CN1125961A

CN1125961A - 丙酮酸的制备方法

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Publication number: CN1125961A
Application number: CN94192574A
Authority: CN
Inventors: D·L·安顿; R·迪科西莫; V·G·韦特霍尔特
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1993-06-25
Filing date: 1994-06-15
Publication date: 1996-07-03
Anticipated expiration: 2014-06-15
Also published as: ZA944559B; JP3709202B2; GR3030756T3; KR100274552B1; ES2132409T3; HU213759B; WO1995000656A1; NZ267894A; DE69417892T2; DE69417892D1; BR9407269A; RU2123529C1; JPH08511689A; CA2165940A1; CN1096500C; EP0705345B1; CA2165940C; HUT74223A; HU9503773D0; AU7056794A

Abstract

一种生产丙酮酸的方法，包括在水溶液中，在甘醇酸盐氧化酶((S)-2-羟基酸氧化酶，EC1.1.3.15)和过氧化氢酶(EC1.11.1.6)这些催化剂的存在下，L-乳酸和氧的酶促反应。能以商业上可接受的浓度(典型地可高达0.5M)得到高纯度(98％钠盐)、高产率(例如96％)的丙酮酸盐，产品对酶基本上无抑制作用。

Description

丙酮酸的制备方法

发明背景

发明领域：

本发明涉及丙酮酸的生产方法，其中L-乳酸和氧是在由甘醇酸盐氧化酶((S)-2-羟基酸氧化酶，EC1.1.3.15)和过氧化氢酶(EC1.11.1.6)组成的催化剂存在下，在水溶液中反应的。

有关技术的描述

丙酮酸已通过各种碳源(如葡萄糖、酵母提取物和胨)发酵制备，但这些方法产生的丙酮酸往往是低产率(基于所加的碳源)的，而且作为发酵产物混合物的一种成分，往往是相当低浓度的。从如此复杂的发酵液体培养基中分离提取丙酮酸一般是难以进行的，费用也很昂贵。

Cooper(美国专利4,900,668：1990年2月13日)已描述了通过光学纯D(-)-乳酸的微生物学氧化进行的丙酮酸制备。尽管这种工艺由于不利用D-乳酸作为碳源来产生该反应所需的细胞群而比其它发酵路线有所改进，但细胞群的产生以及D-乳酸的发酵转化都需要一种含有第二碳源(例如D(-)-甘露醇和玉米浆)的菌种生长培养基。此外，D-乳酸在自然界中不是随遇的，其生产或购买要比L(+)-乳酸昂贵得多。

L-乳酸向丙酮酸的转化，已利用L-乳酸盐氧化酶(L-乳酸：氧氧化还原酶，非脱羧，EC1.1.3.2)这种酶作为催化剂(B.A.Burdick and J.R.Schaeffer Biotech.Lett.，Vol.9，253-258(1987))加以证实。L-乳酸盐氧化酶(来自足球菌属(Pediococcus))催化氧将L-乳酸盐氧化成丙酮酸盐和过氧化氢：

L-乳酸盐氧化酶是与过氧化氢酶共固定的(氧化酶∶过氧化氢酶＝1∶281(IU/IU))，以限制副产物过氧化氢对丙酮酸盐的氧化而产生乙酸盐和二氧化碳。在pH7的0.1M磷酸盐缓冲剂中，49mML-乳酸盐溶液的氧化导致高达47％产率的丙酮酸(以2，4-二硝基苯腙衍生物形式分离)。

甘醇酸盐氧化酶((S)-2-羟基酸氧化酶，EC1.1.3.15)，即多叶绿色植物和哺乳动物细胞中常见的一种酶，能催化乙醇酸氧化成乙醛酸。这种酶同样也能催化L-乳酸氧化成丙酮酸，并有过氧化氢随附物质产生。C.O.Clagett，N.E.Tolbert和R.H.Burris，J.Biol.Chem.，Vol.178，977-987(1949)，首次报告从各种绿色多叶植物提取的一种α-羟基酸氧化酶，它能催化乙醇酸氧化，而且对乳酸的L-异构体也是专一的。80mM dl-乳酸盐氧化的最佳pH是7.6；没有鉴定或分离出反应产物。N.E.Tolbert等人.J.Biol.Chem.，Vol.181，905-914(1949)，把从烟草叶提取的一种纯化α-羟基酸氧化酶用于pH8的磷酸盐缓冲剂中约113mM dl-乳酸的氧化；从反应中以2，4-二硝基苯腙的形式分离出丙酮酸，未报告其数量，该反应也产生显著数量的二氧化碳。K.E.Richardson和N.E.Tolbert，J.Biol.Chem.，Vol.236，1280-1284(1961)，后来报告说这种α-羟基酸氧化酶更通常称之为乙醇酸氧化酶(即甘醇酸盐氧化酶)。

I.Zelitch和S.Ochoa，J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718(1953)，报告说，乙醇酸氧化酶能催化分子氧对L-乳酸的氧化而产生丙酮酸和过氧化氢，而且在不存在过氧化氢酶时，该过氧化物与丙酮酸盐发生非酶促反应而生成乙酸盐、CO₂和水。黄素单核苷酸(FMN)被确认为一种所需要的酶辅助因子，而且在该酶的水溶液中添加FMN大大提高了乙醇酸氧化酶的稳定性。在50mM磷酸盐缓冲剂(pH8.0)中，在过量外加过氧化氢酶的存在下，3.3mM L-乳酸盐溶液氧化产生3.2mM丙酮酸(比色法测定)；没有分离产物。

乳酸盐氧化成丙酮酸盐，也已经用一种从大鼠肾分离的L-α-羟基酸氧化酶加以证实(M.Blanchard等人，J.Biol.Chem.，Vol.163，137-144(1946))。在pH8.0的0.167M磷酸盐缓冲剂中，在外加过量过氧化氢酶的存在下，33mM乳酸盐溶液氧化产生79％产率的丙酮酸盐(以2，4-二硝基苯腙衍生物的形式分离)。乳酸由可溶性酶催化氧化成丙酮酸的进一步参考文献包括：J.C.Robinson et al.，Biol.Chem.，Vol.237，2001-2010(1962)(猪肾皮层L-α-羟基酸氧化酶)；P.Urban et al.，Biochemistry，Vol.27，7365-7371(1988)(大鼠肾L-α-羟基酸氧化酶)；D.W.Fry和K.E.Richardson，Biochim.Biophs.Acta.Vol.568，135-144(1979))(人肝乙醇酸氧化酶)；M.J.Emes和K.H.Erismann，Int.J.Biochem.，Vol.16，1373-1378(1984)(浮萍(Lemna minor L.)甘醇酸盐氧化酶)；H.S.Kim和J.D.Choi.，Korean Biochem.J.，Vol.20，350-356(1987)(菠菜甘醇酸盐氧化酶)。

虽然酶催化的氧对L-乳酸的氧化是众所周知的，但对丙酮酸的高选择性只在一个实验中得到证实(I.Zelitch和S.Ochoa)，其中L-乳酸盐的浓度是3.3mM；这种低浓度L-乳酸盐限制了所生成过氧化氢的浓度，而且在过量过氧化氢酶的存在下，也限制了过氧化氢与丙酮酸盐反应产生乙酸盐和二氧化碳。从含水反应混合物中回收如此低浓度的丙酮酸盐(约3.2mM)对于一种经济制造工艺来说是不实际的。

发明概要

本发明涉及在水溶液中，在甘醇酸盐氧化酶(例如，(S)-2-羟基酸氧化酶，EC1.1.3.15)和过氧化氢酶(例如，EC1.11.1.6)这两种酶催化剂的存在下，用氧氧化L-乳酸(或其盐)进行的丙酮酸(或其盐，以下还要更充分地解释)制备。因此，本发明提供一种改进的丙酮酸生产方法，包括如下步骤：在一种水溶液中，在甘醇酸盐氧化酶这种酶催化剂和过氧化氢酶这种酶催化剂的存在下，使L-乳酸和氧反应一段足以使L-乳酸以高产率转化成丙酮酸的时间，其中L-乳酸的初始浓度是约0.1～约2.0M，然后回收丙酮酸。应当知道的是，为了本发明之目的，丙酮酸和L-乳酸这些术语的使用，尤其当针对pH范围为6～10的水溶液时，是更具体地指一种高度离解状态，其中一种部分中和的酸溶液主要分别以丙酮酸根离子和L-乳酸根离子的形式存在。丙酮酸可作为一种化学中间体用于精细化学品、农用化学品和医药的制备。因此，应当进一步知道的是，为了本发明之目的，高产率和高回收率丙酮酸这种说法旨在包括一种等效方法.其中丙酮酸固有地以对应高产率作为丙酮酸的其它可用衍生化合物的中间体产生。

按照本发明，丙酮酸是通过可高达0.5M浓度的L-乳酸的酶催化氧化制备并以96％产率(98％纯度，钠盐)分离的。所采用L-乳酸的高初始浓度预期可能导致基质对甘醇酸盐氧化酶的抑制，这会限制反应速度和/或产品最终浓度。类似地，0.5M丙酮酸浓度可能导致产品对酶的抑制，也会限制所得产品的浓度。

进一步按照本发明，已经发现，用无任何pH控制的无缓冲反应可以得到高达98-99％的丙酮酸盐产率；以前L-乳酸盐酶促氧化的所有实例都是用一种缓冲剂，通常用磷酸盐缓冲剂进行的。缓冲剂不存在时得到的丙酮酸盐的高产率等于或超过外加缓冲剂存在下得到的丙酮酸盐产率。无外加缓冲剂的丙酮酸盐制备简化了反应混合物中产品的分离；催化剂是用过滤或离心法脱除的，留下丙酮酸盐水溶液，易于用脱水法回收(例如，用减压下脱水、低压升华干燥法，等)。

遗传工程渗透整体细胞催化剂(即一种同时含有甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的微生物转化体)用于使L-乳酸盐氧化成丙酮酸盐已经得到证实。这些整体细胞催化剂的使用，已提供许多优于可溶酶作为催化剂在本发明中使用的优点。含有整体细胞催化剂的溶液可以随氧或一种含氧气体一起通入，从而提高反应速度；而通入含有可溶酶的反应混合物则导致甘醇酸盐氧化酶的快速不可逆变性。在反应结束时，整体细胞催化剂容易用过滤法或离心法回收重复利用，而可溶酶则不能离心分离，过滤会导致甘醇酸盐氧化酶活性大量流失。整体细胞催化剂可重复利用酶活性的回收率在每次催化剂再循环之后都是极高的(大约95％或以上)，而一次反应之后剩余可溶甘醇酸盐氧化酶的实测活性典型地是40％～60％。使用附着或固定在惰性支撑体上的甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶，将显示出许多与此相同的优点，因而也被认为是符合本发明目的的等效物。

下表比较了在相同反应条件下使用下列催化剂进行0.50M L-乳酸盐溶液氧化得到的结果：1)可溶性甘醇酸盐氧化酶(g.o.)和可溶性过氧化氢酶，2)多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)渗透细胞催化剂，和3)巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)渗透细胞催化剂(反应条件见实例5、12和13)：催化剂甘醇酸盐过氧化反应丙酮乙酸乳酸

氧化酶氢酶时间酸盐盐盐

(IU/mL) (IU/mL) (h) (％) (％) (％)可溶酶 6.0 10,000 5 95.3 4.5 0.9多形汉逊酵母 6.4 5,000 2 97.0 2.5 0.4巴斯德毕赤氏酵母 6.3 10,000 3 98.2 1.2 0.6

当使用上述任意一种渗透细胞催化剂时，与使用可溶性甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶作为催化剂时相比较，丙酮酸盐的产率较高，而副产物乙酸盐的产量较低。当以与用于可溶酶实验相同的甘醇酸盐氧化酶浓度使用多形汉逊酵母(H.polymorpha)渗透细胞催化剂时，生成较少的乙酸盐(由副产物过氧化氢与丙酮酸盐反应产生)，尽管反应混合物中存在的内生细胞过氧化氢酶的浓度是可溶酶反应中该酶浓度的一半。这些结果，和伴随实例中那些结果，证实当使用渗透细胞转化体作为催化剂时丙酮酸盐产率有意外的改善。

较好实施方案描述

L-乳酸或其一种适用盐的催化氧化，是在一种能催化L-乳酸与O₂反应生成丙酮酸的酶催化剂存在下，让L-乳酸与一种分子氧源接触而方便地进行的。一种这样的催化剂是甘醇酸盐氧化酶(EC1.1.3.15)这种酶，也称之为乙醇酸氧化酶。甘醇酸盐氧化酶可以从技术上众所周知的许多源(见上文)分离。反应中使用的甘醇酸盐氧化酶应以有效浓度存在，浓度通常为约0.01～约1000IU/ml，较好是约0.1～约10IU/ml。IU(国际单位)定义为每分钟能催化1微摩尔底质(酶作用物)转化的酶的数量。这种酶的试验步骤见I.Zelitch和S.Ochoa，J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718(1953)。这种方法也用来检测回收或再循环甘醇酸盐氧化酶的活性。

甘醇酸盐氧化酶作为催化剂用于L-乳酸氧化转化成丙酮酸的最佳结果，是通过在反应溶液中加进一种过氧化氢分解催化剂得到的。一种与甘醇酸盐氧化酶组合时有效的此类过氧化物破坏催化剂是过氧化氢酶(EC1.11.1.6)这种酶。过氧化氢酶催化过氧化氢分解成水和氧，据信它能通过加速在甘醇酸盐氧化酶催化的乳酸与O₂的反应中与丙酮酸一起产生的过氧化氢的分解，提高丙酮酸的产率。过氧化氢酶的浓度应是50～50,000IU/ml，较好是2,000～15,000IU/ml。较好的是，把过氧化氢酶和甘醇酸盐氧化酶浓度调整在上述范围内，从而使过氧化氢酶与甘醇酸盐氧化酶的比值(每种酶均用IU量度)为至少约250∶1。

除使用可溶酶作为催化剂外，还制备了能表达甘醇酸盐氧化酶活性以及内生过氧化氢酶活性的微生物转化体，并证实了它们作为微生物催化剂在本发明中的用途。本发明中利用的微生物细胞催化剂是多形汉逊酵母(H.polymorpha)(一种嗜甲基酵母)的一种转化体。已通过在甲酸盐脱氢酶(FMD)促进剂的控制下把甘醇酸盐氧化酶的DNA插入一种表达媒介物中，制备了若干种具有足够甘醇酸盐氧化酶活性的多形汉逊酵母转化体。多形汉逊酵母就是用这种媒介物转化的，并筛选出一个能产生高水平甘醇酸盐氧化酶的菌株，定名为GO1多形汉逊酵母(H.polymorpha GOl)(保藏在美国伊利诺州皮奥里亚美国农业部ARS专利培养物保藏中心，北部地区研究室登记号：Y-21065)。

多形汉逊酵母细胞催化剂的制备，典型地是先在500ml pH4.4的YPD(Difco公司)中生长一种多形汉逊酵母转化体种菌。然后把这种培养物接种到一个盛有101由无氨基酸的酵母氮基(YNB，Difco公司)(14g)、硫酸铵(50g)和甲醇(100g)组成，pH5.0的培养基的发酵罐中。该发酵罐在37℃、搅拌速度400转/分、恒pH5.0、40％溶解氧(受控)和14磅/平方英寸表压(psig)空气的条件下运行42.5小时。发酵结束时添加1.0kg甘油，离心法收获细胞，用液氮冷冻、贮存在-80℃。

本发明中利用的第二种微生物细胞催化剂是巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)(一种嗜甲基酵母)的转化体，它表达了来自菠菜的甘醇酸盐氧化酶以及内生过氧化氢酶。已按如下制备了若干种有足够甘醇酸盐氧化酶活性的巴斯德毕赤氏酵母转化体：诸如在甲醇诱导醇氧化酶I促进剂的控制下，把一种含有菠菜甘醇酸盐氧化酶基因的DNA片段插入一种巴斯德毕赤氏酵母表达媒介物(pHIL-D4)中，产生质粒pMP1。用质粒pMP1使巴斯德毕赤氏酵母菌株GTS115(NRRLY-15851)转化，并进行筛选，以使得线性化质粒pMP1能整合到染色体醇氧化酶I位点上，用甘醇酸盐氧化酶基因代替醇氧化酶基因。然后筛选一批这样的转化体，以得到最大数目的表达盒整合拷贝。分离出一种定名为GS115-MSP10巴斯德毕赤氏酵母菌株(P.pastorisstrain GS115-MSP10)的高拷贝数转化体，作为NRRL Y-21001保藏。

巴斯德毕赤氏酵母细胞的制备，典型地是在100ml含有1％甘油的YNR中生长一种种菌。在30℃生长48小时后，把这些细胞转移到一个盛放101培养基的发酵罐中，该培养基由无氨基酸的酵母氮基(YNB)(134g)、甘油(100g)和生物素(20mg)组成。发酵操作条件是pH5.0(用NH₄OH控制)，30℃，搅拌速度200转/分，曝气5slpm，5磅/平方英寸表压空气，溶解氧保持在不低于50％饱和度。当甘油耗尽时，通过在除用甲醇(50g)代替甘油外相同的培养基中生长，诱导这些细胞以使之表达甘醇酸盐氧化酶。诱导期间的甘醇酸盐氧化酶活性用酶检定法跟踪。诱导24小时后，先用甘油(1kg)处理，再收获这些细胞。收获后，细胞用液氮冷冻，在-80℃保存。

多形汉逊酵母和巴斯德毕赤氏酵母细胞转化体在作为乙醇酸氧化成乙醛酸的催化剂使用之前需要进行渗透。有各种各样的已知渗透方法可用于制备有足够甘醇酸盐氧化酶活性的细胞(参阅Felix，H.，Anal.Biochemistry，Vol，120，211-234(1982))。典型地说，10％(重量)湿细胞在0.1％(体积)“TRITON”X-100/20mM磷酸盐缓冲剂(pH7.0)中的悬浮液混合15分钟，然后用液氮冷冻，解冻，用20mM磷酸盐/0.1mM FMN缓冲剂(pH7.0)洗涤。第二种渗透方法按以下进行：10％(重量)湿细胞在0.2％(重量/体积)氯化苄烷铵/20mM磷酸盐缓冲剂(pH7.0)中的悬浮液混合60分钟，然后用20mM磷酸盐/0.1mM FMN缓冲剂(pH7.0)洗涤这些经过渗透的细胞。一旦进行了渗透，立即选择添加到反应混合物中的整体细胞催化剂的数量，以便提供如以上对对应可溶酶所述那样的必要甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶活性浓度。甘醇酸盐氧化酶与过氧化氢酶活性的回收率之所以大于其初始值的100％，是由于在反应期间细胞的渗透作用增大。

微生物细胞转化体的甘醇酸盐氧化酶活性检测是准确称量约5～10mg湿细胞(用滤纸吸干以除去多余水分)放进一个3ml石英杯中，杯中含有一枚磁搅拌棒和2.0ml由0.12mM 2，6-二氯苯酚-靛酚(DCIP)和80mM TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)缓冲剂(pH8.3)组成的一种溶液。杯上盖一张橡皮膜，通氮鼓泡5分钟使溶液脱氧。然后用注射器向杯中添加40μl 1.0M乙醇酸/1.0M TRIS(pH8.3)，搅拌混合物，同时测定在605nm(ε＝22,000)的吸收随时间的变化。过氧化氢酶活性检测是准确称量约2～5mg湿细胞(用滤纸吸干以除去多余水分)放进一个3ml石英杯中，杯中含有一枚磁搅拌棒和2.0ml蒸馏水，然后添加1.0ml 59mM过氧化氢在50mM磷酸盐缓冲剂(pH7.0)中的溶液，并测定在240nm(ε＝39.4)的吸收随时间的变化。在不同培养基中培养的多形汉逊酵母或巴斯德毕赤氏酵母湿细胞(渗透的)甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶活性范围，对甘醇酸盐氧化酶是20～120 DCIP IU/克湿细胞，而对内生过氧化氢酶是30,000～200,000IU/克湿细胞。

反应溶液中一种任选但往往有益的组分是黄素单核苷酸(FMN)，其使用浓度一般可高达约2.0mM，较好是约0.01～约0.2mM。据信，FMN能提高甘醇酸盐氧化酶的生产力，即每单位酶能使乙醇酸转化成乙醛酸的数量。要理解的是，所添加FMN的浓度不包括与酶一起存在的任何FMN，因为在酶的制备期间往往也向酶中添加FMN。FMN的结构及其分析方法见K.Yagai，Methods of Biochemical Analysis，Vol.X，Interscience Publishers，New York，1962，p.319-355。

L-乳酸是商业上可得的，在本反应中，它的初始浓度范围是0.10M～2.0M，较好是在0.25M和1.0M之间。它可以作为酸或作为其一种兼容盐用于反应，这就是说，这种盐应是水溶性的，且其阳离子不干扰所希望的L-乳酸向丙酮酸的转化。适用和兼容的成盐阳离子组容易通过试验来确定。这类盐的代表是碱金属盐，碱土金属盐、铵盐、取代的铵盐、鏻盐、和取代的鏻盐。通过发酵产生的L-乳酸可以利用直接来自发酵罐的过滤溶液作为底质，无需纯化或与发酵液体培养基分离。

L-乳酸向丙酮酸转化方便地且较好在水培养基中进行。反应混合物的pH调节到6～10、较好7～9之间的一个值。在这个pH范围内，可以通过添加任何一种兼容的非干扰碱，包括，(但不限于)碱金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐和磷酸盐，调节一个能获得预期pH的准确数值。未缓冲反应混合物的pH会随着反应进行而降低大约2pH单位，因此，往往有益的是让反应在最大酶活性pH范围的高端约9.0～8.5开始，并让它在反应期间下降；典型地说，未缓冲反应混合物的最终pH范围是大约6.7～7.5。这个pH可以任选地通过单独添加一种在pH7.5左右有一定缓冲能力的非干扰性无机或有机缓冲剂来保持，因为L-乳酸盐氧化的最佳酶活性接近于这个值；当使用一种适用缓冲剂时采用7.5的初始pH。要理解，L-乳酸和丙酮酸在水中是高度离解的，而且在7～10之间的pH时大部分(如果不是基本上的话)以L-乳酸根和丙酮酸根离子的形式存在。

氧(O₂)即L-乳酸转化成丙酮酸的氧化剂，可以通过在气-液界面上搅拌液体或通过一张能透过氧的膜，以气体形式加到反应中。当采用渗透的整体细胞催化剂时，可以通过向反应混合物中通入(鼓泡)氧或一种含氧气体来加氧。在大多数条件下，反应速度至少部分地受到氧能溶解到该含水培养基中的速度控制。因此，尽管氧能以空气形式加到反应中，但也可以使用相当纯粹形式的氧。尽管不知道氧压的上限，但可以使用可高达50大气压的氧压，而且较好是上限为15大气压。搅拌对于保持高氧溶解速度(因而高反应速度)是重要的。任何方便的搅拌方式均可使用，例如机械搅拌。高剪切搅拌或产生泡沫的搅拌可能使溶解酶活性降低，因而当使用溶解酶催化剂时应当避免。

反应温度是一个重要变量，其原因在于它影响反应速度和酶的稳定性。典型地说，可以使用可高达约40℃的反应温度而不显著损失催化活性，但较好的反应温度范围是约0℃～约15℃。在这个较好反应温度范围内操作，能在反应结束时使回收的酶活性达到最大限度。温度不应低得使水溶液开始凝固。温度可以用普通方法控制，例如，但不限于，使用夹套式反应容器并让有适当温度的液体通过该夹套。反应容器可以用任何一种对反应组分惰性的材料建造。

当反应完成时，可溶性酶催化剂可以用过滤法或离心法脱除，并任选地重复利用。此外，也可以通过加热诸如到70℃5分钟而使之变性和沉淀，和/或如果它们的存在不令人讨厌，还可以允许它们仍然留在反应混合物中。渗透的细胞催化剂可以用离心法或过滤法从反应混合物中分离出来再循环。在可溶性酶或微生物细胞催化剂脱除之后，黄素单核苷酸(FMN)可以任选地通过让该溶液与活性炭接触而脱除。然后，所希望的丙酮酸(即丙酮酸和丙酮酸盐)可以作为溶液本身回收，也可以通过脱水而使所得到的溶液浓缩和回收该丙酮酸：这种浓缩可以诸如通过在减压下脱水、冻干(冷冻干燥)或者技术上普遍知道的任何其它方法进行。

在用来进一步说明本发明的下列实例中，丙酮酸盐和乙酸盐的产率，以及L-乳酸盐的回收率，是以反应开始时存在的L-乳酸总量为基准计算的百分率，除非另有所指。反应混合物的分析是用高压液相色谱法(HPLC)进行的，有机酸分析用Bio-Rad HPX-87H柱进行。

实例1

在一个3盎司Fischer-Porter玻璃气溶胶反应容器中放进一个磁搅拌棒和10ml pH8.9的水溶液，其中含有L-乳酸锂(0.75M)、FMN(0.01mM)、异丁酸(HPLC内插标准，0.100M)、N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲剂(0.788M)、菠菜甘醇酸盐氧化酶(1.0IU/ml)和黑曲霉(Aspergillus niger)过氧化氢酶(1,400IU/ml)。将反应容器密封并使反应混合物冷却到5℃，然后通过加压至70磅/平方英寸表压(psig)并在搅拌下向大气压放空5次，用氧冲洗该容器。然后使该容器增压至70磅/平方英寸表压的氧气，混合物在5℃搅拌。按有规律的时间间隔用注射器通过采样口(不损失容器内的压力)取出等分试样(0.10ml)进行HPLC分析，以监测反应的进展。28.5小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为47.7％和43.6％，剩余11.5％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的40％和100％。

实例2

在pH8.1和5℃，用10ml含有下列成分的水溶液重复实例1中所述步骤：L-乳酸(96％L-异构体，4％D-异构体，0.750M)KH₂PO₄(0.750M)、FMN(0.01mM)、异丁酸(HPLC内插标准，0.100M)，菠菜甘醇酸盐氧化酶(1.0IU/ml)，和可溶性黑曲霉过氧化氢酶(14,000IU/ml)。48小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为79.6％和3.8％，剩余20.2％乳酸盐。反应18小时后甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的22％和100％。

实例3

在pH8.3和5℃，用10ml含有下列成分的水溶液重复实例1中所述步骤：L-乳酸(96％L-异构体，4％D-异构体，0.500M)KH₂PO₄(0.50M)、FMN(0.01mM)、异丁酸(HPLC内插标准，0.100M)，菠菜甘醇酸盐氧化酶(2.0IU/ml)，和可溶性黑曲霉过氧化氢酶(14,000IU/ml)。18小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为90.5％和4.2％，剩余6.4％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的57％和100％。

实例4

在pH9.0(用50％NaOH调节)和15℃，用10ml含有下列成分的水溶液重复实例1中所述步骤：L-乳酸钠(0.500M)，异丁酸(HPLC内插标准，0.100M)，菠菜甘酵酸盐氧化酶(2.0IU/ml)，和可溶性黑曲霉过氧化氢酶(20,000IU/ml)；不添加缓冲剂。7小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为91.6％和0.6％，剩余7.1％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氢化氢酶的剩余活性分别为其初始值的21％和100％。

实例5

在pH9.0(用50％NaOH调节)和15℃，用10ml含有下列成分的水溶液重复实例1中所述步骤：L-乳酸钠(0.500M)，异丁酸(HPLC内插标准，0.100M)，菠菜甘醇酸盐氧化酶(6.0IU/ml)，和可溶性黑曲霉过氧化氢酶(10,000IU/ml)；不添加缓冲剂。5小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为95.3％和0.9％，剩余4.5％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的68％和100％。

实例6

在一个3盎司Fischer-Porter气溶胶反应容器中放置一枚磁搅拌棒和10ml合有乳酸钠(0.500M)、KH₂PO₄(0.50M)和异丁酸(HPLC内插标准，0.100M)、pH9.0(用50％NaOH调节)的水溶液，将溶液冷却到5℃。然后向该容器中添加0.75g已经通过用0.1％氯化苄烷铵(“LONZA BARQUAT”OJ-50)处理而渗透的巴斯德毕赤氏酵母转化体GS115-MSP10(65.2IU甘醇酸盐氧化酶和101,000IU过氧化氢酶)，然后将反应容器密封，反应混合物冷却到5℃，该容器通过增压至70磅/平方英寸表压并在搅拌下向大气压放空5次，用氧冲洗该容器；然后使该容器增压至70磅/平方英寸表压的氧气，混合物在5℃搅拌。按有规律的时间间隔用注射器通过采样口(不损失容器内的压力)取出等分样品(0.10ml)进行HPLC分析，以监测反应的进展。5小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为97.6％和2.5％，剩余0.3％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余渗透细胞活性分别为其初始值的104％和105％。

实例7

用N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲剂(0.5M)代替KH₂PO₄(0.50M)，重复实例6中的反应。5小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为93.1％和6.3％，剩余0.4％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余渗透细胞活性分别为其初始值的107％和122％。

实例8

用10ml含有L-乳酸钠(0.500M)和异丁酸(HPLC内插标准，0.100M)的pH9.0(用50％NaOH调节)水溶液重复实例6中所述步骤，向该水溶液中添加0.75g已通过用0.1％氯化苄烷铵(“LONZABARQUAT”OJ-50)处理而渗透的巴斯德毕赤氏酵母转化体GS115-MSP10(65.2IU甘醇酸盐氧化酶和101,000IU过氧化氢酶)；不添加缓冲剂。5小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为99.0％和0.7％，剩余0.4％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余渗透细胞活性分别为其初始值的119％和113％。

实例9

用10ml含有L-乳酸钠(0.500M)和异丁酸(HPLC内插标准，0.100M)的pH9.0(用50％NaOH调节)水溶液重复实例6中所述步骤，向该水溶液中添加0.35g已通过用0.1％氯化苄烷铵(“LONZABARQUAT”OJ-50)处理而渗透的巴斯德毕赤氏酵母转化体GS115-MSP10(22.6IU甘醇酸盐氧化酶和50,000IU过氧化氢酶)；不添加缓冲剂。8小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为97.4％和2.3％，剩余0.4％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余渗透细胞活性分别是其初始值的123％和150％。

实例10

用10ml含有L-乳酸钠(0.500M)和异丁酸(HPLC内插标准，0.100M)的pH9.0(用50％NaOH调节)水溶液重复实例6中所述步骤，向该水溶液中添加0.18g已通过用0.1％氯化苄烷铵(“LONZABARQUAT”OJ-50)处理而渗透的巴斯德毕赤氏酵母转化体GS115-MSP10(11.3IU甘醇酸盐氧化酶和25,000IU过氧化氢酶)；不添加缓冲剂。10小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为92.9％和5.0％，剩余3.3％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余渗透细胞活性分别是其初始值的121％和228％。

实例11

用10ml含有L-乳酸钠(1.00M)和异丁酸(HPLC内插标准，0.100M)的pH9.0(用50％NaOH调节)水溶液重复实例6中所述步骤，向该水溶液中添加0.71g已通过用0.1％氯化苄烷铵(“LONZABARQUAT”OJ-50)处理而渗透的巴斯德毕赤氏酵母转化体GS115-MSP10(45.9IU甘醇酸盐氧化酶和100,000IU过氧化氢酶)；不添加缓冲剂。8小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为89.1％和8.4％，剩余1.3％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余渗透细胞活性分别为其初始值的124％和145％。

实例12

用10ml含有L-乳酸钠(0.50M)和异丁酸(HPLC内插标准，0.1000M)的pH9.0(用50％NaOH调节)水溶液重复实例6中所述步骤，向该水溶液中添加0.66g已通过用0.1％氯化苄烷铵(“LONZABARQUAT”OJ-50)处理而渗透的巴斯德毕赤氏酵母转化体GS115-MSP10(62.7IU甘醇酸盐氧化酶和100,000IU过氧化氢酶)；不添加缓冲剂。反应温度是15℃，氧压是70磅/平方英寸表压。3小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别是98.2％和1.2％，剩余0.6％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余渗透细胞活性分别为其初始值的124％和130％。

实例13

用10ml含有L-乳酸钠(0.50M)和异丁酸(HPLC内插标准，0.100M)的pH9.0(用50％NaOH调节)水溶液重复实例12中所述步骤，向该水溶液中添加1.04g已通过用0.1％氯化苄烷铵(“LONZABARQUAT”OJ-50)处理而渗透的多形汉逊酵母转化体G01(64.7IU甘醇酸盐氧化酶和50,000IU过氧化氢酶)；不添加缓冲剂。反应温度是15℃，氧压是70磅/平方英寸表压。2小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为97.0％和2.5％，剩余0.4％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余渗透细胞活性分别为其初始值的99％和155％。

实例14

在5℃和120磅/平方英寸表压的氧，重复实例13中所述反应。4小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为93.1％和3.7％，剩余2.2％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余渗透细胞活性分别为其初始值的66％和180％。

实例15

在30℃和70磅/平方英寸表压的氧，重复实例13中所述的反应。3小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为89.9％和6.5％，剩余0.6％乳酸盐。甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶的剩余渗透细胞活性分别为其初始值的45％和140％。

实例16

一台配备Dispersimax Impeller的300ml EZE-Seal搅拌式高压釜反应器(Autoclave Engineers)注入100ml含有L-乳酸钠(5.50g，0.50M)的溶液。然后向该反应器中添加6.70g已通过用0.1％氯化苄烷铵(“LONZA BARQUAT”MB-50)处理而渗透的巴斯德毕赤氏酵母转化体菌株GS115-MSP10(670IU甘醇酸盐氧化酶和1,177,000IU过氧化氢酶).混合物用50％NaOH调节至pN9.0，冷却至5℃。该反应器通氧，然后该混合物在40磅/平方英寸表压氧气下在5℃以750转/分搅拌，利用涡轮叶轮的作用使氧气通过混合物鼓泡。反应的监测按如下进行：按有规律的时间间隔取出0.40ml反应混合物等分样品，用一种Millipore Ultrafree-MC10,000NMWL过滤单元过滤该等分样品，对滤液进行HPLC分析，用添加到样品中的0.10M异丁酸作为内插标准。3.0小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别为99.2％和1.4％，剩余0.6％乳酸盐。回收的渗透细胞甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶活性分别为其初始值的107％和106％。

反应混合物离心分离，以除去渗透细胞催化剂，得到的上清液通过一种0.2mm尼龙过滤器过滤，用1.0N HCl把所得到滤液的pH调节到4.6，然后将溶液冷冻，用冻干法脱水，产生5.20g丙酮酸钠(分离产率96％，用HPLC分析测定的98％丙酮酸钠)。

实例17

一种含有109.9g/l乳酸铵(97.8％L-乳酸盐，2.2％D-乳酸盐)、0.8g/l乙酸盐和2.8g/l麦芽糖的发酵液体培养基进行离心分离以除去颗粒物质，然后通过一个0.45mm过滤器过滤。所得到溶液中乳酸铵的浓度是1.10M(118.6g/l，用HPLC分析法测定)。在一个配备Dispersimax Impeller的300ml EZE-Seal搅拌式高压釜反应器(Autoclave Engineers)中放入45ml 1.10M过滤的发酵液体培养基，然后加55ml蒸馏水，以产生100ml含有0.50M乳酸铵的水溶液。然后向该反应器中添加6.70g已通过用0.1％氧化苄烷铵(“LONZA BARQUAT”OJ-50)处理而渗透的再循环巴斯德毕赤氏酵母转化体菌株GS115-MSP10(666IU甘醇酸盐氧化酶和1,107,000IU过氧化氢酶)，混合物用50％NaOH调节至pH7.5，冷却到5℃。反应器中通入氧气，然后混合物在40磅/平方英寸表压氧气下在5℃以750转/分搅拌，借助于涡轮叶轮的作用使氧气通过混合物鼓泡。反应的监测按如下进行，按有规律的时间间隔取出0.40ml反应混合物等分样品，用一种Millipore Ultrafree-MC10,000NMWL过滤单元过滤该等分样品，对滤液进行HPLC分析，用0.10M异丁酸作为内插标准。3.0小时后，丙酮酸盐和乙酸盐的HPLC产率分别是94.1％(根据L-乳酸盐计算为96.2％)和2.8％，剩余2.5％乳酸盐。回收的渗透细胞甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶活性分别为其初始值的101％和56％。

以上对本发明做了某种具体程度的描述和说明，应当知道的是，下列权利要求不要因此而受限制，而是有一个与各该权利要求的每个要素及其对等物的说法一致的范围。

Claims

1.一种生产丙酮酸的方法，包括如下步骤：在一种水溶液中，在甘醇酸盐氧化酶这种酶催化剂和过氧化氢酶这种酶催化剂的存在下，让L-乳酸和氧反应一段足以使L-乳酸以高产率转化成丙酮酸的时间，其中L-乳酸的初始浓度是约0.1～约2.0M，然后回收该丙酮酸。

2.权利要求1的方法，其中所述酶催化剂存在于一种微生物转化体中。

3.权利要求1的方法，其中不添加额外的缓冲剂，反应期间也不进行pH控制。

4.权利要求1的方法，其中反应是在约6～约10的pH进行的，且其中存在0.01～1,000IU/ml甘醇酸盐氧化酶活性和50～50,000IU/ml过氧化氰酶活性。

5.权利要求3的方法，其中存在0.1～10IU/ml甘醇酸盐氧化酶活性和2,000～15,000TU/ml过氧化氢酶活性，且过氧化氢酶活性与甘醇酸盐氧化酶活性的IU/ml比是至少250∶1。