HINTERGRUND DER ERFINDUNG
GEBIET DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Brenztraubensäure, worin L-Milchsäure und Sauerstoff in einer wäßrigen Lösung in Gegenwart
eines Katalysators aus Glykolatoxidase ((S)-2-Hydroxysäure-Oxidase, EC 1.1.3.15) und
Katalase (EC 1.11.1.6) umgesetzt werden.
BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN GEBIETES
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Brenztraubensäure ist aus verschiedenen Kohlenstoff-Ausgangsstoff (z. B. Glucose,
Hefeextrakte und Pepton) durch Fermentation dargestellt worden, wobei diese Verfahren
jedoch in der Regel Brenztraubensäure in geringen Ausbeuten (bezogen auf den zugesetzten
Kohlenstoff-Ausgangsstoff) und in relativ geringen Konzentrationen als eine Komponente
einer Mischung von Fermentationsprodukten erzeugten. Die Abtrennung und Isolation von
Brenztraubensäure aus derartigen komplexen Fermentationsbrühen sind in der Ausführung
normalerweise schwierig und aufwendig.
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Die Darstellung von Brenztraubensäure über die mikrobiologische Oxidation von
optisch reiner D(-)-Milchsäure wurde von Cooper beschrieben (US-P-4 900 668 vom 13.
Februar 1990). Obgleich dieses Verfahren gegenüber anderen Fermentationswegen unter
Nichteinsatz der D-Milchsäure als ein Kohlenstoff-Ausgangsstoff verbessert ist, um die für
die Reaktion erforderliche Zellmasse zu erzeugen, wird ein Nährmedium, das einen zweiten
Kohlenstoff-Ausgangsstoff enthält (D(-)-Mannitol und Korn-Weichwasser) sowohl für die
Erzeugung von Zellmasse als auch für die fermentative Umwandlung von D-Milchsäure
benötigt. Darüber hinaus ist D-Milchsäure in der Natur nicht allgegenwärtig und sehr viel
kostspieliger herzustellen oder zu erwerben als L(+)-Milchsäure.
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Die EP-A-342 984 offenbart einen enzymatischen Assay, der zur Bestimmung der
Konzentration von NAD(P)H in einer Probe verwendet wird. Bei dem Assay wird als das
Reagens ein Gemisch verwendet, das Lactat-Oxidase enthält. Dieses ist nicht die Oxidase
der vorliegenden Erfindung.
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Die Umwandlung von L-Milchsäure zu Brenztraubensäure ist unter Verwendung des
Enzyms L-Lactat-Oxidase (L-Lactat: Sauerstoff-Oxidoreductase, nicht decarboxylierend, EC
1.1.3.2) als Katalysator demonstriert worden (B. A. Burdick und J. R. Schaeffer, Biotech.
Lett., Bd. 9, (1987) 253 ... 258), L-Lactat-Oxidase (von Pediococcus) katalysiert die
Oxidation von L-Lactat durch Sauerstoff zu Pyruvat und Wasserstoffperoxid:
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Die L-Lactat-Oxidase wurde mit Katalase (Oxidase : Katalase = 1 : 281 (IU : IU)
co-immobilisiert, um die Oxidation von Pyruvat durch Nebenprodukt von Wasserstoffperoxid
zu beschränken, das Acetat und Kohlendioxid erzeugt. Die Oxidation von 49 mMol-Lösungen
von L-Lactat in 0,1 M Phosphat = Puffer bei pH 7 führte zu Ausbeuten bis zu 47% an
Brenztraubensäure (isoliert als das 2,4-Dinitrophenylhydrazon-Derivat).
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Glykolat-Oxidase ((S)-2-Hydroxysäure-Oxidase, EC 1.1.3.15), ein häufig
anzutreffendes Enzym in grünen Blattpflanzen und Mammalia-Zellen, katalysiert die
Oxidation von Glykolsäure zu Glyoxalsäure. Das gleiche Enzym katalysiert auch die
Oxidation von L-Milchsäure zu Brenztraubensäure mit der parallel laufenden Erzeugung von
Wasserstoffperoxid. C. O. Clagett, N. E. Tolbert und R. H. Burris, J. Biol, Chem., Bd.
178, (1949) 977 ... 987, berichteten als erstes von einer alpha-Hydroxysäure-Oxidase, die
aus einer Vielzahl von grünen Blattpflanzen extrahiert wurde und die die Oxidation von
Glykolsäuren katalysiert und auch für das L-Isomer von Milchsäure spezifisch war. Das
pH-Optimum für die Oxidation von 80 mMol (dl)-Lactat beträgt 7,6; wobei keine
Reaktionsprodukte identifiziert oder isoliert wurden. N. E. Tolbert et al., J. Biol.
Chem., Bd. 181, (1949) 905 ... 915, setzte eine gereinigte alpha-Hydroxysäure-Oxidase aus
Tabakblättern für die Oxidation von ca. 113 mMol (dl)-Milchsäure in Phosphat-Puffer bei
pH 8 ein, wobei eine nicht veröffentlichte Menge Brenztraubensäure aus der Reaktion als
ein 2,4-Dinitrophenylhydrazon isoliert wurde, und wobei ebenfalls eine signifikante Menge
von Kohlendioxid erzeugt wurde. K. D. Richardson und N. E. Tolbert. J. Biol. Chem., Bd.
236. (1961) 1280 ... 1284, berichteten später, daß diese alpha-Hydroxysäure-Oxidase häufiger
bezeichnet wird als Glykolsäure-Oxidase (d. h. Glykolat-Oxidase).
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I. Zelitch und S. Ochoa, J. Biol. Chem., Bd. 201, (1953) 707 ... 718, berichteten,
daß Glykolsäure-Oxidase die Oxidation von L-Milchsäure durch molekularen Sauerstoff
katalysiert, um Brenztraubensäure und Wasserstoffperoxid zu erzeugen und daß bei
Abwesenheit von Katalase das Peroxid nicht enzymatisch mit Pyruvat unter Bildung von
Acetat, CO&sub2; und Wasser reagiert. Flavin-Mononucleotid (FMN) wurde als ein erforderlicher
Enzym-Cofaktor identifiziert, und der Zusatz von FMN zu wäßrigen Lösungen des Enzyms
erhöht wesentlich die Stabilität von Glykolsäureoxidase. Die Oxidation von 3,3
mMol-Lösungen L-Lactat in 50 mMol Phosphat-Puffer (pH 8,0) und in Gegenwart eines
Überschusses von zugesetzter Katalase erzeugte 3,2 mMol Brenztraubensäure (colorimetrisch
bestimmt); ein Produkt wurde nicht isoliert.
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Die Oxidation von Lactat zu Pyruvat wurde auch unter Verwendung einer
L-alpha-Hydroxysäure-Oxidase demonstriert, die aus Rattennieren isoliert wurde (M.
Blanchard et al., J. Biol. Chem., Bd. 163, (1946) 137 ... 144. Die Oxidation einer 33
mMol-Lösung von Lactat in 0,167 M Phosphat-Puffer bei pH 8,0 und in Gegenwart eines
zugesetzten Überschusses von Katalase erzeugte Pyruvat mit einer Ausbeute von 79%
(isoliert als das 2,4-Dinitrophenylhydrazon-Derivat). Weitere Fundstellen über die
Oxidation von Milchsäure zu Brenztraubensäure, die durch lösliche Enzyme katalysiert wird,
schließen ein: J. C. Robinson et al.. J. Biol. Chem., Bd. 237. (1962) 2001 ... 2010
(Hundenieren-L-alpha-Hydroxysäure-Oxidase), P. Urban et al., Biochemistry, Bd. 27, (1988)
7365 ... 7371 (Rattennieren-L-alpha-Hydroxysäure-Oxidase), D. W. Fry and K. E. Richardson,
Biochim. Biophys., Acta, Bd. 568 (1979) 135 ... 144 (Humanleber-Glykolsäure-Oxidase), M. J.
Emes und K. H. Erismann, Int. J. Biochem., Bd. 16. (1984) 1373 ... 1378 (Lemna minor L.
Glyakolat-Oxidase), H. S. Kim und J. D. Choi, Korean Biochem. J., Bd. 20, (1987) 350 ... 356
(Spinat-Glykolat-Oxidase).
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Obgleich die enzymkatalysierte Oxidation von L-Milchsäure durch Sauerstoff gut
bekannt ist, ist lediglich in einem einzigen Versuch eine hohe Selektivität auf
Brenztraubensäure demonstriert worden (I. Zelitch und S. Ochoa), wo die Konzentration von
L-Lactat 3,3 mMol betrug. Diese geringe Konzentration von L-Lactat beschränkte die
Konzentration des gebildeten Wasserstoffperoxids und beschränkte in Gegenwart eines
Überschusses von Katalase auch die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Pyruvat unter
Erzeugung von Acetat und Kohlendioxid. Die Gewinnung einer derart geringen Konzentration
von Pyruvat (ca. 3,2 mMol) aus einem wäßrigen Reaktionsgemisch ist für einen
wirtschaftlichen Herstellungsprozeß nicht durchführbar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Darstellung von Brenztraubensäure (oder
eines Salzes von ihr, wie nachfolgend ausführlicher dargestellt wird) durch Oxidieren von
L-Milchsäure (oder eines Salzes von ihr) mit Sauerstoff in wäßriger Lösung und in
Gegenwart der zwei Enzymkatalysatoren Glykolat-Oxidase (z. B. (S)-2-Hydroxysäure-Oxidase,
EC 1.1.3.15) und Katalase (z. B. EC 1.11.1.6.). Damit gewährt die vorliegende ein
verbessertes Verfahren zur Herstellung von Brenztraubensäure. umfassend die Schritte des
Umsetzen von L-Milchsäure und Sauerstoff in einem wäßrigen Medium in Gegenwart des
Enzymkatalysators Glykolat-Oxidase und des Enzymkatalysators Katalase für eine
ausreichende Zeitdauer, um die L-Milchsäure in Brenztraubensäure mit hohen Ausbeuten
umzuwandeln, wobei die Ausgangskonzentration der L-Milchsäure etwa 0,1 bis etwa 2,0 Mol
beträgt; sowie nachfolgendes Gewinnen der Brenztraubensäure. Die Ausführungsformen der
Erfindung sind in den Ansprüchen festgelegt. Es ist davon auszugehen, daß für die Aufgaben
der vorliegenden Erfindung die Begriffe Brenztraubensäure und L-Milchsäure speziell, wenn
auf eine wäßrige Lösung im pH-Bereich von 6 bis 10 Bezug genommen wird, den stark
dissoziierten Zustand bezeichnen, worin eine teilweise neutralisierte saure Lösung
überwiegend als das Pyruvat-Ion bzw. das L-Lactat-Ion vorliegt. Brenztraubensäure ist als
ein chemisches Zwischenprodukt bei der Herstellung von Feinchemikalien, Agrochemikalien
und Pharmazeutika verwendbar. Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist daher davon
auszugehen, daß bei der Angabe von hohen Ausbeuten und der Gewinnung von Brenztraubensäure
ein Verfahren als gleichwertig einzubeziehen ist, bei welchem die Brenztraubensäure an
sich als ein Zwischenprodukt für eine auf andere Weise verwendbare abgeleitete Verbindung
der Brenztraubensäure mit entsprechend hohen Ausbeuten erzeugt wird.
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Nach der vorliegenden Erfindung wird die Brenztraubensäure über eine
enzymkatalysierte Oxidation von L-Milchsäure in Konzentrationen bis zu 0,5 Mol hergestellt
und mit einer Ausbeute von 96% (98%ige Reinheit, Natriumsalz) dargestellt. Man hätte
erwarten können, daß die hohe Ausgangskonzentration der eingesetzten L-Milchsäure zu einer
Substrathemmung der Glykolat-Oxidase führt, die die Reaktionsgeschwindigkeit und/oder die
Endkonzentration des Produkt beschränkt haben würde. In ähnlicher Weiser könnte eine
Konzentration der Brenztraubensäure von 0,5 Mol zu einer Produkt-Hemmung des Enzyms
geführt haben, was wiederum die Konzentration des erhaltenen Produktes beschränken würde.
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Ferner wurde nach der vorliegenden Erfindung entdeckt, daß Ausbeuten von Pyruvat
bis zu 98 ... 99% in ungepufferten Reaktionen erhalten werden können, die ohne eine
pH-Kontrolle ablaufen; sämtliche früheren Beispiele von enzymatischen Oxidationen von
L-Milchsäure sind unter Verwendung eines Puffers ausgeführt worden, bei dem es sich in der
Regel um Phosphat-Puffer handelte. Die hohen Ausbeuten an Pyruvat, die in Abwesenheit von
Puffer erhalten wurden, sind genauso hoch wie diejenigen, die bei Abwesenheit von
zugesetztem Puffer erhalten werden oder überschreiten diese. Die Darstellung von Pyruvat
in Abwesenheit von zugesetztem Puffer ermöglichen eine einfache Abtrennung von Produkt aus
dem Reaktionsgemisch; der Katalysator wird durch Filtration oder Zentrifugieren entfernt
und läßt eine wäßrige Lösung eines Salzes der Brenztraubensäure zurück, das leicht durch
Entfernung des Wassers gewonnen werden kann (beispielsweise durch Abtreiben von Wasser
unter vermindertem Druck, durch Lyophilisierung o. dgl.).
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Die Verwendung von gentechnisch behandelten, permeabilisierten
Ganzzellenkatalysatoren (d. h. einem mikrobiellem Transformanten, der sowohl
Glykolat-Oxidase als auch Katalase enthält) für die Oxidation von L-Milchsäure zu Pyruvat
ist demonstriert worden. Die Verwendung dieser Ganzzellenkatalysatoren hat zu einer Reihe
von Vorteilen gegenüber der Verwendung von löslichen Enzymen als Katalysatoren in der
vorliegenden Erfindung geführt. Die Lösungen, die Ganzzellenkatalysatoren enthalten,
lassen sich mit Sauerstoff oder einem Sauerstoff enthaltenden Gas überspülen, wodurch die
Reaktionsgeschwindigkeit erhöht wird; das Überspülen eines Reaktionsgemisches, das
lösliche Enzyme enthält, führt zu einer raschen, irreversiblen Denaturierung von
Glykolat-Oxidase. Am Ende der Reaktion wird der Ganzzellenkatalysator mühelos zur
Wiederverwendung durch Filtration oder Zentrifugieren wieder hergestellt, während die
löslichen Enzyme nicht abzentrifugiert werden können und die Filtration zu einem Verlust
des größten Teils der löslichen Glykolat-Oxidaseaktivität führt. Die Rückgewinnung von
wiederverwendbaren Enzymaktivitäten für die Ganzzellenkatalysatoren ist nach jedem
Katalysatorrücklauf außerordentlich hoch (ca. 95% oder größer), während die gemessene
Aktivität der nach nur einer Reaktion verbleibenden löslichen Glykolat-Oxidase
typischerweise 40 ... 60% beträgt. Die Verwendung von Glykolat-Oxidase und Katalase, die
an einem inerten Träger gebunden oder mit diesem immobilisiert ist, zeigt viele dieser
gleichen Vorteile und wird als solche für die Aufgaben der vorliegenden Erfindung als
gleichwertig angesehen.
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Die folgende Tabelle gibt einen Vergleich der Ergebnisse, die aus der Oxidation
von 0.50 Mol L-Milchsäure-Lösungen erhalten wurden, indem verwendet wurden: 1) lösliche
Glykolat-Oxidase (g. o.) und lösliche Katalase: 2) Hansenula polymorpha-permeabilisierter
Zellenkatalysator; sowie 3) Pichia pastoris permeabilisierter Zellenkatalysator; und zwar
unter indentischen Reaktionsbedingungen (die Reaktionsbedingungen siehe Beispiele 5, 12
und 13):
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Die Ausbeute von Pyruvat ist höher und die Erzeugung von Acetat als Nebenprodukt
geringer, wenn beide permeabilisierten Katalysatoren im Vergleich zur Verwendung von
löslicher Glykolat-Oxidase und Katalase als Katalysator verwendet wurden. Bei Verwendung
des H. polymorpha-permeabilisierter Zellenkatalysator in der gleichen
Glykolat-Oxidasekonzentration wie bei dem Versuch mit löslichem Enzym verwendet wurde,
wurde weniger Acetat gebildet. (erzeugt durch die Reaktion von Wasserstoffperoxid als
Nebenprodukt mit Pyruvat), und zwar obgleich die Konzentration der im Reaktionsgemisch
vorliegenden endogenen Zellularkatalase halb so groß ist wie die in der Reaktion des
löslichen Enzyms. Diese Ergebnisse und die in den beigefügten Beispielen demonstrieren die
unerwartete Verbesserung in den Pyruvat-Ausbeuten bei Verwendung von permeabilisierten
Zelltransformanten als Katalysatoren.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die katalytische Oxidation von L-Milchsäure oder eines geeigneten Salzes davon wird
am einfachsten ausgeführt, indem die L-Milchsäure mit einer Quelle für molekularen
Sauerstoff in Gegenwart eines Enzymkatalysators in Kontakt gebracht wird, der die Reaktion
von L-Milchsäure mit O&sub2; unter Bildung von Brenztraubensäure katalysiert. Ein derartiger
Katalysator ist das Enzym Glykolat-Oxidase (EC 1.1.3.15), auch bekannt als
Glykolsäure-Oxidase. Glykolat-Oxidase kann aus zahlreichen Quellen isoliert werden, die
auf dem Gebiet gut bekannt sind (s.o.). Die in der Reaktion verwendete Glykolat-Oxidase
sollte in einer wirksamen Konzentration vorliegen, in der Regel in einer Konzentration von
etwa 0,01 bis etwa 1.000 IU/ml, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 10 IU/ml. Eine "IU"
(International Unit) wird als diejenige Enzymmenge festgelegt, die die Umsetzung von einem
Mikromol Substrat pro Minute katalysiert. Eine Vorgehensweise zur Bestimmung dieses Enzyms
findet sich in I. Zelitch und S. Ochoa, J. Biol. Chem., Bd. 201 (1953) 707 ... 718. Diese
Methode wird auch zur Bestimmung der Aktivität von gewonnener oder recyclierter
Glykolat-Oxidase angewendet.
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Optimale Ergebnisse bei der Verwendung von Glykolat-Oxidase als ein Katalysator
für die oxidative Umwandlung von L-Milchsäure zu Brenztraubensäure werden erhalten, indem
in die Reaktionslösung ein Katalysator für die Zersetzung des Wasserstoffperoxids
einbezogen wird. Ein derartiger Peroxid-zerstörender Katalysator, der bei der Vereinigung
mit Glykolat-Oxidase wirksam ist, ist die Enzym-Katalase (EC 1.11.1.6). Die Katalase
katalysiert die Zersetzung von Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff, wobei
angenommen wird, daß sie die Ausbeuten an Brenztraubensäure in dem erfindungsgemäßen
Prozeß dadurch verbessert, daß sie die Zersetzung des Wasserstoffperoxids beschleunigt,
das gemeinsam mit der Brenztraubensäure in der von Glykolat-Oxidase katalysierten Reaktion
von Milchsäure mit O&sub2; erzeugt wird. Die Konzentration von Katalase sollte 50 ... 50.000
IU/ml und vorzugsweise 2.000 ... 15.000 IU/ml betragen. Vorzugsweise werden die
Konzentrationen von Katalase und Glykolat-Oxidase innerhalb der vorgenannten Bereiche so
eingestellt, daß das Verhältnis (gemessen in IU für jedes Enzym) von Katalase zu
Glykolat-Oxidase mindestens etwa 250 : 1 beträgt.
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Zusätzlich zur Verwendung von löslichen Enzymen als Katalysatoren sind mikrobielle
Transformanten, die sowohl Glykolat-Oxidaseaktivität als auch endogene Katalaseaktivität
exprimieren, dargestellt worden und ihre Verwendung als mikrobielle Katalysatoren in der
vorliegenden Erfindung demonstriert worden. Ein mikrobieller Zellkatalysator, der in der
vorliegenden Erfindung eingesetzt worden ist, ist ein Transformant von Hansenula
polymorpha (eine methylotrophe Hefe). Es wurde mehrere Transformanten von H. polymorpha,
die über ausreichend Gylkolat-Oxidaseaktivität verfügen, durch Einsetzen der DNA für
Glykolat-Oxidase in einen Expressionsvektor unter der Kontrolle des
Formiatdehydrogenase(FMD)-Promotors hergestellt. H. polymorpha wurde mit diesem Vektor
transformiert und ein große Mengen von Glykolat-Oxidase erzeugender Stamm selektiert und
H. polymorpha GO1 bezeichnet (hinterlegt im ARS-Patent Culture Collection, unter dem
Northern Regional Research Laboratory mit der Hinterlegungsnummer: Y-21065 mit der
U. S. D. A. Peoria, Illinois.
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H. polymorpha Zellkatalysatoren werden normalerweise dargestellt, indem zunächst
ein Inokulum eines H. polymorpha-Transformanten in 500 ml YPD (Difco), pH 4,4, aufgezogen
wird. Diese Kultur wurde sodann in einen Fermenter inokuliert, der 10 l "Yeast Nitrogen
Base (YNB. Difco) ohne Aminosäuren (14 g) Ammoniumsulfat (50 g) und Methanol (100 g) bei
pH 5,0 enthielt. Der Fermenter wurde für 42,5 Stunden bei 37 C mit einer
Rührgeschwindigkeit von 400 U/min. einem konstanten pH-Wert von 5,0, 40% aufgelösten
Sauerstoff (kontrolliert) und 2 · 10&sup5; Pa (40 psig) Luft betrieben wurde. Bei Abschluß der
Fermentation wurden 1,0 kg Glyzerin zugesetzt und die Zellen durch Zentrifugieren,
Gefrieren in flüssigem Stickstoff geerntet und bei -80ºC aufbewahrt.
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Ein zweiter mikrobieller Zellenkatalysar, der in der vorliegenden Erfindung zum
Einsatz gelangte, ist ein Transformant von Pichia Pastoris (eine methylotrophe Hefe), die
das Enzym der Glykolat-Oxidase aus Spinat exprimiert, sowie eine endogene Katalase. Es
wurden mehrere Transformanten von P. pastoris mit ausreichender Glykolat-Oxidaseaktivität
durch Einsetzen eines DNA-Fragmentes dargestellt, indem ein DNA-Fragment, welches das Gen
der Spinat-Glykolat-Oxidase enthält, in einen P. pastoris-Expressionsvektor (pHIL-D4)
eingesetzt wurde, so daß es unter der Kontrolle des Methanol-induzierbaren
Alkohol-Oxidase-I-Promotors war, der das Plasmid pMP1 erzeugt. Es wurde P. pastoris Stamm
GTS115 (NRRL Y-15851) zu Plasmid pMP1 transformiert und eine Selektion vorgenommen, um die
Integration des linearisierten Plasmids pMP1 in einen chromosomalen
Alkohol-Oxidase-I-Locus und den Austausch von Alkohol-Oxidase-Gen mit Glykolat-Oxidase-Gen
zu ermöglichen. Als nächstes wurde ein Pool derartiger Transformanten für die maximale
Zahl von integrierten Kopien der Expressionskassette gewählt. Es wurde eine hohe Kopiezahl
von Transformant mit der Bezeichnung P. pastoris Stamm GS115-MSP10 isoliert und als NRRL
Y-21001 hinterlegt.
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P. pastoris-Zellen werden typischerweise durch Aufziehen eines Inokulums in 100
ml YNB dargestellt, die 1% Glycerin enthält. Nach 48 Stunden Wachstum bei 30 C wurden
die Zellen in einen Fermenter gegeben, der 10 l Medium enthält, das sich aus
Hefe-Stickstoff-Base (YNB) ohne Aminosäuren (124 g). Glycerin (100 g) und Biotin (20 mg)
zusammensetzte. Die Fermentation wurde bei pH 5,0 (kontrolliert mit NH&sub4;OH), 30ºC, mit
einer Rührgeschwindigkeit von 200 U/m. Belüftung von 1,4 · 10&sup5; Pa (5 slpm, 5 psig) Luft
und aufgelösten Stickstoff ausgeführt, der bei weniger als 50% Sättigung gehalten wurde.
Bei Verarmung von Glycerin wurden die Zellen zur Expression von Glykolat-Oxidase durch
Wachstum im gleichen Medium mit der Ausnahme induziert, daß Methanol (50 g) für Glycerin
ersetzt wurde. Mit Hilfe eines Enzymassays wurde die Glykolat-Oxidaseaktivität während der
Induktion verfolgt. Nach 24 Stunden Induktion wurden die Zellen nach einer Behandlung mit
Glycerin (1 kg) geerntet. Nach der Ernte wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff
tiefgefroren und bei -80ºC aufbewahrt.
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H. polymorpha- und P. pastoris-Zelltransformanten erforderten vor der Verwendung
als Katalysator für die Oxidation von Glykolsäure zu Glyoxalsäure eine Permeabilisierung.
Es ist eine Vielzahl bekannter Verfahren zur Permeabilisierung für die Herstellung von
Zellen mit ausreichender Glykolat-Oxidaseaktivität bekannt (siehe Felix, H., Anal.
Biochemistry, Bd. 120, (1982) 211 ... 234) Typischerweise wurde eine Suspension von 10
Gewichtsprozent nasser Zellen in 0,1% (Volumen/Volumen) "TRITON" X - 100/20 mMol
Phosphat-Puffer (pH 7,0) für 15 Minuten gemischt, danach in flüssigem Stickstoff gefroren,
aufgetaut und mit 20 mMol Phosphat/0,1 mMol FMN-Puffer (pH 7,0) gewaschen. Unmittelbar
nach der Permeabilisierung wurde die Menge des Ganzzellenkatalysators, die dem
Reaktionsgemisch zugesetzt wurde, so gewählt, daß die erforderlichen Konzentrationen von
Glykolat-Oxidase- und Katalaseaktivitäten entsprechend der vorstehenden Beschreibung für
die entsprechenden löslichen Enzyme geschaffen wurden. Ergebnisse von Glykolat-Oxidase-
und Katalaseaktivitäten von mehr als 100 · ihrer Anfangswerte sind auf die erhöhte
Permeabilisierung der Zellen während des Ablaufs der Reaktion zurückzuführen.
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Es wurden mikrobielle Zelltransformanten auf Glykolat-Oxidaseaktivität assayiert,
indem genau etwa 5 ... 10 mg nasser Zellen (abgetupft auf Filterpapier zur Entfernung von
übermäßiger Feuchtigkeit) in einer 3 ml-Quarzcuvette eingewogen wurden, die einen
Magnetrührstab und 2,0 ml einer Lösung von 0,12 mMol 2,6-Dichlorphenol-indophenol (DCIP)
und 80 mMol TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethan)-Puffer (pH 8,3) enthielt. Die Cuvette
wurde mit einer Gummimembran verschlossen und die Lösung desoxidiert, indem für 5 Minuten
Stickstoff durchgeperlt wurde. Mit Hilfe einer Spritze wurden der Cuvette sodann 40
Mikroliter 1,0 M Glykolsäure/1,0 Mol TRIS (pH 8,3) zugegeben und die Mischung gerührt,
während die Änderung der Absorption in Abhängigkeit von der Zeit bei 605 nm (e = 22,000)
gemessen wurde. Die Katalaseaktivität wurde assayiert, indem genau etwa 2 ... 5 mg nasser
Zellen (abgetupft auf Filterpapier zur Entfernung übermäßiger Feuchtigkeit) in eine 3
ml-Quarzcuvette eingewogen wurden, die einen Magnetrührstab und 2,0 ml destilliertes
Wasser enthielt, wonach 1,0 ml von 59 mMol Wasserstoffperoxid in 50 mMol Phosphat-Puffer
(pH 7,0) zugesetzt und die Änderung der Absorption in Abhängigkeit von der Zeit bei 240
nm (e = 39,4) gemessen wurde. Die Aktivitäten von Glykolat-Oxidase und Katalase der H.
polymorpha oder P. pastoris nassen Zellen (permeabilisiert) und aufgezogen in
verschiedenen Medien lagen im Bereich von 20 ... 120 DCIP IU/g nasse Zellen für
Glykolat-Oxidase und 30.000 ... 200.000 IU/g nasse Zellen für endogene Katalase.
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Ein wahlweiser, oftmals jedoch vorteilhafter Bestandteil der Reaktionslösung ist
Flavin-Mononucleotid (FMN), das im allgemeinen bei einer Konzentration bis zu etwa 2,0
mMol und vorzugsweise etwa 0,01 bis etwa 0,2 mMol verwendet wird. Es wird angenommen, daß
FMN die Produktivität der Glykolat-Oxidase erhöht, worunter die Menge Glykolsäure
verstanden wird, die pro Enzymeinheit zu Glyoxalsäure umgesetzt wird. Es wird davon
ausgegangen, daß die Konzentration von zugesetztem FMN zusätzlich zu etwaigem, mit dem
Enzym vorliegenden FMN zählt, da FMN oftmals auch dem Enzym während der Herstellung des
Enzyms zugesetzt wird. Die Struktur von FMN und eine Methode zu seiner Analyse findet sich
bei K. Yagai, "Methods of Biochemical Analysis, Bd. X, Interscience Publishers, New York,
(1962), S. 319 ... 355.
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L-Milchsäure ist kommerziell verfügbar. In der vorliegenden Reaktion liegt ihre
Ausgangskonzentration im Bereich von 0,10 Mol bis 2,0 Mol und vorzugsweise zwischen 0,25
Mol und 1,0 Mol. Sie kann in der Reaktion in Form als Säure oder als ein kompatibles Salz
davon eingesetzt werden. d. h. ein Salz, das wasserlöslich ist und dessen Kation die
angestrebte Umwandlung von L-Milchsäure zu Brenztraubensäure nicht stört. Geeignete und
kompatible salzbildende kationische Gruppen lassen sich leicht empirisch bestimmen.
Repräsentative Salze dafür sind die Alkalimetall-Salze, Erdalkalimetall-Salze,
Ammonium-Salze, substituierte Ammonium-Salze, Phosphonium-Salze und substituierte
Phosphonium-Salze. Auf dem Wege der Fermentation erzeugte L-Milchsäure kann als Substrat
als eine filtrierte Lösung unmittelbar aus dem Fermenter ohne Reinigung oder Abtrennung
aus der Fermentationsbrühe eingesetzt werden.
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Die Umwandlung von L-Milchsäure zu Brenztraubensäure wird ohne Schwierigkeiten und
vorzugsweise in wäßrigen Medien ausgeführt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird auf
einen Wert zwischen 6 und 10 und vorzugsweise zwischen 7 und 9 eingestellt. Innerhalb
dieses pH-Bereichs läßt sich der genaue angestrebte pH-Wert durch Zusatz irgendeiner
kompatiblen, nichtstörenden Base einstellen, einschließend Alkalimetallhydroxide,
-carbonate, -hydrogencarbonate und -phosphate, ohne darauf beschränkt zu sein. Der pH-Wert
eines nichtgepufferten Reaktionsgemisches nimmt um etwa 2 pH-Einheiten im Verlaufe der
Reaktion ab, so daß es oftmals nützlich ist, die Reaktion am oberen Ende des pH-Bereichs
der maximalen Enzymaktivität von etwa 9,0 ... 8,5 zu starten und während des
Reaktionsablaufes abfallen zu lassen, wobei der End-pH-Wert der nichtpufferten
Reaktionsgemische typischerweise im Bereich von 6,7 bis 7,5 liegt. Der pH-Wert läßt sich
wahlweise durch separaten Zusatz eines nichtstörenden, anorganischen oder organischen
Puffers aufrechterhalten, der über ein Pufferungsvermögen um den pH-Wert von 7,5 verfügt,
da die optimale Enzymaktivität für die Oxidation von L-Milchsäure nahe an diesem Wert
liegt, wobei bei Verwendung eines geeigneten Puffers ein Anfangs-pH-Wert von 7,5
eingesetzt wird. Es gilt als selbstverständlich, daß L-Milchsäure und Brenztraubensäure
in Wasser stark dissoziiert vorliegen und daß bei einem pH-Wert zwischen 7 und 10
überwiegend, wenn nicht fast ausschließlich L-Lactat- und Pyruvat-Ionen vorliegen.
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Sauerstoff (O&sub2;) kann als das Oxidationsmittel für die Umwandlung von L-Milchsäure
zu Brenztraubensäure als ein Gas der Reaktion unter Rühren der Flüssigkeit an der
Gas/Flüssigkeit-Grenzfläche oder durch eine für Sauerstoff durchlässige Membran zugesetzt
werden. Bei Einsatz eines permeabilisierten Ganzzellenkatalysators kann Sauerstoff durch
Bespülen (Durchperlenlassen) von Sauerstoff oder eines Sauerstoff enthaltenden Gases durch
das Reaktionsgemisch zugesetzt werden. Unter den meisten Bedingungen wird die
Reaktionsgeschwindigkeit mindestens teilweise von der Geschwindigkeit bestimmt, mit der
Sauerstoff im wäßrigen Medium aufgelöst werden kann. Somit kann, obgleich Sauerstoff der
Reaktion in Form von Luft zugeführt werden kann, auch eine relativ reine Form von
Sauerstoff verwendet werden. Obgleich keine obere Grenze des Sauerstoffdruckes bekannt
ist, können Sauerstoffdrücke bis zu 50 · 10&sup5; Pa (50 atm) verwendet werden, wobei eine
obere Grenze von 15 · 10&sup5; Pa (15 atm) bevorzugt wird. Um eine hohe
Auflösungsgeschwindigkeit für Sauerstoff (und damit Reaktionsgeschwindigkeit) aufrecht zu
erhalten, ist eine Bewegung wichtig. Es ist jede beliebige geeignete Form der Bewegung
anwendbar, wie beispielsweise das Rühren. Eine Bewegung mit hoher Scherung oder eine
Bewegung, die ein Schaum erzeugt, können die Aktivität des/der löslichen Enzym/Enzyme
herabsetzen und sollten bei Verwendung von löslichen Enzymkatalysatoren vermieden werden.
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Die Reaktionstemperatur ist sofern eine wichtige Variable, als sie die
Reaktionsgeschwindigkeit und Stabilität der Enzyme beeinflußt. Es kann typischerweise eine
Reaktionstemperatur bis zu etwa 40ºC ohne wesentlichen Verlust der katalytischen
Aktivität angewendet werden, wobei die bevorzugte Reaktionstemperatur im Bereich von etwa
0ºC bis etwa 15ºC liegt. Bei Betrieb im bevorzugten Temperaturbereich wird die gewonnene
Enzymaktivität am Ende der Reaktion auf ein Maximum gebracht. Die Temperatur sollte nicht
so niedrig sein, daß die wäßrige Lösung zu gefrieren beginnt. Die Temperatur kann mit
üblichen Methoden geregelt werden, wie beispielsweise unter Verwendung eines
Mantelreaktionsgefäßes und Durchleiten von Flüssigkeit geeigneter Temperatur durch den
Mantel, ohne darauf beschränkt zu sein. Das Reaktionsgefäß kann aus einem beliebigen
Material beschaffen sein, das gegenüber dem Reaktionsinhaltsstoffen inert ist.
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Bei Beendigung der Reaktion lassen sich die löslichen Enzymkatalysatoren durch
Filtration oder Zentrifugieren entfernen und wahlweise wiederverwenden. Alternativ können
sie durch Erhitzten. z. B. für 5 Minuten auf 70ºC, denaturiert und ausgefällt werden
und/oder man beläßt sie im Reaktionsgemisch, wenn ihre Anwesenheit kein Hinderungsgrund
ist. Permeabilisierte Zellkatalysatoren können aus den Reaktionsgemischen zum Recyclieren
durch Zentrifugieren oder Filtration abgetrennt werden. Nach der Entfernung des löslichen
Enzyms oder der mikrobiellen Zellkatalysatoren kann wahlweise Flavin-Mononucleotid (FMN)
entfernt werden, indem die Lösung mit Aktivkohle in Kontakt gebracht wird. Die angestrebte
Brenztraubensäure (d. h. die Brenztraubensäure und die Pyruvat-Salze) können als Lösung an
sich gewonnen werden, oder die resultierende Lösung kann eingeengt werden und die
Brenztraubensäure durch Entfernung von Wasser gewonnen werden; wiederum z. B. durch
Abtreiben von Wasser unter vermindertem Druck, durch Lyophilisierung (Gefriertrocknen)
oder nach einer anderen auf dem Gebiet allgemein bekannten Methode.
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In den folgenden, zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung dienenden Beispiele
werden, sofern nicht anders angegeben, die Ausbeuten von Pyruvat und Acetat und das
gewonnene L-Lactat in Prozent bezogen auf die Gesamtmenge der zu Beginn der Reaktion
vorliegenden L-Milchsäure angegeben. Die Analysen der Reaktionsgemische wurden unter
Verwendung der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ausgeführt. Die Analysen der
organischen Säuren wurden unter Verwendung einer Bio-Rad HPX-87H-Säule ausgeführt.
BEISPIEL 1
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In ein 3 oz.-Aerosol-Reaktionsgefäß aus Glas nach Fischer-Porter wurden ein
Magnetstabrührer und 10 mm einer wäßrigen Lösung gegeben, die Lithium-L-Lactat (0,75 Mol)
enthielt, FMN (0,01 mMol), Isobutansäure (HPLC - interner Standard, 0,100 Mol),
BICINE-Puffer (0,788 Mol), Spinat-Glycolat-Oxidase (1.0 IU/ml) und Aspergillus
niger-Katalase (1.400 IU/ml) bei pH 8,9. Das Reaktionsgefäß wurde verschlossen und das
Reaktionsgemisch auf 5ºC gekühlt und das Gefäß danach mit Sauerstoff gespült, indem auf
5,8 · 10&sup5; Pa (70 psig) Überdruck und Ablassen auf Atmosphärendruck 5 · unter Rühren unter
Druck gesetzt wurde. Das Gefäß wurde sodann unter einen Überdruck von 5,8 · 10&sup5; Pa (70
psig) Sauerstoff gesetzt und das Gemisch bei 5ºC gerührt. Aliquote (0,10 ml) wurden mit
Hilfe einer Spritze durch eine Probenahmeöffnung (ohne Druckverlust im Gefäß) in
regelmäßigen Abständen zur HPLC-Analyse für die Überwachung des Ablaufs der Reaktion
entnommen. Nach 28,5 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten von Pyruvat und Acetat 47,7%
bzw. 43,6%, wobei 11,5% Lactat verblieben. Die verbleibende Aktivität von
Glykolat-Oxidase und -Katalase betrug 40% bzw. 100% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 2
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Die im Beispiel 1 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von 10 ml wäßriger
Lösung wiederholt, die L-Milchsäure (96% L-Isomer, 4% D-Isomer, 0,750 Mol) enthielt.
KH&sub2;PO&sub4; (0,750 Mol). FMN (0,01 mMol), Isobutansäure (HPLC - interner Standard. 0,100 Mol).
Spinat-Glykolat-Oxidase (1,0 IU/ml) und lösliche Aspergillus niger-Katalase (14.000 IU/ml)
bei pH 8,1 und 5ºC enthielt. Nach 48 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten von Pyruvat bzw.
Acetat 79,6% bzw. 3,8 X, wobei 20,2% Lactat verblieben. Die verbleibende Aktivität von
Glykolat-Oxidase und -Katalase nach 18 Stunden der Reaktion betrug 22% bzw. 100% ihrer
Ausgangswerte.
BEISPIEL 3
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Es wurde die in Beispiel 1 beschriebene Prozedur unter Verwendung von 10 ml
wäßriger Lösung wiederholt, die L-Milchsäure (96% L-Isomer, 4% D-Isomer, 0,500 Mol),
KH&sub2;PO&sub4; (0,50 Mol), FMN (0,01 mMol), Isobutansäure (HPLC interner Standard, 0,100 Mol),
Spinat-Glykolat-Oxidase (2,0 IU/ml) und lösliche Aspergillus nicier-Katalase (14.000 IU/ml)
bei pH 8,3 und 5ºC enthielten. Nach 18 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten von Pyruvat
bzw. Acetat 90,5% bzw. 4,2%, wobei 6,4% Lactat verblieben. Die verbleibende Aktivität
von Glykolat-Oxidase und -Katalase betrug 57% bzw. 100% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 4
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Die in Beispiel 1 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von 10 ml wäßriger
Lösung wiederholt, die Natrium-L-Lactat (0,500 Mol). Isobutansäure (HPLC - interner
Standard, 0,100 Mol), Spinat-Gylkolat-Oxidase (2,0 IU/ml) und lösliche Aspergillus
niger-Katalase (20.000 IU/ml) bei pH 9,0 (eingestellt mit 50%iger NaOH) und 15ºC
enthielten. Ein Puffer wurde nicht zugesetzt. Nach 7 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten
von Pyruvat bzw. Acetat 91,6% bzw. 0,6%, wobei 7,1% Lactat verblieben. Die verbleibende
Aktivität von Glykolat-Oxidase bzw. -Katalase betrug 21% bzw. 100% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 5
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Die im Beispiel 1 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von 10 ml wäßriger
Lösung wiederholt, die Natrium-L-Lactat (0,500 Mol). Isobutansäure (HPLC - interner
Standard, 0,100 Mol). Spinat-Glykolat-Oxidase (6,0 IU/ml) und lösliche Aspergillus
niger-Katalase (10.000 IU/ml) bei pH 9,0 (eingestellt mit 50%iger NaOH) und 15ºC
enthielten. Ein Puffer wurde nicht zugesetzt. Nach 5 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten
von Pyruvat bzw. Acetat 95,3% bzw. 0,9%, wobei 4,5% Lactat verblieben. Die verbleibende
Aktivität von Glykolat-Oxidase und -Katalase betrug 68% bzw. 100% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 6
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In ein 3 oz.-Aerosol-Reaktionsgefäß aus Glas nach Fischer-Porter wurden 1
Magnetrührstab und 10 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, die Natrium-L-Lactat (0,500 Mol),
KH&sub2;PO&sub4; (0,50 Mol) und Isobutansäure (HTLC - interner Standard, 0,100 Mol) bei pH 9,0
(eingestellt mit 50%iger NaOH) enthielt und die Lösung auf 5ºC gekühlt. Sodann wurden in
das Gefäß 0,75 g Pichia pastoris-Transformant GS115-MSP10 (65,2 IU-Glykolat-Oxidase und
101.000 IU-Katalase) gegeben, die durch Behandlung mit 0,1%igem Benzalkoniumchlorid
("LONZA BARQUAT" 01-50) permeabilisiert wurden, wonach das Reaktionsgefäß verschlossen
wurde und das Reaktionsgemisch auf 5ºC gekühlt wurde. Das Gefäß wurde mit Sauerstoff
gespült, indem auf einen Überdruck von 5,8 · 10&sup5; Pa (70 psig) und Ablassen an
Atmosphärendruck 5 · unter Rühren unter Druck gesetzt wurde, wonach das Gefäß auf einen
Überdruck von 5,8 · 10&sup5; Pa (70 psig) Sauerstoff unter Druck gesetzt wurde und die Mischung
bei 5ºC gerührt wurde. Aliquote (0,10 ml) wurden mit Hilfe einer Spritze durch eine
Probenahmeöffnung (ohne Druckverlust im Gefäß) in regelmäßigen Abständen zur HPLC-Analyse
für die Überwachung des Ablaufs der Reaktion entnommen. Nach 5 Stunden betrugen die
HPLC-Ausbeuten von Pyruvat bzw. Acetat 97,6% bzw. 2,5%, wobei 0,3% Lactat verblieben.
Die verbleibende permeabilisierte Zellaktivität von Glykolat-Oxidase und -Katalase betrug
104% bzw. 105% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 7
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Die Reaktion in Beispiel 6 wurde unter Verwendung von BICINE-Puffer (0,5 Mol)
anstelle von KH&sub2;PO&sub4; (0,50 Mol) wiederholt. Nach 5 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten von
Pyruvat bzw. Acetat 93,1% bzw. 6,3%, wobei 0,4% Lactat verblieben. Die verbleibende
permeabilisierte Zellaktivität von Glykolat-Oxidase und -Katalase betrug 107% bzw. 122
% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 8
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Die im Beispiel 6 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von 10 ml einer
wäßrigen Lösung wiederholt, die Natrium-L-Lactat (0,500 Mol) und Isobutansäure (HPLC -
interner Standard. 0.100 Mol) bei pH 9,0 (eingestellt mit 50%iger NaOH) enthielt, zu der
0,75 g Pichia pastoris-Transformant GS115-MSP10 (65,2 IU-Glykolat-Oxidase und 101.000
IU-Katalase) zugesetzt wurden, die durch Behandlung mit 0,1% Benzalkoniumchlorid ("LONZA
BARQUAT" OJ-50) permeabilisiert worden waren. Ein Puffer wurde nicht zugesetzt. Nach 5
Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten von Pyruvat bzw. Acetat 99,0% bzw. 0,7%, wobei 0,4
% Lactat verblieben. Die verbleibende permeabilisierte Zellaktivität von Glykolat-Oxidase
und -Katalase betrug 119% bzw. 113% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 9
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Die im Beispiel 6 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von 10 ml wäßriger
Lösung wiederholt, die Natrium-L-Lactat (0,500 Mol) und Isobutansäure (HPLC interner
Standard, 0,100 Mol) bei pH 9,0 (eingestellt mit 50%iger NaOH) enthielt, zu der 0,35 g
Pichia pastoris-Transformant GS115-MSP10 (22,6 IU-Glykolat-Oxidase und 50.000 IU-Katalase)
zugesetzt wurden, die durch Behandlung mit 0,1% Benzalkoniumchlorid ("LONZA BARQUAT"
OJ-50) permeabilisiert worden waren. Ein Puffer wurde nicht zugesetzt. Nach 8 Stunden
betrugen die HPLC-Ausbeuten von Pyruvat bzw. Acetat 97,4% bzw. 2,3%, wobei 0,4% Lactat
verblieben. Die verbleibende permeabilisierte Zellenaktivität von Glykolat-Oxidase und
-Katalase betrug 123% bzw. 150% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 10
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Es wurde die im Beispiel 6 beschriebene Prozedur unter Verwendung von 10 ml einer
wäßrigen Lösung wiederholt, die Natrium-L-Lactat (0,500 Mol) und Isobutansäure (HPLC -
interner Standard, 0,100 Mol) bei pH 9,0 (eingestellt mit 50%iger NaOH) enthielt, wozu
0,18 g Pichia pastoris-Transformant GS115-MSP10 (11,3 IU-Glykolat-Oxidase und 25.000
IU-Katalase) zugesetzt wurden, die durch Behandlung mit 0,1% Benzalkoniumchlorid ("LONZA
BARQUAT" OJ-50) permeabilisiert worden waren. Ein Puffer wurde nicht zugesetzt. Nach 10
Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten von Pyruvat bzw. Acetat 92,9% bzw. 5,0%, wobei 3,3
% Lactat verblieben. Die verbleibende permeabilisierte Zellaktivität von Glykolat-Oxidase
und -Katalase betrug 121% bzw. 228% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 11
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Die im Beispiel 6 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von 10 ml einer
wäßrigen Lösung wiederholt, die Natrium-L-Lactat (1,00 Mol) und Isobutansäure (HPLC
interner Standard, 0,100 Mol) bei pH 9,0 (eingestellt mit 50%iger NaOH) enthielt, wozu
0.71 g Pichia Dastoris-Transforniant GS115-MSP10 (45,9 IU-Glykolat-Oxidase und 100.000
IU-Katalase) zugesetzt wurden, die durch Behandlung mit 0.1% Benzalkoniumchlorid ("LONZA
BARQUAT" OJ-50) permeabilisiert worden waren. Ein Puffer wurde nicht zugesetzt. Nach 8
Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten von Pyruvat bzw. Acetat 89,1% bzw. 8,4%, wobei 1,3
%
Lactat verblieben. Die verbleibende permeabilisierte Zellaktivität von Glykolat-Oxidase
und -Katalase betrug 124% bzw. 145% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 12
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Die im Beispiel 6 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von 10 ml einer
wäßrigen Lösung wiederholt, die Natrium-L-Lactat (0,50 Mol) und Isobutansäure (HPLC -
interner Standard, 0,100 Mol) bei pH 9,0 (eingestellt mit 50%iger NaOH) enthielt, wozu
0,66 g Pichia pastoris-Transformant GS115-MSP10 (62,7 IU-Glykolat-Oxidase und 100.000
IU-Katalase) zugesetzt wurden, die durch Behandlung mit 0,1% Benzalkoniumchlorid ("LONZA
BARQUAT" OJ-50) permeabilisiert worden waren. Ein Puffer wurde nicht zugesetzt. Die
Reaktionstemperatur betrug 15ºC und der Sauerstoff-Überdruck 9,3 · 10&sup5; Pa (70 psig). Nach
3 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten von Pyruvat bzw. Acetat 98,2% bzw. 1,2%, wobei 0,6
% Lactat verblieben. Die verbleibende permeabilisierte Zellaktivität von Glykolat-Oxidase
und -Katalase betrug 124% bzw. 130% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 13
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Die im Beispiel 12 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von 10 ml einer
wäßrigen Lösung wiederholt, die Natrium-L-Lactat (0,50 Mol) und Isobutansäure (HPLC
interner Standard. 0,100 Mol) bei pH 9,0 (eingestellt mit 50%iger NaOH) enthielt, wozu
1,04 g Hansenula polymorpha-Transformant GO1 (64,7 IU-Glykolat-Oxidase und 50.000
IU-Katalase) zugesetzt wurden, die durch Behandlung mit 0,1% Benzalkoniumchlorid ("LONZA
BARQUAT" OJ-50) permeabilisiert worden waren. Ein Puffer wurde nicht zugesetzt. Die
Reaktionstemperatur betrug 15ºC und der Sauerstoff-Überdruck 5,8 · 10&sup5; Pa (70 psig). Nach
2 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten von Pyruvat bzw. Acetat 97,0% bzw. 2,5%, wobei 0,4
% Lactat verblieben. Die verbleibende permeabilisierte Zellaktivität von Glykolat-Oxidase
und -Katalase betrug 99% bzw. 155% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 14
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Die im Beispiel 13 beschriebene Reaktion wurde bei 5ºC und einem
Sauerstoff-Überdruck von 9,3 · 10&sup5; Pa (120 psig) wiederholt. Nach 4 Stunden betrugen die
HPLC-Ausbeuten von Pyruvat bzw. Acetat 93,1% bzw. 3,7%, wobei 2,2% Lactat verblieben.
Die verbleibende permeabilisierte Zellaktivität von Glykolat-Oxidase und -Katalase betrug
66% bzw. 180% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 15
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Die im Beispiel 13 beschriebene Reaktion wurde bei 30ºC und einem
Sauerstoff-Überdruck von 5,8 · 10&sup5; Pa (70 psig) wiederholt. Nach 3 Stunden betrugen die
HPLC-Ausbeuten von Pyruvat bzw. Acetat 89,9% bzw. 6,5%, wobei 0,6% Lactat verblieben.
Die verbleibende permeabilisierte Zellaktivität von Glykolat-Oxidase und -Katalase betrug
45% bzw. 140% ihrer Ausgangswerte.
BEISPIEL 16
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Es wurde ein 300 ml-EZE-Seal-Autoklav-Reaktor, der mit einem Dispersimax Impeller
(Autoclave Engineers) und einem Rührwerk ausgestattet war, mit 100 ml einer Lösung
beschickt, die Natrium-L-Lactat (5,50 g, 0,50 Mol) enthielt. Sodann wurden dem Reaktor
6,70 g Pichia pastoris-Transformant-Stamm GS115-MSP10 (670 IU-Glykolat-Oxidase und
1.177.000 IU-Katalase) zugesetzt, die durch Behandlung mit 0,1% Benzalkoniumchlorid
("LONZA BARQUAT") MB-50) permeabilisiert worden waren, wonach die Mischung mit 50%iger
NaOH auf pH 9,0 eingestellt und auf 5ºC gekühlt wurde. Der Reaktor wurde mit Sauerstoff
gespült und die Mischung danach mit 750 U/min gerührt, womit durch die Wirkung des
Turbinenimpellers bei 5ºC unter einem Überdruck von 3,8 · 10&sup5; Pa (40 psig) Sauerstoff
durch das Gemisch durchgeperlt wurde. Die Reaktion wurde überwacht, indem ein 0,40 ml
Aliquot des Reaktionsgemisches in regelmäßigen Abständen entnommen, das Aliquot unter
Verwendung einer Millipore Ultrafree-MC 10.000 NMWL-Filtereinheit filtriert und das
Filtrat mit Hilfe der HPLC unter Verwendung von 0,10 Mol Isubutansäure analysiert wurde,
die der Probe als interner Standard zugesetzt wurde. Nach 3,0 Stunden betrugen die
HPLC-Ausbeuten von Pyruvat bzw. Acetat 99,2% bzw. 1,4%, wobei 0,6% Lactat verblieben.
Die gewonnenen Aktivitäten von permeabilisierter Zell-Glykolat-Oxidase und -Katalase
betrugen 107% bzw. 106% ihrer Ausgangswerte.
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Das Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung des permeabilisierten Zellkatalysators
zentrifugiert und der resultierende Überstand durch ein 0,2 mm-Nylonfilter filtriert. Der
pH-Wert des resultierenden Filtrats wurde mit 1,0 N HCl auf 4,6 eingestellt, wonach die
Lösung gefroren wurde und das Wasser durch Lyophilisierung entfernt wurde, um 5,20 g
Natriumpyruvat zu ergeben (96% isolierte Ausbeute, 98% Natriumpyruvat bestimmt mit Hilfe
der HPLC-Analyse).
BEISPIEL 17
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Es wurde eine Fermentationsbrühe, die 109,9 g/l Ammoniumlactat (97,8% L-Lactat,
2,2% D-Lactat), 0,8 g/l Acetat und 2,8 g/l Maltose enthielt, zur Entfernung von
Feststoffsubstanz zentrifugiert und danach durch ein 0,45 mm-Filter filtriert. Die
Konzentration von Ammoniumlactat in der resultierenden Lösung betrug 1,10 Mol (118,6 g/l
bestimmt mit Hilfe der HPLC-Analse). In einen 300 ml-EZE-Seal-Autoklav-Reaktor, der mit
einem Dispersimax Impeller (Autoclave Engineers) und einem Rührwerk ausgestattet war,
wurden 45 ml der filtrierten 1,10 M Fermentationsbrühe gegeben, wonach 55 ml destilliertes
Wasser zugesetzt wurden, um 100 ml einer wäßrigen Lösung zu ergeben, die 0,50 Mol
Ammoniumlactat enthielt. Sodann wurden dem Reaktor 6,70 g recycliertes Pichia
pastoris-Transformant-Stamm GS115-MSP10 (666 IU-Glykolat-Oxidase und 1.107.000
IU-Katalase) zugesetzt, die durch Behandlung mit 0,1% Benzalkoniumchlorid ("LONZA
BARQUAT" OJ-50) permeabilisiert worden waren, wonach das Gemisch mit 50% der NaOH auf pH
7,5 eingestellt und auf 5ºC gekühlt wurde. Der Reaktor wurde mit Sauerstoff gespült und
das Gemisch danach bei 750 U/min gerührt, womit durch die Wirkung des Turbinen-Impellers
Sauerstoff durch die Mischung geperlt wurde, und zwar bei 5ºC unter einem
Sauerstoff-Überdruck von 3,8 · 10&sup5; Pa (40 psig). Die Reaktion wurde überwacht, indem ein
0,40 ml Aliquot des Reaktionsgemisches in regelmäßigen Abständen entnommen wurde, das
Aliquot unter Verwendung einer Millipore Ultrafree-MC 10.000 NMWL-Filtereinheit filtriert
und das Filtrat mit Hilfe der HPLC unter Verwendung von 0,10 M Isobutansäure als interner
Standard analysiert wurde. Nach 3 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten von Pyruvat bzw.
Acetat 94,1% (96,2% bezogen auf L-Lactat) bzw. 2,8%, wobei 2,5% Lactat verblieben. Die
gewonnenen Aktivitäten von permeabilisierter Zell-Glykolat-Oxidase und -Katalase betrugen
101% bzw. 56% ihrer Ausgangswerte.