ES2281539T3 - Composicion nutritiva que previene el sobrecrecimiento bacteriano. - Google Patents

Abstract

El uso de hidrolizado de proteína de suero lácteo, como única fuente de proteínas, en la preparación de una composición nutritiva para la prevención del crecimiento bacteriano, de la enterocolitis necrotizante, y / o de la septicemia por translocación bacteriana.

Description

Composición nutritiva que previene el sobrecrecimiento bacteriano.

La presente invención, se refiere al uso de una composición nutritiva que previene el sobrecrecimiento bacteriano, la translocación bacteriana y la enfermedad unida a éstos, como la enterocolitis necrotizante, la septicemia de translocación bacteriana y/o disponibilidad reducida de nutrientes. La presente invención, se refiere, también, a un procedimiento para la prevención o tratamiento de tales tipos de condiciones.

Antecedentes y trasfondo del arte correspondiente a la técnica anterior

El sobrecrecimiento bacteriano, acontece, a menudo, en niños lactantes prematuros, en pacientes críticamente enfermos y en personas mayores, y es una de las causas principales de los eventos que ponen la vida en peligro, tales como la enterocolitis necrotizante, la septicemia, y el aprovechamiento reducido de los nutrientes.

En las etapas más tempranas del crecimiento bacteriano, las bacterias que, usualmente, únicamente habitan en el intestino grueso, empiezan a inmigrar a través de la válvula ileocecal y a colonizar el ileum. En un estado posterior, incluso puede invadirse el yeyuno. De una forma general, la colonización del intestino delgado mediante bacterias, es desventajoso para el huésped, incluso en el caso de las bacterias probióticas, como ciertas cepas de Lactobacillus ó Bifidobacterium, las cuales pueden tener un impacto beneficioso para el huésped, en el intestino grueso.

El documento de patente internacional WO 2 000 22 945 (SOC PROD NESTLÉ SA), reporta sobre una nueva proteína aislada a partir de leche, la cual tiene propiedades anti-inflamatorias, antibacterianas y antialérgicas, y que es por lo tanto de utilidad para la prevención y el tratamiento de la enfermedad del intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn, colitis ulcerante y otras enfermedades.

El documento de patente japonesa JP 08 059 500 (MORINAGA MILK IND CO LTD), enseña una nueva mezcla de péptidos coleccionados a partir de hidrolizados de lactoferrina, la cual tiene propiedades fisicoquímicas y biológicas especiales, para la prevención de la migración de bacterias entéricas procedentes del intestino, hacia el interior de otros órganos.

El documento de patente japonesa JP 05 304 929 (MORINAGA MILK IND CO LTD), da a conocer una forma para mejorar las composiciones bacterianas anormales de la flora del intestino humano o animal. El líquido o fluido alimenticio en concordancia con la JP 05 304 929, contiene lactoferrina bovina.

En general, los hidrolizados de proteínas, son bien conocidos, y éstos se utilizan en fórmulas líquidas, principalmente, para hacer decrecer la alergenidad de las correspondientes proteínas intactas. Así, por ejemplo, los hidrolizados de proteína láctea, son parte de las fórmulas nutricionales para personas con alergia contra antígenos de proteínas lácteas.

Hasta hoy, el problema del sobrecrecimiento bacteriano, se aborda mediante un terapia a base de fármacos o, de una forma más reciente, mediante otras substancias fisiológicamente activas, las cuales pueden también aislarse o purificarse a partir de la leche (por ejemplo, lactoferrina). Una terapia a base de fármacos, usualmente, no es muy aconsejable, debido a hecho de que, ello, significa un gran impacto sobre el cuerpo y, también, afecta a la flora bacteriana del intestino. Así, de este modo, una terapia a base de fármacos, no únicamente trata el sobrecrecimiento bacteriano, sino que, además, aniquila la flora bacteriana en su totalidad. El inconveniente de los principios activos específicos, también de aquéllos aislados de la leche, reside en el hecho de que, éstos, deben producirse o aislarse y que, su toma, debe dosificarse exactamente y, finalmente, en el hecho de que, éstos, pueden también provocar efectos secundarios. Adicionalmente a ello, estas substancias, se utilizan, usualmente, únicamente para tratar un sobrecrecimiento bacteriano avanzado, y no se utilizan para propósitos de prevención o para el tratamiento de condiciones menos graves.

Así, por lo tanto, existe una necesidad en cuanto al hecho de disponer de un producto natural, fácil de producir, para el tratamiento del crecimiento bacteriano, el cual no involucre un procedimiento de purificación caro, el cual tenga, al mismo tiempo, un valor nutritivo, y el cual no incluya efectos secundarios relacionados con la terapia a base de fármacos. En este sentido, existe también una necesidad, en cuanto al hecho de disponer de un tratamiento suave, el cual no interfiera con el crecimiento bacteriano en el colon, allí en donde sea deseable.

Después de todo, existe una necesidad en cuanto al hecho de disponer de un nutriente para la fabricación de una composición nutritiva, para mamíferos lactantes, el cual fomente un modelo patrón de la flora intestinal, similar al presente en mamíferos alimentados por su madre.

Existe también una necesidad en cuanto al hecho de poder proporcionar tal tipo de nutrición, a base de productos alimenticios inofensivos y utilizados, en lugar de una medicación o, en general, de substancias farmacológicamente activas.

La presente invención, está dirigida al problema de proporcionar nutrición a un paciente que esté afectado de crecimiento o translocación bacteriana, en el intestino, y otras enfermedades que se encuentran íntimamente ligadas al crecimiento bacteriano o que son consecuencias directas del crecimiento bacteriano. La presente invención, tiene también el objetivo de proporcionar una nutrición a base de nutrientes y alimentos inofensivos y nutritivamente valiosos y ventajosos.

Es también un objetivo de la presente invención, el proporcionar nutrición a un paciente afectado de un sobrecrecimiento bacteriano, reduciendo el uso de substancias farmacéuticamente activas, en la máxima extensión posible.

Resumen de la invención

De una forma remarcable, se ha encontrado el hecho de que, los hidrolizados específicos de proteínas, previenen el crecimiento bacteriano en el intestino delgado, y fomentan el modelo patrón de la flora intestinal, el cual es similar al inducido por la leche de pecho.

Por consiguiente, la presente invención, proporciona el uso de hidrolizado de proteína de suero lácteo, como única fuente de proteínas, en la preparación de una composición nutricional para la prevención del crecimiento bacteriano, de la enterocolitis necrotizante, y/o de la septicemia por translocación bacteriana.

Una ventaja de la presente invención, reside en el hecho de que, ésta, proporciona medios sencillos, fácilmente asequibles, y que no son caros, para prevenir de forma efectiva el crecimiento bacteriano en el intestino y otras condiciones patológicas relacionadas con éste.

Otra ventaja de la presente invención, reside en el hecho de que, ésta, proporciona la prevención del crecimiento bacteriano y que, al mismo tiempo, es nutritivamente valioso para el paciente.

Todavía otra ventaja de la presente invención, reside en el hecho de que, ésta, es particularmente apropiada para preparar fórmulas líquidas, por ejemplo, fórmulas enterales.

En las figuras,

La figura 1, muestra la distribución del peso molecular (MW) del hidrolizado de proteína, de utilidad para realizar la invención. Las barras, representan el porcentaje del área total, medida a 220 nm, que corresponde a los márgenes indicados del MW. La línea, representa la distribución acumulada del tamaño (% de área versus MW). La mediana del MW, se encuentra a 475 Da (= MD 50%).

El perfil peptídico, se valoró mediante cromatografía líquida, de exclusión, de alto rendimiento, (SEC-HPLC). Se realizó una curva de calibración, del tiempo de retención, versus peso molecular, utilizando proteínas puras, péptidos y aminoácidos, de peso molecular conocido (patrones standard). A una longitud de onda de 200 nm, se detectan enlaces de péptidos, así como también anillos aromáticos, de algunos aminoácidos.

Los ejes verticales de la figura 1, se denominan "% de área a 200 nm", los cuales reflejan el hecho de que, la superficie irregular del cromatograma, se encuentra dividido en varias secciones, en base al tiempo de retención de los patrones standard, correspondiendo, cada uno de ellos, a los márgenes de los pesos moleculares. La superficie de cada sección, se divide por el área total (100%). Se trata de un procedimiento standard para analizar la distribución del peso molecular.

La figura 2, muestra los recuentos de enterobacterias en el yeyuno, ileum y cecum de ratas alimentadas por sus madres (MF, barra transparente), o mediante dietas artificiales (grado de hidrólisis (DH, véase la definición, posteriormente, más abajo), 0% y DH 30%, barra llena y denuda, respectivamente). Se representan los valores de Media \pm errores standard (\pmSEM). Dentro del mismo segmento intestinal, diferentes letras, significan diferencias significativas.

La figura 3, muestra el recuento de Enterococos. Para mayores detalles, véase la explicación facilitada en la figura 2.

La figura 4, muestra el recuento de Lactobacilos. Para mayores detalles, véase la explicación facilitada en la figura 2.

Descripción detallada de la invención

Dentro de contexto de la presente especificación, la palabra "comprende", se toma como queriendo significar "incluye, entre otras cosas". No se pretende que ésta se interprete como "consiste únicamente en".

Dentro del contexto de la presente especificación, la palabra "crecimiento bacteriano", se refiere, también, a unas condiciones de enfermedad, malestar o indisposición, relacionadas con el crecimiento bacteriano, o que son la consecuencia de un crecimiento bacteriano. La septicemia y aprovechamiento reducido de los nutrientes, pueden servir como ejemplos de tales tipos de consecuencias.

Dentro del contexto de esta especificación, la abreviación "DH", se refiere al grado de hidrólisis. El término, es bien conocido en el arte especializado de la técnica, y denota, en el contexto del sentido proteinogénico, el porcentaje de \alpha-BH_{2}-nitrógeno, con respecto al nitrógeno total (la cantidad de nitrógeno que se encuentra en forma de amino-nitrógeno libre). La unidad (porcentaje), se omite, a veces, por motivos de conveniencia, especialmente, allí en donde se utilizan hidrolizados standard (por ejemplo, DH0, se refiere a la proteína intacta y DH30, se refiere a un hidrolizado extensivamente hidrolizado).

Las composiciones nutricionales en concordancia con el uso de la presente invención, pueden producirse en concordancia con la práctica común. La composiciones apropiadas, son conocidas para otros propósitos, por ejemplos, fórmulas nutritivas para individuos afectados de alergias alimenticias, tales como las alergias a la proteína láctea o a la soja. De una forma general, los ingredientes de la composición nutritiva, pueden mezclarse en forma seca y, después, reconstituirse en agua, por ejemplo, bajo agitación y/o calentamiento.

En la presente invención, la proteína hidrolizable, es hidrolizado de suero lácteo.

El hidrolizado de proteína, pueden producirse mediante cualquier procedimiento de hidrólisis. De una forma preferible, éste se produce mediante una hidrólisis ácida o enzimática. La patente europea EP 322 589 (SOCIETÉ DES PRODUITS NESTLÉ), da a conocer un procedimiento que es apropiado para obtener un hidrolizado de proteína, dentro del significado de la presente invención. Adicionalmente, la publicación de patente internacional WO 99 13 738 (SOCIETÉ DES PRODUITS NESTLÉ), da a conocer una forma de obtención de un hidrolizado particularmente de utilidad. En el ejemplo 1, bajo el subtítulo "hidrolizado 3", de esta referencia, se proporciona el protocolo del procedimiento, así como también un análisis del hidrolizado resultante.

De una forma preferible, en una forma de presentación de la presente invención, el grado de hidrólisis (DH) del hidrolizado de proteína, es mayor de un 10%. De una forma preferible, el grado de hidrólisis, es mayor de un 20%, de una forma más preferible, éste es mayor de un 30%.

De una forma preferible, en una forma de presentación de la presente invención, el grado de hidrólisis del hidrolizado de proteína de suero lácteo, se encuentra comprendido dentro de unos márgenes situados entre un 10% y un 70%. De una forma más preferible, éste se encuentra comprendido dentro de unos márgenes situados entre un 20% y un 50%, encontrándose situado, de una forma mayormente preferible, entre un 25 y un 35%. Por ejemplo, el grado de hidrólisis de la proteína, es de un 30%. Para un hidrolizado de proteína de suero lácteo, un grado de hidrólisis del 30%, significa el hecho de que, la mayor parte de la materia de proteína, se encuentra presente en forma de dipéptidos. Pueden también encontrarse presentes tri- y oligo- y polipéptidos, así como también aminoácidos libres, no obstante, en una extensión más reducida, siembre y cuando, se encuentre concernido el número de moléculas.

Un hidrolizado de proteína de suero lácteo utilizado en concordancia con la presente invención, se encuentra también comercialmente disponible en el mercado. Así, por ejemplo, puede también utilizarse el hidrolizado de proteína de suero lácteo Lacprodan® DI-3065 de la firma Arla Food Ingredients Ltd.

La fuente de proteína, proporciona, de una forma preferible, aproximadamente un porcentaje correspondiente a unos márgenes que van de un 1 a un 50%, del valor calórico total de la composición nutritiva. De una forma preferible, ésta proporciona de un 10 a un 30% del valor calórico total de la composición.

La composición nutritiva, pueden también comprender una fuente de lípidos. La cantidad de grasa para el componente de aceite, puede ajustarse a factores circunstanciales, como por ejemplo, la condición de un paciente, y la presencia de otras enfermedades. La fuente de grasa, puede proporcionar de un 0 a aproximadamente un 50%, del valor calórico total de la composición. De una forma preferible, éste se encuentra presente en una cantidad que va del 20 al 35%, del valor calórico total. El componente de grasa, puede ser cualquier lípido o grasa conocida en el arte especializado de la técnica, para uso en composiciones nutritivas. La grasas típicas, incluyen a la grasa de leche, aceite de girasol, aceite de cánola, lípido de yema de huevo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodón, aceite de coco, aceite de avellana, aceite de palma, aceite de almendra de palma y/o aceite de semilla de colza. La fuente de grasa, puede incluir triglicéridos de cadena larga, de cadena corta y/o de cadena media (SCT, LCT, y/ó MCT), en cantidades suficientes. Los lípidos, pueden consistir en ácidos grasos saturados, insaturados, mono-, di-, tri-, ó poli-insaturados. Los ácidos grasos insaturados, pueden ser ácidos grasos n-3 ó n-6.

La composición nutritiva, puede también comprender una fuente de hidratos de carbono. El componente de hidrato de carbono, puede proporcionar del 5 al 90% del valor calórico total. De una forma preferible, éste comprende de un 20 a un 55%, de una forma preferible, de un 40 a un 50%, de la energía. La fuente de hidratos de carbono, pude ser cualquier hidrato de carbono apropiado o mezclas de hidratos de carbono apropiados. Así, por ejemplo, el hidrato de carbono, puede ser lactosa, maltodextrina, almidón modificado, almidón de amilosa, almidón de amilosa superior, almidón de tapioca, almidón de maíz, sucrosa, galactosa, glucosa, fructosa, o mezclas de éstos. Así, de este modo, pueden añadirse cualesquiera poli-, oligo-, di-, y/o monosacáridos conocidos como siendo apropiados para su uso en fórmulas nutritivas.

Adicionalmente, la composición nutritiva, puede comprender fibra dietética. Puede utilizarse cualquier fuente de fibra, en dependencia de las necesidades circunstanciales del paciente. Así, de este modo, puede utilizarse fibra soluble e insoluble, bien ya sea sola o bien ya sea en combinación. La fibra soluble, puede ser una fibra viscosa o una fibra no viscosa o una combinación de éstas. La posibles fuentes de fibras solubles, son la goma de guar, la goma de xantano, la goma arábica, la pectina, el \beta-glucano, la inulina, o mezclas de éstos. Las fuentes apropiadas de fibras insolubles, son las fibras procedentes de las pieles de las legumbres y de los cereales; por ejemplo, la fibra de piel de guisante, la fibra de piel de avena, la fibra de piel de cebada, y la fibra de piel de soja. No obstante, puede utilizarse cualquier fuente apropiada de fibra dietética insoluble.

La composición nutritiva, incluye, de una forma preferible, un perfil completo de vitaminas y minerales. Así, por ejemplo, pueden suministrarse suficientes fibras y minerales, para proporcionar de aproximadamente un 75% a aproximadamente un 250% de la ración diaria recomendada de las vitaminas y minerales, por 100 calorías de la composición nutritiva.

Pueden encontrarse presentes varios saborizantes, edulcorantes y otros aditivos. Así, por ejemplo, pueden utilizarse emulsionantes.

En caso apropiado, la fórmula nutritiva, puede también incluir ingredientes funcionales. En dependencia de la condición del paciente, pueden añadirse extractos de plantas apropiados. Así, por ejemplo, pueden añadirse extractos de plantas apropiadas que tengan efectos beneficiosos en la flora intestinal, restriñimiento, diarrea, y por el estilo. Son ejemplos de éstas, el hinojo, el "vervain", el té verde, el extracto de menta, las fibras prebióticas, la manzanilla, el tilo, el linden.

La composición nutritiva, de una forma conveniente, tiene una osmoralidad que va desde aproximadamente
180 mOsm/l hasta aproximadamente 400 mOsm/l; por ejemplo, de aproximadamente 250 mOsm/l, hasta aproximadamente 300 mOsm/l.

La densidad de energía de la composición nutritiva es, de una forma preferible, de un valor que va desde aproximadamente 500 kcal/l hasta 1500 kcal/l; de una forma más preferible, desde aproximadamente 700 hasta aproximadamente 1100 kcal/l.

La composición nutritiva es, de una forma preferible, en forma de una formulación lista para su uso. En esta forma, la composición puede suministrarse a un paciente, vía un tubo nasogástrico, vía un tubo de yeyuno, o haciendo que el paciente la beba. Como tal, la composición nutritiva, puede ser en una variedad de formas; por ejemplo, como una fórmula líquida para un lactante, una bebida del tipo de zumo de frutas, una bebida del tipo de batido de leche, y por el estilo. No obstante, la composición nutritiva, puede ser en forma de una materia soluble, en polvo, para ser reconstruida antes de su uso.

Con respecto al procedimiento de prevención del sobrecrecimiento bacteriano, o el procedimiento para la prevención de las enfermedades asociadas con éste, el hidrolizado de proteína de suero lácteo, es la única fuente de materia proteinogénica. La materia proteinogénica de una fórmula nutritiva standard o de un producto alimenticio, se reemplaza completamente por el hidrolizado de proteína tal y como se define en esta descripción.

La composición nutritiva, puede producirse en concordancia con la práctica standard; así, por ejemplo, procediendo a mezclar conjuntamente la fuente de proteína, la fuente de hidratos de carbono, y la fuente de lípidos. En el caso en el que se utilicen, los emulsionantes, pueden introducirse en la mezcla. La vitaminas y minerales, pueden añadirse en este punto, pero, usualmente, éstos se añaden posteriormente, con objeto de evitar la degradación térmica. Pueden disolverse cualesquiera vitaminas lipofílicas, emulsionantes y por el estilo, en la fuente de lípidos, previamente a proceder al mezclado. A continuación, puede añadirse y mezclarse agua, de una forma preferible, agua que haya sido sometida a una osmosis inversa, con objeto de formar una mezcla líquida. La temperatura del agua, puede encontrarse, de una forma conveniente, a un nivel comprendido dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 50ºC hasta aproximadamente 80ºC, con objeto de ayudar en la dispersión de los ingredientes. Pueden utilizarse licuefactores comercialmente obtenibles en el mercado, para formar el líquido.

La mezcla líquida, puede tratarse térmicamente, a continuación, con objeto de reducir las cantidades o cargas bacterianas. Así, por ejemplo, la mezcla líquida, puede calentarse rápidamente, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 75ºC hasta aproximadamente 110ºC, durante un transcurso de tiempo que va desde aproximadamente 5 segundos hasta aproximadamente 5 minutos. Esto puede llevarse a cabo mediante inyección de vapor o mediante intercambiador de calor; por ejemplo, un intercambiador de calor de
placas.

La mezcla líquida, puede calentarse, a continuación, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 60ºC hasta aproximadamente 85ºC; por ejemplo, mediante enfriamiento "flash" (de evaporación instantánea). Se procede, a continuación, a homogeneizar la mezcla líquida, por ejemplo, en dos etapas, a aproximadamente 7 MPa en la primera etapa, y a un valor de aproximadamente 2 MPa a aproximadamente 14 MPa, en la segunda etapa. A continuación, la mezcla homogeneizada, puede enfriarse adicionalmente, con objeto de añadir cualesquiera componentes sensibles al calor; tales como vitaminas o minerales. El pH y el contenido de sólidos de la mezcla homogeneizada, se estandariza de una forma conveniente, en este punto.

Para un producto en forma líquida, la mezcla homogeneizada, se introduce, preferiblemente, de una forma aséptica, en recipientes contenedores apropiados. El llenado aséptico de los recipientes contenedores, puede llevarse a cabo procediendo a precalentar la mezcla homogeneizada (por ejemplo, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 75ºC hasta aproximadamente 85ºC) y, a continuación, inyectando vapor al interior de la mezcla homogeneizada, con objeto de hacer subir la temperatura, a un nivel comprendido dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 120ºC hasta aproximadamente 180ºC, de una forma preferible, desde aproximadamente 140ºC hasta aproximadamente 160ºC. La mezcla homogeneizada, puede enfriarse a continuación, por ejemplo, mediante enfriamiento "flash" (de evaporación instantánea), a una temperatura de aproximadamente 75ºC hasta aproximadamente 85ºC. La mezcla homogeneizada, puede entonces homogeneizarse adicionalmente, enfriarse a la temperatura ambiente, y llenarse en recipientes contenedores. Los aparatos apropiados para llevar a cabo un llenado aséptico de esta naturaleza, se encuentran comercialmente disponibles en el mercado.

Para un producto en forma de materia en polvo, la mezcla homogeneizada, se seca hasta su conversión en materia en polvo; por ejemplo, mediante proyección pulverizada (spray). Pueden utilizarse procedimientos convencionales.

La composición nutritiva, puede utilizarse como una nutrición completa o suplementaria, para prevenir el sobrecrecimiento bacteriano en el intestino, la translocación bacteriana y/o septicemia por translocación bacteriana, en bebés prematuros, o nacidos a término, en lactantes, en pacientes críticamente enfermos, y en las personas mayores.

Sin pretender vincularlo a ninguna teoría, se postula que, el efecto beneficioso del hidrolizado de proteína, con respecto al crecimiento bacteriano, se cree que se encuentra ligado a la alta digestibilidad y rápida absorción del hidrolizado de proteína. El hecho de que, la mayoría del material proteináceo se encuentra presente en pequeñas fracciones, por ejemplo, en di-, tri-, ó tetrapéptidos, tiene la consecuencia de que, éstas, se absorben completamente en el intestino delgado, incluso en pacientes con la función gastrointestinal dañada. En el caso en que estos tipos de pacientes o un bebé prematuro, consuman proteína intacta, esta proteína, no se absorbería enteramente en el intestino delgado, y alcanzaría el extremo inferior del ileum. Allí, el material proteináceo, puede servir como un substrato para las bacterias que, usualmente, no colonizan esta área del tracto digestivo en individuos sanos. Se ha encontrado, por lo tanto, el hecho de que, el crecimiento bacteriano, puede prevenirse, procediendo a incrementar la digestibilidad del material proteináceo, de una forma más específica, suministrando una proteína hidrolizable, más bien que una proteína intacta, a este individuo afectado. Otra vez, no está probado que, este modelo explicativo, cuente en su totalidad, para los efectos sorprendentes aquí reportados.

El ejemplo que se facilita a continuación, se proporciona a título de ilustración y, en ningún caso, debe ser interpretado como limitativo de la materia objeto de la presente invención. Los porcentajes y partes, se refieren a peso, a menos que se indique de otro modo.

En el ejemplo, se utiliza un modelo basado en ratas, el cual no refleja la situación idéntica encontrada en los humanos y, cuyos resultados, no son por lo tanto directamente y inequívocamente transferibles a humanos. No obstante, el modelo, se selecciona en base a investigaciones científicas que reconocen este modelo en ratas, para estudiar el impacto de las intervenciones nutritivas en sistemas digestivos inmaduros, como los de los bebés prematuros, recién nacidos, pero también de los pacientes con problemas digestivos.

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Ejemplo Efecto de la fuente de proteína (proteína intacta versus proteína de suero lácteo hidrolizada) en el modelo patrón de la flora intestinal de ratas lactantes criadas artificialmente Procedimientos Animales y dietas

Para la realización de este estudio, se utilizaron ratas Sprague-Dawley. Se procedió a ubicar individualmente en jaulas de plástico, madres engendradas (compradas en el mercado, de procedencia de los laboratorios Charles River Laboratories, Wilmington, MA) y, éstas, se mantuvieron bajo un ciclo de 12 horas, de oscuridad/luz, a una temperatura de 21 \pm 1ºC. Los animales, tenían libre acceso a una dieta de ratón/rata 7002 Teklad 6% (Harland Teklad, Madison, WI) y a agua corriente. En el 4º día, después del nacimiento, se procedió a distribuir 18 ratas lactantes, en 2 grupos experimentales y, a continuación, se gatrostomizaron y se alimentaron artificialmente, durante un transcurso de tiempo de 10 días. Después, 10 compañeros de camada, sirvieron como control de alimento de las madres.

Dietas

Los animales, se alimentaron con dos fórmulas de leche experimentales, que tenían la misma composición, excepto en cuanto a lo referente a la fuente de proteína (tabla 1): 100% de proteína de suero lácteo, intacta (DH 0%) y 100% de hidrolizado de proteína de suero de suero lácteo común (DH 30%). La distribución del peso molecular del hidrolizado de proteína, se muestra en la figura 1.

TABLA 1 Composición de las fórmulas experimentales empleadas durante la alimentación artificial

1

TABLA 1 (continuación)

2

Protocolo experimental

Todos los procedimientos utilizados en este protocolo, fueron revisados y aprobados por parte del Animal Care Committee, en la Universidad de Arizona. Se procedió a anestesiar y a gastrostomizar, ratas lactantes de cuatro días de edad, con una cánula de polietileno, con un extremo en forma de gancho. (PE-20, Clay Adams/Benton Dickinson and Co., Parsippany, NJ). Después de la recuperación post-quirúrgica, la cual incluía 2 horas de ayuno, se procedió a pesar los cachorros, y se calculó el volumen de la fórmula artificial a dar a cada animal, para proporcionar aproximadamente un 35 - 37% de peso corporal para un período de 24 horas. Se procedió a emplazar los cachorros en tazas de plástico, y se hicieron flotar en un baño a una temperatura de 39ºC, durante el transcurso de tiempo del estudio de la alimentación, para mantener la temperatura y la humedad ambiente. Los tubos de gastrostomía, se conectaron a jeringas, en bombas de infusión del Modelo 44 Harvard (Harvard Apparatus, South Natick, MA), en un refrigerador, por mediación de entubado de Silastic (Dow Corning Corp., Midland, MI). Las bombas, se ajustaron para suministrar el volumen de dieta calculado, para un transcurso de tiempo de 20 minutos, seguido de una pausa de 40 minutos, cada hora. El volumen de dieta a ser suministrado, se recalculó diariamente. Cada día, se procedió a registrar los pesos corporales, la apertura de ojos, y las longitudes de las colas. Se indujo una urinación y una defecación correspondientes a dos veces al día, mediante estimulación suave de la región anogenital.

En el día 14, se procedió a sacrificar los cachorros, mediante decapitación. El tracto gastrointestinal, se extrajo rápidamente, mediante condiciones estériles y se cortó hasta el duodeno (1 cm desde el píloro), yeyuno, ileum (partes a media distancia y partes distales del intestino delgado restante, respectivamente), y cecum. El yeyuno y el ileum, se lavaron, cada uno de ellos, con una solución estéril, enfriada con hielo, de NaCl al 0,9% y un 10% de glicerol. Los contenidos, se recogieron directamente y se pesaron en tubos estériles de NUNC (Nalgene). Se procedió a abrir el cecum, se eliminaron los contenidos con una espátula estéril, y se pesaron en el interior de un tubo de NUNC, al cual, se le añadió, a continuación, 1 ml de una solución de NaCl + glicerol. Los contenidos intestinales, se congelaron, inmediatamente, en nitrógeno líquido.

Análisis de la flora en los contenidos intestinales

Se procedió a valorar la flora (bifidobacterias, lactobacilos, enterococos, enterobacterias y Clostridium perfigenes) en los contenidos del yeyuno, del ileum y del cecum, procediendo a plantarla medios selectivos o semi-selectivos.

Se realizaron diluciones en serie, a un valor de 100 veces, en una solución de Ringer, que contenía un 0,5% de cisteína, de -2 a -8. Se procedió a inocular placas de Petri de varios medios selectivos, y se incubaron (véase la
tabla 2).

TABLA 2

3

*:	Waldworth Anaerobic Bacteriology Manual, V. Suter, D. Citron y s. Finegold, 3ª edición.
**:	Fosfomicina (79,5 mg/l) + Sulfametoxazol (0,93 mg/l) + Trimetroprima (5 mg/l)
***:	NN agar procedente de Lowbury and Lilly, 1995.

La atmósfera anaeróbica, se obtuvo utilizando Anaercoult A (MERCK, Darmstadt, Alemania). Después de la incubación, las colonias, se contaron, y se identificaron adicionalmente, en caso necesario. Las cepas de lactobacilos y de bifidobacterias, se identificaron mediante microscopía, y actividades enzimáticas. Los recuentos, se expresaron en cfu/g de muestra fecal, con un límite de detección, a 2,30 cfu/g, expresado como log.

Análisis estadístico

Debido a la nula variabilidad observada, en algunos de los grupos, no pudo realizarse un análisis clásico de la varianza (ANOVA). En su lugar, se empleó un test de ensayo de clasificación, del tipo Wilconox rank test, para pares de grupos. La diferencias medias, con valores p inferiores a 0,05, se consideraron como significativos.

Resultados

La figuras 2 - 4, muestra los recuentos de enterobacterias, enterococos y lactobacilos en los contenidos de diferentes segmentos intestinales.

Los recuentos de enterobacterias, en el ileum, fueron mayores en DH0, que en los otros grupos. Los DH30 y MF, resultaron en valores similares, en el límite de detección. En el cecum, el único grupo distinto, era el de MF, con recuentos más pequeños.

Los enterococos, eran mucho más abundantes en el yeyuno y en el ileum, con DH0, que con DH30 ó MF. No se observaron diferencias significativas en las dietas, en el cecum.

Los lactobacilos en el ileum, eran más abundantes en DH0 que en otros grupos. Se encontró una tendencia similar en el yeyuno, si bien, en este caso, el MF, mostró valores emplazados entre EH0 y DH30. Otra vez, no se detectó ninguna diferencia en el cecum.

Las bifidobacterias, no se detectaron, ni en el grupo ni en el segmento intestinal. En cuanto a lo concerniente al Clostridium, únicamente cuatro animales (dos en DHO y dos en MF), tenían valores detectables en el cecum, y un animal, en el ileum (en DH0). Estos valores, eran considerablemente negligibles, es decir, que podría prescindirse de éstos, y no se efectuó ninguna comparación estadística entre dietas.

Conclusiones

La alimentación con proteína de suero intacto, fomentó el sobrecrecimiento bacteriano, en el intestino delgado de los cachorros. Este sobrecrecimiento, se previno en una mayor medida, procediendo a alimentar con hidrolizado de proteína de suero lácteo común, lo cual daba como resultado unos modelos patrón de flora, bastante similares a los observados después de la alimentación de los cachorros por parte de la madre.

Los hidrolizados de proteína, son por lo tanto medios adecuados para prevenir el sobrecrecimiento bacteriano y las enfermedades asociadas con éste. Es posible el restaurar un modelo patrón de flora intestinal, que sea similar al de los individuos alimentados con leche materna.

Claims (5)

1. El uso de hidrolizado de proteína de suero lácteo, como única fuente de proteínas, en la preparación de una composición nutritiva para la prevención del crecimiento bacteriano, de la enterocolitis necrotizante, y/o de la septicemia por translocación bacteriana.

2. El uso, según la reivindicación 1, en donde, la composición nutritiva, está prevista para bebés recién nacidos prematuros o nacidos a término, lactantes, pacientes críticamente enfermos, o personas mayores.

3. El uso, según la reivindicación 1, en donde, la composición nutritiva, está prevista para animales de compañía.

4. El uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde, el grado de hidrólisis del hidrolizado de proteína, es de más de un 10%.

5. El uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde, el grado de hidrólisis del hidrolizado de proteína, se encuentra comprendido entre un 10% y un 70%.