59 мМ перекиси водорода в 50 мм фосфатном буфере (pH 7,0) и измеряли изменения величины поглощения в зависимости от времени при 240 нм (ε = 39,4). Показатели гликолат-оксидазной и каталазной активности мокрых клеток H. polymorpha P. pastoris
(активированных, культивированных в различных средах варьировали от 20 до 120 М.ед. дихлорфенолиндофенола на 1 г мокрых клеток по гликолат-оксидазе и 30000 до 200000 М.ед. дихлорфенолиндофенола на 1 г мокрых клеток по эндогенной каталазе.
Анализ каталазной активности проводили путем точного отмера примерно 2-5 мг мокрых клеток (блотированных на фильтровальной бумаге для удаления избыточной влаги) в 3-мл кварцевую кювету, снабженную магнитной мешалкой и содержащую 2,0 мл дистиллированной воды раствора, к которой затем добавляли 1,0 мл 59 мМ перекиси водорода в 50 мм фосфатном буфере (pH 7,0) и измеряли изменения величины поглощения в зависимости от времени при 240 нм (ε = 39,4). Показатели гликолат-оксидазной и каталазной активности мокрых клеток H. polymorpha P. pastoris
(активированных, культивированных в различных средах варьировали от 20 до 120 М.ед. дихлорфенолиндофенола на 1 г мокрых клеток по гликолат-оксидазе и 30000 до 200000 М.ед. дихлорфенолиндофенола на 1 г мокрых клеток по эндогенной каталазе.
К необязательному, но полезному ингредиенту в реакционном растворе относится флавинмононуклеотид (ФМН), который обычно используют при концентрации до примерно 2,0 мМ, предпочтительно от примерно 0,01 до 0,2 мМ. Полагают, что ФМН повышает производительность гликолат-оксидазы, которая выражается как количество гликолевой кислоты, превращенной в глиоксалевую кислоту на единицу активности фермента. Следует понимать, что концентрация вводимого ФМН относится, кроме того, к любому ФМН, который используют с ферментом, поскольку ФМН часто добавляют к ферменту во время его приготовления. Информацию по структуре ФМН и методике его анализа можно найти у K. Yagai, Methods of Biochemical Analysis, vol. X, InterScience Publishes, New-York, стр. 319-355.
L-молочная кислота является коммерчески доступным материалом. В предлагаемой реакции окисления ее исходная концентрация варьирует в диапазоне от 0,10 до 2,0 М, предпочтительно от 0,25 до 1,0 М. В реакции этот реагент можно использовать в виде кислоты или совместимой ее соли, то есть соли, которая растворяется в воде и катион которой не мешает необходимой биоконверсии L-молочная кислоты в пировиноградную кислоту. Подходящие и совместимые солеобразующие катионные группы можно легко найти экспериментальным путем. В качестве примера таких солей можно указать соли щелочных, щелочноземельных металлов, соли аммония, замещенного аммония, фосфония и замещенного фосфония, L-молочную кислоту, продуцируемую в процессе ферментации можно использовать в качестве субстрата в виде раствора, отфильтрованного непосредственно из ферментера без ее очистки или выделения из сбраживаемой среды.
Конверсию L-молочной кислоты в пировиноградную кислоту удобно и предпочтительно проводить в водной среде. pH реакционной массы поддерживают в интервале 6-10, предпочтительно 7-9. В пределах этого интервала pH, для обеспечения требуемой pH раствора, можно задавать точное ее значение прибавлением любого совместимого, не мешающего реакции основания, включая (но не ограничивая объема) гидроокиси, карбонаты, бикарбонаты и фосфаты щелочных металлов. pH незабуференной реакционной смеси снижается примерно на 2 ед. pH по мере протекания реакции, поэтому часто целесообразно использовать для запуска реакции, достигшей пика максимальной ферментативной активности, диапазон pH примерно от 9,0-8,5, с последующим снижением pH в ходе реакции; конечная величина pH незабуференной реакционной массы меняется в диапазоне примерно от 6,7 до 7,5. Величину pH можно при желании регулировать путем прибавления отдельного любого не мешающего реакции неорганического или органического буфера, который имеет буферную емкость примерно pH 7,5, поскольку оптимальная активность фермента для окисления L-лактата приближается к этому значению; в случае использования подходящего буферного раствора начальная pH составляет 7,5. Следует иметь в виду, что L-молочная и пировиноградная кислоты сильно диссоциированы в воде, и что при pH 7-10 они в большей степени, если не практически полностью присутствуют в виде L-лактат- и пируват-ионов.
Молекулярный кислород (O2), используемый в качестве окислителя в процессе превращения L-молочной кислоты в пировиноградную кислоту, можно вводить в реакцию в виде газа путем интенсивного перемешивания культуральной жидкости на поверхности раздела между газовой и жидкой фазами или через проницаемую для кислорода мембрану. При использовании катализатора из целой клетки с увеличенной проницаемостью мембраны молекулярный кислород можно вводить барботированием кислорода воздуха или кислородсодержащего газа через реакционную смесь. В оптимальных условиях скорость реакции по меньшей мере регулируется частично скоростью, при которой O2 может раствориться в водной среде. Таким образом, хотя O2 можно вводить в реакционную массу в виде воздуха, возможно также использование кислорода в относительно чистой форме. Поскольку не установлено никакого верхнего граничного значения давления кислорода, то можно использовать давление до 50 атм, предпочтительно, чтобы верхнее граничное значение давления составляло примерно 15 атм. Перемешивание играет важное значение для ускорения процесса растворения молекулярного кислорода, необходимого для проведения реакции. Для этого можно использовать любой удобный метод, например механическое перемешивание. Перемешиванием с высокой степенью сдвига или перемешивание с образованием пены может привести к снижению активности растворимого фермента (ов), и поэтому в случае использования катализаторов из растворимых ферментов эти методы следует избегать.
Реакционная температура является важной переменной, поскольку она влияет на скорость реакции окисления и устойчивость ферментов. Обычно можно использовать температурный режим для проведения реакции до примерно 40oC без существенной потери каталитической активности, хотя предпочтительно использование температуры реакции в интервале примерно от 0oC до 15oC. Проведение реакции в предпочтительном температурном интервале обеспечивает максимальную активность восстановленного фермента на заключительной стадии проведения реакции. Не следует проводить реакцию при такой низкой температуре, которая вызвала бы замерзание водного раствора. Температуру реакционной массы можно регулировать традиционными методами, например, но не ограничивая объема, при использовании реактора с охладительной рубашкой, через которую пропускают жидкость с требуемой температурой. Реактор может быть выполнен из любого инертного материала относительно компонентов реакционной массы.
После завершения реакции катализаторы из растворимых ферментов можно удалить фильтрованием или центрифугированием и, при желании, использовать повторно. В альтернативном варианте растворимые биокатализаторы могут быть денатурированы и осаждены путем нагревания, например, до температуры 70oC в течение 5 мин и/или их можно оставить в реакционной массе, если их присутствие не мешает реакции. Проницаемые клеточные биокатализаторы можно отделить от реакционной массы для повторного использования методом центрифугирования или фильтрации. После отделения растворимых ферментов или катализаторов из микробных клеток, флавинмононуклеотид (ФМН) можно, при желании, удалить путем обработки раствора активированным углем. Целевой продукт (то есть пировиноградную кислоту и ее соли) можно затем извлечь непосредственно в виде раствора или полученный раствор можно упарить и выделить пировиноградную кислоту путем удаления оставшейся воды, например, путем отгонки при пониженном давлении, лиофилизацией (сушкой при низкой температуре) или любым другим общеизвестным в данной области методом.
В приводимых ниже примерах, которые служат для дополнительной иллюстрации предлагаемого изобретения, выходы пирувата и ацетата, и выход оставшегося L-лактата приведены в процентах в расчете от общего количества используемой вначале реакции L-молочной кислоты, за исключением особо оговоренных случаев. Анализ реакционной массы проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием колонки Bio-Rad HPX-87H.
Пример 1. В 88,7 см3 стеклянный реакционный сосуд Fisher-Porter аэрозольного типа, оснащенный магнитным сердечником для перемешивания, загружают 10 мл водного раствора, содержащего L-лактат лития (0,75 М), ФМН (0,01 мМ), изомасляную кислоту (ВЭЖХ, внутренний стандарт, 0,100 М), буциновый буфер (0,788 М), гликолат-оксидазу из шпината (1,0 ед.ак/мл), м каталазу из Aspergillus niger (1400 ед.ак./мл), pH 8,9. Реакционный сосуд герметично закрывают, и реакционную массу охлаждают до температуры 5oC. После этого в сосуд закачивают кислород под давлением до 4,9 кг/см2, а затем выпускают до атмосферного давления пять раз при перемешивании. Затем в реакционный сосуд опять нагнетают кислород под давлением до 4,9 кг/см2, и реакционную массу перемешивают при температуре 5oC. Для регулирования процесса развития реакции отбирают аликвоты (0,10 мл) с помощью шприца через отверстие для взятия пробы (не снижая давление в сосуде) через определенные промежутки времени для анализа ВЭЖХ. Через 28,5 ч реакционного процесса выходы пирувата и ацетата по данным ВЭЖХ составляют 47,7 и 43,6% соответственно, и остаток лактата составляет 11,5%. Остаточная активность гликолат-оксидазы и каталазы составляет 40 и 100% соответственно от их исходной активности.
Пример 2. Повторяют методику примера 1, за исключением того, что используют 10 мл водного раствора, содержащего L-молочную кислоту (смесь 96% L-изомера, 4% D-изомера, 0,750 М), KH2PO4 (0,750 М), ФМН (0,01 мМ), изомасляную кислоту (ВЭЖХБ, внутренний стандарт, 0,100 М), гликолат-оксидазу из шпината (1,0 ед.ак/мл), и растворимую каталазу из Aspergillus niger (14000 ед.ак./мл), pH 8,1, температура 5oC. Через 48 ч реакционного процесса выходы пирувата и ацетата по данным ВЭЖХ составляют 79,6 и 3,8% соответственно и лактата остается еще в количестве 20,2%. Остаточная активность гликолат-оксидазы и каталазы составляет 22 и 100% соответственно от их исходной активности.
Пример 3. Повторяют методику примера 1, за исключением того, что используют 10 мл водного раствора, содержащего L-молочную кислоту (смесь 96% L-изомера, 4% D-изомера, 0,500 М), KH2PO4 (0,50 М), ФМН (0,01 мМ), изомасляную кислоту (ВЭЖХБ, внутренний стандарт, 0,100 М), гликолат-оксидазу из шпината (2,0 ед. ак/мл), и растворимую каталазу из Aspergillus niger (14000 ед.ак. /мл), pH 8,3, и реакцию проводят при температуре 5oC. Через 18 ч реакционного процесса выходы пирувата и ацетата по данным ВЭЖХ составляют 90,5 и 4,2% соответственно и остается лактат в количестве 6,4%. Остаточная активность гликолат-оксидазы и каталазы составляет 57 и 100% соответственно от их исходной активности.
Пример 4. Повторяют методику примера 1, за исключением того, что используют 10 мл водного раствора, содержащего L-лактат натрия (0,500 М), изомасляную кислоту (ВЭЖХБ, внутренний стандарт, 0,100 М), гликолат-оксидазу из шпината (2,0 ед.ак/мл), и растворимую каталазу из Aspergillus niger (20000 ед. ак./мл), pH 9,0 (регулируют при добавлении 50% NaOH), и реакцию проводят при температуре 15oC; в отсутствии буфера. Через 7 ч реакционного процесса выходы пирувата и ацетата по данным ВЭЖХ составляют 91,6 и 0,6% соответственно и остается лактат в количестве 7,1%. Остаточная активность гликолат-оксидазы и каталазы составляет 21 и 100% соответственно от их исходной активности.
Пример 5. Повторяют методику примера 1, за исключением того, что используют 10 мл водного раствора, содержащего L-лактат натрия (0,500 М), изомасляную кислоту (ВЭЖХБ, внутренний стандарт, 0,100 М), гликолат-оксидазу из шпината (6,0 ед.ак/мл), и растворимую каталазу из Aspergillus niger (10000 ед. ак./мл), pH 9,0 (регулируют при добавлении 50% NaOH), и реакцию проводят при температуре 15oC; в отсутствии буфера. Через 5 ч реакционного процесса выходы пирувата и ацетата по данным ВЭЖХ составляют 95,3 и 0,9% соответственно и остается лактат в количестве 4,5%. Остаточная активность гликолат-оксидазы и каталазы составляет 68 и 100% соответственно от их исходной активности.
Пример 6. В 88,7 см3 стеклянный реакционный сосуд Fisher-Porter аэрозольного типа, оснащенный магнитным сердечником для перемешивания, загружают 10 мл водного раствора, содержащего L-лактат лития (0,500 М), KH2PO4 (0,50 М), изомасляную кислоту (ВЭЖХБ, внутренний стандарт, 0,100 М) при pH 9,0 (регулируют при добавлении 50% NaOH), и реакционный раствор охлаждают до температуры 5oC. Затем в сосуд добавляют 0,75 клеток-трансформантов Pichia pastoris GS115-MSP10 (с гликолат-оксидазной активностью 65,2 М.ед, и каталазной активностью 101000 М. ед.), которые были обработаны 0,1% бензалконийхлоридом (фирмы Lonza Berquat, OJ-50) для увеличения их проницаемости, затем реакционный сосуд герметично закрывают и реакционную смесь охлаждают до температуры 5oC. Реакционный сосуд герметично закрывают. После этого в сосуд закачивают кислород под давлением до 4,9 кг/см2, а затем выпускают до атмосферного давления пять раз при перемешивании. Затем в реакционный сосуд опять нагнетают кислород под давлением до 4,9 кг/см2, и реакционную массу перемешивают при температуре 5oC. Для регулирования процесса развития реакции отбирают аликвоты (0,10 мл) с помощью шприца через отверстие для взятия пробы (не снижая давление в сосуде) через определенные промежутки времени для анализа ВЭЖХ. Через 5 ч реакции выходы пирувата и ацетата по данным ВЭЖХ составляют 97,6 и 2,55% соответственно и остается 0,3% лактата. Остаточная каталитическая активность клеток по гликолат-оксидазе и каталазе составляет 104 и 105% соответственно от их исходной активности.
Пример 7. Реакцию проводят по методике Примера 7 за исключением того, что бициновый буфер (0,5 М) используют вместо KH2PO4 (0,50 М). Через 5 ч реакционного процесса выходы пирувата и ацетата по данным ВЭЖХ составляют 93,1 и 6,3% соответственно и остается 0,4% лактата. Остаточная каталитическая активность клеток по гликолат-оксидазе и каталазе составляет 107 и 122% соответственно от их исходной активности.
Пример 8. Повторяют методику примера 6, за исключением того, что используют 10 мл водного раствора, содержащего L-лактат натрия (0,500 М) и изомасляную кислоту (ВЭЖХБ, внутренний стандарт, 0,100 М) при pH 9,0 (регулируют при добавлении 50% NaOH), к которому добавляют 0,75 г клеток-трансформантов Pichia pastoris GS115-MSP10 (с гликолат-оксидазной активностью 65,2 М.ед. и каталазной активностью 101000 М.ед.), предварительно обработанные 0,1% бензалконийхлоридом (фирмы Lonza Barquat, OJ-50) для увеличения их проницаемости; не добавляют никакого буфера. Через 5 ч реакции выходы пирувата и ацетата по данным ВЭЖХ составляют 99,0 и 0,7% соответственно и остается 0,4 лактата. Остаточная каталитическая активность клеток по гликолат-оксидазе и каталазе составляет 119 и 113% соответственно от их исходной активности.
Пример 9. Повторяют методику примера 6, за исключением того, что используют 10 мл водного раствора, содержащего L-лактат натрия (0,500 М) и изомасляную кислоту (ВЭЖХБ, внутренний стандарт, 0,100 М) при pH 9,0 (регулируют при добавлении 50% NaOH), к которому добавляют 0,35 г клеток-трансформантов Pichia pastoris GS115-MSP10 (с гликолат-оксидазной активностью 22,6 М.ед. и каталазной активностью 50000 М.ед.), предварительно обработанные 0,1% бензалконийхлоридом (фирмы Lonza Barquat, OJ-50) для увеличения их проницаемости; не добавляют никакого буфера. Через 8 ч реакции выходы пирувата и ацетата по данным ВЭЖХ составляют 97,4 и 2,3% соответственно и остается 0,4% лактата. Остаточная каталитическая активность клеток по гликолат-оксидазе и каталазе составляет 123 и 150% соответственно от их исходной активности.
Пример 10. Повторяют методику Примера 6, за исключением того, что используют 10 мл водного раствора, содержащего L-лактат натрия (0,500 М) и изомасляную кислоту (ВЭЖХБ, внутренний стандарт, 0,100 М) при pH 9,0 (регулируют при добавлении 50% NaOH), к которому добавляют 0,18 г клеток-трансформантов Pichia pastoris GS115-MSP10 (с гликолат-оксидазной активностью 11,3 М.ед. и каталазной активностью 25000 М.ед.), предварительно обработанные 0,1% бензалконийхлоридом (фирмы Lonza Barquat, OJ-50) для увеличения их проницаемости; не добавляют никакого буфера. Через 10 ч реакции выходы пирувата и ацетата по результата ВЭЖХ составляют 92,9 и 5,0% соответственно и остается 3,3% лактата. Остаточная каталитическая активность клеток по гликолат-оксидазе и каталазе составляет 121 и 228% соответственно от их исходной активности.
Пример 11. Повторяют методику примера 6, за исключением того, что используют 10 мл водного раствора, содержащего L-лактат натрия (1,00 М) и изомасляную кислоту (ВЭЖХБ, внутренний стандарт, 0,100 М) при pH 9,0 (регулируют при добавлении 50% NaOH), к которому добавляют 0,71 г клеток-трансформантов Pichia pastoris GS115-MSP10 (с гликолат-оксидазной активностью 45,9 М.ед. и каталазной активностью 100000 М.ед.), предварительно обработанные 0,1% бензалконийхлоридом (фирмы Lonza Barquat, OJ-50) для увеличения их проницаемости; не добавляют никакого буфера. Через 8 ч реакции выходы пирувата и ацетата по результатам ВЭЖХ составляют 89,1 и 8,4% соответственно и остается 1,3% лактата. Остаточная каталитическая активность клеток по гликолат-оксидазе и каталазе составляет 124 и 145% соответственно от их исходной активности.
Пример 12. Повторяют методику примера 6, за исключением того, что используют 10 мл водного раствора, содержащего L-лактат натрия (0,500 М) и изомасляную кислоту (ВЭЖХБ, внутренний стандарт, 0,100 М) при pH 9,0 (регулируют при добавлении 50% NaOH), к которому добавляют 0,66 г клеток-трансформантов Pichia pastoris GS115-MSP10 (с гликолат-оксидазной активностью 62,7 М.ед. и каталазной активностью 100000 М. ед. ), предварительно обработанные 20,1% бензалконийхлоридом (фирмы Lonza Barquat, OJ-50) для увеличения их проницаемости; не добавляют никакого буфера. Реакцию проводят при температуре 15oC и давлении кислорода 4,9 кг/см2. Через 3 ч реакции выходы пирувата и ацетата по результатам ВЭЖХ составляют 98,2 и 1,2% соответственно и остается 0,6% лактата. Остаточная каталитическая активность клеток по гликолат-оксидазе и каталазе составляет 124 и 130% соответственно от их исходной активности.
Пример 13. Повторяют методику примера 12, за исключением того, что используют 10 мл водного раствора, содержащего L-лактат натрия (0,50 М) и изомасляную кислоту (ВЭЖХЮ, внутренний стандарт, 0,100 М) при pH 9,0 (регулируют при добавлении 50% NaOH), к которому добавляют 1,04 г клеток-трансформантов Hansenula polymorpha GO1 (с гликолат-оксидазной активностью 64,7 М. ед. и каталазной активностью 50000 М.ед.), предварительно обработанные 0,1% бензалконийхлоридом (фирмы Lonza Barquat, OJ-50) для увеличения их проницаемости; не добавляют никакого буфера. Реакцию проводят при температуре 15oC и давлении кислорода 4,9 кг/см2. Через 2 ч реакции выходы пирувата и ацетата по результатам ВЭЖХ составляют 97,0 и 2,5% соответственно и остается 0,4% лактата. Остаточная каталитическая активность клеток по гликолат-оксидазе и каталазе составляет 99 и 155% соответственно от их исходной активности.
Пример 14. Реакцию, описанную в примере 13, повторяют при температуре 5oC и давлении кислорода 4,9 кг/см2. Через 4 ч реакции выходы пирувата и ацетата по результатам ВЭЖХ составляют 93,1 и 3,7% соответственно и остается 2,2% лактата. Остаточная каталитическая активность клеток по гликолат-оксидазе и каталазе составляет 66 и 180% соответственно от их исходной активности.
Пример 15. Реакцию, описанную в примере 13, повторяют при температуре 30oC и давлении кислорода 4,9 кг/см2. Через 3 ч реакции выходы пирувата и ацетата по результатам ВЭЖХ составляют 89,9 и 6,5% соответственно и остается 0,6% лактата. Остаточная каталитическая активность клеток по гликолат-оксидазе и каталазе составляет 45 и 140% соответственно от их исходной активности.
Пример 16. В 300-мл реактор EZE-Seal автоклавного типа, оснащенный лопастной мешалкой Dispersimax (фирмы Autoclave Engineers), загружают 100 мл раствора, содержащего L-лактат натрия (5,5 г, 0,50 М). Затем в реактор добавляют 6,70 г клеток-трансформантов Pichia pastoris GS115-MSP10 (с гликолат-оксидазной активностью 670 М.ед, и каталазной активностью 1177000 М.ед. ), которые были обработаны 0,1% бензалконийхлоридом (фирмы Lonza Barquat, OJ-50) для увеличения их проницаемости, и затем полученную реакционную массу доводят до pH 9,0 при добавлении 50% NaOH и охлаждают до температуры 5oC. Реактор продувают кислородом воздуха, после чего реакционную массу перемешивают при скорости мешалки 750 об/мин, при этом барботируют через массу кислород под действием турбинной мешалки при температуре 5oC и давлении кислорода 2,8 кг/см2. Реакционный процесс регулируют путем отбора 0,40 мл аликвотного количества реакционной массы через определенные промежутки времени, фильтрованием отобранной аликвоты через фильтровальную установку Millipore Ultrafree-MC 10,000 NMWL, и фильтрат анализируют методом ВЭЖХ с использованием 0,10 М раствора изомасляной кислоты, который прибавляют к образцу в качестве внутреннего стандарта. Через 3 ч реакции выходы пирувата и ацетата по результатам ВЭЖХ составляют 99,2 и 1,4% соответственно и 0,6% остатка лактата. Остаточная каталитическая активность клеток по гликолат-оксидазе и каталазе составляет 107 и 106% от их исходной активности соответственно.
Реакционную массу центрифугируют для отделения катализатора из активированных клеток, и полученную надосадочную жидкость фильтруют через 0,2 мм нейлоновый фильтр. pH полученного фильтрата доводят до 4,6 путем добавления 1,0 N HCl, а затем раствор замораживают. После удаления воды лиофилизацией получают 5,20 г натриевой соли пировиноградной кислоты (выход конечного продукта 96%, 98% чистота пирувата натрия по результатам ВЖЭХ).
Пример 17. Культуральную жидкость, содержащую 109,9 г/л лактата аммония (смесь 97,8% L-лактата и 2,2% D-лактата), 0,8 г/л ацетата и 2,8 г/л мальтозы центрифугируют для удаления корпускулярного вещества с последующей фильтрацией через 0,45 мм фильтр. Содержание лактата аммония в полученном растворе составляет 1,10 М (118,6 г/л, определенная анализом методом ВЖЭХ). В 300-мл реактор EZE-Seal автоклавного типа, оснащенный лопастной мешалкой Dispersimax (фирмы Autoclave Engineers), загружают 45 мл 1,10 М отфильтрованной культуральной жидкости, а затем добавляют к ней 55 мл дистиллированной воды с получением 100 мл водного раствора, содержащего 0,50 М лактата аммония. Затем в реактор добавляют 6,70 г клеток-трансформантов регенерированного штамма Pichia pastoris GS115-MSP10 (с гликолат-оксидазной активностью 666 М.ед, и каталазной активностью 1107000 М.ед.), которые были обработаны 0,1% бензалконийхлоридом (фирмы Lonza Barquat, OJ-50) для увеличения их проницаемости, и затем полученную реакционную массу доводят до pH 7,5 при добавлении 50% NaOH и охлаждают до температуры 5oC. Реактор продувают кислородом воздуха, после чего реакционную массу перемешивают при скорости мешалки 750 об/мин, при этом барботируют через массу кислород под действием турбинной мешалки при температуре 5oC и давлении кислорода 2,8 кг/см2. Реакционный процесс регулируют путем отбора 0,40 мл аликвотного количества реакционной массы через определенные промежутки времени, фильтрованием отобранной аликвоты через фильтровальную установку Millipore Ultrafree-MC 10,000 NMWL, и фильтрат анализируют методом ВЭЖХ с использованием 0,10 М раствора изомасляной кислоты, который прибавляют к образцу в качестве внутреннего стандарта. Через 3 ч реакции выходы пирувата и ацетата по результатам ВЭЖХ составляют 94,1 (96,2% в расчете на L-лактат) и 2,8% соответственно и остаток лактата составляет 2,5%.
Несмотря на проиллюстрированные и описанные выше конкретные варианты осуществления изобретения, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается изложенными вариантами или отдельными их деталями, и что возможны различные изменения, не выходящие за пределы нижеследующей формулы изобретения.
Claims (4)
1. Способ получения пировиноградной кислоты путем взаимодействия в водном растворе L-молочной кислоты с кислородом в присутствии ферментных катализаторов гликолат-оксидазы и каталазы с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что взаимодействие проводят при концентрации L-молочной кислоты от 0,1 до 2,0 М при pH 6-10.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ферментных катализаторов используют растворимые ферменты - гликолат-оксидазу с каталитической активностью от 0,01 до 1000 МЕ/мл и каталазу с каталитической активностью от 50 до 50000 МЕ/мл,
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ферментные катализаторы используют в виде микробных клеток-трансформантов штамма Pichia pastories GS 115-MSP 10(NRRL Y-21001) или штамма Hansenula polymorpha GOI (NRRL Y-21065).
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ферментные катализаторы используют в виде микробных клеток-трансформантов штамма Pichia pastories GS 115-MSP 10(NRRL Y-21001) или штамма Hansenula polymorpha GOI (NRRL Y-21065).
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию проводят при pH 7-9.
5. Способ по п.1 и 2, отличающийся тем, что используют гликолат-оксидазу с каталитической активностью от 0,1 до 10 МЕ/мл, а каталазу с каталитической активностью от 2000 до 15000 МЕ/мл, при соотношении активностей каталазы и гликолат-оксидазы, выраженной в МЕ/мл по меньшей мере 250:1.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8287993A | 1993-06-25 | 1993-06-25 | |
| US08/082,879 | 1993-06-25 | ||
| PCT/US1994/006436 WO1995000656A1 (en) | 1993-06-25 | 1994-06-15 | Process for the preparation of pyruvic acid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2123529C1 true RU2123529C1 (ru) | 1998-12-20 |
| RU96101052A RU96101052A (ru) | 1998-12-27 |
Family
ID=22174039
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96101052A RU2123529C1 (ru) | 1993-06-25 | 1994-06-15 | Способ получения пировиноградной кислоты |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0705345B1 (ru) |
| JP (1) | JP3709202B2 (ru) |
| KR (1) | KR100274552B1 (ru) |
| CN (1) | CN1096500C (ru) |
| AU (1) | AU686182B2 (ru) |
| BR (1) | BR9407269A (ru) |
| CA (1) | CA2165940C (ru) |
| DE (1) | DE69417892T2 (ru) |
| ES (1) | ES2132409T3 (ru) |
| GR (1) | GR3030756T3 (ru) |
| HU (1) | HU213759B (ru) |
| NZ (1) | NZ267894A (ru) |
| RU (1) | RU2123529C1 (ru) |
| WO (1) | WO1995000656A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA944559B (ru) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5869301A (en) * | 1995-11-02 | 1999-02-09 | Lockhead Martin Energy Research Corporation | Method for the production of dicarboxylic acids |
| JP4367616B2 (ja) | 2003-10-21 | 2009-11-18 | 日本電気株式会社 | 耐熱性乳酸酸化酵素 |
| US7470813B2 (en) | 2007-03-30 | 2008-12-30 | Ge Healthcare Limited | Method for the production of pyruvic acid |
| CN106754780B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106591252B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-26 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106754778B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106754784B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-26 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106754787B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106754799B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106754796B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106754797B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106701703B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-08 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106754795B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106754798B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106754779B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106636022B (zh) * | 2017-01-05 | 2020-01-07 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106754783B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106591251B (zh) * | 2017-01-05 | 2020-01-03 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106754785B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106701706B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN106754786B (zh) * | 2017-01-05 | 2019-11-15 | 江南大学 | 一种氧化酶及其应用 |
| CN109988784B (zh) * | 2019-04-16 | 2021-02-02 | 台州学院 | 一种固定化甘醇酸氧化酶催化合成丙酮酸的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4900668A (en) * | 1987-10-01 | 1990-02-13 | Basf Aktiengesellschaft | Preparation of pyruvic acid |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2804079B2 (ja) * | 1988-05-18 | 1998-09-24 | 協和メデックス株式会社 | Ｎａｄ（ｐ）ｈの定量法 |
-
1994
- 1994-06-15 ES ES94919409T patent/ES2132409T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 CA CA002165940A patent/CA2165940C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-15 HU HU9503773A patent/HU213759B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 BR BR9407269A patent/BR9407269A/pt not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 KR KR1019950705919A patent/KR100274552B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-15 WO PCT/US1994/006436 patent/WO1995000656A1/en active IP Right Grant
- 1994-06-15 DE DE69417892T patent/DE69417892T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-15 AU AU70567/94A patent/AU686182B2/en not_active Ceased
- 1994-06-15 EP EP94919409A patent/EP0705345B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 RU RU96101052A patent/RU2123529C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 NZ NZ267894A patent/NZ267894A/en unknown
- 1994-06-15 JP JP50286895A patent/JP3709202B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-15 CN CN94192574A patent/CN1096500C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-24 ZA ZA944559A patent/ZA944559B/xx unknown
-
1999
- 1999-07-14 GR GR990401841T patent/GR3030756T3/el unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4900668A (en) * | 1987-10-01 | 1990-02-13 | Basf Aktiengesellschaft | Preparation of pyruvic acid |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Zelitch et al. "Oxidation and reduction of glycolic and dlyoxylic acids in plants", J.Biol. Chem., v.201, 1953, p.707-718. N. Tolbest et al."Products of the oxidation of glycolic acid and l-lactic acid by enzymes from tobacco leaves", J.Biol. Chem, v.181, 1949, p.905-914. B.A.Burdick, Y.R SCHAEFFER. Biotech. Lett., v.9, 1987, p.253-258. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR3030756T3 (en) | 1999-11-30 |
| KR100274552B1 (ko) | 2000-12-15 |
| CN1125961A (zh) | 1996-07-03 |
| AU686182B2 (en) | 1998-02-05 |
| HUT74223A (en) | 1996-11-28 |
| AU7056794A (en) | 1995-01-17 |
| CA2165940A1 (en) | 1995-01-05 |
| WO1995000656A1 (en) | 1995-01-05 |
| EP0705345B1 (en) | 1999-04-14 |
| EP0705345A1 (en) | 1996-04-10 |
| HU213759B (en) | 1997-09-29 |
| DE69417892D1 (de) | 1999-05-20 |
| ES2132409T3 (es) | 1999-08-16 |
| DE69417892T2 (de) | 1999-10-14 |
| NZ267894A (en) | 1997-10-24 |
| CN1096500C (zh) | 2002-12-18 |
| HU9503773D0 (en) | 1996-02-28 |
| JP3709202B2 (ja) | 2005-10-26 |
| ZA944559B (en) | 1995-12-27 |
| JPH08511689A (ja) | 1996-12-10 |
| BR9407269A (pt) | 1996-10-01 |
| CA2165940C (en) | 2005-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2123529C1 (ru) | Способ получения пировиноградной кислоты | |
| Van Der Donk et al. | Recent developments in pyridine nucleotide regeneration | |
| US4221869A (en) | Enzymatic synthesis of L-carnitine | |
| WO1996035800A1 (en) | Enzymatic production of gluconic acid or its salts | |
| Eisenberg et al. | Pyruvic acid production using methylotrophic yeast transformants as catalyst | |
| Simon et al. | D-Lactate dehydrogenase: substrate specificity and use as a catalyst in the synthesis of homochiral 2-hydroxy acids | |
| EP0384534B1 (en) | A process for the fermentative oxidation of reducing disaccharides | |
| CA2127094C (en) | Oxidation of glycolic acid to glyoxylic acid using a microbial cell transformant as catalyst | |
| US5538875A (en) | Process for the preparation of pyruvic acid using permeabilized transformants of H. polymorha and P. pastoris which express glycolate oxidase and catalase | |
| JPH03155792A (ja) | ５―デカノライド及びその製造方法 | |
| KR20000070226A (ko) | 발효 공정을 사용한 산화물의 제조 방법 | |
| JP2006521101A (ja) | 水性媒体中での組み合わされた補因子依存型酵素反応系 | |
| US5234827A (en) | Enzymatic process for manufacturing formaldehyde and hydrogen peroxide | |
| JP2005117905A (ja) | 光学活性１−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法 | |
| JP2624296B2 (ja) | γ−ハロ−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法 | |
| JP2002000292A (ja) | 微生物培養法による光学活性１，２−ジオール類の製造法 | |
| JP3843692B2 (ja) | 光学活性ｅｎｄｏ−ノルボルネオールの製造法 | |
| JPH10501984A (ja) | 形質転換微生物を用いて製造されるグリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸混合物 | |
| Nishise et al. | Glyceric acid production from glycerol by microorganisms | |
| JPS63141597A (ja) | Ｌ−乳酸の製法 | |
| GB2218099A (en) | Process for preparing a catalase-free oxidase | |
| JP2000060548A (ja) | 電気化学的方法による代謝の制御方法 | |
| JPWO2003100043A1 (ja) | 微生物由来新規（ｄ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、およびそれを用いたグリオキシル酸の生化学的製造方法 | |
| JPS58152479A (ja) | 膜結合型アルコ−ル脱水素酵素の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090616 |